ES2718550T3 - Análogos de urea con puente sustituidos como moduladores de sirtuinas - Google Patents

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Rebecca Casaubon
Brian H White
Robert B Perni
Karsten Koppetsch
Jeremy S Disch
Pui Yee Ng
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Description

DESCRIPCIÓN
Análogos de urea con puente sustituidos como moduladores de sirtuinas
Antecedentes de la invención
La familia de genes reguladores de la información silenciosa (SIR) representa un grupo muy conservado de genes presente en los genomas de organismos que van desde arqueobacterias a eucariotas. Las proteínas codificadas por SIR están implicadas en diversos procedimientos desde la regulación del silenciamiento de genes hasta la reparación del ADN. Un gen bien caracterizado en esta familia es SIR2 de S. cerevisiae, que está implicado en el silenciamiento de locus de HM que contienen información que especifica el tipo de levadura que corresponde, efectos de posición de telómeros y envejecimiento celular. La proteína Sir2 pertenece a una familia de histona desacetilasas. Las proteínas codificadas por miembros de la familia de genes SIR muestran una alta conservación de secuencia en un dominio central de 250 aminoácidos. El homólogo de Sir 2, CobB, en Salmonella typhimurium, funciona como una ADP-ribosil transferasa dependiente de NAD (dinucleótido de nicotinamida y adenina).
La proteína Sir2 es una desacetilasa de clase III que usa NAD como cosustrato. A diferencia de otras desacetilasas, muchas de las cuales están implicadas en el silenciamiento de genes, sir2 es insensible a los inhibidores de histona desacetilasa de clase I y II como la tricostatina A (TSA).
La desacetilación de la acetil-lisina por Sir2 está estrechamente acoplada con la hidrólisis del NAD, produciendo nicotinamida y un nuevo compuesto de acetil-ADP-ribosa. La actividad de la desacetilasa dependiente de NAD de Sir2 es esencial para sus funcionales, que pueden conectar su función biológica como el metabolismo celular en levaduras. Los homólogos de Sir2 en mamíferos tienen actividad de histona desacetilasa dependiente de NAD. Estudios bioquímicos han mostrado que Sir2 puede desacetilar fácilmente las colas amino terminales de las histonas H3 y H4, dando como resultado la formación de 2'/3'-O-acetil-ADP-ribosa (OAADPR) y nicotinamida. Cepas con copias adicionales de SIR2 presentan mayor silenciamiento de rADN y un periodo de vida 30% más larga. También se ha mostrado que copias adicionales del homólogo de SIR2 de C. elegans, sir-2.1, y el gen dSir2 de D. melanogaster prolongan el periodo de vida en estos organismos. Esto implica que la ruta reguladora dependiente de SIR-2 para el envejecimiento surge pronto en la evolución y se ha conservado bien. Hoy en día, se cree que los genes de Sir2 han evolucionado para potenciar la salud del organismo y la resistencia al estrés para aumentar su posibilidad de supervivencia frente a la adversidad.
En seres humanos, hay siete genes similares a Sir2 (SIRT1-SIRT7) que comparten el dominio catalítico conservado de Sir2. SIRT1 es una proteína nuclear con el mayor grado de similitud de secuencia con Sir2. SIRT1 regula múltiples dianas celulares por desacetilación, que incluyen el supresor tumoral p53, el factor de señalización celular NF-kB, y el factor de transcripción FOXO.
SIRT3 es un homólogo de SIRT1 que está conservado en procariotas y eucariotas. La proteína de SIRT3 se dirige a las crestas mitocondriales por un dominio único situado en el extremo N. SIRT3 tiene actividad de proteína desacetilasa dependiente de NAD+ y es expresada de forma ubicua, en particular en tejidos metabólicamente activos. Tras la transferencia a la mitocondria, se cree que SIRT3 es escindida es una forma activa más pequeña por una proteasa procesadora de matriz mitocondrial (MPP).
Se sabe desde hace más de 70 años que la restricción calórica mejora la salud y aumenta la esperanza de vida de mamíferos. El periodo de vida de metazoarios, también es prolongada por intervenciones que se parecen a la restricción calórica, tal como la glucosa baja. El descubrimiento de que tanto levaduras como moscas que carecen del gen SIR2 no viven más tiempo cuando se someten a restricción calórica, proporciona pruebas de que los genes SIR2 median los efectos de salud beneficiosos de una dieta de restricción calórica. Además, las mutaciones que reducen la actividad de la ruta (PKA) dependiente de cAMP (3',5'-monofosfato de adenosina) sensible a la glucosa en levadura prolongan el periodo de vida en células de tipo natural pero no en cepas mutantes de sir2, demostrando que es probable que SIR2 sea un componente clave corriente abajo de la ruta de restricción calórica.
Además del potencial terapéutico, serían útiles estudios estructurales y biofísicos de la actividad de SIRT1 y activación por moléculas pequeñas moduladores de sirtuina, para comprender mejor el mecanismo de acción de la activación de sirtuinas y ayudar en el desarrollo de ensayos que identifiquen nuevos moduladores de sirtuina.
Resumen
Se proporcionan en la presente memoria nuevos compuestos moduladores de sirtuinas.
En un aspecto, la invención proporciona compuestos moduladores de sirtuinas de fórmulas estructurales (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb) y (IV) como se describen en detalle más adelante.
En otro aspecto la descripción proporciona métodos para usar compuestos moduladores de sirtuinas, o composiciones que comprenden compuestos moduladores de sirtuinas. Se describen en la presente memoria, compuestos moduladores de sirtuinas que aumentan el nivel y/o la actividad de una proteína sirtuina que se pueden usar para una variedad de aplicaciones terapéuticas que incluyen, por ejemplo, aumentar el periodo de vida de una célula y tratar y/o prevenir una amplia variedad de enfermedades y trastornos que incluyen, por ejemplo, enfermedades o trastornos relacionados con el envejecimiento o el estrés, diabetes, obesidad, enfermedades neurodegenerativas, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía asociada con un suceso isquémico, enfermedades y/o trastornos oculares, enfermedad cardiovascular, trastornos de coagulación de la sangre, inflamación y/o sofoco, etc. Los compuestos moduladores de sirtuinas que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto, que se beneficiaría de una mayor actividad mitocondrial, para potenciar el rendimiento muscular, para aumentar los niveles de ATP musculares, o para tratar o prevenir el daño del tejido muscular asociado con hipoxia o isquemia. Se describen en la presente memoria compuestos moduladores de sirtuinas que disminuye el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para una variedad de aplicaciones terapéuticas que incluyen, por ejemplo, aumentar la sensibilidad celular al estrés, aumentar la apoptosis, tratar el cáncer, estimulación del apatito, y/o estimulación del aumento de peso, etc. Como se describe más adelante con más detalle, los métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto modulador de sirtuinas
Se describe además que los compuestos moduladores de sirtuinas de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros compuestos, que incluyen otros compuestos moduladores de sirtuinas, u otros agentes terapéuticos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el espectro de RMN 1H del compuesto 1.
La figura 2 muestra el espectro de RMN 13C y RMN APT del compuesto 1.
La figura 3 representa (A) HDX-MS de SIRT1 de longitud completa, (B) Caracterización enzimática del efecto de CBS en la actividad de SIRT1, (C) Gráfica de ejes de la activación por STAC de mini-hSIRTI(AN) frente a minihSIRTI, (D) Gráfica de ejes de la activación por STAC de mini-hSIRTI(ACBS) frente a mini-hSIRT1 y (E) Gráfica de ejes de la activación por STAC de mini-hSIRTl(E230K) frente a mini-hSIRT1.
La figura 4 muestra estructuras químicas de activadores de SIRT1 sintéticos (1, 4-9), inhibidor (2) y sonda de ensayo de polarización fluorescente (3).
La figura 5 representa la cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) de mini-hSIRT1 en ausencia o presencia de STAC.
La figura 6 representa el perfil de HDX-MS de SIRT1cc tras la unión al péptido CBS, (B) Comparación estructural del complejo Mini-hSIRT1/1 y ySIR2, (C) Comparación estructural del SBD N-terminal del complejo de Mini-hSIRT1/1, complejo Mini-hSIRT1/1/2 y complejo cuaternario Mini-hSIRT1/1/Ac-p53-7mer/CarbaNAD.
La figura 7 representa las curvas de dosis de activación-respuesta que comparan la SIRT1 de tipo natural y (A) I223A o (B) E230K usando el ensayo OAcADPr con el sustrato Ac-p53 (W5).
La figura 8 representa la comparación de la activación de hSIRT1 de longitud completa de tipo natural frente a mutante.
La figura 9 representa (A) Interfase de interacción de Mini-hSIRT1/Ac-p53. (B) Interfase de interacción de MinihSIRT1/carbaNAD. (C) Interfase de interacción de Mini-hSIRT1/2.
La figura 10 representa (A) Unión de la sonda FP 3 a SIRT1. (B) Competición de 4 frente al complejo SIRT1/3. La figura 11 representa la unión de STAC deteriorada por I223R hSIRT1 de longitud completa.
La figura 12 representa la gráfica de ejes de la activación por STAC de mini-hSIRT1 (R446A) frente a mini-hSIRT1.
Descripción detallada
1. Definiciones
Como se usan en la presente memoria, los siguientes términos y frases tendrán los significados expuestos más adelante. Salvo que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica.
El término “agente” como se usa en la presente memoria indica un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica (tal como un ácido nucleico, un anticuerpo, una proteína o parte de la misma, p. ej., un péptido) o un extracto hecho de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos animales (en particular de mamífero).
El término “biodisponible” cuando se refiere a un compuesto, se aceptado en la técnica y se refiere a una forma de un compuesto que permite que todo o una parte de la cantidad del compuesto administrado sea absorbido por, incorporado en, o fisiológicamente disponible de otra forma, para un sujeto o paciente al que se administra.
“Parte biológicamente activa de una sirtuina” se refiere a una parte de una proteína sirtuina que tiene una actividad biológica, tal como la capacidad de desacetilar (“catalíticamente activo”). Las partes catalíticamente activas de una sirtuina pueden comprender el dominio nuclear de sirtuinas. Las partes catalíticamente activas de SIRT1 que tienen n° de acceso en GenBank NP_036370 que abarcan el dominio de unión de NAD+ y el dominio de unión del sustrato, por ejemplo, pueden incluir, sin limitación, los aminoácidos 240-664 o 240-505 del n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por el polinucleótido de n° de acceso en GenBank NM_012238. Por lo tanto, esta región se denomina a veces el dominio nuclear. Otras partes catalíticamente activas de SIRT1, también denominadas a veces dominios nucleares, incluyen aproximadamente los aminoácidos 261 a 447 de n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 834 a 1394 de n° de acceso en GenBank NM_012238; aproximadamente los aminoácidos 242 a 493 de n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 777 a 1532 de n° de acceso en GenBank NM_012238; o aproximadamente los aminoácidos 254 a 495 de n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 813 a 1538 de n° de acceso en GenBank NM_012238. Otra parte “biológicamente activa” de SIRT1 son los aminoácidos 62-293 o 183-225 de n° de acceso en GenBank NP_036370, que comprenden un dominio N-terminal del dominio nuclear que es importante para el sitio de unión del compuesto.
La expresión “animales de compañía” se refiere a gatos y perros. Como se usa en la presente memoria, el término “perro(s)” indica cualquier miembro de la especie Canis familiaris, de los cuales hay un gran número de razas diferentes. El término “gato(s)” se refiere a un animal felino que incluye gatos domésticos y otros miembros de la familia Felidae, género Felis.
“Diabetes” se refiere a azúcar en sangre elevada o cetoacidosis, así como anomalías metabólicas generales, crónicas, que surgen de un estado prolongado de azúcar en sangre elevado o una disminución de la tolerancia a la glucosa. “Diabetes” abarca las formas de la enfermedad tanto de tipo I como de tipo II (Diabetes mellitus no dependiente de insulina o DMNDI). Los factores de riesgo para la diabetes incluyen los siguientes factores: cintura de más de 101 cm (40 pulgadas) para hombres o de 89 cm (35 pulgadas) para mujeres, presión sanguínea de 130/85 mm de Hg o superior, triglicéridos superiores a 150 mg/dl, glucosa en sangre en ayunas mayor que 100 mg/dl o lipoproteínas de alta densidad menores de 40 mg/dl en hombres o 50 mg/dl en mujeres.
El término “ED50” se refiere a la medición aceptada en la materia de la dosis eficaz. En algunas realizaciones, ED50 significa la dosis de un fármaco que produce 50% de su respuesta o efecto máximo, o alternativamente, la dosis que produce una respuesta predeterminada en 50% de los sujetos de ensayo o preparaciones, tales como tejido o células aisladas. El término “LD50” se refiere a la media aceptada en la materia de dosis letal. En algunas realizaciones, LD50 significa la dosis de un fármaco que es letal en 50% de los sujetos de ensayo. La expresión “índice terapéutico” es una expresión aceptada en la materia que se refiere al índice terapéutico de un fármaco, definido como LD50/ED50.
El término “hiperinsulinemia” se refiere a un estado en un individuo en el que el nivel de insulina en la sangre es mayor que el normal.
La expresión “resistencia a la insulina” se refiere a un estado en el que una cantidad normal de insulina produce una respuesta biológica por debajo de la normal con respecto a la respuesta biológica en un sujeto que no tiene resistencia a la insulina,
Un “trastorno de resistencia a la insulina”, como se describe en la presente memoria, se refiere a cualquier enfermedad o afección que es causada por o a la que contribuye la resistencia a la insulina. Los ejemplos incluyen: diabetes, obesidad, síndrome metabólico, síndromes de resistencia a la insulina, síndrome X, resistencia a la insulina, hipertensión arterial, hipertensión, colesterol en sangre alto, dislipidemia, hiperlipidemia, enfermedad aterosclerótica incluyendo accidente cerebrovascular, cardiopatía coronaria o infarto de miocardio, hiperglucemia, hiperinsulinemia y/o hiperproinsulinemia, tolerancia a la glucosa alterada, liberación de insulina retrasada, complicaciones diabéticas, incluyendo cardiopatía coronaria, angina de pecho, insuficiencia cardíaca congestiva, accidente cerebrovascular, funciones cognitivas en la demencia, retinopatía, neuropatía periférica, nefropatía, glomerulonefritis, glomeruloesclerosis, síndrome nefrótico, nefroesclerosis hipertensiva, algunos tipos de cáncer (tales como endometrial, mama, próstata y colon), complicaciones del embarazo, salud reproductora en mujeres pobres (tales como irregularidades menstruales, infertilidad, ovulación irregular, síndrome del ovario poliquístico (PCOS)), lipodistrofia, trastornos asociados con el colesterol, tales como cálculos biliares, colecistitis y colelitiasis, gota, apnea del sueño obstructiva, osteoartritis y pérdida ósea, p. ej., osteoporosis en particular.
La expresión “animales de ganadería” se refiere a cuadrúpedos domesticados, que incluyen los criados para carne y diferentes subproductos, p. ej., un animal bovino que incluye vacas y otros miembros del género Bos, un animal porcino que incluye cerdo doméstico y otros miembros del género Sus, un animal ovino que incluye ovejas y otros miembros de la familia Ovis, cabras domésticas y otros miembros del género Capra; cuadrúpedos domesticados que se crían para tareas especializadas tales como usados como bestias de carga, p. ej., un animal equino que incluye caballos domésticos y otros miembros de la familia Equidae, género Equus.
El término “mamífero” se conoce en la materia, y los mamíferos de ejemplo incluyen seres humanos, primates, animales de ganadería (que incluyen animales bovinos, porcinos, etc.), animales de compañía (p. ej., caninos, felinos, etc.) y roedores (p. ej., ratones y ratas).
Individuos “obesos” o individuos que padecen obesidad en general son individuos que tienen un índice de masa corporal (IMC) de al menos 25 o mayor. La obesidad puede o no estar asociada con la resistencia a la insulina. Las expresiones “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” son aceptadas en la materia y se refieren a modo de administración distintos de la administración enteral o tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e intraesternal.
Un “paciente”, “sujeto”, “individuo” u “hospedante” se refiere a animal humano o no humano.
La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” es aceptada en la materia y se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en llevar o transportar cualquier composición objeto o componente de la misma. Cada vehículo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con la composición objeto y sus componentes y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua exenta de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringe; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas usadas en formulaciones farmacéuticas.
El término “prevenir” es aceptado en la materia, y cuando se usa en relación con una afección, tal como una recaída local (p. ej., dolor), una enfermedad como el cáncer, un síndrome complejo como la insuficiencia cardiaca y cualquier otra afección médica, se entiende bien en la materia, e incluye la administración de una composición que reduce la frecuencia de, o retrasa el inicio de, síntomas de una afección médica en un sujeto con respecto a un sujeto que no recibe la composición. Por lo tanto, la prevención del cáncer incluye, por ejemplo, reducir el número de crecimientos cancerosos detectables en una población de pacientes que recibe un tratamiento profiláctico con respecto a una población de control no tratada, y/o retrasar la aparición de crecimientos cancerosos detectables en una población tratada frente a una población de control no tratada, p. ej., por una cantidad estadística y/o clínicamente significativa. La prevención de una infección incluye, por ejemplo, reducir el número de diagnósticos de la infección en una población tratada frente a una población de control no tratada, y/o retrasar el inicio de síntomas de la invención en una población tratada frente a una población de control no tratada. La prevención del dolor incluye, por ejemplo, reducir la magnitud de, alternativamente retrasar, sensaciones de dolor experimentadas por sujetos en una población tratada frente a una población de control.
El término tratamiento “profiláctico” o “terapéutico” es aceptado en la materia y se refiere a la administración de un fármaco a un hospedante. Si se administra antes de la manifestación clínica de la afección indeseada (p. ej., enfermedad o estado indeseado del animal hospedante), entonces el tratamiento es profiláctico, es decir, protege al hospedante frente al desarrollo de la afección indeseada, mientras que si se administra después de la manifestación de la afección indeseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, se pretende disminuir, mejorar o mantener la afección existente indeseada o los efectos secundarios de la misma).
La expresión “exento de pirógenos”, en referencia a una composición, se refiere a una composición que no contiene un pirógeno en una cantidad que conduciría a un efecto adverso (p. ej., irritación, fiebre, inflamación, diarrea, dificultad respiratoria, choque endotóxico, etc.) en un sujeto al que se ha administrado la composición. Por ejemplo, se entiende que el término abarca composiciones que están exentas de, o sustancialmente exentas de una endotoxina tal como, por ejemplo, un lipopolisacárido (LPS).
La “vida útil de replicación” de una célula se refiere al número de células hija producidas por una “célula madre” individual. El “envejecimiento cronológico” y la “vida útil cronológica”, por otra parte, se refieren a la duración de tiempo que una población de células que no se dividen permanece viable cuando se priva de nutrientes. El “aumento de la vida útil de una célula” o “prolongación de la vida útil de una célula”, cuando se aplica a células u organismos, se refieren a aumentar el número de células hijas producidas por una célula; aumentar la capacidad de las células u organismos a aguatar el estrés y combatir el daño, p. ej., al ADN, proteínas; y/o aumentar la capacidad de las células u organismos a sobrevivir y existir en un estado vivo durante más tiempo en un estado particular, p. ej., estrés (por ejemplo, choque térmico, estrés osmótico, radiación de energía alta, estrés químicamente inducido, daño al ADN, nivel de sal inadecuado, nivel de nitrógeno inadecuado o nivel de nutrientes inadecuado). La vida útil se puede aumentar en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o entre 20% y 70%, 30% y 60%, 40% y 60% o más, usando los métodos descritos en la presente memoria.
El “compuesto modulador de sirtuinas” se refiere a un compuesto que aumenta el nivel de una proteína sirtuina y/o aumenta al menos una actividad de una proteína sirtuina. En una realización de ejemplo, un compuesto modulador de sirtuinas puede aumentar al menos una actividad biológica de una proteína sirtuina en al menos aproximadamente 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, o más. Las actividades biológicas de ejemplo de proteínas sirtuinas incluyen la desacetilación, p. ej., de histonas y p53; extensión de la vida útil; aumento de la estabilidad genómica; transcripción de silenciamiento; y control de la segregación de proteínas oxidadas entre células madre e hija.
las proteínas incluyen desacetilación, p. ej., un sustrato peptídico acetilado.
“Proteína sirtuina” se refiere a un miembro de la familia de proteínas desacetilasa de sirtuina, o preferiblemente a la familia proteínas Sir2 de levadura (n° de acceso en GenBank P53685), C. elegans Sir-2.1 (n° de acceso en GenBank NP_501912), y SIRT1 humana (n° de acceso en GenBank NM_012238 y NP_036370 (o AF083106)) y SIRT2 (n° de acceso en GenBank NM_012237, NM_030593, NP_036369, NP_085096, y AF083107). Otros miembros de la familia incluyen los cuatro genes similares a Sir2 de levadura adicionales denominados "genes HST' (homólogos de Sir dos) HST1, HST2, HST3 y HST4, y los otros cinco homólogos humanos hSIRT3, hSIRT4, hSlRT5, hSIRT6 y hSIRT7 (Brachmann et al. (1995) Genes Dev. 9:2888 y Frye et al. (1999) BBRC 260:273).
“Proteína SIRT1” se refiere a un miembro de la familia sir2 de sirtuina desacetilasas. En algunas realizaciones, una proteína SIRT1 incluye Sir2 de levadura (n° de acceso en GenBank P53685), Sir-2.1 de C. elegans (n° de acceso en GenBank NP_501912), SIRT1 humana (n° de acceso en GenBank NM_012238 o NP_036370 (o AF083106)), y SIRT1 de ratón (n° de acceso en GenBank NM_019812 o NP_062786), y equivalentes y fragmentos de los mismos. En otra realización, una proteína SIRT1 incluye un polipéptido que comprende una secuencia que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos expuesta en los n° de acceso en GenBank NP_036370, NP_501912, NP_085096, NP_036369 o P53685. La proteína SIRT1 incluye polipéptidos que comprenden toda o una parte de la secuencia de aminoácidos como se exponen en los n° de acceso en GenBank NP_036370, NP_501912, NP_085096, NP_036369 o P53685; la secuencia de aminoácidos expuesta en los n° de acceso en GenBank NP_036370, NP_501912, NP_085096, NP_036369 o P53685 con de 1 a aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o más sustituciones de aminoácidos conservadoras; una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a los n° de acceso en GenBank NP_036370, NP_501912, NP_085096, NP_036369 o P53685, y fragmentos funcionales de los mismos. Los polipéptidos de la invención también incluyen homólogos (p. ej., ortólogos y parálogos), variantes o fragmentos, de n° de acceso en GenBank NP_036370, NP_501912, NP_085096, NP_036369 o P53685.
Como se usa en la presente memoria, “proteína SIRT2", “proteína SIRT3", “proteína SIRT4", “proteína SIRT5", “proteína SIRT6", y “proteína SIRT7" se refieren a proteínas sirtuina desacetilasas de otro mamífero, p. ej., ser humano, que son homólogas a la proteína SIRT1, en particular en el dominio catalítico conservado de aproximadamente 275 aminoácidos. Por ejemplo, la “proteína SIRT3” se refiere a un miembro de la familia de proteínas sirtuina desacetilasas que es homólogo a la proteína SIRT1. En algunas realizaciones, una proteína SIRT3 incluye proteínas SIRT3 humanas (n° de acceso en GenBank AAH01042, NP_036371 o NP_001017524) y SIRT3 de ratón (n° de acceso en GenBank NP_071878), y equivalentes y fragmentos de las mismas. En ciertas realizaciones, una proteína SIRT4 incluye la SIRT4 humana (n° de acceso en GenBank NM_012240 o NP_036372). En ciertas realizaciones, una proteína SIRT5 incluye la SIRT5 humana (n° de acceso en GenBank NM_012241 o Np_036373). En ciertas realizaciones, una proteína SIRT6 incluye la SIRT6 humana (n° de acceso en GenBank NM_016539 o NP_057623). En otra realización, una proteína SIRT3 incluye un polipéptido que comprende una secuencia que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos expuesta en los n° de acceso en GenBank AAH01042, NP_036371, NP_001017524, o NP_071878. Las proteínas SIrT3 incluyen polipéptidos que comprenden todas o una parte de la secuencia de aminoácidos expuesta en los n° de acceso en GenBank AAH01042, NP_036371, Np_001017524, o NP_071878; la secuencia de aminoácidos expuesta en los n° de acceso en GenBank AAH01042, NP_036371, NP_001017524, o NP_071878 con de 1 a aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o más sustituciones de aminoácidos conservadoras; una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a los n° de acceso en GenBank AAH01042, NP_036371, NP_001017524, o NP_071878, y fragmentos funcionales de las mismas. Los polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen también homólogos (p. ej., ortólogos y parálogos), variantes o fragmentos, con los n° de acceso en GenBank AAH01042, NP_036371, NP_001017524 o NP _071878. En algunas realizaciones, una proteína SIRT3 incluye un fragmento de proteína SIRT3 que es producida por escisión con una peptidasa procesadora de matriz mitocondrial (MPP) y/o una peptidasa intermedia mitocondrial (MIP).
El término “estereoisómero” como se usa en la presente memoria está aceptado en la materia y se refiere a cualquiera de dos o más isómeros que tienen la misma constitución molecular y difieren solo en la disposición tridimensional de sus grupos atómicos en el espacio. Cuando se usa en la presente memoria para describir un compuesto o género de compuestos, estereoisómero incluye cualquier parte del compuesto o el compuesto en su totalidad. Por ejemplo, los diastereoisómeros y enantiómeros son estereoisómeros.
Las expresiones “administración sistémica” y “administrado por vía sistémica”, están aceptadas en la materia y se refiere a la administración de una composición objeto, material terapéutico u otro, por vía enteral o parenteral.
El término “tautómero” como se usa en la presente memoria está aceptado en la materia y se refiere a una cualquiera de las estructuras posibles alternativas que pueden existir como resultado de tautomería, que se refiere a una forma de isomería constitucional en la que una estructura puede existir en dos o más disposiciones constitucionales, en particular con respecto a la posición de los hidrógenos unidos al oxígeno. Cuando se usa en la presente memoria para describir un compuesto o género de compuestos, se entiende además que un “tautómero” se puede interconvertir fácilmente y existe en equilibrio. Por ejemplo, los tautómeros ceto y enol existen en proporciones determinadas por la posición de equilibrio para cualesquiera condiciones dadas, o conjunto de condiciones:
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La expresión “agente terapéutico” está aceptada en la materia y se refiere a cualquier sustancia biológica, fisiológica o farmacológicamente activa que actúa local o sistémicamente en un sujeto. La expresión también significa cualquier sustancia dirigida al uso en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedad o en la mejora de desarrollo y/o condiciones físicas o mentales deseables en un animal o ser humano.
La expresión “efecto terapéutico” está aceptada en la materia y se refiere a un efecto local o sistémico beneficioso, en particular en mamíferos, y más en particular en seres humanos, causado por una sustancia farmacológicamente activa. La frase “cantidad terapéuticamente eficaz” significa la cantidad de dicha sustancia que produce alguno efecto local o sistémico deseado con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz de dicha sustancia variará dependiendo del sujeto y la enfermedad que se va a tratar, el peso y edad del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la manera de administración y similares, que puede determinar fácilmente un experto en la técnica. Por ejemplo, algunas composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar en una cantidad suficiente para producir un efecto deseado con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a dicho tratamiento.
“Tratar” una afección o enfermedad se refiere a curar, así como a mejorar al menos un síntoma de la afección o enfermedad.
La expresión “deterioro de la visión” se refiere a visión disminuida, que a menudo es solo parcialmente reversible o irreversible tras el tratamiento (p. ej., cirugía). El deterioro particularmente importante de la visión se denomina “ceguera” o “pérdida de visión”, que se refiere a la pérdida completa de visión, visión peor que 20/200 que no se puede mejorar con lentes correctivas, o un campo visual menor de 20 grados de diámetro (radio de 10 grados). 2. Compuestos
Se describen en la presente memoria nuevos compuestos para tratar y/o prevenir una amplia variedad de enfermedades y trastornos que incluyen, por ejemplo, enfermedades o trastornos relacionados con el envejecimiento o estrés, diabetes, obesidad, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades y trastornos oculares, enfermedad cardiovascular, trastornos de coagulación de la sangre, inflamación, cáncer y/o rubefacción, etc. Los presentes compuestos, tales como compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina, también se pueden usar para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto que se beneficiaría de la mayor actividad mitocondrial, para potenciar el rendimiento muscular, para aumentar los niveles de ATP musculares, o para tratar o prevenir el daño del tejido muscular asociado con hipoxia o isquemia. Los compuestos descritos en la presente memoria pueden ser adecuados para usar en composiciones farmacéuticas y/o uno o más métodos descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, los compuestos de la invención se representan por la fórmula estructural (I):
La invención incluye composiciones farmacéuticas de cualquiera de los compuestos de fórmulas estructurales (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb) y (IV) o como se ha expuesto de otra forma antes. La composición farmacéutica del compuesto de fórmulas estructurales I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb) y (IV) puede comprender uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
En una realización, los compuestos moduladores de sirtuina de la invención se representan por la fórmula estructural (I):
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o una de sus sales, en donde:
m es 1 o 2;
n es 2 o 3;
p es de 0 a 4;
R1 se selecciona de un carbociclo y heterociclo, en donde R1 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, alquilo C1-C4, alquilo C1-C4 fluoro-sustituido, -C=N, -Y, -X-C(=O)-Y, -X-O-Y, -X-OR4, -X-C(=O)-NR3R3, -X-NH-C(=O)-Y-NR3R3, -X-NH-C(=O)-O-Y, -X-NR3R3, =O, -NH-S(=O)2-Rs, - S(=O)2-R3, -S-R3, cicloalquilo (C3-C7), -C(=N)-NR3R3, -C(=N)-NH-X -NR3R3, -X-NH-C(=O)-Y, -C(=O)-NH-X, -NH-X, fenilo, -O-fenilo, heterociclo saturado o insaturado de 3 a 6 miembros y -O-(heterociclo saturado de 5 a 6 miembros), en donde cualquier fenilo, heterociclo saturado o insaturado de 3 a 6 miembros y -O-(heterociclo saturado de 5 a 6 miembros) sustituyente de R1 está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de carbono sustituible con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -OR4, -X-O-Y, -CF3, -Y, -X-R3R3, -X-NH-C(=O)-Y-NR3R3, -X-NH-C(=O)-O-Y-(heterociclo o carbociclo saturado de 5 a 6 miembros), -X-C(=N)-NR3R3 y -S-Y y opcionalmente sustituido en cualquier átomo de nitrógeno sustituible con -Y, -C(=O)-Y, -C(=O)-O-Y, -C(=O)-OR4, -Y-C(=O)-Y-NR3R3, -Y-NH-C(=O)-O-Y, -Y-NH-C(=O)-OR4, -Y-NH2, -C(=O)-NH-Y o -C(=O)-carbociclo saturado de 3 a 5 miembros;
R2 se selecciona de un carbociclo y un heterociclo, en donde R2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, alquilo C1-C4, alquilo C1-C4 fluoro-sustituido, _C=N, -Y, -X-OR4, -X-O-Y, -SO2-R3, -X-NR3R3, -NH-S(=O)2R3, -C(=O)-NR3R3, -C(=O)-Y, -C(=O)-O-Y, -SO2-Ry, -SO2-NH-Ry, -SO2-NR3R3, carbociclo o heterociclo saturado de 3 a 6 miembros y fenilo, en donde cualquier heterociclo saturado de 3 a 6 miembros sustituyente de R2 está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de carbono con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF3, _Y, -X-O-Y, -NH-Y y -N(Y)2, y está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de nitrógeno con uno o más sustituyentes seleccionados de -C(=O)-O-Y, -Y y -C(=O)-Y, y cuando R2 es un heterociclo saturado o insaturado de 5 a 7 miembros unido por N está sustituido además en cualquier átomo de nitrógeno con uno o más sustituyentes seleccionados de -C(=O)-O-Y, -Y y -C(=O)-Y;
cada R3 se selecciona independientemente de hidrógeno, -C(=N)-NH2, -C(=O)-Y, -Y, -Y-NH-C(=O)-O-Y, -Y-NH-C(=O)-OH, -Y-NH-C(=O)-CF3, -C(=O)-Y-heterociclo saturado de 3 a 5 miembros, -C(=O)-O-Y-(heterociclo saturado de 3 a 5 miembros), -C(=O)-CF3, -C(=O)-O-Y, -C(=O)-OH, -C(=O)-O-CF3, -S(=O)2-Y, -S(=O)2-OH;
dos R3 se consideran junto con el átomo de nitrógeno o carbono al que están unidos para formar un heterociclo saturado de 4 a 8 miembros que comprende opcionalmente un heteroátomo adicional independientemente seleccionado de N, S, S(=O), S(=O)2 y O, en donde el heterociclo formado por dos R3 está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de carbono con uno o más de OH, halógeno, Y, NH2, NH-Y, N(Y)2, O-Y, y opcionalmente sustituido en cualquier átomo de nitrógeno sustituible con C(=O)-O-Y, Y o C(=O)-Y;
cada R4 se selecciona independientemente de hidrógeno, Y, -CF3, -C(=O)-Y, -C(=O)-O-Y, -Y-C(=O)-Y o -Y-C(=O)-O-Y;
R5 y R6 se seleccionan independientemente de hidrógeno, -OH, -OCF3, -O-Y, -O-C(=O)-Y, -O-C(=O)-O-Y, -O-C(=O)-NH-Y, -O-C(=O)-N(Y)2 , -O-C(=O)-heterociclo o carbociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros, en donde solo uno de R5 y R6 es O-C(=O)-heterociclo o carbociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros, y cuando R5 o R6 es O-C(=O)-heterociclo o carbociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros está sustituido además con halógeno, -OH, Y, -O-Y, -OCF3 o -O-C(=O)-Y; o
R5 y R6 se pueden considerar junto con el átomo de carbono al que están unidos para formar =O;
R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, -OH, -O-Y e Y;
R9 se selecciona de hidrógeno, halógeno, -OH, -OCF3, -O-Y, Y, -O-C(=O)-Y, -NH-Y y -N(Y)2;
cada X es alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal o ramificada C0-C5; y
cada Y es alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal o ramificada C1-C5;
en donde cualquiera de Y o X está opcionalmente sustituido con uno o más de -OH, -alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada, -alqueno C1-C4, -alquino C1-C4, -O-(alquilo C1-C4), -O-(alqueno C1-C4), -O-(alquino C1-C4), -C(=O)-alquilo-C1-C4 de cadena lineal o ramificada, -C(=O)-alqueno-C1-C4, -C(=O)-alquino-C1-C4, -C(=O)-O-alquilo-C1-C4 de cadena lineal o ramificada, -C(=O)-O-alqueno-C1-C4, -C(=O)-O-alquino-C1-C4, halógeno, -NH2, -NH(alquilo C1-C4), -N(alquilo CrC4)2, -(alquilo C1-C3 de cadena lineal o ramificada)-NH-(=NH)-NH2, -NH(alquilo C1-C4 sustituido con alcoxi), -NH(alquilo C1-C4 sustituido con hidroxi), -N(alquilo C1-C4 sustituido con alcoxi)(alquilo C1-C4 sustituido con hidroxi), -N(alquilo C1-C4 sustituido con hidroxi)2 o - N(alquilo C1-C4 sustituido con alcoxi)2.
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por la estructura representada por la fórmula estructural (IIa):
Figure imgf000009_0001
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por la estructura representada por la fórmula estructural (IIIa):
Figure imgf000009_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por la estructura representada por las fórmulas estructurales (IIb) o (IIIb):
Figure imgf000009_0003
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por la estructura representada por la fórmula estructural (IV):
Figure imgf000010_0001
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por tener un p = 0 (es decir, no hay metileno entre el C(O)-NH y R1).
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por tener un p = 1-4 (es decir, de 1 a 4 metilenos entre el C(O)-NH y R1).
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por tener un grupo -(CH2)p-R1 seleccionado de:
Figure imgf000010_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R1 que es fenilo, un heterociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros, o un carbociclo o heterociclo saturado o insaturado, de 8 a 11 miembros, bicíclico condensado.
En realizaciones particulares, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un R1 que es un heterociclo saturado o insaturado de 8 a 11 miembros, bicíclico condensado.
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R1 que se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
En realizaciones particulares, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R1 que se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000016_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R2 que se selecciona de un carbociclo o heterociclo saturado de 5 a 7 miembros, un heterociclo unido por N, y un heterociclo saturado o insaturado de 8 a 11 miembros.
En realizaciones particulares, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R2 que es un heterociclo saturado o insaturado de 5 a 7 miembros unido por N.
En ciertas realizaciones de lo anterior, el compuesto se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000017_0001
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R2 que es un heterociclo saturado o insaturado de 8 a 11 miembros bicíclico condensado.
En ciertas realizaciones de lo anterior, el compuesto se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000017_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R2 que se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000019_0001
En realizaciones particulares, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se caracterizan por un grupo R2 que se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000019_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (I) se seleccionan de uno cualquiera de:
Figure imgf000020_0001
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (IIa) se seleccionan de uno cualquiera de:
Figure imgf000020_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (Illa) se seleccionan de uno cualquiera de:
Figure imgf000021_0001
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (IIb) se seleccionan de:
Figure imgf000021_0002
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (IIIb) se seleccionan de:
Figure imgf000021_0003
En ciertas realizaciones, los compuestos o sales de fórmula estructural (IV) se seleccionan de uno cualquiera de:
Figure imgf000021_0004
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Los compuestosde la invención, incluyendo nuevos compuestos de la invención, también se pueden usar en las composiciones farmacéuticas y métodos descritos en la presente memoria.
En cualquiera de las fórmulas precedentes, un grupo sustituido con alcoxi C1-C4 puede incluir uno o más sustituyentes alcoxi, tal como dos o tres grupos metoxi o un grupo metoxi y un grupo etoxi, por ejemplo. Los sustituyentes alcoxi C1-C4 de ejemplo incluyen metoxi, etoxi, isopropoxi y terc-butoxi.
En cualquiera de las fórmulas precedentes, un grupo sustituido con hidroxi puede incluir uno o más sustituyentes hidroxi, tal como dos o tres grupos hidroxi.
En cualquiera de las realizaciones precedentes, un grupo “sustituido con halógeno” incluye desde un sustituyente halógeno hasta sustitución perhalógeno. Los alquilo C1-C4 sustituido con halógeno de ejemplo incluyen CFH2, CClH1, CBrH2, CF2H, CChH, CBr2H, CF3, CCls, CBrs, CH2CH2F, CH2CH2C CH2CH2Br, CH2CHF2, CHFCH3, CHClCH3, CHBrCH3, CF2CHF2, CF2CHCl2, CF2CHBr2, CH(CF3)2, y C(CF3)3. Alquilo C1-C4 perhalógeno-sustituido, por ejemplo, incluye CF3, CCl3, CBr3, CF2CF3, CCl2CF3 y CBr2CF3.
En cualquiera de las realizaciones precedentes, un grupo “carbociclo” se puede referir a una realización de carbociclo monocíclico y/o una realización de carbociclo policíclico, tal como una realización de carbociclo condensado, puente o bicíclico. Los grupos “carbociclo” como se usa en la presente memoria se pueden referir además a una realización de carbociclo aromático y/o una realización de carbociclo no aromático, o en el caso de realizaciones policíclicas, un carbociclo que tiene tanto uno o más anillos aromáticos como/o uno o más anillos no aromáticos. Los grupos carbociclo policíclicos pueden ser un anillo bicíclico, un anillo condensado o un biciclo con puente. Los ejemplos no limitantes de carbociclos incluyen fenilo, ciclohexano, ciclopentano o ciclohexeno, amantadina, ciclopentano, ciclohexano, biciclo[2.2.1]heptano, 1,5-ciclooctadieno, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, biciclo[4.2.0]oct-3-eno, naftaleno, adamantano, decalina, naftaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, norbornano, decalina, espiropentano, memantina, biperideno, rimantadina, alcanfor, colesterol, 4-fenilciclohexanol, biciclo[4.2.0]octano, memantina y 4,5,6,7-tetrahidro-1H-indeno y biciclo[4.1.0]hept-3-eno.
En cualquiera de las realizaciones precedentes, un grupo "heterociclo" se puede referir a una realización heterociclo monocíclico y/o una realización heterociclo policíclico, tal como grupo heterociclo condensado, puente o bicíclico. Los grupos “heterociclo” de la invención se pueden referir además a una realización heterociclo aromático y/o una realización heterociclo no aromático, o en el caso de realizaciones policíclicas, un heterociclo que tiene tanto uno o más anillos aromáticos como/o uno o más anillos no aromáticos. Las realizaciones de heterociclo policíclicas pueden ser un anillo bicíclico, un anillo condensado o un biciclo puente. Los heterociclos de ejemplo no limitantes incluyen piridilo, pirrolidina, piperidina, piperazina, pirrolidina, morfolina, pirimidina, benzofurano, indol, quinolina, lactonas, lactamas, benzodiazepina, indol, quinolina, purina, adenina, guanina, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol, hexamina y metenamina.
Algunos compuestos de la presente invención pueden existir en formas geométricas o estereoisómeras particulares. La presente invención contempla que todos dichos compuestos, incluyendo isómeros cis y trans, enantiómeros (R) y (S), diastereoisómeros, isómeros (D), isómeros (L), las mezclas racémicas de los mismos y otras mezclas de los mismos, están dentro del alcance de la invención. Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos adicionales en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Todos dichos isómeros, así como sus mezclas, se pretende que estén incluidos en esta invención.
Los compuestos y sales de los mismos descritos en la presente memoria también pueden estar presentes como los correspondientes hidratos (p. ej., hemihidrato, monohidrato, dihidrato, trihidrato, tetrahidrato) o solvatos. Los disolventes adecuados para la preparación de solvatos e hidratos los puede seleccionar en general un experto en la técnica.
Los compuestos y sus sales pueden estar presentes en formas amorfa o cristalina (que incluye cocristalina y polimorfo).
Los compuestos moduladores de sirtuina de la invención modulan ventajosamente el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina, en particular la actividad de desacetilasa de la proteína sirtuina.
Por separado o además de las propiedades anteriores, algunos compuestos moduladores de sirtuina de la invención no tienen sustancialmente una o más de las siguientes actividades: inhibición de PI3, inhibición de aldorreductasa, inhibición de tirosina quinasa, transactivación de tirosina quinasa EGFR, dilación coronaria o actividad espasmolítica, en concentraciones del compuesto que son eficaces para modular la actividad de desacetilación de una proteína sirtuina (p. ej., tal como una proteína SIRT1 y/o SIRT3).
Un grupo “alquilo” o “alcano” es un hidrocarburo no aromático de cadena lineal o ramificada que está completamente saturado. Típicamente, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada tiene de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a aproximadamente 10 salvo que se defina otra cosa. Los ejemplos de grupos alquilo de cadena lineal o ramificada incluyen metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, tere-butilo, pentilo, hexilo, pentilo y octilo. Un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada C1-C4 también se denomina un grupo “alquilo inferior”.
Los términos “alquenilo” (“alcano”) y “alquinilo” (“alquino”) se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y posible sustitución a los grupos alquilo descritos antes, pero que contienen al menos un doble o triple enlace, respectivamente.
La expresión “carbociclo aromático” se refiere a un sistema de anillo hidrocarbonado aromático que contiene al menos un anillo aromático. El anillo puede estar condensado o unido de otra forma a otros anillos carbocíclicos aromáticos o anillos carbocíclicos no aromáticos. Los ejemplos de grupos carbociclo aromáticos incluyen grupos carbocíclicos aromáticos tales como fenilo, naftilo y antracilo.
“Azabiciclo” se refiere a una molécula bicíclica que contiene un átomo de nitrógeno en el esqueleto del anillo. Los dos anillos del biciclo pueden estar condensados a dos átomos mutuamente unidos, p. ej., indol, a través de una secuencia de átomos, p. ej., azabiciclo[2.2.1]heptano, o unido a un solo átomo, p. ej., espirociclo.
“Biciclo” o “triciclo” se refiere a un sistema de dos anillos en el que uno, dos o tres o más átomos están compartidos entre los dos anillos. Biciclo incluye biciclos condensados en los que dos átomos adyacentes están compartidos por cada uno de los dos anillos, p. ej., decalina, indol. Biciclo también incluye biciclos espiránicos en los que dos anillos comparten un solo átomo, p. ej., espiro[2.2]pentano, 1-oxa-6-azaspiro[3.4]octano. Biciclo incluye además biciclos con puente en los que al menos tres átomos están compartidos entre dos anillos, p. ej. norbornano.
Los compuestos de “biciclo con puente” son sistemas de anillo bicíclicos en los que al menos tres átomos están compartidos por ambos anillos del sistema, es decir, incluyen al menos un puente de uno o más átomos que conectan dos átomos cabeza de puente. El azabiciclo con puente se refiere a una molécula bicíclica con puente que contiene un átomo de nitrógeno en al menos uno de los anillos.
El término "Boc" se refiere a un grupo terc-butiloxicarbonilo (un grupo protector de amina común).
Los términos “carbociclo” y “carbocíclico”, como se usan en la presente memoria, se refieren a un anillo saturado o insaturado en el que todos los átomos del anillo son carbono. El término carbociclo incluye tanto carbociclos aromáticos como carbociclos no aromáticos. Los carbociclos no aromáticos incluyen tanto anillos de cicloalcano, en los que todos los átomos de carbono son saturados, como anillos de cicloalqueno, que contienen al menos un doble enlace. “Carbociclo” incluye anillos monocíclicos de 5-7 miembros y bicíclicos de 8-12 miembros. Cada anillo de un carbociclo bicíclico se puede seleccionar de anillos no aromáticos o aromáticos. El carbociclo incluye moléculas bicíclicas en las que uno, dos o tres o más átomos están compartidos entre los anillos. La expresión “carbociclo condensado” se refiere a un carbociclo bicíclico en el que cada uno de los anillos comparte dos átomos adyacentes con el otro anillo. Cada anillo de un carbociclo condensado se puede seleccionar de anillos no aromáticos y aromáticos. En una realización de ejemplo, un anillo aromático, p. ej., fenilo, puede estar condensado con un anillo no aromático o aromático, p. ej., ciclohexano, ciclopentano o ciclohexeno. Cualquier combinación de anillos bicíclicos no aromáticos y aromáticos, según permita la valencia, está incluida en la definición de carbocíclico. Los “carbociclos” de ejemplo incluyen ciclopentano, ciclohexano, biciclo[2.2.1]heptano, 1,5-ciclooctadieno, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, biciclo[4.2.0]oct-3-eno, naftaleno y adamantano. Los carbociclos condensados de ejemplo incluye decalina, naftaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, biciclo[4.2.0]octano, 4,5,6,7-tetrahidro-1H-indeno y biciclo[4.1.0]hept-3-eno. Los "carbociclos" pueden estar sustituidos en una cualquiera o más posiciones capaces de llevar un átomo de hidrógeno.
Un grupo “cicloalquilo” es un hidrocarburo cíclico que está completamente saturado (no aromático). Típicamente, un grupo cicloalquilo tiene de 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, más típicamente de 3 a 8 átomos de carbono salvo que se defina de otra forma. Un grupo “cicloalquenilo” es un hidrocarburo cíclico que contiene uno o más dobles enlaces.
Un “halógeno” indica F, Cl, Br o I.
Una “sustitución con halógeno” o sustitución “halógeno-“ indica la sustitución de uno o más hidrógenos por F, Cl, Br o I.
El término “heteroarilo” o “heterociclo aromático” incluye estructuras de un solo anillo aromático sustituido o no sustituido, preferiblemente anillos de 5 a 7 miembros, más preferiblemente de 5 a 6 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen al menos un heteroátomo, preferiblemente de uno a cuatro heteroátomos, más preferiblemente uno o dos heteroátomos. El término “heteroarilo” también incluye sistemas de anillo que tienen uno o dos anillos en donde al menos uno de los anillos es heteroaromático, p. ej., los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, carbociclo aromático, heteroarilo y/o heterociclilo. Los grupos heteroarilo incluyen, por ejemplo, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina.
Los términos “heterociclo” y “heterocíclico”, como se usan en la presente memoria, se refieren a un anillo no aromático o aromático, que comprende uno o más heteroátomos seleccionados de, por ejemplo, átomos de N, O, B y S, preferiblemente N, O o S. El término "heterociclo" incluye tanto “heterociclos aromáticos” como “heterociclos no aromáticos”. Los heterociclos incluyen anillos monocíclicos de 4-7 miembros y anillos bicíclicos de 8-12 miembros. El heterociclo incluye moléculas bicíclicas en las que uno, dos o tres o más átomos son compartidos entre los dos anillos. Cada anillo de un heterociclo bicíclico se puede seleccionar de anillos no aromáticos y aromáticos. La expresión “heterociclo condensado” se refiere a un heterociclo bicíclico en el que cada uno de los anillos comparte dos átomos adyacentes con el otro anillo. Cada anillo de un heterociclo condensado se puede seleccionar de anillos no aromáticos y aromáticos. En una realización de ejemplo, un anillo aromático, p. ej., piridilo, puede estar condensado con un anillo no aromático o aromático, p. ej., ciclohexano, ciclopentano, pirrolidina, 2,3-dihidrofurano o ciclohexeno. Los grupos "heterociclo" incluyen, por ejemplo, piperidina, piperazina, pirrolidina, morfolina, pirimidina, benzofurano, indol, quinolina, lactonas y lactamas. Los "heterociclos condensados" de ejemplo incluyen benzodiazepina, indol, quinolina, purina y 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol. Los "heterociclos" pueden estar sustituidos en una cualquiera o más posiciones capaces de llevar un átomo de hidrógeno.
Los “anillos monocíclicos” incluyen carbociclo aromático o heteroarilo de 5-7 miembros, cicloalquilo o cicloalquenilo de 3-7 miembros y heterociclilo no aromático de 5-7 miembros. Los grupos monocíclicos de ejemplo incluyen heterociclos o carbociclos sustituidos o no sustituidos tales como tiazolilo, oxazolilo, oxazinilo, tiazinilo, ditianilo, dioxanilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, furanilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, piranilo, tetrazolilo, pirazolilo, pirazinilo, piridazinilo, imidazolilo, piridinilo, pirrolilo, dihidropirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirimidinilo, morfolinilo, tetrahidrotiofenilo, tiofenilo, ciclohexilo, ciclopentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, cicloheptanilo, azetidinilo, oxetanilo, tiiranilo, oxiranilo, aziridinilo y tiomorfolinilo.
Como se usa en la presente memoria, “sustituido” significa sustituir un átomo de hidrógeno en una estructura por un átomo o molécula distinto de hidrógeno. Un átomo sustituible tal como un “nitrógeno sustituible” es un átomo que lleva un átomo de hidrógeno en al menos una forma de resonancia. El átomo de hidrógeno se puede sustituir por otro átomo o grupo tal como un CH3 o un grupo OH. Por ejemplo, el nitrógeno en una molécula de piperidina es sustituible si el nitrógeno está unido a un átomo de hidrógeno. Si, por ejemplo, el nitrógeno de una piperidina está unido a un átomo distinto de hidrógeno, el nitrógeno no es sustituible. Un átomo que no puede llevar un átomo de hidrógeno en ninguna forma de resonancia no es sustituible.
Las combinaciones de sustituyentes y variables previstas por esta invención son solo las que dan como resultado la formación de compuestos estables. Como se usa en la presente memoria, el término “estable” se refiere a compuestos que tienen la estabilidad suficiente para permitir la fabricación y que mantienen la integridad del compuesto durante un periodo de tiempo suficiente para ser útiles para los propósitos detallados en la presente memoria.
Los compuestos descritos en la presente memoria también incluyen variantes parcial y totalmente deuteradas. En algunas realizaciones, las variantes deuteradas se pueden usar para estudios cinéticos. Un experto en la técnica puede seleccionar los sitios en los que están presentes los átomos de deuterio.
También están incluidas en la presente invención sales, en particular sales farmacéuticamente aceptables, de los compuestos descritos en la presente memoria. Los compuestos de la presente invención que tienen grupos funcionales suficientemente ácidos, suficientemente básicos o ambos, pueden reaccionar con cualquiera de una serie de bases inorgánicas y ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal. Alternativamente, los compuestos que están inherentemente cargados, tales como aquellos con un nitrógeno cuaternario, pueden formar una sal con un contraión adecuado (p. ej., un haluro tal como bromuro, cloruro o fluoruro, en particular bromuro).
Los ácidos usados habitualmente para formar sales de adición de ácido son ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, y similares. Los ejemplos de dichas sales incluyen el sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gammahidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato, y similares.
Las sales de adición de base incluyen las derivadas de bases inorgánicas, tales como hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos de amonio o alcalinos o alcalinotérreos, y similares. Dichas bases útiles en la preparación de las sales de la invención incluyen, por lo tanto, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido amónico, carbonato potásico, y similares.
Se describen métodos de producción de los compuestos definidos antes. Los compuestos se pueden sintetizar usando técnicas convencionales. Ventajosamente, estos compuestos se pueden sintetizar de forma conveniente a partir de materiales de partida fácilmente disponibles.
Las transformaciones y metodologías de química sintética útiles para sintetizar los compuestos descritos en la presente memoria son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (1989); T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a Ed. (1991); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (1994); y L. Paquette, ed., Enciclopedia of Reagents for Organic Synthesis (1995).
En una realización de ejemplo, un compuesto terapéutico puede atravesar la membrana citoplasmática de una célula. Por ejemplo, un compuesto puede tener una permeabilidad celular de al menos aproximadamente 20%, 50%, 75%, 80%, 90% o 95%.
Los compuestos descritos en la presente memoria también pueden tener una o más de las siguientes características: el compuesto puede ser esencialmente no tóxico para una célula o sujeto; el compuesto puede ser una molécula orgánica o una molécula pequeña de 2000 uma o menos, 1000 uma o menos; un compuesto puede tener una semivida en condiciones atmosféricas normales de al menos aproximadamente 30 días, 60 días, 120 días, 6 meses o 1 año; el compuesto puede tener una semivida en disolución de al menos aproximadamente 30 días, 60 días, 120 días, 6 meses o 1 año; un compuesto puede ser más estable en disolución que el resveratrol en al menos un factor de aproximadamente 50%, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 30 veces, 50 veces o 100 veces; un compuesto puede promover la desacetilación del factor de reparación del ADN Ku70; un compuesto puede promover la desacetilación de RelA/p65; un compuesto puede aumentar las tasas de recuperación general y potenciar la sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por TNF.
En algunas realizaciones, un compuesto modulador de sirtuina no tiene ninguna capacidad sustancial para inhibir una histona desacetilasa (HDAC) de clase I, y/o una HDAC de clase II en concentraciones (p. ej., in vivo) eficaces para modular la actividad de desacetilasa de la sirtuina. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, el compuesto modulador de sirtuina es un compuesto modulador de sirtuina y se elige para tener una CE50 para activar la actividad de desacetilasa de sirtuina que es al menos 5 veces menor que la EC50 para inhibir una HDAC I y/o HDAC II, e incluso más preferiblemente al menos 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces menos. Los métodos para ensayar la actividad de HDAC I y/o HDAC II son bien conocidos en la técnica y se pueden adquirir en el comercio kits para realizar dichos ensayos. Véase, p. ej., BioVision, Inc. (Mountain View, CA; world wide web en biovision.com) y Thomas Scientific (Swedesboro, NJ; world wide web en tomassci.com).
En algunas realizaciones, un compuesto modulador de sirtuina no tiene sustancialmente ninguna capacidad para modular homólogos de sirtuina. En algunas realizaciones, un activador de una proteína sirtuina humana puede no tener ninguna capacidad sustancial para activar una proteína sirtuina de eucariotas inferiores, en particular levaduras o patógenos humanos, en concentraciones (p. ej., in vivo) eficaces para desactivar la actividad de desacetilasa de la sirtuina humana. Por ejemplo, se puede elegir un compuesto modulador de sirtuina para que tenga una EC50 para activar una sirtuina humana, tal como una actividad de acetilasa de SIRT1 y/o SIRT3, que es al menos 5 veces menor que la EC50 para activar una sirtuina de levadura, tal como Sir2 (tal como Candida, S. cerevisiae, etc.), e incluso más preferiblemente al menos 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces menor. En otra realización, un inhibidor de una proteína sirtuina de eucariotas inferiores, en particular levaduras o patógenos humanos, no tiene ninguna capacidad sustancial para inhibir una proteína sirtuina de seres humanos en concentraciones (p. ej., in vivo) eficaces para inhibir la actividad de desacetilasa de la proteína sirtuina de un eucariota inferior. Por ejemplo, se puede elegir un compuesto inhibidor de sirtuina para que tenga una EC50 para inhibir una sirtuina humana, tal como una actividad de acetilasa de SIRT1 y/o SIRT3, que es al menos 5 veces menor que la CE50 para inhibir una sirtuina de levadura, tal como Sir2 (tal como Candida, S. cerevisiae, etc.), e incluso más preferiblemente al menos 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces menor.
En algunas realizaciones, un compuesto modulador de sirtuina puede tener la capacidad de modular uno o más homólogos de proteína sirtuina, tales como, por ejemplo, una o más SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 o SIRT7 humanas. En algunas realizaciones, un compuesto modulador de sirtuina tiene la capacidad de modular tanto una proteína SIRT1 como una SIRT3.
En otras realizaciones, un modulador de SIRT1 no tiene ninguna capacidad sustancial para modular otros homólogos de proteína sirtuina, tales como, por ejemplo, una o más de SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 o SIRT7 humanas, en concentraciones (p. ej., in vivo) eficaces para modular la actividad de desacetilasa de la SIRT1. Por ejemplo, se puede elegir un compuesto modulador de sirtuina para tener una ED50 para modular la actividad de desacetilasa de SIRT1 humana que es al menos 5 veces menor que la ED50 para modular una o más de las SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, o SIRT7 humanas, e incluso más preferiblemente al menos 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces menos. En algunas realizaciones, un modulador de SIRT1 no tiene ninguna capacidad sustancial para modular una proteína SIRT3.
En otras realizaciones, un modulador de SIRT3 no tiene sustancialmente ninguna capacidad para modular otros homólogos de proteínas sirtuinas, tales como por ejemplo, una o más de SIRT1, SIRT2, SIRT4, SIRT5, SIRT6 o SIRT7 humanas, en concentraciones (p. ej., in vivo), eficaces para modular la actividad de desacetilasa de la SIRT3 humana. Por ejemplo, se puede elegir un compuesto modulador de sirtuina para tener una ED50 para modular la actividad de desacetilasa de SIRT3 humana que es al menos 5 veces menor que la ED50 para modular una o más de SIRT1, SIRT2, SIRT4, SIRT5, SIRT6 o SIRT7 humanas, e incluso más preferiblemente al menos 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces menos. En algunas realizaciones, un modulador de SIRT3 no tiene sustancialmente ninguna capacidad para modular una proteína SIRT1.
En algunas realizaciones, un compuesto modulador de sirtuina puede tener una afinidad de unión por una proteína sirtuina de aproximadamente 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menos. Un compuesto modulador de sirtuina puede reducir (activador) o aumentar (inhibidor) la Km aparente de una proteína sirtuina por su sustrato o NAD+ (u otro cofactor, en un factor de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50 o 100. En algunas realizaciones, los valores de Km se determinan usando el ensayo de espectrometría de masas descrito en la presente memoria. Los compuestos activadores preferidos reducen la Km de una sirtuina por su sustrato o cofactor en mayor medida que lo hace el resveratrol en una concentración similar, o reducen la Km de una sirtuina por su sustrato o cofactor de forma similar a la producida por el resveratrol en una concentración menor. Un compuesto modulador de sirtuina puede aumentar la Vmáx de una proteína sirtuina en un factor de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50 o 100. Un compuesto modulador de sirtuina puede tener una ED50 para modular la actividad de desacetilasa de una proteína SIRT1 y/o SIRT3 menor de aproximadamente 1 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 100 nM, menor aproximadamente 1 pM, menor de aproximadamente 10 pM, menor de aproximadamente 100 pM, o de aproximadamente 1-10 nM, de aproximadamente 10-100 nM, de aproximadamente 0,1-1 pM, de aproximadamente 1-10 pM o de aproximadamente 10-100 pM. Un compuesto modulador de sirtuina puede modular la actividad de desacetilasa de una proteína SIRT1 y/o SIRT3 en un factor de al menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 50 o 100, medido en un ensayo celular o en un ensayo basado en células. Un compuesto modulador de sirtuina puede producir una inducción aproximadamente 10%, 30%, 50%, 80%, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor de la actividad de desacetilasa de una proteína sirtuina con respecto a la misma concentración de resveratrol. Un compuesto modulador de sirtuina puede tener una ED50 para modular la SIRT5 que es al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces mayor que la de modular SIRT1 y/o SIRT3.
3. Usos de ejemplo
Se describen en la presente memoria métodos para modular el nivel y/o la actividad de una proteína sirtuina y sus métodos de uso.
Se describen en la presente memoria métodos para usar compuestos moduladores de sirtuina, en donde los compuestos moduladores de sirtuina activan una proteína sirtuina, p. ej., aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina pueden ser útiles para una variedad de aplicaciones terapéuticas, que incluyen, por ejemplo, aumentar el periodo de vida de una célula, y tratar y/o prevenir una amplia variedad de enfermedades y trastornos que incluyen, por ejemplo, enfermedades o trastornos relacionados con el envejecimiento o estrés, diabetes, obesidad, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad cardiovascular, trastornos de coagulación de la sangre, inflamación, cáncer y/o rubefacción, etc. Los métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto modulador de sirtuina, p. ej., un compuesto modulador de sirtuina.
Si querer estar limitados por la teoría, se cree que los activadores de la presente invención pueden interaccionar con una sirtuina en el mismo sitio dentro de la proteína sirtuina (p. ej., sitio activo o sitio que afecta a la Km o Vmáx del sitio activo). Se cree que esta es la razón por la que algunas clases de activadores e inhibidores de sirtuina pueden tener sustancial similitud estructural.
Los compuestos moduladores de sirtuina descritos en la presente memoria, se pueden considerar solos o en combinación con otros compuestos. Se describe en la presente memoria una mezcla de dos o más compuestos moduladores de sirtuina que se puede administrar a un sujeto que lo necesite. Se describe en la presente memoria que un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede administrar con uno o más de los siguientes compuestos: resveratrol, buteina, fisetina, piceatanol o quercetina. En esta descripción, un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede administrar en combinación con ácido nicotínico o ribósido de nicotinamida. Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que disminuye el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede administrar con uno o más de los siguientes compuestos: nicotinamida (NAM), suramina; NF023 (un antagonista de proteína G); NF279 (un antagonista de receptor purinérgico); Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8,tetrametilcroman-2-carboxílico); (-)-epigalocatequina (hidroxi en sitios 3,5,7,3',4',5'); galato de (-)-epigalocatequina (sitios hidroxi 5,7,3',4',5' y éster de galato 3); cloruro de cianidina (cloruro de 3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavilio); cloruro de delfinidina (3,5,7,3',4',5'-cloruro de hexahidroxiflavilio); miricetina (canabiscetina; 3,5,7,3',4',5'-hexahidroxiflavona); 3,7,3',4',5'-pentahidroxiflavona; gosipetina (3,5,7,8,3',4'-hexahidroxiflavona), sirtinol; y esplitomicina. Se describe en la presente memoria, que se pueden administrar uno o más compuestos moduladores de sirtuina con uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de diferentes enfermedades, que incluyen, por ejemplo, cáncer, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad cardiovascular, coagulación de la sangre, inflamación, rubefacción, obesidad, envejecimiento, estrés, etc. En diferentes realizaciones, las terapias de combinación que comprenden un compuesto modulador de sirtuina se pueden referir a (1) composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos moduladores de sirtuina en combinación con uno o más agentes terapéuticos (p. ej., uno o más agentes terapéuticos descritos en la presente memoria); y (2) coadministración de uno o más compuestos moduladores de sirtuina con uno o más agentes terapéuticos en donde el compuesto modulador de sirtuina y el agente terapéutico no se han formulado en las mismas composiciones (pero pueden estar presentes dentro del mismo kit o envase, tal como un envase blíster o u otro envase de múltiples cámaras; recipientes sellados por separado, conectados (p. ej., bolsas de papel de aluminio) que pueden ser separados por el usuario; o un kit donde el o los compuestos y el o los otros agentes terapéuticos están en recipientes separados). Cuando se usan formulaciones separadas, el compuesto modulador de sirtuina se puede administrar simultáneo con, de forma intermitente con, alternado con, antes de, posteriormente a, o combinaciones de los mismos, la administración de otro agente terapéutico.
Se describen métodos para reducir, prevenir o tratar enfermedades o trastornos usando un compuesto descrito en la presente memoria, que también pueden comprender aumentar el nivel de proteína de una sirtuina, tal como SIRT1, SIRT2 y/o SIRT3 humanas, u homólogas de las mismas. Se pueden lograr mayores niveles de proteína introduciendo en una célula una o más copias de un ácido nucleico que codifica una sirtuina. Por ejemplo, se puede aumentar el nivel de sirtuina en una célula de mamífero, introduciendo en la célula de mamífero un ácido nucleico que codifica la sirtuina, p. ej., aumentar el nivel de SIRT1 introduciendo un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en el n° de acceso en GenBank NP_036370, y/o aumentar el nivel de SIRT3 introduciendo un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en el n° de acceso en GenBank AAH01042. Un ácido nucleico que se introduce en una célula para aumentar el nivel de proteína de una sirtuina puede codificar una proteína que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de una sirtuina, p. ej., proteína SIRT1 y/o SIRT3. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica la proteína puede ser al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a un ácido nucleico que codifica una proteína SIRT1 (p. ej. n° de acceso en GenBank NM_012238) y/o SIRT3 (p. ej., n° de acceso en GenBank BC001042). El ácido nucleico también puede ser un ácido nucleico que hibrida, preferiblemente en condiciones de hibridación restrictivas, con un ácido nucleico que codifica una sirtuina de tipo natural, p. ej., la proteína SIRT1 y/o SIRT3. Las condiciones de hibridación restrictivas pueden incluir hibridación y un lavado en 0,2 x SSC a 65°C. Cuando se usa un ácido nucleico que codifica una proteína que es diferente de una proteína sirtuina de tipo natural, tal como una proteína que es un fragmento de una sirtuina de tipo natural, la proteína preferiblemente es biológicamente activa, p. ej., es capaz de desacetilación. Solo es necesario expresar en una célula una parte de la sirtuina que es biológicamente activa. Por ejemplo, una proteína que difiere de SIRT1 de tipo natural que tiene n° de acceso en GenBank NP_036370, preferiblemente contiene la estructura central de la misma. La estructura central se refiere a veces a los aminoácidos 62-293 del n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 237 a 932 del n° de acceso en GenBank NM_012238, que abarca la unión del NAD, así como los dominios de unión del sustrato. El dominio central de SIRT1 también se puede referir a los aminoácidos de aproximadamente 261 a 447 del n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 834 a 1394 del n° de acceso en GenBank NM_012238; a los aminoácidos de aproximadamente 242 a 493 del n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 777 a 1532 del n° de acceso en GenBank NM_012238; o a los aminoácidos de aproximadamente 254 a 495 del n° de acceso en GenBank NP_036370, que son codificados por los nucleótidos 813 a 1538 del n° de acceso en GenBank NM_012238. Se puede determinar si una proteína retiene una función biológica, p. ej., capacidades de desacetilación, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Los métodos descritos para reducir, prevenir o tratar enfermedades o trastornos usando un compuesto modulador de sirtuina pueden comprender también disminuir el nivel de proteína de una sirtuina, tal como SIRT1, SIRT2 y/o SIRT3 humanas, u homólogas de las mismas. Se puede lograr disminuir un nivel de proteína sirtuina de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede expresar en la célula un ARNip, un ácido nucleico de sentido contrario o un ribozima dirigido a la sirtuina. También se puede usar un mutante de sirtuina negativo dominante, p. ej., un mutante que no es capaz de desacetilación. Por ejemplo, se puede usar el mutante H363Y de SIRT1, descrito, p. ej., en Luo et al. (2001) Cell 107:137. Alternativamente, se pueden usar agentes que inhiben la transcripción.
Los métodos para modular los niveles de proteína sirtuina también incluyen métodos para modular la transcripción de genes que codifican sirtuinas, métodos para estabilizar/desestabilizar los ARNm correspondientes, y otros métodos conocidos en la técnica.
Envejecimiento/estrés
Se describe un método para prolongar el periodo de vida de una célula, prolongando la capacidad proliferativa de una célula, ralentizando el envejecimiento de una célula, promoviendo la supervivencia de una célula, retrasando la senescencia celular en una célula, imitando los efectos de la restricción calórica, aumentando la resistencia de una célula frente al estrés, o previniendo la apoptosis de una célula, poniendo en contacto la célula con un compuesto modulador de sirtuina de la invención que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Los métodos descritos comprenden poner en contacto la célula con un compuesto modulador de sirtuina.
Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para aumentar la cantidad de tiempo que células, en particular células primarias (es decir, células obtenidas de un organismo, p. ej., un ser humano), se pueden mantener vivas en un cultivo celular. Los citoblastos embrionarios (ES) y células pluripotentes, y células diferenciadas de las mismas, también se pueden tratar con un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina para mantener las células, o su progenie, en cultivo durante periodos de tiempo más prolongados. Dichas células también se pueden usar para el trasplante en un sujeto, p. ej., después de modificación ex vivo.
En un aspecto, las células que se pretende conservar durante periodos de tiempo largos, se pueden tatar con un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Las células pueden estar en suspensión (p. ej., células sanguíneas, suero, medio de crecimiento biológico, etc.) o en tejidos u órganos. Por ejemplo, la sangre recogida de un individuo para fines de transfusión, se puede tratar con un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina para conservar las células sanguíneas durante periodos de tiempo más largos. Adicionalmente, la sangre para usar con fines forenses también se puede conservar usando un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Otras células que se pueden tratar para prolongar su periodo de vida o proteger frente a la apoptosis, incluyen células para consumo, p. ej., células de mamíferos no humanos (tal como carne) o células vegetales (tal como verduras).
Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden aplicar durante fases de desarrollo y crecimiento en mamíferos, plantas, insectos o microorganismos, con el fin de, p. ej., alterar, retrasar o acelerar los procesos de desarrollo y/o crecimiento.
Se describen en la presente memoria compuestos modulares de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina, que se pueden usar para tratar células útiles para trasplante o terapia con células, que incluyen, por ejemplo, injertos de tejido sólido, trasplante de órgano, suspensiones celulares, citoblastos, células de la médula ósea, etc. Las células o tejido pueden ser un autoinjerto, un aloinjerto, un isoinjerto o un xenoinjerto. Las células o tejido se pueden tratar con un compuesto modulador de sirtuina antes de la administración/implante, simultáneamente con la administración/implante, y/o después de la administración/implante en un sujeto. Las células o tejido se pueden tratar antes de retirar las células del individuo donante, ex vivo después de retirar las células o tejido del individuo donante, o después de implante en el receptor. Por ejemplo, el individuo donante o receptor se puede tratar de forma sistémica con un compuesto modulador de sirtuina o se puede tratar un subconjunto de células/tejido localmente con un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Se describe en la presente memoria que las células o tejido (o individuos donantes/receptores) se pueden tratar adicionalmente con otro agente terapéutico útil para prolongar la supervivencia del injerto, tal como, por ejemplo, un agente de inmunosupresión, una citoquina, un factor angiogénico, etc.
En otras realizaciones más, las células se pueden tratar con un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina in vivo, p. ej., para aumentar su periodo de vida o prevenir la apoptosis. Por ejemplo, se puede proteger la piel frente al envejecimiento (p. ej., desarrollo de arrugas, pérdida de elasticidad, etc.) tratando la piel o células epiteliales con un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. En una realización de ejemplo, la piel se pone en contacto con una composición farmacéutica o cosmética que comprende un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Las dolencias de la piel y afecciones de la piel de ejemplo que se pueden tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria incluyen trastornos o enfermedades asociadas con o causadas por inflamación, daño por el sol o envejecimiento natural. Por ejemplo, las composiciones son útiles en la prevención o tratamiento de dermatitis de contacto (que incluye la dermatitis de contacto irritante y dermatitis de contacto alérgico), dermatitis atópica (también conocida como eczema alérgico), queratosis actínica, trastornos de queratinización (que incluye eczema), enfermedades de epidermólisis ampollosa (que incluye pénfigo), dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritemas (que incluyen eritema multiforme y eritema nodoso), daño causado por el sol u otras fuentes de luz, lupus eritematoso discoide, dermatomiositis, psoriasis, cáncer de piel y los efectos del envejecimiento natural. En otra realización, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para el tratamiento de heridas y/o quemaduras para promover la cicatrización, que incluyen, por ejemplo, quemaduras de primer, segundo o tercer grado, y/o quemaduras químicas o eléctricas. Las formulaciones se pueden administrar por vía tópica, a la piel o tejido de mucosa.
Las formulaciones tópicas que comprenden uno o más compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden usar como composiciones de prevención, p. ej., quimioprevención. Cuando se usan en un método de quimioprevención, la piel susceptible se trata previamente a cualquier afección visible en un individuo particular.
Los compuestos moduladores de sirtuina se pueden suministrar de forma local o sistémica a un sujeto. En algunas realizaciones, un compuesto modulador de sirtuina se suministra de forma local a un tejido u órgano de un sujeto por inyección, formulación tópica, etc.
Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad o afección inducida o exacerbada por la senescencia celular en un sujeto; métodos para disminuir la velocidad de senescencia de un sujeto, p. ej., después del inicio de la senescencia; métodos para prolongar el periodo de vida de un sujeto; métodos para tratar o prevenir una enfermedad o afección relacionada con el periodo de vida; métodos para tratar o prevenir una enfermedad o afección relacionada con la capacidad proliferativa de células; y métodos para tratar o prevenir una enfermedad o afección que resulta del daño o muerte celular. En algunas circunstancias, el método descrito no actúa disminuyendo la tasa de aparición de enfermedades que acortan el periodo de vida de un sujeto. En algunas circunstancias, el método descrito no actúa reduciendo la mortalidad causada por una enfermedad, tal como el cáncer.
Se describe en la presente memoria, que se puede administrar un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina a un sujeto, con el fin de aumentar en general el periodo de vida de sus células y proteger sus células frente al estrés y/o frente a la apoptosis. Se cree que el tratamiento de un sujeto con un compuesto descrito en la presente memoria, es similar a someter al sujeto a hormesis, es decir, estrés suave que es beneficioso para los organismos y puede prolongar su periodo de vida.
Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar a un sujeto para prevenir el envejecimiento y las consecuencias asociadas con el envejecimiento o enfermedades, tales como accidente cerebrovascular, cardiopatía, insuficiencia cardiaca, artritis, hipertensión, y enfermedad de Alzheimer. Otras afecciones que se pueden tratar incluyen trastornos oculares, p. ej., asociados con el envejecimiento del ojo, tales como cataratas, glaucoma y degeneración macular. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden administrar a sujetos para el tratamiento de enfermedades, p. ej., enfermedades crónicas, asociadas con la muerte celular, con el fin de proteger a las células de la muerte celular. Las enfermedades de ejemplo incluyen las asociadas con la muerte de células neuronales, disfunción neuronal o muerte o disfunción de células musculares, tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y distrofia muscular; SIDA; hepatitis fulminante; enfermedades asociada con la degeneración del cerebro, tales como enfermedad de Creutzfeld-Jakob, retinitis pigmentosa y degeneración cerebelar; mielodisplasia tal como anemia aplásica; enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio y accidente cerebrovascular; enfermedades hepáticas, tales como hepatitis alcohólica, hepatitis B y hepatitis C; enfermedades de las articulaciones tales como osteoartritis; aterosclerosis; alopecia; daño a la piel debido a la luz UV; liquen plano; atrofia de la piel; cataratas; y rechazos de injertos. La muerte celular también puede ser causada por cirugía, terapia con fármacos, exposición a productos químicos o exposición a radiación.
Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden administrar a un sujeto que padece una enfermedad aguda; p. ej., daño en un órgano o tejido, p. ej., un sujeto que sufre un accidente cerebrovascular o infarto de miocardio o un sujeto que padece una lesión de la médula espinal. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden usar para reparar un hígado alcohólico.
Enfermedad cardiovascular
Se describe un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cardiovascular por administración a un sujeto que lo necesite de un compuesto modulador de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina.
Las enfermedades cardiovasculares que se pueden tratar o prevenir usando los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina incluyen miocardiopatía o miocarditis; tales como miocardiopatía idiopática, miocardiopatía metabólica, miocardiopatía alcohólica, miocardiopatía inducida por fármacos, miocardiopatía isquémica y miocardiopatía hipertensiva. También se pueden tratar o prevenir usando los compuestos y métodos descritos en la presente memoria, trastornos ateromatosis de los vasos sanguíneos mayores (enfermedad macrovascular) tales como la aorta, las arterias coronas, las arterias carótidas y las arterias poplíteas. Otras enfermedades vasculares que se pueden tratar o prevenir incluyen las relacionadas con la agregación de plaquetas, las arteriolas retinianas, las arteriolas glomerulares, los vasa nervorum, arteriolas cardiacas y lechos capilares asociados del ojo, el riñón, el corazón, y los sistemas nerviosos centrales y periféricos. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también se pueden usar para aumentar los niveles de HDL en el plasma de un individuo.
Otros trastornos más que se pueden tratar con compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina incluyen reestenosis, p. ej., después de intervención coronaria, y trastornos relacionados con un nivel anormal de colesterol de alta densidad y baja densidad.
Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede administrar como parte de una terapia de combinación con otro agente cardiovascular. Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede administrar como parte de una terapia de combinación con un agente antiarritmia.
Muerte celular/Cáncer
Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar a sujetos que han recibido recientemente o es probable que reciban una dosis de radiación o toxina. Se describe en la presente memoria, que la dosis de radiación o toxina se recibe como parte de un procedimiento relacionado con el trabajo o médico, p. ej., administrado como una medida profiláctica. Se describe en la presente memoria, que la dosis de radiación o toxina se recibe de forma no intencionada. En dicho caso, el compuesto se administra preferiblemente tan pronto como sea posible después de la exposición para inhibir la apoptosis y el posterior desarrollo del síndrome de radiación agudo.
Los compuestos moduladores de sirtuina también se pueden usar para tratar y/o prevenir el cáncer. En algunas realizaciones, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para el tratamiento y/o prevención del cáncer. La restricción calórica se ha asociado con una reducción de la incidencia de trastornos relacionados con la edad, incluyendo el cáncer. Por consiguiente, un aumento en el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina puede ser útil para tratar y/o prevenir la incidencia de trastornos relacionados con la edad, tales como por ejemplo, el cáncer. Los cánceres de ejemplo que se pueden tratar usando un compuesto modulador de sirtuina son los de cerebro y riñón; cánceres dependientes de hormonas que incluyen cánceres de mama, próstata, testicular y de ovario; linfomas y leucemias. En cánceres asociados con tumores sólidos, se puede administrar directamente en el tumor un compuesto modulador. El cáncer de células sanguíneas, p. ej., leucemia, se puede tratar administrando un compuesto modulador en el torrente sanguíneo o en la médula ósea. También se puede tratar el crecimiento de células benignas, p. ej., verrugas. Otras enfermedades que se pueden tratar incluyen enfermedades autoinmunitarias, p. ej., lupus eritematosos sistémico, escleroderma y artritis, en los que deben eliminarse las células autoinmunitarias. Las infecciones víricas tales como herpes, VIH, adenovirus, y trastornos malignos y benignos asociados con el HTLV-1, también se pueden tratar por la administración de un compuesto modulador de sirtuina. Alternativamente, se pueden obtener las células de un sujeto, tratar ex vivo para eliminar ciertas células indeseables, p. ej., células de cáncer y volver a administrar al mismo sujeto o uno diferente.
Se pueden coadministrar agentes quimioterapéuticos con compuestos moduladores descritos en la presente memoria, que tienen actividad antineoplásica, p. ej., compuestos que inducen la apoptosis, compuestos que reducen el periodo de vida o compuestos que convierten a las células en sensibles al estrés. Los agentes quimioterapéuticos se pueden usar por si mismos con un compuesto modulador de sirtuina descrito en la presente memoria, para inducir la muerte celular o reducir el periodo de vida o aumentar la sensibilidad al estrés y/o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos. Además de los productos quimioterapéuticos convencionales, los compuestos moduladores de sirtuina descritos en la presente memoria también se pueden usar con un ARN de sentido contrario, ARNi u otros polinucleótidos para inhibir la expresión de los componentes celulares que contribuye a la proliferación celular no deseada.
Las terapias de combinación que comprenden compuestos moduladores de sirtuina y un agente quimioterapéutico convencional pueden ser ventajosas frente a terapias de combinación conocidas en la técnica, debido a que la combinación permite que el agente quimioterapéutico convencional ejerza un efecto mayor con dosis menores. Se describe en la presente memoria, que la dosis efectiva (ED50) para un agente quimioterapéutico, o combinación de agentes quimioterapéuticos convencionales, cuando se usan en combinación con un compuesto modulador de sirtuina es al menos 2 veces menos que la DE50 para el agente quimioterapéutico solo, e incluso más preferiblemente 5 veces, 10 veces o incluso 25 veces menos. A la inversa, el índice terapéutico (IT) para dicho agente quimioterapéutico o combinación de dicho agente quimioterapéutico cuando se usa en combinación con un compuesto modulador de sirtuina descrito en la presente invención, puede ser al menos 2 veces mayor que el IT para el régimen quimioterapéutico convencional solo, e incluso más preferiblemente 5 veces, 10 veces o incluso 25 veces mayor.
Enfermedades/Trastornos neuronales
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar pacientes que padecen enfermedades neurodegenerativas, y lesiones traumáticas o mecánicas del sistema nervioso central (SNC), médula espinal o sistema nervioso periférico (SNP). La enfermedad neurodegenerativa típicamente implica reducciones en la masa y volumen del cerebro humano, que pueden deberse a la atrofia y/o muerte de células cerebrales, que son mucho más profundas que las de una persona sana que son atribuibles al envejecimiento. Las enfermedades neurodegenerativas pueden evolucionar gradualmente, después de un periodo largo de función cerebral normal, debido a la degeneración progresiva (p. ej., disfunción y muerte de células nerviosas) de regiones específicas del cerebro. Alternativamente, las enfermedades neurodegenerativas pueden tener un inicio rápido, tal como las asociadas con traumatismo o toxinas. El inicio real de la degeneración cerebral puede preceder en muchos años a la expresión clínica. Los ejemplos de enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de cuerpos de Lewy difusos, corea-acantocitosis, esclerosis lateral primaria, enfermedades oculares (neuritis ocular), neuropatías inducidas por quimioterapia (p. ej., de vincristina, paclitaxel, bortezomib), neuropatías inducidas por diabetes y ataxia de Friedreich. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar estos trastornos y otros como se describe a continuación.
La EA es un trastorno del SNC que produce pérdida de memoria, comportamiento inusual, cambios de personalidad y un deterioro de la capacidad de pensar. Estas pérdidas están relacionadas con la muerte de tipos específicos de células cerebrales y la rotura de conexiones y su red de apoyo (p. ej., células gliales) entre ellas. Los primeros síntomas incluyen la pérdida de la memoria reciente, juicio defectuoso y cambios en la personalidad. La Ep es un trastorno del SNC que produce movimientos del cuerpo incontrolados, rigidez, temblor y discinesia, y está asociada con la muerte de células cerebrales en una zona del cerebro que produce dopamina. La ELA (enfermedad de la neurona motora) es un trastorno del SNC que ataca a neuronas motoras, competentes del SNC que conectan el cerebro con los músculos esqueléticos.
La EH es otra enfermedad neurodegenerativa que produce movimientos incontrolados, pérdida de facultades intelectuales y alteración emocional. La enfermedad de Tay-Sachs y enfermedad de Sandhoff son enfermedades del almacenamiento de glucolípidos donde el gangliósido GM2 y sustratos glucolípidos relacionados para la phexosaminidasa se acumulan en el sistema nervioso y producen neurodegeneración aguda.
Es bien conocido que la apoptosis tiene una función en la patogénesis del SIDA en el sistema inmunitario. Sin embargo, el VIH-1 también induce enfermedad neurológica, que se puede tratar con compuestos moduladores de sirtuina como se definen en la reivindicación 1.
La pérdida neuronal también es una característica destacada de las enfermedades priónicas, tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en seres humanos, BSE en el ganado (enfermedad de las vacas locas), encefalopatía espongiforme bovina en ovejas y cabras, y encefalopatía espongiforme felina (FSE) en gatos. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina pueden ser útiles para tratar o prevenir la pérdida neuronal debido a estas enfermedades priónicas.
Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede usar para tratar o prevenir cualquier enfermedad o trastorno que implique axonopatía. La axonopatía distal es un tipo de neuropatía periférica que es resultado de algún trastorno metabólico o tóxico de neuronas del sistema nervioso central (SNC). Es la respuesta más común de los nervios a alteraciones metabólicas o tóxicas, y como tal puede ser causada por enfermedades metabólicas tales como la diabetes, insuficiencia renal, síndromes de deficiencia tales como la malnutrición y alcoholismo, o los efectos de toxinas o fármacos. Los que tienen axonopatías distales normalmente presentan alteraciones sensitivo-motoras con distribución en guante y calcetín. También se pierden o disminuyen en las zonas afectadas los reflejos tendinosos profundos y funciones del sistema nervioso autónomo (SNA).
Las neuropatías diabéticas son trastornos neuropáticos que están asociados con la diabetes mellitus. Las afecciones relativamente comunes que se pueden asociar con la neuropatía diabética incluyen la parálisis del tercer nervio craneal; mononeuropatía; mononeuritis múltiple; amiotrofía diabética; una polineuropatía dolorosa; neuropatía autonómica; y neuropatía toracoabdominal.
La neuropatía periférica es el término médico para el daño a nervios del sistema nervioso periférico, que puede ser causado bien por enfermedades de los nervios o por efectos secundarios de enfermedad sistémica. Las causas principales de la neuropatía periférica incluyen convulsiones, deficiencias nutricionales, y VIH, aunque la diabetes es la causa más probable.
Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede usar para tratar o prevenir la esclerosis múltiple (EM), incluyendo la recaída en EM y EM monosintomática, y otras afecciones desmielinizantes, tales como por ejemplo, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), o síntomas asociados con las mismas.
Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede usar para tratar traumatismo a los nervios, incluyendo, traumatismo debido a enfermedad, lesión (incluyendo intervención quirúrgica) o traumatismo ambiental (p. ej., neurotoxinas, alcoholismo, etc.).
Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina también pueden ser útiles para prevenir, tratar y aliviar síntomas de diferentes trastornos del SNP. La expresión “neuropatía periférica” abarca una amplia variedad de trastornos en los que se han dañado los nervios fuera del cerebro y médula espinal, nervios periféricos. La neuropatía periférica también se puede denominar neuritis periférica, o si hay muchos nervios implicados, se pueden usar los términos polineuropatía o polineuritis.
Las enfermedades del SNP que se pueden tratar con compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina incluyen: diabetes, lepra, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, síndrome de Guillain-Barré y neuropatías del plexo braquial (enfermedades de las raíces cervicales y primeras raíces torácicas, troncos nerviosos, troncos y componentes de nervios periféricos del plexo braquial.
Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad de la poliglutamina. Las enfermedades de la poliglutamina de ejemplo incluyen atrofia muscular bulbar y espinal (enfermedad de Kennedy), enfermedad de Huntigton (EH), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (síndrome de Haw River), ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3 (enfermedad de Machado-Joseph), ataxia espinocerebelosa de tipo 6, ataxia espinocerebelosa de tipo 7 y ataxia espinocerebelosa de tipo 17.
Se describe un método para tratar una célula del sistema nervioso central para prevenir el daño en respuesta a una disminución del flujo sanguíneo a la célula. Típicamente la gravedad del daño que se puede prevenir dependerá en gran parte del grado de reducción del flujo sanguíneo a la célula y la duración de la reducción. En algunas realizaciones, se puede prevenir la muerte celular apoptótica o necrótica. En otra realización más, se puede prevenir el daño mediado por isquemia, tal como edema citotóxico o anoxemia de tejido del sistema nervioso central. Se describe en la presente memoria, que la célula del sistema nervioso central puede ser una célula espinal o una célula cerebral.
Otro aspecto abarca la administración de un compuesto modulador de sirtuina a un sujeto para tratar una afección isquémica del sistema nervioso central. Se pueden tratar una serie de afecciones isquémicas del sistema nervioso central mediante los compuestos moduladores de sirtuina descritos en la presente memoria. Se describe en la presente memoria, que la afección isquémica es un accidente cerebrovascular que produce cualquier tipo de daño isquémico del sistema nervioso central, tal como muerte celular apoptótica o necrótica, edema citotóxico o anoxia de tejido del sistema nervioso central. El accidente cerebrovascular puede impactar en cualquier área del cerebro o ser causado por cualquier etiología que se sabe habitualmente que produce la aparición de un accidente cerebrovascular. Se describe en la presente memoria, que el accidente cerebrovascular es un accidente cerebrovascular del tronco encefálico. Se describe en la presente memoria, que el accidente cerebrovascular es un accidente cerebrovascular cerebeloso. Se describe también en la presente memoria, que el accidente cerebrovascular es un accidente cerebrovascular embólico. En otra alternativa más, el accidente cerebrovascular puede ser un accidente cerebrovascular hemorrágico. En una descripción adicional, el accidente cerebrovascular es un accidente cerebrovascular trombótico.
Se describe en la presente memoria, que se puede administrar un compuesto modulador de sirtuina para reducir el tamaño de infarto del núcleo isquémico después de una afección isquémica del sistema nervioso central. Además, también se puede administrar de forma beneficiosa un compuesto modulador de sirtuina para reducir el tamaño de la penumbra isquémica o zona de transición después de una afección isquémica del sistema nervioso central.
Se describe en la presente memoria, que un régimen de combinación de fármacos puede incluir fármacos o compuestos para el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos o afecciones secundarias asociadas con estas afecciones. Por lo tanto, un régimen de combinación de fármacos puede incluir uno o más activadores de sirtuina y uno o más agentes antineurodegeneración.
Trastornos de coagulación sanguínea
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar o prevenir trastornos de coagulación de la sangre (o trastornos hemostáticos). Tal como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, las expresiones “hemostasia”, “coagulación de la sangre” y “coágulo de sangre” se refieren al control de la hemorragia, que incluye las propiedades fisiológicas de vasoconstricción y coagulación. La coagulación de la sangre ayuda a mantener la integridad de la circulación en mamíferos después de lesión, inflamación, enfermedad, defecto congénito, disfunción u otra alteración. Además, la formación de coágulos de sangre no solo limita la hemorragia en caso de una lesión (hemostasia), sino que puede conducir a daño importante de órganos y muerte en el contexto de enfermedades ateroscleróticas por oclusión de una arteria o vena importante. La trombosis es, por lo tanto, la formación de coágulo de sangre en el momento y sitio incorrectos.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona tratamientos de anticoagulación y antitrombóticos dirigidos a inhibir la formación de coágulos de sangre con el fin de prevenir o tratar trastornos de coagulación sanguínea, tales como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, pérdida de una extremidad por enfermedad arterial periférica o embolia pulmonar.
Tal como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, “que modula o modulación de hemostasia” y “que regula o regulación de hemostasia” incluye la inducción (p. ej., estimulación o aumento) de la hemostasia, así como la inhibición (p. ej., reducción o disminución) de la hemostasia.
Se describe un método para reducir o inhibir la hemostasia en un sujeto, administrando un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Las composiciones y métodos descritos en la presente memoria son útiles para el tratamiento o prevención de trastornos trombóticos. Como se usa en la presente memoria, la expresión “trastorno trombótico” incluye cualquier trastorno o afección caracterizado por la coagulación o actividad hemostática excesiva o no deseada, o un estado hipercoagulable. Los trastornos trombóticos incluyen enfermedades o trastornos que implican la adhesión de plaquetas y la formación de trombos, y se pueden manifestar como una mayor propensión a la formación de trombos, p. ej., un mayor número de trombos, trombosis a una edad temprana, una tendencia familiar a la trombosis y trombosis en sitios inusuales.
Se describe en la presente memoria, que un régimen de combinación de fármacos puede incluir fármacos o compuestos para el tratamiento o prevención de trastornos de coagulación sanguínea o afecciones secundarias asociadas con estas afecciones. Por lo tanto, un régimen de combinación de fármacos puede incluir uno o más compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina y uno o más agentes anticoagulación o antitrombosis.
Control de peso
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar o prevenir el aumento de peso y la obesidad en un sujeto. Por ejemplo, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar, por ejemplo, para tratar o prevenir la obesidad hereditaria, obesidad dietética, obesidad relacionada con hormonas, obesidad relacionada con la administración de medicamentos, para reducir el peso de un sujeto o reducir o prevenir el aumento de peso en un sujeto. Un sujeto que necesite dicho tratamiento puede ser un sujeto que es obeso, es probable que se vuelva obeso, tiene sobrepeso o es probable que tenga sobrepeso. Los sujetos que es probable que se vuelvan obesos se pueden identificar, por ejemplo, basándose en los antecedentes familiares, genética, dieta, nivel de actividad, ingestión de medicación, o diferentes combinaciones de los mismos. Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar a sujetos que padecen una variedad de otras enfermedades y afecciones que se pueden tratar o prevenir promoviendo la pérdida de peso en el sujeto. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, tensión sanguínea alta, hipertensión, colesterol en sangre elevado, dislipidemia, diabetes tipo 2 , resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, cardiopatía coronaria, angina de pecho, insuficiencia cardiaca congestiva, accidente cerebrovascular, cálculos biliares, colecistitis y colelitiasis, gota, osteoartritis, apnea obstructiva del sueño y problemas respiratorios, algunos tipos de cáncer (tales como de endometrio, mama, próstata y colon), complicaciones del embarazo, mala salud reproductiva femenina (tales como irregularidades menstruales, infertilidad, ovulación irregular), problemas de control de la vejiga (tales como incontinencia de esfuerzo); nefrolitiasis por ácido úrico; trastornos psicológicos (tales como depresión, trastornos de la alimentación, imagen corporal distorsionada y baja autoestima). Finalmente, los pacientes con SIDA pueden desarrollar lipodistrofia o resistencia a la insulina en respuesta a terapias de combinación para el SIDA.
En otra realización, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para inhibir la adipogénesis o diferenciación de células grasas, sea in vitro o in vivo. Dichos métodos se pueden usar para tratar o prevenir la obesidad.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para reducir el apetito y/o aumentar la saciedad, produciendo así la pérdida de peso o evitando la ganancia de peso. Un sujeto que necesite dicho tratamiento puede ser un sujeto que tiene sobrepeso, es obeso o un sujeto que es probable que vaya a tener sobrepeso o se vuelva obeso. El método descrito puede comprender administrar una dosis diaria, o en días alternos, o una vez por semana, p. ej., en forma de una píldora, a un sujeto. La dosis puede ser una “dosis que reduce el apetito”.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar como una terapia de combinación para tratar o prevenir el aumento de peso o la obesidad. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina en combinación con uno o más agentes antiobesidad. Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar para reducir el aumento de peso inducido por fármacos. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina como una terapia de combinación con medicamentos que pueden estimular el apetito o producir aumento de peso, en particular, aumento de peso de debido a factores distintos de la retención de agua.
Trastornos metabólicos/Diabetes
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar o prevenir un trastorno metabólico, tal como la resistencia a la insulina, un estado prediabético, diabetes de tipo II y/o complicaciones de la misma. La administración de un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina puede aumentar la sensibilidad a la insulina y/o disminuir los niveles de insulina en un sujeto. Un sujeto que necesite dicho tratamiento puede ser un sujeto que tiene resistencia a la insulina u otros síntomas precursores de la diabetes de tipo II, que tiene diabetes de tipo II o que es probable que desarrolle cualquiera de estas afecciones. Por ejemplo, el sujeto puede ser un sujeto que tiene resistencia a la insulina, p. ej., que tiene niveles elevados en la circulación de insulina y/o afecciones asociadas, tales como hiperlipidemia, dislipogénesis, hipercolesterolemia, tolerancia a la glucosa alterada, nivel elevado de glucosa en la sangre, otras manifestaciones del síndrome X, hipertensión, aterosclerosis y lipodistrofia.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar como una terapia de combinación para tratar o prevenir un trastorno metabólico. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina en combinación con uno o más agentes antidiabéticos. Enfermedades inflamatorias
En otros aspectos, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con la inflamación. Los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar antes del inicio de, en o después del inicio de la inflamación. Cuando se usan de forma profiláctica, los compuestos se proporcionan preferiblemente con antelación a cualquier respuesta o síntoma inflamatorio. La administración de los compuestos puede prevenir o atenuar las respuestas o síntomas inflamatorios.
En otra realización, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar o prevenir alergias y afecciones respiratorias, que incluyen asma, bronquitis, fibrosis pulmonar, rinitis alérgica, toxicidad por oxígeno, enfisema, bronquitis crónica, síndrome agudo de dificultad respiratoria y cualquier enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Los compuestos se pueden usar para tratar la infección por hepatitis crónica, que incluye la hepatitis B y hepatitis C.
Adicionalmente, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar enfermedades autoinmunitarias y/o la inflamación asociada con enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis, incluyendo la artritis reumatoide, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante, así como enfermedades autoinmunitarias de órganos y tejidos (p. ej., síndrome de Rayanaud), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, mucositis oral, esclerodermia, miastenia grave, rechazo de trasplante, choque séptico por endotoxinas, septicemia, psoriasis, eczema, dermatitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, uveítis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Addison, enfermedad poliglandular autoinmune (también conocida como síndrome poliglandular autoinmune) y enfermedad de Grave.
En algunas realizaciones, uno o más compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden tomar solos o en combinación con otros compuestos útiles para tratar o prevenir la inflamación.
Rubefacción
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para reducir la incidencia o gravedad de rubefacción y/o sofocos que son síntomas de un trastorno. Por ejemplo, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina, solos o en combinación con otros agentes, para usar para reducir la incidencia o gravedad de rubefacción y/o sofocos en pacientes con cáncer. En otras realizaciones, el método proporciona el uso de compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina para reducir la incidencia o gravedad de rubefacción y/o sofocos en mujeres menopáusicas y postmenopáusicas.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar como una terapia para reducir la incidencia o gravedad de la rubefacción y/o sofocos que son efectos secundarios de otra terapia de fármacos, p. ej., rubefacción inducida por fármaco. Se describe un método para tratar y/o prevenir la rubefacción inducida por fármaco comprende administrar a un paciente que lo necesite una formulación que comprende al menos un compuesto que induce rubefacción y al menos un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina. Se describe un método para tratar la rubefacción inducida por fármaco comprende administrar de manera separada uno o más compuestos que inducen rubefacción y uno o más compuestos moduladores de sirtuina, p. ej., en donde el compuesto modulador de sirtuina y el agente que induce rubefacción no se han formulado en las mismas composiciones. Cuando se usan formulaciones separadas, el compuesto modulador de sirtuina se puede administrar (1 ) en la misma administración del agente de inducción de rubefacción, (2 ) de manera intermitente con el agente de inducción de rubefacción, (3) escalonado en relación con la administración del agente de inducción de rubefacción, (4) antes de la administración del agente de inducción de rubefacción, (5) consecutivo a la administración del agente de inducción de rubefacción, y (6) varias de sus combinaciones. Los agentes de inducción de rubefacción de ejemplo incluyen, por ejemplo, niacina, raloxifeno, antidepresivos, antisicóticos, agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de canal de calcio y antibióticos.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para reducir efectos secundarios de rubefacción de un vasodilatador o un agente hipolipemiante (que incluyen agentes anticolesterolémicos y agentes lipotrópicos). Se describe en la presente memoria, que un compuesto modulador de sirtuina que aumenta el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se puede usar para reducir la rubefacción asociada con la administración de niacina.
Se describe un método para tratar y/o prevenir la hiperlipidemia con efectos secundarios de rubefacción reducidos. El método descrito implica el uso de compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina para reducir efectos secundarios de rubefacción del raloxifeno. El método descrito implica el uso de compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina para reducir los efectos secundarios de rubefacción de agentes antidepresivos o antipsicóticos. Por ejemplo, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel de y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar junto (administrado por separado o juntos) con un inhibidor de recaptación de serotonina, o un antagonista del receptor 5HT2.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar como parte de un tratamiento con un inhibidor de recaptación de serotonina (SRI) para reducir la rubefacción. Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para reducir efectos secundarios de rubefacción de agentes quimioterapéuticos, tales como ciclofosfamida y tamoxifeno.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para reducir efectos secundarios de rubefacción de bloqueadores de canales de calcio, tales como amlodipina.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para reducir los efectos secundarios de rubefacción de antibióticos. Por ejemplo, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar en combinación con levofloxacina.
Trastornos oculares
Se describe un método para inhibir, reducir o tratar de otra manera el deterioro de la visión administrando a un paciente una dosis terapéutica de modulador de sirtuina seleccionado de un compuesto descrito en la presente memoria, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos o derivados metabólicos.
Se describe en la presente memoria, el deterioro de la visión causado por daño al nervio óptico o al sistema nervioso central. Se describe además, el daño al nervio óptico causado por presión intraocular alta, tal como la creada por el glaucoma. En otras realizaciones particulares, el daño del nervio óptico es causado por hinchazón del nervio, que está asociado con frecuencia con una infección o una respuesta inmunitaria (p. ej., autoinmunitaria) tal como en la neuritis óptica.
Se describe en la presente memoria, que el deterioro de la visión es causado por daño en la retina. Se describe en la presente memoria, el daño en la retina causado por alteraciones en el flujo sanguíneo al ojo (p. ej., arteriosclerosis, vasculitis). También se describe, el daño en la retina causado por alteración de la mácula (por ejemplo, degeneración macular exudativa o no exudativa).
Las enfermedades retinianas de ejemplo incluyen degeneración macular exudativa asociada a la edad, degeneración macular no exudativa asociada a la edad, degeneración macular asociada a la edad por prótesis electrónica retiniana y por trasplante de RPE, epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal aguda, necrosis retiniana aguda, enfermedad de Best, oclusión de rama arterial de la retina ramificada, oclusión de rama venosa de la retina, retinopatías autoinmunes relacionadas y asociadas con cáncer, oclusión de arteria central de la retina, oclusión de vena central de la retina, coriorretinopatía serosa central, enfermedad de Eales, membrana epimacular, degeneración reticular, macroaneurisma, edema macular diabético, edema macular de Irving-Gass, agujero macular, membranas neovasculares subretinianas, neurorretinitis subaguda unilateral difusa, edema macular cistoide no pseudofáquico, síndrome de presunta histoplasmosis ocular, desprendimiento de retina exudativo, desprendimiento de retina postoperatorio, desprendimiento de retina proliferativo, desprendimiento de retina regmatógeno, desprendimiento de retina traccional, retinitis pigmentaria, retinitis por CMV, retinoblastoma, retinopatía de prematuridad, retinopatía de Birdshot, retinopatía diabética de fondo, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía en hemoglobinopatías, retinopatía de Purtscher, retinopatía de Valsalva, retinosquisis juvenil, retinosquisis senil, síndrome de Terson y síndromes de puntos blancos.
Otras enfermedades de ejemplo incluyen infecciones bacterianas oculares (p. ej., conjuntivitis, queratitis, tuberculosis, sífilis, gonorrea), infecciones víricas (p. ej., virus del herpes simple ocular, virus de la varicela zóster, retinitis por citomegalovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH)), así como necrosis retiniana externa progresiva secundaria al VIH u otras enfermedades oculares asociadas con VIH y asociadas con otras inmunodeficiencias. Además, las enfermedades oculares incluyen infecciones fúngicas (p. ej., coroiditis por Cándida, histoplasmosis), infecciones por protozoos (p. ej., toxoplasmosis) y otras tales como toxocariasis ocular y sarcoidosis.
Se describe un método para inhibir, reducir o tratar el deterioro de la visión en un sujeto que se somete a tratamiento con un fármaco quimioterapéutico (p. ej., un fármaco neurotóxico, un fármaco que aumenta la presión intraocular, tal como un esteroide), administrando al sujeto que necesite dicho tratamiento una dosis terapéutica de un modulador de sirtuina descrito en la presente memoria.
Se describe un método para inhibir, reducir o tratar el deterioro de la visión en un sujeto que se somete a cirugía, que incluye cirugías oculares u otras realizadas en la posición boca abajo tal como cirugía de médula espinal, mediante la administración al sujeto que necesita dicho tratamiento de una dosis terapéutica de un modulador de sirtuina descrito en la presente memoria. Las cirugías oculares incluyen cataratas, iridotomía y reemplazo de lentes. Se describe en la presente memoria el tratamiento, que incluye inhibición y tratamiento profiláctico, de enfermedades oculares relacionadas con la edad que incluyen cataratas, ojo seco, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), daño de la retina y similares, mediante la administración al sujeto que necesita dicho tratamiento de una dosis terapéutica de un modulador de sirtuina descrito en la presente memoria.
Se describe en la presente memoria la prevención o tratamiento de daño al ojo causado por estrés, insulto químico o radiación, mediante la administración al sujeto que necesite dicho tratamiento de una dosis terapéutica de un modulador de sirtuina descrito en la presente memoria. La radiación o daño electromagnético al ojo puede incluir el causado por CRT o exposición a luz solar o UV.
Se describe en la presente memoria, que un régimen de combinación de fármacos puede incluir fármacos o compuestos para el tratamiento o prevención de trastornos oculares o afecciones secundarias asociadas con estas afecciones. Por lo tanto, un régimen de combinación de fármacos puede incluir uno o más activadores de sirtuina y uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento de un trastorno ocular.
Se describe en la presente memoria, que un modulador de sirtuina se puede administrar junto con una terapia para reducir la presión intraocular. Se describe en la presente memoria, que un modulador de sirtuina se puede administrar junto con una terapia para tratar y/o prevenir el glaucoma. Se describe en la presente memoria, que un modulador de sirtuina se puede administrar junto con una terapia para tratar y/o prevenir la neuritis óptica. Se describe en la presente memoria, que un modulador de sirtuina se puede administrar junto con una terapia para tratar y/o prevenir la retinopatía por CMV. Se describe en la presente memoria, que un modulador de sirtuina se puede administrar junto con una terapia para tratar y/o prevenir la esclerosis múltiple.
Enfermedades y trastornos asociados con mitocondria
Se describen métodos para tratar enfermedades o trastornos que se beneficiarían de una mayor actividad mitocondrial. Los métodos implican administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto modulador de sirtuina. La mayor actividad mitocondrial se refiere a aumentar la actividad de la mitocondria mientras se mantiene el número total de mitocondrias (p. ej., masa mitocondrial), aumentar el número de mitocondrias aumentando así la actividad mitocondrial (p. ej., mediante estimulación de biogénesis mitocondrial), o sus combinaciones. Las enfermedades y trastornos descritos que se beneficiarían de una mayor actividad mitocondrial incluyen enfermedades o trastornos asociados con la disfunción mitocondrial.
Los métodos descritos para tratar enfermedades o trastornos que se beneficiarían de una mayor actividad mitocondrial pueden comprender identificar a un sujeto que padece una disfunción mitocondrial. Los métodos descritos para diagnosticar una disfunción mitocondrial pueden implicar análisis genéticos moleculares, patológicos y/o bioquímicos. Las enfermedades y trastornos asociados con la disfunción mitocondrial incluyen enfermedades y trastornos en los que las deficiencias en la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial contribuyen al desarrollo de la fisiopatología de dichas enfermedades o trastornos en un mamífero. Las enfermedades y trastornos que se beneficiarían de una mayor actividad mitocondrial generalmente incluyen por ejemplo, enfermedades en las que la lesión oxidativa mediada por radicales libres conduce a degeneración de tejido, enfermedades en las que las células experimentan apoptosis de forma inadecuada, y enfermedades en que las células dejan de sufrir apoptosis.
Se describen métodos para tratar una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de una mayor actividad mitocondrial, que implican la administración a un sujeto que lo necesite, de uno o más compuestos moduladores de sirtuina en combinación con otro agente terapéutico tal como, por ejemplo, un agente útil para tratar la disfunción mitocondrial o un agente útil para reducir un síntoma asociado con una enfermedad o trastorno que implica disfunción mitocondrial.
Se describen métodos para tratar enfermedades o trastornos que se beneficiarían de una mayor actividad mitocondrial, administrado a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto modulador de sirtuina. Las enfermedades o los trastornos de ejemplo incluyen, por ejemplo, trastornos neuromusculares (p. ej., ataxia de Friedreich, distrofia muscular, esclerosis múltiple, etc.), trastornos de inestabilidad neuronal (p. ej., trastornos de convulsiones, migraña, etc.), retraso en el desarrollo, trastornos neurodegenerativos (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, etc.), isquemia, acidosis tubular renal, neurodegeneración y deterioro cognitivo asociados con la edad, fatiga por quimioterapia, menopausia asociada con la edad o inducida por quimioterapia o irregularidades del ciclo menstrual o de ovulación, miopatías mitocondriales, daño mitocondrial (p. ej., acumulación de calcio, excitotoxicidad, exposición a óxido nítrico, hipoxia, etc.), y la desregulación mitocondrial.
La distrofia muscular se refiere a una familia de enfermedades que implican deterioro de la estructura y función neuromuscular, frecuentemente produciendo atrofia del músculo esquelético y disfunción miocárdica, tal como distrofia muscular de Duchenne. Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina se pueden usar para reducir la velocidad de deterioro de las capacidades funcionales musculares y para mejorar el estado funcional muscular en pacientes con distrofia muscular.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina pueden ser útiles para el tratamiento de miopatías mitocondriales. Las miopatías mitocondriales varían de leve, debilidad de evolución lenta de los músculos extraoculares a grave, miopatías infantiles mortales y encefalomiopatías multisistémicas. Algunos síndromes se han definido, con algo de solapamiento entre ellos. Los síndromes establecidos que afectan el músculo incluyen oftalmolplejía externa progresiva, síndrome de Kearns-Sayre (con oftalmoplejia, retinopatía pigmentaria, defectos de conducción cardíaca, ataxia cerebelosa y sordera neurosensitiva), el síndrome MELAS (encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica, y episodios tipo accidente cerebrovascular), el síndrome de MERFF (epilepsia mioclónica y fibras rojas rasgadas), debilidad de distribución del anillo óseo y miopatía infantil (benigna o grave y mortal).
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina pueden ser útiles para el tratamiento de pacientes que sufren de daño tóxico mitocondrial, tal como, daño tóxico debido a la acumulación de calcio, excitotoxicidad, exposición a óxido nítrico, daño tóxico inducido por fármaco, o hipoxia.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con la desregulación mitocondrial.
Rendimiento muscular
Se describen métodos para potenciar el rendimiento muscular administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto modulador de sirtuina. Por ejemplo, los compuestos moduladores de sirtuina pueden ser útiles para mejorar la resistencia física (p. ej., capacidad de desempeñar una tarea física tal como ejercicio, trabajo físico, actividades deportivas, etc.), inhibir o retardar fatigas físicas, potenciar niveles de oxígeno en la sangre, potenciar la energía en individuos sanos, potenciar la capacidad y resistencia al trabajo, reducir la fatiga muscular, reducir el estrés, potenciar la función cardíaca y cardiovascular, mejorar la capacidad sexual, aumentar los niveles de ATP del músculo, y/o reducir el ácido láctico en la sangre. Los métodos descritos implican administrar una cantidad de compuesto modulador de sirtuina que aumentan la actividad mitocondrial, aumenta la biogénesis mitocondrial, y/o aumenta la masa mitocondrial.
El rendimiento deportivo se refiere a la capacidad de los músculos del atleta para trabajar al tomar parte en actividades deportivas. El rendimiento deportivo potenciado, fuerza, velocidad y resistencia se miden por un aumento de la fuerza de contracción muscular, aumento en amplitud de la contracción muscular, acortamiento del tiempo de reacción del músculo entre la estimulación y contracción. Atleta se refiere a un individuo que participa en deportes en cualquier nivel y que busca lograr un nivel mejorado de fuerza, velocidad y resistencia en su rendimiento, tal como, por ejemplo, culturistas, ciclistas, corredores de larga distancia, corredores de corta distancia, etc. El rendimiento deportivo mejorado se pone de manifiesto por la capacidad para superar la fatiga muscular, la capacidad para mantener la actividad durante periodos de tiempo más largos y tener un entrenamiento más efectivo. En el campo del rendimiento muscular del atleta, es deseable crear condiciones que permitan la competición o entrenamiento en niveles más altos de resistencia durante un periodo de tiempo prolongado.
Está contemplado que los métodos descritos en la presente descripción también serán efectivos en el tratamiento de afecciones patológicas relacionadas con los músculos, incluyendo sarcopenia aguda, por ejemplo, atrofia muscular y/o caquexia asociada con quemaduras, reposo en cama, inmovilización de extremidades, o cirugía mayor torácica, abdominal y/u ortopédica.
Se describe en la presente memoria, que la invención proporciona composiciones dietéticas nuevas que comprenden moduladores de sirtuina, un método descrito para su preparación, y un método descrito para usar las composiciones para mejorar el rendimiento deportivo. Por consiguiente, se proporcionan composiciones terapéuticas, alimentos y bebidas que tienen acciones de mejora de la resistencia física y/o inhibición de fatigas físicas para las personas implicadas en ejercicios definidos ampliamente que incluyen deportes que requieren resistencia y trabajos que requieren esfuerzos musculares repetidos. Dichas composiciones dietéticas pueden comprenden electrolitos, cafeína, vitaminas, carbohidratos, etc. adicionales.
Otros usos
Los compuestos moduladores de sirtuina descritos en la presente memoria que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para tratar o prevenir infecciones víricas (tales como infecciones por influenza, herpes o virus del papiloma) o como agentes antifúngicos. Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar como parte de una terapia de combinación de fármacos con otro agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades víricas. Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden administrar como parte de una terapia de combinación de fármacos con otro agente antifúngico.
Los sujetos que se pueden tratar como se describe en la presente memoria incluyen eucariotas, tales como mamíferos, p. ej., seres humanos, ovinos, bovinos, equinos, porcinos, caninos, felinos, primates no humanos, ratones y ratas. Las células que se pueden tratar incluyen células eucarióticas, p. ej., de un sujeto descrito anteriormente, o células de plantas, células de levaduras y células procariotas, p. ej., células bacterianas. Por ejemplo, los compuestos moduladores se pueden administrar a animales de granja para mejorar su capacidad de soportar condiciones de granja más prolongadas.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o la actividad de una proteína sirtuina también se pueden usar para aumentar el periodo de vida, resistencia al estrés, y la resistencia a la apoptosis en plantas. Se describe en la presente memoria, que un compuesto se aplica a plantas, p. ej., de forma periódica, o a hongos. Se describe en la presente memoria, que las plantas se modifican genéticamente para producir un compuesto. Se describe en la presente memoria, que las plantas y frutos se tratan con un compuesto antes de la selección y transporte para aumentar la resistencia al daño durante el transporte. Las semillas de plantas también se pueden poner en contacto con compuestos descritos en la presente memoria, p. ej., para conservarlos.
Se describe en la presente memoria, que los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden usar para modular el periodo de vida en células de levadura. Las situaciones en las cuales puede ser deseable extender el periodo de vida de las células de levadura incluyen cualquier procedimiento en el cual se usa levadura, p. ej., al producir cerveza, yogurt y artículos horneados, p. ej., pan. El uso de levaduras que tienen un periodo de vida extendido puede dar como resultado el uso de menos levadura o que la levadura puede ser activa durante periodos de tiempo más largos. Las levaduras u otras células de mamífero usadas para producir proteínas de manera recombinante también se pueden tratar como se describe en la presente memoria.
Los compuestos moduladores de sirtuina descritos en la presente memoria que aumentan el nivel y/o la actividad de una proteína sirtuina también se pueden usar para aumentar el periodo de vida, resistencia al estrés y resistencia a la apoptosis en insectos. Se describe en la presente memoria, que los compuestos se pueden aplicar a insectos útiles, p. ej., abejas y otros insectos que están implicados en la polinización de plantas. Se describe en la presente memoria, que un compuesto se aplicaría a abejas implicadas en la producción de miel. Generalmente, los métodos descritos en la presente memoria se pueden aplicar a cualquier organismo, p. ej., eucariota, que puede tener importancia comercial. Por ejemplo, se pueden aplicar a peces (acuicultura) y pájaros (p. ej., pollos y aves de corral). También se pueden usar dosis más altas de compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina como un plaguicida al interferir con la regulación de genes inactivados y la regulación de apoptosis durante el desarrollo. En esta descripción, un compuesto se puede aplicar a plantas usando un método conocido en la técnica que asegura que el compuesto está biodisponible para larvas de insectos, y no para plantas.
Al menos en vista de la conexión entre la reproducción y longevidad, los compuestos moduladores de sirtuina que aumentan el nivel y/o actividad de una proteína sirtuina se pueden aplicar para afectar a la reproducción de organismos tales como insectos, animales y microorganismos.
4. Ensayos
Otros métodos más contemplados en la presente memoria incluyen métodos de cribado para identificar compuestos o agentes que modulan sirtuinas. Un agente puede ser un ácido nucleico, tal como un aptámero. Los ensayos se pueden realizar en un formato basado en células o exento de células. Por ejemplo, un ensayo puede comprender incubar (o poner en contacto) una sirtuina con un agente de ensayo en condiciones en las que una sirtuina puede ser modulada por un agente conocido para modular la sirtuina, y vigilar o determinar el nivel de modulación de la sirtuina en la presencia del agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo. El nivel de modulación de una sirtuina se puede determinar determinando su capacidad para desacetilar un sustrato. Los sustratos de ejemplo son péptidos acetilados que se pueden obtener de BIOMOL (Plymout Meeting, PA). Los sustratos preferidos incluyen péptidos de p53, tales como los que comprenden un K382 acetilado. Un sustrato particularmente preferido es el Fluor de Lys-SIRT1 (BIOMOL), es decir, el péptido acetilado Arg-His-Lys-Lys. Otros sustratos son péptidos de histonas humanas H3 y H4 o un aminoácido acetilado. Los sustratos pueden ser fluorogénicos. La sirtuina puede ser SIRT1, Sir2, SIRT3, o una parte de las mismas. Por ejemplo, SIRT1 recombinante se puede obtener de BIOMOL. La reacción se puede llevar a cabo durante aproximadamente 30 minutos y detener, por ejemplo, con nicotinamida. El ensayo de actividad fluorescente HDAC/kit de descubrimiento de fármaco (AK-500, BIOm Ol , Research Laboratories) se puede usar para determinar el nivel de acetilación. Se describen ensayos similares en Bitterman et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:45099. El nivel de modulación de la sirtuina en un ensayo se puede comparar con el nivel de modulación de la sirtuina en la presencia de uno o más (de manera separada o simultánea) compuestos descritos en la presente memoria, que pueden servir como controles positivos o negativos. Las sirtuinas para usar en ensayos pueden ser proteínas de sirtuina de longitud completa o partes de las mismas. Ya que se ha mostrado en la presente memoria que los compuestos activadores parecen interactuar con el extremo N de SIRT1, las proteínas para usar en los ensayos incluyen partes N-terminales de sirtuinas, por ejemplo, aproximadamente los aminoácidos 1-176 o 1-255 de SIRT1; aproximadamente los aminoácidos 1-174 o 1-252 de Sir2.
Se describe en la presente memoria, un ensayo de cribado comprende (i) poner en contacto una sirtuina con un agente de ensayo y un sustrato acetilado en condiciones apropiadas para que la sirtuina desacetile el sustrato en la ausencia del agente de ensayo; y (ii) determinar el nivel de acetilación del sustrato, en donde un nivel inferior de acetilación del sustrato en presencia del agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo indica que el agente de ensayo estimula la desacetilación por la sirtuina, mientras que un nivel más alto de acetilación del sustrato en presencia del agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo indica que el agente de ensayo inhibe la desacetilación por la sirtuina.
Se describe en la presente memoria, que el ensayo de cribado puede detectar la formación de un producto de 2'/3'-O-acetil-ADP-ribosa de desacetilación dependiente de NAD mediada por sirtuina. Este producto de O-acetil-ADP-ribosa se forma en cantidades equimolares con el producto peptídico desacetilado de la reacción de desacetilación de sirtuina. Por consiguiente, el ensayo de cribado puede incluir (i) poner en contacto una sirtuina con un agente de ensayo y un sustrato acetilado en condiciones apropiadas para que la sirtuina desacetile el sustrato en la ausencia del agente de ensayo; y (ii) determinar la cantidad de formación de O-acetil-ADP-ribosa, en donde un aumento de formación de O-acetil-ADP-ribosa en presencia del agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo indica que el agente de ensayo estimula la desacetilación por la sirtuina, mientras que una disminución de formación de O-acetil-ADP-ribosa en presencia del agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo indica que el agente de ensayo inhibe la desacetilación por la sirtuina.
Los métodos descritos en la presente memoria para identificar un agente que modula, p. ej., estimula, sirtuinas in vivo pueden comprender (i) poner en contacto una célula con un agente de ensayo y un sustrato que es capaz de entrar en una célula en presencia de un inhibidor de HDAC de clase I y clase II en condiciones apropiadas para que la sirtuina desacetile el sustrato en ausencia del agente de ensayo; y (ii) determinar el nivel de acetilación del sustrato, en donde un nivel inferior de acetilación del sustrato en presencia de un agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo indica que el agente de ensayo estimula la desacetilación por la sirtuina, mientras que un nivel más alto de acetilación del sustrato en presencia del agente de ensayo en relación con la ausencia del agente de ensayo indica que el agente de ensayo inhibe la desacetilación por la sirtuina. Un sustrato preferido es un péptido acetilado, que es también preferiblemente fluorogénico, como se describe además en la presente memoria. El método además puede comprender lisar las células para determinar el nivel de acetilación del sustrato. Los sustratos se pueden añadir a células en una concentración que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 mM, preferiblemente de aproximadamente 10 pM a 1 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 100 pM a 1 mM, tal como aproximadamente 200 pM. Un sustrato descrito es una lisina acetilada, p. ej., e-acetil-lisina (Fluor de Lys, FdL) o Fluor de Lys-SIRT1. Un inhibidor de HDAC de clase I y clase II descrito es la tricostatina A (TSA) que se puede usar en concentraciones que varían de aproximadamente 0,01 a 100 pM, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 pM, tal como 1 pM. La incubación de células con el compuesto de ensayo y el sustrato se puede llevar a cabo durante aproximadamente 10 minutos a 5 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1-3 horas. Puesto que la TSA inhibe todas las HDAC de clase I y clase II, y que ciertos sustratos, p. ej., Fluor de Lys, es un sustrato malo para SIRT2 y todavía menos un sustrato para SIRT3-7, dicho ensayo se puede usar para identificar moduladores de SIRT1 in vivo.
5. Composiciones farmacéuticas
Los compuestos descritos en la presente memoria se pueden formular de una manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológica o farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, los compuestos y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables se pueden formular para la administración, por ejemplo, por inyección (p. ej., SC, IM, IP), inhalación o insuflación (o por la boca o la nariz) o administración oral, bucal, sublingual, transdérmica, nasal, parenteral o rectal. En algunas realizaciones, un compuesto se puede administrar de manera local, en el sitio donde las células objetivo están presentes, es decir, en un tejido, órgano o fluido específico (p. ej., sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.).
Los compuestos se pueden formular para una variedad de modos de administración, que incluyen la administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y las formulaciones se pueden encontrar en general en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Para administración parenteral, se prefiere la inyección, que incluye intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los compuestos se pueden formular en soluciones líquidas, preferiblemente en tampones compatibles fisiológicamente tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos se pueden formular en forma sólida y volver a disolver o suspender inmediatamente antes de usar. Las formas liofilizadas también están incluidas.
Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (p. ej., almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato sódico). Los comprimidos se pueden recubrir por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tener la forma de, p. ej., soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usar. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (p. ej., aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p. ej., phidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampones, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes según sea adecuado. Las preparaciones para administración oral se pueden formular de manera adecuada para proporcionar la liberación controlada del compuesto activo.
Para administración por inhalación (p. ej., suministro pulmonar), los compuestos se pueden suministrar de manera conveniente en forma de una presentación de pulverización en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina, para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyección, p. ej., inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, p. ej., en ampollas o en envases de dosis múltiples, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersión. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constituir con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril exenta de pirógenos, antes de usar.
Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tal como supositorios o enemas de retención, p. ej., que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de actuación prolongada se pueden administrar mediante implante (p. ej. de manera subcutáneo o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados bastante solubles, por ejemplo, como una sal bastante soluble. Las fórmulas de liberación controlada también incluyen parches.
En algunas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria se pueden formular para suministrar al sistema nervioso central (SNC) (revisado en Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)). Los procedimientos convencionales para el suministro de fármacos al SNC incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (p. ej., inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (p. ej., producción de una proteína de fusión quimérica que comprende un péptido de transporte que tiene una afinidad por una molécula de la superficie celular endotelial en combinación con un agente que es incapaz de cruzar la BHE por sí mismo) en un intento de explotar una de las rutas de transporte endógenas de la BHE; procedimientos farmacológicos diseñados para aumentar la solubilidad en lípidos de un agente (p. ej., conjugación de agentes hidrosolubles a vehículos lipídicos o de colesterol); y la alteración transitoria de la integridad de la BHE por alteración hiperosmótica (resultado de la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o el uso de un agente biológicamente activo como un péptido de angiotensina).
Los liposomas son otro sistema de suministro de fármaco que es fácilmente inyectable. Por consiguiente, en el método descrito, los compuestos activos también se pueden administrar en forma de un sistema de suministro de liposomas. Los liposomas son bien conocidos para un experto en la técnica. Los liposomas se pueden formular a partir de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina de fosfatidilcolinas. Los liposomas que se pueden usar para el método descrito abarcan todos los tipos de liposomas que incluyen, pero no se limitan a, vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares.
Otra manera de producir una formulación, en particular una solución, de un compuesto descrito en la presente memoria, es mediante el uso de ciclodextrina. Por ciclodextrina se entiende a-, p-, o Y-ciclodextrina. Las ciclodextrinas se describen en detalle en Pitha et al., patente de EE.UU. n° 4.727.064. Las ciclodextrinas son oligómeros cíclicos de glucosa; estos compuestos forman complejos de inclusión con cualquier fármaco cuya molécula puede ajustar en las cavidades que buscan lipófilos de la molécula de ciclodextrina.
Las formas farmacéuticas de disgregación o disolución rápida son útiles para la absorción rápida, en particular absorción bucal y sublingual, de agentes farmacéuticamente activos. Las formas farmacéuticas de fundido rápido son beneficiosas para pacientes, tales como pacientes de edad avanzada y pediátricos, que tienen dificultad para tragar formas farmacéuticas sólidas típicas, tal como comprimidos oblongos y comprimidos. Adicionalmente, las formas farmacéuticas de fundido rápido salvan inconvenientes asociados con, por ejemplo, formas farmacéuticas masticables, en donde el periodo de tiempo que permanece un agente activo en la boca de un paciente juega una función importante para determinar la cantidad de enmascaramiento del sabor y el grado al cual un paciente puede oponerse a la aspereza en la garganta del agente activo.
Las composiciones farmacéuticas (incluyendo preparaciones cosméticas) pueden comprender de aproximadamente 0,00001 a 100%, tal como de 0,001 a 10% o de 0,1% a 5% en peso de uno o más compuestos descritos en la presente memoria. En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende: (i) de 0,05 a 1000 mg de los compuestos de la invención, o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y (ii) de 0,1 a 2 gramos de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria se incorpora en una formulación tópica que contiene un vehículo tópico que en general es adecuado para la administración tópica de fármaco y que comprende cualquier material conocido en la técnica. El vehículo tópico se puede seleccionar para de modo que proporcione la composición en la forma deseada, p. ej., como una pomada, loción, crema, microemulsión, gel, aceite, solución, o similar, y puede estar compuesto de un material que existe naturalmente o de origen sintético. Es preferible que el vehículo seleccionado no afecte adversamente al agente activo u otros componentes de la formulación tópica. Los ejemplos de vehículos tópicos adecuados para usar en la presente memoria incluyen agua, alcoholes y otros disolventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras, y similares.
Las formulaciones pueden ser pomadas, lociones, cremas, microemulsiones y geles incoloros, inodoros.
Los compuestos se pueden incorporar en pomadas, que generalmente son preparaciones semisólidas que típicamente se basan en vaselina u otros derivados de petróleo. La base específica de la pomada que se va a usar, como apreciarán los expertos en la técnica, es una que proporcionará el suministro óptimo del fármaco, y preferiblemente proporcionará otras características deseadas también, p. ej., propiedad emoliente o similares. Como con otros excipientes o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizante. Los compuestos se pueden incorporar en lociones, que generalmente son preparaciones que se van a aplicar en la superficie de la piel sin fricción, y son típicamente preparaciones líquidas o semilíquidas en las que partículas sólidas, que incluyen el agente activo, están presentes en una base de agua o alcohol. Las lociones son normalmente suspensiones de sólidos, y pueden comprender una emulsión aceitosa líquida del tipo aceite en agua. Los compuestos se pueden incorporar en cremas, que generalmente son emulsiones líquidas viscosas o semisólidas, ya sea de aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son lavables en agua, y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa generalmente está compuesta de vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico; la fase acuosa normalmente, aunque no necesariamente, supera la fase oleosa en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulación de crema, como se explica en Remington's, véase antes, es generalmente un agente tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero.
Los compuestos se pueden incorporar en microemulsiones, que generalmente son dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles, tales como aceite y agua, estabilizados por una película interfacial de moléculas de tensioactivo '(Enciclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volumen 9).
Los compuestos se pueden incorporar en formulaciones de gel, que generalmente son sistemas semisólidos que consisten en suspensiones compuestas de partículas inorgánicas pequeñas (sistemas de dos fases) o moléculas orgánicas grandes distribuidas de manera sustancialmente uniforme por un vehículo líquido (geles de una fase). Aunque los geles habitualmente usan vehículo líquido acuoso, se pueden usar también alcoholes y aceites como el vehículo líquido.
También se pueden incluir en las formulaciones otros agentes activos, p. ej., otros agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, antibióticos, vitaminas, antioxidantes, y agentes bloqueadores solares encontrados habitualmente en formulaciones de protectores solares que incluyen, pero no se limitan a antranilatos, benzofenonas (en particular benzofenona-3), derivados de alcanfor, cinamatos (p. ej., metoxicinamato de octilo), dibenzoilmetanos (p. ej., butil-metoxidibenzoil-metano), ácido p-aminobenzoico (PABA) y sus derivados, y salicilatos (p. ej., salicilato de octilo).
En algunas formulaciones tópicas, el agente activo está presente en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,25% en peso a 75% en peso de la formulación, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,25% en peso a 30% en peso de la formulación, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5% en peso a 15% en peso de la formulación, y lo más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1,0% en peso a 10% en peso de la formulación.
Las afecciones del ojo se pueden tratar o prevenir mediante, p. ej., inyección sistémica, tópica, intraocular de un compuesto, o por inserción de un dispositivo de liberación sostenida, que libera un compuesto. Un compuesto se puede suministrar en un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable, de manera que el compuesto se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un período de tiempo suficiente para permitir que el compuesto penetre en las regiones de la córnea e internas del ojo, como por ejemplo, la cámara anterior, cámara posterior, cuerpo vítreo, humor acuoso, humor vítreo, córnea, iris/ciliar, cristalino, coroides/retina y esclerótica. El vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, una pomada, aceite vegetal o un material de encapsulación. Alternativamente, los compuestos de la invención se pueden inyectar directamente en el humor vítreo y acuoso. En una alternativa adicional, los compuestos se pueden administrar sistémicamente, tal como por infusión o inyección intravenosa, para el tratamiento del ojo.
Los compuestos descritos en la presente memoria se pueden almacenar en ambiente exento de oxígeno. Por ejemplo, una composición se puede preparar en una cápsula hermética al aire para administración oral, tal como Capsugel de Pfizer, Inc.
Se pueden administrar células, p. ej., tratadas ex vivo con un compuesto como se describe en la presente memoria, de acuerdo con métodos para la administración de un injerto a un sujeto, que se pueden acompañar, p. ej. por la administración de un fármaco inmunosupresor, p. ej., ciclosporina A. Para principios generales en formulación medicinal, se remite al lector a Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, gen Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; y Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.
La toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales. La LD50 es la dosis letal para 50% de la población. La ED50 es la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población. La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos (LD50/ED50) es el índice terapéutico. Los compuestos que presentan índices terapéuticos grandes son preferidos. Aunque se pueden usar compuestos que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no infectadas, y para así reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos puede caer dentro del intervalo de concentraciones en la circulación que incluye la ED50 con poca o sin toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación usada y la vía de administración usada. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva se puede calcular inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos de animales para lograr un intervalo de concentración plasmática en la circulación que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) determinada en el cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar de manera más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles plasmáticos se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.
6. Kits
También se proporcionan en la presente memoria kits, p. ej., kits para propósitos terapéuticos o kits para modular el periodo de vida de las células o modular la apoptosis. Un kit puede comprender uno o más compuestos como se describen en la presente memoria, p. ej., en dosis pre-medidas. Un kit puede comprender opcionalmente dispositivos para poner en contacto células con los compuestos e instrucciones de uso. Los dispositivos incluyen jeringas, endoprótesis y otros dispositivos para introducir un compuesto en un sujeto (p. ej., el vaso sanguíneo de un sujeto) o aplicarlo a la piel de un sujeto.
Se describe en la presente memoria, que la invención proporciona una composición de materia que comprende un compuesto de esta invención y otro agente terapéutico (el mismo usado en terapias de combinación y composiciones de combinación) en formas farmacéuticas separadas, pero asociadas entre sí. La expresión “asociadas entre sí” como se usa en la presente memoria significa que las formas farmacéuticas separadas se envasan juntas o se unen de otra manera una con otra de modo que es fácilmente evidente que las formas farmacéuticas separadas están dirigidas a ser vendidas y administradas como parte del mismo régimen. El compuesto y el otro agente preferiblemente se envasan juntos en un envase blíster u otro envase de múltiples cámaras, o como recipientes sellados por separado, conectados (como bolsas de aluminio o similares) que puede separar el usuario (por ejemplo, rompiendo por las líneas punteadas entre los dos recipientes).
Se describe en la presente memoria, que la invención proporciona un kit que comprende en envases separados, a) un compuesto de esta invención; y b) otro agente terapéutico tal como los descritos en otra parte en la memoria descriptiva.
La práctica de los métodos presentes empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullís et al. patente de EE.UU. n° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Ejemplos
Habiéndose descrito ahora en general la invención, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen solamente para propósitos de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente descripción, y no pretenden limitar la invención en ninguna manera.
Ejemplo 1. Preparación de (4S)-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de dimetilo:
Figure imgf000043_0001
En un matraz de 2 litros equipado con un termómetro, un refrigerante de reflujo y un agitador mecánico, se añadió (100 g, 0,52 mol) de 2,6-dicloro-3-nitropiridina, (205 g, 1,04 mol) de hidrocloruro del éster dimetílico del ácido (S)-aspártico, (174 g, 2,07 mol) de NaHCO3 y 1 litro de tetrahidrofurano. La reacción se agitó a 40°C durante 16 h, y se vigiló la desaparición de la 2,6-dicloropiridina por HPLC. Después de completarse la reacción, los sólidos se separaron por filtración y se lavaron con acetato de etilo (3 x 300 ml). El filtrado y lavados combinados se secaron hasta sequedad, y el residuo se recogió en 1 litro de acetato de etilo. La disolución se agitó con 200 g de carbón a temperatura ambiente durante 2 h, y después el carbón se separó por filtración y se lavó con acetato de etilo adicional (3 x 200 ml). El filtrado y lavados combinados se concentraron a vacío para dar el producto bruto (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de dimetilo (180 g) en forma de un aceite amarillo. Este se usó en la siguiente etapa sin más purificación. MS (ESI) calculado para CnH12ClN3O6: 317,0; encontrado: 318,0 (M+H)+. Se podía usa un procedimiento análogo para preparar el (R)- 2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de dimetilo partiendo del hidrocloruro del éster dimetílico del ácido (R)-aspártico.
Etapa 2. Síntesis de (S)-2-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de metilo:
Figure imgf000043_0002
Un matraz de tres bocas, de 5 litros, equipado con un termómetro, un refrigerante de reflujo y un agitador mecánico se cargó con el (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de dimetilo bruto (180 g, 0,52 mol), hierro en polvo (146 g, 2,59 mol), 2 litros de 2-propanol, y 700 ml de agua. La mezcla se agitó a 40°C, se añadió ácido acético (15,5 g, 0,259 mmol) a una velocidad suficiente para mantener la temperatura interior por debajo de 70°C. La reacción se agitó a 70°C durante 30 min, la HPLC indicaba que la mezcla se había completado. La mezcla se enfrió a 40°C, después se añadió Na2CO3 (165 g, 1,55 mol), y la mezcla se agitó durante 1 h. Los sólidos se separaron por filtración, después los sólidos se lavaron con tetrahidrofurano (3 x 500 ml). El filtrado y los lavados combinados se concentraron a vacío, después el residuo se agitó en 1 litro de etanol durante 12 h. El sólido se filtró y se lavó con etanol frío. Este se secó a vacío para dar el (S)-2-(6-doro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de metilo (91 g, 68%) en forma de un sólido blanquecino. MS (ESI) calculado para C10H10CIN3O3: 255,0; encontrado: 256,0 (M+H)+.
Se podía usa un procedimiento análogo para preparar el (R)-2-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de metilo partiendo del (R)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de dimetilo.
Etapa 3. Síntesis de (S)-2-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol:
Figure imgf000044_0001
Un matraz de 3 bocas, de 5 litros, equipado con un agitador mecánico, un refrigerante de reflujo y una entrada de nitrógeno se cargó con LiAlH (60 g, 1,58 mol). El matraz se enfrió con un baño de hielo, y después se añadieron 500 ml de tetrahidrofurano. La mezcla agitada se enfrió a 0°C, se añadió una disolución de (S)-2-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de metilo (81 g, 0,32 mol) en 2 litros de tetrahidrofurano, mientras se mantenía la temperatura interior por debajo de 5°C. Después de completarse la adición, la reacción se calentó a reflujo durante 16 h, vigilando por HPLC la aparición del producto. La reducción del éster se produjo rápidamente, mientras que la reducción de la lactama requirió más tiempo para completar la reducción. La reacción se enfrió a 5°C, después se añadieron 60 ml de agua, manteniendo la temperatura interior por debajo de 10°C. Después de completarse la adición, la reacción se agitó durante 15 min. Después, se añadieron 60 ml de NaOH(ac.) al 15% (p/p), manteniendo la temperatura interior por debajo de 5°C. Después de completarse la adición, la reacción se agitó durante 15 min. Para completar el tratamiento, se añadieron 180 ml de agua, y después la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Los sólidos se filtraron y se lavaron con tetrahidrofurano (3 x 150 ml). El filtrado y los lavados se concentraron a vacío, después el residuo sólido se secó a vacío para dar el (S)-2-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol (55 g, 81%) en forma de un sólido marrón. MS (ESI) calculado para C9H12ClN3O: 213,1; encontrado: 214,1 (M+H)+.
Se podía usa un procedimiento análogo para preparar el (R)-2-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol partiendo del (R) 2-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de dimetilo.
Etapa 4. Síntesis de (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000044_0002
A una disolución de (S)-2-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol (50 g, 0,234 mol) en 500 ml de CH2Cl2 se añadió trietilamina (95 g, 0,936 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que era homogénea, después se enfrió a 0°C. Después, se añadió POCl3 (54 g, 0,351 mol), gota a gota, manteniendo la temperatura a 0°C 5. Se retiró el enfriamiento y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y se vigiló por HPLC la desaparición del alcohol de partida. Después de completarse la reacción, se añadieron 200 ml de NaHCO3(ac.) 1,2 M. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con CH2Cl2. Las capas de CH2Cl2 combinadas se extrajeron con HCl(ac.) 1 M (4 x 300 ml), y las capas de HCl combinadas se ajustaron a pH = 8 con NaHCO3(sat.). La mezcla resultante se extrajo con CH2Cl2 (4 x 300 ml), y las capas combinadas de CH2Ch se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se trataron con 50 g de carbón. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, se filtró a través del carbón, y el carbón se lavó con 200 ml adicionales de CH2Cl2. El filtrado y lavados combinados se concentraron hasta sequedad. El residuo sólido se secó a vacío para dar la (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (30 g, 66%) en forma de un sólido blanquecino cristalino. MS (ESI) calculado para C9H10ClN3: 195,1; encontrado: 196,1 (M+H)+.
Se podía usar un procedimiento análogo para preparar la (4R)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina partiendo del (R)-2-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol.
Etapa 5. Síntesis de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000044_0003
Una mezcla de (4S)-7-doro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (1,88 g, 9,6 mmol), ácido (3-trifluorometilfenil)borónico (2,4 g, 12,6 mmol), Pd(OAc)2 (0,228 g, 1,02 mmol), 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo (0,972 g, 2,04 mmol) y Cs2CO3 (6,6 g, 20,4 mmol) se disolvió en dioxano/-hO (50 ml, v/v = 9:1). La mezcla de reacción se calentó a 90°C durante la noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc (120 ml) y se lavó con agua. La capa acuosa se extrajo con EtOAc, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía en gel de sílice (gradiente de 0 a 100% de EtOAc en pentano) dio la (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina en forma de un sólido amarillo claro (2,26 g, 77%). MS (ESI) calculado para C16H14F3N3: 305,1; encontrado: 306 [M+H].
Se podía usar un procedimiento de acoplamiento análogo usando Pd(OAc)2 para preparar las (4S)-7-(3-sustituido fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepinas usando los ésteres o ácidos fenilborónico 3-sustituidos adecuados. Los enantiómeros análogos se podían hacer partiendo de (4R)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina.
Etapa 6. Síntesis de (4S)-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000045_0001
A una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (0,100 g, 0,328 mmol) and Et3N (160 |jl, 1,15 mmol) en THF (4 ml) se añadió trifosgeno (0,050 g, 0,164 mmol). Después de agitar durante 30 min a temperatura ambiente, se añadió 2-piridilamina (0,092 g, 0,983 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 60°C durante la noche, y la mezcla de reacción se concentró y el residuo se recogió en CH2Ch (30 ml). La disolución se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía en gel de sílice (gradiente de 0 a 100% de EtOAc en pentano) dio la (4S)-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,086 g, 62%). MS (ESl) calculado para C22H18F3N5O: 425,2; encontrado: 426,2 [M+H].
Se podía usar un procedimiento análogo para preparar una variedad de (4S)-7-(3-trifluorometilfenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo la 2-piridilamina por el resto de amina adecuado. Los enantiómeros análogos se podían hacer partiendo de la (4R)-7-(3-trifluorometilfenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida. De forma análoga, las (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-N-(aril)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamidas se podían preparar por este procedimiento general a partir de (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina y el resto de amina adecuado.
Ejemplo 2. Preparación de (4S)-N-fenetil-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000045_0002
A una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (0,100 g, 0,326 mmol) en CH2Ch (10 ml) se añadió piridina (0,0775 g, 0,980 mmol) y cloroformiato de fenilo (0,06117 g, 0,392 mmol) a 0°C. Después de 2 h, la mezcla se inactivó con solución acuosa saturada de Na2CO3, se extrajo con CH2Ch (3 x 75 ml), se lavó con salmuera, se secó con Na2SO3, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice ultrarrápida para dar el (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de fenilo (0,120 g, rendimiento 84%).
El (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de fenilo, 2-feniletanamina (0,057 g, 0,470 mmol) y DMAP (0,035 g, 0,282 mmol) en MeCN (3 ml) se agitaron a 80°C durante la noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se concentró y el residuo se purificó por prep-TLC eluyendo con CH2Ch:MeOH (10:1) para dar la (4S)-N-fenetil-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,020 g, rendimiento 18%). MS (ESI) calculado para C25H23F3N4O: 452,18; encontrado: 453 [M+H].
Ejemplo 3. Preparación de (4S)-N-(3-(3-aminoprop-1-in-1-il)-5-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000046_0001
Una suspensión de (4S)-N-(3-(3-aminoprop-1-in-1-il)-5-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (A, 0,050 g, 0,08 mmol) en HCl 4 N en dioxano (10 ml) se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentró a presión reducida y se trituró con CH3CN. El residuo se disolvió en CH3CN:H2O y se liofilizó para dar la (4S)-N-(3-(3-aminoprop-1-in-1-il)-5 -(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,030 g, rendimiento 70%). MS (ESI) calculado para C29H23F3N6O2: 544,18; encontrado: 545 [M+H].
Ejemplo 4. Preparación de (4S)-N-metil-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000046_0002
La (4S)-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,267 g, 0,63 mmol) se disolvió en dimetilacetamida y se añadió un equivalente de NaH (0,025 g, 60% en aceite). La disolución se agitó durante 5 minutos antes de la adición de Mel (39 ^l). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente, después se diluyó con acetato de etilo y se lavó secuencialmente con salmuera (2x), agua (2x) y salmuera. La disolución se secó (Na2SO4) y se concentró a presión reducida y se cargó en un cartucho de gel de sílice (eluyente acetato de etilo:pentano). La concentración de las fracciones puras proporcionó la (4S)-N-metil-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida pura. MS (ESI) calculado para C23H20F3N5O: 439,16; encontrado: 440,1 [M+H].
Ejemplo 5. Preparación de (4S)-N-(3-fluoropiridin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000046_0003
Se añadió gota a gota cloroformiato de fenilo (1,46 g, 9,37 mmol) a una disolución enfriada de 3-fluoropiridin-4-amina (1 g, 8,92 mmol) y piridina (0,95 ml, 11,16 mmol) en THF (10 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La purificación por prep-TLC dio el (3-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo en forma de un sólido amarillo.
Una mezcla de (3-fluoropiridin-4-il)carbamato de fenilo (72 mg, 0,31 mmol), (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (50 mg, 0,16 mmol) y DMAP (24 mg, 0,20 mmol) en 3 ml de acetonitrilo se agitó a 60°C durante la noche. La mezcla se cargó directamente en prep-TLC y se purificó usando acetato de etilo/éter de petróleo = 1:3—1:8 como eluyente para dar la (4S)-N-(3-fluoropiridin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (18 mg, 25%) en forma de un sólido blanco. Ms (ESI) calculado para C22H17F4N5O: 443,1; encontrado: 444,1 [M+H].
Este procedimiento general de formación de urea usando carbamatos de fenilo se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(aril)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo la (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina por la (4S)-7-(aril)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina adecuada y sustituyendo la 3-fluoropiridin-4-amina por el resto de amina adecuado. La serie de enantiómeros se podía hacer partiendo de las (4R)-7-(aril)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepinas.
Ejemplo 6. Preparación de (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000047_0001
A dioxano/H2O (10 ml/1 ml) se añadió (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (500 mg, 2,56 mmol), ácido (3-clorofenil)borónico (807 mg, 5,11 mmol), Pd(dppf)Cl2 (212 mg, 0,26 mmol) y Cs2CO3 (2,08 g, 6,4 mmol). La mezcla se agitó a 90°C durante la noche. La mezcla se concentró y se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 1/4) para dar la (4S)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (506 mg, 81%). MS (ESI) calculado para C15H14CIN3: 271,1, encontrado: 272,1 [M+H].
Se podía usar un procedimiento análogo para preparar la (4S)-7-(3-fluorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina o (4S)-7-(3-metoxifenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina usando el éster o ácido borónico adecuado. La serie de enantiómeros se podía hacer partiendo de la (4R)-7-(3-sustituido fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina adecuada. También se hicieron por este método usando el cloruro de partida adecuado: (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina, (9R)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina, 3-((9R)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)benzonitrilo, 3-((9S)-7.8.9.10- tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)benzonitrilo, (9S)-2-(5-(metilsulfonil)piridin-3-il)-7.8.9.10- tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina, (9S)-2-(5-(trifluorometil)piridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina, N,N-dimetil-3-((9R)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)anilina, N,N-dimetil-3-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)anilina, (9s)-2-(6-metilpiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina, (9S)-2-(piridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina, (9S)-2-(3-clorofenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000047_0002
Se añadió gota a gota cloroformiato de fenilo (6,99 ml, 55,79 mmol) a una disolución enfriada de 2-piridilamina (5 g, 53,10 mmol) y piridina (5,65 ml, 66,41 mmol) en THF (50 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió lentamente salmuera y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico y salmuera. Después la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró a presión reducida. El residuo se lavó con éter de petróleo para dar el piridin-2-ilcarbamato de fenilo (2,1 g, 18%).
Una mezcla de piridin-2-ilcarbamato de fenilo (66 mg,0,30 mmol), (4S)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (40 mg, 0,15 mmol) y DMAP (23 mg, 0,18 mmol) en 3 ml de acetonitrilo se agitó a 65°C durante la noche. El avance de la reacción se siguió por TLC y LC-MS. La mezcla se cargó directamente en prep-TLC usando acetato de etilo/éter de petróleo = 1:3—1:8 como eluyente, para dar la (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (28 mg, 48%) en forma de un sólido blanco. MS (ESI) calculado para C21H18CW5O: 391,1; encontrado: 392,1 [M+H].
Este procedimiento general de formación de urea usando carbamatos de fenilo se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(3-cloro, -fluoro o -metoxifenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando (4S)-7-(3-cloro, -fluoro o -metoxifenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina y el resto de amina adecuado. La serie de enantiómeros se podía hacer partiendo de la (4R)-7-(3-substituted fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina adecuada. De forma análoga, las (9S)-2-(5-fluoro- o cloropiridin-3-il)-N-(aril)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamidas se podían preparar por este procedimiento de formación de urea; véase el siguiente ejemplo para la preparación de las (9S)-2-(5-fluoro- o cloropiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocinas de partida.
El procedimiento análogo usado para preparar la (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (etapas 1 y 2 anteriores) se podía usar para hacer los siguientes compuestos partiendo de ésteres borónicos disponibles en el mercado:
Ejemplo 7. Preparación de (9S)-2-(5-cloropiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina:
Etapa 1. Síntesis de (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)glutarato de dimetilo:
Figure imgf000048_0001
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. A una mezcla de 40,0 g (207 mmol) de 2,6-dicloro-3-nitropiridina, 87,7 g (414 mmol) de hidrocloruro del éster dimetílico del ácido L-glutámico, y 69,6 g (829 mmol) de NaHCO3 se añadieron 600 ml de tetrahidrofurano. La mezcla se agitó a 40°C durante 24 h, vigilando la desaparición de la 2,6-dicloro-3-nitropiridina por HPLC. Después de completarse la reacción, los sólidos se separaron por filtración y se lavaron con acetato de etilo (3 x 100 ml). El filtrado y los lavados combinados se concentraron a vacío, después el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 10/1 (v/v) para dar 60 g (87%) del producto en forma de un sólido amarillo. MS (ESI) calculado para C^H^Cl^Oa: 331,0; encontrado: 332,1 (M+H)+.
Etapa 2. Síntesis de (S)-3-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propanoato de metilo:
Figure imgf000048_0002
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. A una mezcla de 20 g (60,2 mmol) de (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)pentanedioato de dimetilo y 16,8 g (301 mmol) de hierro en polvo se añadieron 375 ml de 2-propanol, y después 125 ml de agua. A la mezcla agitada se añadieron 5,5 g (90,3 mmol) de ácido acético, y después la reacción se agitó a reflujo durante 1 h. Se vigiló en la reacción la desaparición del material de partida por HPLC. Después de completarse la reacción, los sólidos se separaron por filtración y se lavaron con 2-propanol (3 x 50 ml). El filtrado y los lavados combinados se concentraron hasta sequedad, y después el residuo se secó a vacío para dar 15 g (81%) del producto en forma de un sólido amarillo oscuro. Este se usó sin más purificación en la siguiente etapa. MS (ESI) calculado para CnH^ClN3O3: 269,0; encontrado: 270,1.
Etapa 3. Síntesis de (S)-3-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propan-1-ol:
Figure imgf000049_0001
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. A una disolución de 17,78 g (133,3 mmol) de AlCl3 en 260 ml de tetrahidrofurano (THF) en atmósfera de N2 se añadieron 200 ml de LiAlH42 M en THF, gota a gota, a una velocidad para controlar la evolución de gas. Esto dio una disolución de alano (AlH3) en THF. En un matraz separado, se preparó una disolución de 26,0 g (96,4 mmol) de (S)-3-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propanoato de metilo en 460 ml de THF en atmósfera de N2, y después se enfrió con un baño de hielo seco/acetona. A esta se añadió la disolución de alano, gota a gota, con agitación, a lo largo de 2 h. Cuando se completó la adición, se retiró el baño de enfriamiento, y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 1,5 h, el análisis por LCMS mostró que la reacción se había completado. Después, se añadió lentamente una disolución de 17,6 g de NaOH en 65 ml de agua para controlar la evolución de H2. La suspensión se dejó agitar durante 18 h, y después los sólidos se separaron por filtración. El precipitado se lavó con acetato de etilo, y después el filtrado y los lavados se concentraron a vacío. El producto se purificó por cromatografía en gel de sílice, (columna preempaquetada de 330 g) eluyendo con CH2Cl2, seguido de un gradiente de 0 a 10% de metanol en CH2Cl2 para dar 15,21 g (69%) de un sólido amarillo-naranja. MS (ESI) calculado para C10H14CM3O: 227,1; encontrado: 228,1.
Etapa 4. Síntesis de (5R,9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina:
Figure imgf000049_0002
A 12 g (52,7 mmol) de (S)-3-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propan-1-ol se añadieron 160 ml de HBr(ac.) al 48% (p/p), y después la reacción se agitó a 90°C durante 18 h. La reacción se siguió por HPLC para la desaparición del alcohol de partida. Después de completarse la reacción, se enfrió a temperatura ambiente, después se añadió NaHCO3(ac.) 1,2 M hasta pH = 8. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml), después la fase orgánica se volvió a extraer con salmuera (1 x 100 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 2/1 (v/v) para dar 6,0 g (55%) del producto en forma de un sólido amarillo claro. MS (ESI) calculado para C10H12ClN3: 209,1; encontrado: 210 ,1.
Etapa 5. Síntesis de (9S)-2-cloro-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000049_0003
La (9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (1,3 g, 6,19 mmol, Nota: se sobreentiende la estereoquímica 5R), Boc2O (2,02 g, 9,28 mmol, 1,5 equiv.) y DMAP (1,51g, 12,38 mmol, 2,0 equiv.) en 5 ml de THF se agitó a 60°C durante 2 h. El avance de la reacción se siguió por TLS y LC/MS. Se añadió agua (30 ml) y la mezcla se extrajo con DCM (3x15 ml). Los extractos orgánicos se concentraron y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para dar el (9S)- 2-cloro-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo en forma de un sólido blanco (1,3 g, 92%). MS (ESI) calculado para C15H20ClN3O2: 309,1.
Etapa 6. Síntesis de (9S)-2-(5-cloropiridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000050_0001
A una mezcla desgasificada de dioxano/agua (10 ml/1 ml) se añadió (9S)-2-cloro-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo (650 mg, 2,096 mmol), ácido 5-cloropiridin-3-il)borónico (658 mg, 4,19 mmol), Pd(dppf)Ch (171 mg, 0,209 mmol) y Cs2CO3(2,04 g, 6,29 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 12 h, después se concentró y se purificó por cromatografía en columna (PE/EA = 3/1) para dar el (9S)-2-(5-cloropiridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo (600 mg, 63%). MS (ESI) calculado para C20H23ClN4O2: 386,2.
El (9S)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo se preparó por el mismo método, partiendo del ácido (5-fluoropiridin-3-il)borónico.
Etapa 7. Síntesis de (9S)-2-(5-cloropiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b] [1,4]diazocina:
Figure imgf000050_0002
Este resto se hizo usado el siguiente protocolo. El (9S)-2-(5-cloropiridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxilato de terc-butilo (600 mg, 1,55 mmol) se disolvió en HCl/MeOH (1 M, 20 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h, y después se concentró a vacío. Se añadieron agua (20 ml) y K2CO3 (3 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, y después se extrajo con DCM (3x15 ml) para dar la (9S)-2-(5-cloropiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (450 mg, cuant.). MS (ESI) calculado para C15H15ClN4: 286,1.
La (9S)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina se preparó por el mismo método.
Estos restos se usaron para preparar compuestos de urea por el procedimiento general de acoplamiento de urea descrito en el ejemplo previo.
Ejemplo 8. Preparación de (9S)-2-(5-metilpiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina:
Figure imgf000050_0003
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. A 1 ,4-dioxano/H2O desgasificado (20 ml, v/v=10/1) se añadieron (9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (600 mg, 2,87 mmol), ácido 5-metilpiridin-3-ilborónico (1,18 g, 3,0 equiv.), PCy3 (644 mg, 0,8 equiv.) y Pd2(dba)3 (330 mg, 0,2 equiv.). La mezcla se calentó a 110°C en un tubo sellado. Después de agitar 12 h a 110°C, la suspensión negra se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El concentrado se suspendió en EtOAc (300 ml), se lavó con agua (4x80 ml), salmuera (80 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El concentrado se purificó por columna (DCM/MeOH=10/1) para dar el producto en forma de un sólido marón claro (756 mg, 99%). MS (ESI) calculado para C16H18N4: 266,1; encontrado: 267,2 [M+H].
Estas condiciones también se usaron para preparar la (9S)-2-(4-metilpiridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina y 4-(3-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2 il)fenil)morfolina partiendo del ácido borónico adecuado.
Los restos resultantes se usaron para preparar compuestos de urea por el procedimiento general de acoplamiento de urea descrito antes.
Ejemplo 9. Preparación de (9S)-N-(piridazin-3-il)-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000051_0001
Este resto se preparó por el protocolo del carbamato análogo al descrito para la (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida, usando el carbamato de p-clorofenilo en lugar del carbamato de fenilo. MS (ESI) calculado para C20H19N7O: 373,2; encontrado: 374,3 [M+H].
Ejemplo 10. Preparación de (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(6-(2,3-dihidroxipropoxi)pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000051_0002
A la mezcla de 6-((2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi)pirazin-2-amina (83 mg, 0,37 mmol) y piridina (29 mg, 1,37 mmol) en 3 ml de THF se añadió trifosgeno (43 mg, 0,14 mmol). La mezcla anterior se agitó a 60°C durante 2 h. Después se añadió (4S)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (50 mg, 0,18 mmol) a la mezcla de reacción y se agitó durante la noche a 60°C. El producto bruto se purificó por prep-TLC para dar la urea intermedia en forma de un sólido amarillo. A una disolución de este material en THF (3 ml) se añadió HCl conc. y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió disolución saturada de NaHCO3 para ajustar el pH a 7-8. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc y la capa orgánica se lavó con salmuera. La purificación por prep-TLC proporcionó la (4S)-7-(3-clorofenil)-N-(6-(2,3-dihidroxipropoxi)pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (8,9 mg, 40%) en forma de un sólido blanco. MS (ESI) calculado para C23H23ClN6O4: 482,2; encontrado: 483,1 [M+H].
Este procedimiento general de formación de urea usando fosgeno se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(3-cloro o -fluorofenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando también (4S)-7-(3-fluorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina y el resto de amina adecuado. Ejemplo 11. Preparación de (9S)-2-(3-cianofenil)-N-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000051_0003
Se añadió DIPEA (97 |jl, 0,54 mmol) a una mezcla de 3-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)benzonitrilo (50 mg, 0,18 mmol) y trifosgeno (27 mg, 0,10 mmol) en THF (12 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se calentó a 60°C durante 30 minutos. Se añadió 3-aminopiridina (102 mg, 1,09 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 32 h. Se añadió CH3OH después de enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se concentró y se purificó por HPLC prep. La sal de TFA se suspendió en CH3CN, en se añadió HCl y la mezcla se liofilizó para dar la (9S)-2-(3-cianofenil)-N-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (48 mg, 61%) en forma de la sal de hidrocloruro. MS (ESI) calculado para C23H20N6O: 396,2; encontrado: 397,1 [M+H].
Ejemplo 12. Preparación de (9S)-N-(piridin-2-il)-2-(5-(trifluorometil)piridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000052_0001
Una mezcla de piridin-2-ilcarbamato de 4-clorofenilo (325 mg, 1,31 mmol), (9S)-2-(5-(trifluorometil)piridin-3-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (70 mg, 0,22 mmol) y DMAP (160 mg, 1,31 mmol) en DMF (3 ml) se calentó at 100°C en un tubo sellado durante 24 h. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y después se repartió entre EtOAc/H2O (60 ml/ 30 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con H2O, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. El producto bruto se purificó por prep-TLC (eluyendo con CH2Cl2/EtOAc/CH3OH, 120:40:2) para dar la (9S)-N-(piridin-2-il)-2-(5-(trifluorometil)piridin-3-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida en forma de un sólido marrón claro (80 mg, 83%). MS (ESI) calculado para C22H19F3N6O: 440,2; encontrado: 441,2 [M+H].
Ejemplo 13. Preparación de (4S)-N-(2-metil-2H-indazol-5-il)-7-(2-metilpiridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000052_0002
A una disolución de (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]-diazepina (500 mg, 2,55 mmol) en dioxano/H2O desgasificado (14 ml, v/v=10/1) se añadió ácido 2-metilpiridin-4-borónico (1,048 g, 7,65 mmol), Pcy3 (286 mg, 1,02 mmol), KbPO4^ 3H2O (1,698 g, 6,375 mmol) y Pd2(dba)3 (234 mg, 0,255 mmol). La mezcla resultante se agitó a 110 °C durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y después se concentró. El residuo se repartió entre EtOAc y agua (50 ml de cada uno). La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4, y se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (CH2W TH F = 3/2) para dar la (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (418 mg, 82%) en forma de un sólido amarillo claro. MS (ESI) calculado para C15H16N4: 252,1; encontrado: 253,2 [M+H].
Los siguientes compuestos intermedios se prepararon usando el protocolo anterior sustituyendo el ácido borónico y 2-cloropiridina adecuados. 2-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)benzonitrilo, 5-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)nicotinonitrilo
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(2-metil-2H-indazol-5-il)-7-(2-metilpiridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b] [1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000053_0001
A una disolución de cloroformiato de fenilo (0,2 ml, 1,6 mmol) y piridina (0,16 ml, 1,95 mmol) en CH2CI2 (18 ml) se añadió 2-metil-2H-indazol-5-amina (180 mg, 1,22 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, y después se inactivó con disolución sat. de NaHCO3 (10 ml). La fase acuosa se extrajo con CH2G2 (10 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron sobre Na2SO4, y se concentraron hasta sequedad. El residuo se lavó con hexano (5 ml x 3) para dar el (2-metil-2H-indazol-5-il)carbamato de fenilo (304 mg, 93%).
Una mezcla de (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (90 mg, 0,36 mmol), (2-metil-2H-indazol-5-il)carbamato de fenilo (285 mg, 1,07 mmol) y DMAP (130 mg, 1,07 mmol) en THF (3 ml) se calentó a 80°C en un tubo sellado. Después de calentar 36 h a 80°C, la mezcla después se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El residuo se suspendió en EtOAc (60 ml) y se filtró. El filtrado se lavó con agua (20 ml x 3), después salmuera (20 ml), y se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El concentrado se purificó por prep-TLC (CH2Ch/EtOAc/MeOH = 23/1/gotas) para dar la (4S)-N-(2-metil-2H-indazol-5-il)-7-(2-metilpiridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (60 mg, 40%) en forma de un sólido marrón. MS (ESI) calculado para C24H23N7O: 425,2; encontrado: 426,3 [M+H].
Este procedimiento general de formación de urea usando carbamatos de fenilo se podía usar para preparar una variedad de (4S)-N-(aril)-7-(2-metilpiridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando el resto de amina adecuado.
Ejemplo 14: Preparación de (4S)-N-(2,6-dietilfenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000053_0002
En atmósfera de nitrógeno, a una mezcla de 2,6-dietilanilina (39,1 mg, 0,262 mmol, 2,0 eq) y piridina (0,5 ml, en exceso) en THF seco (3 ml) se añadió trifosgeno (54,4 mg, 0,183 mmol). La mezcla se agitó a 60°C durante 2 horas y se añadió (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (40 mg, 0,131 mmol, 1,0 eq) a la mezcla de reacción y se agitó durante 18 horas adicionales. Se añadieron disolución saturada de bicarbonato sódico (5 ml) y diclorometano (10 ml) a la mezcla de reacción; la capa orgánica se lavó sucesivamente con agua (10 ml) y salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró a vacío. El producto bruto se purificó por prep-TLC usando acetato de etilo en CH2Ch 15:1 como eluyente para dar la (4S)-N-(2,6-dietilfenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida, un sólido blanco. (5,1 mg, 8% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C27H27F3N4O: 480,21; encontrado: 481 [M+H].
Este procedimiento general de formación de urea usando trifosgeno se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(3-trifluorometilfenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo la 2 ,6-dietilanilina por el resto de amina adecuado.
Ejemplo 15. Preparación de (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-cloro-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000054_0001
Una mezcla de (4S)-7-doro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (400 mg, 2,04 mmol), pirazin-2-ilcarbamato de fenilo (1,32 g, 6,13 mmol) y DMAP (249 mg, 2,04 mmol) en DMF (8 ml) se calentó a 82°C en un matraz sellado. Después de calentar durante 22 h, la mezcla después se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc (100 ml). La mezcla se lavó con agua (8 ml x 9), después con salmuera, y se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna (CH2Ch/MeOH = 50/1) para dar la (4S)-7-cloro-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (600 mg, 93%) en forma de un sólido blanco. MS (ESI) calculado para C-mH-^Ci^O : 316,1.
Este procedimiento general se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-cloro-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo el pirazin-2-ilcarbamato de fenilo por el resto de carbamato adecuado.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000054_0002
A una mezcla de (4S)-7-cloro-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (40 mg, 0,126 mmol), ácido 2-metilpiridin-4-borónico (44 mg) y NaHCO3 (32 mg) en tolueno/EtOH/H2O (1,9 ml, v/v/v = 10/6/3) se añadió PdCl2(PPh3)2 (9 mg) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 6 h. Se añadió otra porción de ácido 2-metilpiridin-4-borónico (44 mg), NaHCO3 (32 mg), y PdCl2(PPh3)2 (8 mg) y la mezcla se desgasificó. Después de agitar a temperatura de reflujo durante la noche, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El concentrado se suspendió en EtOAc (30 ml) y agua (5 ml). La suspensión acuosa se extrajo con EtOAc (8 ml). Las fases de EtOAc combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. La purificación por prep-TLC (CH2Ch/MeOH = 50/1) proporcionó la (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (18 mg, 38%) en forma de un sólido blanquecino. MS (ESI) calculado para C20H19N7O: 373,2; encontrado: 374,3 [M+H].
Este procedimiento general usando PdCl2(PPh3)2 se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(2-metilpiridin-4-il)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas y (4S)-7-(6-metilpiridin-3-il)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando la (4S)-7-cloro-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida adecuada y el éster o ácido borónico adecuado.
Ejemplo 16. Preparación de (4S)-7-(3-((R)-3-fluoropirrolidin-1-il)fenil)-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000054_0003
Una mezcla de (4S)-7-cloro-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (40 mg, 0,126 mmol), (R)-3-fluoro-1-(3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)pirrolidina (74 mg, 0,252 mmol), Pd(OAc)2 (2 mg, 0,0126 mmol), 2-dicidohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo (12 mg, 0,0252 mmol) y CS2CO3 (82 mg, 0,252 mmol) en dioxano/H2O (1,5 ml, v/v = 9/1) se calentó a 110°C en un matraz sellado. Después de calentar durante la noche, la mezcla se enfrió y se filtró para separar los materiales insolubles. El filtrado se diluyó con EtOAc (30 ml), se lavó con H2O (5 ml x 2), se lavó con salmuera (5 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. La purificación por prep-TLC (CH2Ch/EtOAc = 3/1) proporcionó la (4S)-7-(3-((R)-3-fluoropirrolidin-1-il)fenil)-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (18 mg, 32%) en forma de un sólido amarillo pálido. MS (ESI) calculado para C24H24FN7O: 445,2; encontrado: 446,3 [M+H].
Este procedimiento general usando Pd(OAc)2 se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(3- y 2-sustituido fenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas y (4S)-7-(2-(trifluorometil)piridin-4-il)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando la (4S)-7-cloro-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida adecuada y el éster o ácido borónico adecuado.
Ejemplo 17. Preparación de (4S)-7-(3-((S)-2,3-dihidroxipropoxi)fenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000055_0001
La mezcla de (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (300 mg, 1,53 mmol), piridin-2-ilcarbamato de fenilo (986 mg, 4,59 mmol) y DMAP (188 mg, 1,53 mmol) en d Mf (6 ml) se desgasificó y se calentó a 80°C en el matraz sellado. Después de agitar durante la noche a 80°C, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió en EtOAc/H2O (150 ml/50 ml). La fase orgánica se lavó con agua (20 ml x 6), salmuera (20 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El concentrado después se purificó por columna (C^Ch/EtOAc = 1/1 ) para dar la (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (409 mg, 84%) en forma de un sólido blanquecino. MS (ESI) calculado para C15H14ClN5O: 315,1; encontrado: 316,1 [M+H].
Etapa 2. (4S)-7-(3-hidroxifenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000055_0002
Una mezcla de (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (80 mg, 0,284 mmol), ácido (3-hidroxifenil)borónico (78 mg, 0,568 mmol), Pd(OAc)2 (6 mg, 0,0384 mmol), 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo (27 mg, 0,0568 mmol) y Cs2CO3 (185 mg, 0,568 mmol) en dioxano/H2O (3 ml, v/v = 9/1) se desgasificó y se calentó a 110°C durante la noche en tubo sellado, después se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El concentrado se suspendió en EtOAc (20 ml), se lavó con agua (5 ml x 2), salmuera (5 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó por columna (CH2Cl2/EtOAc = 1/1) para dar la (4S)-7-(3-hidroxifenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (65 mg, 61%) en forma de un sólido blanquecino. MS (ESI) calculado para C21H19N5O2: 373,2; encontrado: 374,2 [M+H].
Etapa 3. Síntesis de (4S)-7-(3-((S)-2,3-dihidroxipropoxi)fenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000056_0001
A una disolución de (4S)-7-(3-hidroxifenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (90 mg, 0,241 mmol) en DMF (3 ml) se añadió NaH (24 mg, 0,603 mmol). Después de agitar durante 30 min a temperatura ambiente, se añadió (S)-4-(clorometil)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano (217 mg, 1,45 mmol) y la mezcla se calentó a 85°C durante 32 h en un matraz sellado. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El concentrado se disolvió en CH2Ch (3 ml) y se añadió disolución de HCl en dioxano (6 ml). La mezcla así obtenida se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. El disolvente se separó a presión reducida y el concentrado se suspendió en disolución sat. de NaHCO3 (5 ml). La mezcla se extrajo con CH2Ch (5 ml x 3) y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. La purificación por prep-TLc proporcionó la (4S)-7-(3-((S)-2,3-dihidroxipropoxi)fenil)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (24 mg, 33%) en forma de un polvo blanquecino. MS (ESI) calculado para C24H25N5O4: 447,2; encontrado: 448,3 [M+H].
Este procedimiento general se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(3-((S)-2,3-dihidroxipropoxi)fenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando la (4S)-7-(3-hidroxifenil)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida adecuada.
Ejemplo 18. Preparación de (4S)-7-(1-propiMH-pirazol-4-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-cloro-N-(piradil-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000056_0002
La (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (999 mg, 3,26 mmol, 1,0 eq) se combinó con DIEA (1,7 ml, 9,78 mmol, 3,0 eq) en cloruro de metileno (30 ml) y se enfrió a 0°C en un baño de hielo. Después se añadió trifosgeno (482 mg, 1,63 mmol, 0,5 eq) en varias porciones pequeñas a la disolución en agitación. Se retiró el baño de hielo y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después la reacción se dejó agitando durante la noche. Después se añadió lentamente piridina-3-amina (800 mg, 3,60 mmol, 1,1 eq) en pequeñas porciones a lo largo de varios minutos. La mezcla después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla después se trató con agua (100 ml), se diluyó con EtOAc (100 ml). Se separaron la fase y la fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando un gradiente de 15-100% (EtOAc/Pentano) para dar la (4S)-7-cloro-N-(piradil-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (761 mg, rendimiento 47%). MS (ESI) calculado para Ci5Hi4ClN5O 315,1; encontrado: 315,7 [M+H].
Etapa 2. (4S)-7-(1-propil-1H-pirazol-4-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000056_0003
El compuesto del título se preparó usando el siguiente protocolo: Una mezcla de (4S)-7-cloro-N-(piradil-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (100 mg, 0,32 mmol, 1,0 eq), ácido 1-etil-1H-pirazol-4-borónico (151 mg, 0,64 mmol, 2,0 eq), Pd(dppf)Cl2 (26,7 mg, 0,06 mmol, 0,2 eq) y Cs2CO3 (208 mg, 0,64 mmol, 2,0 eq) en dioxano/H2O (5 ml) se agitó a 100°C durante 6 h. Se añadió agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se concentraron y se purificaron por pre-TLC para dar la (4S)-7-(1-propil-1H-pirazol-4-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida. (37,1 mg, rendimiento 30%) MS (ESl) calculado para C21H23N7O 389,2; encontrado: 390,3 [M+H].
Este procedimiento general usando Pd(dppf)Cl2 se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(piridin-3-il)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo el ácido 2,2­ difluorobenzo[d][1,3]dioxole-5-borónico por el éster o ácido borónico adecuado.
Ejemplo 19: Preparación de (4S)-7-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de 3-(Piridin-2-il)-2H-pirido[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona:
Figure imgf000057_0001
El compuesto del título se preparó usando el siguiente protocolo: se suspendieron 10,0 g de ácido picolínico (81,2 mmol, 1 eq) en 250 ml de tolueno. Se añadieron 20,0 ml de difenil-fosforil-azida (92,6 mmol, 1,14 eq). Se añadieron gota a gota 13,4 ml de trietilamina (95,8 mmol, 1,18 eq). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después durante 2 h a 80°C. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los sólidos se filtraron y se lavaron con acetato de etilo y pentano. El sólido se secó con alto vacío. Obtenidos 6,46 g (66% de rendimiento) en forma de un sólido marrón. MS (ESl) calculado para C15H14CIN5O: 240,06; encontrado: 241,31 [M+H].
Este procedimiento general se podía usar para preparar 3-(piridin-2-il)-2H-pirido[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona y 3-(pirazin-2-il)-2H-pirazino[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona sustituyendo el ácido heteroaril-carboxílico que lleva heteroátomo nitrógeno en la posición 2 en el anillo aromático de seis miembros, adecuado.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000057_0002
El compuesto del título se preparó usando el siguiente protocolo: se disolvió la (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (2,0 g, 10,2 mmol, 1,0 eq) en 2-metil-tetrahidrofurano (40 ml) y se trató con NaH (1,7 g, 30,6 mmol, 3,0 eq) a temperatura ambiente. La mezcla resultante después se agitó a t.a. durante 30 minutos. Después se añadió 3-(piridin-2-il)-2H-pirido[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona (2,4 g, 10,2 mmol, 1,0 eq) y la reacción se equipó con un refrigerante de reflujo y se calentó a 80°C durante la noche. La reacción después se enfrió t.a., se puso en un baño de hielo, y se inactivo con adición lenta de NaHCO3 (65 ml). Después la reacción bruta se extrajo con 3x EtOAc (75 ml cada vez) y los extractos orgánicos se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. La reacción se purificó por cromatografía en columna usando un gradiente de EtOAc/Pentano al 10-100% para dar la (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (2,5 g, 78%). MS (ESI) calculado para C15H14CIN5O: 315,09; encontrado: 316,10 [M+H].
Etapa 3. Síntesis de (4S)-7-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000058_0001
La (4S)-7-doro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (79 mg, 0,250 mmol, 1,0 eq) se combinó con Pd2(dba)3 (2,3 mg, 0,006 mmol, 0,02 eq), K3PO4 (80 mg, 0,380 mmol, 2 eq), S-Phos (4,8 mg, 0,012 mmol, 0,05 eq) y el matraz se purgó con N2 y se selló. Después se añadió N-butanol (1 ml) mediante jeringa y la reacción se calentó a 100°C durante 3 h. Después la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y se purificó directamente por cromatografía de fase inversa usando un gradiente de 5-95% de CH3CN/H2O (0,1% de TFA) para dar la (4S)-7-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (11 mg, 10%). C15H14CIN5O: 437,13; encontrado: 438,17 [M+H].
Este procedimiento general usando Pd(dppf)Cl2 se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(piridin-2-il)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas y (4S)-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida sustituyendo el ácido 2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxole-5-borónico por el resto de éster o ácido borónico adecuado.
Ejemplo 20. Preparación de (4S)-N-(5-fluoropiridin-2-il)-7-(2-(3-(trifluorometil)pirrolidin-1 -il)piridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-cloro-N-(5-fluoropiridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000058_0002
Una mezcla de (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (280 mg, 1,43 mmol), (5-fluoropiridin-2-il)carbamato de 4-clorofenilo (1,14 g, 4,29 mmol) y DmAp (174 mg, 1,43 mmol) en DMF (7 ml) se calentó a 80°C en un matraz sellado. Después de agitar durante la noche a 80°C, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con agua (50 ml x 1, 10 ml x 6), después salmuera (50 ml), y se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El concentrado después se purificó por columna (CH2Cl2/EtOAc = 1/1) para dar la (4S)-7-cloro-N-(5-fluoropiridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (360 mg, 75%) en forma de un sólido blanquecino. MS (ESI) calculado para C15H13CIFN5O: 333,1.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(5-fluoropiridin-2-il)-7-(2-(3-(trifluorometil)pirrolidin-1-il)piridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000058_0003
Una mezcla de (4S)-7-cloro-N-(5-fluoropiridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (50 mg, 0,149 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-2-(3-(trifluorometil)pirrolidin-1-il)piridina (102 mg, 0,298 mmol), PCy3 (8 mg, 0,0298 mmol), Pd2(dba)3 (14 mg, 0,0149 mmol) y KíP O ^ ^ O (79 mg, 0,373 mmol) en dioxano/H2O desgasificado (2 ml, v/v =9/1) se calentó a 120°C en un matraz sellado. Después de agitar durante la noche, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc (60 ml). La disolución diluida se lavó con H2O (20 ml x 1, 10 ml x 5) y salmuera (20 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. La purificación por prep-TLC (CH2Cl2/EtOAc/MeOH = 3/1/2 gotas) proporcionó la (4S)-N-(5-fluoropiridin-2-il)-7-(2-(3-(trifluorometil)pirrolidin-1-il)piridin-4-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (54 mg, 71%) en forma de un sólido blanquecino. MS (ESI) calculado para C25H23F4N7O: 513,2; encontrado: 514,3 [M+H].
Este procedimiento general usando Pd2(dba)3 se podía usar para preparar una variedad de (4S)-7-(2-(3-sustituidopirrolidin-1 -il)piridin-4-il)-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas usando la (4S)-7-cloro-N-(aril)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida adecuada y el éster o ácido borónico adecuado.
Ejemplo 21. Preparación de (4S)-7-(3-clorofenil)-9-metoxi-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de 2,6-dicloro-4-metoxipiridina:
Figure imgf000059_0001
A una disolución de 2,4,6-tricloropiridina (30 g, 165 mmol) en MeOH se añadió lentamente metóxido sódico (10,7 g, 197 mmol). La mezcla se agitó durante la noche y se inactivó con 300 ml de agua. La suspensión se filtró, se lavó con agua y éter de petróleo para obtener la 2,6-dicloro-4-metoxipiridina en forma de un sólido blanco (18,0 g, 61% de rendimiento). MS (ESI) calculado para CaH5Cl2NO: 176,97.
Etapa 2. Síntesis de 2,6-dicloro-4-metoxi-3-nitropiridina:
Figure imgf000059_0002
A una disolución de 2,6-dicloro-4-metoxipiridina (18,1 g, 102 mmol) en ácido sulfúrico (110 ml) se añadió ácido nítrico (15,6 ml) gota a gota a 0°C, y después la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se vertió en hielo-agua, la suspensión se filtró y se lavó con agua para obtener la 2,6-dicloro-4-metoxi-3-nitropiridina en forma de un sólido blanco (19,9 g, 88% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C6H4Cl2N2O3: 221,96.
Etapa 3. Síntesis de (S)-2-((6-cloro-4-metoxi-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de di-terc-butilo:
Figure imgf000059_0003
A una disolución de 2,6-dicloro-4-metoxi-3-nitropiridina (14,5 g, 65 mmol) y cloruro de (S)-1,4-di-terc-butoxi-1,4-dioxobutan-2-aminio (22 g, 78 mmol) en DMF (150 ml) se añadió DIEA (32,3 ml), y la mezcla se calentó a 80°C durante 3 horas. Se separó el DMF con vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en éter de petróleo al 10%) para obtener el (S)-2-((6-cloro-4-metoxi-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de di-terc-butilo en forma de un aceite amarillo (4,8 g, 16% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C18H26ClN3O7: 431,15.
Etapa 4. Síntesis de (S)-2-(6-cloro-8-metoxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de terc-butilo:
Figure imgf000060_0001
A una mezcla de (S)-2-((6-cloro-4-metoxi-3-nitropiridin-2-il)amino)succinato de di-terc-butilo (4,7 g, 10,9 mmol) en AcOH (60 ml) se añadió hierro en polvo (6,107 g, 109 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 2 horas. La reacción se inactivó con NaOH 1 N y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera y se purificaron por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en éter de petróleo al 40%) para obtener el (S)-2-(6-cloro-8-metoxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de terc-butilo en forma de un aceite amarillo (1,87 g, 52% de rendimiento). MS (ESI) calculado para Ci4Hi8ClN3O4: 327,10.
Etapa 5. Síntesis de (S)-2-(6-cloro-8-metoxi-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol:
Figure imgf000060_0002
A una disolución de (S)-2-(6-cloro-8-metoxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)acetato de terc-butilo (1,7 g, 5,2 mmol) en THF (20 ml) se añadió BH3-Me2S (5,2 ml, 10 M en Me2S, 52 ml), y la mezcla de reacción después se calentó a 50°C durante la noche. Tras enfriar a temperatura ambiente, la reacción se inactivó por adición gota a gota de agua, después se añadió disolución acuosa de HCl 1 N (10 ml) y la mezcla se agitó a 50°C durante 2 horas. Se añadió disolución saturada de NaHCO3 y la mezcla se extrajo con CH2Cl2, y se concentró hasta un aceite. El aceite se trató con TFA (15 ml) en CH2Cl2 (15 ml) durante 2 horas y el DCM y TFA se separaron con vacío. El residuo se disolvió en MeOH (20 ml) y se añadió Cs2CO3 (2 g). La mezcla se agitó durante 1 hora, se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida (CH2Ch/MeOH 30:1) para obtener el (S)-2-(6-cloro-8-metoxi-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol en forma de un aceite amarillo (997 mg, 79% de rendimiento). MS (ESI) calculado para Ci0Hi4ClN3O2: 243,08.
Etapa 6. Síntesis de (4S)-7-cloro-9-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000060_0003
A una disolución de PPh3 (1,003 g, 3,83 mmol) en CH2Ch (50 ml) se añadió DDQ (869 mg, 3,83 mmol), y después se añadió (S)-2-(6-cloro-8-metoxi-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etanol (620 mg, 2,55 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min, se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en éter de petróleo de 33 a 100%) para obtener la (4S)-7-cloro-9-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina en forma de un sólido amarillo (413 mg, 72% de rendimiento). MS (ESI) calculado para Ci0Hi2ClN3O: 225,07.
Etapa 7. Síntesis de (4S)-7-(3-clorofenil)-9-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000060_0004
Una mezcla de (4S)-7-cloro-9-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (226 mg, 1,0 mmol, ácido (3-clorofenil)borónico (187 mg, 1,2 mmol), Cs2CO3 (654 mg, 2,0 mmol) y Pd(dppf)Cl2.DCM (40 mg, 0,05 mmol) en disolución en dioxano/agua 10:1 (6 ml) se calentó con microondas (130°C x 1 h). La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad, se suspendió en CH2Cl2, se lavó con disolución sat. de NaHCO3, agua, salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró. La mezcla de reacción se purificó inicialmente por cromatografía en gel de sílice (gradiente de 0 a 10% de MeOH en CH2Cl2) y posteriormente se purificó por HPLC prep. La reacción se repitió una 2a vez a la misma escala, y las fracciones de HPLC combinadas se liofilizaron para obtener la (4S)-9-metoxi-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (199 mg, 33% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C^H^ClNsO: 301,10; encontrado: 302 [M+H].
Este procedimiento general se podía usar para preparar la (4S)-9-metoxi-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina sustituyendo el ácido (3-clorofenil)borónico por el ácido (3-(trifluorometil)fenil)borónico.
Etapa 8. Síntesis de (4S)-7-(3-clorofenil)-9-metoxi-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000061_0001
A una disolución de (4S)-7-(3-clorofenil)-9-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (60 mg, 0,2 mmol) en THF (10 ml) se añadió suspensión de NaH al 60% en aceite mineral (24 mg, 1 mmol). La mezcla se calentó a temperatura de reflujo durante 1 hora, se añadió 3-(pirazin-2-il)-2H-pirazino[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona (73 mg, 0,3 mmol) y la mezcla se calentó a temperatura de reflujo durante 2 horas adicionales. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se concentró hasta sequedad, se diluyó con disolución sat. de NaHCO3, y se extrajo con CH2Cl2 (3x). Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se concentraron y se purificaron por HPLC prep. y se liofilizaron para dar la (4S)-7-(3-clorofenil)-9-metoxi-N-(pirazin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (54 mg, 64% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C21H19ClN6O2: 422,13; encontrado: 423 [M+H].
Ejemplo 22. Preparación de (4S)-9-metoxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000061_0002
Una mezcla de piridin-2-ilcarbamato de fenilo (191,6 mg, 0,8995 mmol), (4S)-9-metoxi-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (150 mg, 0,4477 mmol) y DMAP (65,55 mg, 0,5373 mmol) en 15 ml de acetonitrilo se agitó a 60°C durante la noche. La mezcla se cargó directamente en prep-TLC y se purificó (usando acetato de etilo como eluyente) para dar la (4S)-9-metoxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1.4- metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de un sólido blanco (150 mg, rendimiento: 74%). MS (ESl) calculado para C23H20F3N5O2: 455,2; encontrado: 456 [M+H].
Este procedimiento general se podía usar para preparar (4S)-9-metoxi-N-(Aril)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1.4- metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5 (2H)-carboxamidas sustituyendo el piridin-2-ilcarbamato de fenilo por el resto de carbamato adecuado.
Ejemplo 23. Preparación de (4S)-9-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000062_0001
En atmósfera de nitrógeno, a la mezcla de (4S)-9-metoxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (50 mg, 0,1098 mmol) en 3 ml de CH2Cl2 seco se añadió gota a gota BBr3 (0,5 ml, 0,5494 mmol) a 0°C. Después la mezcla de reacción se agitó a 50°C durante la noche. Se añadieron disolución de bicarbonato sódico (5 ml) y diclorometano (10 ml) a la mezcla de reacción y la capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó con sulfato sódico anhidro y se concentró a vacío. El producto bruto se purificó por prep-TLC usando (MeOH en CH2Ch 1:20) como eluyente para dar la (4S)-9-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de un sólido blanco (18 mg, 35% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H18F3N5O2: 441,1; encontrado: 442 [M+H].
Este procedimiento general se podía usar para preparar ((4S)-9-hidroxi-N-(aril)-7-(3 (trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1.4- metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo la (4S)-9-metoxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida por la (4S)-9-metoxi-N-(Aril)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida adecuada.
Ejemplo 24. Preparación de (4S)-N-(4-((3-(3-metil-3H-diazirin-3-il)propanamido)metil)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3.4- dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000062_0002
Una disolución de hidrocloruro de (4S)-N-(4-(aminometil)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (49 mg, 0,1 mmol), 3-(3-metil-3H-diazirin-3-il)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (23 mg, 0,1 mmol) y trietilamina (70 ^l, 0,5 mmol) en DMF (2 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió agua (10 ml) y disolución sat. de NaHCO3 (5 ml), y la mezcla de reacción se extrajo con CH2Cl2 (3x) y se concentró hasta sequedad. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de MeOH en CH2Cl2 de 0 a 10%), se concentró, se recogió con éter dietílico y pentano, y se secó con vacío para dar la (4S)-N-(4-((3-(3-metil-3H-diazirin-3-il)propanamido)metil)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de una espuma blanca (39 mg, 68% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C29H28F3N7O2: 563,23; encontrado: 564 [M+H].
Ejemplo 25: Preparación de (4S)-N-(3-(3-(trifluorometil)-3H-diazirin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000062_0003
A una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (46 mg, 0,15 mmol) y trifosgeno (36 mg, 120 mmol) en CH2CI2 (2 ml) se añadió trietilamina (56 pl, 0,45 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 40°C durante 2,5 horas y se añadió 3-(3-(trifluorometil)-3H-diazirin-3-il)anilina (40 mg, 0,2 mmol) disuelta en CH2Cl2 (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La capa orgánica se lavó con disolución sat. de NaHCO3, agua, salmuera se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (eluyendo primero con gradiente de CH2Cl2 en pentano de 0 a 100%, después de MeOH en CH2Cl2 de 0 a 10%) para dar la (4S)-N-(3-(3-(trifluorometil)-3H-diazirin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (40 mg, 50% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C25H18F6N6O: 532,14; encontrado: 533 [M+H].
La 3-(3-(trifluorometil)-3H-diazirin-3-il)anilina anterior se preparó de acuerdo con Biasotti B. et. al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2247-2254.
Este procedimiento general se usó para preparar una variedad de (3-(3-(trifluorometil)-3H-diazirin-3-il)fenil)ureas sustituyendo la (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina por la amina adecuada.
Ejemplo 26. Preparación de (3R,4R)-7-cloro-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Etapa 1. Síntesis de (S)- 2-benzamidosuccinato de dimetilo.
Figure imgf000063_0001
En un matraz de tres bocas, de 5 litros, equipado con un termómetro, un refrigerante y un agitador mecánico, se añadieron 161 g (1,00 mol) de éster dimetílico del ácido L-aspártico, 2500 ml de diclorometano, y 198 g (1,96 mol) de trietilamina. La disolución se enfrió a -5°C, después se añadieron 156 g (1,11 mol) de cloruro de benzoilo, gota a gota, manteniendo la temperatura interior a -5°C. La mezcla se agitó a -5°C durante 1 h, después se filtró. El precipitado se lavó tres veces con diclorometano adicional, después el filtrado y los lavados combinados se extrajeron con disolución acuosa saturada de K2CO3. La capa de diclorometano se secó sobre Na2SO4 y después se concentró a vacío para dar 200 g (75%) del producto en forma de un sólido blanco. MS (ESI) calculado para C13H15NO5: 265,1.
Etapa 2. Síntesis de (4S,5S)-2-fenil-4,5-dihidrooxazol-4,5-dicarboxilato de dimetilo.
Figure imgf000063_0002
En un matraz de cuatro bocas, de 10 litros, equipado con un termómetro, un agitador mecánico y una entrada de N2 se añadieron 100 g (0,377 mol) de (S)-2-benzamidosuccinato de dimetilo, después 4 litros de tetrahidrofurano seco. La mezcla se agitó y se enfrió a 0°C. Se añadieron a la disolución 770 ml (0,77 mol) de una disolución de bis(trimetilsilil)amiduro de litio 1,0 M en tetrahidrofurano, manteniendo la temperatura interior a 0°C durante la adición. La reacción se agitó a 0°C durante 30 min, después se enfrió a -78°C. A esta se añadió una disolución de 195 g (0,77 mol) de yodo en 2 litros de tetrahidrofurano, gota a gota, a -78°C. La reacción se agitó a -78°C durante 1 h, después se inactivó por adición de 2 litros de disolución saturada de NH4Cl(ac.), y 400 g (2,53 mol) de Na2S2O3. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, después se añadieron 2 litros de acetato de etilo, y se separaron las capas. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo adicional (3 x 2 litros). Las capas de acetato de etilo combinadas se secaron sobre Na2SO4 y después se concentraron a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con heptanos:acetato de etilo 20:1 (v/v) para dar 30 g (30%) del producto en forma de un sólido blanco. MS (ESl) calculado para C13H13NO5: 263,1.
Etapa 3. Síntesis de ácido (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccínico.
Figure imgf000064_0001
En un matraz de 500 ml equipado con un refrigerante de reflujo se añadieron 13 g (50 mmol) de (4S,5S)-2-fenil-4,5-dihidrooxazol-4,5-dicarboxilatode dimetilo, y 200 ml (2,4 mol) de HCl(ac.) 12 M. La reacción se agitó a 50°C durante 16 h, después el disolvente se separó a vacío. El residuo se recogió en 1000 ml de agua, y se extrajo con acetato de etilo hasta que no había ácido benzoico presente en la capa acuosa por HPLC. Las capas orgánicas se descartaron y la capa acuosa se concentró a vacío para dar 8,6 g (94%) de hidrocloruro del ácido (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccínico en forma de un sólido cristalino blanco. MS (ESI) calculado para C4H7NO5: 149,0.
Etapa 4. Síntesis de (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccinato de dimetilo.
Figure imgf000064_0002
En un matraz de tres bocas de 500 ml equipado con un refrigerante de reflujo se añadieron 170 ml de metanol. El metanol se enfrió a -5°C, después se añadieron gota a gota 23,6 g (198 mmol) de SOCb. Después de completarse la adición, se añadieron 8,6 g (46 mmol) de la sal de HCl del ácido (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccínico, y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El disolvente se separó a vacío, para dar la sal de HCl del (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccinato de dimetilo en forma de un aceite amarillo, que se usó sin más purificación en la siguiente etapa. MS (ESI) calculado para C6HnNO5: 177,1.
Etapa 5. Síntesis de (2S,3S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)-3-hidroxisuccinato de dimetilo.
Figure imgf000064_0003
En un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un refrigerante de reflujo, se añadieron 18 g (84,3 mmol) de (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccinatode dimetilo-HCl, 29 g (150 mmol) de 2,6-dicloro-3-nitropiridina, 42,5 g de NaHCO3 (506 mmol), y 350 ml de THF. La reacción se agitó a 40°C durante 36 h. Los sólidos se separaron por filtración y se lavaron con THF adicional (30 ml x 3). El filtrado y los lavados se combinaron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de heptanos:acetato de etilo de 5:1 (v/v) a 1:1 (v/v) para dar 22 g (63%) del (2S,3S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)-3-de dimetilo en forma de un sólido cristalino amarillo. MS (ESI) calculado para CnHi2CN3O7: 333,0.
Este procedimiento se podía usar para preparar el hidrocloruro del 2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)-3-hidroxisuccinato de dimetilo sustituyendo el hidrocloruro de (2S,3S)-2-amino-3-hidroxisuccinato de dimetilo por el hidrocloruro del 2-amino-3-hidroxisuccinato de dimetilo.
Etapa 6. Síntesis de (S)-2-((S)-6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)-2-hidroxiacetato de metilo.
Figure imgf000064_0004
Una suspensión de 10 g de Ni Raney en H2O se decantó para separar el agua, se diluyó con 2-propanol y se decantó de nuevo para dar una mezcla húmeda que pesaba 10 g. En un matraz de 500 ml se añadieron 10 g (30 mmol) de (2S,3S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)-3-hidroxisuccinatode dimetilo, 200 ml de 2-propanol, y después 10 g de Ni Raney. La reacción se puso bajo vacío y después se volvió a cargar con hidrógeno 3 veces, después se agitó bajo 1 atm de H2 durante 3 h, o hasta que no quedaba nitrocompuesto por HPLC. El Ni Raney se separó por filtración, después el filtrado se puso en un matraz de fondo redondo de 500 ml, y se añadieron 5 ml (87 mmol) de ácido acético glacial. El matraz se equipó con un refrigerante de reflujo, después la reacción se agitó a 80°C durante 16 h, hasta que no había presente diaminopiridina intermedia por HPLC. Los disolventes se separaron a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con heptanos/acetato de etilo 5/1 (v/v) para dar 6 g (72%) del producto en forma de un sólido amarillo claro. MS (ESI) calculado para C10H-i0ClN3O4: 271,0.
Este procedimiento se podía usar para preparar el 2-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)-2-hidroxiacetato de metilo sustituyendo el (2S,3S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)-3-hidroxisuccinatode dimetilo por el 2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)-3-hidroxisuccinato de dimetilo.
Etapa 7. Síntesis de (S)-1-((R)-6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etano-1,2-diol.
Figure imgf000065_0001
En un matraz de fondo redondo de 3 bocas, de 100 ml, equipado con un refrigerante de reflujo y un termómetro, se añadieron 20 ml de tetrahidrofurano, y después 1,19 g (30 mmol) de LiAlH4. La mezcla agitada se enfrió a -5°C, después se añadió gota a gota una disolución de 0,5 g (2 mmol) de (S)-2-((S)-6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)-2-hidroxiacetato de metilo en 20 ml de tetrahidrofurano. La reacción se agitó a 70°C durante 16 h, o hasta que la reacción se había completado por HPLC. (La reducción de lactama era más lenta que la reducción de éster).
La reacción se enfrió a -10°C, después se añadieron, gota a gota, 1,2 ml de agua y la reacción se agitó durante 10 min. Después, se añadieron 1,2 ml de NaOH(ac.) al 15% (p/v), y la reacción se agitó durante 20 min. Para completar la inactivación del exceso de LiAlH4, se añadieron gota a gota otros 3,6 ml de agua, después la reacción se agitó durante 20 min. La reacción se filtró, y el precipitado se lavó con tetrahidrofurano (3 x 20 ml). El filtrado y los lavados combinados se concentraron a vacío para dar aproximadamente 1,5 g de un sólido. Este se diluyó con 16 ml de acetato de etilo y se filtró. El filtrado se concentró a vacío para dar 310 mg (80%) del producto en forma de un sólido marrón. MS (ESI) calculado para CgH-i2ClN3O2: 229,1.
Este procedimiento se podía usar para preparar 1-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etano-1,2-diol sustituyendo el (S)-2-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)-2-hidroxiacetato de metilo por el 2-((S)-6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)-2-hidroxiacetato de metilo.
Etapa 8. Síntesis de (1S,4R)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol.
Figure imgf000065_0002
En un matraz de fondo redondo de 10 ml equipado con un refrigerante de reflujo, se añadieron 250 mg (1,1 mmol) de (S)-1-((R)-6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etano-1,2-diol, y después 5 ml de HBr(ac.) al 48%. La reacción se calentó a 105°C durante 16 h, o hasta que el análisis por HPLC mostró que se había consumido todo el material de partida. La reacción se enfrió, después se añadió lentamente K2CO3(S) hasta pH = 8. El disolvente se separó a vacío, después el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con diclorometano/metanol 20/1 (v/v) para dar 110 mg (47%) del producto en forma de un sólido cristalino blanco. MS (ESI) calculado para CgH1üClN3O: 211,1.
Este procedimiento se podía usar para preparar 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol sustituyendo el (S)-1-((R)-1-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etano-1,2-diol por el 6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)etano-1,2-diol.
Etapa 9. Síntesis de (1S,4R)-7-cloro-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina.
Figure imgf000066_0001
En un matraz de fondo redondo de 10 ml se añadieron 1,68 g (7,9 mmol) de (1S,4R)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol, 5 ml de N,N-dimetilformamida, y 2,8 ml (24 mmol) de 2,6-dimetilpiridina. La mezcla se agitó hasta que se hizo homogénea, después se añadieron 1,5 ml (12 mmol) de clorotrimetilsilano, gota a gota, a temperatura ambiente. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, después se diluyó con 100 ml de diclorometano, y se extrajo con disolución saturada de NaHCO3(ac.) (1 x 50 ml), después salmuera (3 x 50 ml), y se concentró a vacío para dar 2,04 g (91%) del producto en forma de un sólido blanco cristalino. MS (ESI) calculado para C^H^Cl^OSi: 283,1.
Este procedimiento se podía usar para preparar la 7-cloro-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina sustituyendo el(1S,4R)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol por el 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol.
Ejemplo 27. Preparación de (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000066_0002
Una mezcla de (3R,4R)-7-cloro-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (283 mg, 1,0 mmol), ácido (3-(trifluorometil)fenil)borónico (285 mg, 1,5 mmol), XPhos (24 mg, 0,05 mmol), Pd(OAc)2 (5,6 mg, 0,025 mmol), CS2CO3 (977 mg, 3,0 mmol) en dioxano:agua 10:1 (8,8 ml) se desgasifició y se calentó en microondas a 100°C durante 25 min. La capa de dioxano se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de MeOH en CH2Ch de 0 a 7%) para obtener la (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina. Las fracciones se concentraron, se disolvieron en EtoAc, se lavaron con disolución sat. de NaHCO3, agua, salmuera, se secaron (Na2SO4) y se concentraron para obtener la (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (338 mg, 85% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C19H22F3N3OSL 393,15; encontrado: 394 [M+H].
Este procedimiento general de acoplamiento usando hidruro sódico se podía usar para preparar la (3R,4R)-3-hidroxi-N-aril-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida sustituyendo la 3-(piridin-2-il)-2H-pirido[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona por el aril-isocianato o dímero de aril-isocianato adecuado. La serie no estereoespecífica se podía hacer partiendo de la 7-(3-(trifluorometil)fenil)-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina.
Ejemplo 28. Preparación de (3R,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000066_0003
Una disolución de (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (215 mg, 0,55 mmol) y NaH al 60% en aceite mineral (66 mg, 1,65 mmol) en THF (30 ml) se calentó a temperatura de reflujo durante 20 min. Se añadió 3-(piridin-2-il)-2H-pirido[1,2-a][1,3,5]triazina-2,4(3H)-diona (197 mg, 0,82 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió, se concentró hasta sequedad, se diluyó con CH2Ch. La capa orgánica se lavó con disolución sat. de NaHCO3, agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó por prep-HPLC, y las fracciones se concentraron hasta sequedad y se trituraron con una mezcla de éter dietílico y pentano para obtener el 2,2,2-trifluoroacetato de la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de un sólido blanco (132 mg, 44% de rendimiento).
MS (ESI) calculado para C22H18F3N5O2: 441,14; encontrado: 442 [M+H].
Ejemplo 29. Preparación de (4R)-3-oxo-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000067_0001
A una disolución del 2,2,2-trifluoroacetato de la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (92 mg, 0,166 mmol) en CH2Cl2 (20 ml) se añadió periodinano de Dess-Martin (105 mg, 0,25 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se cargó una segunda parte alícuota de periodinano de Dess-Martin (105 mg, 0,25 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se añadió una disolución sat. de NaHCO3 (ac) y la mezcla de reacción se extrajo con CH2Cl2. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó (Na2SO4), y se concentró hasta una espuma blanca. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en Penate de 0 a 100%), y después se purificó por prep-HPLC y se liofilizó para obtener el 2,2,2-trifluoroacetato de la (4R)-3-oxo-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (62 mg, 67% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H16F3N5O2: 439,13; encontrado: 440 [M+H].
Este procedimiento general se usó para preparar la (4R)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-3-oxo-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida sustituyendo la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida por la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida
Ejemplo 30. Preparación de (3S,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000067_0002
A una disolución del 2,2,2-trifluoroacetato de la (4R)-3-oxo-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (50 mg, 0,09 mmol) en THF (10 ml) a -78°C, en atmósfera de nitrógeno, se añadió gota a gota una disolución de SuperHydride 1 M en THF (0,45 ml, 0,45 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -78°C durante 30 min, se inactivó con la adición de EtOAc (5 ml), se calentó a temperatura ambiente y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente de MeOH en CH2Cl2de 0 a 10%) para dar la (3S,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (22 mg, 55% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H18F3N5O2: 441,14; encontrado: 442 [M+H].
Ejemplo 31. Preparación de acetato de (3S,4R)-5-(piridin-2-ilcarbamoil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ilo:
Figure imgf000068_0001
A una disolución de (3S,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (15 mg, 0,034 mmol) en CH2CI2 se añadió trietilamina (10 |jl, 0,07 mmol) seguido de DMAP (1 mg) y anhídrido acético (10 jl, 0,011 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se concentró hasta sequedad y se purificó por prep-HPLC. Las fracciones se liofilizaron para obtener el acetato y 2,2,2-trifluoroacetato de (3S,4R)-5-(piridin-2-ilcarbamoil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ilo (5,9 mg, 29% de rendimiento). Ms (ESI) calculado para C24H20F3N5O3: 483,15; encontrado: 484 [M+H].
Este procedimiento general se usó para preparar el acetato de (3R,4R)-5-(piridin-2-ilcarbamoil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ilo sustituyendo la (3S,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida por la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-bí[1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida.
Este procedimiento general se usó para preparar el benzoato de (3R,4R)-5-(piridin-2-ilcarbamoil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ilo sustituyendo la (3S,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida por la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-bí[1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida, y sustituyendo el anhídrido acético y el anhídrido benzoico.
Ejemplo 32. Preparación de (3R,4R)-3-hidroxi-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000068_0002
Una disolución de (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (284 mg, 0,722 mmol), (3-(oxazol-5-il)fenil)carbamato de fenilo (404 mg, 1,44 mmol) y DmAP (44 mg, 0,36 mmol) en CH3CN (20 ml) se calentó a 60°C (durante la noche) y después a 80°C (2 h). Después a la mezcla de reacción se añadió una cantidad adicional de (3-(oxazol-5-il)fenil)carbamato de fenilo (202 mg, 0,72 mmol) y DMAP (88 mg, 0,72 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante la noche y se concentró hasta sequedad. La mezcla de reacción se purificó inicialmente por cromatografía en columna (gradiente de acetato de etilo en pentano de 0 a 100%) y después se purificó por prep-HPLC y se liofilizó para obtener la (3R,4R)-3-hidroxi-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de la sal del ácido trifluoroacético (161 mg, 36%). MS (ESI) calculado para C26H20F3N5O3: 507,15; encontrado: 508 [M+H].
Ejemplo 33. Preparación de (3R,4R)-7-(3-clorofenil)-3-hidroxi-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000068_0003
Se añadió lentamente TBSOTf (111 mg, 0,42 mmol) a una disolución de (3R,4R)-7-cIoro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol (90 mg, 0,28 mmol) en 2 ml de CH2CI2 en atmósfera de N2 a -20°C. La mezcla se agitó durante 1 h y después se lavó con en HCl y agua, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó hasta sequedad. El residuo se purificó por prep-TLC (DCM/EA=20:1) para dar la (3R,4R)-3-((terc-butiIdimetiIsiIiI)oxi)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina en forma de un sólido amarillo (90 mg, 73% de rendimiento), MS (ESI) calculado para C15H24C1N3OSÍ: 325,14;
Etapa 2. Síntesis de (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b] [1,4]diazepina.
Figure imgf000069_0001
Una mezcla de (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (1,08 g, 3,32 mmol), ácido (3-clorofenil)borónico (570 mg, 3,65 mmol), CS2CO3 (2,48 g, 7,63 mmol), Pd(dppf)Cl2 (300 mg, 0,33 mmol) en dioxano/H2O (11 ml, 10:1) se calentó a 130°C durante 2,5 h en un reactor de microondas. La mezcla se vertió en agua, y se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó hasta sequedad. El residuo se purificó por prep-HPLC para dar la (3R,4R)-3-((tercbutildimetilsilil)oxi)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina en forma de un sólido amarillo claro (850 mg, 63% de rendimiento), MS (ESI) calculado para C21H28CN3OSÍ: 401,17;
Este procedimiento general se usó para preparar la (3R,4R)-3-((terc-butiIdimetiIsiIiI)oxi)-7-(5-(trifIuorometiI)piridin-3-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina.
Etapa 3. Síntesis de (3R,4R)-3-((terc-butiIdimetiIsiIiI)oxi)-7-(3-cIorofeniI)-N-(piridin-2-iI)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000069_0002
Una mezcla de piridina-2-ilcarbamato de fenilo (86 mg, 0,20 mmol), (3R,4R)-3-((tertbutiIdimetiIsiIiI)oxi)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (80 mg, 0,20 mmol) y DMAP (24 mg, 0,20 mmol) en 5 ml de MeCN se agitó a 65°C durante la noche. La mezcla de reacción bruta se purificó por prep-TLC eluyendo con DCM:EA=20:1 para dar la (3R,4R)-3-((terc-butiIdimetiIsiIiI)oxi)-7-(3-cIorofeniI)-N-(piridin-2-iI)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (110 mg). MS (ESI) calculado para C27H32CIN3O2SÍ: 521,2;
Etapa 4. Síntesis de (3R,4R)-7-(3-cIorofeniI)-3-hidroxi-N-(piridin-2-iI)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000069_0003
Una disolución de (3R,4R)-3-((terc-butiIdimetiIsiIiI)oxi)-7-(3-cIorofeniI)-N-(piridin-2-iI)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (110 mg, 0,21 mmol) en 10 ml de THF y HCl conc. (1 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 h. La mezcla se concentró a presión reducida. El pH se ajustó a 8 usando disolución sat. ac. de NaHCO3. La mezcla se extrajo con EtOAc, se lavó con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. El residuo se trituró en EtOAc para dar la (3R,4R)-7-(3-cIorofeniI)-3-hidroxi-N-(piridin-2-iI)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (34 mg, 39% de rendimiento) en forma de un sólido blanco MS (ESI) calculado para C21H18CIN5O2: 407,1; encontrado: 408 [M+H].
Ejemplo 34. Preparación de (3R,4R)-N-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-3-hidroxi-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol:
Figure imgf000070_0001
Una mezcla de (3R,4R)-7-cloro-3-((trimetilsilil)oxi)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (1 g, 3,53 mmol), ácido ((3-trifluorometil)fenil)borónico (1,34 g, 7,06 mmol), CS2CO3 (3,44 g, 10,6 mmol), Pd(dppf)Cl2 (300 mg, 0,35 mmol) en dioxano/H2O (30 ml, 10:1) se hizo reaccionar con microondas a 130°C durante 2,5 h. Después la mezcla de reacción se vertió en agua, se extrajo con EtOAc, se lavó con agua y después salmuera, se secó (Na2SO4), se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (PE/EA=4:1) para dar el (3R,4R)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol (600 mg, 39% de rendimiento). MS (eSi) calculado para C16H14F3N3O: 321,1;
Etapa 2. Síntesis de (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000070_0002
Una mezcla de TBSCl (338 mg, 2,24 mmol), (3R,4R)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-3-ol (600 mg, 1,87 mmol), trietilamina (415 mg, 4,11 mmol) y DMa P (22 mg, 0,20 mmol) se agitó durante 48 h. Se requirió TBSCl y TEA adicionales para consumir el material de partida. El residuo bruto se purificó por cromatografía en columna para dar la (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (90 mg, 73% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H28F3N3OSL 435,20;
Etapa 3. Síntesis de (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000070_0003
Una mezcla de (4,5-dimetilthiazol-2-il)carbamato de fenilo (25 mg, 0,10 mmol), (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (30 mg, 0,05 mmol) y DMAP (6 mg, 0,05 mmol) en 5 ml de MeCN se agitó a 65°C durante la noche. La mezcla de reacción bruta se purificó por prep-TLC para dar la (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (30 mg, cuant.). MS (ESI) calculado para C28H34F3N5O2SSL 589,22;
Etapa 4. Síntesis de (3R,4R)-N-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-3-hidroxi-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000071_0001
A una disolución de (3R,4R)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4] diazepina-5 (2H)-carboxamida (3o mg, 0,051 mmol) en t Hf (2 ml) se añadió TBAF/THF (0,1 ml, 0,1 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y después salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó hasta sequedad. El residuo se purificó por prep-TLC (EtOAc) para dar la (3R,4R)-N-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-3-hidroxi-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de un sólido blanco (12 mg, 50% de rendimiento). MS (eSi) calculado para C22H20F3N5O2S: 475,13; encontrado: 476 [M+H].
Ejemplo 35: Preparación de (4S)-N-(4-(oxazol-5-il)piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000071_0002
A una disolución de 4-(oxazol-5-il)piridin-2-amina (500 mg, 3,10 mmol) en piridina (780 |jl, 9,65 mmol) y diclorometano (10 ml), enfriada a 0°C, se añadió cloroformiato de fenilo (466 jl, 3,72 mmol) a lo largo de 1,5 h. La reacción se agitó a 0°C durante 2 h. Se añadió lentamente agua (15 ml) y se añadió diclorometano adicional. La capa orgánica se separó, se lavó con disolución saturada de carbonato sódico (20 ml) y salmuera (20 ml), se secó con sulfato sódico y se separaron todos los disolventes a vacío. El residuo se suspendió en éter de petróleo:acetato de etilo 5:1 durante 30 min, después la suspensión se filtró para dar el (4-(oxazol-5-il)piridin-2-il)carbamato de fenilo (547 mg, 1,94 mmol, 63% de rendimiento).
Una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (110 mg, 0,361 mmol), (4-(oxazol-5-il)piridin-2-il)carbamato de fenilo (203 mg, 0,722 mmol) y 4-(dimetilamino)piridina (53,0 mg, 0,434 mmol) en acetonitrilo (5 ml) se agitó a 60°C durante la noche. La mezcla se purificó por HPLC preparativa para dar la (4S)-N-(4-(oxazol-5-il)piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (24,3 mg, 0,0493 mmol, 14% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C25H19F3N6O2: 492,2; encontrado: 493,2 [M+H].
Ejemplo 36: Síntesis de (4S)-N-(3,5-bis(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (3,5-bis(oxazol-5-il)fenil)carbamato de fenilo:
Figure imgf000071_0003
Una mezcla de 3,5-bis(oxazol-5-il)anilina (100 mg, 0,44 mmol), cloroformiato de fenilo (76 mg, 0,48 mmol) y piridina (0,20 ml) en diclorometano (15 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se separó a vacío, y el material que quedaba se purificó por TLC preparativa (éter de petróleo:acetato de etilo 1:1) para dar el (3,5-bis(oxazol-5-il)fenil)carbamato de fenilo (140 mg, 0,40 mmol, 92% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C19H13N3O4: 347,1.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(3,5-bis(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000072_0001
Una mezcla de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (70 mg, 0,23 mmol), (3,5-bis(oxazol-5-il)fenil)carbamato de fenilo (140 mg, 0,40 mmol) y DMAP (56 mg, 0,46 mmol) en acetonitrilo (2 ml) se calentó a reflujo durante la noche. El disolvente se separó a vacío, y el residuo que quedaba se purificó por TLC preparativa (diclorometano:metanol 10:1) para dar la (4S)-N-(3,5-bis(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (13,7 mg, 0,0245 mmol, 11% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C29H21F3N6O3: 558,2; encontrado: 559,0.
Ejemplo 37. Preparación de ((1-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000072_0002
A una disolución de trifosgeno (214 mg, 0,721 mmol) en acetonitrilo (5 ml) se añadió una disolución de ((1-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo (417 mg, 1,44 mmol) en acetonitrilo (5 ml) y trietilamina (2 ml). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 10 min, después se añadieron (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (Compuesto #; 302 mg, 0,989 mmol) y 4-(dimetilamino)piridina (122 mg, 1,00 mmol) en forma de sólidos. La reacción se agitó a 80°C durante 15 min. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se añadió metanol (2 ml), y la reacción se vertió en disolución saturada de bicarbonato sódico (50 ml), y se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico, el disolvente se separó a vacío, y el material restante se purificó por cromatografía ultrarrápida (metanol en diclorometano de 0% a 8%) para dar el ((1-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo (579 mg, 0,933 mmol, 94% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C31H31F3N8O3: 620,3; encontrado: 621,0 [M+H].
Ejemplo 38. Preparación de (4S)-N-(3-(4-(aminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000073_0001
Se disolvió ((1-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo (160 mg, 0,258 mmol) en ácido trifluoroacético (1,6 ml). La reacción se agitó a 50°C durante 10 min, después se separaron todos los disolventes a vacío para dar la sal del ácido trifluoroacético de la (4S)-N-(3-(4-(aminometil)-1H-1,2,3-triazoM-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (164 mg, 0,258 mmol, 100% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C26H23F3N8O: 520,2; encontrado: 521,0 [M+H].
Ejemplo 39: Síntesis de (4S)-N-(6-(1-metiMH-pirazol-5-il)piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1: Preparación de (4S)-N-(6-bromopiridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000073_0002
A una disolución de trifosgeno (1,81 g, 6,10 mmol) en acetonitrilo (25 ml) se añadió una disolución de 6-bromopiridin-2-amina (2,26 g, 13,1 mmol) en acetonitrilo (25 ml). Se añadió trietilamina (8,00 ml, 57,4 mmol) y la reacción se agitó a 80°C durante 30 min. Se añadieron (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (1,04 g, 3,41 mmol) y 4-(dimetilamino)piridina (410 mg, 3,36 mmol) como sólidos, y la reacción se agitó a 80°C durante 1 h. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en agua (30 ml), y se extrajo con diclorometano (2 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico, y se separaron todos los disolventes a vacío. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en pentano de 30% a 100%) para dar la (4S)-N-(6-bromopiridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (1,12 g, 2,22 mmol, 65% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H-i7BrF3N5O: 503,1; encontrado: 503,8 [M+H].
Etapa 2: Preparación de (4S)-N-(6-(1-metil-1H-pirazol-5-il)piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000073_0003
Un vial de microondas se cargó con (4S)-N-(6-bromopiridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4 metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (46,0 mg, 0,0912 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)paladio (4,8 mg, 0,0042 mmol), fluoruro de cesio (180 mg, 1,18 mmol), 1-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-pirazole (60,0 mg, 0,288 mmol), DME (1,5 ml), y agua (150 |jl). El vial de microondas se selló y se calentó en el microondas a 100°C durante 3 h. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo:metanol 10:1 (2 x 2 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico, el disolvente se separó a vacío y el residuo que quedaba se disolvió en DMSO (4 ml), se filtró y el filtrado se purificó por HPLC preparativa para dar la sal de ácido trifluoroacético de la (4S)-N-(6-(1-metil-1H-pirazol-5-il)piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (28,4 mg, 0,0460 mmol, 50% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C26H22F3N7O: 505,2; encontrado: 506,0 [M+H].
Ejemplo 40: Síntesis de (4S)-N-(3-(piperazin-1-ilmetil)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000074_0001
Un vial se cargó con trifosgeno (75,0 mg, 0,253 mmol) y este se disolvió en acetonitrilo (2,5 ml). Se añadió una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (150 mg, 0,491 mmol) en acetonitrilo (2,5 ml) seguido de trietilamina (0,50 ml, 3,59 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, y se añadió 4-(3-aminobenzil)piperazina-1-carboxilato (480 mg, 1,65 mmol) de terc-butilo en forma de sólido, seguido de DMAP (360 mg, 2,95 mmol). La reacción se agitó a 80°C durante 16 h, y se separaron todos los disolventes a vacío. El material que quedaba se disolvió en ácido trifluoroacético (5,0 ml), y la disolución se agitó a 50°C durante 20 min. El exceso de ácido trifluoroacético se separó a vacío, el material que quedaba se disolvió en DMSO, y la disolución resultante se purificó por HPLC preparativa para dar el trifluoroacetato de la (4S)-N-(3-(piperazin-1-ilmetil)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (89,1 mg, 0,140 mmol, 29% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C28H29F3N6O: 522,2.
Ejemplo 41: Síntesis de (4S)-N-(4-(piperazin-1-il)pirimidin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de 4-(2-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)pirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000074_0002
A una disolución de 4-(2-aminopirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (200 mg, 0,716 mmol) en THF (20 ml) a 0°C se añadió disolución de bis(trimetilsilil)amiduro sódico (1,0 M en THF, 1,50 ml, 1,50 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 30 min, y se añadió una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de fenilo (327 mg, 1,07 mmol) en THF (5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h, después el disolvente se separó a vacío y el residuo que quedaba se purificó por prep-TLC (éter de petróleo:acetato de etilo 3:1) para dar el 4-(2-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)pirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (160 mg, 0,262 mmol, 37% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C30H33F3NEO3: 610,3.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(4-(piperazin-1-il)pirimidin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000075_0001
Se disolvió el 4-(2-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)pirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (160 mg, 0,262 mmol) en ácido clorhídrico en acetato de etilo (2 M, 10 ml), y se agitó durante 30 min. Se separaron todos los disolventes a vacío para dar la (4S)-N-(4-(piperazin-1-il)pirimidin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (47 mg, 0,092 mmol, 35% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C25H25F3N8O: 510,2; encontrado: 511,0 [M+H].
Ejemplo 42: Síntesis de (2-(4-(3-((9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10-carboxamido)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000075_0002
Se cargó un vial con trifosgeno (180 mg, 0,607 mmol), y este se disolvió en diclorometano (3 ml). Se añadió una disolución de (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (320 mg, 1,00 mmol) y se añadió N,N-diisopropiletilamina (1,00 ml, 5,74 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 25 min, y después se añadió una disolución de (2-(4-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)carbamato de terc-butilo (415 mg, 1,37 mmol) en diclorometano (5 ml). La reacción se agitó a 40°C durante 16 h, después se calentó en un microondas a 120°C durante 1 h. Después de enfriar, el disolvente se separó a vacío, y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía ultrarrápida (metanol en diclorometano de 0% a 8%) para dar el (2-(4-(3-((9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10-carboxamido)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)carbamato de terc-butilo (99,0 mg, 0,153 mmol, 15% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C33H35F3N8O3: 648,3.
Ejemplo 43: Preparación de (4S)-N-(3-(2-(guanidinometil)oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000075_0003
Una disolución de hidrocloruro de 1H-pirazol-1-carboximidamida (15 mg, 0,10 mmol) y DIEA (17 |jl, 0,10 mmol) en DMF (1 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 10 min, se añadió la (4S)-N-(3-(2-(aminometil)oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (52 mg, 0,10 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después se purificó por prep-HPLC y se liofilizó para obtener la sal de ácido trifluoroacético de la (4S)-N-(3-(2-(guanidinometil)oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (25,5 mg, 38% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C28H25F3N8O2: 562,21; encontrado: 563 [M+H].
Este procedimiento general se usó para preparar otras guanidinas sustituyendo la (4S)-N-(3-(2-(aminometil)oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida por la amina adecuada.
Ejemplo 44: Síntesis de (4S)-N-(pirimidin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (9S)-2-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina:
Figure imgf000076_0001
Un vial de microondas de 20 ml se cargó con una barra agitadora magnética, (9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (629 mg, 3,00 mmol), [1,3-bis(2,6-dMsopropilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-iliden]cloro]alilpaladio(ll) (62,1 mg, 0,120 mmol), 3-trifluorometilpiperidina (919 mg, 6,00 mmol) y terc-butóxido potásico (673 mg, 6,00 mmol). Se añadió DME (7,0 ml), el vial de microondas se tapó y se calentó a 90°C durante 2 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron metanol (5 ml) y gel de sílice (5 g), y se separaron todos los disolventes a vacío. La suspensión de gel de sílice que quedaba se cargó en la parte superior de una columna de gel de sílice de 40 g, y la cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en pentano de 50% a 100%) dio la (9S)-2-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina 2 como una mezcla de diastereoisómeros 1:1 (713 mg, 2,18 mmol, 73% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C16H21F3N4: 326,2.
Figure imgf000076_0002
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(pirimidin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000076_0003
A una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (40,0 mg, 0,128 mmol) en acetonitrilo (2 ml) y piridina (1 ml) se añadió trifosgeno (26,0 mg, 0,0876 mmol) en forma de sólido. La disolución roja resultante se agitó a 50°C durante 1 h. Después se añadió 4-aminopirimidina (95,0 mg, 1,00 mmol) en forma de sólido, y la reacción se agitó a 70°C durante 6 h. Después de 6 h, se separó la mayor parte del acetonitrilo bajo una corriente de nitrógeno, y se añadió metanol (1 ml) y DMSO (2 ml) a la reacción. La disolución resultante se purificó por prep-HPLC, y el material aislado se liofilizó a partir de acetonitrilo/HCl acuoso 1 N para dar el hidrocloruro de la (4S)-N-(pirimidin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (34,9 mg, 0,0743 mmol, 58% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C20H22F3N7O: 433,2.
Ejemplo 45: Síntesis de (4S)-7-((S)-3-(dimetilamino)pirrolidin-1-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (3S)-N,N-dimetil-1-((4S)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-7-il)pirrolidin-3-amina:
Figure imgf000077_0001
Un vial de microondas de 20 ml se cargó con una barra agitadora magnética, (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (978 mg, 5,00 mmol), [1,3-Bis(2,6-diisopropilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilidene]cloro]alilpaladio(II) (51,7 mg, 0,100 mmol), (S)-N,N-dimetilpirrolidin-3-amina (1,14 g, 10,00 mmol) y tercbutóxido potásico (1,12 mg, 10,00 mmol). Se añadió DME (10,0 ml), el vial de microondas se tapó y se calentó a 100°C durante 4 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron metanol (20 ml) y gel de sílice (5 g), y se separaron todos los disolventes a vacío. La suspensión de gel de sílice que quedaba se cargó en la parte superior de una columna de gel de sílice de 40 g, y la cromatografía ultrarrápida (metanol en pentano de 0% a 10%) dio la (3S)-N,N-dimetil-1-((4S)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-7-il)pirrolidin-3-amina (524 mg, 1,92 mmol, 38% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C15H23N5: 273,2.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-7-((S)-3-(dimetilamino)pirrolidin-1-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000077_0002
A una disolución de (3S)-N,N-dimetil-1-((4S)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-7-il)pirrolidin-3-amina (40,0 mg, 0,146 mmol) en acetonitrilo (540 jl) y piridina (150 jl) se añadió una disolución de trifosgeno (28,9 mg, 0,0975 mmol) en acetonitrilo (310 jl). La reacción se agitó a 50°C durante 30 min, después se añadió trietilamina (40 jl). Se añadió 3-aminopiridina (94 mg, 1,00 mmol) en forma de sólido, y la reacción se agitó a 60°C durante 16 h. Después de 16 h, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se añadió metanol (1 ml), y la disolución resultante se purificó por HPLC preparativa. El material aislado se liofilizó a partir de acetonitrilo/HCl acuoso 1 N para dar el hidrocloruro de la (4S)-7-((S)-3-(dimetilamino)pirrolidin-1-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (30,6 mg, 0,0712 mmol, 49% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C21H27N7O: 393,2.
Ejemplo 46: Síntesis de 4-((9S)-10-(pirimidin-4-ilcarbamoil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepan-1-carboxilato de terc-butilo:
Etapa 1. Síntesis de 4-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepan-1-carboxilato:
Figure imgf000077_0003
Un vial de microondas de 20 ml se cargó con una barra agitadora magnética, (9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (500 mg, 2,38 mmol), [1,3-Bis(2,6-di-isopropilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilidene]cloro]alilpaladio(II) (12,4 mg, 0,0240 mmol), homopiperazina-1-carboxilato de terc-butilo (953 mg, 4,76 mmol) y terc-butóxido potásico (534 mg, 4,76 mmol). Se añadió DME (5,0 ml), el vial se selló y se calentó en el microondas a 85°C durante 4 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron metanol (20 ml) y gel de sílice (5 g), se separaron todos los disolventes a vacío, y la suspensión de gel de sílice que quedaba se cargó en la parte superior de una columna de gel de sílice de 40 g. La cromatografía ultrarrápida (metanol en diclorometano de 0% a 8%) dio el 4-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepane-1-carboxilato de terc-butilo (550 mg, 1,48 mmol, 62% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C20H31N5O2: 373,2; encontrado: 374,2 [M+H].
Etapa 2. Síntesis de 4-((9S)-10-(pirimidin-4-ilcarbamoil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepan-1-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000078_0001
Una mezcla de 4-((9S)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepan-1-carboxilato de terc-butilo (500 mg, 1,34 mmol), éster de fenilo del ácido pirimidin-4-il-carbámico (570 mg, 2,65 mmol), 4-dimetilaminopiridina (190 mg, 1,56 mmol) en acetonitrilo (30 ml) se agitó a 60°C durante 3,5 h. El disolvente se separó a presión reducida, El residuo se disolvió en diclorometano, se lavó con agua, salmuera, y la capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro. Se separaron todos los disolventes a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice con diclorometano:acetato de etilo (2 :1 ), después se purificó por cromatografía en capa fina preparativa con metanol en diclorometano al 3% para dar el 4-((9S)-10-(pirimidin-4-ilcarbamoil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepan-1-carboxilato de terc-butilo (363 mg, 0,734 mmol, 55% de rendimiento). m S (ESI) calculado para C25H34N8O3: 494,3; encontrado: 495,4 [M+H].
Ejemplo 47: Síntesis de (9S)-2-(1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000078_0002
El 4-((9S)-10-(pirimidin-4-ilcarbamoil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocin-2-il)-1,4-diazepano-1-carboxilato de terc-butilo (400 mg, 0,808 mmol) se disolvió en HCl 1 M en MeOH (20 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se separaron todos los disolventes a vacío. Se añadieron agua (20 ml) y carbonato potásico (344mg, 2,42 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La extracción con diclorometano (3 x 5 ml) y secado del disolvente a vacío dio la (9S)-2-(1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (300 mg, 0,761 mmol, 94% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C20H26N8O: 394,2.
Ejemplo 48: Síntesis de (9S)-2-(4-(metilsulfonil)-1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000078_0003
A una disolución de (9S)-2-(1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (60,0 mg, 0,152 mmol) en diclorometano (3 ml) se añadió trietilamina (46,1 mg, 0,457 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (18,1 mg, 0,152 mmol). La mezcla se agitó a 0°C durante 1 h. La disolución se lavó con agua, salmuera y la capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro. La disolución que quedaba se purificó por cromatografía en capa fina preparativa con metanol en diclorometano al 3% para dar la (9S)-2-(4-(metilsulfonil)-1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (30,0 mg, 0,0635 mmol, 42% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C21H28N8O3S: 472,2.
Ejemplo 49: Síntesis de (9S)-2-(4-metiM,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000079_0001
A una disolución de (9S)-2-(1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (100 mg, 0,254 mmol) en metanol (3 ml) se añadió formaldehido (37% en agua, 20 pl) y paladio sobre carbono al 10% (10 mg). La reacción se agitó en atmósfera de hidrógeno durante 1 h. El disolvente se separó a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía en capa fina preparativa con metanol en diclorometano al 3% para dar la (9S)-2-(4-metil-1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (22,2 mg, 0,0543 mmol, 21% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C21H28N8O: 408,2.
Ejemplo 50: Síntesis de (9S)-2-(4-isopropiM,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazoci na-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000079_0002
A una disolución de (9S)-2-(1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (50,0 mg, 0,127 mmol) en diclorometano (3 ml) se añadió acetona (12,9 mg, 0,254 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min y se añadió cianoborohidruro sódico (20,1 mg, 0,0759 mmol) en forma de sólido, y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se separaron todos los disolventes a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía en capa fina preparativa (acetato de etilo al 100%) para dar la (9S)-2-(4-isopropil-1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (16,8 mg, 0,0385 mmol, 30% de rendimiento). Ms (ESI) calculado para C23H32N8O: 436,3.
Ejemplo 51: Síntesis de (9S)-N-(pirimidin-4-il)-2-(4-(2,2,2-trifluoroetil)-1,4-diazepan-1-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000080_0001
A una disolución de (9S)-2-(1,4-diazepan-1-il)-N-(pirimidin-4-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (100 mg, 0,254 mmol) en DMF (3 ml) se añadió carbonato sódico (80,7 mg, 0,761 mmol) y trifluorometanosulfonato de 2,2,2-trifluoroetilo (163 mg, 0,508 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, después se diluyó con diclorometano (10 ml) y se lavó con agua, salmuera, y se secó con sulfato sódico. Se separaron todos los disolventes a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía en capa fina preparativa con metanol en diclorometano al 3% para dar la (9S)-N-(pirimidin-4-il)-2-(4-(2,2,2-trifluoroetil)-1,4-diazepan-1-il)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (19,5 mg, 0,0409 mmol, 16% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H27F3N8O: 476,2.
Ejemplo 52: Síntesis de (4S)-7-(4-(2,2,2-trifluoroetil)-1,4-diazepan-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Etapa 1. Síntesis de 4-((4S)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-7-il)-1,4-diazepane-1-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000080_0002
A una disolución de (4S)-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (500 mg, 2,56 mmol), N-Boc-homopiperazina (953 mg, 4,76 mmol), terc-butóxido potásico (534 mg, 4,76 mmol) en DME (5 ml) se añadió [1,3-bis(2,6-diisopropilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilidene]cloro]alilpaladio(II) (12,4 mg, 0,0240 mmol). La mezcla se calentó a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, se añadió agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 15 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice (pentano:acetato de etilo 5:1) para dar el 4-((4S)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-7-il)-1,4-diazepan-1-carboxilato de tercbutilo (610 mg, 1,70 mmol, 66% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C19H29N5O2: 359,2.
Etapa 2. Síntesis de (4S)-7-(1,4-diazepan-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000080_0003
Una mezcla de 4-((4S)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepin-7-il)-1,4-diazepane-1-carboxilato de terc-butilo (610 mg, 1,70 mmol) y HCl en EtOAc (5M, 10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se separó el disolvente para dar la (4S)-7-(1,4-diazepan-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (418 mg, 1,61 mmol, 95% de rendimiento). MS (ESl) calculado para C14H21N5: 259,2.
Etapa 3. Síntesis de (4S)-7-(4-(2,2,2-trifluoroetil)-1,4-diazepan-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000080_0004
A una disolución de (4S)-7-(1,4-diazepan-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (418 mg, 1,61 mmol) en DMF (5 ml) se añadió trifluorometanosulfonato de 2,2,2-trifluoroetilo (748 mg, 3,23 mmol) y carbonato potásico (666 mg, 4,83 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con agua, se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato sódico, se filtraron y se concentraron. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice (pentano:acetato de etilo 6:1) para dar la (4S)-7-(4-(2,2,2-trifluoroetil)-1,4-diazepan-1-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (320 mg, 0,937 mmol, 58% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C16H22F3N5: 341,2.
Ejemplo 53: Síntesis de (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-((R)-3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida y (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-((S)-3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000081_0001
La (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (120 mg, 0,241 mmol) se cargó en una columna de 30x250 mm Chiralcel OD-H. En la elución con etanol:heptanos 20:80 eluía primero la (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-((R)-3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (41,3 mg, 0,0828 mmol, 34% de rendimiento), [a]D25 = 32 (c, 0,09, MeOH), seguido de la (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-((S)-3-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (44,8 mg, 0,0899 mmol, 37% de rendimiento) [a]D25 = 18,5 (c, 0,11, MeOH). MS (ESI) calculado para C25H25F3N6O2: 498,2; encontrado: 499,3 [M+H].
Ejemplo 54. Preparación de 1,1 -dióxido de (5S)-N-(5-fluoropiridin-3-il)-8-(3-(trifluorometil)fenil)-4,5-dihidro-2,5-metanopirido [2,3-g] [1,2,6]tiadiazocina-6(3H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (S)-(1-((2,6-dicloropiridin-3-il)sulfonil)pirrolidin-3-il)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000081_0002
A una disolución de cloruro de 2,6-dicloropiridina-3-sulfonil (Org. Process Res. Dev. 2009, 13, 875-879) (3,40 g, 13,8 mmol) en diclorometano (10 ml) se añadió (S)-pirrolidin-3-ilcarbamato de terc-butilo (2,82 g, 14,5 mmol), seguido de trietilamina (3,00 ml, 21,5 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, después se vertió en disolución saturada de bicarbonato sódico y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y el disolvente se separó a vacío, para dar el (S)-(1-((2,6-dicloropiridin-3-il)sulfonil)pirrolidin-3-il)carbamato de terc-butilo (5,47 g, 13,8 mmol, 100% de rendimiento).
Etapa 2. Síntesis de 1,1 -dióxido de (5S)-8-cloro-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina:
Figure imgf000081_0003
A una disolución de (S)-(1-((2,6-dicloropiridin-3-il)sulfonil)pirrolidin-3-il)carbamato de terc-butilo (5,47 g, 13,8 mmol) en diclorometano (30 ml) se añadió ácido trifluoroacético (10 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se separaron todos los disolventes a vacío. El residuo que quedaba se disolvió en DMF (30 ml) y se añadió carbonato sódico (10,0 g, 94,3 mmol). La reacción se agitó a 90°C durante 2 h. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en agua helada, y la disolución resultante se filtró, y los sólidos se lavaron con agua. El sólido recogido se secó y purificó por cromatografía en gel de sílice para dar el 1,1-dióxido de (5S)-8-cloro-3,4,5,6 tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina (1,80 g, 6,93 mmol, 50% de rendimiento).
Etapa 3. Síntesis de 1,1 -dióxido de (5S)-8-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g] [1 ,2 ,6]tiadiazocina:
Figure imgf000082_0001
Una mezcla de 1,1 -dióxido de (5S)-8-cloro-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina (800 mg, 3,08 mmol), ácido 3-trifluorometilbencenoborónico (1,17 g, 6,16 mmol), carbonato de cesio (3,00 g, 9,21 mmol) y [1 ,1 '-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(N) (370 mg, 0,453 mmol) en dioxano:agua 10:1 (45 ml) se agitó a 110°C durante la noche. Después de enfriar, el disolvente se separó a vacío, y el residuo se repartió entre diclorometano y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con agua, salmuera, se secó con Na2SO4, y el disolvente se separó a vacío. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice para dar el 1,1 -dióxido de (5S)-8-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina (1,00 g, 2,71 mmol, 88% de rendimiento).
Etapa 4. Síntesis de 1,1 -dióxido de (5S)-8-((S)-3-fluoropirrolidin-1-il)-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g] [1 ,2 ,6]tiadiazocina:
Figure imgf000082_0002
Se añadió hidrocloruro de la (S)-3-fluoropirrolidina (1,10 g, 8,76 mmol) a una disolución de 1,1 -dióxido de (5S)-8-cloro-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina (800 mg, 3,08 mmol) y carbonato sódico (1,60 g, 15,1 mmol) en DMF (10 ml). La reacción se agitó a 90°C durante 6 h, después se vertió sobre hielo triturado, se agitó y filtró. El sólido recogido se lavó con agua, se secó y se purificó por cromatografía en gel de sílice para dar el 1,1-dióxido de (5S)-8-((S)-3-fluoropirrolidin-1-il)-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina (680 mg, 2,18 mmol, 71% de rendimiento).
Etapa 5. Síntesis de 1,1-dióxido de (5S)-N-(5-fluoropiridin-3-il)-8-(3-(trifluorometil)fenil)-4,5-dihidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina-6(3H)-carboxamida:
Figure imgf000082_0003
Se disolvió 1,1-dióxido de (5S)-8-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4,5,6-tetrahidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina (70,0 mg, 0,190 mmol) en DMF (3 ml) y se añadió hidruro sódico (54 mg, 60% en aceite, 1,35 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y se añadió (5-fluoropiridin-3-il)carbamato de fenilo (176 mg, 0,768 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se vertió en agua y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se concentró a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía en capa fina preparativa para dar el 1,1-dióxido de (5S)-N-(5-fluoropiridin-3-il)-8-(3-(trifluorometil)fenil)-4,5-dihidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina-6(3H)-carboxamida (24,0 mg, 0,0473 mmol, 25% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C22H17F4N5O3S: 507,1; encontrado: 508,1 (M+H)+.
El siguiente compuesto se hizo de forma análoga: 1,1-dióxido de (5S)-N-(5-fluoropiridin-3-il)-8-((S)-3-fluoropirrolidin-1-il)-4,5-dihidro-2,5-metanopirido[2,3-g][1,2,6]tiadiazocina-6(3H)-carboxamida.
Ejemplo 55. Síntesis de (4S)-N-(3-(4-((6-aminohexanamido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000083_0001
Una disolución de ((1-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo (190 mg, 0,306 mmol) en ácido trifluoroacético (3,0 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, después se separó el exceso de ácido trifluoroacético a vacío. El residuo que quedaba se disolvió en DMF (5,0 ml) y trietilamina (1,0 ml), y se añadió 6-((tercbutoxicarbonil)amino)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (250 mg, 0,761 mmol). La reacción se agitó a 80°C durante 30 min, después se enfrió a 65°C y se añadió HCl 4 N (4 ml). La reacción se agitó a 65°C durante 2 h, después se filtró y el filtrado se purificó por HPLC preparativa. El material aislado se liofilizó a partir de acetonitrilo/HCl 1 N para dar el hidrocloruro de la (4S)-N-(3-(4-((6-aminohexanamido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (208 mg, 0,310 mmol, 100% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C32H34F3N9O2: 633,3; encontrado: 634,3(M+H)+.
Ejemplo 56. Síntesis de (4S)-N-(3-(4-((6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)hexanamido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000083_0002
A una disolución de (4S)-N-(3-(4-(aminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (44,2 mg, 0,0850 mmol) en acetonitrilo (1,3 ml) y trietilamina (0,13 ml, 0,933 mmol) se añadió éster de N-hidroxisuccinimida del ácido biotinamidohexanoico (40,9 mg, 0,090 mmol). La reacción se agitó a 65°C durante 2 h, después se añadió DMF (1 ml), y la mezcla de reacción resultante se filtró y el filtrado se purificó por HPLC preparativa para dar la (4S)-N-(3-(4-((6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)hexanamido)metil)-1H-1,2,3-triazoM-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (43,6 mg, 0,0448 mmol, 53% de rendimiento).
Ejemplo 57. Síntesis de (4S)-N-(3-(4-((3-(3',6'-dihidroxi-3-oxo-3H-spiro[isobenzofurano-1,9'-xanten]-5-il)tioureido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000084_0001
A una disolución de (4S)-N-(3-(4-(aminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][l,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (44,2 mg, 0,0850 mmol) en acetonitrilo (1,3 ml) y trietilamina (0,13 ml, 0,933 mmol) se añadió isotiocianato de fluoresceína isómero I (35,0 mg, 0,090 mmol). La reacción se agitó a 65°C durante 2 h, después se añadió DMF (1 ml) y la mezcla de reacción resultante se filtró y el filtrado se purificó por HPLC preparativa para dar la (4S)-N-(3-(4-((3-(3',6'-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofurano-1,9'-xanten]-5-il)tioureido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (51,0 mg, 0,0498 mmol, 58% de rendimiento).
Ejemplo 58. Síntesis de (4S)-N-(3-(4-((3-((Z)-2-((1-(difluoroboril)-1H-pirrol-2-il)metilen)-2H-pirrol-5-il)propanamido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000084_0002
A una disolución de (4S)-N-(3-(4-(aminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (12,2 mg, 0,0234 mmol) en acetonitrilo (0,35 ml) y trietilamina (0,035 ml, 0,251 mmol) se añadió éster de succinimidilo del ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-sindaceno-3-propiónico (10 mg, 0,0257 mmol). La reacción se agitó a 60°C durante 30 min, después la mezcla de reacción se purificó por HPLC preparativa para dar la (4S)-N-(3-(4-((3-((Z)-2-((1-(difluoroboril)-1H-pirrol-2-il)metilen)-2H-pirrol-5-il)propanamido)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (5,8 mg, 0,0064 mmol, 27% de rendimiento).
Ejemplo 59. Síntesis de (9S)-N-(4-(acetamidometil)fenil)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida:
Figure imgf000085_0001
A una disolución de hidrocloruro de la (9S)-N-(4-(aminometil)fenil)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (108 mg, 0,214 mmol) en piridina (3,0 ml) se añadió anhídrido acético (28,0 |jl, 0,300 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h y la mezcla de reacción se purificó por HPLC preparativa para dar el trifluoroacetato de la (9S)-N-(4-(acetamidometil)fenil)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida (111 mg, 0,178 mmol, 83% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C27H26F3N5O2: 509,2; encontrado: 510,2 (M+H)+.
Ejemplo 60. Preparación de (4S)-N-(3-(pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1: Síntesis de 3-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)pirrolidina-1-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000085_0002
Se disolvió (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (A7, 0,150 g, 0,490 mmol) en 5 ml de cloruro de metileno y se trató con DIEA (193 ul, 1,08 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se añadió 3-(3-aminofenil)pirrolidina-1-carboxilato de terc-butilo (0,141 g, 0,539 mmol) y la disolución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con 5 ml de cloruro de metileno y se lavó con 10 ml de una disolución saturada de hidrogenocarbonato sódico. Los extractos orgánicos se recogieron y se concentraron hasta sequedad. La purificación por cromatografía en columna de sílice usando acetato de etilo en pentano al 5-100% proporcionó el 3-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)pirrolidina-1-carboxilato de terc-butilo (0,077 g, 26%). MS (ESI) calculado para C32H34F3 N5O3: 593,3, encontrado: 594 [M+H].
Etapa 2: Síntesis de (4S)-N-(3-(pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000086_0001
El (S)3-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)pirrolidina-1-carboxilato de terc-butilo: (0,077 g, 0,130 mmol) se disolvió en 5 ml de HCl 4 N en 1.4- dioxano y se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 3 horas a temperatura ambiente. Después se separaron todos los disolventes a presión reducida y el sólido resultante se secó durante la noche a vacío para dar la (4S)-N-(3-(pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,078 g, 100%). MS (ESI) calculado para C27H26F3N5O: 493,21; encontrado: 494 [M+H].
Ejemplo 61. Preparación de (4S)-N-(3-(1-(2-amino-2-oxoetil)pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1.4- metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000086_0002
Se disolvió la (4S)-N-(3-(pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (B579, 0,029 g, 0,058 mmol) en 2 ml de cloruro de metileno y después se trató con DIEA (31 ul, 0,174 mmol). Después se añadió cloroacetamida (0,006 g, 0,064 mmol) y la reacción se calentó a 60°C durante la noche. La reacción después se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con 5 ml cloruro de metileno y se lavó con 10 ml de una disolución saturada de hidrogenocarbonato sódico. Los extractos orgánicos se concentraron hasta sequedad y se purificaron por cromatografía de fase inversa en C18 usando un gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de ácido trifluoroacético como aditivo para dar la (4S)-N-(3-(1-(2-amino-2-oxoetil)pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,008 g, 23%). MS (ESI) calculado para C29H29F3N6O2: 550,2; encontrado: 551 [M+H].
Ejemplo 62: Preparación de (4S)-N-(3-(1-(2-amino-2-oxoetil)pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000086_0003
Se disolvió la (4S)-N-(3-(pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (B579, 0,020 g, 0,038 mmol) en 1,5 ml cloruro de metileno y después se trató con DIEA (13 ul, 0,076 mmol). Después se añadió cloruro de acetilo (0,005 g, 0,042 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción después se diluyó con 5 ml cloruro de metileno y se lavó con 10 ml de una disolución saturada de hidrogenocarbonato sódico. Los extractos orgánicos se concentraron hasta sequedad y se purificaron por cromatografía de fase inversa en C18 para dar la (4S)-N-(3-(1-(2-amino-2-oxoetil)pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,023 g, 88%). MS (ESI) calculado para C29H28F3N5O2: 535,2; encontrado: 536 [M+H].
Este procedimiento de acilación general se usó para preparar la (4S)-N-(3-(1-propionilpirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida y (4S)-N-(3-(1-(ciclopropanecarbonil)pirrolidin-3-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida.
Ejemplo 63. Preparación de ((5-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)oxazol-2-il)metil)carbamato de bencilo:
Figure imgf000087_0001
La (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (0,276 g, 0,902 mmol) en 4 ml de cloruro de metileno se combinó con DIEA (400 ul, 2,261 mmol) y trifosgeno (0,200 g, 0,676 mmol). La mezcla después se calentó a 65°C momento en el que se añadió gota a gota lentamente ((5-(3-aminofenil)oxazol-2-il)metil)carbamato de bencilo (0,321 g, 0,992 mmol) en 4 ml cloruro de metileno. La mezcla después se calentó a 65°C durante 5 horas. La reacción después se enfrió a t.a. y después se añadieron 10 ml de cloruro de metileno seguido de lavado con 50 ml de una disolución saturada de hidrogenocarbonato sódico. La capa orgánica se recogió y se concentró hasta sequedad a presión reducida. Después el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para dar el ((5-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)oxazol-2-il)metil)carbamato de bencilo (0,082 g, 14%). MS (ESI) calculado para C35H29F3N6O4: 654,22; encontrado: 655 [M+H].
Ejemplo 64. Preparación de (4S)-N-(3-(2-(aminometil)oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000087_0002
Se disolvió el ((5-(3-((4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5-carboxamido)fenil)oxazol-2-il)metil)carbamato de bencilo (0,040 g, 0,06 mmol) en 10 ml acetato de etilo y se desgasifició tres veces con vacío. Después se añadieron aproximadamente 5 mg de paladio (10% sobre carbono tipo degaussa) y el recipiente de reacción se purgó tres veces con nitrógeno y después se equipó con un balón de hidrógeno. Después se inició la agitación y la mezcla se agitó en atmósfera de hidrógeno durante 2 horas. El recipiente de reacción después se evacuó y se purgó con nitrógeno. Los sólidos se separaron por filtración y se separó el disolvente a presión reducida para dar la (4S)-N-(3-(2-(aminometil)oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (0,032 g, 100%) que se usó sin purificación. MS (ESI) calculado para C27H23F3N6O2: 520,51; encontrado: 521 [M+H].
Ejemplo 65. Preparación de (4S)-N-(5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de fenilo:
Figure imgf000088_0001
A una disolución de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (1,5 g, 4,92 mmol) y piridina (0,74 ml, 9,84 mmol) en DCM (15 ml) se añadió cloroformiato de fenilo (1,1 ml, 8,85 mmol) a 0°C gota a gota. La mezcla resultante se agitó a esa temperatura durante 2 h, después se lavó con disolución acuosa saturada de NaHCO3, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se concentró para dar el carbamato de fenilo bruto (1,8 g) en forma de un aceite marrón, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Figure imgf000088_0002
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
A una disolución de la amina 5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-amina (30 mg, 0,18 mmol) en THF seco (5 ml) se añadió NaH (18 mg, 0,75 mmol) en porciones a 0°C, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Después se añadió (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de fenilo (157 mg, 0,37 mmol) y la mezcla se agitó durante la noche. La mezcla resultante se inactivó con MeOH (2 ml), se concentró a vacío mediante evaporador. El residuo se purificó por prep-TLC para dar el 2-(3-((2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (50 mg, rendimiento 54,9%) en forma de un sólido blanco.
Este procedimiento general usando el (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de fenilo se podía usar para preparar una variedad de carboxamidas usando las aril-aminas adecuadas en lugar de la 5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-amina.
Ejemplo 66. Preparación de (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carbotioamida
Etapa 1. Síntesis de 5-(3-isotiocianatofenil)oxazol:.
Figure imgf000088_0003
A una disolución de 3-(oxazol-5-il)anilina (160 mg, 1,0 mmol) y TEA (0,4 ml, 3,0 mmol) en THF seco (6 ml) se añadió una disolución de tiofosgeno (0,152 ml, 2,0 mmol) en THF seco (1,5 ml) gota a gota a lo largo de 10 min a 0°C en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, el análisis por TLC mostró que la 3-(oxazol-5-il)anilina se había consumido totalmente. Se separó el disolvente mediante evaporador a presión reducida, el residuo se diluyó con agua (10 ml) y acetato de etilo (25 ml), se separó la capa orgánica. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3x30 ml), las capas orgánicas combinadas se lavaron con disolución acuosa saturada de NaHCO3 seguido de agua y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron para dar el 5-(3-isotiocianatofenil)oxazol que se usó para la siguiente reacción sin más purificación. Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carbotioamida:
Figure imgf000089_0001
Se disolvió la (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (244 mg, 0,8 mmol) en DMF seca (5 ml) y se añadió NaH (128 mg, 60%, 3,2 mmol) en porciones a 0°C en atmósfera de argón. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. Se añadió gota a gota una disolución de 5-(3-isotiocianatofenil)oxazol preparada antes en DMF (3 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla resultante después se inactivó con disolución acuosa saturada de NH4Cl, se extrajo con acetato de etilo (3x15 ml), se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice usando DCM:MeOH =10:1 para dar el compuesto del título (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carbotioamida (186,1 mg, rendimiento 46%).
Ejemplo 67. Preparación de (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (S)-2-((5-bromo-2-nitrofenil)amino)succinato de dimetilo:
Figure imgf000089_0002
La mezcla de 4-bromo-2-fluoro-1-nitrobenceno (15,0 g, 68 mmol), hidrocloruro del (S)-2-aminosuccinato de dimetilo (15 g, 75 mmol) y DIPEA (36 ml) en DMSO (127 ml) se agitó a 100°C durante 2 h. Después de enfriar, se añadió agua (200 ml) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 4/1) para dar el (S)-2-((5-bromo-2-nitrofenil)amino)succinato de dimetilo (12,4 g, rendimiento 51%)
Etapa 2. Síntesis de (S)-2-(7-bromo-3-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-2-il)acetato de metilo (Sundia E655-523-23):
Figure imgf000089_0003
La mezcla de (S)-2-((5-bromo-2-nitrofenil)amino)succinato de dimetilo (12,4 g, 34,4 mmol), Fe (22 g, 392 mmol) y AcOH (1,2 ml) en i-PrOH (250 ml) y agua (50 ml) se agitó a temperatura de reflujo durante 2 h. Después de enfriar, los sólidos se filtraron y el filtrado se concentró. El residuo se diluyó con DCM (300 ml) y agua (300 ml), la capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 4/1) para dar el (S)-2-(7-bromo-3-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-2-il)acetato de metilo (8,8 g, rendimiento 86%) RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): 810,43 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,75-6,73 (m, 1H), 6,66-6,63 (m, 1H), 6,32 (s, 1H), 4,19-4,16 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 2,78-2,72 (m, 1H), 2,68-2,61 (m, 1H).
Etapa 3. Síntesis de (S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-2-il)etanol:
Figure imgf000090_0001
A la disolución de (S)-2-(7-bromo-3-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinoxaNn-2-N)acetato de metilo (4,4 g, 14,7 mmol) en THF (30 ml) se añadió BH3Me2S (10 M, 10 ml) a 0°C a lo largo de 15 min en un modo gota a gota. La reacción se calentó a temperatura de reflujo durante la noche. Después de enfriar, la mezcla se inactivó con HCl 6 N (10 ml) y la mezcla resultante se agitó a 50°C durante 2 h. La mezcla después se hizo básica usando NaOH 2 N y se llevó a pH~8. La mezcla se extrajo con DCM (3x50 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH = 20/1) para dar el (S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-2-il)etanol (2,4 g, rendimiento 63%).
Etapa 4. Síntesis de (4S)-7-bromo-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina:
Figure imgf000090_0002
Se añadió DDQ (2,7 g, 11,7 mmol) a una disolución de PPh3 (3,0 g, 11,7 mmol) en DCM (100 ml) a temperatura ambiente. Se añadió (S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-2-il)etanol (2,0 g, 7,8 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de separar el disolvente, el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH = 40/1) para dar la (4S)-7-bromo-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina (1,5 g, rendimiento 81%).
Etapa 5. Síntesis de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina:
Figure imgf000090_0003
A la mezcla de (4S)-7-bromo-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina (600 mg, 2,5 mmol), ácido (3-(trifluorometil)fenil)borónico (950 mg, 5,0 mmol), CS2CO3 (2,4 g, 7,5 mmol) en dioxano (60 ml) y agua (6 ml) se añadió Pd(dppf)Cl2 (204 mg, 0,25 mmol) a temperatura ambiente en atmósfera de N2. La mezcla se agitó a 110°C durante la noche. Después de enfriar, los sólidos se filtraron y el filtrado se concentró. El residuo se diluyó con DCM (30 ml) y agua (30 ml), La capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH = 20/1) para dar la (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina (700 mg, rendimiento 95%).
Etapa 6. Síntesis de (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000091_0001
La mezcla de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina (50 mg, 0,16 mmol), TEA (0,1 ml) y trifosgeno (40 mg, 0,13 mmol) en THF (5ml) se agitó a 60°C durante 2 h. Se añadió 3-(oxazol-5-il)anilina (38 mg, 0,24 mmol). La mezcla se agitó a 60°C durante la noche. Después de enfriar, la mezcla resultante se concentró, el residuo se purificó por prep-TLC (DCM/MeOH = 20/1) para dar la (4S)-N-(3-(oxazol-5-il)fenil)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (26,1 mg, rendimiento 33%). Ejemplo 68. Preparación de (4S)-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000091_0002
La mezcla de (4S)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina (50 mg, 0,16 mmol), DMAP (52 mg, 0,42 mmol) y piridin-2-ilcarbamato de fenilo (89 mg, 0,42 mmol) en CH3CN (2,5 ml) se calentó a reflujo durante la noche. Después de enfriar, se separó el disolvente. El residuo se purificó por prep-TLC (DCM/MeOH = 20/1) para dar la (4S)-N-(piridin-2-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-metanobenzo[b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (24,4 mg, rendimiento 35%).
Ejemplo 69. Preparación de (4S)-N-(piridin-3-il)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de (4S)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000091_0003
Este resto se hizo usando el procedimiento general de acoplamiento de Negishi anterior para dar la (4S)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina como una mezcla 11:1 de diastereoisómeros (482 mg, 36%). MS (ESI) calculado para C16H20F3N3: 311,16; encontrado: 312 [M+H].
Etapa 2. Síntesis de (4S)-N-(piridin-3-il)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000092_0001
Estos compuestos se hicieron usando el procedimiento de acoplamiento de trifosgeno y urea anterior para dar la (4S)-N-(piridin-3-il)-7-(3-(trifluorometil)cidohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida como una mezcla 9:1 de diastereoisómeros (38 mg, 62%). MS (ESI) calculado para C22H24F3N5O: 431,19; encontrado: 432 [M+H].
Ejemplo 70. Preparación de (4S)-N-(pirimidin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000092_0003
Esta mezcla de diastereoisómeros se hizo usando el siguiente protocolo.
Se suspendió carbonildiimidazol (CDI, 21 mg, 0,13 mmol) en DCM (1,5 ml), seguido de la adición de 4-aminopirimidina (13 mg, 0,13 mmol). Para conseguir todo en disolución se añadió dioxano (0,5 ml). La mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1 h en atmósfera de nitrógeno. Se añadió (4S)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (41 mg, 0,13 mmol) en DCM (1 ml), y la reacción se dejó agitar durante la noche, después se añadió más CDI (21 mg) y la reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 4 h. La reacción se vigiló por LCMS y el compuesto intermedio (antes de la adición de 4-aminopirimidina) era el componente de reacción principal. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se concentró, después se añadió más 4-aminopirimidina (25 mg) en 1 ml DMSO (para la mejor solubilidad). La reacción se calentó a 60°C durante la noche, después a 100°C en a tubo sellado durante una segunda noche. Se añadió más 4-aminopirimidina (25 mg) y la reacción sellada y se calentó a 120°C en microondas durante 1 h. Se añadió DCM (10 ml), y después HCl 1 N (3 ml). Esta se extrajo con DCM (3x15 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH/DCMal 0 - 10%), después de nuevo por prep-HPLC para dar la (4S)-N-(pirimidin-4-il)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (4 mg, 7%). MS (ESl) calculado para C21H23F3N6O: 432,19; encontrado: 433 [M+H].
Ejemplo 71. Preparación de (4S)-N-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000092_0002
Esta mezcla de diastereoisómeros se hizo usando el siguiente protocolo.
Procedimiento general de formación de carbamato:
Se añadió gota a gota cloroformiato de fenilo (2,09 g, 13,3 mmol, 1,05 equiv.) a lo largo de 1,5 h a una disolución enfriada de 4,5-dimetiltiazol-2-amina (1,63 g, 12,7 mmol, 1,0 equiv.) y piridina (3,01 g, 38,2 mmol, 3,0 equiv.) en DCM (16 ml). La reacción se agitó con enfriamiento continuado durante 2 h. Se añadió agua (15 ml) lentamente a lo largo de 30 min, y después la mezcla se diluyó con DCM. Se separaron las capas y la capa orgánica se lavó con disolución acuosa saturada de carbonato sódico (20 ml), después salmuera (20 ml). La capa orgánica después se secó sobre Na2SO4, y después se concentró a presión reducida. El residuo se suspendió en EA/PE (1:5) durante 30 min, después se filtró para dar el (4,5-dimetiltiazol-2-il)carbamato de fenilo (1,7 g, 54%).
Procedimiento general para el acoplamiento de urea mediante carbamato:
Una mezcla de (4,5-dimetiltiazol-2-il)carbamato de fenilo (80 mg, 0,322 mmol, 2,0 equiv.), (4S)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (75 mg, 0,161 mmol, 1,0 equiv.) y DMAP (24 mg, 0,193 mmol, 1,2 equiv.) en acetonitrilo (4 ml) se agitó a 60°C durante la noche. Se usaron TLC y LC/MS para vigilar el avance de la reacción. La mezcla se purificó por prep-HPLC para dar la (4S)-N-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-7-(3-(trifluorometil)ciclohexil)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (14,5 mg, 12%). MS (ESI) calculado para C22H26F3N5OS: 465,18; encontrado: 466 [M+H].
Ejemplo 72. Preparación de N-(piridazin-3-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (Compuesto xx):
Etapa 1: 3-aminopent-2-enedioato de dietilo
Figure imgf000093_0001
Un matraz de 3 bocas de 250 ml se cargó con 6,00 g (29,7 mmol) del éster 1,3-acetonedicarboxilato de dietilo, 4,70 g (59,4 mmol) de bicarbonato amónico y 80 ml de etanol. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h, después se concentró a vacío. El residuo se recogió en 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se volvieron a extraer con salmuera (1 x 200 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para dar 5 g (87%) del producto en forma de un aceite incoloro. Este se usó en la siguiente reacción sin más purificación.
Etapa 2: 3-aminopentanodioato de dietilo
Figure imgf000093_0002
Un matraz de 3 bocas de 250 ml se cargó con 5,00 g (24,8 mmol) de 3-aminopent-2-enedioato de dietilo, 40 ml de etanol, 10 ml de ácido acético glacial y 3,1 g (49,6 mmol) de NaBHaCN. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, después los disolventes se separaron a vacío. El residuo se recogió en agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Las capas de acetato de etilo combinadas se volvieron a extraer con salmuera (1 x 200 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vacío para dar 4 g (80%) del producto en forma de un aceite incoloro. Este se usó en la siguiente reacción sin más purificación.
Etapa 3: 3-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)pentanodioato de dietilo
Figure imgf000093_0003
Un matraz de 3 bocas de 250 ml se cargó con 1,8 g (9,8 mmol) de 2,6-dicloro-3-nitropiridina, 4,0 g (19,7 mmol) de 3-aminopentanodioato de dietilo bruto, 3,2 g (39,0 mmol) de NaHCO3, y 60 ml de tetrahidrofurano. La reacción se agitó a 40°C durante 24 h, después se separó el disolvente a vacío. El residuo se disolvió en 100 ml de agua, después se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se volvieron a extraer con salmuera (1 x 200 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 20/1 (v/v) para dar 2,7 g (80%) del producto en forma de un sólido amarillo claro.
Etapa 4: 3-((3-amino-6-doropiridin-2-il)amino)pentanodioato de dietilo
Figure imgf000094_0001
Un matraz de 3 bocas de 250 ml equipado con un termómetro y una barra agitadora magnética se cargó con 2,7 g (7,5 mmol) de 3-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)pentanodioato de dietilo, 2,1 g (37,5 mmol) de hierro en polvo, 60 ml de 2-propanol, 20 ml de agua y 675 mg (11,0 mmol) de ácido acético. La mezcla se agitó a 100°C durante 1 h, vigilando por HPLC la desaparición del nitrocompuesto de partida. Después de completarse la reacción, los sólidos se filtraron y se lavaron con 2-propanol (3 x 50 ml), después el filtrado y los lavados combinados se concentraron a vacío. El residuo se disolvió en 100 ml de agua y se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se volvieron a extraer con salmuera (1 x 50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron hasta sequedad. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 4/1 (v/v) para dar 1,8 g (75%) del producto en forma de un sólido gris.
Etapa 5: 2-(7-cloro-2-oxo-2,3,4,5-tetrahidro-1H-pirido[2,3-b][1,4]diazepin-4-il)acetato de etilo
Figure imgf000094_0002
Un matraz de 3 bocas de 100 ml equipado con un termómetro y un refrigerante de reflujo, se cargó con 1,8 g (5,4 mmol) de 3-((3-amino-6-cloropiridin-2-il)amino)pentanodioato de dietilo, 20 ml de tolueno y 1,0 ml (13,4 mmol) de ácido trifluoroacético. La mezcla se agitó a temperatura de reflujo durante 5 h y se vigiló en la reacción por HPLC la desaparición del material de partida. Después de completarse la reacción, los disolventes se separaron a vacío, después el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 3/1 (v/v) para dar 1,1 g (70%) del producto en forma de un sólido blanquecino.
Etapa 6: 2-(7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1H-pirido[2,3-b][1,4]diazepin-4-il)etanol
Figure imgf000094_0003
Un matraz de 3 bocas de 50 ml equipado con una entrada de nitrógeno, un refrigerante de reflujo y un termómetro, se cargó con 1,0 g (3,5 mmol) de 2-(7-cloro-2-oxo-2,3,4,5-tetrahidro-1H-pirido[2,3-b][1,4]diazepin-4-il)acetato de etilo, 530 mg (14,0 mmol) de LiAlH4, y 10 ml de tetrahidrofurano. La reacción se agitó en atmósfera de N2 a 60°C durante 6 h, vigilando la aparición de producto por HPLC. El éster se redujo rápidamente, pero la lactama requirió más tiempo para completar la reducción. Cuando la reacción se había completado, la mezcla se enfrió con un baño de hielo, se añadieron 530 pl de agua mientras se mantenía la temperatura interior por debajo de 5°C, después la mezcla se agitó durante 15 min. Después, se añadieron 530 pl de NaOH(ac.) al 15% (p/p) mientras se mantenía la temperatura interior por debajo de 5°C, después la mezcla se agitó durante 15 min. Para completar el tratamiento, se añadieron 1590 pl de agua, después la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Los sólidos se filtraron, después el precipitado se lavó con tetrahidrofurano (3 x 50 ml). El filtrado se concentró a vacío, después el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 2/1 para dar 520 mg (65%) del producto en forma de un sólido amarillo claro.
Etapa 7: 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina
Figure imgf000095_0001
Un matraz de 3 bocas de 50 ml se cargó con 500 mg (2,2 mmol) de 2-(7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1H-pirido[2,3-b][1,4]diazepin-4-il)etanol, y 10 ml de HBr(ac.) al 40% (p/p). La mezcla se agitó a temperatura de reflujo durante 18 h, después se enfrió a temperatura ambiente y se neutralizó con disolución saturada de NaHCO3(ac.). La mezcla acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml), después las capas orgánicas combinadas se volvieron a extraer con salmuera (1 x 50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetato de etilo 3/1 para dar 320 mg (70%) del producto en forma de un sólido blanquecino.
Etapa 8. Síntesis de 7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000095_0002
Una mezcla de dioxano/agua (10 ml/1 ml) se desgasificó y se añadió 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (250 mg, 1,196 mmol), seguido de ácido 3-(trifluorometil)fenilborónico (454 mg, 2,392 mmol), pd(dppf)Cl2 (97 mg, 0,19 mmol) y Cs2Co3 (1,16 g, 3,588 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 12 horas, después se concentró y se purificó por cromatografía en columna (PE/EtOAc = 4/1) para dar 7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (200 mg, 48%). MS (ESl) calculado para C17H16F3N3: 319,13.
Etapa 9. Síntesis de N-(piridazin-3-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000095_0003
Se usó el siguiente procedimiento general de acoplamiento de ureas:
El carbamato de la piridazin-3-amina (53,9 mg, 0,25 mmol, 2,0 equiv.), 7-(3-(trifluorometil)fenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (40 mg, 0,12 mmol, 1,0 equiv.) y DMAP (18,4 mg, 0,15 mmol, 1,2 equiv.) en acetonitrilo (5 ml) se agitaron a 60°C durante la noche. El avance de la reacción se vigiló por TLC y LC/MS. La mezcla de reacción se cargó directamente en TLC prep. usando EtOAc al 100% como eluyente, para dar la N-(piridazin-3-il)-7-(3-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida en forma de un sólido blanco (16,9 mg, 30,6%). MS (ESl) calculado para C22H19F3N6O: 440,16; encontrado: 440,9 [M+H]. Este procedimiento general de acoplamiento de ureas se podía usar para preparar una variedad de 7-(3-(trifluorometil)fenil)-, 7-(3-clorofenil)-, 7-(5-cloropiridin-3-il)- y 7-(5-fluoropiridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamidas sustituyendo la piridazin-3-amina por el resto de amina adecuado.
Ejemplo 73. Preparación de 7-(3-clorofenil)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de 7-cloro-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000096_0001
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. Una mezcla de 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (3,0 g, 14,31 mmol), (Boc)2O (4,6 g, 21,05 mmol, 1,5 equiv.) y DMAP (3,49 g, 28,62 mmol, 2,0 equiv.) en THF (5 ml) se agitó a 60°C durante 2 h. Se usaron TLC y LC/MS para vigilar el avance de la reacción. Se añadió agua (30 ml) y la mezcla se extrajo con DCM (3x15 ml). Los extractos orgánicos se concentraron y el residuo se purificó por cromatografía en columna para dar el 7-cloro-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo en forma de un sólido blanco (4,5 g, 92%). MS (ESI) calculado para C-i5H2qCIN302: 309,12.
Etapa 2. Síntesis de 7-(3-clorofenil)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo: (Sundia Prop. 455)
Figure imgf000096_0002
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. A una mezcla desgasificada de dioxano/agua (20 ml/1ml) se añadió 7-cloro-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo (1,5 g, 4,85 mmol), ácido (3-clorofenil)borónico (1,51 g, 9,70 mmol), Pd(dppf)Cl2 (0,396 g, 0,485 mmol), y Cs2cOa (4,74 g, 14,56 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 12 h, después se concentró y se purificó por cromatografía en columna (PE/EA = 2/1) para dar el 7-(3-clorofenil)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo (1,2 g, 89%). MS (ESI) calculado para C2H24ClN3O2: 385,16.
Este procedimiento general de acoplamiento se podía usar para preparar una variedad de 7-(3-sustituido fenil o piridil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepinas sustituyendo el ácido (3-clorofenil)borónico por el resto de ácido borónico o éster borónico adecuado.
Etapa 3. Síntesis de 7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina: (Sundia Prop. 455)
Figure imgf000096_0003
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. Se disolvió el 7-(3-clorofenil)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo (1,2 g, 3,1 mmol) en HCl/MeOH (1 M, 20 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h, después se concentró a vacío. Se añadieron agua (20 ml) y K2CO3 (3 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, después se extrajo con DCM (3x15 ml). Los extractos orgánicos se concentraron para dar la 7-(3-clorofenil)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (800 mg, 90%). MS (ESI) calculado para C -^H ^C N 285,10.
Etapa 4. Síntesis de 7-(3-clorofenil)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000096_0004
Este compuesto se hizo usado el procedimiento general de acoplamiento de ureas para dar la 7-(3-clorofenil)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (20,4 mg, 24%). MS (ESI) calculado para C22H20ClN5O: 405,14; encontrado: 406 [M+H].
Ejemplo 74. Preparación de 7-(5-fluoropiridin-3-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Etapa 1. Síntesis de 7-(5-fluoropiridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000097_0001
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. A una mezcla desgasificada de dioxano/agua (30 ml/3 ml) se añadió 7-cloro-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo (1,39 g, 4,5 mmol), ácido (5-fluoropiridin-3-il)borónico (1,27 g, 9,0 mmol), Pd(dppf)Cl2 (0,37 g, 0,45 mmol) y Cs2CO3 (4,40 g, 13,5 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 12 h, después se concentró y se purificó por cromatografía en columna (PE/EA = 2/1) para dar el 7-(5-fluoropiridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de tercbutilo (1,5 g, 89%). MS (ESI) calculado para C20H23FN4O2: 370,18.
Etapa 2. Síntesis de 7-(5-fluoropiridin-3-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina:
Figure imgf000097_0002
Este resto se hizo usando el siguiente protocolo. Se añadió TFA (20 ml) a una disolución de 7-(5-fluoropiridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxilato de terc-butilo (1,50 g) en DCM (20 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, y después se concentró a vacío. El residuo se hizo básico con disolución saturada de NaHCO3y se extrajo con DCM (3x15 ml). Los extractos orgánicos se concentraron para dar la 7-(5-fluoropiridin-3-il)-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina (1,2 g, 100%). MS (ESI) calculado para C15H15FN4: 270,13.
Etapa 3. Síntesis de 7-(5-fluoropiridin-3-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida:
Figure imgf000097_0003
Este compuesto se hizo usando el procedimiento general de acoplamiento de ureas para dar la 7-(5-fluoropiridin-3-il)-N-(piridin-3-il)-3,4-dihidro-1,4-etanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (12,8 mg, 15%). MS (ESI) calculado para C21H19FN6O: 390,16; encontrado: 391 [M+H].
Ejemplo 75. Preparación de 3-bromo-5-(oxazol-5-il)anilina:
Etapa 1. Síntesis de 5-(3-bromo-5-nitrofenil)oxazol:
Figure imgf000097_0004
A una disolución de 3-bromo-5-nitrobenzaldehído (1 g, 4,34 mmol) en DME (10 ml) se añadió K2CO3 (1,2 g, 8,68 mmol), seguido de 1-((isocianometil)sulfonil)-4-metilbenceno (891 mg, 4,56 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura de reflujo durante la noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió EtOAc y la mezcla se lavó con H2O dos veces y después con salmuera. Las capas orgánicas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía en gel de sílice (gradiente de EtOAc en pentano de 0% a 100%) proporcionó el 5-(3-bromo-5-nitrofenil)oxazol (762 mg, 65%) en forma de un sólido naranja. MS (ESI) calculado para CgH5BrN2Oa: 268,0, 270,0.
Etapa 2. Síntesis de 3-bromo-5-(oxazol-5-il)anilina:
Figure imgf000098_0001
A una disolución de 5-(3-bromo-5-nitrofenil)oxazol (762 mg, 2,83 mmol) en THF (14 ml) se añadió ácido acético (13,6 ml), seguido de hierro en polvo (474 mg, 8,49 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60°C durante la noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se vertió en una disolución saturada de Na2CO3 (175 ml) y se extrajo con EtOAc (50 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para dar la 3-bromo-5-(oxazol-5-il)anilina (697 mg) en forma de un aceite marrón. Este material se usó sin más purificación. MS (ESI) calculado para C9HyBrN2O: 238,0, 240,0.
Este procedimiento general de dos etapas de formación de oxazol seguido de reducción de nitro, se podía usar para preparar la 4-bromo-5-(oxazol-5-il)anilina usando 4-bromo-5-nitrobenzaldehído.
Ejemplo 76. Preparación de 6-(oxazol-5-il)piridin-2-amina:
Etapa 1. Síntesis de 6-amino-N-metoxi-N-metilpicolinamida:
Figure imgf000098_0002
A una suspensión de ácido 6-aminopicolínico (10,0 g, 72,5 mmol) en acetonitrilo (150 ml) se añadió hidrocloruro de la N,O-dimetilhidroxilamina (8,52 g, 87,0 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (11,8 g, 87,0 mmol), hidrocloruro de la N-(3-dimetilamino)-N'-etilcarbodiimida (16,7 g, 87,0 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (37,7 ml, 217 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y el disolvente se separó a vacío. El residuo se repartió entre NaOH 1 N y acetato de etilo y la capa acuosa se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato sódico y el disolvente se separó a vacío. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo con 0,1% de trietilamina) para dar la 6-amino-N-metoxi-N-metilpicolinamida (4,30 g, 23,7 mmol, 33% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C8H11N3O2: 181,1.
Etapa 2. Síntesis de 6-(oxazol-5-il)piridin-2-amina:
Figure imgf000098_0003
Se añadió hidruro de litio y aluminio (1,08 g, 28,5 mmol) a una disolución de 6-amino-N-metoxi-N-metilpicolinamida (4,30 g, 23,7 mmol) en THF (30 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 90 min. Se añadió lentamente acetato de etilo (30 ml), la reacción se filtró y se recogió el filtrado y se separaron todos los disolventes a vacío para dar el 6-aminopicolinaldehído, que se llevó en forma bruta a la siguiente etapa.
A una disolución del aldehído anterior en metanol (20 ml) se añadió isocianuro de p-toluenosulfonilmetilo (13,9 g, 71,2 mmol) y carbonato potásico (19,4 g, 140 mmol). La reacción se agitó a temperatura de reflujo durante 2 h, después se separaron todos los disolventes a vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo (150 ml) y agua (70 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato sódico y el disolvente se separó a vacío. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía ultrarrápida (metanol en diclorometano al 10%) para dar la 6-(oxazol-5-il)piridin-2-amina (2,00 g, 12,4 mmol, 52% de rendimiento en dos etapas). MS (ESI) calculado para C8H7N3O: 161,1. Los siguientes compuestos se prepararon de una forma análoga: 4-(oxazol-5-il)piridin-2-amina; 5-(oxazol-5-il)piridin-3-amina.
Ejemplo 77: Síntesis de 3,5-bis(oxazol-5-il)anilina:
Etapa 1. Síntesis de N1,N3-dimetoxi-N1,N3-dimetil-5-nitroisoftalamida:
Figure imgf000099_0001
A una disolución de ácido 5-nitroisoftálico (5,00 g, 23,7 mmol) en diclorometano (100 ml) se añadió cloruro de oxalilo (5,00 ml, 59,1 mmol) y la disolución se enfrió a 0°C. Se añadió gota a gota DMF (1,0 ml) a lo largo de 30 min. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 4 h. Se separaron todos los disolventes a vacío.
A una mezcla de hidrocloruro de la N,O-dimetilhidroxilamina (4,6 g, 47,1 mmol) y trietilamina (6,60 ml, 47,4 mmol) en diclorometano (80 ml) se añadió una disolución del cloruro de ácido anterior en diclorometano (20 ml) a 0°C. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se concentró a vacío. El residuo se repartió entre hidróxido sódico 1 N y acetato de etilo, se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato sódico, los disolventes se separaron a vacío y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:acetato de etilo 1 :1 ) para dar la N1,N3-dimetoxi-N1,N3-dimetil-5-nitroisoftalamida (4,00 g, 13,5 mmol, 57% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C12H15N3O6: 297,1.
Etapa 2. Síntesis de 5-nitroisoftalaldehído:
Figure imgf000099_0002
Se añadió hidruro de litio y aluminio (2,70 g, 71,1 mmol) a una disolución agitada de N1,N3-dimetoxi-N1,N3-dimetil-5-nitroisoftalamida (5,00 g, 16,9 mmol) en THF (150 ml) a -40°C. La reacción se agitó a -40°C durante 4 h. Se añadió lentamente disolución de hidróxido sódico al 10% (2,7 ml), seguido de agua (2,7 ml). El sólido resultante se filtró y el filtrado se concentró a vacío para dar el 5-nitroisoftalaldehído (1,37 g, 7,65 mmol, 45% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C8H5NO4: 179,0.
Etapa 3. Síntesis de 5,5'-(5-nitro-1,3-fenilen)bis(oxazol):
Figure imgf000099_0003
Se añadieron 1-isocianometanosulfonil-4-metil-benceno (7,40 g, 37,8 mmol) y carbonato potásico anhidro (5,20 g, 37,8 mmol) a una disolución de 5-nitroisoftalaldehído (1,37 g, 7,65 mmol) en metanol (100 ml). La reacción se calentó a temperatura de reflujo en atmósfera de nitrógeno durante 2 h. Después de enfriar, se separó el disolvente a vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo (150 ml) y agua (70 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato sódico y se concentraron para dar el 5,5'-(5-nitro-1,3-fenileno)bis(oxazol) bruto (1,70 g, 6,61 mmol, 86% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C12H7N3O4: 257,0.
Etapa 4. Síntesis de 3,5-bis(oxazol-5-il)anilina:
Figure imgf000099_0004
Una mezcla de 5,5'-(5-nitro-1,3-fenileno)bis(oxazol) (1,70 g, 6,61 mmol) y paladio sobre carbono (200 mg) en acetato de etilo (50 ml) se agitó en atmósfera de hidrógeno durante 4 h. Los sólidos se filtraron y el filtrado se concentró a vacío. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:acetato de etilo 4:1) para dar la 3,5-bis(oxazol-5-il)anilina (1,30 g, 5,72 mmol, 87% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C12H9N3O2: 227,1.
Ejemplo 78. Preparación del (2-(4-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000100_0001
Un vial de microondas de 20 ml se cargó con (2-bromoetil)carbamato de terc-butilo (551 mg, 2,50 mmol), azida sódica (460 mg, 7,05 mmol) y DMF (5 ml). El vial se selló y se calentó en el microondas a 110°C durante 12 h. La mezcla de reacción se vertió en agua (8 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico y se separaron todos los disolventes a vacío para dar el (2-azidoetil)carbamato de terc-butilo bruto.
El (2-azidoetil)carbamato de terc-butilo bruto se disolvió en THF (5 ml) y trietilamina (1 ml). Se añadió 3-etinilanilina (350 mg, 2,99 mmol) seguido de yoduro de cobre (I) (15,0 mg, 0,0788 mmol). La reacción se agitó a 60°C durante 2 h, después se separaron todos los disolventes a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en pentano de 50% a 100%) para dar el (2-(4-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)carbamato de terc-butilo 415 mg, 1,37 mmol, 55% de rendimiento en 2 etapas.) MS (ESI) calculado para C15H21N5O2: 303,2.
Ejemplo 79. Preparación de ((1-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000100_0002
A una disolución de 3-azidoanilina (Chem. Commun. 2004, 888) (1,34 g, 9,99 mmol) en THF (9,0 ml) y trietilamina (1,0 ml) se añadió prop-2-in-1-ilcarbamato de terc-butilo (1,55 g, 9,99 mmol) y yoduro de cobre (I) (40 mg, 0,210 mmol). La reacción se agitó a 60°C durante 1 h, después se separaron todos los disolventes a vacío. El residuo que quedaba se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en pentano de 0% a 80%) para dar el ((1-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)carbamato de terc-butilo (Compuesto #; 1,71 g, 5,91 mmol, 59% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C14H19N5O2: 289,1; encontrado: 290,1 [M+H].
Ejemplo 80: Preparación de ((1-(3-aminofenil)-1H-1,2,3-triazol-5-il)metil)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000100_0003
En un vial con 3-azidoanilina (1,33 g, 9,92 mmol), prop-2-in-1-ilcarbamato de terc-butilo (1,55 g, 9,99 mmol) y cloruro de pentametilciclopentadienilbis(trifenilfosfina)rutenio(II) (15,9 mg, 0,020 mmol) se añadió tolueno (10 ml). La reacción se agitó a 100°C durante 72 h, después la reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió diclorometano (5 ml) para disolver cualquier sólido y la disolución que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice (acetato de etilo en pentano de 50% a 80%) para dar el ((1-(3-aminofenil)-1H-,2,3-triazol-5-il)metil)carbamato de terc-butilo (970 mg, 3,35 mmol, 34% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C14H19N5O2: 289,2.
Ejemplo 81: Preparación de N4,N4-dimetilpirimidina-2,4-diamina:
Figure imgf000101_0001
Se disolvió la 4-cloro-2-aminopirimidina (495 mg, 3,82 mmol) en disolución acuosa de dimetilamina (33%) en un tubo sellado, y la reacción se agitó a 100°C durante la noche. Después de enfriar, la reacción se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, y se secó con sulfato sódico, y los disolventes se separaron a vacío para dar la N4,N4-dimetilpirimidina-2,4-diamina (400 mg, 2,89 mmol, 76% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C6H10N4: 138,1.
Ejemplo 82: Preparación de 4-(2-aminopirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo:
Figure imgf000101_0002
Se añadió THF (20 ml) a una mezcla de 4-cloro-2-aminopirimidina (500 mg, 3,87 mmol) y N-Boc piperazina (7,21 g, 38,7 mmol). La reacción se agitó a 70°C durante la noche. Después de enfriar, se separó el disolvente a vacío y el residuo que quedaba se purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:acetato de etilo 1 :1 ) para dar el 4-(2-aminopirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (650 mg, 2,33 mmol, 60% de rendimiento). MS (ESI) calculado para C13H21N5O2: 279,2.
El siguiente compuesto se hizo de una forma análoga: 4-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidin-2-amina
Ejemplo 83. Preparación de (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo:
Etapa 1. Síntesis de 2-bromo-5-nitrobenzaldehído:
Figure imgf000101_0003
A una disolución de 2-bromobenzaldehído (10,0 g, 53,7 mmol) en H2SO4 (100 ml) se añadió KNO3 (5,43 g, 53,7 mmol) en porciones a lo largo de 1 h a 0°C. La mezcla se agitó durante 40 min y se añadió KNO3 (0,72 g) adicional. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 3 h y después se vertió en agua helada. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se recristalizó en EtOAc/Pentano para dar el 2-bromo-5-nitrobenzaldehído (11,7 g, 94% de rendimiento) en forma de un sólido blanco. MS (ESI) calculado para CyH4BrNO3: 228,9.
Etapa 2. Síntesis de 5-(2-bromo-5-nitrofenil)oxazol:
Figure imgf000101_0004
Una mezcla de 2-bromo-5-nitrobenzaldehído (1,0 g, 4,33 mmol), K2CO3 (1,79 g, 12,9 mmol) y TosMIC (2,12 g, 10,8 mmmol) en MeOH se calentó a 60°C durante 1,5 h. La mezcla se concentró. Se añadió agua y el sólido se recogió por filtración, se lavó con agua, MeOH y después éter de petróleo para dar el 5-(2-bromo-5-nitrofenil)oxazol (750 mg, rendimiento 65%). en forma de un sólido gris. MS (ESI) calculado para CgH5BrN2O3: 228,9.
Etapa 3. Síntesis de (3-(4-nitro-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000102_0001
A una disolución de 5-(2-bromo-5-nitrofenil)oxazol (300 mg, 1,11mmol) en DME (20 ml) se añadió prop-2-in-1-ilcarbamato de terc-butilo (431 mg, 2,77 mmol) en atmósfera de N2. Se añadieron Cul (21 mg, 0,11 mmol) y Pd(dppf)Cl2 (78 mg, 0,11 mmol) seguido de TEA (0,5 ml). La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 4 h, se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (EtOAc: Pentano = 1:5) para dar el (3-(4-nitro-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo (350 mg, rendimiento 92%) en forma de un aceite amarillo. MS (ESI) calculado para C17H17N3O5: 343,1. Etapa 4. Síntesis de (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1 -il)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000102_0002
Una suspensión de (3-(4-nitro-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo (3,8 g, 11,1 mmol) y Fe (4,96 g, 8,86 mmol) en disolución sat. ac. de NH4Cl/MeOH (V/V=1:3) se calentó a 60°C durante 4,5 h. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se pasó a través de una almohadilla de celite y el filtrado se concentró. El residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con agua, se secó (Na2SO4) y se concentró. El residuo bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para dar el (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo (1,51 g, rendimiento 44%) en forma de un aceite amarillo. MS (ESI) calculado para Ci7HigN3O3: 228,9.
El (3-(3-amino-5-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo se preparó a partir del 3-bromo-5-nitrobenzaldehído en una forma similar a la descrita para el (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo.
Ejemplo 84. Preparación de (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)propil)carbamato de terc-butilo:
Figure imgf000102_0003
Una mezcla de (3-(4-nitro-2-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo (3,0 g, 8,75 mmol) y Pd/C al 10% en peso (1,0 g) en MeOH (100ml) se agitó en atmósfera de H2 ((3,5 kg/cm2) 50 psi)) durante 16 h. El catalizador de la mezcla se separó por filtración y el filtrado se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para dar el (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)propil)carbamato de terc-butilo (940 mg, rendimiento 35%) en forma de un aceite amarillo. MS (ESI) calculado para C17H23N3O3: 228,9.
El (3-(3-amino-5-(oxazol-5-il)fenil)propil)carbamato de terc-butilo se preparó a partir del (3-(3-nitro-5-(oxazol-5-il)fenil)prop-2-in-1-il)carbamato de terc-butilo en una forma similar a la descrita para el (3-(4-amino-2-(oxazol-5-il)fenil)propil)carbamato de terc-butilo.
Ejemplo 85. Preparación de 2-(3,3-difluoropirrolidin-1-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina:
Figure imgf000103_0001
Una mezcla de 2-fluoro-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina (1 g, 4,48 mmol), hidrocloruro de 3,3-difluoropirrolidina (1,9 g, 13,4 mmol) y K2CO3 (3 g, 22,4 mmol) en NMP (13 ml) se agitó a 110 °C durante la noche. Se añadió una segunda porción de hidrocloruro de 3,3-difluoropirrolidina (0,5 g) y se agitó durante la noche. La mezcla se filtró, se lavó con H2O, se añadió HCl 2 N para ajustar el pH a 1. La mezcla se lavó con EtOAc para separar la 2-fluoro-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina residual. La capa acuosa se ajustó a pH 13 con disolución de K2CO3, después se extrajo con EtOAc para dar la 2-(3,3-difluoropirrolidin-1-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina (220 mg, 17%). MS (ESI) calculado para C15H21BF2N2O2: 310,2.
Este procedimiento general se podía usar para preparar la 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-2-(3-(trifluorometil)pirrolidin-1-il)piridina usando el hidrocloruro de 3-(trifluorometil)pirrolidina.
Ejemplo 86. Preparación de (S)-2-(3-fluoropirrolidin-1-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina:
Figure imgf000103_0002
Una mezcla de 2-fluoro-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina (200 mg), hidrocloruro de (S)-3-fluoropirrolidina (350 mg) y Na2CO3 (480) en IPA (3,5 ml) se agitó a 91°C durante 17 h. La mezcla se filtró y se concentró. Se añadió HCl 2 N para ajustar el pH a 1 y se extrajo con EtOAc. La capa acuosa se ajustó a pH 7 con disolución de Na2CO3 y el agua se separó con el tolueno. El residuo se recogió en EtOAc, se filtró, y se concentró para dar la (S)-2-(3-fluoropirrolidin-1-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina (95 mg, 36%). MS (ESI) calculado para C15H22BFN2O2: 292,2.
Este procedimiento general se podía usar para preparar la (R)-2-(3-fluoropirrolidin-1-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina usando el hidrocloruro de (R)-3-fluoropirrolidina.
Ejemplo 87. Preparación de 3,3-difluoro-1-(3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)pirrolidina:
Etapa 1. Síntesis de 1-(3-bromofenil)-3,3-difluoropirrolidina:
Figure imgf000103_0003
Una mezcla de 1,3-dibromobenceno (1 g, 4,24 mmol), hidrocloruro de 3,3-difluoropirrolidina (669 mg, 4,66 mmol), Pd2(dba)3 (134 mg, 0,233 mmol), Cs2CO3 (3,32 g, 10,2 mmol) y BINAP (264 mg, 0,424 mmol) en tolueno (20 ml) se calentó a temperatura de reflujo en atmósfera de N2. Después de agitar durante la noche, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El concentrado se suspendió en EtOAc (50 ml), se lavó con agua (20 ml x 3) y salmuera (20 ml), se secó sobre Na2SO3 y se concentró. La purificación por cromatografía en columna (hexano/EtOAc=100/1) proporcionó la 1-(3-bromofenil)-3,3-difluoropirrolidina (645 mg, >100%) en forma de un aceite incoloro. MS (ESI) calculado para C10H-i0BrF2N: 261,0.
Etapa 2. Síntesis de 3,3-difluoro-1-(3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)pirrolidina:
Figure imgf000103_0004
Una suspensión de 1-(3-bromofenil)-3,3-difluoropirrolidina (899 mg, 3,43 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'bi(1,3,2-dioxaborolano) (957 mg, 3,77 mmol), Pd(dppf)Cl2 (75 mg, 0,103 mmol), KOAc (1 g, 10,29 mmol) en dioxano (18 ml) se calentó a 85°C en atmósfera de N2. Después de agitar durante la noche, la suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en columna (hexano, después hexano/EtOAc = 100/1 ) para dar la 3,3-difluoro-1-(3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)pirrolidina (Compuesto A#; 873 mg, 82%) en forma de un sólido blanco. MS (ESI) calculado para C16H22BF2NO2: 309,2.
Este procedimiento general en dos etapas se podía usar para preparar la 1-(3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)-3-(trifluorometil)pirrolidina usando el hidrocloruro de 3-(trifluorometil)pirrolidina.
Ejemplo 88. Preparación de 2-(3-((2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano: Etapa 1. Síntesis de 1-alil-3-bromobenceno:
Figure imgf000104_0001
En un matraz de tres bocas, se sumergió Mg metal (1,78 g, 73,76 mmol) en éster seco (20 ml) en atmósfera de N2. Se añadió un tercio del volumen de 1,3-dibromobenceno (15 g, 63,58 mmol) en éster seco (20 ml) a la mezcla. Se añadió 1,2-dibromoetano (0,1 ml) para iniciar la reacción. Después de que el reflujo estuviera estable, se añadió gota a gota la cantidad restante de disolución de 1,3-dibromobenceno a una velocidad para mantener el reflujo. Tras completarse la adición, la mezcla se agitó a temperatura de reflujo durante 1 h. Después se añadió gota a gota una disolución de bromuro de alilo (7,87 g, 65,12 mmol) en éter seco (20 ml). Tras completarse la adición, la suspensión se agitó a reflujo durante 1 h. La reacción se inactivó con disolución sat. de NH4Cl (100 ml) y la mezcla se separó. La fase acuosa se extrajo con éter (20 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (70 ml x 2) y salmuera (30 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron para dar el 1-alil-3-bromobenceno (146 g) en forma de un aceite incoloro. Este material se usó son más purificación. MS (ESI) calculado para CgHgBr: 196,0.
Etapa 2. Síntesis de 3-(3-bromofenil)propano-1,2-diol:
Figure imgf000104_0002
A una disolución de 1-alil-3-bromobenceno (A#; 1 g, 5,08 mmol) en CH3CN/H2O (20 ml, v/v = 4/1) se añadieron NMO (1,3 g, 11,16 mmol) y K2OsO4^ 2H2O (187 mg, 0,508 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. El CH3CN se separó a presión reducida y el concentrado se diluyó con EtOAc. La mezcla se filtró a través de Celite y el filtrado se concentró para dar el 3-(3-bromofenil)propano-1,2-diol (Compuesto A#). Este material se usó sin más purificación. MS (ESI) calculado para C9HnBrO2: 230,0.
Etapa 3. Síntesis de 4-(3-bromobencil)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano:
Figure imgf000104_0003
A una disolución de 3-(3-bromofenil)propano-1,2-diol (A#; 1,17 g, 5,06 mmol) en acetona (25 ml) se añadieron 2,2-dimetoxipropano (1,8 ml, 15,18 mmol) y PTSA (96 mg, 0,506 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró y se purificó por cromatografía en columna (hexano/EtOAc = 20/1) para dar el 4-(3-bromobenzil)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano (Compuesto A#; 200 mg, 15%) en forma de un aceite amarillo pálido. MS (ESI) calculado para C12H15BrO2: 270,0.
Etapa 4. Síntesis de 2-(3-((2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano:
Figure imgf000104_0004
Una mezcla de 4-(3-bromo-benzil)-2,2-dimetil-[1,3]dioxolano (A#; 800 mg, 2,95 mmol) y bis(pinacolato)diboro (822 mg, 1,1 eq), Pd(dppf)Cl2 (216 mg, 0,1 eq) y KOAc (868 mg, 3,0 eq) en dioxano (15 ml) se desgasificó y se calentó a 85°C en atmósfera de N2. Después de agitar durante la noche a 85°C, la suspensión negra se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de Celite. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en columna (hexano/EtOAc = 40/1) para dar 2-(3-((2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (Compuesto A#; 800 mg, 85%) en forma de un aceite amarillo. MS (ESI) calculado para C18H27BO4: 318,2.
Ejemplo 89. Preparación de hidrocloruro de la (9S)-N-(4-(aminometil)fenil)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-¿>][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida y ácido 2-(6-Hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-5-((6-oxo-6-((4-((9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-¿>][1,4]diazocina-10-carboxamido)bencil) amino)hexil)carbamoil)benzoico:
Figure imgf000105_0001
Reactivos y condiciones: a) NaHCO3, THF, 40°C; b) Fe, AcOH, IPA/Agua , reflujo; c) AH 3, THF, -78°C a t.a.; d) HBr al 48%; e) ácido 3-trifluorofenilborónico, Pd(OAc)2, X-Phos, Cs2CO3, dioxano/agua; f) trifosgeno, DIEA, CH2Ch; g) HCl 4 N, dioxano; h) DIEA, éster de A/-hidroxisuccinimida del ácido 6[fluorescein-5(6)-carboxamido]hexanoico, CH3CN.
Etapa 1. Síntesis de (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)glutarato de dimetilo. A una mezcla de 2,6-dicloro-3-nitropiridina (40,0 g, 207 mmol), hidrocloruro del éster dimetílico del ácido L-glutámico (87,7 g, 414 mmol) y NaHCO3 (69,6 g, 829 mmol) se añadió tetrahidrofurano (600 ml). La mezcla se agitó a 40°C durante 24 h, mientras se vigilaba la desaparición de la 2,6-dicloro-3-nitropiridina por HPLC. Después de completarse la reacción, los sólidos se filtraron y se lavaron con acetato de etilo (3 x 100 ml). El filtrado y los lavados combinados se concentraron a vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyendo con hexanos/acetato de etilo 10:1 (v/v)) para obtener el (S)-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)glutarato de dimetilo en forma de un sólido amarillo. (60 g, 87%). LRMS (m/z) 332,1 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C ^H ^O a C l, 332,0649; encontrado, 332,0651.
Etapa 2. Síntesis de (S)-3-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-¿>]pirazin-3-il)propanoato de metilo
A una mezcla de fSJ-2-((6-cloro-3-nitropiridin-2-il)amino)pentanodioato de dimetilo (20 g, 60,2 mmol) y hierro en polvo (16,8 g, 301 mmol) se añadió 2-propanol (375 ml) y agua (125 ml). A la mezcla agitada se añadió ácido acético (5,5 g, 90,3 mmol) y la reacción se agitó a temperatura de reflujo durante 1 h mientras se vigilaba la desaparición del material de partida por HPLC. Después de completarse la reacción, los sólidos se filtraron y se lavaron con 2-propanol (3 x 50 ml). El filtrado y los lavados combinados se concentraron hasta sequedad, después el residuo se concentró a vacío para obtener el (S)-3-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-6]pirazin-3-il)propanoato de metilo en forma de un sólido amarillo oscuro, que se usó en la siguiente etapa sin más purificación (15 g, 81%). LRMS (m/z) 270,1 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C11H13N3O3C 270,0645; encontrado, 270,0645.
Etapa 3. Síntesis de fSJ-3-(6-Cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propan-1-ol
A una disolución de AICI3 (17,78 g, 133,3 mmol) en tetrahidrofurano (260 ml) en atmósfera de N2 se añadió LÍAIH42 M en THF (200 ml, 400 mmol), gota a gota, a una velocidad para controlar la evolución de gas. Esto dio una disolución de alano (AlH3) en THF. En un matraz separado, se preparó una disolución de ('S)-3-(6-cloro-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propanoato de metilo (26,0 g, 96,4 mmol) en THF (460 ml) en atmósfera de N2, después se enfrió con un baño de hielo seco/acetona. A esta se añadió gota a gota la disolución de alano, a lo largo de 2 h. Cuando se completó la adición, se retiró el baño de enfriamiento, y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 1,5 h, el análisis de LCMS mostró que la reacción se había completado, y se añadió lentamente una disolución de NaOH (17,6 g) en agua (65 ml) para controlar la evolución de H2. La suspensión se dejó agitar durante 18 h, después de lo cual los sólidos se separaron por filtración. El precipitado se lavó con acetato de etilo, después el filtrado y los lavados se concentraron a vacío. El producto se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de MeOH en CH2Cl2 de 0 a 10%) para obtener el S)-3-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propan-1-ol en forma de un sólido amarillo-naranja (15,21 g, 69%). LRMS (m/z) 228,1 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C^H-ia^OCl, 228,0904; encontrado, 228,0903.
Etapa 4. Síntesis de (5R,9S)-2-Cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina
Al ('S)-3-(6-cloro-1,2,3,4-tetrahidropirido[2,3-b]pirazin-3-il)propan-1-ol (12 g, 52,7 mmol) se añadió HBr(ac.) al 48% (p/p) (160 ml) y la reacción se agitó a 90°C durante 18 h mientras se vigilaba la desaparición del alcohol de partida por HPLC. Después de completarse la reacción, se enfrió a temperatura ambiente, después se añadió disolución ac. de NaHCO31,2 M hasta alcanzar pH 8. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml), después la fase orgánica se lavó con salmuera (1 x 100 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyendo con hexanos/acetato de etilo 2:1 (v/v)) para obtener la (5R,9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina en forma de un sólido amarillo claro (6,0 g, 55%). LRMS (m/z) 210,1 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C^H^NaCl, 210,0798; encontrado, 210,0800. Etapa 5. Síntesis de (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina Una disolución de (9S)-2-cloro-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina 3,0 g, 15,4 mmol), ácido (3-(trifluorometil)fenil)borónico (4,4 g, 23,1 mmol), acetato de paladio (344 mg, 1,54 mmol), 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo (X-Phos, 476 mg, 3,08 mmol) y carbonato de cesio (15 g, 46,2 mmol) en una mezcla de 10 a 1 (v/v) de 1,4-dioxano y agua (60 ml), se calentó a 90°C durante 24 horas. La reacción después se enfrió a temperatura ambiente, y se diluyó con acetato de etilo (150 ml). La mezcla se lavó con disolución sat. ac. de NaHCO3 (200 ml x 3), después las capas orgánicas se secaron (MgSO4) y se concentraron hasta sequedad. El residuo resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de acetato de etilo en pentano 10-100%) para obtener la (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina en forma de un sólido amarillo claro (3,7 g, 75%). LRMS (m/z) 320,2 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C17H17N3F3, 320,1375; encontrado, 320,1375.
Etapa 6. Síntesis de 4-((9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metano-pirido[2,3-b][1,4]diazocina-10-carboxamido)benzilcarbamato de terc-butilo
A una disolución de (9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina (999 mg, 3,23 mmol) en CH2Cl2 (30 ml) se añadió W,W-diisopropiletil-amina (1,7 ml, 9,78 mmol) y la mezcla de reacción se enfrió a 0°C con un baño de hielo. Después se añadió trifosgeno (482 mg, 1,63 mmol) en cuatro porciones pequeñas. Se retiró el baño de hielo y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Se vigiló el avance de la reacción sacando una parte alícuota de 500 ul y combinándola con metanol para ensayar la conversión del carbamato de metilo por formación del cloroformiato intermedio. Si quedaba algo de material de partida, se añadió una porción adicional de trifosgeno (200 mg) y la mezcla de reacción se agitó durante cinco horas a temperatura ambiente. Después, se añadió 4-aminobencilcarbamato de terc-butilo (800 mg, 3,60 mmol) en dos porciones iguales (400 mg cada una) a la mezcla anterior y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante dos horas. Se añadió disolución acuosa saturada de NaHCO3 (30 ml) y la fase orgánica después se separó y se concentró hasta sequedad a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de acetato de etilo en pentano al 15-100%) para obtener el 4-((9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10-carboxamido)benzil-carbamato de terc-butilo en forma de un sólido blanco. (761 mg, 42%). LRMS (m/z) 568,2 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C30H33N5O3F3, 568,2536; encontrado, 568,2538.
Etapa 7. Síntesis de hidrocloruro de la (9S)-W-(4-(aminometil)fenil)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida
Se disolvió el 4-((9S)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-7,8,9,10-tetrahidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10-carboxamido)bencilcarbamato de terc-butilo (759 mg, 1,34 mmol) en HCl 4 N (10 ml) y 1,4-dioxano y se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 1 hora a temperatura ambiente. Los disolventes se separaron a presión reducida y el sólido resultante se secó durante la noche a vacío para obtener el hidrocloruro de la (9S)-A/-(4-(aminometil)fenil)-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-6H-5,9-metanopirido[2,3-b][1,4]diazocina-10(7H)-carboxamida en forma de un sólido marrón claro (763 mg, 100%). LRMS (m/z) 468,1 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C25H25N5OF3, 468,2011; encontrado, 468,2010.
Etapa 8. Síntesis de ácido 2-(6-H¡drox¡-3-oxo-3H-xanten-9-¡l)-5-((6-oxo-6-((4-((9S)-2-(3-(tr¡fluoromet¡l)fen¡l)-7,8,9,10-tetrah¡dro-6H-5,9-metanop¡r¡do[2,3-b][1,4]d¡azoc¡na-10-carboxam¡do)benc¡l)am¡no)hex¡l)carbamo¡l)benzo¡co El h¡drocloruro de la (9S)-N-(4-(am¡nomet¡l)fen¡l)-2-(3-(tr¡fluoro-met¡l)fen¡l)-8,9-d¡h¡dro-6H-5,9-metanop¡r¡do[2,3-b][1,4]d¡azoc¡na-10(7H)-carboxam¡da (39 mg, 0,10 mmol) se d¡solv¡ó en aceton¡tr¡lo (2 ml) y metanol (0,2 ml). Después, se añad¡ó N,N-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (32 pl, 0,20 mmol) segu¡do del éster de N-h¡drox¡succ¡n¡m¡da del ác¡do 6-[fluoresce¡n-5(6)-carboxam¡do]hexano¡co (50 mg, 0,085 mmol). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante la noche, después el producto se a¡sló por HPLC de fase ¡nversa (grad¡ente de acetomtnlo en agua mod¡f¡cado con 0,1% de TFA, 5-95%) para obtener el ác¡do 2-(6-h¡drox¡-3-oxo-3H-xanten-9-¡l)-5-((6-oxo-6-((4-((9S)-2-(3-(tr¡fluoromet¡l)fen¡l)-7,8,9,10-tetrah¡dro-6H-5,9-metanop¡r¡do[2,3-b][1,4]d¡azoc¡na-10-carboxam¡do)benc¡l)am¡no)hex¡l)carbamo¡l)benzo¡co en forma de un sól¡do marrón (26 mg, 35%). LRMS (m/z) 939,2 [M+H]+; HRMS (m/z): [M+H]+ calculado para C52H46N6O8F3, 939,3329; encontrado, 939,3328.
Ejemplo 90. D¡seño y caracter¡zac¡ón de m¡n¡-hSIRT1
Se llevó a cabo la espectrometría de masas de ¡ntercamb¡o protón-deuterón (HDX-MS) en la proteína hSIRTI de long¡tud entera, para ¡dent¡f¡car y caracter¡zar las reg¡ones func¡onales clave de hSIRTI. La veloc¡dad de ¡ntercamb¡o H-D es muy depend¡ente de las prop¡edades d¡nám¡cas de la proteína, produc¡éndose ¡ntercamb¡o más ráp¡do en reg¡ones expuestas al d¡solvente y/o flex¡bles y produc¡éndose el ¡ntercamb¡o más lento en las reg¡ones más enterradas y/o estructuralmente ríg¡das (Hamuro, Y. et al. (2003J J biomol Techniques: JBT 14, 171). De acuerdo con el estud¡o prev¡o sobre hSIRT1(19-747) (Hubbard, B. P. et al. (2013) Science 339, 1216), la hSIRT1 de long¡tud entera cont¡ene tres reg¡ones estructuradas pr¡nc¡pales: la reg¡ón nuclear catalít¡ca, restos 229-516 (denom¡nada en lo suces¡vo hSIRT1cc) (J¡n, L. et al. (2009) J Biol Chem 284, 24394 y Frye, R. A. (2000) Biochem Biophys Res Commun 273, 793), la reg¡ón N-term¡nal de 190-230 que precede ¡nmed¡atamente el núcleo catalít¡co y una reg¡ón remota en el extremo C después del centro catalít¡co alrededor de 640-670.
Para detectar el s¡t¡o de un¡ón de STAC en hSIRT1, se llevó a cabo la HDX-MS en ausenc¡a y presenc¡a de STAC 1.
La ad¡c¡ón de 1 reduce la veloc¡dad de ¡ntercamb¡o H-D alrededor de los restos 190-230 en el dom¡n¡o N-term¡nal de hSIRT1, sug¡r¡endo que esta reg¡ón está ¡mpl¡cada en la un¡ón de STAC. Además, el espectro de HSQC de 1H, 15N de la hSIRT1(180-230) marcada con 15N está b¡en d¡sperso lo que sug¡ere que forma un dom¡n¡o plegado de forma autónoma. La ad¡c¡ón de 1 a hSIRT1(180-230) marcada con 15N produce perturbac¡ones s¡gn¡f¡cat¡vas en el desplazam¡ento quím¡co y además soporta la ¡nteracc¡ón d¡recta de 1 con esta reg¡ón, en lo suces¡vo denom¡nado el dom¡n¡o de un¡ón a STAC (SBD). La ad¡c¡ón de 1 a hSIRT1 en presenc¡a de un sustrato peptíd¡co der¡vado de p53 (Ac-p53(W5)) (Da¡, H. et al. (2010) J Biol Chem 285, 32695) produce la perturbac¡ón de las veloc¡dades de ¡ntercamb¡o H-D tanto alrededor del SBD como en el supuesto s¡t¡o de un¡ón al sustrato (restos 417-424) en el centro catalít¡co, ¡nd¡cando que la un¡ón de STAC en el dom¡n¡o N-term¡nal y la un¡ón al sustrato dentro del centro catalít¡co de hSIRT1 están acoplados. Esto está de acuerdo con una observac¡ón prev¡a de que los STAC potenc¡an la un¡ón del sustrato a hSIRT1, aumentando así la ef¡cac¡a catalít¡ca de hSIRT1 (M¡lne, J. C. et al. (2007) Nature 450, 712). A d¡ferenc¡a del SBD, el elemento estructural C-term¡nal (641-665) ¡dent¡f¡cado por HDX-MS está separado del centro catalít¡co en aprox¡madamente 150 restos y se pred¡ce que cont¡ene var¡as cadenas p, denom¡nado aquí cadenas/lám¡na p C-term¡nales (CBS), s¡m¡lar al pépt¡do Esenc¡al para la Act¡v¡dad de SIRT1 (ESA) prev¡amente descr¡to (19). hSIRT1cc solo muestra aprox¡madamente una octava parte de la act¡v¡dad de la enz¡ma de long¡tud completa usando cond¡c¡ones de ensayo de desacet¡lac¡ón prev¡amente descr¡tas (Da¡, H. et al. (2010) J Biol Chem 285, 32695). El pépt¡do CBS restablece la act¡v¡dad catalít¡ca de hSIRTlcc en trans, al 80% de la de hSIRT1 de long¡tud completa, con EC50 = 59 nM, de acuerdo con las observac¡ones prev¡as (Kang, H. et al. (2011) Mol Cell 44, 203 y Marmorste¡n, R. et al. (2012) J Biol Chem 287, 2468). Tamb¡én se d¡señó un fragmento de CBS mín¡mo que cubría solo la reg¡ón de cadena p (642-658), que se comporta de forma s¡m¡lar al pépt¡do de CBS parental. La caracter¡zac¡ón c¡nét¡ca pone de man¡f¡esto que el pépt¡do de CBS restablece la act¡v¡dad d¡sm¡nuyendo los valores de Km tanto para el sustrato peptíd¡co como para nAd+ de hSIRTlcc en 4-5 veces (véase la tabla 1).
Tabla 1. C¡nét¡ca del estado estac¡onar¡o del núcleo catalít¡co de hSIRT1 en ausenc¡a o presenc¡a del pépt¡do de CBS.a
Km (pM)
Grupo kcat(s-1) Ac-p53(W5) b NAD+c hSIRT1(229-516) 0,29 ± 0,01 163 ± 8 988 ± 73 hSIRT1(229-516) CBS 0,54 ± 0,01 37 ± 2,5 180 ± 14 hSIRT1 (229-516) m¡n¡-CBS 0,54 ± 0,01 49 ± 3 207 ± 19 a Datos del ensayo de PNC1/GDH.
b Concentrac¡ón fija de NAD+1 mM.
c Concentrac¡ón f¡ja de Ac-p53(W) 500 pM.
Considerados juntos, los datos anteriores sugieren una arquitectura tripartita para una hSIRTI mínimamente funcional que incluye; 1) el núcleo central que constituye la maquinaria catalítica básica, 2) el SBD N-terminal que media la unión y activación de STAC, y 3) el péptido de CBS C-terminal que estabiliza el núcleo catalítico dando como resultado actividad de desacetilasa más eficaz. Basándose en esto, se diseñaron construcciones de SIRT1 que abarcaban los tres elementos estructurales mínimos covalentemente unidos, que se denominaron mini-hSIRT1. Las construcciones abarcan 183-505 o 183-516, que están conectadas al péptido CBS por un conector flexible de poli-glicina/serina (GS, (GGGS)2 o (GGGS)3) (Sauer, R. T. y Robinson, C. R. (1998) Proceedings of Nat Academy of Sciences of USA 95, 5929). Los valores de Km y kcat son comparables entre construcciones de mini-hSIRT1 y la enzima de longitud completa, así como lo son los valores de IC50 para los inhibidores de hSIRT1 no competitivos EX-527 o nicotinamida (NAM) que confirman la fidelidad funcional de los mini-hSIRT1 (véase la tabla 2). Además, hay una excelente correlación entre mini-hSIRT1 y la enzima de longitud entera con respecto a la activación mediada por STAC a través de un amplio conjunto de quimiotipos. La eliminación del SBD anula completamente la activación mediada por STAC de mini-hSIRT1, confirmando la importancia crítica de este dominio para la activación. En cambio, el mini-hSIRT1 que carece de CBS retiene un nivel significativo de activación de STAC demostrando que el CBS potencia pero no es necesario para la activación mediada por STAC. Finalmente, la mutación E230K también atenúa la activación mediada por STAC en mini-hSIRT1 como en la enzima de longitud completa (Hubbard, B. P. et al. (2013) Science 339, 1216). De forma colectiva, estas observaciones demuestran que con la mitad del tamaño molecular, el mini-hSIRT1 es un sustituto completamente funcional y activable para hSIRT1 de longitud completa. Tabla 2. Cinética del estado estacionario de construcciones de mini-hSIRT1.a
Km (pM) hSIRT1 kcat s-1) Ac-p53(W5)b NAD+c hSIRT1(1-747) 0,37 ± 0,01 3,7 ± 0,8d 70 ± 6 hSIRT1(183-516) 0,38 ± 0,01 42 ± 4,9 769 ± 97 hSIRT1 (183-516-(GGGS)2-641-665) 0,44 ± 0,02 16 ± 2,2 82 ± 6 hSIRT1 (183-516-(GS)-641-665) 0,54 ± 0,01 14 ± 1,1 78 ± 8 hSIRT1 (183-505-(GGGS)2-641-665) 0,54 ± 0,02 13 ± 2 112 ± 10 hSIRT1 (229-516-(GGGS)2-641-665) 0,49 ± 0,01 13 ± 3 222 ± 25 hSIRT1 (229-505-(GGGS)2-641-665) 0,43 ± 0,02 11 ± 3 218 ± 34 hSIRT1 (183-505-(GGGS)2-641-665) 0,54 ± 0,01 42 ± 4,1 170 ± 19
(R446A)
hSIRT1 (183-505-(GGGS)2-641-665) 0,21 ± 0,01 30 ± 3 375 ± 24
(R446E)
hSIRT1 (183-505-(GGGS)2-641-665) 0,30 ± 0,01 33 ± 2 423 ± 41 (E230K,R446E)
hSIRT1 (183-505-(GGGS)2-641-665) 0,65 ± 0,01 23,4 ± 1 273 ± 26 (P231G,P232G)
a Datos del ensayo de PNC1/GDH.
b Concentración de NAD+ fija 2 mM.
c Concentración de Ac-p53(W) fija 400 pM.
d Valor de (1)
Ejemplo 91. Estructura del complejo mini-hSIRT1/STAC
Aunque se ha descrito la estructura cristalográfica de rayos X del núcleo catalítico de hSIRT1 (Zhao, X. et al. (2013) J Med Chem 56, 963), según el conocimiento de los autores de la invención no existe la estructura de la enzima de longitud completa. La estructura de la hSIRT1 de longitud completa ha sido un reto, en parte, debido a la flexibilidad conformacional de los dominios N y C-terminales extendidos. Las construcciones de mini-hSIRT1 proporcionan la oportunidad de cristalizar un sustituto equivalentemente funcional de la enzima de longitud completa. Se ha cristalizado con éxito la mini-hSIRT1 (183-505-(GGGS)2-CBS) con STAC 1 usado en los experimentos de HDX-MS y se ha determinado la estructura del complejo (mini-hSIRT1/1) a 3,1 A por sustitución molecular usando un modelo de búsqueda basado en el modelo homólogo de SIRT3 (Jin, L. et al. (2009) J Biol chem 284, 24394). Mini-hSIRT1 está compuesto de un núcleo catalítico que adopta un lóbulo grande de plegamiento de Rossmann y un lóbulo común pequeño de unión al zinc común a todas las sirtuinas, un SBD de haz de tres hélices N-terminal y un CBS en horquilla p C-terminal. Es interesante que se observó un dímero mediado por STAC de la mini-hSIRTI relacionado por simetría cristalográfica en las redes cristalinas. La cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) confirma que mini-hSIRTI forma dímero en solución en presencia de STAC 1. Sin embargo, no se observa formación de dímero de mini-hSIRT1 para un STAC 7 similar del mismo quimiotipo. Dada esta observación y el hecho de que la concentración de STAC usada para la cristalización es mucho mayor que la usada en el ensayo bioquímico que mide la activación, parecería que la dimerización observada en la estructura cristalina no es un requisito para la activación de hSIRT1 por los STAC.
La CBS media el aumento p con la lámina p de seis hebras del lóbulo de plegamiento de Rossmann del dominio catalítico, de acuerdo con los resultados de HDX-MS de la perturbación de hSIRTlcc tras la unión de CBS. El aumento p mediado por CBS parece que estabiliza el sitio activo del núcleo catalítico de hSIRTI que restablece los valores de Km observados tanto para el péptido acetilado como los sustratos de NAD+. El SBD N-terminal forma un haz de tres hélices independientemente plegado con 1 que se une al motivo hélice-vuelta-hélice (H2-T-H3) dentro del SBD, de acuerdo con el HDX-MS, RMN y resultados cinéticos enzimáticos. El sitio de unión de mini-hSIRT1/1 principal es una superficie hidrófoba poco profunda con un bolsillo hidrófobo más profundo, fuera del centro, que el grupo CF3 que ocupa 1. Esto está de acuerdo con la relación de actividad y estructura (SAR) observada a lo largo de múltiples quimiotipos de STAC que indican el requisito de planaridad general del armazón del núcleo mantenida por un enlace de hidrógeno intramolecular (Vu, et al. (2009) J Med Chem, 52, 1275). Se observa una similitud notable en términos de configuración de dominio entre la estructura de mini-hSIRT1 y la de la Sir2 de levadura, teniendo ambas un haz helicoidal N-terminal y aumento p C-terminal por una horquilla p más allá del lóbulo grande de plegamiento de Rossmann típico (Hsu, H. C. et al. (2013) Genes & Dev 27, 64). Sin embargo, la Sir2 de levadura no incluye la inserción de 150 aminoácidos observada en hSIRTI y aparece como una "mini-hSIRT1" natural en levaduras. El dominio N-terminal en Sir2 parece que es importante para la activación alostérica por otra proteína de levadura Sir4 (Hsu, H. C. et al. (2013) Genes & Dev 27, 64). Aunque la arquitectura del dominio N-terminal de Sir2 difiere del SBD de hSIRT1, parece que las dos tienen papeles funcionalmente conservados en la activación alostérica del núcleo catalítico.
Ejemplo 92. Mutagénesis dirigida del bolsillo de unión de STAC
Se usó mutagénesis dirigida de hSIRT1 de longitud completa para confirmar los restos clave del SBD que se identificaron por las estructuras de mini-hSIRT1. Se generaron los siguientes mutantes puntuales de hSIRT1 de longitud completa detectando tres clases de restos: a) restos que parece que interaccionan directamente con activadores (T219A, I223A, N226A y I227A), b) modulador de acoplamiento Glu230 (Hubbard, B. P. et al. (2013) Science 339, 1216) (E230K, E230A y E230Q), y c) restos de SBD sin función aparente en la unión del activante (Q222A y V224A). Ninguno de los mutante perjudicaba significativamente la actividad catalítica basal usando el sustrato Ac-p53(W5) o afectaba a la inhibición por EX-527, un péptido TFA-p53 (Ac-RHK-KTFA-L-Nle-F-NH2) o nicotinamida (NAM) (véase las tablas 4 y 5).
El impacto general de las mutaciones en la activación se evaluó comparando la activación de plegado de SIRT1 de longitud completa de tipo natural frente a mutante usando un conjunto estructuralmente diverso de 246 STAC ensayados con una concentración fija de 25 pM. Además, se investigó el efecto de las mutaciones en la unión de STAC frente a la activación mediante el control de los cambios en sus EC50 y valores de activación máxima respectivamente usando un panel de cinco compuestos (STACs 1, 6-9). T219A, I223A y I227A presentaban todos un amplio deterioro de la activación con aumento en EC40 comparado con la hSIRT1 de tipo natural, lo que implicaba la unión del activador deteriorada de acuerdo con las estructuras (véase la tabla 6). Es interesante que I223A era el mutante más dependiente del compuesto con activación mediada por STAC que variaba de atenuada a potenciada. Los STAC que muestran activación potenciada están enriquecidos en estructuras que contienen un anillo de fenilo sustituido orto-CF3. En las estructuras cristalinas, Ile223 está directamente debajo del activador y recubre el bolsillo en el que se inserta el meta-CF3 de 1. Se esperaría que la cavidad creada por la mutación de Ile223 a Ala acomodara mejor un sustituyente orto frente a una sustitución meta. Esta observación también valida las interacciones moleculares clave que dirigen la unión de STAC y señala a estrategias para alterar la interacción de STAC con el SBD.
Tabla 4. Cinética de sustrato de sustrato en estado estacionario para hSIRT1 de longitud completa de tipo natural y mutante
Km (pM)
hSIRT1 kcat(s-1)a Ac-p53(W5)a Ac-p53(W5)b NAD+a
tipo natural 0,37 ± 0,01 3,7 ± 0,8c 2,7 ± 0,4c 70 ± 6
T219A 0,35 ± 0,01 2,7 ± 0,5 1,7 ± 0,2 45 ± 4
Q222A 0,34 ± 0,01 7,1 ± 2,3 4,8 ± 0,6 35 ± 6
I223A 0,33 ± 0,02 2,5 ± 0,3 4,2 ± 0,4 96 ± 14
V224A 0,31 ± 0,01 6,2 ± 0,7 4,2 ± 0,3 43 ± 4
N226A 0,34 ± 0,02 1,8 ± 0,7 2,5 ± 0,2 85 ± 9
I227A 0,36 ± 0,01 5,3 ± 0,7 3,4 ± 0,4 43 ± 6
E230K 0,36 ± 0,01 7,0 ± 0,7 5,4 ± 0,2 70 ± 5
E230A 0,41 ± 0,01 6,2 ± 0,6 6,2 ± 0,5 57 ± 2
E230Q 0,38 ± 0,01 3,2 ± 0,7 7,5 ± 0,9 99 ± 17
I223R 0,27 ± 0,01 3,5 ± 0,5 1,4 ± 0,2 91 ± 13
a Datos del ensayo de PNC1/GDH.
b Datos del ensayo de OAcADPr.
c Valores de (1)
Tabla 5. Inhibición de hSIRTI de longitud completa de tipo natural y mutante
IC50 (jM )a
TFA-p53
hSIRT1 EX-527 7-merob nam tipo natural 0,140 ± 0,020 0,680 ± 0,070 92 ± 6
T219A 0,310 ± 0,040 0,490 ± 0,020 53 ± 4
Q222A 0,110 ± 0,010 0,630 ± 0,050 53 ± 5
I223A 0,180 ± 0,020 0,540 ± 0,150 108 ± 10
V224A 0,140 ± 0,010 0,860 ± 0,080 64 ± 3
N226A 0,190 ± 0,010 0,350 ± 0,040 100 ± 9
I227A 0,220 ± 0,020 0,940 ± 0,060 92 ± 4
E230K 0,150 ± 0,020 1,6 ± 0,3 54 ± 3
E230A 0,100 ± 0,030 1,3 ± 0,4 60 ± 3
E230Q 0,240 ± 0,020 0,860 ± 0,060 56 ± 3
I223R 0,210 ± 0,020 0,660 ± 0,060 87 ± 6
a Datos del ensayo de OAcADPr usando el sustrato Ac-p53(W5).
b Secuencia peptídica de TFA-p53: Ac-RHKK(TFA)L-Nle-F-NH2.
Tabla 6. Concentraciones de sustrato usadas en los ensayos de activación o inhibición de hSIRT1 de longitud completa
Ensayos de activación Ensayos de inhibición hSIRT1 Ac-p53(W5) ( |j M) NAD+ (j M) Ac-p53(W5) (j M) NAD+ (j M) tipo natural 0,20 8,0 2 80
T219A 0,20 4,5 2 45
Q222A 0,70 4,5 6,5 45
I223A 0,25 10 2,5 100
V224A 0,60 4,5 6,5 45
N226A 0,20 8,0 2 80
I227A 0,40 4,5 4 45
E230K 0,40 8,0 4 80
E230A 0,40 8,0 4 80
E230Q 0,30 8,0 3 80
I223R 0,14 10 1,4 100 Parece que Asn226 forma un enlace de hidrógeno entre su nitrógeno de carboxamida y el oxígeno carbonílico de 1 en la superficie de la proteína. Sin embargo, la activación de N226A estaba solo mínimamente dificultada en comparación con el tipo natural. La pequeña contribución de este enlace de H se debe probablemente a su alta exposición al disolvente.
Se ha descrito recientemente que la mutación de la Glu230 a Lys o Ala deteriora ampliamente la activación de STAC, aunque no está claro el mecanismo por el cual ocurre esto (Hubbard, B. P. et al. (2013) Science 339, 1216). Los autores de la invención probaron la activación de las proteínas hSIRT1 de longitud completa E230K, E230A y E230Q. En los tres mutantes de Glu230, la activación máxima está dañada sin cambiar la CE50 (véase las tablas 7 y 8) sugiriendo una función para la Glu230 en la formación o estabilización de la conformación activada de hSIRT1. La activación de E230Q también está ampliamente dañada, lo que indica que la carga negativa de la Glu230 es importante para estabilizar la conformación activada de hSIRT1 y que la Glu230 probablemente interacciona con un resto positivamente cargado en la conformación activada.
Tabla 7. Efecto de las mutaciones de hSIRT1 en los valores de EC50.
compuesto: 1 6 7 8 9 hSIRT1 EC50 n° veces EC50 n° veces EC50 n° veces EC50 n° veces EC50 n° veces (pM) de cambio® (pM) de cambio® (PM) de cambio® (PM) de cambio® (PM) de cambio®
WT 0,30 1,00 0,77 1,00 2,20 1,00 0,48 1,00 0,77 1,00
T219A 1,00 3,30 2,38 3,10 8,83 4,01 3,96 8,26 4,12 5,36 Q222A 0,25 0,84 0,78 1,02 2,01 0,91 0,51 1,07 0,56 0,73
I223A 0,77 2,56 2,11 2,75 5,51 2,51 2,36 4,91 2,97 3,86
V224A 0,43 1,43 1,15 1,50 2,60 1,18 0,90 1,87 1,09 1,41 N226A 0,55 1,83 2,64 3,44 3,92 1,78 1,03 2,15 1,17 1,52
I227A 1,09 3,65 3,72 4,83 6,76 3,07 2,98 6,21 4,28 5,55
E230A 0,26 0,86 1,89 2,46 2,61 1,19 0,530 1,11 1,23 1,60 E230K 0,15 0,50 2,92 3,81 3,21 1,46 0,70 1,46 1,63 2,12 E230Q 0,37 1,23 2,15 2,80 3,36 1,53 0,58 1,21 1,34 1,74 a n° de veces de cambio = (EC50 mutante/ EC50 tipo natural)
Valores de EC50 determinados a partir de curvas de dosis de activación-respuesta usando la ec. 1. La activación se midió usando el ensayo de OAcADPr con el sustrato Ac-p53(W5).
Tabla 8. Efecto de las mutaciones de hSIRT1 en la activación máxima por STAC.
Compuesto: 1 6 7 8 9 hSIRT1 RVmáx n° veces RVmáx n° veces de RVmáx n° veces de RVmáx n° veces RVmáx n° veces de de cambio® cambio® cambio® de cambio® cambio®
WT 10,5 1,00 14,7 1,00 7,16 1,00 6,28 1,00 14,9 1,00
T219A 5,76 1,99 14,3 1,03 3,25 2,73 4,22 1,64 10,4 1,47
Q222A 7,58 1,44 10,9 1,39 7,27 0,98 5,32 1,22 10,4 1,48
I223A 4,52 2,69 9,85 1,55 1,89 6,90 6,45 0,97 8,00 1,98
V224A 9,56 1,11 12,9 1,15 9,58 0,72 7,71 0,79 14,5 1,03
N226A 7,82 1,39 11,2 1,34 5,68 1,32 4,95 1,34 13,4 1,12
I227A 5,22 2,25 6,14 2,67 8,25 0,85 5,98 1,06 12,5 1,20
E230A 2,64 5,81 6,15 2,66 2,72 3,58 3,21 2,39 6,91 2,35
E230K 1,39 24,3 3,83 4,84 1,71 8,67 1,99 5,36 2,96 7,06
E230Q 2,28 7,40 4,67 3,73 2,57 3,93 2,72 3,07 5,14 3,35 a n° de veces de cambio = (RVmáx tipo natural-1 )/( RVmáx mutante-1 )
Valores de activación máximos (RVmáx) determinados a partir de las curvas de dosis de activación-respuesta usando la ec. 1.
La activación se midió usando el ensayo de OAcADPr con el sustrato Ac-p53(W5).
A diferencia de los mutantes anteriores, Q222A y V224A presentaban activación normal, lo cual está de acuerdo con sus posiciones alejadas de STAC en la estructura de mini-hSIRT1/1. Es importante que todos estos datos obtenidos con hSIRT1 de longitud completa están de acuerdo con lo que predicen las estructuras cristalinas de mini-hSIRT1 que validan adicionalmente la importancia bioquímica de estas estructuras.
A pesar del amplio impacto de las mutaciones descritas antes, ninguna de ellas anula completamente la activación de hSIRT1 como se ve con la eliminación del SBD. Puesto que la Ile223 está directamente debajo del STAC unido y la activación de I223A es muy dependiente del compuesto, se planteó la hipótesis de que I223R hSIRT1 constituiría la enzima de longitud completa con la más alta activación dañada hasta la fecha. La sustitución de Ile a Arg introduce volumen y carga al sitio de unión de STAC hidrófobo que se esperaría que alterara la unión del compuesto basada en la estructura. I223R no altera la actividad catalítica basal con los péptidos sustratos Ac-p53(W5) o FOXO-3a o la inhibición por EX-527, péptido TFA-p53 o NAM (véase las tablas 4, 5 y 9). Sin embargo, la activación se pierde completamente para los 246 activadores para ambos sustratos.
Tabla 9. Cinética de estado estacionario para hSIRT1 de longitud completa con el 21-mero FOXO-3aa
hSIRT1 kcat (s-1) Km péptido (|jM) Km NAD+ (j M) tipo natural 0,39 ± 0,02 50 ± 6 280 ± 40
I223R 0,25 ± 0,01 90 ± 6 460 ± 50
a Data del ensayo de PNC1/GDH.
Ejemplo 93. Acoplamiento alostérico entre STAC y unión del sustrato
Los autores de la invención investigaron el mecanismo de activación de hSIRT1 por STAC. Para este fin, se determinó una estructura de 2,73 A de un complejo cuaternario de mini-hSIRT1, 1, un sustrato peptídico de 7 aminoácidos derivado de p53 (Ac-p53), y el análogo de NAD+ no hidrolizable carbaNAD y una estructura de 2,74 A mini-hSIRT1/1 en complejo con un nuevo inhibidor dirigido al sitio activo 2 que ocupa los sitios de unión del péptido y NAD+. En la estructura de complejo cuaternario, el péptido Ac-p53 y carbaNAD se une al sitio activo hendidura entre los lóbulos pequeño y grande. Ac-p53 adopta una conformación extendida, con el grupo amida de la cadena principal que forma enlaces de hidrógeno con los restos de Gly415 y Glu416 del lóbulo pequeño y los restos Lys444 y Arg446 del lóbulo grande. Los enlaces de hidrógeno entre la amida de la posición 1 del péptido y el de la Arg446 produce una potencial interacción entre las cadenas laterales para un resto 1 hidrófobo, que puede ser importante en la activación de hSIRTI mediada por STAC (Dai, H. et al. (2010) J Biol Chem 285, 32695). La cadena lateral de acetil-lisina se inserta en una cavidad hidrófoba recubierta por Phe414, Leu418 y Val445. El grupo acetilo está interpuesto entre la His363 y Phe297, con el £-N de la acetil-lisina unido por enlace de hidrógeno con el oxígeno carbonílico de la Val412, que mantiene la orientación y conformación extendida de la cadena lateral de acetil-lisina. CarbaNAD también se pone en contacto en múltiples puntos con hSIRT1, la mayoría de los cuales son similares a los observados en el complejo ternario del núcleo catalítico de hSIRT1/NAD/análogo de EX-527 (Zhao, X. et al. (2013) J Med Chem 56, 963). Se observaron algunas diferencias, tales como que el grupo amida del anillo de nicotinamida forma enlaces de hidrógeno con la Ile147 y Asp348 en el bolsillo C. Además de los grupos hidroxilo 2' y 3' de la ribofuranosa en el lado de la nicotinamida forman enlaces de hidrógeno con el átomo de oxígeno carbonílico de la acetil-lisina, que ayuda a orientar el átomo C-1' del NAD para el posterior ataque nucleófilo por el grupo N-£-acetilo peptídico. El inhibidor 2 ocupa tanto el sitio de unión de la acetil-lisina como el bolsillo C de unión de nicotinamida de la mini-hSIRT1, similar a la estructura recientemente descrita del complejo SIRT3/2. Similar a la SIRT3, la unión de sustratos o del inhibidor del sitio activo conduce al cierre del dominio, poniendo juntos los lóbulos pequeño y grande (Szczepankiewicz, B. G. et al. (2012) J Org chem 77, 7319 y Jin, L. et al. J Biol Chem (2009) 284, 24394). Un cambio conformacional más prominente tras la ocupación del sitio activo es un movimiento en la dirección 5' del dominio N-terminal, que parece girar alrededor de la Arg234 y lleva al SBD más cerca del sitio activo proporcionan un potencial mecanismo para el acoplamiento alostérico de los sitios de unión de STAC y unión de sustrato a través de movimientos concertados. El resto bisagra, Arg234, está situado dentro del conector polibásico (restos 233-238) y ancla el SBD N-terminal al núcleo catalítico por un enlace de sal formado entre su grupo guanidino y el grupo carboxilato de la Asp475 y forma enlaces de hidrógeno con los grupos carbonilo de la His473 y Val459. La comparación de los SBD en estas tres estructuras muestra que el dominio es relativamente rígido, con un motivo de hélice-vueltahélice (H2-T-H3) de unión a STAC superponible con solo la primera hélice que se inclina ligeramente fuera en la estructura de complejo mini-hSIRT1/1/2. Se evaluó si el conector corto (230-233) entre el SBD y la Arg234 de anclaje puede ser importante para el acoplamiento alostérico modulando la rigidez del conector por mutación de la Pro231 y Pro232 a Gly. Realmente, P231G/P232G presenta activación por STAC de mini-hSIRT1 notablemente atenuada, apoyando la importancia de este conector corto para mediar el movimiento del SBD y el consiguiente acoplamiento de la unión de STAC y unión del sustrato.
Los datos de HDX-MS ponen de manifiesto que, a diferencia de hSIRT1 de tipo natural, la unión de STAC al mutante E230K ya no confiere protección alrededor del sitio de unión del péptido en el complejo E230K/1/Ac-p53(W5). Esto indica que es probable que la mutación E230K comprometa el acoplamiento entre los sitios de unión de STAC y del sustrato. Para explorar esto más, se desarrolló un ensayo de polarización de fluorescencia (FP) para medir la unión de STAC a hSIRT1 e investigar el efecto de acoplamiento en presencia del sustrato. Se usó un STAC unido a fluoresceína (3) que se une a hSIRTI de longitud completa con una Kd de 0,3 j M, como una sonda de FP y competía eficazmente por su compuesto parental 4. La unión de 3 estaba gravemente dañada para I223R hSIRTl confirmando la función de este resto mostrada en las estructuras de mini-hSIRT1/1 como que estaban directamente implicado en la unión de STAC en la enzima de longitud completa. Se ensayaron STAC en el ensayo de FP en ausencia o presencia de Ac-p53(W5) ilustrado por 5 que presentaban mayor afinidad de unión (Ki) en presencia de Ac-p53(W5) acorde con un mecanismo de disminución de Km para la activación. Aunque el mutante E230K muestra una afinidad de unión notablemente similar para la mayoría de los STAC comparado con el tipo natural, la potenciación de esta unión por Ac-p53(W5) está ausente o gravemente atenuada. Los datos de HDX-MS y activación juntos sugieren que la Glu230 no está directamente implicada en la unión de STAC sino que en su lugar es un resto crítico que media el acoplamiento de STAC y la unión del sustrato para promover la activación. Esto se verificó más determinando la estructura de la proteína E230K mini-hSIRT1 con los compuestos 1 y 2. Las estructuras generales eran similares a las de los complejos ternarios de mini-hSIRT1 de tipo natural/1/2 confirmando que Glu230 no participa directamente en la unión de STAC sino que en su lugar tiene una función dinámica durante el acoplamiento alostérico. Además, se observó un dímero cristalográfico con la estructura de E230K minihSlRTl/STAC, similar a la vista para las estructuras de proteínas de tipo natural, indicando además que no es probable que se requiera la dimerización para la activación bioquímica de hSIRTI por los STAC.
Para evaluar el requisito general para un resto hidrófobo en el acetil-sustrato para la activación de SIRT1 mediada por STAC (Dai, H. et al. (2010) J Biol Chem 285, 32695), se mutó el potencial resto que interacciona con 1 Trp de Arg446 a Ala basándose en la proximidad de la Arg446 a la posición 1. R446A hSIRTl tiene un mayor valor de Km para Ac-p53(W5) (véase la tabla 2) como se esperaba. Sin embargo, también muestra activación atenuada, similar a lo que se observa para los mutantes E230K/A. Dada esta observación, la naturaleza catiónica de la Arg446 y el acoplamiento entre el sitio activo y el sitio de unión de STAC, se hicieron los mutantes dobles de mini-hSlRT1 R446E/E230K para ensayar si la Arg446 es una posible pareja electrostática para E230 con E230K y R446E minihSIRTI como controles. Mientras que E230K o R446E producen la atenuación significativa de la activación por STAC de mini-hSIRT1, el mutante doble R446E/E230K restablece parcialmente la activación mediada por STAC de mini-hSIRT1 en comparación con E230K o R446E. Estos datos apoyan la existencia de un puente de sal entre la Glu230 y Arg446 en la conformación activada y están de acuerdo con el movimiento propuesto del SBD para interaccionar con el núcleo catalítico en el estado activado.
Todas las construcciones de mini-hSIRT1 que se describen en la presente memoria recapitulan tres características clave de la hSIRTI de longitud completa: i) la cinética enzimática en estado estacionario e inhibición, 2) el perfil de activación de STAC a través de múltiples quimiotipos, 3) y daño a la activación de STAC por E230K. Por lo tanto, después se usaron las construcciones de mini-hSIRTI para obtener las primeras estructuras descritas de una forma completamente funcional de hSIRTI con un STAC unido. La caracterización bioquímica y estructural pone de manifiesto las interacciones intramoleculares de hSIRT1 entre el CBS y el núcleo catalítico, que son esenciales para la actividad de desacetilación basal de hSIRTI. Lo que es más importante, las estructuras del complejo de minihSIRTI/STAC ponen de manifiesto la arquitectura detallada del sitio de unión de STAC proporcionando información importante para el diseño de fármacos basado en estructura. La comparación de las estructuras de hSIRTI con diferentes ligandos unidos, sugiere que el SBD N-terminal sufre un movimiento hacia arriba a lo largo de la coordenada de reacción conformacional, aunque es probable que la localización exacta del SBD esté influida por el empaquetamiento cristalino. Por lo tanto, se puede inferir un potencial mecanismo para la activación de STAC, en particular los movimientos concertados de un movimiento hacia arriba del SBD y cierre de dominio del núcleo catalítico para acoplar la unión de STAC y la unión del sustrato. La caracterización biofísica usando FP y mutagénesis dirigida usando la hSIRTI de longitud completa están totalmente de acuerdo con la observación estructural del complejo de mini-hSIRTI/STAC en apoyo de este modelo de unión de STAC y activación. Según el conocimiento de los autores de la invención, las estructuras de los complejos de mini-hSIRTI/STAC descritos aquí, representan solo el segundo ejemplo de un activador alostérico sintético unido a una enzima además de la glucoquinasa (Grimsby, J. et al. (2005) Science 301, 370). En resumen, los resultados presentados aquí proporcionan una prueba visual y funcional de la activación alostérica directa de hSIRT1 por moléculas pequeñas con sustratos peptídicos y proporcionan una base para la elucidación del mecanismo de activación de hSIRT1 por STAC, y potencialmente también por reguladores endógenos de hSIRT1.
Ejemplo 94. Clonación, expresión y purificación de proteínas
Se clonaron construcciones de mini-hSIRT1 en un vector pET21b modificado (Novagen). La proteína se expresó en células de E. coli BL21-Gold (DE3) (Stratagene) como una fusión N-terminal con un marcador de afinidad de hexahistidina con un sitio de proteasa TEV integrado. Se inoculó una sola colonia en medio LB que contenía ampicilina 100 jg/ml a 37°C, 250 rpm, hasta que se alcanzó la A6000,3. Después el cultivo se transfirió a 16°C, 250 rpm, hasta que se alcanzó la A6000,6. Se añadió 1-tio-p-D-galactopiranósido de isopropilo (IPTG) hasta una concentración final de 0,2 mM, y la expresión continuó a 16°C, 250 rpm durante la noche. Se recogieron las células por centrifugación, y el sedimento se volvió a suspender en tampón de lisis (HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glicerol al 5% y 2-mercaptoetanol 5 mM) y se trató con ultrasonidos para romper las células. El líquido sobrenadante se separó de los restos celulares por centrifugación a 10.000 xg durante 40 min a 4°C y se cargó en una columna de Ni-NTA (Qiagen) que se equilibró con un tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, 2-mercaptoetanol 5 mM e imidazol 20 mM. La columna se lavó con 5 volúmenes del tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, 2-mercaptoetanol 5 mM e imidazol 50 mM, y se eluyó con el tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, 2-mercaptoetanol 5 mM e imidazol 250 mM. La proteína eluida se dializó en tampón de lisis y se digirió con proteasa TEV (Invitrogen) para separar el marcador de His N-terminal a 4°C durante la noche. La proteína se cargó en una segunda columna de Ni-NTA equilibrada con tampón de lisis. La proteína no marcada se eluyó con el tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, 2-mercaptoetanol 5 mM e imidazol 5 mM. La proteína purificada se dializó contra el tampón de diálisis que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, glicerol al 5% y DTT 10 mM y se concentró. La proteína se purificó por una columna S200 (GE Healthcare) al 95% de pureza, evaluado por análisis de SDS-PAGE teñido con azul brillante Coomassie R-250 y se concentró a 10-15 mg/ml en el tampón de diálisis.
Se clonaron hsirtl 180-230 humanas en el vector pET21b (Novagen) entre BamHI y Xhol, que pone la expresión bajo el control del promotor T7-lacO. La proteína se expresó en células de E. co//BL21-Gold(DE3) (Stratagene) como una proteína de fusión N-terminal con el marcador de afinidad hexahistidina con sitios de proteasa TEV integrados. Se inoculó una sola colonia en 100 ml de medio LB que contenía ampicilina 100 pg/ml a 37°C, 250 rpm, durante la noche. Después se inocularon 20 ml de medio LB a 1 litro de medio M9 que contenía 15NH4Cl y se incubaron a 37°C en un agitador orbital (200 rpm) hasta que la OD600 era aproximadamente 0,8. Después, el cultivo se transfirió a 16°C, 250 rpm hasta alcanzar A600 de 1,0. Se añadió 1-tio-p-D-galactopiranósido de isopropilo hasta una concentración final de 0,3 mM, y la expresión continuó a 16°C, 250 rpm durante la noche. Se recogieron las células por centrifugación, y el sedimento se volvió a suspender en tampón de lisis (HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, glicerol al 5% y p-ME 5 mM, pH 7,5) y se trató con ultrasonidos para abrir las células. El líquido sobrenadante se separó de los restos celulares por centrifugación a 10.000 xg durante 40 min a 4°C y se cargó en una columna de Ni-NTA (Qiagen) que se equilibró con el tampón que contenía HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, p-ME 5 mM, pH 7,5. La columna se lavó con 20 volúmenes del tampón que contenía HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, B-ME 5 mM e imidazol 50 mM, pH 7,5, y después se eluyó con el tampón que contenía HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, p-ME 5 mM e imidazol 250 mM, pH 7,5. La proteína eluida se dializó en tampón de lisis y se digirió con proteasa TEV (Invitrogen) para separar el marcador de His N-terminal a 4°C durante la noche. La proteína se cargó en una segunda columna de Ni-NTA equilibrada con tampón de lisis. La proteína no marcada se eluyó con el tampón que contenía HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, glicerol al 5%, p-ME 5 mM e imidazol 10 mM, pH 7,5. La proteína purificada se concentró y se purificó más mediante una columna S200 (GE Healthcare) para alcanzar 95% de pureza, evaluado por análisis de SDS-PAGE teñido con azul brillante Coomassie R-250 y se concentró a 10 mg/ml en HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, TCEP 0,5 mM, pH 6,5.
Ejemplo 95. Producción de SIRT1 de longitud completa
Se expresaron proteínas SIRT1 (hSIRT1) de longitud completa con un marcador de His6 C-terminal y se purificaron como se describe en Hubbard et al. (2013) Sc/ence 339, 1216, excepto que Q222A y I223R SIRT1 se purificaron usando ÁKTAxpress™ (GE Lifesciences). Cada pasta celular se volvió a suspender en tampón A (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, imidazol 25 mM y TCEP 0,1 mM) con nucleasa benzonasa 1.000 U (Sigma Aldrich) complementado con cOmplete, comprimidos de cóctel inhibidor de proteasa exento de EDTA (Roche) sobre hielo. Las células se alteraron mediante ultrasonidos por pulsos con 50% activado y 50% desactivado durante 12 minutos totales a 40 W. Los residuos insolubles se separaron por centrifugación. El líquido sobrenadante clarificado se cargó directamente en 1 ml de la columna HisTrap FF Crude (GE Lifesciences). Después de lavar con tampón A, se eluyó SIRT1 con tampón B (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, imidazol 500 mM y TCEP 0,1 mM). La proteína se purificó más por cromatografía de exclusión por tamaños en tampón C (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, TCEP 0,1 mM) usando una columna Hi-load Superdex 200 16/60 (GE Lifesciences). Las concentraciones enzimáticas se determinaron por ensayo Bradford usando BSA como referencia. La pureza de la proteína final se evaluó por densitometría en gel. Las proteínas se confirmaron por LC/MS. Todas las proteínas eran de más de 90% de pureza excepto V224A y T219A (80%) y E230A (85%).
Ejemplo 96. Reacciones de desacetilación de SIRT1
Se llevaron a cabo reacciones de desacetilación de SIRT1 en tampón de reacción (HEPES-NaOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, y DMSO al 1%) a 25°C controlando la producción de nicotinamida usando el ensayo acoplado de PNC1/GDH continuo (Smith, B. C. et al. (2009) Ana/ B/ochem 394, 101) o la producción de O-acetil-ADP-ribosa (OAcADPr) por espectrometría de masas (Hubbard. et al. (2013) Sc/ence 339, 1216). Las concentraciones finales de los componentes del sistema de acoplamiento PNC1/GDH usadas eran GDH bovino 20 unidades/ml (Sigma-Aldrich), levadura PNC11 uM, a-cetoglutarato 3,4 mM y NADH o NADPH 220 pM. Se usó un coeficiente de extinción de 6.22 mM'1cm'1 y una longitud de paso de 0.81 cm para convertir la absorbancia a 340 nm en concentración de producto para las reacciones de 150 ul usadas. Se llevaron a cabo ensayos que controlaban la producción de OAcADPr en tampón de reacción con BSA al 0,05% y se tomaron tiempos de medición inactivando la reacción de desacetilación con una solución de parada que daba una concentración final de ácido fórmico al 1% y nicotinamida 5 mM. Las reacciones inactivadas se diluyeron 5 veces con acetonitrilo:metanol 1:1 y se centrifugaron a 5.000 x g durante 10 minutos para precipitar la proteína antes de ser analizada con un sistema de espectrometría de masas de alta capacidad Agilent RapidFire 200 (Agilent, Wakefield, MA) acoplado con un espectrómetro de masas ABSciex API 4000 equipado con una fuente de ionización por electropulverización. Los péptidos basados en péptidos de 21 unidades p53 Ac-p53(W5) (Ac-RHKKAcW-NH2) y FOXO-3a (Ac-SADDSPSQLSKAcWPGSPTSRSSNH2) obtenidos de Biopeptide, Inc. Los ensayos de desacetilación usaban el sustrato Ac-p53(W5) salvo que se indique otra cosa.
Las determinaciones de Km del sustrato se llevaron a cabo variando una concentración de sustrato a una concentración de saturación fija del segundo sustrato. Los ensayos de activación e inhibición de SIRT1 se llevaron a cabo en tampón de reacción con BSA al 0,05% a 25°C y se analizaron usando el ensayo de OAcADPr. La enzima y el compuesto se preincubaron durante 20 minutos antes de la adición de sustratos. Para el cribado de activación de hSIRTl de longitud completa, se ensayó un conjunto estructuralmente diverso de 246 compuestos por duplicado en una concentración final 25 pM cada uno. Con el fin de ser sensible a los activadores que modulan Km, se usaron concentraciones de sustrato de aproximadamente una décima parte de sus valores de Km (véase la tabla 5). Se ensayó la dependencia con la dosis de cinco compuestos y se describieron los datos de número de veces de activación mediante la ecuación 1
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donde vx/vo es la relación de la velocidad de reacción en presencia (vx) frente a en ausencia (vo) del activador (X), RVmáx es la velocidad relativa a la concentración de activador infinita, EC50 es la concentración de activador necesaria para producir la mitad de la RVmáx y b es el valor mínimo de vx/vo.
Tabla 5. Inhibición de hSIRTl de longitud completa de tipo natural y mutante
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a Datos del ensayo de OAcADPr usando el sustrato Ac-p53(W5).
b Secuencia peptídica de TFA-p53: Ac-RHKK(TFA)L-Nle-F-NH2.
Ejemplo 97. Cristalización de proteínas, recolección de datos y determinación estructural
Los cristales del complejo binario mini-hSIRT1/1 se obtuvieron por el método de difusión por vapor de gota colgante a 18°C. La gota estaba compuesta de 1 pl de mezcla de proteína/compuesto y 1 pl de tampón de cristalización de cloruro de magnesio 0,2 M, Tris 0,1 M a pH 8,5 y PeG 4000 al 16% p/v. Los cristales de mini-hSIRT1/1/2 se obtuvieron por el método de difusión por vapor de gota colgante a 18°C. La gota estaba compuesta de 1 pl de mezcla de proteína/compuesto y 1 pl de tampón de cristalización de cloruro sódico 0,55 M, MES 0,1 M pH 6,5, y PEG 4000 al 20% p/v. Los cristales de complejo mini-hSIRT1/1/p53-7mer/carbaNAD se obtuvieron por el método de difusión por vapor de gota colgante a 18°C. La gota estaba compuesta de 1 pl de mezcla de proteína/sustrato y 1 pl de tampón de cristalización de Tacsimato al 5% v/v, pH .0 HEPES 0,1 M a pH 7,0 y PEG 5000 MME al 10% p/v. Los cristales de mini-hSIRT1(E230K)/1/2 se obtuvieron por el método de difusión por vapor de gota colgante a 18°C. La gota estaba compuesta de 1 pl de mezcla de proteína/compuesto y 1 pl de tampón de cristalización de sulfato de litio 0,2 M, Bis-Tris 0,1 M a pH 6,5, PEG 3350 al 29% en p/v.
Los cristales se crioprotegieron en aguas madre que contenía glicerol al 20% antes de congelación instantánea en nitrógeno líquido. Los datos de difracción se recogieron en líneas de haces SSRF BL17U1, APS 21-ID-D o APS 21-ID-G y se procesaron usando el programa Xia2 (Winter, G. (2010J J Appl Crystallogr 43, 186). Se usó el software de sustitución molecular Phaser (McCoy, A. J. et al. (2007) J Appl Crystallogr 40, 658) para resolver la estructura con un modelo de búsqueda que contenía 242-494 restos basado en el modelo homólogo de SIRT3 (código PDB: 3GLU). El refinamiento iterativo de la estructura y la construcción de modelo se llevaron a cabo entre Refmac5 (Murshudov, A. A. et al. (1997) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240) del paquete CCP4 ((1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760) y Coot et al. (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126. Se da la información detallada relativa a los datos de difracción, refinamiento y análisis estadístico de la estructura en la tabla 3.
Tabla 3. Datos de procesamiento y análisis estadístico de refinamiento
Mini-SIRT1 Mini-SIRT1/1/p53
Mini-SIRT1/1 Mini-SIRT1/1/2 (E230K)/1/27-mero/CarbaNAD Recogida de datos
Resolución (A)* 45,67 -3,10 39,98 -2,73 40,17 -3,22 91,36 -2,74 (2,81
-2,74)
(3,18 -3,10) (2,81 - 2,73) (3,30 - 3,22)
Grupo espacial I212121 P6322 P6322 I4122 Parámetros de la celda unidad
a (A) 99,19 122,15 122,72 94,51 b (A) 111,64 122,15 122,72 94,51 c (A) 132,52 104,92 105,88 356,84 a (°) 90,00 90,00 90,00 90,00 P (°) 90,00 90,00 90,00 90,00 Y (°) 90,00 120,00 120,00 90,00 Completitud (%)* 99,5 (99,8) 99,9 (100,0) 99,9 (99,9) 99,5 (99,4) Redundancia* 4,8(4,9) 17,6(18,2) 17,4(18,4) 9,6 (9,9) Promedio I/aI* 17,4 (2,0) 38,8 (4,0) 38,1 (4,4) 20,7 (3,3) Rfusión (%)* 6,7(78,1) 5,3 (80,3) 6,2 (80,6) 8,2 (82,9) Refinamiento
45,71 -3,10 40,01 -2,74 40,17 -3,22 91,36 -2,74 (2,81 Resolución (A)* (3,18 -3,10) (2,81 - 2,73) (3,30 - 3,22) - 2,74) Rtrabajo (%)* 21,2 (33,9) 22,4 (33,6) 22,8 (28,8) 18,3 (31,8) Rlibre (%)* 25,0 (37,6) 27,1 (43,8) 25,1 (40,3) 23,5 (36,7) R.M.S.D en longitudes de 0,005 0,007 0,006 0,010 enlace (A)
R.M.S.D en ángulos de enlace 1,089 1,14 1,079 1,538
(°)
Factores B medios (A2) 100,1 78,6 104,5 67,3
* Los valores entre paréntesis son para la cubierta de resolución más alta
Ejemplo 98. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN)
Los experimentos de RMN HSQC de 1H,15N se llevaron a cabo a 25°C en un espectrómetro de RMN Bruker AVANCE III 600 MHz con criosonda usando muestras que contenían SIRT1(180-230) marcada con 15N aproximadamente 200 pM en presencia o ausencia de 1400 pM. Todos los datos de RMN se procesaron con NMRPipe (Delaglio, F. et al. (1995) J Biomol NMR 6, 277) y se analizaron con NMRView (Johnson, et al. (1994) J Biomol NMR 4, 603).
Ejemplo 99. Ensayo de cromatografía de exclusión por tamaños (SEC)
Los ensayos se llevaron a cabo usando una columna Superdex 75 10/300 GL (GE healthcare) inyectando muestras de 100 pl que contenían mini-hSIRT1 10 pM en ausencia o presencia de STAC 100 pM, disuelto en HEPES-NaOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y TCEP 0,5 mM. Las reacciones de unión se incubaron durante 1 h a t.a. antes de inyección en la columna.
Ejemplo 100. Ensayo de polarización de fluorescencia (FP)
Se llevaron a cabo experimentos de FP en 20 j l de tampón de ensayo (HEPES-NaOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y DTT 1 mM) a 25°C. Las placas de 384 pocillos se leyeron en PHERAstar FS con longitudes de onda de excitación y emisión de 502 nm y 533 nm, respectivamente. Para la unión de la sonda, se añadieron concentraciones crecientes de SIRT1 en sonda 310 nM. La isoterma de unión se describió mediante la ec. 2. Para el modo de unión competitiva, se añadieron concentraciones crecientes de competidores en la mezcla de 3 10 nM y SIRT1 de tipo natural o mutante E230K 0,3 jM en ausencia o presencia de Ac-p53(W5) 15 jM. Los datos de competición se describían mediante la Ec. 3. La conversión de IC50 a Ki se describía mediante la Ec. 4, donde Kd es la afinidad de unión de 3 a SIRT1, F0 es la fracción de sonda unida B/(B+F) y L0 es la concentración de la sonda 3.
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Ejemplo 101. Espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio (HDX-MS)
Experimento con intercambio de SIRT1.
Se llevaron a cabo reacciones de intercambio H/D seguido de digestión por pepsina, desalación, separación por HPLC y análisis de MS usando un sistema completamente automático, descrito en detalle en otra parte (Hamuro, Y. et al. (2003) J Biomol Techniques: JBT 14, 171). En particular para este conjunto de experimentos, las reacciones con intercambio se iniciaron mezclando 20 j l de una solución madre de SIRT1 (SIRT1 0,77 mg/ml, ± 3,88 mM Acp53(W5), ± 192 jM ligando, en DMSO al 1,9%) y 20 j l de fosfato 100 mM, pH leído 7,0 en D2O. La mezcla de D2O al 50% se incubó a 0°C durante 15, 50, 150, 500, 1,500 o 5.000 s. Para SIRT1 (229-516), las reacciones con intercambio se iniciaron mezclando 4 j l de una solución madre de SIRT1 (1,36 mg/ml de SIRT1 (229-516), ± 1,67 mM de Trp-25mero) y 36 j l de fosfato 200 mM, pH leído 7,0 en D2O. La mezcla de D2O al 90% se incubó a 0°C durante 15, 50, 150, 500, 1.500 o 5.000 s. La adición de 20 j l de hidrocloruro de guanidina 1,6 M (GuHCl), ácido fórmico al 0,8%, pH 2,3, inactivó la reacción con intercambio inmediatamente antes de ser analizada.
Ejemplo 102. Procedimiento de proteínas general para la muestra de HDX estándar
La solución inactivada se pasó por una columna de pepsina (volumen de lecho 104 |il) cargada con pepsina porcina (Sigma, St Louis, MO) inmovilizada en medio Poros 20 AL (Life Technologies, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante, con TFA acuoso al 0,05% (200 jl/min) durante 2 min. Los fragmentos digeridos se recogieron temporalmente en una columna trampa de fase inversa (volumen de lecho 4 |il) y se desalinizaron. Los fragmentos peptídicos después se eluyeron de la columna trampa y se separaron en una columna C18 (BioBacis-18; Thermo Scientific, San Jose, CA) con un gradiente lineal de disolvente B al 13% a disolvente B al 40% a lo largo de 23 min (disolvente A, 0,05% de TFA en agua; disolvente B, 95% de acetonitrilo, 5% de tampón A; caudal 10 jl/min). Los análisis de espectrometría de masas se llevaron a cabo usando un espectrómetro de masas LTQ OrbiTrap XL (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) con temperatura capilar a 200°C.
Ejemplo 103. Optimización de la digestión/separación y experimento no deuterado de SIRT1
Antes del experimento de intercambio H/D, se optimizaron las condiciones de digestión y separación para dar alta cobertura de la secuencia de SIRT1 con alta resolución en condiciones no deuteradas. En esta etapa, se inactivó una mezcla de 20 j l de SIRT1 0,77 mg/ml (9,2 jM ) y 20 j l de H2O por la adición de 20 j l de diferentes tampones ácidos. Para SIRT1 (229-516), una mezcla de 4 j l de una solución madre de SIRT1 (SIRT1 1,36 mg/ml (229-516), ± Trp-25mero 1,67 mM de) y 36 j l de H2O se inactivó por la adición de 20 j l de diferentes tampones ácidos. Las mezclas inactivadas se sometieron al procedimiento de proteínas general mencionado antes. Se identificaron los fragmentos peptídicos no deuterados mediante Sequest en Proteome Discoverer 1.1 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA).
Ejemplo 104. Experimento completamente deuterado de SIRT1
La muestra completamente deuterada se preparó incubando una mezcla de 45 |jl de SIRT1 0,77 mg/ml (9,2 j M) con 45 j l de TCEP 100 mM en D2O, pH 2,5 a 60°C durante 3 h. Para SIRT1 (229-516), la muestra completamente deuterada se preparó por incubación de una mezcla de 9 j l de SIRT1 (229-516) 1,36 mg/ml (41,7 j M) con 81 j l de TCEP 100 mM en D2O, pH 2,5 a 60°C durante 3 h. Después de incubación, la muestra se mantuvo a 0°C antes de ser inactivada de forma idéntica a una solución con intercambio y sometida al procedimiento de proteínas general. Ejemplo 105. Determinación del nivel de deuteración de cada péptido después de la reacción con intercambio. Se midieron los centroides de las envueltas isotópicas peptídicas usando el programa desarrollado en el laboratorio en colaboración con Sierra Analytics (Modesto, CA). Las correcciones para el retro-intercambio durante la etapa de procesamiento de proteínas se hicieron usando la siguiente secuencia de referencia Ec. 5 (Zhang, Z. et al. (1993) Protein Science 2, 522):
m(P) - m(N)
Nivel de deuteración (%) = ------------------- x 100
m(F) - m(N) {EC. 5) donde m(P), m(N) y m(F) son el valor centroide del péptido parcialmente deuterado (con intercambio), péptido no deuterado y péptido completamente deuterado, respectivamente.
Ejemplo 106. Actividad biológica
Se usaron ensayos basados en espectrometría de masas para identificar moduladores de la actividad de SIRT1. El ensayo basado en TAMRA usaba un péptido que tiene 20 restos de aminoácidos como sigue: Ac-EE-K(biotin)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2 (SEQ ID NO: 1), en donde K(Ac) es un resto de lisina acetilada y Nle es una norleucina. El péptido se marcó con el fiuoróforo 5TMR (excitación 540 nm/emisión 580 nm) en el extremo C. La secuencia del sustrato peptídico se basaba en p53 con varias modificaciones. Además, el resto de metionina naturalmente presente en la secuencia se sustituyó por la norleucina debido a que la metionina puede ser susceptible a la oxidación durante la síntesis y purificación. El ensayo basado en Trp usaba un péptido que tiene unos restos de aminoácidos como sigue: Ac-R-H-K-K(Ac)-W-NH2 (SEQ ID NO: 2).
El ensayo de espectrometría de masas basado en TAMRA se llevó a cabo como sigue: se incubaron sustrato peptídico 0,5 jM y pNAD+ 120 jM con SIRT1 10 nM durante 25 minutos a 25°C en un tampón de reacción (Trisacetato 50 mM a pH 8, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCh 1 mM, DTT 5 mM, BSA al 0,05%). La proteína SIRT1 se obtuvo por clonación del gen de SirT1 en un vector que contenía el promotor T7, que después se transformó y expresó en células bacterianas BL21(DE3). Se añadió compuesto de ensayo en diferentes concentraciones a esta mezcla de reacción y se controlaron las reacciones resultantes. Después de 25 minutos de incubación con SIRT1, se añadieron 10 j l de ácido fórmico al 10% para detener la reacción. Las reacciones resultantes se sellaron y congelaron para el análisis es espectrometría de masas posterior. La determinación de la cantidad del sustrato peptídico desacetilado formado (o, alternativamente, la cantidad de O-acetil-ADP-ribosa (OAADPR) generada) por la reacción de desacetilación dependiente de NAD mediada por sirtuina permitida para la medición precisa de la actividad relativa de la SIRT1 en presencia de diferentes concentraciones del compuesto de ensayo frente a reacciones de control que carecen del compuesto de ensayo.
El ensayo de espectrometría de masas Trp se llevó a cabo como sigue. Se incubaron sustrato peptídico 0,5 jM y pNAD+ 120 jM con SIRT1 10 nM durante 25 minutos a 25°C en un tampón de reacción (HEPeS 50 mM a pH 7,5, NaCl 1500 mM, DTT 1 mM, BSA al 0,05%). La proteína SIRT1 se obtuvo por clonación del gen de SirT1 en un vector que contenía el promotor T7, que después se expresó en células bacterianas BL21(DE3) y se purificó como se describe con más detalle más adelante. Se añadió compuesto de ensayo en diferentes concentraciones a esta mezcla de reacción y se controlaron las reacciones resultantes. Después de 25 minutos de incubación con SIRT1, se añadieron 10 j l de ácido fórmico al 10% para detener la reacción. Las reacciones resultantes se sellaron y congelaron para el análisis de espectrometría de masas posterior. Después se determinó la actividad relativa de SIRT1 midiendo la cantidad de O-acetil-ADP-ribosa (OAADp R) formada (o alternativamente, la cantidad de péptido Trp desacetilado generado) por la reacción de desacetilación de sirtuina dependiente de NAD en presencia de diferentes concentraciones del compuesto de ensayo frente a reacciones de control que carecen del compuesto de ensayo. El grado al que el agente de ensayo activada la desacetilación por la SIRT1 se expresó como EC15 (es decir, la concentración de compuesto requerida para aumentar la actividad de SIRT1 en 50% frente al control que carece de compuesto de ensayo) y porcentaje de activación máxima (es decir, la actividad máxima con respecto al control (100%) obtenido para el compuesto de ensayo).
Se llevó a cabo un control para la inhibición de la actividad de la sirtuina añadiendo 1 |il de nicotinamida 500 mM como un control negativo al inicio de la reacción (p. ej., permite la determinación de la inhibición máxima de sirtuina). Se llevó a cabo un control para la activación de la actividad de sirtuina usando proteína sirtuina 10 nM, con 1 |il de DMSO en lugar de compuesto, para determinar la cantidad de desacetilación del sustrato en un tiempo de medición dado dentro de un intervalo lineal del ensayo. Este tiempo de medición era el mismo que el usado para los compuestos de ensayo y, dentro del intervalo lineal, los puntos finales representan un cambio en la velocidad.
Para el ensayo anterior, la proteína SIRT1 se expresó y purificó como sigue. El gen SirT1 se clonó en un vector que contenía el promotor T7 y se transformó en BL21(DE3). La proteína se expresó por inducción con IPTG 1 mM como una proteína de fusión con marcador de His N-terminal a 18°C durante la noche, y se recogió a 30.000 x g. Las células se lisaron con lisozima en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, Tris[2-carboxietil]fosfina 2 mM (TCEP), ZnCh 10 |jM, NaCl 200 mM) y se trató además por ultrasonidos durante 10 min para completar la lisis. La proteína se purificó en una columna de Ni-NTA (Amersham) y se combinaron las fracciones que contenían proteína pura, se concentraron y se hicieron pasar por una columna de exclusión por tamaño (Sephadex S20026/60 global). El pico que contenía proteína soluble se recogió y se hizo pasar por una columna de intercambio iónico (MonoQ). La elución con gradiente (NaCl 200 mM - 500 mM) dio la proteína pura. Esta proteína se concentró y se dializó frente a tampón de diálisis (Tris-HCl 20 mM, TCEP 2 mM) durante la noche y se congeló a -80°C hasta el uso posterior.
Se identificaron los compuestos moduladores de sirtuina de fórmula (I) que activaban SIRT1 usando el ensayo descrito antes y se muestran a continuación en la tabla 1. Los valores de EC15 representan la concentración de compuestos de ensayo que da como resultado la activación al 150% de SIRT1. Los valores de EC15 para los compuestos activadores de fórmula (I) se representan por A (EC-i,5 <1 jM), B (EC-i,51-25 jM), C (EC-i,5 >25 jM). El porcentaje máximo de número de veces de activación se representa por A (número de veces de activación >150%) o B (número de veces de activación <150%). "NT" significa no ensayado; "ND" significa no determinable. La numeración del compuesto en la tabla empieza con el compuesto número 10 (n°) que corresponde al sistema de numeración de STAC en la figura 4 y los ejemplos 90-106 (es decir, el compuesto n° 68 también es STAC 1, por lo que se muestra como 68(1), y STAC adicionales: 546(3), 444(4), 314(5), 816(7), 76(8) y 81(9)).
Tabla 1. Compuestos de fórmula (I)
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85 42 B A
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En ciertas realizaciones, el compuesto es uno cualquiera de los números de compuestos 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 53, 54, 56, 57, 59, 61, 63, 66, 68, 75, 76, 80, 81, 83, 86, 87, 90, 93, 95, 99, 101, 102, 107, 110, 118, 119, 120, 121, 122, 128, 129, 130, 133, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 150, 151, 153, 156, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 184, 189, 191, 194, 197, 207, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 223, 230, 233, 235, 239, 250, 254, 260, 261, 264, 268, 271, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 285, 286, 288, 289, 290, 292, 293, 295, 299, 314 316, 322, 324, 325, 329, 330, 332, 333, 335, 341, 344 347, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 356, 359, 360, 361, 365 366, 367, 369, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 383 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 394, 396, 401, 402, 403 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 415, 417 419, 421, 422, 423, 425, 427, 428, 430, 431, 435, 452, 459 461, 463, 470, 472, 473, 474, 475, 480, 481, 483, 485 491, 492, 496, 497, 498, 499, 500, 502, 503, 504, 505, 506 507, 509, 515, 517, 519, 523, 526, 527, 530, 538, 540 541, 542, 556, 557, 559, 562, 563, 574, 575, 580, 581, 583 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 601, 604 605, 606, 607, 611, 617, 623, 625, 626, 629, 630, 635, 636 637, 638, 639, 640, 642, 643, 645, 646, 647, 648, 651 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 663, 665, 666 667, 668, 670, 671, 672, 676, 683, 692, 693, 694, 698 703, 706, 708, 709, 710, 714, 717, 718, 719, 720, 721, 722 723, 724, 725, 727, 730, 731, 733, 736, 737, 739, 740 741, 742, 743, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754 756, 757, 758, 760, 763, 765, 766, 767, 770, 776, 777 780, 788, 790, 792, 797, 301, 808.
Ejemplo 107
(4S)-N-(piridin-3-il)-7-(4-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida
Figure imgf000231_0001
A una disolución desgasificada de ((4S)-7-cloro-N-(piridin-2-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (700 mg, 2,217 mmol), 4-(trifluorometil)piperidina (679 mg, 4,43 mmol) en 1,4-dioxano (20 ml) se añadió dicidohexil(2',4l,6l-triisopropil-[1,1l-bifenil]-2-il)fosfina (423 mg, 0,887 mmol), carbonato potásico (919 mg, 6,65 mmol) y posteriormente acetato de paladio(II) (100 mg, 0,443 mmol) a 20°C y la mezcla de reacción se agitó en a tubo sellado a 90°C durante 16 h. La mezcla de reacción se vertió en agua fría (70 ml) y se extrajo con acetato de etilo (150 ml). Los extractos orgánicos se separaron y se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se concentraron a presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto se añadió a una columna de gel de sílice y se eluyó con metanol en diclorometano de 1% a 2%. Se recogieron las fracciones para dar 500 mg, se purificó de nuevo por HPLC de fase inversa GRACE para dar la (4S)-N-(piridin-3-il)-7-(4-(trifluorometil)piperidin-1-il)-3,4-dihidro-1,4-metanopirido[2,3-b][1,4]diazepina-5(2H)-carboxamida (320 mg, 0,710 mmol, 32%). MS (ESI) calculado para C21H23F3N6O: 433,2.
La presente invención proporciona entre otras cosas compuestos moduladores de sirtuina. La memoria descriptiva anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones serán evidentes para el experto en la técnica tras la revisión de esta memoria descriptiva. El alcance completo se debe determinar por referencia a las reivindicaciones.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000232_0001
o una de sus sales, en donde:
m es 1 o 2;
n es 2 o 3;
p es de 0 a 4;
R1 se selecciona de un carbociclo y heterociclo, en donde R1 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, alquilo C1-C4, alquilo C1-C4 fluoro-sustituido, -C=N, -Y, -X-C(=O)-Y, -X-O-Y, -X-OR4, -X-C(=O)-NR3R3, -X-NH-C(=O)-Y-NR3R3, -X-NH-C(=O)-O-Y, -X-NR3R3, =O, -NH-S(=O)2-Rs, -S(=O)2-R3, -S-R3, cicloalquilo (C3-C7), -C(=N)-NR3R3, -C(=N)-NH-X -NR3R3, -X-NH-C(=O)-Y, -C(=O)-NH-X, -NH-X, fenilo, -O-fenilo, heterociclo saturado o insaturado de 3 a 6 miembros y -O-(heterociclo saturado de 5 a 6 miembros), en donde cualquier fenilo, heterociclo saturado o insaturado de 3 a 6 miembros y -O-(heterociclo saturado de 5 a 6 miembros) sustituyente de R1 está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de carbono sustituible con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -OR4, -X-O-Y, -CF3, -Y, -X-R3R3, -X-NH-C(=O)-Y-NR3R3, -X-NH-C(=O)-O-Y-(heterociclo o carbociclo saturado de 5 a 6 miembros), -X-C(=N)-NR3R3 y -S-Y y opcionalmente sustituido en cualquier átomo de nitrógeno sustituible con -Y, -C(=O)-Y, -C(=O)-O-Y, -C(=O)-OR4, -Y-C(=O)-Y-NR3R3, -Y-NH-C(=O)-O-Y, -Y-NH-C(=O)-OR4, -Y-NH2, -C(=O)-NH-Y o -C(=O)-carbociclo saturado de 3 a 5 miembros;
R2 se selecciona de un carbociclo y un heterociclo, en donde R2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, alquilo C1-C4, alquilo C1-C4 fluoro-sustituido, _C=N, -Y, -X-OR4, -X-O-Y, -SO2-R3, -X-NR3R3, -NH-S(=O)2R3, -C(=O)-NR3R3, -C(=O)-Y, -C(=O)-O-Y, -SO2-Ry, -SO2-NH-Ry, -SO2-NR3R3, carbociclo o heterociclo saturado de 3 a 6 miembros y fenilo, en donde cualquier heterociclo saturado de 3 a 6 miembros sustituyente de R2 está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de carbono con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF3, _Y, -X-O-Y, -NH-Y y -N(Y)2, y está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de nitrógeno con uno o más sustituyentes seleccionados de -C(=O)-O-Y, -Y y -C(=O)-Y,
cada R3 se selecciona independientemente de hidrógeno, -C(=N)-NH2, -C(=O)-Y, -Y, -Y-NH-C(=O)-O-Y, -Y-NH-C(=O)-OH, -Y-NH-C(=O)-CF3, -C(=O)-Y-heterociclo saturado de 3 a 5 miembros, -C(=O)-O-Y-(heterociclo saturado de 3 a 5 miembros), -C(=O)-CF3, -C(=O)-O-Y, -C(=O)-OH, -C(=O)-O-CF3, -S(=O)2-Y, -S(=O)2-OH;
dos R3 se consideran junto con el átomo de nitrógeno o carbono al que están unidos para formar un heterociclo saturado de 4 a 8 miembros que comprende opcionalmente un heteroátomo adicional independientemente seleccionado de N, S, S(=O), S(=O)2 y O, en donde el heterociclo formado por dos R3 está opcionalmente sustituido en cualquier átomo de carbono con uno o más de OH, halógeno, Y, NH2, NH-Y, N(Y)2, O-Y, y opcionalmente sustituido en cualquier átomo de nitrógeno sustituible con C(=O)-O-Y, Y o C(=O)-Y;
cada R4 se selecciona independientemente de hidrógeno, Y, -CF3, -C(=O)-Y, -C(=O)-O-Y, -Y-C(=O)-Y o -Y-C(=O)-O-Y;
R5 y R6 se seleccionan independientemente de hidrógeno, -OH, -OCF3, -O-Y, -O-C(=O)-Y, -O-C(=O)-O-Y, -O-C(=O)-NH-Y, -O-C(=O)-N(Y)2 , -O-C(=O)-heterociclo o carbociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros, en donde solo uno de R5 y R6 es O-C(=O)-heterociclo o carbociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros, y cuando R5 o R6 es O-C(=O)-heterociclo o carbociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros está sustituido además con halógeno, -OH, Y, -O-Y, -OCF3 o -O-C(=O)-Y; o
R5 y R6 se pueden considerar junto con el átomo de carbono al que están unidos para formar =O;
R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, -OH, -O-Y e Y;
R9 se selecciona de hidrógeno, halógeno, -OH, -OCF3, -O-Y, Y, -O-C(=O)-Y, -NH-Y y -N(Y)2;
cada X es alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal o ramificada C0-C5; y
cada Y es alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal o ramificada C1-C5;
en donde cualquiera de Y o X está opcionalmente sustituido con uno o más de -OH, -alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada, -alqueno C1-C4, -alquino C1-C4, -O-(alquilo C1-C4), -O-(alqueno C1-C4), -O-(alquino C1-C4), -C(=O)-alquilo-C1-C4 de cadena lineal o ramificada, -C(=O)-alqueno-C1-C4, -C(=O)-alquino-C1-C4, -C(=O)-O-alquilo-C1-C4 de cadena lineal o ramificada, -C(=O)-O-alqueno-C1-C4, -C(=O)-O-alquino-C1-C4, halógeno, -NH2, -NH(alquilo C1-C4), -N(alquilo C1-C4)2, -(alquilo C1-C3 de cadena lineal o ramificada)-NH-(=NH)-NH2, -NH(alquilo C1-C4 sustituido con alcoxi), -NH(alquilo C1-C4 sustituido con hidroxi), -N(alquilo C1-C4 sustituido con alcoxi)(alquilo C1-C4 sustituido con hidroxi), -N(alquilo C1-C4 sustituido con hidroxi)2 o - N(alquilo C1-C4 sustituido con alcoxi)2.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene una estructura representada por la fórmula estructural (IIa):
Figure imgf000233_0001
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene una estructura representada por la fórmula estructural (IIIa):
Figure imgf000233_0002
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene una estructura representada por las fórmulas estructurales (IIb) o (IIIb):
Figure imgf000233_0003
5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene una estructura representada por la fórmula estructural (IV):
Figure imgf000234_0001
6. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde p es de 1 a 4.
7. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde R1 se selecciona de fenilo, un heterociclo saturado o insaturado de 5 a 6 miembros, y un carbociclo o heterociclo saturado o insaturado, de 8 a 11 miembros, bicíclico condensado.
8. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde R1 se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000235_0001
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Figure imgf000240_0001
9. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde -(CH2V-R1 se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000240_0002
10. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde R2 se selecciona de un carbociclo o heterociclo saturado de 5 a 7 miembros, un heterociclo unido por N y un heterociclo saturado o insaturado de 8 a 11 miembros.
11. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde R2 es un heterociclo saturado o insaturado de 8 a 11 miembros, bicíclico condensado.
12. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde R2 se selecciona de cualquiera de:
Figure imgf000241_0001
Figure imgf000243_0001
13. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000244_0001
Figure imgf000245_0001
14. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona de uno cualquiera de:
Figure imgf000245_0002
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j
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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
15. El compuesto de la reivindicación 1 que es:
Figure imgf000302_0002
16. El compuesto de la reivindicación 1 que es:
Figure imgf000302_0003
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
17. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para usar en terapia.
19. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para usar en un método para tratar un sujeto que padece o es susceptible frente a dolencias de la piel o afecciones de la piel.
20. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para usar según la reivindicación 19, en donde la dolencia de la piel o afección de la piel se selecciona de:
- trastornos o enfermedades asociadadas o cuasadas por inflamación, daño por el sol o envejecimiento natural, seleccionadas de dermatitis de contacto, dermatitis de contacto irritante, dermatitis de contacto alérgica), dermatitis atópica (también conocida como eczema alérgico), queratosis actínica, trastornos de queratinización, eczema, enfermedades de epidermólisis ampollosa, pénfigo), dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritemas, eritema multiforme, eritema nodoso, daño causado por el sol u otras fuentes de luz, lupus eritematoso discoide, dermatomiositis, psoriasis, cáncer de piel, efectos del envejecimiento natural; y
- heridas o quemaduras para promover la cicatrización seleccionadas de quemaduras de primer, segundo o tercer grado, y/o quemaduras químicas o eléctricas.
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