ES2714689T3 - Proteína de espina mutante que extiende el tropismo tisular del virus de bronquitis infecciosa (IBV) - Google Patents

Proteína de espina mutante que extiende el tropismo tisular del virus de bronquitis infecciosa (IBV) Download PDF

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Abstract

Una proteína de espina (proteína S) de virus de bronquitis infecciosa (IBV) en donde la secuencia del dominio S2 de la proteína S tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con el dominio S2 de la proteína S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido en su conjunto pero ignorando las posiciones de aminoácidos 686-694, 578, 617, 826, 857 y 1000 en referencia a la numeración de posición de la SEQ ID NO 2, pero que comprende la secuencia XBBXBX en la parte de la proteína S2 en los restos 686 a 691 en referencia a la numeración de posición de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO 2, donde B es un resto básico y X es cualquier aminoácido; y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en referencia a la numeración de posición de la SEQ ID NO: 2: Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posición 578 Asparagina (N) a Serina (S) en la posición 617 Asparagina (N) a Serina (S) en la posición 826 Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posición 857 e Isoleucina (I) a Valina (V) en la posición 1000 de modo que un virus IBV que comprende la proteína S tiene tropismo tisular extendido y en donde la numeración de posición de aminoácido se identifica por alineamiento de la proteína S de IBV con la secuencia de la SEQ ID NO 2.

Description

DESCRIPCION
Protema de espina mutante que extiende el tropismo tisular del virus de bronquitis infecciosa (IBV)
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una protema de espina (protema S) de coronavirus. En particular una protema S de IBV que, cuando se usa para producir un virus, provoca que el virus tenga tropismo tisular extendido. La presente invencion tambien se refiere a secuencias de nucleotidos que codifican dicha protema S; partmulas virales que comprenden dicha protema S y su uso en una vacuna para prevenir y/o tratar una enfermedad.
Antecedentes de la invencion
Virus de la bronquitis infecciosa (IBV)
El virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV) es un patogeno altamente infeccioso y contagioso de las aves domesticas que se replica principalmente en el tracto respiratorio pero tambien en celulas epiteliales del intestino, rinon y oviducto. El IBV es un miembro de los Coronaviridae y coronavirus geneticamente muy similares provocan enfermedad en pavos y faisanes.
Las senales clmicas de BI incluyen estornudos, estertores traqueales, descarga nasal y sibilacion. Las aves de tipo carnico tienen aumento de peso reducido, mientras que las aves ponedoras ponen menos huevos. La infeccion respiratoria predispone a los pollos a infecciones bacterianas secundarias que pueden ser letales en polluelos. El virus tambien puede provocar dano permanente en el oviducto, especialmente en polluelos, lo que conduce a una produccion y una calidad de huevos reducidas; y en el rinon, lo que conduce en ocasiones a enfermedad renal que puede ser letal.
Se usan en la actualidad vacunas tanto vivas como atenuadas en la vacunacion de BI. Hasta la fecha, las vacunas mas eficaces son virus atenuados vivos producidos de forma empmica despues de pases repetidos con ocultacion a traves de huevos embrionados.
Un problema con este enfoque es que, tras el pase en serie, la inmunogenicidad del virus se reduce. Es necesario conseguir un equilibrio entre un grado aceptable de atenuacion para hacer al virus seguro, y una perdida aceptable de inmunogenicidad de modo que la vacuna del virus aun sea eficaz. Este “equilibrado” de la atenuacion es un enfoque de ensayo y error, que hace el resultado del proceso de atenuacion incierto.
Ya que la atenuacion por pase en serie es en la practica un acontecimiento aleatorio, la vacuna resultante esta geneticamente mal definida ya que la base molecular de la atenuacion se desconoce. Cada lote de virus atenuado sera diferente, haciendo difmil conseguir uniformidad de la vacuna resultante y reproducibilidad del efecto protector/terapeutico in vivo.
Una desventaja adicional es que los huevos embrionados son caros y no pueden usarse como una fuente prolongada de virus.
El cultivo del virus en huevos embrionados es un proceso incomodo ya que cada huevo debe esterilizarse, mirarse al trasluz, inocularse con virus e incubarse antes de recoger volumenes pequenos de lfquido alantoideo de cada huevo y agrupar antes de la purificacion. La falta de progresiones fiables de huevos de alta calidad da como resultado limitaciones en la cantidad de vacuna que puede producirse, particularmente en una situacion de emergencia.
Ademas de estos problemas logfsticos y de provisiones, los huevos embrionados tienen otras limitaciones como un sistema hospedador para la produccion de vacuna. Por ejemplo, hay preocupaciones crecientes acerca de la presencia de virus adventicios, particularmente retrovirus en huevos, que comprometenan la produccion de vacunas virales atenuadas vivas.
Existe por lo tanto la necesidad de vacunas de IBV alternativas y metodos para su produccion que no padezcan las desventajas anteriormente mencionadas.
El IBV es un virus con envoltura que se replica en el citoplasma celular y contiene un genoma de ARN con sentido positivo, monocatenario.
La envoltura lipfdica contiene al menos tres protemas de membrana: la glucoprotema spike (S), protema integral de membrana (M) y protema pequena de membrana (E). La protema S de IBV es una glucoprotema de tipo I que oligomeriza en el retroulo endoplasmico y se ensambla en membranas de viriones mediante interacciones no covalentes con la protema de membrana. Despues de la incorporacion en partroulas de coronavirus, la protema S es responsable de la union con el receptor de celula diana y fusion de las membranas viral y celular. La glucoprotema S consiste en cuatro dominios: una secuencia senal que se escinde durante la smtesis; el ectodominio, que esta presente en el exterior de la partmula del virion; la region transmembrana responsable del anclaje de la protema S en la bicapa lipfdica de la partmula de virion; y la cola citoplasmatica.
La protema S de IBV (1.162 aminoacidos) se escinde en dos subunidades, S1 (535 aminoacidos; 90 kDa) que comprende la mitad N terminal de la protema S, y S2 (627 aminoacidos; 84 kDa) que comprende la mitad C terminal de la protema S.
La subunidad S2 se asocia de forma no covalente con la subunidad S1 y contiene los dominios transmembrana y de cola citoplasmatica C terminal.
Los presentes inventores han mostrado previamente que el tropismo celular de IBV, asociado con el crecimiento en la lmea celular de mairnfero, celulas Vero, se determina por la subunidad S2 de la cepa Beaudette de IBV, y que la sustitucion de una subunidad S2 con toda o parte de la subunidad S2 de Beaudette puede alterar (extender o reducir) el tropismo de celulas Vero del virus, dependiendo del tropismo celular del virus del que derivo la subunidad S2 (WO 2011/004146).
Han mostrado que para una cepa de IBV tal como M41, que tiene tropismo tisular restringido y es incapaz de crecer en celulas Vero, la sustitucion de la subunidad S2 con toda o parte de la protema S de IBV Beaudette da como resultado un virus que es capaz de crecer en lmeas celulares tales como celulas Vero.
El tropismo celular extendido conferido al virus por sustitucion de todas o parte de sus subunidades S2 significa que puede producirse reserva de virus para produccion de vacuna cultivando en lmeas celulares, en lugar de huevos embrionados o celulas primarias.
El uso de lmeas celulares tales como celulas Vero tiene muchas ventajas:
(i) se ha validado previamente para el cultivo de virus y fines de diagnostico;
(ii) las celulas (y por lo tanto virus) pueden cultivarse en suspension, en lugar de lechos planos; y
(iii) es posible conseguir rendimientos uniformes.
Los presentes inventores han identificado previamente un “motivo” en la cepa de IBV Beaudette, que es capaz de conferir la capacidad de crecer en celulas Vero.
Los presentes inventores han identificado ahora varias sustituciones de aminoacidos que, cuando se usan junto con el motivo de Beaudette, potencian adicionalmente la capacidad del virus para crecer en lmeas celulares.
Sumario de aspectos de la invencion
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona una protema de espina (protema S) del virus de bronquitis infecciosa (IBV) donde la secuencia del dominio S2 de la protema S tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con el dominio S2 de la protema S de una cepa IBV con tropismo tisular restringido en su conjunto pero ignorando las posiciones de aminoacidos 686-694, 578, 617, 826, 857 y 1000 en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID No. 2, pero que comprende la secuencia XBBXBX en la parte de la protema S2 en los restos 686 a 691 en referencia a la numeracion de posicion de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 21, en la que B es un resto basico y X es cualquier aminoacido; y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2:
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 578
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 826
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 857 e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 1000
de modo que un virus IBV que comprende la protema S tiene tropismo tisular extendido y en donde la numeracion de posicion de aminoacido se identifica por el alineamiento de la protema S de IBV con la secuencia de la SEQ ID No. 2.
La protema S de IBV puede comprender la secuencia SRRKRS o SRRRRS en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 686 a 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 2.
La protema S de IBV puede comprender la secuencia SRRKRSLIE o SRRRRSVIE en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 686 a 694 de la secuencia proporcionada como SEQ ID No. 2.
La protema S de IBV puede comprender la sustitucion de aminoacidos de Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617 en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2.
La protema S de IBV puede comprender las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2:
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 578 y
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617.
La protema S de IBV puede comprender las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2:
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 826
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 857 e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 1000.
En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una secuencia de nucleotidos capaz de codificar una protema S de acuerdo con el primer aspecto de la invencion.
La invencion tambien proporciona un plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.
En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona una partmula viral que comprende una protema S de acuerdo con el primer aspecto de la invencion y/o una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.
La partmula viral puede ser un virus de vaccinia recombinante (rVV) o un coronavirus.
La partmula viral puede ser capaz de crecer en una lmea celular tal como celulas Vero.
La infeccion de celulas Vero por una partmula viral de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion puede bloquearse por heparina soluble.
En un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona una celula que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion; o una partmula viral de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion. La celula puede, por ejemplo, ser una celula, tal como una celula de rinon de polluelo primaria, capaz de producir virus recombinante usando un sistema de genetica inversa, o una celula infectada con una partmula viral de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion.
La celula infectada con una partmula viral de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion puede ser derivable de una lmea celular, tal como una celula Vero.
En un quinto aspecto, la presente invencion proporciona una vacuna que comprende una partmula viral del cuarto aspecto de la invencion.
Aspectos adicionales de la invencion proporcionan:
(i) una vacuna de acuerdo con el quinto aspecto de la invencion para el tratamiento y/o prevencion de una bronquitis infecciosa en un sujeto;
(ii) un metodo para producir una vacuna de acuerdo con el quinto aspecto de la invencion, que comprende la etapa de infectar celulas Vero con una partmula viral de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion; y
(iii) un cultivo celular que comprende una celula o una poblacion de celulas de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion.
Descripcion de las figuras
Figura 1 - Cinetica de crecimiento de los seis rIBV variantes en celulas Vero. Todos los rIBV investigados se habfan pasado 7 veces en celulas Vero.
Figura 2 - Cinetica de crecimiento de los seis rIBV variantes en celulas Vero sin pase previo en celulas Vero. Figura 3 - Alineamiento de secuencias de aminoacidos de protemas S completas para IBV Beaudette, M41, H120 y QX. La union S1/S2 esta en la posicion 537. Las posiciones de aminoacidos en la subunidad S2 son 2 mas que las mostradas en la SEQ ID NO 1 (578 se convierte en 580) debido a que la secuencia de QX S1 es dos aminoacidos mas larga que las otras secuencias de S1.
Figura 4 - Alineamiento de secuencias de aminoacidos de las subunidades S2, para IBV Beaudette, M41, H120 y QX. Las modificaciones de aminoacidos ensayadas en los seis rIBV descritos en los Ejemplos estan marcadas con una flecha roja.
Descripcion detallada
IBV
La bronquitis infecciosa (IB) aviar es una enfermedad respiratoria aguda y altamente contagiosa de polios que provoca perdidas economicas significativas. La enfermedad se caracteriza por senales respiratorias incluyendo jadeos, tos, estornudos, estertores traqueales y descarga nasal. En pollos jovenes, puede producirse dificultad respiratoria grave. En ponedoras, son comunes dificultad respiratoria, nefritis, reduccion de la produccion de huevo y perdida de calidad interna de huevo y calidad de cascara de huevo.
En pollos de engorde, son senales clmicas comunes la tos y crepitacion, que se propagan rapidamente en todas las aves de la instalacion. La morbilidad es 100 % en bandadas no vacunadas. La mortalidad vana dependiendo de la edad, la cepa del virus y las infecciones secundarias pero puede ser de hasta el 60 % en bandadas no vacunadas.
El primer serotipo de IBV identificado fue Massachusetts, pero en los Estados Unidos estan en circulacion en la actualidad varios serotipos, incluyendo Arkansas y Delaware, ademas del tipo Massachusetts identificado originalmente.
La cepa de IBV Beaudette se derivo despues de al menos 150 pases en embriones de polluelos. IBV Beaudette ya no es patogeno para aves adultas, pero mata rapidamente los embriones.
H120 es una cepa de vacuna de serotipo Massachusetts de IBV viva comercial, atenuada por aproximadamente 120 pases en huevos de pollos embrionados. H52 es otra cepa de Massachusetts, y representa un virus de pase anterior y ligeramente mas patogenico (pase 52) durante el desarrollo de H120. Se usan habitualmente vacunas basadas en H120 y H52.
IB QX es un aislado de campo virulento de IBV. Se conoce en ocasiones como "QX chino" ya que se aislo originalmente despues de brotes de enfermedad en la region de Qingdao en China. Desde ese momento el virus ha avanzado hacia Europa. Desde 2004, se han identificado problemas graves de produccion de huevos con un virus muy similar en partes de Europa occidental, predominantemente en los Pafses Bajos, pero tambien comunicado desde Alemania, Francia, Belgica, Dinamarca y en el Reino Unido.
El virus aislado de los casos de los Pafses Bajos fue identificado por el Instituto de Investigacion de los Pafses Bajos en Deventer como una nueva cepa que denominaron D388. La conexion china vino de ensayos adicionales que mostraron que el virus era 99 % similar a los virus QX chinos. Se ha desarrollado ahora una cepa de virus de bronquitis infecciosa de tipo QX viva atenuada.
Protema S
La protema S de IBV comprende un ectodominio muy glucosilado, grande, que puede escindirse durante la biosmtesis en dos subunidades (S1 y S2) por una enzima de tipo furina en el aparato de Golgi. S1 comprende el dominio de union al receptor y S2 comprende el dominio de fusion. La protema S de IBV se escinde completamente en el lfmite S1/S2, especialmente en sistemas de embrion de pollo.
El dominio S2 contiene cinco dominios o regiones funcionales: dos dominios, HR1 y HR2, forman estructuras helicoidales que dan como resultado la estructura de tallo de la protema; un dominio transmembrana responsable de anclar la protema en la membrana de virion; un dominio citoplasmatico rico en cistema responsable de interaccionar con otras protemas estructurales de virus y un quinto dominio, el peptido de fusion, responsable de fusion virus-celula o fusion entre celulas.
Las secuencias de aminoacidos para las cepas de IBV Beaudette y M41 son las siguientes:
SEQ ID NO 1: protema S de IBV Beaudette. El motivo espedfico de Beaudette completo se muestra en negrita (aminoacidos 686-694).
1 mlvtplllvt llcalcsavl ydsssyvyyy qsafrppsgw hlqggayaw nissefnnag
61 sssgctvgii hggrvvnass iamtapssgm awsssqfcta hcnfsdttvf vthcykhggc 121 pltgmlqqnlirvsamkngq lfynltvsva kyptfrsfqc vnnltsvyln gdlvytsnet 181 idvtsagvyfkaggpitykv mrevkalayf vngtaqdvil cdgsprglla cqyntgnfsd 241 gfypftnsslvkqkfivyre nsvnttctlh nfifhnetga npnp3gvqni qtyqtktuqs 301 gyynfnfsflssfvykesnf roygsyhpsck frletinngl wfnslsvsia ygplqggckq 361 svfkgratccyaysyggpsl ckgvysgeld hnfecgllvy vtksggsriq tateppvitq 421 nnynnitlntcvdyniygrt gqgfitnvtd savsynylad aglaildtsg sidifvvqge 481 yglnyykvnpcedvnqqfvv sggklvgilt smetgsqll enqfyikitn gtrrfrrsit 541 envancpyvsygkfcikpdg siativpkql eqfvaplfnv tenvlipnsf nltvtdeyiq 601 rrmdkvqinclqyvcgssld crklfqqygp vcdnilswn svgqkedir.el lnfysstkpa 661 gfntpvlsnvstgefnisll ltnpssrrkr sliedllfts vesvglptr.d ayknctagpl 721 gffkdlacareyngllvlpp iitaemqaly tsslvasmaf ggitaagaip farqlqarin 781 hlgitqslllknqekiaasf nkaighmqeg frstslalqq iqdwskqsa iltetmasln 841 knfgaissviqeiyqqfdai qanaqvdrli tgrlsslsvl asakqaeyir vsqqrelatq 901 kinecvksqsirysfcgngr hvltipqnap ngivfihfsy tpdsfvnvta ivgfcvkpan
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SEQ ID NO 2: protema S de IBV M41. Las posiciones de aminoacidos 686-691 y 578, 617, 826, 857 y 1000 se muestran en negrita.
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La Figura 3 muestra un alineamiento entre las protemas S de las cepas de IBV Beaudette, M41, H120 y QX.
La Figura 4 muestra un alineamiento entre las subunidades S2 de las cepas de IBV Beaudette, M41, H120 y QX.
TROPISMO TISULAR
Los coronavirus muestran fuerte tropismo de especie y tisular. De forma similar, los aislados clmicos de IBV muestran tropismo definido tanto in vivo como en cultivo celular.
La cepa M41 se ha adaptado para crecimiento en celulas de rinon de polluelo primarias (CK) y se restringe a infeccion de celulas de pollo primarias, y por lo tanto es necesario cultivarla en huevos embrionados o celulas CK.
Se sabe que la cepa Beaudette, por otro lado, es capaz de infectar una serie de celulas en cultivo, incluyendo celulas Vero y celulas de rinon de cna de hamster (BHK).
Una cepa de IBV con tropismo tisular restringido es capaz de infectar un numero menor de tipos celulares que un coronavirus con tropismo tisular extendido.
Una cepa de IBV con tropismo tisular restringido puede, por ejemplo, restringirse a infeccion de celulas primarias, mientras que una cepa de IBV con tropismo tisular extendido puede (ademas de ser capaz de infectar celulas primarias) ser capaz de infectar una o mas lmeas celulares.
Una cepa de IBV con tropismo tisular extendido puede, por ejemplo, tener la capacidad de infectar celulas Vero.
El linaje celular Vero se aislo en 1962 de celulas epiteliales de rinon extrafdas de un mono verde africano (Cercopithecus aethiops). Las celulas Vero se usan para muchos fines experimentales y clmicos, incluyendo su accion como celulas hospedadoras para cultivar virus.
El linaje celular Vero es continuo porque puede replicarse a traves de muchos ciclos de division y no se convierte en senescente.
El linaje celular Vero se ha autorizado para su uso en la fabricacion de vacunas y se usa actualmente para la produccion de vacunas de la polio y rabia.
Una cepa de IBV con tropismo tisular restringido puede ser inmunogenica y capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora o terapeutica in vivo. Los ejemplos de cepas con tropismo tisular restringido incluyen las cepas usadas en la actualidad para produccion de vacunas. Para IBV, esto incluye cepas tales como: H52, H120, Ma5, 4/91, D41, D274, W93 y QX. La cepa con tropismo tisular restringido puede ser o derivar de un aislado “del campo” tal como BJ1, BJ2 o BJ3 (Li y Yang (2001) Avian Pathol 30: 535-541).
Un ejemplo de una cepa de IBV con tropismo tisular extendido es IBV Beaudette.
Puede establecerse tropismo celular experimentalmente simplemente exponiendo un tipo celular dado a infeccion por un virus. Despues puede analizarse el efecto citopatico (cpe) y el grado de formacion de sincitios tras un cierto numero de pases. El cambio de morfologfa de las celulas infectadas puede analizarse usando microscopfa.
PROTEfNA VARIANTE
La presente invencion se refiere a una protema de espina (protema S) de virus de bronquitis infecciosa (IBV) quimerica que se basa en una protema S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido, pero que comprende un “motivo espedfico de Beaudette” junto con una o mas sustituciones de aminoacidos espedficas de Beaudette, de modo que un virus IBV que comprende la protema S tiene tropismo tisular extendido.
La expresion “basado en” indica que al menos el dominio S1 deriva o puede derivar de la cepa con tropismo tisular restringido. La mayor parte del dominio S2 tambien puede obtenerse o ser obtenible de la cepa con tropismo tisular restringido. Por ejemplo, los dominios transmembrana y/o citoplasmatico pueden derivar o ser derivables de la cepa con tropismo tisular restringido. El dominio S2 puede corresponder a la secuencia del dominio S2 de la cepa con tropismo tisular restringido, sujeta a los siguientes cambios:
(1) insercion de un "motivo espedfico de Beaudette" en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 686 a 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO 2;
(2) sustitucion de aminoacidos en una o mas de las siguientes posiciones, en referencia a la SEQ ID NO 2: 578, 617, 826, 857, 1000.
El dominio S2 puede comprender algunas mutaciones de aminoacidos adicionales, tales como sustituciones, inserciones o supresiones, siempre que no afecten de forma significativa a la capacidad de la subunidad S2 para extender el tropismo tisular del virus resultante. Las mutaciones de aminoacidos adicionales pueden surgir, por ejemplo, como resultado del pase en una lmea celular tal como celulas Vero. El dominio S2 puede, por ejemplo, comprender una mutacion adicional en la posicion del aminoacido 865 (glutamina (Q) a histidina (H)).
Considerando la secuencia de S2 completa sin posiciones de aminoacidos 686-694, 578, 617, 826, 857 y 1000, sustancialmente todo el resto de la secuencia puede corresponder a la de la secuencia de S2 de tipo silvestre de la cepa con tropismo tisular restringido.
La expresion "sustancialmente toda" significa que la protema S2 tiene al menos 90, 95 o 98 % de la secuencia de tipo silvestre en su conjunto pero ignorando las posiciones de aminoacidos 686-694, 578, 617, 826, 857 y 1000.
La expresion “tipo silvestre” se usa para indicar un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos primaria que es identica a la protema nativa (es decir, la protema viral).
Pueden realizarse comparaciones de identidad a la vista, o mas habitualmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencias disponibles facilmente. Estos programas informaticos disponibles en el mercado pueden calcular el % de identidad entre dos o mas secuencias. Un programa informatico adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, Estados Unidos; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Los ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitacion, el paquete BLAST (vease Ausubel et al., 1999 misma referencia - Capttulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparacion. Tanto BLAST como FASTA estan disponibles para busqueda fuera de lmea y en lmea (vease Ausubel et al., 1999 misma referencia, paginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Tambien esta disponible una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences para comparar secuencia proteica y de nucleotidos (vease FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
La secuencia puede tener una o mas supresiones, inserciones o sustituciones de restos de aminoacidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una molecula funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de aminoacidos deliberadas basandose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipatica de los restos siempre que la actividad se conserve. Por ejemplo, los aminoacidos con carga negativa incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoacidos de grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservativas, por ejemplo de acuerdo con la Tabla posterior. Los aminoacidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferentemente en la misma lmea de la tercera columna pueden sustituirse entre sf:
Figure imgf000008_0001
Un alineamiento entre protemas S de diferentes cepas es sencillo porque los coronavirus comparten una estructura de dominio comun y, entre cepas, debenan tener un nivel de identidad de secuencia relativamente alto. Puede usarse software de alineamiento tal como el paquete BLAST™ descrito anteriormente.
Ubicacion de aminoacidos
La protema S de la presente invencion comprende la secuencia XBBXBX en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 686 a 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO 2, donde B es un resto basico y X es cualquier aminoacido; y comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2:
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 578
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 826
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 857 e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 1000.
La secuencia ID NO 2 es la secuencia de protema S de la cepa M41 de IBV. Puede ser que la protema S de otras cepas de IBV tenga numeracion de aminoacidos ligeramente diferente. Por ejemplo, la secuencia de S1 de la cepa QX es dos aminoacidos mas larga que las secuencias S1 de cepas tales como M1, Beaudette y H120. Esto significa que para una protema S de acuerdo con la invencion basada en QX, el motivo XBBXBX aparecena en la seccion de secuencia en la posicion 688-693. Las mutaciones anteriormente mencionadas estanan en las posiciones 580, 619, 828, 859 y 1002.
La expresion "en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO 2" indica que la posicion de aminoacido es equivalente a la mostrada para la secuencia de protema S de M41 mostrada en la s Eq ID NO 2. Se apreciara que el numero real del aminoacido del extremo N de la protema puede variar entre protemas S de IBV de diferentes cepas, como lo hace para QX como se ha explicado anteriormente. Sin embargo, debena estar claro a partir de un alineamiento de la protema S de IBV con la secuencia de M41 de la SEQ ID NO 2 que es la posicion de aminoacido "equivalente".
Se muestra un alineamiento de protemas S de diversas cepas de IBV en la Figura 3.
La posicion del motivo y mutaciones tambien puede proporcionarse en el contexto de la subunidad S2.
Se muestra un alineamiento de las subunidades S2 de diversas cepas de IBV en la Figura 4. Las posiciones de aminoacidos correspondientes para la subunidad S2 se muestran en la siguiente tabla:
Figure imgf000009_0001
Por lo tanto la protema S de la presente invencion comprende la secuencia XBBXBX en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 154 a 159 de la secuencia mostrada en la Figura 4, donde B es un resto basico y X es cualquier aminoacido; y comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de las secuencias mostradas en la Figura 4:
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 46
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 85
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 294
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 325 e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 468.
SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS
La presente invencion tambien proporciona una secuencia de nucleotidos capaz de codificar la protema S de la presente invencion.
La secuencia de nucleotidos puede ser natural, sintetica o recombinante. Puede ser mono o bicatenaria, puede ser de ADN o ARN o combinaciones de los mismos. Puede ser, por ejemplo, ADNc, un producto de PCR, secuencia genomica o ARNm.
La secuencia de nucleotidos puede optimizarse con respecto a codones para la produccion en el hospedador/la celula hospedadora elegido.
Puede estar aislada o como parte de un plasmido, virus o celula hospedadora.
p lAs m id o
Un plasmido es una molecula de ADN extracromosomica separada del ADN cromosomico que es capaz de replicar independientemente del ADN cromosomico. Son habitualmente circulares y bicatenarios.
Los plasmidos, o vectores (como se conocen en ocasiones), pueden usarse para expresar una protema en una celula hospedadora. Por ejemplo, una celula hospedadora bacteriana puede transfectarse con un plasmido capaz de codificar una protema particular, para expresar esa protema. El termino tambien incluye cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de bacterias que son capaces de acomodar partes mas largas de ADN.
El plasmido de la presente invencion comprende una secuencia de nucleotidos capaz de codificar el gen S. Tambien puede comprender una o mas secuencias de nucleotidos de coronavirus adicionales o secuencias de nucleotidos capaces de codificar una o mas protemas de coronavirus tales como el gen de replicasa y/o gen 3.
El plasmido tambien puede comprender un marcador de resistencia, tal como el gen de guanina xantina fosforribosiltransferasa (gpt) de Escherichia coli, que confiere resistencia a acido micofenolico (MPA) en presencia de xantina e hipoxantina y se controla por el promotor temprano/tardm de virus vaccinia P7.5.
PARTfcULA VIRAL
La presente invencion tambien se refiere a una partmula viral con una protema S de la presente invencion. La partmula viral puede ser, por ejemplo, un virus vaccinia recombinante (rVV) o un coronavirus.
La partmula viral puede ser recombinante.
La partmula viral puede prepararse usando un sistema de genetica inversa, tal como un sistema de genetica inversa basado en virus vaccinia.
Se conocen en la tecnica sistemas de genetica inversa adecuados (Casais et al (2001) J. Virol 75: 12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77: 9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological Methods 123: 203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454: 255-273).
CELULA
La partmula viral puede usarse para infectar una celula.
Ya que la partmula viral que comprende el gen S de la presente invencion tiene tropismo tisular extendido, la celula puede ser derivable de o una parte de una lmea celular.
La celula puede ser, por ejemplo, una celula de rinon de cna de hamster (por ejemplo BHK-21) o una celula Vero. La celula puede usarse para producir la partmula viral.
Por lo tanto la presente invencion tambien proporciona un metodo para producir una partmula viral que comprende las siguientes etapas:
(i) infeccion de una celula con una partmula viral de acuerdo con el sexto aspecto de la invencion;
(ii) permitir que el virus se replique en la celula; y
(iii) recoger el virus descendiente.
La celula puede ser de o parte de una lmea celular, tal como una celula Vero. Las partmulas virales pueden recogerse, por ejemplo del sobrenadante por metodos conocidos en la tecnica, y opcionalmente purificarse.
La presente invencion tambien proporciona una celula que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invencion y/o una partmula vmca de acuerdo con la invencion. La celula puede ser capaz de producir una partmula viral recombinante de acuerdo con el cuarto aspecto de la invencion usando un sistema de genetica inversa. Por ejemplo, la celula puede comprender un genoma de virus recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos capaz de codificar el gen S de la presente invencion.
La celula puede ser capaz de producir virus de recombinacion recombinantes (por ejemplo virus vaccinia) que contiene el gen S. La celula puede ser una celula Vero.
Como alternativa la celula puede ser capaz de producir coronavirus recombinante por un sistema de genetica inversa. La celula puede expresar o inducirse para expresar polimerasa T7 para rescatar la partmula viral recombinante. La celula puede ser una celula CK.
VACUNA
La partmula viral puede usarse para producir una vacuna.
La vacuna puede ser una forma atenuada viva de la partmula viral.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para producir dicha vacuna que comprende la etapa de infectar celulas, por ejemplo celulas Vero, con una partmula viral que comprende una protema quimerica de acuerdo con el primer aspecto de la invencion.
METODO DE VACUNACION
La partmula viral de la presente invencion puede usarse para tratar y/o prevenir la bronquitis infecciosa en un sujeto.
“T ratar” significa administrar la vacuna a un sujeto que tiene una enfermedad existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un smtoma asociado con la enfermedad y/o para ralentizar, reducir o bloquear la progresion de la enfermedad.
“Prevenir” significa administrar la vacuna a un sujeto que aun no ha contrafdo la enfermedad y/o que no muestra ningun smtoma de la enfermedad para evitar o alterar la causa de la enfermedad (por ejemplo infeccion) o para reducir o prevenir el desarrollo de al menos un smtoma asociado con la enfermedad.
La vacuna puede administrarse a polluelos eclosionados o pollos, por ejemplo por colirio o administracion intranasal. Aunque son precisos, estos metodos pueden ser caros por ejemplo para bandadas de pollos de engorde grandes. Las alternativas incluyen inoculacion por pulverizacion de administracion al agua para beber pero puede ser difmil asegurar la aplicacion de vacuna uniforme usando dichos metodos.
La vacuna puede proporcionarse en una forma adecuada para su administracion, tal como un colirio para uso intraocular.
La vacuna puede administrarse por la inoculacion en el huevo, por ejemplo mediante inyeccion de huevos embrionados. La vacunacion en el huevo tiene la ventaja de que proporciona una resistencia de estadio temprano a la enfermedad. Tambien facilita la administracion de una dosis uniforme por sujeto, a diferencia de la inoculacion por pulverizacion y administracion mediante agua para beber.
La vacuna puede administrarse a cualquier compartimento adecuado del huevo, incluyendo fluido alantoideo, saco vitelino, amnios, celda de aire o embrion. Puede administrarse debajo de la membrana de la cascara (celda de aire) y membrana corioalantoidea.
Habitualmente la vacuna se inyecta a huevos embrionados durante los estadios tardms del desarrollo embrionario, generalmente durante el ultimo trimestre del periodo de incubacion, tal como 3-4 dfas antes de eclosionar. En los pollos, la vacuna puede administrarse entre el dfa 15 y el 19 del periodo de incubacion de 21 dfas, por ejemplo al dfa 17 o 18.
El proceso puede automatizarse usando un proceso de inyeccion robotico, tal como el descrito en el documento WO 2004/078203.
La vacuna puede administrarse junto con una o mas vacunas distintas, por ejemplo, vacunas para otras enfermedades, tales como virus de enfermedad de Newcastle (NDV). La presente invencion tambien proporciona una composicion de vacuna que comprende una vacuna de acuerdo con la invencion junto con uno o mas vacunas adicionales. Tambien se describe en el presente documento un kit que comprende una vacuna de acuerdo con la invencion junto con una o mas vacunas distintas para administracion separada, secuencial o simultanea.
La vacuna de la invencion pueden usarse para tratar un sujeto aviar. Por ejemplo, el sujeto puede ser un polluelo o pollo.
Tfpicamente, un medico o veterinario determinara la dosis real que sera mas adecuada para un sujeto individual o grupo de sujetos y variara con la edad, el peso y la respuesta del sujeto o los sujetos particulares.
La composicion puede comprender opcionalmente un vehmulo, diluyente, excipiente o adyuvante farmaceuticamente aceptable. La eleccion de vehmulo farmaceutico, excipiente o diluyente puede seleccionarse con respecto a la via pretendida de administracion y la practica farmaceutica convencional. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender como (o ademas de) el vehmulo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspension, agente de recubrimiento, agente de solubilizacion y otros agentes vehmulos adecuados que pueden ayudar o aumentar el suministro o la inmunogenicidad del virus.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Generacion de IBV recombinantes que comprenden aminoacidos derivados de Beaudette
Los presentes inventores han mostrado previamente que el motivo espedfico de Beaudette fue capaz de conferir la capacidad de crecer en celulas Vero pero no en el mismo grado que la subunidad S2 de Beaudette completa. En el trabajo previo de los presentes inventores, reemplazaron la secuencia de motivo espedfico de Beaudette equivalente en la subunidad S2 de M41 en BeauR-M41 (S) con el motivo espedfico de Beaudette. El rIBV resultante, BeauR-M41-S-BeauR-Hep, fue capaz de crecer en celulas Vero, sin embargo, los estudios cineticos mostraron que no credo en el mismo grado que el rIBV que expresaba una protema S que comprendfa S1 de M41 y una S2 completa de Beaudette.
En el presente estudio, los presentes inventores han investigado si otros aminoacidos espedficos de Beaudette pueden estar implicados en la adquisicion de la capacidad para crecer en celulas Vero.
Para este fin, se genero una serie de rIBV basados en BeauR-M41-S-BeauR-Hep en los que se introdujeron otros aminoacidos derivados de Beaudette. Esto se consiguio generando ADNc basados en BeauR-M41-S-BeauR-Hep que teman los aminoacidos espedficos de Beaudette, 578F, 617S, 826S, 857F y 1000I, identificados en la S2 de Beaudette, introducidos en la glucoprotema S de rIBV BeauR-M41-S-BeauR-Hep para reemplazar los aminoacidos de M41 correspondientes 578L, 617N, 826N, 857L y 1000V.
Los cambios (M41 a Beaudette) fueron:
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion de 578
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 826
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 857 e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 1000.
Se sintetizaron dos regiones separadas de la glucoprotema S de M41 que conteman los cambios de aminoacidos deseados por Geneart y se clonaron en el vector de transferencia/recombinacion pGPTNEB193. Estas se usaron para introducir las mutaciones en el ADNc de longitud completa de BeauR-M41-S-BeauR-Hep clonado en el genoma del virus vaccinia usando un metodo de seleccion dominante transitorio (TDS) para modificar el genoma del IBV. Los virus vaccinia recombinantes se exploraron para identificar aislados que conteman diferentes combinaciones de los aminoacidos de S2 espedficos de Beaudette. Se llevo a cabo una TDS adicional para introducir los cinco aminoacidos espedficos de Beaudette en el ADNc de longitud completa de BeauR-M41-S-BeauR-Hep. Los virus vaccinia recombinantes resultantes se exploraron mediante analisis de secuencia para identificar secuencias de ADNc de IBV que conteman todos los aminoacidos espedficos de Beaudette.
Despues se rescataron rIBV infecciosos con diferentes combinaciones de los aminoacidos espedficos de Beaudette en la subunidad S2 de la glucoprotema S de BeauR-M41-S-BeauR-Hep. Para hacer esto, los virus vaccinia recombinantes que conteman el ADNc de BeauR-M41-S-BeauR-Hep con las secuencias de S2 modificadas se semipurificaron y se extrajo el ADN. Se transfectaron celulas CK primarias con el ADN de virus vaccinia recombinante para recuperar los rIBV infecciosos, que posteriormente se pasaron en serie tres veces en celulas CK.
Se rescataron seis rIBV diferentes con diferentes combinaciones de mutaciones de la siguiente manera:
MSBH-NS - N a S en la posicion 617
MSBH-LFNS - L a F en 578 y N a S en 617
MSBH-IV - I a V en 1000
MSBH-LFIV - L a F en 857 e I a V en 1000
MSBH-NSLFIV - N a S en 826, L a F en 857 e I a V en 1000
MSBH-LFNSNSLFIV - L a F en 578, N a S en 617, N a S en 826, L a F en 857 e I a V en 1000.
La cinetica de crecimiento de los seis rIBV descritos anteriormente se analizo en celulas CK y se descubrio que las variantes credan con cinetica similar al virus parental, rIBV BeauR-M41-S-BeauR-Hep (datos no mostrados).
Los rIBV se pasaron en serie siete veces en celulas Vero y se secuenciaron los genes de S.
El analisis de secuencia mostro que, despues del pase en celulas Vero, los seis rIBV teman cambios de aminoacidos adicionales en comparacion con el virus parental P3 CKC, con un aminoacido en la posicion de aminoacido 865 (glutamina (Q) a histidina (H)) comun para tres virus. Esta mutacion tambien se produce en algunos otros virus, de modo que se cree que no es directamente responsable de la potenciacion del crecimiento en celulas Vero pero puede interaccionar con las otras sustituciones que se introdujeron por ingeniena genetica en la S2 de M41. Se cree que las mutaciones Q a H han surgido debido al crecimiento en celulas Vero.
Ejemplo 2 - Analisis de la cinetica de crecimiento de los rIBV de celulas Vero
Las caractensticas de crecimiento de las variantes en celulas Vero se analizaron usando microscopia de campo claro. El crecimiento de los aislados de rIBV se comparo con rIBV BeauR-M41-S-BeauR-Hep (M41 con el motivo Beaudette pero ninguna otra mutacion derivada de Beaudette) para determinar si los cinco aminoacidos de Beaudette mejoran

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una protema de espina (protema S) de virus de bronquitis infecciosa (IBV) en donde la secuencia del dominio S2 de la protema S tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con el dominio S2 de la protema S de una cepa de IBV con tropismo tisular restringido en su conjunto pero ignorando las posiciones de aminoacidos 686-694, 578, 617, 826, 857 y 1000 en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO 2, pero que comprende la secuencia XBBXBX en la parte de la protema S2 en los restos 686 a 691 en referencia a la numeracion de posicion de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO 2, donde B es un resto basico y X es cualquier aminoacido; y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2:
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 578
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 826
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 857 e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 1000
de modo que un virus IBV que comprende la protema S tiene tropismo tisular extendido y
en donde la numeracion de posicion de aminoacido se identifica por alineamiento de la protema S de IBV con la secuencia de la SEQ ID NO 2.
2. Una protema S de IBV de acuerdo con la 1, que comp rreenivdien:dicación
(a) la secuencia SRRKRS o SRRRRS en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 686 a 691 de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO 2; o
(b) la secuencia SRRKRSLIE o SRRRRSVIE en la parte de la protema S2 correspondiente a los restos 686 a 694 de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO 2.
3. Una protema S de IBV de acuerdo con la 1 o 2, que co remipvriennddiec:ación
(a) la sustitucion de aminoacido Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617 en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2; o
(b) Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 578 y Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 617 en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2.
4. Una protema S de IBV de acuerdo con la 1 o 2, qu reeiv cionmdpicreancdieón las siguientes sustituciones de aminoacidos en referencia a la numeracion de posicion de la SEQ ID NO: 2:
Asparagina (N) a Serina (S) en la posicion 826;
Leucina (L) a Fenilalanina (F) en la posicion 857; e
Isoleucina (I) a Valina (V) en la posicion 1000.
5. Una secuencia de nucleotidos que codifica una protema S de IBV de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente.
6. Un plasmido que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 5.
7. Una partmula viral que comprende una protema S de IBV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y/o una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la 5. reivindicación
8. Una celula que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 5 y/o una partmula viral de acuerdo con la reivin 7.dicación
9. Una celula de acuerdo con la 8 que r eesiv uinnad cicealuclaió Vnero.
10. Una vacuna que comprende una partmula viral de acuerdo con la reivindicacion 7.
11. Una vacuna de acuerdo con la 10 re pivariand uiscoac einón el tratamiento y/o la prevencion de bronquitis infecciosa en un sujeto.
12. Un metodo para producir una vacuna de acuerdo con la 10, que comprende r laei evtianpdaic daec iinófnectar celulas Vero con una partmula viral de acuerdo con la 7. reivindicación
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