ES2733307T3 - Microorganismos mutantes para sintetizar ácido colánico, oligosacáridos manosilados y/o fucosilados - Google Patents

Abstract

Un método para regular al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico en una bacteria en comparación con la expresión de dichos genes dentro de una bacteria de tipo silvestre correspondiente, comprendiendo el método generar la disrupción de los genes codificantes de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, en donde dicho operón comprende los genes cpsG, cpsB, gmd y fcl que codifican una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa y GDP-fucosa sintasa, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos mutantes para sintetizar ácido colánico, oligosacáridos manosilados y/o fucosilados

Campo de la invención

La presente memoria descriptiva se refiere a microorganismos mutados y/o transformados para la síntesis de diversos compuestos. Más específicamente, en la presente memoria se describen microorganismos mutados en los genes codificantes de los reguladores ArcA e IcIR. Estas mutaciones dan como resultado una regulación significativa al alza de los genes que forman parte del operón del ácido colánico. Por tanto, dichos microorganismos son útiles para la síntesis de cualquier compuesto que forme parte de la ruta del ácido colánico tal como GDP-fucosa, GDP-manosa y ácido colánico, y/o se pueden usar además -partiendo de GDP-fucosa como precursor- para sintetizar oligosacáridos fucosilados o -partiendo de GDP-manosa como precursor- para sintetizar oligosacáridos manosilados. Además, las mutaciones en los genes que codifican los reguladores transcripcionales ArcA e IcIR conducen a un fenotipo de resistencia a ácidos en la fase de crecimiento exponencial que permite la síntesis de moléculas sensibles al pH y ácidos orgánicos.

Antecedentes de la invención

Los genes arcA, que codifica la proteína de control de la respiración aeróbica, e icIR, que codifica el regulador de la isocitrato liasa, se sabe que regulan el metabolismo central del carbono. ArcA es un regulador transcripcional global que regula una amplia gama de genes, mientras que IcIR es un regulador transcripcional local que regula la ruta del glioxilato. ArcA se sabe que regula el metabolismo central del carbono en respuesta a la privación de oxígeno y no tiene más conexión con IcIR que la de que también regula la ruta del glioxilato (24, 28, 29, 37, 38). En un estudio anterior, se ha observado el efecto combinado de cepas mutantes AiclRAarcA sobre el metabolismo central del carbono. Se presentaron flujos aumentados en el ciclo del ácido tricarboxílico (ATC) y la ruta del glioxilato y apareció un interesante y sorprendente fenotipo cuando ambos genes se desactivaron, a saber, la cepa doble mutante formó biomasa con un rendimiento que se acercó al rendimiento teórico máximo (4, 39).

Algunos compuestos, tales como GDP-fucosa, son muy demandados. Este compuesto es, de hecho, un precursor de oligosacáridos fucosilados tales como fucosillactosa, fucosillactoNbiosa y oligosacáridos Lewis X, o de proteínas fucosiladas. Estos azúcares son componentes de la leche materna humana, en la que tienen efectos antiinflamatorios y prebióticos y/o tienen aplicaciones en usos terapéuticos como agente nutracéutico y antiinflamatorio o prebiótico, además, las proteínas fucosiladas encuentran aplicaciones en los productos farmacéuticos (5, 8, 27). Sin embargo, todavía es necesario un método eficaz para producir estos compuestos de alto valor.

Además, la GDP-manosa también es un producto intermedio de la ruta hacia GDP-fucosa. Interrumpir la ruta prematuramente conduce a la acumulación de este compuesto, que es un precursor de los oligosacáridos manosilados. Estos oligosacáridos encuentran aplicaciones, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones por bacterias gram-negativas, además, la GDP-manosa es importante para la humanización de glicosilaciones de proteína, que es esencial para la producción de ciertas proteínas terapéuticas (18, 30). Los oligosacáridos manosilados y los glicoconjugados manosilados también se usan para el guiado de fármacos, por ejemplo, los antivirales manosilados se pueden guiar específicamente al hígado y los riñones (7).

La presente memoria descriptiva proporciona microorganismos que están cambiados genéticamente de tal manera que pueden producir eficazmente estos compuestos.

Asimismo, las síntesis de moléculas sensibles al pH, tales como -pero que no se limitan a - glucosamina, y ácidos orgánicos, tales como -pero no que no se limitan a - ácido pirúvico, ácido succínico, ácido siálico, oligosacáridos sialilados..., se producen preferiblemente a pH bajo para indistintamente estabilizar el producto o por motivos de tratamiento aguas abajo (4, 12, 40). Por lo tanto, las cepas que pueden crecer a pH bajo son beneficiosas para estos procedimientos de producción. E. coli es un organismo que se puede adaptar fácilmente a diversas condiciones, por ejemplo, se puede adaptar fácilmente a las duras condiciones de pH del estómago, que es aproximadamente pH 2 (14). Sin embargo, E. coli no parece crecer en estas condiciones, pero induce su mecanismo de resistencia a ácidos en la fase estacionaria (40). Durante esta fase, la célula ya no se multiplica y, por lo tanto, dificulta la productividad. Hasta ahora, no se ha encontrado solución a este problema. Sin embargo, en la presente memoria se proporciona un microorganismo modificado genéticamente que puede inducir mecanismos de resistencia a ácidos en la fase de crecimiento exponencial, que es la fase que se usa principalmente para la producción de ácidos orgánicos y productos inestables al pH.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Patrón de expresión genética del tipo silvestre, la cepa mutante AiclR y AarcA en comparación con la cepa mutante AarcAAiclR de genes implicados en la biosíntesis de ácido colánico en condiciones de fermentación por lotes. Los genes implicados en la biosíntesis de ácido colánico se presentan en las Figuras 3 y 4.

Figura 2: Patrón de expresión genética del operón del ácido colánico del tipo silvestre, la cepa mutante AiclR y AarcA en condiciones de fermentación quimiostática en comparación con la cepa mutante AarcAAiclR.

Figura 3: La organización de genes del operón del ácido colánico y un resumen de la función de estos genes:

Figura 4: La ruta de biosíntesis de ácido colánico.

Figura 5: Red reguladora del operón del ácido colánico. Esta red se construyó con Pathway tools v 13.0.

Figura 6: Efecto de las mutaciones AarcAAidR sobre la ruta de biosíntesis de GDP-fucosa.

Figura 7: Resumen de las modificaciones genéticas necesarias para mejorar la producción de fucosillactosa y oligosacáridos fucosilados partiendo de glucosa como sustrato.

Figura 8: Partiendo de sucrosa, se producen derivados de azúcar fucosilados tales como fucosillactosa y, más específicamente, 1,2-fucosillactosa. La cepa se modifica para forzar a la célula a producir fructosa-6-fosfato, que es un producto intermedio en la síntesis de GDP-fucosa. A continuación, se alimenta glucosa o glucosa-1-fosfato (si la enzima de partida es indistintamente una sucrasa o una sucrosa fosforilasa) al metabolismo central del carbono a través de la ruta de la pentosa fosfato.

Figura 9: Resumen de las modificaciones genéticas necesarias para mejorar la producción de fucosillactosa y oligosacáridos fucosilados partiendo de glucosa como sustrato en un metabolismo dividido.

Figura 10: Detalle del flujo de la ruta de la pentosa fosfato en una cepa en la que los genes que codifican fosfoglucosa isomerasa y fosfofructoquinasa están desactivados.

Figura 11: Partiendo de sucrosa, se producen derivados de azúcar manosilados. La cepa se modifica para forzar a la célula a producir fructosa-6-fosfato, que es un producto intermedio en la síntesis de GDP-fucosa. A continuación, se alimenta glucosa o glucosa-1-fosfato (si la enzima de partida es indistintamente una sucrasa o una sucrosa fosforilasa) al metabolismo central del carbono a través de la ruta de la pentosa fosfato.

Figura 12: Patrón de expresión genética de genes relacionados con resistencia a ácidos del tipo silvestre, la cepa mutante AicIR y AarcA en condiciones de cultivo por lotes en comparación con la cepa mutante AarcAAiclR.

Figura 13: Cromatografías de análisis por CL EMEM de caldo de cultivo y un patrón de 2-fucosillactosa. A. Análisis por CL EMEM del patrón, B. análisis por CL EMEM de una muestra del caldo de cultivo de una cepa mutante que expresa una fucosiltransferasa de H. pylori, C. análisis por CL EMEM de una muestra del caldo de cultivo de una cepa mutante que expresa una fucosiltransferasa de H. pylori.

Figura 14: Espectro de masas del análisis por CL EMEM de los cromatogramas presentados en la Figura 13 de caldo de cultivo y un patrón de 2-fucosillactosa. A. Masa (m/z) del patrón, B. masa (m/z) de la muestra del caldo de cultivo de una cepa mutante que expresa una fucosiltransferasa de H. pylori, C. masa (m/z) de la muestra del caldo de cultivo de una cepa mutante que expresa una fucosiltransferasa de H. pylori.

Figura 15: La secuencia del promotor híbrido artificial como se proporciona en SEQ ID N° 6 (la combinación del promotor natural y uno artificial) que se clonó frente al operón del ácido colánico.

Descripción de la invención

La presente memoria descriptiva se refiere a microorganismos tales como enterobacterias que están cambiados genéticamente de tal manera que pueden producir eficazmente compuestos que forman parte de la ruta del ácido colánico. Un compuesto de interés particular es la GDP-fucosa, que se usa como precursor para sintetizar oligosacáridos fucosilados. Esta tiene efectos favorables para la salud, como se indicó anteriormente, pero no se dispone de un método de producción eficaz para producir dichos compuestos.

La presente invención proporciona un método para regular al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico en una bacteria en comparación con la expresión de dichos genes en una bacteria de tipo silvestre correspondiente, que comprende generar la disrupción de los genes codificantes de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, en donde dicho operón comprende los genes cpsG, cpsB, gmd y fcl que codifican una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa y GDP-fucosa sintasa, respectivamente. Este operón también puede comprender los genes cpsG, cpsB, gmd, fcl y wza. Además, se aumenta la expresión del gen rcsA. Este gen es un regulador transcripcional del operón del ácido colánico. La expresión mejorada de este gen aumenta la transcripción del operón del ácido colánico (13, 36).

Por tanto, la presente invención se refiere a un método para regular al alza el regulador transcripcional del operón del ácido colánico, rcsA, el cual, a su vez, regula al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico, en una bacteria que comprende generar la disrupción de los genes codificantes del regulador transcripcional, la proteína de control de la respiración aeróbica, ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR.

La presente memoria descriptiva se refiere a un microorganismo mutado y/o transformado tal como -pero no limitado a - enterobacterias tales como una cepa de Escherichia coli (E. Coli) que comprende un cambio genético que conduce a una expresión modificada de los reguladores transcripcionales: la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR.

Un microorganismo mutado y/o transformado tal como E. coli como se emplea en esta memoria se puede obtener mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica, que incluye, pero no se limita a, mutagénesis UV y mutagénesis química. Una manera preferida de obtener este microorganismo es generando la disrupción (desactivando) los genes (arcA y icIR) que codifican las proteínas ArcA e IcIR, o sustituyendo los promotores endógenos de dichos genes por promotores artificiales o sustituyendo el sitio de unión del ribosoma endógeno por un sitio de unión del ribosoma artificial. El término “promotores artificiales” se refiere a promotores heterólogos o no naturales o diseñados por ordenador con fuerza de expresión conocida, estos promotores se pueden obtener de bibliotecas como describen Alper et al. (2005), Hammer et al. (2006), o De Mey et al. (2007) (3, 11, 15). El término promotor heterólogo se refiere a cualquier promotor que no está presente en la naturaleza en frente del gen. El término “promotor artificial” también se puede a referir a promotores con secuencias de ADN que son combinaciones de la secuencia de promotor natural (autólogo) con partes de secuencias de promotores diferentes (autólogos o heterólogos) como se muestra, por ejemplo, además en los ejemplos. Las secuencias de tales “promotores artificiales” se pueden encontrar en bases de datos tales como, por ejemplo, partsregistry.org (6). El término “sitio de unión del ribosoma artificial” se refiere a sitios de unión del ribosoma heterólogos o no naturales o diseñados por ordenador con tasas de traducción conocidas o medibles, estas bibliotecas se pueden obtener a partir de bibliotecas o diseñar por medio de algoritmos como describen Salis et al (2009) (26). Por tanto, la presente memoria descriptiva se refiere específicamente a un microorganismo mutado y/o transformado como se indicó anteriormente en donde dicho cambio genético es generar la disrupción de los genes codificantes de ArcA e IcIR, o reducir o eliminar la función de ArcA e IcIR por medio de mutaciones en la secuencia codificadora de los genes que codifican ArcA e IcIR, o es sustituir los promotores endógenos de los genes codificantes de ArcA e IcIR por promotores artificiales; o es sustituir el sitio de unión del ribosoma endógeno por un sitio de unión del ribosoma artificial. Además, está claro que el mutante y/o transformante descrito en la presente memoria puede comprender además cambios genéticos adicionales en uno o más genes distintos dentro de su genoma como se describe además más adelante. El término microorganismo se refiere específicamente a una bacteria, más específicamente a una bacteria que pertenece a la familia de las endobacterias. Esta bacteria se refiere preferiblemente a cualquier cepa que pertenece a la especie Escherichia coli tal como, pero no limitada a, Escherichia coli B, Escherichia coli C, Escherichia coli W, Escherichia coli K12, Escherichia coli Nissle. Más específicamente, este término se refiere a cepas de Escherichia coli cultivadas -denominadas cepas E. coli K12- que están bien adaptadas al ambiente de laboratorio y, a diferencia de las cepas de tipo silvestre, han perdido su capacidad para prosperar en el intestino. Ejemplos bien conocidos de las cepas E. coli K12 son K12 de tipo silvestre, W3110, MG1655, M182, MC1000, MC1060, MC1061, MC4100, JM101, NZN111 y AA200. La presente memoria descriptiva se refiere específicamente a una cepa de Escherichia coli mutada y/o transformada como se indicó anteriormente en donde dicha cepa de E. coli es una cepa K12. Más específicamente, la presente memoria descriptiva se refiere a una cepa de Escherichia coli mutada y/o transformada como se indicó anteriormente en donde dicha cepa K12 es E. coli MG1655.

La expresión “que conduce a una expresión o actividad modificada” indica que las mutaciones/transformaciones descritas anteriormente afectan a la transcripción y/o traducción y/o modificación postraduccional de dichos genes (arcA e IcIR) en las proteínas de regulador transcripcional de la presente invención (ArcA e IcIR) de tal manera que esta transcripción se ha reducido significativamente o incluso se ha abolido completamente en comparación con una cepa de tipo silvestre, que no se ha mutado o transformado en lo que respecta a ambos genes particulares descritos en la presente memoria. Por tanto, la presente memoria descriptiva se refiere a un microorganismo mutado y/o transformado tal como una cepa de Escherichia coli como se indicó anteriormente en donde dicha expresión modificada es una expresión reducida, y a un microorganismo mutado y/o transformado tal como una cepa de Escherichia coli como se indicó anteriormente en donde dicha expresión reducida es una expresión abolida.

La expresión “que regula al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico” indica que la expresión de al menos 1, 2, 3, 4... o todos los genes que pertenecen al operón del ácido colánico se regula al alza significativamente (= P > 0,05) en comparación con la expresión de dichos genes en un microorganismo de tipo silvestre correspondiente que se cultiva en las mismas condiciones que el microorganismo mutado y/o transformado. Los genes que pertenecen al operón del ácido colánico son wza, wzb, wzc, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, gmd, fcl, gmm, weal, cpsB, cpsG, wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL y wcaM como se indica en la Fig. 3 y/o como se describe en (35). Asimismo, se regula al alza el gen rcsA, que codifica el regulador transcripcional del operón del ácido colánico (13, 36). Más específicamente, la expresión “que regula al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico” o el regulador transcripcional del operón del ácido colánico indica que la regulación de al menos uno de los genes del operón del ácido colánico se regula al alza 6 a 8 veces en comparación con la expresión de los genes del operón del ácido colánico en el microorganismo de tipo silvestre correspondiente. Además, regular al alza genes del operón del ácido colánico como se describió anteriormente puede comprender sustituir el promotor natural por un “promotor artificial”, más específicamente, una combinación de la secuencia del promotor natural con secuencias de otras secuencias de promotor artificial. La combinación de la secuencia del promotor natural con la secuencia de otras secuencias de promotor artificial es más específicamente la sustitución del sitio de unión de factor sigma del promotor natural con un sitio de unión de factor sigma más fuerte. Se describen factores sigma tales como, pero que no se limitan a, sigma70, sigmaS, sigma24... (41), subunidades de ARN polimerasa que determinan la afinidad por secuencias de promotor y la tasa de transcripción de genes. La presente memoria descriptiva proporciona microorganismos que están cambiados genéticamente de tal manera que pueden producir eficazmente compuestos que forman parte de la ruta del ácido colánico. La expresión “compuestos que forman parte de la ruta del ácido colánico” se refiere a todos los compuestos, como se indica en la Figura 4, que parten de fructosa-6-P y dan como resultado ácido colánico extracelular. Más específicamente, esta expresión se refiere a los compuestos manosa-6-P, manosa-1-P, GDP-manosa, GDP-4-deshidro-6-desoximanosa, GDP-fucosa y ácido colánico. Por tanto, la presente memoria descriptiva se refiere específicamente al uso de los microorganismos mutados y/o transformados descritos en la presente memoria para la síntesis de ácido colánico y/o para la síntesis de GDP-fucosa. Como la GDP-fucosa es un precursor de oligosacáridos fucosilados tales como fucosillactosa, fucosillactoNbiosa y oligosacárido Lewis X o proteínas fucosiladas, y como estos azúcares tienen efectos terapéuticos, nutracéuticos, antiinflamatorios y prebióticos, la presente memoria descriptiva se refiere específicamente al uso de los microorganismos mutados y/o transformados descritos en la presente memoria para la síntesis de oligosacáridos fucosilados. En otras palabras, la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de ácido colánico y/o GDP-fucosa y/u oligosacáridos fucosilados en una bacteria que comprende generar la disrupción de los genes codificantes de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, para regular al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico, en donde dicho operón comprende los genes cpsG, cpsB, gmd y fcl o los genes cpsG, cpsB, gmd, fcl y wza. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento como se describe en donde las mutaciones para ArcA e IcIR se aplican en combinación con al menos una mutación que mejora la producción de compuestos fucosilados. Con el fin de producir eficazmente oligosacáridos fucosilados (véanse las Figuras 1, 2 y 5-10), las mutaciones descritas anteriormente en arcA e icIR se pueden aplicar en combinación con otras mutaciones que mejoran adicionalmente la producción de compuestos fucosilados. Algunas de estas otras mutaciones -no limitantes- son: a) la supresión de wcaJ del operón del ácido colánico, que detiene el inicio de la biosíntesis del ácido colánico y, por tanto, permite la acumulación de GDP-fucosa; b) la introducción de una fucosiltransferasa para enlazar la fucosa con diferentes moléculas aceptoras tales como lactosa; c) para la acumulación del precursor de la ruta biosintética de GDP-fucosa y además de la supresión de wcaJ, se desactiva al menos uno de los siguientes genes del operón del ácido colánico que no codifican la biosíntesis de GDP-fucosa: gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL, wzx, wza, wzb, wzc y/o wcaM; d) para la producción de fucosillactosa, se desactiva lacZ, que codifica p-galactosidasa, para evitar la degradación de lactosa; e) para acumular el precursor fructosa y fructosa-6-fosfato, se introduce una sucrosa fosforilasa o invertasa; f) puesto que la fructosa-6-fosfato se degrada fácilmente en la glicólisis, la glicólisis se debe interrumpir con el fin de dirigir toda la fructosa-6-fosfato en la dirección de GDP-fucosa y, por tanto, se desactivan los genes pgi, pfkA y pfkB (que codifican glucosa-6-fosfato isomerasa y fosfofructoquinasa A y B); g) reducir la degradación de proteína desactivando una proteasa codificada por un gen tal como Ion; h) expresando constitutivamente una lactosa permeasa, se evitan subpoblaciones en el procedimiento de producción que son comunes para los sistemas de expresión de genes inducida por lactosa (19). En otras palabras, la presente invención se refiere a un procedimiento como se describió anteriormente para la síntesis de oligosacáridos fucosilados en donde una mutación que mejora la producción de compuestos fucosilados se selecciona del grupo que consiste en: la supresión del gen wcaJ, y/o desactivar los genes del operón del ácido colánico gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL, wzx, wza, wzb, wzc y/o wcaM, y/o desactivar lacZ, y/o introducir una sucrosa fosforilasa o invertasa, y/o desactivar los genes pgi, pfkA y pfkB, y/o desactivar el gen Ion, y/o introducir una fucosiltransferasa, y/o una lactosa permeasa. El término “ introducir una fucosiltransferasa” se refiere a regular al alza o mejorar la expresión heteróloga de fucosiltransferasas que están comprendidas en, pero no se limitan a, las enzimas de las clases de enzimas EC2.4.1.65, 2.4.1.68, 2.4.1.69, 2.4.1.152, 2.4.1.214 y/o 2.4.1.221, y/o las familias de glicosiltransferasas GT1, GT2, GT10 GT11, GT23, GT37, GT65, GT68 y/o GT74, y/o que proceden de, pero no se limitan a, Helicobacter pylori, Campylobacterjejuni, Dictyostellium discoideum, Mus musculus, Homo sapiens,... y estas fucosiltransferasas catalizan la formación de enlaces a(1,2), a(1,3), a(1,4) o (1,6) sobre otros azúcares tales como, pero que no se limitan a, galactosa, lactosa, lactoAbiosa, lactoMetraosa, lactosamina, lactoA/tetraosa, sialillactosas, disialillactosas, o proteínas fucosiladas, o ácidos grasos fucosilados, o aglicones fucosilados tales como, pero que no se limitan a, antivirales, antibióticos...

La presente memoria descriptiva proporciona el uso de un microorganismo mutado y/o transformado descrito en la presente memoria que comprende un cambio genético que conduce a una expresión y/o actividad modificada de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, para regular al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico, en donde dicho operón comprende los genes cspG y cspB, que codifican fosfomanomutasa y manosa-1-fosfato guanililtransferasa, que son necesarios para la biosíntesis de GDP-manosa. Como la GDP-manosa es un precursor de oligosacáridos manosilados y glicoconjugados manosilados. Estos oligosacáridos y glicoconjugados encuentran aplicaciones, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones por bacterias gram-negativas, además, la GDP-manosa es importante para la humanización de glicosilaciones de proteína, que es esencial para la producción de ciertas proteínas terapéuticas (18, 30). Los oligosacáridos manosilados y los glicoconjugados manosilados también se usan para el guiado de fármacos, por ejemplo, los antivirales manosilados se pueden guiar específicamente al hígado y los riñones (7). Con el fin de producir eficazmente oligosacáridos manosilados (véanse las Figuras 1, 2, 5, 6 y 11), las mutaciones en arcA e icIR descritas anteriormente se pueden aplicar en combinación con otras mutaciones que mejoran adicionalmente la producción de compuestos manosilados. Algunas de estas otras mutaciones -no limitantes- son: a) se suprime el gen gmd del operón del ácido colánico, y/o b) en donde se suprime el gen gmm que codifica GDP-manosa hidrolasa, y/o c) en donde se suprimen los genes del operón del ácido colánico que no codifican reacciones de biosíntesis de GDP-manosa, los genes gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL, fcl, gmd, wzx, wza, wzb y/o wcaM, y/o d) en donde se introduce un gen que codifica una sucrosa fosforilasa o una invertasa, y/o e) en donde se suprimen los genes pgi, pfkA y pfkB, que codifican fosfoglucosa isomerasa, fosfofructoquinasa A y fosfofructoquinasa B, respectivamente, y/o f) desactivar el gen Ion que codifica una proteasa, y/o f) en donde se introduce un gen que codifica una manosiltransferasa. En otras palabras, la presente invención se refiere a un procedimiento como se describió anteriormente para la síntesis de ácido colánico y/o GDP-fucosa y/u oligosacáridos fucosilados para la síntesis de GDP-manosa y/o para la síntesis de oligosacáridos manosilados. La presente invención se refiere además a dicho procedimiento en donde se regulan al alza los genes cpsG y cpsB del operón del ácido colánico y en donde: a) se suprime el gen gmd del operón del ácido colánico, y/o b) en donde se suprime el gen gmm, y/o en donde se desactivan los genes del operón del ácido colánico fcl, gmd, gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL, wzx, wza, wzb, wzc y/o wcaM, y/o d) en donde se introduce un gen que codifica una sucrosa fosforilasa o una invertasa, y/o e) en donde se suprimen los genes pgi, pfkA y pfkB, y/o f) desactivar el gen Ion, y/o g) en donde se introduce un gen que codifica una manosiltransferasa. El término “ introducir una manosiltransferasa” se refiere a regular al alza o mejorar la expresión heteróloga de manosiltransferasas que están comprendidas en, pero no se limitan a, las enzimas de las clases de enzimas EC 2.4.1.32, 2.4.1.B27, 2.4.1.B44, 2.4.1.48, 2.4.1.54, 2.4.1.57, 2.4.1.83, 2.4.1.109, 2.4.1.110, 2.4.1.119, 2.4.1.130, 2.4.1.131, 2.4.1.132, 2.4.1.142, 2.4.1.199, 2.4.1.217, 2.4.1.232, 2.4.1.246, 2.4.1.251,2.4.1.252, 2.4.1.257, 2.4.1.258, 2.4.1.259, 2.4.1.260, 2.4.1.265 y/o 2.4.1.270, y/o las familias de glicosiltransferasas GT1, GT2, GT4, GT15, GT22, GT32, GT33, GT39, GT50 y/o GT58, y/o que proceden de, pero no se limitan a, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Dictyostellium discoideum, Mus musculus, Homo sapiens,... y estas manosiltransferasas catalizan la formación de enlaces a(1,2), a(1,3), a(1,4) o (1,6) sobre otros azúcares tales como, pero que no se limitan a, galactosa, N-acetilglucosamina, ramnosa, lactosa, lactoAbiosa, lactoA/tetraosa, lactosamina, lactoA/tetraosa, sialillactosas, disialillactosas, o proteínas manosiladas, o ácidos grasos manosilados, o aglicones manosilados tales como, pero que no se limitan a, antivirales, antibióticos...

El término “expresión heteróloga” se refiere a la expresión de genes que no están presentes en la naturaleza en el huésped de producción, genes que se pueden sintetizar químicamente o recuperar de su huésped natural por medio de PCR, genes cuyos codones pueden estar optimizados para el huésped de producción o en los que se puede añadir una mutación puntual para mejorar la actividad o expresión enzimática. La expresión de genes heterólogos y/o naturales se puede realizar indistintamente sobre el cromosoma, cromosomas artificiales o plásmidos y la transcripción se puede controlar por medio de promotores inducibles, constitutivos, naturales o artificiales y la traducción se puede controlar por medio de sitios de unión del ribosoma natural o artificial.

Por consiguiente, la presente invención se refiere además a bacteria mutada y/o transformada en la que los reguladores ArcA e IcIR como se describió anteriormente, en combinación con los genes codificantes de las enzimas fosfoglucosa isomerasa y fosfofructoquinasa, están desactivados. Más específicamente, la presente invención se refiere a estos organismos en donde la enzima fosfoglucosa isomerasa está codificada por el gen pgi y en donde la enzima fosfofructoquinasa está codificada por el(los) gen(es) pfkA y/o pfkB.

La expresión “genes que se restituyen menos funcionales o no funcionales” se refiere a las tecnologías bien conocidas por un experto en la técnica tales como el uso de ARNip, ARNi, miARN, ARNas, mutar genes, desactivar genes, mutagénesis por transposones, etc., que se usan para cambiar los genes de tal manera que son menos capaces (es decir, estadísticamente significativamente “menos capaces” en comparación con un gen de tipo silvestre funcional) o completamente incapaces (tal como genes desactivados) de producir productos finales funcionales. El término “desactivación (de genes)”, por tanto, se refiere a un gen que se restituye no funcional. El término “gen suprimido” o “supresión de genes”, también se refiere a un gen que se restituye no funcional.

La presente invención se refiere además a una bacteria mutada y/o transformada como se describió en el párrafo anterior en donde dicho organismo se transforma además con un gen que codifica una sucrosa fosforilasa.

La presente invención también se refiere a una bacteria mutada y/o transformada como se describió anteriormente en donde, además, la actividad del gen que codifica una lactosa permeasa está aumentada. Dicha actividad se puede aumentar sobreexpresando dicho gen y/o transformando dichos organismos con un gen que codifica una lactosa permeasa.

La presente invención se refiere además a cualquier bacteria mutada y/o transformada como se describió anteriormente en donde al menos uno de los siguientes genes está desactivado se ha restituido menos funcional:

un gen que codifica una beta-galactosidasa, un gen que codifica una glucosa-1-fosfato adenililtransferasa, un gen que codifica una glucosa-1-fosfatasa, un gen que codifica fosfogluconato deshidratasa, un gen que codifica 2-ceto-3-desoxigluconato-6-fosfato aldolasa ,un gen que codifica una glucosa-1-fosfato uridiltransferasa, un gen que codifica una UDP-glucosa-4-epimerasa, un gen que codifica una UDP-glucosa:galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, un gen que codifica una UDP-galactopiranosa mutasa, un gen que codifica una UDP-galactosa:(glucosil)lipopolisacárido-1,6-galactosiltransferasa, un gen que codifica una UDP-galactosiltransferasa, un gen que codifica una UDP-glucosiltransferasa, un gen que codifica una UDP-glucuronato transferasa, un gen que codifica una UDP-glucosa transferasa al vehículo lipídico, un gen que codifica una GDP-manosa hidrolasa, un gen que codifica una UDP-azúcar hidrolasa, un gen que codifica una manosa-6-fosfato isomerasa, un gen que codifica una UDP-N-acetilglucosamina enoilpiruvoil transferasa, un gen que codifica una UDP-N-acetilglucosamina acetiltransferasa, un gen que codifica una UDP-Nacetilglucosamina-2-epimerasa, un gen que codifica una undecaprenil-fosfato alfa-N-acetilglucosaminil transferasa, un gen que codifica una glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa, y/o un gen que codifica una L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa, un gen que codifica una manosa-6-fosfato isomerasa, un gen que codifica una sorbitol-6-fosfato deshidrogenasa, un gen que codifica una manitol-1-fosfato-5-deshidrogenasa, un gen que codifica una alulosa-6-fosfato 3-epimerasa, un gen que codifica una invertasa, un gen que codifica una maltasa, un gen que codifica una trehalasa, un gen que codifica un fosfotransferasa transportadora de azúcar, un gen que codifica una proteasa, o un gen que codifica una hexoquinasa. El término “al menos uno” indica que al menos 1, pero también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o los 33 genes se desactivan o restituyen menos funcionales.

En la presente memoria se describe además el uso de un microorganismo mutado y/o transformado tal como una cepa Escherichia coli que comprende un cambio genético que conduce a una expresión modificada de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y regulador de la isocitrato liasa IcIR, para regular al alza al menos uno de los siguientes genes relacionados con la resistencia a ácidos: ydeP, ydeO, hdeA, hdeD, gadB, gadC, gadE, gadX, gadW y/o sip (17, 22). Estos genes normalmente se expresan en condiciones de fase estacionaria; sin embargo, el microorganismo mutado y/o transformado es capaz de mejorar la expresión de estos genes relacionados con la resistencia a ácidos en la fase de crecimiento exponencial. Por tanto, la presente invención se refiere al uso como se describió anteriormente para la síntesis de ácidos o moléculas sensibles al pH tales como, pero que no se limitan a, glucosamina, que es sensible al pH y se debe producir a pH bajo (12). Los ácidos orgánicos tales como, pero que no se limitan a, ácido pirúvico, ácido succínico, adípico, ácido siálico, oligosacáridos sialilados (p. ej., sialillactosa, azúcares Lewis X de sialilo...), oligosacáridos acetilados (quitinas, quitosanos...), oligosacáridos sulfonados (heparanos y heparosanos)... se producen preferiblemente a pH bajo con fines de procesamiento aguas abajo (4). En otras palabras, en la presente memoria se describe un procedimiento para la síntesis de ácidos, ácido siálico, oligosacáridos sialilados o glucosamina que comprende cambiar genéticamente los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, para regular al alza al menos uno de los siguientes genes relacionados con la resistencia a ácidos: ydeP, ydeO, hdeA, hdeD, gadB, gadC, gadE, gadX, gadW y/o sip.

La presente invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Un cribado mediante RT-qPCR de alto rendimiento de los microorganismos descritos en la presente memoria se configuró con la tecnología OpenArray® de Biotrove. En este experimento, la transcripción de 1800 genes se midió en 4 cepas (tipo silvestre, AarcA, AiclR, AarcA AicIR) en dos condiciones (quimiostática y por lotes). Los datos se procesaron usando una herramienta de ajuste de curvas en R (25, 34) y normalización de cuantiles, el error en los datos se calculó usando estadística bayesiana (20, 21, 31).

Material y métodos

Cepas y plásmidos

La Escherichia coli MG1655 [□□', F-, rph-1] se obtuvo de la Colección de Cultivos de Bacterias de los Países Bajos (NCCB). La Escherichia coli BL21(DE3) se obtuvo de Novagen. La Escherichia coli MG1655 uackA-pta, apoxB, npppc ppc-p37 (10), las desactivaciones únicas E. coli MG1655 □arcA and E. coli MG1655 □icIR y la doble desactivación E. coli MG1655 □arcA, □icIR se construyeron en el Laboratorio de Genética y Microbiología (MICR) usando el método de Datsenko y Wanner (9).

Medios

El medio de caldo Luria (LB) consistió en 1 % de triptona peptona (Difco, Erembodegem, Bélgica), 0,5 % de extracto de levadura (Difco) y 0,5 % de cloruro sódico (VWR, Leuven, Bélgica). El medio del matraz de agitación contenía 2 g/l de NH4Ci, 5 g/l de (NH^S04, 2,993 g/l de KH2P04, 7,315 g/l de K2HP04, 8,372 g/l de MOPS, 0,5 g/l de NaCI, 0,5 g/l de MgS04-7H20, 16,5 g/l de glucosaH20, 1 ml/l de solución de vitamina, 100 pl/l de solución de molibdato y 1 ml/l de solución de selenio. El medio se ajustó a un pH de 7 con KOH 1 M.

La solución de vitamina consistió en 3,6 g/l de FeCh-4H20, 5 g/l de CaCh-2H20, 1,3 g/l de MnCh-2H20, 0,38 g/l de CuCh-2H20, 0,5 g/l de CoCI^6H20, 0,94 g/l de ZnCh, 0,0311 g/l de H3B04, 0,4 g/l de Na2EDTA2H20 y 1,01 g/l de tiaminaHCI. La solución de molibdato contenía 0,967 g/l de Na2Mo04-2H20. La solución de selenio contenía 42 g/l de Se02.

El medio mínimo para fermentaciones contenía 6,75 g/l de NH4Cl, 1,25 g/l de (NH4)2S04, 1,15 g/l de KH2P04, 0,5 g/l de NaCI, 0,5 g/l de MgS04-7H20, 16,5 g/l de glucosaH20, 1 ml/l de solución de vitamina, 100 pl/l de solución de molibdato y 1 ml/l de solución de selenio con la misma composición como se describió anteriormente.

Condiciones de cultivo

Un precultivo, de una única colonia sobre una placa LB, se incubó en 5 ml de medio LB durante 8 horas a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm. A partir de este cultivo, se transfirieron 2 ml a 100 ml de medio mínimo en un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 16 horas a 37 °C en un matraz orbital a 200 rpm. Se utilizó 4 % de inóculo en un recipiente de cultivo de 2 l Biostat B Plus con 1,5 l de volumen de trabajo (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania). Las condiciones de cultivo fueron: 37 °C, agitación a 800 rpm y un caudal de gas de 1,5 l/min. Las condiciones aeróbicas se mantuvieron llenando de aire, las condiciones anaeróbicas se obtuvieron impregnando con gas el cultivo con una mezcla de 3 % de CO2 y 97 % de N2. El pH se mantuvo en 7 con H2S040,5 M y KOH 4 M. El gas de escape se enfrió a 4 °C mediante un refrigerante de gas de escape (Frigomix 1000, Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania). Se añadió 10 % de solución de agente antiespumante de silicona (BDH 331512K, VWR Int Ltd., Poole, Inglaterra) cuando subió la formación de espuma durante la fermentación (aproximadamente 10 pl). El gas emitido se midió con un analizador de gas emitido EL3020 (ABB Automation GmbH, 60488 Frankfurt am Main, Alemania).

Todos los datos se registraron con el sistema MFCS/win v3.0 de Sartorius (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania).

Todas las cepas se cultivaron al menos dos veces y las desviaciones estándar proporcionadas de los rendimientos y las tasas se basaron en al menos 10 puntos de datos tomados durante los experimentos repetidos.

Metodología de toma de muestras

El biorreactor contiene en su interior una tubería de cosecha (aguja espinal BD, 1,2 x 152 mm (BDMedical Systems, Franklin Lakes, NJ - EE. UU.) conectada a un puerto del reactor, enlazada en el exterior a un tubo Masterflex-14 (Cole-Parmer, Antwerpen, Bélgica) seguido de un puerto de cosecha con un septo para toma de muestras. El otro lado de este puerto de cosecha está conectado de vuelta al recipiente del reactor con un tubo Masterflex-16. Este sistema se denomina bucle de toma de muestras rápido. Durante la toma de muestras, el caldo del reactor se bombea alrededor en el bucle de toma de muestras. Se ha estimado que, a un caudal de 150 ml/min, el caldo del reactor necesita 0,04 s para alcanzar el puerto de cosecha y 3,2 s para volver a entrar al reactor. A un nivel de pO2 de 50 %, hay alrededor de 3 mg/l de oxígeno en el líquido a 37 °C. El nivel de pO2 no debe caer nunca por debajo de 20 % para evitar condiciones microaeróbicas. Por tanto, se pueden consumir 1,8 mg/l de oxígeno durante el tránsito a través del bucle de cosecha. Suponiendo una velocidad de absorción de oxígeno de 0,4 g de oxígeno/g de biomasa/h (la velocidad máxima de absorción de oxígeno encontrada a |Jmáx), esto da para 5 g/l de biomasa, una velocidad de absorción de oxígeno de 2 g/l/h o 0,56 mg/l/s, que multiplicada por 3,2 s (tiempo de residencia en el bucle) da 1,8 mg/l de consumo de oxígeno.

Con el fin de extinguir el metabolismo de células durante la toma de muestras, el caldo del reactor se aspiró a través del puerto de cosecha en una jeringa llena con 62 g de perlas de acero inoxidable preenfriadas a -20 °C, para enfriar 5 ml de caldo inmediatamente a 4 °C. La toma de muestras fue seguida inmediatamente de centrifugación en frío (15 000 g, 5 min, 4 °C). Durante los experimentos por lotes, se tomó una muestra para medidas de DO600nm y RT-qPCR usando el bucle de toma de muestras rápido y el método de toma de muestras con perlas inoxidables frías.

RT-qPCR

El ARNm se extrajo con el equipo de reactivos RNeasy (Qiagen, Venlo, Países Bajos). La calidad y cantidad de ARN se comprobó con un espectrofotómetro ND-1000 de nanogotas (Nanodrop technologies, Wilmingto, EE. UU.). Las relaciones 260:280 (nm) y 260:230 (nm) se encontraron entre 1,8 y 2 y fueron necesarios al menos 100 ng/jl para análisis adicional. El ADNc se sintetizó con cebadores aleatorios con el equipo de reactivos para síntesis de la primera cadena de ADNc RevertAid™ H minus (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania). Por último, la expresión genética de 1800 genes se midió con la plataforma de PCR en tiempo real OpenArray de Biotrove. Los cebadores para el ensayo RT-PCR se diseñaron con herramientas de diseño de cebadores a partir de la base de datos de cebadores (23).

La mezcla de reacción estuvo compuesta como se describe en el manual del usuario del sistema de qPCR en tiempo real OpenArray™ de Biotrove. En resumen, se fabricó una mezcla maestra con 26,4 j l de LightCycler® DNA Master SYBR® Green I (Roche applied Science), 1,1 j l de SYBR GREEN I (100x solución madre, Sigma S9430), 8,8 j l de glicerol (Sigma G5150), 5,3 j l de Pluronic® F68 (10 % de solución madre, Invitrogen), 2,64 j l de BSA (Sigma A7906), 26,4 j l de cloruro de magnesio (solución madre 25 mM, suministrada en el equipo de reactivos LightCycler® de Roche applied Science ), 21,1 j l de formamida HiDi™ (Applied biosystems) y 94,66 j l de agua estéril exenta de RNasa, lo que dio como resultado una mezcla madre de 186,4 jl, que fue suficiente para cargar 1 OpenArray™. Para 1 subconjunto ordenado (cada OpenArray está subdividida en 48 subconjuntos ordenados en los que se puede cargar 1 muestra), se mezclaron 1,5 j l de muestra (con una concentración de 100 ng/jl) con 3,5 j l de mezcla maestra, como control negativo, el agua se usó como blanco. La mezcla muestra-mezcla maestra se cargó en una placa de carga (placa de polipropileno negro de volumen bajo y 384 pocillos MatriPlate™, Biotrove) en una campana exenta de RNasa. Se cargó una placa de carga completa con un cargador automático (Biotrove) y puntas de carga en las OpenArray. Estas OpenArray se sumergieron a continuación en fluido de inmersión OpenArray™ en un estuche de qPCR en tiempo real OpenArray™. El estuche se selló con pegamento para sellado del estuche y se incubó en la estación de sellado del estuche, que polimeriza el pegamento con luz UV.

Métodos analíticos

La densidad de células del cultivo se supervisó frecuentemente midiendo la densidad óptica a 600 nm (espectrofotómetro Uvikom 922, BRS, Bruselas, Bélgica). El peso en seco de células se obtuvo mediante centrifugación (15 min, 5000 g, rotor GSA, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Bélgica) de 20 g de caldo del reactor en tubos de tipo Falcon presecados y pesados. Los sedimentos de lavaron posteriormente una vez con 20 ml de solución fisiológica (9 g/l de NaCl) y se secaron a 70 °C hasta un peso constante. Para poder convertir las mediciones de DO600nm en concentraciones de biomasa, se realizó una curva de correlación de la DO600nm a la concentración de biomasa. Las concentraciones de glucosa y ácidos orgánicos se determinaron en un sistema de CLAR Prostar de Varian (Varian, Sint-Katelijne-Waver, Bélgica), usando una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Eke, Bélgica) calentada a 65 °C, equipada con una precolumna de 1 cm, usando H2S045 mM (0,6 ml/min) como fase móvil. Se usó un detector de doble onda UV-VIS (210 nm y 265 nm) (Prostar 325 de Varian) y un detector de índice de refracción diferencial (Merck LaChrom L-7490, Merck, Leuven, Bélgica) para la detección de picos. Dividiendo las absorciones de los picos a 265 y 210 nm se pudieron identificar los picos. La división da como resultado un valor constante, típico para un determinado compuesto (fórmula de Beer-Lambert).

La glucosa, fructosa, sucrosa, fucosillactosa y glucosa-1-fosfato se midieron mediante CLAR con una columna Hypercarb y se detectaron con un detector de EMEM (Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006).

Métodos genéticos

Todas las cepas mutantes se construyeron por medio de los métodos descritos a continuación.

Los plásmidos se mantuvieron en la E. coli DH5a huésped (F‘, 980dlacZAM15, A(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17{rk-, mk+), phoA, supE44, A', thi-1, gyrA96, relA1).

Plásmidos. Los plásmidos pKD46 (plásmido auxiliar para Red, resistencia a ampicilina), pKD3 (contiene un gen de resistencia a cloranfenicol (cat) flanqueado por FRT), pKD4 (contiene un gen de resistencia a kanamicina (kan) flanqueado por FRT), y pCP20 (expresa actividad recombinasa FLP) se usaron para la construcción de mutantes. El plásmido pBluescript (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) se usó para construir los derivados de pKD3 y pKD4 con una biblioteca de promotores, o con alelos que llevaban una mutación puntual.

Mutaciones. Las mutaciones consistieron en la rotura de genes (desactivación, KO). Se introdujeron usando el concepto de Datsenko y Wanner (9). Los cebadores para las estrategias de mutación se describen en la Tabla 1.

Los transformantes que llevaban un plásmido auxiliar para Red se hicieron crecer en 10 ml de medio LB con ampicilina (100 mg/ml y L-arabinosa (10 mM) a 30 °C hasta una DO600nm de 0,6. Las células se hicieron electrocompetentes lavándolas con 50 ml de agua helada, una primera vez, y con 1 ml de agua helada, una segunda vez. A continuación, las células se resuspendieron en 50 ^l de agua helada. Se realizó electroporación con 50 ^l de células y 10-100 ng de producto de ADN bicatenario lineal usando un Gene Pulser™ (BioRad) (600 O, 25 ^FD y 250 voltios).

Después de la electroporación, las células se añadieron a 1 ml de medio LB incubado 1 h a 37 °C y, por último, se diseminaron sobre LB-agar que contenía 25 mg/l de cloranfenicol o 50 mg/l de kanamicina para seleccionar transformantes resistentes a antibióticos. Los mutantes seleccionados se verificaron mediante PCR con cebadores aguas arriba y aguas abajo de la región modificada y se hicieron crecer en LB-agar a 42 °C para la pérdida del plásmido auxiliar. Los mutantes se ensayaron para determinar la sensibilidad a ampicilina.

ADN bicatenario lineal. Los amplicones de ADNbc se obtuvieron mediante PCR usando pKD3, pKD4 y sus derivados como molde. Los cebadores usados tenían una parte de la secuencia complementaria al molde y otra parte complementaria al lado del ADN cromosómico donde debe tener lugar la recombinación (Tabla 1). Para la KO, la región de homología se diseñó 50 nt aguas arriba y 50 nt aguas abajo del codón de iniciación y detención del gen de interés. Para la KI, se tuvo que respetar el punto de partida transcripcional (+1). Los productos de la PCR se purificaron mediante PCR, se digirieron con Dpnl, se repurificaron de un gel de agarosa y se suspendieron en tampón de elución (Tris 5 mM, pH 8,0).

Eliminación del gen de resistencia a antibióticos. Los mutantes seleccionados (resistentes a cloranfenicol o kanamicina) se transformaron con plásmido pCP20, que es un plásmido resistente a ampicilina y cloranfenicol que presenta replicación sensible a la temperatura e inducción térmica de la síntesis de FLP. Los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30 °C, después de lo que, unos cuantos se purificaron de colonias en LB a 42 °C y a continuación se ensayaron para determinar la pérdida de toda la resistencia a antibióticos y del plásmido auxiliar de FLP. Las desactivaciones y activaciones de genes se comprobaron con cebadores de control (Fw/Rv-genout). Estos cebadores se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1 Cebadores usados para crear E. coli MG1655 □arcA, E. coli MG1655 □icIR y la doble desactivación E. coli MG1655 □arcA, □icIR y todas las demás desactivaciones o activaciones genéticas

Transformación. Los plásmidos se transformaron en células competentes con CaCl2 usando el procedimiento simplificado de Hanahan (16) o por medio de electroporación como se describió anteriormente.

Métodos de cálculo

Introducción

Se realizaron diferentes experimentos con diferentes cepas. En total se ensayaron 8 condiciones diferentes. Hubo variación en el contexto genético (WT, desactivación de icIR, desactivación de arcA y desactivación de icIR-arcA combinada) y el modo de fermentación (quimiostática, por lotes). Cada experimento se repitió dos veces.

Cuando se analizaron las muestras en el aparato de BioTrove, se obtuvo una curva de qPCR (fluorescencias en función del número de ciclos) y una curva de fusión (fluorescencias en función de la temperatura) para cada muestra. Esos datos se exportaron del programa de BioTrove y se analizaron adicionalmente en R. El análisis se dividió en dos etapas: primero se ajustaron las curvas de qPCR y se calcularon los valores de Ct, y en la segunda etapa los valores de Ct se convirtieron a datos de expresión.

Cálculo de las curvas de qPCR

Los datos de la curva de qPCR sin procesar se extrajeron del programa de BioTrove y se importaron en R (1). Las curvas se ajustaron a un modelo sigmoidal de 5 parámetros, con el paquete R para qPCR (25, 34). El máximo de la segunda derivada de esas curvas se usó como valor de Ct. No se aplicó normalización a los datos antes del ajuste de las curvas. Sin embargo, se retiraron los resultados discrepantes. La detección de los resultados discrepantes se realizó usando el procedimiento siguiente:

Ajustar el modelo a los datos.

Calcular los residuos estadísticos (definidos como las fluorescencias medidas menos las calculadas con el modelo). Suponiendo que los residuos estadísticos están distribuidos normalmente, calcular la media y la desviación estándar de los residuos estadísticos.

Usando esta media y esta desviación estándar, se calcula el intervalo de 95 %.

Todos los puntos de datos para los que los residuos estadísticos cayeron fuera de este intervalo de 95 % se consideraron valores discrepantes.

La curva se reajustó sin los valores discrepantes.

Esto se repitió hasta que ya no se detectaron valores discrepantes. Usando este procedimiento, los datos no se tienen normalizar antes del ajuste, ni se deben retirar los primeros puntos de datos.

Se deben ajustar muchas curvas (1800 genes para un experimento). Por lo tanto, era inviable comprobar manualmente cada curva y se tuvieron que aplicar métodos automatizados para rechazar las curvas malas. Para ello, se extrajeron diferentes parámetros de las curvas: el valor del número de ciclos al que se producía el máximo de la primera derivada (D1), el valor del número de ciclos al que se producía el máximo de la segunda derivada (D2), la fluorescencia mínima (Fmín) y la fluorescencia máxima (Fmáx). Combinando los valores de esos parámetros se evaluó la validez de la curva y el grado de expresión. En la siguiente sección se explica cómo se hace esto.

Filtrado de los datos

Para algunas combinaciones gen-experimento, no se detectó amplificación. Esto se puede deber a un abanico de razones:

La expresión es demasiado baja y 32 ciclos (el número de ciclos para todos los conjuntos ordenados de BioTrove se ajustó a 32) no son suficientes para detectar la expresión. En este caso, el Ct real no se puede determinar y se encuentra en algún punto entre 32 e infinito.

No hay expresión. En este caso, el Ct real es infinito.

Fracasos técnicos: cebadores no adecuados, carga errónea (es muy difícil cargar uniformemente los conjuntos ordenados de BioTrove, especialmente los orificios a los lados del conjunto ordenado están frecuentemente vacíos), etc. En este caso, el Ct real puede variar entre 0 e infinito.

Algunos genes no se expresan realmente y ajustar su valor de Ct a algo que no sea infinito no es correcto. Para los genes que se expresan, pero para los que el valor de la expresión, debido a fracasos técnicos o limitaciones, no es conocido, ajustar el valor de Ct a infinito no es correcto. Asimismo, usar valores arbitrarios que están fuera del intervalo de expresión complica las rutinas de cálculo y las rutinas de visualización. Por lo tanto, se optó por retirar las combinaciones gen-experimento para las que no se detectaron datos de expresión correctos.

Un caso obvio de pares gen-experimento para los que no se detectó expresión son aquellos para los que no se pudo ajustar la curva a los datos de qPCR. A continuación, se detallan casos menos obvios.

Es habitual para los genes expresados que los valores de fluorescencia cubran un cierto intervalo. Los puntos de datos para los que este intervalo no era lo suficientemente alto se descartaron, ya que señalaban a curvas muy mal ajustadas y a datos generalmente malos. El intervalo de fluorescencia mínimo se ajustó a 400 (por tanto, Fmáx - Fmín > 400).

En una curva de amplificación buena, la primera (D1) y segunda (D2) derivadas están bastante próximas entre sí (véase la documentación de la función SOD en el paquete de qPCR (25)). Por lo tanto, todos los puntos de datos para los que la diferencia entre D1 y D2 era mayor que un valor arbitrario (se usó 7) se descartaron.

Para cada par de cebadores, se realizó un experimento de qPCR sin añadir ADN. Solo se añadió agua. Normalmente, no se debería observar expresión en esas muestras. Sin embargo, se detectó amplificación en agua para algunos pares de cebadores. Los genes para los que el valor de Ct (como se mencionó antes, se usó D2) era superior al valor de Ct del agua menos 5 se descartaron, ya que no se podía excluir que la fluorescencia procediera de la amplificación de los cebadores y no del ADN añadido.

Normalización y cálculo de los contrastes

Antes de calcular las diferencias de expresión, los valores de Ct se tienen que normalizar. Como se midieron tantos genes (1800), se pudo usar normalización de cuantiles (33). Los 1800 genes medidos se dividieron en 3 tipos de conjuntos ordenados, que contenían cada uno 600 genes. La normalización de cuantiles se realizó para cada tipo de conjunto ordenado por separado. Se construyó una tabla en la que las filas representaban los diferentes genes y las columnas los diferentes experimentos (T1, véase Ecuaciones 1). Cada columna se clasificó independientemente (T2) y se guardó la posición original de los elementos. Los valores de esta nueva tabla se sustituyeron con el valor medio en las diferentes filas (T3). Y, por último, esta tabla se transformó para que las posiciones de los valores correspondieran otra vez a las posiciones originales (T4).

Ecuaciones 1: Ejemplo de normalización de cuantiles

Las expresiones diferenciales se calcularon con los datos normalizados. Esto se realizó con el paquete R limma, que usa una estrategia bayesiana para calcular las relevancias estadísticas de las diferencias (31,32). Limma se adaptó para que fuera capaz de asumir datos perdidos: el paquete limma original descarta todos los valores de expresión de un gen en los diferentes experimentos cuando un valor de un experimento no está disponible. Esto dificulta el análisis cuando se tienen muchas condiciones diferentes, ya que, para cada gen para el que una de las condiciones experimentales no produce valores de expresión, se debe generar una matriz de contraste diferente que omita esa condición experimental. Por lo tanto, la función para ajustar los contrastes se adaptó para omitir puntos de datos con datos perdidos.

Las expresiones diferenciales se calcularon entre los valores de Ct y el valor medio de Ct para un determinado gen. Por tanto, cuanto más alto es el valor, más baja es la expresión. Para cada gen, se generaron representaciones gráficas que presentaban esas diferencias. Sin embargo, en esas curvas, los valores de Ct se invirtieron, por lo que cuanto más alto era el valor, más alta era la expresión.

Ejemplo 1: Efecto de las supresiones del gen arcA e icIR sobre la expresión genética de la biosíntesis de ácido colánico

Las Figuras 1 y 2 presentan el patrón de expresión de genes implicados en la biosíntesis de ácido colánico (35). Las mutaciones de desactivación de arcA o icIR únicas no afectaron a la expresión del operón en comparación con la cepa del tipo silvestre en condiciones por lotes y quimiostáticas. La cepa doble mutante, AarcAAiclR, sin embargo, mejoró la regulación de los genes del operón del ácido colánico 6 a 8 veces en comparación con el tipo silvestre y las cepas mutantes únicas en condiciones quimiostáticas y por lotes. Ambos reguladores tienen, por tanto, un efecto sorprendentemente cooperativo sobre la expresión de este operón que es independiente de la condición de cultivo que se aplica. Examinando la red reguladora de este operón, no se pudo encontrar un enlace directo entre ambos, ArcA e IcIR, y el factor de transcripción que controla el operón, RcsA (Figura 5). Solo ArcA está conectada con RcsA por medio de otros 3 factores de transcripción, que también están regulados al alza. Sin embargo, la cepa mutante con supresión de un único gen AArcA no afectó a la transcripción del operón.

Ejemplo 2: Efecto de las supresiones del gen arcA e icIR sobre la expresión genética de los genes de la biosíntesis de GDP-fucosa

Las Figuras 4 y 6 presentan la relación del operón del ácido colánico con la biosíntesis de GDP-fucosa. En la Figura 6 se presenta la regulación al alza de genes específicos de la biosíntesis de GDP-fucosa. Estas mutaciones, por tanto, mejoran la biosíntesis de GDP-fucosa, que es un precursor de oligosacáridos fucosilados tales como fucosillactosa, fucosillactoNbiosa y oligosacárido Lewis X o proteínas fucosiladas. Estos azúcares y proteínas, como ya se indicó anteriormente, tienen aplicaciones en usos terapéuticos como nutracéuticos, como componentes de la leche materna humana en la que tienen efectos antiinflamatorios y prebióticos (5, 8, 27).

Ejemplo 3: Mejora de la biosíntesis de GDP-fucosa y oligosacárido fucosilado

Las mutaciones AArcAAiclR aplicadas en combinación con otras mutaciones mejoran la producción de compuestos fucosilados. “Otra” primera modificación genética que mejora dicha producción es la supresión de wcaJ del operón colánico, que detiene el inicio de la biosíntesis de ácido colánico y, por tanto, la acumulación de GDP-fucosa. Además, se debe introducir una fucosiltransferasa para enlazar la fucosa con diferentes moléculas aceptoras tales como lactosa. El metabolismo se modifica a continuación adicionalmente para acumular el precursor de la ruta biosintética de GDP-fucosa. Estas modificaciones se presentan en la Figura 7. Además de wcaJ, se desactivan los genes del operón del ácido colánico que no codifican reacciones de biosíntesis de GDP-fucosa, tales como gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaK, wcaL y/o wcaM. Para la producción de fucosillactosa, se desactiva lacZ, que codifica p -galactosidasa, para evitar la degradación de lactosa y se mejora la expresión de lacY, que codifica una lactosa permeasa, por medio de un promotor constitutivo fuerte.

Ejemplo 4: Mejora de la producción de GDP-fucosa y oligosacárido fucosilado por medio de un metabolismo dividido con sucrosa como sustrato.

Para acumular el precursor de GDP-fucosa fructosa y fructosa-6-fosfato, se introduce una sucrosa fosforilasa o invertasa. Como la fructosa-6-fosfato se degrada fácilmente en la glicólisis, la glicólisis se interrumpe con el fin de dirigir toda la fructosa-6-fosfato en la dirección de GDP-fucosa. Por tanto, se desactivan los genes pgi, pfkA y pfkB, que codifican glucosa-6-fosfato isomerasa y fosfofructoquinasa A y B. Por último, se introduce una fucosiltransferasa para enlazar la fucosa a una molécula aceptora.

La velocidad de crecimiento de la cepa de tipo silvestre se ve algo afectada cuando se hace crecer en sucrosa después de la introducción de una sucrosa fosforilasa (BaSP) (plásmido con secuencia SEQ ID N° 2) (Tabla 2), sin embargo, la introducción de mutaciones de pgi y mutaciones dobles de pfkA y pfkB condujo a una reducción significativa de la velocidad de crecimiento, esta fue extremadamente baja (0,02 Ir1). La combinación de todas las mutaciones (Apgi y ApfkA y ApfkB) condujo a la velocidad de crecimiento más lenta, sin embargo, la velocidad de crecimiento en sucrosa y glucosa fue sorprendentemente similar a la del mutante único pgi.

Tabla 2: velocidades de crecimiento específicas de las cepas con desactivación de la glicólisis en un medio mínimo con glucosa y sucrosa

SEQ ID N° 2: Secuencia de plásmido con sucrosa fosforilasa BaSP

AATTCGGAGGAAACAAAGATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGC ATGAAAAACAAGGTGCAGCTCATCACTTACGCCGACCGCCTTGGCGACGGCACCATCAAG TCGATGACCGACATTCTGCGCACCCGCTTCGACGGCGTGTACGACGGCGTTCACATCCTG CCGTTCTTCACCCCGTTCGACGGCGCCGACGCAGGCTTCGACCCGATCGACCACACCAAG GTCGACGAACGTCTCGGCAGCTGGGACGACGTCGCCGAACTCTCCAAGACCCACAACATC ATGGTCGACGCCATCGTCAACCACATGAGTTGGGAATCCAAGCAGTTCCAGGACGTGCTG GCCAAGGGCGAGGAGTCCGAATACTATCCGATGTTCCTCACCATGAGCTCCGTGTTCCCG AACGGCGCCACCGAAGAGGACCTGGCCGGCATCTACCGTCCGCGTCCGGGCCTGCCGTTC ACCCACTACAAGTTCGCCGGCAAGACCCGCCTCGTGTGGGTCAGCTTCACCCCGCAGCAG GTGGACATCGACACCGATTCCGACAAGGGTTGGGAATACCTCATGTCGATTTTCGACCAG ATGGCCGCCTCTCACGTCAGCTACATCCGCCTCGACGCCGTCGGCTATGGCGCCAAGGAA GCCGGCACCAGCTGCTTCATGACCCCGAAGACCTTCAAGCTGATCTCCCGTCTGCGTGAG GAAGGCGTCAAGCGCGGTCTGGAAATCCTCATCGAAGTGCACTCCTACTACAAGAAGCAG GTCGAAATCGCATCCAAGGTGGACCGCGTCTACGACTTCGCCCTGCCTCCGCTGCTGCTG CACGCGCTGAGCACCGGCCACGTCGAGCCCGTCGCCCACTGGACCGACATACGCCCGAAC AACGCCGTCACCGTGCTCGATACGCACGACGGCATCGGCGTGATCGACATCGGCTCCGAC CAGCTCGACCGCTCGCTCAAGGGTCTCGTGCCGGATGAGGACGTGGACAACCTCGTCAAC ACCATCCACGCCAACACCCACGGCGAATCCCAGGCAGCCACTGGCGCCGCCGCATCCAAT CTCGACCTCTACCAGGTCAACAGCACCTACTATTCGGCGCTCGGGTGCAACGACCAGCAC TACATCGCCGCCCGCGCGGTGCAGTTCTTCCTGCCGGGCGTGCCGCAAGTCTACTACGTC GGCGCGCTCGCCGGCAAGAACGACATGGAGCTGCTGCGTAAGACGAATAACGGCCGCGAC ATCAATCGCCATTACTACTCCACCGCGGAAATCGACGAGAACCTCAAGCGTCCGGTCGTC AAGGCCCTGAACGCGCTCGCCAAGTTCCGCAACGAGCTCGACGCGTTCGACGGCACGTTC TCGTACACCACCGATGACGACACGTCCATCAGCTTCACCTGGCGCGGCGAAACCAGCCAG GCCACGCTGACGTTCGAGCCGAAGCGCGGTCTCGGTGTGGACAACGCTACGCCGGTCGCC ATGTTGGAATGGGAGGATTCCGCGGGAGACCACCGTTCGGATGATCTGATCGCCAATCCG CCTGTCGTCGCCTGACTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCAG GCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAA TCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTC CCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGG TCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAA AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAA TCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT TGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTC ATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT CAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCT CACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGT TACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGAC GCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC TCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCT GCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCG AAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGG GAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAA CAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTT CCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATC ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGG AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATT AAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATC CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCT TCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTA CCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGC

TTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCAC

TTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT

GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGAT

AAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG

ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAA

GGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGG

GAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA

CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC

AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCT

GCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCT

CGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTG

ATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTC

AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTG

ACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT

GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGAGCTCGATATC

CCGGGCGGCCGCTTCATTTATAAATTTCTTGACATTTTGGAATAGATGTGATATAATGTG

TACATATCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTCGACCTCG

Los redireccionamientos de flujo y las mutaciones para la biosíntesis de GDP-fucosa y oligosacárido fucosilado en un metabolismo dividido se presentan en la Figura 8, ambos para una cepa que expresa una invertasa y sucrosa fosforilasa heterólogas. Además de wcaJ, se desactivan los genes del operón del ácido colánico que no codifican reacciones de biosíntesis de GDP-fucosa, tales como gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaK, wcaL y/o wcaM. Para la producción de fucosillactosa, se desactiva lacZ, que codifica p -galactosidasa, para evitar la degradación de lactosa y se mejora la expresión de lacY, que codifica una lactosa permeasa, por medio de un promotor constitutivo fuerte.

Ejemplo 5: Mejora de la producción de GDP-fucosa y oligosacárido fucosilado por medio de un metabolismo dividido con glucosa como sustrato.

Cuando los genes pgi, pfkA y pfkB están desactivados, el carbono, absorbido como glucosa, solo se puede metabolizar por medio de la ruta de la pentosa fosfato. Debido a las propiedades bioquímicas de esta ruta, se forma fructosasfosfato (Figuras 9 y 10). Para formar biomasa se debe formar gliceraldehído-3-fosfato, que se forma mediante las reacciones de transcetolasa codificadas por tktA y tktB en E. coli. Este gliceraldehído-3-fosfato se forma junto con fructosa-6-fosfato a partir de xilulosa-5-fosfato y eritrosa-5-fosfato. Esta, a su vez, se forma junto con fructosa-6-fosfato a partir de gliceraldehído-3-fosfato y seudoheptulosa-7-fosfato por medio de reacciones de transaldolasa codificadas por talA y talB. Para equilibrar todas estas reacciones juntas, el flujo se debe distribuir entre xilulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato, de tal forma que, a partir de 1 mol de glucosa, se forman 2/3 moles de xilulosa-5-fosfato y 1/3 moles de ribosa-5-fosfato. Para impulsar estas reacciones de equilibrio, la fructosa-6-fosfato se retira de la ruta de la pentosa fosfato mediante la ruta de la biosíntesis de GDP-fucosa y oligosacárido fucosilado. Además de wcaJ, se desactivan los genes del operón del ácido colánico que no codifican reacciones de biosíntesis de GDP-fucosa, tales como gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaK, wcaL y/o wcaM. Para la producción de fucosillactosa, se desactiva lacZ, que codifica p -galactosidasa, para evitar la degradación de lactosa y se mejora la expresión de lacY, que codifica una lactosa permeasa, por medio de un promotor constitutivo fuerte.

Ejemplo 6: Producción de 2-fucosillactosa fermentativa con una fucosiltransferasa procedente de Helicobacterpylorí La cepa mutante en la que los genes lacZ, glgC, agp, pfkA, pfkB, pgi, arcA, icIR, wcaJ están desactivados y lacY se expresó por medio de expresión constitutiva para garantizar expresión en todas las condiciones de cultivo, se transformó adicionalmente con una fucosiltransferasa procedente de Helicobacter pylori y una sucrosa fosforilasa procedente de Bifidobacterium adolescentis, que también se expresaron constitutivamente. Los promotores constitutivos proceden de la biblioteca de promotores descrita por De Mey et al. 2007. Esta cepa se cultivó en un medio como se describió en los materiales y métodos, sin embargo, con 30 g/l de sucrosa y 50 g/l de lactosa. Esto dio como resultado la formación de 2-fucosillactosa como se presenta en la Figura 13 y 14.

Ejemplo 7: Producción de fucosillactosa fermentativa con una fucosiltransferasa procedente de Dictyostellium discoideum

La cepa mutante en la que los genes lacZ, glgC, agp, pfkA, pfkB, pgi, arcA, icIR, wcaJ están desactivados y lacY se expresó por medio de expresión constitutiva para garantizar la expresión en todas las condiciones de cultivo, se transformó adicionalmente con una fucosiltransferasa procedente de Dictyostellium discoideum y una sucrosa fosforilasa procedente de Bifidobacterium adolescentis, que también se expresaron constitutivamente. Los promotores constitutivos proceden de la biblioteca de promotores descrita por De Mey et al. 2007. Esta cepa se cultivó en un medio como se describió en los materiales y métodos, sin embargo, con 30 g/l de sucrosa y 50 g/l de lactosa. Esto dio como resultado la formación de 2-fucosillactosa como se presenta en la Figura 13 y 14.

Ejemplo 8: Mejora de la producción de GDP-manosa y oligosacárido manosilado por medio de un metabolismo dividido con sucrosa como sustrato

Para acumular los precursores de GDP-manosa fructosa y fructosa-6-fosfato, se introduce una sucrosa fosforilasa o invertasa. Como la fructosa-6-fosfato se degrada fácilmente en la glicólisis, la glicólisis se interrumpe con el fin de dirigir toda la fructosa-6-fosfato en la dirección de GDP-fucosa. Por tanto, se desactivan los genes pgi, pfkA y pfkB que codifican glucosa-6-fosfato isomerasa y fosfofructoquinasa A y. Por último, se introduce una manosiltransferasa para enlazar la manosa a una molécula aceptora. Para evitar la degradación de GDP-manosa, se deben desactivar los genes gmm y gmd en el operón del ácido colánico. Además, se desactivan los genes que no codifican reacciones de biosíntesis de GDP-manosa, tales como wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL y/o wcaM.

Ejemplo 9: Regulación al alza de genes relacionados con la resistencia a ácidos

De forma similar a la regulación al alza del operón del ácido colánico, también se regulan al alza los genes relacionados con la resistencia a ácidos en una cepa doble mutante AArcAAicIR en comparación con la cepa de tipo silvestre y las cepas mutantes únicas. Estos genes hacen una cepa más resistente a pH bajo, lo que es beneficioso para la producción de ácidos (4) o la producción de glucosamina (12), que no es estable a pH neutro y alto. La Figura 12 presenta el patrón de expresión genética de estos genes relacionados con la resistencia a ácidos e indica hasta 8 veces de aumento de la expresión en la cepa doble mutante.

Ejemplo 10: Producción discontinua de 2-fucosillactosa

Se construyó una cepa mutante por medio de metodologías de ingeniería genética descritas anteriormente con el genotipo siguiente:

AlacZYA::P22-lacYAglgCAagpApgiApfkA-P22-baSPApfkBAarcAAiclR::slAwcaJAIonAadhE-P14-frk pCXP14-FT_H. pylori (un vector con secuencia SEQ ID N° 1). Los promotores P22 y P14 proceden de la biblioteca de promotores construida por De Mey et al (11) y se clonaron de forma similar a la metodología descrita por Aerts et al (2). “ ::sl” marca una supresión de gen sin cicatrices, por tanto, sin un sitio FRT que permanece en el cromosoma.

Esta cepa se cultivó en un biorreactor como se describió en materiales y métodos, en el medio mineral con 30 g/l de sucrosa y 50 g/l de lactosa. Después de la fase por lotes, el biorreactor se alimentó con 500 g/l de sucrosa, 50 g/l de lactosa y 1 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado. Esto condujo a la acumulación de 27,5 g/l de fucosillactosa en el sobrenadante.

SEQID N° 1: pCXP14-FT_H. pylori

CGCGTTGGATGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCC

TGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCA

GTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCG

ATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGA

AAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTC

CTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGG

TGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTG

ACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAA

ATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGA

AGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC

TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG

GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTC

GCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTAT

TATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATG

ACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAG

AATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAA

CGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTC

GCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCA

CGATGCCTACAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTC

TAGC TTCCCGGCAACAATTAATAGACT GGAT GGAGGCGGATAAAGT TGCAGGACCAC TT C

TGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG

GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTA

TC TACACGACGGGGAGT CAGGCAAC TATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCT GAGATAG

GTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGA

TTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATC

TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAA

AGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAA

AAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTC

CGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGT

AGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCC

TGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGAC

GATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCA

GCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCG

CCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAG

GAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGT

TTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT

GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC Ejemplo 11: Producción discontinua de 2-fucosillactosa con un promotor híbrido de ácido colánico

Se construyó un promotor híbrido de ácido colánico basado en la información del genoma y las secuencias de la biblioteca de promotores descrita por De Mey et al (11).

AlacZYA::P22-lacYAglgCAagpApgiApfkA::P22-BaSPApfkB AarcAAiclR:sl AwcaJ Alon AadhE-P14-frk AldhA::P14-FT_H. pylori ApromCA:P14

Esta cepa se cultivó en un biorreactor como se describió en materiales y métodos, en el medio mineral con 30 g/l de sucrosa y 20 g/l de lactosa. Después de la fase por lotes, el biorreactor se alimentó con 500 g/l de sucrosa, 20 g/l de lactosa y 1 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado. Esto condujo a la acumulación de 26 g/l de fucosillactosa en el sobrenadante con conversión prácticamente estequiométrica de lactosa. Aumentar las concentraciones de alimentación de lactosa conduce además a títulos de fucosillactosa finales aumentados y conversión estequiométrica de lactosa.

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Warnecke, T., and R. T. Gill. 2005. Organic acid toxicity, tolerance, and production in Escherichia coli biorefining

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para regular al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico en una bacteria en comparación con la expresión de dichos genes dentro de una bacteria de tipo silvestre correspondiente, comprendiendo el método generar la disrupción de los genes codificantes de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, en donde dicho operón comprende los genes cpsG, cpsB, gmd y fcl que codifican una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa y GDP-fucosa sintasa, respectivamente.

2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha regulación al alza al alza de al menos uno de los genes del operón del ácido colánico está precedida por la regulación al alza del regulador transcripcional de dicho operón del ácido colánico rcsA.

3. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho microorganismo es una cepa de Escherichia coli, en donde dicha cepa de E. coli es específicamente una cepa K12 o, en donde dicha cepa K12 es más específicamente E. coli MG1655.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde al menos uno de los genes del operón del ácido colánico es regulado al alza 6 a 8 veces en comparación con la expresión del operón del ácido colánico en la bacteria de tipo silvestre correspondiente.

5. Un procedimiento para la síntesis de ácido colánico y/o GDP-fucosa y/u oligosacáridos fucosilados en una bacteria, que comprende: generar la disrupción de los genes codificantes de los reguladores transcripcionales, la proteína de control de la respiración aeróbica ArcA y el regulador de la isocitrato liasa IcIR, en dicha bacteria para regular al alza al menos uno de los genes del operón del ácido colánico, en donde dicho operón comprende los genes cpsG, cpsB, gmd y fcl.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en donde una mutación que mejora la producción de compuestos fucosilados se selecciona del grupo que consiste en: la supresión del gen wcaJ; desactivación de los genes del operón del ácido colánico gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL, wzx, wza, wzb, wzc y/o wcaM; desactivación de lacZ; introducción de una sucrosa fosforilasa o invertasa; desactivación de los genes pgi, pfkA y pfkB; desactivación del gen Ion; introducción de una fucosiltransferasa y/o una lactosa permeasa; o combinaciones de las mismas.

7. El procedimiento según la reivindicación 5, para la síntesis de GDP-manosa y/o para la síntesis de oligosacáridos manosilados.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en donde se regulan al alza los genes cpsG y cpsB del operón del ácido colánico y en donde:

a) se suprime el gen gmd del operón del ácido colánico, y/o

b) en donde se suprime el gen gmm, y/o

c) en donde se desactivan los genes del operón del ácido colánico fcl, gmd, gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, weal, wcaJ, wcaK, wcaL, wzx, wza, wzb, wzc y/o wcaM, y/o

d) en donde se introduce un gen que codifica una sucrosa fosforilasa o una invertasa, y/o

e) en donde se suprimen los genes pgi, pfkA y pfkB, y/o

f) se desactiva el gen Ion, y/o

g) en donde se introduce un gen codificante de una manosiltransferasa.

9. Una bacteria mutada y/o transformada en la que los reguladores ArcA e IcIR, en combinación con los genes codificantes de las enzimas fosfoglucosa isomerasa y fosfofructoquinasa, están desactivados.

10. La bacteria mutada y/o transformada según la reivindicación 9, en donde la enzima fosfoglucosa isomerasa está codificada por el gen pgi y en donde la enzima fosfofructoquinasa está codificada por el(los) gen(es) pfkA y/o pfkB.

11. La bacteria mutada y/o transformada según la reivindicación 9 o 10, en donde dicho organismo se transforma adicionalmente con un gen codificante de una sucrosa fosforilasa o invertasa.

12. La bacteria mutada y/o transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la actividad del gen codificante de una lactosa permeasa está aumentada.

13. La bacteria mutada y/o transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde al menos uno de los siguientes genes está desactivado o se ha hecho menos funcional:

un gen codificante de una beta-galactosidasa, un gen codificante de una glucosa-1-fosfato adenililtransferasa, un gen codificante de una glucosa-1-fosfatasa, un gen codificante de fosfogluconato deshidratasa, un gen codificante de 2-ceto-3-desoxigluconato-6-fosfato aldolasa, un gen codificante de una glucosa-1-fosfato uridiltransferasa, un gen codificante de una UDP-glucosa-4-epimerasa, un gen codificante de una UDP-glucosa:galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, un gen codificante de una UDPgalactopiranosa mutasa, un gen codificante de una UDP-galactosa:(glucosil)lipopolisacárido-1,6-galactosiltransferasa, un gen codificante de una UDP-galactosiltransferasa, un gen codificante de una UDP-glucosiltransferasa, un gen codificante de una UDP-glucuronato transferasa, un gen codificante de una UDP-glucosa transferasa al vehículo lipídico, un gen codificante de una GDP-manosa hidrolasa, un gen codificante de una UDP-azúcar hidrolasa, un gen codificante de una manosa-6-fosfato isomerasa, un gen codificante de una UDP-N-acetilglucosamina enoilpiruvoil transferasa, un gen codificante de una UDP-N-acetilglucosamina acetiltransferasa, un gen codificante de una UDP-Nacetilglucosamina-2-epimerasa, un gen codificante de una undecaprenil-fosfato alfa-N-acetilglucosaminil transferasa, un gen codificante de una glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa, y/o un gen codificante de una L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa, un gen codificante de una manosa-6-fosfato isomerasa, un gen codificante de una sorbitol-6-fosfato deshidrogenasa, un gen codificante de una manitol-1-fosfato-5-deshidrogenasa, un gen codificante de una alulosa-6-fosfato 3-epimerasa, un gen codificante de una invertasa, un gen codificante de una maltasa, un gen codificante de una trehalasa, un gen codificante de un fosfotransferasa transportadora de azúcar, un gen codificante de una proteasa, o un gen codificante de una hexoquinasa.