ES2714324T3 - Un método para identificar o producir un aptámero - Google Patents

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Felix Friedrich
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Abstract

Un metodo para identificar o producir un aptamero, que comprende los pasos de: (a) Preparar una mezcla candidata de acidos nucleicos, en donde la mezcla comprende al menos un nucleotido que esta modificado para comprender una funcionalizacion introducida mediante quimica clic, en donde el nucleotido modificado comprende una nucleobase modificada con alquino que se modifica adicionalmente a traves de una cicloadicion 1,3-dipolar de una azida para producir una nucleobase modificada con azida-alquino, en donde la azida comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion; (b) Poner en contacto la mezcla candidata con una muestra diana; (c) Separar los acidos nucleicos que se unen a la muestra diana de aquellos que no se unen; (d) Amplificar los acidos nucleicos de union para producir una poblacion de acidos nucleicos que se unen a la muestra diana, identificando o produciendo, de este modo, un aptamero.

Description

DESCRIPCION
Un metodo para identificar o producir un aptamero
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a los campos tecnicos de las tecnicas para producir oligonucleotidos que se unen espedficamente a una diana. La presente invencion se refiere a un metodo para identificar o producir un aptamero.
Antecedentes de la invencion
La evolucion sistematica de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX, de sus siglas en ingles), tambien conocida como seleccion in vitro o evolucion in vitro, es una tecnica para producir oligonucleotidos de ADN o ARN monocatenario que se unen espedficamente a un ligando diana. El metodo SELEX se describe, por ejemplo, en el documento US 5270163. En el metodo SELEX, una mezcla candidata de acidos nucleicos monocatenarios que tienen regiones de secuencia aleatoria se pone en contacto con una estructura diana y se seleccionan y amplifican aquellos acidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada con la diana. Despues de varias iteraciones, se obtiene un acido nucleico con buena afinidad con la diana.
Philipp M. E. Gramlich et al. describe en Angew. Chem. Int. Ed. 2008, vol. 47, n.° 18, paginas 3442-3444 reacciones de clic para modificacion simple a triple del ADN. Anthony D Keefe y Sharon T Cload describen en Current Opinion in Chemical Biology, vol. 12, n.° 4, 2008, paginas 448-456 "SELEX con nucleotidos modificados".
Muchas dianas no pueden abordarse con los enfoques SELEX tradicionales. Una razon es la limitada diversidad quimica de los acidos nucleicos. El uso de acidos nucleicos modificados quimicamente puede resolver este problema. Sin embargo, los nucleotidos-trifosfatos modificados quimicamente a menudo carecen de compatibilidad con los pasos enzimaticos, por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, de sus siglas en ingles), del proceso de seleccion in vitro. Por lo tanto, las posibles modificaciones quimicas de las moleculas de ADN adecuadas para la seleccion in vitro son limitadas. Desde un punto de vista practico, el uso de tales modificaciones no es facil de lograr ya que la mayoria de ellas no son accesibles comercialmente y, por lo tanto, requieren una síntesis quimica laboriosa antes del uso.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo que permita la introduccion de entidades quimicas adicionales en el ADN durante el proceso de seleccion.
Sumario de la invencion
Se proporciona un metodo para identificar o producir un aptamero que comprende los pasos de:
(a) Preparar una mezcla candidata de acidos nucleicos, en donde la mezcla comprende al menos un nucleotido que se modifica para comprender una funcionalizacion introducida mediante quimica clic, en donde el nucleotido modificado comprende una nucleobase modificada con alquino que se modifica adicionalmente a traves de una cicloadicion 1,3-dipolar de una azida para producir una nucleobase modificada con azida-alquino, en donde la azida comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion;
(b) Poner en contacto la mezcla candidata con una muestra diana;
(c) Particion de acidos nucleicos que se unen a la muestra diana de aquellos que no se unen;
(d) Amplificar los acidos nucleicos de union para producir una poblacion de acidos nucleicos que se unen a la muestra diana, identificando o produciendo, de este modo, un aptamero.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el metodo permite introducir entidades quimicas adicionales en el ADN durante el proceso de seleccion. Ventajosamente, la modificacion solo esta presente de forma transitoria durante el ciclo de seleccion. Esto permite un alto grado de compatibilidad con el paso enzimatico del proceso de seleccion. Este enfoque permite ademas introducir entidades quimicas mas grandes en bibliotecas de ADN que no se pueden utilizar usando los metodos del estado de la materia. El metodo tiene una amplia aceptacion de diversos sustratos de azida, que estan disponibles comercialmente o son accesibles mediante síntesis quimica.
El metodo puede comprender ademas desplazar una cadena de al menos un acido nucleico amplificado en el paso (d), y modificar adicionalmente el acido nucleico para introducir otra funcionalizacion.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un reactivo que comprende un ligando de acido nucleico capaz de unirse a una muestra diana, en donde el ligando de acido nucleico comprende al menos una nucleobase modificada para contener un grupo quimico azida-alquino, en donde el grupo quimico azida-alquino comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion.
Otras caracteristicas y ventajas de la presente invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion y de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una cicloadicion 1,3-dipolar catalizada por Cu(I) de una azida con una desoxitimidina modificada con 5-C8-alquino.
La Figura 2 muestra una representacion esquematica de una realizacion del metodo.
La Figura 3 muestra una realizacion de una modificacion fotosensible de un grupo quimico azida-alquino.
La Figura 4 muestra un diagrama de los resultados de una realizacion del metodo dirigido a la MAP-cinasa ERK y que emplea una modificacion del indol NPE fotosensible.
Perfil de interaction de una biblioteca de inicio (barras blancas) y las bibliotecas enriquecidas obtenidas a partir de los ciclos de selection 8 (barras grises) y 10 (barras negras). Las moleculas de ADN se marcaron radiactivamente con 32P en el extremo 5' y se incubaron con Erk acoplada a particulas magneticas. Como control, se utilizaron particulas magneticas no derivadas (perlas vacias). No se detecto union de las bibliotecas de inicio o de la ronda 10 a las perlas vacias. A su vez, la ronda 10 mostro una union mas fuerte a las perlas de Erk en comparacion con la biblioteca de inicio, pero solo su version pulsada. Esto se refleja en la mayor cantidad de ADN que se podria eluir de las perlas. La fotoescision de la modificacion (10° ciclo escindido) dio como resultado una perdida de union.
La Figura 5 muestra un electroferograma de una serie representativa de rondas 1 a 3 de acuerdo con una realizacion del metodo dirigido a la Proteina C Activada (APC, de sus siglas en ingles) Humana. Aunque la concentration de ADN y APC se redujo en un factor de 10, respectivamente, la intensidad maxima que representa el complejo APC/ADN no disminuyo, lo que indica un enriquecimiento de las secuencias de ADN con una afinidad de union mas fuerte a APC.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el termino "aptamero" se refiere a un pequeno oligonucleotido monocatenario que reconoce su diana con alta especificidad y se une a la diana con alta afinidad.
Como se usa en el presente documento, el termino "alquino" se refiere a una fraccion de carbono insaturado que tiene un triple enlace carbono-carbono entre dos atomos de carbono.
Como se usa en el presente documento, el termino "azida" se refiere a un grupo funcional RN3. El grupo R se refiere a una modificacion quimica o entidad quimica adicional que se puede introducir en el ADN. Por ejemplo, el grupo R puede ser una entidad quimica voluminosa fotoescindible.
Como se usa en el presente documento, la expresion "grupo quimico de azida-alquino" se refiere a un producto de reaction de un alquino y una azida. La reaction puede ser una cicloadicion 1,3-dipolar de la azida con el alquino. Mediante la cicloadicion 1,3-dipolar de una azida con un alquino, el enlace de azida-alquino puede ser un enlace triazol.
Como se usa en el presente documento, la expresion "quimica clic" se refiere a reacciones bioortogonales conocidas por los expertos en la materia. La expresion "quimica clic" puede referirse a una cicloadicion 1,3-dipolar. Un ejemplo de la quimica clic es la cicloadicion 1,3-dipolar de una azida a un alquino, por ejemplo, utilizando la cicloadicion 1,3-dipolar catalizada por Cu(I) de una azida con un alquino (CuAAC), o la cicloadicion de azida-alquino promovida por cepas libres de cobre (SPAAC).
Como se usa en el presente documento, la expresion "mezcla candidata" se refiere a una mezcla de acidos nucleicos de diferente secuencia, de la cual se selecciona un ligando deseado. La fuente de una mezcla candidata puede ser de acidos nucleicos o fragmentos de los mismos de origen natural, acidos nucleicos sintetizados quimicamente, acidos nucleicos sintetizados enzimaticamente o acidos nucleicos preparados mediante una combinacion de las tecnicas anteriores.
Como se usa en el presente documento, el termino "ligando" se refiere a un acido nucleico que se une a otra molecula, por ejemplo, la diana. En una mezcla de acidos nucleicos candidatos, un ligando se une con mayor afinidad que a de la mezcla en masa. Una mezcla candidata puede comprender mas de un ligando para una diana dada. Los ligandos pueden diferir entre si en sus afinidades de union para la diana.
Como se usa en el presente documento, el termino "nucleobase" se refiere a los compuestos biologicos que contienen nitrogeno que se encuentran dentro de los nucleotidos de ADN y ARN y los nucleotidos, generalmente denominados bases. Las nucleobases primarias son citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) y uracilo (U). Como se usa en el presente documento, el termino "nucleotido" se refiere a los bloques de construccion basicos de acidos nucleicos que comprenden o consisten en una nucleobase unida, ribosa o desoxirribosa, y al menos un grupo fosfato.
Si no se indica de otra manera, la expresion "acido nucleico" se refiere a un acido ribonucleico o un acido desoxirribonucleico, monocatenario o bicatenario. El aptamero de acuerdo con la invencion, por lo tanto, se puede proporcionar en forma de una molecula de ADN o ARN monocatenaria.
Como se usa en el presente documento, la expresion "muestra diana" se refiere a cualquier compuesto de interes para el que se desea un aptamero. Una muestra puede ser cualquier material, que probablemente contenga una diana a determinar, incluyendo cualquier muestra liquida o fluida o material solido, incluida una muestra procedente de una fuente biologica. El termino muestra se refiere a polipeptidos, peptidos o pequenas moleculas organicas. El termino muestra tambien se refiere a material biologico, por ejemplo, celulas, organulos celulares o tejidos, o extractos de cualquiera de los anteriores, fluidos biologicos, moleculas biologicas o sobrenadantes.
Como se usa en el presente documento, el termino "amplificacion" se refiere a cualquier proceso o combinacion de pasos de procesos que aumenta la cantidad o el numero de copias de una molecula, tal como un acido nucleico. La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es un metodo a modo de ejemplo para la amplificacion de acidos nucleicos.
Como se usa en el presente documento, el termino "particion" se refiere a cualquier proceso mediante el cual los aptameros unidos a la muestra diana se pueden separar de los acidos nucleicos no unidos a la diana. La particion, por ejemplo, se puede lograr mediante la inmovilizacion de los acidos nucleicos unidos a la diana en perlas magneticas o mediante electroforesis capilar de los acidos nucleicos unidos contra la diana. La eleccion del metodo de particion dependera de las propiedades de la muestra diana y de los acidos nucleicos que se unen a la muestra diana y se puede realizar de acuerdo con los principios y propiedades conocidos por los expertos en la materia. Salvo que se defina de otro modo, los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion.
Deberia observarse que, tal y como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referentes plurales salvo que el contenido indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a una composicion que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o mas compuestos. Tambien se debe tener en cuenta que el termino "o" se emplea generalmente en su sentido incluyendo "y/o" a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
Descripcion detallada de la invencion
De acuerdo con la invencion, se proporciona un metodo para identificar o producir un aptamero que comprende los pasos de:
(a) Preparar una mezcla candidata de acidos nucleicos, en donde la mezcla comprende al menos un nucleotido que se modifica para comprender una funcionalizacion introducida mediante quimica clic, en donde el nucleotido modificado comprende una nucleobase modificada con alquino que se modifica adicionalmente a traves de una cicloadicion 1,3-dipolar de una azida para producir una nucleobase modificada con azida-alquino, en donde la azida comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion;
(b) Poner en contacto la mezcla candidata con una muestra diana;
(c) Particion de acidos nucleicos que se unen a la muestra diana de aquellos que no se unen;
(d) Amplificar los acidos nucleicos de union para producir una poblacion de acidos nucleicos que se unen a la muestra diana, identificando o produciendo, de este modo, un aptamero.
El metodo permite la introduccion de entidades quimicas adicionales en el ADN durante el proceso de seleccion. Ventajosamente, la modificacion solo esta presente de forma transitoria durante el ciclo de seleccion. Esto permite un alto grado de compatibilidad con el paso enzimatico del proceso de seleccion. Este enfoque permite ademas introducir entidades quimicas mas grandes en bibliotecas de ADN que no se pueden utilizar usando los metodos conocidos. El metodo tiene una amplia aceptacion de diversos sustratos de azida, que estan disponibles comercialmente o son accesibles mediante síntesis quimica.
En una realization, el metodo comprende ademas desplazar una cadena de al menos un acido nucleico amplificado en el paso (d), y modificar adicionalmente el acido nucleico para introducir otra funcionalizacion.
Una biblioteca de ADN modificada para comprender una funcionalizacion, por ejemplo, un grupo qmmico azidaalquino, se puede incubar con una molecula diana. Despues de la incubacion, las secuencias no unidas se eliminaran y las moleculas unidas se recuperaran y amplificaran mediante PCR. El metodo de desplazamiento de una cadena del acido nucleico se puede hacer de acuerdo con los principios y propiedades conocidos por los expertos en la materia. El ADN monocatenario se puede lograr mediante la digestion selectiva con exonucleasa lambda de una cadena. El ADN resultante se puede modificar nuevamente mediante la reintroduccion de la modificacion quimica. Esta biblioteca se puede someter nuevamente a un ciclo de seleccion in vitro hasta que se pueda detectar un enriquecimiento de las secuencias de union a la diana.
En un primer ciclo SELEX, en el paso (a) se puede proporcionar una mezcla candidata de acidos nucleicos que se prepara mediante síntesis quimica. Cuando se desplaza una cadena de al menos un acido nucleico amplificado en el paso (d), y se modifica adicionalmente el acido nucleico para introducir otra funcionalizacion, por ejemplo, un grupo quimico azida-alquino, en los ciclos siguientes, las mezclas candidatas se pueden preparar de forma semienzimatica.
En particular, la quimica clic sobre la base de las cicloadiciones 1,3 dipolares se puede utilizar en sistemas biologicos acuosos para introducir entidades quimicas. Se han identificado varios tipos de reacciones que se pueden utilizar para la quimica clic a traves de la cicloadicion 1,3-dipolar. La cicloadicion 1,3-dipolar de una azida a un alquino ha demostrado ser particularmente util. Ademas, la modificacion de la nucleobase ha demostrado ser util en el metodo. Por lo tanto, en una realizacion, la mezcla candidata comprende al menos una nucleobase que se modifica para comprender un grupo quimico azida-alquino.
En una realizacion, el paso de amplificacion (d) emplea una reaccion en cadena de la polimerasa utilizando una nucleobase modificada con alquino que se modifica adicionalmente a traves de la cicloadicion 1,3-dipolar de una azida para producir una nucleobase modificada con azida-alquino.
Los acidos nucleicos de la mezcla candidata pueden ser ADN monocatenario. La introduccion de entidades quimicas adicionales en el ADN durante el proceso de seleccion se puede lograr utilizando una nucleobase modificada con 5 alquinos, por ejemplo, timina. Los nucleotidos-trifosfatos modificados con 5-C8-alquino, por ejemplo, desoxitimidinas, estan disponibles comercialmente o se pueden sintetizar. Dichas nucleobases modificadas con 5-C8-alquino, por ejemplo, desoxitimidinas, se pueden introducir en el ADN mediante PCR. La modificacion se puede derivar adicionalmente con la llamada quimica bioortogonal, por ejemplo, utilizando la cicloadicion 1,3-dipolar catalizada por Cu(I) de las azidas respectivas con el alquino. Ademas de la cicloadicion de azida-alquino catalizada por Cu(I) (CuAAC), tambien se pueden usar reacciones de cicloadicion de azida-alquino promovidas por cepas libres de cobre (SPAAC). En aplicaciones en sistemas celulares o vivos, la cicloadicion de azida-alquino promovida por cepas puede superar los problemas de toxicidad asociados con el uso de Cu(I).
Las bibliotecas de ADN que se modifican de esta manera se pueden emplear para fines de seleccion in vitro. Por lo tanto, esta reaccion permite introducir modificaciones quimicas en el a Dn aplicable en SELEX. De este modo, se puede mejorar la diversidad quimica de las bibliotecas de ADN.
En la presente invencion, la azida se modifica con una molecula fotosensible. El uso de modificaciones fotosensibles mejora aun mas el enfoque hacia los restos voluminosos que se introduciran y utilizaran en el proceso de seleccion. Tambien permite la seleccion directa de aptameros fotosensibles. Esto permite el desarrollo de protocolos de seleccion completamente nuevos.
La molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion mediante PCR. Ademas, comprende una fraccion fotoescindible, y la escision del grupo voluminoso se puede iniciar mediante irradiacion, por ejemplo con luz ultravioleta, y la molecula modificada con azida-alquino mas pequena restante puede estar disponible para la PCR.
El metodo se puede aplicar a una amplia variedad de muestras diana. Esto permite una amplia diversidad de muestras que incluyen estructuras biologicas. En una realizacion, la muestra diana se selecciona del grupo que consiste en un polipeptido, peptido, celula, fragmento celular, membrana celular, molecula organica pequena, muestra de fluido biologico y una combination de los mismos. En especial, el metodo no se limita a muestras purificadas, de polipeptidos, peptidos o pequenas moleculas organicas, sino que se extiende a contextos biologicos altamente complejos tales como muestras de fluidos biologicos o incluso directamente en las membranas de las celulas.
Otro aspecto, la invencion se refiere un reactivo que comprende un ligando de acido nucleico capaz de unirse a una muestra diana, en donde el ligando de acido nucleico comprende al menos una nucleobase modificada para contener un grupo quimico azida-alquino, en donde el grupo quimico azida-alquino comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion.
La nucleobase modificada, por ejemplo, puede ser la timina. La modificacion se puede lograr mediante la utilizacion de una desoxitimidina modificada con 5-C8-alquino que se puede introducir en el ADN mediante PCR. La modificacion se puede derivar adicionalmente con la llamada quimica bioortogonal, por ejemplo, utilizando la cicloadicion 1,3-dipolar catalizada por Cu(I) de una azida respectiva con el alquino.
En la presente invencion, el grupo quimico azida-alquino comprende una molecula fotosensible. La molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion mediante PCR del ligando de acido nucleico. Tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion con luz ultravioleta, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion.
La invencion se explicara con mas detalle en virtud de los ejemplos que se exponen a continuacion. Si bien se presenta al menos una realizacion a modo de ejemplo, debe apreciarse que existe un gran numero de variaciones. Tambien debe apreciarse que las realizaciones a modo de ejemplo son solo ejemplos, y no pretenden limitar el alcance, aplicabilidad o configuracion de ninguna manera. Mas bien, la descripcion anterior proporcionara a los expertos habituales en la materia las caracteristicas esenciales de esta invencion para implementar al menos una realizacion a modo de ejemplo, entendiendose que pueden realizarse diversos cambios sin apartarse del alcance como se establece en las reivindicaciones adjuntas.
La figura 1 muestra una desoxitimidina modificada con 5-C8-alquino que se introduce en el ADN mediante PCR. Esta modificacion se puede derivar adicionalmente utilizando la cicloadicion 1,3-dipolar catalizada por Cu(I) de una azida R1N3.
La figura 2 muestra una representacion esquematica de una realizacion del metodo. Una biblioteca de ADN modificada para comprender un grupo azida-alquino se incuba con una molecula diana. Despues de la incubacion, las secuencias no unidas se eliminan y las moleculas unidas se recuperan. La molecula seleccionada se amplifica mediante PCR, utilizando una nucleobase modificada con alquino. El desplazamiento de una sola hebra se logra mediante la digestion selectiva con exonucleasa lambda de una hebra. El ADN resultante se modifica luego de nuevo mediante la cicloadicion 1,3-dipolar de una azida RN3, reintroduciendo, de este modo, la modificacion quimica de un grupo azida-alquino. Esta biblioteca se somete nuevamente a un ciclo de seleccion in vitro hasta que se pueda detectar un enriquecimiento de las secuencias de union a la diana.
La figura 3 muestra una modificacion fotosensible. El grupo azida-alquino tiene una molecula fotosensible que se introduce a traves del grupo R de la azida. La molecula voluminosa inhibe la amplificacion mediante PCR. La irradiacion con luz ultravioleta escinde una fraccion fotoescindible, y la molecula restante permite la amplificacion mediante PCR.
Ejemplos
Material
Acidos nucleicos:
nombre especificacion proveedor Biblioteca (FT2-N42): CAC GAC GCA AGG GAC CAC AGG NNN NNN NNN ATDBio, R.U. NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN CAG CAC GAC ACC GCA GAG GCA; (SEQ ID NO: 1)
N: dA, dC, dG, C8-Alquino-dU (1:1:1:1)
CAC GAC GCA AGG GAC CAC AGG (SEQ ID NO: 2) cebador directo Microsynth AG,
(FT2-F) Suiza Fosfato-TGC CTC TGC GGT GTC GTG CTG (SEQ ID NO: 3) cebador inverso Microsynth AG,
(FT2-R-P) Suiza
Proteinas:
nombre especificacion proveedor N.° de catalogo
ADN polimerasa P w o 2,5 U/|jl Genaxxon, Alemania M3002.0100
A-Exonucleasa 10 U/jl Thermo Scientific EN0562
Proteina C activada humana (APC) Haematologic Technologies HCAPC-080; Lote: CC0405-1.0MG Seroalbumina bovina (BSA) Sigma-Aldrich A9418-10G
Polinucleotido cinasa T4 New England Biolabs M0201L
Productos quimicos:
nombre especificacion proveedor N.° de catalogo Tris(4-(3-hidroxi-propoil)-[1,2,3]triazol-1-ilmetil)amina Baseclick, Alemania BCMI-006-5 (THPTA)
Sulfato de cobre 5-(Octa-1,7-diinil)-5'-0-trifosfato-2'- Sigma-Aldrich 451657-10G desoxiuridina (Alquino-dUTP) Baseclick, Alemania BCT-05-L dNTP Larova, Alemania 250 |jM Solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco Sigma-Aldrich D8662-1L (D-PBS)
ADN de esperma de salmon Life Technologies AM9680 TWEEN® 20 Merck Millipore, Alemania 8170721000 ATP [y-32P]- 3000Ci/mmol 10 mCi/ml_____________ Perkin Elmer BLU002A500UC Diversos:
nombre proveedor N.° de catalogo Dynabeads® His-Tag Isolation & Pulldown Life Technologies 10103D
soporte para DynaMag™-2 magnetic Life Technologies 12321D
Gel NucleoSpin® y limpieza de PCR Macherey-Nagel, Alemania 740609,250 __________________________________ Tampones:__________________________________ nombre especificacion
tampon SELEX 1x D-PBS BSA al 0,1 % esperma de salmon 0,1 mg/ml Tween20 al 0,01 % Tampon B15 Tris 25 mM, NaCl 30 mM, KCl 1 mM, CaCh 1 mM, MgCh 1 mM; pH 8,3
Ejemplo 1
Sintesis de una azida modificada con una molecula fotosensible: 1-[5-(azidometil)-2-nitrofenil] etil-[2-(1 H-indol-3-il)etil]carbamato
Paso 1.1 - Sintesis del cloruro de 2-nitro-5-metil-benzoNo
Se disolvieron 25 g (0,14 mol) de acido 2-nitro-5-metilbenzoico en 200 ml (2,75 mol) de cloruro de tionilo en un matraz para horno. Se anadio una cantidad catalitica de dimetilformamida y la solucion se calento a reflujo durante 3 h en gas inerte. El exceso de cloruro de tionilo se elimino mediante destilacion. El producto se aislo cuantitativamente como un solido marron y se utilizo adicionalmente sin caracterizacion.
Paso 1.2 - Sintesis de 2-nitro-5-metil acetofenona
Se calentaron 3,5 g (0,14 mol) de magnesio, 0,33 ml (3,4 mmol) de tetracloruro de carbono y 3,25 ml (56 mmol) de etanol bajo una atmosfera de argon en un matraz para horno. Despues del inicio de la reaccion, se anadieron gota a gota 130 ml de eter seco. Se anadio una solucion de 22,0 ml (0,14 mol) de dietil malonato en 16,6 ml de eter y 13,3 ml adicionales (0,23 mol) de etanol. Posteriormente, la reaccion se calento a reflujo hasta que se consumio el magnesio. A continuation, se anadio una mezcla de 26 g (0,13 mol) de cloruro de 2-nitro-5-metilbenzoilo del paso 1.1 en 32,5 ml de eter seco. La viscosidad de la solucion aumento. Despues de detener la agitation, se agregaron 9 ml de acido sulfurico en 130 ml de agua. Las fases resultantes se separaron y la fase acuosa se lavo con eter. Las fases organicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio y el disolvente se evaporo. Se obtuvo dietil-5-metil-2-nitrobenzoilo malonato como producto intermedio, y se disolvio en 26 ml de acido acetico puro. Se anadieron 5 ml de acido sulfurico. La solucion se calento a reflujo mientras se observo la formation de gas. A continuacion, la solucion se puso en hielo y se alcalinizo utilizando una solucion de hidroxido de sodio. La fase acuosa se extrajo con eter. Las fases organicas se secaron con sulfato de magnesio, el disolvente se evaporo y el producto bruto se separo mediante cromatografia en columna utilizando una mezcla 15:1 de ciclohexano:acetato de etilo. Se aislaron 18.1 g (77 %) del producto.
Paso 1.3 - Sintesis de 5-(bromometil)-2-nitroacetofenona
Se disolvieron 18,1 g (0,10 mol) de 2-Nitro-5-metil acetofenona del paso 1.2 con 18,9 g (0,11 mol) de N-bromuccinimida y 2,4 g (10 mmol) de peroxido de dibenzoilo en 60 ml de tetra cloruro de carbono y se calentaron a reflujo durante 16 h. Posteriormente, se anadieron 1,21 g (5 mmol) de peroxido de dibenzoilo y la solucion se calento a reflujo durante otras 8 h. La solucion de reaccion se filtro luego y el filtrado se concentro al vacio. El residuo se disolvio en acetato de etilo y se extrajo con una solucion saturada de hidrogeno y sodio y una solucion salina. La fase organica se seco con sulfato de magnesio, el disolvente se evaporo y el producto se limpio mediante cromatografia en columna utilizando una mezcla 15:1 de ciclohexano: acetato de etilo. El producto aislado se disolvio en 200 ml de eter y se cubrio con 50 ml de hexano para la cristalizacion para eliminar la contamination con productos y eductos dos veces halogenados. El solido se filtro y se seco al vacio. Se aislaron 9,9 g (41 %) del producto.
Paso 1.4 - Smtesis de 5-azidometil-2-nitroacetofenona
Se disolvieron 7,76 g (30,2 mmol) de 5-(bromometil)-2-nitroacetofenona del paso 1.3 en 84 ml de acetona y 16 ml de agua, y se agregaron 2,95 g (45,3 mmol) de azida sodica. La reaccion se calento a 75 °C y el proceso de reaccion se controlo mediante cromatografia en capa fina. Una vez completada la reaccion, la acetona se elimino al vado y el producto se extrajo con acetato de etilo. La fase organica se lavo con solucion salina, se seco con sulfato de magnesio, el disolvente se evaporo y el residuo se limpio con cromatografia en columna usando un gradiente de ciclohexano:acetato de etilo de 10:1 a 5:1. Se aislaron 4,6 g (69 %) del producto deseado.
Paso 1.5 - Smtesis de 1-[5-azidometil)-2-nitrofenil]etanol
Se disolvieron 4,0 g (18,2 mmol) de 5-azidometil-2-nitro acetofenona del paso 1.4 en una mezcla de 60 ml de metanol seco y 40 ml de dioxano seco. Se anadio 1,0 g (27,2 mmol) de borohidruro de sodio y la mezcla de reaccion se agito en atmosfera gar inerte. El proceso de reaccion se controlo mediante cromatografia de capa fina. Una vez completada la reaccion, se anadieron 160 ml de agua y 6,5 ml de acido clorhidrico 1 M y el producto se extrajo en acetato de etilo. La fase organica se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco con sulfato de magnesio, el disolvente se evaporo y el residuo se limpio con cromatografia en columna usando una mezcla 5:1 de ciclohexano:acetato de etilo. Se aislaron 3,66 g (91 %) del producto.
Paso 1.6 - Smtesis del diester de acido carbonico 1-[5-(azidometil)-2-nitrofenil]etil-W-succinimidil
Se disolvieron 0,65 g (3,0 mmol) de 1-[5-(azidometil)-2-nitrofenil] etanol del paso 1.5 en 6 ml de acetonitrilo seco. Se anadieron 0,70 ml (5,0 mmol) de trietilamina seguidos de 1,53 g (6,0 mmol) de carbonato de W,W'-discuccinimidilo y la solucion se agito en atmosfera gar inerte. El proceso de reaccion se controlo mediante cromatografia de capa fina. Una vez completada la reaccion, se anadieron 10 ml de agua y 0,2 ml de solucion saturada de cloruro de sodio y el producto se extrajo en acetato de etilo. La fase organica se separo, se seco con sulfato de magnesio, se concentro al vado y, finalmente, se aislo el producto con cromatografia en columna utilizando una mezcla 2:1 de ciclohexano:acetato de etilo. Se aislaron 640 mg (80 %) del producto.
Paso 1.7 - Smtesis de 1-[5-(azidometil)-2-nitrofenil]etil-[2-(1H-indol-3-il)etil] carbamato
Se disolvieron 640 mg (1,8 mmol) de diester de acido carbonico 1-[5-(azidometil)-2-nitrofenil]etil-N-succinimidil del paso 1.6 en 11 ml de tetrahidrofurano seco. Posteriormente, se agregaron 0,41 ml (2,9 mmol) de trietilamina y 235 mg (1,47 mmol) de triptamina y la solucion se agito durante 24 h en gas inerte. A continuacion, se anadieron 55 ml de diclorometano y 170 ml de una solucion al 5% de acido clorhidrico, y se extrajo el producto. La fase acuosa se lavo dos veces con diclorometano y las fases organicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio. El disolvente se elimino al vado y el residuo se limpio con cromatografia en columna usando un gradiente de ciclohexano:acetato de etilo de 5:1 a 5:3. Se obtuvieron 520 mg (87 %) del producto. Se disolvieron 30 mg del producto en una solucion de acetonitrilo al 60 % y 40 % de acido trifluoroacetico al 0,1 % y se limpiaron a traves de HPLC en diez ciclos utilizando una columna Nucleosil 100-5 C18 de 250x4,6 mm. El procedimiento comenzo con acetonitrilo al 60 % y 40 % de acido trifluoroacetico al 0,1 % y se enjuago durante 20 minutos a una relacion de 80 %: 20 %. El tiempo de retention del producto 1-[5-(azidometil)-2-nitrofenil]etil-[2-(1H-indol-3-il)etil]carbamato fue de 8,7 minutos.
Ejemplo 2
Smtesis de 3-(2-azidoetil)-1-indol
En una atmosfera de argon, se resolvieron 0,90 g de 3-(2-bromoetil)-1H-indol (4,02 mmol) en 10 ml de DMF seco y se agregaron 0,26 g de azida sodica (4,02 mmol). Despues de 15 horas a 25 °C, la solucion se lavo secuencialmente con agua. Las capas acuosas combinadas se volvieron a extraer con acetato de etilo y las soluciones de acetato de etilo combinadas se secaron con MgSO4 y se concentraron. La cromatografia en columna (acetato de etilo/eter de petroleo 1:9) dio 3-(2-Azidoetil)-1 H-indol como un aceite amarillo. El rendimiento fue de 0,52 g (70 %).
Ejemplo 3
El metodo que se dirige a la proteina cinasa ERK2 activada por mitogenos y que emplea una modification de indol NPE fotosensible
3.1 - Preparation de una mezcla candidata de acidos nucleicos
La biblioteca de inicio de ADN monocatenario que comprende 42 posiciones falsas (FT2-N42: CAC GAC GCA AGG GAC CAC AGG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN CAG CAC GAC ACC GCA GAG GCA; N: dA, dC, dG, C8-Alquino-dU (1:1:1:1)) (SEQ ID NO: 1) se sintetizo y la PAGE se purifico por ATDBio (Southampton, Reino Unido).
La biblioteca se funcionalizo adicionalmente con el indol-NPE-azida fotosensible 1-[5 (azidometil)-2-nitrofenil]etil-[2-(1H-indol-3-il)etil]carbamato preparado de acuerdo con el ejemplo 1 en una cicloadicion de azida-alquino catalizada por Cu(I) (reaccion de CuAAC) como sigue: se mezclaron 150 j l de una solucion de ADN 3,5 |jM con 20 j l de D-PBS y 20 j l de solucion de azida 10 mM y la reaccion se inicio mediante la adicion de 10 j l de solucion de catalizador recien preparada (THPTA 10 mM, CuSO42 mM, ascorbato de sodio 50 mM). La mezcla de reaccion se incubo durante 1 hora a 37 °C, 800 rpm y el ADNmc funcionalizado se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante.
3.2 - Preparacion de la muestra diana
Se inmovilizaron 100 jg de ERK2 recombinante marcada con His6 expresados y purificados (His6-ERK2) (gentilmente proporcionados por Sabine Lennarz, Universidad de Bonn) en perlas magneticas de 5 mg (Dynabeads His-Tag Isolation) en un volumen total de 500 j l de tampon SELEX (1x D-PBS BSA al 0,1 % esperma de salmon 0,1 mg/ml Tween20 al 0,01 %), de acuerdo con la recomendacion del fabricante. Las perlas cargadas de ERK se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior.
3.3 - Puesta en contacto de la mezcla candidata con la muestra diana y particion de los acidos nucleicos que se unen a ERK2 a partir de aquellos que no se unen
Se calentaron 100 j l (aprox. 500 pmol) de la biblioteca de inicio de ADN pulsada y purificada en el paso 3.1 en 1X D-PBS se calentaron a 95 °C durante 3 minutos y luego se dejaron enfriar lentamente a temperatura ambiente. Se agregaron 50 j l (500 jg ) de perlas magneticas no acopladas (en tampon SELEX) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, 800 rpm. El sobrenadante se anadio a 50 j l (500 jg) de suspension de perlas de ERK2 y se incubo durante 30 minutos a 37 °C, 800 rpm. El sobrenadante se descarto y las perlas se lavaron 3 veces durante 30 segundos con 200 j l de tampon SELEX. Se anadieron 100 j l de solucion de imidazol 300 mM y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C, 800 rpm. Este sobrenadante se utilizo para la posterior amplificacion por PCR.
3.4 - Amplificacion de los acidos nucleicos de union
El ADN eluido (biblioteca enriquecida) se dividio en 8 partes alicuotas y la PCR se amplifico de la siguiente manera: Todas las reacciones de PCR se realizaron en 100 j l de volumen de reaccion de acuerdo con el siguiente esquema de pipeteo y ciclo de la tabla 1 en un termociclador Mastercycler® Personal (Eppendorf). Las muestras se sometieron a un ciclo hasta que se pudo detectar la banda del producto deseado en un gel de agarosa al 4 % tenido con bromuro de etidio.
Tabla 1:
Reactivo Concentration madre Concentracion final
Agua
solucion de ADN
Tampon PWO 10X 1X
dN*TPs 25 mM 250 jM
Cebador D 50 jM 0,5 jM
Cebador I 50 jM 0,5 jM
PWO-Pol. 2,5 U/jl 2,5 U
dN*TPs: dATP / dCTP / dGTP / C8-alquino-dUTP
El esquema de ciclos fue el siguiente: 2 min a 95 °C, seguido de 30 segundos a 95 °C / 30 segundos a 62 °C / 1 minuto a 72 °C durante X ciclos, almacenamiento a 4 °C.
Los productos de PCR de ADNbc se purificaron con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y como respaldo de esta ronda SELEX, se almaceno el 10 % del ADNbc purificado a -20 °C.
3.5 - Desplazamiento de una sola hebra
El producto de PCR de ADNbc purificado se complemento con 40 j l de 10X de tampon de reaccion de exonucleasa y se agregaron 8 j l de exonucleasa lambda. La mezcla se incubo durante 60 min a 37 °C, 800 rpm y el producto de digestion con ADNmc se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante
3.6 - Funcionalizacion de la biblioteca enriquecida
Para la siguiente ronda SELEX, la biblioteca monocatenaria enriquecida se funcionalizo nuevamente con la Indol-NPE-Azida fotosensible en una reaccion de CuAAC de la siguiente manera: se mezclaron 150 j l de una solucion de ADN con 20 |jl de D-PBS y 20 |jl de solucion de azida 10 mM y la reaccion se inicio mediante la adicion de 10 |jl de solucion de catalizador recien preparada (THPTA 10 mM, CuSO42 mM, ascorbato de sodio 50 mM). La mezcla de reaccion se incubo durante 1 hora a 37 °C, 800 rpm y el ADNmc funcionalizado se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante.
3.7 - 2a a 10a ronda SELEX
Se agregaron 10 j l de 10X D-PBS a 90 j l de la biblioteca de ADN enriquecida pulsada (aprox. 50 pmol) y se realizo la siguiente ronda SELEX como se describe para la primera ronda. En total se realizaron 10 rondas SELEX. Para aumentar la presion de seleccion, se redujo la cantidad de perlas funcionalizadas con ERK2 y se aumentaron los tiempos de lavado como se resume en la siguiente tabla 2:
Tabla 2:
Figure imgf000010_0001
3.8 - Ensayo de union radioactiva
La biblioteca enriquecida de la 8a y 10a ronda SELEX, asi como la biblioteca de inicio, se marcaron radiactivamente y se funcionalizaron con indol-NPE-azida de la siguiente manera: se mezclaron 41 j l de ADNmc purificado con 5 j l de tampon de reaccion 10 X T4 PNK, 2 j l de T4 PNK y 2 j l de ATP y 32P y la mezcla se incubo durante 1 hora a 37 °C. El ADN marcado radiactivo se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR kit de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Como control, una muestra de la biblioteca de la 10a ronda pulsada se irradio con luz ultravioleta (360 nm) durante 5 minutos con el fin de dividir la fraccion NPE fotosensible.
Se simulo una ronda SELEX (sin seleccion negativa) recolectando todas las fracciones (biblioteca residual / Lavado 1/2/3 / Eluido / Perlas). Todas las muestras se llenaron con agua hasta 1 ml y se midio la radioactividad (radiacion de Cherenkov) durante 3 minutos en un contador de centelleo (winSpectral 1414; Perkin Elmer).
La Figura 4 muestra un diagrama de los resultados dirigidos a la MAP cinasa ERK. La Figura 4 muestra el perfil de interaccion de una biblioteca de inicio, dado como barras blancas, y las bibliotecas enriquecidas obtenidas de los ciclos de seleccion 8, como barras grises y 10, como barras negras. Como control, se utilizaron particulas magneticas no derivadas (perlas vacias). Como se puede tomar de la figura 4, no se detecto union de las bibliotecas de inicio o de la ronda 10 a las perlas vacias. A su vez, la ronda 10 mostro una union mas fuerte a las perlas de Erk en comparacion con la biblioteca de inicio, pero solo es a traves de la version modificada de quimica clic. Esto se reflejo en la mayor cantidad de ADN que se podria eluir de las perlas. La fotoescision de la modificacion (10° ciclo escindido) dio como resultado una perdida de union. Este resultado demuestra que los acidos nucleicos que se unen a la diana ERK se identificaron con exito.
Ejemplo 4
El metodo dirigido a la proteina C activada (APC) humana
4.1 Preparacion de una mezcla candidata de acidos nucleicos
La biblioteca de inicio de ADN monocatenario que comprende 42 posiciones falsas (FT2-N42: CAC GAC GCA AGG GAC CAC AGG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN CAG CAC GAC ACC GCA GAG GCA; N: dA, dC, dG, C8-Alquino-dU (1:1:1:1)) (SEQ ID NO: 1) se sintetizo y la PAGE se purifico por ATDBio (Southampton, Reino Unido).
La biblioteca se funcionalizo adicionalmente con el indol-azida preparado de acuerdo con el ejemplo 2 en una cicloadicion de azida-alquino catalizada por Cu(I) (reaccion de CuAAC) como sigue: se mezclaron 150 j l de una solucion de ADN 3,5 jM con 20 j l de D-PBS y 20 j l de solucion de azida 10 mM y la reaccion se inicio mediante la adicion de 10 j l de solucion de catalizador recien preparada (THPTA 10 mM, CuSO42 mM, ascorbato de sodio 50 mM). La mezcla de reaccion se incubo durante 1 hora a 37 °C, 800 rpm y el ADNmc funcionalizado se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante.
4.2 Puesta en contacto de la mezcla candidata con una muestra diana y particion de los acidos nucleicos que se unen a APC a partir de aquellos que no se unen mediante electroforesis capilar
Se calentaron 100 |jl (aprox. 500 pmol) de la biblioteca de inicio de ADN purificados y pulsados en tampon 1X B15 (Tris 25 mM, NaCl 30 mM, KCl 1 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM; pH 8,3) a 95 °C durante 3 min y luego se dejaron enfriar lentamente a temperatura ambiente. La biblioteca de inicio pulsada con indol-azida (concentracion final 3 jM) y APC (concentracion final 3 jM) se incubaron durante 10 minutos en tampon B15 y se realizaron 3 a 20 minutos de separacion de electroforesis capilar como sigue. La biblioteca enriquecida de las 3 operaciones de separacion se recogio en 80 j l de tampon B15 para la posterior amplificacion mediante PCR.
Se utilizo un sistema de electroforesis capilar PA 800 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE.UU.) con software de 32 Karat (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE.UU.) y equipado con un capilar de 50 cm de largo y 50 jm de diametro interno que tiene una longitud de 40 cm al detector. Antes de cada ejecucion de EC, el capilar se enjuago con agua y tampon B15 durante 5 min. El cartucho capilar se mantuvo a 25 °C y la camara de muestra se mantuvo a 20 °C. Se utilizaron campos electricos de 25 kV para impulsar las separaciones por electroforesis. Las muestras (47,5 nl) se inyectaron en el capilar, se llenaron previamente con el tampon de ejecucion B15, mediante un pulso de presion de 5 s x 4 psi. Las muestras se monitorizaron utilizando deteccion UV a 254 nm.
4.3 Amplificacion de los acidos nucleicos de union
La biblioteca enriquecida recibida del paso 4.2 se amplifico mediante PCR de la siguiente manera: Todas las reacciones de PCR se realizaron en 100 j l de volumen de reaccion de acuerdo con el siguiente esquema de pipeteo y ciclo de la tabla 3 en un termociclador Mastercycler® Personal (Eppendorf). Las muestras se sometieron a un ciclo hasta que se pudo detectar la banda del producto deseado en un gel de agarosa al 4 % tenido con bromuro de etidio.
Tabla 3:
Reactivo Concentracion madre Concentracion final
Agua
solucion de ADN
Tampon PWO 10X 1X
dN*TPs 25 mM 250 jM
Cebador D 50 jM 0,5 jM
Cebador I 50 jM 0,5 jM
PWO-Pol. 2,5 U/jl 2,5 U
dN*TPs: dATP / dCTP / dGTP / C8-alquino-dUTP
El esquema de ciclos fue el siguiente: 2 min a 95 °C, seguido de 30 segundos a 95 °C / 30 segundos a 62 °C / 1 minuto a 72 °C durante X ciclos, y almacenamiento a 4 °C.
Los productos de PCR de ADNbc se purificaron con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante. El primer producto de la PCR se dividio en 16 alicuotas y se amplifico la PCR adicionalmente como se describe anteriormente. Como respaldo de esta ronda SELEX, el 10 % del ADNbc purificado se almaceno a -20 °C.
4.4 Desplazamiento de una sola hebra
El producto de PCR de ADNbc purificado se complemento con 40 j l de 10X de tampon de reaccion de exonucleasa y se agregaron 8 j l de exonucleasa lambda. La mezcla se incubo durante 60 min a 37 °C, 800 rpm y el producto de digestion con ADNmc se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante
4.5 Funcionalizacion de la biblioteca enriquecida
Para la siguiente ronda SELEX, la biblioteca monocatenaria enriquecida se funcionalizo nuevamente con Indol-Azida en una reaccion de CuAAC de la siguiente manera: se mezclaron 150 j l de una solucion de ADN con 20 j l de D-PBS y 20 j l de solucion de azida 10 mM y la reaccion se inicio mediante la adicion de 10 j l de solucion de catalizador recien preparada (THPTA 10 mM, CuSO42 mM, ascorbato de sodio 50 mM). La mezcla de reaccion se incubo durante 1 hora a 37 °C, 800 rpm y el ADNmc funcionalizado se purifico con el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR de acuerdo con la recomendacion del fabricante.
4.62a a 5a ronda SELEX

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para identificar o producir un aptamero, que comprende los pasos de:
(a) Preparar una mezcla candidata de acidos nucleicos, en donde la mezcla comprende al menos un nucleotido que esta modificado para comprender una funcionalizacion introducida mediante química clic, en donde el nucleotido modificado comprende una nucleobase modificada con alquino que se modifica adicionalmente a traves de una cicloadicion 1,3-dipolar de una azida para producir una nucleobase modificada con azida-alquino, en donde la azida comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion;
(b) Poner en contacto la mezcla candidata con una muestra diana;
(c) Separar los acidos nucleicos que se unen a la muestra diana de aquellos que no se unen;
(d) Amplificar los acidos nucleicos de union para producir una poblacion de acidos nucleicos que se unen a la muestra diana, identificando o produciendo, de este modo, un aptamero.
2. El metodo de la reivindicacion 1 que comprende ademas desplazar una hebra de al menos un acido nucleico amplificado en el paso (d), y modificar adicionalmente el acido nucleico para introducir otra funcionalizacion.
3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el paso de amplificacion (d) emplea una reaccion en cadena de la polimerasa utilizando una nucleobase modificada con alquino que se modifica adicionalmente a traves de una cicloadicion 1,3-dipolar de una azida para producir una nucleobase modificada con azida-alquino.
4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la muestra diana se selecciona del grupo que consiste en un polipeptido, un peptido, una celula, un fragmento celular, una membrana celular, una molecula organica pequena, una muestra de fluido biologico y una combinacion de los mismos.
5. Un reactivo que comprende un ligando de acido nucleico capaz de unirse a una muestra diana, en donde el ligando de acido nucleico comprende al menos una nucleobase modificada para contener un grupo quimico azidaalquino, en donde el grupo quimico azida-alquino comprende una molecula fotosensible, en donde la molecula fotosensible es un grupo voluminoso que inhibe la amplificacion por PCR del ligando de acido nucleico, y en donde la molecula fotosensible comprende una fraccion fotoescindible, en donde tras el inicio de la escision de la fraccion fotoescindible mediante irradiacion, una molecula modificada con azida-alquino mas pequena que queda permite la amplificacion.
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