ES2735899T3 - Composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, la proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos o la proteína de fusión de transferrina de la misma - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que el 116º aminoácido, treonina, está sustituido con una cisteína, de manera que la cisteína es adecuada para enlaces de sulfuro con el 17º aminoácido, cisteína, de G-CSF.

Description

d e s c r ip c ió n

Composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, la proteína muíante del factor estimulante de colonias de granulocitos o la proteína de fusión de transferrina de la misma

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención.

La presente invención se refiere a una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF).

2. Descripción de la técnica relacionada

El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es una glicoproteína que estimula la supervivencia, proliferación, diferenciación y funciones de las células progenitoras de neutrófilos y granulocitos y los neutrófilos maduros.

El G-CSF natural que ahora se usa clínicamente se llama 'Filgrastim', y es una proteína recombinante compuesta por 175 aminoácidos originados de la secuencia de aminoácidos humanos. Esta proteína recombinante se expresa en E. coli y no está glicosilada a diferencia del tipo natural.

El G-CSF se usa como un adyuvante anticáncer para la prevención de complicaciones infecciosas causadas por neutropenia acompañada por el tratamiento del cáncer mediante la estimulación de la granulopoyesis de neutrófilos. El G-CSF demuestra un efecto clínico beneficioso en pacientes con cáncer porque puede reducir los efectos secundarios de la neutropenia febril causada por la quimioterapia o la radioterapia para el tratamiento del cáncer y, por lo tanto, puede reducir la tasa de mortalidad por quimioterapia para el tratamiento del cáncer. El G-CSF aumenta el número de células progenitoras hematopoyéticas y, en consecuencia, reduce los efectos secundarios mencionados anteriormente.

También se sabe que el G-CSF estimula las células madre de la médula ósea para mover el corazón isquémico y acelera la diferenciación de las células madre en células vasculares y cardiomiocitos mediante la estimulación de la regeneración miocárdica.

El G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) muestra efectos farmacológicos solo por un corto tiempo. Por lo tanto, debe administrarse al menos una vez al día para tratar la enfermedad isquémica o para tratar la leucopenia causada por la quimioterapia ^o la radioterapia contra el cáncer. Si se administra una sustancia que tiene una semivida in ^vivo larga, los tiempos de administración necesarios para aliviar la leucopenia se reducirían y, como resultado, podría traer el efecto de prevenir las complicaciones infecciosas.

Cuando el polietilenglicol (PEG), el polímero químico que no se degrada in vivo, se fusiona con el extremo N-terminal de G-CSF, se produce una sustancia llamada 'Pegfilgrastim'. Esta sustancia se utiliza clínicamente para el tratamiento de la leucopenia. Esta sustancia tiene un aumento de la semivida in vivo y muestra un efecto clínico, mientras que la leucopenia continúa incluso con la administración realizada una o dos veces por semana. Sin embargo, en ese caso, una proteína se fusiona con un polímero químico por reacción química y, por lo tanto, pueden causarse problemas de eficiencia de fusión insatisfactoria y un procedimiento de purificación complicado.

La cisteína, el 17o aminoácido de G-CSF, se expone en la superficie de la proteína como un estado de unión no sulfatada. En pH neutro, la cisteína expuesta se combina con cisteína G-CSF adyacente a través de un enlace de sulfuro y como resultado pierde ^su actividad. Un muíante de G-CSF en el que la 17a cisteína está sustituida con serina muestra una mayor estabilidad en pH neutro, de acuerdo con los informes anteriores.

La transferrina es la tercera proteína más abundante en el plasma sanguíneo, que sirve para transportar los iones de hierro presentes en la sangre a diversos tejidos. La transferrina tiene una semivida relativamente larga de 8 días, que es más corta que la de la albúmina o la inmunoglobulina G. Entra a la célula a través del receptor de la transferrina en la superficie de la célula y, una vez que suministra iones de hierro, se libera al exterior de la célula en estado de unión con el receptor. Usando estas características, la transferrina se ha usado como un compañero de fusión para aumentar la semivida en circulación al combinar las proteínas con semividas cortas de la técnica anterior.

El documento WO 01/51510 describe conjugados polipeptídicos que comprenden un polipéptido que presenta actividad de G-CSF y que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de G-CSF humano en al menos un residuo de aminoácido introducido y/o eliminado especificado que comprende un grupo de unión para una fracción no polipeptídica, y que tiene al menos una fracción no polipeptídica unida a un grupo de unión del polipéptido. El grupo adjunto puede, por ejemplo, puede ser un residuo de lisina, cisteína, ácido aspártico o ácido glutámico o un sitio de glicosilación, y una fracción no polipeptídica puede por ejemplo ser un polímero como el polietilenglicol o un oligosacárido.

En la presente invención, la treonina, el 116o aminoácido del G-CSF humano, se sustituyó con cisterna para inducir la unión de sulfuro con la 17a cisterna de la secuencia de aminoácidos original de G-CSF. La unión al sulfuro hace que la estructura de la proteína sea más estable, de modo que la proteína puede ser resistente contra las proteasas, es decir, la proteína ahora tiene una resistencia a la proteasa. El intento de tener una resistencia a la proteasa a través de la construcción de tal proteína mutante es nuevo y ^su efecto aún no se ha informado.

No ha habido reportes sobre el uso de la proteína mutante de G-CSF, en la que el 116o aminoácido se reemplace con cisterna para que la fusión con transferrina aumente la semivida en sangre de G-CSF.

L^os presentes inventores lograron fabricar una proteína de fusión de transferrina y la proteína mutante de G-CSF humano en la que el 116^o aminoácido se reemplazó con cisterna y se confirmó además que la proteína de fusión había aumentado significativamente la actividad específica y la estabilidad de la sangre, en comparación con el G-CSF humano original sin fusionar, que lleva a la culminación de esta invención.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de tal manera que la cisteína es adecuada para el enlace de sulfuro con el 17o aminoácido, cisteína, de G-CSF.

Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, y un uso de la misma.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica y un adyuvante anticáncer para prevenir ^o tratar enfermedades isquémicas o neutropenia que comprende la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisteína es adecuada para el enlace de sulfuro con el 17^o aminoácido, cisteína, de G-CSF, como ingrediente activo.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que contiene el gen que codifica una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116^a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisteína sea adecuada para el enlace de sulfuro con el 17^o aminoácido, cisteína, de G-CSF, y un transformante preparado insertando el vector de expresión anterior en una célula huésped.

La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación del vector de expresión que contiene el gen que codifica una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que se sustituye la 116^a treonina con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisteína es adecuada para el enlace de sulfuro con el aminoácido 17, cisteína, de G-CSF, y el transformante preparado insertando el vector de expresión anterior en una célula huésped.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención para ^uso en terapia. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención para uso en el tratamiento de una neutropenia.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención para uso en el tratamiento del cáncer.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención para ^{su uso} en el tratamiento de una enfermedad isquémica.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención para usar en la inhibición de la disminución en el número de neuTrófilos.

La presente divulgación también describe un procedimiento para prevenir o tratar la neutropenia o la enfermedad isquémica que contiene la etapa de administrar la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en el que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, el vector de expresión o el transformante anterior a un sujeto que tiene neutropenia ^o enfermedad isquémica.

La presente divulgación también describe un procedimiento para inhibir la disminución en el número de neutrófilos que contienen la etapa de administrar la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína muíante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisterna en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, el vector de expresión ^o el transformante anterior a un sujeto.

Además, la presente invención proporciona un ^uso de la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína muíante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisterna en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisterna es adecuada para el enlace de sulfuro con el 17^o aminoácido, la cisterna, del G-CSF, el vector de expresión ^o el transformante anterior.

Efecto ventajoso

La proteína de fusión de transferrina de la presente invención muestra un aumento significativo de la actividad específica y la estabilidad de la sangre, en comparación con el G-CSF humano convencional, y tiene una mayor eficiencia de purificación que el G-CSF PEGilado convencional caracterizado por la semivida prolongada, de modo que se puede usar ventajosamente para prevenir ^o tratar enfermedades isquémicas ^o neutropenia.

Breve descripción de I^os dibujos

La aplicación de las realizaciones preferentes de la presente invención se entiende mejor con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es un diagrama que ilustra el mapa de escisión del vector pcDNA3.1(+)/preTf.

La Figura 2 es un diagrama que ilustra el mapa de escisión del vector pcDNA3.1(+)/preTf(B).

La Figura 3 es un diagrama que ilustra el mapa de escisión del vector pcDNA3.1(+)/Tf(B).

La Figura 4 es un diagrama que ilustra el mapa de escisión del vector pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-TF.

La Figura 5 es un diagrama que ilustra la expresión de G-CSF(T116C)-Tf en la línea celular Expi293F transfectada con plásmido G-CSF(T116C)-Tf.

La Figura 6 es un diagrama que ilustra la proteína G-CSF(T116C)-Tf separada por cromatografía en azul DEAE Affi-gel.

La Figura 7 es un diagrama que ilustra la preparación, concentración y separación de Fe3+ G-CSF(T116C)-Tf fusionado en forma holo (holoenzima).

La Figura 8 es un diagrama que ilustra la fuerza de unión de G-CSF(T116C)-Tf en forma de holo al receptor de transferrina.

La Figura 9 es un diagrama que ilustra la actividad de proliferación celular de las células HL-60 tratadas con G-CSF, G-CSF-Tf y G-CSF(T116C)-Tf.

La Figura 10 es un diagrama que ilustra la comparación de la resistencia de proteasa entre G-CSF y G-CSF(T116C).

La Figura 11 es un diagrama que ilustra la comparación de la semivida en plasma in ^vivo entre G-CSF-Tf y G-CSF(T116C)-Tf.

La Figura 12 es un diagrama que ilustra la comparación de la actividad fisiológica entre G-CSF y G-CSF(T116C)-Tf en la rata que tiene neutropenia.

Descripción de las realizaciones preferentes

En lo sucesivo, la presente invención se describe en detalle.

La presente invención proporciona una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína muíante G-CSF del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116^a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos de G-CSF, de modo que la cisteína es adecuada para la unión de sulfuro con el 17^o aminoácido, la cisteína, del G-CSF, y un ^uso del mismo.

El G-CSF ^o la transferrina utilizado en esta invención puede originarse a partir de animales, plantas ^o microorganismos. Es más preferiblemente el G-CSF o la transferrina originados en el hombre en el presente documento, pero también puede ser una proteína heteróloga que tenga la misma actividad que el G-CSF ^o la transferrina originados en humano.

La proteína anterior puede modificarse adicionalmente, tal como fosforilación, acetilación, metilación, glicosilación, etc., ^o puede fusionarse con otra proteína. Siempre que la función de la proteína no se pierda, dicha proteína mutante puede considerarse como la proteína antes de cualquier modificación.

Otro aminoácido que puede reemplazar la 116a treonina es un aminoácido hidrófobo, que es más precisamente la cisterna que posiblemente esté unida a la 17a cisterna de la secuencia de G-CSF a través del enlace disulfuro, pero no siempre está limitada a la misma.

El terminal donde se une la transferrina puede ser el terminal amino (extremo 5', terminal N) o el terminal carboxi (extremo 3', terminal C).

La proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es la proteína representada por la SEQ ID NO: 1, pero esta secuencia puede tener adición, eliminación ^o sustitución de uno ^o más aminoácidos en ^su secuencia, siempre que el gen que codifica el G-CSF se encuentre en la misma posición en el cromosoma y la actividad no cambie.

La proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) anterior tiene preferiblemente al menos 80 % de homología, más preferiblemente al menos 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. NO: 1, pero no siempre se limita a ello.

La citada transferrina es la proteína representada por la SEQ ID. NO: 2, pero esta secuencia puede tener adición, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos en su secuencia, siempre que el gen que codifica la transferrina se encuentre en la misma posición en el cromosoma y la actividad no cambie.

La proteína transferrina anterior tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID. NO: 2, pero no siempre se limita a ello. La proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es la proteína representada por la SEQ ID. NO: 3, pero esta secuencia puede tener adición, supresión ^o sustitución de uno ^o más aminoácidos en ^su secuencia siempre que el gen que codifica la transferrina se encuentre en la misma posición en el cromosoma y la actividad no cambie.

La proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) anterior tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. NO: 3, pero no siempre se limita a ello.

La proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de G-CSF tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. NO: 4, pero no siempre se limita a ello.

La proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante de G-CSF en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. NO: 5, pero no siempre se limita a ello.

La proteína mutante de G-CSF en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, ^o la transferrina puede tener la sustitución de la secuencia de nucleótidos para la manipulación de genes. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en el gen se puede sustituir con otra secuencia de nucleótidos que codifica otro aminoácido que es igual al aminoácido original pero que no causa ningún cambio en la actividad de la proteína, o una parte del gen terminal se puede eliminar, sustituir o agregar con un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción. Por ejemplo, la timina del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI del gen de la proteína, GGATCC, puede sustituirse por citosina, pero no siempre se limita a ella.

Dicha enzima de restricción se ejemplifica mediante E^coRI, BamHI, Hindlll, kpnl, Notl, Pstl, Smal, Xhol, Fokl, AI^w26I, Bbvl, Bsrl, Earl, Hphl, Mbol, SfaNI, T th ll l l , Nael, Nhel, NgoMlV, Nhel, E^co57I, Bcgl, Bpl, Bsp24l, Bael, Cjel, EcoPI, Hintlll y StyLTI, etc. Sin embargo, cualquier enzima de restricción que se use en la técnica puede usarse de acuerdo con el gen, el vector de expresión ^o el entorno de manipulación genética sin limitación.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para uso en la prevención o el tratamiento de la neutropenia y la enfermedad isquémica que comprende la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante de G-CSF en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF o la proteína mutante G-CSF en la que la 116a treonina está sustituida con cisterna en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de manera que la cisterna es adecuada para la unión de sulfuro con el 17^o aminoácido, cisterna, de G-CSF, como ingrediente activo, un adyuvante anticanceroso que comprende el mismo, un vector de expresión que comprende un gen que codifica dicha proteína y un transformante que comprende dicho vector de expresión.

El término 'neutropenia' como se usa en este documento indica la reducción anormal de los neutrófilos. Cuando el número de neutrófilos en sangre es inferior a 1500/^|j I, se clasifica como neutropenia ligera y cuando el número de neutrófilos en sangre es inferior a 1000/^j I, se clasifica como neutropenia moderada. Cuando el número de neutrófilos en sangre es inferior a 500/j I, se clasifica como neutropenia grave. En un sentido amplio, la leucopenia (neucopenia) también se incluye en la neutropenia.

La "enfermedad isquémica" a la que se hace referencia aquí es causada por el daño celular causado cuando el suministro de sangre al tejido se interrumpe por hemorragia, embolia e infarto, etc., que se ejemplifica por trauma, rechazo de injerto, derrame cerebral, infracción cerebral, enfermedad renal isquémica, enfermedad pulmonar isquémica, enfermedad isquémica mediada por infección, enfermedad isquémica de las extremidades, cardiomiopatía isquémica, infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca, etc.

La proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es la proteína representada por la SEQ ID NO: 1, pero esta secuencia puede tener adición, eliminación ^o sustitución de uno ^o más aminoácidos en ^su secuencia, siempre que el gen que codifica el G-CSF se encuentra en la misma posición en el cromosoma y la actividad no se cambia.

La proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) anterior tiene preferiblemente al menos 80 % de homología, más preferiblemente al menos 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, pero no siempre se limita a ello.

La citada transferrina es la proteína representada por la SEQ ID NO: 2, pero esta secuencia puede tener adición, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos en su secuencia, siempre que el gen que codifica la transferrina se encuentre en la misma posición en el cromosoma y la actividad no cambie.

La proteína transferrina anterior tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2, pero no siempre se limita a ello. La proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es la proteína representada por la SEQ ID NO: 3, pero esta secuencia puede tener adición, supresión ^o sustitución de uno ^o más aminoácidos en ^su secuencia siempre que el gen que codifica la transferrina se encuentre en la misma posición en el cromosoma y la actividad no cambie.

La proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) anterior tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3, pero no siempre se limita a ello.

La proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de G-CSF tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4, pero no siempre se limita a ello.

La proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante de G-CSF en la que la 116atreonina está sustituida con otro aminoácido en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, pero esta secuencia puede tener adición, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos en su secuencia siempre que el gen que codifica el G-CSF o la transferrina se encuentre en la misma posición en el cromosoma y la actividad no cambie.

La proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante de G-CSF en la que la 116a treonina está sustituida con otro aminoácido en la secuencia de aminoácidos del G-CSF tiene preferiblemente al menos un 80 % de homología, más preferiblemente al menos un 90 % de homología, y lo más preferiblemente al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ^o 99,5 % de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5, pero no siempre se limita a ello.

La proteína mutante de G-CSF en la que la 116a treonina está sustituida con otro aminoácido en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, ^o la transferrina puede tener la sustitución de la secuencia de nucleótidos para la manipulación del gen. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en el gen se puede sustituir con otra secuencia de nucleótidos que codifica otro aminoácido que es igual al aminoácido original pero que no causa ningún cambio en la actividad de la proteína, ^o una parte del gen terminal se puede eliminar, sustituir ^o agregar con un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción. Por ejemplo, la timina del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI del gen de la proteína, GGATCC, puede sustituirse por citosina, pero no siempre se limita a ella.

Dicha enzima de restricción se ejemplifica mediante E^coRI, BamHI, Rindlll, kpnl, Notl, Pstl, Smal, Xhol, Fokl, AI^w26I, Bbvl, Bsrl, Earl, Hphl, Mbol, SfaNI, T th llll, Nael, Nhel, NgoMlV, Nhel, E^co57I, Bcgl, Bpl, Bsp24l, Bael, Cjel, EcoPI, Hintlll, y StyLTI, etc. Sin embargo, cualquier enzima de restricción que se use en la técnica puede usarse de acuerdo con el gen, el vector de expresión o el entorno de manipulación genética sin limitación.

El 'vector de expresión' de la invención es una herramienta para introducir la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína diana en una célula huésped, que incluye plásmido, cósmido, BAC y ácido nucleico del virus, etc. El vector mencionado generalmente incluye un marcador de selección, como un gen resistente a I^os antibióticos que puede confirmar la introducción exitosa de un gen diana en una célula huésped. El vector puede incluir además promotor, operador, codón de iniciación, codón de detención, secuencia poliadenilada, potenciador, secuencia de Kozak y secuencia de Shine-Dalgarno, etc., para la expresión de un gen diana. Si el vector es un vector de expresión replicable, puede contener un origen de replicación.

La célula huésped en este documento puede seleccionarse del grupo que consiste en E. coli, levadura, hongos, células vegetales y células animales, pero no siempre se limita a ellas y cualquier célula huésped que se use para la producción de una proteína recombinante en este campo puede ser aceptado.

La composición farmacéutica de la presente invención se puede preparar para administración oral ^o parenteral mezclando con diluyentes ^o excipientes de ^uso general, tales como cargas, diluyentes, aglutinantes, agentes humectantes, agentes desintegrantes y tensioactivos. Las formulaciones sólidas para administración oral son tabletas, píldoras, polvos, gránulos y cápsulas. Estas formulaciones sólidas se preparan mezclando con uno o más excipientes adecuados tales como almidón, carbonato de calcio, sacarosa o lactosa, gelatina, etc. Excepto Ios excipientes simples, se pueden usar lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, talco, etc. Las formulaciones líquidas para administraciones orales son suspensiones, soluciones, emulsiones y jarabes, y las formulaciones mencionadas anteriormente pueden contener diversos excipientes, como agentes humectantes, edulcorantes, aromáticos y conservantes, además de diluyentes simples de uso general, como agua y parafina líquida. Las formulaciones para administración parenteral son soluciones acuosas esterilizadas, excipientes insolubles en agua, suspensiones, emulsiones, preparaciones liofilizadas y supositorios. Los excipientes y suspensiones insolubles en agua pueden contener, además del compuesto o compuestos activos, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal como el aceite de oliva, éster inyectable como etilato, etc. L^os supositorios pueden contener, además del compuesto o compuestos activos, witepsol, macrogol, tween 61, manteca de cacao, manteca de laurina, glicerogelatina, etc. La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía oral ^o parenteral, y la administración parenteral incluye la aplicación externa de la piel, la inyección intrarrectal, la inyección intravenosa, la inyección intramuscular, la inyección hipodérmica, la inyección intratorácica o la inyección intracerebroventricular. La dosis efectiva de la composición farmacéutica se puede determinar según el peso, la edad, el sexo, el estado de salud, la dieta, la frecuencia de administración, el procedimiento de administración, la excreción y la gravedad de la enfermedad, pero no pueden limitar la presente invención por ningún medio. Una dosis individual contiene preferiblemente la cantidad de compuesto activo que es adecuada para ser administrada en una dosis única.

La dosis única en el presente documento para la proteína es de 1~100 mg, preferiblemente de 3~50 mg, y más preferiblemente de 6~30 mg, que puede administrarse una vez al día ^o varias veces al día y puede administrarse por separado a diferentes partes.

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse sola o tratarse junto con operación quirúrgica, terapia hormonal, quimioterapia y reguladores biológicos.

La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisteína es adecuada para el enlace de sulfuro con el aminoácido 17o, cisteína, de G-CSF, un vector de expresión que contiene el gen que codifica una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) proteína mutante en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de manera que la cisteína es adecuada para la unión de sulfuro con el 17^o aminoácido, cisteína, de G-CSF, y transformante que comprende el vector de expresión.

La proteína en el presente documento puede obtenerse mediante síntesis química o producirse a partir de células naturales, ^o purificarse a partir de células huésped transfectadas mediante tecnología de ADN recombinante. La proteína obtenida puede tener una modificación adicional, como la fosforilación, la acetilación, la metilación y la glicosilación, ^o se puede fusionar con otra proteína, pero dicha modificación se permite siempre que la función de la proteína no cambie.

El procedimiento de preparación de la proteína utilizando tecnología de ADN recombinante se compone de Ios siguientes pasos:

insertar un gen diana para la expresión en un vector de expresión;

introducir el vector de expresión en una célula huésped; y

obtener la proteína producida mediante el cultivo de la célula huésped.

Sin embargo, la producción de la proteína no se limita a lo anterior y se puede usar cualquier procedimiento conocido por I^os expertos en la técnica.

La etapa de obtención de la proteína se puede realizar utilizando una técnica de purificación bien conocida por Ios expertos en la técnica, que se ejemplifica mediante la precipitación de proteínas, centrifugación, interrupción ultrasónica, ultrafiltración, diálisis, filtración en gel, cromatografía de adsorción, cromatografía intercambio iónico, y cromatografía de afinidad.

En una realización preferente de la presente invención, se eliminó un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción del gen de la transferrina, y en ^su lugar se insertó un sitio de enzimas de restricción en el extremo 5' y también se insertaron un sitio de enzimas de restricción y un codón de detención en el extremo 3', dando como resultado la construcción de un plásmido. En el plásmido se insertó el gen que tiene la eliminación de un sitio de reconocimiento de enzima de restricción de la secuencia de G-CSF, dando como resultado la construcción de un plásmido en el que el gen de transferrina se fusionó con el gen de G-CSF.

En una realización preferente de la presente invención, se preparó un mutante de G-CSF reemplazando el 116^o aminoácido de la secuencia de G-CSF con cisterna. Se eliminó un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción del gen y en ^su lugar se insertaron un sitio de enzimas de restricción y la secuencia Kozak en el extremo 5' y también se insertó un sitio de enzimas de restricción en el extremo 3', dando como resultado la construcción de un plásmido. Luego, el gen de la transferrina se fusionó con el plásmido anterior para construir un plásmido en el que el gen de la transferrina se fusionó con el gen mutante G-CSF.

En el presente documento también se describe un procedimiento para prevenir ^o tratar la neutropenia ^o enfermedad isquémica que contiene la etapa de administrar la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisteína es adecuada para el enlace de sulfuro con el 17o aminoácido, cisteína, de G-CSF, el vector de expresión que alberga el gen que codifica dicho proteína, o el transformante preparado insertando dicho vector de expresión en una célula huésped a un sujeto que tiene neutropenia o enfermedad isquémica.

La proteína de fusión transferrina de la presente invención muestra un aumento significativo de la actividad específica y la estabilidad de la sangre, en comparación con el G-CSF humano convencional, y tiene una mayor eficiencia de purificación que el G-CSF PEGilado convencional caracterizado por la semivida eXtendida, de modo que puede usarse ventajosamente para prevenir o tratar enfermedades isquémicas o neutropenia.

En el presente documento también se describe un procedimiento para inhibir la disminución en el número de neutrófilos que contienen la etapa de administrar la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, el vector de expresión ^o el transformante anterior a un sujeto.

La proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) de la presente invención ^o la proteína de fusión transferrina de la misma muestra un aumento significativo de la actividad específica y la estabilidad de la sangre, en comparación con el G-CSF humano convencional, y tiene una mayor eficiencia de purificación que el G-CSF PEGilado convencional caracterizado por una semivida prolongada, de modo que puede usarse ventajosamente para inhibir la disminución en el número de neutrófilos.

Además, la presente invención proporciona un ^uso de la proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que la 116a treonina está sustituida con cisteína en la secuencia de aminoácidos del G-CSF, de modo que la cisteína es adecuada para el enlace de sulfuro con el 17o aminoácido, la cisteína, del G-CSF, el vector de expresión o el transformante anterior.

La proteína de fusión de transferrina de la presente invención muestra un aumento significativo de la actividad específica y la estabilidad de la sangre, en comparación con el G-CSF humano convencional, y tiene una mayor eficacia de purificación que el G-CSF PEGilado convencional caracterizado por la semivida extendida, de modo que se puede usar ventajosamente como adyuvante anticáncer, y se usa para prevenir o tratar enfermedades isquémicas ^o neutropenia.

Las realizaciones prácticas y actualmente preferentes de la presente invención son ilustrativas como se muestra en Ios siguientes Ejemplos.

Ejemplo 1: Construcción de plásmido

<1-1> Construcción del plásmido de expresión de transferrina

Se obtuvo ARNm total a partir de la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2. Las células HepG2 se subcultivaron en DMEM (HyClone) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal (WELGENE) y un 1 % de penicilina-estreptomicina (Gibco) en una incubadora a 370C y un 5 % de CO2. Dos días después, el medio de cultivo celular HepG2 se desechó y las células se lavaron con regulador fosfato (HyClone). Se obtuvo el sedimento celular y se eliminó el medio por centrifugación. Luego, el sedimento celular se almacenó a -70 oc. Las células congeladas almacenadas a -70 ^oc se descongelaron y se extrajo el ARNm total de las mismas usando RnaUs ToTal Tissue Premium RNA Preps (LeGene) con las condiciones estándar presentadas en el manual. Se sintetizó ADN^c a partir del ARNm total obtenido utilizando oligo (dT) con el sistema de síntesis de ADNc Premium Express 1st strand (LeGene).

La PCR se realizó utilizando el ADNc sintetizado como plantilla con ADN polimerasa (Phusion). Los cebadores utilizados en la reacción fueron hechos a medida en Cosmogenetech Co., Ltd. Particularmente, el sitio de la enzima de restricción Nhel y la secuencia de Kozak se insertaron en el extremo 5' del gen de la transferrina y el sitio de la enzima de restricción Xho I y el codón de detención (TAA) se insertaron en el extremo 3' del gen. 10 pmol de un cebador en sentido (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3', SEQ. ID. NO: 9) y 10 pmol de un cebador antisentido (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 10). Los cebadores, el ADN polimerasa y el ADNc se mezclaron con un regulador, al que se agregó agua destilada para que el volumen total fuera de 50 ^|j I. Se realizó la PCR de la siguiente manera; predesnaturalización a 98 ^oc durante 30 segundos, desnaturalización a 98 oc durante 10 segundos, fusión a 53 oc durante 30 segundos, polimerización a 72 oc durante 1 minuto, 30 ciclos desde la desnaturalización a la polimerización y extensión final a 72 oc durante 10 minutos. El gen de la transferrina amplificada se transfirió a gel de agarosa al 1 % para que la electroforesis confirme el tamaño. El área objetivo del gel de agarosa se cortó y el ADN se purificó utilizando el kit de purificación de ADN de fragmentos totales MEGAquick-spin™ (iNtRoN).

El gen de transferrina purificado y el plásmido pcDNA3.1(+) (Invitrogen) se digirieron con las enzimas de restricción Nhel (Enzynomics) y Xhol (Enzynomics). Se agregaron 10 unidades de la enzima de restricción y el regulador 2 (Tris-HCI 10 mM, pH 7.9, NaCI 50 mM, MgCl210 mM, DTT 1 mM, 100 j g/ml de BSA), seguido de reacción a 37 oc durante 2~3 horas. Una vez completada la reacción, se confirmó el tamaño del gen mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El área objetivo del gel de agarosa se cortó y el ADN se purificó utilizando el kit de purificación de ADN de fragmentos totales MEGAquick-spin™ (iNtRoN).

El gen de transferrina purificado y el vector pcDNA3.1(+) se hicieron reaccionar con ADN ligasa T4 (Takara) a 16 ^oc durante 16 horas. Una vez completada la reacción, el vector se insertó en E. coli DH10B, que se distribuyó en una placa de agar que contenía ampicilina, seguido de cultivo a 37 ^oc durante 16 horas. Luego, se seleccionó la colonia de E. coli.

Para investigar si el gen de la transferrina se insertó con éxito o no en el plásmido ^pcDNA3.1(+), la PCR se realizó utilizando ADN polimerasa. La colonia de E. coli seleccionada se diluyó en agua, que se usó como plantilla, seguida de PCR con el cebador en sentido (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3', SEQ. ID. NO: 9) y el cebador antisentido (5'- AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 10) utilizado para la amplificación del gen de la transferrina anterior. La PCR se realizó de la siguiente manera; predesnaturalización a 98 ^oc durante 30 segundos, desnaturalización a 98 ^oc durante 10 segundos, fusión a 53 ^oc durante 30 segundos, polimerización a 72 ^oc durante 1 minuto, 30 ciclos desde la desnaturalización a la polimerización y extensión final a 72 oc durante 10 minutos. Al finalizar la PCR, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1 % para confirmar el gen.

La colonia confirmada de E. coli se inoculó en un medio líquido LB (1 % de triptón, 0,5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCI), seguido de cultivo a 37 oc durante 16 horas en una incubadora de agitación. La E. coli cultivada se centrifugó para separar el sobrenadante y el sedimento celular. El ADN del plasma se purificó del sedimento celular utilizando Exprep™ Plasmid SV, mini (GeneAll). La secuenciación del plásmido purificado se realizó por Cosmogenetech Co., Ltd. El plásmido de expresión de transferrina preparado se denominó en esta invención 'pcDNA3.1(+)/preTf (SEQ. ID. NO: 6)' (Figura 1).

Para usar el sitio de la enzima de restricción BamHl para la construcción de un plásmido, el sitio de BamHl en el gen de la transferrina se mutó mediante mutagénesis directa para eliminar el sitio de la enzima de restricción de BamHl. Para eliminar el sitio de la enzima de restricción BamHl del gen de la transferrina, la timina (T) se reemplazó con citosina (C), pero la secuencia de aminoácidos se mantuvo con ácido aspártico. Para reemplazar el sitio de la enzima de restricción BamHl, GGATCC, con la secuencia GGACCC, el cebador en sentido (5'-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3', SEQ ID NO 11: y se usó el cebador antisentido (5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3', SEQ. ID. NO: 12) hecho a medida en Cosmogenetech Co., Ltd. La mutagénesis directa al sitio se realizó utilizando el plásmido pcDNA3. (+)/preTf preparado como plantilla utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Muta-direct (iNtRON) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una vez completada la reacción, el gen se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. La colonia de E. coli confirmada se inoculó en un medio líquido LB que contenía ampicilina, seguido de cultivo a 37 0C durante 16 horas en una incubadora de agitación. La E. coli cultivada se centrifugó para separar el sobrenadante y el sedimento celular. El ADN del plasma se purificó a partir del sedimento celular utilizando un kit de extracción de plásmidos (GeneAll). La sustitución del ácido nucleico del sitio de la enzima de restricción BamHI en el gen de la transferrina se confirmó mediante secuenciación. El plásmido preparado se denominó en esta invención 'pcDNA3.1(+)/preTf(B) (SEQ ID NO: 7)' (Figura 2).

La transferrina es una proteína secretora que contiene un péptido de señalización para ayudar al transporte de una proteína sintetizada en el terminal N a la membrana celular. La transferrina se compone de la secuencia de aminoácidos 'MRLAVGALLVCAVLGLCLA (SEQ ID NO: 13)'. Para insertar un gen del factor estimulante de la leucocitopoyesis humana en el extremo 5' del gen de la transferrina, se eliminó el péptido de señalización de la transferrina y se colocó la enzima de restricción BamHI en el extremo 5', lo que dio como resultado la construcción de un plásmido. En el extremo 3' se insertaron Xhol y el codón de detención (TAA). La PCR se realizó utilizando pcDNA3.1(+)/preTf(B) como plantilla en presencia de A^d N polimerasa. El sitio de la enzima de restricción Xho I y el codón de detención (TAA) se insertaron en el extremo 3 'del gen. La PCR se realizó utilizando pcDNA3.1(+)/preTf(B) como plantilla con ADN polimerasa. L^os cebadores utilizados en la reacción fueron hechos a medida en Cosmogenetech C^o., Ltd. Se utilizaron 10 pmol de un cebador en sentido (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3', SEQ ID NO: 14) y 10 pmol de un cebador antisentido (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 10). Los cebadores, el ADN polimerasa y la plantilla se mezclaron con regulador, al que se agregó agua destilada para hacer que el volumen total fuera de 50 ^|j I. La PCR se realizó de la siguiente manera; predesnaturalización a 98 oc durante 30 segundos, desnaturalización a 98 oc durante 10 segundos, fusión a 53 oc durante 30 segundos, polimerización a 72 oc durante 1 minuto, 30 ciclos desde la desnaturalización a la polimerización y extensión final a 72 ^oc durante 10 minutos. El gen de la transferrina amplificada se transfirió a gel de agarosa al 1 % para que la electroforesis confirmara el tamaño. El área objetivo del gel de agarosa se cortó y el ADN se purificó utilizando el kit de purificación de ADN de fragmentos totales MEGAquick-spin™ (iNtRoN). El gen de transferrina purificado y el plásmido pcDNA3.1(+) se digirieron con las enzimas de restricción BamHI (Enzynomics) y Xhol (Enzynomics). Se agregaron 10 unidades de la enzima de restricción y el regulador 2 (Tris-HCl 10 mM, pH 7,9, NaCI 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, 100 j g/ml de BSA), seguido de reacción a 37 oc durante 2~3 horas. Una vez completada la reacción, se confirmó el tamaño del gen mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El área objetivo del gel de agarosa se cortó y el ADN se purificó utilizando el kit de purificación de ADN de fragmentos totales MEGAquick-spin™ (iNtRoN). El gen de transferrina purificado y el vector pcDNA3.1(+) procedieron a electroforesis en gel de agarosa al 1 % nuevamente, seguido de cuantificación de ADN. El gen de la transferrina y el vector ^pcDNA3.1(+) se hicieron reaccionar con ADN ligasa T4 (Takara) a 16 oc durante 16 horas. Una vez completada la reacción, el vector se insertó en E. coli DH10B, que se distribuyó en una placa de agar que contenía ampicilina, seguido de cultivo a 37 oc durante 16 horas. Luego, se seleccionó la colonia de E. coli. Para investigar si el gen de la transferrina se insertó con éxito ^o no en el plásmido PcDNA3.1(+), se realizó la PCR. La colonia de E. coli seleccionada se diluyó en agua, que se usó como plantilla, seguido de PCR con el cebador en sentido (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3', SEQ ID NO: 14) y el cebador antisentido (5'-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 10) utilizado para la amplificación del gen de la transferrina anterior. La PCR se realizó de la siguiente manera; predesnaturalización a 98 ^oc durante 30 segundos, desnaturalización a 98 ^oc durante 10 segundos, fusión a 53 ^oc durante 30 segundos, polimerización a 72 oc durante 1 minuto, 30 ciclos desde la desnaturalización a la polimerización y extensión final a 72 ^oc durante 10 minutos. Al finalizar la PCR, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1 % para confirmar el gen. La colonia de E. coli confirmada se inoculó en un medio líquido LB (1 % de triptón, 0,5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCI), seguido de cultivo a 37 oc durante 16 horas en una incubadora de agitación. La E. coli cultivada se centrifugó para separar el sobrenadante y el sedimento celular. El ADN del plasma se purificó del sedimento celular utilizando Exprep™ Plasmid SV, mini (GeneAll). La inserción del gen de la transferrina sin péptido de señalización se confirmó mediante secuenciación. El plásmido preparado se denominó en esta invención 'pcDNA3.1(+)/Tf(B) (SEQ ID. NO: 8)' (Figura 3).

<1-2> Construcción del plásmido de expresión G-CSF-Tf

Para eliminar el sitio de la enzima de restricción BamHI de ^pcDNA6/G-CSF, el plásmido ^pcDNA6/G-CSF se trató con 20 unidades de BamHI (Enzynomics), seguido de reacción a 37 ^oc durante 3 horas. El plásmido reaccionado (45 ng) se amplificó por PCR con 10 pmol de un cebador sentido (5'CATGCTAGCTCCACcA TGGCTGGACCTGCCACCCAG-3', SEQ ID NO: 15) y un cebador antisentido (5' CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3', SEQ ID. NO: 16). Como resultado, se preparó un fragmento del gen G-CSF que tiene un sitio de enzima de restricción Nhe l y una secuencia de Kozak en el sitio del extremo 5' y un sitio de enzima de restricción BamHI en el extremo 3'. 1 j g del fragmento de gen de G-CSF preparado y 365 ng de plásmido pcDNA3.1(+)/Tf(B) se hicieron reaccionar con 10 unidades de enzima de restricción Nhel y 20 unidades de enzima de restricción BamHI respectivamente a 37 ^oc para 4 horas Se realizó la electroforesis de ADN en gel de agarosa (0,5^x TAE, 1 % de agarosa). Para construir pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf, el pcDNA3.1(+)/Tf(B) plásmido purificado y el fragmento del gen G-CSF se mezclaron a la relación molar de 1:3, que reaccionó con 350 U de ADN ligasa T4 a 25 0C durante 1 hora. A continuación, se transfectó E. coIÍ DH5a con el producto de reacción. Se seleccionaron colonias que mostraban resistencia contra la ampicilina. Se realizó una PCR de colonias para confirmar la construcción del plásmido pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf. Particularmente, las colonias seleccionadas de E. coli DH5ci transfectadas se amplificaron por PCR de colonias con 10 pmol del cebador en sentido (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3', SEQ ID. NO: 17) y el cebador antisentido (5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCCTCCTCC)-3', SEQ ID NO: 18). El tamaño del producto amplificado se confirmó en gel de agarosa (0,5X TAE, agarosa al 1 %). La colonia confirmada se inoculó en un medio líquido LB (50 mg de triptón, 25 mg de extracto de levadura y 50 mg de cloruro de sodio por 5 ml) que contenían ampicilina (100 pg/ml), seguido de un cultivo durante 15 horas. pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf se extrajo utilizando un kit de extracción de plásmidos. La construcción exitosa de pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf se confirmó mediante secuenciación.

<1-3> Construcción del plásmido de expresión G-CSF(T116C) y G-CSF(T116C)-Tf

Se mezclaron 10 pmol del cebador en sentido (5'-GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3', SEQ. ID. NO: 19) y el cebador antisentido (5'-ATCTGCTGCCAGATGCAGGGGGCAAAGTCGGC-3', SEQ ID NO: 20 pET21a(+)/G-CSF, seguido de PCR. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó de la misma manera que se describe en el Ejemplo <1-1> para construir G-CSF (T116C). El plásmido resultante se denominó en esta invención 'pET21a(+)/G-CSF (T116C)'.

El tamaño de pET21a(+)/G-CSF(T116C) se confirmó mediante electroforesis de ADN en gel de agarosa (0,5X TAE, agarosa al 1 %). El área objetivo del gel de agarosa se cortó y el ADN se purificó utilizando un kit de purificación de gel (Cosmogenetech). E. coli DH10B se transfectó con el pET21a(+)/G-CSF purificado (T116C). Se seleccionaron colonias que mostraban resistencia contra la ampicilina. La colonia seleccionada se inoculó en un medio líquido LB (50 mg de triptón, 25 mg de extracto de levadura y 50 mg de cloruro de sodio por 5 ml) que contenían ampicilina (100 pg/ml), seguido de un cultivo durante 15 horas. Se extrajo pET21a(+)/G-CSF(T116C) usando un kit de extracción de plásmido. Se realizó la secuenciación y, como resultado, se confirmó la sustitución exitosa de la secuencia de nucleótidos.

En primer lugar, el cebador en sentido (5'-GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3', SEQ. ID. NO: 19) y el cebador antisentido (5'-ATCTGCTGCCAGATGCAGGGGGCAAAGTCGGC-3', SEQ ID: 20) se disolvieron respectivamente a la concentración de 10 pmol/pt. Se tomaron 10 pmol de cada cebador para la PCR con 100 ng del gen G-CSF (100 ng) insertado en pcDNA6. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó de la misma manera que se describe en el Ejemplo <1-1> para obtener el gen G-CSF(T116C). El plásmido obtenido se nombró en esta invención 'P^cDNA6/G-CSF(T116C).

El tamaño de ^pcDNA6/G-CSF(T116C) se confirmó mediante electroforesis de ADN en gel de agarosa (0,5X TAE, agarosa al 1 %). El área objetivo del gel de agarosa se cortó y el ADN se purificó utilizando un kit de purificación de gel (Cosmogenetech). E. coli DH10B se transfectó con el ^pcDNA6/G-CSF purificado (T116C). Se seleccionaron colonias que mostraban resistencia contra la ampicilina. La colonia seleccionada se inoculó en un medio líquido LB (50 mg de triptón, 25 mg de extracto de levadura y 50 mg de cloruro de sodio por 5 ml) que contenían ampicilina (100 pg/ml), seguido de un cultivo durante 15 horas. Se extrajo el ^pcDNA6/G-CSF(T116^c ) utilizando un kit de extracción de plásmidos. Se realizó la secuenciación y, como resultado, se confirmó la sustitución exitosa de la secuencia de nucleótidos. Para eliminar el sitio de la enzima de restricción BamHI de ^pcDNA6/G-CSF(T116C), se trató 1 pg de plásmido de ^pcDNA6/G-CSF(T116C) con 20 unidades de BamHI (Enzynomics), seguido de reacción a 37 oc durante 3 horas. El plásmido reaccionado (45 ng) se amplificó por PCR con 10 pmol de un cebador sentido (5'-CATGCTAGCTCCACCA TGGCTGGACCTGCCACCCAG-3', SEQ ID NO: 15) y un cebador antisentido (5'-CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3', SEQ ID NO: 16). Como resultado, se preparó un fragmento de ADN G-CSF(T116C) que tiene un sitio de enzima de restricción Nhe I y una secuencia de Kozak en el sitio del extremo 5' y un sitio de enzima de restricción BamHI en el extremo 3'. 1 pg del fragmento de ADN de G-CSF(T116C) preparado y 365 ng de plásmido pcDNA3.1(+)/Tf(B) se hicieron reaccionar con 10 unidades de enzima de restricción Nhel y 20 unidades de enzima de restricción BamHI respectivamente a 37 ^oc durante 4 horas. Se realizó la electroforesis de ADN en gel de agarosa (0,5^x TAE, 1 % de agarosa), seguida de purificación utilizando un kit de extracción en gel. Para construir pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf, el plásmido pcDNA3.1(+)/Tf(B) purificado y el fragmento de ADN G-CSF(T116C) se mezclaron en la relación molar de 1:3, que se hizo reaccionar con 350 U de ADN ligasa T4 a 25 oc durante 1 hora. A continuación, se transfectó E. coli DH5ci con el producto de reacción. Se seleccionaron colonias que mostraban resistencia contra la ampicilina. Se realizó una PCR de colonias para confirmar la construcción del plásmido pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf. Particularmente, las colonias seleccionadas de E. coli DH5ci transfectadas se amplificaron por ^p C^r de colonias con 10 pmol del cebador en sentido (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3', SEQ ID NO: 17) y el cebador antisentido (5'-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCCTCCTCC)-3', SEQ ID NO: 18). El tamaño del producto amplificado se confirmó en gel de agarosa (0,5X TAE, agarosa al 1 %). La colonia confirmada se inoculó en un medio líquido LB (50 mg de triptón, 25 mg de extracto de levadura y 50 mg de cloruro de sodio por 5 ml) que contenían ampicilina (100 pg/ml), seguido de un cultivo durante 15 horas. Se extrajo ^pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf utilizando un kit de extracción de plásmidos. La construcción exitosa de ^pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf (SEQ ID NO: 21) se confirmó mediante secuenciación.

Ejemplo 2: Expresión de proteínas a través de transfección transitoria

<2-1> Expresión de G-CSF(T116C)

Se inoculó 1 j í de plásmido pET21a(+}/G-CSF(T116C} en 20 j í de Rosetta2 (DE3), la cepa de expresión, seguido de reacción a 420C durante 90 segundos para la transfección. La cepa de expresión transfectada se extendió sobre una placa LB que contenía ampicilina (50 j g/ml), seguido de cultivo a 370C durante 15 horas para obtener colonias. Las colonias se inocularon en 100 ml de medio LB que contenía ampicilina (50 j g/ml) y cloranfenicol (25 j g/ml), seguido de cultivo a 370C durante 15 horas. Se inocularon 20 ml de la cepa cultivada en 1 L de medio Lb que contenía ampicilina (50 j g/ml) y cloranfenicol (25 j g/ml), seguido de cultivo con agitación a 37 ^oc durante 4 horas hasta que la OD6^oo alcanzó 0,8. Se añadió 1 mM de IPTG, seguido de agitación del cultivo a 37^oc durante 4 horas. La centrifugación se realizó a 6000 rpm durante 15 minutos para separar el sobrenadante y el precipitado respectivamente. La expresión de la proteína como un cuerpo de inclusión se confirmó mediante SDS-PAg E.<2-2> Expresión de G-CSF(T116C)-Tf

Las proteínas utilizadas en esta invención se expresaron mediante secreción extracelular utilizando Expi293F™ (Gibco), la línea celular de cáncer de riñón embrionario humano modificada para el cultivo en suspensión. Las células Expi293F™ incluidas en el kit del sistema de expresión Expi293F™ (Gibco) se descongelaron primero, se inocularon en un matraz esterilizado de 125 ml (Thermo) que contenía 30 ml de medio sin suero para el cultivo de células animales (Gibco), seguido de un cultivo con agitación 125 rpm en una incubadora a 37 oc con 5 % de CO2. La densidad de la línea celular Expi293F™ se mantuvo en 3~5^x106 células/ml. El subcultivo se realizó cada 3~4 días. Una vez estabilizadas, las células se inocularon en medio sin suero a la densidad de 2x106 células/ml para la transfección, seguido de agitación del cultivo durante 24 horas. Justo antes de la transfección, la densidad celular se ajustó a 2x106 células/ml y la tasa de supervivencia celular se confirmó al menos el 90 % antes del siguiente experimento.

Se prepararon 22,5 j g de ADN del plasma de G-CSF-Tf y G-CSF(T116C)-Tf y se diluyeron en Opti-MEM (Gibco). También se diluyeron 45 j l de reactivo 45 de ExpiFectamine™ 293 en Opti-MEM®, que se mantuvo a temperatura ambiente durante 5 minutos. El plásmido y la mezcla de reactivos ExpiFectamine™ 293 se mezclaron bien, y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, la mezcla se distribuyó uniformemente a las células. 16~18 horas después de la transfección, ExpiFectamine™ 293 Transfección Enhancers 1 y 2 (Gibco) se añadieron a la misma con el fin de aumentar la expresión de la proteína, seguido de cultivo adicional durante 32 horas bajo la misma condición cultivo con agitación anteriormente. El fluido de cultivo celular obtenido se centrifugó a 2000 x g durante 10 minutos y, como resultado, se obtuvo el sobrenadante.

Para confirmar la expresión de la proteína, el sobrenadante se mezcló con un colorante de carga 5x (Biosesang), que se hirvió a 95 ^oc durante 20 minutos. La mezcla se cargó en 10 % SDS-PAGE, seguido por electroforesis a 160 V durante 1 hora. Una vez completada la electroforesis, la proteína en el gel se transfirió a la membrana de transferencia de inmobilon-P PVDf (Millipore). La membrana se hizo reaccionar en leche desnatada al 5 % a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la membrana con el regulador de lavado (regulador fosfato que contiene Tween 20 al 0,05 %), se le añadió un anticuerpo transferrina (2000x, Santa Cruz), seguido de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar la membrana con regulador de lavado nuevamente, se agregó un anticuerpo conjugado con peróxidos de rábano picante (10000^x, Santa Cruz), seguido de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez completada la reacción antígeno-anticuerpo, la membrana se lavó con regulador de lavado y se indujo el desarrollo del color mediante el uso del sustrato quimioluminiscente SuperSignal® West Pico (Thermo). El peso molecular de G-CSF-Tf y G-CSF(T116C)-Tf fue de 105,7 kDa, lo que sugiere que la proteína se expresó normalmente (Figura 5).

Ejemplo 3: Purificación de proteínas

<3-1> Purificación de G-CSF(T116C)

Para purificar el cuerpo de inclusión, las células se disolvieron en un regulador de lisis (Tris-Cl 50 mM (pH 8.0), EDTA 2 mM, PMSF 1 mM), seguido de lisis celular utilizando un ultrasonicador (tiempo de lisis: 5 minutos, ultrasonicación: 30 segundos, reposo: 40 segundos). La centrifugación se realizó a 10.000 rpm durante 30 minutos a 4 oc para eliminar el sobrenadante. Luego, el precipitado se disolvió en un regulador de lavado (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, Triptón al 0,3 %) y se sometió a lisis utilizando un ultrasonicador (tiempo de lisis: 5 minutos, ultrasonicación: 30 segundos, en espera: 40 segundos). La centrifugación se realizó de nuevo a 10.000 rpm durante 30 minutos a 4 ^oc para eliminar el sobrenadante. El precipitado se disolvió en un regulador de lavado (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, NaCI 1 M) y se sometió a lisis utilizando un ultrasonicador (tiempo de lisis: 5 minutos, ultrasonicación: 30 segundos, en espera: 40 segundos). La centrifugación se realizó de nuevo a 10.000 rpm durante 30 minutos a 4 ^oc para eliminar el sobrenadante. El cuerpo de inclusión lavado se disolvió en un regulador de solubilización (urea 8 M, Tris-Cl 50 mM, pH 8,0). Se cargaron 10 ml de la muestra de proteína disuelta en un tubo de diálisis, que se dejó en 2 L de un regulador de diálisis (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, Tween20 al 0,1 %) a 4 ^oc durante 16 horas para el replegamiento. Se cargó ácido acético 2 M en la muestra de reacción y se ajustó el pH a 4,5, seguido de centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos a 40C. La columna de desalinización (17-5087-05) conectada a Hiprep 26/10 AKTA Pprime más FPLC se llenó con un regulador de desalinización (acetato de Na 25 mM, pH 4,5, sacarosa al 5 %, Tween20 al 0,004 %). Luego, se realizó el Intercambio de regulador pasando el sobrenadante separado por centrifugación a través de la columna anterior.

<3-2> Cuantificación de G-CSF(T116C)

El G-CSF(T116C) purificado se cuantificó usando tinción con plata. La curva de cuantificación estándar se obtuvo utilizando Grasin (menos de 30 ng/pozo SDS-PAGE), el material estándar de G-CSF. La cantidad desconocida de cada muestra se comparó con la curva de cuantificación estándar para cuantificar la proteína.

<3-3> Cuantificación de G-CSF(T116C)-Tf

Se dializaron 30 ml del sobrenadante que contenía G-CSF-Tf o G-CSF(T116C)-Tf en 4 L de regulador de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,5), seguido de un intercambio de regulador. La columna DEAE Affi-gel Blue se llenó con G-CSF-Tf ^o G-CSF(T116C)-Tf incluido en el regulador de fosfato de potasio a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Luego, se vertió fosfato de potasio 72 mM a través de un gradiente escalonado y, por lo tanto, las proteínas absorbidas en la resina se separaron de otras proteínas incluidas en el fluido de cultivo (Figura 6).

<3-4> Preparación de la forma fundida de hierro (Fe3+)

La preparación de la forma holo de G-CSF(T116C)-Tf se basó en [Zhang et al. BMC Biotechnology 2012, 12:92]. El G-CSF-Tf o G-CSF(T116C)-Tf purificados se trató con el citrato de amonio férrico equivalente, seguido de la reacción a 37 0C durante 2 horas. La mezcla se dializó en 2 L de solución salina tamponada con fosfato a 40C durante 15 horas, durante las cuales se intercambió el regulador. La muestra se concentró 10 veces utilizando un concentrador (Millipore) (Figura 7).

<3-5> Cuantificación de proteínas

La proteína purificada se cuantificó por inmunotransferencia Western usando un anticuerpo de transferrina. La transferrina medida se cargó en SDS-PAGE al 10 % a las concentraciones de 15 ng, 20 ng, 25 ng y 30 ng por pozo. Otra proteína purificada cuya concentración no se determinó se cargó en otro pozo, seguido de electroforesis. Se realizó una inmunotransferencia Western para cuantificar las muestras de proteína comparando la proteína purificada con la curva estándar de transferrina.

Ejemplo 4: Investigación de la fuerza de unión con el receptor de transferrina

Una vez que la transferrina se une al receptor de la transferrina expresado en la superficie celular, ingresa a la célula a través de la endocitosis. Después de liberar el hierro, el complejo receptor-transferrina se mueve de nuevo a la superficie celular y luego se secreta en la sangre. La transferrina repite el proceso anterior, es decir, el metabolismo de reciclaje in ^vivo, mediante el cual suministra el hierro y evita que se descomponga en el lisosoma intracelular, lo que resulta en el aumento de la semivida. Si una proteína diana que tiene una semivida corta se conjuga con la transferrina, la proteína experimenta la acción del metabolismo de reciclaje in vivo de la transferrina junto con la transferrina. Como resultado, la proteína diana también puede evitar su descomposición in vivo. Por lo tanto, la proteína de fusión en la que el G-CSF está conjugado con la transferrina debe mantener la fuerza de unión al receptor de la transferrina para evitar la degradación in vivo.

Para investigar la fuerza de unión de las proteínas de la invención al receptor de transferrina de superficie extracelular (TfR), se utilizó la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 que demuestra una alta expresión de TfR en la superficie celular para el siguiente experimento. Las células HepG2 se inocularon en una placa de 96 pozos a la densidad de 5x105 células/pozo, seguido de cultivo durante 24 horas. Las células HepG2 unidas a la placa se lavaron con regulador fosfato, al que se añadió DMEM sin suero (HyClone) suplementado con 1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino). La mezcla permaneció en una incubadora a 37 oc con 5 % de CO2 durante 30 minutos para eliminar la transferrina endógena de las células. Las células se lavaron con regulador fosfato de nuevo y luego se agregaron la muestra de prueba y la transferrina humana Fluor® 647 (Life Technologies) marcada con fluorescencia al DMEM sin suero complementado con 1 mg/ml de BSA en las concentraciones de 133 nM y 5 pg/ml respectivamente. La mezcla anterior se trató con las células HepG2 preparadas anteriormente, que se mantuvieron en una incubadora a 37 oc con 5 % de CO2 durante 30 minutos. La muestra de proteína restante en el medio se lavó con regulador de fosfato frío. El receptor de transferrina conjugado de fluorescencia-transferrina se cuantificó por fluorometría. Para la fluorometría, se proporcionó una fuente de luz a 650 nm y se midió la intensidad de fluorescencia a 668 nm.

La fuerza de unión al receptor de transferrina de la forma holo de G-CSF(T116C)-Tf preparada en el Ejemplo <3-4> se muestra en la Figura 8. Como resultado, como se muestra en la Figura 8, la fuerza de unión del receptor de transferrina de la proteína de fusión G-CSF-Tf ^o G-CSF(T116C)-Tf fue similar a la de la holo-transferrina humana natural (SIGMA). Este resultado sugiere que la proteína de fusión G-CSF-Tf ^o G-CSF(T116C)-Tf puede tener una semivida mayor al experimentar el reciclado in vivo debido a la conjugación con el receptor de transferrina, como la transferrina humana.

Ejemplo 5: Actividad biológica de la proteína mutante G-CSF

Para medir la actividad biológica de la proteína muíante G-CSF-Tí purificada, se midió la proliferación de células HL-60 diferenciadas por DMSO al 1,25 %.

<5-1> Preparación y tratamiento de la línea celular HL-60 derivada de la médula ósea humana

La línea celular derivada de médula ósea humana HL-60 utilizada en esta divulgación fue distribuida por la Korean Collection for TYpe Culture (KCTC), Korea Research Institute of Bioscience and BiotechnologY (KRIBB). La línea celular se cultivó en RPMI-1640 que contenía FBS al 10 % en un incubador a 37 0C ^y 5 % de CO2. El medio se reemplazó por uno nuevo cada 2~3 días. Las células no dependían del anclaje. Los reactivos para el cultivo celular se adquirieron de HYClone.

<5-2> Actividad de proliferación celular de la proteína muíante G-CSF

Se contó el número de células ^y se ajustó la densidad para que fuera de 2 ^x 105 células/ml. Las células se trataron con el inductor de diferenciación DMSo (dimetilsulfóxido, grado de cultivo, SIGMA) a la concentración final de 1,25 % (^v/^v), seguido de cultivo durante 3 días para inducir la diferenciación en granulocitos. Antes de agregar la muestra de prueba, las células se recolectaron mediante centrifugación y se lavaron con regulador fosfato (D-PBS). Las células se distribuYeron en una placa de 96 pozos (Corning), 100 pL por cada pozo, a la densidad de 4 ^x104 células/pozo.

Los controles G-CSF humano PEGilado (GenScript) ^y G-CSF natural (GenScript), ^y las muestras de prueba G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf y G-CSF(T116C) se diluYeron en regulador desalador (fosfato sódico 5 mM, sacarosa al 5 %, Tween-20 al 0,004 %), que se agregaron a cada pozo que contenía células HL-60 diferenciadas, seguido de cultivo en una incubadora a 37 oc y CO2 al 5 % durante 72 horas. Las concentraciones finales de cada muestra fueron 300, 200, 100, 30, 15, 3, 0,3 ^y 0,03 ng/ml.

Para investigar el nivel de proliferación celular mediante la administración de las muestras de prueba, se agregaron 15 pL de solución CellTiter96™ (Promega) a cada pozo, seguido de cultivo durante 4 horas. Se añadieron 100 pl de solución de solubilización/parada a cada pozo para terminar la reacción. La OD570 de cada pozo se midió con un lector ELISA (TECAN). Se contó ^y analizó el aumento del número de células. La actividad de proliferación celular de esas muestras de prueba se presentó como la concentración equivalente a la de G-CSF.

La actividad de proliferación celular de G-CSF, PEG.G-CSF, G-CSF(T116C), G-CSF-Tf y G-CSF(T116C)-Tf se muestra en la Figura 9. Como se muestra en la Figura 9, la actividad de proliferación celular de G-CSF(T116C) fue menor que la del G-CSF natural, pero fue similar a la del G-CSF PEGilado. Mientras tanto, la actividad de proliferación celular de la proteína de fusión G-CSF(T116C)-Tf en la que la transferrina se fusiona con una proteína muíante G-CSF(T116C) aumentó significativamente, en comparación con la de G-CSF(T116C) y también fue superior a la del G-CSF PEGilado. Por lo tanto, dado que el G-CSF(T116C)-Tf muestra una maYor actividad de proliferación celular que la del G-CSF PEGilado comercial, se espera que sea un candidato prometedor como agente para el tratamiento, en particular utilizando G-CSF.

Ejemplo 6: Resistencia a las proteasas sanguíneas

Para medir la resistencia contra las proteasas sanguíneas de la proteína muíante G-CSF(T116C) de la presente invención, se hizo reaccionar la proteína con suero humano ^y luego se midió la cantidad de G-CSF restante en el suero durante un tiempo designado.

<6-1> Reacción de G-CSF con suero humano

Se investigó si la estabilidad de la proteína muíante de G-CSF de la presente invención estaba asociada estrechamente con la resistencia contra la proteasa de la sangre. En particular, el suero humano (SIGMA) se inactivó a 56 oc durante 30 minutos. Se añadieron 2,8 pg/ml de la muestra de proteína a la relación de 24:1 (v/v), seguido de reacción a 37oc. Las horas de reacción fueron 0, 3, 6, 9, 12, 15 y 18 horas. La mezcla completa de inhibidores de la proteasa (Roche) se trató en la muestra a cada hora designada, que luego se almacenó a -70 ^oc al finalizar la reacción.

<6-2> Medición de G-CSF residual

Después de descongelar la muestra, la cantidad de G-CSF restante después de la reacción con suero humano se cuantificó mediante un ELISA de sándwich (ensaYo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Se preparó la curva de calibración de la absorbancia según la concentración de proteína a la solución estándar y se realizó un análisis de regresión para determinar el contenido de proteína G-CSF en la solución de prueba.

Se preparó la placa de microtitulación de alta unión a proteínas (Corning) recubierta con un anticuerpo policlonal de conejo anti-G-CSF (KOMA BIOTECH) a la concentración de aproximadamente 2 pg/ml. Se utilizó regulador de fosfato 1X que contenía sal de sodio de caseína al 1 % como regulador de bloqueo. La solución estándar y la solución de prueba se mezclaron con un regulador (regulador de bloqueo diluido 10x). La muestra de proteína y los regentes se distribuYeron en 100 pl por cada pozo. La placa se trató con un regulador de lavado (1X ^p B^s , Tween-20 al 0,05 %) tres veces (300 pl/pozo) para lavar las muestras no reaccionadas. La muestra de proteína y el anticuerpo de detección (anticuerpo policlonal de conejo anti-G-CSF, KOMA BIOTECH) se trataron por etapas a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas, seguido de reacción con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Pierce) a 37 0C durante 30 minutos. Se trató TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Pierce), que se mantuvo a temperatura ambiente durante aproximadamente 7~10 minutos y luego se terminó el desarrollo de color con ácido sulfúrico 2M. Luego, se midió la OD450 con un lector de microplacas (TECAN).

La absorbancia se convirtió en concentración basada en la curva de calibración de la concentración de proteínaabsorbancia en la solución estándar. La curva estándar se realizó utilizando el programa Excel. Se calculó la diferencia entre el valor medio de la absorbancia correspondiente a cada solución estándar de G-CSF y el valor de absorbancia del pozo tratado con el regulador solo. Para la determinación de la concentración de la solución de prueba, solo cuando el valor de absorbancia de cada muestra estaba en el rango de la curva de calibración de la solución estándar, se tomó como válida. El criterio de valor absoluto (|R|) calculado mediante el uso del coeficiente de correlación (R2) como raíz (V) se estableció en al menos 0,98. La cantidad de la proteína G-CSF restante ( % G-CSF) se expresó considerando la concentración de G-CSF (pg/ml) en el punto de tiempo de reacción de 0 h como 100 %.

La cantidad ( %) de G-CSF restante y G-CSF(T116C) por período de tiempo se muestra en la Figura 10. El porcentaje de G-CSF(T116C) restante fue aproximadamente un 30 % más alto que el del G-CSF natural desde las 15 horas después de que la reacción comenzó. Se confirmó que el enlace disulfuro entre Cys116 y Cys17 fue útil para el aumento de la resistencia de la proteína contra la proteasa de la sangre.

Ejemplo 7: Medición de la semivida in ^vivo de proteínas mutantes de G-CSF

Para investigar la semivida in vivo de la proteína mutante G-CSF y la proteína de fusión transferrina de la invención, las proteínas se administraron a ratones y luego se midió el nivel de G-CSF en el suero de rata. La mencionada 'semivida in vivo’ indica la 'semivida de la proteína en suero'. E^s decir, el momento en que el nivel de proteína G-CSF se redujo a 50 % en la concentración inicial durante su circulación en suero se expresó numéricamente. El cálculo farmacocinético se realizó utilizando Pksolver v2.0.

<7-1> Prueba en animales de la proteína mutante G-CSF

Se realizó una prueba en animales para determinar la duración de la proteína mutante CSF de la invención y ^su proteína de fusión en el cuerpo. Q^u-BEST Consulting C^o., Ltd. Realizó todos los procedimientos, como la compra, reproducción, administración y recolección de sangre de los animales de prueba.

Para los animales de prueba, se compraron ratones macho ICR y SPF de 6 semanas de edad de Samtako. L^os ratones fueron inspeccionados y adaptados durante al menos 6 días. En el último día del período de adaptación, se midió el peso individual. En función del peso corporal, se seleccionaron animales sanos sin aumento de peso y síntomas generales y se organizaron de forma aleatoria para que el peso medio de cada grupo fuera lo más equitativo posible (35~45 g por animal). A cada grupo experimental se le asignaron 6 animales.

El día de la administración de la muestra de prueba, se calculó una dosis unitaria para cada animal (5 ml/kg) en función del peso corporal medido inmediatamente antes de la administración. La proteína mutante G-CSF (20 pg/kg) o la proteína de fusión transferrina mutante G-CSF (100 pg/kg) se inyectaron lentamente en el BoIus Intravenoso utilizando una jeringa desechable (1 ml, aguja 26G). El día de la administración se definió como el día 1 de la prueba.

Después de la inyección, se extrajo sangre de I^os animales mediante una recogida orbital en el punto de tiempo de 0,25, 0,5, 1, 3, 6, 12, 24, 48 y 72 horas, respectivamente. La muestra de sangre se centrifugó a 10.000~13.000 rpm durante 1~2 minutos para separar el plasma. El plasma separado se cargó en un tubo (aproximadamente 50 pL/tubo) con una etiqueta que contiene la información del tipo de prueba, el número de animal y el tiempo de muestreo. El tubo se almacenó en un congelador profundo (aproximadamente -70 oc ) hasta el día del análisis. <7-2> Farmacocinética de ratón de proteínas mutantes de G-CSF

La cantidad de G-CSF activo en plasma se determinó mediante ELISA después de descongelar la muestra en hielo. La cuantificación de G-CSF en plasma mediante ELISA se realizó utilizando el kit ELISA de G-CSF humano, rosado-ONE (Koma Biotech.) de acuerdo con el manual del reactivo. Se preparó la curva de calibración de la absorbancia según la concentración de proteína a la solución estándar y se determinó el contenido de mutantes de G-CSF en la solución de prueba mediante análisis de regresión.

El análisis farmacocinético no compartimental se realizó a partir del perfil de concentración media en el tiempo de cada compuesto de prueba mediante la aplicación de la entrada de análisis de no compartimiento B^oI^us IV al programa Pksolver v2.0. Los parámetros farmacocinéticos evalúan la semivida terminal (t-io).

La semivida de las proteínas en plasma se muestra en la Figura 11. Como se muestra en la Figura 11, la proteína mutante G-CSF(T116C) mostró una semivida en sangre similar a la del G-CSF humano natural. Este es el resultado

Claims (15)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína muíante del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que el 116o aminoácido, treonina, está sustituido con una cisterna, de manera que la cisterna es adecuada para enlaces de sulfuro con el 17^o aminoácido, cisterna, de g -c s f .

2. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la transferrina tiene la eliminación de un péptido de señalización en la región terminal amino.

3. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la cisterna sustituida forma un enlace disulfuro con el 17o aminoácido, cisterna, de G-CSF.

4. Un vector de expresión que contiene un gen que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El vector de expresión según la reivindicación 4, en el que la secuencia de nucleótidos de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en el gen está sustituida por otra secuencia de nucleótidos que codifica el mismo aminoácido.

6. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el gen que codifica la proteína de fusión tiene la sustitución de timina del sitio de reconocimiento del enzima de restricción BamHI (GGATCC) con citosina.

7. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el gen que codifica la proteína de fusión contiene adicionalmente un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción al final del gen.

8. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el vector de expresión comprende una cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 7, 8 y 21.

9. Un transformante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.

10. Un procedimiento de preparación de la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que contiene la etapa de obtener la proteína diana a partir del transformante de la reivindicación 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para ^uso en terapia.

12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para ^uso en el tratamiento de una neutropenia.

13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para ^uso en el tratamiento de cáncer.

14. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en el tratamiento de una enfermedad isquémica.

15. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en la inhibición de la disminución en el número de neutrófilos.