ES2725598T3 - Formulación liofilizada de Tat-NR2B9C - Google Patents

Abstract

Una formulación preliofilizada que consiste en TAT-NR2B9c (SEQ ID NO: 6), histidina y trehalosa a un pH de 6-7, en donde el TAT-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la histidina está en una concentración de 15- 100 mM, y la trehalosa está en una concentración de 80-160 mM, que después de la liofilización da como resultado una formulación liofilizada, que es estable a 20 °C durante al menos seis meses.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación liofilizada de Tat-NR2B9C

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

La presente solicitud es una no provisional de 61/730.952; presentada el 28 de noviembre de 2012.

Referencia al listado de secuencias

Se hace referencia a un listado de secuencias designado 427409SEQLIST.txt de 16 kbytes creado el 20 de noviembre de 2013.

Antecedentes

Tat-NR2B9c (NA-1) es un agente que inhibe la PSD-95, disrumpiendo así la unión a los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR) y las sintasas de óxido nítrico neuronal (nNOS) y reduciendo la excitoxicidad inducida por isquemia cerebral. El tratamiento reduce el tamaño del infarto y los déficits funcionales. TAT-NR2B9c (NA-1) ha se ha experimentado en un exitoso ensayo de fase II (véase WO 2010144721 y Aarts et al., Science 298, 846-850 (2002), Hill et al., The Lancet Neurology, 11: 942 - 950 (2012)).

Debido a que TAT-NR2B9c carece de efectos secundarios graves, puede administrarse cuando se sospecha un accidente cerebrovascular u otras afecciones isquémicas o afecciones hemorrágicas sin que se haya hecho un diagnóstico según criterios reconocidos en la técnica para confirmar que no hay hemorragia presente. Por ejemplo, TAT-NR2B9c puede administrarse en el lugar donde ha ocurrido el accidente cerebrovascular o el neurotrauma (p. ej., en el domicilio los pacientes) o en una ambulancia que transporta a un sujeto a un hospital.

Resumen de la invención reivindicada

La invención proporciona una formulación preliofilizada que comprende TAT-NR2B9c (SEQ ID NO: 6), histidina y trehalosa a un pH de 6-7. Opcionalmente, el TAT-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la histidina está en una concentración de 15-100 mM, y la trehalosa está en una concentración de 80-160 mM. Opcionalmente, el TAT-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la histidina está en una concentración de 20-100 mM, y la trehalosa está en una concentración de 100-140 mM.

Opcionalmente, el Tat-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la concentración de histidina 20-50 mM, y la concentración de trehalosa es de 100-140 mM, y el pH es de 6-7. Opcionalmente, la concentración de histidina es 20 mM y la concentración de trehalosa es 100-200 mM, preferiblemente 120 mM y la concentración de TAT-NR2B9c es 90 mg/ml.

La invención proporciona además una formulación liofilizada preparada liofilizando cualquiera de las formulaciones preliofilizadas descritas anteriormente.

La descripción proporciona además una formulación reconstituida preparada combinando una formulación liofilizada como se ha descrito anteriormente con una disolución acuosa. Opcionalmente, la disolución acuosa es agua o disolución salina normal. Opcionalmente, el volumen de la formulación reconstituida es de 3 a 6 veces el volumen de la formulación preliofilizada.

La descripción proporciona además una formulación reconstituida que comprende TAT-NR2B9c a una concentración de 15-25 mg/ml, histidina a una concentración de 4-20 mM y trehalosa a una concentración de 20-30 mM a pH 6-7.

La invención proporciona además un método para preparar una formulación, que comprende almacenar una muestra de una formulación liofilizada como se describe en la presente memoria durante al menos una semana a temperatura ambiente; y reconstituir la formulación liofilizada. El método puede incluir además administrar la formulación reconstituida, opcionalmente después de una dilución adicional en disolución salina normal, a un paciente. Opcionalmente, el paciente tiene un accidente cerebrovascular o lesión traumática en el SNC. Opcionalmente, la muestra liofilizada se almacena en una ambulancia. Opcionalmente, el paciente tiene una hemorragia subaracnoidea. Opcionalmente, el paciente está siendo sometido a reparación endovascular por un aneurisma.

Breves descripciones de las figuras

Figura 1: gráfico muestra el área de infarto del cerebro de rata de accidente cerebrovascular 3PVO después del tratamiento con diferentes formulaciones de NA-1.

Figuras 2A, B: A) gráfico de barras que demuestra la estabilidad de diferentes formulaciones de NA-1 a -20 °C y 40 °C. El eje Y representa la pureza del NA-1 después de 1 semana a la temperatura de almacenamiento, medida por % de área total usando RP-HPLC. B) los mismos datos de A, pero ordenados por tampón y pH.

Figura 3: gráfico de barras que demuestra la estabilidad (por HPLC) de 20 mg/ml de NA-1 en tampón de histidina, pH 6.5, en presencia de diferentes agentes de carga y sal a -20 °C y 40 °C.

Figuras 4A, B: gráficos de calorimetría de barrido diferencial de 20 mg/ml de NA-1 en tampón de histidina pH 6,5 en presencia de manitol (A) o manitol y NaCl (B).

Figuras 5A, B: gráficos de calorimetría de barrido diferencial de 20 mg/ml de NA-1 en tampón de histidina pH 6,5 en presencia de trehalosa (A) o trehalosa y NaCl (B).

Figuras 6A, B: gráfico de calorimetría de barrido diferencial de 20 mg/ml de NA-1 en tampón de histidina pH 6,5 en presencia de Dextrano-40 (A) o Dextrano-40 y NaCl (B).

Figuras 7A, B: A) apariencia de la torta después de la liofilización de 3 ml de 90 mg/ml de NA-1 en histidina 100 mM, pH 6,5 con trehalosa 120 mM. B). apariencia de la torta de las formulaciones NA-1 alternativas con diferentes cantidades de histidina y trehalosa.

Definiciones

Además de los ingredientes activos, las formulaciones liofilizadas pueden incluir una o más de las siguientes clases de componentes. Las clases no son mutuamente excluyentes; en otras palabras, el mismo agente puede formar parte de múltiples clases.

Un "agente de carga" proporciona estructura a un péptido liofilizado. Los agentes de carga incluyen manitol, trehalosa, dextrano-40, glicina, lactosa, sorbitol y sacarosa, entre otros. Además de proporcionar una torta farmacéuticamente elegante, los agentes de carga también pueden impartir cualidades útiles con respecto a la modificación de la temperatura de colapso, proporcionando protección contra la congelación, temperatura de transición vítrea y mejorando la estabilidad de la proteína durante el almacenamiento a largo plazo. Estos agentes también pueden servir como modificadores de la tonicidad.

Un tampón es un agente que mantiene el pH de la disolución en un rango aceptable antes de la liofilización. Un tampón preferido es la histidina. Otros tampones incluyen succinato (sodio o potasio), histidina, citrato (sodio), gluconato, acetato, fosfato, Tris. Los tampones preferidos son efectivos en un rango de pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7 o de aproximadamente 6 a aproximadamente 7,7; preferiblemente un pH de aproximadamente 6.5. Los ejemplos de tampones que controlan el pH en este rango incluyen succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácido orgánico.

Un "crioprotector" proporciona estabilidad a un péptido frente a las tensiones inducidas por la congelación, presumiblemente al ser excluido preferentemente de la superficie de la proteína. También puede ofrecer protección durante el secado primario y secundario, y el almacenamiento de productos a largo plazo. Los ejemplos son polímeros tales como dextrano y polietilenglicol; azúcares tales como sacarosa, glucosa, trehalosa y lactosa; y tensioactivos tales como polisorbatos; y aminoácidos tales como glicina, arginina y serina.

Un lioprotector proporciona estabilidad al péptido durante el proceso de secado o "deshidratación" (ciclos de secado primario y secundario), presumiblemente al proporcionar una matriz vítrea amorfa y al unirse a la proteína mediante enlaces de hidrógeno, reemplazando a las moléculas de agua que se eliminan durante el proceso de secado. Esto ayuda a mantener la conformación del péptido, minimiza la degradación del péptido durante el ciclo de liofilización y mejora la estabilidad del producto a largo plazo. Los ejemplos incluyen polioles o azúcares tales como sacarosa y trehalosa.

En la medida en la que no se ha mencionado, otros estabilizadores o inhibidores de degradaciones pueden incluir inhibidores de la desamidación, tensioactivos, algunos comunes son ésteres de ácidos grasos de polietoxilatos de sorbitán (p. ej., polisorbato 20 o polisorbato 80), poloxámero 188 y detergentes.

Los términos "liofilización", "liofilizado" y "secado por congelación" se refieren a un proceso mediante el cual el material que se va a secar se congela en primer lugar y entonces el hielo o el disolvente congelado se eliminan por sublimación en un ambiente de vacío.

Una "formulación farmacéutica" o composición es una preparación que permite que un agente activo sea efectivo y carece de componentes adicionales que sean tóxicos para los sujetos a los que se administraría la formulación.

El "tiempo de reconstitución" es el tiempo requerido para rehidratar una formulación liofilizada con una disolución a disolución que carece de partículas a simple vista.

Una formulación peptídica liofilizada "estable" es aquella sin cambios significativos observados a 20 °C durante al menos una semana, mes, o más preferiblemente al menos tres meses, al menos seis meses o un año. Los cambios se consideran insignificantes si no más del 10%, preferiblemente el 5%, del péptido se degrada según lo medido por SEC-HPLC. La disolución rehidratada es incolora o clara a ligeramente opalescente, mediante análisis visual. La concentración, el pH y la osmolalidad de la formulación no tienen cambio mayor del /- 10% después del almacenamiento. La potencia está dentro del 70-130%, preferiblemente 80-120% o a veces 80-100% de una muestra control recién preparada. No se observa más del 10%, preferiblemente del 5% de recorte. No se forma más del 10%, preferiblemente del 5% de agregación. La estabilidad puede medirse mediante varios métodos revisados en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).

El término "isotónico" significa que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 270­ 328 mOsm. La presión ligeramente hipotónica es de 250-269 y la presión ligeramente hipertónica es de 328-350 mOsm. La presión osmótica se puede medir, por ejemplo, usando un osmómetro de tipo de presión de vapor o de punto de congelación.

Modificadores de la tonicidad: se pueden usar sales (NaCl, KCl, MgCh, CaCh) como modificadores de la tonicidad para controlar la presión osmótica. Además, los crioprotectores/lioprotectores y/o agentes de carga tales como sacarosa, manitol o glicina pueden servir como modificadores de la tonicidad.

Los valores numéricos, tales como las concentraciones o los pH, se proporcionan dentro de una tolerancia que refleja la exactitud con la que se puede medir el valor. A menos que el contexto requiera otra cosa, los valores fraccionarios se redondean al número entero más cercano. A menos que el contexto requiera otra cosa, la recitación de un rango de valores significa que se puede usar cualquier número entero o subrango dentro del rango.

Descripción detallada

I. General

La presente invención proporciona formulaciones liofilizadas de agentes activos, particularmente de TAT-NR2B9c. Dichas formulaciones son estables a temperatura ambiente, lo que facilita el mantenimiento de suministros de dicha formulación en ambulancias o con personal de emergencia para la administración en la escena de la enfermedad o el accidente o entre dicha escena y una instalación médica.

Las formulaciones liofilizadas se preparan a partir de una formulación preliofilizada que comprende un agente activo, un tampón, un agente de carga y agua. Otros componentes, tales como crio o lioconservantes, un agente de tonicidad, vehículos farmacéuticamente aceptables pueden estar o no presentes. Un agente activo preferido es TAT-NR2B9c. Un tampón preferido es la histidina. Un agente de carga preferido es la trehalosa. La trehalosa también sirve como crio y lioconservante. Una formulación preliofilizada ejemplar comprende el agente activo (p. ej., TAT-NR2B9c), histidina (10-100 mM, 15-100 mM 15-80 mM, 40-60 mM o 15-60 mM, por ejemplo, 20 mM u opcionalmente 50 mM, o 20-50 mM)) y trehalosa (50-200 mM, preferiblemente 80-160 mM, 100-140 mM, más preferiblemente 120 mM). El pH es de 5,5 a 7,5, más preferiblemente, 6-7, más preferiblemente de 6,5. La concentración de agente activo (p. ej., t At -NR2B9c) es 20-200 mg/ml, preferiblemente 50-150 mg/ml, más preferiblemente 70-120 mg/ml o 90 mg/ml. Por lo tanto, una formulación preliofilizada ejemplar es histidina 20 mM, trehalosa 120 mM y 90 mg/ml de TAT-NR2B9c.

Después de la liofilización, las formulaciones liofilizadas tienen un bajo contenido de agua, preferiblemente de aproximadamente 0% a 5% de agua, más preferiblemente por debajo de 2,5% de agua en peso. Las formulaciones liofilizadas se pueden almacenar en un congelador (p. ej., -20 o -70 °C), en un refrigerador (0-4 °C) o a temperatura ambiente (20-25 °C).

Los agentes activos se reconstituyen en una disolución acuosa, preferiblemente agua para inyección u opcionalmente disolución salina normal (disolución salina al 0,8-1,0% y preferiblemente disolución salina al 0,9%). La reconstitución puede tener el mismo volumen o un volumen mayor o menor que el de la formulación preliofilizada. Preferiblemente, el volumen es mayor después de la reconstitución que antes (p. ej., 3-6 veces mayor). Por ejemplo, un volumen de preliofilización de 3-5 ml se puede reconstituir como un volumen de 13,5 ml. Después de la reconstitución, la concentración de histidina es preferiblemente 2-20 mM, p. ej., 2-7 mM o 4,5 mM; la concentración de trehalosa es preferiblemente 15-45 mM o 20-30 mM o 25-27 mM. El agente activo está preferiblemente en una concentración de 10-30 mg/ml, por ejemplo, 15-25, 18-20 o 20 mg/ml de agente activo (p. ej., TAT-NR2B9c). Una formulación ejemplar después de la reconstitución tiene histidina 4-5 mM, trehalosa 26-27 mM y 20 mg/ml de TAT-NR2B9c (con concentraciones redondeadas al número entero más cercano). La formulación reconstituida se puede diluir más antes de la administración, tal como añadiéndola a una bolsa de fluido que contiene disolución salina normal para infusión intravenosa.

Los métodos de secado por congelación se exponen, por ejemplo, en Methods in Enzymology, vol. 22, páginas 33-39, Academic Press, Nueva York (1971); y en Freeze-Drying, EW Flosdorf, Rheinhold, Nueva York (1949). TAT-NR2B9c se liofiliza preferiblemente en el mismo vial en el que se reconstituirá para su uso. Una disolución acuosa de TAT-NR2B9c se añade al vial, opcionalmente después de filtrar a través de un sistema de filtración de esterilización, tal como un filtro de 0,22 micrómetros que se usa de manera estándar para los péptidos. Las formulaciones se pueden liofilizar en un ciclo controlado, tal como se describe en los Ejemplos. Una formulación preliofilizada puede ponerse en un vial y liofilizarse a temperatura y presión reducidas. Después de la liofilización, los viales se pueden sellar. Para su uso, el liofilizado se reconstituye con agua para inyección, disolución salina normal u otro vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Para la liofilización, son adecuados varios contenedores. Un contenedor debe poder soportar la presión exterior cuando el contenedor se sella y se almacena bajo vacío parcial. El contenedor debe estar hecho de un material que permita una transferencia razonable de calor del exterior al interior. El tamaño del contenedor debe ser tal que la disolución que se va a liofilizar no ocupe más del 20% del volumen útil o se pueda sobrellenar con un exceso, según las recomendaciones de USP vigentes en ese momento para el volumen en un contenedor. Por ejemplo, una disolución de 0,5 ml se puede utilizar para llenar en un vial de 3 ml. Los viales pueden estar hechos de vidrio, p. ej., borosilicato o plástico, p. ej., polipropileno.

Se pueden usar botellas de vidrio usadas comúnmente para liofilizar materiales biológicos. Otro contenedor adecuado es una jeringa de dos compartimentos en donde un compartimiento contiene la torta de péptido TAT-NR2B9c liofilizada y el otro compartimiento contiene el diluyente acuoso. Una vez que se completa la liofilización, el vacío dentro de los viales o ampollas se puede liberar al llenar el sistema con un gas inerte, se tapar en su lugar usando un equipo estándar y luego se sella por engastado. Dicho método asegurará un producto final estéril. También se pueden usar otras soluciones de dos partes, tales como una bolsa con un sello rompible entre el compartimiento del fármaco liofilizado y el diluyente.

II. Agentes activos

Los agentes activos inhiben la interacción entre PSD-95 y uno o más NMDAR (p. ej., 2A, 2B, 2C o 2D) o nNOS (p. ej., Swiss-Prot P29475) mediante unión a PSD-95. Dichos agentes son útiles para reducir uno o más efectos dañinos del accidente cerebrovascular y otras afecciones neurológicas mediadas, al menos en parte, por la excitotoxicidad de NMDAR. Dichos agentes incluyen péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye o se basa en el resto PL de un receptor de NMDa o dominio PDZ de PSD-95. Dichos péptidos también pueden inhibir las interacciones entre PSD-95 y nNOS y otros receptores de glutamato (p. ej., receptores de kainito o receptores de AMPA), tales como KV1-4 y GluR6. Los péptidos preferidos inhiben la interacción entre los dominios PDZ 1 y 2 de la proteína de la densidad postsináptica 95 (PSD-95) (secuencia de aminoácidos humana proporcionada por Stathakism, Genomics 44 (1): 71-82 (1997)) y la secuencia C terminal PL de una o más subunidades del receptor de NMDA 2, incluida la subunidad NR2B del receptor neuronal de N-metil-D-aspartato (Mandich et al., Genomics 22, 216-8 (1994)). NMDAR2B tiene GenBank ID 4099612, un resto C terminal de 20 aminoácidos FNGSSNGHVYEKLSSIESDV (SEQ ID NO: 11) y un resto PL ESDV (SEQ ID NO: 12). Los péptidos preferidos inhiben las formas humanas de PSD-95 y los receptores NMDAR humanos. Sin embargo, la inhibición también se puede mostrar a partir de variantes de especies de las proteínas. A continuación, se muestra una lista de los receptores de NMDA y de glutamato que se pueden usar:

Receptores de NMDA Con Secuencias PL

Los péptidos pueden incluir o estar basados en un resto PL del extremo C de cualquiera de las subunidades anteriores y tener una secuencia de aminoácidos que comprende [S/T]-X-[V/L]. Esta secuencia aparece preferiblemente en el extremo C de los péptidos de la invención. Los péptidos preferidos tienen una secuencia de aminoácidos que comprende [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO: 38) en su extremo C. Los péptidos ejemplares comprenden: ESDV (SEQ ID NO: 12), ESEV (SEQ ID NO: 29), ETDV (SEQ ID NO: 39), ETEV (SEQ ID NO: 40), DTDV (SEQ ID NO: 41) y DTEV (SEQ ID NO: 42) como los aminoácidos C-terminales. Dos péptidos particularmente preferidos son KLSSIESDV (SEQ ID NO: 5) y KLSSIETDV (SEQ ID NO: 43). Dichos péptidos tienen habitualmente 3-25 aminoácidos (sin un péptido de internalización), se prefieren longitudes de péptido de 5-10 aminoácidos, y particularmente 9 aminoácidos (también sin un péptido de internalización). En algunos de dichos péptidos, todos los aminoácidos son del extremo C de un receptor de NMDA (sin incluir los aminoácidos de un péptido de internalización).

Los péptidos y peptidomiméticos de la invención pueden contener residuos de aminoácidos modificados, por ejemplo, residuos que están alquilados en N. Las modificaciones de alquilo N-terminal pueden incluir, p. ej., N-metilo, N-etilo, N-propilo, N-butilo, N-ciclohexilmetilo, N-ciclohexiletilo, N-bencilo, N-feniletilo, N-fenilpropilo, N-(3,4-diclorofenil)propilo, N-(3,4-difluoropenil)propilo y N-(naftalen-2-il)etilo).

Bach, J. Med. Chem. 51,6450-6459 (2008) y WO 2010/004003 han descrito una serie de análogos de NR2B9c (SEQ ID NO: 6 ). La actividad de unión a PDZ es exhibida por péptidos que tienen solamente tres aminoácidos C-terminales (SDV). Bach también informa de análogos que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en X-itSX2V (SEQ ID NO: 68), en donde t y S son aminoácidos alternativos, X1 se selecciona entre E, Q y A, o análogo de los mismos, X2 se selecciona entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D y N-Me-N o un análogo de los mismos. Opcionalmente, el péptido se alquila en N en la posición P3 (tercer aminoácido desde el extremo C, es decir, la posición ocupada por tS). El péptido puede estar alquilado en N con un ciclohexano o sustituyente aromático, y comprende además un grupo espaciador entre el sustituyente y el grupo amino terminal del péptido o análogo de péptido, en donde el espaciador es un grupo alquilo, preferiblemente seleccionado entre metileno, etileno, propileno y butileno. El sustituyente aromático puede ser un resto naftalen-2-ilo o un anillo aromático sustituido con uno o dos grupos halógeno y/o alquilo.

También se pueden incorporar otras modificaciones sin afectar adversamente la actividad y estas incluyen la sustitución de uno o más de los aminoácidos en la forma isomérica L natural con aminoácidos en la forma isomérica D. Por lo tanto, cualquier aminoácido que aparezca naturalmente en la configuración L (que también puede referirse como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede reemplazarse con el aminoácido del mismo tipo estructural químico o un peptidomimético, pero de la quiralidad opuesta, generalmente referido como el D-aminoácido, pero que adicionalmente se puede referir como la forma R o S. Por lo tanto, un peptidomimético puede incluir 1,2, 3, 4, 5, al menos el 50%, o todos los residuos de D-aminoácidos. Un peptidomimético que contiene algunos o todos los residuos D se refiere a veces como un péptido "inverso".

Los peptidomiméticos también incluyen retro péptidos. Un retro péptido tiene una secuencia de aminoácidos inversa. Los peptidomiméticos también incluyen péptidos retro inversos en los que se invierte el orden de los aminoácidos, de modo que el aminoácido C-terminal originalmente aparece en el extremo N y se usan los D-aminoácidos en lugar de los L-aminoácidos. El documento WO 2008/014917 describe un análogo retro inverso de Tat-NR2B9c que tiene la secuencia de aminoácidos vdseisslk-rrrqrrkkrgyin (SEQ ID NO: 69) (indicando las letras minúsculas D aminoácidos), e informa que es un inhibidor efectivo de la isquemia cerebral. Otro péptido efectivo descrito en la presente memoria es Rv-Tat-NR2B9c (RRRQRRKKRGYKLSSIESDV; SEQ ID NO: 70).

Se puede usar un enlazador, p. ej., un enlazador de polietilenglicol, para dimerizar el resto activo del péptido o del peptidomimético para aumentar su afinidad y selectividad hacia proteínas que contienen dominios PDZ en tándem. Véase, p. ej., Bach et al., (2009) Angew. Chem. Int. Ed. 48: 9685-9689 y WO 2010/004003. Un péptido que contiene un resto PL se dimeriza preferiblemente mediante la unión del extremo N de dos de dichas moléculas, dejando el extremo C libre. Bach informa además que un péptido pentámero IESDV (SEQ ID NO: 71) del extremo C de NMDAR 2B fue efectivo para inhibir la unión de NMDAR 2B a PSD-95. IETDV (SEQ ID NO: 73) también se puede usar en lugar de IESDV. Opcionalmente, aproximadamente 2-10 copias de un PEG se pueden unir en tándem como un enlazador. Opcionalmente, el enlazador también puede unirse a un péptido de internalización o lipidado para aumentar la captación celular. A continuación, se muestran ejemplos de inhibidores diméricos ilustrativos (véase Bach et al., PNAS 109 (2012) 3317-3322). Se puede usar cualquiera de los inhibidores de PSD-95 descritos en la presente memoria en lugar de IETDV, y se puede usar cualquier péptido de internalización o resto lipidante en lugar de tat. También se pueden usar otros enlazadores aparte de los mostrados.

Dímero O (X = O) Dímero Tat-N (R = YGRKKRRQRRR)

Dímero N (X = N) Dímero ReTat-N (R = rrrqrrkkr)

A IETAV se le asigna SEQ ID NO: 26, YGRKKRRQRRR SEQ ID NO: 2, y rrrqrrkkr, SEQ ID NO: 10, las letras minúsculas indican D-aminoácidos.

La actividad farmacológica apropiada de los péptidos, peptidomiméticos u otro agente puede confirmarse, si se desea, usando modelos de accidente cerebrovascular en ratas previamente descritos antes del ensayo en primates y ensayos clínicos descritos en la presente solicitud. Los péptidos o peptidomiméticos también pueden cribarse para determinar su capacidad para inhibir las interacciones entre PSD-95 y NMDAR 2B usando los ensayos descritos, p. ej., en US 20050059597. Los péptidos útiles tienen típicamente valores de CI50 de menos de 50 mM, 25 mM, 10 mM, 0,1 mM o 0,01 mM en dicho ensayo. Los péptidos preferidos tienen típicamente un valor de CI50 de entre 0,001-1 mM, y más preferiblemente 0,001-0,05, 0,05-0,5 o 0,05 a 0,1 mM. Cuando un péptido u otro agente se caracteriza como que inhibe la unión de una interacción, p. ej., la interacción de PSD-95 con NMDAR2B, dicha descripción no excluye que el péptido o el agente también inhiba otra interacción, por ejemplo, la inhibición de la unión de PSD-95 a nNOS.

Los péptidos tales como los que se acaban de describir pueden derivatizarse opcionalmente (p. ej., acetilarse, fosforilarse, miristoilarse, geranilarse, pegilarse y/o glicosilarse) para mejorar la afinidad de unión del inhibidor, para mejorar la capacidad del inhibidor para ser transportado a través de una membrana celular o para mejorar la estabilidad. Como un ejemplo específico, para los inhibidores en los que el tercer residuo desde el extremo C es S o T, este residuo puede ser fosforilado antes del uso del péptido.

Un agente farmacológico puede estar ligado a un péptido de internalización para facilitar la captación en las células y/o a través de la barrera hematoencefálica. Los péptidos de internalización son una clase muy conocida de péptidos relativamente cortos que permiten que muchas proteínas celulares o virales atraviesen las membranas. Los péptidos de internalización, también conocidos como péptidos de transducción de membrana celular o péptidos que penetran en la célula, pueden tener, p. ej., 5-30 aminoácidos. Dichos péptidos tienen típicamente una carga catiónica de una representación normal anterior (relativa a las proteínas en general) de residuos de arginina y/o lisina que se cree que facilita su paso a través de las membranas. Algunos de dichos péptidos tienen al menos 5, 6 , 7 u 8 residuos de arginina y/o lisina. Los ejemplos incluyen la proteína antennapedia (Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997)) (y variantes de la misma), la proteína tat del virus de la inmunodeficiencia humana, la proteína VP22, el producto del gen UL49 del virus del herpes simple tipo 1, Penetratina, SynBl y 3, Transportano, Anfipático, gp41NLS, poliArg, y varias toxinas proteicas bacterianas y de plantas, como la ricina, abrina, modecina, toxina de la difteria, toxina del cólera, toxina del ántrax, toxinas lábiles al calor y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA). Otros ejemplos se describen en las siguientes referencias (Temsamani, Drug Discovery Today, 9 (23): 1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390: 407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24 (1): 1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62: 1839-49, 2005); Gao, ACS Chem. Biol. 2011, 6 , 484-491, SG3 (RLSGMNEVLSFRWL (SEQ ID NO: 9)), Stalmans PLoS ONE 2013, 8(8) e71752, 1-11 y suplemento.

Un péptido de internalización preferido es tat del virus del VIH. Un péptido tat informado en un trabajo previo comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos estándar YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) encontrada en la proteína Tat del VIH. Si están presentes residuos adicionales que flanquean dicho resto tat (además del agente farmacológico), los residuos pueden ser, por ejemplo, aminoácidos naturales que flanquean este segmento de una proteína tat, aminoácidos espaciadores o enlazadores de un tipo usado típicamente para unir dos dominios peptídicos, p. ej., gly (ser)4 (SEQ ID NO: 44), TGEKP (SEQ ID NO: 45), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 46), o LRQRDG-ERP (SEQ ID No : 47) (véase, p. ej., Tang et (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410)), o puede ser cualquier otro aminoácido que no reduzca significativamente la capacidad para conferir la captación de la variante sin los residuos flanqueantes. Preferiblemente, el número de aminoácidos flanqueantes distintos de un péptido activo no excede de diez a cada lado de YGRKKRRQRRRR (SEQ ID NO: 2). Un péptido tat adecuado que comprende residuos de aminoácidos adicionales que flanquean el extremo C de YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) es YGRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 48). Sin embargo, preferiblemente, no están presentes aminoácidos flanqueantes. Otros péptidos tat que se pueden usar incluyen GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 4) y GRKKRRQRRRP (SEQ ID NO: 72).

Las variantes del péptido tat anterior que tienen una capacidad reducida para unirse a los canales de calcio de tipo N se describen por el documento WO/2008/109010. Dichas variantes pueden comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 49), en la que X es un aminoácido distinto de Y o nada (en cuyo caso G es un residuo N-terminal libre). Un péptido tat preferido tiene el residuo Y N-terminal sustituido con F. Por lo tanto, se prefiere un péptido tat que comprende o que consiste en FGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 3). Otra variante preferida del péptido tat consiste en GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1). Otro péptido tat preferido comprende o consiste en RRRQRRKKRG o RRRQRRKKRGY (aminoácidos 1-10 o 1-11 de la Se Q ID NO: 70). Otros péptidos derivados de tat que facilitan la captación de un agente farmacológico sin inhibir los canales de calcio de tipo N incluyen los que se presentan a continuación.

X puede representar un extremo amino libre, uno o más aminoácidos, o un resto conjugado. Los péptidos de internalización pueden usarse en forma inversa o retro o retro inversa con o sin el péptido unido o el peptidomimético en dicha forma. Por ejemplo, un péptido quimérico preferido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en YGRK^k R^r Q^r RR-KLSSIE^s D^v (SEQ ID NO: 6 , también conocido como NA-1 o Tat-NR2B9c), o YGRKKRRQRRRR-KLSSIETDV (SEQ ID NO: 7). Otros péptidos preferidos incluyen RRRQRRKKRGY-KLSSIESDV (SEQ ID NO: 70), también conocido como RvTat-NR2B9c o que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en RRRQRRKKRGY-KLSSIETDV (SEQ ID NO: 37).

Los péptidos de internalización pueden unirse a agentes farmacológicos por métodos convencionales. Por ejemplo, los agentes pueden unirse a péptidos de internalización por enlace químico, por ejemplo, a través de un agente de acoplamiento o conjugación. Numerosos de dichos agentes están disponibles comercialmente y están revisados por S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991). Algunos ejemplos de reactivos de reticulación incluyen 3-(2-piridilditio) propionato de J-succinimidilo (SPDP) o N,N'- (1,3-fenileno) bismaleimida; N,N'-etilen-bis-(yodoacetamida) u otro reactivo de este tipo que tenga puentes de metileno de 6 a 11 carbonos (lo que es relativamente específico para los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina). Otros reactivos de reticulación incluyen p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona (que forma enlaces cruzados irreversibles con grupos amino y fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico para grupos amino); cloruro de fenol-1,4-disulfonilo (que reacciona principalmente con grupos amino); hexametilendiisocianato o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobencidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Para agentes farmacológicos que son péptidos, la unión a un péptido de internalización se puede lograr generando una proteína de fusión que comprende la secuencia peptídica fusionada, preferiblemente en su extremo N, a un péptido de internalización.

En lugar de, o así como, la unión de un péptido (u otro agente) que inhibe PSD-95 a un péptido de internalización, dicho péptido se puede unir a un lípido (lipidación) para incrementar la hidrofobicidad del conjugado en relación con el péptido solo y así facilitar el paso del péptido unido a través de las membranas celulares y/o a través de la barrera cerebral. La lipidación se realiza preferiblemente en el aminoácido N-terminal, pero también puede realizarse en aminoácidos internos, siempre que la capacidad del péptido para inhibir la interacción entre PSD-95 y NMDAR 2B no se reduzca en más del 50%. Preferiblemente, la lipidación se realiza en un aminoácido distinto de uno de los cuatro aminoácidos más C-terminales. Los lípidos son moléculas orgánicas más solubles en éter que en agua e incluyen ácidos grasos, glicéridos y esteroles. Las formas adecuadas de lipidación incluyen miristoilación, palmitoilación o unión de otros ácidos grasos, preferiblemente con una cadena con una longitud de 10 a 20 carbonos, tales como ácido láurico y ácido esteárico, así como geranilación, geranilgeranilación e isoprenilación. Se prefieren las lipidaciones de un tipo que se producen en la modificación posterior a la traducción de proteínas naturales. También se prefiere la lipidación con un ácido graso a través de la formación de un enlace amida con el grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal del péptido. La lipidación puede ser por síntesis peptídica que incluye un aminoácido prelipidado, puede realizarse enzimáticamente in vitro o por expresión recombinante, por reticulación química o derivación química del péptido. Los aminoácidos modificados por miristoilación y otras modificaciones lipídicas están disponibles comercialmente.

La lipidación facilita preferiblemente el paso de un péptido unido (p. ej., KLSSIESDV (SEQ ID NO: 5) o KLSSIETDV (SEQ ID NO: 43)) a través de una membrana celular y/o la barrera hematoencefálica sin causar una reducción transitoria de la presión sanguínea como se ha encontrado cuando un péptido tat estándar se administra a una dosis alta (p. ej., a 3 mg/kg o más), o al menos con una reducción menor que la del mismo péptido unido a un péptido tat estándar.

Los péptidos farmacológicos, opcionalmente fusionados con los péptidos tat, pueden sintetizarse mediante síntesis en fase sólida o métodos recombinantes. Los peptidomiméticos pueden sintetizarse usando una variedad de procedimientos y metodologías descritas en la bibliografía científica y de patentes, p. ej., Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotecnol. 9: 205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3: 17-27; Ostresh (1996) Métodos Enzymol. 267: 220-234.

III. Enfermedades

Las formulaciones liofilizadas son útiles para tratar una variedad de enfermedades, particularmente enfermedades neurológicas, y especialmente enfermedades mediadas en parte por la excitotoxicidad. Dichas enfermedades y afecciones incluyen accidente cerebrovascular, epilepsia, hipoxia, hemorragia subaracnoidea, lesión traumática en el SNC no asociada con accidente cerebrovascular, tal como lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal, otra isquemia cerebral, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Otras enfermedades neurológicas tratables por agentes de la invención que no se sabe que están asociadas con la excitotoxicidad incluyen la ansiedad y el dolor.

Un accidente cerebrovascular es una afección que resulta de un flujo sanguíneo deficiente en el SNC, independientemente de la causa. Las posibles causas incluyen embolia, hemorragia y trombosis. Algunas células neuronales mueren inmediatamente como resultado del flujo sanguíneo alterado. Estas células liberan sus moléculas componentes, incluido el glutamato, que a su vez activa los receptores de NMDA, que elevan los niveles de calcio intracelular, y los niveles de enzimas intracelulares que dan lugar a una muerte de células neuronales adicional (la cascada de excitotoxicidad). La muerte del tejido del SNC se conoce como infarto. El volumen de infarto (es decir, el volumen de células neuronales muertas a causa de un accidente cerebrovascular en el cerebro) se puede usar como un indicador de la extensión del daño patológico resultante de un accidente cerebrovascular. El efecto sintomático depende tanto del volumen de un infarto como del lugar donde se encuentra en el cerebro. El índice de discapacidad se puede usar como una medida del daño sintomático, tal como la Escala de Resultados de Accidente Cerebrovascular de Rankin (Rankin, Scott Med J; 2: 200-15 (1957)) y el Índice de Barthel. La escala de Rankin se basa en evaluar directamente las condiciones globales de un paciente de la siguiente manera.

0: Sin síntomas en absoluto

1: No hay discapacidad significativa a pesar de los síntomas; capaz de realizar todos los deberes y actividades habituales.

2: Discapacidad leve; incapaz de llevar a cabo todas las actividades anteriores pero capaz de cuidar de sus propios asuntos sin ayuda.

3: Discapacidad moderada que requiere ayuda, pero que puede caminar sin ayuda

4: Discapacidad moderada a severa; incapaz de caminar sin ayuda e incapaz de atender sus propias necesidades corporales sin ayuda.

5: Discapacidad severa; postrado en cama, incontinente, y que requieren atención y cuidados de enfermería constantes.

El Índice de Barthel se basa en una serie de preguntas sobre la capacidad del paciente para realizar 10 actividades básicas de la vida diaria que dan como resultado una puntuación entre 0 y 100, indicando una calificación más baja más discapacidad (Mahoney et al, Maryland State Medical Journal 14:56 -61 (1965)).

Alternativamente, la gravedad/resultados de los accidentes cerebrovasculares se pueden medir usando la escala de accidentes cerebrovasculares del NIH, disponible en el sitio web mundial ninds.nih.gov/doctors/NIH Stroke ScaleJBooklet.pdf.

La escala se basa en la capacidad de un paciente para llevar a cabo 11 grupos de funciones que incluyen evaluaciones del nivel de conciencia del paciente, funciones motoras, sensoriales y del lenguaje.

Un accidente cerebrovascular isquémico se refiere más específicamente a un tipo de accidente cerebrovascular causado por un bloqueo del flujo sanguíneo al cerebro. La afección subyacente para este tipo de bloqueo es lo más comúnmente el desarrollo de depósitos de grasa que revisten las paredes de los vasos. Esta afección se llama aterosclerosis. Estos depósitos grasos pueden causar dos tipos de obstrucción. La trombosis cerebral se refiere a un trombo (coágulo de sangre) que se desarrolla en la parte obstruida del vaso. "Embolia cerebral" se refiere generalmente a un coágulo de sangre que se forma en otra ubicación en el sistema circulatorio, habitualmente en el corazón y las arterias grandes del tórax superior y cuello. Una porción del coágulo de sangre se suelta, entra en el torrente sanguíneo y viaja a través de los vasos sanguíneos del cerebro hasta que llega a vasos demasiado pequeños que no lo dejan pasar. Una segunda causa importante de embolia es un latido irregular, conocido como fibrilación arterial. Crea afecciones en las que los coágulos pueden formarse en el corazón, desplazarse y viajar al cerebro. Las causas potenciales adicionales del accidente cerebrovascular isquémico son hemorragia, trombosis, disección de una arteria o vena, un paro cardíaco, choque de cualquier causa, incluida hemorragia y causas iatrogénicas, tales como lesión quirúrgica directa en vasos sanguíneos del cerebro o vasos que conducen al cerebro o cirugía cardíaca. El accidente cerebrovascular isquémico representa aproximadamente el 83 por ciento de todos los casos de accidente cerebrovascular.

Los ataques isquémicos transitorios (AIT) son accidentes cerebrovasculares menores o de advertencia. En un AIT, existen condiciones indicativas de un accidente cerebrovascular isquémico y se desarrollan los signos típicos de advertencia de accidente cerebrovascular. Sin embargo, la obstrucción (coágulo de sangre) se produce durante un corto tiempo y tiende a resolverse a través de mecanismos normales. Los pacientes sometidos a cirugía cardíaca tienen un riesgo particular de ataque isquémico cerebral transitorio.

El accidente cerebrovascular hemorrágico representa aproximadamente el 17 por ciento de los casos de accidente cerebrovascular. Es el resultado de un vaso debilitado que se rompe y sangra en el cerebro circundante. La sangre se acumula y comprime el tejido cerebral circundante. Los dos tipos generales de accidentes cerebrovasculares hemorrágicos son la hemorragia intracerebral y la hemorragia subaracnoidea. El accidente cerebrovascular hemorrágico es el resultado de la ruptura de una ruptura de vasos sanguíneos debilitados. Las posibles causas de ruptura de un vaso sanguíneo debilitado incluyen una hemorragia hipertensiva, en la que la presión sanguínea alta causa la ruptura de un vaso sanguíneo, u otra causa subyacente de vasos sanguíneos debilitados, tal como una malformación vascular cerebral dañada, incluido un aneurisma cerebral, una malformación arteriovenosa (AVM) o malformación cavernosa. Los accidentes cerebrovasculares hemorrágicos también pueden surgir de una transformación hemorrágica de un accidente cerebrovascular isquémico que debilita los vasos sanguíneos en el infarto, o de una hemorragia de tumores primarios o metastásicos en el SNC que contienen vasos sanguíneos anormalmente débiles. El accidente cerebrovascular hemorrágico también puede surgir de causas iatrogénicas, tales como la lesión quirúrgica directa en un vaso sanguíneo cerebral. Un aneurisma es una dilatación de una región debilitada de un vaso sanguíneo. Si no se trata, el aneurisma continúa debilitándose hasta que se rompe y sangra en el cerebro. Una malformación arteriovenosa (AVM) es una agrupación de vasos sanguíneos anormalmente formados. Una malformación cavernosa es una anomalía venosa que puede causar una hemorragia por estructuras venosas debilitadas. Cualquiera de estos vasos puede romperse, lo que también causa sangrado en el cerebro. El accidente cerebrovascular hemorrágico también puede resultar de un trauma físico. El accidente cerebrovascular hemorrágico en una parte del cerebro puede dar lugar a un accidente cerebrovascular isquémico en otra, por la escasez de sangre perdida en el accidente cerebrovascular hemorrágico.

Una clase de pacientes susceptibles de tratamiento son los pacientes que se someten a un procedimiento quirúrgico que implica o puede implicar un vaso sanguíneo que abastece al cerebro, o de otra manera en el cerebro o el SNC. Algunos ejemplos son pacientes sometidos a baipás cardiopulmonar, colocación de stent carotídeo, angiografía diagnóstica del cerebro o arterias coronarias del arco aórtico, procedimientos quirúrgicos vasculares y procedimientos neuroquirúrgicos. Los ejemplos adicionales de dichos pacientes se discuten en la sección IV anterior. Los pacientes con un aneurisma cerebral son particularmente adecuados. Dichos pacientes pueden tratarse mediante una variedad de procedimientos quirúrgicos, incluyendo pinzar el aneurisma para interrumpir la sangre o realizar una cirugía endovascular para bloquear el aneurisma con pequeñas bobinas o introducir un stent en un vaso sanguíneo desde el que emerge un aneurisma, o insertar un microcatéter. Los procedimientos endovasculares son menos invasivos que el pinzamiento de un aneurisma y se asocian con un mejor resultado para el paciente, pero el resultado aún incluye una alta incidencia de pequeños infartos. Dichos pacientes pueden tratarse con un inhibidor de la interacción de PSD95 con NMDAR 2B y, en particular, los agentes descritos anteriormente, incluyendo el péptido YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (S^e Q ID NO: 6 , también conocido como Tat-NR2B9c). La cronología de la administración en relación con la realización de la cirugía puede ser como se ha descrito anteriormente para el ensayo clínico.

Otra clase de pacientes susceptibles de tratamiento son los pacientes que tienen una hemorragia subaracnoidea con o sin un aneurisma (véase US 61/570.264).

IV. Regímenes efectivos de administración

Después de la reconstitución, se administra una formulación liofilizada de tal manera que el agente activo (p. ej., NR2B9c) se administra en una cantidad, frecuencia y ruta de administración efectiva para curar, reducir o inhibir un deterioro adicional de al menos un signo o síntoma de una enfermedad en un paciente que tiene la enfermedad que se está tratando. Una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de agente activo suficiente para curar, reducir o inhibir un deterioro adicional de al menos un signo o síntoma de la enfermedad o afección que se va a tratar en una población de pacientes (o modelos animales) que padece la enfermedad tratada con un agente de la invención en relación con el daño en una población de control de pacientes (o modelos animales) que padecen esa enfermedad o afección que no se tratan con el agente. La cantidad también se considera terapéuticamente efectiva si un paciente tratado individual logra un resultado más favorable que el resultado medio en una población control de pacientes comparables no tratados por los métodos de la invención. Un régimen terapéuticamente efectivo implica la administración de una dosis terapéuticamente efectiva a una frecuencia y ruta de administración necesarias para lograr el propósito pretendido.

Para un paciente que padece un accidente cerebrovascular u otra afección isquémica, el agente activo se administra en un régimen que comprende una cantidad frecuencia y ruta de administración efectivas para reducir los efectos dañinos del accidente cerebrovascular u otra afección isquémica. Cuando la afección que requiere tratamiento es un accidente cerebrovascular, el resultado puede determinarse por el volumen de infarto o el índice de discapacidad, y una dosificación se considera terapéuticamente efectiva si un paciente tratado individual muestra una discapacidad de dos o menos en la escala de Rankin y 75 o más en la escala de Barthel, o si una población de pacientes tratados muestra una distribución de puntuaciones significativamente mejorada (es decir, menos discapacitada) en una escala de discapacidad que una población no tratada comparable, véase Lees et al L, N Engl J Med 2006; 354: 588-600. Una dosis única de agente es habitualmente suficiente para el tratamiento del accidente cerebrovascular.

La invención también proporciona métodos y formulaciones para la profilaxis de un trastorno en un sujeto con riesgo de ese trastorno. Habitualmente, dicho sujeto tiene una mayor probabilidad de desarrollar el trastorno (p. ej., una afección, dolencia, trastorno o enfermedad) en relación con una población control. La población control, por ejemplo, puede comprender uno o más individuos seleccionados al azar de la población general (p. ej., con concordancia de edad, sexo, raza y/o etnicidad) que no hayan sido diagnosticados o tengan un historial familiar del trastorno. Un sujeto puede ser considerado en riesgo para un trastorno si se encuentra que un "factor de riesgo" asociado con ese trastorno está asociado con ese sujeto. Un factor de riesgo puede incluir cualquier actividad, rasgo, evento o propiedad asociada con un trastorno dado, por ejemplo, a través de estudios estadísticos o epidemiológicos en una población de sujetos. Por lo tanto, un sujeto puede clasificarse como en riesgo de padecer un trastorno, incluso si los estudios que identifican los factores de riesgo subyacentes no incluyeron específicamente al sujeto. Por ejemplo, un sujeto sometido a cirugía cardíaca está en riesgo de ataque isquémico cerebral transitorio debido a que la frecuencia del ataque isquémico cerebral transitorio aumenta en una población de sujetos que se han sometido a una cirugía cardíaca en comparación con una población de sujetos que no lo han hecho.

Otros factores de riesgo comunes para el accidente cerebrovascular incluyen la edad, el historial familiar, el sexo, la incidencia previa del accidente cerebrovascular, el ataque isquémico transitorio o el ataque cardíaco, la presión sanguínea alta, el tabaquismo, la diabetes, la enfermedad arterial carótida u otra enfermedad arterial, la fibrilación auricular y otras enfermedades cardíacas como la enfermedad cardíaca , insuficiencia cardíaca, miocardiopatía dilatada, enfermedad de las válvulas cardíacas y/o defectos cardíacos congénitos; colesterol alto en sangre y dietas altas en grasas saturadas, grasas trans o colesterol.

En la profilaxis, una formulación liofilizada después de la reconstitución se administra a un paciente con riesgo de una enfermedad pero que aún no tiene la enfermedad en una cantidad, frecuencia y ruta suficiente para prevenir, retrasar 0 inhibir el desarrollo de al menos un signo o síntoma de la enfermedad. Una cantidad profilácticamente efectiva significa una cantidad de agente suficiente para prevenir, inhibir o retrasar significativamente al menos un signo o síntoma de la enfermedad en una población de pacientes (o modelos animales) en riesgo de la enfermedad en relación con el agente en comparación con una población control de pacientes (o modelos animales) con riesgo de enfermedad no tratada con un agente quimérico de la invención. La cantidad también se considera profilácticamente efectiva si un paciente individual tratado logra un resultado más favorable que el resultado medio en una población control de pacientes comparables no tratados por los métodos de la invención. Un régimen profilácticamente efectivo implica la administración de una dosis profilácticamente efectiva a una frecuencia y ruta de administración necesarias para lograr el propósito pretendido. Para la profilaxis del accidente cerebrovascular en un paciente con riesgo inminente de accidente cerebrovascular (p. ej., un paciente sometido a cirugía cardíaca), habitualmente es suficiente una dosis única de agente.

Dependiendo del agente, la administración puede ser parenteral, intravenosa, nasal, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. Se prefiere la administración intravenosa para agentes peptídicos.

Para la administración a seres humanos, una dosis preferida de agente activo (p. ej., Tat-NR2B9c) es 2-3mg/kg y más preferiblemente 2,6 mg/kg. Debe entenderse que las dosificaciones indicadas incluyen el margen de error inherente a la exactitud con la que se pueden medir las dosificaciones en un entorno hospitalario típico. Dichas cantidades son para la administración de dosis únicas, es decir, una dosis por episodio de enfermedad.

Los agentes activos, tales como Tat-NR2B9c, se administran preferiblemente por infusión en un vaso sanguíneo, más preferiblemente por infusión intravenosa. El momento de la infusión puede afectar tanto a los efectos secundarios (debido, p. ej., a la desgranulación de los mastocitos y a la liberación de histamina) como a la eficacia. En general, para un nivel de dosificación dado, es más probable que un tiempo de infusión más corto conduzca a la liberación de histamina. Sin embargo, un tiempo de infusión más corto también puede dar lugar a una eficacia mejorada. Aunque la práctica de la invención no depende de la comprensión del mecanismo, este último resultado puede explicarse debido a que el retraso es significativo en relación con el desarrollo de la patología en el paciente y debido al hecho de que el retraso es significativo en relación con la semivida plasmática del agente quimérico, como resultado de lo cual el agente quimérico no alcanza un nivel terapéutico óptimo. Para el agente quimérico Tat-NR2B9c, un tiempo de infusión preferido que proporciona un equilibrio entre estas consideraciones es 5-15 minutos y más preferiblemente 10 minutos. Se debe entender que los tiempos indicados incluyen una marca de error de /- 10%. Los tiempos de infusión no incluyen ningún tiempo adicional para que una difusión de lavado elimine las gotas remanentes de una difusión inicial que, de otro modo, ha transcurrido hasta la compleción. Los tiempos de infusión para Tat-NR2B9c también pueden servir como una guía para otros agentes activos.

Aunque la invención se ha descrito en detalle para propósitos de claridad de comprensión, ciertas modificaciones pueden ponerse en práctica dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En la medida en que más de una secuencia esté asociada con un número de acceso en diferentes momentos, se entienden las secuencias asociadas con el número de acceso a partir de la fecha de presentación efectiva de esta solicitud. La fecha de presentación efectiva es la fecha de la primera solicitud de prioridad que revela el número de acceso en cuestión. A no ser que sea evidente otra cosa a partir del contexto, cualquier elemento, realización, etapa, característica o apariencia de la invención se puede realizar en combinación con cualquier otro.

Ejemplos

Ejemplo 1: Demostración de que los tampones y los excipientes estándar no interfieren con la eficacia de NA-1 in vivo.

Se formularon cinco formulaciones de toxicología líquida dirigidas a una concentración de 20 mg/ml de NA-1. La Tabla 1 incluye la composición del vehículo, el número de lote y el contenido, pureza y pH en el momento de la formulación. Aproximadamente 5 ml de cada formulación se pusieron en viales para el ensayo. Los viales se congelaron a -20 para simular las condiciones del transporte o del almacenamiento de líquidos.

Tabla 1: composición de formulaciones de NA-1 para ensayos de eficacia in vivo

Se observó que la formulación tamponada con fosfato no mantenía el pH tan bien como lo hicieron los tampones de histidina entre la formulación y el ensayo, lo que indica que la histidina puede ser un tampón superior para la formulación.

Las formulaciones 1-5 se ensayaron en el modelo de rata de accidente cerebrovascular por oclusión de 3 vasos piales (3PVO). A las ratas sometidas a accidente cerebrovascular se les administró una de las formulaciones mediante administración intravenosa en la vena femoral, y luego los animales se sacrificaron 24 horas después del accidente cerebrovascular. Los cerebros se recogieron, se fijaron y se tiñeron con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) para visualizar las porciones isquémicas del cerebro. Todas las formulaciones ensayadas fueron capaces de proporcionar una neuroprotección significativa en los animales en relación con el control de disolución salina solamente (Fig. 1).

Métodos

Modelo de isquemia por oclusión de tres vasos piales

Los experimentos se realizaron en ratas. Para la oclusión permanente de tres vasos piales (3PVO) se realizó como se ha descrito anteriormente [Angiogenic protection from focal ischemia with angiotensin II type 1 receptor blockade in the rat. Forder et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. abril de 2005; 288 (4): H1989-96]. Brevemente, se anestesiaron ratas de de 250 g a 350 g con una inyección intramuscular de 0,5 ml/kg de ketamina (100 mg/kg), acepromazina (2 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg), suplementada con un tercio de la dosis inicial según se requiera. Se insertó una sonda de temperatura anal y el animal se puso sobre una almohadilla térmica mantenida a aproximadamente 37 °C. El cráneo se expuso a través de una incisión en la línea media y el tejido se eliminó por raspado. Usando un microscopio de disección y un taladro dental neumático, se hizo una ventana craneal de 6 a 8 mm sobre la corteza somatosensorial derecha (2 mm caudal y 5 mm lateral a bregma) al perforar un rectángulo a través del cráneo y levantar la pieza de cráneo mientras se mantenía la duramadre intacta. Las 3 ramas de arterias cerebrales medias arteriolares piales fueron cauterizadas alrededor de la corteza del barril y se seleccionaron y cauterizaron eléctricamente a través de la duramadre. Después de las cauterizaciones, se suturó el cuero cabelludo. Cada rata fue devuelta a su jaula individual bajo una lámpara de calentamiento para mantener la temperatura corporal hasta que la rata se recuperó completamente. Se suministró comida y agua. Una hora después de la isquemia 3PVO, se inyectaron a las ratas formulaciones de NA1 a 3 nmoles/g en ~ 0,45 ml de disolución salina sobre la base del peso de la rata. Las dosis se administraron durante 5 minutos.

Veinticuatro horas después de la cirugía, el cerebro se recogió rápidamente. Se tomaron cortes coronales (2 mm) a través del cerebro y se incubaron en cloruro de trifeniltetrazolio (t Tc ) al 2% (Sigma-Aldrich St. Louis MO) durante 15 min a 37 °C. Las imágenes se escanearon (CanoScan 4200F Canon) y se cuantificaron.

Ejemplo 2: Determinación de la estabilidad de NA-1 en diferentes tampones y en diferentes valores de pH

Cribado de tampones

Se formularon diez tampones a 1 mg/ml de NA-1 para el cribado de excipientes. Las muestras se almacenaron a 25 °C/60% de humedad relativa (HR) y 40 °C/75% HR. Las muestras se ensayaron para determinar la estabilidad (pureza) en t = 0 y t = 1 semana para la pureza por RP-HPLC (métodos de TFA y MSA), y los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3.

Los resultados indican una estabilidad mejorada para NA-1 en medios líquidos tamponados entre pH 6,0 y pH 6,5. La degradación parece incrementarse fuera de este rango en cualquier dirección. Los datos generados con el método de MSA mostraron patrones claros de degradación que dependían tanto del pH como de las especies tamponadoras, y proporcionaron una valiosa información sobre el desarrollo de futuras formulaciones. Los resultados para la pureza del pico principal por % de área de HPLC usando el método de MSA se proporcionan en la Tabla 2, mientras que los resultados para la pureza del pico principal por % de área de HPLC usando el método de TFA se proporcionan en la Tabla 3.

Tabla 2. % Del área del pico principal por el método de MSA, NA-1

Tabla 3. % Del área del pico principal por el método de TFA, NA-1

Los resultados indican que la estabilidad de la disolución de NA-1 se mantiene mejor en medios tamponados de pH 6,0 a 6,5 y el vehículo aún es bien tolerado para la administración por IV. En general, los sistemas de tamponamiento de histidina y citrato fueron capaces de mantener el NA-1 en una forma intacta, incluso cuando se mantuvieron en condiciones de estabilidad acelerada de 25 °C o 40 °C durante 1 semana.

Hay varios factores que se deben considerar al seleccionar una especie de tamponamiento: los patrones de degradación específicos que se producen en cada medio, y cualquier dato sobre preocupaciones sobre sustancias o toxicología relacionadas identificadas puede agilizar el proceso de decisión si se deben evitar las sustancias relacionadas especificadas. Durante el período ensayado, los tampones de histidina y citrato entre pH 6 y 6,5 mostraron pocos productos de degradación. El tampón de histidina solo usado en este estudio contenía un contaminante que estaba presente en el tampón de histidina en ausencia de NA-1 añadido. Por lo tanto, la identificación de un proveedor de histidina sin dicho contaminante simplificaría el análisis. La Tabla 4 proporciona un resumen de las especies de tampón desde el punto de vista de la estabilidad de NA-1.

Tabla 4. Selección de especies tamponadoras

Ejemplo 3: Determinación de la estabilidad de NA-1 en tampones de histidina y citrato y a diferentes valores de pH con cantidades variables de cloruro de sodio.

El objetivo de este estudio fue demostrar los efectos del cloruro de sodio (NaCI) sobre el pH y la estabilidad de NA-1 en formulaciones líquidas. Las formulaciones de tampón con 1 mg/ml de NA-1 se listan en la Tabla 5, y los resultados para el pH se proporcionan en la Tabla 6. Los datos muestran resultados bastante consistentes durante la duración del estudio. Sin embargo, se produjeron desplazamientos notables en el citrato con la adición de NaCl, donde la capacidad de tamponamiento se vio afectada y el pH disminuyó en ~ 0,2 unidades. Los pH seleccionados de 6,0 y 6,5 están en el límite exterior del rango ideal de tamponamiento del citrato (pH 2,5-5,6), por lo que esto puede causar dificultades con varios aditivos durante el proceso de formulación y debe considerarse cuando se evalúa la solidez de la formulación.

Tabla 5: Formulaciones de tampón para examinar el efecto de la sal en el pH

Tabla 6 : Estabilidad del pH de las formulaciones de NA-1 en condiciones de temperatura de congelación y acelerada

Los resultados indican que la adición de NaCI 200 mM a las disoluciones de NA-1 tamponadas con histidina y citrato no afecta significativamente el pH de las disoluciones si se almacenan durante una semana congeladas o a la temperatura acelerada de 40 °C.

A continuación, examinamos la estabilidad de NA-1 en estas formulaciones cuando se almacenan 1 semana a temperaturas de congelación y aceleradas. La Tabla 7 muestra los resultados del ensayo usando el método de RP-HPLC con un gradiente de m Sa . Los datos también se presentan en las Figuras 2A y 2b . La Figura 2A presenta la estabilidad acelerada de las formulaciones clasificadas de izquierda a derecha (estabilidad baja a alta). La Figura 2B muestra la estabilidad relativa acelerada por el agente de tamponamiento.

Tabla 7. Pureza (Método de MSA), NA-1

Estos resultados indican que la estabilidad de la disolución de NA-1 se mantiene mejor a pH 6,5, y que la adición de NaCl puede ofrecer una ligera mejora en la estabilidad (Figuras 2A y 2B). Debido a la capacidad mejorada de tamponamiento y a la estabilidad comparable del tampón de histidina, especialmente cuando se excluye el contaminante que migra con un tiempo de retención relativo (RRT) de 0,28 (área del contaminante incluida en la tabla anterior, lo que resulta en un valor de estabilidad más bajo para el área del pico de NA-1), la especie de tamponamiento de histidina a pH 6,5 es la mejor formulación para pasar a los estudios de liofilización.

Los vehículos a pH 6,5 son bien tolerados para su administración por IV.

Ejemplo 4: Selección de agentes de carga para NA-1 para formar una torta liofilizada estable

Para identificar los agentes de carga que generarían una buena torta después de la liofilización y mejorar la estabilidad, formulamos varias disoluciones de 20 mg/ml de NA-1 en tampón de histidina 50 mM, agente de carga y NaCl como se describe en la Tabla 8. Para simular el tiempo y las temperaturas de manejo a las que se pueden exponer las formulaciones de NA-1 durante el proceso de liofilización, estas muestras se almacenaron a -20 °C (control) y 40 °C / 75% HR (ensayo), y se analizaron después de una semana de almacenamiento por determinar la pureza por HPLC (método de m Sa ) y pH. Los resultados para la estabilidad del pH se resumen en la Tabla 9, y los resultados para la estabilidad de NA-1 en las diferentes formulaciones líquidas se muestran en la Tabla 10 y la Figura 3.

Tabla 8. Matriz de muestra del agente de carga

Tabla 9. pH, muestras de agente de carga

Tabla 10. Pureza por % de área del pico de NA-1, método de MSA

Resultados de las formulaciones líquidas de agentes de carga sobre la estabilidad de NA-1

El manitol, la trehalosa y el dextrano-40 mantienen el pH en 6,5 bien (Tabla 9) y hay una disminución de la pureza de aproximadamente el 1% (Tabla 10) durante 1 semana como una formación de líquido cuando se almacena a alta temperatura. En términos de la estabilidad química de la disolución de llenado de liofilización de NA-1, el manitol y la trehalosa son agentes de carga preferidos ya que confieren mejor estabilidad a NA-1 que las disoluciones de dextrano-40 (Figura 3).

Ejemplo 5: Análisis térmico de agentes de carga para facilitar el diseño de ciclos de liofilización

Como parte del desarrollo del ciclo de liofilización para el producto farmacológico liofilizado NA-1, las disoluciones de llenado propuestas a partir de la matriz de muestra del agente de carga (Tabla 8) se evaluaron mediante Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC) para las características térmicas, incluyendo la transición vítrea (Tg) en la formulación. Los resultados se listan en la Tabla 11 y las trazas de DSC se incluyen en las Figuras 4A-6B.

Tabla 11. Transiciones vítreas de disoluciones de llenado de liofilización de NA-1

A una concentración de NA-1 de 20 mg/ml, las formulaciones de NA-1 ensayadas mostraron un perfil térmico caracterizado por un amplio evento de fusión con un inicio a baja temperatura. Este fundido extendido enmascaró el evento de cristalización que se observa típicamente en las formulaciones de manitol, y puede indicar que se debe realizar un ciclo de liofilización robusto donde el producto nunca supera la temperatura de transición vítrea. En este caso, sobre la base de las transiciones vitreas observadas de la disolución de llenado del producto farmacéutico NA-1, el uso de manitol como un agente de carga requeriría una temperatura de secado primario inferior a -40 °C, el límite típico de factibilidad para un ciclo escalable. En términos de perfiles térmicos, la trehalosa y el dextrano-40 son superiores para su uso como un agente de carga. Sin embargo, dado que la estabilidad de NA-1 en las formulaciones líquidas que contienen trehalosa fue superior a las que contenían dextrano, la trehalosa sería el agente de carga preferido de los ensayados.

Debido a las temperaturas relativamente bajas de Tg que probablemente requerirían un ciclo de liofilización más largo para secarse, observamos un rango más amplio de agentes de carga estándar y tratamos de reducir el volumen de llenado en el sistema de cierre del contenedor para que hubiera un volumen reducido de líquido para liofilizar. En un esfuerzo por disminuir el volumen de llenado y mantener 270 mg/vial, se realizó un estudio de solubilidad de NA-1 en histidina, pH 6,5 y en histidina trehalosa, pH 6,5. Las muestras se analizaron visualmente a 35, 50, 75 y 100 mg/ml. Todas las disoluciones fueron claras a t= 0 y t= 24 horas. Sobre la base de estos datos, podríamos utilizar un volumen de llenado inferior a 3 ml, que al usar una formulación de NA-1 de 90 mg/ml proporcionaría 270 mg en un vial diana. Se puede requerir un amplio rango de cantidades en un vial, pero 270 mg proporcionarían una dosis de 2,6 mg/kg para un paciente de 100 kg. Asumiendo que la concentración de reconstitución diana para la administración al paciente aún sea de 20 mg/ml (pero puede ser de 1 mg/ml a 100 mg/ml), entonces se puede usar un vial de liofilización de 20 ml que contiene 270 mg de NA-1 con un volumen de reconstitución de 13,5 ml. Por lo tanto, los volúmenes óptimos de líquido para la liofilización de NA-1 en el vial serían entre 2,5 ml y 10 ml.

Se ensayó un rango más amplio de agentes de carga antes de avanzar hacia el desarrollo de la liofilización, y las Tg se muestran en la Tabla 12. Los 100 mg/ml de NA-1 en histidina, pH 6,5 también se evaluaron mediante d Sc y los datos se incluyen en la Tabla 12.

Tabla 12. Datos de DSC, Formulaciones

Sobre la base de los datos de DSC en la Tabla 12, hay varias opciones de formulación para productos farmacéuticos tanto activos como placebo. En general, las formulaciones 5 y 11 son las más prometedoras para el producto activo con respecto a la Tg. Cualquier agente de carga puede ser adecuado para su uso en un producto placebo, pero la Formulación 4 (Manitol) tendrá la duración del ciclo más corto si se recuece, y puede ser la más deseable si la apariencia coincide con el activo.

A medida que determinamos una formulación activa óptima, es importante considerar la estabilidad de la disolución, la solidez del ciclo de liofilización y la estabilidad química. La Formulación 5 de la Tabla 12 (Trehalosa) demostró una buena estabilidad de la disolución y estabilidad química del liófilo en condiciones aceleradas (datos mostrados posteriormente), pero requiere un ciclo de liofilización más largo con una configuración de llenado de 13,5 ml. Esta mayor duración del ciclo puede no ser ideal para la fabricación comercial en el futuro, donde es deseable un ciclo más corto. La Formulación 11 de la Tabla 12 (sin un agente de carga, a 100 mg/ml de NA-1) tiene una temperatura de transición vítrea más alta que la Formulación 5, lo que permite un ciclo más cálido y más corto. Además, una disminución del volumen de llenado acortará significativamente el tiempo de operación, ya que habrá menos hielo para sublimar de cada vial.

Ejemplo 6: Estabilidad de NA-1 con diversos agentes de carga, escalas y condiciones de liofilización Estabilidad acelerada del agente de carga

Se liofilizó un pequeño lote de producto farmacéutico NA-1 para evaluar la estabilidad del estado sólido después de 1 semana a 25 °C, 40 °C y 60 °C. NA-1 se formuló a una concentración activa de 20 mg/ml en tres vehículos diferentes. Las muestras se evaluaron para determinar su apariencia, reconstitución, pH, cantidad y pureza por HPLC (método de MSA) en t= 0 y t= 1 semana. El contenido de agua se evaluó en t= 0 solamente.

Todos los productos farmacéuticos NA-1 aparecieron como tortas blancas liofilizadas y se reconstituyeron en menos de 10 segundos a t= 0 y t= 1 semana.

Los vehículos del producto farmacéutico se describen en la Tabla 13 y se listan con los resultados correspondientes de temperatura de transición vítrea y contenido de agua. Los resultados de pH, cantidad de NA-1 y pureza de NA-1 se describen en las Tablas 14-16.

Tabla 13. Matriz de muestra de agente de carga: Tg y % de contenido de agua

Tabla 14. pH, agente de carga escala pequeña de liofilización no. 1

Tabla 15. Cantidad (mg/vial), agente de carga escala pequeña de liofilización no. 1

Tabla 16. Pureza (% de área por HPLC), agente de carga escala pequeña de liofilización no. 1

Los tres agentes de carga, trehalosa, dextrano-40 y trehalosa:dextrano-40, mantienen el pH en 6,5 (Tabla 14) y hay un rango de disminución de la pureza del 0,5-2,5% a 60 °C después de 1 semana (Tabla 15) . Ambos productos farmacéuticos que contienen dextrano-40 y almacenados a 60 °C mostraron un crecimiento en sustancias relacionadas a un tiempo de retención (RT) ~ 6,0. Estas sustancias relacionadas no estaban presentes en las muestras de trehalosa, lo que sugiere que la trehalosa tiene un efecto estabilizador en el producto farmacéutico liofilizado y el dextrano-40 puede causar un producto de degradación específico.

La inclusión de dextrano-40 en el agente de carga permite una temperatura de secado primario más cálida, pero el dextrano-40 como un agente de carga demostró la peor estabilidad. La combinación de trehalosa y dextrano-40 (1:1) da lugar a una temperatura de transición vítrea que es aproximadamente 10 °C más cálida que la trehalosa sola. Sin embargo, parece que la estabilidad a 60 °C es intermedia a las muestras de trehalosa y dextrano solo, de modo que la trehalosa es un agente de carga preferido.

Desarrollo de la formulación de NA-1 liofilizada: Experimento a pequeña escala no. 2

Se liofilizó un pequeño lote de producto farmacéutico NA-1 para evaluar el ajuste de la temperatura de almacenamiento a 5 °C durante el secado primario. NA-1 se formuló a una concentración activa de 27 mg/ml en histidina 50 mM, pH 6,5 y trehalosa 120 mM. Los parámetros del ciclo se resumen en la Tabla 17. Cuatro viales de liofilización de vidrio de 20 ml se llenaron con 10 ml. Se probaron dos viales con sondas de temperatura.

Tabla 17. Pequeña escala 2, desarrollo de la formulación de NA-1

Debido al gran volumen de llenado, es necesario ajustar la temperatura del estante considerablemente más caliente que la temperatura de transición vítrea con el fin de compensar el enfriamiento por evaporación. La temperatura de la disolución durante el secado primario fue a -29 °C, que está cerca de la temperatura de transición vítrea de -28 °C a partir del análisis térmico de DSC.

Estabilidad acelerada del liófilo de 90 mg/ml de NA-1 (Pequeña Escala 3)

Antes de formular la disolución de llenado 3 a pequeña escala, se evaluó el pH de un NA-1 de 90 mg/ml en un tampón (histidina 50 mM, pH 6,5). El pH de la disolución fue de 6,04. Se determinó que con el aumento de la concentración de NA-1, la fuerza de tamponamiento también debía aumentar. Las disoluciones se prepararon a 150 mM, 100 mM, 75 mM y agua y se evaluaron para determinar el pH. Los pH se listan en la Tabla 18. La pequeña escala 3 se formuló en un tampón de histidina 100 mM a pH 6,5, y el pH se reajustó a 6,5 después de la adición de NA-1.

Tabla 18. pH, 90 mg/ml de NA-1 en tampones de histidina, pH 6,5

Se liofilizó un pequeño lote de producto farmacéutico NA-1 para evaluar la estabilidad del estado sólido después de 1 semana de almacenamiento a 25 °C y 60 °C. Se formularon dos formulaciones de 90 mg/ml de NA-1 (tampón y tampón con trehalosa). Las muestras se evaluaron para determinar su apariencia, reconstitución, contenido de agua y pureza por HPLC (método de MSA) en t= 0 y t = 1 semana.

Todos los productos farmacéuticos NA-1 aparecían como tortas blancas liofilizadas. Algunas tortas estaban agrietadas. Las formulaciones de placebo fueron visualmente similares a las formulaciones activas.

El tiempo de reconstitución fue de aproximadamente 1,5 minutos en comparación con menos de 10 segundos en las formulaciones anteriores. El tiempo de reconstitución incrementado se debe lo más probablemente a las concentraciones incrementadas de NA-1 e histidina. Los ensayos adicionales mostraron una buena estabilidad de NA-1 con concentraciones de tampón de histidina de 50 y 75 mM, con tiempos de resuspensión más cortos. Además, debido al tamaño del vial de 2 ml usado para este estudio, solo se añadió 1 ml de agua al liófilo. El volumen de reconstitución real es de 4,5 ml en esta configuración a pequeña escala. El tiempo de reconstitución probablemente mejorará cuando se use un mayor volumen de diluyente.

Los viales se pusieron en estabilidad a 25 °C y 60 °C y se ensayaron después de 1 semana de almacenamiento.

Sobre la base de los datos de la apariencia visual, la muestra de trehalosa proporcionó una torta más elegante. El ciclo de liofilización se realizó de forma conservadora durante 5 días, con una temperatura de secado primario de -32°. Sobre la base de los datos de la sonda de temperatura, el ciclo se puede acortar, lo que demuestra que con la mayor concentración y el menor volumen de llenado, el ciclo optimizado será más corto.

Los resultados de pureza se resumen en la Tabla 19.

Tabla 19. Pureza (% de área por HPLC), pequeña escala 3

Sobre la base de estos datos de estabilidad acelerada, la trehalosa demuestra un efecto estabilizador en la formulación de NA-1 que mejora la estabilidad química del liófilo. Es sorprendente que la trehalosa sea capaz de conferir este efecto estabilizador, mientras que otros agentes de carga estándar, tales como el dextrano y el manitol usados para otros péptidos, no lo hacen.

El volumen de llenado reducido minimiza el enfriamiento por evaporación competitivo de los viales circundantes y minimiza la resistencia al agua de sublimación.

Desarrollo del ciclo de liofílización - Pequeña escala 4 (Placebo y activo)

Se inició la pequeña escala 4 del desarrollo del ciclo de liofilización para ensayar la apariencia de la torta y las condiciones de liofilización para un llenado de 3 ml. Las muestras ensayadas fueron His 100 mM, pH 6,5 con trehalosa 120 mM y 90 mg/kg de NA-1 o una muestra idéntica eliminando la trehalosa. Se realizó un ciclo conservador de 4 días como se describe en la Tabla 20. Los viales de placebo y activos se incluyeron con una configuración de llenado de 3 ml en un vial de liofilización de vidrio de 20 ml en lugar de los pequeños viales usados para los experimentos anteriores. Se usó una sonda de temperatura activa para confirmar la temperatura durante el ciclo de liofilización. Los viales activos resultantes se muestran en la Figura 7A.

Tabla 20. Parámetros de liofilización para la pequeña escala 4

La formulación a 90 mg/ml en un vial de 20 ml formó una torta elegante en un ciclo de 4 días, y los datos de la sonda de temperatura sugirieron que el ciclo podría acortarse a 3 días.

El contenido de agua para el placebo y activo fue el 0,01% y 0,00%.

Desarrollo del ciclo de liofilización - Pequeña escala 5 (Placebo y activo)

Se realizó una pequeña escala 5 para observar el desarrollo de un vial de placebo concordante para los ensayos clínicos y para observar los tiempos de resuspensión para formulaciones a una escala comercial potencial (270 mg/vial). Se evaluaron 10 formulaciones de placebo y 1 formulación activa para determinar la apariencia y el tiempo de reconstitución. Las tortas activas eran elegantes, tortas blancas con una contracción menor que dieron lugar a una grieta alrededor de la superficie de la pared del vial. Las tortas de placebo eran blancas con más grietas en las tortas que contenían cantidades crecientes de trehalosa.

Los viales fueron reconstituidos con 13,5 ml de agua. El tiempo para la disolución se lista en la Tabla 21. El liófilo activo se resuspendió inmediatamente, pero estuvo turbio durante 17,6 segundos antes de convertirse en una disolución clara e incolora. Todos los placebos eran una disolución clara e incolora.

Tabla 21. Reconstitución de placebo y activo (SS5)

Sobre la base de la estabilidad, los tiempos de resuspensión y los tiempos de liofilización, una formulación comercial preferida para NA-1, la preliofilización, sería histidina 20-100 mM, trehalosa 120 mM, pH 6,5. Las concentraciones de trehalosa se pueden aumentar sin perder la estabilidad o la elegancia de la torta, pero sí los tiempos de resuspensión.

Examen del aumento de la trehalosa en la formación de la torta y concordancia con placebo por la apariencia visual y el tiempo de resuspensión.

Para concordar mejor con un placebo, se ensayaron concentraciones variadas de trehalosa con y sin NA- ', y en volúmenes de llenado de 3 o 5 ml.

En primer lugar, se resumirán las formulaciones activas y las formulaciones de placebo. Después, se destacarán las concordancias visuales principales para el llenado de 3 ml y el llenado de 5 ml. Actualmente se están analizando muestras analíticas (disolución de llenado y una muestra de potencia). Las Tablas 22 y 23 muestran un subconjunto de las formulaciones ensayadas.

Tabla 22. Formulaciones activas

La Figura 7B muestra la apariencia de las formulaciones activas listadas anteriormente.

Tabla 23. Formulaciones de placebo

La Tabla 24 muestra las condiciones del ciclo de liofilización para las muestras anteriores

Tabla 24. Parámetros del ciclo

Tabla 25. Resumen de las concordancias principales

Ejemplo 7: Estabilidad de 270 mg de NA-1 liofilizados en tampón de histidina 20 mM, pH 6,5 y trehalosa 120 mM

Preparación del producto farmacéutico liofilizado

Se formuló un pequeño lote de producto farmacéutico NA-1 a 90 mg/ml en histidina 20 mM, pH 6,5 y trehalosa 120 mM, y se liofilizó para evaluar la estabilidad del estado sólido después de 4 semanas a -20 °C, 40 °C y 60 °C. La Tabla 25 muestra las condiciones de liofilización.

Tabla 25: Condiciones del ciclo de liofilización para el Ejemplo 7

Las muestras se almacenaron en hornos a temperatura constante y la pureza, la potencia y el tiempo de reconstitución en 13,2 ml (para un volumen final de 13,5) se evaluaron a 0, 1, 2 y 4 semanas. Los datos para cada temperatura y tiempo de almacenamiento se presentan en las Tablas 26A-C.

Tabla 26A: Estabilidad a -20 °C

Tabla 26B: Estabilidad a 40 °C

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación preliofilizada que consiste en TAT-NR2B9c (SEQ ID NO: 6), histidina y trehalosa a un pH de 6-7, en donde el TAT-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la histidina está en una concentración de 15­ 100 mM, y la trehalosa está en una concentración de 80-160 mM, que después de la liofilización da como resultado una formulación liofilizada, que es estable a 20 °C durante al menos seis meses.

2. La formulación preliofilizada de la reivindicación 1, en donde el TAT-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la histidina está en una concentración de 20-100 mM y la trehalosa está en una concentración de 100­ 140 mM.

3. La formulación preliofilizada de la reivindicación 1, en donde el Tat-NR2B9c está en una concentración de 70-120 mg/ml, la concentración de histidina es 20-50 mM y la concentración de trehalosa es 100-140 mM.

4. La formulación preliofilizada de la reivindicación 1, en donde la concentración de histidina es 20 mM y la concentración de trehalosa es 100-200 mM, preferiblemente 120 mM y la concentración de TAT-NR2B9c es 90 mg/ml.

5. Una formulación liofilizada preparada mediante liofilización de la formulación preliofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un método para preparar una formulación, que comprende almacenar una formulación liofilizada según la reivindicación 5 durante al menos una semana a temperatura ambiente; y reconstituir la formulación liofilizada.

7. El método de la reivindicación 6, que comprende además diluir adicionalmente la formulación reconstituida en disolución salina normal.

8. Una formulación liofilizada según la reivindicación 5, para uso en el tratamiento de accidente cerebrovascular o lesión traumática en el SNC, hemorragia subaracnoidea o de un paciente en reparación endovascular por un aneurisma.