ES2714726T3 - Solución farmacéutica que comprende dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson - Google Patents

Abstract

Una solución farmacéutica que comprende al menos dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en el que dicha solución farmacéutica se mantiene en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración.

Description

DESCRIPCION

Solucion farmaceutica que comprende dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson Sector de la tecnica

La presente invencion se refiere a una solucion farmaceutica que comprende dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en el que dicha solucion farmaceutica se mantiene en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion.

Estado de la tecnica

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que afecta al sistema nervioso, en particular, al sistema nigroestradial, que comprende neuronas dopaminergicas. La perdida de dopamina en el cuerpo estriado, como resultado de la degeneracion neuronal progresiva en la pars compacta de la sustancia negra (SNpc), es responsable de los smtomas motores.

El tratamiento farmacologico de la enfermedad de Parkinson se puede dividir en terapia neuroprotectora y sintomatica. La terapia neuroprotectora de la enfermedad de Parkinson se basa en la proteccion de las neuronas dopaminergicas de la sustancia negra humana y del cuerpo estriado del proceso degenerativo complejo que causa la muerte celular prematura y el agotamiento de la dopamina. En la practica, sin embargo, casi todos los tratamientos disponibles son de naturaleza sintomatica, y no parecen retardar ni revertir el curso natural de la enfermedad. De hecho, en este momento, no hay tratamiento neuroprotector disponible en el mercado.

Numerosos tratamientos sintomaticos se han centrado en la atenuacion de esta deficiencia de dopamina (Chauduri et al., 2009; Devos et al. 2013) (1, 2).

Como la dopamina no atraviesa la mucosa digestiva ni la barrera hematoencefalica, su precursor lipofilo L-dopa (Levodopa) se ha desarrollado como un medicamento administrado por via oral para aliviar los smtomas de la enfermedad de Parkinson.

Sin embargo, hay numerosos inconvenientes farmacocineticos relacionados con el uso de L-dopa, y desencadenan en la aparicion de complicaciones relacionadas con L-dopa (CRLD). La L-dopa tiene una semivida corta en plasma, y genera una estimulacion dopaminergica pulsatil. En condiciones normales, las neuronas dopaminergicas de la pars compacta de la sustancia negra (SNpc) se disparan de manera continua, y la concentracion de dopamina en el cuerpo estriado se mantiene a un nivel relativamente constante (Miler y Abercrombie, 1999; Venton et al., 2003; Olanow et al., 2006) (3-5). Sin embargo, en el estado de agotamiento de la dopamina, las dosis orales intermitentes de levodopa inducen una estimulacion discontinua de los receptores de dopamina del cuerpo estriado y, despues del tratamiento a largo plazo, contribuyen a la disfuncion de las vfas dopaminergicas que conducen al desarrollo de complicaciones motoras (Fahn y el grupo de estudio de Parkinson, 2005; Parkinson study group, 2009) (6-7). Esta administracion oral pulsatil que conduce a penodos alternativos de dosis inferiores y sobredosis podna contribuir al empeoramiento de la progresion de la enfermedad (Devos et al., 2013) (2). De hecho, la administracion oral intermitente de L-dopa es incapaz de restablecer la neurotransmision dopaminergica nigroestriada continua.

La administracion dopaminergica continua podna ser mas fisiologica, y podna prevenir altas fluctuaciones en el nivel de dopamina que tendnan consecuencias perjudiciales.

Algunos tratamientos se han centrado en una administracion dopaminergica continua. Sin embargo, la administracion directa de un gel de levodopa al duodeno (Olanow et al., 2014; Devos et al., 2009) (8, 9) o las infusiones subcutaneas de apomorfina, un agonista de la dopamina (Manson et al., 2002; Drapier et al., 2012) (10­ 11), han demostrado una eficacia moderada para reducir las CRLD y una ergonoirna deficiente debido a la bomba externa (Syed et al., 1998; Devos et al., 2009) (9, 12). El uso de agonistas de dopamina de accion prolongada (Rascol et al., 2000) (13) o la administracion de L-dopa con un inhibidor de la catecol-O-metiltransferasa (COMTI) para prolongar la semivida de eliminacion de la dopamina (Stocchi et al., 2010) (14) no logro mejorar significativamente las CRLD graves.

Tambien se ha estudiado la distribucion espacial de la dopamina y del metotrexato durante la microperfusion intracerebral continua (Sendelbeck y Urquhart, 1985) (15). La infusion se realizo en los tejidos cerebrales, mas concretamente, en la region talamica media del diencefalo, con una bomba miniosmotica Alzet 2001 llena de clorhidrato de dopamina y metotrexato de sodio disueltos en lfquido cefalorraqrndeo artificial desoxigenado que contema fluorescencia de sodio. La bomba miniosmotica se lleno con la solucion al menos 16 h antes de la implantacion. Sin embargo, en estas condiciones, el oxfgeno necesariamente penetrara en la bomba y hara que la dopamina sea toxica. Por otra parte, el estudio solo se realizo para analizar la difusion de diferentes farmacos de acuerdo con su liposolubilidad y polaridad, sin ninguna intencion terapeutica.

La liberacion continua de dopamina de una matriz mesoporosa de TiO² se ha descrito en el documento MX 2012012559. La dopamina se incrusta en la matriz producida mediante un metodo de gel sol. Sin embargo, dicha matriz debe implantarse en el nucleo caudado del cerebro, cuya implantacion es invasiva, y no es conveniente para el paciente. Por otra parte, esta liberacion continua de dopamina de la matriz mesoporosa solo permite controlar los smtomas de la enfermedad de Parkinson, sin producir ningun efecto neuroprotector.

Otra estrategia terapeutica se relaciona con una infusion continua de dopamina directamente en el cuerpo estriado o en el ventnculo lateral en animales.

Yebenes et al., (1987) (16) y Yebenes et al., (1988) (25) evaluaron el efecto de la dopamina o los agonistas de la dopamina mediante infusion intracerebroventricular en ratas con lesiones unilaterales de la via nigroestriada y monos tratados con MPTP. La infusion se realizo en el ventnculo lateral cerebral ipsilateral a la lesion con un cateter conectado a una bomba Alzet 2001 llena de dopamina en diferentes vehmulos tales como el metabisulfito de sodio. Se uso metabisulfito de sodio para reducir la autoxidacion de la dopamina. Se observo que los smtomas motores disminuyeron y que las concentraciones intracerebrales de dopamina aumentaron.

Sin embargo, la rotacion contralateral se indujo mediante la infusion de dopamina o agonistas de la dopamina con un maximo 2 dfas despues de la implantacion y una disminucion lenta durante un penodo de 5 dfas de infusion. Este efecto muestra que la infusion continua induce un efecto de taquifilaxis, apoyado por la reduccion en el numero de receptores de dA en animales infundidos. Esto significa que el tratamiento induce un fenomeno de adaptacion con una perdida progresiva de eficacia. Por lo tanto, se requiere aumentar progresivamente la dosis de dopamina para mantener una maxima eficacia.

Por otra parte, se observo un problema de oxidacion. La autoxidacion de la dopamina induce la formacion de quinonas y radicales libres que son altamente toxicos para las celulas. Esta autoxidacion de la dopamina induce la oxidacion del tejido circundante y las paredes celulares. Se ha demostrado que esta oxidacion induce neurotoxicidad y, por consiguiente, podna actuar contra el empeoramiento de la enfermedad de Parkinson. Este problema de autoxidacion se redujo, pero se mantuvo cuando la dopamina se disolvio en metabisulfito de sodio. Por otra parte, el metabisulfito de sodio induce problemas de tolerancia, tales como la reaccion alergica a los sulfitos. Ademas, se ha demostrado que el empeoramiento de la degeneracion neuronal es inducido por el uso de sulfito en las neuronas piramidales (Akdogan et al., 2011) (17). Esto sugiere una posible toxicidad del metabisulfito de sodio en el modelo de enfermedad de Parkinson.

Por ultimo, pero no menos importante, el tratamiento estudiado por Yebenes et al. fue solo una terapia sintomatica, y no pudo lograr una proteccion de las neuronas dopaminergicas de la sustancia negra humana ni del cuerpo estriado. Por lo tanto, todavfa existe la necesidad en la tecnica de un tratamiento de la enfermedad de Parkinson que no presente los inconvenientes mencionados anteriormente. Mas particularmente, existe la necesidad de una composicion que permita una terapia neuroprotectora de la enfermedad de Parkinson y no solo una terapia sintomatica. Tambien existe la necesidad de una composicion que sea, por un lado, estable y que no presente problemas de oxidacion que conduzcan a un aumento de la neurodegeneracion de la sustancia negra y a los efectos secundarios relacionados, y, por otro lado, que no induzca taquifilaxis. Por ultimo, existe la necesidad de una composicion terapeutica que no proporcione una implantacion altamente invasiva ni complicada.

Objeto de la invencion

Los inventores han encontrado ahora que los inconvenientes anteriores pueden superarse cuando la dopamina esta comprendida en una solucion farmaceutica que se mantiene en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion.

La invencion se dirige, por tanto, a una solucion farmaceutica que comprende dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, manteniendose dicha solucion farmaceutica en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion.

Por "en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion" se entiende todas las condiciones necesarias para la prevencion de la oxidacion o autoxidacion de la dopamina hasta su administracion al sitio de administracion deseado, normalmente durante la formulacion, acondicionamiento/almacenamiento (si corresponde) y administracion. Esto significa que la formulacion, el almacenamiento (si corresponde) y el uso, incluyendo la administracion en el sitio de administracion deseado, de la solucion farmaceutica de la invencion se realizan en un entorno esencialmente exento de oxfgeno, es decir, que contiene menos del 5 % de oxfgeno, preferentemente, menos del 2 % de oxfgeno, mas preferentemente, menos del 1 % de oxfgeno, mas preferentemente, menos del 0,5 % de oxfgeno, mas preferentemente, aproximadamente el 0 % de oxfgeno. Asimismo, la solucion farmaceutica de la invencion en sf misma esta exenta de oxfgeno, lo que significa que contiene menos del 5 % de oxfgeno, preferentemente, menos del 2 % de oxfgeno, mas preferentemente, menos del 1 % de oxfgeno, mas preferentemente, menos del 0,5 % de oxfgeno, mas preferentemente, aproximadamente el 0 % de oxfgeno.

De hecho, la presente invencion se basa en los hallazgos inesperados de que, cuando la dopamina se encuentra en una solucion farmaceutica que se mantiene en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion, es capaz de tratar la enfermedad de Parkinson restaurando eficazmente la actividad motora normal sin inducir taquifilaxis. Por otra parte, solo se observa una ligera autoxidacion cuando la dopamina se usa en condiciones anaerobicas como se ha descrito anteriormente.

Ademas de estos efectos sintomaticos, se ha encontrado ventajosamente que, en estas condiciones, la dopamina induce eficazmente neuroplasticidad, incluyendo al menos un efecto neuroprotector, a las neuronas del cuerpo estriado y de la SNpc. Dicho efecto neuroprotector para las neuronas del cuerpo estriado o del SNpc no se puede inducir cuando la dopamina se formule y/o se administre aerobicamente.

Asimismo, estos efectos sorprendentes se pueden obtener cuando la dopamina se encuentra en una solucion farmaceutica que se mantiene en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion, incluso sin agente conservante. Por lo tanto, no se requiere el uso de metabisulfito de sodio y se superan los inconvenientes relacionados con este compuesto.

El termino "neuroplasticidad" (o plasticidad cerebral) se refiere a la capacidad del cerebro para reorganizarse mediante la formacion de nuevas conexiones neuronales. En la presente invencion, la neuroplasticidad significa que el numero de neuronas es mayor cuando se aplica el tratamiento de la invencion sin el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. La neuroplasticidad comprende la neuroproteccion, la neurogenesis (es decir, formacion de neuronas a partir de celulas madre), el cambio de fenotipo a neuronas dopaminergicas (es decir, a partir de neuronas no dopaminergicas) y/o los cambios de plasticidad tales como la sinaptogenesis y dentritogenesis.

El termino "neurogenesis" se refiere a la produccion de nuevas neuronas a partir de celulas madre.

Se ha demostrado anteriormente que la proliferacion de progenitores se ve afectada en la zona subventricular (SVZ) y en la zona subgranular (SGZ) de pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson, probablemente como consecuencia de la denervacion dopaminergica (Hoglinger et al. 2007) (18). De hecho, se ha demostrado que el agotamiento experimental de la dopamina disminuye la proliferacion de progenitores tanto en la SVZ como en la SGZ en roedores. En el modelo de ratones con 6-hidróxidopamina de la enfermedad de Parkinson, la proliferacion en la SVZ se redujo en aproximadamente un 40 % (Hoglinger et al. 2007) (18).

Por "efecto neuroprotector" o la "neuroproteccion" se entiende la preservacion de la estructura neuronal y/o la funcion de los pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson en comparacion con los pacientes que no estan afectados por la enfermedad de Parkinson. Preferentemente, se refiere a la preservacion del numero de neuronas en el cuerpo estriado y/o en la pars compacta de la sustancia negra de pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson en comparacion con pacientes que no estan afectados por la enfermedad de Parkinson.

El termino "tratamiento", "tratar" y terminos derivados significan revertir, aliviar, detener o prevenir la enfermedad de Parkinson y/o al menos un smtoma relacionado con la enfermedad de Parkinson. El termino "tratamiento" tambien se refiere a un tratamiento profilactico que puede retrasar la aparicion de la enfermedad de Parkinson.

La solucion farmaceutica de la invencion es farmaceuticamente aceptable, es decir, no produce una reaccion adversa, alergica u otra reaccion perjudicial cuando se administra a un paciente.

Por "dopamina" se entiende la molecula dopamina en forma de su base libre (4-(2-aminoetil)benceno-1,2-diol), asf como sus sales farmaceuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, su clorhidrato.

La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal obtenida de la dopamina, teniendo dicha sal una actividad biologica ligeramente similar en comparacion con la actividad biologica de dicho compuesto de la invencion. La dopamina es una amina, y puede formar sales de adicion de acido. Las sales de adicion de acido adecuadas se forman a partir de acidos que forman sales no toxicas. Los ejemplos de dichos acidos son acido clorhndrico, acido bromhndrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido metanosulfonico, acido acetico, acido fumarico, acido succmico, acido lactico, acido cftrico, acido tartarico y acido maleico, de los que el acido clortndrico, acido bromhndrico, acido sulfurico, acido fosforico y acido acetico son particularmente preferidos. Preferentemente, la sal farmaceuticamente aceptable es clorhidrato de dopamina.

La solucion farmaceutica de la invencion puede comprender ademas complejos, moleculas, peptidos, sales, vectores o cualquier otro compuesto que pueda mejorar o que pueda ser beneficioso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Ventajosamente, la solucion farmaceutica de la invencion esta exenta de agente conservante.

Por "agente conservante" se entiende todas las moleculas, los peptidos, las sales u otros compuestos que tienen un efecto antioxidante o que son esenciales para conservar la dopamina y otros compuestos que constituyen la solucion farmaceutica de la invencion.

En una variante particularmente preferida de la presente realizacion, la solucion farmaceutica de la invencion se formula para una administracion parenteral.

Preferentemente, la solucion farmaceutica contiene veldculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de ser inyectada. Estas pueden ser, en particular, soluciones salinas isotonicas esteriles (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, en especial, liofilizadas que permitan la constitucion de soluciones inyectables tras la adicion, en funcion del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica. Por ejemplo, cuando se disuelve en solucion salina (o solucion de cloruro de sodio), el clorhidrato de dopamina asf obtenido da una solucion acida estable, que tiene preferentemente un pH comprendido entre 4,5 y 7, mas preferentemente entre 5,5 y 7, dependiendo de la dilucion.

La solucion farmaceutica de la invencion esta preferentemente en forma de una solucion acuosa.

Con respecto a la formulacion de la solucion de dopamina, la dopamina puede proporcionarse, por ejemplo, directamente en forma de una solucion que se administre al paciente. Tambien es posible proporcionar dopamina solida, por ejemplo, en forma de polvo, que se disuelva en un disolvente adecuado, en especial, en un disolvente acuoso, formando la solucion poco antes de la administracion. La preparacion de la solucion de dopamina justo o poco antes de la administracion reduce aun mas el riesgo de oxidacion y tiene la ventaja de una vida util mas prolongada de la dopamina solida en comparacion con las soluciones de dopamina.

La formulacion de la solucion farmaceutica que comprende dopamina en condiciones anaerobicas, es decir, la solucion que esta exenta o esencialmente exenta de oxfgeno, puede obtenerse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante la desoxigenacion con gas inerte tal como nitrogeno, freones, argon, xenon, (36)-kripton o neon. Con este fin, se puede realizar un lavado de una solucion acuosa, por ejemplo, en una solucion acuosa que contenga sal, en la que se haya disuelto dopamina previamente en una atmosfera inerte como se ha descrito en el documento FR0114796.

La forma (en especial, la concentracion) de la solucion farmaceutica, la via de administracion, la dosis y la pauta dependen naturalmente de la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

La solucion farmaceutica de la presente invencion se puede usar para el tratamiento de cualquier organismo vivo, mas en especial, un mairnfero y, mas particularmente, un ser humano y mas particularmente un ser humano de mas de 45 anos, mas preferentemente de mas de 65 anos.

Ventajosamente, dicha solucion farmaceutica es adecuada para la administracion intraventricular cerebral. Mas espedficamente, dicha solucion farmaceutica esta adaptada para ser administrada en el ventnculo lateral derecho, preferentemente, cerca del foramen interventricular, de modo que la solucion farmaceutica pueda administrarse en el tercer ventnculo.

De hecho, los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, una administracion cercana al foramen interventricular, en particular, colocando el cateter en el ventnculo lateral derecho cerca del foramen interventricular, permite que la solucion farmaceutica se administre directamente en el tercer ventnculo y permita la concentracion bilateral de dopamina en el cuerpo estriado a traves de las paredes del ventnculo y del area subventricular (SVZ). Esta administracion reduce considerablemente las complicaciones motoras, mientras que la dopamina se concentra lateralmente en la region frontal y en el nucleo caudado cuando se administra en la region frontal del cerebro, lo que sena menos ventajoso con respecto a las complicaciones motoras y al desarrollo de psicosis.

Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona una solucion farmaceutica como se ha descrito anteriormente, solucion farmaceutica que esta adaptada para ser administrada en un ventnculo cerebral, preferentemente, en el ventnculo lateral derecho, preferentemente, cerca del foramen interventricular.

Con este fin, y para llevar a cabo la administracion en condiciones anaerobicas, la solucion farmaceuticamente aceptable de acuerdo con la invencion se adapta para administrarse con una bomba anaerobica.

La administracion de la solucion de la invencion en condiciones anaerobicas tambien puede realizarse mediante cualquier otro metodo conocido por el experto en la materia.

Por "bomba anaerobica" se entiende cualquier dispositivo que permita una liberacion controlada de la solucion de la invencion y que no degrade la anaerobia de dicha solucion al exponerla al oxfgeno. Por lo general, dicha bomba debe ser compatible con la presente invencion, y en particular, es capaz de administrar anaerobicamente una solucion de dopamina en el sitio deseado de administracion.

Por ejemplo, se puede usar una bomba SYNCHROMED II (comercializada por Medtronic), una bomba IPRECIO (comercializada por Iprecio) o una bomba ALZET (comercializada por Alzet) con este fin. La bomba SYNCHROMED II (comercializada por Medtronic) es adecuada para seres humanos y, por lo tanto, se puede usar preferentemente en pacientes humanos. Esta bomba permite condiciones anaerobicas completas y una excelente estabilidad de la dopamina. De hecho, los inventores han demostrado que la dopamina en condiciones anaerobicas fue estable durante al menos un mes.

Por lo tanto, el uso de estas bombas reduce extremadamente el riesgo de oxidacion o de autoxidacion de la dopamina. El balance de beneficio/riesgo para el uso de dopamina en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson fue negativo antes del desarrollo de estas bombas anaerobicas.

Las dosis usadas para la administracion pueden adaptarse en funcion de diversos parametros, y en particular, en funcion del modo de administracion usado, de la patologfa relevante o, como alternativa, de la duracion deseada del tratamiento.

La presente invencion tambien proporciona una solucion farmaceutica y su uso como se ha descrito anteriormente, administrandose dicha solucion farmaceutica de manera continua con variaciones de dosis. Preferentemente, dicha solucion farmaceutica se administra con una dosis diurna predominante o con una dosis diurna exclusiva.

De hecho, los presentes inventores han descubierto que este protocolo de administracion reduce, e incluso evita, la taquifilaxis y permite una eficacia a largo plazo del tratamiento sin aumentar el riesgo de desarrollo de psicosis inducido por una dosis nocturna excesiva.

Dicho protocolo de administracion puede llevarse a cabo facilmente usando una bomba anaerobica como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, una bomba SYNCHROMED II. Por "administracion continua" se entiende una administracion de la solucion farmaceutica de la invencion en un penodo continuo, ya sea durante todo el dfa y la noche, es decir, durante 24 horas, o solo durante unas cuantas horas.

"Dosis diurna predominante" significa que la dosis nocturna es mas baja que la diurna, preferentemente, al menos un 25 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 50 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 70 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 80 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 90 % mas baja que la diurna.

Por "una dosis diurna exclusiva" se entiende que no hay una dosis nocturna.

En una realización particular, la solucion farmaceutica como se ha descrito anteriormente se administra con la siguiente pauta posologica:

- una dosis diurna continua y estable,

- un bolo administrado por la manana y

- opcionalmente, al menos un bolo cuando sea necesario, y/u

- opcionalmente, una dosis nocturna continua y estable mas baja que la dosis diurna, preferentemente, al menos un 25 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 50 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 70 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 80 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 90 % mas baja que la diurna.

Por "bolo" se entiende una dosis unica y relativamente alta de la solucion farmaceutica de la invencion que se administra para lograr un efecto inmediato. Preferentemente, el bolo es de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Se administra un bolo por la manana y, opcionalmente, cuando sea necesario, es decir, cuando el paciente necesite un efecto inmediato del tratamiento.

Los inventores han descubierto que este protocolo de administracion permite la determinacion de una dosis minima eficaz que puede variar de un paciente a otro. Los smtomas motores y no motores de la enfermedad de Parkinson se tratan sin ninguno de los efectos secundarios (disquinesias, fluctuaciones, psicosis...), que, en general, ocurren con la administracion periferica de tratamientos dopaminergicos (es decir, la administracion oral pulsatil de L-dopa, la administracion subcutanea de apomorfina, la administracion yeyunal de un gel de L-dopa) ni los riesgos de autoxidacion observados con la administracion central (intracerebroventricular) de la dopamina aerobica. Estas complicaciones o efectos secundarios pueden detenerse o incluso prevenirse si el tratamiento con dopamina anaerobica de acuerdo con la invencion se administra antes de la aparicion de dichas complicaciones. Ademas, el uso de esta dosis minima eficaz produce al menos una neuroproteccion y, en ultima instancia, incluso un restablecimiento neuronal. Por lo general, el uso de una bomba anaerobica permite determinar una dosis minima eficaz que se adapte a cada caso.

Por "dosis minima eficaz" se entiende una cantidad suficiente para ser eficaz, con una relacion beneficio/riesgo razonable aplicada a cualquier tratamiento medico. Se entendera, sin embargo, que el uso diario total sera decidido por el medico tratante dentro del alcance de un buen juicio medico. La dosis eficaz minima espedfica para cualquier paciente en particular que la necesite dependera de una variedad de factores que incluyen la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente, el tiempo de administracion, la via de administracion, la duracion del tratamiento; los medicamentos usados en combinacion o coincidentes con los factores similares conocidos en el campo de la Medicina. Por ejemplo, esta bien dentro de las habilidades del experto en iniciar dosis del compuesto a niveles inferiores que los requeridos para conseguir el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se logre el efecto deseado. Las dosis tambien pueden variar de acuerdo con la sensibilidad a la dopamina por parte del paciente. Por ejemplo, previamente, se ha observado una proporcion de 1/100 a 1/300 entre la dosis requerida administrada por via oral y la dosis administrada con una via intracerebroventricular (ICV) (por ejemplo, morfina, baclofeno).

En el presente documento, tambien se proporciona un metodo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson que comprende administrar dopamina a un paciente que lo necesite, en el que la dopamina se formula, acondiciona y administra anaerobicamente.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Estabilidad de la solucion de la invencion a lo largo del tiempo en bombas anaerobicas (A: SYNCHROMED II, B: ALZET 2001)

Figura 2: Restauracion del deficit motor en ratones de MPTP tras 7 dfas de infusion de dopamina intracerebroventricular o tratamiento oral con L-dopa. Las dosis de dopamina se expresan en jgM a y de L-dopa en mg/kgMa. Los datos se expresan en medias porcentuales ± ETM de ratones con solucion salina (n = 8-15). * frente a ratones de solucion salina, # frente a ratones de MPTP no tratados, p < 0,05 (pruebas de ANOVA de una via y LSD Fisher post-hoc).

A: velocidad media

B: distancia cubierta en zona de ensayo durante 10 min.

Figura 3: Modificaciones del contenido de neurotransmisores en el cuerpo estriado de ratones de MPTP tras 7 dfas de infusion de dopamina intracerebroventricular o tratamiento oral con L-dopa. Dopamina, acetato de dihidrofenilo (DOPAC) y acido homovamlico (HVA) (A, B), serotonina (5HT) y acetaldetndo de hidroxiindol (5HIA) (C, D) y noradrenalina (NA) (E, F) en el cuerpo estriado ipsilateral a la infusion de dopamina con bomba (A, C, E) y cuerpo estriado contralateral (B, D, F). Las dosis de dopamina de tratamiento se expresan en jg/dfa y de L-dopa en mg/kgMa. Los datos se expresan en medias porcentuales ± ETM de ratones de solucion salina (n = 8). * frente a ratones de solucion salina, # frente a ratones de MPTP no tratados, p < 0,05 (pruebas de ANOVA de una via y LSD Fisher post-hoc).

Figura 4: Restablecimiento de la tincion TH-ir en SNpc y cuerpo estriado de ratones de MPTP tras 7 dfas de infusion de dopamina intracerebroventricular preparada y administrada en condiciones anaerobicas, dopamina preparada y administrada en condiciones aerobicas o con tratamiento oral de L-dopa. Las dosis de dopamina se expresan en jg/dfa y de L-dopa en mg/kg/dfa. Los datos se expresan en medias porcentuales ± DT de ratones de solucion salina (n = 10). "dopamina A" significa dopamina preparada y administrada en condiciones anaerobicas, "dopamina O²" significa dopamina preparada y administrada en condiciones aerobicas. * significa una diferencia significativa entre la condicion designada y la condicion de solucion salina. # significa una diferencia significativa entre la condicion designada y la condicion de MPTP. p < 0,05 (pruebas de ANOVA de una via y LSD Fisher post-hoc).

A: Recuento de neuronas TH-ir en SNpc

B: Densidad optica TH-ir en el cuerpo estriado dorsal

Descripcion detallada de la invencion

Ejemplos

Ejemplo 1

El solicitante ejecuto su invencion usando ratones de MPTP. Estos ratones se intoxicaron con MPTP para reproducir las mismas complicaciones motoras que las inducidas por la enfermedad de Parkinson. La MPTP es una neurotoxina (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) que causa smtomas permanentes de la enfermedad de Parkinson mediante la destruccion de las neuronas dopaminergicas en la sustancia negra del cerebro.

Se produjeron diferentes soluciones de la invencion y se infundieron en ventnculos cerebrales usando una canula y una bomba ALZET en la que se habfa realizado una desoxigenacion previa con gas inerte.

Dichas soluciones se han realizado diluyendo clorhidrato de dopamina en solucion salina que previamente se han desoxigenado mediante lavado con nitrogeno en un gas inerte. Dichas soluciones tienen un pH comprendido entre 5,58 y 6,84 dependiendo de la dilucion. Este pH permite que la solucion sea bastante estable, ya que la dopamina esta en su forma protonada como se muestra en la figura 1.

Los ratones de MPTP obtienen sus funciones motoras "normales" con 0,06 mg/dfa de dopamina (DA con MPTP a 0,06) tras 7 dfas de tratamiento. Por el contrario, los ratones de control (LD con MPTP) que se trataron con dosis altas de L-Dopa tuvieron comportamientos anormales, tales como disquinesia, como se muestra en la figura 2. Se han analizado las "paredes ventriculares" de los grupos de ratones. Las paredes ventriculares de los ratones tratados con altas dosis de dopamina aerobica comprenden numerosas zonas negras, a diferencia de las paredes ventriculares de los ratones tratados con la solucion de la invencion.

El color negro se debe a la oxidacion de las paredes del ventnculo de la quinona de la dopamina y los radicales libres producidos por la oxidacion de la dopamina.

Por ultimo, los inventores descubrieron que el uso de una solucion de la invencion produce un efecto neuroprotector en las neuronas dopaminergicas de la sustancia negra, como se muestra en la figura 4.

Por lo tanto, en el presente documento se propone una solucion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en el que dicha solucion se administra con variaciones de dosis por infusion en el ventnculo lateral derecho, preferentemente, cerca del foramen interventricular, de modo que la solucion se puede administrar directamente en el tercer ventnculo. La invencion permite obtener un mayor equilibrio de beneficio/riesgo que los tratamientos conocidos anteriores.

Ejemplo 2

MATERIALES Y METODOS

Modelo de ratones de MPTP y diseno experimental

Se alojaron los animales por grupos (10 por jaula) en una sala con temperatura controlada (22 ± 2 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. Habfa comida y agua disponibles a voluntad en la jaula. Se respeto un penodo de habituacion de 7 dfas tras el transporte antes de cualquier manipulacion de los animales.

Se usaron ratones C57B1/6J macho de cinco meses de vida(Elevage Janvier, Le Genest St Isle, Francia) que pesaban 28-30 g. Los ratones recibieron cuatro inyecciones intraperitoneales (con intervalos de 2 h) de solucion salina que contema 0 ("ratones de solucion salina") o 20 mg/kg de MPTP ("ratones de MPTP") (Sigma Aldrich, St Louis, Mo , Estados Unidos). Se administro solucion salina o MPTP en el dfa 0 (D0), la infusion central continua de dopamina o el tratamiento con L-dopa periferica se administraron del dfa 7 al 14 (D7 a D14), y luego se realizaron la medicion locomotora espontanea y el sacrificio el D14.

T ratamientos

Se crearon trece grupos diferentes:

- Ratones sin implantacion de solucion salina (tratados con solucion salina)

- Ratones sin implantacion de MPTP (tratados con solucion salina)

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones anaerobicas con dopamina a 40 |jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones anaerobicas con dopamina a 60 |jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones anaerobicas con dopamina a 80 jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones anaerobicas con dopamina a 120 jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones anaerobicas con dopamina a 240 jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones aerobicas con dopamina a 60 jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones aerobicas con dopamina a 120 jg/dfa

- MPTP con implantacion de bomba llenada en condiciones aerobicas con dopamina a 240 jg/dfa

- Ratones de MPTP tratados con L-dopa a 12,5 mg/kg benzerasida a 12 mg/kg, i.p. dos veces al dfa

- Ratones de MPTP tratados con L-dopa a 25 mg/kg benzerasida a 12 mg/kg, i.p. dos veces al dfa

- Ratones de MPTP tratados con L-dopa a 50 mg/kg benzerasida a 12 mg/kg, i.p. dos veces al dfa Tratamiento con una solucion de la invencion

Las soluciones de la invencion se han preparado mediante la dilucion de clorhidrato de dopamina (a veces denominado de aqrn en adelante para abreviar "dopamina") (referencia H8502, Sigma-Aldrich) en solucion salina (NaCl al 0,9 %) que previamente se habfa desoxigenado mediante lavado abundante con nitrogeno en gas inerte. Dichas soluciones tienen un pH comprendido entre 5,58 y 6,84 dependiendo de la dilucion. Este pH permite que la solucion sea bastante estable, ya que la dopamina esta en su forma protonada.

La estabilidad de este farmaco en la bomba osmotica ALZET 2001 se probo durante 30 dfas a 37 °C usando un ensayo de HPLC de dopamina cada 4 dfas (vease la Figura 1B). La bomba osmotica ALZET 2001 se calibro para infundir a una velocidad de 1 pl/hora durante 7 d^ as.

La solucion de dopamina se inyecto en la bomba conectada a una canula de infusion cerebral, bien en condiciones aerobicas o anaerobicas. Los experimentos anaerobicos se procesaron en una atmosfera que contema hidrógeno al 5 %, dióxido de nitrogeno al 5 % y nitrogeno al 90 % (camara anaerobica/ambiental Bactron, Anaerobe System). Si apareda ox^geno, se combinaba directamente con hidrógeno, dando el agua recogida en un bote. Por otra parte, se anadio resazurina en el area como un indicador redox que cambia su color en presencia de oxfgeno. Luego, las bombas se mantuvieron en estas condiciones para el cebado durante 4 horas a 37 °C antes de la cirugfa estereotaxica.

Tratamiento con L-DOPA

Se administro L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) junto con un inhibidor de la DOPA descarboxilasa periferica para prevenir la smtesis periferica de la dopamina a partir de L-DOPA. Se disolvio clorhidrato de metilester de L-dopa (Sigma-aldrich) en solucion salina con benserazida a 12 mg/kg, independientemente de la dosis de L-dopa (Cenci y Lundblad, 2007) (19) y se preparo de forma extemporanea antes de cada inyeccion. La L-dopa se administro por via intraperitoneal (i.p.) dos veces al dfa durante 7 dfas a las dosis descritas previamente (Espadas et al., 2012; Fornai et al., 2000; Cenci y Lundblad, 2007) (19,21).

Preparacion de la bomba ALZET

La bomba escogida para el presente estudio fue el tipo 2001 con un volumen de reservorio de 200 pl, que permitio la infusion de 1 pl por hora durante 7 dfas. El kit de infusion cerebral proporciono una canula cerebral (calibre 30; DI = 0,16 mm; DE = 0,31 mm; longitud bajo el pedestal = 3 mm) y un soporte de canula adaptado para ratones. Se incluyo un tubo de cateter en el kit, y se puede cortar a la longitud necesaria para conectar la canula al moderador de flujo de la bomba ALZET. El cateter, que conecta la canula con la bomba, debe ser un 25 % mas largo que la distancia entre el sitio subcutaneo de la bomba y la ubicacion de la canula, para permitir el libre movimiento de la cabeza y del cuello del animal.

En condiciones ambientales adaptadas, en el recinto de la caja de manipulacion con guantes anaerobica, cuando se requena en el protocolo, se disolvieron las diferentes soluciones de dopamina, y las diferentes partes del conjunto de infusion cerebral y la bomba osmotica se llenaron con las soluciones de dopamina con una jeringa y un tubo de llenado espedfico.

Para eliminar definitivamente la presencia de burbujas de aire y "poner en marcha" la bomba, se requiere cebado; se colocaron las bombas precargadas en un bote cerrado anaerobico con solucion salina esteril al 0,9 % a 37 ° durante al menos cuatro horas. Para evitar cualquier mezcla de soluciones durante el cebado y la exposicion al oxfgeno durante la implantacion quirurgica, se uso parafilm para cubrir el extremo de la canula. El conjunto de infusion de la bomba y el cerebro ya esta listo para el implante.

Tambien se controlo que la bomba ALZET no tuviera un impacto negativo en el rendimiento de la actividad motora al comparar el rendimiento de la actividad motora de ratones de solucion salina y de MPTP bien sin implantacion (NI) o con implantacion de una bomba Alzet llena de solucion salina (solucion salina).

Implantacion de la bomba Alzet mediante cirugia

Se anestesiaron los ratones con hidrato de cloral (300 mg/kg, Sigma-Aldrich) y se colocaron en un marco estereotaxico. En resumen, tras la incision del cuero cabelludo y la limpieza/el secado del craneo, se realizo una perforacion a traves del craneo en coordenadas estereotaxicas para el ventnculo lateral derecho, B - 0,34 mm, L 1 mm (atlas cerebral de Paxinos y Watson). Luego, se inserto la bomba de Alzet llena por via subcutanea en el lomo del raton y se fijo la canula de infusion cerebral a un soporte de canula adaptado al marco estereotaxico. Se coloco el portador de la canula en las coordenadas estereotaxicas anteroposteriores y laterales requeridas, y la canula se bajo lentamente a traves del orificio trepanado, hasta el ventnculo lateral. Entonces, se anclo la canula de soporte al craneo con cemento acnlico. Una vez seca la incrustacion de cemento, se corto suavemente la cabeza del soporte de la canula, se suturo el cuero cabelludo y se dejo que los animales se recuperaran bajo una lampara caliente hasta que se despertaron. Tras la cirugfa, se realizaron cuidados diarios a lo largo del experimento.

Evaluacion de la actividad motora

Despues de 7 dfas de tratamiento (L-dopa i.p. o dopamina i.c.v), se registro la actividad motora espontanea en un actfmetro (Panlab, Barcelona, Espana) durante 10 minutos. El aparato era un recinto de plexiglas transparente de 45 x 45 x 35 cm dotado de dos marcos de rayos infrarrojos. Este aparato permitio medir la actividad motora horizontal (distancia recorrida, velocidad, tipo de movimiento) y el comportamiento posterior en funcion de las obstrucciones de los rayos infrarrojos. Los parametros escogidos se recogieron con el programa informatico Actitrack (Panlab, Barcelona, Espana).

Tincion y analisis de tirosina hidroxilasa nigroestriada

Despues de 7 dfas de tratamiento (L-dopa i.p. o dopamina i.c.v), se anestesiaron los animales profundamente con pentobarbital sodico y se perfundieron por via transcardiaca con paraformaldetndo al 4 % en tampon fosfato 0,1 M para la fijacion de tejidos (pH 7,4). Se extirparon los cerebros y, tras un proceso posterior a la fijacion, se crioprotegieron y se congelaron.

Se prepararon secciones coronales de cuarenta micrometros de espesor del cuerpo estriado y de la pars compacta de la sustancia negra (SNpc)/area tegmental ventral (VTA) usando un criostato (Leica, Nussloch, Alemania). Se tomaron cortes en serie de Bregma 0,98 mm a Bregma -0,82 mm para el cuerpo estriado, y de Bregma -2,92 mm a Bregma -3,42 mm para la SNc/VTA.

Se usaron esos cortes coronales de flotacion libre para el analisis inmunohistoqmmico. Se incubaron los cortes sucesivamente con anticuerpo policlonal de conejo anti-tirosina hidroxilasa (1:1000, Chemicon International, CA, EE. UU.), anticuerpo policlonal anti-conejo conjugado biotinilado de cabra (1:500, kit ABC de Vectastain elite, Vector Laboratories, C^a , EE.UU.), y el complejo de avidina/biotina conjugado con peroxidasa de rabano picante (kit ABC de Vectastain elite, Vector Laboratories, CA, Estados Unidos). Se expusieron los cortes luego a diaminobenzidina para la deteccion.

Se evaluo el numero de neuronas TH-ir (“inmunorreactivas a la tirosina hidroxilasa”) de la SNpc contando las neuronas TH-ir del hemisferio izquierdo y derecho en cada 4a corte de la SNpc de todos los grupos experimentales. Se uso el programa informatico de analisis de estereologfa Mercator (Explora Nova, La Rochelle, Francia) para realizar recuentos estereologicos imparciales de las neuronas TH-ir. Para la cuantificacion imparcial, se dibujo una lmea alrededor de la SNpc de cada corte. El observador tema ocultacion de los grupos experimentales. Las celulas se contaron con un aumento de 40, usando un microscopio Nikon Eclipse E600 (Tokio, Japon). Se usaron marcos de recuento aleatorios y sistematicos. El numero de neuronas TH-ir en la SNpc se evaluo contando las neuronas TH-ir del hemisferio izquierdo y derecho en cada cuarto corte de la SNpc de todos los grupos experimentales. Como no se encontro ninguna diferencia entre la SNps izquierda y derecha, se agruparon las neuronas TH-ir contadas de ambos lados y para cada animal, se calculo una suma de neuronas contadas en cada corte. Para el cuerpo estriado dorsal, se evaluo la tincion con TH como una densidad optica en cada corte, se calculo un valor de densidad optica medio para cada animal.

Cromatografia liquida de alto rendimiento

Catorce dfas despues de la inyeccion de MPTP o de solucion salina para los ratones o 7 dfas despues de la implantacion de la bomba, se anestesiaron los animales profundamente con pentobarbital sodico y se perfundieron por via transcardiaca con solucion salina recien preparada. Se extirparon los cerebros rapidamente y se diseccionaron para recoger el cuerpo estriado izquierdo y derecho, que se congelaron inmediatamente en nitrogeno lfquido. Se determinaron la dopamina, los metabolitos y la 5-cisteinil-dopamina mediante HPLC usando una columna Chromsystems 6100 y la fase movil de Chromsystems mediante deteccion colorimetrica (Coulochem III, Thermo Fisher).

Analisis estadistico

Todos los datos se expresaron como la media ± ETM (o DT en la tabla). Para todos los parametros, se uso un ANOVA de una via para evaluar el efecto del grupo, seguido de la prueba LSD Fisher post hoc (STATISTICA 6.1, Statsoft, Francia). Si los datos no segrnan una distribucion gausiana, se realizo un analisis de la varianza de Kruskal-Wallis, seguido de una prueba de Mann-Whitney post hoc (STATISTICA 6.1, Statsoft, Francia). La significancia se fijo en p < 0,05.

RESULTADOS EXPERIMENTO 1: Determinacion de la eficacia de la infusion de dopamina en el deficit motor de ratones de MPTP (registrada mediante actimetna)

En el siguiente experimento, el uso del termino "dopamina" significa "dopamina anaerobica".

Para evaluar la eficacia de la infusion de dopamina central (es decir, la infusion de dopamina intracerebroventricular) frente a L-dopa periferica en ratones de MPTP, se realizo la medicion de la sintomatologfa y de la actividad locomotora despues de cada tratamiento. Como se muestra en la Figura 2 y como se ha informado anteriormente (Laloux et al., 2012) (22), los ratones de MPTP mostraron una reduccion en la velocidad media y la distancia recorrida en la zona de ensayo.

Siete dfas de infusion intracerebro-ventricular de dopamina restablecieron la velocidad media y la distancia cubierta, independientemente de las cinco dosis ensayadas en ratones tratados con MPTP. Por el contrario, la actividad locomotora espontanea en ratones tratados con MPTP se restablecio solo para 50 mg/kg/dfa de tratamiento con L dopa periferica, mientras que 25 y 100 mgMa no tuvieron efecto (Figura 2).

La potenciacion motora descrita en el presente estudio demostro que la dopamina administrada por infusion intraventricular puede penetrar a traves del cuerpo estriado e inducir una potenciacion motora en modelos de roedores que padecen la enfermedad de Parkinson.

Asimismo, se observo que la dosis minima eficaz de dopamina anaerobica es la dosis de 0,06 mgMa, que permitio un restablecimiento significativa y total de la actividad motora normal. Tambien se observo el efecto clasico de la dosis de dopamina de 0,04 (con menor eficacia en la funcion motora) a 0,12 mgMa (sobredosis sobre la funcion motora). Esto refleja perfectamente la situacion conocida de los pacientes con enfermedad de Parkinson. La dosis mas alta, de 0,24 mgMa, se esta volviendo menos eficaz como una situacion de sobredosis.

Por ultimo, pero no menos importante, se observo un restablecimiento de la actividad motora normal tras siete dfas de infusion de dopamina intracerebro-ventricular en condiciones anaerobicas. Al contrario de los estudios previos en los que la dopamina no se administro en condiciones anaerobicas (Yebenes et al.) (16) y en los que la actividad motora disminuyo tras dos o tres dfas de tratamiento (que es un signo de taquifilaxis), siete dfas de tratamiento de la invencion no inducen taquifilaxis.

EXPERIMENTO 2: La infusion de dopamina cerebral y el tratamiento periferico con L-dopa modificaron diferencialmente el contenido de dopamina, noradrenalina y serotonina en el cuerpo estriado de los ratones En el siguiente experimento, el uso del termino "dopamina" significa "dopamina anaerobica".

Despues de haber mostrado un restablecimiento de los parametros motores en ratones de MPTP tratados con la solucion de la invencion, se analizaron las modificaciones de neurotransmision inducidas por ambos tratamientos; es decir, la solucion de la invencion y L-Dopa, sobre la estructura cerebral espedfica, es decir, el cuerpo estriado dorsal.

Como se muestra en la Figura 3, la intoxicacion por MPTP indujo una reduccion del aproximadamente 85-90 % del contenido de dopamina (tambien del 70-80 % para DOPAC y del 60-70 % para HVA), del 35-50 % de noradrenalina y del 40-40 % de serotonina (tambien del 20-50 % de HIA) en cada cuerpo estriado.

La infusion de dopamina cerebral y el tratamiento periferico con L-dopa indujeron modificaciones significativas de los contenidos en el cuerpo estriado de dopamina, noradrenalina y serotonina en ratones de MPTP.

Asimismo, se puede observar un efecto de dosis paralela entre la dosis de dopamina administrada a traves de la infusion intracerebro-ventricular y la dosis de la dopamina dentro del cuerpo estriado. Esto muestra que la dopamina puede atravesar la barrera ventricular y alcanzar la zona diana del cuerpo estriado con un efecto de dosis logico. Hay un efecto maximo alcanzado a los 0,12 mgMa. De hecho, el aumento de la dosis hasta 0,24 mgMa no permitio aumentar la dosis de dopamina. Esto se correlaciona perfectamente con los resultados de la funcion motora medida por actimetna.

En el lado infundido (cuerpo estriado ispsilateral), la dopamina a 60 y 80 jgM a aumento el contenido de HVA sin efecto en el contenido en el cuerpo estriado de DA o DOPAC y sin modificacion de los sistemas de neurotransmision de NA o 5HT en comparacion con los ratones de MPTP no tratados. Las dosis mas altas de dopamina, de 120 y 240 jgM a, fueron capaces de aumentar el contenido de DA y metabolitos, y la dosis de 240 jgM a tambien aumento el contenido de HIA y NA (Figura 3, A,C,E).

En el lado no infundido (cuerpo estriado controlateral), la dopamina a 60 y 80 jgM a no tuvo efecto, mientras que las dosis mas altas aumentaron los metabolitos de dopamina y serotonina (DOPAC, HVA, HIA) sin efecto sobre NA (Figura 3, B,D,F).

La inyeccion periferica de 25 mgMa de L-dopa no tuvo ningun efecto sobre la neurotransmision dopaminergica, pero indujo un aumento de serotonina y noradrenalina en ambos cuerpos estriados, superando el contenido en el cuerpo estriado de los ratones de control, mientras que las dosis mas altas, es decir, de 50 y 100 mgMa, indujeron un aumento significativo de la dopamina y los metabolitos en el cuerpo estriado, sin efecto complementario sobre el contenido de serotonina y noradrenalina (Figura 3 C a F).

Sorprendentemente, la L-dopa periferica y la dopamina central tuvieron efectos opuestos dependientes de la dosis. Las dosis bajas de L-dopa indujeron un aumento en el contenido de NA y 5HT, y solo las dosis mas altas fueron capaces de modificar la dopamina, mientras que la infusion central de dopamina indujo primero un aumento de la dopamina, y las dosis mas altas aumentaron el contenido de NA y 5HT. En otros lugares, la dopamina central indujo un aumento en la dopamina y los metabolitos, mientras que la L-dopa aumento primero la dopamina con poco efecto sobre los metabolitos, lo que sugiere que la dopamina tambien indujo un aumento en el recambio de la dopamina. La L-dopa por via oral indujo un alto nivel de dopamina extracelular con un menor recambio de dopamina, lo que sugiere un uso insuficiente de dopamina y un riesgo de toxicidad por dopamina. Por el contrario, la dopamina administrada i.c.v. se usa con un bajo nivel de dopamina extracelular y un menor riesgo de toxicidad relacionada con la administracion exogena de dopamina/L-dopa. La toxicidad de la L-dopa tambien podna ser mayor con respecto al menor nivel de almacenamiento (es decir, el menor nivel de neuronas dopaminergicas restantes: neuronas ^t H+). EXPERIMENTO 3: Determinacion del impacto de la infusion de dopamina en las lesiones de las vias nigroestriadas en ratones de MPTP.

Como se muestra en la Figura 4, primero se observa que el modelo de MPTP es eficaz, ya que la administracion de MPTP produjo una perdida del 44,3 % de las neuronas con expresion de TH en la SNpc en comparacion con los ratones inyectados con solucion salina y una perdida del 38,2 % de las neuronas con expresion de TH en el cuerpo estriado en comparacion con los ratones inyectados con solucion salina.

De forma interesante, la infusion anaerobica de dopamina a 60 y 80 |jgMa indujo un aumento significativo en las neuronas TH-ir en la SNpc, de respectivamente el 30,65 % y el 25,19 %, en comparacion con los ratones tratados con MPTP, mientras que el tratamiento con L-dopa o la difusion de dopamina aerobica (3 h de aerobia) no tuvo ningun efecto significativo (Figura 4A). Por otra parte, si las condiciones aerobicas se mantienen durante 12 h, una dosis de 240 |jgMa induce la muerte en todos los animales.

El efecto neuroprotector observado de la infusion de dopamina anaerobica intracerebro-ventricular fue sorprendente y revelo una gran ventaja en comparacion con la L-dopa periferica o la infusion de dopamina aerobica intracerebroventricular, que no pudieron reproducir este efecto.

En el cuerpo estriado, la infusion anaerobica de dopamina i.c.v. a dosis de 40, 60 y 80 pg/dfa revierte la perdida de terminaciones TH-ir en ratones de MPTP, mientras que el tratamiento oral con L-dopa o la difusion de dopamina aerobica no.

Esos resultados proporcionaron evidencia de una recuperació dne TH-ir despues de la infusion anaerobica i.c.v. continua de dopamina en el cuerpo estriado, pero tambien en la SNpc (dependiendo de la dosis administrada), mientras que la infusion continua i.c.v. de dopamina aerobica o la L-dopa intermitente periferica no. Esta recuperació fnuncional puede ser representativa de diferentes fenomenos, ya sea el brote sinaptico de neuronas dopaminergicas supervivientes o celulas locales que cambian hacia un fenotipo dopaminergico o celulas recien reclutadas de un nicho de neurogenesis.

Se demostro asf que se logro un numero significativamente mayor de celulas dopaminergicas dentro de la sustancia negra con una dosis minima eficaz de 60 |jgMa de dopamina anaerobica. De forma interesante, el efecto de la dosis en la neuroproteccion se correlaciona con los resultados previos sobre la funcion motora (vease el Experimento 1) y la neurotransmision nigroestriada dopaminergica (vease el Experimento 2).

Finalmente, se observo un buen mdice terapeutico (hasta 6 veces la dosis minima eficaz), ya que no se observo un empeoramiento de la degeneracion. De hecho, el intervalo entre la dosis eficaz mas baja y la primera dosis toxica fue amplio, ya que la dosis de 240 (6 veces la primera dosis eficaz de 40) no fue toxica.

EXPERIMENTO 4: Evaluacion de la dopamina autoxidada relacionada con la dosis en el cuerpo estriado para las diferentes dosis (5-cisteinil dopamina)

En el siguiente experimento, "dopamina" significa "dopamina anaerobica".

Incluso si el fenotipo TH de las neuronas nigroestriadas no fue alterado, permanece el posible efecto toxico de un exceso de dopamina extracelular. De hecho, el tratamiento con L-dopa o dopamina ha demostrado ser toxico para las neuronas supervivientes al causar un estres oxidativo adicional debido a los productos de autoxidacion de mayor contenido de dopamina y su recambio. Tanto la dopamina como su precursor L-dopa pueden autoxidarse produciendo un radical de semiquionona y, posteriormente, una quinona mas estable que reaccione con la cistema, glutation o cistema libres que se encuentran en la protema (Hastings y zigmond, 1994; Pattison et al., 2002) (23,24). La reaccion entre la dopamina quinona y la cistema produce la formacion de 5-cisteinil-dopamina, un metabolito oxidativo estable de la dopamina que es toxico para las celulas. Esto podna inducir un aumento en las especies oxidativas reactivas que tienen consecuencias perjudiciales para los tejidos.

Por lo tanto, se analizo si la infusion de dopamina central indujo la autoxidacion de la dopamina a traves de la determinacion de la concentracion del derivado de 5-cisteinil-dopamina en el cuerpo estriado inyectado.

Los resultados se muestran en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: Concentracion de 5-cisteinil-dopamina en el cuerpo estriado (los datos se expresan como la media ± ETM. Las dosis de dopamina (DA) se expresan en pgMa. La importancia estad^stica se evaluo con el analisis de varianza de Kruskall wallis y la prueba LSD Fisher post-hoc. El umbral significativo se establecio en p < 0,05; *frente a solucion salina; # frente a MPTP).

Un ligero aumento en la 5-cisteinil-dopamina muestra un ligero aumento en la autoxidacion de la dopamina. Sin embargo, como se muestra anteriormente, esta ligera autoxidacion no indujo un empeoramiento de la neurodegeneracion dentro del cuerpo estriado ni dentro de la sustancia negra, y se observo un efecto neuroprotector.

La coloracion de las paredes ventriculares es un buen indicador de la oxidacion realizada. Opuesta a las experimentaciones previas realizadas con dopamina sin preparacion anaerobica (Yebenes et al., 1987) (16), la dopamina preparada en anaerobia y preparada con dosis adaptadas indujo una oxidacion muy baja de la pared ventricular (es decir, una coloracion negra de la pared correspondiente a la oxidacion grave).

Solo se observo una coloracion marron muy leve en una parte muy pequena de la pared ventricular cercana a la canula de infusion (vease la primera columna de la Tabla: tres ratones de los ocho solo mostraron una ligera coloracion parcial marron). Esto se explica por la ligera autoxidacion de la dopamina como se demostro con el aumento paralelo de 5-cisteinil-dopamina.

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(25) DE YEBENES J. G. ET AL: "Continuous intracerebroventricular infusion of dopamine and dopamine agonists through a totally implanted drug delivery system in animal models of Parkinson's disease", JOURNAL OF NEURAL TRANSMISSION. SUPLEMENTO, SPRINGER, AUSTRIA, vol. 27, N.° de suplemento, 1 de enero de 1988 (01-01-1988), paginas 141-160.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una solucion farmaceutica que comprende al menos dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en el que dicha solucion farmaceutica se mantiene en condiciones anaerobicas desde su formulacion hasta su administracion.

2. La solucion farmaceutica para el uso de acuerdo con la 1, en la que la dopamin rae eivsin cldoirchaidcraióton de dopamina.

3. La solucion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la solucion farmaceutica esta exenta de agente conservante.

4. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solucion esta adaptada para ser administrada en el ventnculo cerebral, preferentemente, en el ventnculo lateral derecho, preferentemente, cerca del foramen interventricular.

5. La solucion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha solucion esta adaptada para ser administrada con una bomba anaerobica.

6. La solucion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha solucion se administra de manera continua con variaciones de las dosis.

7. La solucion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha solucion se administra con una dosis diurna predominante o con una dosis diurna exclusiva.

8. La solucion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha solucion se administra con la siguiente pauta posologica:

- una dosis diurna continua y estable,

- un bolo administrado por la manana y

- opcionalmente, al menos un bolo cuando sea necesario, y/u

- opcionalmente, una dosis nocturna continua y estable mas baja que la dosis diurna, preferentemente, al menos un 25 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 50 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 70 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 80 % mas baja que la diurna, mas preferentemente, al menos un 90 % mas baja que la diurna.