ES2733025T3

ES2733025T3 - Método para producir mutantes de levadura y su utilización

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Publication number: ES2733025T3
Application number: ES16703117T
Authority: ES
Inventors: Jürgen Fröhlich; Jürgen Eck; Guido Meurer; Christian Naumer; Jörg Büscher; Jörg Mampel
Original assignee: BRAIN Biotechnology Research and Information Network AG; Erbsloeh Geisenheim GmbH
Current assignee: BRAIN Biotech AG; Erbsloeh Geisenheim GmbH
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2019-11-27
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: US20180016543A1; BR112017017120A2; WO2016128296A1; AU2016218052A1; DK3256567T3; ZA201705565B; CA2973776A1; CL2017002056A1; CN107820517A; EP3256567B1; RU2017128466A3; EP3256567A1; RU2017128466A

Abstract

Método para producir mutantes de levadura, en donde por lo menos una cepa de levadura es contactada en un primer paso de mutagénesis con un primer mutágeno y, en un segundo paso de mutagénesis con un segundo mutágeno, caracterizado por que - siendo el primer y segundo mutágenos diferentes uno del otro y siendo seleccionados del siguiente grupo: agente nucleótido-alquilante, agente nucleótido-desaminante y radiación UV, y - siendo un primer paso de selección realizado entre el primer y segundo pasos de mutagénesis y siendo un segundo paso de selección realizado después del segundo paso de mutagénesis, en el cual los mutantes resultantes del paso de mutagénesis anterior se exponen a un factor de selección escogido de los siguientes grupos: (a) Medio hipertónico y (b) Inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol. en el que uno de los factores de selección se selecciona del Grupo (a) y uno de los factores de selección del Grupo (b).

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir mutantes de levadura y su utilización

La presente invención se refiere a un método para producir mutantes de levadura durante el cual, por lo menos una cepa de levadura toma contacto con un primer paso de mutagénesis con un primer mutágeno y se contacta en un segundo paso de mutagénesis con un segundo mutágeno, y a levaduras producidas por este método y a un uso de tales levaduras.

En años recientes, las temperaturas en muchas regiones de cultivo de vinos durante el período de maduración de la uva de vino han aumentado bruscamente, lo cual además ha hecho aumentar el contenido de azúcares de las uvas maduradas de esta manera. En el caso de la fermentación etanólica usada para producir vino, esta azúcar en particular glucosa, se convierte en etanol como el producto de fermentación predominante a través del uso de cepas de levadura. En años recientes, en el caso de la fermentación etanólica para la producción de vinos, ha surgido el problema de que como resultado del contenido aumentado de glucosa en las uvas, se han producido vinos que presentaron un contenido elevado de alcohol. Los consumidores no desean tal contenido elevado de alcohol, aunque, como incluso en diferentes cosechas los consumidores prefieren el contenido de alcohol en vinos individuales que sea tan consistente como sea posible. Además la demanda para los vinos con un menor contenido de alcohol recientemente ha aumentado. Más aún, el etanol en los vinos representa un componente, el cual por una parte, es necesario y deseable, sin embargo, en el caso de un contenido elevado, lleva a que sufra la calidad en el sabor del vino. Altas concentraciones de glicerol, por ejemplo, más de 10 g/l, tienen un efecto positivo en las propiedades del sabor del vino.

Un intento para proveer estas propiedades consiste en usar levaduras conocidas, las cuales producen menos etanol para la misma cantidad de azúcar en mosto. Algunas de estas levaduras son conocidas, particularmente para la producción de vinos de alta calidad, sin embargo, es deseable tener una selección de diferentes levaduras disponibles, las cuales, en vez de etanol, producen otras substancias secundarias que pueden influir substancialmente en las propiedades de sabor de un vino.

Intentos para producir tales levaduras en particular, comprenden la modificación genética intencional y el cultivo convencional y los procesos de selección en base al cultivo convencional. Un ejemplo de tales métodos para producir levaduras con las propiedades deseadas se describe en WO 2011/080411. Una desventaja de los organismos específicamente modificados en forma genética es que los consumidores son muy escépticos con estos organismos. Los métodos de cultivo y los métodos en base al cultivo convencional y los procesos puros de selección, también pueden ser factibles, sin embargo, son métodos extremadamente prolongados y en consecuencia muy costosos. De manera alternativa, las levaduras salvajes también están aisladas y las propiedades deseadas están probadas. Tal aislación se describe en EP 2634247 B1. Este proceso también es muy costoso y su éxito es incierto.

En este contexto, el objetivo de la invención consiste en preparar levaduras que produzcan un menor contenido de etanol y un mayor contenido de glicerol durante la fermentación etanólica para un contenido dado de azúcar, que una cepa antes mencionada y que puede ser obtenida en forma simultánea rápidamente.

Este objetivo se logra por un método del tipo antes mencionado, en donde el primer y segundo mutágenos difieren uno del otro y son seleccionados a partir del siguiente grupo: agente nucleótido-alquilante, agente nucleótidodesaminante y radiación UV, y se ejecuta un primer paso de selección entre el primer y el segundo paso de mutagénesis y se ejecuta un segundo paso de selección después del segundo paso de mutagénesis, en donde los mutantes que resultan del paso de mutagénesis respectivo precedente, están expuestos a un factor de selección, el cual se selecciona de los siguientes grupos: (a) medio hipertónico y (b) inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol. Se ha podido apreciar que en un método tal, durante el cual se ejecutan dos pasos de mutagénesis, en donde un paso de selección se ejecuta en forma adicional después de cada paso de mutagénesis, se producen levaduras, las cuales por una parte proveen un menor contenido de etanol durante la fermentación alcohólica para una concentración dada de azúcar, que la cepa inicial usada y, por otra parte produce una mayor concentración de glicerol bajo las mismas condiciones. Ambas tienen un efecto positivo en el sabor de un vino producido usando tal levadura.

El término “levadura” cómo se usa aquí, de preferencia se refiere a levaduras del género Saccharomyces, particular y preferiblemente a las especies Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces bayanus. Estas además incluyen subespecies tales como la Saccharomyces cerevisiae subespecie bayanus.

De preferencia se usan cepas de levaduras diploides como la cepa antes mencionada para el primer paso de mutagénesis en el método de acuerdo a la invención. En el caso de las mutaciones realizadas, no se pierde el diploide, de modo tal que la levadura mutante finalmente producida, también sea diploide. Una ventaja de las levaduras diploides es que sus propiedades permanecen comparativamente estables para las generaciones y, por lo tanto, son particularmente adecuadas como levaduras puras. Sin embargo, precisamente esta propiedad conduce a una mutación no específica, gatillada por ejemplo por agentes de radiación o mutagénicos, que parece no ser significativa. Ahora sorprendentemente se ha observado que al combinar simplemente tales medios para una mutación no específica, principalmente los agentes nucleótidos-alquilantes, agentes nucleótidos-desaminantes o de radiación UV junto con una selección y mutación repetida y, otra selección hace que se produzcan mutantes de levadura con propiedades deseadas, principalmente una producción de etanol reducida y de glicerol aumentada. El término “agente nucleótido-alquilante” describe una substancia que forma un enlace covalente entre los grupos alquilo y las bases de ADN. Tales bases modificadas pueden conducir a emparejamientos erróneos de base y, por lo tanto, a mutaciones puntuales. Se conocen numerosas substancias, las cuales producen tal alquilación.

El término “agente nucleótido-desaminante” describe una substancia que separa los grupos amino de las bases de ADN. Tal separación también causa emparejamientos erróneos de base, es decir, mutaciones puntuales. Se conocen numerosas substancias que causan tal desaminación.

El término “radiación UV” como se usa aquí se refiere a la radiación electromagnética en el rango de longitud de onda de 400 nm a 100 nm y, en particular, a la radiación UV-C en un rango de longitud de onda de 200 nm a 100 nm. Se prefiere un rango de longitud de onda de 280 nm a 240 nm, en particular 254 nm. Una intensidad de radiación preferida comprende entre 1000 pJ/cm2 y 3000 pJ/cm2, particular y preferiblemente 2000 pJ/cm2. El efecto de tal radiación en el ADN produce la formación de dímeros de pirimidina, en particular, dímeros de timina. Estos dímeros influyen en la estructura tri-dimensional del ADN y bloquean la polimerasa del ADN durante la replicación. Como se usa aquí el término “medio hipertónico” se refiere a un medio que contiene una substancia osmóticamente activa, incluyendo una sal, azúcar o alcohol de azúcar, en una concentración que produce una osmolaridad de más de 308 mOsmol/l. El medio está presente en forma líquida o en una forma solidificada a través de la adición de agar. Las substancias osmóticamente activas adecuadas son conocidas por aquellas personas entendidas en la materia. Un “inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol” es una substancia que es capaz de inhibir la enzima de la deshidrogenasa del alcohol, es decir, para bloquear su actividad de modo tal que no más acetaldehído sea convertido por la enzima que actúa como el catalizador para convertir el acetaldehído en etanol en levadura. El inhibidor de por sí no es convertido. Numerosas substancias que tienen esta propiedad son conocidas por aquellas personas entendidas en la materia.

En una realización, se lleva a cabo un paso exhaustivo de prueba, en el cual los mutantes de levadura obtenidos en el método son probados y seleccionados para determinar si estos producen más glicerol y menos etanol durante la fermentación etanólica, que la cepa de levadura antes mencionada usada bajo las mismas condiciones.

Se deberá comprender que las mismas condiciones significan que los mutantes de levadura y la cepa de levadura antes mencionados usados son incubados en el mismo medio, en la misma atmósfera y a la misma temperatura, en forma tan simultánea como sea posible y entonces se determina la concentración de glicerol y de etanol. Métodos adecuados para determinar la concentración de glicerol son conocidos por aquellas personas entendidas en la materia. Los medios usados para el paso de prueba son preferiblemente seleccionados del mosto de uva obtenido de las uvas de vino y, un medio de mosto artificial que imita las condiciones de un mosto de uva. Varios de tales medios de mosto artificial son conocidos por aquellas personas entendidas en la materia.

En una realización, el agente nucleótido-alquilante se selecciona a partir de lo siguiente: sulfato dimetil (DMS), metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (MNNG), metilnitrosocianamida (MNC), metilnitrosourea (MNU) y metiltransferasas de ADN. Se sabe que todas estas substancias alquilizan las bases de ADN y se reconoce que estas son especialmente adecuadas para mutagénesis en el caso de la Saccharomyces cerevisiae y la Saccharomyces bayanus. Para el método de acuerdo con la invención, preferiblemente se usa metanosulfonato de etilo (EMS).

En una realización, el agente nucleótido-desaminante se selecciona a partir de lo siguiente: sal de nitrito inorgánica, sal de nitrito orgánica y ácido nitroso. Se ha visto que estos agentes nucleótido-desaminantes crean una condición suficientemente mutagénica para la mutación de la Saccharomyces cerevisiae y la Saccharomyces bayanus, las cuales por otra parte, sin embargo, facilitan su sobrevivencia. Un nitrito de sodio se usa preferiblemente para el método de acuerdo con la invención.

En una realización, el primer mutágeno es un agente nucleótido-alquilante o un agente nucleótido-desaminante. Se ha visto que bajo estas condiciones, un mayor número de mutantes de levadura pueden obtenerse después del primer paso de mutagénesis y el paso de selección, los cuales pueden usarse para otras mutagénesis.

En una realización, el primer mutágeno es un agente nucleótido-alquilante y el segundo mutágeno es un agente nucleótido-desaminante o radiación UV. Fue posible obtener particularmente grandes cantidades de mutantes de levadura, las cuales se pueden usar en un segundo paso de mutagénesis a través de la combinación especial de un agente nucleótido-alquilante como primer mutágeno. El segundo mutágeno es preferiblemente un agente nucleótidodesaminante.

En una realización, el medio hipertónico se obtiene por la adición de una de las siguientes substancias: cloruro y sulfato de sodio, de potasio, de magnesio, de calcio y de azúcar, incluyendo fructosa y glucosa, y alcoholes de azúcar, incluyendo sorbitol y manitol. Aquellas personas entendidas en la materia sabrán que en el contexto de las levaduras, el término hipertónico se refiere al hecho de que la solución acuosa hipertónica tiene una presión osmótica mayor que el citoplasma de levadura, es decir, esta tiene una osmolaridad de más de 308 mOsmol/l. Se prefiere una osmolaridad en el rango de 500 a 700 mOsmaol/l.

En una realización, el inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol se selecciona a partir de los siguientes: pirazol, 3-metilpirazol, 4-metilpirazol y ácido acetilsalicílico. Se ha visto que estos inhibidores de la deshidrogenasa del alcohol son particularmente adecuados para la selección de la levadura, incluyendo la Saccharomyces cerevisiae y la Saccharomyces bayanus, para lo cual se desea una producción reducida de etanol. El uso de pirazol es particularmente preferido.

En una realización, uno de los factores de selección se escoge del Grupo (a) y uno de los factores de selección se escoge del Grupo (b). En el método de acuerdo a la invención, se pueden producir más mutantes al combinar dos factores diferentes de selección, los cuales tienen mejores propiedades con respecto a una producción reducida de etanol y a una mayor producción de glicerol.

En una realización, el primer factor de selección se escoge del Grupo (a) y el segundo factor de selección se escoge del Grupo (b).

En otra realización, el primer factor de selección se escoge del Grupo (b) y el segundo factor de selección se escoge del Grupo (a).

En una realización, se lleva a cabo un paso de prueba después del primer paso de selección, durante el cual los mutantes de levadura intermedios obtenidos después del primer paso de selección, son probados para ver si estos producen más glicerol durante una fermentación etanólica bajo las mismas condiciones que las usadas por la cepa de levadura antes mencionada, en donde solamente tales mutantes de levadura intermedios a los cuales esto aplica, son sometidos al segundo paso de mutagénesis y al segundo paso de selección.

También se prueba preferiblemente si los mutantes intermedios que producen más glicerol también producen menos etanol durante la fermentación etanólica que la cepa de levadura usada antes mencionada, en donde solamente tales mutantes de levadura intermedios que producen más glicerol y menos etanol, son sometidos al segundo paso de mutagénesis y al segundo paso de selección.

Se deberá comprender que las mismas condiciones significan que los mutantes de levadura intermedios y la cepa de levadura usada antes mencionada son incubados en el mismo medio, en la misma atmósfera y a la misma temperatura en forma tan simultánea como sea posible y, posteriormente se determina la concentración de glicerol y preferiblemente también la de etanol. Métodos adecuados para determinar la concentración de glicerol y para determinar la concentración de etanol, son conocidos por aquellas personas entendidas en la materia.

El objetivo antes mencionado además se logra por un mutante de levadura obtenido de acuerdo con un método descrito anteriormente y depositado con el Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMbH bajo el número de acceso DSM 29822. Esta es una designación taxonómica de la Saccharomyces cerevisiae subespecie bayanus: la Saccharomyces cerevisiae. El signo de referencia usado por el solicitante es NP12B8 o aquí también Nitrite Pyra 12 B8 o NO2Pyra12B8.

La cepa se propaga en un medio con 10 gramos de extracto de levadura, 10 gramos de Bacto Peptona, 5 gramos de NaCl para producir 1 litro con H²O y cuyo valor de pH se establece en 7. Para esto, el medio se esteriliza durante 20 minutos a 121° C y después de esterilizar el valor del pH, queda entre 6 y 7. La propagación se lleva a cabo en forma aeróbica a una temperatura de 30° C. La incubación se lleva a cabo durante 24 horas.

Cuando el mosto de las uvas Riesling, las cuales tienen un peso de mosto de 90° Oe (21,6% de Brix) obtenido por la chaptalización, con un valor NOPA de 107 mg/ml (+/- 5 mg/l), para una dosis de levadura de 4 x 106/ml después de 35 días a una temperatura de fermentación de 15-25° C, este mutante de levadura produce un vino con las siguientes proporciones de etanol, de glucosa, de fructosa, de ácido succínico y de glicerol.

Etanol:90-106 g/l

Glucosa:0,18-0,42 g/l

Fructosa:0,95-5,55 g/l

Acido succínico:2-5 g/l

Glicerol:10-16 g/l

Este mutante de levadura además se caracteriza por el hecho de que este tiene el perfil de ADN característico mostrado en la Figura 4 descrito en un procedimiento de verificación en DE 102006022569, el cual generalmente se describe allí por los microorganismos, usando los primers A-not, C-not, G-not, T-not descritos allí en una primera reacción de la PCR y el uso de los primers T-not-A, T-not-T, T-not-G descritos allí en una segunda reacción de la PCR y la posterior electroforesis de gel, también descrita en DE 102006022569.

En el proceso “NO2Pyra12B8” indicado en la Figura 4, la levadura depositada con el Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMbH bajo el número de acceso DSM 29822, “O. Freddo” designa la cepa Saccharomyces cerevisiae subespecie bayanus LW 317-30, la cual está disponible en el mercado a lo largo del mundo bajo la designación “OenofermFreddo F3” y “Neg. control” designa una muestra que no contuvo ADN. La GeneRuler DNA Ladder Mix de Thermo scientific (Fermentas) se usó como estándar de longitud.

El problema descrito inicialmente también se resuelve por un mutante de levadura obtenido de acuerdo con un método descrito anteriormente, en donde cuando se fermenta el mosto a 90° Oe (21,6% de Brix) y un valor NOPA = 107 mg/l (+/- 5mg/l) con una dosis de 4 x 106/ml, después de 35 días a una temperatura de fermentación de 15-25° C, el mutante produce un vino con las siguientes proporciones de etanol y de glicerol:

Etanol70-150 g/l

Glicerol10-20 g/l

El problema antes mencionado además se resuelve por el uso de un mutante de levadura obtenido de acuerdo con el método descrito anteriormente o el mutante de levadura depositado con el Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMbH bajo el número de acceso DSM 29822, o un mutante de levadura obtenido de acuerdo con un método descrito anteriormente, en donde cuando se fermenta el mosto a 90° Oe (21,6% de Brix) y un valor NOPA = 107 mg/l (+/- 5 mg/l) con una dosis de 4 x 106/ml, después de 35 días a una temperatura de fermentación de 15-25° C, la levadura produce un vino con las siguiente proporciones de etanol y de glicerol:

Etanol70-150 g/l

Glicerol10-20 g/l

en un método para la producción de una bebida alcohólica.

En una realización, el uso es tal que la bebida alcohólica se produce del mosto de uva. Se deberá entender que este comprende tanto el uso para la producción de una bebida alcohólica a partir del mosto de uvas blancas y rojas, incluyendo el mosto blanco obtenido a partir de uvas rojas por el método saignée (blanc de noir) y las versiones rosé de estas.

Otras ventajas, características y aplicaciones potenciales de la presente invención son claras a partir de la siguiente descripción de las realizaciones y de los ejemplos preferidos.

Figura 1:Diagrama de mutagénesis y pasos de selección

Figura 2:Progreso de la fermentación después de una primera mutagénesis y de un primer paso de selección Figura 3:Progreso de la fermentación después de una segunda mutagénesis y de un segundo paso de selección Figura 4:Perfil del ADN del mutante de levadura depositado bajo el número de acceso: DSM29822

Ejemplos

Se realizaron varias pruebas de mutación para producir mutantes de levadura, los cuales producen una baja concentración de etanol y una mayor concentración de glicerol en un vino o en un medio, a una concentración especificada inicial de glucosa.

Pruebas preliminares

En las pruebas iniciales realizadas usando bromuro de etidio, el cual produce mutaciones a través de cambios de marcos, fue posible mostrar que en el proceso solamente unas pocas levaduras viables pudieran producirse, las cuales están en particular comprometidas con respecto a su cadena respiratoria y parecen mostrar cambios generales en el ADN mitocondrial. Tales levaduras no son adecuadas para una fermentación.

Además fue posible mostrar que un uso repetido del mismo mutágeno conduce a sólo unos pocos o a ningún mutante de levadura, que se obtienen después del segundo paso de mutagénesis y de la posterior selección.

Se realizaron los esquemas de mutagénesis mostrados en la Figura 1, en donde “++” significa que se obtuvieron más de 100 mutantes de levadura con las propiedades deseadas, “+” significa que se obtuvieron entre 1 y 99 mutantes de levadura con las propiedades deseadas, “-“ significa que no se obtuvieron mutantes de levadura con las propiedades deseadas y “0” significa que no se obtuvo ningún mutante de levadura. Por propiedades deseadas se entiende aquí que los mutantes producen más glicerol y menos etanol durante una fermentación etanólica, que la cepa de levadura antes mencionada usada bajo las mismas condiciones.

Fue posible determinar durante las fermentaciones de prueba que la producción de glicerol se lleva a cabo en general de inmediato después de comenzar la fermentación y habitualmente dura hasta 10 días. La mayoría del glicerol se produce por la fermentación de los primeros 100 gramos de azúcar por litro del medio, de allí en adelante la producción de glicerol decae, sin embargo, en principio no se detiene por completo.

En contraste, se ha observado que la fermentación etanólica que produce etanol dura hasta tres semanas, de modo tal que la fermentación etanólica y la producción de glicerol se superponen levemente durante la fermentación. Los diferentes pasos de mutagénesis y/o de selección y los métodos de prueba se explican más adelante en detalle. Información general

Se seleccionaron los pasos de mutagénesis y de selección de modo tal que estos estén basados en el método de producción para vinos.

Después de la primera mutagénesis y de la primera selección, 10.000 mutantes se seleccionaron y probaron para su producción de glicerol. De los 10.000 mutantes estudiados de esta manera, se seleccionaron 400, los cuales tenían la mayor concentración de glicerol y se probaron nuevamente para su producción de glicerol.

Los mutantes que tienen una mayor producción de glicerol reproducible se sometieron a una fermentación de vino a pequeña escala y luego se analizaron en forma organoléptica. También se llevó a cabo la determinación de etanol. Los mutantes con el mejor perfil organoléptico, la mayor producción de glicerol, la menor concentración de etanol y la mejor capacidad de fermentación se seleccionaron para el segundo paso de mutagénesis. En el proceso, el perfil organoléptico se determinó en forma subjetiva al probar y evaluar la nota oxidativa, la acidez, el amargor y la impresión general. La capacidad de fermentación sobreviene de la velocidad de fermentación, medida por una pérdida de peso durante la fermentación y de la duración de la fermentación, hasta que se consuma el azúcar presente, en particular, la glucosa.

Un mutante se consideró adecuado cuando este hubo convertido 70% del azúcar presente después de 35 días. Paso de mutagénesis con un agente nucleótido-alquilante

Se usó metanosulfonato de etilo (EMS) como el agente nucléotido-alquilante. Se inoculó una colonia de una cepa de levadura desde placas de agar en 5 ml de medio YPD y se cultivó durante la noche a 28° C. Entonces las células fueron peletizadas por centrifugación y lavadas dos veces con 100 mM de tampón de fosfato de potasio con un valor de pH 7. Entonces las células fueron resuspendidas en 10 ml de un tampón de fosfato de potasio de 100 mM a un valor de pH 7. Se agregaron 37,5 pl de EMS puro a 500 pl de la suspensión celular. Se incubó la suspensión durante una hora a 30° C en un agitador. Se detuvo la reacción por la adición de 1 ml de 5% de tiosulfato de sodio (% por peso). Las células de levadura entonces se lavaron una vez con una solución acuosa al 5% de tiosulfato de sodio. Después de la centrifugación, se resuspendió el pellet en 500 pl de medio YPD.

Paso de mutagénesis con un agente nucleótido-desaminante

Se usó nitrito de sodio como un agente nucleótido-desaminante. Se inocularon las colonias de cepas de levadura desde las placas de agar en un medio YPD de 5 ml y se cultivaron durante la noche a 28° C. Las células se peletizaron por centrifugación y se lavaron dos veces con 2 ml de agua. Después del lavado, se resuspendieron las células en una mezcla de 2 ml de agua, 2 ml de 0,6 M de un tampón de acetato de sodio con un pH de 4,5 y 2 ml de una solución de 55 ml de nitrito de sodio. Se incubó la suspensión celular en un agitador durante 8 minutos a 30° C. Después de la incubación, se mezcló 1 ml de la suspensión con 9 ml de un tampón de 0,67 M de fosfato de potasio con un valor de pH 7, para detener la reacción.

Paso de mutagénesis con radiación UV

Se inocularon las colonias de cepas de levadura desde placas de agar en 5 ml de medio YPD, el cual contuvo 0,3 M de cloruro de sodio y se cultivaron durante la noche a 28° C. Se peletizaron las células por centrifugación y se lavaron una vez en 10 ml de medio KP sin glucosa y fructosa, y se resuspendieron. Se midió la densidad óptica (DO) a 600 nm y se diluyó la suspensión a una densidad óptica de 0,025 y se transfirió a una placa de Petri. La suspensión celular en la placa de Petri entonces se irradió con radiación UV de longitud de onda de 254 nm a una intensidad de 2000 pJ/cm2 durante 45 segundos en un Hoefer UVC 500 Reticulante.

Paso de selección con inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol

Se usó pirazol para la selección con un inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol.

Para este paso de selección, las células de levadura obtenidas de un paso de mutación fueron esparcidas sobre placas con medio KP, el cual además contuvo 5 g/l de pirazol, en donde aproximadamente 2.000 a 3.000 células fueron transferidas a una placa que medía 30 x 30 cm. Se incubaron las placas durante 10 días a 18° C bajo condiciones microaerofílicas. Las condiciones microaerofílicas indican que la mezcla de gas (atmósfera) que rodea las placas tenían solamente de 2 a 10% por volumen de oxígeno, en lugar del 20% por volumen de oxígeno que, de otra forma, es normal para el aire.

Paso de selección con medio hipertónico

En este paso de selección, se usó cloruro de sodio para producir el estrés osmótico. Las células de levadura obtenidas de un paso de mutagénesis se transfirieron a las placas con medio KP, el cual además contuvo 17,52 g/l de cloruro de sodio, en donde aproximadamente 2.000 a 3.000 células se aplicaron a una placa que medía 30 x 30 cm. En general se asume que los mutantes que tienen una ventaja de crecimiento en el medio hipertónico, producen más glicerol. Se incubaron las placas durante 10 días a 18° C bajo condiciones microaerofílicas. Las condiciones microaerofílicas indican que la mezcla de gas (atmósfera) que rodea las placas tenía solamente de 2 a 10% por volumen de oxígeno, en lugar del 20% por volumen de oxígeno, lo cual de otro modo, es normal para el aire.

Medios

El medio KP usado, un medio que además está indicado como mosto artificial, el cual se usó, inter alia, para los pasos de selección, contuvo 115,5 gramos de monohidrato de glucosa, 105 gramos de fructosa, 3 gramos de ácido tartárico, 0,3 gramos de ácido cítrico, 0,3 gramos de ácido málico, 0,3 gramos de (NH^SO ⁴, 2 gramos de KH²PO⁴, 0,2 gramos de MgSO⁴x 7 H²O, 4 mg de MnSO⁴x H²O, 4 mg de ZnSO⁴x 7 H²O, 0,5 mg de CuSO⁴x 5 H²O, 0,5 mg de Kl, 0,2 mg de CoCl²x 6 H²O, 0,5 mg de (NH⁴)⁶MozO²⁴, 0,5 mg de H³BO³, 300 mg de mioinositol, 1 mg de ácido nicotínico, 1 mg de pantotenato de calcio, 1 mg de hidrocloruro de piridoxina, 0,04 mg de biotin, 1 mg de ácido paminobenzoico, 247 mg de L-glutamina, 183 mg de L-arginina, 87,7 mg de L-triptofano, 71 mg de L-alanina, 58,9 mg de ácido L-glutámico, 38,4 mg de L-serina, 37,1 mg de L-treonina, 23,7 mg de L-leucina, 21,8 mg de ácido L-aspártico, 21,8 mg de L-valina, 18,6 mg de L-fenilalanina, 16 mg de L-isoleucina, 16 mg de L-histidina, 15,4 mg de L-metionina, 9 mg de L-tirosina, 9 mg de L-glicina, 8,3 mg de L-lysina y 6,4 mg de L-cisteína por litro.

El medio YPD contuvo 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos de peptona y 20 gramos de flucosa por litro y se estableció a un valor de pH de 5,5 a 6,0.

Se agregaron 15 g/l de agar al medio para las placas con el medio descrito.

Investigación de la producción de glicerol

Se inocularon las colonias de levadura desde una placa de agar en el medio YPD para determinar la producción de glicerol. Después de tres días de crecimiento a 30° C, 1 ml del medio KP se inoculó con 20 pl del cultivo producido de esta manera. No hubo ajuste de la densidad de la célula. Entonces los cultivos KP se incubaron a 18° C bajo condiciones microaerofílicas. Después de 10 días, el exceso de cultivo se removió por centrifugación y filtración. El exceso entonces se analizó con respecto a la concentración de glicerol. Se llevó a cabo la determinación de la concentración de glicerol en forma fotométrica. Se usó un kit de R-Biopharm AG para la medición, en donde la prueba se ajustó para la medición en una placa de microtitulación a un volumen de muestra total de 155 pl.

Pruebas de fermentación

Se usó un mosto real para las pruebas de fermentación, no un mosto artificial, en donde se usó una cosecha Riesling 2013 con 70° C Oe (17,1% de Brix) enriquecida por la adición de sacarosa (52 gramos) a 90 ° Oe (21,6% de Brix) con un valor NOPA de 107 mg/l (+/- 5 mg/l).

Para la fermentación, cuyos resultados se muestran en la Figura 2, se usó una cosecha de mosto de Riesling 2013, la cual se enriqueció a 91 ° Oe (21,7% de Brix) y la cual tuvo un valor NOPA de 124 mg/l (+/- 5 mg/l).

El valor medio del pH fue de entre 3,1 y 3,2. En cada caso, la temperatura de fermentación fue de 18° C. Los ensayos de fermentación no se agitaron.

Determinación de glicerol, de etanol, de glucosa y de fructosa producidos y la capacidad total de azúcar/análisis organoléptico/fermentación

El análisis de las fermentaciones de prueba se llevó a cabo por HPLC con los siguientes parámetros:

Equipo: Ultimate 3000 ThermoScientific

Columna REZEX ROA Ácido Orgánico H+ Phenomenex

Detector RI & detector UV a 210 nm

Mezcla solvente: 0,005 N H²SO⁴(isocrática)

Temperatura: 75° C

Tasa de flujo: 0,5 ml/min

El perfil organoléptico, el cual además resulta de la composición del vino, también fue determinado en forma subjetiva por medio de la degustación y evaluación de la nota oxidativa, de la acidez, del amargor y de la impresión general.

La capacidad de fermentación sobreviene de la velocidad de la fermentación, medida por una pérdida de peso durante la fermentación y de la duración de la fermentación, hasta que se consuma el azúcar presente, en particular la glucosa.

Ejemplo 1:

Para determinar los diversos efectos de diferentes estímulos mutagénicos, primero se llevaron a cabo pruebas en las cuales se expuso una cepa Saccaromyces cerevisiae subespecie bayanus a radiación UV, EMS o nitrito de sodio. En el caso de la cepa usada en este ejemplo, fue la cepa de levadura disponible alrededor del mundo bajo la designación “OenofermFreddo F3”.

Esto continuó con la selección, ya sea a través de un medio hipertónico de cloruro de sodio, o en un medio de pirazol.

La Figura 2 muestra los resultados de la investigación de algunas cepas, las cuales resultaron de la mutación con EMS o nitrito de sodio. La Figura 2 muestra en un gráfico, la pérdida de peso durante una fermentación de prueba durante un total de 35 días, en donde el peso total del mosto usado se determinó al pesarla, y los datos de la pérdida de peso se refieren al peso del mosto con la levadura usada originalmente. Mientras mayor sea la pérdida de peso, mejor es la capacidad fermentativa de la cepa respectiva.

La Tabla 1 a continuación muestra los resultados del análisis HPLC de esta fermentación de prueba después de 35 días, en donde dos ensayos de fermentación independientes se investigaron para cada mutante.

Tabla 1:

En la Figura 2 y en la Tabla 1, las levaduras que fueron primero sometidas a un paso de mutagénesis con EMS y luego a una selección con NaCl se designaron “F EMS 16 NaCl E7” y “F EMS 16 NaCl B7”. Las cepas que primero fueron expuestas a un paso de mutagénesis con nitrito y a una selección con NaCl se designaron “F Nitrito 8 NaCl H10” y “F Nitrito 8 NaCl A12”, las cepas que primero fueron sometidas a un paso de mutagénesis con nitrito y luego a una selección con pirazol son designadas “F Nitrito 6 Pyra B9” y “F Nitrito 7 Pyra F10” y las cepas que primero fueron sometidas a un paso de mutagénesis con EMS y luego a una selección con pirazol son designadas “F EMS 3 Pyra A9”, “F EMS 4 Pyra D11” y “F EMS 3 Pyra E10”. La designación “Referencia” se refiere a la cepa Saccharomyces cerevisiae subespecie bayanus usada como una levadura de comparación, la cual también se usó para el primer paso de mutagénesis antes mencionado.

Se puede apreciar que como resultado de este primer paso de mutagénesis y el paso de selección posterior, se obtienen los mutantes, los cuales ambos producen menos y más glicerol que la levadura de comparación, bajo las mismas condiciones. Básicamente, se debe tomar en consideración, que una parte de los mutantes intermedios no habían convertido todo el azúcar después de 35 días, de modo tal, que los valores de glicerol en estas pruebas son comparables sólo hasta cierto punto.

Ejemplo 2:

En esta prueba de espécimen, la cepa “F EMS 16 NaCl D7” obtenida del Ejemplo 1, la cual mostró una concentración de glicerol particularmente alta en la prueba de fermentación, se seleccionó para un segundo paso de mutagénesis y para el paso de selección. También se usaron EMS, nitrito de sodio y radiación UV para el segundo paso de mutagénesis. Se hizo una selección posterior en cada caso con cloruro de sodio o pirazol. Se pudo apreciar que en el caso de la cepa mutada previamente con EMS, no se obtuvieron mutantes viables en otra mutación con EMS.

Los resultados de una prueba de fermentación con diferentes mutantes obtenidos después del segundo paso de mutagénesis y de la segunda selección, se muestran como un ejemplo en la Figura 3.

“F EMS 16 NaCl D7” y “F EMS 4 Pyra D11” designan los mutantes intermedios. En este ejemplo, estos representan valores de comparación.

“Nitrito Pyra 12 B8”, “Nitrito Pyra 12 H3” y “Nitrito Pyra 25 A1” designan cepas para las cuales se efectuó el segundo paso de mutagénesis con nitrito de sodio, y el segundo paso de selección con pirazol. UV Pyra 17 A8 designa una cepa para la cual se efectuó el segundo paso de mutagénesis con radiación UV y la segunda selección con pirazol. La Tabla 2 muestra los resultados de las investigaciones por HPLC de estas cepas. Aquí también se puede apreciar que se obtuvieron algunas cepas, las cuales producen mucho más glicerol que los mutantes intermedios obtenidos en el Ejemplo 1 y se obtuvieron algunas cepas, las cuales producen menos glicerol. En total, sólo unos pocos mutantes se produjeron, los cuales producen mucho menos etanol que los mutantes intermedios antes mencionados usados al principio del segundo paso de mutagénesis. La cepa “Nitrito Pyra 12 H3” se caracteriza porque ni la glucosa ni la fructosa se convirtieron totalmente, lo cual indica una fermentación incompleta.

Los datos mostrados en la Tabla 2 se obtuvieron después de 35 días de fermentación de prueba, en donde se realizaron dos ensayos de fermentación para cada mutante y se evaluaron en forma independiente uno del otro.

Tabla 2:

En conclusión, se pudo apreciar en las pruebas que después de 35 días, el mutante “Nitrite Pyra 12 B8” provee una fermentación casi completa y en ambos ensayos de fermentación se produjo más de 11 g/l de glicerol. Este mutante corresponde a la cepa depositada con el Leibnitz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, bajo el número de acceso DSM 29822.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir mutantes de levadura, en donde por lo menos una cepa de levadura es contactada en un primer paso de mutagénesis con un primer mutágeno y, en un segundo paso de mutagénesis con un segundo mutágeno, caracterizado por que

- siendo el primer y segundo mutágenos diferentes uno del otro y siendo seleccionados del siguiente grupo:

agente nucleótido-alquilante, agente nucleótido-desaminante y radiación UV, y

- siendo un primer paso de selección realizado entre el primer y segundo pasos de mutagénesis y siendo un segundo paso de selección realizado después del segundo paso de mutagénesis, en el cual los mutantes resultantes del paso de mutagénesis anterior se exponen a un factor de selección escogido de los siguientes grupos:

(a) Medio hipertónico y

(b) Inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol.

en el que uno de los factores de selección se selecciona del Grupo (a) y uno de los factores de selección del Grupo (b).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el agente nucleótido-alquilante se selecciona de los siguientes: dimetilsulfato (DMS), metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (MⁿNG), metilnitrosocianamida (MⁿC), metilnitrosourea (MNU) y metiltransferasas de ADN.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que el agente nucleótido-desaminante se selecciona de los siguientes: sal de nitrito inorgánica, sal de nitrito orgánica y ácido nitroso.

4. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el primer mutágeno es un agente nucleótido-alquilante y el segundo mutágeno es un agente nucleótido-desaminante o radiación UV.

5. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el medio hipertónico se obtiene por la adición de una de las siguientes substancias: cloruros y sulfatos de sodio, de potasio, de magnesio, de calcio y de azúcar, incluyendo fructosa y glucosa y alcohol de azúcar, incluyendo sorbitol y manitol.

6. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el inhibidor de la deshidrogenasa del alcohol se selecciona a partir de los siguientes: pirazol, 3-metilpirazol, 4-metilpirazol y ácido acetil salicílico.

7. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que se realiza un paso de prueba después del primer paso de selección, en el cual los mutantes de levadura intermedios obtenidos después del primer paso de selección son probados para ver si estos producen más glicerol durante una fermentación etanólica que la cepa de levadura usada inicialmente bajo las mismas condiciones, en donde sólo tales mutantes de levadura intermedios a los cuales se aplica esto, son sometidos al segundo paso de mutagénesis y al segundo paso de selección.

8. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que se produce un mutante de levadura, tal como el depositado en el Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH bajo el número de acceso DSM 29822.

9. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que se produce un mutante de levadura, que se produce mediante la fermentación del mosto con 90 ° Oe (21,6% de Brix) y un valor NOPA = 107 mg/l a una dosis de 4 x 106/ml, después de 35 días a una temperatura de fermentación de 15-25° C los mutantes producen un vino con las siguientes proporciones de etanol y de glicerol:

Etanol70-150 g/l

Glicerol10-20 g/l

10. El mutante de levadura obtenido mediante un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 y depositado en el Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH bajo el número de acceso DSM 29822.

11. Utilización del método de levadura de acuerdo con la reivindicación 10 en un método para producir una bebida alcohólica.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que la bebida alcohólica se produce a partir del mosto de la uva.