ES2714531T3 - Composiciones de oligonucleótidos antisentido - Google Patents

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Abstract

Una composición de oligonucleótidos antisentido útil para el suministro de oligonucleótido antisentido en el citosol de una célula, que comprende: un par de oligonucleótidos parcialmente complementarios monocatenarios, en la que los dos oligonucleótidos se hibridan para proporcionar al menos una secuencia antisentido monocatenaria y al menos una secuencia de unión a proteínas bicatenaria; una proteína lanzadera capaz de transportar material genético a través de un poro de una membrana celular, comprendiendo la proteína lanzadera un dominio de unión de ácidos nucleicos que reconoce la secuencia de unión de proteínas bicatenaria y se une no covalentemente a ella, en la que la proteína lanzadera contiene dominio I (LFn) de factor letal (LF) de B. anthracis; y una proteína formadora de poros que es Antígeno Protector PA83 de factor de virulencia de B. anthracis

Description

DESCRIPCION
Composiciones de oligonucleotidos antisentido
La presente divulgacion se refiere a composiciones de oligonucleotidos antisentido (OAS) y en particular a composiciones y procedimientos para el suministro citosolico de oligonucleotidos antisentido (OAS). Los OAS hnbridos, parte monocatenario y parte bicatenario, se proporcionan, mediante la hibridacion para formar una region bicatenaria que puede unirse no covalentemente a regiones de protemas de union de acidos nucleicos. De esta forma, se pueden producir complejos de OAS::protema que facilitan el suministro de ADN antisentido en celulas diana. Tales complejos se pueden usar para regular negativamente la expresion genica en celulas.
Los oligonucleotidos antisentido se han aprobado por la FDA para su uso como antivmcos, para el tratamiento de retinitis mediada por citomegalovirus y colitis ulcerativa cronica (Roehr, 1998; Yacychyn y col., 1998). Los OAS estan comprendidos de segmentos de ADN monocatenario o analogos de los mismos, que se designan para hibridarse a una transcripcion de ARN mensajero (ARNm), derivada de un gen espedfico. Los tnbridos de ARNm::OAS formados de este modo pueden degradarse mediante ARNsa H. En un organismo infectado con un virus, el material genetico del virus entra en las celulas espedficas para replicarse, un procedimiento que requiere la translacion de ARNm espedfico del virus. Tratando una celula infectada con un oligonucleotido antisentido espedfico para ARNm vrnco, es posible evitar la expresion de un gen vrnco diana y bloquear el ciclo de vida vrnco.
Un factor importante en la eficacia del tratamiento de oligonucleotido antisentido es la biodisponibilidad de los oligonucleotidos (Biroccio y col., 2003). La biodisponibilidad puede estar limitada por la incapacidad de oligonucleotidos antisentido de penetrar la membrana plasmatica o el sistema de endomembrana de las celulas. Puesto que las dianas de oligonucleotidos antisentido (por ejemplo, ARNm) estan emplazados dentro del citosol de una celula, los oligonucleotidos necesitan ser capaces de atravesar membranas celulares antes de que puedan acceder al citosol.
Un modo de abordar este problema de acceso citosolico de oligonucleotidos antisentido es administrar el tratamiento localmente en lugar de sistemicamente y, en particular, administrar el oligonucleotido antisentido en un compartimento farmacocinetico separado, aumentando la concentracion local del oligonucleotido antisentido. Por ejemplo, un tratamiento de oligonucleotidos antisentido de retinitis mediada por citomegalovirus implica la administracion de fomivirsen (Vitravene®) en un compartimento farmacocinetico separado mediante inyeccion intravttrea. Sin embargo, el acceso citosolico, es decir, el acceso de los oligonucleotidos antisentido en su ARNm diana, sigue siendo una limitacion sustancial, incluso despues de la administracion intravftrea (Lysik y Wu-Pong, 2003). Otros enfoques con respecto al suministro intracelular de oligonucleotidos antisentido pueden implicar: dano celular mecanico y electrico a la membrana celular, vehnculos polimericos y de lfpidos (conocidos por desestabilidad no espedficamente membranas) o vectores vmcos. Sin embargo, estos enfoques y similares no han demostrado ser seguros o fiables en la clmica y no han dado como resultado (hasta la fecha) ninguna tecnologfa de suministro aprobada para productos antisentido en el mercado.
La presente divulgacion pretende proporcionar composiciones y procedimientos para su uso en un sistema para la regulacion negativa de uno o mas genes dentro de una celula por medio de una novedosa disposicion de una secuencia antisentido activa (por ejemplo, de ADN monocatenario) que flanquea una segunda cadena de oligonucleotidos que se solapa parcialmente que forma un sitio de union que puede unirse a un dominio protemico, de union de acidos nucleicos. Denominamos estos nucleotidos en parte monocatenarios y en parte bicatenarios, "hnbridos de OAS". Inesperadamente, hemos descubierto y hemos demostrado empmcamente (datos no publicados):
1) Que los hnbridos de OAS pueden mostrar un perfil de actividad antisentido equivalente con respecto al oligonucleotido antisentido monocatenario en un ensayo sin celulas, por ejemplo, en una concentracion de OAS de 30 pMol.
2) Que los hnbridos de OAS se unen a un dominio de union de acidos nucleicos (tal como GAL4 de S. cerevisiae) para formar un complejo sin requerir un agarre de afinidad policationico (tal como poli(L-lisina), usada previamente (Gaur y col., 2002; documento WO97/23236)) u otros procedimientos de conjugacion química covalente.
3) Que si, en un complejo hnbrido de OAS (por ejemplo, GAL4::OAS) el dominio de union de acidos nucleicos se fusiona en factor letal atenuado de dominio 1 (de Bacillus anthracis, es decir, LFn), es conjunto supramolecular puede pasar a traves de un poro que deriva de un factor de virulencia bacteriana (PA63 de Bacillus anthracis). Este resulta inesperado pues se informa que el pasaje a traves del poro de PA requiere el desmontaje estructural de la carga (transicion globular fundida) (Zornetta y col., 2010). Para que un complejo supramolecular circule en el citosol a traves del poro PA, la transicion globular fundida de la carga, es decir, una transicion desde una estructura ordenada a un bucle aleatorio, no tiene que tener lugar. De nuevo, esta transicion se ha demostrado sin el uso de un agarre de afinidad policationico (tal como poli(L-lisina) (Gaur y col., 2002: documento WO97/23236)).
Es un objeto particular de la presente divulgacion proporcionar una estrategia de conjugacion para permitir que las composiciones de oligonucleotidos antisentido crucen una membrana celular. De esta forma, se pueden suministrar oligonucleotidos antisentido al citosol de una celula que proporciona acceso directo a dianas de ARN o ADN dentro del citosol (tal como transcripciones de ARNm vmco) mediante la estrategia de conjugacion de antisentido-a-protema descrita.
La invencion a la cual pertenece la presente memoria descriptiva se indica en las reivindicaciones adjuntas a la presente descripcion.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion de oligonucleotidos antisentido que comprende un par de oligonucleotidos antisentido, en la que los dos oligonucleotidos antisentido se hibridan para proporcionar al menos una secuencia antisentido monocatenaria y al menos una secuencia de union a protemas bicatenaria. Preferentemente, la composicion comprende adicionalmente una protema lanzadera (por ejemplo, LFn-GAL4 recombinante), en la que la protema lanzadera comprende un dominio de union de acidos nucleicos (por ejemplo, GAL4) que reconoce la secuencia de union de protemas bicatenaria y en la que la protema lanzadera esta unida no covalentemente al par de oligonucleotidos antisentido.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un sistema de suministro de un oligonucleotido antisentido a traves de una membrana de una celula, comprendiendo el sistema (i) un par de oligonucleotidos antisentido, comprendiendo el par una secuencia de union de protemas bicatenaria (por ejemplo, GAL4) y al menos una secuencia antisentido monocatenaria (como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1) y (ii) una protema lanzadera que tiene un dominio de union de acidos nucleicos que es capaz de reconocer una secuencia espedfica (por ejemplo, CGG-N11CCG) incorporada dentro de la secuencia de acidos nucleicos de union de protema bicatenaria para unir no covalentemente la protema lanzadera al par de oligonucleotidos antisentido.
En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un procedimiento de conjugacion no covalente de un oligonucleotido antisentido a una protema lanzadera (por ejemplo, LFn-GAL4), comprendiendo el procedimiento: (i) proporcionar dos oligonucleotidos antisentido, (ii) hibridar los dos oligonucleotidos antisentido para formar un hnbrido antisentido, en la que el tnbrido antisentido comprende al menos una secuencia antisentido monocatenaria y al menos una secuencia de union a protemas bicatenaria, (iii) proporciona una protema lanzadera que contiene un dominio de union de acidos nucleicos que reconoce una secuencia diana de union de protemas bicatenaria, y (iv) conjugar no covalentemente la protema lanzadera al tnbrido antisentido por medio del dominio de union de acidos nucleicos de la protema y la secuencia de union de protemas del tnbrido antisentido.
El procedimiento de conjugacion y translocacion de membrana no requiere el uso de agentes condensadores de ADN (policationicos o ionicos) (tales como (poli(etilenimina) o poli(L-Lisina)) puesto que estos materiales son a menudo toxicos y se piensa que su toxicidad se debe, en parte, a su tendencia en desestabilizar las membranas celulares (Richardson y col., 1999) (y vease Tabla 1 a continuacion). En el contexto de la presente invencion, una protema lanzadera se define como una protema que es capaz de transportar material genetico a traves de un poro en una membrana celular. El poro puede comprender una protema formadora de poros, tal como PA83 o PA63 de Bacillus anthracis.
Los oligonucleotidos de la divulgacion comprenden secuencias de acido nucleico, que puede ser ADN o analogos de ADN, por ejemplo, analogos sulfonados en los que se sustituyen determinados atomos de oxfgeno por azufre. Otros analogos de ADN que pueden encontrarse adecuados incluyen aquellos que se desvelan por Leumann (2002). Las secuencias pueden adjuntarse directamente entre sf o pueden conectarse mediante una secuencia de ADN que interviene, preferentemente, al menos parcialmente bicatenaria.
En un aspecto preferente de la divulgacion realizada, la protema lanzadera es una protema de toxina atenuada. En particular, la protema lanzadera puede ser dominio I de factor letal (LFn) de B. anthracis.
Preferentemente, en la toxina atenuada, al menos un dominio de toxina, por ejemplo, uno o mas de los dominios II-IV toxicos de la toxina de protema de factor letal de B. anthracis, se sustituye por un dominio de union de acidos nucleicos. Por ejemplo, el dominio de union de acidos nucleicos puede ser GAL4 de Saccharomyces cerevisiae (fusionado con LFn).
Ventajosamente, la composicion de oligonucleotidos antisentido comprende adicionalmente una protema formadora de poros. Preferentemente, la protema formadora de poros es una protema no toxica. Una protema formadora de poros preferente es Antfgeno Protector (PA) de factor de virulencia de B. anthracis. En particular, la protema formadora de poros puede ser PA83 o PA63 de B. anthracis.
En un aspecto (en el caso de dirigirse a sintaxina5 (Syn5) para la regulacion negativa) uno de los oligonucleotidos incluye la secuencia antisentido de extremo 5' AATTTGTTTGTTGAGGCTA 3' (SEQ ID No: 18). Cada miembro del par de oligonucleotidos antisentido comprende una de las dos cadenas complementarias que hibridan para formar la secuencia de union de protemas (vease Figura 1). La secuencia antisentido puede ser corriente abajo (extremo 3') o corriente arriba (extremo 5') de la secuencia de union de protemas (o ambas, si hay mas de una secuencia antisentido en el hnbrido resultante) (vease, Figura 1a).
En una realizacion, la secuencia de union de protemas es CGG-N11-CCG en la que "N" es cualquier nucleotido que comprenda una base de purina o pirimidina. De forma adecuada, la secuencia de union de protemas es 5' CGGCTGCTCTGATGCCG 3' (SEQ ID No: 19).
Ventajosamente, la composicion de oligonucleotidos antisentido comprende pares de oligonucleotidos que hibridan para formar una secuencia de union de protemas que incluye la secuencia: 5' CGGCATCAGAGCAGCCG 3' (SEQ ID No: 20). Ejemplos de tales secuencias son las SEQ ID Nos 9, 11 y 13 que se muestran a continuacion (Ejemplo 4).
En un aspecto, el oligonucleotido comprende adicionalmente una secuencia flanqueantes entre la secuencia de union de protemas y la secuencia antisentido (vease Figura 1a).
Ventajosamente, los oligonucleotidos usados en la presente invencion pueden sulfonarse, aumentando, de este modo, su estabilidad. En oligonucleotidos sulfonados, uno o mas atomos de ox^geno que no se entrecruzan en la cadena de oligonucleotidos se puede sustituir por atomos de azufre. La sulfonacion se puede efectuar mediante diversos procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante el uso del Reactivo de Beucage (3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1,-dioxido) (Cieslak y col., 2005). Otros modos de aumentar la estabilidad de los oligonucleotidos que pueden emplearse en la invencion son: por ejemplo, los que se desvelan en Leumann (2002).
La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento in vitro de regulacion negativa de la expresion de un gen diana en el citosol de una celula suministrando un oligonucleotido antisentido a traves de una membrana de la celula usando una composicion de oligonucleotidos antisentido tal como se ha descrito anteriormente.
Un aspecto alternativo de la presente divulgacion es una composicion de oligonucleotidos antisentido tal como se ha descrito anteriormente para su uso en un procedimiento de regulacion negativa de la expresion de un gen a partir de Virus de Papiloma Humano (VPH) en una celula epitelial cervical humana (vease, Figura 5 y Ejemplo 7).
En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona una composicion de oligonucleotidos antisentido tal como se ha descrito anteriormente como un tratamiento potencial o profilaxis de cancer, en particular, canceres provocados por el virus del papiloma humano (VPH), incluido cancer cervical y canceres orales.
Muchas toxinas vegetales y bacterianas (factores de virulencia) han evolucionado para suministrar una toxina, en la forma de un dominio proteico catalfticamente activo macromolecular, al citosol de una celula. Ejemplos incluyen la toxina del colera (Sandvig y col, 2005), toxina de ricino (Sandvig y col., 2010) y toxina de antrax (Gaur y col., 2002). Estos agentes se conocen por funcionar in vivo, provocando morbidez y mortalidad del ser humano.
Los presentes inventores han preparado una version atenuada del factor letal (LFn) de Bacillus anthracis, en la que los dominios II-IV de tipo silvestre (responsables de la actividad toxica catalftica) se han retirado usando PCR recombinante. Estos dominios (II-IV) se han sustituido posteriores con un dominio de union de acidos nucleicos tal como GAL4 de Saccharomyces cerevisiae. Todo esto se conoce en la tecnica (Gaur y col., 2002). Los inventores han demostrado que GAL4 puede unirse, indirectamente, para activar oligonucleotidos antisentido en condiciones adecuadas, es decir, cuando dos oligonucleotidos adecuados se hibridan juntos para formar un tnbrido que contiene una secuencia antisentido monocatenaria y una secuencia de union de protema bicatenaria (DS). Los inventores han demostrado ademas que el complejo completo (LFn-GAL4::OAS) puede usarse para translocar oligonucleotidos antisentido en el citosol de una celula mediante su interaccion con otra protema, PA83. Significativamente, los procedimientos y materiales empleados por los inventores para generar el complejo oligonucleotido-protema antisentido completo significan que los agentes de condensacion o agarres de afinidad de policationes considerados hasta ahora como necesarios para la formacion de complejos de ADN en la tecnica (tal como poli(L-Lisina) (Gaur y col., 2002; documento WO97/23236), que son toxicos y se conocen por desestabilizar las membranas (Richardson y col., 1999)) no se requieren.
Un aspecto preferente de un sistema de acuerdo con la presente divulgacion proporciona una secuencia de oligonucleotido antisentido monocatenaria de extremo 3' y/o extremo 5' con respecto a una secuencia de union de protemas bicatenaria (DS). Las protemas tales como PFn pueden usarse junto con protemas formadoras de poros, por ejemplo, PA83. PA83 tiene la capacidad de potenciar la translocacion de membrana de LFn. La interaccion entre LFn y pA83 se describe en (Krantz y col., 2005) aunque se ha documentado que requiere la transicion globular fundida de la carga durante la translocacion de poros. Ahora hemos demostrado que es posible usar un conjunto supramolecular como carga y que una secuencia antisentido asociada con ese conjunto supramolecular puede translocarse en el citosol. Esto no podna haberse predicho.
Los inventores han desarrollado adicionalmente el sistema para usar oligonucleotido hibridado que contiene una secuencia de union de LFn-GAL4 bicatenaria y una secuencia antisentido monocatenaria saliente del extremo 3' y/o extremo 5', que han demostrado no ser menos eficaces que la secuencia antisentido (nucleotido monocatenario) sin ninguna secuencia flanqueante en concentraciones de oligonucleotidos antisentido (OAS) por encima de 30 pMol. El complejo desarrollado por los inventores se puede usar como un sistema de conjugacion de oligonucleotidos antisentido para facilitar el suministro citosolico de oligonucleotidos antisentido sin una union covalente entre los oligonucleotidos y la protema de LFn-GAL4. La presente invencion proporciona una herramienta util para la investigacion in vitro asf como una base para una composicion farmaceutica de oligonucleotidos antisentido y una parte importante de la metodologfa de suministro de cualquier terapia antisentido adecuada. En particular, la presente invencion puede formar la base de una composicion antivmca antisentido para el tratamiento de celulas epiteliales cervicales infectadas por UPV.
Se ha demostrado la dimerizacion de la protema de LFn.GAL4 en respuesta a la presencia de una secuencia de acidos nucleicos de reconocimiento de protemas bicatenaria adyacente a la secuencia antisentido usando una difusion de neutrones a bajo angulo (SANS) (vease Ejemplo 5). El Ejemplo 5 muestra que la protema LFn-GAL4 forma complejos de alto peso molecular (radio de giro de protema (Rg) que se expande desde aproximadamente 5 nm a 25 nm) cuando se anaden las composiciones de oligonucleotidos tnbridos de la invencion.
Para someter a ensayo un sistema de tres componentes de acuerdo con la presente invencion, los inventores produjeron inicialmente un prototipo. La capacidad del sistema en regular negativamente genes se evaluo en celulas epiteliales humanas (HeIa). El compuesto de LFn-GAL4::oligonucleotido, cuando se mezclo con PA83 facilita la regulacion negativa del gen espedfico, seleccionado (vease, Ejemplo 6), que se corresponde con la secuencia antisentido. Haciendo referencia al Ejemplo 6, esta ilustra la regulacion negativa de la protema de Sintaxina5 mediante transferencia de Western e inmunodeteccion (Suga y col., 2005). La especificidad genica (as^ como el control del numero celular) se enfatiza adicionalmente normalizando los niveles de expresion genica diana con respecto a los niveles de expresion de un gen "guardian" tal como Derlinal y mediante la inclusion de controles "sin sentido" (vease, Figura 4). Los controles "sin sentido" son controles que incluyen ADN monocatenario que no es complementary a ARN diana en el gen que se expresa y, por consiguiente, no se espera que inhiba su expresion.
Ademas, la actividad antisentido tambien se muestra frente a la expresion del gen de VPH E7 (vease, Ejemplo 7). El VPH E7 es fundamental para la propagacion del ciclo de vida vmco del VPH y es una diana para la intervencion terapeutica (Jonson y col., 2008).
La disposicion de dos cadenas de oligonucleotidos para proporciona una region o secuencia de union de protemas bicatenaria, mientras que deja regiones monocatenarias libres de secuencia que tienen actividad antisentido proporciona un procedimiento de conjugacion conveniente que puede usarse para unir los dominios antisentido a agentes ya descritos en la tecnica (tales como LFn-GAL4 y pA83). Esto facilita el suministro citosolico de los agentes antisentido que pueden medir la regulacion negativa de genes que codifican dianas de farmaco potenciales, por ejemplo VPH E7.
Ahora se describen realizaciones espedficas de la invencion con mas detalles haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 comprende las Figuras 1a a 1e que muestran cinco composiciones distintas de acuerdo con la invencion, que ilustran distintas topologfas para la creacion de un sitio de union de protemas bicatenario a partir de un par de oligonucleotidos antisentido monocatenarios;
La Figura 2 compara la actividad inhibitoria de una composicion de acuerdo con la invencion con otras composiciones antisentido en un ensayo sin celulas.
La Figura 3, mediante el uso de difusion de neutrones a bajo angulo (SANS), muestra que en la presencia de composiciones antisentido de la invencion, LFn-GAL4 dimeriza para formar composiciones de mayor peso molecular.
Las Figuras 4 y 5 ilustran el modo en el que el sistema descrito puede regular negativamente la expresion de dos genes distintos: mediante la regulacion negativa de la expresion de Sintaxina5 se muestra en la Figura 4 y de VPH (serotipo 18) Early (E)7 se muestra en la Figura 5;
La Figura 6 es la secuencia de nucleotidos de LFn-GAL4 (SEQ ID No: 1);
La Figura 7 es la secuencia de protemas de LFn (dominio I de LF) (SEQ ID No: 2);
La Figura 8 es la secuencia de protemas de GAL4 (aminoacidos 1-147) (SEQ ID No: 3);
La Figura 9 es la secuencia de ADN de V5-LFn-GAL4-6His (SEQ ID No: 4);
La Figura 10 es la secuencia de protemas de V5-LFn-GAL4-6His (SEQ ID No: 5);
La Figura 11 es la secuencia de ADN de MRGS-6His-PA83 (SEQ ID No: 6); y
La Figura 12 es la secuencia de protemas de MRGS-6His-pA83 (SEQ ID No: 7).
Ejemplo 1: Formacion de protema lanzadera
Se enriquecio LFn-GAL4 a partir de cultivos de E. coli con un rendimiento de aproximadamente 5 mg/l. La secuencia de ADN que codifica la protema de LFn-GAL4 es SEQ ID No: 4 (Figura 9). Esta secuencia se encuentra dentro del plasmido pET151/D (Invitrogen), un casete de expresion de E.coli.
La secuencia de ADN para LFn (dominio 1 de LF) y GAL4 (aminoacidos 1-147) (conocida en la tecnica - Gaur y col., 2002) se subclono en el casete de expresion bacteriana pET151/D. La adicion de un marcador de epftopo V5 en el extremo N y marcador de afinidad de histidina 6x en el extremo C permitio la rapida inmunodeteccion y purificacion de afinidad, respectivamente, de la protema de fusion del listado bacteriano.
Produccion recombinante de protemas: Se transformaron bacterias químicamente competentes (E.coli BL21*DE3 (Invitrogen)) con plasmido purificado (descrito anteriormente) y se cultivaron durante la noche (10 ml) en triptona de extracto de levadura 2x (2xYT) de cultivo bacteriano, que contema medio de ampicilina (200 pg/ml) antes de su subcultivo en grandes volumenes (1 l) de 2xYT que tambien contema una concentracion similar de ampicilina. A continuacion, se incubaron cultivos bacterianos en un agitar orbital configurado a 180 rpm (a 37 °C) durante 3 horas. Posteriormente, se anadio isopropil p-D-1-tiogalactopirnosida (IPTG) a una concentracion final de 500 pM y se incubo durante 3 horas adicionales. Se prepararon sedimentos bacterianos mediante centrifugacion (6000 xg durante 10 min a 4 °C) y se sometieron a lisis usando prensa francesa configurada a 1.500 PSI. Los lisados bacterianos se sometieron a centrifugacion adicional (20000 xg durante 20 min). El sobrenadante resultante se paso por una columna de cromatograffa de afinidad de 6xHis (resina Co2+ Tallon® (Clontech)). Se eluyo LFn-GAL4 usando 150 mM de imidazol en fracciones de 1 ml. Las fracciones se analizaron para su pureza protema y concentracion, se agruparon y sometieron a dialisis en tampon fosfato salino. La preparacion proteica final se evaluo mediante SDS-PAGE y se sometio a tincion Coomassie (para determinar la pureza proteica) y analisis de transferencia de Western (usando un anticuerpo espedfico a V5 y 6xHis).
Ejemplo 2: Produccion de proteina formadora de poros
Se enriquecio PA83 a partir de cultivos de E. coli BL21*DE3 con un rendimiento de aproximadamente 5 mg/l. Se obtuvo un plasmido que contema la secuencia de ADN conocida que codificaba PA83 como una donacion del Profesor Les Baillie (Universidad de Cardiff). Contema la secuencia codificadora de PA83 subclonada en el vector de expresion bacteriano pQE30 que proporcionada un marcador de afinidad de histidina 6x de extremo N (Baillie y col., 2010). Las bacterias químicamente competentes se transformaron con plasmido purificado y se cultivo durante la noche como anteriormente. Durante la fase de crecimiento, los cultivos bacterianos de 1 l se incubaron cultivos bacterianos en un agitar orbital configurado a 180 rpm (a 37 °C) durante 3 horas. Posteriormente, se anadio (IPTG) a una concentracion final de 500 pM y se incubo durante 2 horas adicionales. Se prepararon sedimentos bacterianos mediante centrifugacion (6000 xg 10 mi) y se sometieron a lisis usando prensa francesa como antes. Los lisados bacterianos se sometieron a centrifugacion adicional (20000 xg durante 20 min). El sobrenadante resultante se paso por una columna de cromatograffa de afinidad de histidina 6x. Se eluyo PA usando 150 mM de imidazol en fracciones de 1 ml. Las fracciones de protemas se analizaron para su pureza y concentracion, se agruparon y se sometieron a dialisis en tampon de fosfato salino (PBS). La preparacion proteica final se evaluo mediante SDS-PAGE y se sometio a tincion Coomassie (para determinar la pureza) y analisis de transferencia de Western (usando un anticuerpo espedfico a PA).
La secuencia de aminoacidos para PA83 se muestra en la SEQ ID No: 7 (Figura 12 -MRGS-6His-protema PA83).
Ejemplo 3: Formacion de oligonucleotido antisentido con region de union de protemas bicatenaria
Se emparejaron dos oligonucleotidos, que codificaba cada uno una cadena de una secuencia de reconocimiento de GAL4, para formar una secuencia de union de protemas bicatenaria (GAL4) con secuencias antisentido monocatenarias flanqueantes. Las composiciones de OAS descritas (SEQ ID Nos: 8 y 9: vease, Ejemplo 4) se usaron en este caso. La composicion resultante se muestra en la Figura 1a. Se llevo a cabo la hibridacion de oligonucleotidos antisentido mediante ciclado termico repetido (10 veces), fusion (1 min a 94 °C) y reemparejamiento (1 min a 55 °C) los dos oligonucleotidos parcialmente solapados, dejando la secuencia de oligonucleotidos antisentido monocatenaria libre para interactuar con ARNm de un modo espedfico a secuencia.
Las Figuras 1a - 1e muestras varios topologfas posibles de la secuencia de union de protemas (DS) de ADN (o analogos de ADN) respecto a la(s) secuencia(s) de acidos nucleicos antisentido usando la estrategia de conjugacion de protema::oligonucleotido que se desvela en el presente documento. La Figura 1a muestra dos secuencias SEQ ID Nos: 8 y 9 orientadas en sentidos opuestos y unidas juntas mediante secciones complementarias - bases 23 a 48 en SEQ ID No: 8 que se unen con las bases 48 a 23 de la SEQ ID No. 9 (SEQ ID No. 9 se muestra el extremo 3' a 5' en la Figura 1a). Los Imbridos de OAS de nuestra invencion pueden o no pueden incluir una secuencia de ADN adicional que flanquea la(s) secuencia(s) antisentido. Como se muestra en las Figuras 1a - 1e, la region bicatenaria (union de protemas) del fnbrido de OAS puede formarse en una cantidad de distintos modos. Por ejemplo, la region bicatenaria puede posicionarse entre dos secuencias antisentido (que pueden ser identicas o distintas), como en la Figura 1a. Como alternativa, la region bicatenaria puede posicionarse en un lado de un oligonucleotido antisentido unico, como en las Figuras 1b-1e.
Ejemplo 4: Produccion de secuencias de ADN utiles para inhibir la expresion de protemas espedficas
Secuencia de oligonucleotidos antisentido espeafica para Sintaxina5 con secuencia de union GAL4 y flanqueante:
Oligonucleotido directo (SEQ ID No: 8)
5' AATTTGTTTGTTGAGGCTAATGCATGCCGGCTGCTCTGATGCCGGCAT 3'
Oligonucleotido inverso (SEQ ID No: 9)
5' AATTTGTTTGTTGAGGCTAATGCATGCCGGCATCAGAGCAGCCGGCAT 3'
Secuencia de oligonucleotidos antisentido espeafica para VPH (serotipo 18) Early (E) 7 de transcripciones de ARNm, con secuencia de union de GAL4 y flanqueante:
Oligonucleotido directo (SEQ ID No: 10)
5' GGTCGTCTGCTGAGCTTTCTATGCATGCCGGCTGCTCTGATGCCGGCAT 3'
Oligonucleotido inverso (SEQ ID No: 11)
5' GGTCGTCTGCTGAGCTTTCTATGCATGCCGGCATCAGAGCAGCCGGCAT 3'
Secuencia de oligonucleotidos antisentido especfica para transcripciones de ARNm de TurboGFP, con secuencia de union de GAL4 y flanqueante:
Oligonucleotido directo (SEQ ID No: 12)
5' GGTGCTCTTCATCTTGTTGGTATGCATGCCGGCTGCTCTGATGCCGGCAT 3'
Oligonucleotido inverso (SEQ ID No: 13)
5' GGTGCTCTTCATCTTGTTGGTATGCCGGCATCAGAGCAGCCGGCATGCAT 3'
Los anteriores oligonucleotidos (SEQ ID Nos: 8-13) se sintetizaron con modificacion de fosforotioato para potenciar el tiempo de vida del oligonucleotido antisentido.
Pares de cebadores directos e inversos (SEQ ID Nos 8 con 9; 10 con 11; 12 con 13) se hibridaron usando un ciclador de PCR usando las siguientes condiciones: Se calento a 94 °C durante 1 min y se enfrio a 55 °C durante 1 min, 10 veces. Este proceso de emparejamiento produjo secuencias de ADN monocatenarias y bicatenarias hnbridas de acuerdo con la invencion.
Ejemplo 5: Formacion de un complejo de oligonucleotido-lanzadera (LFn-GAL4)
Se produjeron hnbridos de OAS emparejados (como en el Ejemplo 4). Estos hnbridos de OAS se co-incubaron con LFn-GAL4 en tampon fosfato salino (PBS) durante 30 min a temperatura ambiente en la estequiometria adecuada (es decir, aproximadamente una protema 3:1 con respecto a la relacion molar de oligonucleotidos).
Un tal producto obtenido de este modo se investigo mediante difusion de neutrones a bajo angulo (SANS). El perfil resultante se compara en la Figura 3 con el obtenido en ausencia de cualquier oligonucleotido antisentido. La Figura 3 muestra la dimerizacion de LFn-GAL4 segun se midio mediante SANS en respuesta a la adicion de la composicion de oligonucleotidos antisentido que se muestra en la Figura 1a - difusion de neutrones a bajo angulo mediante LFn-GAL4 y LFn-GAL4::DS-oligonucleotido antisentido en PBS (a aproximadamente 0,5 mg/ml de LFn-GAL4 en cada caso). Las unidades del eje x de la Figura 3 son q/l/angstrom y del eje y son 1/cm. La lmea gruesa superior en negro muestra los resultados en presencia del OAS, en comparacion con la lmea fina inferior en la que el OAS esta ausente. El diferencial en el perfil de difusion entre 0,01 y 0,04 (q/1/A) es atribuible a la dimerizacion de LFn-GAL4, provocado por la asociacion con la secuencia de union de protemas bicatenaria que forma parte del oligonucleotido (Figura 1a). En este caso, se cargaron cubetas de 2 mm (Hellman Analytics, Essex, Reino Unido) con LFn-GAL4 y LFn-GAL4::oligonucleotido estequiometria de 3:1 respectivamente (relacion molar).
La intensidad de tal radiacion de difusion es un reflejo del tamano y forma del difusor, asf como la composicion (es decir, LFn-GAL4). Se examinaron tanto las protemas individuales como sus mezclas. Para los componentes individuales, no se observo, en general, difusion, lo que indicaba su tamano relativamente pequeno. En la mezcla de LFn-GAL4 y el oligonucleotido hibridado, se observo difusion, confirmando que se produda un interaccion para formar estructuras mas grandes (es decir, complejos de LFn-GAL4::OAS).
Ejemplo 6: Regulacion negativa de expresion de genes diana (Sintaxina5)
Uno de los complejos producidos en el Ejemplo 5 se empleo para dirigir la expresion del gen SIntaxina5 en celulas Hela. La protema PA83 formadora de poros se uso para ayudar a medir la translocacion de membrana de oligonucleotidos antisentido mediante una interaccion con LFn-GAL4. La porcion de OAS del complejo consistfa en dos secuencias de OAS (como en el ejemplo 4) hibridadas (SEQ ID Nos: 8 y 9). Las celulas Hela producen Sintaxina5 cuando se cultivan en condiciones normales. Las celulas Hela se trataron de diversos modos en un intervalo de concentraciones de complejo de OAS: 0 (control), 1, 10, 50, 100 y 200 pMol por litro.
En la Figura 4: la barra rellenada en negro representa las celulas Hela tratadas con PA83, LFn-GAL4 y una "no-Sintaxina5" (espedfica a GFP) OAS (formada de la SEQ ID No: 12 y 13 hibridada). La barra sin relleno representa las celulas Hela tratadas con PBS solo. Estos dos tratamientos muestran la especificidad de secuencia para la regulacion negativa de Sintaxina5 (puesto que la secuencias de OAS anti-GFP aqu es inactiva frente a la Sintaxina5) y sirven como controles negativos. Las barras rellenadas con sombreado horizontal representan celulas Hela electroporadas con OAS hnbrido espedfico para Sintaxina5 (formado a partir de las SEQ ID Nos: 8 y 9). Las barras rellenadas con sombreado vertical representan celulas Hela tratadas con PA83, LFn-GAL4 y OAS tnbrido espedfico para Sintaxina5 (formadas a partir de las SEQ ID Nos: 8 y 9). Las barras rellenadas con sombreado diagonal representan celulas Hela tratadas con OAS hnbrido espedfico para Sintaxina5 (formado a partir de las SEQ ID Nos: 8 y 9) mezcladas con Oligofectamina (Invitrogen), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Los niveles de expresion de Sintaxina5 en las celulas se midio despues de 24 horas usando inmunotransferencia. Los resultados se muestran como % de expresion de control (celulas Hela tratadas con PBS solo) (eje y). Los datos muestras que las composiciones de acuerdo con la invencion regulan negativamente la expresion de Sintaxina5 de un modo espedfico a gen. Esto se demuestra en un nivel de poblacion mediante transferencia de Western e inmunodeteccion. El grafico de la Figura 4 muestra los niveles de expresion de Sintaxina5 y muestra el efecto de la carga de hnbridos de oligonucleotidos antisentido (3,2 pg/ml) (SEQ Id Nos: 8 y 9) sobre LFn-GAL4 (50 pg/ml) coincubado con PA (50 pg/ml) sobre celulas Hela con respecto a la expresion de un gen guardian, Derlina1 (para controlar cualquier variacion en el numero celular). Los datos que se muestran derivan de 3 experimentos por separado y demuestran que la adicion de las composiciones descritas puede mediar la destruccion de un oligonucleotido antisentido de gen espedfico que codifica una secuencia antisentido (es decir, Sintaxina5). Los datos representan tres repeticiones para cada experimento y las barras de eror representan el error estandar de la mediana.
Ejemplo 7: Regulacion negativa de expresion de genes diana (VPH18 E7)
Se llevo a cabo un experimento para examinar la eficacia de los oligonucleotidos antisentido de anti-VPH E7 frente a la expresion de Virus de Papiloma Humano (serotipo 18) Early 7 en celulas Hela tal como se describe en el Ejemplo 6 anterior, pero usando distintas secuencias de oligonucleotidos. En este caso, los hnbridos de OAS espedficos a Sintaxina5 (formados a partir de la SEQ ID No: 8 y la SEQ ID No: 9) del Ejemplo 6 se sustituyeron con hnbrido de OAS espedfico a VOH-E7 que contema tambien la region de union de protemas hnbrida y una pequena region flanqueante (formada a partir de la SEQ ID No: 10 y la SEQ ID No: 11). En este ejemplo, se usaron 200 pM de oligonucleotido, asociado con LFn-GAL4 y PA83, (esta es la barra negra en el grafico de la Figura 5). El resultado se muestra en la Figura 5: el % de expresion genica se muestra en el eje y. El tratamiento de control, PBS, se tomo como el 100 %: esta es la barra blanca en el grafico de la Figura 5. Los datos representan tres repeticiones de cada experimento y las barras de error representan el error estandar de la mediana. Hubo una diferencia estadfstica entre los dos tratamientos (p= 0,0104 tal como se midio mediante un ensayo t de una cola, no emparejado).
Ejemplo 8: Toxicidad in vitro de composiciones de la invencion con comparacion con poli(etilenimina)
Los complejos de hnbrido-lanzadera de OAS producidos como en el Ejemplo 5 se sometieron a ensayo para su toxicidad con respecto a poli(etilenimina) (PEI) (Tabla 1). Estos datos muestran un diferencial en toxicidad con respecto a celulas expuestas a concentraciones variantes de tanto PEI, un polfmero cationico bien caracterizado en la literatura como que es capaz de mediar la transfeccion, como protema de LFn-GAL4 despues de la hibridacion con hnbridos de OAS en presencia de 50 pg/ml de PA durante 72 h. Se normalizo la viabilidad celular con respecto a celulas no tratadas y se midio mediante la adicion de MTT (Richardson y col., 1999).
Tabla 1
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 9: Inhibicion antisentido de ensayo de translacion in vitro usando distintas composiciones de oligonucleotidos antisentido
La Figura 2 muestra el efecto de las composiciones de la invencion en comparacion con OAS de componente en un ensayo sin celulas (en el que la translocacion de membrana no es limitante a la tasa).
Se llevaron a cabo reacciones de control usando "un kit de translacion in vitro mini de alto rendimiento de una etapa" (Thermo Scientific), junto con un plasmido de control que codifica la protema turboGFP (protema fluorescente verde -Evrogen). Las reacciones se llevaron a cabo en volumenes de 4,5 pl (incubadas durante 3 h a 30 °C) y la expresion de turboGFP se controlo mediante inmunotransferencia de Western usando un anticuerpo primario anti-6His (dilucion 1:1000) y un anticuerpo secundario conjugado de HRP anti-raton (1:1000). Se llevo a cabo la deteccion usando un kit ECL Picostable (GE Healthcare). Se anadieron tres composiciones de oligonucleotidos antisentido (OAS) de GFP anti-turbo a la reaccion en concentraciones distintas al inicio del penodo de incubacion de 3 h previamente descrito.
Los resultados se muestran en la Figura 2, (n=3 ± SEM) respecto a un control que no contiene oligonucleotidos antisentido. En la Figura 2 el eje y representa la expresion de turboGPF (%) con respecto a un control sin tratar, mientras que el eje x representa la concentracion de oligonucleotido antisentido anadido a la reaccion (en pMol). Los puntos de datos representados con un recuadro se derivaron de un oligonucleotido de OAS monocatenario, SEQ ID No: 12, que consistfa en la secuencia antisentido de turboGPF y (una cadena de la) secuencia de union de protemas. Los puntos de datos representados mediante triangulos representan datos generados a partir de solo la secuencia antisentido incorporada en la SEQ ID No: 12 es decir los 21 meros de GGTGCTCTTCATCTTGTTGGA, SEQ ID No: 21). Los puntos de datos representados mediante drculos se generaron a partir del hnbrido de OAS de la invencion formado mediante emparejamiento juntas las SEQ ID Nos: 12 y 13. Los resultados que se muestran en la Figura 2 ilustran que (in vitro) la presencia de la secuencia de union de protemas en el hnbrido de OAS no inhibe la actividad de la secuencia antisentido anterior una concentracion de OAS de 30 pMol.
Nuestra invencion se puede usar para producir composiciones antisentido que tienen sustancialmente actividad antisentido no significativamente reducida (tal como se midio en el ensayo sin celulas), con respecto a un control antisentido que no tema secuencia de union de protemas o secuencia flanqueante, en o por encima de una concentracion de 30 pMol de oligonucleotido antisentido (OAS). El Ejemplo 9 anterior (Figura 2) ilustra esto.
Referencias:
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion de oligonucleotidos antisentido util para el suministro de oligonucleotido antisentido en el citosol de una celula, que comprende:
un par de oligonucleotidos parcialmente complementarios monocatenarios, en la que los dos oligonucleotidos se hibridan para proporcionar al menos una secuencia antisentido monocatenaria y al menos una secuencia de union a protemas bicatenaria;
una protema lanzadera capaz de transportar material genetico a traves de un poro de una membrana celular, comprendiendo la protema lanzadera un dominio de union de acidos nucleicos que reconoce la secuencia de union de protemas bicatenaria y se une no covalentemente a ella, en la que la protema lanzadera contiene dominio I (LFn) de factor letal (LF) de B. anthracis; y
una protema formadora de poros que es Antigeno Protector PA83 de factor de virulencia de B. anthracis
2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende un oligonucleotido que esta modificado mediante sulfonacion para aumentar su estabilidad.
3. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en la que la secuencia de union de protemas es CGG-N11-CCG, en la que "N" es cualquier base de purina o pirimidina.
4. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en la que la secuencia de union de protemas es:
5'-CGGCTGCTCTGATGCCG-3' o 5'-CGGCATCAGAGCAGCCG-3'.
5. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en la que al menos uno de los dominios (II-IV) del factor letal (LF) de B. anthracis se reemplaza por el dominio de union de acidos nucleicos.
6. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el dominio de union de acidos nucleicos de la protema lanzadera es g AL4 de Saccharomyces cerevisiae.
7. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia antisentido es ADN monocatenario designado para hibridarse a ARN mensajero que deriva de un gen diana.
8. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el gen diana se expresa mediante un virus.
9. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en la que el gen diana se expresa mediante Virus de Papiloma Humano (VPH).
10. Un procedimiento in vitro de regulacion negativa de la expresion de un gen diana en el citosol de una celula que comprende el suministro de una composicion de oligonucleotidos antisentido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y a traves de la membrana de la celula.
11. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento medico y, opcionalmente, que contiene adicionalmente al menos un aditivo seleccionado entre el grupo que consiste en excipientes y vehnculos farmaceuticamente aceptables.
12. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la reivindicacion 11, para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado con Virus del Papiloma Humano (VPH).
13. Una composicion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la reivindicacion 11, para su uso en el tratamiento de cancer, por ejemplo, cancer cervical u oral.
14. Un procedimiento de conjugacion de manera no covalente de un oligonucleotido antisentido a una protema lanzadera, comprendiendo el procedimiento: (i)
(i) proporcionar dos oligonucleotidos parcialmente complementarios monocatenarios;
(ii) hibridar los dos oligonucleotidos para formar un hnbrido de oligonucleotido, en el que el hnbrido comprende al menos una secuencia antisentido monocatenaria y al menos una secuencia de union a protemas bicatenaria; (iii) proporciona una protema lanzadera capaz de transportar material genetico a traves de un poro de una membrana celular y que tiene un dominio de union de acidos nucleicos que reconoce la secuencia de union de protemas bicatenaria y que proporciona una protema formadora de poros, en el que la protema lanzadera contiene dominio I (LFn) de factor letal (LF) de B. anthracis y la protema formadora de poros es Antfgeno Protector PA83 de factor de virulencia de B. anthracis; y
(iv) conjugar de manera no covalente la protema lanzadera al hnbrido antisentido por medio del dominio de union de acidos nucleicos de la protema y la secuencia de union de protemas del tnbrido de oligonucleotido.
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