ES2714312T3 - Proceso para separar diésteres de ciclopropilo - Google Patents

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Abstract

Un proceso para la preparacion de un compuesto de formula (II)**Fórmula** en donde R1 es alquilo; y R2 se selecciona entre alquenilo y alquilo; comprendiendo el proceso: hacer reaccionar un compuesto de formula (I)**Fórmula** con la enzima de Penicillina V amidohidrolasa de Fusarium oxysporum.

Description

DESCRIPCION
Proceso para separar diesteres de ciclopropilo
La presente invencion proporciona un metodo para la hidrolisis estereoespedfica de 1,1-dialquiloxicarbonilciclopropanos racemicos.
El 7rans-(1R,2S)-1-ferc-butoxicarbonilamino-1-carboxi-2-vinilcidopropano (1) es un importante intermediario quiral para la síntesis de determinados inhibidores de la proteasa del virus de la Hepatitis C.
Figure imgf000002_0001
Se han dado a conocer distintos enfoques sinteticos. Fliche, y col. (e.g. Synthetic Communications, vol.24, No 20, 2873-2876) da a conocer una via quimioenzimatica, que implica la separacion enzimatica del ester de dimetilo racemico (2) para preparar el correspondiente monoacido c/s-(1 S,2S)-(6a) seguido por conversion quimica (6a) en el intermediario quiral deseado (1) (esquema 1).
Figure imgf000002_0002
En este enfoque, todas las enzimas evaluadas mostraron solo enantioselectividad moderada e incluso con la mejor enzima, la separacion enzimatica tuvo que llevarse a cabo dos veces para mejorar el ee a un nivel necesario para la aplicacion practica para la síntesis enantioselectiva de intermediarios farmaceuticos. La hidrolisis enzimatica del ester de metilo racemico (2) mediante Carboxil Naproxen esterasa (CENP) proporciono el monoacido c/s-(1S,2S)-(6a) con ee de solo el 70 % y material de partida sin reaccionar enriquecido con el ester de dimetilo (2R)-(2b) con ee del 95 %. El monoacido c/s-(1 S,2S)-(6a) ee del 70 % se reesterifico con el diester y la segunda hidrolisis enzimatica con CENP mejoro el ee del monoacido c/s-(1 S,2S)-(6a) al 90 %. Una segunda hidrolisis enzimatica del ester de dimetilo enriquecido (2R)-(2b) ee del 95 % mediante Esterasa 30000 proporciono el monoacido cis-(1R,2R)-(6a) con un ee del 95 %.
La hidrolisis catalizada por esterasa de higado porcino (PLE) del ester de dietilo (±)-(3) tambien dio a conocer que proporcionaba al monoacido (7a) con una baja diaestereoselectividad (de del 60 %). La hidrolisis no enzimatica del ester de dietilo (±)-(3) mostro una diaestereo-preferencia parcial en proporcionar c/s-(±)-(7) racemico como producto principal.
Figure imgf000003_0001
Alupei y col. (Macromolecu. Rapid. Commun., vol.22, No 16, 2001) tambien desvela la hidrolisis enzimatica de 1,1-dietoxicarbonil-2-vinilciclopropano. Asimismo, el documento EP 2537825 desvela metodos de produccion de (2S)-1,1-dietoxicarbonil-2-vinilciclopropano.
Ejemplos tales como estos senalan la necesidad de encontrar una enzima con una alta diaestereoselectividad y una alta enantioselectividad para la síntesis enantioselectiva practica de intermediarios farmaceuticos tales como vinilciclopropano (1).
En un primer aspecto, la presente divulgacion proporciona un proceso para preparar un compuesto de formula (II)
Figure imgf000003_0002
en donde
R1 es alquilo; y
R2 se selecciona entre alquenilo y alquilo;
comprendiendo el proceso:
hacer reaccionar un compuesto de formula (I)
Figure imgf000003_0003
con la enzima de Penicillina V de amidohidrolasa de Fusarium oxysporum.
En una primera realizacion del primer aspecto la Penicilina V amidohidrolasa de la enzima de Fusarium oxysporum se obtiene a partir de un organismo recombinante que contiene el gen de la Penicilina V amidohidrolasa de Fusarium oxysporum.
En una segunda realizacion del primer aspecto R1 es alquilo en donde el alquilo se selecciona entre metilo, etilo, propilo y butilo. En una tercera realizacion del primer aspecto R2 es alquenilo C2.
En una cuarta realizacion del primer aspecto el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso diastereomerico igual a o superior al 90 %. En una quinta realizacion del primer aspecto, el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso diastereomerico del 95 % o superior. En una sexta realizacion del primer aspecto, el compuesto de formula (II) se obtiene un exceso enantiomerico de mas del 70 %. En una septima realizacion del primer aspecto el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso enantiomerico del 90 % y superior. En una octava realizacion del primer aspecto, el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso enantiomerico del 95 % o superior.
La enzima puede usarse como tal o como una enzima inmovilizada. Ademas, la enzima como tal o en la forma inmovilizada puede volverse a usar.
Tal como se usan en la presente memoria descriptiva, los terminos siguientes tienen los significados indicados: El termino “alquenilo” , como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de cadena lineal o ramificada de dos a seis atomos de carbono que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono.
El termino “alquilo” , como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo obtenido a partir de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a seis atomos de carbono.
Todos los procesos en la presente divulgacion pueden llevarse a cabo como procesos continuos. La expresion "proceso continuo", como se usa en el presente documento, representa etapas que se han llevado a cabo sin aislamiento del intermediario.
Las estructuras de los compuestos relevantes se muestran en los Esquemas 3-5.
Las abreviaturas utilizadas en la presente solicitud, incluidas particularmente en los esquemas y ejemplos ilustrativos que siguen, son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Algunas de las abreviaturas utilizadas son las siguientes: TFA para acido trifluoroacetico; min para minutos; h para horas; DMSO para dimetilsulfoxido; MTBE para terc-butil eter de metilo; Et para etilo; n-Pr para n-propilo, n-Bu para n-butilo, t-Bu para terc-butilo; y Me para metilo. Ejemplos
Esquema 3
Figure imgf000004_0001
Los isomeros cis- y -trans se mostraron con distintos numeros de compuesto.
Los enantiomeros se identificaron como a y b del mismo numero (1,2, 3, 4).
El cis- y el trans- en el texto representa la relation entre el grupo vinilo y ester.
Figure imgf000005_0001
a. CICO2Et, Et3N; b. NaN3, agua; c. t-BuOH, reflujo; d. LiOH, agua.
El prefijo trans- representa la relacion entre los grupos N-Boc y vinilo en 17a y 1.10*52
Los productos qmmicos se adquirieron de VWR y/o de Aldrich. Se registro el espectro de RMN en CDCh (excepto como se indica) en un espectrofotometro de RMN BRUKER-300 y/o JEOL-400. Las asignaciones de protones se basaron en experimentos de 1H-1H COSY. Los datos de LCMS se registraron en un sistema de LCMS de Shimadzu con metodo de electropulverizacion de iones positivos (ES+) o electropulverizacion de iones negativos (ES-). Los datos de rotacion se registraron sobre un polarimetro de Perkin-Elmer 241.
El metodo 1 aquiral de HPLC de fase inversa, y los metodos 2 y 3 quirales se llevaron a cabo con distintos gradientes de disolvente A (0,05 % de TFA en agua:metanol 80:20) y disolvente B (0,05 % de TFA en acetonitrilo:metanol 80:20) a temperatura ambiente con deteccion UV a 2 l0 nm excepto cuando se indica lo contrario. El metodo 4 de HPLC de fase normal fue para analisis quiral. Algunas modificaciones de estos metodos de HPLC tambien se usaron durante el estudio para una mejor separacion o un analisis mas rapido. El metodo 1 se uso para el analisis quiral de todos los compuestos y se llevo a cabo sobre una columna YMC-Pack Pro C18 (3 pm, 150 x 4,6 mm) con un caudal de 1 ml/min y un gradiente desde el 30 % hasta el 100 % de disolvente B durante 14 min y manteniendo el 100 % de B durante 2 min adicionales. Los tiempos de retencion fueron de 6,1, 8,7, 11,4 y 13,5 min para los diesteres 2, 3, 4 y 5; 4,2, 5,3, 6,7 y 8,1 min para los monoacidos cis 6, 7, 8 y 9; 4,0, 5,1, 6,5 y 7,9 min para los monoacidos trans 10, 11, 12 y 13; 3,0 min para el diacido 14; 8,7 y 12,5 min para el compuesto trans 17 y su isomero cis 18; 5,9 min para el compuesto trans 1, respectivamente.
El metodo 2 se uso para el analisis quiral del compuesto trans 17 y se llevo a cabo sobre una columna Chiralcel OD-RH (150 x 4,6 mm) con un caudal de 0,5 ml/min y una composicion isocratica del 35 % de disolvente B durante 25 min. Los tiempos de retention fueron de 19,1 min para (1R,2S)-17a y 20,6 min para (1S,2R)-17b.
El metodo 3 se uso para el analisis quiral del compuesto trans 1 y se llevo a cabo sobre una columna Chiralpak AS-RH (150 x 4,6 mm) con un caudal de 0,5 ml/min y una composicion isocratica del 22 % de disolvente B durante 20 min. Los tiempos de retencion fueron de 9,1 min para (1R,2S)-1 y 11,6 min para su enantiomero (1S,2R)-1 b.
El metodo 4 se uso para el analisis quiral de los monoacidos cis de 6 a 9 y se llevo a cabo sobre una columna Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm) con un caudal de 1 ml/min y una composicion isocratica del 5 % de isopropanol en heptano durante 15 min. Los tiempos de retencion fueron de 8,0 y 8,7 min durante 6b y 6a; 7,4 y 8,2 para 7b y 7a; 6,9 y 7,6 min para 8b y 8a; 6,6 y 7,0 min para 9b y 9a respectivamente.
Figure imgf000006_0001
Smteisis de ester de dimetilo racemico (2)
Se anadio a un matraz de 250 ml de (E)-1,4-dibromo-2-buteno (92,6316 mmol, 20,014 g), carbonato potasico (anhidrido, 231,802 mmol, 32,036 g), metanol (anhidrido 100 ml) y malonato de dimetilo (101,8786 mmol, 13,4598 g). La reaction fue exotermica al inicio. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 20 h. El disolvente se retiro con presion reducida. El resto se trato con 200 ml de acetato de etilo y 200 ml de agua. La capa organica se lavo adicionalmente con agua (2 x 100 ml), se seco con MgSO4, y se filtro. La retiracion de disolvente del filtrado proporciono ester de dimetilo (2) (14,7833 g, 86,6 % de rendimiento). Se obtuvo una muestra analitica pura mediante destilacion (89 °C / 5 mmHg). RMN 1H (Cd CI3) 5 5,43-5,36 (m, 1H), 5,26 (d aparente, J = 16,7 Hz, 1H), 5,10 (d aparente, J = 10,4 Hz, 1H), 3,703 (s, 3H), 3,700 (s, 3h ), 2,55 (q aparente, J = 8,5 Hz, 1H), 1,68 (dd, J = 7,63, 4,88 Hz, 1H), 1,55 (dd, J=9,16, 4,89 Hz, 1H) ppm. RMN 13C (CDCI3) 5 170,01, 167,78, 133,05, 118,65, 52,68, 52,53, 35,81,31,43, 20,58 ppm.
Figure imgf000006_0002
Smteisis de ester de dietilo racemico (3)
Se anadio a un matraz de 250 ml de (E)-1,4-dibromo-2-buteno (92,63 mmol, 20,01 g), carbonato potasico (anhidrido, 231,44 mmol, 31,99 g), etanol (anhidrido 100 ml) y malonato de dietilo (102,00 mmol, 16,34 g). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 46 h. El mismo procedimiento de trabajo que se uso para preparar ester de dimetilo proporciono ester de dietilo (3) (20,473 g, 104 % de rendimiento). Se obtuvo una muestra analitica pura mediante destilacion (97 °C / 5 mmHg). RMN 1H (CDCI3) 5 5,47-5,40 (m, 1H), 5,29 (d aparente, J = 17,09 Hz, 1H), 5,13 (d aparente, J = 10,1 Hz, 1H), 4,26~4,12 (m, 4H), 2,56 (q aparente, J = 8,24 Hz, 1H), 1,68 (dd, J= 7,33, 4,89, 1H), 1,54 (dd, J = 9,16, 4,89 Hz, 1H), 1,28~1,23 (m, 6H) ppm. RMN 13C (CDCI3) 5 169,69, 167,44, 133,27, 118,39, 61,62, 61,44, 36,04, 31,08, 20,35, 14,23, 14,11 ppm.
Figure imgf000006_0003
Smteisis de ester de dipropilo racemico (4)
Se anadio a un matraz de 250 ml de (E)-1,4-dibromo-2-buteno (92,598 mmol, 20,007 g), carbonato potasico (anhidrido, 231,668 mmol, 32,018 g), 1-propanol (100 ml) y malonato de dipropilo (101,916 mmol, 19,183 g). La mezcla se agito a 60 °C durante 24 h. El mismo procedimiento de trabajo que se uso para preparar ester de dipropilo proporciono ester de dietilo (4) (23,069 g, 103,7 % de rendimiento). RMN 1H (CDCI3) 5 5,47-5,40 (m, 1H), 5,28 (d aparente, J = 17,09 Hz, 1H), 5,12 (d aparente, J = 10,38 Hz, 1H), 4,15~4,03 (m, 4H), 2,57 (q aparente, J = 8,24 Hz, 1H), 1,70~1,62 (m, 5H), 1,54 (dd, J= 8,85, 4,88, 1H), 0,95~0,92 (t aparente, J = 7,33 Hz, 6H) ppm. RMN 13C (CDCI3) 5 169,82, 167,57, 133,35, 118,40, 67,26, 67,20, 36,16, 31,13, 22,04, 21,97, 20,47, 10,42, 10,35 ppm.
Figure imgf000007_0001
Sntesis de ester de dibutilo racemico (5)
Se anadio a un matraz de 250 ml de (E)-1,4-dibromo-2-buteno (92,784 mmol, 20,047 g), carbonato potasico (anhidrido, 231,430 mmol, 31,985 g), 1-butanol (100 ml) y malonato de dibutilo (101,869 mmol, 22,032 g). El procedimiento usado para preparar el ester de dimetilo proporciono ester de dibutilo (5) (23,933 g, 96,1 % de rendimiento). RMN 1H (CDCl3) 55,42 (m, 1H), 5,27 (d aparente, J = 16,78 Hz, 1H), 5,10 (d aparente, J = 10,37 Hz, 1H), 4,17-4,05 (m, 4H), 2,54 (q aparente, J = 8,54 Hz, 1H), 1,66 (dd, J= 7,63; 4,88 Hz, 1H), 1,62-1,56 (m, 4H), 1,52 (dd, J= 8,85; 4,89 Hz, 1H), 1,40-1,32 (m, 4H), 0,93-0,89 (m, 6H), RMN 13C (CDCb) 5169,80, 167,55, 133,33, 118,34, 65,51,65,37, 36,12, 34,96, 31,09, 30,69, 30,63, 20,44, 19,10, 13,65, 13,63 ppm.
Deteccion enzimatica
Se tomaron placas multipocillo que contenian enzimas fuera de la sala fria. Cada pocillo contenia aproximadamente 10 mg de enzima liofilizada o inmovilizada. Tampon fosfato, 100 mM, pH 7 (1 ml) de anadio a cada pocillo. Las placas se agitaron en el Termomezclador R a 600 rpm a 28 °C durante 5 minutos. Se anadio a cada pocillo una solucion de 1 j l (1,097 mg) del ester de dimetilo racemico (±)-(2) en 20 |jl de DMSO. Se llevo a cabo la hidrolisis agitando en el mismo agitador a 600 rpm y 28 °C durante 24 h. Despues de 24 h, se anadio a cada pocillo acetonitrilo (1 ml). Las mezclas se colocaron en el agitador a 300 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos para mezclar y, a continuacion, se filtraron a traves de un filtro de 0,2 j y se analizaron mediante HPLC de fase inversa (Metodo 1) para determinar el grado de hidrolisis. Las mezclas de reaccion de la hidrolisis de enzimas que mostraban mas de un 10 % de conversion se analizaron mediante HPLC quiral para determinar las composiciones enantiomericas. A la mezcla de reaccion de la hidrolisis enzimatica, se anadio 0,1 ml de 1 N de HCI para hacer la mezcla acidica (pH ~ 2,5) y se extrajo con 2 ml de acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se separo y evaporo con un vapor de nitrogeno. El resto se disolvio con heptano-isopropanol (95:5, 1 ml) y se analizo mediante HPLC quiral (Metodo 4).
Tabla 1
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000008_0001
Hidrolisis enzimatica del ester de dietilo (±)-3 con Pen V Amidasa para preparar cis-(1S,2S)-(7a)
La reaccion se llevo a cabo en un matraz de 2 l revestido sobre un STAT de pH para mantener la temperatura a 30 °C y pH 8,0 mediante adicion automatica de 1 M de NaOH acuoso. Al matraz se cargaron 60 g de Pen V amidasa y 1,5 l de 0,1 M de tampon de fosfato pH 8,0. Con agitacion, se anadio el ester de dietilo (±)-(3) (30,5 g). Despues de 48 h, la tasa de consumo de NaOH indico la finalizacion de la hidrolisis. La reaccion se finalizo filtrando la mezcla para retirar la enzima. El solido se lavo con 0,1 M de tampon de fosfato, el pH 8,0 (200 ml) y acetato de etilo (3 x 200 ml). El filtrado y los lavados se combinaron y se separaron las dos fases. La fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo (2 x 600 ml). La fase organica combinada se lavo con 300 ml de 5 % de NaHCO3, 300 ml de agua. La retiracion de disolvente a temperatura ambiente proporciono 16,7 g del ester de dietilo restante (2R)-(3b), rendimiento aislados del 55 %, AP 97, [a]D = 23,98 (c=2,16, CHCb). RMN (CDCb) 55,46 (m, 1H), 5,30 (dd, 1h ), 5,14 (dd, 1H), 4,19 (m, 4H), 2,58 (c, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,56 (m, 1H), 1,27 (dos tripletes, 6H) ppm.
La fase acuosa se acidifico con 4 M de HCI y se extrajo con acetato de etilo (3 x 600 ml). Los extractos organicos se combinaron y lavaron con agua. La retiracion con disolvente en un evaporador giratorio a 20-25 °C proporciono 10,3 g de producto cis-(1S,2S)-(7a), rendimiento aislado del 39 %, AP 98, de del 99 % y ee del 90 %, [a]D = 5,52 (c=2,82, CHCb). RMN (CDCb) 1H 5 11,35 (amplio, 1H), 5,68 (m, 1H), 5,43 (d, J= 16,9 Hz, 1H), 5,25 (d, J= 10,1 Hz, 1H), 4,30 (m, 2H), 2,75 (c, J= 8,6 Hz, 1H), 1,95 (m, 2H), 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3h) ppm.
Reaccion Curtius modificada que convierte cis-(1S,2S)-(7a) en trans-(1 R,2S)-(17a)
A una solucion de cis-(1S,2S)-(7a) (3,684 g, de del 99 %, ee del 90 %) en acetona (50 ml, secada sobre tamiz molecular) a -5 a 0 °C se anadio trietilamina (3,35 ml) seguido por adicion a gotas de una solucion de cloro formato de etilo (2,49 ml) en 10 ml de acetona secada. Despues de 30 min a -5 a 0 °C, la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 18 h. El precipitado de color blanco formado se retiro mediante filtracion. El filtrado se enfrio a -5 °C y se anadio a gotas una solucion de azida de sodio (1,95 g) en 10 ml de agua. La mezcla se agito a -5 a 0 °C durante 1 h. A la mezcla se anadieron 100 ml de agua fria (5 °C). La mezcla se extrajo con MTBE (3 x 80 ml). La fase de MTBE se seco sobre MgSO4, y se filtro. La retiracion con disolvente en un evaporador giratorio a 20-25 °C proporciono 4,118 g de azida de color amarillo claro (16a), un rendimiento completo del 98 %.
Se sometio a reflujo una mezcla de azida (16a) en 50 ml de t-butanol anhidrido durante 18 h (100 °C de bano con aceite). La mezcla se concentro hasta sequedad con presion reducida para proporcionar 4,259 g de producto de color amarillo claro de trans-(1 R,2S)-(17a), AP 78, de > 99 %, ee del 90 %, rendimiento completo del 83 % de (7a).
Hidrolisis de Trans-(1R,2S)-(17a) en Trans-(1R,2S)-(1)
Una mezcla del producto bruto (17a) obtenido en la ultima seccion, 10 ml de YHF y 40 ml de 2 M de LiOH acuoso se agito a temperatura ambiente durante 5 dias. La mezcla se extrajo con 100 ml de MTBE. La fase de MTBE se extrajo al reves con 20 ml de agua. La fase acuosa combinada se acidifico con una mezcla de KHSO4 (10,9 g) y agua (30 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). El extracto de acetato de etilo se lavo con salmuera (2x50 ml), agua (2x50 ml), se seco sobre MgSO4, y se filtro. La retiracion con disolvente a temperatura ambiente proporciono 3,192 g de producto bruto, AP 77. El producto bruto se sometio a cromatografia ultrarrapida (80 g de gel de silice) y se eluyo con heptano-etilo acetato-acido acetico (50:50:1) para proporcionar 2,448 g (54 % de rendimiento completo de (7 a)) de trans-(1R,2S)-(1) de color blanco solido, AP 95, ee del 90 %, [a]D 22,34 (c 1,41, MeOH). LCMS m/z 226 (M-h ) mediante metodo de ES- y 250 (M+Na) mediante metodo de ES+. Los espectros RMB 1H, 1H-1H COSY, 13C y De p T de (1) se registraron en DMSO-d6. La asignacion de protones se baso en 1H-1H COSY y la asignacion de carbono se baso en experimentos DEPT. 1H 5 12,41 (amplio, 1 H, CO2H), 7,52 (amplio, 0.74H, NH del rotamero principal), 7,18 (amplio, 0.26H, NH del rotamero secundario), 5,67 (m, 1H, 4-CH), 5,21 (d, J= 15,8 Hz, 1H, 5-CH2-A), 5,02 (d, J= 10,3 Hz, 1H, 5-CH2-B), 2,02 (m, 1H, 2-CH), 1,49 (m, 1H, 3-CH2-A), 1,35 (s, 9H, Boc), 1,22 (m, 1H, 3-CH2-B) ppm. 13C del rotamero principal 5 172,41 (C-6), 155,51 (C-7), 134,95 (C-4 arriba en DEPT), 116,78 (C-5 abajo en DEPT), 77,95 (C-8), 39,92 (C-1 no se muestra en DEPT), 32,45 (C-2 arriba en DEPT), 28,18 (C-9, 10 y 11 arriba en DEPT), 22,52 (C-3 abajo en DEPT) ppm.
Procedimiento general para hidrolisis enzimatica en pequenos viales
A cada vial (4 ml) se cargo Pen V Amidasa (10 mg o como se indica) y 1 ml de un tampon. El vial se coloca en el pocillo de una placa multipocillo y se agita en un agitador Termomezclado. Despues de 10 min, se anadio 10 |jl del sustrato diester (2, 3, 4 o 5) o como se indico y se continuo la agitacion. Despues de 24 h o el tiempo indicado, se anadieron 20 j l de 4 M de HCl y 3 ml de acetonitrilo. La mezcla se filtro a traves de un filtro de 0,2 jm . 1 ml del filtrado se sometio al metodo 1 de HPLC para su analisis aquiral. La conversion se estimo mediante el area de HPLC relativa. El filtrado restante se concentro parcialmente con un vapor de nitrogeno y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se seco y el resto se disolvio en isopropanol-heptano (1:1), se filtro a traves de un filtro de 0,2 jm y se sometio al metodo 4 de HPLC para su analisis quiral.
El efecto de los codisolventes (5-10 % de volumen) se evaluo para la hidrolisis catalizada por Pen V amidasa de (±)-(2). Alcanos de cadena lineal tales como hexano, heptanos, octano y tetradecano mejoraron la enantioselectividad con un ligero efecto sobre la actividad enzimatica. Se muestran datos representativos en la Tabla 2:
Codisolvente Conversion (%) ee (%) Ninguno 45 93,2 Hexano 25 98,0 Heptano 52 b 97,4 Octano 32 96,9 Tetradecano 39 96,0
a. SM (±)-(2) 20 g/l, Pen V amidasa 50 g/l, codisolvente 10 %, pH 7, temperatura ambiente, 24 h.
b. La conversion podria sobreestimarse.
Se llevaron a cabo multiples experimentos con distintas concentraciones de heptano con distinto pH y temperaturas para evaluar el efecto de la hidrolisis catalizada por Pen V amidasa del ester de dimetilo (±)-(2). Consideranro tanto la actividad enzimatica como la enantioselectividad, las mejores condiciones se determinaron que eran: tampon acuoso, pH de 6,5 a 7 con aproximadamente un 20 % de volumen de heptanos a 28-32 °C.
Hidrolisis enzimatica del ester de dimetilo (±)-(2) para preparar cis-(1S,2S)-(6a)
La reaccion se llevo a cabo en un matraz de 500 ml revestido sobre un STAT de pH para mantener la temperatura a 32 °C y pH 7,0 mediante adicion automatica de 1 M de NaOH acuoso. Al matraz se cargaron 30 g de Pen V amidasa, 240 ml de 0,1 M de tampon de fosfato pH 7,0 y 60 ml de heptano. Con agitacion, se anadio el ester de dimetilo (±)-(2) (6,47 g). Despues de 22 h, el analisis de una muestra mostro una conversion del 48 %. El consumo de NaOH tambien indico la finalizacion de la reaccion. La mezcla de reaccion completa se ajusto a un pH 8,0 con 1 M de NaOH y se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). La fase organica combinada se lavo con 0,1 M de tampon de fosfato, pH 8,0 (200 ml) y agua (200 ml). La retiracion de disolvente proporciono 3,1 g del ester de dimetilo restante (2R)-(2b), rendimiento aislados del 48 %, AP 98, [a]D 34,15 (c 1,95, CHCb). RMN (CDCb) 1H 55,38-5,49 (m, 1H), 5,30 (dd, J= 17,0, 1,8 Hz, 1H), 5,15 (dd, J= 10,0, 1,8 Hz, 1H), 3,75 (s, 6H), 2,60 (m, 1H), 1,73 (dd, J= 7,5; 4,9 Hz, 1H), 1,59 (dd, J=9,0, 4,9 Hz, 1H) ppm. 13C 5169,59, 167,37, 132,74, 118,29, 52,33 (2C), 35,42, 31,04, 20,20 ppm.
La fase acuosa (pH 8,0) se acidifico a pH 2 con 6 N de HCI inmediatamente despues de la extraccion del diester sin reaccionar restante. La extraccion de la fase acuosa acidificada con acetato de etilo (3 x 200 ml) de retiracion con disolvente proporciono el monoacido de cis-(1 S,2S)-(6a) deseado, 2,5 g, rendimiento aislado del 42 %, AP 97, de del 99 % y ee del 95 %, [a]D - 8,28 (c 1,63, CHCb). RMN (CDCb) 1H 5 10,5 (amplio, 1H), 5,6 (m, 1h), 5,39 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 2,73 (m, 1H), 2,0 (m, 2H) ppm. RMN 13C 5 171,99, 170,29, 131,99, 119,56, 52,49, 35,53, 33,86, 21,86 ppm.
Hidrolisis no enzimatica para determinar el ee de (2R)-(2b)
Se enfrio una solucion de (2R)-(2b) (840 mg, 4,6 mmol) obtenida a partir del experimento de hidrolisis enzimatica descrito anteriormente en 5 ml de MeOH en un bano de hielo. Con agitacion, se anadieron 330 mg de KOH (5,9 mmol) en tres partes en 10 min. Despues de 5 h, la mezcla de reaccion se concentro, se mezclo con 10 ml de agua, se extrajo con acetato de etilo (3x10 ml). La fase acuosa se acidifico a pH 4,5 con 1 M de HCI y se extrajo con acetato de etilo (2x10). La retiracion con disolvente del extracto organico acidico proporciono 272 mg de la mezcla de monoacido. El AP total de 98 y de del 85 % se determinaron mediante el metodo 1 de HPLC aquiral. El ee de cis-(1R,2R)-(6b) obtenido se determino que era del 82 % mediante el metodo 4 de HPLC quiral.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la preparacion de un compuesto de formula (II)
Figure imgf000011_0001
en donde
R1 es alquilo; y
R2 se selecciona entre alquenilo y alquilo;
comprendiendo el proceso:
hacer reaccionar un compuesto de formula (I)
Figure imgf000011_0002
con la enzima de Penicillina V amidohidrolasa de Fusarium oxysporum.
2. El proceso de la reivindicacion 1 en donde la Penicilina V amidohidrolasa de la enzima de Fusarium oxysporum se obtiene a partir de un organismo recombinante que contiene el gen de la Penicilina V amidohidrolasa de Fusarium oxysporum.
3. El proceso de la reivindicacion 1 en donde R1 es alquilo, en donde el alquilo se selecciona entre metilo, etilo, propilo y butilo.
4. El proceso de la reivindicacion 1 donde R2 es alquenilo C2.
5. El proceso de la reivindicacion 1 donde el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso diastereomerico igual a o superior al 90 %.
6. El proceso de la reivindicacion 1 donde el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso diastereomerico del 95 % o superior.
7. El proceso de la reivindicacion 1 donde el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso enantiomerico de mas del 70 %.
8. El proceso de la reivindicacion 1 donde el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso enantiomerico del 90 % y superior.
9. El proceso de la reivindicacion 1 donde el compuesto de formula (II) se obtiene con un exceso enantiomerico del 95 % y superior.
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