ES2715638T3 - Polipéptidos que se unen al complemento humano C5 - Google Patents

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Malin Lindborg
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Abstract

Polipéptido de unión a C5, que comprende un motivo de unión a C5, BM, motivo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D, en la que, independientemente entre sí, X2 se selecciona de H, Q, S, T y V; X3 se selecciona de I, L, M y V; X4 se selecciona de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y; X6 se selecciona de N y W; X7 se selecciona de A, D, E, H, N, Q, R, S y T; X11 se selecciona de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de I, L y V; X18 se selecciona de A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T; X21 se selecciona de I, L y V; X25 se selecciona de D, E, G, H, N, S y T; X26 se selecciona de K y S; X28 se selecciona de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86% de identidad con la secuencia definida en i), en la que el polipéptido se une a C5; en la que dicho motivo de unión a C5 forma parte de un dominio del conjunto de proteínas de tres hélices, y en la que dicho polipéptido de unión a C5 muestra actividad de unión a C5 humano y a C5 de modelos animales, tales como ratón o rata.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos que se unen al complemento humano C5
Campo técnico
La presente descripción se refiere a polipéptidos que se unen al componente del complemento humano 5 (C5) y al uso de dichos polipéptidos en terapia.
Antecedentes
La proteína del complemento C5 es un componente principal del sistema del complemento; una parte clave del sistema inmunitario innato. El sistema del complemento es un sistema de supervivencia inmunitario intrincado con numerosas tareas en diversos procesos estrechamente controlados. Una de sus funciones es como defensa del huésped de la primera línea contra una infección a través de otros organismos mediante la discriminación de los tejidos huésped sanos de los restos celulares y células apoptóticas y necróticas. Además, está involucrado en la depuración de los complejos inmunitarios, la regulación de la respuesta inmunitaria adaptiva, la promoción de la regeneración tisular, la angiogénesis, la movilización de las células madre, y el desarrollo del sistema nervioso central (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48 (14):1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795). Cualquier desencadenante, por ejemplo, activación errónea o sin restricciones o regulación insuficiente, que altere el fino equilibrio de la activación y la regulación del complemento pueden llevar a afecciones patológicas, incluyendo el auto-ataque de las células huésped, lo que conduce a un extenso daño tisular.
El sistema del complemento consiste en aproximadamente 30 proteínas. Existen tres trayectorias para iniciar la inmunidad del complemento; la trayectoria clásica que emplea C1q para reconocer complejos inmunitarios en la superficie de las células, la ruta de lectina que se inicia cuando la lectina de unión a manosa (MLB) reconoce ciertos azúcares y la ruta alternativa que se inicia espontáneamente por la hidrólisis del factor del complemento 3 (C3), un proceso suprimido por ciertas moléculas de superficie de la célula que no están presentes en los patógenos invasores. La ruta alternativa también actúa como un bucle de amplificación para el sistema del complemento. Las tres rutas convergen en el nivel de C3. La escisión de C3 en C3a y C3b conduce a la formación de una convertasa que, a su vez, escinde el factor del complemento 5 (C5) en C5a y C5b. C5a es un atrayente muy potente de diversas células inmunitarias, mientras C5b se oligomeriza con C6-9 para formar un poro conocido como el complejo de ataque a membrana (MAC) o a veces el complejo terminal del complemento (TCC). La activación del sistema del complemento conduce a varios mecanismos con el propósito de neutralizar el patógeno; la formación del MAC en la superficie de una célula tal como una bacteria invasora que conduce a la lisis, la disposición de los productos de escisión de C3 C4, C3b y C4b ayuda a la opsonización que conduce a la fagocitosis del patógeno por medio de macrófagos y anafilatoxinas tal como C3a y C5a atrae monocitos y neutrófilos al sitio de la activación, regula positivamente los marcadores de superficie lo que conduce a una susceptibilidad inmunológica aumentada y a la liberación de citocinas.
C5 es una glucoproteína de 190 kDa compuesta por 2 cadenas polipeptídicas ligadas a disulfuro, alfa y beta, con una masa molecular de 115 y 75 kDa, respectivamente (Tack et al. Biochem 1979, 18:1490-1497). Haviland et al. (J Immun 1991, 146: 362-368) construyeron la secuencia de ADNc completa del complemento humano pro-C5, que se pronostica que codifica una pro-molécula del aminoácido 1.676 que contiene un péptido líder del aminoácido 18 y un conector del aminoácido 4 que separa las cadenas alfa y beta. El bloqueo de la escisión de C5 en C5a C5b evita la formación de MAC y la formación de C5a pro-inflamatorio, pero deja el sistema efector del complemento aguas arriba intacto permitiendo la opsonización mediada por C3/C4.
El papel clave del sistema del complemento en la defensa contra patógenos en general hace de éste un objetivo interesante para intervención farmacéutica. Esto se enfatiza por el hecho de que muchas mutaciones o regulaciones alteradas del complemento están involucradas en diversas enfermedades y afecciones. Estas incluyen la susceptibilidad aumentada a enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico (SLE), donde la deposición de los complejos inmunitarios activa la ruta clásica (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456). Además, las mutaciones de las proteínas del complemento C1-C5 a menudo dan como resultado SLE o síntomas de tipo SLE. Otras enfermedades autoinmunes con una fuerte participación del sistema del complemento son artritis reumatoide (AR), donde los complejos inmunitarios pueden activar el complemento en la articulación de la AR, síndrome de Sjógren, dermatomiositis y otras enfermedades estimuladas por el autoanticuerpo, tales como síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Fisher (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12) diferentes tipos de vasculitis, esclerosis sistémica, membrana basal anti-glomerular (anti-GBM) y el síndrome anti-fosfolípido (APS) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286).
El sistema del complemento además está involucrado en los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), donde las placas Ap activan directamente el sistema del complemento que conduce al reclutamiento mediado por C5a de la microglía. Esto además se confirma cuando un antagonista de C5aR demostró ser neuroprotector en un modelo de ratón de EA (Fonseca et al. J Immunol 2009, 183:1375-1383). Los auto-anticuerpos contra el receptor de acetilcolina y la posterior activación del complemento son la causa más común de miastenia gravis, una enfermedad que afecta a las uniones neuromusculares (Toyka y Gold, Schweizer Archive Neurol Psych 2007, 158:309-321). La formación del MAC está involucrada en la patofisiología de la esclerosis múltiple (EM) (Oh et al. Immunol Res 2008, 40:224-234). Además, en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y las enfermedades por priones, tal como enfermedad de Creutzfeld-Jacob, la activación del complemento es una parte de la patología (Bonifati y Kishore, Mol Immunol 2007, 44:999-1010). En la cicatrización de heridas, las respuestas inflamatorias son un componente clave para restaurar la homeostasis tisular y el sistema del complemento está involucrado en el temprano reconocimiento del tejido dañado. Sin embargo, en modelos de heridas crónicas y quemaduras severas, por ejemplo, la inhibición del complemento, por ejemplo, por el inhibidor de C1 dio como resultado una cicatrización mejorada y un daño tisular reducido sugiriendo ese complemento. Además, diversas deficiencias del complemento, tales como se ilustra por el ratón con inactivación genética de C4, se han encontrado como protectoras contra daños tisulares a largo plazo que son resultado de heridas (revisado en Cazender et al. Clinical and Developmental Immunology 2012, publicación en línea). Por último, se ha demostrado que el crecimiento tumoral y la proliferación se facilitan por la activación del complemento, en particular por C5a, y que el bloqueo del receptor de C5a ralentiza este proceso. Además, los ratones que carecen de C3 muestran un crecimiento tumoral significativamente más lento que sus crías naturales (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235).
La regulación disfuncional del complemento es la causa de varias afecciones de raras a ultra-raras, tales como hemoglobinuria nocturna paroxística (PNH) y síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), donde la hemólisis es un rasgo clave en la patología. En PNH, un clon de las células madres hematopoyéticas con el gen PIG-A mutado que codifica la subunidad A de fosfatidilinositol N-acetilglucosaminiltransferasa se apodera de un grupo de células sanguíneas. Esta mutación conduce a la pérdida de proteínas ancladas por GPI tales como los reguladores del complemento CD55 y CD59. Los glóbulos rojos que carecen de CD55 y CD59 en la superficie se exponen a la lisis mediada por el complemento por MAC. Clínicamente, la PNH se manifiesta por la hemólisis que conduce a anemia, trombosis y aplasia medular. HUS atípica está provocada por mutaciones en las proteínas reguladoras de principalmente la ruta alternativa, tal como por mutaciones en el factor H.
El ojo es fuertemente indicado como un sitio para la patología inducida por el complemento. La causa más común de pérdida visual es la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) donde, en su forma más grave (AMD exudativa o húmeda), las membranas neurovasculares coroideas patológicas se desarrollan bajo la retina. En Estados Unidos, aproximadamente el 10% de la población con edades de 65-74 muestran signos de degeneración macular y como máximo el 5% tienen deterioro visual como resultado de la AMD. Estos números aumentan drásticamente con la edad, pero también existen factores genéticos. Entre estos genes los más fuertes asociados con la AMD son el factor del complemento H, factor B y C3 y el inhibidor de C1 (Bradley et al. Eye 2011, 25:683-693). Además, varios estudios y ensayos clínicos que utilizan varias moléculas de bloqueo del complemento han demostrado ser beneficiosas, sugiriendo que una molécula de bloqueo C5 podría ayudar a este grupo de pacientes. Sin embargo, los tratamientos actuales de AMD avanzada se dirigen hacia la inhibición de la vascularización inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mediante inyecciones intra-vítreas de, por ejemplo, Ranibizumab (fragmento de anticuerpo monoclonal) y Bevacizumab (anticuerpo monoclonal). En modelos de animal de uveítis, la inflamación del ojo debido a las respuestas inmunitarias a antígenos oculares, los anticuerpos de bloqueo frente al factor B de la ruta alternativa (Manickam et al. J Biol Chem 2011, 286:8472-8480), así como contra C5 (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314), mejoran el estado de la enfermedad.
En el trasplante de órganos sólidos, existen dos rutas mecánicas principales que conducen al rechazo o función retrasada/alterada del injerto: 1) las barreras inmunológicas entre el donante y el receptor con respecto al grupo sanguíneo (ABO) y las clases MCH, así como el grado de presensibilización del receptor frente al donante, es decir, la aparición de anticuerpos específicos del donante (DSA) que llevan a un rechazo agudo mediado por el anticuerpo (AMR); y 2) la condición del órgano trasplantado, así como el periodo de tiempo en que se ha mantenido sin una perfusión de sangre constante, es decir, el grado de daño isquémico o lesión por reperfusión/isquemia (IRI) del injerto. En ambas, AMR e IRI, el sistema del complemento está atacando al órgano reconocido como foráneo y, por lo tanto, una entidad que debe rechazarse. En AMR, los anticuerpos anti-donante preexistentes rápidamente forman complejos inmunitarios en la superficie del órgano foráneo, lo que conduce al reconocimiento por medio de C1q y la posterior activación del sistema del complemento vía la ruta clásica. Este proceso, conocido como rechazo híperagudo, sucede en minutos y, por consiguiente, el moderno trasplante de órganos incompatibles incluye la eliminación de DSA antes del trasplante por medio de plasmaféresis o intercambio plasmático e IgG intravenosa combinada con diferentes inmunosupresores. Los nuevos tratamientos también incluyen agotamiento de linfocitos B a través del uso del anticuerpo anti-CD20 Rituximab (Genberg et al. Transplant 2008, 85:1745-1754). Estos protocolos han eliminado vastamente la aparición del rechazo híper-agudo, pero aún, en pacientes altamente sensibilizados, la incidencia de AMR aguda (semanas-meses) es tan alta como del 40% (Burns et al. Am J Transplant 2008, 6:2684-2694; Stegall et al. Am J Transplant 2011, publicación en línea anterior). Con respecto a IRI, la mayor parte de los puntos de evidencia en la ruta terminal con la posterior formación de MAC y la lisis como la causa principal del daño celular. Por lo tanto, un polipéptido de bloqueo de C5 sería protector contra el rechazo independientemente de que la causa sea AMR, IRI o, como sucede a menudo, una combinación tanto de AMR como de IRI. Como se esperaba, los órganos altamente perfundidos, tales como el hígado (Qin et al. Cell Mol Immunol 2006, 3:333-340), el corazón y los riñones son particularmente susceptibles al daño mediado por el complemento.
La colocación central de la proteína C5; la conexión de las partes próxima y terminal de la cascada del complemento, las hace un objetivo atractivo para intervención farmacéutica. Debido a que C5 es común en todas las rutas de la activación del complemento, el bloqueo de C5 detendrá el avance de la cascada independientemente del estímulo y evita de este modo las propiedades perjudiciales de la activación del complemento terminal mientras deja las funciones inmunoprotectoras e inmunorreguladoras de la cascada del complemento proximal intactas.
Se conocen anticuerpos dirigidos al complemento humano C5 a partir de los documentos, por ejemplo, WO 95/29697; WO 02/30985; y WO 2004/007553. Eculizumab (Soliris™) es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína C5 y previene la escisión de C5 en C5a y C5b. Eculizumab ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de PNH, una enfermedad rara y a veces mortal de la sangre caracterizada por anemia hemolítica intravascular, trombofilia y aplasia medular, y está aprobado para esta indicación. Eculizumab también fue recientemente aprobado por la FDA para el tratamiento del síndrome hemolítico atípico (aHUS), una enfermedad rara pero potencialmente mortal provocada por la pérdida del control de la ruta del complemento alternativa que conduce a la sobre-activación manifestada como microangiopatía trombótica (TMA) que conduce a un riesgo de daño constante en los órganos vitales, tales como el riñón, el corazón y el cerebro. En aHUS, el trasplante del órgano dañado solo ayuda temporalmente al paciente ya que el hígado continúa produciendo la forma mutada de la proteína de control (casi siempre el factor del complemento H u otras proteínas de la ruta alternativa). Una enfermedad relacionada con una patofisiología aguda transitoria es HUS causado por infección de E. coli positivo para la toxina Shiga (STEC-HUS) (STEC-HUS) y existen datos prometedores que sugieren la eficacia también para esta afección (Lapeyraque et al. N Engl J Med 2011, 364:2561-2563). Finalmente, el anticuerpo de bloqueo de C5 Eculizumab ha demostrado ser eficaz en la prevención de AMR en receptores de riñones altamente incompatibles (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413).
Aparte de los anticuerpos de longitud completa, se describen en la bibliografía los fragmentos variables monocatenarios (scFV), minicuerpos y aptámeros que activan C5. Estos inhibidores de C5 pueden unirse a través de diferentes sitios (epítopos) en la molécula C5 y pueden tener diferentes modos de acción. Por ejemplo, mientras Eculizumab interactúa con C5 a cierta distancia del sitio de escisión de convertasa, el minicuerpo Mubodina® interactúa con el sitio de escisión de C5. Se ha formulado la hipótesis de que inhibidor del complemento Ornithodoros moubata de la proteína inhibidora de C5 (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091) de la garrapata blanda Ornithodoros moubata se une al extremo distal del superdominio CUB-C5d-MG8, que está cerca del sitio de escisión de la convertasa (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7):753-760). En contraste con las tres proteínas mencionadas anteriormente que inhiben la escisión de C5, el anticuerpo monoclonal TNX-558 se une a un epítopo C5a presente tanto en C5 intacto como en C5a liberado sin inhibir la escisión de C5. (Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2):160-169).
Los anticuerpos con sus puentes disulfuro grandes de estructura multidominio, intra-cadena 12 e inter-cadena 4 y los patrones de glucosilación de complejo, tienen varias desventajas intrínsecas relacionadas con su estructura molecular. Por ejemplo, el tamaño del Eculizumab es de aproximadamente 148 kDa. La concentración de C5 en sangre humana es de aproximadamente 400 nM y con el fin de bloquear la actividad de C5 completamente, la concentración del inhibidor deber ser al menos igual o mayor que ésta. Por consiguiente, el régimen de tratamiento a largo plazo estándar de PNH usando Soliris™ son infusiones intravenosas de 900 mg de proteína cada dos semanas, un tratamiento que principalmente tiene lugar en la clínica que conduce a una gran inconveniencia para el paciente y coste para la sociedad. También se ha notificado que Soliris™ causa dolor de pecho, fiebre, escalofríos, picazón, urticaria, enrojecimiento de la cara, sarpullido, mareos, problemas para respirar, o hinchazón de la cara, lengua y garganta, a pesar de que las razones de estos efectos secundarios no son claras. Además, no está activo en ningún modelo de animal ensayado, incluyendo primates, imposibilitando los estudios de animales con el fármaco activo. Como se menciona anteriormente, los tratamientos actuales de AMD también dependen del anticuerpo y, por lo tanto, los tratamientos basados en inyecciones u otras rutas de administración con moléculas de menor peso molecular, son altamente requeridos.
Además, la producción del anticuerpo es más difícil y más costoso que la producción de pequeñas proteínas (Kenanova et al. Expert Opin Drug Deliv 2006, 3 (1):53-70). Otros inconvenientes generalmente relacionados con los anticuerpos se enumeran por Reilly et al. (Clin Pharmacokinet 1995, 28:126-142), tal como la reactividad cruzada y la unión no específica a tejidos normales, un metabolismo aumentado de los anticuerpos inyectados y la formación de anticuerpos anti-humanos (HAMA) que causan la reducción o pérdida del efecto terapéutico.
Por lo tanto, la provisión continua de agentes con actividad de bloqueo de C5 comparable sigue siendo un tema de interés sustancial dentro del campo. En particular, existe la necesidad continua de moléculas que eviten la cascada del complemento terminal, así como la formación de la molécula pro-inflamatoria C5a. También es de gran interés una provisión de usos de dichas moléculas en el tratamiento de la enfermedad.
Descripción
Es un objeto de la invención proporcionar nuevos agentes de unión a C5. Es además otro objeto de la invención proporcionar nuevos agentes de unión a C5 para su uso en aplicaciones terapéuticas.
En un aspecto, se proporciona un polipéptido de unión a C5, que comprende un motivo de unión a C5, BM, cuyo motivo consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de
i)
EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D,
en la que, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de H, Q, S, T y V;
X3 se selecciona de I, L, M y V;
X4 se selecciona de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X6 se selecciona de N y W;
X7 se selecciona de A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X11 se selecciona de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X16 se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de I, L y V;
X18 se selecciona de A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X21 se selecciona de I, L y V;
X25 se selecciona de D, E, G, H, N, S y T;
X26 se selecciona de K y S;
X28 se selecciona de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86% de identidad con la secuencia definida en i), en la que el polipéptido se une a C5;
en la que dicho motivo de unión a C5 forma parte de un dominio del conjunto de proteínas de tres hélices, y en la que dicho polipéptido de unión a C5 muestra actividad de unión a C5 humano y a C5 de modelos animales, tales como ratón o rata.
La clase definida anteriormente de polipéptidos relacionados con la secuencia que tienen una afinidad de unión para C5 se deriva de una secuencia de polipéptido parental común. Más específicamente, la definición de la clase se basa en el análisis de un gran número de variantes de polipéptido aleatorias del polipéptido parental que se seleccionaron para su interacción con C5 en experimentos de selección. El motivo de unión a C5 identificado, o "BM', corresponde a la región de unión a diana del andamiaje parental, cuya región constituye dos hélices alfa dentro de un dominio del conjunto de proteínas tri-helicoidales. En el andamiaje parental, los residuos de aminoácidos variados de las dos hélices BM hélices BM constituyen una superficie de unión para la interacción con la parte Fc constante de los anticuerpos. Por la variación aleatoria de los residuos de superficie de unión y la posterior selección de las variantes, la capacidad de interacción de Fc de la superficie de unión se ha reemplazado por una capacidad para la interacción con C5.
Como se considera en los siguientes Ejemplos, la selección de variantes de polipéptido de unión a C5 puede conseguirse, por ejemplo, por presentación en fagos para la selección de variantes sin tratamiento de un andamiaje proteico opcionalmente seguido de duración por afinidad y presentación en células para la selección de las variantes de unión a C5 maduradas por afinidad. Sin embargo, se entiende que cualquier sistema de selección, ya sea basado en fagos, basado en bacterias, basado en células u otro, puede utilizarse para la selección de los polipéptidos de unión a C5.
Los términos "unión a C5" y "afinidad de unión a C5" como se utilizan en esta memoria descriptiva se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede someterse a ensayo, por ejemplo, mediante el uso de tecnología de resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento Biacore (GE Healthcare). La afinidad de unión a C5, por ejemplo, puede someterse a ensayo en un experimento en el que C5 se inmoviliza en un chip sensor de un instrumento Biacore, y la muestra que contiene el polipéptido a someter a ensayo se pasa sobre el chip. Como alternativa, el polipéptido a someter a ensayo se inmoviliza en un chip sensor del instrumento, y una muestra que contiene C5, o un fragmento del mismo, se pasa sobre el chip. El experto en la técnica después puede interpretar los resultados obtenidos por medio de dichos experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la unión del polipéptido a C5. Si se desea una medida cuantitativa, por ejemplo, para determinar la constante de disociación en equilibrio aparente Kd para la interacción, también se pueden utilizar métodos de resonancia de plasmón superficial. Los valores de unión pueden definirse, por ejemplo, en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). C5 se inmoviliza en un chip sensor de la medición, y las muestras del polipéptido cuya afinidad se va a determinar se preparan por medio de dilución seriada y se inyectan sobre el chip. Los valores de Kd pueden calcularse entonces a partir de los resultados utilizando, por ejemplo, el modelo de unión de Langmuir 1:1 del software BIAevaluation provisto por el fabricante del instrumento. El C5 o fragmento del mismo utilizado en la determinación de Kd, por ejemplo, pueden comprender la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:760.
En una forma de realización, el polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la presente invención, el polipéptido de unión a C5 se une a C5 de tal forma que el valor de Kd de la interacción sea a lo sumo 1 x 10-6 M, tal como, a lo sumo 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, o 1 x 10-9 M.
Un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como una alternativa para anticuerpos convencionales o sustancias de bajo peso molecular en diversas aplicaciones veterinarias y de diagnóstico. En particular, el polipéptido de unión a c 5 puede ser útil en cualquier método que requiera afinidad por C5 de un reactivo. Por consiguiente, el polipéptido de unión a C5 puede utilizarse como un reactivo de detección, un reactivo de captura, un reactivo de separación, un agente de diagnóstico o un agente terapéutico en dichos métodos.
Como un experto en la técnica comprenderá, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión a C5 de los polipéptidos como se definen en el presente documento, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Por lo tanto, es posible hacer cambios menores en la secuencia de aminoácido de un polipéptido sin afectar en gran medida la estructura terciaria y función del mismo. Por lo tanto, en una forma de realización, el polipéptido comprende variantes modificadas del BM de i), que son de tal forma que la secuencia resultante es a menos un 89% idéntica a una secuencia que pertenece a la clase definida por i), tal como al menos un 93% idéntica, tal como al menos un 96% idéntica a una secuencia que pertenece a la clase definida por i). Por ejemplo, es posible que un residuo de aminoácido que pertenece a un cierto agrupamiento funcional de residuos de aminoácidos (por ejemplo, hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) podría intercambiarse por otro residuo de aminoácido del mismo grupo funcional. En otra forma de realización del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, la secuencia de aminoácidos se selecciona de i) como se define anteriormente, y iii) una secuencia de aminoácidos que en las 13 posiciones variables como se representa por Xn, en la que n es 2-4, 6-7, 11, 16-18, 21,25-26 y 28, tiene al menos un 84 % de identidad con la secuencia definida en i), y que en las posiciones 1, 5, 8-10, 12-15, 19-20, 22-24, 27 y 29 tiene al menos un 87% de identidad con la secuencia definida en i).
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X2 se selecciona de H, T y V. En otra forma de realización, X2 se selecciona de T y V. En aún otra forma de realización, X2 es V.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X3 se selecciona de I, L y V. En otra forma de realización, X3 se selecciona de I y L. En aún otra forma de realización, X3 es I. En una forma de realización alternativa, X3 es L.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X4 se selecciona de A, D, E, K, L, Q y R. En otra forma de realización, X4 se selecciona de A, D, E, K y R. En aún otra forma de realización relacionada, X4 se selecciona de D y E.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X6 es W.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X7 se selecciona de A, D, N y T. En otra forma de realización, X7 se selecciona de D y N. En aún otra forma de realización relacionada, X7 es D. En una forma de realización alternativa, X7 es N.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X11 se selecciona de A, H, K, Q, R y S. En otra forma de realización, X11 se selecciona de A, H, K y R. En aún otra forma de realización relacionada, X11 se selecciona de A, K y R. En aún otra forma de realización relacionada, X11 se selecciona de K y R.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X16 es T.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X17 se selecciona de I y L. En otra forma de realización, X17 es I. En una forma de realización alternativa, X17 es L.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X18 se selecciona de A, D, E, N, Q, S y T. En otra forma de realización, X18 se selecciona de A, D, E, Q y S. En aún otra forma de realización relacionada, X18 se selecciona de D, E y Q. En aún otra forma de realización relacionada, X18 se selecciona de D y E. En aún otra forma de realización relacionada, X18 es D. En una forma de realización alternativa, X18 es E.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X21 se selecciona de I y L. En otra forma de realización, X21 es I. En una forma de realización alternativa, X21 es L.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X25 se selecciona de E, H, N y T. En otra forma de realización, X25 se selecciona de E y N. En aún otra forma de realización relacionada, X25 es N. En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X26 es K.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X28 se selecciona de A, D, E, H, N, Q y S. En otra forma de realización del polipéptido divulgado anteriormente, X28 se selecciona de A, D, E y S. En aún otra forma de realización relacionada, X28 se selecciona de A, D y E. En aún otra forma de realización relacionada, X28 se selecciona de D y E. En aún otra forma de realización relacionada, X28 es D.
En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X3X4 se selecciona de LE y LD. En una forma de realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X17X18 se selecciona de IE y LD. En las formas de realización anteriores del primer aspecto, se identifican los ejemplos de polipéptidos de unión a C5 que están dentro de la clase de polipéptidos. Se contempla que las formas de realización individuales anteriores pueden combinarse en todas las formas concebibles y aún estar dentro del alcance de la presente invención. Dichas combinaciones de formas de realización individuales definen una secuencia de aminoácidos restringida, en una o más de las posiciones X2-X28, de acuerdo como se comparó con la definición de aminoácido en i).
Las formas de realización anteriores de un polipéptido de unión a C5, por ejemplo, pueden combinarse de tal forma que el aminoácido i) cumple al menos cuatro de las siguientes ocho condiciones I-VIII:
I. X2 es V;
II. X3 se selecciona de I y L;
III. X6 es W;
IV. X7 se selecciona de D y N;
V. X17 se selecciona de I y L;
VI. X21 es L;
VII. X25 es N;
VIII. X28 es D.
En algunos ejemplos de un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con el primer aspecto, la secuencia de aminoácidos i) cumple al menos cinco de las ocho condiciones I-VIII. Más específicamente, la secuencia de aminoácidos i) puede cumplir al menos seis de las ocho condiciones I-VIII, tal como al menos siete de las ocho condiciones I-VIII, tal como las ocho condiciones I-VIII.
Como se describe en los siguientes Ejemplos, la selección de las variantes de unión a C5 ha conducido a la identificación de secuencias de motivo motivos de unión (BM) a C5 individuales. Estas secuencias constituyen formas de realización individuales de polipéptidos de unión a C5 de acuerdo con este aspecto. Las secuencias de motivos de unión a C5 individuales se presentan en la Figura 1 y como SEQ ID NO:1-248. En algunas formas de realización de este aspecto, la secuencia BM i) se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO:1-12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23-24, SEQ ID NO:26-28, SEQ ID NO:32-35, SEQ ID NO:38-39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56-57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:78-79, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:215 y la SEQ ID NO:243. Más específicamente, la secuencia BM i) se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO:1-12, tal como de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:5. En particular, la secuencia BM i) puede seleccionarse de SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:4.
Como se menciona anteriormente, el motivo de unión (BM) a C5 forma parte de un dominio de conjuntos de proteínas de tres hélices. Por ejemplo, el BM puede constituir esencialmente dos hélices alfa con un bucle de interconexión, dentro de dicho dominio del conjunto de proteínas de tres hélices.
El dominio del conjunto de proteínas de tres hélices se selecciona, en otra forma de realización, de dominios de proteínas del receptor bacteriano. Los ejemplos no limitantes de dichos dominios son los cinco diferentes dominios de tres hélices de la Proteína A de Staphylococcus aureus, tal como el dominio B, y derivados del mismo. En algunas formas de realización, el dominio del conjunto de proteínas de tres hélices es una variante de proteína Z, que se obtiene a partir de dicho dominio B de la proteína A de estafilococos.
En formas de realización de la invención, el polipéptido de unión a C5 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
i)
K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
en la que
[BM] es un motivo de unión a C5 como se define anteriormente;
Xa se selecciona de A y S;
Xb se selecciona de N y E;
Xc se selecciona de A, S y C;
Xd se selecciona de A y S;
y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 79% de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente. Dicha secuencia de aminoácidos puede tener al menos un 81 %, tal como al menos un 83 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 87 %, tal como al menos un 89 %, tal como al menos un 91 %, tal como al menos un 93 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 97 % de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente.
En una forma de realización del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xa es A. En una forma de realización alternativa del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xa es S.
En una forma de realización del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xb es N. En una forma de realización alternativa, Xb es E.
En una forma de realización del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xc es A. En una forma de realización alternativa, Xc es S. En aún otra forma de realización alternativa, Xc es C.
En una forma de realización del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xd es A. En una forma de realización alternativa, Xd es S.
En una forma de realización del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xa es A; Xb es N; Xc es A y Xd es A.
En una forma de realización adicional del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xa es A; Xb es N; Xc es C y Xd es A.
En una forma de realización adicional del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xa es S; Xb es E; Xc es S y Xd es S.
En una forma de realización adicional del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente, Xa es S; Xb es E; Xc es C y Xd es S.
En aún una forma de realización adicional, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión a C5 como se define anteriormente se selecciona de la SEQ ID NO:249-496, en particular de la SeQ ID NO:249-260, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:271-272, SEQ ID NO:274-276, SEQ ID NO:280-283, SEQ ID NO:286-287, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:304-305, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:326-327, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:463 y la SEQ ID NO:491, tal como de la SEQ ID NO:249-260. En una forma de realización adicional, la secuencia de aminoácidos se selecciona de la SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252 y la SEQ ID NO:253, tal como de la SEQ ID NO:249 y la SEQ ID NO:252.
Por lo tanto, en una forma de realización adicional, se proporciona un polipéptido de unión a C5 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
i)
YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
en la que [BM] es un motivo de unión a C5 como se define anteriormente y
Xc se selecciona de S y C; y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias definidas en i) anteriormente.
Como alternativa, se proporciona un polipéptido de unión a C5 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
i)
FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
en la que [BM] es un motivo de unión a C5 como se define anteriormente y
Xc se selecciona de A y C; y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 81 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias definidas en i) anteriormente.
Como se analiza anteriormente, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con la secuencia de aminoácidos anterior sin afectar en gran medida a la estructura terciara y la función de la misma también están dentro del alcance de la presente solicitud. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los polipéptidos de unión a C5 como se definen anteriormente pueden tener, por ejemplo, una secuencia que es al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 86 %, al menos un 88 %, al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 96 % o al menos un 98 % idéntica a la secuencia definida en i).
En algunas formas de realización y como se divulga en los Ejemplos a continuación, el motivo de unión a C5 puede formar parte de un polipéptido de 58 o 60 aminoácidos. Tal polipéptido puede comprender, por ejemplo, una secuencia seleccionada de una cualquiera de la SEQ ID NO:497-757, en particular una secuencia seleccionada de una cualquiera de la SEQ ID NO:497-508, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531, SEQ ID NO:534-535, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:552-553, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:602, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:615, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:637, SEQ ID NO:647, SEQ ID NO:657, SEQ ID NO:662, SEQ ID NO:683, SEQ ID NO:693, SEQ ID NO:699, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:711, SEQ ID NO:739 y la SEQ ID NO:745-757, tal como una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO:497-508 y la SEQ ID NO:745-757. En otra forma de realización, la secuencia de aminoácidos se selecciona de la SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:746, SEQ ID NO:747, SEQ ID NO:748, SEQ ID NO:750 y la SEQ ID NO:753, tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:748 y la SEQ ID NO:753.
La unión de una molécula a C5 no necesariamente inhibe la escisión de C5. La inhibición depende del sitio de unión, y ya que no es enteramente claro qué efectos tiene la interacción con regiones específicas de C5, algunas moléculas de unión a C5 pueden interactuar con C5 sin inhibir su escisión en C5a y C5b. En una forma de realización de la presente invención, el polipéptido de unión a C5, cuando se administra, por ejemplo, a un sujeto mamífero, inhibe la escisión de C5. El polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la invención puede inhibir más específicamente la escisión de C5 humano cuando se administra a un sujeto humano.
La estructura de C5 difiere en alguna forma entre las especies, y por lo tanto, se encontró que un aglutinante de C5 que se une a C5 de una especie puede estar inactivo en otras especies. El anticuerpo humanizado Eculizumab, por ejemplo, se une a un dominio de C5 comúnmente denominado MG7. Esta región es altamente variable entre las especies y, por lo tanto, la unión de Eculizumab está restringida a C5 humano. El polipéptido de unión a C5 de la presente invención, sin embargo, no está restringido a C5 humano, pero presenta actividad en modelos de animales también, como se demuestra en los Ejemplos adjuntos.
El experto en la técnica entenderá que se pueden hacer diversas modificaciones y/o adiciones a un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier aspecto divulgado en el presente documento con el fin de adaptar el polipéptido a una aplicación específica sin apartarse del alcance de la presente invención. Por ejemplo, un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier aspecto puede comprender aminoácidos N-terminal y/o C-terminal adicionales. Tal polipéptido deberá ser comprendido como un polipéptido con residuos de aminoácido adicionales en la primera y/o la última posición en la cadena del polipéptido, es decir en el extremo N y/o C-terminal. Por lo tanto, un polipéptido de unión a C5 puede comprender cualquier número adecuado de residuos de aminoácido adicionales, por ejemplo, al menos un residuo de aminoácido adicional. Cada residuo de aminoácido adicional puede individual o colectivamente añadirse con el fin de, por ejemplo, mejorar la producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento, o detección del polipéptido. Dichos residuos de aminoácido adicionales pueden comprender uno o más residuos de aminoácido añadidos con el propósito del acoplamiento químico. Un ejemplo de esto es la adición de un residuo de cisteína. Dichos residuos de aminoácido adicionales también pueden proporcionar una "etiqueta" para la purificación o detección del polipéptido, tal como una etiqueta His6 o una etiqueta "myc" (c-myc) o una etiqueta "FLAG" para la interacción con anticuerpos específicos para la etiqueta o cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) en el caso de la etiqueta His6.
Los aminoácidos adicionales como se analiza anteriormente pueden estar acoplados al polipéptido de unión a C5 por medio de conjugación química (utilizando métodos de química orgánica conocidos) o por cualquier otro medio, tal como la expresión del polipéptido de unión a C5 como una proteína de fusión.
Los aminoácidos adicionales como se analiza anteriormente, por ejemplo, pueden comprender uno o más dominios de polipéptido. Un dominio de polipéptido adicional puede proporcionar al polipéptido de unión a C5 otra función, tal como, por ejemplo, otra función de unión, o una función enzimática, o una función tóxica (por ejemplo, una inmunotoxina), o una función de señalización fluorescente, o combinaciones de las mismas.
Un dominio de polipéptido adicional además puede proporcionar al polipéptido de unión a C5 la misma función de unión. Por lo tanto, en una forma de realización más, se proporciona un polipéptido de unión a C5 que comprende al menos dos unidades monoméricas del polipéptido de unión a C5, cuya secuencia de aminoácidos puede ser igual o diferente. Las formas multiméricas de los polipéptidos pueden comprender un número adecuado de dominios, teniendo cada uno un motivo de unión a C5, y formando cada un "monómero" dentro del multímero. Todos estos dominios pueden tener la misma secuencia de aminoácidos, pero como alternativa, pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos. En particular, el polipéptido de unión a C5 de la invención puede formar homo- o heterodímeros.
El dominio o dominios polipeptídicos adicionales como se describe anteriormente pueden unirse al polipéptido de unión a C5 por acoplamiento covalente utilizando métodos de química orgánica conocidos. Como alternativa, el polipéptido de unión a C5 que comprende el dominio o dominios polipeptídicos adicionales puede expresarse como uno o más polipéptidos de fusión, por ejemplo, en un sistema para la expresión recombinante de polipéptidos, o unirse de cualquier otra forma, ya sea directamente o vía un conector, por ejemplo, un conector de aminoácidos.
En algunas formas de realización, el dominio o dominios polipeptídicos adicionales pueden comprender un resto de extensión de semivida que aumenta la semivida del polipéptido de unión a C5 in vivo. Como se entiende por el experto en la técnica, semivida aumentada, o extendida significa una depuración más lenta de una molécula particular de la sangre. Existen varias estrategias conocidas para prolongar la semivida de un polipéptido particular in vivo, tal como el acoplamiento del dominio Fe de un anticuerpo (conjugación de Fc) o acoplamiento a albúmina. Otro ejemplo es el acoplamiento a una fracción de extensión de la semivida, por ejemplo, un péptido o proteína, que se asociará a albúmina sérica in vivo. En particular, la fracción de extensión de la semivida puede ser una fracción de unión a albúmina. Una fracción de unión a albúmina puede consistir, por ejemplo, en un polipéptido de origen natural, o un fragmento de unión a albúmina del mismo, o un polipéptido modificado. Un polipéptido modificado puede derivarse de un polipéptido de partida de origen natural sometiéndolo a técnicas de modificación de proteína, tales como mutaciones y alteraciones en un enfoque de sitio dirigido o aleatorio, con la visión de crear propiedades nuevas o mejoradas, tales como afinidad de unión para una molécula tal como albúmina. Tal polipéptido de unión a albúmina modificado puede ser, por ejemplo, una variante del andamiaje proteico, cuya variante se ha seleccionado por su afinidad de unión específica para albúmina. En una forma de realización específica, el andamiaje proteico puede seleccionarse de dominios de Proteína G de estreptococo o derivados de los mismos, tales como, por ejemplo, el dominio GA1, el dominio GA2 y el dominio GA3 de la Proteína G de la cepa G148 del Estreptococo, en particular el dominio GA3.
Por consiguiente, en una forma de realización del polipéptido de unión a C5, los aminoácidos adicionales mejoran la estabilización in vivo o in vitro y comprenden un dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococo, o un derivado del mismo. Un ejemplo de un dominio de unión a albúmina que puede estar comprendido como un dominio polipeptídico adicional en el polipéptido de unión a C5 de la invención se expone en la SEQ ID NO:759. Otros ejemplos de dominios de unión a albúmina adecuados se describen en los documentos WO 2009/016043 y WO 2012/004384. Tal polipéptido extendido con ABD se une a albúmina sérica in vivo, y se beneficia de su semivida más larga, que aumenta la semivida neta del propio polipéptido (véase, por ejemplo, WO 91/01743). El perfil farmacocinético de un polipéptido de unión a C5 que comprende un resto de unión a albúmina como se define anteriormente, se asemeja de esta forma a la de la albúmina sérica cuando se administra, por ejemplo, a un sujeto mamífero. El ABD y derivados del mismo se unen fuertemente a albúmina sérica humana (HSA), así como a albúmina sérica de otras especies tales como de ratón y rata.
El ABD de la proteína G de estreptococo tiene 46 aminoácidos de longitud, y por lo tanto, cuando un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la invención comprende un resto ABD o un derivado del mismo, el tamaño global del polipéptido de unión a C5 es relativamente pequeño. Cuando se administra, por ejemplo, a un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano, la parte de unión a albúmina del polipéptido de unión a C5 se asociará no covalentemente con la albúmina sérica y el polipéptido, por lo tanto, puede beneficiare de la depuración renal reducida y la recirculación aumentada en células epiteliales. Sin embargo, la penetración tisular aún puede ser rápida debido a las propiedades de extravasación de la albúmina sérica. Además, un polipéptido de unión a C5 que comprende una fracción de extensión de la semivida puede no solamente mostrar una semivida extendida in vivo, sino también una respuesta inmunológica reducida in vivo, como se compara con un polipéptido que carece de una fracción de extensión de la semivida (véase, por ejemplo, el documento WO 2005/097202).
El polipéptido de unión a C5 de la invención puede formar opcionalmente parte de un compuesto de unión a C5, que comprende al menos un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior; al menos un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica, o un derivado del mismo, y al menos un resto de unión para unir dicho al menos un dominio o derivado del mismo, al extremo C o N de dicho al menos un polipéptido de unión a C5. Tal compuesto de unión a C5 tiene una alta afinidad por C5, así como para albúmina sérica in vivo, cuando se administra, por ejemplo, a un sujeto mamífero, y la unión a albúmina sérica no interfiere con la interacción con C5, como se demuestra en los siguientes Ejemplos.
En una forma de realización, el compuesto de unión a C5 tiene la estructura seleccionada de
[CBP1]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2];
[ALBD]-[L1]-[CBP1];
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2];
[CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD], y
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[L2]-[CBP2]
en la que, independientemente entre sí,
[CBP1] y [CBP2] son polipéptidos de unión a C5 que pueden ser iguales o diferentes;
[L1] y [L2] son restos de unión que pueden ser iguales o diferentes; y
[ALBD] es un dominio de unión a albúmina de la proteína G de estreptococo, o un derivado del mismo. Los compuestos de unión a C5 preferidos tienen una estructura seleccionada de
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]; y lo más preferiblemente,
[CBP1]-[L1]-[ALBD],
Los ejemplos de restos de unión que pueden usarse en dichos compuestos de unión a C5 se seleccionan de G, GS;
[G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n, en los que n es 0-7 (preferiblemente, n es 0-2); [S2G]m; [S3G]m;[S4G]m; en los que m es 0-7, y VDGS. Los conectores preferidos son GS y GS[G4S]2.
Los ejemplos de dominios de unión a albúmina, o derivados de los mismos que pueden estar comprendidos en un compuesto de unión a C5 son como se describe anteriormente. En particular, un ejemplo de un dominio de unión a albúmina de determina en la SEQ ID NO:759.
Los compuestos particularmente preferidos de unión a C5 tienen la estructura [CBP1]-[L1]-[ALBD], en la que [CBP1] es un polipéptido seleccionado de la SEQ ID NO:748 y la SEQ ID NO:753, [L1] es Gs , y [ALBD] es un polipéptido mostrado como la SEQ ID NO:759.
El polipéptido o los polipéptidos de unión a C5 comprendidos en un polipéptido de unión a C5 son, en una forma de realización, independientemente seleccionados de polipéptidos de unión a C5 58-mer o 60-mer como se describe previamente. En particular, el compuesto de unión a c 5 pueden comprender uno o más polipéptidos de unión a C5 seleccionados independientemente de una cualquiera de la SEQ ID No :497-508, SEQ ID n O:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531, SEQ ID NO:534-535, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:552-553, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:602, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:615, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:637, SEQ ID NO:647, SEQ ID NO:657, SEQ ID NO:662, SEQ ID NO:683, SEQ ID NO:693, SEQ ID NO:699, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:711, SEQ ID NO:739 y la SEQ ID NO:746-757, tal como una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO:497-508 y la SEQ ID NO:746-757. En otra forma de realización, la secuencia de aminoácidos se selecciona de la SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:746, SEQ ID NO:747, SEQ ID NO:748, SEQ ID NO:750 y la SEQ ID NO:753, tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:748 y la SEQ ID NO:753.
Un polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a C5 o un compuesto como se describe anteriormente, comprendido en un vector de expresión puede permitir la producción de un polipéptido de unión a C5 o un compuesto de unión a C5, por ejemplo, mediante expresión en una célula huésped.
Debe entenderse que el polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la presente invención puede ser útil como agente terapéutico o de diagnóstico por derecho propio o como un medio para dirigirse a otros agentes terapéuticos o de diagnóstico, por ejemplo, efectos directos o indirectos sobre la proteína del complemento C5. Un efecto terapéutico directo puede lograrse, por ejemplo, inhibiendo la escisión de C5. Un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la invención o un compuesto de unión a C5 como se describe anteriormente, puede combinarse con un agente terapéutico. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos que pueden demostrar ser útiles en una combinación de este tipo son agentes inmunoestimulantes y radionúclidos.
Por lo tanto, el polipéptido de unión a C5 como tal, o como está comprendido en un compuesto de unión a C5 o una combinación como se describe anteriormente, se proporciona en una forma de realización para su uso en terapia, por ejemplo, para el tratamiento de una afección relacionada con C5, tal como una condición relacionada con C5 en un mamífero, tal como un sujeto humano. En una forma de realización, dicha afección relacionada con C5 se selecciona de enfermedad inflamatoria, tal como la artritis inducida por antígenos, sepsis, inflamación sinovial, vasculitis y asma; enfermedad autoinmune, tal como lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de las aglutininas frías, artritis reumatoide, esclerosis múltiple (EM), síndrome de Sjogren, dermatomiositis, miastenia gravis y otras enfermedades estimuladas por autoanticuerpos tal como síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Fisher, esclerosis sistémica, membrana basal antiglomerular (anti-GBM) y síndrome antifosfolípido (APS); enfermedad infecciosa, tal como síndrome hemolítico-urémico (HUS), infecciones víricas, infecciones bacterianas e infecciones fúngicas; enfermedad cardiovascular, tal como infarto de miocardio (agudo) (sometimiento a revascularización por fibrinolisis o intervención coronaria percutánea (PCI)); trastornos neurodegenerativos tal como enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Creutzfeld-Jacob y enfermedad de Parkinson; cánceres; heridas; lesión de injerto, tal como lesión por reperfusión-isquemia (IRI) y rechazo mediado por anticuerpos agudo (AMR); enfermedad ocular, tal como degeneración macular relacionada con la edad (AMD), uveítis, enfermedades y trastornos oculares diabéticos, y retinopatía del prematuro; enfermedad renal, tal como glomerulonefritis membranosa, nefritis membranosa, nefropatía por inmunoglobulina A, nefritis lúpica, síndrome de Goodpasture y glomerulonefritis post-estreptocócica; enfermedades pulmonares, tal como síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis quística; enfermedades hematológicas; tal como anemia hemolítica, hemoglobinuria paroxística fría, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS) y hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH); enfermedades alérgicas, tal como choque anafiláctico, alergia y asma; y enfermedades dermatológicas, tal como pénfigo, pénfigo ampolloso, reacciones fototóxicas y psoriasis. En una forma de realización más particular, el polipéptido de unión a C5, compuesto o combinación de acuerdo con la invención, se usa para el tratamiento de la hemoglobinuria nocturna paroxística (PNH).
Como se menciona al analizar el trasplante de órganos en la sección de antecedentes anterior, las diferencias entre el donante y el receptor (por ejemplo, ABO y las clases MCH), así como la condición del órgano trasplantado pueden conducir a un retraso en el funcionamiento o incluso al rechazo del órgano trasplantado. Por lo tanto, el tratamiento puede ser necesario para eliminar los anticuerpos anti-donante a pesar de una prueba cruzada positiva entre el donante y el receptor o para eliminar los anticuerpos ABO cuando se produce un trasplante contra la barrera ABO. Dicho tratamiento incluye típicamente la inmunoadsorción, por ejemplo, mediante el uso de técnicas de cromatografía de afinidad, tanto antes como después del trasplante o plasmaféresis. Sin embargo, dichos procedimientos corren el riesgo de eliminar casi todos los anticuerpos presentes en la circulación, incluyendo, por lo tanto, anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, los polipéptidos o compuestos de unión a C5 de la invención no se ven afectados por ningún procedimiento de eliminación de anticuerpos y, por lo tanto, pueden aprovecharse en estos tratamientos.
En algunas afecciones relacionadas con C5 donde una patología aguda más local en tejidos fácilmente accesibles, tal como el pulmón y el torrente sanguíneo, domina en lugar de las patologías sistémicas, un fármaco con una semivida muy corta podría ser ventajoso sobre uno con una eliminación lenta. Por lo tanto, en dichas afecciones relacionadas con C5, un polipéptido de unión a C5 sin un resto de extensión de la semivida puede ser beneficioso. Como se explica anteriormente, un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la invención, debido a su tamaño relativamente pequeño, presentará un perfil farmacocinético relativamente rápido cuando se administre a un mamífero, tal como un ser humano. El polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la invención puede ser potencialmente activo en el tratamiento de afecciones relacionadas con C5, tal como asma (Zhang et a/.(Zhang et al. Expert Rev Clin Immunol 2010, 6:269-277), sepsis (Ward et al. The Sci World J 2010, 10:2395-2402), y el síndrome de hipersensibilidad que incluye la pseudoalergia relacionada con la activación de C (CARPA, una reacción a ciertos liposomas terapéuticos y fármacos basados en excipientes lipídicos que en casos raros pueden conducir a insuficiencia cardiopulmonar potencialmente mortal (Szebeni et al. Adv Drug Delivery Rev 2011, 63:1020-1030). Además, un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la invención se puede usar para la inhibición del complemento cuando un receptor de transfusión de sangre ha recibido sangre de un tipo incompatible (una situación que tiene lugar en aproximadamente 1:14000 unidades de transfusión en EE.UU., que está asociado con alta mortalidad, Goodnough et al. Lancet 2003, 361:161-169).
Un método de tratamiento de una afección relacionada con C5 puede comprender la administración de un polipéptido de unión a C5, o una combinación como se describe anteriormente a un sujeto mamífero que lo necesite. En consecuencia, en el método de tratamiento, el sujeto se trata con un polipéptido de unión a C5, un compuesto de unión a C5 o una combinación de acuerdo con la invención. Más específicamente, la unión del polipéptido de unión a C5 o la combinación, a un C5 expresado en una superficie celular en el sujeto, inhibe la escisión de C5. La afección relacionada con C5 puede seleccionarse de una enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; enfermedad infecciosa; enfermedad cardiovascular; trastornos neurodegenerativos; cánceres; heridas; lesión de injerto; enfermedad ocular; enfermedad renal; enfermedades pulmonares; enfermedades hematológicas; enfermedades alérgicas y enfermedades dermatológicas. En particular, la afección relacionada con C5 puede ser como se define anteriormente en relación con el uso terapéutico de un polipéptido, compuesto o combinación de unión a C5 de acuerdo con la invención. La afección relacionada con C5 puede ser, por ejemplo, la hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH). En un método de tratamiento, dicho polipéptido de unión a C5 se administra por vía intravenosa, subcutánea, por inhalación, nasal, oral, intravítrea o tópica.
La invención se ilustrará ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 es una lista de las secuencias de aminoácidos de los ejemplos de motivos de unión a C5 comprendidos en los polipéptidos de unión a C5 de la invención (SEQ ID NO: 1-248), ejemplos de polipéptidos de unión a C549-mer de acuerdo con la invención (SEQ ID NO: 249-496), ejemplos de polipéptidos de unión a C558-mer de acuerdo con la invención (SEQ ID NO: 497-744) y ejemplos de polipéptidos de unión a C560-mer de acuerdo con la invención (SEQ ID NO: 745-757), así como las secuencias de la proteína Z (SEQ ID NO: 758), un dominio de unión a albúmina (ABD094, SEQ ID NO: 759), la entrada Swiss-Prot P01031 del C5 humano (residuos de aminoácidos 1-1676, SEQ ID NO: 760; cuya cadena a corresponde a los residuos de aminoácidos 678-1676 y la cadena p corresponde a los residuos de aminoácidos 19-673), la secuencia de la proteína de garrapata marcada con His6 OmCI utilizada en el presente documento (SEQ ID NO: 761) y C5 de cynomolgus (SEQ ID NO: 762) derivado de una secuencia genómica (publicada en línea en www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res.
21(10):1746-1756) usando C5 humano como plantilla. La secuencia contiene dos aminoácidos desconocidos "X" en las posiciones 63 y 1346.
La Figura 2 muestra el resultado de un análisis de unión típico realizado en un instrumento Biacore como se describe en el Ejemplo 2. Los sensogramas se obtuvieron mediante inyección de C5 humano (hC5; curva sólida de color negro), C5 de cynomolgus (cC5; curva de línea discontinua de color negro), C5 de rata (rC5; curva de guiones largos de color negro), dominio MG7 humano (hMG7; curva de puntos de color gris), e inmunoglobulina G humana (hIgG; curva sólida de color gris), respectivamente, sobre una variante Z dimérica inmovilizada (Z05477, SEQ ID NO:509).
La Figura 3 es un gráfico de columnas que muestra la respuesta en ELISA contra hC5 y rC5, respectivamente, para variantes Z maduradas seleccionadas. Las columnas negras corresponden a la absorbancia a 450 nm obtenida usando 0,05 pg/ml de hC5 (columna izquierda en cada grupo) y a la absorbancia a 450 nm obtenida usando 4 pg/ml de rC5 para cada variante Z (columna derecha en cada grupo), como se describe en el Ejemplo 4. Las respuestas para la variante Z Z05363 (SEQ ID NO: 510) se representan como un control positivo.
La Figura 4 muestra esquemáticamente diferentes construcciones que abarcan una o varias variantes Z de unión a C5 seleccionadas de la SEQ ID NO: 745-757, opcionalmente vinculadas a ABD094 (SEQ ID NO: 759).
La Figura 5 muestra los análisis de SDS-PAGE de variantes Z de unión a C5 purificadas (condición reducida) visualizadas por Instant Blue, como se describe en el Ejemplo 6. A) representa un ejemplo de Z-Z-ABD dimérico (carril 1 donde Z es igual a la SEQ ID NO:745 y ABD es igual a la SEQ ID NO:759) en comparación con diferentes proteínas de fusión Z-ABD (donde Z es igual a la SEQ ID NO:745 (carril 2), SEQ ID NO:748-757 (carril 4-13) fusionadas a ABD094 (SEQ ID NO:759) mediante un conector GS); B) representa una variante Z de unión a C5 (SEQ ID NO:753) en diferentes construcciones, y C) representa dos variantes Z de unión a C5 diferentes (SeQ ID NO:748, carriles 2-3 y 6 y la SEQ ID NO:753, carriles 4-5 y 7), en forma monomérica (carriles 6-7) y en fusión con ABD094 (SEQ ID NO:759) a través de un conector GS(G4S)2 (carriles 2-5).
Las Figuras 6A y B son diagramas que muestran datos ejemplares de la caracterización de respuesta a la dosis de la potencia de diferentes variantes Z de unión a C5 para inhibir la activación del complemento como se ve en un ensayo hemolítico, descrito en el Ejemplo 6. El suero deficiente en C5 se diluyó 63 veces y se complementó con hC5 0,1 nM. A) muestra el efecto de diferentes proteínas de fusión Z-ABD (las variantes Z correspondientes a SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748-753 y SEQ ID NO: 756 fusionadas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS) a hC5, mientras que B) muestra el efecto de diferentes construcciones de unión a c 5 que comprenden la misma variante Z de unión a C5 (Z06175a, SEQ ID NO: 753) como monómero o dímero, en fusión con ABD094 (SEQ ID NO: 759), o según se proporcione una etiqueta His6 (seis residuos de histidina), en comparación con la proteína de garrapata de unión a C5 OmCI (SEQ ID NO: 761).
Las Figuras 7A y B son diagramas que muestran datos ejemplares de la unión en equilibrio en base a la técnica ECL de desplazamiento descrita en el Ejemplo 6. La Figura 7A muestra la unión a C5 de diferentes variantes Z (SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748-757) en fusión con ABD094 (SEQ ID NO: 759) en comparación con la unión C5 de la proteína de garrapata OmCI (SEQ ID NO: 761). La Fig. 7B muestra la unión de diferentes construcciones de unión a C5 que comprenden la misma variante Z de unión a C5 (SEQ ID NO: 753) como monómero o dímero, en fusión con ABD094 (SEQ ID NO: 759), o como se proporciona con una etiqueta His6.
Las Figuras 8A y 8B muestran interacciones entre las variantes de Z-ABD y la albúmina sérica humana (HSA) estudiadas como se describe en el Ejemplo 7. A) Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) donde Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a a Bd094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS) se ha preincubado con cantidades equimolares de HSA (1). Como comparación, los cromatogramas para HSA en solitario (2) y Z-ABD en solitario (3) también se muestran en el gráfico. B) Sensores de Biacore de Z-ABD y Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionados a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por los conectores especificados en la Figura 4, en la construcción 2 y la construcción 5, respectivamente) inyectados sobre una superficie recubierta con HSA. Cada una de las dos construcciones se inyectó a una concentración de 25, 100 y 400 nM.
La Figura 9 es un diagrama que muestra los perfiles farmacocinéticos para los compuestos de unión a C5 Z-ABD y Z-ABD-Z (Z06175a, SEQ ID NO: 753) fusionados a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por los conectores especificados en la Figura 4, en la construcción 2 y la construcción 5, respectivamente) en ratas Sprague Dawley macho en el tiempo después de la administración intravenosa (i.v., 0,25 pmol/kg) y subcutánea (s.c., 0,5 pmol/kg), como se describe en el Ejemplo 8. Cada punto de datos representa un promedio de tres animales individuales en un punto de tiempo específico que varía de cinco minutos a dos semanas después de la dosificación de los animales que recibieron la dosis i.v. y de 15 minutos a dos semanas para los animales que recibieron la dosis s.c.
La Figura 10 muestra la hemólisis ex vivo en eritrocitos de oveja después de la exposición a suero diluido 1:5 de muestras de animales tomadas de ratas Sprague Dawley después de la administración intravenosa (i.v.; 0,25 pmol/kg) de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS), como se describe en el Ejemplo 8. Cada punto representa un animal individual en un punto de tiempo específico que varía de cinco minutos a dos semanas después de la dosificación.
La Figura 11 muestra la hemólisis ex vivo en eritrocitos de oveja después de la exposición a suero diluido 1:5 de muestras de animales tomadas de ratas Sprague Dawley después de la administración subcutánea (s.c.; 0,5 pmo/kg) de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS), como se describe en el Ejemplo 8. Cada punto representa un animal individual en un punto de tiempo específico que varía de 15 minutos a dos semanas.
La Figura 12 muestra la hemólisis frente a la concentración sérica de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS) después de la administración i.v. y s.c. a ratas Sprague Dawley macho, como se describe en el Ejemplo 8.
La Figura 13 muestra la hemólisis en eritrocitos de oveja frente a la concentración sérica de Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por los conectores especificados en la Figura 4, construcción 5) después de la administración i.v. y s.c. a ratas Sprague Dawley macho, como se describe en el Ejemplo 8.
La Figura 14 muestra la exposición al suero de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO:759) mediante un conector GS) después de la administración i.v. (415 nmol/kg) y s.c. (1250 nmol/kg) en monos macho Cynomolgus, como se describe en el Ejemplo 9. Cada punto de datos representa la media de tres animales individuales.
La Figura 15 es un diagrama que muestra el efecto (concentración de C5a en el lavado) de la molécula proinflamatoria zymosan (40 mg/kg i.p.) en solitario y en combinación con una molécula de fusión Z-ABD que se une a C5 (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) mediante un conector Gs ) o OmCI (SEQ ID NO: 761) analizado como se describe en el Ejemplo 10. Z-ABD se administró a 20 nmol/kg (LD), 100 nmol/kg (MD) y 500 nmol/kg (HD) s.c. 18 h antes de la inducción con zymosan. Se administró i.p. OmCI (30 nmol/kg) 1 h antes del tratamiento con zymosan y se tomaron muestras 1 h después de la inducción con zymosan.
Las Figuras 16A y 16B muestran el perfil farmacocinético de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS) después de la administración intratraqueal de 500 nmol/kg en ratones C57bl hembra, como se describe en el Ejemplo 11. A) Concentración sérica en cada animal (n = 3 para cada punto de tiempo, 27 animales en total) y B) hemólisis en eritrocitos de oveja expuestos a estas muestras de suero diluidas 1:5.
Ejemplos
Los siguientes materiales se utilizaron a lo largo de este trabajo, excepto cuando se indique lo contrario.
Cepa de Escherichia coli RR1AM15 (Rüther, Nucleic Acids Res 10:5765-5772, 1982).
Cepa de Escherichia coli XL1-Blue (Agilent Technologies, cat. n.° 200268).
Proteína C5 del complemento humano (hC5). La pro-proteína de 1676 aminoácidos completa tiene el número de acceso de GenBank: NP_001726 (SEQ ID No :760), en la que los aminoácidos 19-673 son la cadena beta y los aminoácidos 678-1676 son la cadena alfa. El C5 humano utilizado en el presente documento se adquirió en Quidel (cat. n.° A403)
Proteína C5 del complemento de Cynomolgus (cC5; SEQ ID NO: 762). La secuencia de cC5 se obtuvo a partir de la secuencia genómica de Cynomolgus (Macaca fascicularis) (www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756). La región codificante del C5 humano se recuperó de www.ensembl.org, y el gen C5 se localizó en el cromosoma 15. La región que contiene el gen tiene aproximadamente 110 000 bases de longitud y está contenida en los cóntigos CAEC01154150 a CAEC01154178. Los cóntigos se unieron manualmente a un solo archivo y se utilizaron como contexto genómico para el software sim4 para alinear la región codificante de C5 humano con el material genómico de Cynomolgus sin procesar. El C5 de Cynomolgus utilizado en el presente documento se purificó internamente a partir del suero usando un procedimiento de tres etapas; precipitación con PEG6000, intercambio iónico y cromatografía de afinidad para OmCI.
Proteína C5 del complemento de rata (rC5; Número de acceso de GenBank: El C5 de rata XP_001079130) utilizado en el presente documento se purificó internamente a partir del suero usando un procedimiento de tres etapas; precipitación con PEG6000, intercambio iónico y cromatografía de afinidad para OmCI.
Dominio MG7 humano (hMG7) de la proteína del complemento C5, correspondiente a los residuos de aminoácidos 822-931 de C5 humano (SEQ ID NO: 760; Fredslund et al. (2008) Nature Immunology 9: 753­ 760) producido internamente en células Freestyle HEK293.
Proteína de unión a hMG7.
OmCI (AF2999, Nunn, M. A. et al. anteriormente) de garrapata blanda Ornithodoros moubata con una etiqueta His6 en el extremo C (SEQ ID NO:761) se produjo internamente en la cepa de E. coli Origami(DE3) y se purificó en una columna HisT rap1.
Ejemplo 1: Selección y cribado de los polipéptidos de unión a la proteína del complemento C5
Materiales y métodos
Biotinilación de la proteína diana hC5: hC5 se biotiniló de acuerdo con las recomendaciones del fabricante a temperatura ambiente (TA) durante 40 min usando No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, cat. n.° 21327) en un exceso molar de diez veces (10x). El intercambio de tampón posterior a PBS (fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, pH 7,4) se realizó utilizando columnas de centrifugación desaladoras de proteínas (Pierce, n.° de cat.
89849) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Selección de presentación en fago de polipéptidos de unión a C5: Se usaron bibliotecas de variantes aleatorias de la proteína Z mostrada en el bacteriófago, construida en fagémido pAffi1/pAY00065/ pAY02947/pAY02592 esencialmente como se describe en Gronwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183), para seleccionar polipéptidos de unión a C5. Se utilizaron tres vectores de biblioteca diferentes. Dos de estos utilizan un dominio de unión a la albúmina (ABD, GA3 de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus) como compañero de fusión a las variantes Z que generan las bibliotecas Zlib003Naive.I y Zlib006Naive.II. La tercera biblioteca, Zlib004Naive.I utiliza la molécula de unión a la ADN polimerasa Taq Z03639 (denominada ZTaqS1-1 en Gunneriusson et al. Protein Eng 1999, 12:873-878) como compañero de fusión. Las bibliotecas tenían los siguientes tamaños reales: 3 x 109 (Zlib003Naive.I); 1,5 x 1010 (Zlib006Naive.II); y 1,4 x 1010 (Zlib004Naive.I), refiriéndose el número a la cantidad de variantes.
Las soluciones madre de fagos se prepararon en matraces de agitación (Zlib003Naive.I) como se describe en Gronwall et al. anteriormente o en un fermentador de 20 l (Zlib006Naive.II y Zlib004Naive.I). Las células de una solución madre de glicerol que contenía la biblioteca de fagémidos Zlib004Naive.I se inocularon en 20 l de TSB-YE (extracto de levadura tríptica con soja; 30 g/l de TSB, 5 g/l de extracto de levadura) complementado con el 2% de glucosa y 100 pg/ml de ampicilina. Las células de una solución madre de glicerol que contenía la biblioteca de fagémicos Zlib006Naive.II se inocularon en 20 l de un medio libre de prolina definido [hidrogenofosfato dipotásico 7 g/l, citrato trisódico dihidrato 1 g/l, uracilo 0,02 g/l, YNB (Disco™ base nitrógenada de levadura sin aminoácidos, Becton Dickinson) 6,7 g/l, glucosa monohidrato 5,5 g/l, L-alanina 0,3 g/l, monoclorhidrato de L-arginina 0,24 g/l, L-asparagina monohidrato 0,11 g/l, L-cisteína 0,1 g/l, ácido L-glutámico 0,3 g/l, L-glutamina 0,1 g/l, glicina 0,2 g/l, L-histidina 0,05 g/l, L-isoleucina 0,1 g/l, L-leucina 0,1 g/l, monoclorhidrato de L-lisina 0,25 g/l, L-metionina 0,1 g/l, L fenilalanina 0,2 g/l, L-serina 0,3 g/l, L-treonina 0,2 g/l, L-triptófano 0,1 g/l, L-tirosina 0,05 g/l, L-valina 0,1 g/l] complementado con 100 pg/ml de ampicilina. Los cultivos se dejaron crecer a 37 °C en un fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Cuando las células alcanzaron una densidad óptica (DO) de 0,7-0,8, se infectaron aproximadamente 2,6 l del cultivo utilizando un exceso molar 10x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs #N0315S). Las células se incubaron durante 30 minutos, después de lo cual el fermentador se llenó hasta 20 l con TSB-YE complementado con IPTG 100 pM (isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido, para la inducción de la expresión), 25 pg/ml de kanamicina y 12,5 pg/ml de carbenicilina y se dejaron crecer a 30°C durante 22 h. Las células en el cultivo se sedimentaron por centrifugación a 15.900 g y las partículas de fago que permanecían en el medio se precipitaron posteriormente dos veces en PEG/NaCl (polietilenglicol/cloruro de sodio), se filtraron y se disolvieron en PBS y glicerol como se describe en Gronwall et al. anteriormente. Las soluciones madre de fago se almacenaron a -80°C antes de su uso.
Las selecciones se realizaron en cuatro ciclos contra hC5 biotinilado. La preparación de la solución madre de fago, el procedimiento de selección y la amplificación de fago entre ciclos de selección se realizaron esencialmente como se describe en el documento WO 2009/077175. Se usó PBS complementado con albúmina sérica bovina al 3% (BSA) y Tween20 al 0,1% como tampón de selección y los complejos del fago diana se capturaron directamente con Estreptavidina Dynabeads® M-280 (Dynal, cat. n.° 112.06). Se usaron 1 mg de perlas por 10 pg de proteína C5 del complemento. Se utilizó la cepa RR1AM15 de E. coli para la amplificación de fagos. En el ciclo 1 de las selecciones, se utilizó hC5 100 nM y se realizaron dos lavados con PBST al 0,1% (PBS complementado con el 0,1% de Tween-20). En los tres ciclos posteriores se aplicó una mayor rigorusidad, utilizando una concentración objetivo reducida y un mayor número de lavados. En el ciclo 2, 3 y 4; se usaron hC550 o 33 nM, hC525 o 11 nM y hC5 12,5 o 3,7 nM. En los ciclos 2, 3 y 4; se realizaron 4, 6 y 8 lavados, utilizando PBST al 0,1% en todos los ciclos o PBST al 0,2%, 0,3% y 0,4% en los ciclos 2, 3 y 4. Cribado de ELISA de variantes Z: Para probar si las moléculas de variantes Z seleccionadas podrían interactuar con la proteína C5 del complemento humano, se realizaron ensayos ELISA. Las variantes Z se produjeron inoculando colonias individuales de las selecciones en 1 ml de medio TSB-YE complementado con 100 pg/ml de ampicilina e IPTG 0,1 mM en placas de pocillos profundos (Nunc, cat. n.° 278752). Las placas se incubaron durante 18-24 h a 37°C. Las células se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 300 pl de PBST al 0,05% y se congelaron a -80°C para liberar la fracción periplásmica de las células. Las muestras congeladas se descongelaron en un baño de agua y las células se sedimentaron por centrifugación. El sobrenadante periplásmico contenía las variantes Z como fusiones a un dominio de unión a la albúmina (GA3 de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus), expresado como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Gronwall et al, anteriormente), o a la molécula de unión a la ADN polimerasa Taq Z03639, expresada como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG. Z##### se refiere a variantes Z de 58 residuos de aminoácidos individuales.
Se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos de media área (Costar, cat. n.° 3690) con 50 pl/pocillo de tampón de recubrimiento (carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6) que contenían 4 pg/ml de un anticuerpo específico para variantes Z (Affibody, cat. n.° 20.1000.01.0005) y se incubaron durante una noche a 4°C. La solución de anticuerpo se eliminó por vertido y los pocillos se bloquearon con 100 pl de PBSC (PBS complementado con caseína al 0,5% (Sigma, cat. n.° C8654) durante 1-2 horas a TA. La solución de bloqueo se descartó y se añadieron 50 pl de solución periplásmica a los pocillos y se incubó durante 1 h a TA con agitación lenta. Los sobrenadantes se eliminaron por vertido y los pocillos se lavaron 4 veces con PBST al 0,05%. Después, se añadieron 50 pl de proteína de complemento biotinilada hC5, a una concentración de 5 pg/ml en PBSC, a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1,5 horas a TA seguido de lavados como se describe anteriormente. Se diluyó estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante; Dako, cat. n.° P0397) 1:10.000 en PBSC, se añadió a los pocillos que después se incubaron durante 45 minutos. Después del lavado como se describe anteriormente, se añadieron 50 pl de sustrato ImmunoPure TMB (Thermo Scientific, cat. n.° 34021) a los pocillos y las placas se trataron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La absorbancia de los pocillos se midió a 450 nm utilizando un lector de placas multipocillo, Victor3 (Perkin Elmer).
Como control positivo, una fracción periplásmica que también contenía la molécula de unión a PSMA Z03938 expresada como AQHDEALE-[Z03938]-VDYV-[Z03639]-YVPG se sometió a ensayo frente a 5 pg/ml de proteína PSMA biotinilada. Como control negativo; la misma preparación periplásmica se ensayó contra la proteína del complemento hC5. La secuenciación se realizó para los clones con valores de absorbancia positivos contra hC5.
Secuenciación: Los fragmentos de PCR se amplificaron a partir de colonias individuales utilizando un programa de PCR estándar y los cebadores AFFI-21 (5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg) y AFFI-22 (5'-cggaaccagagccaccaccgg). La secuenciación de fragmentos amplificados se realizó utilizando el oligonucleótido biotinilado AFFI-72 (5'-biotinacggaaccagagccaccaccgg) y un kit de secuenciación de ciclos BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems), utilizado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las reacciones de secuenciación se purificaron mediante la unión a perlas recubiertas con estreptavidina magnéticas (Detach Streptavidin Beads, Nordiag, cat. n.° 2012-01) utilizando un Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolution) y se analizaron en analizador genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems).
ELISA de bloqueo: Los clones que se encontraron positivos para hC5 en el cribado ELISA se sometieron a un ensayo de bloqueo ELISA para dilucidar si su unión a diana se vio afectada por la presencia de las proteínas de unión a hC5 OmCI y/o proteína de unión a hMG7. El ELISA de bloqueo se realizó utilizando variantes Z expresadas en fracciones periplásmicas como se describe en la sección para el cribado ELISA anterior, pero configurando cultivos de 5 ml en tubos de fondo redondo de 12 ml y utilizando 2 ml de PBST al 0,05% para la disolución del sedimento. El ensayo de bloqueo ELISA se realizó como el ensayo de cribado ELISA, con una modificación de protocolo introducida en la etapa diana; OmCI o la proteína de unión a hMG7 se mezclaron con la proteína diana antes de la adición a la placa de ensayo. Se mezclaron 5 pg/ml de hC5 biotinilado con 5 veces o 20 veces el exceso molar de OmCI o la proteína de unión a hMG7, respectivamente, después se incubaron durante 1 h a TA para permitir la formación del complejo antes de la adición a la placa. Para cada clon, se obtuvieron una referencia (1), un control negativo (2) y una respuesta/señal de fondo (3), respectivamente, de la siguiente manera: en la etapa diana, solo se añadió hC5 a las variantes Z (como en el cribado ELISA) (1); se añadió la proteína irrelevante PSMA (producida internamente) a la proteína del complemento hC5, en lugar de OmCI o la proteína de unión a hMG7 (2); solo se añadió tampón a las variantes Z (3).
Resultados
Selección de presentación de fago de los polipéptidos de unión a la proteína del complemento C5: Se obtuvieron clones individuales después de dos-cuatro ciclos de selecciones de presentación en fago contra hC5 biotinilado. Cribado ELISA de variantes Z: Los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección se produjeron en placas de 96 pocillos y se cribaron para determinar la actividad de unión a la proteína del complemento c 5 en ELISA. En total, se cribaron casi 400 clones. Las mediciones de absorbancia mostraron muchos clones positivos para hC5. El resultado de una selección de clones se muestra en la Tabla 1; la variante Z05363 (SEQ ID NO: 510) se etiqueta con ABD, mientras que las otras variantes Z enumeradas se etiquetan con la molécula de unión Taq Z03639 como se describe en la sección de métodos. La molécula específica de PSMA Z03938 utilizada como control negativo dio una señal positiva para PSMA, mientras que no se obtuvo ninguna señal contra hC5.
ELISA de bloqueo: Los clones positivos para hC5 se sometieron a un ensayo de bloqueo utilizando las proteínas de unión a hC5 OmCI y la proteína de unión a hMG7. Para cinco clones, la señal de unión a la proteína del complemento C5 se extinguió completamente por la presencia de OmCI, alcanzando el mismo nivel que el fondo (Tabla 1). Uno de estos clones, concretamente, la variante Z05363 (SEQ ID NO: 510), también se sometió a ensayo para determinar su capacidad para unirse a hC5 en presencia de la proteína de unión a hMG7. La proteína de unión a hMG7 no inhibió la unión de Z05363 a hC5.
Tabla 1. Re n ELI A l i n n in m l l l r v ri variantes Z.
Figure imgf000018_0001
Secuenciación: La secuenciación se realizó para los clones con valores de absorbancia positivos frente a la proteína del complemento C5 en el cribado ELISA. A cada variante se le asignó un número de identificación único //////////, y las variantes individuales se denominan Z//////////. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 residuos de aminoácidos de largo se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 509-513. Los motivos de unión a la proteína del complemento C5 deducidos de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 13-17. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 residuos de aminoácidos de largo que se predice que constituyen el conjunto completo de tres hélices dentro de cada una de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 261-265.
Ejemplo 2: Producción y caracterización de variantes Z
Materiales y métodos
Subclonación de variantes Z, expresión y purificación de proteínas:
Se amplificaron cinco variantes Z de unión a la proteína del complemento C5 (Z05363 (SEQ ID NO:510); Z05477 (SEQ ID NO:509); Z05483 (SEQ ID NO:511); Z05538 (SEQ ID NO:512) y Z05692 (SEQ ID NO:513)) a partir de los vectores de biblioteca pAffi1/pAY00065/pAY02947. Se aplicó una estrategia de subclonación para la construcción de moléculas de Affibody diméricas con etiquetas His6 N-terminales utilizando técnicas estándar de biología molecular y como se describe en detalle en el documento WO 2009/077175.
Los fragmentos génicos Z se subclonaron en el vector de expresión pAY01448 dando como resultado la secuencia codificada MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VD.
Las variantes Z subclonadas se transformaron en BL21(DE3) de E. coli y se expresaron en el sistema multifermentador Greta (Belach Bioteknik). En resumen, los cultivos se dejaron crecer a 37°C en 800 ml de medio TSB-YE que contenía 50 pg/ml de kanamicina. A una DO600 de ~1, los cultivos se indujeron mediante la adición automática de IPTG a una concentración final de 0,05 mM. Los cultivos se enfriaron a aproximadamente 10°C después de 5 h de inducción, y se recogieron por centrifugación (20 min, 15.900 g). Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se recogieron y se almacenaron a -20°C hasta su uso posterior. Los niveles de expresión y el grado de solubilidad se estimaron mediante análisis SDS-PAGE en geles NuPAGE™ al 4-12% (Invitrogen) utilizando la tinción con azul de Coomassie.
Para las variantes Z expresadas principalmente como proteína soluble, los sedimentos celulares se resuspendieron en un tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,4) con una adición de 1000 U de Benzonase® (Merck, cat. no. 1.01654.001) y se alteraron por ultrasonidos. Para cada una de las variantes Z, la suspensión sometida a sonicación se aclaró por centrifugación (40 min, 25.000 g, 4°C) y el sobrenadante se cargó en una columna de His GraviTrap™ de 1 ml (GE Healthcare). La columna se lavó con tampón de lavado (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 60 mM, pH 7,4), antes de eluir las variantes Z con 3 ml de tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 0,5 M, pH 7.4). Las variantes Z que se expresaron principalmente como proteína insoluble se purificaron igualmente, pero se incluyó urea 8 M en el tampón de unión y lavado. Si fuera necesario, las variantes Z se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de fase inversa (RPC) en columnas Resource™ de 1 ml (GE Healthcare) usando agua que incluía TFA al 0,1% (ácido trifluoroacético) como fase móvil y elución con un gradiente apropiado (típicamente 0-50% sobre 20 volúmenes de columna) de acetonitrilo, incluido TFA al 0,1%.
El tampón se cambió a PBS utilizando columnas PD-10 (GE Healthcare).
Caracterización de la proteína: la concentración de las variantes Z purificadas se determinó mediante mediciones de absorbancia a 280 nm utilizando coeficientes teóricos de extinción. La pureza se estimó mediante análisis de SDS-PAGE en geles NuPAGE™ al 4-12% (Invitrogen) usando tinción con azul de Coomassie. Para verificar la identidad y determinar los pesos moleculares de las variantes Z purificadas, se realizaron análisis por LC/MS en un sistema Agilent 1100 LC/MSD (Agilent Technologies).
Análisis de CD: Las variantes Z purificadas se diluyeron a 0,5 mg/ml en PBS. Para cada variante Z diluida, se registró un espectro de CD entre 250-195 nm a una temperatura de 20°C. Además, se realizó una medición de temperatura variable (VTM) para determinar la temperatura de fusión (Tm). En la VTM, la absorbancia se midió a 221 nm mientras que la temperatura se elevó de 20 a 90°C, con una pendiente de temperatura de 5°C/min. La capacidad de la variante Z para replegarse se evaluó mediante la recopilación de un espectro de CD adicional a 250-195 nm después de enfriamiento a 20°C. Las mediciones de CD se realizaron en un espectropolarímetro Jasco J-810 (Jasco Scandinavia AB) utilizando una celda con una longitud de trayectoria óptica de 1 mm.
Análisis de unión de Biacore: Se analizaron las interacciones de las cinco variantes Z de unión a hC5 diméricas marcadas con His6 subclonadas con hC5, cC5, rC5, hMG7 y hIgG (Sigma, cat. n.° G4386) en un instrumento Biacore (GE Healthcare). Las variantes Z se inmovilizaron en diferentes células de flujo en la capa de dextrano carboxilado de varias superficies del chip CM5 (GE Healthcare). La inmovilización se realizó mediante la química de acoplamiento de aminas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se activó y se desactivó una superficie de celda de flujo en cada chip para su uso como blanco durante las inyecciones de analito. Los analitos, diluidos en tampón de ejecución HBS-Ep (GE Healthcare) hasta una concentración final de 100 nM, se inyectaron a un caudal de 10 pl/min durante 1 min. Después de 2 min de disociación, las superficies se regeneraron con una inyección de HCl 10 mM. Los resultados se analizaron en el software BiaEvaluation (GE Healthcare). Las curvas de la superficie en blanco se restaron de las curvas de las superficies del ligando.
Resultados
Subclonación de variantes Z: Se eligieron cinco clones únicos seleccionados (Z05477 (SEQ ID NO:509), Z05363 (SEQ ID NO:510), Z05483 (SEQ ID NO:511), Z05538 (SEQ ID NO:512) y Z05692 (SEQ ID NO:513)) para la subclonación como dímero en el vector de expresión pAY01448 y posteriormente se verificaron por secuenciación. Producción de proteínas: Las variantes Z diméricas marcadas con histidina produjeron niveles de expresión aceptables del producto génico soluble. La pureza de los lotes producidos se estimó en más del 90% de acuerdo con lo evaluado por el análisis SDS-PAGE. El análisis LC/MS verificó el peso molecular correcto para todas las moléculas de la variante Z.
Análisis de CD: Las temperaturas de fusión (Tm) de las diferentes variantes Z se calcularon determinando el punto medio de la transición en el gráfico de la señal de CD frente a la temperatura. Los resultados para una serie de variantes Z plegables de manera reversible se resumen en la Tabla 2 a continuación.
T l 2. T m r r f i n r n ri v ri n Z.
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Análisis de unión de Biacore: La unión de las cinco variantes Z diméricas subclonadas a diferentes especies de C5 y MG7, un subdominio de hC5, así como la unión de fondo a IgG se sometió a ensayo en un instrumento Biacore inyectando las diferentes proteínas sobre las superficies que contenían las variantes Z. Los niveles de inmovilización de ligando para las diferentes variantes Z en las superficies fueron: Z05363: 2080 RU, Z05477: 2180 RU, Z05483: 2010 RU, Z05538: 2570 RU y Z05692: 3270 RU. Las diferentes variantes de Z se sometieron a ensayo para determinar la unión a diferentes conjuntos de proteínas inyectadas a concentraciones de 100 nM, véase la Tabla 3. El resultado de las variantes Z sometidas a ensayo se muestra en la tabla como un resultado de /- para cada proteína. Como ejemplo del análisis de unión de Biacore, la Figura 2 muestra los sensogramas obtenidos a partir del Z05477 dimérico inmovilizado analizado contra hC5, cC5, rC5, hMG7 y hIgG.
Tabla 3. Respuesta de Biacore de diferentes variantes Z contra C5 de varias especies y proteínas de fondo seleccionadas relevantes.
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Ejemplo 3: Diseño y construcción de una biblioteca madura de variantes Z de unión a la proteína del complemento C5
En este Ejemplo, se construyó una biblioteca madurada. La biblioteca se usó para selecciones de polipéptidos de unión a hC5. Generalmente, se espera que las selecciones de bibliotecas maduradas produzcan aglutinantes con afinidad aumentada (Orlova et al. Cancer Res 2006, 66(8):4339-48). En este estudio, los conectores bicatenarios aleatorios se generaron por la tecnología Slonomics® que permite la incorporación de conjuntos aleatorios de componentes básicos de trinucleótidos utilizando ligaduras y restricciones del ADN bicatenario construido posteriormente.
Materiales y métodos
Diseño de biblioteca: La biblioteca se basó en una selección de secuencias de las variantes Z de unión a hC5 descritas en los Ejemplos 1 y 2. En la nueva biblioteca, 13 posiciones variables en el andamiaje de la molécula Z estaban sesgadas hacia ciertos residuos de aminoácidos, de acuerdo con a una estrategia basada en las secuencias de variante Z definidas en la SEQ ID NO:509-513 (Z05477, Z05363, Z05483, Z05538, Z05692). Una biblioteca SlonoMax® de ADN bicatenario, que contenía la hélice 1 y 2 parcialmente asignada al azar de 147 pb de la secuencia de aminoácidos 5'-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA/GAG NNN NNN NNN GCA/GCC NNN NNN GAG/GAA ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT AAC TTA ACC/ACT NNN NNN CAA/CAG TGG NNN GCC/GCG TTC ATC/ATT NNN AAA/AAG TTA/CTG NNN GAT/GAC GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3' (los codones aleatorios se ilustran como NNN) flanqueados por los sitios de restricción XhoI y SacI, se pidió a Sloning BioTechnology GmbH (Pucheim, Alemania). Las distribuciones teóricas de los residuos de aminoácidos en la nueva biblioteca que finalmente incluyen 12 posiciones de Z variables se dan en la Tabla 4.
Tabla 4: Diseño de biblioteca.
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Construcción de biblioteca: La biblioteca se amplificó usando AmpliTaq Gold polimerasa (Applied Biosystems, cat. n.° 4311816) durante 12 ciclos de PCR y los productos combinados se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, cat. n.° 28106) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. El conjunto purificado de fragmentos de biblioteca aleatorizados se digirió con las enzimas de restricción XhoI y SacI (New England Biolabs, cat. n.° R01460L, y cat. n.° R0156L) y se purificó una vez más con el kit de purificación por PCR. Posteriormente, el producto se purificó utilizando electroforesis en gel preparativa en un gel de agarosa al 1%.
El vector fagémido pAY02592 (esencialmente como pAffi1 descrito en Gronwall et al. anteriormente) se restringió con las mismas enzimas, se purificó utilizando extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Los fragmentos restringidos y el vector restringido se ligaron en una relación molar de 5:1 con ADN ligasa T4 (New England Biolabs, cat. n.° M0202S), durante 2 horas a TA, seguido de una incubación durante una noche a 4°C. El ADN ligado se recuperó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, seguido de disolución en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5.
Las reacciones de ligadura (aproximadamente 250 ng de ADN/transformación) se sometieron a electroporación en células RR1AM15 de E. coli electrocompetentes (100 pl). Inmediatamente después de la electroporación, se añadió aproximadamente 1 ml de medio SOC (medio TSB-y E, glucosa al 1%, MgCh 50 pM, MgSO450 pM, NaCl 50 pM y KCl 12,5 pM). Las células transformadas se incubaron a 37°C durante 50 min. Se tomaron muestras para la valoración y para la determinación del número de transformantes. Posteriormente, las células se agruparon y se cultivaron durante una noche a 37°C en 71 de medio TSB-YE, complementado con glucosa al 2% y 100 pg/ml de ampicilina. Las células se sedimentaron durante 15 minutos a 4.000 g, se resuspendieron en una solución de PBS/glicerol (aproximadamente el 40% de glicerol). Las células se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80°C. Los clones de la biblioteca de variantes Z se secuenciaron para verificar el contenido y evaluar el resultado de la biblioteca construida en relación con el diseño de la biblioteca. La secuenciación se realizó como se describe en el Ejemplo 1 y se verificó la distribución de aminoácidos.
Preparación de la solución madre de fago: Las células de la solución madre de de glicerol que contenía la biblioteca de fagémidos C5 se inocularon en 20 l de un medio libre de prolina definido (descrito en el Ejemplo 1) complementado con 100 pg/ml de ampicilina, y se dejaron crecer a 37°C en un fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Todas las etapas se realizaron como se describe en el Ejemplo 1 para la biblioteca Zlib006Naive.II. Después del cultivo, las células se sedimentaron por centrifugación a 15.900 g y las partículas de fago que quedaron en el medio se precipitaron posteriormente dos veces en PEG/NaCl, se filtraron y se disolvieron en PBS y glicerol como se describe en el Ejemplo 1. Las soluciones madre de fago se almacenaron a -80°C hasta su uso en la selección. Resultados
Construcción de biblioteca: La nueva biblioteca se diseñó basándose en un conjunto de variantes Z de unión a C5 bloqueadas por OmCI con propiedades de unión verificadas (Ejemplo 1 y 2). El tamaño teórico de la biblioteca diseñada fue de 6,7 x 109 variantes Z. El tamaño real de la biblioteca, determinado por la valoración después de la transformación en las células RR1AM15 de E. coli, fue de 1,4 x 109 transformantes.
La calidad de la biblioteca se sometió a ensayo mediante la secuenciación de 64 transformantes y comparando sus secuencias reales con el diseño teórico. Se mostró que el contenido de la biblioteca real en comparación con la biblioteca diseñada era satisfactorio. La posición bloqueada en la secuencia de aminoácidos diseñada (W en la posición 27) se reflejó en la secuencia real en que solo el aminoácido esperado se encontraba en esa posición. Por lo tanto, se construyó con éxito una biblioteca madura de polipéptidos de unión a hC5.
Ejemplo 4: Selección, cribado y caracterización de variantes Z a partir de una biblioteca madura
Materiales y métodos
Selección de presentación de fago de los polipéptidos de unión a la proteína del complemento C5: La proteína diana hC5 se biotiniló como se describe en el Ejemplo 1. Las selecciones de presentación de fagos se realizaron contra hC5 esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 utilizando la nueva biblioteca de moléculas de variante Z descritas en el Ejemplo 3. Se usó XL1-Blue de E. coli para la amplificación de fagos. La selección se realizó inicialmente en dos pistas paralelas. En una pista, el tiempo de selección fue de 2 h, mientras que en la otra pista, se utilizaron tiempos de selección más cortos: 20 min en el primer ciclo y 10 min para los ciclos 2-4 posteriores. Estas dos pistas (1 y 2) se dividieron en el segundo ciclo, dando como resultado un total de seis pistas (1a-c y 2a-c, que diferían en la concentración objetivo y las condiciones de lavado). La selección se realizó en un total de cuatro ciclos. En el ciclo 1 de las selecciones, se utilizó la proteína del complemento C525 nM y se realizaron cinco lavados con PBST al 0,1%. En los tres ciclos posteriores se aplicó una mayor rigorusidad, utilizando una concentración objetivo reducida y un mayor número de lavados. En los ciclos 2, 3 y 4; se utilizaron 10, 5 o 2,5 nM de la proteína del complemento C5, 4, 1 o 0,25 nM de la proteína del complemento C5 y 1,6, 0,2 o 0,05 nM de la proteína del complemento C5. En los ciclos 2, 3 y 4; se realizaron 10, 15 y 20 lavados utilizando PBST al 0,1%. Además, el segundo último lavado se prolongó a 3 h con un exceso de 50x de hC5 no biotinilado en la solución de lavado para dos de las pistas (1c y 2c).
Secuenciación de posibles aglutinantes: Los clones individuales de las diferentes pistas de selección se seleccionaron para la secuenciación. Todos los clones realizados en el cribado ELISA se secuenciaron. La amplificación de fragmentos génicos y el análisis de secuencia de fragmentos génicos se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.
Cribado ELISA de variantes Z: Se recogieron aleatoriamente colonias individuales que contenían variantes Z de los clones seleccionados de la biblioteca madurada de la proteína del complemento c 5 y se dejaron crecer en cultivos de 1 ml como se describe en el Ejemplo 1. Se liberaron proteínas periplásmicas mediante 8 ciclos repetidos de congelación-descongelación. Los cribados ELISA se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 con las siguientes excepciones. Las placas ELISA de 96 pocillos de área media se recubrieron con 2 pg/ml de un anticuerpo de cabra específico de ABD (producido internamente) diluido en tampón de recubrimiento. Se utilizó hC5 biotinilado a una concentración de 0,15 pg/ml y se realizó una incubación durante 1,5-2 h. La HRP conjugada con estreptavidina se obtuvo en Thermo Scientific (cat. n.° N100). La variante Z Z05363 (SEQ ID NO: 510) que se originó en las selecciones primarias (Ejemplo 1) se usó como control positivo, así como un control negativo que omite hC5. Las variantes Z maduradas seleccionadas se sometieron a una segunda criba contra hC5 a una concentración inferior y se compararon con rC5. El ensayo se realizó esencialmente como se describe anteriormente. Se utilizaron hC5 y rC5 a una concentración de 0.05 pg/ml y 4 pg/ml, respectivamente. La variante Z Z05363 (SEQ ID NO: 510) también se utilizó como control positivo en este experimento. Como control negativo, se sometió a ensayo una unión de la variante Z a PDGF-Rp (Z01977; descrita en el documento WO 2009/077175) contra hC5 o rC5 biotinilados. En el análisis de secuencia profunda de variantes Z seleccionadas y la correlación de aminoácidos en las 13 posiciones aleatorias con temperaturas de fusión medidas y valores de CI50 para C5 humano y C5 de ratón en el ensayo de hemólisis (descrito en el Ejemplo 6), se sugirió una variante Z favorable no identificada entre los 558 clones secuenciados. Basándose en la variante Z Z05998 (SEQ ID NO: 499), un solo aminoácido, Ile en la posición 10, se sustituyó con Leu utilizando tecnología convencional para la mutagénesis de sitio dirigido. La nueva variante se denomina Z08044 (SEQ ID NO: 498). El motivo de unión a la proteína del complemento C5 deducido de esta variante Z se enumera en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 2. Las secuencias de aminoácidos del polipéptido de 49 residuos de aminoácidos de largo que se predice que constituyen el conjunto completo de tres hélices dentro de esta variante Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 250.
Resultados
Selección de presentación de fago de los polipéptidos de unión a la proteína del complemento C5: La selección se realizó en un total de seis pistas paralelas que contenían cuatro ciclos cada una. Las diferentes pistas de selección difirieron en la concentración objetivo y las condiciones de lavado de la siguiente manera: 1a) 2 h de tiempo de selección, alta concentración, lavado estándar, 1b) 2 h de tiempo de selección, baja concentración, lavado estándar, 1c) 2 h de tiempo de selección, concentración media, lavado largo, 2a) 10 min de tiempo de selección, alta concentración, lavado estándar, 2b) 10 min de tiempo de selección, baja concentración, lavado estándar, y 2c) 10 min de tiempo de selección, concentración media, lavado largo. Para cada ciclo de selección, la concentración objetivo se redujo y las condiciones de lavado fueron más rigurosas. Todas las pistas dieron en cada ronda cantidades suficientes de partículas de fago en el eluato. La mayoría de las partículas de fago se encontraron en las pistas 1a y 2a, que representaban la concentración objetivo más alta y las condiciones de lavado más suaves. Secuenciación: Se secuenciaron clones seleccionados al azar (558). A cada variante Z se le asignó un número de identificación, Z#####, como se describe en el Ejemplo 1. En total, se identificaron 242 nuevas moléculas de variante Z únicas. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 residuos de aminoácidos de largo se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como la SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499-508 y SEQ ID NO: 514-744. Los motivos de unión a la proteína del complemento C5 deducidos de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID nO: 1, SEQ ID NO: 3-12 y SEQ ID NO: 18-248. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 residuos de aminoácidos de largo que se predice que constituyen el conjunto completo de tres hélices dentro de cada una de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251-260 y SEQ ID NO: 266-496. Entre los clones secuenciados, 63 secuencias se produjeron dos o más veces.
Cribado ELISA de variantes Z: Los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección se produjeron en placas de 96 pocillos y se cribaron para determinar la actividad de unión a hC5 usando ELISA. Todos los clones seleccionados al azar se analizaron. Se encontró que 229 de las 242 variantes Z únicas dieron una respuesta más alta (0,3-3,1 UA) contra hC5 a una concentración de 0,15 pg/ml en comparación con el clon de control positivo Z05363 (SEQ ID NO: 510; una señal de absorbancia promedio de 0,3 AU), obtenida de las selecciones primarias (Ejemplo 1). Los clones de todas las pistas de selección mostraron señales positivas. Los controles negativos tenían una absorbancia de aproximadamente 0,1 UA.
Se seleccionaron las variantes Z en función de su rendimiento en el cribado ELISA frente a hC5 y la frecuencia de aparición. Se ensayaron 43 variantes Z únicas contra una concentración inferior de hC5 (0,05 pg/ml), así como rC5 (4 pg/ml). Se obtuvo un resultado positivo contra rC5 para 40 de las variantes Z sometidas a ensayo, definidas como 2 veces la señal para el control negativo (0,4 AU). Los resultados para todas las variantes Z sometidas a ensayo contra la concentración más baja de hC5, así como contra rC5 se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 5: Subclonación, producción y caracterización de un subconjunto de variantes Z de unión a la proteína del complemento C5
Materiales y métodos
Subclonación de moléculas de variante Z en vectores de expresión: En función del análisis de secuencia y el rendimiento en el ELISA contra la proteína del complemento C5 humano y de rata, se seleccionaron 45 clones para la subclonación en el vector de expresión pAY01448. Los fragmentos de la variante Z monomérica se amplificaron a partir del vector fagémido pAY02592 y la subclonación en pAY01448 se realizó como se describe en el Ejemplo 2, dando como resultado un vector que codifica la secuencia proteica MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.
Expresión y purificación de proteínas: Las 45 variantes Z en el formato His6-(Z#####) se expresaron en un sistema multifermentador automatizado como se describe en el Ejemplo 2 o de manera similar en una configuración a pequeña escala de 100 ml de cultivos en matraces de agitación inducidos manualmente con IPTG a una concentración final de 0,4 mM. La purificación se realizó utilizando 1 ml de columnas HisGraviTrap™ esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 o en una escala más pequeña utilizando 0,1 ml de His SpinTrap (GE Healthcare, cat. n.° 28-4013-53). El tampón se cambió a PBS utilizando columnas PD-10 o PD SpinTrap G-25 (GE Healthcare, cat. n.° 28-9180-04) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de variantes Z purificadas se determinó mediante mediciones de absorbancia a 280 nm y la pureza y la identidad se evaluaron mediante SDS-PAGE y LC/MS como se describe en el Ejemplo 2. Las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80°C hasta su uso posterior.
Análisis de CD: El análisis de CD para la determinación de las temperaturas de fusión y la reversibilidad del plegado se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Resultados
Expresión y purificación de proteínas: Podían expresarse las 45 variantes Z subclonadas y la solubilidad in vitro para todas las variantes purificadas era buena. LC/MS estimó que la pureza superaba el 90% para todas las variantes. Los pesos moleculares correctos se verificaron por LC-MS.
Análisis de CD: Las mediciones del espectro de CD realizadas a 20°C confirmaron la estructura a-helicoidal de las variantes Z a esta temperatura. Una superposición de los espectros obtenidos después de las mediciones de temperatura variable (calentamiento a 90°C seguido de enfriamiento a 20°C) en los espectros obtenidos antes de la medición de temperatura variable mostró que todas las variantes Z se repliegan completamente, o casi completamente, a sus estructuras a-helicoidales después del calentamiento a 90°C (resultados no mostrados). Las temperaturas de fusión para un conjunto de variantes Z se determinaron a partir de las mediciones de temperatura variable y se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Temperaturas de fusión de variantes Z maduradas con una etiqueta de histidina fusionada directamente al extremo amino de la SEQ ID NO: 497 la SEQ ID NO: 499-5Q8.
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Ejemplo 6: Caracterización in vitro de variantes Z de unión a C5
Materiales y métodos
Cloración y producción de proteínas: ADN que codifica un subconjunto de variantes Z de unión a C5 (SEQ ID NO: 745-757) donde el codón de E. coli se optimizó y se sintetizó por GeneArt, GmbH. Los genes sintéticos que representan las variantes Z de unión a C5 se subclonaron y se expresaron en E. coli. Los vectores de expresión que codifican construcciones de monómeros o dímeros de variantes Z opcionalmente unidos a un dominio de unión a albúmina (ABD094, SEQ ID NO: 759) se ilustran esquemáticamente en la Figura 4.
Las variantes Z expresadas intracelularmente se purificaron usando métodos de cromatografía convencionales. La homogeneización y la clarificación se realizaron por sonicación seguida de centrifugación y filtración. La cromatografía de intercambio aniónico se utilizó como etapa de captura. Se obtuvo una purificación adicional mediante cromatografía de interacción hidrófoba. Las purificaciones se realizaron en condiciones ácidas (pH 5,5). El pulido y el intercambio de tampón se realizaron por cromatografía de exclusión por tamaño. Antes de la concentración hasta el contenido final de proteína, el nivel de endotoxina se redujo mediante cromatografía de afinidad con polimixina B. Las proteínas producidas se analizaron por MALDI-TOF MS y en SDS-PAGE.
Además, la proteína OmCI expresada de forma recombinante (SEQ ID NO: 761) se usó como una molécula de referencia en los estudios in vitro.
Inhibición de la hemólisis: Para los estudios de la función de la ruta del complemento clásica y la inhibición de la misma por los polipéptidos de unión a C5, se prepararon eritrocitos de oveja a partir de sangre entera de oveja en solución de Alsever (Swedish National Veterinary Institute) y, posteriormente, se trataron con un antisuero de eritrocitos anti-ovino de conejo (Sigma) para convertirse en eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA). Todo el proceso se realizó en condiciones asépticas. Todos los demás reactivos fueron de fuentes comerciales. El ensayo in vitro se realizó en una placa de microtitulación en forma de U de 96 pocillos mediante adiciones consecutivas de una proteína de ensayo, un suero de complemento y una suspensión de EA. Las concentraciones finales de todos los reactivos, en un volumen de reacción total de 50 pl por pocillo y a pH 7,3-7,4, fueron: CaCl20,15 mM; MgCh 0,5 mM; NaN33 mM; NaCl 138 mM; gelatina al 0,1%; barbital sódico 1,8 mM; ácido barbitúrico 3,1 mM; 5 millones de EA; suero de la proteína del complemento C5 a una dilución adecuada, y la variante Z de unión a C5 a las concentraciones deseadas. Se utilizaron diferentes especies de sueros de complemento en el ensayo para definir potencias de especies cruzadas de las variantes Z. Para el suero de ratón, un suero humano empobrecido en C5 (C5D de Quidel cat. n.° A501) se tuvo que complementar en una cantidad igual.
Las variantes Z se preincubaron con el suero del complemento descrito anteriormente durante 20 minutos en hielo antes de comenzar la reacción mediante la adición de una suspensión de EA. La reacción hemolítica se dejó avanzar a 37°C durante la agitación durante 45 minutos y luego se terminó opcionalmente mediante la adición de 100 pl de una solución salina enfriada con hielo que contenía Tween 20 al 0,02%. Las células se centrifugaron hasta el fondo y la porción superior, correspondiente a 100 pl de sobrenadante, se transfirió a una microplaca transparente con pocillos de área media y fondo plano. Los resultados de la reacción se analizaron como densidad óptica utilizando un lector de placas de microtitulación a una longitud de onda de 415 nm.
En todas las ocasiones de ensayo, se incluyeron controles, vehículo y OmCI (SEQ ID NO: 761) en cada placa para definir los valores de las reacciones no inhibidas y completamente inhibidas, respectivamente. Estos valores se utilizaron para calcular el % de inhibición de la hemólisis del complemento en cualquier concentración de muestra dada. Las potencias inhibitorias (valores de CI50) de las variantes Z sometidas a ensayo se definieron aplicando el mismo ensayo en presencia de una concentración controlada de C5 humano añadido al suero empobrecido en C5. Para los inhibidores altamente potentes (bajo nanomolar a sub-nanomolar), una concentración final de C5 de la mezcla de reacción se controló a 0,1 nM, que se estableció opcionalmente utilizando sueros empobrecidos o deficientes en C5.
Cinética in vitro y afinidad de variantes Z de unión a C5 con respecto a hC5 inmovilizado: La afinidad de unión de varias variantes Z de unión a C5 (SEQ ID NO: 748-757) con respecto a hC5 se analizaron utilizando un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). El C5 humano (A403, Quidel Corporation) se acopló a un chip sensor CM5 (900 RU) usando química de acoplamiento de amina de acuerdo con el protocolo del fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando hC5 a una concentración de 7,5 pg/ml en tampón de acetato de sodio 10 mM pH 5 (GE Healthcare). La célula de referencia se trató con los mismos reactivos, pero sin inyectar C5 humano.
Todos los experimentos se realizaron en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005% (tampón HBS-EP, GE Healthcare). Para los análisis cinéticos, el caudal fue de 30 pl/min y los datos se recopilaron a 25°C. Los datos de la celda de referencia se restaron para compensar los cambios en el índice de refracción en masa. En la mayoría de los casos, también se incluyó una inyección de HBS-EP como control, de modo que los sensogramas quedaron en blanco por duplicado. Las superficies se regeneraron en tampón HBS-EP. La unión de variantes Z a hC5 inmovilizado se estudió con el método de cinética de ciclo único, en el que se inyectan cinco concentraciones de muestra una tras otra en el mismo ciclo sin regeneración entre inyecciones. Las constantes cinéticas se calcularon a partir de los sensogramas utilizando el modelo de analito Langmuir 1:1 o bivalente del software Biacore T200 Evaluation versión 1.0.
Cinética in vitro y afinidad de las moléculas Z-ABD de unión a C5 con hC5 inmovilizado: La unión de las moléculas Z-ABD (SEQ ID NO: 748-757 fusionadas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS), a hC5 inmovilizado se evaluó utilizando un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare).
Las construcciones Z-ABD donde Z06175a (SEQ ID NO: 753) como un monómero o dímero se han fusionado a ABD094 (SEQ ID NO: 759) ya sea en el extremo N o en el extremo C a través de diferentes conectores como se especifica en la Figura 4 (construcciones 2, 7, 5 y 4) también se preincubaron con albúmina humana recombinante (Cell Prime rAlbumin AF-G, 9301, Novozymes), se diluyeron y luego se inyectaron sobre C5 humano inmovilizado de acuerdo con el método de cinética de un solo ciclo como se describe anteriormente. Como comparación, las mismas construcciones se inyectaron en ausencia de HSA. Dos construcciones, Z06175a-GS (Figura 4, construcción 1) y Z06175a-GSGGGGSGGGGS-ABD094 (Figure 4, construcción 3) se sometieron a ensayo únicamente en ausencia de HSA.
Unión de estado estable de variantes Z de unión a C5 a placas ECL revestidas con C5: La afinidad de una serie de construcciones de unión a C5 que comprenden variantes Z (SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748-757 fusionadas opcionalmente a ABD094 (SEQ ID NO: 759) en construcciones como se especifica en la Figura 4) con respecto a C5 humano se midió por desplazamiento de una variante Z-ABD de unión a C5 marcada con rutenio (SEQ ID NO: 748 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS).
La variante Z-ABD (SEQ ID NO: 748 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS) a usar como trazador se marcó a una relación molar de 1:12 a 1:20 (proteína: SULFO-TAG NHS-Ester, Meso Scale Discovery, cat. n.° R91AN-1). La reacción de marcaje se realizó en hielo durante dos horas. El SULFO-TAG sin unir se eliminó utilizando una columna de desalinización de centrifugación Zeba™ (Thermo Scientific, cat. n.° 89889) y la concentración final de proteína se midió utilizando un reactivo de Bradford (Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72: 248­ 254, 1976). La afinidad (constante de disociación, Kd) de la variante Z-ABD marcada con SULFO-TAG se determinó mediante análisis de unión de saturación de concentraciones crecientes de la variante Z-ABD marcada con respecto a pocillos de electroquimioluminiscencia recubiertos con C5 (ECL, Meso Scale Discovery). La variante Z-ABD marcada se analizó adicionalmente mediante LC/MS para determinar la distribución de las moléculas SULFO-TAG en la variante Z-ABD.
El desplazamiento se realizó mediante el recubrimiento de placas ECL, multimatriz de 96 pocillos de alta unión, no recubiertas (Meso Scale Discovery, cat. n.° L15XB) con 50 fmol/pocillo de hC5 durante una noche a 4°C. Posteriormente, los sitios no específicos se bloquearon con PBS con el 1% de caseína durante dos horas a TA. Diferentes variantes Z fusionadas opcionalmente con ABD094 (SEQ ID NO: 759) (véase la Figura 4) se incubaron a diferentes concentraciones junto con aproximadamente 100 pM de la variante Z-ABD de unión a C5 marcada con SULFO-TAG en PBS con el 1% de caseína. La incubación duró tres horas a TA mientras se agitaba la placa a 300 rpm. Finalmente, la incubación se terminó por lavado 3 veces con 150 pl de PBS-Tween20 enfriado con hielo. Inmediatamente después del lavado final, se añadieron 150 pl de tampón de lectura 2x (tampón de lectura T 4x, Meso Scale Discovery cat. n.° R92TC-3 diluido 1:1 en H2O ultrapuro) a cada pocillo y la señal se detectó utilizando un lector de placas (SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery). La proteína de unión a C5 de origen natural OmCI (Nunn et al. anteriormente, SEQ ID NO: 761) se incluyó en el ensayo de desplazamiento como control positivo. La afinidad de unión de las construcciones de unión a C5 competentes y controles por C5 se determinó mediante un análisis de regresión no lineal utilizando Excel plugin XLfit5 y GraphPad Prism 4.
Selectividad de unión de Z-ABD a C5 sobre C3, C4 e IgG: La unión de una variante Z-ABD (SEQ ID NO: 748 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS) a las proteínas del complemento estrechamente relacionadas C3 y C4 del ser humano, así como la unión a la IgG humana (ya que el origen del dominio Z, la proteína A estafilocócica, es una proteína de unión a la IgG) se abordó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). La construcción Z-ABD se inmovilizó en un chip CM5 (GE-Healthcare) utilizando un acoplamiento de amina (70 RU). 40 nM y 400 nM de cada C3 humano (A401, Quidel), C4 (A402, Quidel) e IgG (12511, Sigma) diluida en tampón HBS-P (GE Healthcare) se inyectaron sobre la superficie. Cada inyección fue seguida de un ciclo de regeneración con NaOH 20 mM inyectado durante 30 s. El C5 humano a las mismas concentraciones se ejecutó en paralelo como control positivo.
Resultados
Clonación y producción de proteínas: Las variantes de proteínas producidas como se describe esquemáticamente en la Figura 4, donde "Z" se puede representar mediante la SEQ ID NO: 745 y la SEQ ID NO: 748-757, se analizaron por MALDI-TOF MS y en SDS-PAGE. (Figura 5)
Inhibición de hemolisis: Se ensayaron un subconjunto de variantes Z de unión a C5 para determinar la actividad de unión a C5 in vitro y la inhibición de la hemólisis en eritrocitos de oveja. Se calculó la concentración de la variante Z que dio como resultado un 50% de inhibición de la hemólisis (CI50) o un 50% de inhibición de la unión de trazador al C5 humano. Las curvas representativas de concentración-respuesta para las variantes Z mostradas como SEQ ID NO: 745 y SEQ ID NO: 748-757 que inhiben la hemólisis como se describe en la sección de métodos se muestran en las Figuras 6A y 6B. El resultado para diferentes variantes Z fusionadas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) a través de un conector GS corto se muestra en la Figura 6A.
La variante Z parental Z05477a (SEQ ID NO: 745) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) separada por un conector GS corto presentó un valor de CI50 de aproximadamente 100 nM, mientras que las variantes Z-ABD de unión a C5 de segunda generación sometidas a ensayo típicamente inhibían la hemólisis con valores de CI50 de aproximadamente o por debajo de 1 nM. Esto sugiere un aumento de más de 100 veces en la potencia de las variantes Z de unión a C5 identificadas en la selección de maduración y el cribado posterior.
En la Figura 6B, la unión a C5 se muestra para diversas combinaciones de una variante Z representativa (Z06175a; SEQ ID NO: 753) en solitario, como un dímero y en fusión con ABD094 (SEQ ID NO: 759) en el extremo N o el extremo C a través de diferentes conectores como se especifica en la figura. Las combinaciones de unión a C5 presentaron valores de CI50 que variaban de 86 pM a 12 nM con suero humano según se midió usando el ensayo descrito anteriormente. El valor correspondiente para la proteína de garrapata OmCI fue típicamente de 300 a 500 pM.
Cinética in vitro: Los estudios cinéticos de las características de unión para una serie de variantes Z (SEQ ID NO: 748-757) fusionadas opcionalmente con ABD094 (SEQ ID NO: 759), a hC5 inmovilizado, así como a C5 en presencia de albúmina humana, se realizaron utilizando el instrumento Biacore T200.
Los datos para diez variantes Z diferentes fusionadas a ABD094 a través de un conector GS se presentan en la Tabla 6.
T l . r rí i ni n h m n r if r n f i n Z-ABD
Figure imgf000027_0002
La unión de la misma variante Z (SEQ ID NO: 753) pero en diferentes construcciones; es decir, con/sin ABD y diferentes conectores, también se analizaron utilizando Biacore T200. Además, el efecto de la albúmina en algunas fusiones Z-ABD también se evaluó realizando el mismo análisis en ausencia y en presencia de albúmina humana. Estos datos se presentan a continuación en la Tabla 7.
Tabla 7. Características de unión a C5 humano para una variante de fusión Z-ABD Z06175a (SEQ ID NO: 753,
r vi Z m r n i n if r n n r i n .
Figure imgf000027_0001
Se pudieron observar efectos sorprendentemente pequeños cuando se comparan las afinidades de las construcciones para hC5 (SEQ ID NO: 760) en presencia y ausencia de albúmina. Esto sugiere que la unión simultánea de albúmina al resto ABD de las construcciones no interfiere con la interacción de C5.
Unión de estado estable de variantes Z de unión a C5 a placas ECL revestidas con C5: Unión en estado estable de construcciones de unión a C5 compuestas por diferentes variantes Z (SEQ ID NO: 745 y 748-757), opcionalmente fusionadas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) en las construcciones como se especifica en la Figura 4, a hC5 se evaluó en un ensayo de competición. Al competir por la unión a C5 recubierto en placas ECL con variantes Z de unión a C5 marcadas con SULfO-TAG (SEQ ID NO: 748) fusionadas a ABD (SEQ ID NO: 759), se evaluó la unión en estado estable de las construcciones de C5. Como comparación, también se incluyó la proteína de garrapata OmCI (SEQ ID NO: 761). La variante Z-ABD marcada que contenía la SEQ ID NO: 748 tenía una afinidad (Kd) de 0,9 nM para hC5. Además, se encontró que esta variante Z-ABD marcada se unió a un anticuerpo específico para la región constante de las variantes Z de una manera dependiente de la concentración con una Kd de 0,34 nM.
Se encontró que las variantes Z de unión a C5 (SEQ ID NO: 748-757) fusionadas en el extremo carboxi a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS desplazaban la variante Z-ABD etiquetada con SULFO-TAG 200 pM con valores de CI50 que variaban de aproximadamente 300 pM a 1 nM (Figura 7A), mientras que la construcción correspondiente que contenía la variante Z parental Z05477a (SEQ ID NO: 745) presentó un valor de CI50 de aproximadamente 30 nM. En contraste, se descubrió que la proteína de unión a C5 de origen natural OmCI se unía a hC5 con una CI50 de 1,5 nM (Figura 7A). Por lo tanto, todas las variantes Z de segunda generación sometidas a ensayo (SEQ ID NO: 748-757) mostraron una afinidad de unión más alta para C5 humano que la variante Z parental Z05477a (SEQ ID NO: 745). Además, las afinidades fueron mayores que las de la unión de OmCI a C5 humano utilizando el mismo método.
Se probaron varias construcciones diferentes que contenían el mismo dominio de unión a C5 que un monómero, dímero, con o sin ABD, así como también unos pocos conectores diferentes entre los diferentes dominios (Figura 7B). Se encontró que las variantes monoméricas de Z06175a (SEQ ID NO: 753, fusionadas opcionalmente con una etiqueta His6 o un ABD C-terminal) y las variantes diméricas con un conector ABD C-terminal desplazaban la variante Z-ABD marcada con SULFO-TAG 200 pM con valores de CI50 que varían de aproximadamente 500 pM a 1,7 nM, mientras que la variante dimérica sin un ABD y la variante monomérica con un ABD N-terminal desplazaron Z-ABD etiquetado con SULFO-TAG 200 pM con valores de CI50 de 4 nM y 17 nM, respectivamente.
Selectividad: La selectividad se abordó mediante el análisis de SPR y la superficie con la variante Z-ABD inmovilizada (SEQ ID NO: 748 fusionada a la SEQ ID NO: 759 por un conector GS) no mostró una señal de SPR significativa cuando se sometió a 40 y 400 nM de los parálogos de C5 C3 y C4 humano, así como la IgG humana. Como comparación, el C5 humano 400 nM provocó una respuesta SPR de aproximadamente 450 RU que mostraba que la variante Z-ABD sometida a ensayo es selectiva para C5 sobre C3, C4 e IgG.
Ejemplo 7: Estudios de interacción de variantes Z-ABD con HSA, BSA y albúmina sérica de rata y ratón.
Materiales y métodos
Se usaron dos métodos diferentes, cromatografía de exclusión por tamaño y Biacore, para estudiar la interacción entre el dominio de unión a albúmina ABD094 fusionado a variantes Z de unión a C5. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se empleó para estudiar la interacción entre Z06175a-GS-ABD094 (SEQ ID NO: 753 fusionada con SEQ ID NO: 759 por un conector GS) y HSA. Brevemente, las cantidades equimolares de Z06175a-GS-ABD094 y HSA recombinante (Novozymes) se preincubaron en PBS a temperatura ambiente durante 60 minutos y luego se ejecutaron en una columna Superdex200 (GE Healthcare) utilizando el sistema SMART (GE Healthcare). Z06175a-GS-ABD094 y HSA también se ejecutaron por separado como controles.
La unión a albúmina inmovilizada se estudió utilizando un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). La albúmina humana recombinante (Recombumin®, Novozymes) se acopló a un chip sensor CM5 (385 RU) utilizando la química de acoplamiento de amina de acuerdo con lo descrito por el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando albúmina humana en un tampón de acetato de sodio 10 mM, a pH 4,5 (GE Healthcare). La célula de referencia se trató con los mismos reactivos, pero sin inyectar albúmina humana. La inyección de HBS-EP también se incluyó como control, de modo que los sensogramas quedaron en blanco por duplicado. Los experimentos se realizaron en tampón HBS-EP, se usó glicina-HCl 10 mM pH 2 (GE Healthcare) para la regeneración, el caudal era de 30 pl/min y los datos se recopilaron a 25°C. Se sometieron a ensayo dos construcciones diferentes, Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) y Z-Ab D-Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a) a tres concentraciones diferentes; 25 nM, 100 nM y 400 nM. La versión 4.1.1 de BIAevaluation se utilizó para evaluar los datos de sensograma. De manera similar, también se investigó la unión de Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) a superficies inmovilizadas con albúmina sérica de rata (A4538, Sigma), ratón (A3559, Sigma) y vaca (BSA, Sigma).
Resultados
En una columna SEC, las moléculas más grandes se eluyen más rápido que las pequeñas. Como se ve en la Figura 8A, el HSA coinyectado Z06175a-GS-ABD094 se eluye más rápido que cuando se inyecta HSA en solitario, lo que sugiere que las dos moléculas se comportan como un complejo estable en estas condiciones. El Z06175a-GS-ABD094 más pequeño se eluye más lentamente que el complejo o HSA en solitario, lo que demuestra que estas proteínas en solitario son más pequeñas que el complejo.
Los datos de Biacore 2000 para las variantes analizadas de Z-ABD y Z-ABD-Z muestran que Z-ABD tiene una tasa de asociación más rápida que cuando ABD está flanqueado por dominios Z en cada lado (Figura 8B). El análisis de la afinidad de unión de los dominios Z fusionados a ABD apunta a una afinidad por debajo de 1 nM para Z-ABD, mientras que la variante Z-ABD-Z se une a HSA inmovilizada con una Kd por encima de 1 nM.
Z06175a-GS-ABD094 se unió a la albúmina sérica de rata con una afinidad muy alta (KD <100 pM), mientras que la interacción con la albúmina sérica de ratón inmovilizada fue más débil (KD de aproximadamente 4 nM) que tanto con la albúmina sérica humana como de rata. La interacción con la albúmina sérica bovina no fue medible.
Estos datos coinciden bien con los datos publicados sobre una variante anterior de ABD (Jonsson et al. Protein Engineering, Design & Selection 2008, 21: 515-527) y muestran que la variante Z-ABD sometida a ensayo está fuertemente unida a la albúmina sérica en humanos en concentraciones clínicamente relevantes, así como en ratones y ratas, lo que permite comparaciones de datos farmacocinéticos entre animales y seres humanos.
Ejemplo 8: Estudios farmacocinéticos de la variante Z de unión a C5 en ratas
Materiales y métodos
Fase de vida en roedores: La farmacocinética de dos construcciones de unión a C5 Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094; SEQ ID NO: 753 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS, Figura 4, construcción 2 ) y Z-ABD-Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a; (SEQ ID NO: 753 fusionada con la SEQ ID NO: 759 por un conector GS, seguido de un conector GS(G4S)2 y un segundo motivo de SEQ ID NO: 753, Figura 4, construcción 5) se estudió en ratas Sprague Dawley (SD) macho (250-300 g de peso corporal). A cada rata se le administró una dosis única, i.v. (250 nmol/kg) o s.c. (500 nmol/kg), de Z-ABD o A-ABD-Z (n = 3 por grupo de dosis). Se extrajeron muestras de sangre (200 pl) a los 5, 20 y 45 minutos, así como a 1,5, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240 y 336 h después de la administración para el grupo i.v. y a los 15 y 30 min, 1, 2, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240 y 336 h después de la administración para el grupo s.c. La sangre se recogió en tubos y se puso en la nevera durante 20 minutos para permitir la coagulación. El suero se recogió posteriormente después de la centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos. Las muestras de suero se mantuvieron a -70°C en espera del análisis.
Determinación de las concentraciones de las variantes Z de unión a C5 en muestras de suero de animales utilizando LC/LC/MS/MS: Las concentraciones séricas de las construcciones Z-ABD y Z-ABD-Z de unión a C5, como se describe anteriormente, se determinaron por espectrometría de masas (LC/LC/MS/MS).
Las muestras de suero o plasma (25 pl) se diluyeron con 150 pl de una pepsina agarosa (7 mg/ml, Sigma, cat. n.° P0609) suspendida en tampón de formiato amónico 1 M, pH 3,0 en un tubo Eppendorf de 500 pl. Los tubos se taparon y se agitaron en un termomezclador compacto Eppendorf a 37°C durante 20 min. Después de la agitación, se añadieron 25 pl de una solución de patrón interno I(13C6;15N)NKLDDDPSQSSEL (aminoácidos 31-44 de la SEQ ID NO: 746-757) (Thermo Fisher Scientific GmbH), diluida a 0,5 pM en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA). Después de la adición del patrón interno, las muestras se mezclaron y se filtraron a través de filtros de centrifugación de celulosa de 0,45 pm (Grace).
Las muestras estándar para la calibración se prepararon pesando 20 pl de solución madre de proteína con una concentración de proteína conocida (5-10 mg/ml), seguido de una dilución con plasma en blanco de la especie a analizar. El primer patrón estándar de plasma (3 pM) se diluyó adicionalmente hasta 0,1 pM.
Se inyectaron 40 pl de las muestras en un sistema de columna acoplada seguido de espectrometría de masas en tándem con monitorización de reacción múltiple (MRM). La primera columna era una columna Ascentis RP-Amida empaquetada con partículas de 5 pm (2,1 x 150 mm, Supelco). Se usó una columna de enriquecimiento, una columna Newgard de Brownlee (3,2 x 15 mm) empaquetada con partículas C18 de 7 pm, para atrapar la fracción peptídica de analito de la primera columna. El efluente de la primera columna se diluyó con 1 ml/min de agua bombeada por la bomba Shimadzu en un agitador de vórtice (Lee Scientific). La última columna era una columna de fase inversa de modo mixto y de intercambio catiónico (2,1 x 100 mm) empaquetada con partículas de 5 pm Primesep 100 (SIELC Inc).
Las fases móviles para la primera columna (RP-Amida) proporcionadas en un primer cromatógrafo de líquidos (Acquity UPLC) fueron A: 2% de acetonitrilo, 0,1% de ácido acético, 0,1% de TFA y 97,8% de agua y B: acetonitrilo con el 0,1% de ácido acético y el 0,02% de TFA. El flujo fue de 0,5 ml/min y se usó un gradiente lineal para la elución. La muestra se eluyó en condiciones isocráticas con el 100% de A durante 1 minuto, seguido del 80% de A a los 7,9 minutos. A los 8,1 min, la columna se lavó con el 100% de B durante un minuto, seguido de un reacondicionamiento con el 100% de A. El efluente de la columna se conectó a una válvula de seis puertos Valco controlada desde el software del espectrómetro de masas.
La columna trampa (3,2 x 15 mm) se conectó a la válvula de seis puertos en el modo de lavado a contracorriente. Las fases móviles para la segunda columna, proporcionadas en un segundo cromatógrafo de líquidos (Agilent 1100), fueron A: 80% de acetonitrilo, 19,9% de agua y 0,1% de ácido fórmico y B: 80% de acetonitrilo, 19% de agua, 0,5% de acético. ácido y 0,5% de TFA bombeados por un cromatógrafo de líquidos Agilent 1100 a 0,5 ml/min y eluidas con el siguiente gradiente: 100% A durante los primeros 5 minutos, seguido de B que aumenta gradualmente del 0 al 40%, de 5 a 10 minutos, seguido de un aumento al 100% de B durante los siguientes 6 segundos (10 a 10,1 minutos). B se mantuvo al 100% hasta 11,5 minutos seguido de un descenso al 0% (100% de A) durante los siguientes 6 segundos (11,5 a 11,6 minutos) y se mantuvo al 0% de B durante todo el ciclo hasta que se detuvo a los 13 minutos.
El efluente de la última columna se conectó a un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple (Sciex API 4000) equipado con una fuente de iones de electronebulización operada en modo de ión positivo. Las transiciones de MRM fueron 780,9>814,4 para el analito y 784,5>821,4 para el patrón interno. El potencial de desintegración se optimizó a 55 V y la energía de colisión a 35 V. La energía de colisión eficaz fue de 70 eV, ya que el ión precursor estaba doblemente cargado, lo que daba un ión de fragmento cargado individualmente. Las relaciones de área de pico entre el analito y el patrón interno se utilizaron para la cuantificación. Las curvas de calibración lineal se obtuvieron con una recuperación del 85% y un límite de cuantificación de aproximadamente 40 nM.
Hemolisis ex vivo: Se realizó un ensayo hemolítico ex vivo para la activación del complemento con el fin de ensamblar óptimamente las condiciones in vivo para las muestras de suero de los estudios in vivo descritos anteriormente. Las muestras de suero se diluyeron 5 veces en un volumen de reacción total de 25 pl/pocillo que comprendía 5 millones de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA). En general, una porción de 20 pl de suspensión de EA que contenía todos los demás componentes (véase el Ejemplo 6) se mezcló (agitación durante 10 minutos) con 5 pl de muestra de suero para iniciar la activación hemolítica a 37°C. Para muestras de suero de ratón, tal como en el ejemplo 11, sin embargo, se tuvo que incluir 1 pl de C5D en la suspensión de 20 pl de EA. El ensayo ex vivo se realizó esencialmente como se describe para el ensayo in vitro del Ejemplo 6. Cálculos: La evaluación de los parámetros farmacocinéticos se basó en los datos de concentración de suero individual, la media (± desv. est.) se informa para cada grupo de dosis. Los niveles por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) que aparecen en los puntos de muestreo terminales se omitieron del análisis farmacocinético. La concentración sérica máxima, la Cmáx y el tiempo hasta la concentración sérica máxima observada, tmáx, se obtuvieron directamente de los datos de concentración sérica. Los parámetros farmacocinéticos; área bajo la curva (AUC, AUC0-~ y AUC0-último calculada por el método trapezoidal lineal), biodisponibilidad subcutánea (F, calculada como (AUCsc/AUCiv) * (Dosisiv/Dosissc)), semivida sérica terminal (T1/2,z, calculada como In 2/Az donde la estimación de la pendiente terminal, Az, se basó en al menos 4 observaciones C = f(t)), tiempo medio de residencia (MRT, calculado como AUMC/AUC), depuración sérica (CL, calculada como Dosis/AUC0-~), volumen de distribución en estado estable (Vss, calculado como CL*MRT) y volumen de distribución en la fase terminal (Vz, calculado como CL/Az), se calcularon utilizando el software WinNonlin versión 5.2.1 (Pharsight Corp., EE. UU.), análisis no compartimental.
Resultados
Los datos farmacocinéticos para Z-ABD y Z-ABD-Z tras la administración i.v. (250 nmol/kg) y s.c. (500 nmol/kg) se resumen en la Tabla 8. Z-ABd fue cuantificable en suero hasta 10-14 días después de la dosis en el grupo i.v. y 14 días en el grupo s.c., mientras que Z-ABD-Z fue cuantificable en suero hasta 10 días después de la dosis en ambos grupos de dosis (Figura 9). 14 días fue el punto de tiempo de muestreo final.
Correlacionando la concentración sérica del polipéptido de unión a C5 y la cantidad de hemólisis en eritrocitos de oveja, se encontró que Z-ABD obtuvo una inhibición completa de la hemólisis en las condiciones descritas (por ejemplo, dilución de suero 1:5) a concentraciones séricas superiores a 1 pM (Figura 12), mientras que Z-ABD-Z alcanzó una inhibición total a concentraciones séricas de aproximadamente 0,5 pM (Figura 13). Sorprendentemente, como se ve en la Figura 9 y en la Tabla 8, Z-ABD tiene una menor depuración en suero, una semivida terminal más larga y una mayor biodisponibilidad que Z-ABD-Z. En términos de tiempo, esto condujo a una inhibición total de la hemólisis durante aproximadamente tres días después de la administración de 250 nmol/kg de Z-ABD (Figura 10) i.v. o 500 nmol/kg s.c (Figura 11) a ratas S.D.
Tabla 8. Farmacocinética media (± desv. est.) de Z-ABD y Z-ABD-Z tras la administración i.v. y s.c. en ratas Sprague Dawle macho.
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Ejemplo 9: Estudios farmacocinéticos de variantes Z de unión a C5 en monos
Materiales y métodos
El estudio en fase de vida se realizó en Charles River, Nevada (www.criver.com), la formulación del fármaco administrado y el análisis de las muestras de suero se realizaron internamente. La farmacocinética de una variante Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS) se investigó en el mono Cynomolgus macho (n = 3) después de una administración i.v. (intravenosa) y s.c. (subcutánea). La evaluación de los parámetros farmacocinéticos se realizó de acuerdo con el Ejemplo 8, sin embargo, después de una administración i.v., se determinó la semivida en suero inicial (T1/2a) correspondiente a la pendiente inicial de la curva log-lineal de concentración sérica-tiempo, la semivida en suero intermedia (T1/213) correspondiente a la pendiente de la curva log-lineal de concentración en suero-tiempo asociada con la fase secundaria (intermedia) y la semivida en suero terminal (T1/2Y) correspondiente a la pendiente terminal de la curva log-lineal de concentración en suero-tiempo. T1/2 se calculó como In 2/A, donde la estimación de la pendiente, A, se basó en al menos 4 observaciones C = f(t). Los datos farmacocinéticos presentados para la administración sc se compensan por los niveles de Z-ABD previos a la dosis, mientras que el gráfico que muestra la concentración en suero frente al tiempo después de la administración sc muestra las concentraciones en suero reales determinadas. Los monos tenían 2-4 años de edad con un peso corporal de 2,3-3 kg. Cada mono recibió una sola dosis i.v. (540 nmol/kg) seguida de una sola dosis s.c. (1635 nmol/kg) tres semanas después de la administración i.v. Las muestras de sangre se extrajeron a los 10 y 30 minutos y 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336 y 504 horas después de la dosis tras ambas administraciones. Las muestras de sangre se dejaron coagular durante 20-40 minutos a temperatura ambiente y después se centrifugaron a 1500 a 2200 RCF a 2-8°C durante 10-15 minutos antes de recoger y congelar el suero. Las muestras de suero se almacenaron a una temperatura inferior a -20°C hasta el análisis.
Las concentraciones séricas de Z-ABD se analizaron por LC/LC/MS/MS como se describe en el Ejemplo 8. Las concentraciones séricas determinadas por LC/LC/MS/MS también se confirmaron mediante una técnica de inmunoensayo de enzimas cuantitativas de tipo sándwich. Un anticuerpo policlonal específico para el compartimento Z de Z-ABD se aplicó sobre una microplaca. El anticuerpo policlonal no unido se eliminó por lavado y se añadió caseína como agente de bloqueo para reducir la unión inespecífica a la superficie plástica. Las muestras y los patrones se diluyeron en PBS que contenía caseína al 0,5% y entre el 1-5% de suero normal de mono. Después de lavar la caseína no unida, se añadieron por pipeteo los patrones y las muestras a los pocillos, lo que permitió que cualquier Z-ABD presente en la muestra, que se presumía se asociara principalmente con la albúmina sérica, se uniera al anticuerpo inmovilizado. Después de eliminar por lavado cualquier Z-ABD sin unir, se añadió un anticuerpo policlonal marcado con HRP específico para la albúmina para detectar el complejo inmovilizado de Z-ABD-albúmina mediante métodos colorométricos. El anticuerpo policlonal no unido se eliminó por lavado y se añadió una solución de sustrato a los pocillos y el color se desarrolló en proporción a la cantidad de Z-ABD unida. La evaluación y el cálculo de los parámetros farmacocinéticos se realizaron como se describe en el Ejemplo 8.
La hemólisis ex vivo en suero de monos cynomolgus dosificada con la variante Z-ABD descrita anteriormente se controló utilizando el método descrito en los Ejemplos 6 y 8 con la modificación de que el suero de mono se diluyó solo dos veces en comparación con cinco veces para el suero de roedor.
Resultados
Se presentan los datos sobre la farmacocinética media (± desv. est.) de cada grupo de dosis. Las concentraciones séricas de Z-ABD fueron cuantificables en todos los puntos de tiempo tanto después de la administración i.v. como s.c. por LC/LC/MS/MS (Figura 14). Los datos de ELiSa y los datos de LC/LC/MS/MS se correlacionaron linealmente con un coeficiente de 0,986, pero los datos de LC/LC/MS/MS se utilizaron para los cálculos. Tras la administración i.v. de Z-ABD, la semivida sérica inicial fue de 9,1 (0,8) horas, la semivida sérica intermedia fue de 84 (4) horas y la semivida sérica terminal fue de 198 (51) horas. El tiempo medio de residencia fue de 246 (62) horas. El volumen de distribución, Vss y Vz se calculó a 110 (23) ml/kg y 127 (27) ml/kg respectivamente, y la depuración se estimó a 0,45 (0,02) ml/h*kg.
Tras la administración s.c., y corregidas por los niveles séricos pre-dosis restantes de la administración i.v., las concentraciones séricas máximas (Cmáx media 21 (3) pM) se alcanzaron a las 8-24 h después de la dosis. La semivida sérica terminal fue de 206 (40) horas y el tiempo de residencia medio fue de 250 (68) horas. La biodisponibilidad subcutánea se estimó en más del 70%.
El efecto farmacodinámico de la variante Z-ABD inyectada (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fusionada a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por un conector GS) se controló mediante hemólisis. El efecto hemolítico en el mono cynomolgus se suprimió completamente (<20% de la dosis previa) durante al menos siete días después de la administración de 5 mg/kg de Z-ABD i.v. y 15 mg/kg Z-ABD s.c.
Ejemplo 10: Estudios in vivo utilizando peritonitis inducida por Zymosan
Materiales y métodos
Administración a ratones: Ratones hembra C57BL/6 recibieron diferentes concentraciones de una molécula de fusión Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094, SEQ ID NO: 753 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS) o el control positivo OmCI por vía intraperitoneal (i.p.) 1 hora antes de la inducción con zymosan, o por vía subcutánea (s.c.) 18 horas antes de la inducción con zymosan.
Se administraron i.p. 0,8 mg/ratón de zymosan. 1 hora después, se extrajeron muestras de sangre orbital (en viales de suero con activador de coagulación) bajo anestesia con isoflurano. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. Se realizó una incisión en la piel y se visualizó la pared muscular abdominal. La solución de PBS (incluido EDTA 2 mM) se inyectó suavemente en la cavidad abdominal. Se masajeó el abdomen y se extrajo una muestra de líquido (1-2 ml). Las muestras se transfirieron a tubos de ensayo y se almacenaron en hielo húmedo antes de la centrifugación a 600 g durante 10 min. Se analizaron las concentraciones de proteína total y C5a en el sobrenadante.
Las muestras de sangre se mantuvieron en un refrigerador durante al menos 30 minutos y, posteriormente, se realizó una centrifugación a 2000 g. Las muestras de suero se almacenaron en el congelador (-70°C) para un análisis posterior de la actividad hemolítica y los niveles de Z06175a-GS-ABD094.
Análisis de la actividad de hemólisis en muestras de suero de animales: El análisis de la actividad de hemólisis se realizó de acuerdo con el ensayo de hemólisis descrito en los Ejemplos 6 y 7.
Análisis de la concentración de C5a en lavado de ratones dosificados con zymosan y moléculas de fusión Z-ABD de unión a C5: Para la detección de C5a en muestras de lavado peritoneal de ratón, se recubrieron placas de microtitulación (MaxiSorp, Nunc) durante una noche a 4°C con 100 pl/pocillo de anticuerpo anti-C5a (cat. n.° MAB21501, R&D Systems) a una concentración de 1 pg/ml en un tampón de carbonato de sodio-bicarbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6 (cat. n.° C-3041, Sigma). Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST, cat. n.° 09-9410-100, Medicago) y se bloquearon con 200 pl/pocillo de BSA al 1% (cat. n.° A7030, Sigma) en PBST durante 1-1,5 h a TA durante la agitación a 450 rpm. La placa se lavó de nuevo tres veces con PBST y después se incubó con 100 pl/pocillo de patrón C5a de ratón recombinante (cat. n.° 2150-C5, R&D Systems) a diversas concentraciones en PBST con BSA al 0,1% o muestras durante 2 h a TA durante la agitación a 450 rpm. Las muestras de alta concentración también se diluyeron en PBST con BSA al 0,1%. La placa se lavó una vez más tres veces con PBST y luego se incubó con 100 pl/pocillo de anticuerpo antiC5a biotinilado (cat. n.° BAF2150, R&D Systems) a una concentración de 0,1 pg/ml durante 1,5 h a TA mientras se agitaba la placa a 450 rpm. Después de lavar 3 veces con PBST, la placa se incubó con 100 pl/pocillo de estreptavidina-HRP (cat. n.° DY998, R&D Systems) a una dilución de 200 veces en tampón de bloqueo durante 20 minutos a TA durante agitación a 450 rpm. Después de tres lavados finales, la placa se desarrolló con 100 pl/pocillo de sustrato TMB (cat. n.° T0440, Sigma) y se leyó después de 20-30 minutos a 650 nm utilizando un lector de placas Spectramax Plus (Molecular Devices).
Se construyó una curva estándar representando la absorbancia a 650 nm para cada patrón frente a su concentración (intervalo 0-4000 pg/ml).
Determinación de la concentración de variante Z en muestras de suero de animales usando ECL: Las concentraciones séricas de Z06175a-GS-ABD094 de unión a C5 administrada (SEQ ID NO: 753 fusionada a la SEQ ID NO: 759 por un conector GS) y Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGS-Z06175a (SEQ ID NO: 753 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS, seguido de un conector GS(G4S)2 y un segundo motivo de SEQ ID NO: 753, véase la Figura 4 para la descripción de la construcción) se determinaron por ECL. Se recubrieron placas multimatriz de 96 pocillos de alta unión, no recubiertas (Meso Scale Discovery cat. n.° L15XB) con una Ig de molécula anti-Affibody de cabra (Affibody AB, cat. n.° 20.1000.01.0005).
En similitud con el Ejemplo 6, una variante Z-ABD (Z06009a, SEQ ID NO: 748 fusionada a ABD094, SEQ ID NO: 759 Placas multimatriz se recubrieron con la IgG de molécula anti-Affibody de cabra (Affibody AB) durante una noche a 4°C, y posteriormente los sitios no específicos se bloquearon con PBS con caseína al 1% durante dos horas a temperatura ambiente.
Mientras tanto, las muestras de suero se descongelaron a partir de -70°C y se diluyeron en PBS con caseína en suero de la misma cepa animal. Los patrones y controles se diluyeron en el tampón correspondiente. Las muestras y los patrones se incubaron durante tres horas a TA mientras se agitaba la placa a 300 rpm. La incubación se terminó por lavado 3 veces de 150 pl de PBS-Tween20 enfriado con hielo. Inmediatamente después del lavado final, se añadieron 150 pl de tampón de lectura 2x (tampón de lectura T 4x, Meso Scale Discovery cat. n.° R92TC-3 diluido 1:1 en H2O ultrapuro) a cada pocillo y la señal se detectó utilizando un lector de placas (SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery).
En un experimento alternativo, las placas se recubrieron con C5 humano (SEQ ID NO: 760, 1 pmol/pocillo). Antes de la adición a la placa recubierta, las muestras de suero y los patrones, diluidos en suero o en suero y PBS con caseína (todas las muestras y patrones se correspondieron con la misma concentración de suero), se calentaron a 60°C durante 30 minutos para desnaturalizar C5 endógeno. Este experimento alternativo proporcionó un método para la detección exclusiva de proteínas de unión a C5, mientras que la estrategia dependiente de anticuerpos descrita anteriormente se puede aplicar a todas las proteínas que se unen a ese anticuerpo en particular.
Resultados
Análisis de concentraciones séricas de Z-ABD y actividad de hemolisis en muestras de suero de animales: Las concentraciones séricas, así como la capacidad de afectar a la hemólisis en eritrocitos de oveja de la molécula de fusión Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094, SEQ ID NO: 753 fusionada a SEQ ID NO: 759 por un conector GS) se evaluó después de la administración de una dosis baja (20 nmol/kg), media (100 nmol/kg) y alta (500 nmol/kg). Las concentraciones séricas fueron relativamente lineales con la dosis, y la inhibición de la hemólisis confirmó que las moléculas en el suero eran activas y que la inhibición de la hemólisis también dependía de la concentración.
Análisis de la concentración de C5a en lavado de ratones dosificados con zymosan y moléculas de fusión Z-ABD de unión a C5: La molécula proinflamatoria zymosan se administró i.p. y en la Figura 15, se muestra el efecto sobre el producto de escisión de C5 altamente inflamatorio C5a en lavado en función de la dosis de zymosan en solitario y la dosis de zymosan después de una dosis de una variante Z de unión a C5 a 20, 100 y 500 nmol/kg administrada s.c.
18 h antes del tratamiento con zymosan u OmCI administrado i.p. 1 h antes del tratamiento con zymosan. La administración de Zymosan en solitario conduce a una elevación potente de C5a en el lavado. Este efecto se bloquea de una manera dependiente de la dosis por la molécula de fusión Z-ABD de unión a C5 presentada.
Ejemplo 11: Estudios farmacocinéticos de la proteína de unión a C5 en ratones después de la administración intratraqueal
Materiales y métodos
Se estudió el perfil farmacocinético de la construcción de unión a C5 Z06175a-GS-ABD094 (SEQ ID NO: 753 fusionada a la SEQ ID NO: 759 por un conector GS) después de la administración intratraqueal a ratones C57bl hembra. La temperatura, la humedad relativa y la iluminación se ajustaron para mantener 22 ± 1°C, 55 ± 5% y un ciclo de 12 h de luz - 12 h de oscuridad, y se proporcionó dieta y agua a voluntad. Los animales se anestesiaron con isoflurano y se dosificaron directamente en los pulmones utilizando un micropulverizador con 500 nmol/kg de Z06175a-GS-ABD094. Se extrajo la mayor cantidad de sangre posible, bajo anestesia con isoflurano, de la vena cava a los 5 min, 30 min, 1 h, 3 h, 7 h, 16 h, 24 h, 48 h y 72 h (tres animales/punto temporal) para la preparación de muestras de suero. Las muestras de suero se prepararon recogiendo sangre en los tubos y colocando los tubos en el frigorífico durante 20 minutos. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos. Se preparó un mínimo de 100 pl de suero de cada muestra de sangre. Las muestras de suero se mantuvieron a -70°C antes del análisis. Las concentraciones séricas de Z06175a-GS-ABD094 en cada muestra se determinaron por ECL como se describe en el Ejemplo 10 y la capacidad de las muestras de suero para afectar a la hemólisis en eritrocitos de oveja se determinó como se describe en los Ejemplos 6 y 8.
Resultados
La concentración sérica en cada muestra y la capacidad correspondiente para afectar a la hemólisis en eritrocitos de oveja se describen en la Figura 16A y la Figura 16B, respectivamente. En 30 minutos, se alcanza una meseta con concentraciones séricas que varían entre 300 y 1000 nM, donde la hemólisis se bloquea casi por completo. En muestras de suero en los puntos de tiempo posteriores a las 7 h después de la administración, la hemólisis vuelve a producirse gradualmente. En el punto de tiempo final, tres días después de la dosificación, la hemólisis fue aproximadamente el 70% del control (Figura 16B). Estos datos demuestran claramente la absorción de Z06175a-GS-ABD094 en la circulación sistémica después de la administración intratraqueal y que la molécula inhibe funcionalmente la hemólisis.
Ejemplo 12: Estudios farmacocinéticos de la variante Z de unión a C5 en ojo de conejo después de la administración tópica e intravítrea
Materiales y métodos
Fase de vida en conejos: La farmacocinética de una variante Z (Z06175a, SEQ ID NO: 753 seguida de GS (Figura 4, construcción 1)) se estudió en ojo de conejo después de la administración intravítrea.
El estudio en fase de vida y la disección de ojos de animales dosificados (conejos pigmentados, 2 - 2,5 kg) se realizó en Iris Pharma, La Gaude, Francia (www.iris-pharma.com). Los animales se alojaron individualmente a 20 ± 2°C a al 55 ± 10% de humedad relativa con acceso a alimento y agua a voluntad.
Los animales se dividieron en tres grupos: 1) administración intravítrea (50 pl en cada ojo, n = 3, seis ojos en total) seguida de disección y toma de muestras de suero después de un día, 2) administración intravítrea (50 pl en cada ojo, n = 3) seguida de disección y toma de muestras de suero después de cuatro días y 3) animales no tratados (n = 5).
Se diseccionaron cuatro compartimentos oculares distintos (humor acuoso, vítreo, neuro-retina y RPE-coroides) y se congelaron inmediatamente a -80°C. La formulación del fármaco administrado (20,2 mg/ml en tampón fosfato 10 mM, NaCl 145 mM, pH 7,4) y el análisis del fármaco en diversos compartimentos oculares se realizaron de forma interna.
Análisis de la variante Z en los compartimentos oculares disecados: Los compartimentos oculares disecados se enviaron en hielo seco y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. Las muestras de retina y coroides se descongelaron en PBS 10 veces (volumen/peso) que contenía albúmina sérica humano al 1% en tubos Lysing Matrix D (MP Biomedical) que contenían perlas de cerámica y se agitaron a velocidad 4 durante 2 x 20 s en un

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido de unión a C5, que comprende un motivo de unión a C5, BM, motivo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de
i)
EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D,
en la que, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de H, Q, S, T y V;
X3 se selecciona de I, L, M y V;
X4 se selecciona de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X6 se selecciona de N y W;
X7 se selecciona de A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X11 se selecciona de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X16 se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de I, L y V;
X18 se selecciona de A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X21 se selecciona de I, L y V;
X25 se selecciona de D, E, G, H, N, S y T;
X26 se selecciona de K y S;
X28 se selecciona de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 86% de identidad con la secuencia definida en i), en la que el polipéptido se une a C5;
en la que dicho motivo de unión a C5 forma parte de un dominio del conjunto de proteínas de tres hélices, y en la que dicho polipéptido de unión a C5 muestra actividad de unión a C5 humano y a C5 de modelos animales, tales como ratón o rata.
2. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X3 se selecciona de I, L y V.
3. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que X6 es W.
4. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que X16 es T.
5. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que X26 es K.
6. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO:1-248; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:1-12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23-24, SEQ ID NO:26-28, SEQ ID NO:32-35, SEQ ID NO:38-39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56-57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:78-79, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:215 y la SEQ ID NO:243; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:1-12.
7. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
i)
K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
en la que
[BM] es un motivo de unión a C5 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6;
Xa se selecciona de A y S;
Xb se selecciona de N y E;
Xc se selecciona de A, S y C;
Xd se selecciona de A y S;
y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 79% de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente.
8. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO:249-496; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:249-260, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:271-272, SEQ ID NO:274-276, SEQ ID NO:280-283, SEQ ID NO:286-287, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:304-305, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:326-327, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:463 y la SEQ ID NO:491; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:249-260.
9. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO:497-757; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:497-508, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531, SEQ ID NO:534-535, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:552-553, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:602, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:615, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:637, SEQ ID NO:647, SEQ ID NO:657, SEQ ID NO:662, SEQ ID NO:683, SEQ ID NO:693, SEQ ID NO:699, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:711, SEQ ID NO:739 y la SEQ ID NO:746-757; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:497-508 y la SEQ ID NO:746-757; tal como de una cualquiera de la SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:746, SEQ ID NO:747 SEQ ID NO:748, SEQ ID NO:750 y la SEQ ID NO:753.
10. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido de unión a C5 se une a C5 de tal forma que el valor de KD de la interacción es a lo sumo 1 x 10-6 M, tal como, a lo sumo 1 x 10-7 M, tal como, a lo sumo 1 x 10-8 M, tal como, a lo sumo 1 x 10-9 M.
11. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además aminoácidos C terminales y/o N terminales que mejora la producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento o detección del polipéptido.
12. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además una fracción de extensión de la semivida que aumenta la semivida del polipéptido de unión a C5 in vivo, siendo dicha fracción de extensión de la semivida un dominio Fc de un anticuerpo.
13. Compuesto de unión a C5, que comprende al menos un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con cualquier reivindicación anterior; al menos un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica, y al menos un resto de unión para unir dicho al menos un dominio al extremo C o N de dicho al menos un polipéptido de unión a C5.
14. Compuesto de unión a C5 de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene una estructura seleccionada de
[CBP1]-[L1]-[ALBD\,
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2];
[ALBD]-[L1]-[CBP1],
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2];
[CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD]; y
[ALBD]-[L1]-[CAP1]-[L2]-[CBP2]
en la que, independientemente entre sí,
[CBP1] y [CBP2] son polipéptidos de unión a C5 que pueden ser iguales o diferentes;
[L1] y [L2] son restos de unión que pueden ser iguales o diferentes; y
[ALBD] es un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica.
15. Compuesto de unión a C5 de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el resto de unión se selecciona de G, GS; [G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n, en los que n es 0-7; [S2G]m; [S3G]m;[S4G]m; en los que m es 0 7, y VDGS.
16. Compuesto de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que dicho dominio de unión a albúmina es como se expone en la SEQ ID NO:759.
17. Compuesto de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en el que cada uno de dichos polipéptidos de unión a C5 se selecciona independientemente de un polipéptido como se define en la reivindicación 9.
18. Polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-17.
19. Combinación de un polipéptido de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o un compuesto de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-17 con un agente terapéutico.
20. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, compuesto de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-17 o combinación de acuerdo con la reivindicación 19 para su uso en terapia.
21. Polipéptido de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, compuesto de unión a C5 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, o combinación de acuerdo con la reivindicación 19 para el tratamiento de una afección relacionada con C5 seleccionada de enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; enfermedad infecciosa; enfermedad cardiovascular; trastornos neurodegenerativos; cáncer; lesión de injerto; heridas; enfermedad ocular; enfermedad renal; enfermedades pulmonares; enfermedades hematológicas; enfermedades alérgicas y enfermedades dermatológicas, tales como para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH).
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