ES2734276T3 - Producción de polipéptidos glicosilados en microalgas - Google Patents

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Abstract

Un método para producir al menos un polipéptido glicosilado que tiene un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, que comprende las etapas de: (i) cultivar una microalga transformada de Phaeodactylum tricornutum, que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en las microalgas transformadas para obtener la expresión de dicho al menos un polipéptido glicosilado, y, (ii) seleccionar dicho al menos un polipéptido glicosilado para determinar el patrón de glicosilación de dicho al menos un polipéptido glicosilado y para seleccionar el al menos un polipéptido glicosilado que tiene al menos una estructura de Man9GlcNAc2 a Man5GlcNAc2 que no comprende xilosa con enlaces ß(1,2) y/o fucosa con enlaces α(1,3), en donde dichas microalgas transformadas no comparten ninguna actividad de ß(1,2) xilosil transferasa y/o α(1,3) fucosil transferasa antes de transformarse, y no comparten ninguna actividad de manosiltransferasa que conduce a proteínas hipermanosiladas que resultan de la adición de manosa a la estructura de glicano.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de polipéptidos glicosilados en microalgas
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a métodos para producir proteínas glicosiladas (glicoproteínas) en microalgas, teniendo dichos polipéptidos glicosilados patrones de glicosilación adecuados para fines terapéuticos.
Antecedentes de la invención
Después de que el DNA se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento adicional posterior a la traducción implica la unión de los restos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glicosilación (glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótidos) disponibles, de modo que los patrones de glicosilación, así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se expresa la proteína particular. Las bacterias típicamente no glicosilan las proteínas y, de ser así, solo de una manera muy inespecífica. Los eucariotas inferiores, tales como los hongos y levaduras filamentosas, agregan principalmente azúcares de manosa y manosilfosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano de tipo “polimanosa” o un manano.
Por el contrario, en eucariotas superiores tal como los humanos, las células vegetales y las células de insecto, la cadena lateral de oligosacáridos naciente puede recortarse para eliminar varios restos de manosa y alargarse con restos de azúcar adicionales que normalmente no se encuentran en los N-glicanos de eucariotas inferiores, tales como hongos y levaduras filamentosas. Esta síntesis comienza con un conjunto de reacciones secuenciales en el curso de las cuales los restos de azúcar se añaden y eliminan mientras la proteína se mueve a lo largo de la vía secretora en el organismo huésped. Sin embargo, las enzimas que residen en el aparato de Golgi del organismo o célula huésped difieren en sus especificidades y, por lo tanto, determinan los patrones de glicosilación resultantes de las proteínas secretadas.
Por lo tanto, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas tales como levadura, plantas o insectos, difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de proteínas expresadas en humanos y otros mamíferos.
Las primeras etapas de la glicosilación de proteínas de mamíferos se pueden dividir en al menos cuatro fases diferentes:
(i) los oligosacáridos unidos a lípidos se ensamblan mediante un conjunto secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplásmico (ER) y
(ii) la transferencia de este oligosacárido desde el pirofosfato de dolicol de anclaje lipídico sobre la proteína sintetizada novo. El sitio de la transferencia específica se define mediante un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y ácido aspártico.
(iii) el procesamiento adicional por glucosidasas y manosidasas se produce en el ER antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de cis-Golgi, donde los restos de manosa adicionales se eliminan mediante a l, 2-manosidasas específicas de Golgi.
(iv) el procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del aparato de Golgi. En la mediana del Golgi, un número de enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminiltransferasas (GnTI, GnTII, GnTNI, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y eliminan restos de azúcar específicos. Finalmente, en el trans-Golgi, galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) producen una estructura de glicoproteína que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi, tri y tetraantenarias, que contienen galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal que le da a las glicoproteínas sus características de mamífero.
En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas se derivan de un precursor de oligosacárido unido a lípidos común Glc3MangGlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y procesamiento de oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolicol son idénticos entre todos los eucariotas conocidos.
Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido central por las células de hongos, plantas o insectos una vez que se ha transferido a un péptido que sale del ER y entra al Golgi, difiere significativamente de los humanos a medida que se mueve a lo largo de la vía secretora e implica en el aparato de Golgi la adición de varios azúcares específicos del organismo.
Una fracción significativa de proteínas aisladas de humanos u otros animales se glicosila. Entre las proteínas utilizadas terapéuticamente, aproximadamente el 70% están glicosiladas. Sin embargo, si una proteína terapéutica se produce en un organismo huésped tal como levaduras u hongos, y está glicosilada utilizando la vía endógena, su eficacia terapéutica se reduce considerablemente. Dichas glicoproteínas son típicamente inmunogénicas en seres humanos y muestran una vida media reducida in vivo después de la administración. Los receptores específicos en humanos y animales pueden reconocer los restos de manosa terminales y promover la rápida eliminación de la proteína del torrente sanguíneo. Los efectos adversos adicionales pueden incluir cambios en el plegamiento de proteínas, solubilidad, susceptibilidad a las proteasas, tráfico, transporte, compartimentación, secreción, actividad biológica, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad o alergenicidad.
En consecuencia, ha sido necesario producir glicoproteínas terapéuticas en sistemas huéspedes de animales, de modo que el patrón de glicosilación sea idéntico o al menos similar al de los humanos o en las especies receptoras previstas. En la mayoría de los casos, se utiliza un sistema huésped de mamíferos, como el cultivo de células de mamíferos.
Para producir proteínas terapéuticas que tengan glicoformas apropiadas y tengan efectos terapéuticos satisfactorios, se han utilizado sistemas de expresión basados en plantas o animales. Los sistemas disponibles incluyen:
- células de ovario de hámster chino (CHO), células de fibroblastos de ratón y células de mieloma de ratón; - animales transgénicos como cabras, ovejas, ratones y otros;
- levaduras (tal como S. pombe, S. cerevisiae, P. pastoris), bacterias (tal como E. Coli), hongos (tal como A. nidulans, T. ressei);
- plantas (tal como A. thaliana, N. tabacum, M. sativa etc.);
- células de insectos (tal como S. frugiperda Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, etc. en combinación con baculovisus recombinantes tales como el virus de polihedrosis nuclear múltiple de A. californica que infecta las células lepidópteras).
Las proteínas humanas recombinantes expresadas en los sistemas huésped anteriormente mencionados pueden incluir además glicoformas no humanas. En particular, la fracción de los N-glicanos puede carecer de ácido siálico terminal, que se encuentra típicamente en las glicoproteínas humanas. Se han dirigido esfuerzos sustanciales para desarrollar procesos para obtener glicoproteínas que estén lo más cerca posible de la estructura de las formas humanas, o que tengan otras ventajas terapéuticas, tal como tener glicoformas específicas que pueden ser especialmente útiles, por ejemplo, en la selección de proteínas terapéuticas. Por ejemplo, la adición de uno o más restos de ácido siálico a una cadena lateral del glicano puede aumentar la vida útil de una glicoproteína terapéutica in vivo después de la administración. En consecuencia, las células huésped de mamíferos pueden modificarse genéticamente para aumentar la extensión del ácido siálico terminal en las glicoproteínas expresadas en las células. Alternativamente, el ácido siálico puede conjugarse con la proteína de interés in vitro antes de la administración utilizando una sialiltransferasa y un sustrato apropiado. Además, los cambios en la composición del medio de crecimiento o la expresión de las enzimas implicadas en la glicosilación humana se han empleado para producir glicoproteínas que se parecen más a las formas humanas. Alternativamente, pueden utilizarse células humanas cultivadas.
Sin embargo, todos los sistemas existentes tienen inconvenientes significativos. Solo ciertas proteínas terapéuticas son adecuadas para la expresión en sistemas animales o vegetales (por ejemplo, aquellas que carecen de cualquier efecto citotóxico u otro efecto adverso al crecimiento).
Los sistemas de cultivo de células animales y vegetales pueden ser muy lentos, y con frecuencia requieren hasta una semana de crecimiento en condiciones cuidadosamente controladas para producir cualquier cantidad útil de la proteína de interés. No obstante, los rendimientos proteicos se comparan desfavorablemente con los de los procesos de fermentación microbiana. Además, los sistemas de cultivo de células animales requieren típicamente nutrientes y cofactores complejos y costosos, tal como el suero fetal bovino. Además, el crecimiento puede estar limitado por la muerte celular programada (apoptosis).
Además, las células animales (particularmente las células de mamíferos) son altamente susceptibles a la infección o contaminación viral. En algunos casos, el virus u otro agente infeccioso puede comprometer solo el crecimiento del cultivo, mientras que en otros casos; este agente puede ser un patógeno humano que hace que el producto proteico terapéutico no sea apto para su uso previsto. Además, muchos procesos de cultivo celular requieren el uso de componentes de medios de crecimiento derivados de animales complejos, sensibles a la temperatura, que pueden transportar patógenos como los priones de encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Dichos patógenos son difíciles de detectar y/o difíciles de eliminar o esterilizar sin comprometer el medio de crecimiento. En cualquier caso, el uso de células animales para producir proteínas terapéuticas requiere controles de calidad costosos para garantizar la seguridad del producto.
Los animales transgénicos pueden utilizarse también para fabricar grandes volúmenes de proteínas terapéuticas tales como albúmina sérica humana, activador tisular del plasminógeno, anticuerpos monoclonales, hemoglobina, colágeno, fibrinógeno y otros. Si bien las cabras transgénicas y otros animales transgénicos (ratones, ovejas, vacas, etc.) pueden diseñarse genéticamente para producir proteínas terapéuticas en altas concentraciones en la leche, el proceso es costoso ya que cada lote debe someterse a un riguroso control de calidad. Los animales pueden albergar una variedad de patógenos humanos o animales, incluyendo bacterias, virus, hongos y priones. En el caso de los rasguños y la encefalopatía espongiforme bovina, las pruebas pueden demorar aproximadamente un año para descartar una infección. La producción de compuestos terapéuticos se lleva a cabo preferiblemente en un ambiente estéril bien controlado, por ejemplo, bajo buenas condiciones de fabricación (GMP). Sin embargo, generalmente no es factible mantener animales en dichos ambientes. Además, mientras que las células cultivadas en un fermentador se derivan de un Master Cell Bank (MCB) bien caracterizado, la tecnología de los animales transgénicos se basa en diferentes animales y, por lo tanto, es inherentemente no uniforme. Además, factores externos tal como la absorción de alimentos, la enfermedad y la falta de homogeneidad dentro de un hato pueden afectar los patrones de glicosilación del producto final. Se sabe que, en los seres humanos, por ejemplo, los diferentes hábitos alimenticios dan como resultado diferentes patrones de glicosilación.
Las plantas transgénicas se han desarrollado como una fuente potencial para obtener proteínas de valor terapéutico. Sin embargo, el alto nivel de expresión de proteínas en plantas sufre de silenciamiento génico, un mecanismo por el cual los genes para proteínas altamente expresadas son posteriormente regulados en las siguientes generaciones de plantas. Además, las plantas añaden xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3) a los N-glicanos de la proteína, dando como resultado glicoproteínas que difieren en la estructura de los animales y son inmunogénicas en los mamíferos. Además, generalmente no es práctico cultivar plantas en un ambiente estéril o GMP, y la recuperación de proteínas de los tejidos de las plantas es más costosa que la recuperación de microorganismos fermentados.
Los sistemas de levaduras u hongos transgénicos también presentan el inconveniente de expresar los genes de la manosiltransferasa, que añade manosa a la estructura del glicano y conduce a proteínas hipermanosiladas.
En conclusión, todos los sistemas diferentes descritos aquí anteriormente presentan importantes inconvenientes en términos de inmunogenicidad de las proteínas glicosiladas producidas.
Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un sistema alternativo y eficaz para producir glicoproteínas recombinantes que tengan un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos.
El solicitante encontró sorprendente que microalgas tales como Phaeodactylum tricornutum (P. tricornutum) son capaces de producir polipéptidos que albergan de MansGlcNAc2 a MangGlcNAc2 a través de su maquinaria endógena de N-glicosilación. El análisis de los N-glicanos de otras microalgas representativas también reveló la presencia de oligosacáridos del tipo de manosa alta en sus proteínas. Por lo tanto, las microalgas presentan la ventaja de permitir la producción de proteínas con un cierto patrón de glicosilación sin necesidad de la supresión de los genes responsables de la adición de epítopos inmunogénicos, tal como en plantas o levaduras. Este descubrimiento fue inesperado ya que se pensaba que las microalgas producían proteínas con un patrón de glicosilación de la planta y, eventualmente, un patrón de glicosilación de hongos o levaduras. Esta idea se ilustra bien en la solicitud de Patente PCT WO 2006/013572 que describe la producción de un antígeno glicosilado de hepatitis BS (HBsAg) en microalgas rojas y sugiere “humanizar” el patrón de glicosilación de productos recombinantes sintetizados en microalgas rojas (página 16, líneas 4 a 8) por:
• inactivación en dichas microalgas de a-manosidasa I y N-acetilglucosaminiltransferasa (página 16, líneas 29-33), enzimas que están implicadas en la levadura y en los hongos en la adición de una manosa a la estructura del glicano conduciendo a proteínas hipermanosiladas); e
• inactivación de la a (1,3)-fucosiltransferasa y la p (1,2)-xilosiltransferasa (página 17, líneas 16-22 y líneas 1­ 5), enzimas que están implicadas en las plantas en la adición de xilosa con enlaces p (1,2) y fucosa con enlaces a (1,3) a los N-glicanos de la proteína.
Las microalgas presentan también la ventaja de cultivarse en fotobiorreactores confinados, por lo que supera el problema de la diseminación de genes en el medio ambiente y el problema de la transmisión del virus a los animales. Además, el sistema de cultivo de microalgas es muy rápido, proporciona un excelente rendimiento en biomasa y solo requiere agua de mar o agua dulce, elementos nutritivos, carbono y luz.
Compendio de la invención
La solicitud describe las microalgas transformadas que comprenden una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en las microalgas transformadas.
Estas microalgas permiten la producción de dicho polipéptido glicosilado con un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos en animales sin la necesidad de la supresión de los genes responsables de la adición de epítopos inmunogénicos tales como en plantas, que añaden xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3) a los N-glicanos de la proteína dando como resultado glicoproteínas que difieren en la estructura de los animales y son inmunogénicas en mamíferos, o levaduras que expresan los genes de manosiltransferasa añadiendo una mañosa a la estructura de glicano y que conducen a proteínas hipermanosiladas.
Estas microalgas no comparten ninguna actividad de p (1,2)-xilosiltransferasa y/o a (1,3)-fucosil transferasa antes de transformarse.
Estas microalgas no comparten ninguna actividad de la manosiltransferasa que conduzca a proteínas hipermanosiladas resultantes de la adición de manosa a la estructura del glicano como se observa en la levadura y en los hongos.
El polipéptido glicosilado expresado en la microalga transformada comprende un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos.
El polipéptido glicosilado expresado en la microalga transformada comprende al menos una estructura de Man5GlcNAc2.
Estas microalgas se seleccionan entre algas verdes, algas rojas, cromalveolados, y euglénidos; preferiblemente, dichas microalgas se seleccionan entre clorófitas, euglénidos, haptofitas, prasinofitas y diatomeas.
El polipéptido glicosilado se selecciona del grupo que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado no-humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, y/o una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado no de mamífero.
El polipéptido glicosilado es un polipéptido animal, de mamífero o humano.
Estas microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I que se expresa en la microalga transformada.
Estas microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una manosidasa II que se expresa en la microalga transformada.
Las microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II que se expresa en la microalga transformada.
Las microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima seleccionada entre N-acetilglucosaminiltransferasa II, III, IV, V y VI que se expresa en la microalga transformada.
Las microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima glicosiltransferasa seleccionada entre galactosiltransferasa, fucosiltransferasa y sialiltransferasa, que se expresa en la microalga transformada.
La secuencia de nucleótidos, operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión de N-acetilglucosaminiltransferasas, manosidasa II o glicosiltransferasas en dichas microalgas, comprende dicho domino catalítico de la enzima que tiene una actividad óptima en dicho ER y Golgi a un pH entre 5,1 y 8, unido a una señal de direccionamiento celular no asociada normalmente con el dominio catalítico.
La solicitud también describe microalgas transformadas que comprenden una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa que se expresa en las microalgas transformadas. Estas microalgas comprenden también una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una manosidasa II que se expresa en las microalgas transformadas.
Estas microalgas comprenden también una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II que se expresa en las microalgas transformadas.
Estas microalgas comprenden también una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima seleccionada entre N-acetilglucosaminiltransferasa II, III, IV, V y VI que se expresa en las microalgas transformadas.
Estas microalgas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima glicosiltransferasa seleccionada entre galactosiltransferasa, fucosiltransferasa y sialiltransferasas que se expresan en las microalgas transformadas.
Las secuencias de nucleótidos, unidas operativamente a promotores que impulsan la expresión de N-acetilglucosaminiltransferasas, manosidasa II o glicosiltransferasas en dichas microalgas, comprenden dicho dominio catalítico de la enzima que tiene una actividad óptima en dicho ER y Golgi a un pH entre 5,1 y 8, unido a una señal de direccionamiento celular no asociada generalmente con el dominio catalítico.
Estas microalgas se seleccionan entre algas verdes, algas rojas, cromalveolados, y euglénidos.
Un objetivo de la invención es un método para producir al menos un polipéptido glicosilado que tiene un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, que comprende las etapas de:
(i) cultivar unas microalgas transformadas de Phaeodactylum tricornutum que comprenden una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en las microalgas transformadas para obtener la expresión de dicho al menos un polipéptido glicosilado, y,
(ii) seleccionar dicho al menos un polipéptido glicosilado para determinar el patrón de glicosilación de dicho al menos un polipéptido glicosilado y para seleccionar el al menos un polipéptido glicosilado que tiene al menos una estructura de MangGlcNAc2 a MansGlcNAc2 y no comprende xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3),
en donde dichas microalgas transformadas no comparten ninguna actividad de p (1,2)-xilosiltransferasa y/o a (1,3)-fucosil transferasa antes de transformarse, y no comparten ninguna actividad de la manosiltransferasa que conduzca a proteínas hipermanosiladas resultantes de la adición de manosa a la estructura del glicano.
En otra realización, dicho método comprende la etapa de aislamiento del polipéptido glicosilado recombinante después del paso de dicho polipéptido glicosilado recombinante a través del ER y del aparato de Golgi de las microalgas transformadas.
En otra realización, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I que se expresa en las microalgas transformadas.
En otra realización, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima manosidasa II que se expresa en las microalgas transformadas.
En otra realización, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II que se expresa en las microalgas transformadas.
En otra realización, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima seleccionada entre N-acetilglucosaminiltransferasa II, III, IV, V y VI que se expresa en las microalgas transformadas.
En otra realización, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima glicosiltransferasa seleccionada entre galactosiltransferasa, fucosiltransferasa y sialiltransferasa que se expresan en las microalgas transformadas.
Otro objetivo de la invención es el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención.
La solicitud describe también una composición farmacéutica que comprende el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención.
La solicitud describe también una composición farmacéutica que comprende el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención.
La solicitud describe también el uso de las microalgas transformadas como se definió previamente para producir un polipéptido glicosilado que tiene al menos una estructura de MangGlcNAc2 a MansGlcNAc2.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Vía de la N-glicosilación en Phaeodactylum tricornutum basada en el análisis bioinformático del genoma. Las secuencias putativas identificadas en el genoma de Phaeodactylum tricornutum de la vía de la N-glicosilación se han indicado en negrita y cursiva en este esquema. Los N-glicanos del tipo de alta manosa en negrita se identificaron mediante el análisis estructural de oligosacáridos unidos a N a proteínas aisladas de la cepa P.t.1.8.6 fusiforme de P. tricornutum cultivada en condiciones estándar.
Figura 2. Glicoproteínas de Phaeodactylum tricornutum albergan oligosacáridos unidos a N reconocidos por concanavalina A
(a) Afinodetección utilizando concanavalina A e inmunodetección utilizando anticuerpos generados frente a epítopos del núcleo p 1,2-xilosa y núcleo a 1,3-fucosa de proteínas aisladas de cebolla verde (carril 1) y de la cepa P.t.1.8.6 fusiforme de P. tricornutum (carril 2).
(b) Afinodetección mediante concanavalina A de un extracto de proteína aislado de la cepa P.t.1.8.6. fusiforme de P. tricornutum, tratada o no por endoglicosidasa H (Endo H) y péptido N-glicosidasa F (PNGasa F).
Figura 3. Glicanos unidos a N de Phaeodactylum tricornutum son estructuras del tipo de alta manosa. MALDI-TOF MS de los glicanos unidos a N liberados de glicoproteínas aisladas de la cepa Pt 1.8.6 de P. tricornutum cultivada en condiciones estándar y marcadas con 2-aminobenzamida.
Figura 4. Glicanos unidos a N de las microalgas representativas son estructuras del tipo de alta manosa.
A. Afinodetección de N-glicanos de alta manosa mediante concanavalina A de proteínas de Euglena, Tetraselmis, Pavlova, Rhodella,
B. Afinodetección de N-glicanos de alta manosa mediante concanavalina A de proteínas de Skeuletonema, Heterocapsa, Amphora, Chaetoceros, Naviculas, Nanochloropsis.
C. Afinodetección mediante anticuerpos de anti a-1,3 fucosa de proteínas de Skeuletonema, Heterocapsa, Amphora, Chaetoceros, Naviculas, Nanochloropsis.
D. Afinodetección mediante anticuerpos de p-1,2 xilosa de proteínas de Skeuletonema, Heterocapsa, Amphora, Chaetoceros, Naviculas, Nanochloropsis.
Figura 5. Constructos pZEPO y pZEPOHis.
Figura 6. Análisis de DNA de EPO recombinante y transcriptos mediante PCR (A) y RT-PCR (B).
Figura 7. Análisis de las proteínas EPO recombinante mediante transferencia de Western.
Figura 8. Vía de la N-glicosilación humanizada.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Como se utiliza en la presente memoria, un “polipéptido glicosilado” se refiere a un polipéptido con N-glicosilación. Como se utiliza en la presente memoria, el término “N-glicano” se refiere a un oligosacárido unido a N, por ejemplo, uno que está unido mediante un enlace asparagina-N-acetilglucosamina a un resto de asparagina de un polipéptido. Los N-glicanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 (“Man” se refiere a manosa; “Glc” se refiere a glucosa; y “NAc” se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). El término “núcleo de trimanosa” utilizado con respecto al N-glicano se refiere también a la estructura de Man3GlcNAc2 (“Man3”). El término “núcleo de pentamanosa” o “núcleo de Manosa-5” o utilizado con respecto al N-glicano se refiere a la estructura MansGlcNAc2. Los N-glicanos difieren con respecto al número de ramificaciones (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GlcNAc, fucosa y ácido siálico) que se unen a la estructura del núcleo Man3. Los N-glicanos se clasifican según sus constituyentes ramificados (por ejemplo, manosa alta, complejo o híbrido).
Como se utiliza en la presente memoria, un N-glicano del tipo “alta manosa” tiene de cinco a nueve restos de manosa. Un N-glicano del tipo “poli-manosa” tiene más de nueve restos de manosa. Un N-glicano del tipo “complejo” tiene típicamente al menos un GlcNAc unido al brazo de la a 1,3-manosa y al menos un GlcNAc unido al brazo del la a 1,6-manosa del núcleo de trimanosa. Los N-glicanos complejos pueden tener también restos de galactosa (“Gal”) que están opcionalmente modificados con ácido siálico o derivados (“NeuAc”, donde “Neu” se refiere a un ácido neuramínico y “Ac” se refiere a acetilo). Un N-glicano complejo tiene típicamente al menos una ramificación que termina en un oligosacárido tal como, por ejemplo: NeuAc-; NeuAca2-6GalNAca1-; NeuAca2-3Gal 1-3GalNAca1-3; NeuAca2-3/6Gal1-4GlcNAc1-; GlcNAca1-4Gal1-(solo mucinas); Fuca1-2Gal1-(grupo sanguíneo H). Los ésteres de sulfato se pueden producir en galactosa, GalNAc, y restos GIcNAc, y los ésteres de fosfato se pueden producir en restos de manosa. NeuAc puede estar O-acetilado o reemplazado por NeuGc (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glicanos complejos pueden tener también sustituciones dentro de la cadena que comprenden “bisecciones” de GlcNAc y núcleo de Fucosa (“Fuc”). Un N-glicano “híbrido” tiene al menos un GlcNAc en el extremo del brazo de la a 1,3-manosa del núcleo de trimanosa y ninguna o más manosas en el brazo del la a 1,6-manosa del núcleo de trimanosa.
Como se utiliza en la presente memoria, un “patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos” se refiere a polipéptidos que tienen al menos una estructura de MangGlcNAc2 a MansGlcNAc2 (MangGlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, MansGlcNAc2) y polipéptidos que tienen estructuras de N-glicanos complejos como se describió aquí anteriormente.
El término “predominante” o “predominantemente” utilizado con respecto a la producción de N-glicanos se refiere a una estructura que representa el ion principal detectado mediante el análisis de espectrometría de masas del tiempo de ionización de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS).
Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria son de uso común en la técnica, véase, por ejemplo, abreviaturas de azúcares, anteriores. Otras abreviaturas comunes incluyen “PNGasa”, que se refiere al péptido N-glicosidasa, “GlcNAc T” o “GnT” que se refiere a las enzimas N-acetilglucosaminiltransferasa; “NeuAc” se refiere al ácido N-acetilneuramínico.
Como se utiliza en la presente memoria, una “glicoproteína o proteína humanizada” o una “glicoproteína de tipo humano” se refiere alternativamente a una proteína que tiene unida a ella los N-glicanos que tienen menos de cuatro restos de manosa, e intermedios de glicoproteína sintéticos (que son también útiles y se pueden manipular además in vitro o in vivo) que tienen al menos cinco restos de manosa. Preferiblemente, las glicoproteínas producidas según la invención contienen al menos 30% en moles, preferiblemente al menos 40% en moles y más preferiblemente 50, 60, 70, 80, 90, o incluso 100% en moles del intermedio MansGlcNAc2, al menos de forma transitoria. Esto se puede lograr, por ejemplo, diseñando una célula huésped de la invención para expresar una “mejor”, es decir, una vía de glicosilación más eficiente. Por ejemplo, una manosidasa se selecciona de modo que tenga una actividad óptima en las condiciones presentes en el sitio en la célula huésped donde las proteínas están glicosiladas y se introduce en la célula huésped preferiblemente dirigiendo la enzima a un orgánulo de la célula huésped donde se desea la actividad. El término “enzima”, cuando se utiliza en la presente memoria en relación con la alteración de la glicosilación de la célula huésped, se refiere a una molécula que tiene al menos una actividad enzimática, e incluye enzimas de longitud completa, fragmentos catalíticamente activos, quiméricos, complejos y similares. “Fragmento catalíticamente activo” de una enzima se refiere a un polipéptido que tiene un nivel detectable de actividad funcional (enzimática). La actividad de la enzima es “sustancialmente intracelular” cuando menos del 10% de la actividad de la enzima se puede medir fuera de la célula en comparación con la medida de las células lisadas.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “vía de secreción” se refiere a la línea de ensamblaje de varias enzimas de glicosilación a las que se exponen secuencialmente un precursor de oligosacárido unido a lípidos y un sustrato de N-glicano, siguiendo el flujo molecular de una cadena polipeptídica naciente desde el citoplasma hasta el retículo endoplásmico (ER), a los compartimentos del aparato de Golgi y a su destino final. Se dice que las enzimas se localizan a lo largo de esta vía. Una enzima X que actúa sobre un glicano unido a lípidos o sobre un N-glicano antes de que se diga que la enzima Y es o actúa “anterior” a la enzima Y; de manera similar, la enzima Y es o actúa “posterior” a la enzima X.
El término “péptido de direccionamiento” como se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencias de aminoácidos que median la localización (o retención) de una secuencia asociada a localizaciones subcelulares, por ejemplo, orgánulos.
El término “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. El término incluye moléculas de DNA (por ejemplo, cDNa o DNA genómico o sintético) y moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA o RNA sintético), así como análogos de DNA o RNA que contienen análogos de nucleótidos no naturales, enlaces internucleósidos no nativos, o ambos. El ácido nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, tricatenario, cuádruple, parcialmente bicatenario, ramificado, en forma de horquilla, circular, o en una conformación con candado. El término incluye formas de DNA de cadena simple o doble. Una molécula de ácido nucleico de esta invención puede incluir tanto cadenas con sentido como antisentido de RNA, cDNA, DNA genómico, y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Ellos se pueden modificar química o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótidas tales como enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotiatos, fosforoditiatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada a través de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces peptídicos sustituyen a los enlaces fosfato en el esqueleto de la molécula.
El término “microalgas transformadas” se refiere a microalgas en donde una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor se ha introducido mediante métodos convencionales de transformación (por ejemplo, bombardeo de micropartículas, electroporación, perlas de vidrio, polietilenglicol (PEG), patillas de carburo de silicio, o usos de virus o agrobacterias) para expresar dicha molécula de ácido nucleico en el núcleo de dichas microalgas.
Un ácido nucleico o polinucleótido “aislado” o “sustancialmente puro” (por ejemplo, un RNA, DNA o un polímero mixto) es uno que se separa sustancialmente de otros componentes celulares que acompañan de manera natural al polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, y secuencias genómicas con las que se asocia naturalmente. El término abarca un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha eliminado de su entorno natural, (2) no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido que no está unido en la naturaleza, o (4) no está en la naturaleza. El término “aislado” o “sustancialmente puro” también se puede utilizar en referencia a aislados de DNA clonados o recombinantes, análogos de polinucleótidos sintetizados químicamente, o análogos de polinucleótidos que se sintetizan biológicamente mediante sistemas heterólogos.
Como se utiliza en la presente memoria, la frase “variante degenerada” de una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de ácidos nucleicos que se pueden traducir, según los códigos genéticos estándar, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia.
El término “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden utilizar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos se pueden comparar utilizando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madinson, Wisconsin. FASTA proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda.
El término “homología sustancial” o “similitud sustancial” cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando está alineado de manera óptima con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente el 60% de las bases de nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente el 70%, más usualmente al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos medido mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST O Gap, como se explicó anteriormente.
Alternativamente, existe una homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo se hibrida con otro ácido nucleico, con una cadena de otro ácido nucleico, o con la cadena complementaria del mismo, en condiciones de hibridación rigurosas. Las “condiciones de hibridación rigurosas” y las “condiciones de lavado rigurosas” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos dependen de varios parámetros físicos diferentes. La hibridación del ácido nucleico se verá afectada por condiciones tales como la concentración de sal, la temperatura, los disolventes, la composición base de las especies que se hibridan, la longitud de las regiones complementarias y el número de desajustes de bases de nucleótidos entre los ácidos nucleicos que se hibridan, como se apreciará fácilmente por los expertos en la técnica. Un experto en la técnica sabe como variar estos parámetros para lograr una rigurosidad particular de la hibridación. En general, la “hibridación rigurosa” se realiza aproximadamente a 25°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para el híbrido de DNA específico en un conjunto particular de condiciones. El “lavado riguroso” se realiza a temperaturas aproximadamente de 5°C más bajas de la Tm para el híbrido de DNA específico en un conjunto particular de condiciones. La Tm es la temperatura a la que el 50% de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Por ejemplo, se pueden definir “condiciones de alta rigurosidad” para la hibridación en la fase de disolución como hibridación acuosa (es decir, libre de formamida) en 6X SSC (donde 20X SSC contiene NaCl 3,0 M y citrato de sodio 0,3 M), SDS al 1% a 65°C durante 8-12 horas, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C durante 20 minutos. El experto en la técnica apreciará que la hibridación a 65°C se producirá a diferentes velocidades dependiendo de una serie de factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se hibridan.
El término “mutados” cuando se aplica a secuencias de ácidos nucleicos significa que los nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos se pueden insertar, eliminar o cambiar en comparación con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia. Se puede realizar una única alteración en un locus (una mutación puntual) o se pueden insertar, eliminar o cambiar múltiples nucleótidos en un solo locus. Además, se pueden hacer una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de ácidos nucleicos. Una secuencia de ácidos nucleicos puede mutarse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, técnicas de mutagénesis tal como la “PCR propensa a errores” (un proceso para realizar una PCR en condiciones en las que la fidelidad de copia de la DNA polimerasa es baja, de modo que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de la PCR).
El término “vector” como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle circular de DNA bicatenario en el que se pueden unir segmentos de DNA adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de DNA adicionales pueden unirse en el genoma viral (descrito con más detalle a continuación). Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores preferidos son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria como “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión”).
Secuencias de control de expresión “operativamente unidas” se refieren a un enlace en el que la secuencia de control de expresión es contigua al gen de interés para controlar el gen de interés, así como las secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.
El término “secuencia de control de expresión” como se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para afectar a la expresión de las secuencias codificantes a las que se unen operativamente. Las secuencias de control de expresión son secuencias que controlan la trascripción, los eventos post-transcripcionales y la traducción de las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales de procesamiento de RnA eficientes, tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el mRNA citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (por ejemplo, los sitios de unión a ribosomas); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio de unión del ribosoma y la secuencia de terminación de la transcripción. El término “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, las secuencias líderes y las secuencias asociadas de fusión. El término “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”), como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico tal como un vector recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no solo a la célula objeto en particular, sino a la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones se pueden producir en generaciones sucesivas debido tanto a mutaciones como a influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula madre, pero aún están incluidas dentro del alcance del término “célula huésped” como se utiliza en la presente memoria. Una célula huésped recombinante puede ser una célula aislada o una línea celular que crece en cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo.
El término “péptido” como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que típicamente tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos de largo y más típicamente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de largo. El término como se utiliza en la presenta memoria abarca análogos y miméticos que imitan la función estructural y, por lo tanto, la biológica.
El término “polipéptido” como se utiliza en la presente memoria abarca tanto proteínas naturales como no naturales, y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de los mismos. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender varios dominios diferentes, cada uno de los cuales tiene una o más actividades distintas.
El término “proteína aislada” o “polipéptido aislado” es una proteína o polipéptido que, en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) cuando existe en una pureza no encontrada en la naturaleza, donde la pureza puede adjudicarse con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, está libre de otras proteínas de la misma especie) (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido que se encuentra en la naturaleza o incluye análogos o derivados de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza o enlaces distintos a los enlaces peptídicos estándar). Por lo tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula a partir de la cual se origina naturalmente se “aislará” de sus componentes asociados de forma natural. Un polipéptido o proteína también pueden preparase sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural por aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica. Tal como se define así, “aislado” no requiere necesariamente que la proteína, el polipéptido, el péptido u el oligopéptido así descrito se hayan eliminado físicamente de su entorno nativo.
El término “fragmento polipeptídico” como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 12, 14, 16 o 18 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de al menos 20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de al menos 25, 30, 35, 40 o 45 aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 50 o 60 aminoácidos de longitud, y aún más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud.
Un “derivado modificado” se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en la secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas o bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en el polipéptido nativo. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, etiquetado, por ejemplo, con radionucleótidos y diversas modificaciones enzimáticas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Una variedad de métodos para marcar polipéptidos y sustituyentes o etiquetas útiles para dichos fines son bien conocidos en la técnica, e incluyen isotopos radioactivos tales como 125I, 32P, 35S, y 3H, ligandos que se unen a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas, y antiligandos que pueden servir como miembros de pares de unión específicos para un ligando marcado. La elección de la etiqueta depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el cebador, los requisitos de estabilidad y la instrumentación disponible. Los métodos para marcar polipéptidos son bien conocidos en la técnica.
Un “polipéptido mutante” o “muteína” se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción, duplicación, deleción, reorganización o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo nativo. Una muteína puede tener una o más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que un solo aminoácido en una posición se ha cambiado a otro aminoácido, una o más inserciones y/o deleciones, en las que se insertan o eliminan uno o más aminoácidos respectivamente, en la secuencia de la proteína natural, y/u omisiones de la secuencia de aminoácidos en uno o ambos extremos amino o carboxi. Una muteína puede tener la misma, pero preferiblemente tiene una actividad biológica diferente en comparación con la proteína natural. Una muteína tiene al menos un 70% de homología de secuencia global con su homólogo de tipo nativo. Incluso más preferidas son las muteínas que tienen una homología de secuencia global del 80%, 85% o 90% con la proteína de tipo nativo. En una realización aún más preferida, una muteína muestra un 95% de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente un 97%, incluso más preferiblemente un 98% e incluso más preferiblemente un 99% de identidad de secuencia global. La homología de secuencia se puede medir mediante cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, como Gap o Bestfit. Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran la afinidad de unión o actividad enzimática, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Como se utiliza en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional.
Una proteína tiene “homología” o es “homóloga” a una segunda proteína si la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la segunda proteína. Alternativamente, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos “similares”. (Por lo tanto, el término “proteínas homólogas” se define para significar que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares). En una realización preferida, una proteína homóloga es una que muestra un 60% de homología de secuencia con la proteína de tipo nativo, más preferido es un 70% de homología de secuencia. Incluso más preferidas son proteínas homólogas que muestran una homología de secuencia del 80%, 85% o 90% con la proteína de tipo nativo. En una realización todavía más preferida, la proteína homóloga muestra una identidad de secuencia del 95%, 97%, 98% o 99%. Como se utiliza en la presente memoria, la homología entre dos regiones de secuencias de aminoácidos (especialmente con respecto a las similitudes estructurales predichas) se interpreta como que implica similitud en la función.
Cuando se utiliza “homólogo” en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticas a menudo difieren por las sustituciones conservativas de aminoácidos. Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es aquella en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología se puede ajustar después para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Acido aspártico (D), Acido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (a ), Valina (V), y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W). La homología de secuencia para polipéptidos, que se denomina también como porcentaje de identidad de secuencia, se mide típicamente utilizando un software de análisis de secuencia.
El término “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento acoplado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles porque pueden construirse para contener dos o más elementos funcionales deseados de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferiblemente al menos 20 o 30 aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 40, 50 o 60 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 75, 100 o 125 aminoácidos. Las proteínas de fusión pueden producirse de forma recombinante mediante la construcción de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo en marco con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína o péptido diferente y que expresa después la proteína de fusión. Alternativamente, una proteína de fusión se puede producir químicamente mediante la reticulación del polipéptido o un fragmento del mismo a otra proteína.
El término “región” como se utiliza en la presente memoria se refiere a una porción contigua físicamente de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región se define por una porción contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.
El término “dominio” como se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden ser coextensivos con las regiones o partes de los mismas: los dominios pueden incluir también regiones distintas y no contiguas de una biomolécula. Los ejemplos de dominios de proteínas incluyen, pero no se limitan a, un dominio de Ig, un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, un dominio catalítico y un dominio citoplásmico.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “molécula” significa cualquier compuesto, incluyendo, pero no limitado a, una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc... y dicho compuesto puede ser natural o sintético.
II. La invención
El objetivo de la invención es proporcionar un nuevo sistema para producir polipéptidos N-glicosilados. La glicosilación depende de la maquinaria endógena presente en la célula huésped elegida para producir los polipéptidos glicosilados.
El solicitante encontró sorprendentemente que las microalgas son capaces de producir polipéptidos glicosilados que tienen un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos en animales con alto rendimiento a través de su maquinaria endógena de N-glicosilación.
Por lo tanto, un aspecto de la invención es la producción de polipéptidos que albergan de MansGlcNAc2 a MangGlcNAc2 en las microalgas y otro aspecto de la invención es la producción de N-glicanos complejos en microalgas modificadas.
Se describen en la presente memoria las microalgas transformadas, en donde dichas microalgas comprenden una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en las microalgas transformadas.
Las microalgas, como se utilizan en la presente memoria, son organismos fotosintéticos unicelulares acuáticos, que comprenden:
- Algas verdes: Clorofitos tales como Chlorella marina (por ejemplo, CCMP2333), Chlorella sorokiniana (por ejemplo, UTEX 1663), Chlorella sp. (CCMP 2251), Chlorella pyrenoidosa, Chlorella protothecoides, nanocloropsis tales como Nannochloropsis salina (por ejemplo, CCAP849/2), y Nannochloropsis goditana (por ejemplo, CCAP849/5), Trebouxiofitas, Ulvofitas, Prasinofitas tales como Tetraselmis suecica (por ejemplo, CCMP904), tetraselmis marina (por ejemplo, CCMP898), Prasinococcus capsulatus (por ejemplo, CCMP1192), Nephroselmis rotunda (por ejemplo, UTEXLB996), Ostreococcus tauri, y Mesostigma;
- algas rojas: Rodofitina tal como Porphyridium omentum (por ejemplo, CCAP1320/3 y CCMP 675) o Rhodella violacea (por ejemplo, SAG-115.79), Cianidiofitas y Glaucofitas;
- cromalveolados: Dinoflagelados tales como Heterocapsa triquetra (por ejemplo, CCMP448), Oxyhrris, Perkinsus, Diatomeas tales como Thalassiosira pseudonana (por ejemplo, CCMP1335), Phaeodactylum tricornutum (por ejemplo, CCAP1052/1A, P.t. 1.8.6, y CCMP632), Cylindrotheca fusiformis (por ejemplo, CCMP344), Skeletonema costatum (CCMP1332), Chaeotoceros calcitrans (por ejemplo, CCMP1315), Nitzschia punctata (por ejemplo, CCMP561), Amphora coffeaceformis (por ejemplo, CCMP127), Odontella aurita (por ejemplo, CCMP 145), y naviculas, Rafidiofitas, Crisofitas, tales como Pavlova lutheri (por ejemplo, CCMP1325), Faeofitas, Bolidofitas, Actinofridas,Traustrocitridas, Haptofitas tales como Isochrysis galbana (por ejemplo, CCAP927/14), Eustigmatofitas, y Criptomonadas;
- Euglenidos tales como Eutreptiella gymnastica (por ejemplo, CCMP1594).
Preferiblemente, dichas microalgas no son parte de Ostreococcus sp., lo más preferiblemente, dichas microalgas no son Ostreococcus tauri o Ostreococcus oceánica.
Preferiblemente, dichas microalgas no son parte de Clamidomonadales.
Las microalgas no comparten ninguna actividad de la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o alfa (1,3)-fucosil transferasa antes de ser transformadas. De hecho, y sorprendentemente, los inventores han establecido que las microalgas en comparación con las plantas, no añaden xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (l,3) a los N-glicanos de la proteína que son imunogénicos en mamíferos.
Por consiguiente, no es necesario, en comparación con las plantas, inactivar la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o la alfa fucosil transferasa para producir en las microalgas glicoproteínas terapéuticas que no comprenden xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3).
El experto puede identificar simplemente las microalgas que no comparten ninguna actividad de la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o alfa (1,3)-fucosil transferasa antes de transformarse mediante métodos bien conocidos, como los métodos descritos a continuación en los ejemplos.
Por ejemplo, la persona experta puede identificar simplemente las microalgas que no comparten ninguna actividad de la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o alfa (1,3)-fucosil transferasa utilizando los anticuerpos anti-alfa (1,3) fucosa (ref: AS07268) y anti-beta (1,2) xilosa (ref: AS07267) de AGRISERA.
Ventajosamente, dichas microalgas permiten la producción de dicho polipéptido glicosilado con un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos en animales sin necesidad de la supresión de los genes responsables de la adición de epítopos inmunogénicos tales como en plantas, que añaden xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3) a los N-glicanos de la proteína dando como resultado glicoproteínas que difieren en la estructura de los animales y son inmunogénicas en mamíferos, o levaduras que expresan los genes de la manosiltransferasa añadiendo manosa a la estructura del glicano y produciendo proteínas hipermanosiladas.
De hecho, el polipéptido glicosilado expresado en las microalgas transformadas no comprende xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3) y dichas microalgas no comparten ninguna actividad de la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o alfa fucosil transferasa antes de transformarse.
También, dichas microalgas no comparten la actividad de la manosiltransferasa que conduce a proteínas hipermanosiladas que resultan de la adición de manosa a la estructura de glicano como se observa en levaduras y hongos.
Las microalgas se seleccionan entre Diatomeas, Euglénidos, Haptofitas, Prasinofitas y Clorofitas.
Las microalgas se seleccionan entre Clorofitas y Prasinofitas.
Las microalgas se seleccionan entre Diatomeas y Haptofitas.
Las microalgas se seleccionan entre Euglénidos.
Las proteínas glicosiladas producidas en las microalgas transformadas se pueden utilizar terapéuticamente en animales, especialmente en mamíferos y más particularmente en humanos.
En una realización de la invención, el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención se selecciona del grupo que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado de mamífero no humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, y/o una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado no mamífero.
En una realización preferida de la invención, el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención es un polipéptido de animal.
En una realización preferida de la invención, el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención es un polipéptido de mamífero.
En una realización más preferida de la invención, el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención es un polipéptido humano.
Ejemplos de proteínas glicosiladas adecuadas incluyen sin limitación: eritropoyetina, citoquinas tales como interferones, anticuerpos, factores de coagulación, hormonas, beta-glucocerebrosidasa, pentraxina-3, anti-TNFs... Ejemplos de promotores que impulsan la expresión de una proteína recombinante en las microalgas incluyen, pero no se limitan a, promotores nucleares tales como los descritos en la Tabla 1; promotores cloroplásticos tales como promotores del gen rbcl (la subunidad principal de la ribulosa bifosfato carboxilasa/oxigenasa) y del gen atpA (subunidad de A-ATP sintasa) de Chlamydomonas reinhardtii, o 5'UTR del gen rrn, del gen atpB, del gen psbA, del gen psbD; y promotores de plantas o animales.
Tabla 1
Microalgas Promotor Referencias
ChfomydoTnonas sp.
rbcS2 (Sizovaetal 2001)
(Fiihftnann et al 1999) (Kovaretal. 2002) (StevaisetPuiton 1997) (Cerutti 1997) (Auduiicloss et al. 1999) cabH-1 (BlankenslüpetKiridle 1992) P2 tubulina (Davies 1992)
CaMV 35S (Tangetal. 1995) Nitrato reductasa Nit 1 (Ohresser 1997) Complejo PsaD (FisthjwetRjochaix 2001) Fotosistema I
HSP70 (Schroda et aL 2002) Nopalina sintasa (Hall et aL 1993)
Phaeodactyh tm trícom utum FCPA, FCPB (Aptetal. 1996)
(Fakiatoreet al 1999) (Zaslavskaia eral 2000) Anhidrasa carbónica . (Harada et al.2005)
C ylindrotheca fu sifon n is Nitrato reductasa (PoubeiietKxogCT 2005)
Frua 3 (Fisdiereí al.1999)
D u fia iie lb salina Actina (Jiang et aL 2005)
C h lon ella eliipsoidea CaMV 35S (Kimd al.2002)
Amphidfhfum sp.,
Syvibiodm ium m icroodríarictm plV2V (ten LohuisetMiller 199S)
Cx'chíeUa o y p tic a ACC1 (Dunaliay et al. 1995)
ThalússiúsUa pseudónim a HLCF9 del gen fcp (Poulsen et al.200<S)
En una realización preferida de la invención, el polipéptido glicosilado expresado en las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprende un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, especialmente un patrón de glicosilación animal, preferiblemente un patrón de glicosilación de mamíferos, y más preferiblemente un patrón de glicosilación de tipo humano.
En una realización más preferida, el polipéptido glicosilado expresado en las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprende al menos una estructura de MansGlcNAc2.
En una realización de la invención, el polipéptido glicosilado que tiene al menos una estructura de MansGlcNAc2 obtenida por el método de la invención se somete además a al menos una reacción de glicosilación adicional in vitro, después de su aislamiento de las microalgas transformadas.
Esta solicitud también describe microalgas transformadas capaces de producir N-glicanos complejos. Microalgas transformadas como las que se describen aquí anteriormente, expresan además una N-acetilglucosainiltransferasa I (GnT I) capaz de añadir un resto de N-acetilglucosamina (GlcNAc) a MansGlcNAc2, para producir un GlcN AcMansGlcNAc2. Las N-acetilglucosaminiltransferasas I (GnT I) son bien conocidas por los expertos en la técnica, y también se conocen como manosido acetilglucosaminiltransferasas 1 (MGAT1). Como un ejemplo de GnTl, se puede citar el GnTl del Mus musculus (SEQ ID NO: 18, número de acceso NP_034924) o del Homo sapiens (SEQ ID NO: 19, número de acceso NP_002397). Preferiblemente, dicha N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT I) corresponde a SEQ ID NO: 19 (número de acceso NP_002397).
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente; expresan además una N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT I, GnT II, GnT III, Gn T IV, GnT V, GnT VI), una manosidasa II y una fucosiltransferasa, galactosiltransferasa (GalT) o sialiltransferasa (ST), para producir N-glicanos complejos.
GnT I, GnT II, GnT III, Gn T IV, GnT V, GnT VI, manosidasa II, fucosiltransferasa, galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST) son bien conocidas por un experto en la técnica.
Ejemplos de GnT II, también conocido como manosil (alfa-1,6-)-glicocproteína beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (MGAT2), incluyen GnT II de Mus musculus (SEQ ID NO: 20, número de acceso NP_666147) o de Homo sapiens (SEQ ID No : 21, número de acceso NP_002399). Preferiblemente, dichas N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnT II) corresponden a SEQ ID NO: 21 (número de acceso NP_02399).
Ejemplos de GnT III, también conocida como manosil (beta-1,4-)-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa (MGAT3), incluyen GnT III de Mus musculus (SEQ ID NO: 22, número de acceso NP_034925) o de Homo sapiens (SEQ ID NO: 23, número de acceso NP_002400). Preferiblemente, dichas N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) corresponden a SEQ ID NO: 22 (número de acceso NP_002400).
Ejemplos de GnT IV, también conocida como manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa (MGAT4), incluyen la isoenzima A GnT IV de Mus musculus (SEQ ID NO: 24, número de acceso NP_776295), isoenzima B de Mus musculus (SEQ ID NO: 25, número de acceso NP_666038), isoenzima C de Mus musculus (SEQ ID NO: 26, número de acceso NP_080519), isoenzima A de GnT IV de Homo sapiens (SEQ ID NO: 27, número de acceso NP_036346), isoenzima B de GnT IV de Homo sapiens (isoforma 1, SEQ ID NO: 28, número de acceso NP_055090 o isoforma 2, SEQ ID NO: 29, número de acceso NP_463459) o isoenzima C de GnT IV de Homo sapiens (SEQ ID NO: 30, número de acceso NP_037376).
Ejemplos de GnT V, incluyen GnT V de Mus musculus (SEQ ID NO:31, número de acceso NP_660110), isoenzima B de GnT V de Mus musculus (SEQ ID NO: 32, número de acceso NP_766536), GnT V de Homo sapiens (SEQ ID NO: 33, número de acceso n P_002401), isoenzima B de GnT V de Homo sapiens (isoforma 1, s Eq ID NO: 34, número de acceso NP_653278 o isoforma 2, SEQ ID NO: 35, número de acceso NP_945193).
Ejemplos de GnT VI incluyen GnT VI de Gallus gallus (SEQ ID NO: 36, número de acceso NP_990012).
Ejemplos de manosidasa II (MAN II), también conocida como manosidasa 2, alfa 1 (MAN2A1), incluye MAN II de Mus musculus (SEQ ID NO: 37, número de acceso NP_032575) o de Homo sapiens (SEQ ID NO: 38, número de acceso NP_002363). Preferiblemente, dicha manosidasa II (MAN II) corresponde a SeQ ID NO: 38 (número de acceso NP_002363).
Las fucosiltransferasas son bien conocidas por los expertos e incluyen, como un ejemplo, la alfa (1,6) fucosiltransferasa (fucosiltransferasa 8 (FUT8)), como el FUT8 de Mus musculus (SEQ ID nO: 39, número de acceso NP_058589) o FUT8 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 40, número de acceso Q9BYC5). Preferiblemente, dicha fucosil transferasa corresponde a SEQ ID NO: 40 (número de acceso Q9BYC5).
Las galactosiltransferasas son bien conocidas por los expertos e incluyen, como un ejemplo, una beta (1,4) galactosiltransferasa (B4GALT1), como B4GALT1 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 66, número de acceso NP_001488), o B4Ga Lt 1 de Mus musculus (SEQ ID NO: 67, número de acceso CAM14782). Preferiblemente, dicha galactosiltransferasa corresponde a SEQ ID NO: 66 (número de acceso NP_001488).
Las sialiltransferasas son bien conocidas por los expertos e incluyen, como un ejemplo Alfa 2,6-sialiltransferasa (ST6 beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6GAL1) o beta galactosida alfa 2,6 sialiltransferasa 2 (ST6GAL2), como ST6GAL2 de Mus musculus (SEQ ID nO: 41, número de acceso NP_766417) o ST6GAL1 de Homo sapiens (isoforma a, SEQ ID NO: 42, número de acceso NP_775323 o isoforma b, SEQ ID NO: 43, número de acceso NP_775324), o Alfa 2, 3 sialiltransferasa (ST3 beta galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 6 (ST3GAL6), ST3 betagalactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 1 (ST3GAL1), ST3 beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 2 (ST3GAL2), ST3 beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 3 (ST3GAL3), como ST3GAL1 de Mus musculus (SEQ ID NO: 44, número de acceso NP_033203) o de Homo sapiens (SEQ ID NO: 45, número de acceso NP_003024), ST3GAL2 de Homo sapiens (SEQ ID NO:46, número de acceso Np_008858), ST3GAL3 de Homo sapiens (isoforma a, SEQ ID NO: 47, número de acceso NP_777623, isoforma b, SEQ ID NO: 48, número de acceso NP_777624, isoforma c, SEQ ID NO: 49, número de acceso NP_777625, isoterma f, SEQ ID NO: 50, número de acceso NP_777628, isoterma j, SEQ ID NO: 51, número de acceso NP_006270, isoterma d, SEQ ID NO: 52, número de acceso NP_777626, isoterma e, SEQ ID NO: 53, número de acceso NP_777627, isoterma i, SEQ ID NO: 54, número de acceso NP_777631, isoterma g, SEQ ID NO: 55, número de acceso NP_777629, isoforma h, SEQ ID NO: 56, número de acceso NP_777630), o ST3GAL6 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 57, número de acceso NP_006091).
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente, que expresan además la enzima GnT I y una actividad de la a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II capaz de recortar GlcNAcMan5GlcNAc2, para producir GlcNAcMan3GlcNAc2.
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente, que expresan además la enzima GnT I, una actividad de la a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, y la enzima GnT II capaz de transferir p1,2GlcNAc sobre sustratos, para producir GlcNAc2Man3GlcNAc2.
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente, que expresan además la enzima GnT I, una actividad de la a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, y la enzima GnT III capaz de transferir p1-4-GlcNAc sobre sustratos que son capaces de aceptar la bisección de GlcNAc bisectada, para producir GlcNAc2Man3GlcNAc2 biseccionada.
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente, que expresan además la enzima GnT I, una actividad de la a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como las enzimas Manosidasa II, Gn T II y GnT III, para producir una GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionada.
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente, expresan además la enzima GnT I, una actividad de la a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como las enzimas Manosidasa II, y uno o más enzimas de glicosilación entre GnT IV, GnT V y GnT VI, para producir glicanos unidos a N tri-antenarios o tetra-antenarios.
Las microalgas transformadas como se describen aquí anteriormente, expresan además la enzima GnT I, una actividad de la a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como las enzimas Manosidasa II, la enzima GnT II y una o más glicosiltransferasas seleccionadas entre fucosiltransferasas, galactosiltransferasas o sialiltransferasas.
Con la información de secuencia de DNA, un experto en la técnica puede clonar moléculas de DNA que codifican actividades de GnT. Utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica, las moléculas de ácido nucleico que codifican GnT I, II, III, IV, V o VI, manosidasa II o una glicosiltransferasa tal como fucosiltransferasa, galactosiltransferasa o sialiltransferasa (o que codifican fragmentos catalíticamente activos de las mismas) se pueden insertar en vectores de expresión apropiados bajo el control transcripcional de promotores y otras secuencias de control de la expresión capaces de conducir la transcripción en microalgas seleccionadas, de manera que una o más de estas enzimas puedan expresarse activamente en las microalgas.
Preferiblemente, las enzimas son de origen humano, aunque también son útiles otras enzimas de animales, mamíferos, plantas o microalgas.
Los genes se cortan para dar fragmentos que codifican los dominios catalíticos de las enzimas. Al eliminar las secuencias de direccionamiento endógenas, las enzimas pueden redirigirse y expresarse en otra localización celular. La elección de dichos dominios catalíticos puede guiarse por el conocimiento del entorno particular en el que el dominio catalítico posteriormente estará activo. Por ejemplo, si una enzima de glicosilación particular tiene que estar activa en el Golgi tardío, y todas las enzimas conocidas del organismo huésped en el Golgi tardío tienen un cierto pH óptimo, entonces se elige un dominio catalítico que muestre una actividad adecuada a ese pH. El DNA que codifica los fragmentos catalíticamente activos de las enzimas se unen luego al DNA que codifica los péptidos señal para localizar las enzimas dentro de la red del ER, Golgi, o trans-Golgi. Estas secuencias de señales pueden seleccionarse del organismo huésped, así como de otros organismos relacionados o no relacionados. Las proteínas unidas a la membrana del ER o Golgi pueden incluir típicamente, por ejemplo, secuencias N-terminales que codifican una cola citosólica (ct), un dominio de transmembrana (tmd) y una región troncal (sr). Las secuencias ct, tmd y sr son suficientes individualmente o en combinación para anclar proteínas a la membrana interna (lumenal) del orgánulo. Otra fuente de secuencias de señales incluye péptidos de señales de recuperación, por ejemplo, los tetrapéptidos HDEL, KDEL, DDEL o una señal de recuperación equivalente, que se encuentra típicamente en el extremo C de las proteínas que indujeron un transporte retrógrado en el ER o Golgi.
La secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión de GnT I, II, III, IV, V, o VI, Manosidasa II, o una glicosiltransferasa tal como fucosiltransferasa, galactosiltransferasa o sialiltransferasa en dichas microalgas, comprende dicho dominio catalítico del enzima que tiene una actividad óptima en dicho ER y Golgi a un pH entre 5,1 y 8, unida a una señal de direccionamiento celular no asociado normalmente con el dominio catalítico.
Para que una glicosiltransferasa funcione satisfactoriamente en el aparato de Golgi, es necesario para la enzima que se proporcionen con concentraciones suficientes de un azúcar de nucleótido apropiado, que es el donante de alta energía del resto de azúcar añadido a una glicoproteína naciente. En los seres humanos, la gama completa de precursores de azúcar de nucleótido generalmente se sintetiza en el citosol y se transportan al aparato de Golgi, donde se unen al oligosacárido central mediante glicosiltransferasas.
El solicitante observó en microalgas una concentración suficiente de GlcNAc, manosa, fucosa y galactosa, pero no de ácido siálico.
Por lo tanto, para que una sialiltransferasa funcione satisfactoriamente en el aparato de Golgi, es necesario expresar en la microalga una o más enzimas necesarias para la síntesis de ácido siálico, su activación y su transporte dentro del aparato de Golgi entre UDP-GlcNAc 2-epimerasa, GlcNAc2-epimerasa, GlcNAc-6P 2-epimerasa, NeuAc sintasa, NeuAc-9P sintasa, CMP-NeuAc sintasa y CMP- transportador de ácido siálico (véase, por ejemplo, los trabajos hechos en plantas: Misaki R et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jan 27;339(4):1184-9; Paccalet T et al. Plant Biotechnol J. 2007 Jan; 5(1): 16-25).
UDP-GlcNAc 2-epimerasa, que también se conoce como glucosamina (UDP-N-acetil)-2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa (GNE), es bien conocida por los expertos e incluye, como un ejemplo GNE de Mus musculus (SEQ ID NO: 58, número de acceso NP_056643) o g Ne de Homo sapiens (SEQ iD nO: 59, número de acceso NP_005467). Preferiblemente, dicho GNE corresponde a SEQ ID NO: 59 (número de acceso NP_005467). GlcNAc 2-epimerasa es bien conocida por los expertos e incluye, como un ejemplo, la proteína de unión a renina (RENBP) de Homo sapiens (SEQ ID NO: 60, número de acceso NP_002901).
NeuAc-9P sintasa, también denominada ácido N-acetilneuramínico sintasa (NANS), es bien conocida por los expertos e incluyen, como un ejemplo, NANS de Homo sapiens (SEQ ID NO: 61, número de acceso NP_061819). CMP-NeuAc sintasa, que es también conocida como citidina ácido monofosfo-N-acetilneuramínico sintetasa (CMAS), es bien conocida por los expertos e incluye, como un ejemplo CMAS de Mus musculus (SEQ ID NO: 62, número de acceso NP_034038) o de Homo sapiens (SEQ ID NO: 63, número de acceso NP_061156). Preferiblemente, dicha CMAS corresponde a SEQ ID NO: 63 (número de acceso NP_061156).
CMP-transportadores de ácido siálico son también bien conocidos por los expertos e incluyen, como un ejemplo, la familia de portadores de soluto 35 (CMP-transportador de ácido siálico), miembro A1 (SLC35A1) de Mus musculus (SEQ ID No : 64, número de acceso NP_036025) o de Homo sapiens (SEQ ID NO: 65, número de acceso NP_006407). Preferiblemente, dicho CMP-transportador de ácido siálico corresponde a SLC35A1 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 65, número de acceso NP_006407).
La proteína transportadora añadida transporta un azúcar de nucleótido de citosol al aparato de Golgi, donde la glucosiltransferasa puede hacer reaccionar al azúcar de nucleótido, por ejemplo, para alargar un N-glicano. La reacción libera un difosfato o monofosfato del nucleósido, por ejemplo, UDP, GDP, o CMP. Como la acumulación de un difosfato del nucleósido inhibe la actividad adicional de una glicosiltransferasa, con frecuencia es también deseable proporcionar una copia expresada de un gen que codifica un nucleótido difosfatasa. La difosfatasa (específica para UDP o GDP, según corresponda) hidroliza el difosfonucleósido para producir un monofosfato del nucleósido y un fosfato inorgánico. El monofosfato de nucleósido no inhibe la glicosiltransferasa y, en cualquier caso, se exporta del Golgi mediante un sistema celular endógeno.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan una N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT I) capaz de añadir un resto de N-acetilglucosamina (GlcNAc) a MansGlcNAc2 para producir GlcNAcMansGlcNAc2.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan una N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VT), una manosidasa II y una fucosiltransferasa, galactosiltransferasa (GalT) o sialiltransferasas (ST), para producir N-glicanos complejos.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan una enzima GnT I y una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II capaz de recortar GlcNAcMansGlcNAc2 para producir GlcNAcMan3GlcNAc2.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan una enzima GnT I, una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, y una enzima GnT II capaz de transferir p1,2-GlcNAc sobre sustratos, para producir GlcNAc2Man3GlcNAc2.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan una enzima GnT I, una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, y una enzima GnT III capaz de transferir p1,4-GlcNAc sobre sustratos que son capaces de aceptar la bisección de GlcNAc, para producir GlcNAc2Man3GlcNAc2 biseccionado. Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan una enzima GnT I, una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como las enzimas Manosidasa II, GnT II y GnT III, para producir GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionado.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan además la enzima GnT I, una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, y una o más enzimas de glicosilación entre GnT IV, GnT V y GnT VI, para producir glicoproteínas tri-antenarias o tetra-antenarias.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan la enzima GnT I, una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, la enzima GnT II y una o más glicosiltransferasas seleccionadas entre fucosiltransferasas, galactosiltransferasas o sialiltransferasas.
Las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan la enzima GnT I, una actividad de a-1,3/a-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II, la enzima GnT II y una o más glicosiltransferasas seleccionadas entre fucosiltransferasas, galactosiltransferasas o sialiltransferasas, siempre que exprese además una o más enzimas necesarias para la síntesis del ácido siálico, su activación y su transporte dentro del aparato de Golgi entre UDP-GlcNAc 2-epimeras, GlcNAc 2-epimerasa, GlcNAc-6P 2-epimerasa, NeuAc sintasa, NeuAc-9P sintasa, CMP-NeuAc sintasa y CMP-transportador de ácido siálico, cuando la glicosiltransferasa seleccionada es una sialiltransferasa.
La secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión de GnT I, II, III, IV, V, o VI, Manosidasa II, o una glicosiltransferasa tal como fucosiltransferasa, galactosiltransferasa o sialiltransferasa en dichas células de microalgas, comprende dicho dominio catalítico de la enzima que tiene la actividad óptima en dicho ER o Golgi a un pH entre 5,1 y 8, unida a una señal de direccionamiento celular no asociada normalmente con el dominio catalítico.
Las células de microalgas utilizadas en el método de la invención se seleccionan entre algas verdes, algas rojas, cromalveolados, y euglénidos.
Un objetivo de la invención es un método para producir al menos un polipéptido glicosilado que tiene un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, que comprende las etapas de:
(i) cultivar una microalga transformada de Phaeodactylum tricornutum, que comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dicha microalga, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en la microalga transformada para obtener la expresión de dicho al menos un polipéptido glicosilado; y
(ii) seleccionar dicho al menos un polipéptido glicosilado para determinar el patrón de glicosilación de dicho al menos un polipéptido glicosilado y para seleccionar el al menos un polipéptido glicosilado que tiene al menos una estructura de MangGlcNAc2 a MansGlcNAc2 y no comprende xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1.3) ,
en donde dichas microalgas transformadas no comparten ninguna actividad de la p (1,2) xilosil transferasa y/o a (1.3) fucosil transferasa antes de transformarse, y no comparte ninguna actividad de la manosiltransferasa que conduce a proteínas hipermanosiladas que resultan de la adición de manosa a la estructura de glicano.
Ventajosamente, el método de la invención comprende además la etapa de transformar una microalga previa a la etapa (i) para obtener una microalga como se definió anteriormente.
Ventajosamente, el al menos un polipéptido glicosilado presenta un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos en animales y es producido por dichas microalgas transformadas sin necesitar en dichas microalgas transformadas la supresión de los genes responsables de la adición de epítopos inmunogénicos tales como en plantas, que añaden xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3) a los N-glicanos de proteínas dando como resultado glicoproteínas que difieren en la estructura de los animales y son inmunogénicas en mamíferos, o levaduras que expresan genes de manosiltransferasas añadiendo una manosa a la estructura de glicano y conduciendo a proteínas hipermanosiladas.
Por lo tanto, dicho al menos un polipéptido glicosilado no comprende xilosa con enlaces p (1,2) y/o fucosa con enlaces a (1,3) y dichas microalgas no comparten ninguna actividad de la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o alfa fucosil transferasa antes de transformarse.
Además, dichas microalgas no comparten ninguna actividad de la manosiltransferasa que conduce a proteínas hipermanosiladas que resultan de la adición de manosa a la estructura de glicano como se observa en levaduras y hongos.
En una realización preferida, dichas microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención expresan al menos una enzima seleccionada entre GnT I, II, III, IV, V, o VI, Manosidasa II, o una glicosiltransferasa tal como fucosiltransferasa, galactosiltransferasa o sialiltransferasa, con una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en las microalgas transformadas.
En una realización preferida, dicho polipéptido glicosilado producido por dicho método comprende un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, especialmente un patrón de glicosilación animal, preferiblemente un patrón de glicosilación de mamíferos, y más preferiblemente un patrón de glicosilación del tipo humano.
Para purificar un polipéptido glicosilado que tiene un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, el método de la invención comprende una etapa para determinar el patrón de glicosilación de dicho al menos un polipéptido glicosilado.
El patrón de glicosilación se puede determinar por un método bien conocido por los expertos.
Como ejemplo, se pueden obtener informaciones preliminares sobre la N-glicosilación de la glicoproteína recombinante mediante el análisis de afino- y inmunotransferencia utilizando sondas tales como lectinas (CON A; ECA; SNA; MAA...) y anticuerpos de N-glicanos específicos (anti-p1,2-xilosa; anti-a-1,3-fucosa; anti-Neu5Gc, anti-Lewis...). Esto se hace según FITCHETTE et al., (Plant proteomics and glycosylation, Methods Mol. Biol., vol.355, p:317-342, 2007) y podría completarse mediante ensayos de desglicosilación.
Para investigar el perfil detallado del N-glicano de la proteína recombinante, los oligosacáridos unidos al N se liberan después de la proteína de una manera no específica utilizando digestión enzimática o tratamiento químico (FITCHETTE et al., anteriormente mencionado, 2007; SÉVENO et al., Plant N-glycan profiling of minute amounts of material, Anal. Biochem., vol. 379 (1), p: 66-72, 2008). La mezcla resultante de los oligosacáridos reductores se puede perfilar por HPLC y/o los enfoques de espectrometría de masas (ESI-MS-MS y MALDI-TOF esencialmente, BARDOR et al., Analytical strategies to investigate plant N-glycan profiles in the context of plant-made pharmaceuticals, Curr Opin Struct Biol., vol. 16(5), p: 576-583, 2006, SÉVENO et al., anteriormente mencionado, 2008). Estas estrategias, junto con la digestión con exoglicosidasa, permiten la identificación y cuantificación de N-glicanos (Séveno et al., 2008).
Otra alternativa para estudiar el perfil de N-glicosilación de la proteína recombinante es trabajar directamente sobre sus glicopéptidos después de la digestión con proteasa de la proteína, purificación y análisis por espectrometría de masas de los glicopéptidos como se describe en BARDOR et al. (Monoclonal C5-1 antibody produced in transgenic alfalfa plants exhibits a N-glycosylation that is homogenous and suitable for glyco-engineering into human-compatible structures, Plant Biotechnol J., vol. 1(6), p: 451-462, 2003).
Todavía para purificar un polipéptido glicosilado que tiene un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, el método de la invención comprende la etapa de seleccionar al menos un polipéptido glicosilado que comparte un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, tal como un patrón de glicosilación que no comprende xilosa con enlaces (3(1,2) y/o fucosa con enlaces a(1,3). Más preferiblemente, dicho al menos un polipéptido glicosilado comprende al menos una estructura MansGlcNAc2.
Las microalgas utilizadas en dicho método descrito previamente, se seleccionan entre Diatomeas.
En una realización preferida de la invención, el polipéptido glicosilado producido por dicho método se selecciona del grupo que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado humano, un secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado de mamífero no humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, y/o una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado no mamífero.
En una realización más preferida, ejemplos de dichos polipéptidos glicosilados expresados en las microalgas transformadas incluyen, pero no se limitan a, eritropoyetina, citoquinas tal como interferones, anticuerpos, factores de coagulación, hormonas, beta-glucocerebrosidasa, pentraxina-3, anti-TNFs...
En otra realización de la invención, dicho método comprende la etapa de aislar el polipéptido glicosilado recombinante después del paso de dicho polipéptido glicosilado recombinante a través del ER y aparato de Golgi de las microalgas transformadas.
En otra realización de la invención, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa que se expresa en las microalgas transformadas.
En otra realización de la invención, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además secuencias de nucleótidos unidas operativamente a promotores que impulsan la expresión en dichas microalgas, en donde dichas secuencias de nucleótidos codifican una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I y una enzima manosidasa II que se expresan en las microalgas transformadas.
En otra realización de la invención, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además secuencias de nucleótidos unidas operativamente a promotores que impulsan la expresión en dichas microalgas, en donde dichas secuencias de nucleótidos codifican una enzima N-acetilglucosaminiltransferas I, una enzima manosidasa II y una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II que se expresan en las microalgas transformadas.
En otra realización de la invención, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además secuencias de nucleótidos unidas operativamente a promotores que impulsan la expresión en dichas microalgas, en donde dichas secuencias de nucleótidos codifican una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I, una manosidasa II y al menos una enzima seleccionada entre N-acetilglucosaminiltransferasa II, IV, V y VI, que se expresan en las microalgas transformadas.
En otra realización de la invención, las microalgas transformadas utilizadas en el método de la invención comprenden además secuencias de nucleótidos unidas operativamente a promotores que impulsan la expresión en dichas microalgas, en donde dichas secuencias de nucleótidos codifican una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa, una enzima manosidasa II, al menos una enzima seleccionada entre N-acetilglucosaminiltransferasa II, IV, V y VI que se expresan en las microalgas, y al menos una enzima glicosiltransferasa seleccionada entre galactosiltransferasa, fucosiltransferasa y sialiltransferasa, que se expresan en la microalgas transformadas.
Cuando las sialiltransferasas se expresan en las microalgas transformadas, dichas microalgas se transforman también con secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas necesarias para la síntesis del ácido siálico, su activación y su transporte dentro del aparato de Golgi entre UDP-GlcNAc 2-epimerasa, GlcNAc 2-epimerasa, GlcNAc-6P 2-epimerasa, NeuAc sintasa, NeuAc-9P sintasa, CMP-NeuAc sintasa y CMP-trasportador del ácido siálico.
En una realización preferida de la invención, dicha secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión de N-acetilglucosaminiltransferasas, manosidasa II o glicosiltransferasas en dichas microalgas, comprende dicho dominio catalítico de la enzima que tiene una actividad óptima en dicho ER y Golgi a un pH entre 5,1 y 8, unida a una señal de direccionamiento celular no asociada normalmente con el dominio catalítico.
En una realización de la invención, previo a la transformación de las microalgas, dichas secuencias de nucleótidos se pueden someter a una o más rondas de barajado de genes, PCR propensa a errores o mutagénesis in vitro. La transformación de las microalgas se puede realizar mediante métodos convencionales tales como bombardeo de micropartículas, electroporación, perlas de vidrio, polietilenglicol (PEG), patillas de carburo de silicio, o uso de virus o agrobacterias.
En una realización de la invención, las secuencias de nucleótidos se pueden introducir en las microalgas mediante plásmidos, secuencias víricas, DNA bicatenario o monocatenario, DNA circular o lineal.
En otra realización de la invención, es generalmente deseable incluir en cada secuencia de nucleótidos o vectores al menos un marcador seleccionable para permitir la selección de microalgas que se han transformado de manera estable. Ejemplos de dichos marcadores son los genes resistentes a antibióticos, tales como los genes sh ble que permiten la resistencia a zeocina, los genes nat o sat-1 que permiten la resistencia nouseotricina, el gen bar que permite la resistencia a glufosinato.
Después de la transformación de las microalgas, se seleccionan transformantes que muestran las proteínas que muestran el fenotipo de glicosilación deseado. La selección se puede llevar a cabo mediante uno o más métodos convencionales que comprenden: espectrometría de masas tal como MALDI-TOF-MS, cromatografía ESI-MS, caracterización de células utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia, espectrofotómetro, fluorímetro o contador de centelleo; exposición de las células a una lectina o anticuerpo que tiene una afinidad especifica por un resto de oligosacárido deseado; exposición de las células a una molécula citotóxica o radioactiva seleccionada del grupo que consiste en azúcares, anticuerpos o lectinas.
La solicitud también describe el uso de una microalga transformada como se describió anteriormente para producir al menos un polipéptido glicosilado.
Dicha microalga y al menos un polipéptido glicosilado se describen anteriormente.
Ventajosamente, dichas microalgas permiten la producción de dicho polipéptido glicosilado con un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos en animales sin necesitar la supresión, en dichas microalgas, de los genes responsables de la adición de epítopos inmunogénicos tales como en plantas, que añaden xilosa con enlaces (3(1,2) y fucosa con enlaces a (1,3) a los N-glicanos de la proteína dando como resultado glicoproteínas que difieren en estructura de animales y son inmunogénicos en mamíferos, o levaduras que expresan los genes de manosiltransferasa añadiendo manosa a la estructura de glicano y que conducen a proteínas hipermanosiladas. De hecho, dicho al menos un polipéptido glicosilado no comprende xilosa con enlaces 3(1,2) y/o fucosa con enlaces a(1,3) y dichas microalgas no comparten ninguna actividad de la beta (1,2)-xilosil transferasa y/o alfa (1,3)-fucosil transferasa antes de transformarse.
Por lo tanto, dichas microalgas no comparten ninguna actividad de la manosiltransferasa que conduce a proteínas hipermanosiladas que resultan de la adición de manosa a la estructura de glicano como se observa en levaduras y en hongos.
Todavía ventajosamente, dicho al menos un polipéptido glicosilado comprende al menos una estructura Man5GlcNAc2.
Un objetivo de la invención son los polipéptidos glicosilados producidos por el método como se describió aquí anteriormente.
La solicitud también describe una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido glicosilado producido por el método descrito aquí anteriormente.
La solicitud describe también una composición veterinaria que comprende el polipéptido glicosilado producido por el método de la invención.
Ejemplos
En la siguiente descripción, todos los experimentos para los que no se proporciona un protocolo detallado se realizan de acuerdo con el protocolo estándar.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la presente descripción, apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y seguir obteniendo un resultado similar o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Materiales y métodos
Análisis del genoma en silicio
La identificación de genes en el genoma de Phaeodactylum tricornutum se llevó a cabo mediante el análisis BLAST con los genes específicos de Homo sapiens, Mus musculus, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae, Physcomitrella patens, Medicago truncatula, Zea mays y Medicago sativa (http://genome.igi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html). Las búsquedas de péptidos señal y la localización/direccionamiento celular de las proteínas putativas maduras se realizaron utilizando SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) y TargetP (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP).
La presencia del dominio de transmembrana predicho así como la búsqueda para dominios pfam específicos se llevaron a cabo respectivamente con www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/y http://smart.embl-heidelberg.de.
Condiciones de cultivo estándar de Phaeodactylum tricornutum y Tetraselmis suecica
Las cepas utilizadas en este trabajo fueron CCAP 1052/1A de Phaeodactylum tricornutum, el clon P.t.1.8.6 de Phaeodactylum tricornutum y CCMP 904 de la Prasinofita Tetraselmis suecica.
Las microalgas se cultivaron a 20°C bajo iluminación continua (280-350 pmol fotones m2s-1), en agua de mar natural costera (origen St. Malo, Francia) esterilizada mediante filtración de 0,22 pm.
Esta agua de mar está enriquecida con medios nutritivos Conway (Walne, 1966) con adición para las diatomeas de sílice (40 g/L de metasilicato de sodio; 1 ml/L). Para grandes volúmenes (de 2 litros a 300 litros) los cultivos se airearon con una mezcla CO2/aire al 2% para mantener el pH en un intervalo de 7,5-8,1.
Para la transformación genética, las microalgas se extendieron en gelosa que contiene 1% de agar. Después de la concentración por centrifugación, las microalgas se extendieron en placas de Petri selladas y se incubaron a 20°C bajo iluminación constante. La concentración de cultivos se estimó en células de conteo de Mallassez después de la fijación de las microalgas con una solución de Lugol.
Condiciones de cultivo estándar de Chlorella
La cepa utilizada en este trabajo fue Chlorella sorokiniana.
Las microalgas se cultivaron a 28°C bajo iluminación continua (280-350 pmol fotones m2s-1), en medio Kuhl (Kuhl y Lorenzen 1964). Para grandes volúmenes (de 2 litros a 300 litros) los cultivos se airearon con una mezcla CO2/aire al 2% para mantener el pH en un intervalo de 7,5-8,1.
Para la transformación genética, las microalgas se extendieron en gelosa que contiene 1% de agar. Después de la concentración por centrifugación, las microalgas se extendieron en placas de Petri selladas y se incubaron a 28°C bajo iluminación constante. La concentración de cultivos se estimó en células de conteo de Mallassez después de la fijación de las microalgas con una solución de Lugol.
Extracción de proteínas de Phaeodactylum tricornutum para el análisis de N-glicosilación
El cultivo concentrado (20.106 células/L) se centrifugó primero a 5000 g durante 20 minutos a 4°C. El sedimento se liofilizó después. Dos gramos de microalga liofilizada se molieron en un mortero en presencia de arena utilizando un tampón Tris-HCl 750 mM pH 8 que contiene 15% (peso/volumen) de sacarosa, 2% (volumen/volumen) de pmercaptoetanol y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) 1 mM y después se centrifugó durante 30 minutos a 11500 gramos, a 4°C. Las proteínas del sobrenadante se precipitaron con sulfato de amonio al 90% durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) bajo agitación y se centrifugó durante 30 minutos a 11500 gramos. El sedimento se solubilizó en agua y después, se dializó frente a agua, durante una noche a 4°C. Finalmente, el extracto de proteína total se ultracentrifugó a 30000 gramos durante 1 hora a 4°C y se resuspendió en el menor volumen de agua, antes de la cuantificación de proteínas y posterior análisis.
Cuantificación de proteínas
La cuantificación de proteínas se llevó a cabo sobre los extractos de proteínas totales de Phaeodactylum tricornutum utilizando el conjunto de ensayos de proteínas BCA de Pierce según las instrucciones del fabricante.
Análisis de inmuno- y afinotransferencia
Cincuenta |jg del extracto de proteínas totales de las microalgas se separaron mediante SDS-PAGE utilizando un gel de poliacrilamida al 12%. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se tiñeron con Ponceau Red para el control de la eficiencia de transferencia. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó durante la noche a temperatura ambiente con disolución salina Tris-tamponada (TBS) que contiene 0,1% de Tween 20 (TBS-T) para la afinodetección y durante la noche en gelatina al 3% disuelta en TBS para la inmunodetección. La inmunodetección se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos de fabricación casera del núcleo-p1,2-xilosa y núcleo-a1,3-fucosa (1:3000 en TBS que contiene 1% de gelatina, 2 horas, temperatura ambiente). Después de lavar con TBS-T (6 veces, 5 minutos), la unión de los anticuerpos se detectó utilizando un anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante secundario diluido a 1:3000 en TBS que contenía 1% de gelatina durante 1,5 horas a temperatura ambiente (Bio-Rad). El desarrollo final de las transferencias se realizó utilizando 4-cloro 1-naftol como se describió previamente (Fitchette et al., 2007). La afinodetección utilizando concanavalina A se llevó a cabo por incubación con la lectina a 25 jg/mL, 2 horas, temperatura ambiente en TBS-T, complementado con CaCl21 mM y MgCh 1 mM. Después del lavado con TBS-T complementado con CaCl2 y MgCh (6 veces, 5 minutos), la unión de esta lectina se detectó utilizando una peroxidasa de rábano picante diluida a 50 jg/mL, 1 hora a temperatura ambiente en TBS-T complementada con CaCl21 mM y MgCh 1 mM. Después de lavar con el mismo TBS-T y después, TBS, el desarrollo final de las transferencias se realizó utilizando 4-cloro-1-naftol como se describió previamente (Fitchette et al., 2007). La afinodetección con fitohemaglutinina E y L biotiniladas (PHA-E y L), Aglutinina biotinilada de Erythrina Crista Galli (ECA) y aglutinina de cacahuete biotinilada (PNA) se realizaron mediante la incubación de estas lectinas a 20 jg/mL en respectivamente TBS-T para PHA-E y L y TBS-T complementada con CaCl20,1 mM y MnCh 0,5 mM. Después del lavado con TBS-T adecuado, la unión de estas lectinas se detectó utilizando estreptavidina acoplada con peroxidasa de rábano picante diluido a 1/3000, 45 minutos a temperatura ambiente en TBS-T adecuado. El desarrollo final de las transferencias se llevó a cabo como para la afinodetección de concanavalina A.
La oxidación del resto de glicano de las glicoproteínas se llevó a cabo en una transferencia utilizando periodato de sodio según Fitchette-Lainé et al., 1998.
Desglicosilación mediante PNGasa F o Endo H
El ensayo de desglicosilación se realizó sobre el extracto de proteínas total utilizando péptido N-glicosidasa F aislada de Flavobacterium meningosepticum (PNGasa F) o utilizando Endoglicosidasa H (Endo H).
1 mg de proteínas totales se disolvieron primero en 2 ml de tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 que contiene 0,1% de SDS. La muestra se calentó 5 minutos a 100°C para la desnaturalización de la proteína. Después de enfriar, se añadieron 2 mL de tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, que contiene 0,5% de Nonidet P-40 a la muestra, así como 10 unidades de PNGasa F. La digestión se incubó durante 24 horas a 37°C. Después de la digestión, las proteínas se precipitaron con 4 volúmenes de etanol 24 horas a -20°C, antes de la separación por SDS-PAGE, la transferencia y la afinodetección con concanavalina A.
Galactosilación in vitro
La galactosilación in vitro se llevó a cabo tratando 50 jg de un extracto de proteína total con 50 mU de p(1,4)galactosiltransferasa de leche bovina (Fluka) en 1 mL de tampón de cacodilato de sodio 100 mM pH 6,4 en presencia de 5 jmol de UDP-galactosa y 5 jmol de MnCl2 a 37°C durante 24 horas (Bardor et al., 2003). La muestra se liofilizó. Después, las proteínas y glicoproteínas se separaron por SDS-PAGE y el gel se electrotransfirió sobre nitrocelulosa. Las proteínas se afinodetectaron utilizando lectina ECA biotinilada, como se describió anteriormente. Composición del monosacárido
Los extractos de proteínas totales se sometieron a una metanolisis de 16 horas a 80°C con 500 pL de HCl metanólico 1 M. Después de la evaporación y etapas adicionales de lavado con metanol, las muestras se reacetilaron por adición en 200 pL de metanol de 20 pL de ácido acético anhidro y 20 pL de piridina. Los N-acetil metil glicósidos resultantes (metil éster) se secaron y se convirtieron después en sus trimetilsilil derivados y se separaron por cromatografía de gases (GC). El cromatógrafo de gases se equipó con un detector de ionización de llama, un WCOT unido a la columna capilar de sílice (longitud 25 m, diámetro interno 0,25 mm) con CP-Sil 5 CP como fase estacionaria y helio como gas vector. El programa de temperatura del horno fue: 2 minutos a 120°C, 10°C/min a 160°C, y 1,5°C/min a 220°C y después 20°C/min a 280°C. La cuantificación del azúcar se realizó por integración de los picos y determinación de los valores molares correspondientes utilizando factores de respuesta establecidos con monosacáridos estándar. La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de impacto electrónico (GC-EI MS) se llevó a cabo utilizando una cromatografía de gases Hewlett-Packard serie 6890 acoplado con un espectrómetro de masas Autospec de geometría EBE (Micromass, Manchester, UK) equipado con un sistema de datos Opus 3.1. Las separaciones cromatográficas se obtuvieron utilizando una columna capilar de sílice CP-sil 5CB (25 m, 0,25 mm de diámetro interno, 0,25 pm de espesor de película, Chrompack) recubierta con polidimetilsiloxano. El helio fue el gas portador y la velocidad de flujo fue de 0,8 mL min'1. La temperatura del horno se programó como sigue: inicialmente se estableció a 120°C durante 2 min, se aumentó a una velocidad de 10°C min’1 a 160°C, después se aumentó a una velocidad de 1,5°C min_1 a 220°C y finalmente se aumentó a 280°C a una velocidad de 15°C min_1. Las temperaturas del inyector, la interfaz y las líneas fuero 250°C. Las inyecciones de 0,5 pL se realizaron con una relación de división de 5. El espectro de masas de impacto electrónico se registró utilizando una energía de electrones de 70eV, un voltaje de aceleración de 8kV y un poder de resolución de 1000. La corriente de la trampa fue de 200 pA y la velocidad de escaneo de imán fue 1s/década en un intervalo m/z de 800-4000. La temperatura de la fuente de iones fue 250°C.
Análisis del ácido siálico
Los ácidos siálicos unidos de los extractos de proteínas totales se liberaron utilizando hidrólisis con ácido acético 2M, 3h a 80°C (Varki y Diaz, 1984). Los ácidos siálicos liberados se pasaron a través de Microcon® YM-10 (Fisher Scientific) antes de la derivatización con DMB. La derivatización con DMB se realizó según Hara et al., 1989. Los derivados DMB-ácido siálico de las diferentes fracciones fueron después, analizados mediante cromatografía líquida de alta eficacia utilizando una columna C18 (C18 monomérica S/N E000930-10-2) y las condiciones de elución como se reportaron anteriormente (Klein et al., 1997). El eluyente se monitorizó por fluorescencia. Los derivados resultantes se recogieron, secaron y se analizaron por MALDl-TOF MS como se describió anteriormente.
Aislamiento de glicanos unidos a N
Las proteínas totales se digirieron por sucesivos tratamientos con pepsina y PNGasa A como se describió previamente en Fitchette et al., 2007. Brevemente, 4 mg de proteínas se digirieron con 6 mg de pepsina en 2 mL de HCl 10 mM, pH 2,2, a 37°C durante 48 horas. Después de neutralización con hidróxido de amonio 1 M, la disolución se calentó durante 5 minutos a 100°C y se liofilizó. Los glicopéptidos se desglicosilaron después durante una noche a 37°C con PNGasa A (10 mU, Boehringer Mannheim) en un tampón de acetato de sodio 100 mM, pH 5,0. Los N-glicanos se purificaron por sucesivas eluciones a través de una columna AG 50W-X2 (Bio-RAD) y un cartucho C18 (Varian).
Preparación y digestión con exoglicosidasa de oligosacáridos 2-AB
Los N-glicanos purificados se marcaron con 2-aminobenzamida (2-AB) utilizando el protocolo optimizado descrito en Bigge et al., 1995. Brevemente, los N-glicanos se disolvieron en 10 pL de 2-AB en dimetilsulfóxido-ácido acético glacial 0,35 M (7:3 volumen/volumen) que contiene cianoborohidruro de sodio 1 M. Después de la incubación a 60°C durante 2 horas, la mezcla se aplicó a una tira de papel cromatográfico (Whatmann 3MM, longitud, 10 cm; ancho, 3 cm). La cromatografía de papel ascendente se realizó utilizando n-butanol/etanol/agua (4/1/1 volumen/volumen/volumen) a temperatura ambiente durante 45 minutos en un recipiente de vidrio. Después de la migración, el papel se secó utilizando un secador de pelo. Después, los N-glicanos marcados se detectaron utilizando una luz ultravioleta y se eluyeron utilizando agua y después se liofilizaron. Para la digestión con exoglicosidasa, 200 miliunidades de a-manosidasa de frijol Jack (Sigma-Aldrich) se desalaron por ultrafiltración y se incubaron durante una noche a 37°C con aproximadamente 50 pmoles de una mezcla de N-glicano marcado con 2-AB. Después, la digestión se analizó directamente mediante espectrometría de masas del tiempo de ionización de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) utilizando las condiciones descritas anteriormente.
Análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF de N-glicanos marcados con 2-AB
Los espectros de masas de MALDI-TOF de los N-glicanos marcados con 2-AB se adquirieron en un instrumento Voyager DE-Pro MALDI-TOF (Applied Biosystems, USA) equipado con un láser de nitrógeno de 337 nm. Los espectros de masas se realizaron de modo de extracción retardada con reflector utilizando ácido 2,5-dihidroxibenzoico (Sigma-Aldrich) como matriz. La matriz, recién disuelta a 5 mg/mL en acetonitrilo/0,1% de TFA 70:30, se mezcló con los oligosacáridos solubilizados en agua en una relación 1:1 (volumen/volumen). Estos espectros se registraron en un modo positivo, utilizando un voltaje de aceleración de 20000 V con un tiempo de retardo de 100 ns. Se suavizaron una vez y se calibraron externamente utilizando mezclas disponibles comercialmente de péptidos y proteínas (Applied Biosystems). En este estudio, el espectro ha sido calibrado externamente utilizando des-Arg1-bradicinina (904,4681 Da), angiotensina I (1296,6853), Glu1-fibrinopéptido B (1570,6774 Da), ACTH18-39 (2465,1989 Da) e insulina bovina (5730,6087 Da). Se acumularon tomas de láser para cada espectro con el fin de obtener una relación señal/ruido aceptable.
Constructos de expresión para EPOm
El vector de clonación pPHA-T1 construido por Zavlaskaía et al., (2000) incluye secuencias de los promotores fcp-A y fcp-B de P. tricornutum (fucoxantina-clorofila a/c-proteínas de unión A y B) y el terminador de fcpA. Contiene un casete de selección con el gen she ble y un MCS que flanquea el promotor fcpA. La eritropoyetina murina (EPO) se codifica por un gen de 600 pares de base (secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1). El plásmido pCMV-EPO, proporcionado por B. Pitard, Inserm UMR533 Nantes Francia, contiene la secuencia del gen de la EPO posterior a un promotor de citomegalovirus. El gen de la EPO se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando pCMV-EPO como platilla y los cebadores FE1epo, RH3epo o RH3His6epo, permitiendo la adición de sitios de restricción EcoRI y HindlIl. Después de la digestión con EcoRI y HindIII, el inserto se introdujo en el vector pPHA-T1.
Figure imgf000024_0001
Constructos de expresión para PTX3 humano
El vector de clonación pPHA-T1 construido por Zavlaskaía et al., (2000) incluye secuencias de los promotores fcpA y fcpB de P. tricornutum (fucoxantina-clorofila a/c-proteínas de unión A y B) y el terminador de fcpA. Contiene un casete de selección con el gen she ble y un MCS que flanquea el promotor fcpA. La Pentraxina 3 humana (PTX3) se codifica por un gen de 1146 pares de bases (secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 CCDS3180.1). El plásmido pPTX3 (cDNA) se compró a la compañía alemana RPDZ. El gen PTX3 se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando pPTX3 como plantilla y los siguientes cebadores que permiten la adición de sitios de restricción EcoRV y Hindlll. Después de la digestión con EcoRV y Hindlll, el inserto se introdujo en el vector pPHA-T1.
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Constructos para la transformación de P. tricornutum: modificación de las vías de síntesis de N-glicanos
Se diseñaron tres vectores para introducir los genes humanos de las vías de N-glicosilación en P. tricornutum. El esqueleto de estos vectores es pPHA-T1.
El primer vector es pGl. Este vector comprende:
• el gen cat (cloranfenicol acetiltransferasa que confiere resistencia al cloranfenicol) bajo el control del promotor del citomegalovirus (pCMV) y el terminador fcpA: [pCMV-cat-tfcpA]
• un sitio de clonación múltiple rodeado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor (p35S) y el terminador fcpA: [p35S-MCS-tfcpA].
El vector pG2 comprende:
• el gen nat (resistencia a Nourseotricina) bajo el control del promotor del citomegalovirus (pCMV) y el terminador fcpA: [pCMv-nat-tfcpA]
• un sitio de clonación múltiple rodeado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor (p35S) y el terminador fcpA: [p35S-MCS-tfcpA].
El tercer vector, pG3, comprende un sitio de clonación múltiple rodeado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor (p35S) y el terminador fcpA: [p35S-MCS-tfcpA].
Los siguientes genes humanos de las vías de glicosilación se insertaron en MCS de los vectores pG1, pG2 o pG3:
• GNTI humano (SEQ ID NO: 19, ID del gen humano: 4245) se insertó en pG1. Este vector se nombró entonces como pG1 GNT1.
• Manosidasa II humana (SEQ ID NO: 38, ID del gen humano: 4124) se insertó en pG3. Este vector se nombró entonces como pG3ManII.
• GNTII humano (SEQ ID NO: 21, ID del gen humano: 4247) se insertó en pG2. Este vector se nombró entonces como pG2GNTII.
• Alfa 1,6-fucosil transferasa humana (SEQ ID NO: 40, ID del gen humano: 2530) se insertó en pG3. Este vector se nombró después como pG3FucTransf.
Constructos para la expresión de sh ble en Tetraselmis suecica y Chlorella sorokiniana
El vector p35SshbleTnos se construyó en los laboratorios PBA (IFREMER) utilizando un plásmido pUC19. Incluye el promotor del virus del mosaico de la coliflor (p35S), el gen sh ble que confiere resistencia a la zeocina y el terminador de la nopalina sintasa (Tnos).
El vector pUbi1barTnos se construyó en los laboratorios PBA (IFREMER) utilizando un plásmido pUC19. Incluye el promotor ubiquitina 1 del maíz (Ubi1), el gen bar que confiere resistencia al glufosinato y el terminador de la nopalina sintasa (Tnos).
Transformación genética
La transformación genética se llevó a cabo mediante bombardeo de partículas utilizando el aparato BIORAD PDS-1000/He según Thomas et al., (2001).
Los cultivos de microalgas (ccaplO52/1A de P. tricornutum, ccmp904 de Tetraselmis suecica o Chlorella sorokiniana) en fase de crecimiento exponencial se concentraron por centrifugación (10 minutos, 2150 g, 20°C), se diluyeron en agua estéril (agua de mar para P. tricornutum y T. suecica, agua destilada para C. sorokiniana), y se esparcieron en gelosas a 108 células por placa. Los microportadores fueron partículas de oro (diámetro 0,6 pm). Los microportadores se prepararon según el protocolo del proveedor (BIORAD). Los parámetros utilizados para la prueba fueron los siguientes:
- uso de la boquilla larga,
- uso del anillo de parada con el agujero más grande,
- 15 cm entre el anillo de parada y el objetivo (células de microalgas),
- precipitación del DNA con CaCl21,25 M y espermidina 20 mM,
- una relación de 1,25 pg de DNA para 0,75 mg de partículas de oro por toma,
- disco de ruptura de 900 psi con una distancia de escape de 0,2 cm para la microalga Phaeodactylum tricornutum, disco de ruptura de psi con una distancia de escape de 0,4 cm para Tetraselmis suecica, disco de ruptura de 650 psi y una distancia de escape de 0,1 cm para Chlorella sorokiniana.
- un vacío de 30 Hg, y
- cuatro tomas por placa Petri.
Las microalgas se incubaron 48 horas antes de la adición del antibiótico zeocina (100 pg/ml para Phaeodactylum tricornutum o 500 pg/ml para Tetraselmis suecica o 200 pg/ml para Chlorella sorokiniana) o adición de glufosinato (1 mg/ml) para Chlorella sorokiniana y se mantuvieron después a 20°C (o 28°C para Chlorella sorokiniana) bajo iluminación constante.
Extracción del DNA de las microalgas
5.108 células de microalgas se sedimentaron por centrifugación (2150 g, 15 minutos, 4°C). Las células de microalgas se incubaron durante la noche a 4°C con 4 mL de tampón TE NaCl 1X (Tris-HCl 0,1 M, EDTA 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 8). 1% de SDS, 1% de Sarkosyl y 0,4 mg. mL-1 de proteinasa K se añadieron después a la muestra, seguido por 90 minutos de incubación a 40°C. Se llevó a cabo una primera extracción con fenol-cloroformo de alcohol isoamílico para extraer una fase acuosa que comprende los ácidos nucleicos.
El RNA presente en la muestra se eliminó mediante una hora de incubación a 60°C en presencia de RNasa (1 |jg.mL-1). Una segunda extracción con fenol-cloroformo se llevó a cabo, seguido por una precipitación con etanol. Finalmente, el sedimento se secó y se solubilizó en 200 j l de agua estéril ultrapura. La cuantificación del DNA se realizó por espectrometría (260 nm) y se analizó por electroforesis.
Extracción del RNA
107 células se sedimentaron a partir de un cultivo en una fase de crecimiento exponencial por centrifugación a 2150 g durante 10 minutos a 4°C, el sedimento se congeló con nitrógeno líquido y las extracciones del RNA se realizaron con un kit Gen ELuteTM Mammalian Total RNA Miniprep kit (Sigma).
Detección de RNA recombinante por transcripción inversa y PCR
RT-PCRs se llevaron a cabo con el equipo Enhanced Avian RT First Strand Synthesis Kit (Sigma) según las instrucciones del fabricante, utilizando cebadores polydT y los siguientes cebadores específicos.
Figure imgf000026_0001
Preparación del extracto crudo de microalgas para la detección de EPO o PTX3
107 células se sedimentaron a partir de un cultivo en fase de crecimiento exponencial por centrifugación a 2150 g durante 10 minutos a 4°C. Después del lavado con tampón TBS 1X, las células se congelaron en nitrógeno líquido, después se resuspendieron con 1 mL de tampón TBS. La suspensión celular se sometió a sonicación después durante 30 minutos a 4°C y se centrifugó a 4500 g durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se recogió finalmente y correspondió a los extractos crudos de las microalgas.
En algunos casos, las proteínas de los extractos crudos se precipitaron con sulfato de amonio al 90% (NH^SO4 mientras se incubaban a 4°C bajo agitación durante 2h30min. Después de una centrifugación a 9000 g a 4°C durante 30 min, la disolución se suspendió en agua milliQ y se homogeneizó antes de dializarse durante la noche a 4°C frente a agua.
La concentración de proteína de las muestras se midió utilizando el “BCATM Protein Assay Kit” (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. La separación electroforética de las proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, la inmunodetección se llevó a cabo con un anticuerpo anti-murino de EPO murino, un anticuerpo anti-humano PTX3 o un anticuerpo anti-His-tag (R&D systems).
Ensayo ELISA
El análisis de las muestras de proteínas por ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima) se llevó a cabo sobre los extractos celulares crudos.
Los ensayos se realizaron con el Kit de inmunoensayos ELISA Quantikine Mouse/Rat EPO (R&D Systems) o con el Kit Human Pentraxin 3/TSG-14 Quantikine ELISA (R&D Systems), según las instrucciones del fabricante.
Purificación de proteínas recombinantes marcadas en His
1 ml de resina (perlas de Ni-NTA, Hi-Trap chelating HP Amersham Biosciences) se mezcla en una disolución acuosa que contiene imidazol 0,1 M durante 2 horas a temperatura ambiente y bajo agitación. Las muestras de proteínas liofilizadas se mezclan en un pequeño volumen de tampón (Tris pH 7,6, 30 mM, glicerol al 20%, NaCl 50 mM, PMSF 1 mM, p-mercaptoetanol 1 mM) que contiene imidazol 0,1 M. La resina y las muestras se mezclan después y se incuban 2 horas a 4°C bajo agitación. Después de 10 minutos de centrifugación (4000 g a 4°C), el sobrenadante se desecha y se añaden 20 ml de tampón de lavado (Na2HPO420 mM, glicerol al 20%, NaCl 0,5 M, PMSF 1 mM, pmercaptoetanol 1 mM, que contiene imidazol 0,250 M). Después de una mezcla suave y centrifugación (10 min a 4000 g 4°C), el sedimento se resuspende en 3 ml de tampón de elución (Na2HPO420 mM, glicerol al 20%, NaCl 0,5 M, PMSF 1 mM, p-mercaptoetanol 1 mM) que contiene imidazol 1 M. La muestra se incuba después bajo agitación durante 2 horas a 4°C. Después de 10 minutos de centrifugación (4000 g a 4°C), el sobrenadante se recoge y el imidazol se elimina después de las muestras utilizando columnas centricon de 3 kDa (Millipore) según las instrucciones del fabricante.
Bioensayo de EPO
El bioensayo de la EPO recombinante producida en Phaeodactylum tricornutum se realizó utilizando la línea celular TF-I de eritroleucemia humana adquirida de ATCC. Cuando se cultivan con EPO, las células TF-I se diferencian por producir hemoglobina.
Las células se cultivaron (37°C, 5% de CO2) en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2mM, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina y 5 ng/mL del factor estimulante de la colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). 24 horas antes del bioensayo de EPO, GM-CSF se eliminó del medio de cultivo celular. Las células se incubaron después durante 3 días con 0,1-10 ng/mL de EPO de ratón recombinante (control positivo) o 0,1-10 ng/mL de EPO murino recombinante de Phaeodactylum tricornutum (basado en la cuantificación por ELISA). Las células se incubaron también con un volumen similar de extracto de Phaeodactylum tricornutum como un control negativo (Phaeodactylum tricornutum transformado por el plásmido pPHA-T 1).
El día 3, las células diferenciadas que producen hemoglobina se tiñeron utilizando el método de bencidina descrito en Matsubara et al., (J. Biol. Chem., vol 284 (6), p: 3480-3487, 2009). Las células con el citoplasma con tinción azulmarrón se contaron como células hemoglobinizadas. La viabilidad celular se evaluó también utilizando azul tripán. Se contaron 200 células en cada análisis y los experimentos se repitieron tres veces.
Los resultados se expresaron como un porcentaje de células diferenciadas y viables (+/- SEM).
Resultados
Análisis en silicio del genoma de Phaeodactylum tricornutum
La vía biosintética de N-glicanos se puede dividir en tres etapas en eucariotas: 1- la síntesis del donante de oligosacárido unido a pirofosfato de dolicol Glc3MangGlcNAc2-PP-Dol y su transferencia mediante la oligosacariltransferasa (OST) a los restos de asparagina de los polipéptidos nacientes que ingresan al lumen de retículo endoplásmico rugoso, 2- la desglucosilación/reglucosilación del N-glicano precursor en el retículo endoplásmico (ER) que permite la interacción con los chaperones responsables del plegamiento y la oligomeración adecuados y finalmente 3- la maduración en el aparato de Golgi en oligosacáridos unidos a N del tipo de manosa alta y después N-glicanos del tipo complejo. Basados en homologías de secuencia con genes que codifican estas diferentes etapas en organismos eucarióticos, identificamos en el genoma de Phaeodactylum tricornutum un conjunto de secuencias putativas para las etapas de la biosíntesis y maduración de N-glicanos en N-glicanos del tipo de manosa alta (véase Fig. 1 y Table 2). La mayoría de estos genes identificados tienen soporte EST (Fig. 1, Tabla 2).
Tabla 2
Referencias y características de las proteínas putativas implicadas en la biosíntesis de N-glicanos en P. tricornutum N°1 Proteína2 Longitud EST Péptido TMD5 Pfam de proteína P.t.1.8.63 P.t.34 de señal
Síntesis del precursor del fosfato de dolicol
Figure imgf000027_0001
PF0520S
44423 a{U)-M anT 5 SI Sí No Sí (1
PF0390!
44374 aí l,2)-ManT 337 Sí No No 10
PFÜ3901
4490S ai 1,3)-GlcT 437 No Sí No 7
PF03155
44117 aO,3)-GkT 333 No Sí Sí 10
PF03I55
I ^705 P-DnlMúnT 237 Sí No Sí O
PP0O535
34317 P-Dol UlcT 321 No No No o
PF00333
Transferencia del precursor
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000028_0001
PrOl3321*345
1Número de secuencia en el genoma de Phaeodactylum tricornutum
Función biológica putativa de la proteína codificada por el gen
3ESTs de la cepa P.t.1.8.6 de Phaeodactylum tricornutum cultivada en condiciones estándar
4ESTs de la cepa P.t.3 de Phaeodactylum tricornutum cultivada en condiciones estándar
5Dominios de transmembrana
Biosíntesis y transferencia de los oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolicol
Todos los enzimas implicados en la biosíntesis de los oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolicol en la cara citosólica y en el lumen del ER se identificaron en el genoma de Phaeodactylum tricornutum. Estas secuencias y topologías de las proteínas predichas comparten fuertes homologías con los homólogos de glicosilación (alg) unidos a asparagina correspondientes descritos en otros eucariotas. También se predicen transferasas putativas capaces de catalizar la formación de manosa y glucosa activada con dolicol. Estos dos azúcares activados son necesarios para las etapas de alargamiento que surgen en el lumen del ER. Además de las secuencias implicadas en la biosíntesis del oligosacárido unido a pirofosfato de dolicol, se identificaron dos genes putativos homólogos a la subunidad catalítica STT3 del complejo de multisubunidades de oligosacariltransferasa (OST) en el genoma de P. tricornutum (Tabla 2). Estas secuencias de múltiples extensiones, que tienen respectivamente 34% y 37% de identidad con las subunidades STT3 de Arabidopsis thaliana y Homo sapiens, contienen el dominio WWDYG necesario para la transferencia del precursor a los restos asn.
Control de calidad de la proteína en el ER
Solo se encontraron secuencias putativas que codifican las subunidades a y p de la a-glucosidasa II en el genoma de P. tricornutum. Las subunidades a y p albergan la secuencia DMNE característica y un dominio de lectina del tipo C implicado en la unión a manosa. Una UDP-glucosa putativa: también se predicen glucosiltransferasa de glicoproteína (UGGT) y una calreticulina, dos moléculas que aseguran el control de calidad de las proteínas en el ER. La calreticulina es una proteína soluble que es una de las principales proteínas de unión a Ca2+ del lumen del ER que está implicada en la retención de proteínas plegadas de forma incorrecta o incompleta. La calreticulina de P. tricornutum es similar en tamaño a las calreticulinas conocidas (aproximadamente 400 aminoácidos) y muestran más del 50% de identidad con las respectivas proteínas de Nicotiana plumbaginifolia (56%), Chlamydomonas reinhardtii (56%), Ricinus communis (54%) y Arabidopsis thaliana (53%). Estructuralmente, la calreticulina de P. tricornutum contiene los tres dominios específicos necesarios para su función biológica: un dominio N-terminal de aproximadamente 180 aminoácidos, un dominio central de aproximadamente 70 restos que contiene tres repeticiones de unos motivos ácidos de 17 aminoácidos responsables de la unión a Ca2+ con una baja capacidad y una alta afinidad y un dominio C-terminal rico en restos ácidos y de lisina que se pueden unir a Ca2+ con una alta capacidad pero una baja afinidad. La calreticulina de P. tricornutum también alberga un péptido señal predicho y un tetrapéptido YDEF C-terminal que podría asegurar su retención en el ER.
Maduración de los glicanos unidos a N en el aparato de Golgi
Una secuencia que codifica una a(1,2)-manosidasa I putativa en Golgi se identificó en el genoma (Tabla 2). Esta glicosidasa es capaz de convertir MangGlcNAc2 en MansGlcNAc2.
Composición del azúcar y análisis por transferencia de Western de las proteínas de P. tricornutum
La composición del azúcar de las proteínas de P. tricornutum aisladas de la cepa Pt 1.8.6 fusiforme se determinó para investigar la presencia de monosacáridos específicos para N-glicanos. Las proteínas se hidrolizaron y los monosacáridos resultantes se convirtieron en derivados 1-O-metil persililo y se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de impacto electrónico (GC-EI MS). Como se presenta en la Tabla 3, la manosa y la N-acetilglucosamina, dos monómeros constitutivos de los glicanos unidos a N, se identificaron en el extracto de proteínas de P. tricornutum. Se identificaron otros monosacáridos, tales como ramnosa, xilosa, fucosa, glucosa y galactosa. Sin embargo, no se puede concluir si estos monómeros surgen de glicanos unidos a proteínas o de polisacáridos contaminantes. Por el contrario, no se detectaron ácido N-acetilnuramínico ni su precursor N-acetilmanosamina. Para asegurar la ausencia de una vía de sialilación en las proteínas de P. tricornutum, las proteínas de P. tricornutum se sometieron a una hidrólisis ácida suave. El hidrolizado se acopló a 1,2-diamino-4,5-metilen dioxibenceno (DMB) y los derivados resultantes se analizaron por cromatografía de líquidos como se describió anteriormente. Los picos detectados por fluorescencia se recogieron y se analizaron mediante espectrometría de masas del tiempo de ionización de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS). No se identificaron ácidos siálicos que confirmen la ausencia en estas diatomeas de una vía de sialilación detectable (no se muestra).
Tabla 3
Composición de azúcares de las proteínas de P. tricornutum
Monosacárido % en moles1
Arabinosa 0,2+/-0,2
Ramnosa 29,3+/-1,6
Fucosa 5,3+/-1,0
Xilosa 18,6+/-2,0
Manosa 16,7+/-8,4
Galactosa 20,6+/-2,5
GalNAc 5,1+/-2,9
GlcNAc 6,2+/-3,1
ManNAc n.d.2
Neu5Ac n.d.2
1Proporción relativa entre monómeros
2No detectado
El análisis estructural de los glicanos unidos a N de las proteínas de P. tricornutum se investigaron después mediante el análisis de transferencia de Western en un extracto de proteínas totales utilizando sondas específicas para epítopos de glicano. Como se ilustra en la Fig. 2a, las proteínas de P. tricornutum se afinodetectan por concanavalina A, una lectina específica para secuencias de alta manosa. Esta afinodetección se suprime tras el tratamiento con Endo H o PNGasa, dos enzimas capaces de escindir los N-glicanos, lo que confirma que esta lectina reconoció las secuencias de glicanos unidos a N de las proteínas de P. tricornutum (Fig. 2b). Por el contrario, la afinodetección con ECA y PHA, dos lectinas específicas para epítopos de glicanos unidos a N complejos, fue negativa (no se muestra). Después se llevaron a cabo las inmunodetecciones utilizando anticuerpos producidos frente a los glicoepitopos de plantas. Los anticuerpos específicos para los epítopos del núcleo-a(1,3)-fucosa o núcleo-p(1,2)-xilosa unidos al núcleo común de Man3GlcNAc2 no se detectaron en ninguna proteína de P. tricornutum (Fig. 2a).
Los N-glicanos de tipo complejo resultan de la adición de una GlcNAc terminal en MansGlcNAc2 por adición de GnT I y después maduración de este oligosacárido. Para investigar la presencia en las proteínas de P. tricornutum de glicanos complejos, tratamos un extracto de proteína con una galactosiltransferasa, una enzima capaz de transferir un resto de galactosa a unidades de GlcNAc terminales, y después analizamos la preparación de proteína resultante con ECA, una lectina que se une a secuencias de Galp1-4GlcNAc. No se detectó ninguna señal después de este tratamiento, lo que indica que las proteínas de P. tricornutum no presentan GlcNAc terminal de una manera detectable.
Identificación estructural de glicanos unidos a N de P. tricornutum
Los N-glicanos se liberaron de las proteínas de P. tricornutum aisladas de la cepa Pt 1.8.6 mediante tratamiento con PNGasa A como se describió anteriormente para proteínas aisladas de plantas. PNGasa A se prefirió a PNasa F ya que esta enzima de desglicosilación es capaz de liberar una gran variedad de oligosacáridos unidos a N, incluyendo glicanos que albergan fucosa con enlaces a(1,3) al resto de glucosamina proximal. Los N-glicanos resultantes se acoplaron después a la 2-aminobenzamida (2-AB) para facilitar su detección y el análisis por espectrometría de masas. El MALDI-TOF MS del conjunto resultante de N-glicanos marcados se muestra en la Figura 3. Los iones principales corresponden a iones (M+Na)+ de los derivados 2-AB de Hexosa5-gGlcNAc2. El conjunto de glicanos se sometieron después a una digestión con exoglicosidasa. Consistente con la presencia de restos de manosa aunidas, la mezcla de oligosacáridos se convirtió en Hexosa2GlcNAc2 en Hexosa4GlcNAc2 después del tratamiento con a-manosidasa del frijol Jack (no mostrado). Como consecuencia, los iones detectados en MALDI-TOF MS se asignaron a N-glicanos de alta manosa que varían de MangGlcNAc2 a Man5GlcNAc2 descritos anteriormente en otros eucariotas.
En conjunto, el análisis bioquímico de los glicanos unidos a N de P. tricornutum demostró que las proteínas de este organismo albergan N-glicanos del tipo de alta manosa que varían de MangGlcNAc2 a Man5GlcNAc2. Estos análisis no revelaron la presencia de epítopos de N-glicanos de plantas, es decir epítopos de núcleo-a(1,3)-fucosa o núcleop(1,2)-xilosa unidos al núcleo común de Man3GlcNAc2. Se sabe que estos epítopos son altamente imunogénicos en humanos y necesitan el desarrollo de la estrategia de desactivación de los genes correspondientes antes de cualquier uso de proteínas derivadas de plantas en terapia humana.
Análisis de N-glicosilación de proteínas de microalgas representativas del filo principal
La N-glicosilación de proteínas aisladas de las microalgas representativas del filo principal se analizó mediante la transferencia de Western utilizando sondas específicas de glicanos (Figura 4). Las proteínas de Tetraselmis, Rhodella, Euglena y Pavlova (Figura 4A), de Skeuletonema, Heterocapsa, Amphora, Chaetoceros, Naviculas, Nanochloropsis (Figura 4B, C, D) y de Chlorella, Nanochloropsis salina, Chlorella sorokiniana, Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Nitzschia punctata, Thalassiosira pseudonana, Heterocapsa triquetra, Porphyridium cruentum (datos no mostrados) se afinodetectaron por la concanavalina A pero no por otras sondas tales como anticuerpos producidos frente a epítopos de a(1,3)-fucosa y p(1,2)-xilosa, específicos para N-glicanos complejos de plantas. La afinodetección desapareció después del tratamiento con Endo H lo que confirma que las señales positivas de concanavalina A surgieron de los glicanos unidos a N. Como consecuencia, como se observó en P. tricornutum, concluimos que las microalgas representativas ensayadas:
- Algas verdes: Tetraselmis (Prasinofitas), Nanochloropsis (por ejemplo, Nanochloropsis salina) y Chlorella (Clorofitas; por ejemplo, Chlorella sorokiniana),
- algas rojas: Rhodella y Porphyridium cruentum (Rodofitina),
- cromalveolados: Pavlova (Crisofitas), Skeuletonema, Amphora, Chaetoceros (por ejemplo, Chaetoceros calcitrans), Nitzschia punctata, Thalassiosira pseudonana, Navículas (Diatomeas), Isochrysis galbana (Haptofitas), Heterocapsa triquetra (Dinoflagelados);
- Euglenidos: Euglena,
en este estudio abarcan los N-glicanos de alta mañosa en sus proteínas y no abarcan los epítopos de a(1,3)-fucosa y p(1,2)-xilosa.
Expresión de la EPO murina recombinante en P. tricornutum
La cepa CCAP 1052/1A de P. tricornutum se transformó por bombardeo de partículas con los plásmidos pZEPO o pZEPOHis (Figura 5). Entre los transformantes resistentes a zeocina, se probaron 80 clones (para cada constructo) para determinar la presencia del gen de interés, EPO. La presencia del gen EPO se verificó mediante PCR con los siguientes cebadores: un par de cebadores específicos del transgén y un par de cebadores FpZ y RpZ que se hibridan antes y después del transgén dentro del vector pPHA-TL.
Figure imgf000031_0001
Los clones de P. tricornitum transformados por pZEPO se denominaron E1 a E80 y los resultantes de las transformaciones por pZEPOHis se denominaron H1 a H80.
En la Figura 6, las amplificaciones se llevaron a cabo con los cebadores FpZ y RpZ que se hibridan respectivamente en el extremo 5' del promotor fcpA y 3' de la terminación del fcpA, permitiendo la amplificación del transgén insertado en el MCS de pPHA-TI. Las muestras E3 y H6 presentan una amplificación de aproximadamente 600 pares de bases que corresponde al tamaño del transgén de la EPO.
La Figura 6B muestra los productos de PCR realizados con cebadores específicos de EPO. El control positivo de la PCR (realizado sobre el vector pZEPO) presenta una banda de amplificación a aproximadamente 600 pares de bases. Las muestras E3, E5, h6, H7 presentan una amplificación de aproximadamente 600 pares de bases que corresponde al tamaño de la EPO.
Entre todos los clones de P. tricornutum resistentes a zeocina, aproximadamente el 90% integró el transgén de EPO en su genoma.
También se analizó la expresión del transgén a nivel de RNA. La Figura 6C muestra que las muestras E1, E2, H1 y H2 presentan una amplificación de aproximadamente 385 pares de bases que corresponden a los transcriptos de EPO.
Entre todos los clones de P. tricornutum resistentes a zeocina, aproximadamente el 76% expresó transcriptos de EPO.
Después se analizó la presencia de la proteína EPO.
La presencia de EPO murina recombinante se ensayó en extractos crudos mediante ensayos ELISA. La EPO murina recombinante se detectó en un 60% de los clones ensayados.
Para aumentar la cantidad de proteína EPO en las células, se llevó a cabo una inducción del promotor fcpA. Las microalgas se incubaron 36 horas en la oscuridad y después se colocaron en la luz (TO). Las muestras se recogieron a T3, T6, T9, T12 y T15 horas y se cargaron en SDS-PAGE. El análisis por inmunodetección con un anticuerpo anti-EPO mostró que la proteína recombinante de EPO se produce en las células de las microalgas (Figura 7).
Como el peso molecular de la proteína EPO no glicosilada es de aproximadamente 18 kDa, la EPO recombinante detectada por transferencia de Western muestra una migración electroforética (aproximadamente 25 kDa) consistente con la presencia de estructuras de glicano (Figura 7). La EPO recombinante producida en células CHO (columna EPO en la Figura 7) muestra una migración electroforética de aproximadamente 30,1 kDa debido a la presencia de glicanos complejos.
Como demostramos que las células de Phaeodactylum introdujeron Man5 a Mang en sus proteínas, postulamos que dichas estructuras de glicanos están unidas a la EPO recombinante y son responsables de la disminución de la movilidad electroforética observada en SDS-PAGE.
Para verificar esta hipótesis, digerimos la EPO recombinante mediante la PNGasa F que escinde específicamente los N-glicanos que carecen del núcleo de fucosa con enlaces alfa-(1,3). Cargamos las muestras en SDS-PAGE y las EPO murinas recombinantes producidas en CHO, antes y después de la digestión por PNGasa. Después de la inmunodetección con anticuerpos anti-EPO, podemos comparar los perfiles electroforéticos. Todas las muestras digeridas tienen alrededor de 18-19 kDa, lo que concuerda con la digestión efectiva de la N-glicosilaciones que dan una proteína no glicosilada de aproximadamente 18 kDa. Este experimento muestra que algo de N-glicosilación está presente en la EPO murina recombinante producida por Phaeodactylum tricornutum y confirma que dicha EPO no contiene el núcleo de fucosa con enlaces alfa-(1,3).
Para caracterizar aún más las estructuras de N-glicano, estamos analizando los perfiles de N-glicosilación de esta EPO murina recombinante producida por Phaeodactylum tricornutum por espectrometría de masas. Se están realizando ensayos de actividad sobre la EPO recombinante.
Bioensayos de EPO
Los ensayos preliminares del experimento en curso revelaron la producción de hemoglobina cuando las células TF-1 se incubaron con EPO murina de Phaeodactylum tricornutum que lleva el plásmido pZEPO en comparación con las células incubadas con extracto de P. Tricornutum que lleva el plásmido pPHA-T1. La viabilidad celular se mantuvo similar a lo largo del experimento.
Estos resultados revelaron que la EPO murina recombinante producida por Phaeodactylum tricornutum retuvo su actividad biológica medida como la capacidad para inducir la diferenciación de células TF-1.
Inmunogenicidad de EPO
La actividad y la inmunogenicidad de la EPO producida por P. tricornutum se ensayó in vivo en ratones: después de la inyección de la EPO recombinante, la cantidad de eritrocitos se analizó para determinar la actividad de EPO. Además, la respuesta inmune se analizó para determinar que dicha EPO recombinante no presenta ninguna incompatibilidad con un uso terapéutico.
Transformación de las vías de N-glicosilación de P. tricornutum:
Dos cepas de P. tricornutum se transformaron con varios genes humanos: algas de tipo nativo y recombinantes que expresan EPO de ratón.
Estas microalgas se transformaron en dos tiempos.
Primero, las células de Phaeodactylum tricornutum se co-transformaron mediante dos vectores: PG1GNTI que confiere resistencia al cloranfenicol (y con el gen GNTI humano) y con el vector pG3ManII (con el gen manosidasa II humano). Después de la selección de los transformantes con cloranfenicol, se analizaron las vías de glicosilación de las algas: EPO recombinante se purificó y la N-glicosilación se analizó mediante espectrometría de masas. Las algas que presentan una actividad de GNTI y ManII se aislaron y co-transformaron otra vez, pero con: pG2GNTII que confiere resistencia a la Nourseotricina (con el gen GNTII humano) y con el vector pG3Fuctransf (con Alfa 1,6 fucosil transferasa humana). Se seleccionaron las microalgas transformadas con nourseotricina, y se analizó la N-glicosilación de EPO recombinante por espectrometría de masas.
Actualmente estamos terminando estos experimentos antes de introducir otros genes para ir más allá en la “humanización” de los N-glicanos de P. tricornutum.
Expresión de PTX3 humana recombinante en P. tricornutum:
La cepa CCAP 1052/1 A de P. tricornutum se transformó por bombardeo de partículas con el plásmido pZPTX3. Entre los transformantes resistentes a zeocina, se ensayaron 50 clones para la presencia del gen de interés, PTX3. La presencia del gen PTX3 se verificó mediante PCR con los siguientes cebadores: un par de cebadores específicos del transgén, y un par de cebadores FpZ y RpZ que se hibridan antes y después del transgén dentro del vector pPHA-TI.
Figure imgf000033_0001
Entre todos los clones resistentes a zeocina de P. tricornutum, aproximadamente el 90% integró el transgén PTX3 en su genoma.
El análisis de la presencia de transcriptos y proteína de PTX3 en clones resistentes a zeocina de P. tricornutum está actualmente bajo investigación.
Transformación de la Prasinofita Tetraselmis suecica:
El Tetraselmis suecica ccmp904 se transformó por bombardeo de partículas con el constructo p35SshbleNos. Obtuvimos clones resistentes a zeocina, lo que indica que la proteína Sh Ble se expresa en las microalgas. A pesar de que Sh Ble no es una proteína glicosilada, este experimento muestra la viabilidad de producir proteínas recombinantes en Tetraselmis suecica. Como Tetraselmis suecica es capaz de proteínas endógenas N-glicosiladas (véase página 45), podemos asumir que un polipéptido que presenta sitios de N-glicosilación, cuando se expresa en estas microalgas, presentará estructuras de N-glicanos.
Transformación de la Clorofita Chlorella sorokiniana:
La Chlorella sorokiniana UTEX 1330 se transformó por bombardeo de partículas con los constructos p35SshbleTnos y pUbilbarTNos. Se obtuvieron clones resistentes a zeocina, lo que indica que la proteína Sh ble se expresa en las microalgas, y clones resistentes a glufosinato lo que indica que el gen bar se expresa en las microalgas. Esto resalta el hecho de que tenemos herramientas para transformar la clorofita Chlorella sorokiniana, especialmente los vectores con promotores funcionales.
A pesar de que Sh ble no es una proteína glicosilada, este experimento muestra la factibilidad de producir proteínas recombinantes en Chlorella sorokiniana. Como esta alga es capaz de proteínas N-glicosiladas endógenas (datos no mostrados), podemos suponer que un polipéptido que presenta sitios de N-glicosilación, cuando se expresa en estas microalgas, presentará estructura de N-glicanos.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir al menos un polipéptido glicosilado que tiene un patrón de glicosilación adecuado para fines terapéuticos, que comprende las etapas de:
(i) cultivar una microalga transformada de Phaeodactylum tricornutum, que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido glicosilado que se expresa en las microalgas transformadas para obtener la expresión de dicho al menos un polipéptido glicosilado, y,
(ii) seleccionar dicho al menos un polipéptido glicosilado para determinar el patrón de glicosilación de dicho al menos un polipéptido glicosilado y para seleccionar el al menos un polipéptido glicosilado que tiene al menos una estructura de MangGlcNAc2 a MansGlcNAc2 que no comprende xilosa con enlaces p(1,2) y/o fucosa con enlaces a(1,3),
en donde dichas microalgas transformadas no comparten ninguna actividad de p(1,2) xilosil transferasa y/o a(1,3) fucosil transferasa antes de transformarse, y no comparten ninguna actividad de manosiltransferasa que conduce a proteínas hipermanosiladas que resultan de la adición de manosa a la estructura de glicano.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el polipéptido glicosilado se selecciona del grupo que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado no humano, una secuencia de aminoácidos primaria de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, y/o una secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido glicosilado no mamífero.
3. El método según la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido glicosilado expresado en las microalgas transformadas es eritropoyetina, una citoquina, un anticuerpo, un factor de coagulación, una hormona, una betaglucocerebrosidasa, una pentraxina-3, o un anti-TNF.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I (Gnt I) que se expresa en las microalgas transformadas.
5. El método según la reivindicación 4, en donde dichas microalgas comprenden además una secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una manosidasa II que se expresa en las microalgas transformadas.
6. El método según la reivindicación 5, en donde dichas microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa II que se expresa en las microalgas transformadas.
7. El método según la reivindicación 6, en donde dichas microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima seleccionada entre N-acetilglucosaminiltransferasa II, III, IV, V y VI que se expresa en las microalgas transformadas.
8. El método según las reivindicaciones 6 ó 7, en donde dichas microalgas transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor que impulsa la expresión en dichas microalgas, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica al menos una enzima glicosiltransferasa seleccionada entre galactosiltransferasa, fucosiltransferasa y sialiltransferasa, que se expresa en las microalgas transformadas.
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