ES2720287T3 - Fructosil aminoácido oxidasa - Google Patents

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Abstract

Una fructosil aminoácido oxidasa mutante modificada en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 sustituyendo el residuo de aminoácido Asn con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val, en la que una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 significa la posición del residuo de aminoácido en la secuencia de fructosil aminoácido oxidasa que está alineada con el aminoácido en la posición 56 en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, y en la que la fructosil aminoácido oxidasa mutante tiene una proporción de actividad deshidrogenasa/oxidasa de aproximadamente 2,0 o más.

Description

DESCRIPCIÓN
Fructosil aminoácido oxidasa
Campo técnico
La presente invención se refiere a una fructosil aminoácido oxidasa (también llamada fructosilamina oxidasa) para su uso en un kit y un sensor para la medición de proteínas glucadas, tales como glucoalbúmina, fructosil péptidos, HbA1c y fructosil valina (FV). Más en particular, la presente invención se refiere a una fructosil aminoácido oxidasa mutante que tiene actividad oxidasa reducida.
Técnica anterior
Una proteína glucada se genera de forma no enzimática por medio de un enlace covalente entre un grupo amino en una proteína y el extremo reductor de un glúcido, y también se conoce como compuesto de Amadori. En la sangre, la glucosa se une a la valina en el extremo N de la cadena p de la hemoglobina para generar glucohemoglobina (HbA1c). La proporción de abundancia de HbA1c con respecto a la hemoglobina es más alta en los pacientes que sufren diabetes mellitus en comparación con un sujeto sano normal y se sabe que la concentración de HbA1c en la sangre refleja el nivel de glucemia durante las últimas semanas. Por tanto, la concentración de HbA1c en sangre es bastante importante en las pruebas clínicas para el diagnóstico de la diabetes mellitus y en el control de la glucemia de los pacientes que padecen diabetes mellitus. La concentración de HbA1c en sangre se puede medir usando una enzima que tiene especificidad por la fructosil valina o la fructosil valil histidina.
Las fructosil aminoácido oxidasas se han aislado de diversos tipos de cepas o se han preparado de forma recombinante, y se ha sugerido que la proteína glucada, tal como la glucoalbúmina, la HbA1c y los fructosil aminoácidos se puede analizar usando dichas enzimas (documento JP A 61-268.178; documento JP A 61-280.297; documento JP A 03-155.780; documento JP A 05-192.193; documento JP A 07-289.253; documento JP A 08-154.672; documento JP A 2001-95598; documento JP A 2003-79386; documento JP A 2003-235585; documento WO 2007/055282 A2; documento EP 1626 088 A1; documento EP 1291 416 A1; documento EP 2 020 439 A1; Agrio. Biol. Chem., 53(1), 103-110, 1989; Agrio. Biol. Chem, 55(2), 333-338, 1991; J. Biol. Chem, 269 (44), 27297-27301, 1994; Appl. Environ. Miorobiol., 61(12), 4487-4489, 1995; Biosoi. Bioteoh. Bioohem, 59(3), 487-491, 1995; J. Biol. Chem., 270(1), 218-224, 1995; J. Biol. Chem., 271(51), 32803-32809, 1996; y J. Biol. Chem., 272(6), 3437-3443, 1997; Bioteohnol Lett, 28(23), 1895-1900, 2006; Mar. Bioteohnol., 6(6), 625-632, 2004; Bioteohnol Lett, 32(8), 1123-1129, 2010; Bioohemioal and Biophysioal Researoh Communioations, 311(1), 104-111, 2003).
El análisis inicial de la secuencia del genoma del dotideomiceto Stagonospora nodorum (sin. Phaeosphaeria) se ha descrito en The Plant Cell, 19(11), 3347-3368, 2007.
La fructosil aminoácido oxidasa es una enzima dependiente de FAD que cataliza una reacción donde el fructosil aminoácido se oxida para generar 2-ceto-D-glucosa y el correspondiente aminoácido, generando la forma reducida de FAD (FADH2). FADH2 a su vez transmite un electrón a un aceptador de electrones y se convierte en su forma oxidada. En presencia de oxígeno, FADH2 transmite preferentemente electrones a la molécula de oxígeno en lugar de aceptadores de electrones artificiales (también denominados mediadores o mediadores de electrones). Por tanto, cuando un fructosil aminoácido se somete a ensayo mediante fructosil aminoácido oxidasa con mediadores, los resultados del ensayo estarán enormemente afectados por el nivel de oxígeno disuelto en el sistema de reacción. Dicha desventaja se observará en particular en pruebas clínicas de muestras de sangre por un dispositivo de prueba en el punto de atención que utilice un aceptador de electrones artificial. La enzima utilizada para las tiras de sensores enzimáticos que emplean mediadores de electrones artificiales tiene deseablemente una baja actividad con oxígeno.
En consecuencia, el objetivo de la presente invención es proporcionar una enzima, en particular una fructosil aminoácido oxidasa, cuya actividad esté menos afectada por el nivel de oxígeno disuelto.
Divulgación de la invención
En términos generales, los autores de la presente solicitud de invención han podido proporcionar una enzima, en particular una fructosil aminoácido oxidasa, cuya actividad está menos afectada por el nivel de oxígeno disuelto. Más específicamente, esto se ha logrado reduciendo la actividad oxidasa de una enzima que, en su forma natural, muestra predominantemente una actividad oxidasa y, preferentemente al mismo tiempo, aumentando la actividad deshidrogenasa de la enzima. Como se describirá con más detalle a continuación, esto se ha logrado mutando la enzima natural.
Los autores de la presente invención han preparado varios mutantes de una fructosil aminoácido oxidasa y sorprendentemente han encontrado que un determinado tipo de mutantes presentan una actividad oxidasa reducida al tiempo que retienen sustancialmente la actividad deshidrogenasa, en particular actividad deshidrogenasa mediada por tinte.
La presente invención es como se define en las reivindicaciones. Se proporciona una fructosil aminoácido oxidasa muíante que está modificada en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 sustituyendo el residuo de aminoácido Asn con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val, en la que una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 significa la posición del residuo de aminoácido en la secuencia de fructosil aminoácido oxidasa que está alineada con el aminoácido en la posición 56 en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, y en la que la fructosil aminoácido oxidasa mutante tiene una proporción de actividad deshidrogenasa/oxidasa de aproximadamente 2,0 o más.
En un modo de realización preferente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad oxidasa reducida en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural, y preferentemente tiene una actividad deshidrogenasa aumentada en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural. Preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad oxidasa de un 30 % o menos que la de la fructosil aminoácido oxidasa natural, y preferentemente también tiene una actividad deshidrogenasa de un 50 % o más que la de la fructosil aminoácido oxidasa natural. También preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad deshidrogenasa aumentada en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural.
En otro modo de realizción preferente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-16, en la que el residuo de aminoácido Asn en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. Preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 56 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu en las posiciones 109-124 de SEQ ID NO: 1 está reemplazada con la secuencia: Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala.
También preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 47 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. También preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 52 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. También preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 56 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos lie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser en las posiciones 61-72 de SEQ ID NO: 7 está reemplazada con la secuencia Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la presente invención.
Aún en otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención.
Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped transformada con un vector de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para someter a ensayo una proteína glucada en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con la fructosil aminoácido oxidasa de la invención y medir la cantidad de la proteína glucada oxidada por la fructosil aminoácido oxidasa.
Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para someter a ensayo la HbA1c, que comprende digerir la HbA1c en una muestra para generar fructosil valina o fructosil valil histidina, poner en contacto la fructosil valina o la fructosil valil histidina con la fructosil aminoácido oxidasa de la invención, y medir la cantidad de fructosil valina o fructosil valil histidina oxidada.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido en una muestra, que comprende la fructosil aminoácido oxidasa de la invención y un mediador de transferencia de electrones.
Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido en una muestra, que comprende la fructosil aminoácido oxidasa de la invención y un mediador de transferencia de electrones.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un electrodo enzimático que tiene la fructosil aminoácido oxidasa de la invención que está inmovilizada sobre el electrodo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un sensor enzimático para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido, que comprende el electrodo enzimático de la invención como electrodo de trabajo.
En el presente documento se describe además una fructosil aminoácido oxidasa mutante que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos: valser Leu ñrg Asn Pro Val AspLeu Gln Leu Ala en las posiciones 61-72 de SEQ ID NO: 1 está reemplazada con la secuencia: lie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp LeuGln Met Ser. También se describe en el presente documento una fructosil aminoácido oxidasa mutante que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos: SerGly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu en las posiciones 109-124 de SEQ ID NO: 1 está reemplazada con la secuencia: Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala. También se describe en el presente documento una fructosil aminoácido oxidasa mutante que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7, en la que la secuencia de aminoácidos: H e Arg Leu Arg Asn Lys val Asp Leu GlnMet Ser en las posiciones 61-72 de SEQ ID NO: 7 está reemplazada con la secuencia: Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala. También se describe en el presente documento una fructosil aminoácido oxidasa mutante que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7, en la que la secuencia de aminoácidos: Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala en las posiciones 109-126 de SEQ ID NO: 1 está reemplazada con la secuencia: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos alrededor del extremo N de algunas de las FAOD eucarióticas.
La figura 2 muestra el sistema de reacción de la fructosil aminoácido oxidasa.
La figura 3 muestra la actividad oxidasa y deshidrogenasa del mutante N1-1 FAOD N47A purificado.
La figura 4 muestra la actividad oxidasa y deshidrogenasa de PnFPOX natural y mutantes Asn56 en bruto.
La figura 5 muestra los parámetros cinéticos de mutantes PnFPOX Asn56.
La figura 6 muestra la actividad oxidasa y deshidrogenasa del mutante PnFPOX N56A purificado.
La figura 7 muestra la actividad oxidasa y deshidrogenasa de Amadoriasa II natural y mutante N52A purificados. La figura 8 muestra los parámetros cinéticos de Amadoriasa II natural y mutante N52A purificados.
La figura 9 muestra el ensayo de concentración de FV usando un electrodo que tiene PnFPOX N56A o FAOD natural. Descripción detallada de la invención
Son conocidas fructosil aminoácido oxidasas (FAOD) que existen en diversas cepas eucarióticas y procarióticas. La Tabla 1 muestra algunos ejemplos de las FAOD aisladas o previstas hasta la fecha.
Tabla 1 Diversas FAOD
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Las FAOD eucarióticas se pueden agrupar de acuerdo con la especificidad del sustrato: (i) preferencia por a-fructosil aminoácidos (FAOD-P, FAOD-U, FPOX-E, FPOX-C y PnFPOX), (ii) preferencia por £-fructosil aminoácidos (FAOD-F, FAOD-A, Amadoriasa I, y FAOD-Ao1), y (iii) actividad similar con aminoácidos tanto a como £-glucados (amadoriasa II, FAOD-Ao2 y N1-1 FAOD). En general, las FAOD activas en a-fructosil aminoácidos serán útiles para someter a ensayo a-fructosil valina y HbA1c, y aquellas activas en E-fructosil aminoácidos serán útiles para someter a ensayo £-fructosil lisina y glucoalbúmina. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la introducción de una mutación en la enzima puede alterar su preferencia por a- o £-fructosil aminoácidos.
La presente invención proporciona una fructosil aminoácido oxidasa mutante como se define en las reivindicaciones. La fructosil aminoácido oxidasa mutante se modifica en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 (PnFPOX) sustituyendo el residuo de aminoácido Asn con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
El término "mutante" de una proteína como se usa en el presente documento se refiere a una proteína variante que contiene una sustitución en uno o más de los residuos de aminoácido en la proteína en la posición o posiciones indicadas. El término mutante también se usa para un polinucleótido que codifica dicha proteína mutante.
La frase "una posición correspondiente a", como se usa en el presente documento, significa la posición de un residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos examinada que se alinea con el residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos de referencia usando un programa informático AlignX de Vector NTI con parámetros predeterminados (disponible de Invitrogen; véase, Lu, G. y Moriyama, E.N. (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88). Por tanto, "residuo de Asn en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1" significa el residuo de Asn en una secuencia de aminoácidos examinada que está alineada con Asn56 de SEQ ID NO: 1 cuando la secuencia de aminoácidos examinada se alinea con SEQ ID NO: 1 usando AlignX de Vector NTI con parámetros predeterminados. Cabe destacar que la Asn47 de SEQ ID NO: 1 por sí misma también está englobada por este término.
La fig. 1 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos dentro de la región conservada cerca del extremo N de algunas de las FAOD eucarióticas (FAOD-P de Penicillum janthinelum AKU 3413, FAOD-U de Ulocladium sp. JS-103, FPOX-E de Eupenicillum terrenum ATCC 18547, FPOX-C de Coniochaeta sp. NISL 9330, PnFPOX de Phaeosphaeria nodorum, FAOD-F de Fusarium oxysporum NBRC 9972, FAOD-A de Aspergillus terreus GP1, Amadoriasas I de Aspergillus fumigatus, FAOD-Ao1 de Aspergillus oryzae, Amadoriasas II de Aspergillus fumigatus, FAOD-Ao2 de Aspergillus oryzae y N1-1 FAOD de Pichia sp. N1-1). La secuencia completa de estas FAOD se expone en SEQ ID NO: 1-12. La alineación se creó usando la aplicación AlignX de Vector NTI paquete 6.0. La punta de flecha indica los residuos correspondientes a la Asn47 de N1-1 FAOD. El numero en los paréntesis indica la posición de la "P" más a la izquierda de la fig. 1 en cada secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO. Los expertos en la materia apreciarán que otros programas informáticos de alineación tales como Blast proporcionarán la misma o sustancialmente la misma alineación.
Es evidente a partir de la fig. 1 que las secuencias de aminoácidos en la región que contiene Asn47 de N1-1 FAOD están altamente conservadas entre las FAOD eucarióticas. En consecuencia, una persona experta en la técnica puede identificar fácilmente el residuo de Asn correspondiente a la Asn47 de N1-1 FAOD dentro de la región conservada usando cualquiera de los programas informáticos disponibles comercialmente para alineación de secuencias, y entender que una fructosil aminoácido oxidasa mutante se prepara fácilmente introduciendo una modificación en ese residuo de Asn.
En otro modo de realización preferente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-15, en la que el residuo de aminoácido Asn en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. Preferentemente, el residuo de Asn está sustituido con Ala.
En un modo de realización preferente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 (PnFPOX), en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 56 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. Preferentemente, el residuo de Asn está sustituido con Ala. En otro modo de realización preferente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 (N1-1), en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 47 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val. Aún en otro modo de realización preferente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en s Eq ID NO: 3 (Amadoriasa II), en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 52 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención presenta actividad oxidasa disminuida al tiempo que substancialmente retiene la actividad deshidrogenasa. La fig. 2 ilustra el esquema de reacción de la fructosil aminoácido oxidasa.
Como se usa en el presente documento, la "actividad oxidasa" es una actividad enzimática (Vmáx) de la fructosil aminoácido oxidasa para catalizar la oxidación del fructosil aminoácido para generar 2-ceto-D-glucosa y el aminoácido correspondiente con la utilización de oxígeno como aceptador de electrones. La actividad oxidasa se puede someter a ensayo midiendo la cantidad de H2O2 generada por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante reactivos para la detección de H2O2 tal como 4AA/TODB/POD (4-aminoantipirina/sal disódica de N,N-bis(4-sulfobutil)-3-metilanilina/peroxidasa de rábano picante) o mediante un electrodo de Pt. Como se usa en el presente documento en el contexto de la actividad relativa o cuantitativa, la actividad oxidasa se define específicamente como la cantidad en moles del sustrato (fructosil aminoácido) oxidado por unidad de tiempo medida por la cantidad de H2O2 generada a 25 °C en PPB 10 mM, pH 7,0, TODB 1,5 mM, 2 U/ml de peroxidasa de rábano picante (POD) y 4-aminoanti-pirina (4AA) 1,5 mM. Se puede medir la formación de tinte de quinoneimina espectrofotométricamente a 546 nm.
Como se usa en el presente documento, la "actividad deshidrogenasa" es una actividad enzimática (Vmáx) de la fructosil aminoácido oxidasa para catalizar la oxidación del fructosil aminoácido para generar 2-ceto-D-glucosa y el aminoácido correspondiente con la utilización de un mediador de electrones distinto de oxígeno como aceptador de electrones. La actividad deshidrogenasa se puede someter a ensayo midiendo la cantidad de electrones transferida al mediador usando, por ejemplo, mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio/2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etilfenanzinio, NA BM31_1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)3-metoxinitrosoanilina, NABM31_1008 (N,N-bis-hidroxi-etil-4-nitrosoanilina) y N-N-4-dimetil-nitrosoanilina.
Como se usa en el presente documento en el contexto de la actividad relativa o cuantitativa, la actividad deshidrogenasa se define específicamente como la cantidad en moles del sustrato (fructosil aminoácido) oxidado por unidad de tiempo medida por la cantidad de electrones transferidos al mediador a 25 °C en PPB 10 mM (pH 7,0), DCIP 0,6 mM y metoxi Pm S 6 mM (mPMS).
La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad oxidasa reducida en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural, al tiempo que sustancialmente conserva la actividad deshidrogenasa.
Preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad oxidasa de un 50 % o menos que la de la fructosil aminoácido oxidasa natural. Más preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad oxidasa de un 40 % o menos, más preferentemente un 30 % o menos, incluso más preferentemente un 20 % o menos, lo más preferentemente un 15 % o menos que la de la fructosil aminoácido oxidasa natural. También preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad deshidrogenasa de un 50 % o más que la fructosil aminoácido oxidasa natural. Más preferentemente, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene una actividad deshidrogenasa de un 70 % o más, más preferentemente de un 90 % o más, incluso más preferentemente un 100 % o más, lo más preferentemente más de un 100 % que la de la fructosil amino oxidasa natural.
En la fructosil aminoácido oxidasa natural, la actividad oxidasa y la actividad deshidrogenasa están en un nivel similar, siendo la proporción de actividad deshidrogenasa/oxidasa entre aproximadamente 0,8 a 1,2. Cuando está presente oxígeno disuelto en el sistema de ensayo, el electrón generado por la oxidación del sustrato se transferirá preferentemente al oxígeno. Por tanto, la actividad enzimática medida en presencia de un mediador de electrones estará enormemente afectada por la concentración de oxígeno disuelto. Por el contrario, la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención tiene la proporción de actividad deshidrogenasa/oxidasa de aproximadamente 2,0 o más, preferentemente 4,0 o más, más preferentemente 10 o más, incluso más preferentemente 20 o más, lo más preferentemente 40 o más. Dado que la actividad deshidrogenasa supera la actividad oxidasa, la actividad enzimática de la fructosil aminoácido oxidasa de la presente invención estará menos afectada por la concentración de oxígeno disuelto, lo que es ventajoso en la utilización de la fructosil aminoácido oxidasa en el diagnóstico clínico con una muestra de sangre.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una fructosil aminoácido oxidasa donde una o más regiones de bucle están modificadas o mutadas. PnFPOX muestra actividad oxidasa hacia fructosil hexapéptido a un nivel de menos de un 1 % de la actividad en comparación con FVH, mientras que FPOX-C no muestra actividad. Por otra parte, FPOX-C muestra una actividad más alta hacia FVH que P.n FPOX. De la comparación de la secuencia de aminoácidos de ambas oxidasas, se encuentra una diferencia significativa entre FAOD y FPOX en sus regiones de bucle.
Región del bucle 1
PnFPOX (61) Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala (72) (SEQ ID NO: 13)
FPOX-C (61) l i e Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser (72) (SEQ ID NO: 14) Región del bucle 2
PnFPOX (109) Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu (124) (SEQ ID NO: 15)
FPOX-C (109) Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala (126) (SEQ ID NO: 16)
En la región del bucle 1 (12aa), 5 residuos de aminoácido son diferentes entre Pn FPOX y FPOX-C. En la región del bucle 2 (16aa), se observan 2 inserciones de aminoácidos y 7 sustituciones de aminoácidos.
Se encontró sorprendentemente que algunos mutantes de bucle quiméricos, donde se intercambian regiones del bucle 1 de PnFPOX y FPOX-C entre sí, mostraron una actividad mejorada. Como se muestra en el ejemplo 8 a continuación, PnFPOX, donde su región del bucle 2 está reemplazada por la región del bucle 2 de FPOX-C, muestra una actividad oxidasa más alta hacia FV, FVH y fructosil hexapéptido (F-HP) que la PnFPOX natural. FPOX-C, donde su región del bucle 1 está reemplazada por la región del bucle 1 de PnFPOX muestra actividad oxidasa hacia F-HP, que no se detecta en la FPOX-C natural. Además, mutantes de bucle quiméricos que tienen la mutación N56A también muestra una actividad oxidasa disminuida y una actividad deshidrogenasa aumentada, como se observa en los mutantes N56A derivados de PnFPOX y FPOX-C. Un mutante de bucle quimérico preferente en particular es PnFPOX, donde la región del bucle 2 está sustituida con la región del bucle 2 de FPOX-C, y Asn56 está sustituida con Ala. Otro mutante de bucle quimérico preferente en particular es FPOX-C, donde la región del bucle 1 está sustituida con la región del bucle 1 de PnFPOX y Asn56 está sustituida con Ala. Estos resultados sugieren que una combinación de la región del bucle 1 de PnFPOX y la región del bucle 2 de FPOX-C proporciona una actividad más alta hacia fructosil valina y fructosil valil histidina, así como hacia fructosil hexapéptido.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la presente invención. La secuencia de nucleótidos de polinucleótidos que codifican fructosil aminoácido oxidasa se puede obtener fácilmente de bases de datos públicas. El polinucleótido que codifica la fructosil aminoácido oxidasa natural se puede clonar a partir del genoma de los organismos respectivos usando PCR u otras técnicas conocidas. Se pueden introducir mutaciones por mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis por PCR o cualquier otra técnica bien conocida en la técnica. El residuo de Asn que se va a mutar se puede identificar usando cualquiera de los programas informáticos para alineación de secuencias disponibles en la técnica. De forma alternativa, el polinucleótido que codifica la fructosil aminoácido oxidasa mutante se puede preparar por PCR usando una serie de oligonucleótidos sintetizados químicamente, o se puede sintetizar completamente.
La fructosil aminoácido oxidasa mutada se puede preparar insertando el gen mutante en un vector de expresión apropiado e introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, tal como células de E. coli. Se cultiva el transformante y la fructosil aminoácido oxidasa expresada en el transformante se puede recoger de las células o el medio de cultivo.
La fructosil aminoácido oxidasa recombinante obtenida de este modo se puede purificar mediante cualquiera de las técnicas de purificación conocidas en la técnica, incluyendo cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de líquidos, filtración, ultrafiltración, precipitación salina, precipitación en disolvente, inmunoprecipitación, electroforesis en gel, electroforesis isoeléctrica y diálisis.
Por tanto, la presente invención también engloba un vector que comprende el polinucleótido que codifica la fructosil aminoácido oxidasa mutante, una célula huésped transformada con dicho vector, y un procedimiento para preparar la fructosil aminoácido oxidasa mutante de la invención cultivando el transformante, recogiendo y purificando la fructosil aminoácido oxidasa mutante del cultivo.
La invención también abarca un procedimiento para someter a ensayo una proteína glucada en una muestra. El procedimiento comprende poner en contacto la muestra con la fructosil aminoácido oxidasa de la invención y medir la cantidad de la proteína glucada oxidada por la fructosil aminoácido oxidasa. Las proteínas glucadas sometidas a ensayo por la presente invención incluyen, por ejemplo, fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c, fructosil hexapéptido, glucoalbúmina y otros fructosil aminoácidos. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para someter a ensayo la HbA1c que comprende digerir la HbA1c en una muestra para generar fructosil valina, poner en contacto la fructosill valina con la fructosil aminoácido oxidasa de la invención, y medir la cantidad de fructosil valina oxidada.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c, fructosil hexapéptido o glucoalbúmina en una muestra que comprende la fructosil aminoácido oxidasa de la invención y el mediador de transferencia de electrones.
El dispositivo de ensayo puede tener una estructura similar a cualquiera de las tiras reactivas de biosensores amperométricos convencionales, disponibles comercialmente para controlar el nivel de glucemia. Un ejemplo de dicho dispositivo tiene dos electrodos (electrodo de trabajo y electrodo de referencia o contraelectrodo) situados en un sustrato aislante, un puerto de reactivos y un receptor de muestras. El puerto de reactivos contiene la fructosil aminoácido oxidasa mutada de la invención y un mediador. Cuando una muestra tal como una muestra de sangre se añade al receptor de muestras, el fructosil aminoácido contenido en la muestra reaccionará con la fructosil aminoácido oxidasa para generar corriente, que es indicativa de la cantidad de fructosil aminoácido en la muestra. Ejemplos típicos de sensores electroquímicos adecuados para la determinación de sustratos enzimáticos se conocen, por ejemplo, del documento WO 2004/113900 y el documento US 5.997.817. Como alternativa a los sensores electroquímicos, se podrían usar tecnologías de detección óptica. Típicamente, dichos dispositivos ópticos se basan en los cambios de color que se producen en un sistema de reactivos que comprende la enzima, un mediador de transferencia de electrones y un indicador. Los cambios de color se pueden cuantificar usando mediciones de fluorescencia, absorción o remisión. Ejemplos típicos de dispositivos ópticos adecuados para la determinación de sustratos enzimáticos son conocidos, por ejemplo, del documento US 7.008.799, el documento US 6.036.919 y el documento US 5.334.508.
Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido en una muestra que comprende la fructosil aminoácido oxidasa de la invención y un mediador de transferencia de electrones.
Un kit para la medición de fructosil valina o fructosil valil histidina se puede construir usando la enzima de la presente invención. Además de la fructosil aminoácido oxidasa de la invención, el kit contiene el tampón necesario para la medición, un mediador apropiado y, si es necesario, enzimas tales como peroxidasa, solución patrón de fructosil valina o fructosil valil histidina o un derivado de las misma para la preparación de una curva de calibración e instrucciones de uso. La fructosil aminoácido oxidasa de la presente invención se puede proporcionar en diversas formas, por ejemplo, como un reactivo liofilizado o como una solución en una solución de almacenamiento apropiada.
También es posible construir un kit de ensayo de glucoalbúmina, HbA1c o fructosil hexapéptido usando la enzima de la presente invención. La glucoalbúmina, la HbA1c o el fructosil hexapéptido se digieren enzimáticamente o químicamente para generar un fructosil aminoácido o un fructosil péptido, tal como fructosil valina, fructosil valil histidina y fructosil hexapéptido, que a su vez se cuantifica usando la fructosil aminoácido oxidasa de la presente invención. De este modo, se pueden someter a ensayo la glucoalbúmina, la HbA1c o el fructosil hexapéptido. En consecuencia, el kit de ensayo de la presente invención para glucoalbúmina, HbA1c o fructosil hexapéptido puede además contener un reactivo para hidrólisis o proteasa en el kit mencionado anteriormente para la medición de fructosil valina o fructosil valil histidina.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un electrodo enzimático que tiene la fructosil aminoácido oxidasa de la invención que está inmovilizada sobre el electrodo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un sensor enzimático para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido que comprende el electrodo enzimático de la invención como electrodo de trabajo.
La concentración del fructosil aminoácido en una muestra se puede determinar midiendo la cantidad de electrones generados por la reacción enzimática. Se han conocido diversos sistemas de sensores en la técnica, incluyendo electrodo de carbono, electrodo de metal y electrodo de platino. La fructosil aminoácido oxidasa mutada de la presente invención se inmoviliza sobre los electrodos. Los ejemplos de los medios de inmovilización incluyen reticulación, encapsulación en una matriz macromolecular, recubrimiento con una membrana de diálisis, polímero de reticulación óptica, polímero electroconductor, polímero de oxidación-reducción y cualquier combinación de los mismos.
Cuando la medición se realiza en un sistema amperométrico usando un electrodo de carbono, se usa un electrodo de oro o un electrodo de platino provisto de una enzima inmovilizada como electrodo de trabajo, junto con un contraelectrodo (tal como un electrodo de platino) y un electrodo de referencia (tal como un electrodo de Ag/AgCl). Los electrodos se insertan en un tampón que contiene un mediador y se mantienen a una temperatura predeterminada. Se aplica una tensión predeterminada al electrodo de trabajo, a continuación, se añade una muestra y se mide el valor aumentado de la corriente eléctrica. Los ejemplos del mediador utilizado en el ensayo incluyen ferricianuro de potasio, ferroceno, derivado de osmio, derivado de rutenio, metosulfato de fenazina, etc. En general, también es posible usar los llamados sistemas de dos electrodos, con un electrodo de trabajo y un contraelectrodo o electrodo de seudorreferencia.
Además, el fructosil aminoácido se puede someter a ensayo usando un mediador de electrones inmovilizado en un sistema amperométrico que usa un electrodo de carbono, un electrodo de oro o un electrodo de platino. La enzima se inmoviliza sobre el electrodo junto con un mediador de electrones tal como ferricianuro de potasio, ferroceno, derivado de osmio, metosulfato de fenazina en una matriz macromolecular por medio de adsorción o enlace covalente para preparar un electrodo de trabajo. Se inserta en el tampón junto con un contraelectrodo (tal como un electrodo de platino) y un electrodo de referencia (tal como un electrodo de Ag/AgCl), y se mantiene a una temperatura predeterminada. Se aplica una tensión predeterminada al electrodo de trabajo, a continuación, se añade la muestra y se mide el valor aumentado de la corriente eléctrica.
Para preparar un sensor para la medición de glucoalbúmina, HbA1c o fructosil hexapéptido, el sensor mencionado anteriormente para la medición de fructosil aminoácido se combina además con una membrana que contiene proteinasa inmovilizada (tal como proteasa) para construir un sensor complejo. La estructura de dicho sensor complejo basado en una reacción continua por una combinación de múltiples enzimas es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, "Biosensor - Fundamental and Applications" de Anthony P. F. Tuner, Isao Karube y George S. Wilson, Oxford University Press, 1987.
Ejemplos
La presente invención se ilustrará en detalle mediante los ejemplos a continuación, aunque la presente invención no estará limitada a esos ejemplos.
Ejemplo 1
Preparación y caracterización de mutantes de FAOD N1-1.
El estudio de la relación estructura-función de la sarcosina oxidasa monomérica (MSOX) reveló que el sistema de transmisión de protones (PRS) implicado en la transferencia de electrones de FAD al oxígeno está compuesto por Thr48 y Lys 265 con cuatro moléculas de H2O (Trickey et al., Structure, 7, 331-345, 1999). Los sitios activos de fructosil aminoácido oxidasa de la cepa N1-1 de Pichia sp. (N1-1 FAOD, SEQ ID NO: 2) tienen una alta homología con MSOX, especialmente en residuos conservados que se predice que son responsables del sistema de transmisión de protones.
Se construyó un modelo estructural previsto de N1-1 FAOD usando la estructura de MSOX, y se predijo que los residuos de aminoácido Asn44, Ser46, Asn47, Lys48 y Lys269 estarían implicados en la transferencia de protones y electrones desde FAD. Se introdujeron mutaciones individuales o dobles en esos residuos de aminoácido con el objetivo de modificar la disponibilidad del aceptador de electrones de N1-1 FAOD.
Se crearon vectores de expresión de mutantes individuales de N1-1 FAOD por mutagénesis dirigida al sitio usando el procedimiento QuickChange(R) (Stratagene) con el gen de N1-1 FAOD natural como molde. Se diseñaron cebadores para introducir la mutación en Asn44, Ser46, Asn47, Lys48 o Lys269. Los productos amplificados se digirieron por Dpn I y se transformaron en DH5a de E. coli e incubaron en medio de agar LB (50 pg/ml de kanamicina) a 37 °C, durante la noche. Las secuencias mutadas de los clones se verificaron con el kit de secuenciación cíclica ABI Prism BigDye Terminator v3.0 en un analizador genético ABI Prism 3130. A continuación, se digirieron los plásmidos extraídos con Nco I y Sal I y se ligaron en el vector pET28 (a) que se digirió con células Nco I y Sal I. Células BL21(DE3) de E. coli transformadas con mezclas de ligado se incubaron en medio de agar LB (50 pg/ml de kanamicina) a 37 °C, durante la noche. Se crearon mutantes dobles por combinación de los cebadores usando el mismo procedimiento.
Se cultivaron células BL21 (DE3) de Escherichia coli que albergaban vectores de expresión de mutantes de FAOD N1-1 en 150 ml de medio LB que contenía 50 pg/ml de kanamicina a 37 °C. Después de alcanzar un valor de A660 de 0,6, se le añadió IPTG 0,3 mM y se incubó a 25 °C durante 5 horas adicionales. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con NaCl ac. al 0,85 %. A continuación, las células se resuspendieron en tampón de fosfato de potasio (PPB) 10 mM, pH 7.0 y se lisaron mediante un homogeneizador ultrasónico. El lisado se centrifugó a 10000 * g, 4 °C durante 10 min, y el sobrenadante se centrifugó a 50000 rpm, 4 °C durante 60 min; a continuación, el sobrenadante se dializó frente a PPB 10 mM (pH 7,0). La actividad oxidasa se sometió a ensayo a 25 °C en PPB 10 mM, pH 7,0, TODB 1,5 mM, 2 U/ml de peroxidasa de rábano picante (POD) y 4-aminoantipirina (4AA) 1,5 mM en presencia de sustratos (f-aVal 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 5 mM o f-aVal-His 5 mM). La formación de tinte de quinoneimina se midió espectrofotométricamente a 546 nm. La actividad deshidrogenasa se sometió a ensayo a 25 °C en PPB 10 mM (pH 7,0), DCIP 0,6 mM, metoxi PMS (mPMS) 6 mM en presencia de sustratos (f-aVal 0,2, 0,5, 1, 2, 5 mM o f-aVal-His 5 mM).
En la mayoría de los casos, la actividad oxidasa se perdió completa o sustancialmente, pero varios mutantes, como tales N47a , S46A, K48A y N44A, mostraron una actividad relativamente alta. Entre ellos, N47A mostró el rasgo característico más notable. Aunque la actividad oxidasa de N47A disminuyó hasta aproximadamente un 20 % de la actividad natural, la actividad deshidrogenasa de N47A se mantuvo más de un 60 % de la actividad natural. En consecuencia, N47A mostró una actividad deshidrogenasa aproximadamente 4 veces más alta que la actividad oxidasa. Este rasgo característico de N47A debería ser beneficioso en una tira de sensor que emplee fructosil aminoácido oxidasa con un aceptador de electrones artificial. Los parámetros cinéticos de las preparaciones en bruto de N1-1 FAOD natural y el mutante N47A se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 Parámetros cinéticos de la preparación en bruto de N1-1 FAOD mutante y natural
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Ejemplo 2
Purificación de N1-1 FAOD natural y N47A muíante
La FAOD recombinante se purificó como sigue. En primer lugar, se preparó una fracción soluble en agua que contenía la enzima a partir de Escherichia coli recombinante. Se cultivó E. coli que contenía el vector de expresión en 7 l de medio LB (37 °C, en un fermentador de 10 l, 50 |jg/ml de ampicilina); a continuación, se indujo la expresión con IPTG (concentración final: 0,3 mM) a aproximadamente DO660 = 0,7 y la temperatura de cultivo se redujo hasta 30 °C. Las células se suspendieron en PPB 100 mM (pH 7,0) y se rompieron cuatro veces usando una prensa francesa. El líquido sobrenadante se sometió a ultracentrifugación (40 000 g, 90 minutos) y el sobrenadante se dializó frente a PPB 10 mM (pH 7,0) a 4 °C durante la noche para preparar una fracción soluble en agua.
La fracción soluble en agua se sometió además a cromatografía de líquidos para preparar una enzima purificada. La enzima se purificó además con una cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-5PW). La fracción soluble en agua se adsorbió a una columna de cromatografía de intercambio aniónico DEAE-5PW (5,0 mm D.I. x 5 cm, Tosoh) equilibrada con PPB 10 mM (pH 7,0). Después del equilibrado con PPB 10 mM (pH 7,0) en una cantidad de 3 veces el volumen de la columna, se eluyó la FAOd con PPB 10 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 0,7 M. El caudal se ajustó a 1 ml/min y se recogió el eluido cada minuto. Se usó una longitud de onda de absorción de 280 nm para controlar el eluido.
La fracción activa se separó usando sulfato de amonio al 35 % y el líquido sobrenadante se sometió a cromatografía hidrófoba. La fracción activa se adsorbió a una columna de cromatografía hidrófoba Resource Phe (1 ml, Pharmacia) equilibrada con PPB 10 mM (pH 6,5) que contenía sulfato de amonio al 35 %. Después del equilibrado con PPB 10 mM (pH 6,5) que contenía sulfato de amonio al 35 % en una cantidad de 3 veces el volumen de la columna, se eluyó la FAOD con PPB 10 mM (pH 6,5). El caudal se ajustó a 2 ml/min y se recogió el eluido cada minuto. La fracción activa se separó con sulfato de amonio al 45 %; a continuación, el precipitado se disolvió en PPB 10 mM (pH 7,0) que contenía manosa al 1 % y FAD 100 jM , y se dializó frente al mismo tampón a 4 °C durante 6 horas. Se dializó además frente a PPB 10 mM (pH 8,0) que contenía FAD 100 pM a 4 °C durante 6 horas. La muestra dializada se usó para la siguiente cromatografía de intercambio aniónico.
La muestra se adsorbió a una columna de cromatografía de intercambio aniónico Bioasit (4,6 mm D.I. x 5 cm, Tosoh) equilibrada con PPB 10 mM (pH 8,0). Después del equilibrado con PPB 10 mM (pH 8,0) en una cantidad de 3 veces el volumen de la columna, se eluyó la FAOd con PPB 10 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 0,3 M. El caudal se ajustó a 1 ml/min y se recogió el eluido cada minuto. La fracción activa se dializó frente a PPB 10 mM (pH 7,0) a 4 °C durante la noche. El grado de purificación de la muestra se examinó por SDS/PAGE. La muestra se sometió a electroforesis usando Phast Gel 8-25, y el gel se tiñó con plata. La preparación de muestras, la electroforesis y la tinción se realizaron de acuerdo con el manual adjunto a Phast System™.
La actividad oxidasa y deshidrogenasa de las enzimas purificadas se midieron como en el ejemplo 1 y como se muestra en la fig. 3. Los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3 Parámetros cinéticos de N1-1 FAOD natural y N47A mutante purificadas
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Ejemplo 3
Preparación de mutantes de PnFPOX
Se prepararon y caracterizaron mutantes derivados de fructosil aminoácido oxidasa de Phaeosphaeria nolorum (PnFPOX, SEQ ID NO: 1).
En base a la alineación de N1-1 FAOD y PnFPOX (fig. 1) y los resultados de los ejemplos 1 y 2, se predijo que Asn56 estaba implicada en la transferencia de protones y electrones desde FAD. Se introdujeron diversas mutaciones en Asn56 con el objetivo de modificar la disponibilidad del aceptador de electrones de la PnFAOD.
Las mutaciones se introdujeron usando mutagénesis dirigida al sitio como en el ejemplo 1, y se transformaron células BL21 (DE3) con un vector de expresión que contenía PnFPOX natural o mutante. Las células cultivadas se resuspendieron en PPB 10 mM, pH 7,0, y se lisaron por sonicación. El lisado se centrifugó a 10000 g a 4 °C durante 20 min y el sobrenadante se centrifugó a 50000 rpm a 4 °C durante 60 min. Las actividades oxidasa y deshidrogenasa se midieron como en el ejemplo 1.
Las actividades de PnFPOX natural en bruto y variantes de Asn56 se resumen en la fig. 4. La mayoría de los mutantes Asn56 mostraron disminuciones drásticas en sus actividades oxidasa (<20 % de la natural), a excepción de Asn56Ser, que mostró una actividad oxidasa relativamente alta (41 % de la natural). Entre ellas, algunas variantes (Asn56Cys, Phe, Met, Val) mostraron actividades deshidrogenasa relativamente altas (> 60 % de la natural), incluso más altas que las de la natural en Asn56Cys y Asn56Met. Los parámetros cinéticos de los mutantes Asn56 se resumen en la fig. 5. Asn56Met y Asn56Val mostraron una Vmáx deshidrogenasa (B)/Vmáx oxidasa (A) más alta que Asn56Ala. Asn56Asp, Glu y Pro perdieron actividades oxidasa y deshidrogenasa.
Ejemplo 4
Purificación del mutante PnFPOX N56A
Se cultivó aeróbicamente BL21 (DE3) transformada con pEPN(pET28a-PnFPOX)-N56A a 37 °C en medio LB (2 l) que contenía 50 pg de kanamicina ml-1. Después de alcanzar un valor de A660 nm de 0,6, las células se indujeron con IPTG 0,3 mM, y la incubación se continuó a 25 °C durante 5,5 horas. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en PPB 10 mM, pH 7,0, y se lisaron por 3 pases a través de una prensa francesa (1000 kg cm-2). El lisado se centrifugó a 10000 g a 4 °C durante 20 min y el sobrenadante se centrifugó a 50000 rpm a 4 °C durante 60 min. El sobrenadante se dializó a continuación frente a PPB 10 mM, pH 8,0, que contenía FAD 25 pM, y la solución enzimática en bruto se purificó adicionalmente.
Se le añadió sulfato de amonio al sobrenadante dializado a una saturación de un 35 % y, a continuación, se precipitó el precipitado formado por centrifugación a 15000 g durante 20 min. El sobrenadante al que se le añadió sulfato de amonio a una saturación de un 65 % se centrifugó a 15000 g durante 20 min. El precipitado resultante se disolvió en PPB 10 mM, pH 8,0, que contenía FAD 25 pM y manosa al 1 %, y se dializó a 4 °C frente al mismo tampón, y posteriormente se dializó frente a PPB 10 mM, pH 8,0, que contenía FAD 25 pM. La solución enzimática dializada se aplicó a una columna RESOURCE Q (GE Healthcare) equilibrada con p Pb 10 mM, pH 8,0. Las fracciones no adsorbidas activas se recogieron y las proteínas adsorbidas que no mostraron actividades de FAOD se eluyeron con NaCl 1 M. Las fracciones no adsorbidas activas se recogieron y se dializaron frente a PPB 10 mM, pH 7,0. La solución enzimática dializada se aplicó a una columna HiLoad 16/60 Superdex 75 pg (GE Healthcare) equilibrada con PPB 10 mM, pH 7,0. Se llevó a cabo cromatografía de filtración en gel con el mismo tampón. Se recogieron las fracciones activas y la solución enzimática purificada se dializó frente a PPB 10 mM, pH 7,0 que contenía FAD 100 pM y se conservó a 4 °C. La pureza de la enzima purificada se confirmó por SDS-PAGE, y la concentración se midió usando un kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, CA, EE. UU.). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4 Purificación de PnFPOX N56A recombinante
Figure imgf000011_0002
Se midieron las actividades oxidasa y deshidrogenasa de la FAOD mutante N56A. La curva SV y los parámetros cinéticos de la FAOD mutante se muestran en la fig. 6 y en la Tabla 5, respectivamente. En la fig. 6, el gráfico de la izquierda muestra la actividad en la concentración de sustrato de 0-5 mM, y el gráfico de la derecha es una vista aumentada de la concentración de sustrato de 0-2 mM. El mutante N56A mostró un aumento significativo de actividad deshidrogenasa hacia ambos sustratos.
Tabla 5 Parámetros cinéticos del mutante PnFPOX N56A purificado
Figure imgf000011_0001
Ejemplo 5
Preparación y caracterización de imitantes de FAOD de Amadoriasa II
Se prepararon y caracterizaron imitantes derivados de Amadoriasa II (SEQ ID NO: 3). En base a la alineación de N1-1 FAOD y Amadoriasa II (fig. 1) y los resultados de los ejemplos 1-4, se predijo que Asn52 estaba implicada en la transferencia de protones y electrones desde FAD. Se preparó un mutante que tenía la mutación Asn52Ala de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1.
Se transformaron células BL21 (DE3) con un vector de expresión que contenía Amadoriasa II natural o mutante N52A. Las células cultivadas se recogieron y se resuspendieron en 10 ml de PPM 10 mM, pH 7,0, y se lisaron por 2 pases a través de una prensa francesa (1000 kg cm-2). El lisado se centrifugó a 10000 g a 4 °C durante 20 min y el sobrenadante se centrifugó a 50000 rpm a 4 °C durante 60 min. El sobrenadante se dializó a continuación frente a PPB 10 mM, pH 8,0, que contenía FAD 25 pM para preparar una solución enzimática en bruto. La preparación en bruto se purificó por precipitación en sulfato de amonio, cromatografía de intercambio aniónico (columna RESOURCE Q (GE Healthcare)), y de filtración en gel (columna HiLoad 16/60 Superdex 75 pg (GE Healthcare)).
La actividad de FAOD se sometió a ensayo utilizando 4AA/TODB/POD (actividad oxidasa) y PMS/DCIP (actividad deshidrogenasa) con f-aVal como sustrato. Los resultados se muestran en la fig. 7.
Los parámetros cinéticos del Amadoriasa II natural y Asn52Ala purificadas se resumen en la fig. 8. El mutante N52A mostró una actividad deshidrogenasa aproximadamente 2 veces más alta que la actividad oxidasa.
Ejemplo 6
Construcción de biosensor
Se mezclaron 40 mU/5 pl de una solución de PnFPOX natural o N56A PnFPOX con un 2 % de solución de AWP. Se aplicaron 5 ul de la mezcla sobre un electrodo de oro reutilizable (área de superficie: 7 mm2) y se secó durante 30 min a 30 °C. El electrodo se irradió con luz UV durante 1 minuto para preparar un electrodo que tenía FPOX natural o N56A inmovilizada. El electrodo se sumergió en una solución de 2 ml de PBS (pH 7,4) con nitrosoanilina 2 mM (NA; conocida de la p. 33 y siguientes del documento WO 2004/113900). A continuación, se aplicaron 200 mV frente a Ag/AgCl y se controló la corriente. Cuando se observó la corriente en estado estacionario, se le añadió solución de muestra que contenía una concentración diferente de FV a la mezcla de reacción, y se controló el aumento de corriente. Para medir la actividad enzimática en ausencia de oxígeno, se purgó gas Ar continuamente en la cámara de reacción.
La fig. 9 muestra las correlaciones entre la concentración de FV y el aumento de corriente del electrodo que tiene PnFPOX N56A o enzima natural, en presencia o ausencia de oxígeno (en gas Ar). Se observó el efecto del oxígeno sobre la reacción electroquímica, pero el impacto de la presencia de oxígeno fue menor que en la natural usada. Estos resultados sugieren que la actividad de la fructosil aminoácido oxidasa de la invención está menos afectada por el nivel de oxígeno disuelto.
Ejemplo 7
Preparación y caracterización de mutante de FPOX-C
Un mutante derivado de FPOX-C (SEQ ID NO: 7) que tenía la mutación Asn52Ala se preparó de la misma manera que en el ejemplo 5. La preparación enzimática en bruto se usó para el ensayo de actividad enzimática sin otra purificación. La actividad de FAOD se sometió a ensayo usando 4AA/TODB/POD (Ox: actividad oxidasa) y PMS/DCIP (DH: actividad deshidrogenasa) con f-aVal 1 mM o f-aVal-His 1 mM como sustrato. Los resultados se muestran en la Tabla 6 a continuación.
Tabla 6
Figure imgf000012_0001
El mutante FPOX-C N52A mostró una actividad deshidrogenasa mucho más alta que la actividad oxidasa tanto hacia f-aVal como hacia f-aVal-His.
Ejemplo 8
Preparación y caracterización de imitantes de bucle
PnFPOX muestra actividad oxidasa hacia fructosil hexapéptido a un nivel de menos de un 1 % de la actividad en comparación con FVH, mientras que FPOX-C no muestra actividad. Por otra parte, FPOX-C muestra una actividad más alta hacia FVH que P.n FPOx . De la comparación de la secuencia de aminoácidos de ambas oxidasas, se encuentra una diferencia significativa entre FAOD y FPOX en sus regiones de bucle.
Región del bucle 1
PnFPOX (61) Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala (72) (SEQ ID NO: 13) FPOX-C (61) lie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser (72) (SEQ ID NO: 14) Región del bucle 2
PnFPOX (109) Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu A sp Ala T h r Asn Glu (124) (SEQ ID NO: 15)
FPOX-C (109) Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr Hrs Ala (126) (SEQ ID NO: 16)
En la región del bucle 1 (12aa), 5 residuos de aminoácido son diferentes entre Pn FPOX y FPOX-C. En la región del bucle 2 (16aa), se observan 2 inserciones de aminoácidos y 7 sustituciones de aminoácidos.
Se prepararon mutantes de bucle quiméricos, donde se intercambian regiones del bucle 1 de PnFPOX y FPOX-C entre sí, así como mutantes N56A de los mismos. En base a las secuencias de aminoácidos parciales mostradas anteriormente, se prepararon 8 tipos de mutantes:
Pn FPOX/L1ExC (es decir, Pn FPOX donde la región del bucle 1 está sustituida con la región del bucle 1 de FPOX-C)
Pn FPOX/L1ExC/N56A (es decir, mutante N56A de Pn FPOX donde la región del bucle 1 está sustituida con la región del bucle 1 de FPOX-C)
Pn FPOX/L2ExC (es decir, Pn FPOX donde la región del bucle 2 está sustituida con la región del bucle 2 de FPOX-C)
Pn FPOX/L2ExC/N56A (es decir, mutante N56A de Pn FPOX donde la región del bucle 2 está sustituida con la región del bucle 2 de FPOX-C)
FPOX-C/L1ExPn (es decir, FPOX-C donde la región del bucle 1 está sustituida con la región del bucle 1 de Pn FPOX) FPOX-C/L1ExPn/N56A (es decir, mutante N56A de FPOX-C donde la región del bucle 1 está sustituida con la región del bucle 1 de Pn FPOX)
FPOX-C/L2ExPn (es decir, FPOX-C donde la región del bucle 2 está sustituida con la región del bucle 2 de Pn FPOX) FPOX-C/L2ExPn/N56A (es decir, mutante N56A de FPOX-C donde la región del bucle 2 está sustituida con la región del bucle 2 de Pn FPOX)
La introducción de mutaciones y la preparación de enzimas en bruto se llevaron a cabo como se describe en los ejemplos 1 y 5. La actividad de FAOD se sometió a ensayo usando 4AA/TODB/POD (Ox: actividad oxidasa) y PMs /d CIP (DH: actividad deshidrogenasa) con f-aVal 1 mM, f-aVal-His 1 mM o fructosil hexapéptido (F-HP) 5 mM como sustrato.
Tanto Pn FPOX/L1ExC como Pn FPOX/L2ExC mostraron una actividad de oxidación más alta hacia f-aVal-His en comparación con P.n. FPOX natural. FPOX-C/L1ExPn mostró actividad hacia F-HP que no se observó en FPOX-C natural. De forma interesante, Pn FPOX/L2ExC mostró una actividad aumentada hacia F-HP, mientras que Pn FPOX/L1ExC casi perdió la actividad hacia F-HP. Estos resultados indicaron que la mejora de la actividad de Pn. FPOX hacia F-HP se podría mejorar más mediante la modificación de la región del bucle.
La introducción de la mutación N56A en estos mutantes de bucle dio como resultado una actividad oxidasa disminuida y una actividad deshidrogenasa aumentada. Tanto Pn FPOX/L1ExC/N56A como Pn FPOX/L2ExC/N56A mostraron una actividad deshidrogenasa más alta en comparación con su actividad oxidasa hacia f-aVal. La actividad deshidrogenasa hacia f-aVal de Pn FPOX/L2ExC/N56A mostró un aumento marcado en comparación con Pn FPOX/N56A, y fue más alta que las de FPOX-C/N56A.
Tanto Pn FPOX/L1ExC/N56A como Pn FPOX/L2ExC/N56A mostraron la actividad deshidrogenasa más alta hacia faVal-His en comparación con su actividad oxidasa. La actividad deshidrogenasa más alta se observó en Pn FPOX/L2ExC/N56a , que es casi similar a las de FPOX-C/N56A.
En la Tabla 7 a continuación se muestran resultados representativos.
Tabla 7
Figure imgf000014_0001
Aplicabilidad industrial
La fructosil aminoácido oxidasa mutada de la invención se puede usar para la medición de proteínas glucadas, tales como hemoglobina (HbA1c) que es clínicamente útil en el diagnóstico y control de afecciones diabéticas.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Una fructosil aminoácido oxidasa muíante modificada en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 sustituyendo el residuo de aminoácido Asn con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val, en la que una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 significa la posición del residuo de aminoácido en la secuencia de fructosil aminoácido oxidasa que está alineada con el aminoácido en la posición 56 en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, y en la que la fructosil aminoácido oxidasa mutante tiene una proporción de actividad deshidrogenasa/oxidasa de aproximadamente 2,0 o más.
2. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene una actividad oxidasa reducida en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural, y tiene una actividad deshidrogenasa aumentada en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural.
3. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene una actividad oxidasa de un 30 % o menos que la de la fructosil aminoácido oxidasa natural, y tiene una actividad deshidrogenasa de un 50 % o más que la de la fructosil aminoácido oxidasa natural.
4. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene una actividad deshidrogenasa aumentada en comparación con la fructosil aminoácido oxidasa natural.
5. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-12, en la que el residuo de aminoácido Asn en una posición correspondiente a la posición 56 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
6. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 56 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
7. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 6, en la que la secuencia de aminoácidos: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu en las posiciones 109­ 124 de SEQ ID NO: 1 está reemplazada con la secuencia: LysGlnTyrGlnAla Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala.
8. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 47 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
9. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 52 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
10. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7, en la que el residuo de aminoácido Asn en la posición 56 está sustituido con un residuo de aminoácido seleccionado de Ala, Cys, Phe, Met, y Val.
11. La fructosil aminoácido oxidasa mutante de la reivindicación 10, en la que la secuencia de aminoacidos lie Arg Leu Arg Asn Lys Val AspLeu Gln Met Ser en las posiciones 61-72 de SEQ ID NO: 7 está reemplazada con la secuencia V a l S e r Leu A rg Asn P ro V a l A sp Leu Gln Leu Ala.
12. Un polinucleótido aislado que codifica la fructosil aminoácido oxidasa mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 12.
14. Una célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 13.
15. Un procedimiento para someter a ensayo una proteína glucada en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con la fructosil aminoácido oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y medir la cantidad de la proteína glucosilada oxidada por la fructosil aminoácido oxidasa.
16. Un procedimiento para someter a ensayo la HbA1c que comprende digerir la HbA1c en una muestra para generar fructosil valina o fructosil valil histidina, poner en contacto la fructosil valina o la fructosil valil histidina con la fructosil aminoácido oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y medir la cantidad de fructosil valina o fructosil valil histidina oxidada.
17. Un dispositivo para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido en una muestra que comprende la fructosil aminoácido oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un mediador de transferencia de electrones.
18. Un kit para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido en una muestra, que comprende la fructosil aminoácido oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un mediador de transferencia de electrones.
19. Un electrodo enzimático que tiene la fructosil aminoácido oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que está inmovilizada sobre el electrodo.
20. Un sensor enzimático para someter a ensayo fructosil valina, fructosil valil histidina, HbA1c o fructosil hexapéptido, que comprende el electrodo enzimático de la reivindicación 19 como electrodo de trabajo.
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