ES2736035T3 - Producción comercial de peptidasas C1A mediante expresión transitoria en plantas - Google Patents
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Abstract
Célula vegetal que comprende una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, en la que dicha molécula de ADN no está integrada en el genoma de la célula vegetal.
Description
DESCRIPCIÓN
Producción comercial de peptidasas C1A mediante expresión transitoria en plantas
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a una célula vegetal que comprende una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, para expresar en la planta, mediante expresión transitoria, una peptidasa C1A madura y activa.
Estado de la técnica
Las proteasas ocupan un lugar destacado en el mercado mundial de enzimas, estimado en alrededor de 3 mil millones de dólares estadounidenses (Leary et al., 2009, Mar Policy 33, 183-194), porque juegan un papel importante en la biotecnología. En efecto, por una parte, las proteasas intervienen como moléculas de interés, como tales; por otra parte, permiten realizar escisiones proteolíticas que modifican las propiedades químicas, físicas, biológicas e inmunológicas de las proteínas. De esta manera, las proteasas son algunas de las enzimas más importantes, debido a sus múltiples aplicaciones en la industria alimentaria (cervecera, cárnica, productos lácteos, suero lácteo), farmacéutica y de detergentes (Doran, 2002, Plant biotechnology and transgenic plants. Nueva York; Mercel Dekker inc,; 143-163).
Entre las proteasas más utilizadas habitualmente, se encuentran las peptidasas de la familia C1A. Las peptidasas C1A (o proteasas C1A) son cisteín proteasas (CisProt), también conocidas como tiol proteasas, ampliamente distribuidas entre los organismos vivos. De esta manera se encuentran en procariotas y eucariotas (por ejemplo, bacterias, parásitos, plantas, invertebrados y vertebrados). El mecanismo catalítico de estas enzimas implica una cisteína en el sitio activo.
La papaína, una enzima vegetal, es el miembro más estudiado entre las cisteín proteasas. Una gran cantidad de CisProt se han aislado de las plantas, como la actinidina, la proteinasa w, la quimopapaína y la bromelina. Las CisProt más utilizadas son las enzimas lisosomales, tales como las caspasas, las enzimas vacuolares, tales como la papaína, la actinidina y la bromelina, y finalmente las proteasas de tipo catepsina (Palma et al., 2002, Plant Physiol. biochem, 40: 521-530).
Esta familia de proteasas es una diana potencial de fármacos para tratar enfermedades caracterizadas por una degradación excesiva de la matriz extracelular, como la osteoporosis, artritis, enfermedades vasculares y cáncer. También se han identificado como actores clave en el crecimiento, diferenciación celular, señalización, y la invasión de hospedadores por diversos patógenos humanos, en particular, parásitos patógenos que causan la malaria, la enfermedad de Chagas y la esquistosomiasis. Finalmente, las peptidasas de la familia C1A también constituyen el grupo 1 de alérgenos y se reconocen como alérgenos principales. Por ese motivo, actualmente son una diana para el tratamiento de alergias por desensibilización (Lecaille et al., 2002, Chem Rev, 102: 4459-4488 y McKerrow et al., 2006, Annu Rev Pathol, 1: 497-536).
Las CisProt comparten características comunes. De esta manera, todas las proteasas C1A presentan puentes disulfuro necesarios para su estructura funcional; contienen una triada catalítica formada por tres restos de aminoácidos conservados (Cys, His y Asn), y un resto de Gln involucrado en el mantenimiento de la conformación de la enzima en forma activa. Las CisProt se sintetizan como precursores inactivos o poco activos (preproproteínas) para impedir la proteólisis inapropiada. La preproproteína comprende un péptido señal, un propéptido N-terminal de 130 a 150 aminoácidos, y la proteína madura de aproximadamente 220 a 270 aminoácidos. La activación de estas proteasas se produce o bien por la acción de enzimas de maduración, o por autocatálisis. La activación se produce por proteólisis intra o intermolecular controlada, especialmente por escisión del propéptido inhibidor (Wiederanders et al. 2003, Current Protein and Peptide Science, 4, 309-326). De esta manera, este propéptido juega un papel importante como modulador de la actividad de la proteasa, para garantizar que la proteasa madure en el lugar y/o en el momento adecuados (Demidyuk et al., 2010, J. Biol. Chem, 285, 2003-2013).
Hasta ahora, se han realizado muchos esfuerzos para expresar las CisProt en forma recombinante en una amplia variedad de sistemas de expresión (Bromme et al., 2004, Methods, 32, 199-206). A menudo estos trabajos han fracasado dada la compleja estructura de las peptidasas de la familia C1A.
Por lo tanto es necesario producir las CisProt, y en particular, las peptidasas C1A, en forma recombinante y de manera reproducible y eficaz (con un buen rendimiento). También es necesario producir peptidasas C1A a niveles aceptables desde el punto de vista comercial y económico.
Sorprendentemente, dada su toxicidad in vivo, los inventores han descubierto ahora que es posible la producción de peptidasas C1A en forma recombinante, mediante expresión transitoria en plantas. Esta producción, que se realiza en una célula vegetal, permite obtener una peptidasa C1A en forma madura y activa, con un buen rendimiento, de
manera muy sencilla y reproducible. Además, la peptidasa C1A obtenida no está contaminada por proteasas y/u otros contaminantes de origen animal. De esta manera, los inventores han podido obtener una producción, a niveles comercialmente aceptables, de varias peptidasas C1A.
Objeto de la invención
Por lo tanto, el objeto de la invención es una célula vegetal que comprende una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, preferentemente un promotor 35S. La molécula de ADN unida al promotor fuerte permite expresar de manera transitoria una peptidasa C1A madura y activa en la célula. Preferentemente, dicha célula vegetal es una célula de Nicotiana benthamiana. Preferentemente, la célula vegetal según la invención comprende una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, preferentemente un promotor 35S, no estando dicha molécula de ADN integrada en el genoma de la célula vegetal.
El objeto de la invención es también una planta que comprenda al menos una célula vegetal según la invención. Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para producir una peptidasa C1A, que comprenda la expresión de dicha peptidasa C1A en una célula vegetal según la invención, o en una planta que comprenda dicha célula.
Otro objeto de la invención se refiere a una peptidasa C1A que puede obtenerse mediante el procedimiento según la invención, con una célula vegetal según la invención, o con una planta según la invención. La peptidasa obtenida de esta manera puede utilizarse como un medicamento. También puede utilizarse en el diagnóstico de alergias e integrarse en un kit de diagnóstico de alergias.
La célula vegetal según la invención comprende una molécula de ADN unida operativamente a un promotor fuerte, preferentemente un promotor 35S. Por "unida operativamente", se entiende que la molécula de ADN está fusionada con el promotor fuerte, de tal manera que el promotor fuerte induce la transcripción de la molécula de ADN.
Esto permite la expresión de dicha molécula de ADN en forma transitoria, es decir, sin integración del ADN, en particular del ADNc, en el genoma de la célula vegetal. En efecto, el uso de la expresión transitoria en una célula vegetal o en una planta según la invención, permite aumentar los rendimientos de producción de las proteasas C1A en forma activa incluso a niveles altos, compatibles con un aprovechamiento comercial, pero incompatibles con la supervivencia de una planta que exprese estas proteasas tóxicas de manera estable. Esta toxicidad para el hospedador de expresión se ilustra en particular por la imposibilidad de producir la proteasa Der p1 en forma activa en levaduras de P. pastoris o en bacterias de E. coli. En el caso de una expresión transitoria, la recolección de la biomasa vegetal se produce durante el pico de expresión de la proteína recombinante, es decir, normalmente 4 a 6 días después de la transfección.
Preferentemente, la célula vegetal según la invención comprende un vector de expresión que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, preferentemente un promotor 35S.
En una realización preferida, la peptidasa C1A se selecciona entre peptidasas C1A de ácaros y peptidasas C1A vegetales. Preferentemente, la peptidasa C1A de origen vegetal es una peptidasa C1A de la familia de las Asteráceas (Asteraceae) o de la familia de las Fabáceas (Fabaceae).
Los genes que codifican las peptidasas C1A son muy conocidos. De esta manera, muchos de estos genes se han clonado y caracterizado (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=C1). Como ejemplo, entre las aproximadamente 800 proteasas codificadas por genomas de plantas, más de 140 corresponden a cisteín proteasas (CisProt) que pueden agruparse en 15 familias y 5 clanes (Rawlings et al., 2010, Nucleic acids Res, 38, D227-233), incluidas las papaín proteasas C1A (clan CA, familia C1, subfamilia C1A), incluso subdividirse en proteínas de tipo catepsina L, B, H o F dependiendo de sus estructuras genéticas y relaciones filogenéticas (Martínez y Díaz, 2008, BMC Evol Biol, 8, 198-209).
Más preferentemente, la peptidasa C1A se selecciona entre Der p1 (peptidasas C1A del grupo 1 de Dermatophagoides pteronyssinus), Der f1 (peptidasas C1A del grupo 1 de Dermatophagoides farinae), Eur m1 (peptidasas C1A del grupo 1 de Euroglyphus maynei), PEPC1 (cisteín peptidasa - CisP de Aster tripolium), SH-EP (sulfidril-vignain-endopeptidasa de Vigna mungo), AMB (peptidasas C1A de Ambrosia artemisiifolia, de Ambrosia psilostachya y de Ambrosia trífida) y entre las proteínas que presentan al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, preferentemente al menos 99 % de identidad con una de estas últimas. Más preferentemente, la peptidasa C1A se selecciona entre Der p1 (peptidasas C1A del grupo 1 de Dermatophagoides pteronyssinus), Der f1 (peptidasas C1A del grupo 1 de Dermatophagoides farinae), Eur m1 (peptidasas C1A del grupo 1 de Euroglyphus maynei), PEPC1 (cisteín peptidasa - CisP de Aster tripolium), SH-EP (sulfidril-vignain-endopeptidasa de Vigna mungo), AMB (peptidasas C1A de Ambrosia
artemisiifolia, de Ambrosia psilostachya y de ambrosia trífida) y preferentemente AMB A11 (que corresponde a la secuencia de ácido nucleico KF528831 del GenBank, que tiene 1161 pares de bases, o a la secuencia de la proteína AHA56102.1 del GenBank, que tiene 386 aminoácidos), la secuencia SEQ ID NO: 10, la secuencia SEQ ID NO: 11, la secuencia SEQ ID NO: 12 y proteínas que presentan al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, preferentemente al menos 99 % de identidad con una de estas últimas.
Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos en el sentido de la presente invención, se entiende designar un porcentaje de restos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después del mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico y distribuyéndose las diferencias entre las dos secuencias aleatoriamente en toda su longitud. Por "mejor alineamiento" o "alineamiento óptimo", se entiende el alineamiento para el cual el porcentaje de identidad determinado como el siguiente es el más alto. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se realizan tradicionalmente comparando estas secuencias después de alinearlas de manera óptima, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para la establecer la comparación puede realizarse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981, J. Mol Evol., 18: 38-46), mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), mediante programas informáticos utilizando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BlAST P, BLAST N, FASTA y TFASTA del paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
La molécula de ADN comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de la peptidasa C1A. Preferentemente, las preproproteínas que presentan al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, preferentemente al menos 99 % de identidad con preproproteínas silvestres, son también de interés. Preferentemente, la preproproteína se selecciona entre la secuencia s Eq ID NO: 14, la secuencia SEQ ID NO: 15 y la secuencia SEQ ID NO: 16.
La preproproteína de la peptidasa C1A comprende un péptido señal, un propéptido y la proteína C1A madura. Por tanto, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la preproproteína según la invención comprende una secuencia que codifica el péptido señal, una secuencia que codifica el propéptido y una secuencia que codifica la proteína C1A madura.
El péptido señal es, en particular, cualquier péptido señal reconocido por la célula vegetal, provenga o no de una peptidasa C1A. Dicho péptido se dirige, en particular, a la peptidasa C1A en el medio intercelular. Preferentemente, el péptido señal es el de la quitinasa de tabaco, o el péptido señal natural de la peptidasa.
En cuanto al propéptido este se obtiene de una peptidasa C1A. El propéptido contiene el motivo GxNxFxD que parece ser esencial para una escisión adecuada de la forma precursora de la proteasa. La firma no contigua ERFNIN (Ex3Rx3Fx3Nx3I/Vx3N) es específica de las catepsinas de tipo L y H, mientras que en la catepsina de tipo F se observa una firma ERFNAQ. La función de esta firma se desconoce (Grudkowska y Zagdanska 2004, Acta Biochim Pol, 51: 609-624 Martínez y Díaz, 2008,BMC Evol Biol, 8, 198-209). Por el contrario, las proteasas catepsina de tipo B no llevan esta firma (Wiederanders 2003, Current Protein and Peptide Science, 4, 309-326; Martínez Díaz y 2008, BMC Evol Biol, 8, 198-209). Además, algunas catepsinas L también pueden contener una extensión C-terminal, que incluye una región rica en Pro y un dominio de granulina que presenta una fuerte homología con las proteasas de la familia epitelina/granulina de animales (Yamada et al., 2001, Plant Physiol, 127: 1626-1634).
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos heteróloga según la invención comprende, como propéptido, un propéptido de peptidasas C1A, en particular de ácaros o de origen vegetal. Preferentemente, el propéptido de la preproproteína de la peptidasa C1A es el propéptido natural o el propéptido mutado o no de Der p1. Preferentemente, el propéptido de la preproproteína de la peptidasa C1A se selecciona entre el propéptido natural de la peptidasa C1A, el propéptido natural de SH-EP (secuencia SEQ ID NO: 13), la secuencia SeQ ID NO: 8 (es decir, los aminoácidos 19 a 98 de la secuencia Uniprot p08176), la secuencia SEQ ID NO: 9 (es decir, la SEQ ID NO: 8 modificada por la sustitución de la glutamina en la posición 80 por una lisina) y la secuencia SEQ ID NO: 8 o 9 mutada en la asparagina 16.
Preferentemente, la secuencia de la proteína C1A madura se selecciona entre las secuencias maduras de Der p1, las secuencias maduras de Der f1, las secuencias maduras de Eur m1, la secuencia madura de PEPC1, la secuencia madura de SH-EP, la secuencia SEQ ID NO: 10, la secuencia SEQ ID NO: 11, la secuencia SEQ ID NO: 12 y proteínas que presentan al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, preferentemente al menos 99 % de identidad con una de estas últimas.
Según la invención, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la preproproteína puede obtenerse a partir de un gen clonado conocido que codifica una peptidasa C1A, o bien seleccionando un banco de ADNc con anticuerpos anti-proteasa. Los métodos utilizados son muy conocidos por el experto en la materia, e incluyen, en particular, la identificación del gen por hibridación con sondas, PCR, secuenciación y clonación molecular. También
es posible sintetizar el gen para reflejar el uso de codones preferidos en plantas; en este caso, se habla de optimización de codones, a menudo útil para una fuerte expresión de las proteasas seleccionadas (Murray et al, Nucleic Acid Res. 17, 477.498 (1980).
En una realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la preproproteína está unida a una secuencia (denominada secuencia de direccionamiento) que la permite dirigirse a un compartimiento de almacenamiento de la peptidasa C1A, para controlar su maduración. Esta maduración es necesaria para obtener proteasas en forma activa. Comprende, en particular, la escisión proteolítica del propéptido N-terminal; este último tiene lugar cuando la preproproteína de la peptidasa C1A se expresa en plantas. Al contrario, no se efectúa en sistemas de producción de bacterias o levaduras. En una realización preferida de la presente invención, la peptidasa C1A se produce fusionada con su propio propéptido o con el propéptido de la peptidasa C1A o con un propéptido de peptidasa C1A vegetal, para aumentar los rendimientos de producción de la proteína.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la preproproteína según la invención comprende además una secuencia peptídica de direccionamiento intracelular. Preferentemente, esta secuencia peptídica de direccionamiento dirige la peptidasa C1A, en forma soluble o de membrana, hacia el retículo endoplasmático o a los diversos compartimentos que constituyen el sistema endomembranoso de secreción de la célula vegetal.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la preproproteína según la invención se muta para controlar la maduración de la proteasa. En este caso, puede mutarse para bloquear la escisión proteolítica, por ejemplo, utilizando una versión modificada del propéptido de Der p1, del propéptido-Lys, donde el último aminoácido se muta a Lys; o bien mutarse para controlar la cinética de escisión de este propéptido utilizando el propéptido-Gly, derivado del propéptido de Der p1 pero después de la mutación de la asparagina del sitio de glucosilación a glutamina. Preferentemente, el propéptido puede, por tanto, seleccionarse entre el propéptido de Der p1 donde el último aminoácido se muta a lisina, y el propéptido de Der p1 donde la asparagina del sitio de glucosilación muta a glutamina. El propéptido también puede seleccionarse entre los propéptidos de peptidasas C1A de origen vegetal. Una vez que el gen de interés se ha aislado y modificado para contener la totalidad o parte de las modificaciones descritas anteriormente y obtener la secuencia de nucleótidos heteróloga, este última se coloca en un vector de expresión por métodos convencionales. La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del método de introducción del vector de expresión en las células hospedadoras. Un vector de expresión típico contiene elementos de ADN procariota que codifica un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a un antibiótico que debe proporcionarse para el crecimiento y la selección del vector de expresión en el hospedador bacteriano, un sitio de clonación para la inserción de una secuencia de ADN exógeno que codifica la proteasa; elementos de ADN eucariota, como una secuencia de inicio de la transcripción del gen exógeno, como un promotor, y elementos de ADN que controlan el tratamiento de transcritos, como secuencias de terminación/poliadenilación y un casete de expresión que permite la expresión de un supresor de silenciamiento. También contiene secuencias tales como ADN-t que son necesarias para la integración de un fragmento de ADN en la planta o en la célula vegetal.
Preferentemente, el vector de expresión comprende:
- elementos de ADN procariota que codifica un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a un antibiótico;
- al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, preferentemente un promotor 35S;
- un casete de expresión que permite la expresión de un supresor de silenciamiento, preferentemente p19; y - elementos de ADN que controlan el tratamiento de transcritos, como secuencias de terminación/poliadenilación, preferentemente la secuencia Tnos (secuencia de terminación de la nopalina sintasa).
Preferentemente, el vector de expresión es pAG01.
Los promotores utilizados para controlar la expresión de proteasas son promotores fuertes, y pueden ser promotores de genes de plantas, tales como, por ejemplo, el promotor de la ubiquitina, el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, promotores de Agrobacterium tumefaciens, los promotores de la nopalina sintasa y de la octopina sintasa, o incluso promotores de virus, como el 19S y el 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Preferentemente, el promotor fuerte es 35S.
La alta expresión y calidad de las peptidasas recombinantes producidas en la invención permiten diseñar una producción comercial de proteasas c 1a . En efecto, normalmente la peptidasa C1A se expresa en una cantidad igual a al menos el 0,1 % de las proteínas solubles totales de la planta, pero a menudo en una cantidad mucho mayor, pudiendo alcanzar una cantidad de 5 a 10 %.
La planta que comprende las células vegetales según la invención puede ser una planta completa, pero también puede ser una parte de la planta, tal como las hojas.
La planta o las células vegetales según la invención pueden utilizarse tal cual como un medicamento. Como ejemplo,
cuando la proteasa C1A se utiliza como una enzima digestiva, puede ser particularmente ventajoso alimentar directamente al animal con la planta que expresa esta proteasa. En otras aplicaciones, la proteasa recombinante se purifica después de la extracción de la planta o de las células vegetales que la expresan. Para facilitar su purificación, la proteasa podrá expresarse fusionada con etiquetas (His6, GST, MBP, FLAA etc.) que se localizarán preferentemente en la posición N o C-terminal de la proteína madura.
La peptidasa C1A que puede obtenerse mediante el procedimiento según la invención, con una célula vegetal según la invención, o con una planta según la invención, puede utilizarse como un medicamento. También puede utilizarse en el diagnóstico de alergias, en particular, alergias a ácaros o alergias a determinadas plantas. Por tanto, un objeto de la invención es un kit para diagnosticar alergias, que comprende la peptidasa según la invención, y medios para medir los anticuerpos dirigidos contra esta peptidasa.
Métodos generales de cultivo de plantas, así como procedimientos para introducir vectores de expresión en un tejido vegetal, están a disposición del experto en la materia y varían dependiendo de la planta seleccionada. Preferentemente, las plantas se cultivarán según las técnicas no contaminantes de la plataforma Allergopur. Este procedimiento para producir proteínas recombinantes se describe en la solicitud FR1255510, y comprende una primera etapa de cultivo de la planta, en aeroponía o hidroponía, preferentemente cultivo de flotación libre, y con iluminación LED. Después de esta primera etapa, en particular, cinco semanas en cultivo hidropónico sobre flotadores libres, la agroinfiltración de las plantas se realiza al vacío, mediante agrobacterias que comprenden un fragmento de ADN que codifica la proteasa C1A recombinante. Esta etapa de agroinfiltración puede implementarse por cualquier medio que permita hacer el vacío. Preferentemente, en el procedimiento utilizado según la invención, se realiza al vacío por efecto Venturi. Entre las agrobacterias que pueden utilizarse según la invención, pueden mencionarse, preferentemente, las cepas LBA4404, GV3101, EHA 101/105 o C58. Una vez realizada la etapa de agroinfiltración, normalmente las plantas se ponen a escurrir boca abajo durante 15 minutos, y después vuelven a cultivarse, normalmente durante 4 a 6 días, idealmente garantizando una nebulización frecuente de estas últimas durante las 6 primeras horas de cultivo después de la agroinfiltración. Finalmente, la proteína se extrae y se purifica. De esta manera, preferentemente, el objeto de la invención es también un procedimiento para producir una peptidasa C1A en una célula vegetal o en una planta, que comprende las siguientes etapas:
a) transformación de agrobacterias con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte; y b) transfección de la célula vegetal o de la planta con las agrobacterias obtenidas en la etapa a).
Preferentemente, las agrobacterias que pueden utilizarse en la etapa a) se seleccionan entre las cepas LBA4404, GV3101, EHA 101/105 y C58. Preferentemente, el vector de expresión utilizado en la etapa a) comprende:
- elementos de ADN procariota que codifica un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a un antibiótico;
- al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, preferentemente un promotor 35S;
- un casete de expresión que permite la expresión de un supresor de silenciamiento, preferentemente p19; y - elementos de ADN que controlan el tratamiento de transcritos, como secuencias de terminación/poliadenilación, preferentemente la secuencia Tnos.
La transformación de la etapa a) se realiza normalmente por métodos conocidos de la técnica anterior, por ejemplo, mediante choques térmicos con pases sucesivos a 4 °C, -80 °C y 37 °C.
La transfección de la etapa b) comprende, preferentemente, las siguientes etapas:
b1) cultivar la célula vegetal o la planta, en aeroponía o hidroponía, y con luz LED (por sus siglas en inglés, Light Emitting Diode, que en español significa Diodo Emisor de Luz), preferentemente durante cinco semanas en hidroponía sobre flotadores libres,
b2) agroinfiltrar al vacío la célula vegetal o la planta obtenida en b1), por las agrobacterias obtenidas en la etapa a). Preferentemente, esta etapa de agroinfiltración se realiza al vacío por efecto Venturi.
b3) volver a cultivar la célula vegetal o la planta obtenida en b2), normalmente durante 4 a 6 días.
Finalmente, preferentemente, la peptidasa C1A producida de esta manera se extrae y se purifica.
Descripción de las figuras
Los siguientes ejemplos, ilustran, pero no pretenden limitar el alcance de la invención. Será obvio para el experto en la materia que es posible realizar variaciones y modificaciones y que están dentro del alcance y espíritu de la invención.
Las leyendas de las figuras son las siguientes:
Figura 1: Representación esquemática de los diferentes casetes que permiten producir una peptidasa C1A madura y activa utilizando o el péptido señal y el propéptido natural de la proteína (A), o el péptido señal de la quitinasa de tabaco y el propéptido de Der p1 (denominado también DP1) (P08176) (SEQ ID NO: 8) para aumentar los rendimientos (B), o el péptido señal de la quitinasa de tabaco y el propéptido Der p1 modificado por inserción de una lisina en posición C-terminal del propéptido (SEQ ID NO: 9) para controlar la escisión del propéptido (C) o de nuevo el péptido señal de quitinasa de tabaco y el propéptido Der p1 mutado en el sitio de N-glucosilación para controlar la cinética de escisión del propéptido (D).
A (SEQ ID NO: 1-4): ADNc que codifica la forma natural de la proteína. Este ADNc podrá fusionarse con las señales de direccionamiento descritas en la solicitud WO2008/056265,
B (SEQ ID NO: 5): ADNc que codifica la forma madura de una peptidasa C1A fusionada a la secuencia señal de la quitinasa de tabaco (Neuhaus, J.-M. (1996) y al propéptido Der p1 (p08176 - aa 19 a 98 o SEQ ID NO: 8). Este ADNc podrá fusionarse con las señales de direccionamiento descritas en la solicitud WO2008/056265,
C (SEQ ID NO: 6): ADNc que codifica la forma madura de una peptidasa C1A fusionada a la secuencia señal de la quitinasa de tabaco (Neuhaus, J.-M. (1996)) y al propéptido Der p1 (p08176 - 19 a 98 o SEQ ID NO: 8) donde el aminoácido 98 de la secuencia p08176 (= aminoácido 80 de la SEQ ID NO: 8) está sustituido por una Lys (SEQ ID NO: 9). Este ADNc podrá fusionarse con las señales de direccionamiento descritas en la solicitud WO2008/056265,
D (SEQ ID NO: 7): ADNc que codifica la forma madura de una peptidasa C1A fusionada a la secuencia señal de la quitinasa de tabaco (Neuhaus, J.-M. (1996) y al propéptido Der p1 (p08176 - AA 19 a 98 o SEC ID NO: 8) donde la asparagina 34 del sitio de glucosilación de la secuencia p08176 (= aminoácido 16 de la SEQ ID NO: 8 o 9) está mutado a glutamina. Este ADNc podrá fusionarse con las señales de direccionamiento descritas en la solicitud WO2008/056265.
Figura 2: Para la expresión y la producción de diferentes formas de peptidasas C1A se utilizó la plataforma AllergoPur.
Figura 3: Representación esquemática del ADNc que codifica la forma precursora de la peptidasa C1A de Aster tripolium (A), Vigna mungo (C) o de ácaros (D) o que codifica una forma precursora quimérica de la peptidasa C1A de las Asteráceas (Asteraceae) (B). Los genes se expresan bajo dependencia del promotor 35S, y aguas arriba de la secuencia de terminación de la transcripción de la nopalina sintasa. El plásmido comprende las secuencias necesarias para la incorporación en la planta utilizando Agrobacterium, que comprende los límites izquierdo y derecho del ADN-T, la región de origen de la replicación y el sitio de cointegración. Una etiqueta (tAg ) estará o no integrada en la posición N o C-terminal de la proteína madura.
Figura 4: Las proteínas extraídas de plantas no transfectadas (carril 1 TS (tipo silvestre)) o transfectadas al vacío para la expresión de proteínas DPI (carril 2), SHEP (carril 3) o PEPC1 (carril 4), se analizaron mediante SDS-PAGE (panel A) e inmunodetección con un anticuerpo dirigido contra una etiqueta Flag (panel B). El análisis por inmunodetección reveló la producción específica de 3 proteasas de la familia C1A. Estas proteasas se expresan en la forma precursora (*) y en la forma madura (**).
Figura 5: Las proteínas extraídas de plantas no transfectadas (carril 1 TS (tipo silvestre)), transfectadas al vacío con la proteína DP1 (carril 2), SHEP (carril 3) o PEPC1 (carril 4), se analizaron mediante SDS-PAGE (panel A) e inmunodetección con un anticuerpo dirigido contra una etiqueta Flag (panel B). Las proteínas se extrajeron en condiciones nativas y después se incubaron a 4 °C durante 0 min, 120 min o toda la noche (T/N). El análisis de SDS-PAGE demuestra la proteólisis de varias proteínas endógenas de extractos de plantas que expresan una proteasa C1A mientras que estas proteínas son estables en los extractos de control (TS) (Panel A). La proteasa C1A contenida en estos extractos es estable en las mismas condiciones (panel B).
Figura 6: Las proteínas extraídas de plantas no transfectadas (carril 1 TS (tipo silvestre)), transfectadas al vacío con la proteína DP1 (carril 2), SHEP (carril 3) o PEPC1 (carril 4), se analizaron mediante SDS-PAGE (panel A) e inmunodetección con un anticuerpo dirigido contra una etiqueta Flag (panel B). Las proteínas se extrajeron en condiciones de desnaturalización en presencia de un agente reductor y después se incubaron a 4 °C durante 0 min, 120 min o toda la noche (T/N). En estas condiciones, el análisis de SDS-PAGE revela una fuerte degradación de las proteínas endógenas de los extractos de plantas que expresan una proteasa C1A, mientras que estas proteínas son estables en los extractos de control (TS). Esta degradación es casi completa para los extractos incubados durante la noche (Panel A). En las mismas condiciones, ciertas proteasas C1A también se degradan con el tiempo, como lo ilustra el análisis por inmunodetección (panel B).
Figura 7: Las proteínas extraídas de plantas no transfectadas (carril 1 TS) o transfectadas al vacío con la proteína DP1 (carril 2), o por la proteína Derp1L (DP1L), cuyo propéptido se mutó mediante la sustitución de Gln 98 de la secuencia p08176 por una lisina (propéptido de secuencia SEQ ID NO: 9) (carril 3), se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunodetección con un anticuerpo dirigido contra una etiqueta Flag. El análisis de inmunodetección muestra la producción de la forma precursora y la forma madura para las plantas que expresan
la proteína DPI, mientras que en las plantas que expresan DP1L solo se produce la forma precursora inactiva. Figura 8: Las proteínas extraídas de plantas transfectadas al vacío con la proteína DP1, se purificaron en una columna GE Healthcare HisT rap Excell y después las fracciones totales (FT), no retenidas en la columna (FNR) o retenidas en la columna (FR), se analizaron por electroforesis SDS_PAGE. Como se ilustra en el carril FR, la proteasa DP1 está purificada en un 85 %, después de este etapa se realiza una etapa de filtración en gel para mejorar la purificación.
Descripción detallada de la invención
Ejemplo:
Diseño molecular y síntesis de genes
Los ADNc se sintetizan optimizando el uso de codones para su reconocimiento por el sistema vegetal. En el contexto de esta invención, la optimización preferida es la optimización para una expresión en Nicotiana benthamiana, como se muestra en la Figura 1.
Preparación de plásmidos
Los sitios de restricción Xba I / kpn I y Sal I / Sac I están integrados respectivamente en los extremos 5 'y 3' del ADNc durante la síntesis. Estos sitios se utilizan para clonar los ADNc en el vector de expresión binario pAG01 (Figura 1). Los ADNc se clonan aguas arriba de un promotor 35S (35S) y aguas abajo de una secuencia de terminación de la nopalina sintasa (Tnos); el vector pAG01 también contiene un casete de expresión que permite expresar el supresor de silenciamiento p19 simultáneamente con la proteína recombinante para aumentar los rendimientos de producción. Los vectores se utilizan después para transformar la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens.
Expresión transitoria de peptidasas C1A en hojas de Nicotiana benthamiana - Utilización de la plataforma AllergoPur
Para la producción mediante expresión transitoria, se utiliza Agobacterium tumefaciens LBA4404 para la transferencia de un ADNc que codifica la proteasa sin que el gen de interés se integre en el genoma de la célula vegetal: en este caso se habla de transfección y no de transgénesis. Las plantas se cultivan en condiciones hidropónicas en presencia de un medio nutritivo (g He , floragrow, floramicro, florabloom, 10 ml/15 ml/5 ml por 10 l de AGUA de ósmosis) y con iluminación LED. La agrobacteria se transfiere al tejido foliar mediante agroinfiltración según dos procedimientos. Para la producción de pequeños lotes de proteasas destinadas a la selección de prototipos, las agrobacterias se inyectan manualmente con una jeringa aplicada contra la epidermis de la cara inferior de la hoja. Para el análisis de los diferentes prototipos de proteasas, se utilizan discos foliares tomados de las hojas 4 a 6 días después de la agroinfiltración. Este etapa de selección permite definir el vector de expresión que se utilizará para obtener una proteasa de calidad óptima. Para la producción comercial a gran escala, se utiliza el mismo procedimiento, pero en este caso, la agroinfiltración se realiza al vacío, en recintos que contienen varios litros de un cultivo de agrobacterias y donde se infiltran simultáneamente docenas de plantas. Después, estas plantas vuelven a cultivarse durante 4 a 6 días antes de la purificación de la proteasa C1A de los extractos foliares (Figura 2).
Expresión de 4 peptidasas de la familia C1
La expresión de proteínas, así como los rendimientos, se analizan mediante transferencia de Western y ELISA, respectivamente. Se ilustran los resultados de 3 peptidasas C1A de plantas (SH-EP-P12412 y PEPC1-Q75QV8) o de ácaro (DP1-p08176) (Figuras 3 y 4).
Las proteasas expresadas son activas. En efecto, las proteínas vegetales extraídas de las hojas que expresan las proteasas C1A se degradan rápidamente después de la extracción, mientras que en extractos de plantas no transfectadas se mantienen estables (Figura 5). Asimismo, esta degradación de las proteínas endógenas es muy rápida y descontrolada cuando la extracción se realiza en presencia de agentes reductores (Figura 6). Este aumento de la actividad de las peptidasas C1A en presencia de agentes reductores es una característica de estas proteasas (Beers et al, 2000, Plant Mol Biol, 44: 399-415).
Producción de una proteasa C1A en forma de un precursor inactivo
La fusión del ADNc que codifica la proteína madura de DP1 con la secuencia señal de la quitinasa y el propéptido de la secuencia SEQ ID NO: 9 (modificada por la sustitución de glutamina 80/lisina en la posición C-terminal del propéptido) (secuencia total DP1L, SEQ ID NO: 6) permite, como se ilustra en la Figura 7, bloquear la escisión del propéptido y acumular una proteína inactiva en el extracto vegetal. Después, este propéptido puede escindirse in vivo cuando se coexpresa la proteína Lys-C o in vitro cuando se incuba con la misma proteína.
Claims (13)
1. Célula vegetal que comprende una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte, en la que dicha molécula de ADN no está integrada en el genoma de la célula vegetal.
2. Célula vegetal según la reivindicación 1, en la que la peptidasa se selecciona entre las peptidasas C1A de ácaros y las peptidasas C1A vegetales.
3. Célula vegetal según la reivindicación 1 o 2, en la que la peptidasa C1A se selecciona entre Der p 1, Der f1, Eur m 1, PEPC1, SH-EP, AMB, AMB A11, la secuencia SeQ ID NO: 10, la secuencia SEQ ID NO: 11, la secuencia SEQ ID NO: 12 y las proteínas que presentan al menos 70 % de identidad con una de estas últimas.
4. Célula vegetal según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la peptidasa C1A se expresa en una cantidad igual a al menos el 0,1 % de las proteínas solubles totales de la planta.
5. Célula vegetal según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la secuencia de nucleótidos heteróloga comprende una secuencia que codifica el péptido señal, una secuencia que codifica el propéptido y una secuencia que codifica la proteína C1A madura.
6. Célula vegetal según la reivindicación 5, en la que la secuencia que codifica el péptido señal se selecciona entre el péptido señal natural de la peptidasa y el péptido señal de la quitinasa de tabaco; y el propéptido se selecciona entre los propéptidos naturales de peptidasas C1A, el propéptido natural de SH-EP (secuencia SEQ ID NO: 13), la secuencia s Eq ID NO: 8, la secuencia SEQ ID NO: 9 y la secuencia SEQ ID NO: 8 o 9 mutada en la asparagina 16.
7. Célula vegetal según una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia de nucleótidos heteróloga comprende además una secuencia peptídica de direccionamiento que dirige la peptidasa C1A, en forma soluble o de membrana, hacia el retículo endoplasmático o a los diferentes compartimentos que constituyen el sistema endomembranoso de secreción de la célula vegetal.
8. Célula vegetal según una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un vector de expresión que comprende: - elementos de ADN procariota que codifica un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a un antibiótico;
- la secuencia de nucleótidos heteróloga como se define en una de las reivindicaciones anteriores;
- un casete de expresión que permite la expresión de un supresor de silenciamiento, preferentemente p19; y - elementos de ADN que controlan el tratamiento de transcritos, como secuencias de terminación/poliadenilación, preferentemente la secuencia Tnos.
9. Planta que comprende al menos una célula vegetal según una de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Procedimiento para producir una peptidasa C1A, que comprende la expresión de dicha peptidasa C1A en una célula vegetal según una de las reivindicaciones 1 a 8, o en una planta según la reivindicación 9.
11. Procedimiento para producir una peptidasa C1A según la reivindicación 10, que comprende las siguientes etapas:
a) transformación de agrobacterias con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una preproproteína de una peptidasa C1A unida operativamente a un promotor fuerte; y b) transfección de la célula vegetal o de la planta con las agrobacterias obtenidas en la etapa a).
12. Procedimiento para producir una peptidasa C1A según la reivindicación 10 u 11, en el que las agrobacterias utilizadas en la etapa a) se seleccionan entre las cepas LBA4404, GV3101, EHA 101/105 y C58, y en el que la transfección de la etapa b) comprende preferentemente las siguientes etapas:
b1) cultivar la célula vegetal o la planta, en aeroponía o hidroponía, y con luz LED, preferentemente durante cinco semanas en hidroponía sobre flotadores libres,
b2) agroinfiltrar al vacío la célula vegetal o la planta obtenida en b1), mediante las agrobacterias obtenidas en la etapa a); y
b3) volver a cultivar la célula vegetal o la planta obtenida en b2), normalmente durante 4 a 6 días.
13. Uso de una peptidasa obtenida mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 en un método para diagnosticar alergias, en particular, alergias a ácaros o alergias a determinadas plantas.
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