ES2737023T3 - Antígenos asociados con la próstata y regímenes de inmunoterapia basados en vacunas - Google Patents

Antígenos asociados con la próstata y regímenes de inmunoterapia basados en vacunas Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: - al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA unido a membrana seleccionado entre el grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO: 1; 2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; 3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; 4) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; 5) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 9; 6) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 3; 7) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 5; 8) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 7; y 9) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; - al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de PSA citosólico inmunogénico que comprende los aminoácidos 4-240 de la SEQ ID NO: 17; y - al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSCA de los aminoácidos 4-123 de la SEQ ID NO: 21.

Description

DESCRIPCIÓN
Antígenos asociados con la próstata y regímenes de inmunoterapia basados en vacunas
Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos n.° 61/642.844, presentada el 4 de mayo de 2012.
Referencia al listado de secuencias
La presente solicitud se presenta junto con un litado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo en formato .txt con el título "PC71854A SEQ LISTING_ST25.TXT", creado el 4 de abril de 2013 y con un tamaño de 257KB. El listado de secuencias contenido en el archivo .txt forma parte de la memoria descriptiva.
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a inmunoterapia y específicamente a vacunas. La presente divulgación también se refiere a procedimientos para tratar o prevenir trastornos neoplásicos.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Los regímenes de tratamiento del cáncer tradicionales han sido exitosos en el tratamiento de un grupo selecto de cánceres sólidos y circulantes. Sin embargo, muchos tumores son resistentes a las estrategias tradicionales. En los últimos años, se ha explorado la inmunoterapia para el tratamiento de cánceres, que implica la generación de una respuesta inmunitaria sistémica activa específica para el tumor originada en el hospedador mediante la administración de una composición de vacuna en un sitio distante del tumor. Se han propuesto varios tipos de vacuna, incluyendo aquellas que contienen antígenos aislados del tumor.
El cáncer de próstata es el segundo cáncer más comúnmente diagnosticado y la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en varones en los países desarrollados en todo el mundo. Se ha demostrado que diversos antígenos asociados con la próstata (PAA), tales como el antígeno específico de próstata (PSA), el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) y el antígeno de células madre de próstata (PSCA) se encuentran sobreexpresados por las células de cáncer de próstata en comparación con sus homólogos normales. Estos antígenos, por lo tanto, representan posibles dianas para inducir respuestas inmunitarias específicas contra los cánceres que expresan los antígenos mediante el uso de inmunoterapia basada en vacunas. (véase, por ejemplo, Marrari, A., M. lero, y col. (2007). "Vaccination therapy in prostate cancer". Cancer Immunol Immunother 56(4): 429­ 45).
PSCA es una proteína de membrana de 123 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de PSCA humano de longitud completa que consiste en los aminoácidos 4-123 de la SEQ ID NO: 21. PSCA tiene una alta especificidad de tejido y se expresa en más de un 85 % de los especímenes de cáncer de próstata, con niveles de expresión que aumentan con puntuaciones de Gleason más elevadas e independencia de andrógenos. Se expresa en el 80-100 % de las metástasis óseas de pacientes con cáncer de próstata.
PSA es una serina proteasa similar a calicreína que se produce exclusivamente por las células del epitelio columnar que revisten las acinas y conductos de la glándula prostática. El ARNm de PSA se traduce como un precursor preproPSA inactivo de 261 aminoácidos. PreproPSA tiene 24 restos adicionales que constituyen la pre-región (el polipéptido de señal) y el propolipéptido. La liberación del propolipéptido da como resultado la forma madura extracelular de 237 aminoácidos, que es enzimáticamente activa. La secuencia de aminoácidos de PSA de longitud completa humano se proporciona en la SEQ ID NO: 15. El PSA es específico de órgano y, y como resultado de ello, se produce por las células epiteliales del tejido hiperplásico prostático benigno (BPH), el tejido de cáncer de próstata primario y el tejido de cáncer de próstata metastásico.
PSMA, también conocido como folato hidrolasa 1 (FOLH1) está formado por 750 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de PSMA de longitud completa humano se proporciona en la SEQ ID NO: 1. PSMA incluye un dominio citoplásmico (aminoácidos 1-19), un dominio transmembrana (aminoácidos 20-43) y un dominio extracelular (aminoácidos 44-750). PSMA es una proteína transmembrana dimérica de tipo II expresada en la superficie de las células de cáncer de próstata y en la neovasculatura. También se expresa en células prostáticas normales, cerebro, glándula salival y árbol biliar. Sin embargo, en las células de cáncer de próstata se encontró que se expresaba a niveles 1000 veces más elevados que en los tejidos normales. Se expresa abundantemente en la neovasculatura de diversos tumores sólidos distintos, tales como cánceres de colon, mama, hígado, vejiga, páncreas, pulmón, renales, así como melanoma y sarcomas. Por lo tanto, se considera que el PSMA es una diana no solo específica para células de cáncer de próstata, sino también una diana pan-carcinoma para otros cánceres. La expresión de PSMA parece ser una característica universal de los carcinomas de próstata y su expresión aumentada se correlaciona con la agresividad del tumor. La expresión de PSMA es más elevada en tumores de alto grado, lesiones metastásicas y enfermedad independiente de andrógenos.
Si bien se ha identificado un gran número de antígenos asociados a tumores y muchos de estos antígenos se han explorado como vacunas basadas en proteínas o basadas en ADN para el tratamiento o la prevención de cánceres, la mayoría de los ensayos clínicos hasta el momento no han logrado producir un producto terapéutico. Uno de los retos afrontados en el desarrollo de vacunas para el cáncer es el hecho de que los antígenos del cáncer normalmente son de origen propio y, por lo tanto, poco inmunogénicos debido a que el sistema inmunitario se autorregula para no reconocer las proteínas propias. En consecuencia, existe la necesidad de un procedimiento para potenciar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de las vacunas para el cáncer.
El n.° de referencia de la base de datos UNIPROT: Q04609 desvela una secuencia de 750 aminoácidos que comparte cierto grado de identidad con PSMA humano de SEQ ID NO: 1.
Olson S C y col. ("Clinical trials of cancer therapies targeting prostate-specific membrane antigen", Reviews on Recent Clinical Trials, 2007, vol. 2, n.° 3, páginas 182-190), desvela pruebas clínicas que usan PSMA como diana para tratar el cáncer de próstata.
Ferraro B. y col. ("Co-delivery of PSA and PSMA DNA vaccines with electroporation induces potent immune responses", Human Vaccines, 2011, vol. 7 supl, páginas 120-127) desvela vacunas de ADN que codifican antígeno específico de próstata (PSA) y antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) como una estrategia con antígeno dual para inmunizar a ratones en un modelo de ratón de cáncer de próstata.
Ying Waeckerle-Men y col. ("Dendritic cell-based multiepitope immunotherapy of hormone-refractory prostate carcinoma", Cancer Immunology, Immunotherapy, Springler, Berlín, DE, vol. 55, n.° 12, 2006, páginas 1524-1533) desvela la inmunoterapia basada en células dendríticas autólogas de epítopos de linfocitos T procedentes de cuatro antígenos específicos de próstata, antígeno de células madre de próstata (PSCA14-22), fosfatasa ácida prostática (PAP299-307), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA4-12) y antígeno específico de próstata (PSA154-163). Se han explorado numerosos enfoques para mejorar la inmunogenicidad o mejorar la eficacia antitumoral de las vacunas contra el cáncer. Uno de dichos enfoques implica el uso de varios inmunomoduladores, tales como agonistas de TLR, agonistas de TNFR, inhibidores de CTLA-4 e inhibidores de proteína cinasa.
Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores de membrana de tipo 1 que se expresan en células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. Se han identificado al menos 11 miembros en la familia de TLR. Estos receptores se caracterizan por su capacidad para reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) expresados por organismos patógenos. Se ha descubierto que la activación de TLR provoca respuestas inflamatorias profundas a través de la producción potenciada de citocinas, la expresión del receptor de quimiocinas (CCR2, CCR5 y CCR7) y la expresión de moléculas coestimuladoras. Como tales, estos receptores en los sistemas inmunitarios innatos ejercen control sobre la polaridad de la consiguiente respuesta inmunitaria. Entre los TLR, TLR9 se ha investigado exhaustivamente respecto de sus funciones en las respuestas inmunitarias. La estimulación del receptor TLR9 dirige a las células presentadoras de antígenos (APC) hacia el cebado de respuestas de linfocitos T potentes dominadas por Th1, aumentando la producción de citocinas proinflamatorias y la presentación de moléculas coestimuladoras a linfocitos T. Se ha observado que los oligonucleótidos de CpG, ligandos para TLR9, son una clase de factores inmunoestimuladores potentes. Se ha probado la terapia con CpG contra una gran variedad de modelos de tumor en ratones y se ha demostrado consistentemente que promueve la inhibición o regresión tumoral.
El antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y se expresa en la superficie de los linfocitos T colaboradores. CTLA-4 es un regulador negativo de la activación de linfocitos T dependientes de CD28 y actúa como un punto de control inhibitorio para la respuesta inmunitaria adaptativa. Similar a la proteína coestimuladora de linfocitos T CD28, CTLA-4 se une a CD80 y CD86 en células presentadoras de antígenos. CTLA-4 transmite una señal inhibitoria a los linfocitos T, mientras que el CD28 transmite una señal estimuladora. Se han descrito anticuerpos humanos contra CTLA-4 como moduladores de la inmunoestimulación en una serie de patologías, tales como el tratamiento o la prevención de infecciones víricas y bacterianas y para el tratamiento del cáncer (documentos WO 01/14424 y WO 00/37504). Varios estudios preclínicos han demostrado que el bloqueo de CTLA-4 mediante anticuerpos monoclonales mejora la respuesta inmunitaria del hospedador contra tumores inmunogénicos e incluso puede rechazar tumores establecidos. Se han investigado dos anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos anti-CTLA-4 humano, ipilimumab (MDX-010) y tremelimumab (también conocido como CP-675206), en ensayos clínicos en el tratamiento de diversos tipos de tumores sólidos.
La superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) es un grupo de citocinas que se acoplan a receptores específicos afines de la superficie celular, la superfamilia del receptor de TNF (TNFR). Los miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral actúan a través de la trimerización mediada por ligando, provocando el reclutamiento de varios adaptadores intracelulares para activar múltiples vías de transducción de señales, tales como la apoptosis, la vía de NF-kB, la vía de JNK, así como respuestas inmunitarias e inflamatorias. Los ejemplos de la superfamilia de TNF incluyen ligandos de CD40, ligandos de OX40, ligandos de 4-1BB, CD27, ligando de CD30 (CD153), TNF-alfa, TNF-beta, ligandos de RANK, LT-alfa, LT-beta, ligandos de GITR y LIGHT. La superfamilia de TNFR incluye, por ejemplo, CD40, OX40, 4-1BB, CD70 (ligando de CD27), CD30, Tn Fr2, RANK, LT-beta R, HVEM, GITR, TROY y RELT. CD40 se encuentra en la superficie de los linfocitos B, células dendríticas, células dendríticas foliculares, células progenitoras hematopoyéticas, células epiteliales y carcinomas. CD40 se une a un ligando (CD40-L), que es una glucoproteína y se expresa en linfocitos T activados, en su mayoría CD4+, pero también algunos CD8+, así como basófilos/mastocitos. Debido al papel de CD40 en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, se han explorado agonistas de CD40, incluyendo varios anticuerpos agonistas de CD40, tales como el anticuerpo monoclonal agonista completamente humano contra CD40 CP870893, para su uso como adyuvantes de vacunas y en terapias.
Las proteínas cinasas son una familia de enzimas que catalizan la fosforilación de restos específicos en las proteínas. Las proteínas cinasas son elementos clave en las vías de transducción de señales responsables de la transducción de señales extracelulares, incluyendo la acción de las citocinas sobre sus receptores, a los núcleos, desencadenando diversos eventos biológicos. Las muchas funciones de las proteínas cinasas en la fisiología celular normal incluyen el control del ciclo celular y el crecimiento celular, la diferenciación, apoptosis, la movilidad celular y la mitogénesis. Las cinasas tales como c-Src, c-Abl, proteína cinasa activada por mitógeno (MAP), fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K), AKT y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) se activan normalmente en las células cancerosas y se sabe que contribuyen a la tumorigénesis. Lógicamente, en la actualidad se encuentra en desarrollo un número de inhibidores de cinasa para la terapia contra el cáncer, en particular, inhibidores de tirosina cinasa (TKI): inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores de aurora cinasa, inhibidores del punto de control del ciclo celular, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), inhibidores de tirosina cinasa de tipo FMS, inhibidores del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), inhibidores del dominio de inserción de cinasa, inhibidores que se dirigen a la vía de PI3K/Akt/mTOR, inhibidores dirigidos a la vía de Ras-Raf-MEK-ERK (ERK), inhibidores de la cinasa del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEG-FR), inhibidores de c-kit e inhibidores de serina/treonina cinasa. Se ha investigado una serie de inhibidores de cinasas en investigación clínica para su uso en terapias contra el cáncer, que incluye, por ejemplo, MK0457, VX-680, ZD6474, MLN8054, AZD2171, SNS-032, PTK787/ZK222584, Sorafenib (BAY43-9006), SU5416, SU6668 AMG706, Zactima (ZD6474), MP-412, Dasatinib, CEP-701, (Lestaurtinib), XL647, XL999, Tykerb, (Lapatinib), MLN518, (anteriormente conocido como CT53518), PKC412, ST1571, AMN107, AEE 788, OSI-930, OSI-817, Sunitinib malato (Sutent; SU11248), Vatalanib (PTK787/ZK 222584), SNS-032, SNS-314 y Axitinib (AG-013736). Gefitinib y Erlotinib son dos EGFR-TKI disponibles por vía oral.
Los moduladores inmunitarios que se han explorado se administran normalmente por vía sistémica a los pacientes, por ejemplo, mediante administración oral, inyección o infusión intravenosa o inyección intramuscular. Un factor importante que limita el uso eficaz de algunos de los inmunomoduladores es la toxicidad provocada por la elevada exposición sistémica a los agentes administrados. Por ejemplo, con respecto a los agonistas de CD40, se ha informado que 0,3 mg/kg es la dosis máxima tolerada para un anticuerpo agonista de CD40 ejemplar y que dosis más elevadas pueden provocar efectos secundarios que incluyen tromboembolia venosa, cefalea de grado 3, liberación de citocinas que da como resultado efectos tóxicos, tales como escalofríos y similares y toxicidad hepática transitoria. (Vanderheide y col., J Clin. Oncol. 25 (7): 876-8833 (marzo de 2007). En un ensayo clínico para investigar combinaciones de Tremelimumab intravenoso (un anticuerpo anti-CTLA-4) más sunitinib oral en pacientes con carcinoma de células renales metastásico, se observó un inicio rápido de insuficiencia renal y, y como resultado de ello, no se recomendó una investigación adicional de Tremelimumab en dosis superiores a 6 mg/kg más sunitinib a 37,5 mg diarios. Véase: Brian I. Rini y col.: Phase 1 Dose-Escalation Trial of Tremelimumab Plus Sunitinib in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma. Cancer 117(4):758-767 (2011)]. Por lo tanto, existe la necesidad de regímenes de inmunoterapia basados en vacunas en los que los moduladores inmunitarios se administren a dosis eficaces que no produzcan efectos secundarios adversos graves, como toxicidad hepática o insuficiencia renal.
Sumario de la invención
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona polipéptidos inmunogénicos de PSMA y polipéptidos inmunogénicos de PSA aislados, que son útiles, por ejemplo, para provocar una respuesta inmunitaria in vivo (por ejemplo, en un animal, incluidos los seres humanos) o in vitro, generando anticuerpos o para su uso como componente en vacunas para el tratamiento de cánceres, incluyendo el cáncer de próstata. En un aspecto, la presente divulgación proporciona polipéptidos inmunogénicos de PSMA aislados que tienen al menos un 90 % de identidad respecto de los aminoácidos 15-750 del PSMA humano de SEQ ID NO: 1 y comprenden los aminoácidos de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 de los epítopos de linfocitos T conservados del PSMA humano en las posiciones correspondientes.
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos inmunogénicos de PAA. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas o variantes degeneradas de las mismas, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA o una variante funcional de dicho polipéptido, proporcionado por la presente divulgación.
En algunos aspectos diferentes, la presente divulgación proporciona construcciones de ácido nucleico multiantígeno que codifican cada uno de dos o más polipéptidos inmunogénicos de PAA.
La divulgación también proporciona vectores que contienen una o más moléculas de ácido nucleico de la invención.
Los vectores son útiles para clonar o expresar los polipéptidos inmunogénicos de PAA codificados por las moléculas de ácido nucleico o para administrar las moléculas de ácido nucleico en una composición, tal como una vacuna, a una célula hospedadora o a un animal hospedador, tal como un ser humano.
En algunos aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden uno o más polipéptidos inmunogénicos de PAA, moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos inmunogénicos de PAA o vectores o plásmidos que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos inmunogénicos de PAA. En algunas realizaciones, la composición es una composición inmunogénica útil para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA en un mamífero, tal como un ratón, perro, mono o ser humano. En algunas realizaciones, la composición es una composición de vacuna útil para la inmunización de un mamífero, tal como un ser humano, para inhibir la proliferación celular anormal, para proporcionar protección contra el desarrollo del cáncer (usado como profiláctico) o para el tratamiento de trastornos (usados como agente terapéutico) asociados con la sobreexpresión de PAA, tales como cáncer, en particular el cáncer de próstata.
En otros aspectos más, la presente divulgación proporciona procedimientos para usar los polipéptidos inmunogénicos de PAA, moléculas de ácido nucleico aisladas y composiciones que comprenden un polipéptido inmunogénico de PAA o moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA en un mamífero, en particular, un ser humano, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un polipéptido proporcionado por la divulgación que es inmunogénico contra el PAA diana, una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicho polipéptido inmunogénico o una composición que comprende dicho polipéptido inmunogénico de PAA o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicho polipéptido inmunogénico de PAA. Las vacunas de polipéptidos o ácidos nucleicos pueden usarse junto con uno o más adyuvantes.
En otros aspectos más, la presente divulgación proporciona regímenes de inmunoterapia basados en vacunas (o "VBIR") que implican la administración conjunta de una vacuna que proporciona varios antígenos asociados a tumores (TAA) para inducir respuestas inmunitarias específicas de TAA para tratar una variedad de cánceres en combinación con al menos un inhibidor de células supresoras inmunitarias y al menos un potenciador de células efectoras inmunitarias. Específicamente, en algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero que recibe la vacuna una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de células inmunosupresoras y al menos un potenciador de células efectoras inmunitarias. En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno neoplásico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una vacuna, al menos un inhibidor de células supresoras inmunitarias y al menos un potenciador de células efectoras inmunitarias.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1. Ilustración esquemática del vector PJV7563.
FIG. 2. Alineación de aminoácidos de cinco casetes víricos 2A. Los enlaces de glicina-prolina omitidos están indicados por asteriscos.
FIG. 3. Secuencia del IRES de EMCV preferido. El sitio de iniciación de la traducción se indica con un asterisco. El elemento IRES mínimo excluye los primeros 5 codones subrayados de la proteína L de EMCV.
FIG. 4. Gráficas de puntos que muestran la expresión del antígeno PSMA humano modificado (aminoácidos 15­ 750) y PSCA humano de longitud completa en la superficie de células HEK293 transfectadas con construcciones de vacuna de antígeno dual, medida mediante citometría de flujo.
FIG. 5. Imagen de transferencias de Western que muestran la expresión del antígeno PSMA humano modificado (aminoácidos 15-750) y PSCA humano de longitud completa en células HEK293 transfectadas con construcciones de vacuna de antígeno dual, medida mediante transferencia de Western con anticuerpos monoclonales específicos para PSMA y PSCA.
FIG. 6. Imagen de transferencias de Western que muestran la expresión de antígeno PSA citosólico humano (aminoácidos 25-261) en células HEK293 transfectadas con construcciones de vacuna de antígeno dual, medida mediante transferencias de Western con un anticuerpo monoclonal específico para PSA. El carril 5300 mostró una banda débil aproximadamente 2kD mayor que PSA, consistente con una fusión C-terminal del péptido 2A. FIG. 7A, 7B. Gráficas de puntos que muestran la expresión del antígeno PSMA humano modificado (aminoácidos 15-750) y PSCA humano de longitud completa en la superficie de células HEK293 transfectadas con construcciones de vacuna de antígeno triple, medida mediante citometría de flujo. (FIG. 7A. Controles de antígeno único y construcciones de un solo promotor y triple antígeno. FIG. 7B. Construcciones de promotor dual y antígeno triple).
FIG. 8A, 8B. Imágenes de transferencias de Western que muestran la expresión de PSA humano en células HEK293 transfectadas con construcciones de vacuna de antígeno triple, medida mediante transferencias de Western con un anticuerpo monoclonal específico para PSA. Las bandas en los carriles 5259 y 456 son un rebose del carril 5297. Aunque no es visible en el gel escaneado, los carriles 456, 457 y 458 exhibieron una banda aproximadamente 2kD mayor que PSA, consistente con una fusión C-terminal del péptido 2A. (FIG. 8A. Construcciones de un solo promotor y triple antígeno. FIG. 8B. Construcciones de promotor dual y antígeno triple)
FIG. 9A-9D. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y.
FIG. 10A-10D. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y.
FIG. 11. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante los títulos de anticuerpo anti-PSMA.
FIG. 12. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante los títulos de anticuerpo anti-PSCA.
FIG. 13. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante la unión de anticuerpos anti-PSMA a la superficie celular.
FIG. 14. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante la unión de anticuerpos anti-PSCA a la superficie celular.
FIG. 15A-15C. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y.
FIG. 16A-16C. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y.
FIG. 17. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSMA.
FIG. 18. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSCA.
FIG. 19. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión de anticuerpos anti-PSMA a la superficie celular.
FIG. 20. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión de anticuerpos anti-PSCA a la superficie celular.
FIG. 21A-21D. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y.
FIG. 22. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSMA.
FIG. 23. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSCA.
FIG. 24. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión de anticuerpos anti-PSMA a la superficie celular.
FIG. 25. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión de anticuerpos anti-PSCA a la superficie celular.
FIG. 26. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo para evaluar la respuesta inmunitaria de linfocitos T provocada por el antígeno PSMA humano modificado (aa 15-750) frente a PSMA humano de longitud completa (aa 1-750) en ratones C57BL/6.
FIG. 27A, 27B. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo para evaluar la respuesta inmunitaria de linfocitos T contra el antígeno PSMA humano modificado antígeno(aa 15-750) frente al antígeno PSMA humano de longitud completa (aa 1-750) en ratones transgénicos Pasteur (HLA-A2/DR1) mediante un ensayo ELISPOT de IFN-y.
FIG. 28. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de PSMA humano modificado y de longitud completa mediante títulos de anticuerpos anti-PSMA.
FIG. 29. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de PSMA humano modificado y de longitud completa mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSMA.
FIG. 30. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa los niveles en sangre de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 medidos mediante ELISA competitivo en macacos Rhesus indios a los que se inyecta anti-CTLA-4 (CP-675, 206) a 10 mg/kg.
FIG. 31A y 31B. Gráficas que ilustran resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 murino (clon 9H10) en la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante un ensayo de tinción de citocinas intracelulares.
FIG. 32. Gráfica que ilustra los resultados de un estudio representativo que evalúa y compara la velocidad de crecimiento de tumores subcutáneos tras el tratamiento con sunitinib malato (Sutent) como monoterapia o en combinación con un control (control) o una vacuna contra el cáncer (rHER2).
FIG. 33A - 33D. Gráficas que muestran las velocidades de crecimiento de tumores individuales de ratones de un estudio representativo que evalúa y compara la eficacia antitumoral de sunitinib malato (Sutent) a 20 mg/kg con control (control) o vacuna contra el cáncer (rHER2).
FIG. 34. Gráfica que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones del estudio descrito en la figura 33 que evalúa la eficacia antitumoral de sunitinib malato (Sutent) con el control (control) o la vacuna contra el cáncer (rHER2) tratados con sunitinib malato (Sutent) con control (control) o vacuna contra el cáncer (cáncer).
FIG. 35A, 35B. Gráficas que muestran cambios en las células supresoras de origen mieloide (Gr1+CD11b+) y Treg que contienen células CD25+CD4+ en la sangre periférica de ratones tratados en la Fig. 33.
FIG. 36A-36C. Gráficas que muestran los cambios en el número total de células supresoras de origen mieloide (Gr1+CD11b+), Treg (CD4+CD25+Foxp3+) y linfocitos T PD-1+CD8 aislados de tumores de ratones.
FIG. 37. Gráfica que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la eficacia antitumoral de sunitinib malato (Sutent) y el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 murino (clon 9D9) en combinación con un control (control) o vacuna contra el cáncer (vacuna) en ratones BALB/neuT portadores de tumores TUBO subcutáneos.
FIG. 38. Gráfica que muestra la cinética de los niveles de sunitinib en sangre de ratones BALB/neuT con tumores TUBO subcutáneos.
FIG. 39. Gráfica que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la eficacia antitumoral en ratones BALB/neuT con tumores TUBO subcutáneos a los que se administró sunitinib malato (Sutent) y una vacuna de control o contra el cáncer.
FIG. 40. Gráfica que ilustra los resultados del ELISPOT de IFNy de grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la magnitud de las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno inducidas por la vacuna rHER2 cuando se administra con los moduladores inmunitarios.
FIG. 41A, 41B. Gráficas que ilustran resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de CpG7909 (PF-03512676) en la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante un ensayo de tinción de citocinas intracelulares.
FIG. 42A, 42B. Gráficas que ilustran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 murino agonista sobre la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante el ensayo de tinción intracelular de citocinas.
FIG. 43. Gráfica que muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la eficacia antitumoral de sunitinib malato (Sutent) a dosis baja y una vacuna de control o contra el cáncer en ratones BALB/neuT portadores de tumor mamario espontáneo.
Descripción detallada de la invención
A. Definiciones
El término "adyuvante" se refiere a una sustancia que es capaz de potenciar, acelerar o prolongar una respuesta inmunitaria cuando se administra con un inmunógeno de vacuna.
El término "agonista" se refiere a una sustancia que promueve (induce, causa, potencia o aumenta) la actividad de otra molécula o un receptor. El término agonista abarca sustancias que se unen a receptores (por ejemplo, un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie) y sustancias que promueven la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, activando una proteína asociada).
El término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a una sustancia que bloquea, inhibe o neutraliza total o parcialmente una actividad biológica de otra molécula o receptor.
La expresión "administración conjunta" se refiere a la administración de dos o más agentes al mismo sujeto durante un periodo de tratamiento. Los dos o más agentes pueden incluirse en una única formulación y, por lo tanto, administrarse simultáneamente. Como alternativa, los dos o más agentes pueden estar en formulaciones físicas separadas y administrarse por separado, ya sea de manera secuencial o simultánea al sujeto. La expresión "administrado de manera simultánea" o "administración simultánea" significa que la administración del primer agente y la de un segundo agente se solapan en el tiempo entre sí, mientras que la expresión "administrado de manera secuencial" o "administración secuencial" significa que la administración del primera gente y la de un segundo agente no se solapan en el tiempo entre sí.
La expresión "epítopo de linfocitos T conservado" se refiere a una de las siguientes secuencias de aminoácidos de la proteína PSMA humana tal como se expone en la SEQ ID NO: 1:
aminoácidos 168-176 (GMPEGDLVY),
aminoácidos 347-356 (HSTNGVTRIY),
aminoácidos 557-566 (ETYELVEKFY),
aminoácidos 207-215 (KVFRGNKVK),
aminoácidos 431-440 (STEWAEENSR),
aminoácidos 4-12 (LLHETDSAV),
aminoácidos 27-35 (VLAGGFFLL),
aminoácidos 168-177 (GMPEGDLVYV),
aminoácidos 441-450 (LLQERGVAYI),
aminoácidos 469-477 (LMYSLVHNL),
aminoácidos 711-719 (ALFDIESKV),
aminoácidos 663-671 (MNDQ V MFL),
aminoácidos 178-186 (NYARTEDFF),
aminoácidos 227-235 (LYSDPADYF),
aminoácidos 624-632 (TYSVSFDSL),
aminoácidos 334-348 (TGNFSTQKVKMHIHS),
aminoácidos 459-473 (NYTLRVDCTPLMYSL),
aminoácidos 687-701 (YRHVIYAPSSHNKYA) y
aminoácidos 730-744 (RQIYVAAFTVQAAAE).
El término "citosólico" significa que después de que una célula hospedadora expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido particular, el polipéptido expresado se retiene dentro de la célula hospedadora.
La expresión "variante degenerada" se refiere a secuencias de ADN que tienen sustituciones de bases pero que codifican el mismo polipéptido.
La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad administrada a un mamífero que es suficiente para provocar un efecto deseado en el mamífero.
El término "fragmento" de un polipéptido dado se refiere a un polipéptido que es más corto que el polipéptido dado y comparte un 100 % de identidad con la secuencia del polipéptido dado.
El término "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas o de ácidos nucleicos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se compara y se alinea para la máxima correspondencia.
La expresión "potenciador de las células efectoras inmunes" o "potenciador de IEC" se refiere a una sustancia capaz de aumentar o potenciar el número, la calidad o la función de uno o más tipos de células efectoras inmunitarias de un mamífero. Los ejemplos de células efectoras inmunitarias incluyen linfocitos T CD8 citolíticos, linfocitos T CD40, células NK y linfocitos B.
La expresión "modulador inmunitario" se refiere a una sustancia capaz de alterar (por ejemplo, inhibir, disminuir, aumentar, potenciar o estimular) el funcionamiento de cualquier componente del sistema inmunitario innato, humoral o celular de un mamífero. Por lo tanto, la expresión "modulador inmunitario" abarca el "potenciador de células efectoras inmunitarias" como se define en el presente documento y el "inhibidor de células supresoras inmunitarias" como se define en el presente documento, así como una sustancia que afecta a otros componentes del sistema inmunológico de un mamífero.
La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier respuesta detectable a una sustancia particular (como un antígeno o inmunógeno) por el sistema inmunitario de un animal vertebrado hospedador, incluyendo, pero sin limitación, respuestas inmunitarias innatas (por ejemplo, activación de la cascada de señalización del receptor Toll), respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo, respuestas mediadas por linfocitos T, tales como linfocitos T específicos de antígeno y células no específicas del sistema inmunitario) y respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, respuestas mediadas por linfocitos B, tales como la generación y secreción de anticuerpos en los fluidos plasmáticos, linfáticos y/o tisulares). Los ejemplos de respuestas inmunitarias incluyen una alteración (por ejemplo, un aumento) en la activación de receptores de tipo Toll, expresión de linfocinas (por ejemplo, citocinas (por ejemplo, expresión o secreción de citocinas de tipo Th1, Th2 o Th17) o quimiocinas), activación de macrófagos, activación de células dendríticas, activación de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD4+ o CD8+), activación de células NK, activación de linfocitos B (por ejemplo, generación y/o secreción de anticuerpos), unión de un inmunógeno (por ejemplo, antígeno (por ejemplo, polipolipéptido inmunogénico)) a una molécula del MHC, inducción de una respuesta de linfocitos T citotóxicos ("CTL"), inducción de una respuesta de linfocitos B (por ejemplo, producción de anticuerpos) y, expansión (por ejemplo, crecimiento de una población de células) de células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T y linfocitos B) y aumento del procesamiento y presentación del antígeno por parte de las células presentadoras de antígenos. La expresión "respuesta inmunitaria" también abarca cualquier respuesta detectable a una sustancia particular (tal como un antígeno o inmunógeno) por uno o más componentes del sistema inmunitario de un animal vertebrado in vitro.
El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia para causar, provocar, estimular o inducir una respuesta inmunitaria o para mejorar, potenciar, aumentar o prolongar una respuesta inmunitaria preexistente, contra un antígeno particular, ya se encuentre solo o cuando esté vinculado a un portador, en presencia o ausencia de un adyuvante.
La expresión "polipéptido inmunogénico de PSA" se refiere a un polipéptido que es inmunogénico contra la proteína PSA humana o contra las células que expresan la proteína PSA humana.
La expresión "polipéptido inmunogénico de PSCA" se refiere a un polipéptido que es inmunogénico contra la proteína PSCA humana o contra las células que expresan la proteína PSCA humana.
La expresión "polipéptido inmunogénico de PSMA" se refiere a un polipéptido que es inmunogénico contra la proteína PSMA humana o contra las células que expresan la proteína PSMA humana.
La expresión "polipéptido inmunogénico de PAA" se refiere a un "polipéptido inmunogénico de PSA", un "polipéptido inmunogénico de PSCA" o un "polipéptido inmunogénico de PSMA" como se ha definido anteriormente en el presente documento.
La expresión "molécula de ácido nucleico inmunogénica de PSA" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico de PSA como se define en el presente documento.
La expresión "molécula de ácido nucleico inmunogénica de PSCA" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico de PSCA como se define en el presente documento.
La expresión "molécula de ácido nucleico inmunogénica de PSMA" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA como se define en el presente documento.
La expresión "molécula de ácido nucleico inmunogénica de PAA" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un "polipéptido inmunogénico de PSA", un "polipéptido inmunogénico de PSCA" o un "polipéptido inmunogénico de PSMA" como se ha definido anteriormente en el presente documento.
La expresión "inhibidor de células supresoras inmunitarias" o "inhibidor de ISC" se refiere a una sustancia capaz de reducir o suprimir el número o la función de células supresoras inmunitarias de un mamífero. Los ejemplos de células supresoras inmunitarias incluyen linfocitos T reguladores ("Treg"), células supresoras de origen mieloide y macrófagos asociados a tumores.
La expresión "administración intradérmica", o "administrado por vía intradérmica", en el contexto de la administración de una sustancia, tal como un agente terapéutico o un modulador inmunitario, a un mamífero, incluyendo un ser humano, se refiere a la administración de la sustancia en la capa de la dermis de la piel del mamífero. La piel de un mamífero se compone de tres capas, la epidermis, la dermis y la capa subcutánea. La epidermis es la capa relativamente fina y resistente capa externa de la piel. La mayoría de las células en la epidermis son queratinocitos. La dermis, la siguiente capa de la piel, es una capa gruesa de tejido fibroso y elástico (compuesta principalmente de colágeno, elastina y fibrilina) que le da a la piel su flexibilidad y resistencia. La dermis contiene terminaciones nerviosas, glándulas sudoríparas y glándulas oleosas (sebáceas), folículos pilosos y vasos sanguíneos. La dermis varía en espesor dependiendo de la ubicación de la piel. En seres humanos, tiene un grosor de aproximadamente 0,3 mm en los párpados y de aproximadamente 3,0 mm en la espalda. La capa subcutánea está formada de gras y tejido conectivo que aloja los vasos sanguíneos mayores y los nervios. El grosor de esta capa varía por todo el cuerpo y de una persona a otra. La expresión "administración intradérmica" se refiere a la administración de una sustancia al interior de la capa de la dermis. En cambio, "administración subcutánea" se refiere a la administración de una sustancia en la capa subcutánea y "administración tópica" se refiere a la administración de una sustancia sobre la superficie de la piel.
La expresión "administración local" o "administrado por vía local" abarca "administración tópica", "administración intradérmica" y "administración subcutánea", cada una como se han definido anteriormente en el presente documento. Este término también abarca "administración intratumoral", que se refiere a la administración de una sustancia al interior de un tumor. La administración local tiene como objeto posibilitar altas concentraciones locales alrededor del sitio de administración durante un periodo de tiempo hasta que se haya logrado la biodistribución sistémica de la sustancia administrada, mientras que la "administración sistémica" tiene como objeto que se absorba la sustancia administrada a la sangre y lograr rápidamente una exposición sistémica distribuyéndose por el sistema circulatorio a los órganos o tejidos por todo el organismo.
El término "mamífero" se refiere a cualquier especie animal de la clase Mammalia. Los ejemplos de mamíferos incluyen: seres humanos; primates no humanos, tales como monos; animales de laboratorio, tales como ratas, ratones, cobayas; animales domésticos, tales como los gatos, perros, conejos, ganado bovino, ovejas, cabras, caballos y cerdos; y animales salvajes en cautividad, tales como leones, tigres, elefantes y similares.
La expresión "unido a membrana" significa que después de que una célula hospedadora expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido particular, el polipéptido expresado está unido a, ligado o de otro modo asociado con, la membrana de la célula.
La expresión "trastorno neoplásico" se refiere a una afección en la que las células proliferan a una tasa anormalmente alta y no controlada, superando dicha velocidad y estando descoordinada con la de los tejidos normales circundantes. Normalmente da como resultado una lesión sólida o bulto conocida como "tumor". Este término aparca trastornos neoplásicos benignos y malignos. La expresión "trastorno neoplásico maligno", que se usa indistintamente con el término "cáncer" en la presente divulgación, se refiere a un trastorno neoplásico caracterizado por la capacidad de las células tumorales para dispersarse a otras ubicaciones en el cuerpo (lo que se conoce como "metástasis"). La expresión "trastorno neoplásico benigno" se refiere a un trastorno neoplásico en el que las células tumorales carecen de la capacidad de metastatizar.
La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de este modo se encuentran en una relación que les permite funcionar de su modo previsto. Una secuencia de control "unida operativamente" a un transgén está ligada de tal modo que la expresión del transgén se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "ortólogo" se refiere a genes de diferentes especies que son similares entre sí y se originaron a partir de un ancestro común.
La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia en una composición inmunogénica o de vacuna, distinta de los principios activos (por ejemplo, el antígeno, ácido nucleico codificante de antígeno, modulador inmunitario o adyuvante) que es compatible con los principios activos y no provoca un efecto indebido significativo en los sujetos a los que se administra.
Los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados química o bioquímicamente y polipéptidos que tienen cadenas principales polipeptídicas modificadas.
El término "prevención" o "prevenir" se refiere a (a) prevenir que se produzca un trastorno o (b) retrasar la aparición de un trastorno o la aparición de los síntomas de un trastorno.
La expresión "antígeno asociado con la próstata" (o PAA) se refiere al TAA (como se define en el presente documento) que se expresa específicamente en células tumorales de la próstata o se expresa con una mayor frecuencia o densidad por las células tumorales que por las células no tumorales del mismo tipo tisular. Los ejemplos de PAA incluyen PSA, PSCA y PSMA.
El término "secretado", en el contexto de un polipéptido significa que después de que una célula hospedadora expresa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, el polipéptido expresado se secreta fuera de la célula hospedadora.
La expresión "dosis subóptima", cuando se usa para describir la cantidad de un modulador inmunitario, tal como un inhibidor de proteína cinasa, se refiere a una dosis del modulador inmunitario que está por debajo de la cantidad mínima necesaria para producir el efecto terapéutico deseado para la enfermedad que se está tratando cuando el modulador inmunitario se administra de manera individual a un paciente.
El término "tratando", "tratamiento", o "tratar" se refiere a suprimir un trastorno, reducir la gravedad de un trastorno o reducir la gravedad o la frecuencia de la aparición de un síntoma de un trastorno.
La expresión "antígeno asociado con tumores" o "TAA" se refiere a un antígeno que se expresa específicamente por células tumorales o expresado a una frecuencia o densidad mayor por células tumorales que por células no tumorales del mismo tipo tisular. Los antígenos asociados con tumores pueden ser antígenos no expresados normalmente por el hospedador; pueden estar mutados, truncados, plegados erróneamente o ser manifestaciones de otro modo anormales de las moléculas normalmente expresadas por el hospedador; pueden ser idénticos a moléculas normalmente expresadas por el hospedador pero expresados a niveles anormalmente elevados; o pueden expresarse en un contexto o medio que es anormal. Los antígenos asociados a tumores pueden ser, por ejemplo, proteínas o fragmentos de proteínas, carbohidratos complejos, gangliósidos, haptenos, ácidos nucleicos o cualquier combinación de estos u otras moléculas biológicas.
El término "vacuna" se refiere a una composición inmunogénica para su administración a un mamífero para generar una respuesta inmunitaria contra un antígeno particular.
El término "variante" de un polipéptido dado se refiere a un polipéptido que comparte menos del 100 % pero más del 80 % de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido dado y muestra al menos parte de la actividad inmunogénica de ese polipéptido dado.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar o transferir una molécula de ácido nucleico exógena. El término abarca tanto vectores de expresión como vectores de transcripción. La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector capaz de expresar el inserto en la célula diana y generalmente contiene secuencias de control, tales como secuencias potenciadoras, promotoras y terminadoras, que dirigen la expresión del inserto. La expresión "vector de transcripción" se refiere a un vector que se puede transcribir pero no traducir. Los vectores de transcripción se utilizan para amplificar su inserto. La molécula de ácido nucleico exógena se conoce como "inserto" o "transgén". Un vector consiste generalmente en un inserto y una secuencia más grande que sirve como cadena principal del vector. Basándose en la estructura u origen de los vectores, los principales tipos de vector incluyen vectores plasmídicos, vectores de cósmidos, vectores de fagos, tales como fago lambda, vectores víricos, tales como vectores de adenovirus (Ad) y cromosomas artificiales.
B. POLIPÉPTIDOS INMUNOGÉNICOS DE ANTÍGENO ASOCIADO CON LA PRÓSTATA (PAA)
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona polipéptidos de PSA y polipéptidos de PSMA inmunogénicos aislados, que son útiles, por ejemplo, para provocar una respuesta inmunitaria in vivo (por ejemplo, en un animal, incluidos los seres humanos) o in vitro, activar linfocitos T efectores o generar anticuerpos específicos contra PSA y PSMA, respectivamente o para su uso como un componente en vacunas para tratar el cáncer, en particular el cáncer de próstata. Estos polipéptidos pueden prepararse por procedimientos conocidos en la técnica a la luz de la presente divulgación. La capacidad de los polipéptidos para provocar una respuesta inmunitaria puede medirse en ensayos in vitro o ensayos in vivo. Los ensayos in vitro para determinar la capacidad de un polipéptido o construcción de ADN para provocar respuestas inmunitarias son conocidos en la técnica. Un ejemplo de dichos ensayos in vitro es medir la capacidad del polipéptido o ácido nucleico que expresa un polipéptido para estimular la respuesta de linfocitos T, como se describe en la patente de los Estados Unidos 7.387.882. El procedimiento comprende las etapas de: (1) poner en contacto las células presentadoras de antígenos en cultivo con un antígeno, por lo que el antígeno puede captarse y procesarse por las células presentadoras de antígenos, produciendo uno o más antígenos procesados; (2) poner en contacto las células presentadoras de antígeno con linfocitos T en condiciones suficientes para que los linfocitos T respondan a uno o más de los antígenos procesados; (3) determinar si los linfocitos T responden a uno o más de los antígenos procesados. Los linfocitos T usados pueden ser linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+. La respuesta de los linfocitos T se puede determinar midiendo la liberación de una o más de las citocinas, tales como interferón gamma e interleucina-2, la lisis de las células presentadoras de antígenos (células tumorales) y la producción de anticuerpos por los linfocitos B.
B-1. Polipéptidos inmunogénicos de PSMA
En un aspecto, la presente divulgación proporciona polipéptidos inmunogénicos de PSMA aislados que tienen al menos un 90% de identidad respecto de los aminoácidos 15-750 del PSMA humano de SEQ ID NO: 1 y comprenden los aminoácidos de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 de los epítopos de linfocitos T conservados del PSMA humano en las posiciones correspondientes.
En algunas realizaciones, los polipéptidos inmunogénicos de PSMA comprenden al menos 15, 16, 17, 18 o 19 de los epítopos de linfocitos T conservados del PSMA humano.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un polipéptido inmunogénico de PSMA que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o un polipéptido inmunogénico de PSMA que tiene un 93 % -99 %, 94 % - 98 % o 94 % - 97 % de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID NO: 9.
Los ejemplos de algunos polipéptidos inmunogénicos de PSMA particulares incluyen:
1) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID
2) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 -739 de la SEQ ID
3) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID
4) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID
2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos d Q ID NO: 3;
3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos d Q ID NO: 5; y
4) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos d
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Q ID NO: 7.
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un polipéptido inmunogénico de PSMA seleccionado entre el grupo que consiste en:
1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11
2) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y
3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones diferentes, la presente divulgación proporciona polipéptidos inmunogénicos de PSMA aislados que son variantes de cualquiera de los siguientes polipéptidos:
2) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 3;
3) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 5; y
4) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 7,
en los que la secuencia de aminoácidos de la variante tiene una identidad del 93 % - 99 % respecto de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y comparte al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 5 o 7.
Las variantes de un polipéptido de PAA dado pueden obtenerse eliminando, insertando o sustituyendo uno o más aminoácidos en el polipéptido inmunogénico de PAA precursor. Un ejemplo para la producción de tales variantes es la sustitución conservativa de aminoácidos individuales de los polipéptidos, es decir, sustituyendo un aminoácido por otro que tiene propiedades similares.
Un polipéptido inmunogénico de PSMA de la divulgación puede construirse conservando algunos o todos los epítopos de linfocitos T conservados del PSMA humano de la SEQ ID NO: 1 mientras que se sustituyen ciertos aminoácidos en las regiones restantes del PSMA humano con aminoácidos encontrados en uno o más ortólogos de PSMA humano en las posiciones correspondientes. Se encuentran disponibles en la base de datos GenBank secuencias de diversos ortólogos de PSMA que pueden utilizarse para producir los polipéptidos inmunogénicos de PSMA. Estos ortólogos, junto con sus números de ID del NCBI se proporcionan en la tabla 18. Las sustituciones de aminoácidos de PSMA humano con aminoácidos de uno o más de los ortólogos pueden ser sustituciones conservativas o sustituciones no conservativas o ambas y pueden seleccionarse basándose en una serie de factores conocidos en la técnica, incluyendo la divergencia que se necesita lograr, la unión al MHC, la presencia de aminoácidos ortólogos en el sitio de sustitución, exposición en la superficie y conservación de la estructura 3-D de la proteína para su procesamiento y presentación óptimos.
B-2. Polipéptidos inmunogénicos de PSA
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona polipéptidos inmunogénicos de PSA aislados. En una realización, el polipéptido inmunogénico de PSA aislado es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o los aminoácidos 4 - 263 de la s Eq ID NO: 15 o una variante del mismo. En otra realización, el polipéptido inmunogénico de PSA aislado es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o los aminoácidos 4 - 240 de la s Eq ID NO: 17 o una variante del mismo. En una realización adicional, el polipéptido inmunogénico de PSA aislado es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o los aminoácidos 4 - 281 de la SEQ ID NO: 19 o una variante del mismo.
C. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS INMUNOGÉNICOS DE PAA
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos inmunogénicos de PAA. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser desoxirribonucleótidos (ADN) o ribonucleótidos (ARN). Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento en la que la timidina (T) también puede ser uracilo (U), lo que refleja las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y el ARN. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser formas modificadas, formas mono o bicatenarias o formas lineales o circulares. Las moléculas de ácido nucleico pueden prepararse usando procedimientos conocidos en la técnica a la luz de la presente divulgación.
C-1. Moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos inmunogénicos de PSMA
En un aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas o variantes degeneradas de las mismas, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA, incluyendo los polipéptidos inmunogénicos de PSMA proporcionados por la presente divulgación o una variante funcional de los mismos.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA unido a membrana. En algunas realizaciones particulares, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos o una variante degenerada de la misma, seleccionada entre el grupo que consiste en:
1) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9;
2) una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 4- 739 de la SEQ ID NO: 3;
3) una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 4 -739 de la SEQ ID NO: 5; y
4) una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones particulares diferentes, la secuencia de nucleótidos codifica una variante de un polipéptido inmunogénico de PSMA de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, en la que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene (a) de un 93 % a un 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y (b) al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 5 o 7.
En algunas realizaciones particulares diferentes más, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos o una variante degenerada de la misma, seleccionada entre el grupo que consiste en:
1) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10
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217 de la SEQ ID NO: 4; 2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 6; 3) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 8; y 4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 10. C-2. Moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos inmunogénicos de PSA
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas o variantes degeneradas de las mismas, que codifican un polipéptido inmunogénico de PSA, incluyendo los polipéptidos inmunogénicos de PSA proporcionados por la presente divulgación.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSA citosólico. En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA citosólico que consiste en los restos de aminoácidos 4 -240 consecutivos de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA citosólico que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En otra realización adicional más, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA citosólico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En otra realización más, la secuencia de nucleótidos codifica una variante funcional de cualquiera de dichos polipéptidos inmunogénicos citosólicos proporcionados anteriormente en el presente documento.
En algunas realizaciones diferentes, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSA unido a membrana. En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA unido a membrana que comprende los restos de aminoácidos 4 - 281 consecutivos de la SEQ ID NO: 19. En otra realización, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA unido a membrana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. En otra realización adicional más, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA unido a membrana que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. Aún en otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica una variante funcional de cualquiera de dichos polipéptidos inmunogénicos de PSA unidos a la membrana proporcionados anteriormente en el presente documento.
Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico particulares proporcionadas por la presente divulgación incluyen: 1) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18;
2) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18;
3) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20;
4) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20; y
5) una variante degenerada de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico 1) - 4) anteriores.
C-3. Moléculas de ácido nucleico que codifican dos o más polipéptidos inmunogénicos de PAA
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica más de un polipéptido inmunogénico de PAA, por ejemplo, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro polipéptidos inmunogénicos de PAA. Dichas moléculas de ácido nucleico también se citan como "construcciones multiantígeno", "vacuna multiantígeno", "plásmido multiantígeno" y similares, en la presente divulgación. Por lo tanto, en algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico porta dos secuencias de nucleótidos codificantes, en la que cada una de las secuencias de nucleótidos codificantes expresa un polipéptido inmunogénico de PAA individual. Dicha molécula de ácido nucleico también se conoce como "construcción de antígeno dual", "vacuna de antígeno dual" o "plásmido de antígeno dual", etc., en la presente divulgación. En algunos aspectos diferentes, una molécula de ácido nucleico porta tres secuencias de nucleótidos codificantes, en la que cada una de las secuencias de nucleótidos codificantes expresa un polipéptido inmunogénico de PAA individual. Dicha molécula de ácido nucleico también se conoce como "construcción de antígeno triple", "vacuna de antígeno triple" o "plásmido de antígeno triple" en la presente divulgación. Los polipéptidos de PAA individuales codificados por una construcción multiantígeno pueden ser inmunogénicos contra el mismo antígeno, tal como PSMA, PSA o PSCA. Los polipéptidos de PAA individuales codificados por una construcción multiantígeno pueden ser inmunogénicos contra diferentes antígenos, por ejemplo, siendo un polipéptido de PAA un polipéptido de PSMA y el otro un polipéptido de PSA. Específicamente, una construcción multi-antígeno puede codificar dos o más polipéptidos inmunogénicos de PAA en cualquiera de las siguientes combinaciones:
1) al menos un polipéptido inmunogénico de PSMA y al menos un polipéptido inmunogénico de PSA;
2) al menos un polipéptido inmunogénico de PSMA y al menos un polipéptido de PSCA;
3) al menos un polipéptido inmunogénico de PSA y al menos un polipéptido de PSCA; y
4) al menos un polipéptido inmunogénico de PSMa , al menos un polipéptido inmunogénico de PSA y al menos un polipéptido de PSCA.
Los polipéptidos inmunogénicos de PSMA codificados por una construcción multi-antígeno pueden ser citosólicos, secretados o unidos a la membrana, pero preferentemente unidos a la membrana. De forma similar, el polipéptido de PSA inmunogénico codificado por la construcción multi-antígeno puede ser citosólico, secretado o unido a la membrana, pero es preferentemente citosólico.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una construcción multi-antígeno que codifica al menos un polipéptido inmunogénico de PSMA unido a la membrana y al menos un polipéptido de PSA unido a la membrana.
En algunas realizaciones diferentes, la presente divulgación proporciona una construcción multi-antígeno que codifica al menos un polipéptido inmunogénico de PSMA unido a la membrana, al menos un polipéptido de PSA citosólico y al menos un polipéptido de PSCA, en la que el al menos un polipéptido de PSA citosólico comprende los aminoácidos 4 - 240 de la s Eq ID NO: 17 y en la que el al menos un polipéptido inmunogénico de PSMA se selecciona entre el grupo que consiste en:
1) un polipéptido que comprende los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO: 1;
2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5;
4) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;
5) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 9;
6) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 3;
7) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 5;
8) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 7; y
9) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona una construcción de antígenos múltiples que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSA y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de PSCA humano, en la que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA de la SEQ ID NO: 17 o aminoácidos 4-240 de la SEQ ID NO: 17 y en la que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico de PSMA se selecciona entre el grupo que consiste en:
1) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2;
2) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4;
3) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6;
4) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8;
5) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10;
6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 4;
7) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 6;
8) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 8; y
9) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 10.
Los ejemplos de construcciones multi-antígeno específicas proporcionadas por la presente divulgación incluyen las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NO: 23 - 36.
Las construcciones de múltiples antígenos proporcionadas por la presente divulgación se pueden preparar usando diversas técnicas conocidas en la técnica a la luz de la divulgación. Por ejemplo, se puede construir una construcción multi-antígeno incorporando múltiples promotores independientes en un único plásmido (Huang, Y., Z. Chen y col. (2008). "Design, construction, and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant". J Acquir Immune Defic Syndr 47(4): 403-411; Xu, K., Z. Y. Ling y col. (2011). "Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus". Viral Immunol 24(1): 45-56). El plásmido puede diseñarse para portar múltiples casetes de expresión, consistiendo cada uno en a) un promotor de eucariota para iniciar la transcripción dependiente de ARN polimerasa, con o sin un elemento potenciador, b) un gen que codifica un antígeno diana y c) una secuencia terminadora de la transcripción. Tras el suministro del plásmido al núcleo de la célula transfectada, se iniciará la transcripción a partir de cada promotor, dando como resultado la producción de ARNm separados, cada uno codificando uno de los antígenos diana. Los ARNm se traducirán independientemente, produciendo de este modo los antígenos deseados.
Las construcciones multi-antígeno proporcionadas por la presente divulgación también pueden construirse usando un solo vector mediante el uso de polipéptidos similares a 2A vírica (Szymczak, A. L. y D. A. Vignali (2005). "Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors". Expert Opin Biol Ther 5(5): 627­ 638; de Felipe, P., G. A. Luke, y col. (2006). "E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein". Trends Biotechnol 24(2): 68-75; Luke, G. A., P. de Felipe y col. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes". J Gen Virol 89 (Parte 4): 1036-1042; Ibrahimi, A., G. Vande Velde, y col. (2009). "Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences". Hum Gene Ther 20(8): 845­ 860; Kim, J. H., S. R. Lee, y col. (2011). "High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice". PLoS One 6(4): e18556). Estos polipéptidos, también denominados casetes de escisión o CHYSEL (por sus siglas en inglés, elementos de hidrolasa que actúan en cis), tienen aproximadamente 20 aminoácidos de longitud con un motivo D-V/I-EXNPGP carboxilo terminal altamente conservado (figura 2). Los casetes son raros en la naturaleza, encontrándose con mayor frecuencia en virus, tales como el virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la rinitis equina A (ERAV), virus de la encefalomiocarditis (EMCV), teschovirus porcino (PTV) y virus Thosea asigna (TAV) (Luke, G. A., P. de Felipe y col. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes". J Gen Virol 89 (Parte 4): 1036-1042). Con una estrategia de expresión de múltiples antígenos basada en 2A, los genes que codifican varios antígenos diana pueden unirse entre sí en un único marco abierto de lectura, separados por casetes 2A. Todo el marco abierto de lectura se puede clonar en un vector con un solo promotor y terminador. Tras el suministro de las construcciones a una célula hospedadora, el ARNm que codifica los múltiples antígenos se transcribirá y traducida como una sola poliproteína. Durante la traducción de los casetes 2A, los ribosomas se saltan el enlace entre la glicina y la prolina C-terminal. El salto ribosómico actúa como una "escisión" autocatalítica cotraduccional que se libera cadena arriba de las proteínas cadena abajo. La incorporación de un casete 2A entre dos antígenos proteínicos da como resultado la adición de ~20 aminoácidos en el extremo C-terminal del polipéptido cadena arriba y 1 aminoácido (prolina) al extremo N-terminal de la proteína cadena abajo. En una adaptación de esta metodología, pueden incorporarse sitios de escisión de proteasa en el extremo N-terminal del casete 2A, de tal forma que las proteasas ubicuas escindirán el casete de la proteína cadena arriba (Fang, J., S. Yi, y col. (2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo". Mol Ther 15(6): 1153-1159).
Otra estrategia para construir las construcciones multi-antígeno proporcionadas por la presente divulgación implica el uso de un sitio de entrada a ribosomas interno o IRES. Los sitios de entrada ribosomal internos son elementos de ARN (figura 3) encontrados en las regiones 5' no traducidas de ciertas moléculas de ARN (Bonnal, S., C. Boutonnet, y col. (2003). "IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database". Nucleic Acids Res 31(1): 427-428). Atraen ribosomas eucariotas al ARN para facilitar la traducción de los marcos abiertos de lectura corriente abajo. A diferencia de la traducción celular normal dependiente de remate de 7-metilguanosina, La traducción mediada por IRES puede iniciarse en codones AUG distantes dentro de una molécula de ARN. El proceso altamente eficiente se puede aprovechar para su uso en vectores de expresión multicistrónicos (Bochkov, Y. A. y A. C. Palmenberg (2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location". Biotechniques 41(3): 283-284, 286, 288). Típicamente, se insertan dos transgenes en un vector entre un promotor y un terminador de la transcripción en forma de dos marcos abiertos de lectura separados por un IRES. Tras el suministro de las construcciones a una célula hospedadora, se transcribirá un solo transcrito largo que codifica ambos transgenes. El primer ORF se traducirá de la manera tradicional dependiente de remate, que termina en un codón de parada corriente arriba del IRES. El segundo ORF se traducirá de manera independiente del remate utilizando el IRES. De esta forma, pueden producirse dos proteínas independientes a partir de un solo ARNm transcritas a partir de un vector con un solo casete de expresión.
Aunque las estrategias de expresión de múltiples antígenos se describen en el presente documento en el contexto de una construcción de vacuna de ADN, los principios se aplican de manera similar en el contexto de las vacunas genéticas de vectores víricos.
D. VECTORES QUE CONTIENEN UNA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN POLIPÉPTIDO INMUNOGÉNICO DE PAA
Otro aspecto de la divulgación se refiere a vectores que contienen una o más moléculas de ácido nucleico de la divulgación. Los vectores son útiles para clonar o expresar los polipéptidos inmunogénicos de PAA codificados por las moléculas de ácido nucleico o para administrar la molécula de ácido nucleico en una composición, tal como una vacuna, a una célula hospedadora o a un animal hospedador, tal como un ser humano. Puede prepararse una amplia variedad de vectores para contener y expresar una molécula de ácido nucleico de la invención, tales como vectores plasmídicos, vectores de cósmidos, vectores de fago y vectores víricos.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un vector basado en plásmido que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención. Los ejemplos representativos de vectores plasmídicos adecuados incluyen pBR325, pUC18, pSKF, pET23D y pGB-2. Otros ejemplos representativos de vectores plasmídicos, así como el procedimiento de construcción de dichos vectores, se describen en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.580.859, 5.589.466, 5.688.688, 5.814.482 y 5.580.859.
En otras realizaciones, la presente invención proporciona vectores que se construyen a partir de virus, tales como retrovirus, alfavirus, adenovirus. Los ejemplos representativos de vectores retrovíricos se describen con más detalle en el documento EP 0.415.731; Números de publicación PCT WO 90/07936; WO 91/0285, WO 9311230; WO 9310218, WO 9403622; WO 9325698; WO 9325234; y las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.219.740, 5.716.613, 5.851.529, 5.591.624, 5.716.826, 5.716.832 y 5.817.491. Se describen ejemplos representativos de vectores que pueden generarse a partir de alfavirus en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.091.309 y 5.217.879, 5.843.723 y 5.789.245. En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona vectores adenovíricos derivados de adenovirus de primates no humanos, tales como adenovirus de simio. Los ejemplos de dichos vectores adenovíricos, así como su preparación, se describen en las publicaciones de solicitud PCT WO2005/071093 y WO 2010/086189 e incluyen vectores no replicantes, tales como ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, C¡hAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63, ChAd68, ChAd82, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, Pan Ad2 y Pan Ad3 y vectores competentes para la replicación, tales como los vectores Ad4 y Ad7. Se prefiere que a la hora de construir los vectores adenovíricos a partir de los adenovirus de simio, se supriman o hagan no funcionales mediante eliminación o mutación uno o más de los genes tempranos de la región genómica del virus seleccionados entre E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4. En una realización particular, el vector se construye a partir de ChAd3 o ChAd68. Los vectores adecuados también pueden generarse a partir de otros virus, tales como: virus de la viruela, como el virus de la viruela del canario o virus vaccinia (Fisher-Hoch y col., PNAS 86:317-321, 1989; Flexner y col., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner y col., Vaccine 8:17-21, 1990; Patentes de los Estados Unidos n.° 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO 89/01973); vectores adenoasociados (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos n.° 5.872.005); SV40 (Mulligan y col., Nature 277:108-114, 1979); herpes (Kit, Adv. Exp. Med. Biol.
215:219-236, 1989; Patente de los Estados Unidos n.° 5.288.641); y lentivirus, tales como el VIH (Poznansky, J. Virol. 65:532-536, 1991).
Los procedimientos para construir vectores son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión incluyen típicamente uno o más elementos de control que están unidos operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. La expresión "elementos de control" se refiere de manera colectiva a regiones promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores corriente arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma ("IRES"), potenciadores y similares, que colectivamente posibilitan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que todos estos elementos de control estén siempre presentes, siempre que la secuencia codificante seleccionada pueda replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedadora adecuada. Los elementos de control se seleccionan en función de una serie de factores conocidos por los expertos en la materia, tales como las células hospedadoras específicas y la fuente o las estructuras de otros componentes del vector. Para mejorar la expresión de un polipéptido inmunogénico de PAA, puede proporcionarse una secuencia Kozak corriente arriba de la secuencia que codifica el polipéptido inmunogénico de PAA. Para vertebrados, una secuencia Kozak conocida es (GCC)NCCATGG, en la que N es A o G y GCC está menos conservado. Las secuencias Kozak ejemplares que pueden usarse incluyen a CcAUGG y ACcAt GG.
E. COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN UN POLIPÉPTIDO INMUNOGÉNICO DE PAA (COMPOSICIONES DE POLIPÉPTIDOS)
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden uno o más polipéptidos inmunogénicos de pAa aislados proporcionados por la presente divulgación ("composición de polipéptidos"). En algunas realizaciones, la composición polipeptídica es una composición inmunogénica útil para provocar una respuesta inmunitaria contra una proteína PAA en un mamífero, tal como un ratón, perro, primates no humanos o seres humanos. En algunas realizaciones diferentes, la composición polipeptídica es una composición de vacuna útil para la inmunización de un mamífero, tal como un ser humano, para inhibir la proliferación celular anormal, para proporcionar protección contra el desarrollo del cáncer (usado como profiláctico) o para el tratamiento de trastornos (usados como agente terapéutico) asociados con la sobreexpresión de PAA, tales como cánceres, en particular el cáncer de próstata.
Una composición polipeptídica proporcionada por la presente divulgación puede contener un solo tipo de polipéptido inmunogénico de PAA, tal como un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA o un polipéptido inmunogénico de PSCA. Una composición también puede contener una combinación de dos o más tipos diferentes de polipéptidos inmunogénicos de PAA. Por ejemplo, una composición polipeptídica puede contener polipéptidos inmunogénicos de PAA en cualquiera de las siguientes combinaciones:
1) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSA;
2) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido de PSCA; o
3) un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido de PSCA.
Una composición inmunogénica o una composición de vacuna proporcionada por la presente divulgación puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables para composiciones inmunogénicas o de vacunas son conocidos en la técnica. Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen aceites biocompatibles, tales como aceite de colza, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de jojoba, escualano, escualeno, solución salina fisiológica, conservantes y agentes de control de la presión osmótica, gases portadores, agentes de control del pH, disolventes orgánicos, agentes hidrófobos, inhibidores enzimáticos, polímeros absorbentes de agua, tensioactivos, promotores de la absorción, modificadores del pH y agentes antioxidantes.
El polipéptido inmunogénico de PAA en una composición, particularmente una composición inmunogénica o una composición de vacuna, puede estar unido a, conjugado con o de otro modo incorporado en un vehículo para su administración a un receptor. El término "vehículo" se refiere a una sustancia o estructura a la que puede unirse o asociarse de otro modo un polipéptido inmunogénico para el suministro del polipéptido inmunogénico al receptor (por ejemplo, paciente). El propio vehículo puede ser inmunogénico. Los ejemplos de vehículos incluyen polipéptidos inmunogénicos, islas de CpG inmunitarias, hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide tetánico (TT), subunidad B de la toxina del cólera (CTB), bacterias o envolturas bacterianas, liposoma, quitosoma, virosomas, microesferas, células dendríticas o similares. Pueden unirse una o más moléculas de polipéptido inmunogénico de PAA a una sola molécula de vehículo. Los procedimientos para unir un polipéptido inmunogénico a un portador son conocidos en la técnica,
Una composición de vacuna o una composición inmunogénica proporcionada por la presente divulgación se puede usar junto con uno o más moduladores o adyuvantes inmunitarios. Los moduladores o adyuvantes inmunitarios pueden formularse por separado de la composición de la vacuna o pueden ser parte de la misma formulación de la composición de la vacuna. Por lo tanto, en una realización, la composición de vacuna comprende además uno o más moduladores o adyuvantes inmunitarios. A continuación en el presente documento se proporcionan ejemplos de moduladores y adyuvantes inmunitarios.
Las composiciones polipeptídicas, incluyendo las composiciones inmunogénicas y de vacuna, puede prepararse en cualquier forma de dosificación adecuada, tal como formas líquidas (por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones) y formas sólidas (por ejemplo, cápsulas, comprimidos o polvos) y mediante procedimientos conocidos por un expertos en la materia.
F. COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN UNA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO INMUNOGÉNICA DE PAA (COMPOSICIONES DE ÁCIDO NUCLEICO)
La presente divulgación también proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o un vector proporcionado por la presente divulgación (en el presente documento "composición de ácido nucleico"). Las composiciones de ácido nucleico son útiles para provocar una respuesta inmunitaria contra una proteína de PAA in vitro o in vivo en un mamífero, incluyendo un ser humano.
En algunas realizaciones particulares, la composición de ácido nucleico es una composición de vacuna de ADN para su administración a seres humanos para inhibir la proliferación celular anormal, proporcionar protección contra el desarrollo del cáncer (usada como agente profiláctico) o para el tratamiento del cáncer (usada como agente terapéutico) asociado con la sobreexpresión de PAA o para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA humano particular, tal como PSMA, PSA y PSCA. La molécula de ácido nucleico en la composición puede ser una molécula de ácido nucleico "desnuda", es decir, simplemente en la forma de un ADN aislado libre de elementos que promueven la transfección o la expresión. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico en la composición puede incorporarse en un vector.
Una composición de ácido nucleico proporcionada por la presente divulgación puede comprender moléculas de ácido nucleico aisladas individuales, codificando cada una solo un tipo de polipéptido inmunogénico de PAA, tal como un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA o un polipéptido inmunogénico de PSCA.
Una composición de ácido nucleico puede comprender una construcción multi-antígeno proporcionada por la presente divulgación que codifica dos o más tipos de polipéptidos inmunogénicos de PAA. Un construcción multiantígeno puede codificar dos o más polipéptidos inmunogénicos de PAA en cualquiera de las siguientes combinaciones:
1) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSA;
2) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSCA;
3) un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA; y
4) un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA.
Las composiciones de ácidos nucleicos, incluyendo las composiciones de vacuna de ADN, pueden comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables para composiciones de ácido nucleico, incluyendo composiciones de vacuna de ADN, se conocen bien por los expertos en la materia e incluyen azúcares, etc. Dichos excipientes pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de excipientes no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los ejemplos del excipiente acuoso incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados. Los excipientes adecuados también incluyen agentes que ayudan en la captación celular de la molécula de polinucleótido. Los ejemplos de dichos agentes son (i) agentes químicos que modifican la permeabilidad celular, tales como bupivacaína, (ii) liposomas o partículas víricas para la encapsulación del polinucleótido o (iii) lípidos catiónicos o sílice, oro o micropartículas de wolframio que se asocian con los polinucleótidos. Los liposomas aniónicos y neutros son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990), para una descripción detallada de procedimientos para producir liposomas) y son útiles para administrar una gran variedad de productos, incluyendo polinucleótidos. También se conocen en la técnica lípidos catiónicos y se usan habitualmente para el suministro de genes. Dichos lípidos incluyen Lipofectin.TM., también conocido como DOTMA (cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio), DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano), DDAB (bromuro de dimetildioctadecil-amonio), DOGS (dioctadecilamidoglicil espermina) y derivados del colesterol como DCChol (3 beta-(N-(N',N'-dimetilaminometano)-carbamoil)colesterol). Puede encontrarse una descripción de estos lípidos catiónicos en los documentos EP 187.702, WO 90/11092, Patente de los Estados Unidos n.° 5.283.185, WO 91/15501, WO 95/26356 y Patente de los Estados Unidos n.° 5.527.928. Una formulación de lípido catiónico útil particular que puede usarse con la vacuna de ácido nucleico proporcionada por la divulgación es VAXFECTIN, que es una mezcla íntima de un lípido catiónico (GAP-DMORIE) y un fosfolípido neutro (DPyPE) que, cuando se combina en un vehículo acuoso, se autoensambla para formar liposomas.
Los lípidos catiónicos para la administración de genes se usan preferentemente en asociación con un lípido neutro, tal como DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina), como se describe en el documento WO 90/11092 como un ejemplo. Además, una vacuna de ADN también se puede formular con un copolímero de bloque no iónico como CRL1005. G. USOS DE LOS POLIPÉPTIDOS, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO Y COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS DE PAA
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona procedimientos para usar los polipéptidos inmunogénicos de PAA, moléculas de ácido nucleico aisladas y composiciones que comprenden un polipéptido inmunogénico de PAA o molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA en un mamífero, en particular, un ser humano, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de (1) un polipéptido inmunogénico de PAA proporcionado por la divulgación que es inmunogénico contra el PAA diana, (2) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicho polipéptido inmunogénico de PAA, (3) una composición que comprende un polipéptido inmunogénico de PAA de este tipo o (4) una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicho polipéptido inmunogénico de PAA.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria contra PSMA en un ser humano, que comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de una composición inmunogénica de PSMA proporcionada por la presente divulgación, en el que la composición inmunogénica de PSMA se selecciona entre: (1) un polipéptido inmunogénico de PSMA, (2) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA, (3) una composición que comprende un polipéptido inmunogénico de PSMA o (4) una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA.
En algunas realizaciones diferentes, la divulgación proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria contra el PSA en un ser humano, que comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de una composición inmunogénica de PSA proporcionada por la presente divulgación, en el que la composición inmunogénica de PSA se selecciona entre: (1) un polipéptido inmunogénico de PSA, (2) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido inmunogénico de PSA, (3) una composición que comprende un polipéptido inmunogénico de PSA o (4) una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido inmunogénico de PSA.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación celular anormal en un ser humano, en el que la proliferación celular anormal está asociada con la sobreexpresión de un PAA. El procedimiento comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de composición de PAA inmunogénica proporcionada por la presente divulgación que es inmunogénica contra el PAA sobreexpresado. La composición inmunogénica de PAA puede ser (1) un polipéptido inmunogénico de PAA, (2) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno o más polipéptidos inmunogénicos de PAA, (3) una composición que comprende un polipéptido inmunogénico de PAA o (4) una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno o más polipéptidos inmunogénicos de PAA. En algunas realizaciones, el procedimiento es para inhibir la proliferación celular anormal en la próstata en un ser humano. En una realización particular, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación celular anormal en próstata que sobreexpresa PSMA, que comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de (1) un polipéptido inmunogénico de PSMA, (2) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno o más polipéptidos inmunogénicos de PSMA, (3) una composición que comprende un polipéptido inmunogénico de PSMA, o (4) una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno o más polipéptidos inmunogénicos de PSMA.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar el cáncer en un ser humano en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de un PAA. El procedimiento comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de composición inmunogénica de PAA capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra el PAA sobreexpresado. La composición inmunogénica de PAA puede ser (1) un polipéptido inmunogénico de PAA, (2) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno o más polipéptidos inmunogénicos de PAA, (3) una composición que comprende un polipéptido inmunogénico de PAA o (4) una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica uno o más polipéptidos inmunogénicos de PAA. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse con el procedimiento incluyen cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer de ovarios, cáncer broncopulmonar, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de próstata en un ser humano, que comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de una composición de ácido nucleico proporcionada anteriormente en el presente documento. Los ácidos nucleicos en la composición pueden codificar solo un polipéptido inmunogénico de PAA particular, tal como un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA o un polipéptido inmunogénico de PSCA. Los ácidos nucleicos en la composición también pueden codificar dos o más polipéptidos inmunogénicos de PAA diferentes, tales como: (1) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSA; (2) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSCA; (3) un polipéptido inmunogénico de pSa y un polipéptido inmunogénico de PSCA; (4) un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA. Cada molécula de ácido nucleico individual en la composición puede codificar solo un polipéptido inmunogénico de PAA particular, tal como un polipéptido de PSMA, un polipéptido de PSA o un polipéptido de PSCA. Como alternativa, una molécula de ácido nucleico individual en la composición puede ser una construcción multiantigénica que codifica dos tipos diferentes de polipéptidos inmunogénicos de PAA, tales como: (1) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSA; (2) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSCA; (3) un polipéptido inmunogénico de PSCA y un polipéptido inmunogénico de PSA; o (4) un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA. En algunas realizaciones particulares, la composición de ácido nucleico comprende una construcción multi-antígeno que codifica al menos (4) un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA. El polipéptido inmunogénico de PSCA contenido en las composiciones de vacuna o expresado por un ácido nucleico en composiciones de vacuna para el tratamiento del cáncer de próstata en seres humanos es preferentemente la proteína humana de PSCA de longitud completa.
Las composiciones de polipéptidos y ácidos nucleicos pueden administrarse a un animal, incluyendo seres humanos, mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Los ejemplos de procedimientos adecuados incluyen: (1) administración intramuscular, intradérmica, intraepidérmica, intravenosa, intraarterial, subcutánea o intraperitoneal, (2) administración oral y (3) aplicación tópica (tal como aplicación ocular, intranasal e intravaginal). Un procedimiento particular de administración intradérmica o intraepidérmica de una composición de vacuna de ácido nucleico que se puede usar es el suministro de pistola génica utilizando el dispositivo de administración de vacuna de administración epidérmica mediada por partículas (PMED™) comercializado por PowderMed. PMED es un procedimiento sin agujas para administrar vacunas a animales o seres humanos. El sistema PMED implica la precipitación de ADN sobre partículas microscópicas de oro que luego son impulsadas por gas helio hacia la epidermis. Las partículas de oro recubiertas de a Dn se administran a las APC y queratinocitos de la epidermis y una vez dentro de los núcleos de estas células, el ADN se eluye del oro y se vuelve transcripcionalmente activo, produciendo proteína codificada. Las APC presentan esta proteína a los linfocitos para inducir una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. Otro procedimiento particular para la administración intramuscular de una vacuna de ácido nucleico proporcionada por la presente divulgación es la electroporación. La electroporación utiliza impulsos eléctricos controlados para crear poros temporales en la membrana celular, lo que facilita la captación celular de la vacuna de ácido nucleico inyectada en el músculo. Cuando se utiliza un CpG en combinación con una vacuna de ácido nucleico, se prefiere que el CpG y la vacuna de ácido nucleico se formulen de manera conjunta en una formulación y la formulación se administra por vía intramuscular mediante electroporación.
La cantidad eficaz del polipéptido inmunogénico de PAA o ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico de PAA en la composición a administrar en un procedimiento dado proporcionado por la presente divulgación puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica y dependerá de varios factores. En un procedimiento de tratamiento del cáncer, tal como cáncer de próstata, los factores que pueden tomarse en consideración para determinar la cantidad eficaz del polipéptido o ácido nucleico inmunogénico de PAA incluyen, pero sin limitación: (1) el sujeto que se vaya a tratar, incluyendo el estado inmunitario y la salud general del sujeto, (2) la gravedad o estadio del cáncer a tratar, (3) los polipéptidos inmunogénicos de PAA específicos utilizados o expresados, (4) el grado de protección o tratamiento deseado, (5) el procedimiento y la pauta de administración y (6) otros agentes terapéuticos (como adyuvantes o inmunomoduladores) utilizados. En el caso de composiciones de vacunas de ácido nucleico, incluyendo las composiciones de vacuna multiantígeno, el procedimiento de formulación y administración se encuentran entre los factores clave para determinar la dosis de ácido nucleico requerida para provocar una respuesta inmunitaria eficaz. Por ejemplo, las cantidades eficaces del ácido nucleico pueden encontrarse en el intervalo de 2 pg/dosis - 10 mg/dosis cuando la composición de vacuna de ácido nucleico se formula como una solución acuosa y se administra mediante inyección con aguja hipodérmica o inyección neumática, mientras que solo se necesitarían 16 ng/dosis - 16 pg/dosis cuando el ácido nucleico se prepara como partículas microscópicas de oro recubiertas administradas usando una tecnología de pistola génica. El intervalo de dosis para una vacuna de ácido nucleico mediante electroporación se encuentra generalmente en el intervalo de 0,5 - 10 mg/dosis. En los casos en los que la vacuna de ácido nucleico se administra junto con un CpG mediante electroporación en una formulación conjunta, la dosis de la vacuna de ácido nucleico puede encontrarse en el intervalo de 0,5 - 5 mg/dosis y la dosis de CpG se encuentra normalmente en el intervalo de 0,05 mg - 5 mg/dosis, tal como 0,05, 0,2, 0,6 o 1,2 mg/dosis por persona.
La composición de vacuna de ácido nucleico o polipéptido de la presente invención puede usarse en una estrategia de cebado-refuerzo para inducir una respuesta inmunitaria robusta y duradera. Se conocen bien protocolos de vacunación de cebado y refuerzo basados en inyecciones repetidas de la misma construcción inmunogénica. En general, la primera dosis puede no producir inmunidad protectora, sino que solo "ceba" al sistema inmunitario. Una respuesta inmunitaria protectora se desarrolla después de las dosis segunda o tercera (los "refuerzos"). Los refuerzos se realizan de acuerdo con técnicas convencionales y pueden optimizarse aún más empíricamente en términos de pauta de administración, vía de administración, elección del adyuvante, dosis y secuencia potencial cuando se administran con otra vacuna. En una realización, las vacunas de ácido nucleico o polipéptido de la presente divulgación se usan en una estrategia de cebado-refuerzo homóloga convencional, en la que se administra la misma vacuna al animal en dosis múltiples. En otra realización, las composiciones de vacuna de ácido nucleico o polipéptido se utilizan en una en una vacunación de cebado-refuerzo heteróloga, en la que se administran diferentes tipos de vacunas que contienen los mismos antígenos a intervalos de tiempo predeterminados. Por ejemplo, puede administrarse una construcción de ácido nucleico en forma de un plásmido en la dosis inicial ("cebado") y como parte de un vector en las dosis posteriores ("refuerzos") o viceversa.
Para el tratamiento del cáncer de próstata, las vacunas de polipéptidos o ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden usarse junto con vacunas para el cáncer de próstata basadas en otros antígenos, tales como antígenos a base de fosfatasa ácida prostática y receptor de andrógenos.
La composición de vacuna polipeptídica o de ácido nucleico de la presente divulgación se puede usar junto con uno o más adyuvantes. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen: (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como polipéptidos de muramilo o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo (a) MF59 ™ (Publicación PCT n.° WO 90/14837; Capítulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell y Newman, Plenum Press 1995), que contiene un 5 % de escualeno, un 0,5 % de Tween 80 (moonoleato de polioxietileno sorbitán) y un 0,5 % de Span 85 (trioleato de sorbitán) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador, (b) SAF, que contiene escualeno al 10 %, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado con pluronic y thr-MDP o microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión con mayor tamaño de partícula y (c) sistema adyuvante RIBI™ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene un 2 % de escualeno, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular tales como monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS); (2) adyuvantes de saponina, tales como QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), Abisco® (Isconova, Suecia) o Iscomatrix® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia); (3) adyuvante de completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (4) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (Publicación PCT n.° WO 99/44636), etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (Tn F), etc.; (5) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL), opcionalmente en ausencia sustancial de alumbre cuando se usa con sacáridos neumocócicos (por ejemplo, GB-2220221, EP-A-0689454, WO 00/56358); (6) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (por ejemplo, EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231); (7) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG, es decir, que contienen al menos un dinucleótido CG, en el que la citosina no está metilada (por ejemplo, Krieg, Vaccine (2000) 19:618-622; Krieg, Curr Opin Mol Ther (2001) 3:15-24; documentos WO 98/40100, Wo 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581); (8) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno (por ejemplo, WO 99/52549); (9) un tensioactivo de éster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol (por ejemplo, documento WO 01/21207) o un tensioactivo de alquil éter o éster de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional, tal como octoxinol (por ejemplo, documento WO 01/21152); (10) una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) (por ejemplo, documento WO 00/62800); (11) sal de metal, incluyendo sales de aluminio (tales como alumbre, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio); (12) una saponina y una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, WO 99/11241); (13) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IM2 (opcionalmente un esterol) (por ejemplo, WO 98/57659); (14) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición, tales como polipéptidos de muramilo que incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-25 acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutarninil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina, MTP-PE), (15) ligandos para receptores de tipo toll (TLR), naturales o sintetizados (por ejemplo, Kanzler y col., Nature Med. 13:1552-1559 (2007)), incluyendo ligandos de TLR3, tales como polyl:C y compuestos similares tales como Hiltonol y Ampligen.
Las composiciones de vacuna de polipéptidos o ácidos nucleicos de la presente divulgación se pueden usar junto con uno o más moduladores inmunitarios. Los ejemplos de moduladores inmunitarios incluyen inhibidores de proteína tirosina cinasa (tales como afatinib, axitinib, cediranib, erlotinib, gefitinib, grandinin, lapatinib, lestaurtinib, neratinib, pazopanib, quizartinib, regorafenib, semaxanib, sorafenib, sunitinib, tivozanib, toceranib, bosutinib y vandetanib), agonistas de CD40 (tales como anticuerpos agonistas de CD40), agonistas de OX40 (tales como anticuerpos agonistas de OX40), inhibidores de CTLA-4 (tales como los anticuerpos anti-CTLA-4 Ipilimumab y Tremelimumab), agonistas de TLR, agonistas de 4-1BB, antagonistas de Tim-1, antagonistas de LAGE-3 y antagonistas de PD-L1 y PD-1.
H. REGÍMENES DE INMUNOTERAPIA A BASE DE VACUNAS (VBIR)
En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico en un mamífero, en particular, un ser humano. El procedimiento comprende administrar al mamífero que recibe la vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de células inmunosupresoras (inhibidor de ISC) y (2) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de células efectoras (potenciador de IEC). El procedimiento se puede utilizar en combinación con una vacuna en cualquier forma o formulación, por ejemplo, una vacuna de subunidades, una vacuna a base de proteínas, una vacuna a base de péptidos o una vacuna a base de ácidos nucleicos, tal como una vacuna a base de ADN, una vacuna a base de ARN, una vacuna a base de plásmidos o una vacuna a base de vectores. Además, el procedimiento no se limita a ningún tipo particular de vacunas ni a ningún tipo particular de cáncer. En su lugar, el procedimiento se puede utilizar en combinación con cualquier vacuna prevista para el tratamiento del trastorno neoplásico, incluyendo trastornos neoplásicos benignos, premalignos y malignos. Por ejemplo, el procedimiento se puede usar en combinación con una vacuna que está diseñada para el tratamiento de cualquiera de los siguientes trastornos neoplásicos: carcinoma, incluyendo el de vejiga (incluyendo cáncer de vejiga acelerado y metastásico), mama, colon (incluyendo cáncer colorrectal), riñón, hígado, pulmón (incluyendo cáncer de pulmón microcítico y no microcítico y adenocarcinoma de pulmón), ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (incluyendo carcinoma pancreático exocrino), esófago, estómago, vesícula biliar, cuello de útero, tiroides y piel (incluyendo carcinoma escamocelular); tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, tricoleucemia, linfoma histiocítico y linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide y leucemia promielocítica; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma; melanoma, melanoma maligno en estadio III o IV no reseccionable, carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, glioma, cánceres gastrointestinales, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma multiforme, cáncer de cuello de útero, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, cáncer de hueso, tumores óseos, histiocitoma fibroso maligno de hueso en adultos; histiocitoma fibroso maligno de hueso infantil, sarcoma, sarcoma pediátrico, linfoma sinonasal de linfocitos citolíticos naturales, neoplasias, neoplasia de células plasmáticas; síndromes mielodisplásicos; neuroblastoma; tumor testicular de células germinales, melanoma intraocular, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, sarcoma sinovial, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda positiva para el cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL), mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica y mastocitosis.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento del cáncer de próstata en un ser humano. La vacuna administrada puede ser capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra cualquier PAA humano, tal como PSMA, PSA o PSCA. En algunas realizaciones particulares, la vacuna administrada comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno capaz de provocar inmunogenicidad contra un PAA humano, tal como PSMA, PSA o PSCA. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico específicas que pueden estar contenidas en la vacuna incluyen lo siguiente proporcionado por la presente divulgación:
1) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA, o un polipéptido inmunogénico de PSCA;
2) una molécula de ácido nucleico que codifica dos polipéptidos inmunogénicos de PAA proporcionados por la presente divulgación, tal como a) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSA; b) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido de PSCA inmunogénico; o c) un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA; y
3) una molécula de ácido nucleico que codifica tres polipéptidos inmunogénicos de PAA, que son un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA.
En otro aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno neoplásico en un mamífero, en particular, un ser humano. El procedimiento comprende administrar al mamífero (1) una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un TAA asociado con el trastorno neoplásico, (2) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de células inmunosupresoras (inhibidor de ISC) y (3) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de las células efectoras inmunitarias (potenciador de IEC). Puede usarse en el procedimiento cualquier vacuna que sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un TAA particular. Se conocen en la técnica muchos tAa . Además de los antígenos asociados con la próstata, los siguientes son ejemplos de TAA conocidos en la técnica: CEA, MUC-1, Ep-CAM, 5T4, hCG-b, K-ras y TERT para el cáncer colorrectal; CEA, Muc-1, p53, mesotelina, Survivina y NY-ESO-1 para el cáncer de ovario; Muc-1, 5T4, WT-1, TERT, CEA, EGF-R y MAGE-A3 para cáncer de pulmón no microcítico; 5T4 para el carcinoma de células renales; y Muc-1, mesotelina, K-Ras, anexina A2, TERT y CEA para el cáncer pancreático. Se siguen identificando nuevos TAA. En el procedimiento se puede usar una vacuna que sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra cualquiera de los TAA conocidos o nuevos. Además, la vacuna administrada puede estar en cualquier forma o formulación, por ejemplo, vacunas de subunidades, vacuna a base de proteínas, vacunas a base de péptidos o vacunas a base de ácidos nucleicos, tales como vacunas a base de ADN, vacunas a base de ARN, vacunas a base de plásmidos o vacunas a base de vectores.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer de próstata en un ser humano, comprendiendo el procedimiento administrar al ser humano una vacuna capaz de generar una respuesta inmunitaria contra cualquier PAA humano, tal como PSMA, PSA o PSCA. En algunas realizaciones particulares, la vacuna administrada comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno capaz de provocar inmunogenicidad contra un PAA humano, tal como PSMA, PSA o PSCA. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico específicas que pueden estar contenidas en la vacuna incluyen lo siguiente proporcionado por la presente divulgación:
1) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA, o un polipéptido inmunogénico de PSCA;
2) una molécula de ácido nucleico que codifica dos polipéptidos inmunogénicos de PAA proporcionados por la presente divulgación, tal como a) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido inmunogénico de PSA; b) un polipéptido inmunogénico de PSMA y un polipéptido de PSCA inmunogénico; o c) un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSCA; y
3) una molécula de ácido nucleico que codifica tres polipéptidos inmunogénicos de PAA, que son un polipéptido inmunogénico de PSMA, un polipéptido inmunogénico de PSA y un polipéptido inmunogénico de PSMA.
El procedimiento para tratar un trastorno neoplásico en un mamífero y el procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico en un mamífero descrito anteriormente en el presente documento se denominan, como alternativa, "regímenes de inmunoterapia basados en vacunas" (o "VBIR").
En los regímenes de inmunoterapia basados en vacunas, pueden administrarse potenciadores de IEC e inhibidores de ISC mediante cualquier procedimiento y vía adecuados, incluyendo (1) administración sistémica, tal como administración intravenosa, intramuscular u oral y (2) administración oral, tal como administración intradérmica y subcutánea. Cuando sea apropiado o adecuado, generalmente se prefiere administración local frente a administración sistémica. Puede llevarse a cabo la administración local de cualquier potenciador de IEC e inhibidor de ISC en cualquier ubicación del organismo del mamífero que sea adecuada para la administración local de productos farmacéuticos; sin embargo, es más preferible que estos moduladores inmunitarios se administren localmente cerca de la vacuna que drena en los ganglios linfáticos.
Pueden administrarse dos o más potenciadores de IEC específicos de una sola clase de potenciadores de IEC (por ejemplo, dos agonistas de CLA), en combinación con los inhibidores de ISC. Además, pueden administrarse juntos dos o más potenciadores de IEC específicos de dos o más clases diferentes de potenciadores de IEC (por ejemplo, un antagonista de CTLA-4 y un agonista de TLR). De forma similar, pueden administrarse dos o más inhibidores de ISC específicos de una sola clase de inhibidores de ISC (por ejemplo, dos o más inhibidores de proteína cinasa) en combinación con los potenciadores de IEC. Además, pueden administrarse juntos dos o más inhibidores específicos de ISC de dos o más clases diferentes de inhibidores de ISC (por ejemplo, un inhibidor de proteína cinasa y un inhibidor de COX-2).
En los regímenes de inmunoterapia basados en la vacunas, la vacuna puede administrarse simultánea o secuencialmente con cualquiera o todos los moduladores inmunitarios (es decir, inhibidores de ISC y potenciadores de IEC) utilizados. De forma similar, cuando se usan dos o más moduladores inmunitarios, pueden administrarse de manera simultánea o secuencial respecto del otro. En algunas realizaciones, se administra una vacuna de manera simultánea (por ejemplo, en una mezcla) con respecto a un modulador inmunitario, pero secuencialmente con respecto a uno o más moduladores inmunitarios. La administración conjunta de la vacuna y los moduladores inmunitarios en el régimen de inmunoterapia a base de vacuna puede incluir casos en los que se administran la vacuna y al menos un modulador inmunitario, de tal forma que cada uno está presente en el sitio de administración, tal como una vacuna que drena en un ganglio linfático, al mismo tiempo, aunque el antígeno y los moduladores inmunitarios no se administren simultáneamente. La administración conjunta de la vacuna y los moduladores inmunitarios también puede incluir casos en los que la vacuna o el modulador inmunitario se eliminan del sitio de administración, pero persiste al menos un efecto celular de la vacuna eliminada o del modulador inmune en el sitio de administración, tal como una vacuna que drena en un ganglio linfático, al menos hasta que se administren uno o más moduladores inmunitarios adicionales en el sitio de administración. En los casos en los que se administra una vacuna en combinación con un CpG, la vacuna y el CpG pueden estar contenidos en una sola formulación y administrarse juntos mediante cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, la vacuna de ácido nucleico y CpG en una coformulación (mezcla) se administran por inyección intramuscular en combinación con electroporación.
Puede usarse cualquier inhibidor de ISC en los regímenes de inmunoterapia basados en vacunas. Los ejemplos de inhibidores de SIC incluyen inhibidores de proteína cinasa, inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2), inhibidores de fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5) y reticuladores de ADN. Los ejemplos de inhibidores de COX-2 incluyen celecoxib y rofecoxib. Los ejemplos de inhibidores de PDE5 incluyen avanafilo, lodenafilo, mirodenafilo, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, udenafilo y zaprinast. Un ejemplo de reticulador de ADN es ciclofosfamida. Los ejemplos de inhibidores de proteína cinasa específicos se describen en detalle a continuación.
La expresión "inhibidor de proteína cinasa" se refiere a cualquier sustancia que actúa como inhibidor selectivo o no selectivo de una proteína cinasa. La expresión "proteína cinasas" se refiere a las enzimas que catalizan la transferencia del fosfato terminal del adenosín trifosfato a restos de tirosina, serina o treonina en sustratos de proteína. Las proteínas cinasas incluyen tirosina cinasas receptoras y tirosina cinasas no receptoras. Los ejemplos de tirosina cinasas receptoras incluyen EGFR (por ejemplo, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-II1R, IRR (receptor relacionado con el receptor de insulina), PDGFR (por ejemplo, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (tirosina cinasa leucocitaria), ALK (cinasa de linfoma anaplásico), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3 y RTK 106. Los ejemplos de tirosina cinasas no receptoras incluyen BCR-Ab L, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK. En el régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación, los inhibidores de proteína cinasa se administran al mamífero en una dosis subóptima. La expresión "dosis subóptima" se refiere a la cantidad de dosis que se encuentra por debajo de la dosis eficaz mínima cuando se administra el inhibidor de tirosina cinasa en una monoterapia (es decir, cuando el inhibidor de proteína cinasa se administra solo sin ningún otro agente terapéutico) para el trastorno neoplásico diana.
Los ejemplos de inhibidores de proteína cinasa específicos adecuados para su uso en el régimen de inmunoterapia basada en vacuna incluyen Lapatinib, AZD 2171, ET18OCH 3, Indirrubina-3'-oxima, NSC-154020, PD 169316, quercetina, Roscovitina, Triciribina, ZD 1839, 5-lodotubercidina, Adafostina, Aloisina, Alsterpaulona, Aminogenisteína, API-2, Apigenina, Arctigenina, ARRY-334543, Axitinib (AG-013736), AY-22989, AZD 2171, Bisindolilmaleimida IX, CCI-779, Queleritrina, DMPQ, DRB, Edelfosina, ENMD-981693, análogo de erbstatina, Erlotinib, Fasudilo, Gefitinib (ZD1839), H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, Hidroxifasudilo, Kenpaulona, KN-62, KY12420, LFM-A13, Luteolina, LY294002, LY-294002, Malotoxina, ML-9, MLN608, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, Olomoucina, Oxindol I, PD 153035, PD 98059, Floridzina, Piceatanol, Picropodofilina, PKI, PP1, PP2, PTK787/ZK222584, PTK787/ZK222584, Purvalanol A, Rapamune, Rapamicina, Ro 31-8220, Rotlerina, SB202190, SB203580, Sirolimus, SL327, SP600125, Estaurosporina, STI-571, SU1498, SU4312, SU5416, SU5416 (Semaxanib), SU6656, SU6668, inhibidor de Syk, TBB, TCN, Tirfostina AG 1024, Tirfostina AG 490, Tirfostina AG 825, Tirfostina AG 957, U0126, W-7, Wortmanina, Y-27632, Zactima (ZD6474), ZM 252868. gefitinib (Iressa.RTM.), sunitinib malato (Sutent.RTM.; SU11248), erlotinib (Tarceva.RTM.; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec.RTM.; STI571), dasatinib (BMS-354825), leflunomida (SU101), vandetanib (Zactima.RTM.; ZD6474) y nilotinib. Los inhibidores de proteína cinasa adicionales adecuados para su uso en la presente invención se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.618.829, 5.639.757, 5.728.868, 5.804.396, 6.100.254, 6.127.374, 6.245.759, 6.306.874, 6.313.138, 6.316.444, 6.329.380, 6.344.459, 6.420.382, 6.479.512, 6.498.165, 6.544.988, 6.562.818, 6.586.423, 6.586.424, 6.740.665, 6.794.393, 6.875.767, 6.927.293 y 6.958.340.
En algunas realizaciones, el inhibidor de proteína cinasa es un inhibidor de múltiples cinasas, que es un inhibidor que actúa sobre más de una cinasa específica. Los ejemplos de inhibidores de múltiples cinasas incluyen imatinib, sorafenib, lapatinib, BIRB-796 y AZD-1152, AMG706, Zactima (ZD6474), MP-412, sorafenib (BAY 43-9006), dasatinib, CEP-701 (lestaurtinib), XL647, XL999, Tykerb (lapatinib), MLN518, (anteriormente conocido como CT53518), PKC412, ST1571, AEE 788, OSI-930, OSI-817, sunitinib malato (Sutent), axitinib (AG-013736), erlotinib, gefitinib, axitinib, bosutinib, temsirolismus y nilotinib (AMN107). En algunas realizaciones particulares, el inhibidor de tirosina cinasa es sunitinib, sorafenib o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable (como un malato o un tosilato) de sunitinib o sorafenib.
El sunitinib malato, comercializado por Pfizer Inc. con el nombre comercial de SUTENT, se describe químicamente como ácido butanodioico, hidroxi-, (2S)-, en compuesto con W-[2-(dietilamino)etil]-5-[(Z)-(5-fluoro-1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilidin)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida (1:1). El compuesto, su síntesis y polimorfos particulares se describen en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.573.293, las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 2003-0229229, 2003-0069298 and 2005-0059824 y en J. M. Manley, M. J. Kalman, B. G. Conway, C. C. Ball, J. L Havens y R. Vaidyanathan, "Early Amidation Approach to 3-[(4-amido)pyrrol-2-yl]-2-indol¡nones", J. Org. Chew. 68, 6447-6450 (2003). Las formulaciones de sunitinib y su sal de L-malato se describen en la Publicación PCT No. WO 2004/024127. El sunitinib malato ha sido aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, carcinoma avanzado de células renales y tumores neuroendocrinos pancreáticos progresivos bien diferenciados en pacientes con enfermedad localmente avanzada o metastásica no reseccionable. La dosis recomendada de sunitinib malato para el tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y el carcinoma avanzado de células renales (RCC) en seres humanos es de 50 mg por vía oral una vez al día, en una pauta de 4 semanas de tratamiento seguida de 2 semanas de descanso farmacológico (pauta 4/2). La dosis recomendada de sunitinib malato para los tumores neuroendocrinos pancreáticos (pNET) es de 37,5 mg, tomados por vía oral una vez al día.
En el régimen de inmunoterapia a base de vacunas, puede administrarse sunitinib malato por vía oral en una sola dosis o en múltiples dosis. Típicamente, el sunitinib malato se administra durante dos, tres, cuatro o más dosis semanales consecutivas seguidas de un período de "descanso farmacológico" de aproximadamente 1 o 2 semanas o más en las que no se administra sunitinib malato. En una realización, las dosis se administran durante aproximadamente 4 semanas, con 2 semanas de descanso farmacológico. En otra realización, el sunitinib malato se administra durante dos semanas, con 1 semana de descanso farmacológico. Sin embargo, también puede administrarse sin un periodo de "descanso farmacológico" durante el periodo de tratamiento completo. La cantidad eficaz de sunitinib malato administrada por vía oral a un ser humano en el régimen de inmunoterapia a base de vacunas es normalmente inferior a 40 mg por persona por dosis. Por ejemplo, puede administrarse por vía oral a razón de 37,5, 31,25, 25, 18,75, 12,5, 6,25 mg por persona por día. En algunas realizaciones, el sunitinib malato se administra por vía oral en el intervalo de 1 - 25 mg por persona por dosis. En algunas realizaciones diferentes, el sunitinib malato se administra por vía oral en el intervalo de 6,25, 12,5 o 18,75 mg por persona por dosis. Son previsibles otras pautas posológicas y variaciones y se determinarán mediante orientación médica.
El sorafenib tosilato, que se comercializa con el nombre comercial NEXAVAR, también es un inhibidor de múltiples cinasas. Su nombre químico es 4-(4-{3-[4-cloro-3-(trifluorometil)fenil]ureido}fenoxi)-N-metilpiridin-ine-2-carboxamida. Está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento del cáncer primario de riñón (carcinoma avanzado de células renales) y cáncer hepático primario avanzado (carcinoma hepatocelular). La dosis diaria recomendada es de 400 mg tomada por vía oral dos veces al día. En el régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación, la cantidad eficaz de sorafenib tosilato administrado por vía oral suele ser inferior a 400 mg por persona por día. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de sorafenib tosilato administrada por vía oral se encuentra en el intervalo de 10 - 300 mg por persona por día. En algunas realizaciones diferentes, la cantidad eficaz de sorafenib tosilato administrada por vía oral es de entre 10 - 200 mg por persona por día, tal como 10, 20, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 o 200 mg por persona por día.
Axitinib, que se comercializa con el nombre comercial INLYTA, es un inhibidor selectivo de los receptores de VEGF 1, 2 y 3. Su nombre químico es (N-metil-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)-1H-indazol-6-ilsulfanil]-benzamida. Está aprobado para el tratamiento del carcinoma de células renales avanzado después del fracaso con una terapia sistémica previa. La dosis inicial es de 5 mg por vía oral dos veces al día. Pueden efectuarse ajustes de la dosis basándose en la seguridad y tolerabilidad individual. En el régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral es normalmente inferior a 5 mg dos veces al día. En algunas realizaciones diferentes, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral es de entre 1-5 mg dos veces al día. En algunas realizaciones diferentes, la cantidad eficaz de axitinib administrada por vía oral es de entre 1, 2, 3, 4 o 5 mg dos veces al día.
En los regímenes de inmunoterapia basados en la vacuna, se puede utilizar cualquier potenciador de IEC. Pueden ser moléculas pequeñas o moléculas grandes (tales como proteínas, polipéptido, a Dn , ARN y anticuerpo). Los ejemplos de potenciadores de IEC que pueden usarse incluyen agonistas de TNFR, antagonistas de CTLA-4, agonistas de TLR, antagonistas de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) (tal como BMS-936558), anticuerpo CT-011 anti-PD-1 y antagonistas del ligando 1 de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-L1) (tal como BMS-936559), antagonistas del gen 3 de activación de linfocitos (LAG3) y antagonistas de la molécula que contienen dominios de inmunoglobulina y mucina-3 de linfocitos T (TIM-3). Los ejemplos específicos de agonistas de TNFR, antagonistas de CTLA-4 y agonistas de TLR se proporcionan en detalle a continuación en el presente documento.
Agonistas de TNFR.
Los ejemplos de agonistas de TNFR incluyen los agonistas de OX40, 4-1BB (tal como BMS-663513), GITR (tal como TRX518) y CD40. Los ejemplos de agonistas de CD40 específicos se describen en detalle a continuación en el presente documento.
Los agonistas de CD40 son sustancias que se unen a un receptor de CD40 en una célula y son capaces de aumentar una o más actividades asociadas con CD40 o CD40L. Por lo tanto, los "agonistas" de CD40 abarcan "ligandos" de CD40.
Los ejemplos de agonistas de CD40 incluyen anticuerpos agonistas de CD40, fragmentos de anticuerpos agonistas de CD40, ligandos de CD40 (CD40L) y fragmentos y derivados de CD40L, tales como proteínas de fusión oligoméricas (por ejemplo, CD40L bivalente trimérico) y variantes de las mismas.
Los ligandos de CD40 para su uso en la presente invención incluyen cualquier péptido, polipéptido o proteína o un ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína que puede unirse y activar uno o más receptores de CD40 en una célula. Se describen ligandos de CD40 adecuados, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 6.482.411, 6.410.711; la Patente de los Estados Unidos n.° 6.391.637; y la Patente de los Estados Unidos n.° 5.981.724. Aunque se preferirán ligandos de CD40 humanos para su uso en terapia en seres humanos, pueden usarse ligandos de CD40 de cualquier especie en la invención. Para su uso en otras especies animales, tal como en realizaciones veterinarias, se preferirá una especie de ligando de CD40 coincidente con la del animal que se esté tratando. En determinadas realizaciones, el ligando de CD40 es un péptido u oligómero de proteína gp39, incluyendo oligómeros de péptido, polipéptido o proteína de gp39, así como péptidos, polipéptidos, proteínas (y ácidos nucleicos codificantes) de gp39 que comprenden una secuencia de oligomerización. Aunque en ciertos aspectos de la invención se prefieren oligómeros, tales como dímeros, trímeros y tetrámeros, en otros aspectos de la invención se contemplan para su uso estructuras oligoméricas más grandes, siempre que la estructura oligomérica conserve la capacidad de unirse y activar uno o más receptores de CD40.
En ciertas realizaciones diferentes, el agonista de CD40 es un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD40 humano, humanizado o parcialmente humano. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales específicos anti-CD40 incluyen los anticuerpos monoclonales G28-5, mAb89, EA-5 o S2C6 y CP870893. En una realización particular, el anticuerpo agonista anti-CD40 es CP870893 o dacetuzumab (SGN-40).
CP-870.893 es un anticuerpo monoclonal (mAb) agonista de CD40 completamente humano que se ha investigado clínicamente como una terapia antitumoral. La estructura y preparación de CP870.893 se desvelan en el documento WO2003041070 (en el que el anticuerpo se identifica con el identificador interno "21.4.1"). Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de CP-870.893 se exponen en la SEQ ID NO: 40 y la SEQ ID NO: 41, respectivamente. En ensayos clínicos, se administró CP870.893 mediante infusión intravenosa a dosis generalmente en el intervalo de 0,05 - 0,25 mg/kg por infusión. En un estudio clínico de fase I, la dosis máxima tolerada (DMT) de CP-870893 se estimó en 0,2 mg/kg y las toxicidades limitantes de la dosis incluyeron CRS de grado 3 y urticaria de grado 3. [Jens Ruter y col.: Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40 antibody in a phase I study of patients with advanced solid tumors. Cancer Biology & Therapy 10:10, 983-993; 15 de noviembre de 2010]. En el régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación, CP-870.893 puede administrarse por vía intradérmica, subcutánea o tópica. Se prefiere que se administre por vía intradérmica. La cantidad eficaz de CP870893 que se administrará en el régimen generalmente es inferior a 0,2 mg/kg, por lo general en el intervalo de 0,01 mg - 0,15 mg/kg o de 0,05 - 0,1 mg/kg.
Dacetuzumab (también conocido como SGN-40 o huS2C6; número CAS 88-486-59-9) es otro anticuerpo agonista anti-CD40 que se ha investigado en ensayos clínicos para linfomas indolentes, linfomas difusos de linfocitos B grandes y mieloma múltiple. En los ensayos clínicos, se administró dacetuzumab por vía intravenosa en dosis semanales que oscilaron entre 2 mg/kg y 16 mg/kg. En el régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación, puede administrarse dacetuzumab por vía intradérmica, subcutánea o tópica. Se prefiere que se administre por vía intradérmica. La cantidad eficaz de dacetuzumab que se administrará en el régimen de inmunoterapia basado en vacuna generalmente es inferior a 16 mg/kg, por lo general en el intervalo de 0,2 mg -14 mg/kg o 0,5 -8 mg/kg o 1 - 5 mg/kg.
Inhibidores de CTLA-4.
Los agentes antagonistas anti-CTLA-4 adecuados para su uso en el régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la divulgación incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-CTLA-4 (tales como anticuerpos humanos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-CTLA-4 de ratón, anticuerpos anti-CTLA-4 de mamíferos, anticuerpos anti-CTLA-4 humanizados, anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4, anticuerpos policlonales anti-CTLA-4, anticuerpos quiméricos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-dominio de CTLA-4), fragmentos de anticuerpos anti-CTLA-4 (tales como fragmentos monocatenarios anti-CTLA-4, fragmentos de cadena pesada anti-CTLA-4 y fragmentos de cadena ligera anti-CTLA-4) e inhibidores de CTLA-4 que agonizan la vía coestimuladora. En algunas realizaciones, el inhibidor de CTLA-4 es Ipilimumab o Tremelimumab.
Ipilimumab (también conocido como MEX-010 o MDX-101), comercializado como YERVOY, es un anticuerpo humano anti-CTLA-4 humano. Ipilimumab también puede citarse por su número de registro CAS, 477202-00-9 y se desvela como el anticuerpo l0DI en la publicación PCT n.° WO 01/14424. Se proporcionan ejemplos de una composición farmacéutica que comprenden Ipilimumab en la Publicación PCT n.° WO 2007/67959. Ipilimumab está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento del melanoma no reseccionable o metastásico. La dosis recomendad de Ipilimumab como monoterapia es de 3 mg/kg por administración intravenosa cada 3 semanas durante un total de 4 dosis. En los procedimientos proporcionados por la presente divulgación, Ipilimumab se administra por vía local, particularmente por vía intradérmica o subcutánea. La cantidad eficaz de Ipilimumab administrada localmente está generalmente en el intervalo de 5 - 200 mg/dosis por persona. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de Ipilimumab está en el intervalo de 10 - 150 mg/dosis por persona por dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de Ipilimumab es de aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 mg/dosis por persona.
Tremelimumab (también conocido como CP-675.206) es un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano y tiene el número CAS 745013-59-6. Tremelimumab se desvela como el anticuerpo 11.2.1 en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.682.736. Las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de Tremelimumab se exponen en las SEQ ID NO: 42 y 43, respectivamente. Tremelimumab se ha investigado en ensayos clínicos para el tratamiento de varios tumores, incluyendo melanoma y cáncer de mama; en los que se administró Tremelimumab por vía intravenosa o bien como una sola dosis o en múltiples dosis cada 4 o 12 semanas en el intervalo de dosis entre 0,01 y 15 mg/kg. En los regímenes proporcionados por la presente divulgación, Tremelimumab se administra por vía local, particularmente por vía intradérmica o subcutánea. La cantidad eficaz de Tremelimumab administrada por vía intradérmica o subcutánea está típicamente en el intervalo de 5 - 200 mg/dosis por persona. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de Tremelimumab está en el intervalo de 10 - 150 mg/dosis por persona por dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de Tremelimumab es de aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 mg/dosis por persona.
Agonistas de los receptores de tipo Toll (TLR).
La expresión "agonista de receptores de tipo Toll" o "agonista de TLR" se refiere a un compuesto que actúa como agonista de un receptor de tipo Toll (TLR). Esto incluye agonistas de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 y TLR11 o una combinación de los mismos. Salvo que se indique otra cosa, la referencia a un compuesto agonista de TLR puede incluir el compuesto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier isómero (por ejemplo, diastereómero o enantiómero), sal, solvato, polimorfo y similares. En particular, si un compuesto es ópticamente activo, la referencia al compuesto puede incluir cada uno de los enantiómeros del compuesto, así como mezclas racémicas de los enantiómeros. Asimismo, un compuesto puede identificarse como un agonista de uno o más TLR concretos (por ejemplo, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 o un agonista de TLR7/8).
El agonismo de TLR para un compuesto particular puede evaluarse de cualquier manera adecuada conocida en la técnica. Independientemente del ensayo particular empleado, puede identificarse un compuesto como un agonista de un TLR particular si realizar el ensayo con un compuesto da como resultado al menos un aumento de umbral de alguna actividad biológica mediada por el TLR particular. Por el contrario, puede identificarse que un compuesto no actúa como agonista de un TLR específico si, cuando se usa para llevar a cabo un ensayo diseñado para detectar actividad biológica mediada por el TLR específico, el compuesto no logra provocar un aumento de umbral en la actividad biológica. Salvo que se indique otra cosa, un aumento en la actividad biológica se refiere a un aumento en la misma actividad biológica sobre la observada en un control adecuado. Puede llevarse a cabo o no un ensayo junto con el control adecuado. Con la experiencia, un experto en la materia puede desarrollar una familiaridad suficiente con un ensayo particular (por ejemplo, el intervalo de valores observados en un control adecuado en condiciones de ensayo específicas) como para que no sea siempre necesario llevar a cabo un control para determinar el agonismo TLR de un compuesto en un ensayo particular.
Ciertos agonistas de TLR útiles en el procedimiento de la presente invención son moléculas pequeñas orgánicas, a diferencia de las moléculas biológicas grandes, tales como proteínas, péptidos y similares. Los ejemplos de agonistas de TLR de molécula pequeña incluyen los desvelados en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.689.338; 4.929.624; 4.988.815; 5.037.986; 5.175.296; 5.238.944; 5.266.575; 5.268.376; 5.346.905; 5.352.784; 5.367.076; 5.389.640; 5.395.937; 5.446.153; 5.482.936; 5.693.811; 5.741.908; 5.756.747; 5.939.090; 6.039.969; 6.083.505; 6.110.929; 6.194.425; 6.245.776; 6.331.539; 6.376.669; 6.451.810; 6.525.064; 6.545.016; 6.545.017; 6.558.951; y 6.573.273. Los ejemplos de agonistas de TLR de molécula pequeña específicos útiles en los procedimientos proporcionados por la presente invención incluyen 4-amino-alfa,alfa,2-trimetil-1H-imidazo [4,5-c] quinolin-1-etanol, N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi-}etil)-N-metilmorfolina-4-carboxamida, 1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, N-[4-(4-amino-2-etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]metanosulfonamida, N-[4-(4-amino-2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]metanosulfonamida e imiquimod. Algunos agonistas de TLR particularmente útiles en los procedimientos o regímenes proporcionados por la presente divulgación se analizan en el artículo de revisión: Folkert Steinhagen, y col.: TLR-based immune adjuvants. Vaccine 29 (2011): 3341-3355.
En algunas realizaciones, los agonistas de TLR son agonistas de TLR9, particularmente oligonucleótidos de CpG (o CpG.ODN). Un oligonucleótido de CpG es una molécula de ácido nucleico corta que contiene una citosina seguida de una guanina unida por un enlace fosfato en el que el anillo de pirimidina de la citosina no está metilado. Un motivo de CpG es un patrón de bases que incluye un CpG central no metilado rodeado por al menos una base que flanquea (en los lados 3 'y 5' de) el CpG central. Los oligonucleótidos de CpG incluyen oligonucleótidos tanto D como K. El oligonucleótido de CpG completo puede estar sin metilar o pueden estar partes sin metilar. Los ejemplos de oligonucleótidos de CpG útiles en los procedimientos proporcionados por la presente divulgación incluyen los desvelados en las Patentes de los Estados Unidos n.° 6194388, 6207646, 6214806, 628371, 6239116 y 6339068.
Los oligonucleótidos de CpG pueden abarcar diversas modificaciones y sustituciones químicas, en comparación con el ARN y el ADN natural, que implica un puente internucleósido de fosfodiéster, una unidad de beta-D-ribosa (desoxirribosa) y/o una base de nucleósido natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo). Los expertos en la materia conocen ejemplos de modificaciones químicas y se describen, por ejemplo en Uhlmann E. y col. (1990), Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", Synthesis and Properties and Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, ST. y col. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; y Hunziker J. y col., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. Específicamente, un oligonucleótido de CpG puede contener una citosina modificada. Una citosina modificada es un análogo de la base de pirimidina de origen natural o no natural que puede reemplazar esta base sin perjudicar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las citosinas modificadas incluyen, pero no se limitan a, citosinas 5-sustituidas (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-fluorocitosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina y 5-alquinil-citosina no sustituida o sustituida), citosinas 6-sustituidas, citosinas N4-sustituidas (por ejemplo, N4-etilcitosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina con sistemas de anillos condensados (por ejemplo, N,N'-propilen citosina o fenoxazina) y uracilo y sus derivados (por ejemplo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromoviniluracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5-propinil-uracilo). Algunas de las citosinas preferidas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina y N4-etil-citosina.
Un oligonucleótido de CpG también puede contener una guanina modificada. Una guanina modificada es un análogo de la base de purina de guanina natural o no natural que puede reemplazar esta base sin perjudicar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las guaninas modificadas incluyen, entre otras, 7-desazaguanina, 7-desaza-7-guanina sustituida, hipoxantina, guaninas N2-sustituidas (por ejemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas sustituidas (por ejemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina), guanina 8-sustituida (por ejemplo, 8-hidroxi guanina y 8-bromoguanina) y 6-tioguanina. En algunas realizaciones de la divulgación, la base de guanina se sustituye con una base universal (por ejemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol y base K), un sistema de anillo aromático (por ejemplo, bencimidazol o dicloro-bencimidazol, amida del ácido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) o un átomo de hidrógeno.
En determinados aspectos, los oligonucleótidos de CpG incluyen cadenas principales modificadas. Se ha demostrado que la modificación de la cadena principal de ácido nucleico proporciona una actividad mejorada de los ácidos nucleicos cuando se administran in vivo. Las estructuras secundarias, tales como tallos-bucles, pueden estabilizar los ácidos nucleicos frente a la degradación. Como alternativa, la estabilización del ácido nucleico se puede lograr a través de modificaciones en la cadena principal de fosfato. Un ácido nucleico estabilizado preferido tiene al menos una cadena principal modificada parcialmente con fosforotioato. Los fosforotioatos pueden sintetizarse utilizando técnicas automatizadas que emplean químicas de fosforamidato o H-fosfonato. Se pueden producir fosfonatos de arilo y alquilo, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 4.469.863; y pueden prepararse fosfotriésteres de alquilo (en los que el resto de oxígeno cargado se alquila como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.023.243 y la Patente Europea n.° 092.574) mediante síntesis automatizada en fase sólida usando reactivos comercialmente disponibles. Se han descrito procedimientos para realizar otras modificaciones y sustituciones en la cadena principal del ADN (Uhlmann, E. y Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165). Los ácidos nucleicos de 2'-O-metilo con motivos CpG también provocan activación inmunitaria, al igual que los ácidos nucleicos de CpG modificados con etoxi. De hecho, no se han encontrado modificaciones de la cadena principal que eliminen completamente el efecto de CpG, aunque se reduce considerablemente al reemplazar la C con una 5-metil C. Las construcciones que tienen enlaces de fosforotioato proporcionan una actividad máxima y protegen el ácido nucleico de la degradación por exo y endonucleasas intracelulares. Otros oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos modificados con fosfodiéster, combinaciones de oligonucleótidos de fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforititioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos. Cada una de estas combinaciones y sus efectos particulares sobre las células inmunes se discuten con más detalle con respecto a los ácidos nucleicos de CpG en las publicaciones PCT n.° WO 96/02555 y WO 98/18810 y en las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.194.388 y 6.239.116.
Los oligonucleótidos de CpG pueden tener uno o dos extremos 5' accesibles. Es posible crear oligonucleótidos modificados que tengan dos de estos extremos 5', por ejemplo, uniendo dos oligonucleótidos a través de un enlace 3'-3' para generar un oligonucleótido que tiene uno o dos extremos 5' accesibles. El enlace 3'-3' puede ser un fosfodiéster, fosforotioato o cualquier otro puente internucleósido modificado. Los procedimientos para lograr tales enlaces son conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichos enlaces se han descrito en Seliger, H. y col., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides and Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 y Jiang, y col., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic and Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
Adicionalmente, se pueden preparar oligonucleótidos enlazados en 3'-3', en los que el enlace entre los nucleósidos 3'-terminales no es un fosfodiéster, fosforotioato u otro puente modificado, usando un espaciador adicional, tal como un resto de tri o tetra-etilenglicol fosfato (Durand, M. y col., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204, Patentes de los Estados Unidos n.° 5.658.738 y 5.668.265). Como alternativa, el enlazador no nucleotídico puede derivarse de etanodiol, propanodiol o de una unidad de desoxirribosa (dSpacer) abásica (Fontanel, Marie Laurence y col., Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) usando química estándar de fosforamidita. Los enlazadores no nucleotídicos pueden incorporarse una o varias veces o combinarse entre sí permitiendo que se pueda unir cualquier distancia deseable entre los extremos 3' de los dos oligonucleótidos.
Puede reemplazarse un puente internucleósido de fosfodiéster ubicado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido mediante un puente internucleósido modificado, en el que el puente internucleósido modificado se selecciona, por ejemplo, entre puentes de fosforotioato, fosforoditioato, NRiR2-fosforamidato, boranofosfato, fosfonato de ahidroxibencilo, éster de fosfato-(C1-C21)-O-alquilo, fosfato-[(C6-C21)aril-(C1-C21)-O-alquil]éster, alquil (C-i-Cafosfonato y/o aril (C6-C-i2)fosfonato, (C7-C12)-a-hidroximetil-arilo (por ejemplo, desvelados en la Publicación PCT n.° WO 95/01363), en los que el arilo (C6-C12), arilo (C6-C20) y arilo (C6-C14) están opcionalmente sustituidos con halógeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano y en los que R1 y R2 son, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo (C1-C18)-, arilo (C6-C20)-, arilo (C6-C14)-, alquilo (C1C8)-, preferentemente hidrógeno, alquilo (CrCe)-, preferentemente alquilo (C1-C4)- y/o metoxietilo o R1 y R2 forman, junto con el átomo de nitrógeno que porta, un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que puede contener adicionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre el grupo de O, S y N. El reemplazo de un puente fosfodiéster ubicado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido por un puente desfosfo (los puentes desfosfo se describen, por ejemplo, en Uhlmann E. y Peyman A. en "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, páginas.
355 ff), en el que un puente desfosfo se selecciona, por ejemplo, entre los puentes desfosfo formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfona y/o grupos sililo.
Los oligonucleótidos de CpG para su uso en los procedimientos o regímenes proporcionados por la divulgación pueden tener opcionalmente cadenas principales quiméricas. Una cadena principal quimérica es una que comprende más de un tipo de enlace. En una realización, la cadena principal quimérica puede representarse por la fórmula: 5' Y1 N1ZN2Y2 3'. Y1 e Y2 son moléculas de ácido nucleico que tienen entre 1 y 10 nucleótidos. Y1 e Y2 incluyen, cada uno, al menos un enlace internucleótido modificado. Dado que al menos 2 nucleótidos de los oligonucleótidos quiméricos incluyen modificaciones de la cadena principal, estos ácidos nucleicos son un ejemplo de un tipo de "ácidos nucleicos inmunoestimuladores estabilizados".
Con respecto a los oligonucleótidos quiméricos, Y1 e Y2 se consideran independientes entre sí. Esto significa que cada uno de Y1 e Y2 puede o no tener diferentes secuencias y diferentes enlaces de la cadena principal entre sí en la misma molécula. En algunas realizaciones, Y1 y/o Y2 tienen entre 3 y 8 nucleótidos. N1 y N2 son moléculas de ácido nucleico que tienen entre 0 y 5 nucleótidos, siempre que N1ZN2 tenga al menos 6 nucleótidos en total. Los nucleótidos de N1ZN2 tienen una cadena principal de fosfodiéster y no incluyen ácidos nucleicos que tienen una cadena principal modificada. Z es un motivo de ácido nucleico inmunoestimulador, seleccionado preferentemente entre los citados en el presente documento.
Los nucleótidos centrales (N1ZN2) de fórmula Y1 N1ZN2Y2 tienen enlaces entre nucleótidos de fosfodiéster e Y1 e Y2 tienen al menos uno, pero pueden tener más de uno o incluso pueden tener todos los enlaces entre nucleótidos modificados. En realizaciones preferidas, Y1 y/o Y2 tienen al menos dos o entre dos y cinco enlaces entre nucleótidos modificados o Y1 tiene cinco enlaces entre nucleótidos modificados e Y2 tiene dos enlaces entre nucleótidos modificados. El enlace entre nucleótidos modificado, en algunas realizaciones, es un enlace modificado de fosforotioato, un enlace de fosforoditioato o un enlace de p-etoxi modificado.
Los ejemplos de oligonudeótidos de CpG particulares útiles en los procedimientos proporcionados por la presente divulgación incluyen:
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' (CpG 7909);
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3' (CpG 24555); y
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3' (CpG 10103).
CpG7909, un 24-mero sintético monocatenario, se ha investigado exhaustivamente para el tratamiento del cáncer como monoterapia y en combinación con agentes quimioterapéuticos, así como un adyuvante como adyuvante para vacunas contra el cáncer y enfermedades infecciosas. Se ha comunicado que una sola dosis intravenosa de CpG 7909 se toleró bien, sin efectos clínicos y sin una toxicidad significativa hasta 1,05mg/kg, mientras que una sola dosis subcutánea de CpG 7909 tuvo una dosis máxima tolerada (MTD) de 0,45 mg/kg con una toxicidad limitante de la dosis de mialgia y efectos constitutivos. [Véase Zent, Clive S, y col.: Phase I clinical trial of CpG oligonucleotide 7909 (PF-03512676) in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma, 53(2):211-217(7)(2012). En los regímenes proporcionados por la presente divulgación, CpG7909 puede administrarse mediante inyección en el músculo o cualquier otro procedimiento adecuado. Se prefiere su administración por vía local en proximidad al ganglio linfático que drena la vacuna, particularmente mediante administración intradérmica o subcutánea. Para su uso con una vacuna de ácido nucleico, tal como una vacuna de ADN, puede coformularse preferentemente un CpG con la vacuna en una sola formulación y administrarse mediante inyección intramuscular acoplado con electroporación. La cantidad eficaz de CpG7909 mediante administración intramuscular, intradérmica o subcutánea se encuentra normalmente en el intervalo de 10 pg/dosis -10 mg/dosis. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de CpG7909 se encuentra en el intervalo de 0,05 mg - 14 mg/dosis. En algunas realizaciones particulares, la cantidad eficaz de CpG7909 es de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 05 1 mg/dosis. Otros oligonucleótidos de CpG, incluyendo CpG 24555 y CpG 10103, pueden administrarse de un modo y con niveles de dosis similares.
En algunas realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad o el efecto terapéutico de una vacuna para el tratamiento de un trastorno neoplásico en un ser humano, que comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteína cinasa seleccionado entre tosilato de sorafenib, sunitinib malato, axitinib, erlotinib, gefitinib, axitinib, bosutinib, temsirolismus o nilotinib y en el que el al menos un potenciador de IEC se selecciona entre un inhibidor de CTLA-4, un agonista de TLR o un agonista de CD40. En algunas realizaciones preferidas, el régimen comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteína cinasa seleccionado entre axitinib, tosilato de sorafenib o sunitinib malato y en el que el al menos un potenciador de IEC es un inhibidor de CTLA-4 seleccionado entre Ipilimumab o Tremelimumab. En algunas realizaciones preferidas adicionales, el régimen comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos dos potenciadores de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteína cinasa seleccionado entre sunitinib o axitinib y en el que los al menos dos potenciadores de IEC son Tremelimumab y un agonista de TLR seleccionado entre CpG7909, CpG2455 o CpG10103.
En algunas realizaciones diferentes, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar el cáncer de próstata en un ser humano, que comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA humano, (2) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (3) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteína cinasa seleccionado entre tosilato de sorafenib, sunitinib malato, axitinib, erlotinib, gefitinib, axitinib, bosutinib, temsirolismus o nilotinib y en el que el al menos un potenciador de IEC se selecciona entre un inhibidor de CTLA-4, un agonista de TLR o un agonista de CD40. En algunas realizaciones preferidas, el procedimiento comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un PAA humano, (2) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de iSc y (3) una cantidad eficaz de al menos un potenciador de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteína cinasa seleccionado entre tosilato de sorafenib, sunitinib malato o axitinib y en el que al menos un potenciador de IEC es un inhibidor de CTLA-4 seleccionado entre Ipilimumab o Tremelimumab.
En algunas realizaciones específicas adicionales, el procedimiento comprende administrar al ser humano (1) una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de ISC y (2) una cantidad eficaz de al menos dos potenciadores de IEC, en el que el al menos un inhibidor de ISC es un inhibidor de proteína cinasa seleccionado entre sunitinib o axitinib y en el que los al menos dos potenciadores de IEC son Tremelimumab y un agonista de TLR seleccionado entre CpG7909, CpG2455 o CpG10103.
Agentes terapéuticos adicionales.
El régimen de inmunoterapia basado en vacuna proporcionado por la presente divulgación puede comprender además un agente terapéutico adicional. Se puede usar una amplia variedad de agentes terapéuticos contra el cáncer, incluyendo agentes quimioterapéuticos y agentes hormonales terapéuticos. Un experto habitual en la materia reconocerá la presencia y el desarrollo de otras terapias contra el cáncer que pueden usarse en la VIBR proporcionada por la presente divulgación y no se restringirá a aquellas formas de terapia expuestas en el presente documento.
La expresión "agente quimioterapéutico" se refiere a una sustancia química o biológica que puede provocar la muerte de células cancerosas o interferir con el crecimiento, la división, la reparación y/o la función de células cancerosas. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen aquellos que se desvelan en los documentos WO2006/088639, Wo 2006/129163 y US 20060153808. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos particulares incluyen: (1) agentes alquilantes, tales como clorambucilo (LEUKERAN), ciclofosfamida (CYTOXAN), ifosfamida (IFEX), clorhidrato de mecloretamina (MUSTARGEN), tiotepa (tioplex), estreptozotocina (ZANOSAR), carmustina (BICNU, GLIADEL WAFER), lomustina (CEENU) y dacarbazina (DTIC-DOME); (2) alcaloides o alcaloides de la planta de la vinca, incluyendo antibióticos citotóxicos, tales como doxorrubicina (ADRIAMYCIN), epirrubicina (ELLENCE, PHARMORUBICIN), daunorrubicina (CERUBIDINA, DAUNOXOME), nemorrubicina, idarrubicina (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), mitoxantrona (DHAD, NOVANTRONE), dactinomicina (actinomicina D, COSMEGEN), plicamicina (MITHRACIN), mitomicina (MUTAMICINA) y bleomicina (BLENOXANE), tartrato de vinorelbina (NAVELBINE), vinblastina (VELBAN), vincristina (ONCOVIN) y vindesina (ELDISINE); (3) antimetabolitos, tales como capecitabina (XELODA), citarabina (CYTOSAR-U), fludarabina (FlUDARA), gemcitabina (GEMZAR), hidroxiurea (HYDRA), metotrexato (FOLEX, MEXATE, TREXALL), nelarabina (ARRANON), trimetrexato (NEUTREXIN) y pemetrexed (ALIMTA); (4) antagonistas de pirimidina, tales como 5-fluorouracilo (5-FU); capecitabina (XElOdA), raltitrexed (TOMUDeX), tegafur-uracilo (u Ft ORAL) y gemcitabina (GEMZAR); (5) taxanos, tales como docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel (TAXOL); (6) fármacos de platino, tales como cisplatino (PLATINOL) y carboplatino (PARAPLATIN) y oxaliplatino (ELOXATIN); (7) inhibidores de topoisomerasa, tales como irinotecán (CAMPTOSAR), topotecán (HYCAMTIN), etopósido (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR) y tenipósido (VUMON); (8) epipodofilotoxinas (derivados de podofilotoxinas), tales como etopósido (ETOPOPHOS, VEp ESSID, t OpOSAr ); (9) derivados del ácido fólico, tales como leucovorina (WELLCOVORIN); (10) nitrosoureas, tales como carmustina (BiCNU), lomustina (CeeNU); (11) inhibidores de tirosina cinasa receptora, incluyendo receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor de insulina, receptor de factor de crecimiento insulínico (IGFR), receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR), y receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), tales como gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), bortezomib (VELCADE), imatinib mesilato (GLEEVEC), genefitinib, lapatinib, sorafenib, talidomida, sunitinib (SUTENT), axitinib, rituximab (RITUXAN, MABTHERA),, trastuzumab (HERCEPTIN), cetuximab (ERBITUX), bevacizumab (AVASTIN) y ranibizumab (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento-1 insulínico (IGF-1R) que se desvelan en el documento WO2002/053596); (12) inhibidores de la angiogénesis, tales como bevacizumab (AVASTIN), suramina (GERMANIN), angiostatina, SU5416, talidomida e inhibidores de metaloproteinasa de matriz (tales como batimastat y marimastat) y los que se desvelan en el documento WO2002055106; y (13) inhibidores de proteasoma, tales como bortezomib (VELCADE).
La expresión "agente terapéutico hormonal" se refiere a una sustancia química o biológica que inhibe o elimina la producción de una hormona o contrarresta el efecto de una hormona sobre el crecimiento y/o la supervivencia de células cancerosas. Los ejemplos de dichos agentes adecuados para la VBIR incluyen los desvelados en el documento US20070117809. Los ejemplos de agentes terapéuticos hormonales particulares incluyen tamoxifeno (NOLVADEX), toremifeno (Fareston), fulvestrant (FASLODEX), anastrozol (ARIMIDEX), exemestano (AROMASIN), letrozol (FEMARA), megestrol acetato (MEGACE), goserelina (ZOLADeX), leuprolida (LUPRON), abiraterona y MDV3100.
La VBIR proporcionada por la presente divulgación también puede usarse en combinación con otras terapias, incluyendo (1) procedimientos quirúrgicos que eliminan la totalidad o parte de los órganos o glándulas que participan en la producción de la hormona, tales como los ovarios, los testículos, la glándula suprarrenal y la glándula pituitaria y (2) el tratamiento de radiación, en el que los órganos o glándulas del paciente se someten a radiación en una cantidad suficiente para inhibir o eliminar la producción de la hormona diana.
I. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas realizaciones de la invención. No deben interpretarse en modo alguno como limitantes del ámbito de la invención.
Ejemplo 1. Antígenos en formatos citosólicos, secretados y unidos a membrana derivados de la proteína PSMA humana
El ejemplo 1 ilustra la construcción de tres polipéptidos inmunogénicos de PSMA citados como "antígeno de PSMA citosólico humano", "antígeno de PSMA secretado humano", y "antígeno de PSMA unido a membrana humano", respectivamente y las propiedades biológicas de estos polipéptidos.
1A. Diseño de polipéptidos inmunogénicos de PSMA
Se construyeron construcciones de ADN que codificaban polipéptidos inmunogénicos de PSMA en los formatos citosólico, secretado y modificado, basándose en la secuencia de proteína de PSMA humano nativo y se evaluó su capacidad para inducir respuestas inmunitarias efectoras antitumorales. A continuación se proporciona la estructura y la preparación de cada uno de los formatos de antígeno de PSMA.
1A1. Antígeno de PSMA citosólico humano. Se diseñó un polipéptido inmunogénico de PSMA en forma citosólica para retener el polipéptido inmunogénico dentro de la célula una vez que se expresa. Se eliminaron el dominio citoplasmático (aminoácidos 1-19) y el dominio transmembrana (aminoácidos 20-43) del PSMA humano, dando como resultado un polipéptido de PSMA citosólico que consiste en los aminoácidos 44-750 (dominio extracelular o ECD) del PSMA humano de SEQ ID NO: 1. La secuencia Kozak óptima "MAS" se puede agregar al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la expresión.
1A2. Antígeno de PSMa secretado humano. Se diseñó un polipéptido inmunogénico de PSMA en forma secretada para secretar el polipéptido fuera de la célula una vez que se expresa. El polipéptido secretado se produce con los aminoácidos 44-750 (ECD) del PSMA humano de SEQ ID NO: 1 y el elemento secretor de Ig Kappa que tiene la secuencia de aminoácidos ETDTLLLWVLLLLWVPGSTGD y un enlazador de dos aminoácidos (AA) en el extremo N-terminal para maximizar la secreción del antígeno PSMA una vez que se expresa.
1A3. Antígeno de PSMA unido a membrana humano. Se diseñó un polipéptido inmunogénico unido a la membrana de PSMA para estabilizar el polipéptido en la superficie celular. Se eliminaron los primeros 14 aminoácidos de la proteína PSMA humana y el polipéptido inmunogénico resultante que consiste en los aminoácidos 15 - 750 de la proteína PSMA humana de SEQ ID NO: 1. El polipéptido inmunogénico que consiste en los aminoácidos 15 - 750 de la proteína PSMA humana nativa de SEQ ID NO: 1 y comparte una identidad de secuencia del 100% con la proteína PSMA humana nativa también se conoce como "PSMA humano modificado", "hPSMA modificado", o antígeno "hPSMAmod" en la presente divulgación.
1B. Preparación de plásmidos de ADN para expresar los antígenos de PSMA
Se clonaron construcciones de ADN que codifican los antígenos de PSMA citosólico, PSMA secretado y PSMA modificado individualmente en el vector PJV7563 que era adecuado para pruebas in vivo en animales (figura 1). Se secuenciaron las dos cadenas de ADN en los vectores PJV7563 para confirmar la integridad del diseño.
Se produjo una preparación de ADN plasmídico a gran escala (Qiagen/CsCI) a partir de un clon de secuencia confirmada. La calidad del ADN plasmídico fue confirmada por una alta proporción de 260/280, alta proporción de ADN súper enrollado/mellado, niveles bajos de endotoxinas (<10 U/mg de ADN) y carga biológica negativa.
1C. Expresión de construcciones de PSMA en células de mamífero
Se confirmó la expresión de los antígenos de PSMA citosólico, secretado y modificado mediante FACS. Se transfectaron células 293 de mamífero con los vectores PJV7563 PMED que codifican los diversos polipéptidos inmunogénicos de PSMA. Tres días después, se tiñeron las células 293 teñidas con anticuerpo de ratón anti-PSMA, seguido de un anticuerpo secundario de rata anti-ratón fluorescente conjugado (FITC). Los datos a continuación, que se comunicaron como intensidad media de fluorescencia (IMF) frente a los controles negativos, confirmaron que el antígeno de PSMA humano modificado se expresa en la superficie celular.
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1D. Formulaciones de plásmidos PSMA sobre partículas de oro (para ND10/X15)
La tecnología de suministro epidérmico mediado por partículas (PMED) es un procedimiento sin agujas para administrar vacunas a animales o pacientes. El sistema PMED implica la precipitación de ADN sobre partículas microscópicas de oro que luego son impulsadas por gas helio hacia la epidermis. El ND10, un dispositivo de un solo uso, utiliza helio a presión procedente de un cilindro interno para suministrar partículas de oro y el X15, un dispositivo de suministro repetidor, utiliza un tanque de helio externo que está conectado al X15 a través de una manguera de alta presión para suministrar las partículas de oro. Se usaron estos dos dispositivos en estudios para suministrar los plásmidos de ADN de PSMA. Las partículas de oro tenían normalmente un diámetro de 1-3 pm y se formularon las partículas para que contuviesen 2 pg de plásmidos de PSMA por cada 1 mg de partículas de oro. (Sharpe, M. y col.: P. Protection of mice from H5N1 influenza challenge by prophylactic DNA vaccination using particle mediated epidermal delivery. Vaccine, 2007, 25(34): 6392-98: Roberts LK, y col.: Clinical safety and efficacy of a powdered Hepatitis B nucleic acid vaccine delivered to the epidermis by a commercial prototype device. Vaccine, 2005; 23(40):4867-78).
IE. Ratones transgénicos utilizados para estudios in vivo
Se usaron dos modelos de ratón transgénico para HLA para evaluar la presentación de diversos antígenos de PSMA por diferentes HLA y se usó un modelo de ratón transgénico para PSMA para evaluar la interrupción de la tolerancia inmunitaria a PSMA humano. El primer modelo de ratón transgénico para HLA utiliza los ratones HLA A2/DR1 (procedentes del Institute Pasteur, París, Francia; también citado como "ratones Pasteur"). Los ratones Pasteur son nuligénicos para la p-2-microglobulina murina y no expresan moléculas funcionales de H-2b; por lo tanto, se cree que este modelo representa la presentación de antígenos en el contexto de HLA A2 y DR1 humano (Pajot, A., M.-L. Michel, N. Faxilleau, V. Pancre, C. Auriault, D.M. Ojcius, F.A. Lemonnier e Y.-C. Lone. A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knock-out mice. Eur. J. Immunol.
2004, 34:3060-69.). El segundo modelo de ratón transgénico para HLA usa ratones que tienen una inserción génica de HLA A24 humano que está unido covalentemente a la p-2-microglobulina humana en el locus H2bk. Estos ratones carecen de p-2-microglobulina murina y no expresan moléculas H-2b funcionales. Este modelo permite la evaluación de la presentación de antígenos en el contexto del HLA A24 humano.
IF. Inmunogenicidad de las proteínas PSMA humanas en los formatos citosólico, secretado y modificados
Diseño del estudio. Se inmunizó a ratones transgénicos de ocho a 10 semanas de edad usando el procedimiento de PMED con diversas construcciones de ADN de PSMA en un régimen de cebado/refuerzo/refuerzo, espaciados por dos semanas entre cada vacunación. Como alternativa, se cebó a los ratones con vectores adenovíricos que codifican el antígeno PSMA a razón de 1 x 109 partículas víricas en 50 pl (PBS) mediante inyección intramuscular. El vector adenovírico (vector pShuttle-CMV de Stratagene) se modificó para que contuviese los sitios de restricción Nhel y BglII dentro del sitio de clonación múltiple. Después, se digirió con las enzimas de restricción Nhel y BglII el ADN que codifica PSMA humano modificado, se ligó en este vector y se confirmó la secuencia. El vector pShuttle de PSMA humano modificado se recombinó con el vector pAdEasy-1 y se propagó el virus de acuerdo con el sistema AdEasy (Stratagene). Veinte días después, se reforzaron con PMEd como se ha descrito anteriormente. En cada uno de los regímenes usados, se midió la respuesta de linfocitos T específica de antígeno 7 días después de la última inmunización en un ensayo ELISPOT de interferón gamma (IFNy). El ensayo ELISPOT es similar al ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en sándwich (ELISA). En resumen, se recubrió una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con un anticuerpo de captura específico para IFNy (BD Bioscience, n.° 51-2525kc) en una microplaca durante una noche a 4 °C. La placa se bloquea con suero/proteína para evitar la unión no específica al anticuerpo. Después de bloquear, se añaden células efectoras (tales como esplenocitos aislados de ratones inmunizados con PSMA) y dianas (tales como péptidos de PSMA de bibliotecas de péptidos, células dianas pulsadas con péptidos o células tumorales que expresan los antígenos relevantes) o mitógeno (que estimulará a los esplenocitos de manera inespecífica para producir IFNYh) a los pocillos y se incuban durante una noche a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Las citocinas secretadas por células efectoras son capturadas por el anticuerpo de recubrimiento sobre la superficie de la membrana de PVDF. Después de retirar las células y los medios de cultivo, se añadieron 100 pl de un anticuerpo policlonal biotinilado anti-IFNY de ratón (0,5 mg/ml-BD Bioscience, n.° 51-1818kz) a cada uno de los pocillos para la detección. Los puntos se visualizaron añadiendo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP, BD Biosciences, n.° 557630) y el sustrato precipitado, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), para producir un punto de color rojo. Cada punto representa un solo linfocito T productor de citocinas. En general, en los estudios desvelados en el presente documento el ensayo ELISPOT se configuró como se expone a continuación: se cultivaron 5 x 105 esplenocitos de ratones inmunizados con PSMA (1) en presencia de péptidos específicos de PSMA derivados de una biblioteca de péptidos de PSMA (véase la tabla 16) formada por péptidos de 15 aminoácidos solapantes por 11 aminoácidos, (2) con péptidos específicos de PSMA restringidos a HLA A2.1 o (3) con células tumorales. Para medir el reconocimiento de la presentación de antígeno endógeno, se cultivaron esplenocitos con células de cáncer de próstata HLA A2 humanas (es decir, LNCaP, disponible de la ATCC) que expresan PSMA de forma natural o se cultivan con células tumorales HLA A2 transducidas con adenovirus que codifican y expresan de este modo el antígeno PSMA humano modificado. Además, se añadió proteína PSMA eCd humana al ensayo ELISpot para medir específicamente células CD4 productoras de IFNy □. Para controles en caso de que sea adecuado, se usó péptido p168-175 específico de HER2 restringido a HLA A2 o células tumorales que no expresaban PSMA o proteína irrelevante, tal como BSA, como control negativo en el ensayo ELISPOT de IFNy. Los resultados de datos se proporcionan en formato normalizado para el número de células formadoras de puntos (SFC) que secretan IFNy □ en 1 x 106 esplenocitos. Se llevaron a cabo al menos tres estudios para cada uno de los péptidos de antígeno PSMA evaluados.
Resultados. Los resultados del ensayo ELISPOT con esplenocitos de ratones Pasteur cultivados con péptidos procedentes de una biblioteca de péptido de PSMA se presentan en la tabla 1. Se define una respuesta positiva por tener SFC > 100. Tal como se muestra en la Tabla 1, los polipéptidos inmunogénicos de PSMA producidos con los tres formatos de antígeno, los antígenos citosólicos, secretados y modificados de PSMA humano descritos en el ejemplo 1A anterior, tienen la capacidad de inducir respuestas de linfocitos T. El formato de antígeno de PSMA humano modificado indujo la mayor amplitud y magnitud de respuestas de linfocitos T.
Tabla 1. Respuesta de linfocitos T inducida por los antígenos citosólicos, secretados y modificados de PSMA humano en ratones Pasteur
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Los datos del ensayo ELISPOT de respuestas de linfocitos T inducidas por diversos formatos de vacuna de PSMA en ratones Pasteur (que reconocieron células diana pulsadas con péptido PSMA restringido para HLA A2.1 así como células tumorales LNCaP PSMA+ HLA A2.1) se presentan en la tabla 2. PC3, que es una línea celular de cáncer de próstata humano que no expresa PSMA, se usó en este caso como un control negativo. Se define una respuesta positiva por tener SFC > 50. Tal como se muestra en la Tabla 2, las diversas construcciones de PSMA probadas son capaces de inducir linfocitos T que reconocen los conocidos epítopos de PSMA restringidos a HLA A2, así como la proteína PSMA y las células de cáncer de próstata humano LNCaP. Sin embargo, se demostró que la construcción de PSMA modificado induce la mayor amplitud y magnitud de respuesta de linfocitos T.
Tabla 2. Respuesta de linfocitos T inducida por los antígenos citosólicos, secretados y modificados de PSMA humano en ratones Pasteur que reconocieron células diana pulsadas con péptido PSMA restringido a HLA A2.1, así como células tumorales LNCaP PSMA+ HLA A2.1.
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continuación
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1G. Respuesta inmunitaria humoral medida en ratones Pasteur o primates no humanos
1G1. Ensayo ELISA sándwich. El ensayo ELISA sándwich estándar se realizó utilizando un sistema automatizado Biotek. Las placas se recubrieron con 25 |jl de proteína PSMA nativa a 1,0 |jg/ml en PBS durante una noche, las placas se lavaron y se bloquearon con 35 jl/pocillo de FBS al 5 % 1X PBS-T al 0,05% y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador a 600 RPM. Se decantó el medio de bloqueo y se prepararon diluciones seriadas de suero de ratones vacunados con diluciones semilogarítmicas en f Bs al 5% 1X PBS-T al 0,05 % partiendo de 1:100 o 1:500 y se añadieron 25 j l de muestras del suero diluido a cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora a TA en un agitador a 600 RPM. Las placas se lavaron 3 veces con 75 ul/pocillo en 1 X PBS-T al 0,05% utilizando un dispositivo Biotek ELx405 y se añadieron 25 jl/pocillo de anticuerpo secundario IgG anti-ratón-HRP diluido a 1:30.000 de (AbCam n.° de cat. Ab20043) (diluido en 1X PBS-T al 0,05%) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador a 600 RPM. Las placas se lavaron 5X con 75 ul/pocillo en 1 X PBS-T al 0,05% utilizando el dispositivo Biotek Elx405. El sustrato de TMB se diluyó a 1:10 y se añadieron 25 j l a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo agregando 12,5 jl/pocillo de H2SO4 1M. Las placas se leyeron utilizando el dispositivo Spectramax Plus a una longitud de onda de 450 nm. Los datos se comunicaron como títulos y estos se pueden comunicar como primeros positivos (promedio y ambos valores por encima del 5 % de FBS PBS 3 desviación típica) y/o como títulos calculados a una DO de 0,5 o 1,0. Se usó suero de ratones vacunados irrelevantes como controles negativos.
Tabla 3. Inducción de respuesta de anticuerpos anti-PSMA por antígenos de PSMA humano medidos mediante un ensayo ELISA.
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Resultados. Los datos presentados en la tabla 3 muestran que el antígeno citosólico de PSMA humano no indujo ninguna respuesta anti-PSMA, mientras que el antígeno de PSMA humano modificado indujo consistentemente buenas respuestas de anticuerpos anti-PSMA en todos los ratones.
Los datos presentados en la tabla 5 muestran que los anticuerpos inducidos por los antígenos de PSMA humanos reaccionaron con múltiples epítopos peptídicos en la biblioteca de PSMA. El suero de los ratones individuales en cada grupo se agrupó en cantidades iguales y se analizó a una dilución de 1:500 en un ensayo ELISA. Se evaluó en paralelo un grupo de control negativo de ratones vacunados con anti-toxoide diftérico (CRM). Se recubrió cada pocillo de la placa de ELISA de 96 pocillos con 0,03 jg de un solo péptido de 15aa procedente de la biblioteca de péptidos de PSMA. Se considera como positivo un valor de DO superior a 0,10.
1G2. Ensayo FACS de unión a células. Se usaron varias líneas celulares de cáncer de próstata para este ensayo. Se usaron LNCaP (ATCC) como células de cáncer de próstata humano que expresan PSMA y se usaron PC3 (ATCC) como células de cáncer de próstata humano negativas que no expresan PSMA. En algunos ensayos, se usó para el ensayo de unión a células una línea celular TRAMP-C2 modificada para expresar de manera estable el PSMA humano nativo de longitud completa y la línea celular TRAMP-C2 precursora que no expresa PSMA (control negativo). El ensayo de unión a células se llevó a cabo del siguiente modo: se sembraron células LNCaP y PC3 (o TRAMP-C2PSMA y TRAMP C2) en pocillos separados a razón de 2x105 células/pocillo (50 jl) en una placa de 96 pocillos. Se diluyeron sueros de ratones PSMA vacunados, como se describe en 1f, a 1:50 con tampón de FACS (PBS, pH 7,4, FBS al 1 %, HEPES 25 mM y EDTA 1 mM). Se añadieron cincuenta j l de anticuerpo J591-A diluido (anticuerpo de ratón anti-PSMA humano, clon J591-A de la ATCC) a los sueros de prueba diluidos o al tampón de FACS (muestras no teñidas) para lograr los números de células adecuados por pocillo en la placa de tinción. Todo se mezcló mediante pipeteo y después se mantuvo sobre hielo durante 20 min. Las células se lavaron dos veces con tampón de FACS; cada lavado se realizó mediante centrifugación a 1200 RPM a 5°C durante 5 minutos. Se agregaron cincuenta j l de solución de tinción secundaria que contenía una dilución 1:200 de Ig de cabra anti-ratón marcada con PE (Sigma, n.° de cat P9670-5) y 0,25 j l de tinción Live/Dead Aqua (Invitrogen, n.° de cat. L34957) a cada uno de los pocilios que contienen células y se mantuvieron sobre hielo durante 20 min. Las células se lavaron dos veces como se describió anteriormente. Los sedimentos celulares lavados se resuspendieron en 125 ul de tampón FACS y luego se agregaron 75 ul de solución de paraformaldehído al 4% a cada pocillo para reparar las células. Las muestras se mantuvieron sobre hielo y se protegieron de la luz durante al menos 15 minutos. Las muestras se corrieron en un dispositivo FACS Canto II. Se registraron diez mil eventos de células vivas para cada muestra. Las muestras de control para cada tipo de célula fueron 1) células no teñidas, 2) células con solo anticuerpo secundario, 3) células con J591 más anticuerpo secundario y 4) células con suero no inmunizado previamente más anticuerpo secundario. Los datos se comunicaron como intensidad media de fluorescencia (IMF) frente a los controles negativos.
Resultados del ensayo FACS de unión a células. La tabla 4 muestra que los anticuerpos inducidos por antígenos de PSMA humanos tanto secretados como modificados son capaces de unirse a células de cáncer de próstata positivas a PSMA humano (LNCaP) y no a células de cáncer de próstata negativas a PSMA (PC3). El antígeno PSMA modificado indujo consistentemente buenas respuestas de anticuerpo anti-PSMA en todos los ratones.
Tabla 4. Unión de anticuerpos anti-PSMA a células de cáncer de próstata humano, medida mediante FACS.
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Tabla 5. Los anticuerpos inducidos por la vacuna contra PSMA reaccionaron con múltiples péptidos en la biblioteca de PSMA. Basándose en este resultado, se identificaron cuatro epítopos de linfocitos B de PSMA, 1: aa 138-147, 2:
aa 119-123, 3: aa 103-106, 4: aa 649-659.
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1G3. Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)
Diseño del estudio. Se inmunizó a un macaco rhesus con un ácido nucleico que codifica antígeno PSMA humano modificado suministrado por adenovirus (1e11 P.V. inyectadas por vía intramuscular) seguido de 2 inmunizaciones con PMED (8 pulsaciones/inmunización, 4 pulsaciones por cada lado derecho e izquierdo del abdomen inferior) a intervalos de 8 y 6 semanas, respectivamente. El animal también recibió inyecciones intradérmicas de 3 mg de CpG (PF-03512676) en proximidad a cada ganglio linfático que drena en la ingle en el momento de la segunda inmunización con PMED. Se determinó la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo a partir del plasma recogido de la sangre antes de cualquier inmunización (plasma preinmune) y 8 días después de la última inmunización con PMED (plasma inmune).
Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Se determinó la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos usando el ensayo convencional de liberación de cromo 51. Se usaron como células diana las líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP y PC3. Se usaron PBMC recién aisladas como células efectoras. Las relaciones de efectores a células diana se ajustaron a 30:1. En resumen, para una reacción de marcaje, se incubaron 1,5x106 células diana en 200 ul con 200 pCi de 51Cr (37 °C, 5% de CO 2 durante 1 hora). Las células se lavaron tres veces y la concentración celular se ajustó a 2x105 células/ml. Se prepararon anticuerpos monoclonales (mAb) de control o plasma de ensayo (1:50) a una concentración 2X y se añadieron 175 ul de cada una de las diluciones de mAb/plasma (dependiendo del tamaño del ensayo) a 175 ul de células diana. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 4 °C en un tubo Eppendorf. Las células se lavaron una vez para liberar los anticuerpos no unidos. En este momento, se añadieron 100 ul de células efectoras aisladas a cada pocillo de la placa de 96 pocillos junto con 100 ul de anticuerpos monoclonales o células diana unidas a plasma de ensayo y se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante 4 h. Las muestras se analizaron en duplicados. Se añadieron 100 pl de HCl 2N a los pocillos diana para una liberación máxima y se añadieron 100 pl de medio a los pocillos diana para la liberación espontánea. La lisis específica se calculó del siguiente modo: Porcentaje de liberación = (ER-SR)/(MR-SR)x100 en la que ER (efectores liberación de células diana) fue la liberación experimental, SR (células diana solas incubadas con medio) fue de liberación espontánea y MR (células diana solas incubadas con HCl 2N) fue la liberación máxima. Se calculó el porcentaje específico de lisis restando la liberación de diana irrelevante (PC3) de la liberación de diana específica de antígeno (LNCaP).
Tabla 6. Actividad de citotoxicidad dependiente de anticuerpo medida en plasma de animal vacunado con PSMA humano modificado.
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Resultados. Los datos del ensayo de citotoxicidad dependiente de anticuerpos se presentan en la tabla 6. LNCaP, una línea celular de cáncer de próstata PSMA+ recubierta con plasma inmune derivado del animal inmunizado con hPSMA, fue lisada por células efectoras mientras que PC3, una línea celular de cáncer de próstata humano PSMA-recubierta con el mismo suero inmune, no se lisó por las células efectoras. De forma similar, las LNCaP recubiertas con plasma preinmune no se lisaron por células efectoras. Herceptin, un anticuerpo monoclonal contra HER-2, se usó como control positivo, ya que se sabe que las células LNCaP expresan HER-2 (Li, Cozzi y col. 2004). Rituxan, un anticuerpo monoclonal contra antígeno de linfocitos B (CD20) se usó como anticuerpo de control negativo, ya que las células LNCaP no expresan CD20. Se ha comunicado que ambos anticuerpos monoclonales tienen actividades de ADCC (Dall'Ozzo, Tartas y col. 2004; Collins, O'Donovan y col. 2011).
Ejemplo 2. Construcción de antígenos de PSMA reordenados
Este ejemplo ilustra la construcción de y ciertas propiedades biológicas de diversos polipéptidos de PSMA inmunogénicos que son variantes del antígeno PSMA humano modificado (SEQ ID NO: 9), como se ha descrito en el ejemplo 1.
2A. Diseño de antígenos de PSMA reordenados
Se diseñaron varios polipéptidos inmunogénicos de PSMA que son variantes del antígeno de PSMA humano modificado (SEQ ID NO: 9) como se describe en el ejemplo 1. Estas variantes se crearon introduciendo mutaciones seleccionadas entre ortólogos del PSMA humano en la secuencia de antígeno de PSMA humano modificado. Estas variantes se denominan, indistintamente, como "antígenos de PSMA reordenados" o "antígenos de PSMA modificado reordenados" en la divulgación. El principio y el procedimiento usados para crear estas variantes se proporcionan a continuación.
Se desarrolló un algoritmo computacional para seleccionar mutaciones puntuales para la variante reordenada. En primer lugar, se ensambló un alineamiento de múltiples secuencias de PSMA y 12 ortólogos (apéndice 2a) usando PSI-BLAST del NCBI. La salida del PSI-BLAST incluyó las propensiones para cada resto en cada posición de PSMA entre los ortólogos. Después, el código en perl usó estas propensiones para seleccionar mutaciones puntuales como se expone a continuación:
1) Entre todas las posiciones, se selecciona el resto más comúnmente observado que no coincide con la identidad en el PSMA humano nativo.
2) Verificar que esta mutación puntual no se solapa con epítopos de PSMA humanos de clase I o II, para asegurar que la mutación puntual no se encuentra dentro de un epítopo conservado de linfocitos T, como se ha definido anteriormente en el presente documento (tala 19).
3) Calcular la similitud de la mutación con el resto humano mediante la matriz BLOSUM62 para verificar que la puntuación de similitud de BLOSUM62 para la sustitución del resto se encuentra dentro del intervalo de 0 - 1 (inclusive).
Se continúa este procedimiento iterativo hasta que se alcanza un cierto porcentaje de identidad de secuencia (por debajo de 100) con respecto al PSMA humano.
Para que sirvan como entrada para este algoritmo, se ensamblaron los ortólogos de PSMA para construir una matriz de probabilidad específica para una posición usando PSI-BLAST del NCBI. Adicionalmente, las regiones epitópicas identificadas de PSMA se listaron en un archivo que también se proporcionó al algoritmo de reordenamiento. Las regiones no reordenadas también se extendieron a las regiones citosólicas y transmembrana de la proteína para evitar problemas de funcionalidad ligados a la membrana. Las secuencias ortólogas de proteína PSMA, la matriz BLOSUM62 y el programa PSI-BLAST se descargaron de la página web del NCBI.
Posteriormente, se ejecutó el programa de reordenamiento usando estos datos de entrada y se produjo una variante de PSMA humano con un 94 % de identidad de secuencia respecto del PSMA humano original. Adicionalmente, se introdujeron tres mutaciones para mejorar la unión al HLA-A2 basándose en su rendimiento en el algoritmo Epitoptimizer (Houghton, Engelhorn y col., 2007). Estas mutaciones son M664L (epítopo: 663-671), I676V (epítopo: 668-676) y N76L (epítopo: 75-83). El antígeno resultante se denomina "antígeno 1 de PSMA modificado reordenado", "PSMA reordenado modificado 1", o "antígeno 1 de PSMA reordenado".
Los resultados basados en epítopos con rango consenso < 1 % y CI50 mediante red neural (mejor procedimiento individual) <500 mostraron que los epítopos predichos de HLA A2.1, HLA A3, HLA A11, HLA a 24 y HLA B7 estaban altamente conservados en este antígeno reordenado. Se diseñaron dos variantes adicionales del antígeno de PSMA humano modificado descrito en el ejemplo 1 con mayores identidades de secuencia y puntos de corte de puntuación de BLOSUM de 1 más restrictivos para eliminar todas las sustituciones no conservativas. Estas dos variantes también se citan como "antígeno de PSMA modificado reordenado 2" y "antígeno de PSMA modificado reordenado 3", respectivamente. Los porcentajes de identidad de los antígenos de PSMA modificados reordenados 1-3 con respecto a la construcción de PSMA humano modificado (por ejemplo, aminoácidos 15-750 del PSMA humano) son de aproximadamente el 93,6 %, 94,9 % y 96,4 %, respectivamente.
El antígeno de PSMA modificado reordenado 1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y tiene las siguientes mutaciones en relación con el antígeno PSMA humano modificado:
N47S, T53S, K55Q, M58V, L65M, N76L, S98A, Q99E, K122E, N132D, V154I, I157V, F161Y, D191E, M192L, V201L, V225I, I258V, G282E, I283L, R320K, L362I, S380A, E408K, L417I, H475Y, K482Q, M509V, S513N, E542K, M583L, N589D, R598Q, S613N, I614L, S615A, Q620E, M622L, S647N, E648Q, S656N, I659L, V660L, L661V, M664L, I676V El antígeno de PSMA modificado reordenado 2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y tiene las siguientes mutaciones en relación con el antígeno PSMA humano modificado: Mutaciones:
N47S, K55Q, M58V, Q91E, S98A, A111S, K122E, N132D, V154I, I157V, F161Y, V201L, V225I, I258V, S312A, R320K, K324Q, R363K, S380A, E408K, H475Y, K482Q, Y494F, E495D, K499E, M509L, N540D, E542K, N544S, M583I, I591V, R598Q, R605K, S613N, S647N, E648Q, S656N, V660L
El antígeno de PSMA modificado reordenado 3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y tiene las siguientes mutaciones en relación con el antígeno PSMA humano modificado: Mutaciones:
T339A, V342L, M344L, T349N, N350T, E351K, S401T, E408K, M470L, Y471H, H475Y, F506L, M509L, A531S, N540D, E542K, N544S, G548S, V555I, E563V, V603A, R605K, K606N, Y607H, D609E, K610N, I611L
2B. Respuestas inmunitarias medidas después de la vacunación en ratones Pasteur
Diseño del estudio. Se inmunizó a ratones Pasteur de ocho a 10 semanas de edad usando el procedimiento de PMED con los diversos ADN plasmídicos que expresaban antígenos de PSMA modificado reordenado en un régimen de cebado/refuerzo/refuerzo, espaciados por dos semanas entre cada vacunación como se describe en el ejemplo 1F. Se midieron las respuestas de linfocitos T y B específicas de antígeno 7 días después de la última inmunización en un ensayo ELISPOT de interferón gamma (IFNy) y un ELISA en sándwich, respectivamente.
Tabla 7. Respuestas de linfocitos T inducidas por diversos antígenos de PSMA modificado reordenado a grupos de péptidos en la biblioteca de péptidos de PSMA
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continuación
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Resultados. Los datos de ELISPOT presentados en la tabla 7 demuestran que en general, los antígenos de PSMA modificados reordenados son capaces de inducir respuestas de linfocitos T con una amplitud y magnitud muy similares a la del antígeno PSMA humano modificado. SFC >100 se considera positivo. El símbolo "*" representa demasiado numeroso como para contar con precisión.
Tabla 8. Respuestas de linfocitos T inducidas por antígenos de PSMA modificados reorganizados para dianas de HLA A2 y proteína PSMA.
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Tal como se muestra en la Tabla 8, todos los antígenos de PSMA reordenados son capaces de inducir linfocitos T que reconocieron epítopos de PSMA restringidos a HLA A2 conocidos, así como células tumorales HLA A2 transducidas con adenovirus portador del transgén de PSMA para expresar PSMA. Las células tumorales que no sobreexpresaron PSMA sirvieron como controles negativos y no fueron reconocidas. SFC>50 se considera positivo. Tabla 9. Respuestas de linfocitos T inducidas por antígenos de PSMA modificados reorganizados contra linfocitos T CD4 específicos.
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Los datos de ELISPOT mostrados en la tabla 9 se obtuvieron con esplenocitos que estaban agotados para CD8; por lo tanto, los datos representan respuestas de linfocitos T específicas para linfocitos T CD4. Los datos muestran que la respuesta de CD4 generada por el antígeno de PSMA modificado reordenado 2 es muy similar a la inducida por el antígeno de PSMA humano modificado. SFC>50 se considera positivo.
Tabla 10. Inducción de respuesta de anticuerpos anti-PSMA medida mediante un ensayo ELISA
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Los datos en la tabla 10 demuestran que todos los antígenos de PSMA modificados reordenados son capaces de inducir respuestas de anticuerpo anti-PSMA humano. El antígeno de PSMA modificado reordenado 2 y el antígeno de PSMA humano modificado indujeron respuestas de anticuerpo consistentes en todos los ratones.
Tabla 11. Respuestas de linfocitos T en ratones HLA A24 inducidas por el antígeno de PSMA humano modificado y el antígeno de PSMA modificado reordenado 2.
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Los datos de ELISPOT en la tabla 11 demuestran que en general, la respuesta de linfocitos T inducida por el antígeno de PSMA modificado reordenado 2 en ratones HLA A24 es muy similar en su amplitud y magnitud contra el antígeno de PSMA humano modificado. SFC >100 se considera positivo.
2C. Rotura de la tolerancia inmunitaria a PSMA humano mediante antígenos de PSMA modificados reordenados Diseño del estudio. El modelo de ratón transgénico para PSMA humano usa ratones que se prepararon usando el promotor mínimo de probasina de rata que dirige la expresión de PSMA, específicamente en la glándula prostética (Zhang, Thomas y col. 2000) Endocrinology 141(12): 4698-4710. Estos ratones se produjeron en un fondo genético C57BL/6. Los datos de RT-PCR y de inmunohistoquímica confirmaron la expresión de PSMA en las raíces ventrales y dorsolaterales de la glándula prostética en estos ratones transgénicos para PSMA. Se espera que la expresión endógena de proteína PSMA humana en estos ratones genere tolerancia inmunitaria.
Resultados. Tal como se muestra en la Tabla 12, solo un 20% de los ratones transgénicos para PSMA fueron capaces de generar una respuesta de linfocitos T contra PSMA humano usando el antígeno de PSMA humano modificado. Sin embargo, un 67 % de los ratones transgénicos para PSMA fueron capaces de generar una respuesta de linfocitos T específica para PSMA usando el antígeno de PSMA modificado reordenado 2. Los datos sugieren que la inclusión de secuencias de aminoácidos no propias en el antígeno de PSMA modificado reordenado 2 mejoró la rotura de la tolerancia inmunitaria frente al antígeno PSMA humano en sí. SFC>50 se considera positivo. Tabla 12. Respuestas de linfocitos T en ratones transgénicos para PSMA contra un epítopo de PSMA conocido (PADYFAPGVKSYPDG; Durso RJ, Clin Cáncer Res. 1 de julio de 2007;13(13):3999-400).
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Ejemplo 3. Diseño de diversos polipéptidos de PSA inmunogénicos
El ejemplo 3 ilustra la construcción y ciertas propiedades biológicas de polipéptidos inmunogénicos de PSA en las formas citosólica, secretada y unida a membrana.
3A. Construcción de diversas formas de antígeno de PSA
De manera similar a lo que describió en el ejemplo 1 para las tres diferentes formas de polipéptido de PSMA inmunogénico (por ejemplo, las formas citosólicas, unidas a membrana y secretadas), también se diseñaron polipéptidos de PSA inmunogénicos en las tres formas basándose en la secuencia de PSA humano. Se construyó un polipéptido de PSA inmunogénico en forma citosólica, que consiste en los aminoácidos 25-261 del PSA humano nativo, eliminado la señal secretoria y el prodominio (aminoácidos 1-24). La secuencia de aminoácidos de este polipéptido inmunogénico citosólico de PSA se proporciona en la SEQ ID NO: 17. La forma secretada del polipéptido PSA es el PSA humano nativo de longitud completa (aminoácidos 1-261). Se construyó un polipéptido de PSA inmunogénico en forma unida a membrana uniendo la forma citosólica del polipéptido de PSA inmunogénico (aminoácidos 25-261 del PSA humano nativo) al dominio transmembrana de PSMA humano (aminoácidos 15-54 del PSMA humano).
3B. Respuestas inmunitarias en ratones Pasteur y HLA A24
Diseño del estudio. Se inmunizó a ratones HLA A2 Pasteur o HLA A24 de ocho a 10 semanas de edad con ADN que expresa los diversos antígenos de PSA usando PMED proporcionado en el ejemplo 3A en un régimen de cebado/refuerzo/refuerzo con intervalos de dos semanas entre cada vacunación, como se describió en el ejemplo 1. Se midieron las respuestas de linfocitos T y B específicas de antígeno 7 días después de la última inmunización en un ensayo ELISPOT de interferón gamma (IFNy) y un ELISA en sándwich.
Tabla 13. Inducción de respuestas de linfocitos T en ratones Pasteur y ratones HLA A24 vacunados con polipéptidos de PSA
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Resultados. La tabla 13 muestra datos de ELISPOT obtenidos de esplenocitos aislados de ratones HLA A2 Pasteur o ratones HLA A24 cultivados con péptidos obtenidos de la biblioteca de péptidos de PSA. Pueden detectarse linfocitos T en ratones tanto HLA A2 como HLA A24. SFC>100 se considera positivo.
Tabla 14. La inducción de respuestas de linfocitos T por antígenos PSA en ratones Pasteur contra células de cáncer humanas PSA+ HLA A2.1+ SKmel5
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Los datos de ELISPOT mostrados en la tabla 14 indican que los polipéptidos inmunogénicos en sus formas tanto citosólicas como unidas a membrana son capaces de inducir linfocitos T que reconocen células tumorales transducidas con adenovirus para expresar el antígeno PSA citosólico (SKmel5-Ad-PSA) pero no células transducidas con adenovirus para expresar eGFP (SKmel5-Ad-eGFP). Estos dos antígenos también provocaron una respuesta contra la proteína PSA. El antígeno PSA secretado no logró inducir linfocitos T contra SKmel5-Ad-PSA o la proteína PSA. SFC>50 se considera positivo.
Tabla 15. Inducción de respuesta de anticuerpos anti-PSA medida mediante un ensayo ELISA sándwich
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Los datos en la tabla 15 demuestran que los polipéptidos de PSA inmunogénicos en las formas tanto secretadas como unidas a membrana son capaces de inducir respuestas de anticuerpo anti-PSA.
Tabla 16. Grupos de péptidos de la biblioteca de péptidos de PSMA humano y secuencias de aminoácidos correspondientes
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(continuación)
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continuación
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continuación
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Tabla 17. Biblioteca de péptidos de PSA humanos
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continuación
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Tabla 18. Ortólogos de PSMA
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Tabla 19. Epítopos de linfocitos T conservados en el PSMA humano, como se expone en la SEQ ID NO: 1.
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Ejemplo 4. Construcción de construcciones de vacuna multiantígeno
En este ejemplo, se describen varias estrategias para expresar múltiples antígenos a partir de una construcción de vacuna de ADN de un solo componente. Estas construcciones de vacuna de ADN multiantígeno comparten la misma cadena principal de plásmido general que pPJV7563. Aunque las estrategias de expresión de múltiples antígenos se describen en el presente documento en el contexto de una vacuna de ADN, los principios se aplicarán de manera similar en el contexto de las vacunas genéticas de vectores víricos (tales como vectores adenovíricos). A menos que se especifique otra cosa, los genes incluidos en las construcciones multiantígeno codifican el antígeno de PSMA humano modificado (anotado como PSMA), PSCA humano de longitud completa (anotado como PSCA) y el antígeno citosólico de PSA humano (anotado como PSA), como se ha descrito anteriormente en los ejemplos en el presente documento.
Ejemplo 4a. Construcciones de antígeno dual
4A1. Construcción de construcciones de antígeno dual que utilizan múltiples promotores
Estrategia general. Una estrategia para crear construcciones de vacuna de ácido nucleico multivalentes es incorporar múltiples promotores independientes en un solo plásmido (Huang, Y., Z. Chen y col. (2008). "Design, construction, and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant". J Acquir Immune Defic Syndr 47(4): 403-411; Xu, K., Z. Y. Ling y col. (2011). "Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent d Na vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus". Viral Immunol 24(1): 45-56). El plásmido puede diseñarse para portar múltiples casetes de expresión, consistiendo cada uno en a) un promotor de eucariota para iniciar la transcripción dependiente de ARN polimerasa, con o sin un elemento potenciador, b) un gen que codifica un antígeno diana y c) una secuencia terminadora de la transcripción. Tras el suministro del plásmido al núcleo de la célula transfectada, se iniciará la transcripción a partir de cada promotor, dando como resultado la producción de ARNm separados, cada uno codificando uno de los antígenos diana. Los ARNm se traducirán independientemente, produciendo de este modo los antígenos deseados.
Plásmido 460 (promotor dual de PSMA/PSCA). El plásmido 460 se construyó usando las técnicas de mutagénesis de sitio dirigido, PCR e inserción de fragmento de restricción. En primer lugar, se introdujo un sitio de restricción de Kpn I cadena arriba del promotor de CMV en el plásmido 5259 usando mutagénesis de sitio dirigido con los cebadores MD5 y MD6, de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit Quickchange, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). En segundo lugar, se construyó un casete de expresión que consistía en un promotor de CMV mínimo, PSMA humano y terminador de la transcripción de B globulina de conejo mediante la PCR a partir del plásmido 5166 usando cebadores que portaban sitios de restricción de Kpn I (MD7 y MD8). El amplicón de la PCR se digirió con Kpn I y se insertó en el sitio de Kpn I recién introducido del plásmido 5259 tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIP).
4A2. Construcción de construcciones de antígeno dual que utilizan péptidos 2A
Estrategia general. También pueden expresarse múltiples antígenos proteínicos a partir de un solo vector mediante el uso de péptidos similares a 2A vírico (Szymczak, A. L. y D. A. Vignali (2005). "Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors". Expert Opin Biol Ther 5(5): 627-638; de Felipe, P., G. A. Luke, y col. (2006). "E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein". Trends Biotechnol 24(2): 68-75; Luke, G. A., P. de Felipe y col. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes". J Gen Virol 89 (Parte 4): 1036-1042; Ibrahimi, A., G. Vande Velde, y col. (2009). "Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences". Hum Gene Ther 20(8): 845-860; Kim, J. H., S. R. Lee, y col. (2011). "High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice". PLoS One 6(4): e18556). Estos péptidos, también denominados casetes de escisión o CHYSEL (por sus siglas en inglés, elementos de hidrolasa que actúan en cis), tienen aproximadamente 20 aminoácidos de longitud con un motivo D-V/I-EXNPGP carboxilo terminal altamente conservado (figura 2). Los casetes son raros en la naturaleza, encontrándose con mayor frecuencia en virus, tales como el virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la rinitis equina A (ERAV), virus de la encefalomiocarditis (EMCV), teschovirus porcino (PTV) y virus Thosea asigna (TAV) (Luke, G. A., P. de Felipe y col. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes". J Gen Virol 89 (Parte 4): 1036-1042). Con una estrategia de expresión de múltiples antígenos basada en 2A, los genes que codifican varios antígenos diana pueden unirse entre sí en un único marco abierto de lectura, separados por casetes 2A. Todo el marco abierto de lectura se puede clonar en un vector con un solo promotor y terminador. Tras el suministro de la vacuna genética a una célula, el ARNm que codifica los múltiples antígenos se transcribirá y traducida como una sola poliproteína. Durante la traducción de los casetes 2A, los ribosomas se saltan el enlace entre la glicina y la prolina C-terminal. El salto ribosómico actúa como una "escisión" autocatalítica cotraduccional que se libera cadena arriba de las proteínas cadena abajo. La incorporación de un casete 2A entre dos antígenos proteínicos da como resultado la adición de ~20 aminoácidos en el extremo C-terminal del polipéptido cadena arriba y 1 aminoácido (prolina) al extremo N-terminal de la proteína cadena abajo. En una adaptación de esta metodología, pueden incorporarse sitios de escisión de proteasa en el extremo N-terminal del casete 2A, de tal forma que las proteasas ubicuas escindirán el casete de la proteína cadena arriba (Fang, J., S. Yi, y col. (2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo". Mol Ther 15(6): 1153-1159).
Plásmido 451 (PSMA-T2A-PSCA). El plásmido 451 se construyó usando las técnicas de PCR solapante e intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó mediante la PCR el gen que codifica los aminoácidos 15-750 de PSMA usando como molde el plásmido 5166 con los cebadores 119 y 117. Se amplificó mediante la PCR el gen que codifica PSCA humano de longitud completa usando como molde el plásmido 5259 con los cebadores 118 y 120. La PCR dio como resultado la adición de secuencias TAV 2A (T2A) solapantes en el extremo 3' de PSMA y el extremo 5' de PSCA. Los amplicones se mezclaron entre sí y se amplificaron mediante la PCR con los cebadores 119 y 120. Se digirió el amplicón PSMA-T2A-PSCA con Nhe I y Bgl II y se insertó en el plásmido 5166 digerido de un modo similar. Se incluyó un enlazador de glicina-serina entre PSMa y el casete de T2A para promover una alta eficacia de escisión.
Plásmido 454 (PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 454 se creó usando las técnicas de la PCR e intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó mediante la PCR el gen que codifica PSCA humano de longitud completa usando como molde el plásmido 5259 con los cebadores 42 y 132. El amplicón se digirió con BamH I y se insertó en el plásmido 5300 tratado con CIP digerido de un modo similar. Se incluyó un enlazador de glicina-serina entre PSCA y el casete de FMDV 2A (F2A) para promover una alta eficacia de escisión.
Plásmido 5300 (PSA-F2A-PSMA) El plásmido 5300 se construyó usando las técnicas de PCR solapante e intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó mediante la PCR el gen que codifica los aminoácidos 25-261 de PSA a partir del plásmido 5297 con los cebadores MD1 y MD2. Se amplificó mediante la PCR el gen que codifica los aminoácidos 15-750 de PSMA a partir del plásmido 5166 con los cebadores MD3 y MD4. La PCR dio como resultado la adición de secuencias F2A solapantes en el extremo 3' de PSA y el extremo 5' de PSMA. Los amplicones se mezclaron entre sí y se extendieron mediante la PCR. Se digirió el amplicón PSA-F2A-PSMA con Nhe I y Bgl II y se insertó en el plásmido pPJV7563 digerido de un modo similar.
4A3. Construcciones de antígeno dual que utilizan sitios de entrada a ribosomas interno
Estrategia general: Una tercera estrategia para expresar múltiples antígenos proteínicos a partir de un solo plásmido 0 vector implica el uso de un sitio de entrada a ribosomas interno o IRES. Los sitios de entrada ribosomal internos son elementos de ARN (figura 3) encontrados en las regiones 5' no traducidas de ciertas moléculas de ARN (Bonnal, S., C. Boutonnet, y col. (2003). "IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database". Nucleic Acids Res 31(1): 427­ 428). Atraen ribosomas eucariotas al ARN para facilitar la traducción de los marcos abiertos de lectura corriente abajo. A diferencia de la traducción celular normal dependiente de remate de 7-metilguanosina, La traducción mediada por IRES puede iniciarse en codones AUG distantes dentro de una molécula de ARN. El proceso altamente eficiente se puede aprovechar para su uso en vectores de expresión multicistrónicos (Bochkov, Y. A. y A. C. Palmenberg (2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location". Biotechniques 41(3): 283-284, 286, 288). Típicamente, se insertan dos transgenes en un vector entre un promotor y un terminador de la transcripción en forma de dos marcos abiertos de lectura separados por un IRES. Tras el suministro de la vacuna genética a la célula, se transcribirá un solo transcrito largo que codifica ambos transgenes. El primer ORF se traducirá de la manera tradicional dependiente de remate, que termina en un codón de parada corriente arriba del IRES. El segundo ORF se traducirá de manera independiente del remate utilizando el IRES. De esta forma, pueden producirse dos proteínas independientes a partir de un solo ARNm transcritas a partir de un vector con un solo casete de expresión.
Plásmido 449 (PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 449 se construyó usando las técnicas de PCR solapante e intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó mediante la PCR el gen que codifica PSCA humano de longitud completa a partir del plásmido 5259 con los cebadores 124 y 123. Se amplificó mediante la PCR el IRES de EMCV a partir de pShuttle-IRES con los cebadores 101 y 125. Los amplicones solapantes se mezclaron entre sí y se amplificaron mediante la PCR con los cebadores 101 y 123. Se digirió el amplicón de IRES-PSCA con Bgl II y BamH I y se insertó en el plásmido 5166 tratado con CIP y digerido con Bgl II. A fin de fijar una mutación espontánea en el IRES, la secuencia de Avr II a Kpn I que contiene IRES se reemplazó con un fragmento equivalente de pShuttle-IRES.
Plásmido 603 (PSCA-pIRES-PSMA). El plásmido 603 se construyó usando las técnicas de PCR y clonación perfecta. Se amplificó el gen que codifica PSCA humano de longitud completa unido en su extremo 3' a un IRES de EMCV preferido, a partir del plásmido 455 mediante la PCR con los cebadores SD546 y SD547. Se amplificó mediante la PCR el gen que codifica los aminoácidos 15-750 de PSMA a partir del plásmido 5166 usando los cebadores SD548 y SD550. Los dos amplicones de la PCR solapantes se insertaron en pPJV7563 digerido con Nhe 1 y Bgl II mediante clonación perfecta, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Plásmido 455 (PSCA-mIRES-PSA). El plásmido 455 se construyó usando las técnicas de PCR solapante e intercambio de fragmentos de restricción. En primer lugar, se amplificó mediante la PCR el gen que codifica los aminoácidos 25-261 de PSA a partir del plásmido 5297 con los cebadores 115 y 114. Se amplificó mediante la PCR el IRES de EMCV a partir de pShuttle-IRES con los cebadores 101 y 116. Los amplicones solapantes se mezclaron entre sí y se amplificaron mediante la PCR con los cebadores 101 y 114. Se digirió el amplicón de IRES-PSA con Bgl II y BamH I y se insertó en el plásmido 5259 tratado con CIP y digerido con Bgl II. A fin de fijar una mutación espontánea en este clon, la secuencia de Bgl II a BstE II se reemplazó con un fragmento equivalente proveniente de una reacción de PCR solapante reciente.
Ejemplo 4b. Construcciones de ADN de triple antígeno
Estrategia general. Se caracterizaron las capacidades de los vectores de expresión de antígeno dual para dirigir la expresión de PSMA, PSCA y/o PSA en células HEK293 transfectadas (figuras 4-6). Una serie de casetes de expresión de antígeno dual, incluyendo PSA-F2A-PSMA, PSMA-mIRES-PSCA, PSMA-T2A-PSCA, PSA-T2A-PSCA, PSCA-F2A-PSMA,
PSCA-pIRES-PSMA y PSMA-mIRES-PSA, se seleccionaron para su incorporación en diversas combinaciones en vectores de expresión de triple antígeno. En todos los casos, los vectores se basaron en la cadena principal del plásmido pPJV7563 precursor. Cuatro vectores (plásmidos 456, 457, 458 y 459) utilizaron un solo promotor completo de CMV con un terminador de la transcripción de B globina de conejo para dirigir la expresión de los tres antígenos. Otros dos vectores (plásmidos 846 y 850) incorporaron una estrategia de promotor dual, en combinación con o un IRES o 2A para dirigir la expresión de los tres antígenos. Los vectores con múltiples casetes de 2A se modificaron para portar diferentes casetes para minimizar la probabilidad de recombinación entre el primer y el segundo casete durante la amplificación del plásmido/vector. Se demostró mediante citometría de flujo la expresión de antígeno (figura 7) y transferencia de Western (figura 8).
Plásmido 456 (PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA). El plásmido 456 se construyó mediante intercambio de fragmentos de restricción. El plásmido 5300 se digirió con Nhe I y Hpa I y se ligó el inserto de ~1,8 kb en el plásmido 449 digerido de un modo similar.
Plásmido 457 (PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA). El plásmido 457 se construyó mediante intercambio de fragmentos de restricción. El plásmido 5300 se digirió con Nhe I y Hpa I y se ligó el inserto de ~1,8 kb en el plásmido 451 digerido de un modo similar.
Plásmido 458 (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 458 se construyó usando las técnicas de la PCR e intercambio de fragmentos de restricción. Se amplificó mediante la PCR el gen que codifica los aminoácidos 25-261 de PSA a partir del plásmido 5297 con los cebadores 119 y 139, dando como resultado la adición de una secuencia de T2A y el sitio de restricción de Nhe I en el extremo 3'. El amplicón se digirió con Nhe I y se insertó en el plásmido 454 digerido de un modo similar.
Plásmido 459 (PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA). El plásmido 459 se construyó mediante intercambio de fragmentos de restricción. El plásmido 454 se digirió con Nhe I y Bgl II y se ligó el inserto que contiene PSCA-F2A-PSMA en el plásmido 455 digerido de un modo similar.
Plásmido 846 (CBA-PSA, CMV-PSCA-pIRES-PSMA). El plásmido 846 se construyó usando las técnicas de PCR y clonación perfecta. En primer lugar, se sintetizó un casete de expresión que consistía en 1) el promotor y la región 5' no traducida del gen de beta actina (CBA) de pollo, 2) un intrón híbrido de beta actina de pollo/beta globina de conejo, 3) el gen que codifica los aminoácidos 25-261 de PSA humano y 4) el terminador de la hormona del crecimiento bovina. Este casete de expresión de PSA se amplificó mediante la PCR a partir del plásmido 796 con los cebadores 3SalICBA y 5SalIBGH. El amplicón se clonó en el sitio de SalI del plásmido 603 usando un kit de Clonación y Ensamblaje Perfectos de GeneArt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tras el suministro de este plásmido a una célula, la expresión de PSA se impulsará por el promotor CBA, mientras que la expresión de PSCa y PSMA se impulsará por el promotor de CMV.
Plásmido 850 (CBA-PSA, CMV-PSCA-F2A-PSMA). El plásmido 850 se construyó usando las técnicas de PCR y clonación perfecta. En primer lugar, el casete de expresión de PSA dirigido por el promotor de CBA se amplificó mediante la PCR a partir del plásmido 796 con los cebadores 3SalICBA y 5SalIBGH. El amplicón se clonó en el sitio de SalI del plásmido 454 usando Clonación y Ensamblaje Perfectos de GeneArt. Tras el suministro de este plásmido a una célula, la expresión de PSA se impulsará por el promotor CBA, mientras que la expresión de PSCA y PSMA se impulsará por el promotor de CMV.
Tabla 20. Lista de plásmidos que expresan múltiples antígenos
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continuación
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Tabla 21. Lista de cebadores usados en la construcción de los plásmidos multiantígeno
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continuación
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Ejemplo 4c. Construcciones de adenovirus de triple antígeno
Estrategia general. Al igual que con plásmidos de ADN, los vectores de vacuna vírica pueden modificarse para administrar múltiples antígenos de cáncer de próstata. Las tres estrategias de expresión de múltiples antígenos descritas anteriormente para vacunas de ADN - promotores duales, péptidos 2A y sitios de entrada a ribosomas internos - se incorporaron en diversas combinaciones para crear vectores adenovíricos de triple antígeno. En resumen, se clonaron los casetes de expresión multiantígeno en un plásmido pShuttle-CMV modificado para portar dos copias de la secuencia operadora de tetraciclina (TetO2). Se crearon vectores de adenovirus recombinante de serotipo 5 usando el sistema de vector AdEasy de acuerdo con los protocolos del fabricante (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Los virus se amplificaron en células HEK293 y se purificaron mediante doble bandeo en cloruro de cesio de acuerdo con protocolos estándar. Antes de los estudios in vivo, se caracterizaron exhaustivamente las reservas de virus respecto de la concentración de partículas víricas, título infeccioso, esterilidad, endotoxinas, integridad genómica y de transgén, identidad del transgén y expresión.
Adenovirus-733 (PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA). Ad-733 es el equivalente en virus del plásmido 457. La expresión de los tres antígenos está dirigida por un solo promotor de CMV con un operador de tetraciclina para reprimir la expresión del transgén durante la expresión a gran escala en líneas HEK293 que expresan el represor Tet. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos secuencias 2A diferentes.
Adenovirus-734 (PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA). Ad-734 es el equivalente en virus del plásmido 458. La expresión de los tres antígenos está dirigida por un solo promotor de CMV con un operador de tetraciclina para reprimir la expresión del transgén durante la expresión a gran escala en líneas HEK293 que expresan el represor Tet. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos secuencias 2A diferentes.
Adenovirus-735 (PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA). Ad-735 es el equivalente en virus del plásmido 459. La expresión de los tres antígenos está dirigida por un solo promotor de CMV con un operador de tetraciclina para reprimir la expresión del transgén durante la expresión a gran escala en líneas HEK293 que expresan el represor Tet. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen una secuencia de 2A y un IRES.
Adenovirus-796 (CBA-PSA, CMV-PSCA-pIRES-PSMA). Ad-796 es el equivalente en virus del plásmido 846. La expresión de PSA está dirigida por el promotor de beta actina de pollo, mientras que la expresión de PSCA y PSMA está dirigida por el promotor CMV-TetO2. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos promotores y un IRES.
Adenovirus-809 (CBA-PSA, CMV-PSCA-F2A-PSMA). Ad-809 es el equivalente en virus del plásmido 850. La expresión de PSA está dirigida por el promotor de beta actina de pollo, mientras que la expresión de PSCA y PSMA está dirigida por el promotor CMV-TetO2. Las estrategias de expresión multiantígeno incluyen dos promotores y una secuencia de 2A.
Ejemplo 5. Inmunogenicidad de las vacunas de ADN de triple antígeno
El ejemplo 5 ilustra la capacidad de las construcciones de vacuna de ácido nucleico de triple antígeno que expresan PSMA, PSCA y PSA para generar respuestas de linfocitos T y B específicas de antígeno contra los tres antígenos de próstata codificados.
Estudio de respuesta inmunitaria celular. La inmunogenicidad de las construcciones de triple antígeno que contienen PSMA, PSCA y PSA, como se describe en el ejemplo 5, se estudió en ratones C57BL/6 de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.
Se cebó a ratones C57BL/6 hembra en el día 0 y se les reforzó en los días 14, 28 y 49 con construcciones de vacuna de ADN que codificaban antígenos PSMA, PSCA y PSA humanos mediante la administración de PMED. En total, se evaluaron cuatro estrategias de vacunación de triple antígeno diferentes, que incluyeron tres vacunas de ADN que coexpresaron las proteínas diana y una estrategia de coformulación. Para la coexpresión, se usaron del siguiente modo plásmidos de ADN individuales que codifican los tres antígenos de próstata unidos mediante péptidos 2A o sitios de entrada a ribosomas internos (IRES): PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA (n.° de ID del plásmido 457), PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA (n.° de ID del plásmido 458) y PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA (n.° de ID del plásmido 459). Para la estrategia de coformulación, tres plásmidos de ADN, que codificaban cada uno individualmente PSMA, PSCA o PSA, se coformularon en una sola partícula de oro para el suministro de PMED. Con la excepción de la coformulación, los elementos de ADN que controlan la coexpresión (2A e IRES) difieren en cuanto a su longitud, eficacia de expresión del transgén y la presencia de material genético extraño unido a los transgenes diana. Como controles, se vacunó a ratones C57BL/6 con ADN que expresa un solo antígeno de próstata, ya sea PSMA, PSCA o PSA. Para las vacunas de ADN de triple antígeno coexpresado o un solo antígeno, se administró mediante administración de PMED una dosis de 2 |jg de plásmido de vacuna de ADN, mientras que se administraron mediante administración de PMED 1 jg de cada una de las vacunas de ADN de triple antígeno coformuladas (un total de 3 jg). Se midieron las respuestas inmunitarias celulares contra las vacunas de triple y un solo antígeno recogiendo los bazos de cada animal en el día 56, siete días después de la vacunación final con PMED. Se aislaron esplenocitos y se sometieron a un ensayo ELISPOT para IFN-y para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA, PSCA y PSA. En resumen, se sembraron 2x105 esplenocitos de animales individuales por pocillo con 5x104 por pocillo de células TRAMP-C2 (próstata de adenocarcinoma de ratón transgénico) que expresan de manera estable un solo antígeno de próstata humano o PSMA, PSCA y PSA juntos o con grupos individuales de péptidos específicos de PSMA, PSCA y PSA humanos a 10 jg/ml (véase la tabla 22 para los péptidos y la composición del grupo de péptidos) o solo medio como control. Cada condición se realizó por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C y CO2 al 5 %, se lavaron y se revelaron después de la incubación, según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de células formadoras de puntos de IFN-y (SFC) mediante un lector de Cellular Technology Ltd. (CTL). Los resultados se presentan en las figuras 9 y 10, que muestran el número medio de SFC específicos para PSMA, PSCA o PSA /- la desviación típica de cinco ratones por grupo, normalizado a 1x106 esplenocitos.
Tabla 22. Los péptidos 15-meros de PSMA, PSCA y PSA que se evaluaron en el ensayo ELISPOT. Se indica la posición de aminoácido de los extremos N y C-terminales de cada péptido.
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Estudio de respuesta de anticuerpos. Se midieron las respuestas de anticuerpo contra las vacunas de triple y un solo antígeno recogiendo suero de cada animal en el día 56, siete días después de la vacunación final con PMED. El suero se sometió a ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para determinar los títulos de anticuerpo anti-PSMA y anti-PSCA. En resumen, las placas de ELISA se recubrieron con 1 jg/ml de PSMA o PSCA humano y se incubaron durante una noche a 4 °C. Después, se bloquearon las placas y se incubaron a TA durante 1h con seroalbúmina bovina (BSA) al 1 %. Cada muestra de suero se diluyó en serie por duplicado partiendo a una dilución 1:100 y se incubó durante 1h a TA. Después del lavado, se incubó un anticuerpo IgG policlonal de cabra anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) a TA durante 1 h. Después del lavado, se incubó el sustrato de TMB peroxidasa EIA a TA durante 30 min. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 1N y después se leyó la absorbancia a 450 nm. Se representaron curvas de titulación para cada muestra de suero (dilución de muestra frente a absorbancia). Después, el título sérico (posteriormente transformado a título recíproco) se tomó como la muestra de suero más diluida ensayada con un valor de densidad óptica (DO) superior al límite inferior de detección (LLOD; fondo más 3 desviaciones estándar) o la dilución de suero calculada para lograr un valor de DO de 1,0. Los resultados se presentan en las figuras 11 y 12, que muestran los títulos promedio /- la desviación típica de cinco ratones por grupo.
El suero también se sometió a un ensayo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para medir la unión de anticuerpos a PSMA o PSCA humanos expresados en la superficie celular de líneas celulares adecuadas, determinando de este modo si los anticuerpos generados mediante las vacunas multiantígeno eran capaces de reconocer las conformaciones nativas de PSMA y PSCA, respectivamente. Las células LNCaP (adenocarcinoma de próstata humano) se utilizaron para medir la unión de anticuerpos a PSMA nativo. Las células PC3 (cáncer de próstata humano) sirvieron como control en el ensayo de FACS, ya que estas células no expresan PSMA humano. Las células MIA-PaCa-2 (carcinoma pancreático humano) transducidas con un adenovirus que expresa PSCA humano (Ad-PSCA) se utilizaron para medir la unión de anticuerpo a PSCA nativo. Las células MIA-PaCa-2 sirvieron como control. En resumen, para medir la unión de anticuerpos anti-PSMA, se incubaron 2x105 células LNCaP o PC3 con una dilución 1:100 de suero de ratón o 15 pg/ml del anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón anti-PSMA humano de control (clon J591-A) durante 20 min a 4 °C. Para medir la unión de anticuerpos anti-PSCA, se incubaron 2x105 células MIA-PaCa-2 transducidas y no transducidas con Ad-PSCA con una dilución 1:30 de suero de ratón o 4 pg/ml del mAb de control de ratón anti-PSCA humano (clon 7F5) durante 20 min a 4 °C. Posteriormente, se lavaron las células y se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a ficoeritrina (PE) y un colorante de vivas/muertas durante 20 min adicionales a 4 °C. Después de la incubación, se lavaron las células y se resuspendieron en paraformaldehído al 1,5 % y se recogieron 10.000 células vivas en un dispositivo FACS Canto II. Los resultados se presentan en las figuras 13 y 14, que muestran el múltiplo de cambio medio en la intensidad media de fluorescencia (IMF) del suero de ratón frente al anticuerpo secundario anti-ratón solo /- la desviación típica de cinco ratones por grupo. Los títulos de anticuerpo no se midieron debido a que PSA se expresó como una proteína citoplasmática por las vacunas multiantígeno investigadas en este estudio.
Resultados:
Las figuras 9A-9D muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa las respuestas inmunitarias celulares de las vacunas de triple antígeno mediante ensayo ELISPOT de IFN-y. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, siete días después de la última vacunación con PMEd , se evaluó el reconocimiento de los antígenos de próstata endógenos examinando las respuestas de linfocitos T contra células (A) TRAMP C2-PSMA, (B) TRAMP C2-PSCA, (C) TRAMP C2-PSA y (D) TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA mediante el ensayo ELISPOT de IFN^y. Las células TrAm P C2 sirvieron como control de fondo para el ensayo. Para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra PSMA endógeno, se observó una respuesta significativa a TRAMP C2-PSMA después de una sola vacunación con PMED contra PSMA, lo que fue coherente con las respuestas observadas en otros estudios. Se detectó una respuesta de linfocitos T de IFN-y específica para PSMA a la de TRAMP C2-PSMA después de las vacunaciones con triple antígeno. En cambio, se observó una supresión completa de la respuesta después de la vacunación con PSMA, PSCA y PSA formulados conjuntamente (* indica p < 0,05 mediante ANOVA de dos vías). Para las respuestas de linfocitos T de IFN- □y contra PSCA endógeno, no se observó una diferencia significativa en la respuesta a las células TRAMP C2-PSCA cuando se comparó la vacuna individual contra PSCA con las cuatro vacunas de triple antígeno diferentes. Para las respuestas de linfocitos T de IFN- □y contra PSA endógeno, se detectó una reducción significativa en la magnitud de la respuesta a TRAMP C2-PSA cuando se comparó la inmunogenicidad de la vacuna contra PSA individual con PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA (*** indica p < 0,001 mediante ANOVA de dos vías) o la vacuna coformulada (* indica p < 0,05 mediante ANOVA de dos vías). Cuando se examina la respuesta a TRAMP C2-PSMA-PSCA-PSA, se observó la mayor magnitud de respuesta de linfocitos T de IFN-y después de la vacuna con PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA. En conjunto, estos datos demuestran el reconocimiento de PSMA, PSCA y PSA endógenos y la generación de respuestas de linfocitos T específicas de antígeno contra los tres antígenos de próstata usando una estrategia de vacunación de coexpresión de ADN, especialmente con la construcción de vacuna PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA. Sin embargo, la estrategia de vacunación de coformulación de ADN dio como resultado una pérdida de respuestas de linfocitos T de IFN-^y específicas de antígeno contra PSMA y PSA.
Las figuras 10A-10D muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de triple antígeno mediante ensayo ELISPOT de IFN-y. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluaron las respuestas de linfocitos T contra (A) péptidos de PSMA, (B) grupos de péptidos de PSMA, (C) péptidos de PSCA y (D) péptidos de PSA (véase la tabla 22) mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y. El medio solo sirvió como control de fondo para el ensayo. Para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra los péptidos de PSMA tanto individuales como agrupados, en comparación con la vacuna de PSMA individual, se observó la mayor magnitud de la respuesta después de la administración de la vacuna de triple antígeno PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA. De forma similar, la mayor magnitud de la respuesta de linfocitos T de IFN-y contra péptidos específicos de PSCA y PSMA se detectó después de la administración de la vacuna de PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA. La vacuna de PSMA, PSCA y PSA coformulados dio como resultado respuestas de linfocitos T de bajas a nulas contra péptidos específicos de PSMA y respuestas de baja magnitud contra los péptidos específicos de PSCA y PSA. Estos datos también demuestran la generación de respuestas de linfocitos T contra PSMa , PSCA y PSA cuando se coexpresan a partir de la misma construcción de vacuna. Se produjeron respuestas consistentes y robustas de linfocitos T de IFN-y T contra los tres antígenos de próstata después de la vacunación con PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA y reducciones significativas en la magnitud de las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra los antígenos de próstata después de las vacunaciones con PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA, PSMA-F2A-PSMA-IRES-PSA y PSMA, PSCA y PSA coformulados.
La figura 11 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante los títulos de anticuerpo anti-PSMA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSMA. Todos los animales vacunados con PSMA generaron títulos significativos de anticuerpo anti-PSMA. No hubo diferencias significativas entre los títulos, aunque la vacunación con PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA dio como resultado títulos ligeramente inferiores en comparación con los otros grupos vacunados con PSMA. Estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSMA después de la vacunación con triple antígeno, usando estrategias de vacuna tanto de coexpresión como de coformulación.
La figura 12 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno triple mediante los títulos de anticuerpo anti-PSCA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSCA. Se detectaron títulos de anticuerpo en ratones vacunados con PSCA solo y PSMA, PSCA y PSA coformulados. Estos resultados indican que la coformulación de PSMA, PSCA y PSA genera un título de anticuerpo anti-PSCA detectable que es comparable al de las estrategias de vacunación de coexpresión de ADN. La figura 13 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de triple antígeno mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSMA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluó el reconocimiento de PSMA nativo en la superficie celular mediante la unión de anticuerpos séricos a células LNCaP y PC3. Las células PC3 sirvieron como control de fondo para el ensayo. La vacunación con PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA dio como resultado anticuerpos anti-PSMA con una capacidad de unión significativamente menor a las células LNCaP en comparación con ratones vacunados con PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA y PSMA solo (* indica un valor de p < 0,05 mediante ANOVA de una vía). Los demás grupos vacunados con PSMA no mostraron diferencias significativas en la unión de anticuerpos anti-PSMA. El múltiplo de cambio frente al anticuerpo secundario solo para el mAb J591-A fue de 45,3 (datos no mostrados). En general, estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSMA que reconocen a PSMA nativo después de la vacunación con triple antígeno, usando estrategias de vacunación tanto de coexpresión como de coformulación de ADN.
La figura 14 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de triple antígeno mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSCA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, el reconocimiento de PSCA nativo en la superficie celular se evaluó mediante la unión de anticuerpo sérico a células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA y no transducidas. Las células precursoras no transducidas sirvieron como control de fondo para el ensayo. Con la excepción de las vacunas de PSMA individual y PSA cito. individual, todos los regímenes de vacuna con PSCA dieron como resultado una unión de anticuerpos anti-PSCA significativa contra células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA, en comparación con las células precursoras. No hubo diferencias significativas en la unión de anticuerpos anti-PSCA contra células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA entre los grupos vacunados con PSCA (ANOVa de una vía, valor de p > 0,05). El múltiplo de cambio frente al anticuerpo secundario solo para el mAb 7F5 fue de 18,7 (datos no mostrados). En general, Estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSCA que reconocen a PSCA nativo después de la vacunación con triple antígeno, usando estrategias de vacunación tanto de coexpresión como de coformulación de ADN.
Ejemplo 6. Inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la capacidad de las vacunas de antígeno dual que expresan dos antígenos de próstata para generar respuestas de linfocitos T y B específicas de antígeno contra los dos antígenos de próstata codificados.
6A. Inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual que contienen PSMA y PSCA en C57BU6:
Procedimiento del estudio.
Estudio de respuesta inmunitaria celular. Se cebó a ratones C57BL/6 hembra en el día 0 y se les reforzó en los días 14, 28, 42 y 70 con ADN que expresa PSMA y PSCA humano mediante inyección epidérmica de PMED. En total, se evaluaron cinco estrategias de vacunación con ADN de antígeno dual diferentes, que incluyeron cuatro vacunas de ADN que coexpresaron los antígenos y una estrategia de coformulación. Para la coexpresión, se administraron plásmidos de vacuna de ADN que codifican dos antígenos de próstata, PSMA y PSCA, unidos mediante un promotor dual, péptidos 2A o IRES. Estos incluyeron el promotor dual de PSMA-PSCA (ID del plásmido 460), PSMA-T2A-PSCA (n.° de ID del plásmido 451), PSCA-F2A-PSMA (n.° de ID del plásmido 454) y PSCA-IRES-PSMA (n.° de ID del plásmido 603). Para la coformulación, dos plásmidos diferentes, que codifican cada uno individualmente PSMA y PSCA, se coformularon en una sola partícula de oro para el suministro de PMED. Con la excepción de la coformulación, los elementos de ADN que controlan la coexpresión (promotor dual, 2A e IRES) difieren en cuanto a su longitud, eficacia de expresión del transgén y la presencia de material genético extraño unido a los transgenes diana. Como controles, se vacunó a ratones C57BL/6 con ADN que expresa un solo antígeno de próstata, PSMA o PSCA. Para las vacunas de ADN de antígeno dual coexpresado o un solo antígeno, se administró una dosis total de 2 |jg de vacuna de ADN mediante administración de p Me D, mientras que se administraron 2 |jg de cada plásmido de vacuna de ADN (total de 4 jg de ADN por administración) para la coformulación. Se midieron las respuestas inmunitarias celulares de las vacunas de antígeno dual e individual recogiendo los bazos de cada animal en el día 77, siete días después de la vacunación final con PMED. Se aislaron esplenocitos y se sometieron a un ensayo ELISPOT para IFN-y para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSCa y PSCA. En resumen, se sembraron 2x105 esplenocitos de animales individuales por pocillo con 5x104 por pocillo de células TRAMP-C2 que expresan un solo antígeno endógeno de próstata humano o PSMA, PSCA y pSa juntos o con grupos individuales de péptidos específicos de PSMA y PSCA humanos a 10 jg/ml (véase la tabla 22 para los péptidos y la composición del grupo de péptidos) o solo medio como control. Cada condición se realizó por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C y CO2 al 5 %, se lavaron y se revelaron después de la incubación, según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de SFC de IFN-y mediante un lector de CTL. Los resultados se presentan en las figuras 15 y 16, que muestran el número medio de SFC específicos para PSMA o PSCA /- la desviación típica de cinco ratones por grupo, normalizado a 1x106 esplenocitos.
Estudio de respuesta de anticuerpos. Se midieron las respuestas de anticuerpo contra las vacunas de antígeno dual e individual recogiendo suero de cada animal en el día 77, siete días después de la vacunación final con PMED. Se determinaron los títulos séricos de anticuerpo anti-PSMA y anti-PSCA usando ELISA, como se ha descrito en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en las figuras 17 y 18, que muestran los títulos promedio /- la desviación típica de cinco ratones por grupo.
El suero también se sometió a un ensayo de FACS para medir la unión de anticuerpos a PSMA o PSCA humanos expresados en la superficie celular de líneas celulares adecuadas, determinando de este modo si los anticuerpos generados mediante las vacunas multiantígeno eran capaces de reconocer las conformaciones nativas de PSMA y PSCA, respectivamente. No se midió la unión de anticuerpo a PSA nativo en la superficie celular debido a que PSA se expresó como una proteína citoplasmática por las vacunas multiantígeno investigadas en este estudio. El ensayo FACS se llevó a cabo de acuerdo con un procedimiento como el descrito en el ejemplo 5. Los resultados presentados en las figuras 19 y 20, muestran el múltiplo de cambio medio en la IMF del suero de ratón frente al anticuerpo secundario anti-ratón solo /- la desviación típica de cinco ratones por grupo. No se midieron los títulos y la unión de anticuerpo a PSA nativo en la superficie celular debido a que PSA se expresó como una proteína citoplasmática por las vacunas multiantígeno investigadas en este estudio.
Resultados.
Las figuras 15A-165C muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante ensayo ELISPOT de IFN-y. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28, 42 y 70. En el día 77, el reconocimiento de Ps Ma y PSCA endógenos se evaluó examinando las respuestas de linfocitos T contra células (A) TRAMP C2-PSMA, (B) TRAMP C2-PSCA y (C) TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA mediante el ensayo ELISPOT de IFN-^y. Las células TRAMP C2 sirvieron como control de fondo para el ensayo. Para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra PSMA endógeno, se redujo significativamente la magnitud de la respuesta de TRAMP C2-PSMA después de la vacunación con promotor dual de PSMA-PSCA, PSMA-T2A-Ps Ca , PSCA-IRES-PSMA y PSmA PSCA coformulados en comparación con la vacunación solo con PSMA (** y *** indican valores de p < 0,01 y < 0,001, respectivamente, mediante ANOVA de dos vías). Sin embargo, la construcción de vacuna PSCA-F2A-PSMA provocó una magnitud similar de respuesta de linfocitos T de IFN-y T contra las células TRAMP C2-PSMA que la vacuna con PSMA individual. Para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra PSCA endógeno, se observaron respuestas significativamente aumentadas después de la vacunación con varias de las vacunas de antígeno dual, incluyendo promotor dual de PSMA-PSCA, PSCA-F2A-PSMA, PSCA-IRES-PSMA y PSMA PSCA coformulados, en comparación con la vacuna de solo PSCA (*, ** y *** indican valores de p de < 0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente, mediante ANOVA de dos vías). La construcción de vacuna PSCA-T2A-PSMA provocó una magnitud similar de respuesta de linfocitos T de IFN-y T contra las células TRAMP C2-PSCA que la vacuna con PSCA individual. Comparando las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA, no hubo diferencias significativas entre los grupos vacunados con diferentes vacunas de antígeno dual. En conjunto, estos datos demuestran la generación de respuestas de linfocitos T específicas de PSMA y PSCA después de la vacunación con antígeno dual, usando estrategias de vacunación tanto de coexpresión como de coformulación de ADN.
Las figuras 16A-16C muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante ensayo ELISPOT de IFN-y. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28, 42 y 70. En el día 77, se evaluaron las respuestas de linfocitos T contra (A) péptidos de PSMA, (B) grupos de péptidos de PSMA y (C) péptidos de PSCA (véase la tabla 22) mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y. El medio solo sirvió como control de fondo para el ensayo. Para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra los péptidos de PSMA tanto individuales como agrupados, se observaron las respuestas de mayor magnitud en comparación con la vacuna de PSMA individual después de las vacunaciones de antígeno dual con PSMA-T2A-PSCA y PSCA-F2A-PSMA. Se observó una reducción significativa en la respuesta de linfocitos T de IFN-y a los péptidos de PSMA individuales después de la vacunación con promotor dual de PSMA-PSCA, PSCA-IRES-PSMA y PSMA PSCA formulados conjuntamente. La respuesta de linfocitos T de IFN-y al péptido específico de PSCA fue similar entre los grupos vacunados con las diferentes vacunas de antígeno dual. Estos datos demuestran también la generación de respuestas de linfocitos T contra PSMA y PSCA cuando se coexpresan en la misma construcción de vacuna de ADN o se administran como una coformulación.
La figura 17 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSMA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28, 42 y 70. En el día 77, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSMA. Todos los animales vacunados con PSMA generaron títulos significativos de anticuerpo anti-PSMA. Los ratones vacunados con la construcción de vacuna dual, PSCA-F2A-PSMA y la vacuna de PSMa individual generaron títulos de anticuerpos significativamente mayores en comparación con todos los demás grupos de ratones vacunados con PSMA (ANOVA de una vía, valor de p < 0,05). La vacunación con promotor dual de PSMA-PSCA y PSMA y PSCA coformulados dio como resultado mayores títulos de anticuerpo en comparación con los ratones que recibieron la vacuna de PSMA-T2A-PSCA. En conjunto, Estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSMA después de la vacunación con ADN de antígeno dual con PSMA y PSCA, usando estrategias de vacunación tanto de coexpresión como de coformulación.
La figura 18 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSCA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28, 42 y 70. En el día 77, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSCA. Los ratones vacunados con PSMA y PSCA coformulados y la vacuna de PSCA individual generaron títulos de anticuerpos significativamente mayores en comparación con todos los demás grupos de ratones vacunados con PSCA (ANOVA de una vía). La vacunación con promotor dual de PSMA-PSCA dio como resultado mayores títulos de anticuerpo en comparación con la vacunación con PSMA-T2A-PSCA, PSCA-F2A-PSMA y PSCA-IRES-PSMA. Estos resultados indican que la coexpresión o coformulación de PSMA y PSCA genera anticuerpos anti-PSCA.
La figura 19 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSMA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28, 42 y 70. En el día 77, se evaluó el reconocimiento de PSMA nativo en la superficie celular mediante la unión de anticuerpos séricos a células LNCaP y PC3. Las células PC3 sirvieron como control de fondo para el ensayo. Con la excepción de la vacuna de PSCA individual, todos los regímenes de vacuna con PSMA dieron como resultado una unión de anticuerpos anti-PSMA significativa contra células LNCaP, en comparación con las células PC3 de control. No hubo diferencias significativas en la unión de anticuerpos anti-PSMA contra células LNCaP entre los grupos vacunados con PSMA (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05). El múltiplo de cambio frente al anticuerpo secundario solo para el mAb J591-A fue de 45,3 (datos no mostrados). Estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSMA que reconocieron a PSMA nativo después de la vacunación con antígeno dual, usando estrategias de vacunación tanto de coexpresión como de coformulación.
La figura 20 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSCA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28, 42 y 70. En el día 77, el reconocimiento de PSCA nativo en la superficie celular se evaluó mediante la unión de anticuerpo sérico a células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA y no transducidas. Las células precursoras no transducidas sirvieron como control de fondo para el ensayo. Con la excepción de la vacuna de PSMA individual, todos los regímenes de vacuna con PSCA dieron como resultado una unión de anticuerpos anti-PSCA significativa contra células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA, en comparación con las células de control. No hubo diferencias significativas en la unión de anticuerpos anti-PSCA contra células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA entre los grupos vacunados con PSCA (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05). El múltiplo de cambio frente al anticuerpo secundario solo para el mAb 7F5 fue de 18,7 (datos no mostrados). En general, estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSCA que reconocieron a PSCA nativo después de la vacunación con antígeno dual, usando estrategias de vacunación tanto de coexpresión como de coformulación.
6B. Inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual que contienen PSMA y PSA o PSCA y PSA en C57BU6
Procedimiento del estudio.
Estudio de respuesta inmunitaria celular. Se cebó a ratones C57BL/6 hembra en el día 0 y se les reforzó en los días 14 y 28 con ADN que expresa PSMA, PSCA y PSA humano mediante inyección epidérmica de PMED. En total, se evaluaron cuatro estrategias de vacunación de antígeno dual diferentes, que incluyeron dos estrategias de coexpresión y dos estrategias de coformulación. Para la coexpresión, se administró un solo plásmido de ADN que codifica dos antígenos de próstata, PSMA y PSA unidos a un péptido 2A (n.° de ID del plásmido 5300) o PSCA y PSA unidos mediante IRES (n.° de ID del plásmido 455). Para la coformulación, se coformularon en una sola partícula de oro para el suministro de PMED plásmidos que codificaban individualmente PSMA, PSCA o PSA. Específicamente, estos incluyeron PSMA y PSA coformulados y PSCA y PSA coformulados. Como controles, se vacunó a ratones C57BL/6 con ADN que expresa un solo antígeno de próstata, PSMA, PSCA o PSA. Para las vacunas de antígeno dual coexpresado o un solo antígeno, se administró mediante administración de PMED una dosis de 2 |jg de ADN, mientras que se administraron 2 |jg de cada plásmido de vacuna de ADN (total de 4 |jg de ADN por administración) para la coformulación. Se midieron las respuestas inmunitarias celulares de las vacunas de antígeno dual e individual recogiendo los bazos de cada animal en el día 35. Se aislaron esplenocitos y se sometieron a un ensayo ELISPOT para IFN-y para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA, PSCA y PSA. En resumen, se sembraron 2x105 esplenocitos de animales individuales por pocillo con 5x104 por pocillo de células TRAMP-C2 que expresan un solo antígeno endógeno de próstata humano o PSMA, PSCA y PSA juntos o con grupos individuales de péptidos específicos de PSMA, PSCA y PSA humanos a 10 jg/ml (véase la tabla 22 para los péptidos y la composición del grupo de péptidos) o solo medio como control. Cada condición se realizó por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C y CO2 al 5 %, se lavaron y se revelaron después de la incubación, según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de SFC de IFN-y mediante un lector de CTL. Los resultados se presentan en las figuras 21 y 22, que muestran el número medio de SFC específicos para PSMA, PSCA y PSA /- la desviación típica de cinco ratones por grupo, normalizado a 1x106 esplenocitos.
Estudio de respuesta de anticuerpos. Se cebó a ratones C57BL/6 hembra en el día 0 y se les reforzó en los días 14, 28 y 49 con ADN que expresa PSMA, PSCA y PSA humano mediante PMED. Se midieron las respuestas de anticuerpo contra las vacunas de antígeno dual e individual recogiendo suero de cada animal en el día 56, siete días después de la vacunación final con PMED. Se determinaron los títulos séricos de anticuerpo anti-PSMA y anti-PSCA usando el ensayo ELISA, como se ha descrito en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en las figuras 23 y 24, que muestran los títulos promedio /- la desviación típica de cinco ratones por grupo.
El suero también se sometió a un ensayo de FACS para medir la unión de anticuerpos a PSMA o PSCA humanos expresados en la superficie celular de líneas celulares adecuadas, determinando de este modo si los anticuerpos generados mediante las vacunas multiantígeno eran capaces de reconocer las conformaciones nativas de PSMA y PSCA, respectivamente. No se midió la unión de anticuerpo a PSA nativo en la superficie celular debido a que PSA se expresó como una proteína citoplasmática por las vacunas multiantígeno investigadas en este estudio. El ensayo FACS se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento como se describe en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en las figuras 25 y 26, que muestran el múltiplo de cambio medio en la IMF del suero de ratón frente al anticuerpo secundario anti-ratón solo / la desviación típica de cinco ratones por grupo. No se midieron los títulos y la unión de anticuerpo a PSA nativo en la superficie celular debido a que PSA se expresó como una proteína citoplasmática por las vacunas multiantígeno investigadas en este estudio.
Resultados.
Las figuras 21A-21D muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante ensayo ELISPOT de IFN-y. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14 y 28. En el día 35, el reconocimiento de PSMA, PSCA y PSA endógenos se evaluó examinando las respuestas de linfocitos T contra células (A) TRAMP C2-PSMA, (B) TRAMP C2-PSCA, (C) TRAMP C2-PSA y (D) TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA mediante el ensayo ELISPOT de IFN-^. Las células TRAMP C2 sirvieron como control de fondo para el ensayo. Para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra PSMA expresado de manera endógena en las células, no se observaron diferencias significativas entre las respuestas a TRAMP C2-PSMA después de la vacunación con antígenos duales que contenían PSMA (PSA-F2A-PSMA y PSMA y PSA coformulados) y PSMA solo. Asimismo, para las respuestas de linfocitos T de IFN-y contra PSCA endógeno, no se observaron diferencias en la magnitud de la respuesta a TRAMP C2-PSCA entre las vacunas de PSCA-IRES-PSA y PSCA y PSA coformulados, en comparación con la vacuna de PSCA individual. Para las respuestas de linfocitos T de IFN- □y contra PSA endógeno, se detectó un aumento significativo en la magnitud de la respuesta a TRAMP C2-PSA cuando se comparó la inmunogenicidad de la vacuna contra PSA individual con PSA-F2A-PSMA (*** indica p < 0,001 mediante ANOVA de dos vías) PSMA y PSA coformulados (** indica p < 0,01 mediante ANOVA de dos vías). No hubo diferencias observables en la magnitud de la respuesta a TRAMP C2-PSA cuando se comparó a animales que recibieron las vacunas duales de PSCA y PSA con los de vacuna de PSA individual. Cuando se examinó la respuesta de linfocitos T de IFN-y contra TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA, no hubo diferencias significativas en la respuesta entre los grupos vacunados con diferentes vacunas de antígeno dual. En conjunto, estos datos demuestran la generación de respuestas de linfocitos T específicas de PSMA y PSA, así como respuestas de linfocitos T específicas de PSCA y PSA, después de la vacunación con ADN de antígeno dual, usando estrategias de vacuna tanto de coexpresión como de coformulación.
La figura 22 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSMA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSMA. Todos los animales vacunados con PSMA generaron títulos significativos de anticuerpo antiPSMA. No hubo una diferencia significativa en los títulos de anticuerpo entre ratones vacunados con PSA-F2A-PSMA, PSMA y PSA coformulados y PSMA solo (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05). En conjunto, estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSMA después de la vacunación con ADN de antígeno dual con PSMA y PSA, usando estrategias de vacuna tanto de coexpresión como de coformulación.
La figura 23 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante los títulos de anticuerpo anti-PSCA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSCA. Todos los animales vacunados con PSCA generaron títulos significativos de anticuerpo anti-PSCA. No hubo una diferencia significativa en los títulos de anticuerpo entre ratones vacunados con PSCA-IRES-PSA, PSCA y PSA coformulados y PSCA solo (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05), aunque los títulos de anticuerpos generados después de la vacunación con PSCA-IRES-PSA tendieron a ser más bajos que en los otros grupos vacunados con PSCa . Estos resultados indican que la coexpresión o coformulación de PscA y PSA genera anticuerpos anti-PSCA.
La figura 24 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSMA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, se evaluó el reconocimiento de PSMA nativo en la superficie celular mediante la unión de anticuerpos séricos a células LNCaP y PC3. Las células PC3 sirvieron como control de fondo para el ensayo. No hubo diferencias significativas en la unión de anticuerpos anti-PSMA contra células LNCaP entre los grupos vacunados con PSMA (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05). El múltiplo de cambio frente al anticuerpo secundario solo para el mAb J591-A fue de 45,3 (datos no mostrados). En general, Estos datos demuestran la generación de anticuerpos específicos anti-PSMA que reconocieron a PSMA nativo después de la vacunación con antígeno dual, usando estrategias de vacuna tanto de coexpresión como de coformulación.
La figura 25 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de antígeno dual mediante la unión en la superficie celular de anticuerpos anti-PSCA. En resumen, se cebó a 5 ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14, 28 y 49. En el día 56, el reconocimiento de PSCA nativo en la superficie celular se evaluó mediante la unión de anticuerpo sérico a células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA y no transducidas. Las células precursoras no transducidas sirvieron como control de fondo para el ensayo. Todos los grupos de ratones vacunados con PSCA demostraron una unión muy baja de anticuerpos anti-PSCA a células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA. La vacunación con PSCA-IRES-pSa dio como resultado una unión significativamente reducida a células MIA-PaCa-2 transducidas con Ad-PSCA en comparación con ratones vacunados solo con PSCA (* indica p < 0,05 mediante ANOVA de una vía). En conjunto, estos datos demuestran que la coexpresión o coformulación de PSCA y PSA da como resultado un reconocimiento muy bajo de PSCA nativo por anticuerpos específicos anti-PSCA.
Ejemplo 7. Inmunogenicidad del antígeno de PSMA humano modificado
Diseño del estudio. Se compararon las respuestas inmunitarias inducidas por la vacunación con ADN usando una construcción que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA (el "antígeno de PSMA humano modificado" o "hPSMA modificado") que consiste en los aminoácidos (aa) 15-750 de la proteína de PSMA humano nativo de SEQ ID NO: 1, con los inducidos por la proteína PSMA humana de longitud completa (hPSMA de longitud completa). Se cebó a grupos de ratones C57BL/6 hembra o Pasteur hembra (HLA-A2/DR1) en el día 0 y se les reforzó en los días 14 y 28 mediante administración de PMED con una dosis de 2 |jg de una vacuna de ADN que codifica proteína hPSMA de longitud completa o hPSMA modificada. Se extrajo sangre de los ratones y se les sacrificó en el día 35 (7 días después de la tercera vacunación) y se determinaron las respuestas inmunitarias de linfocitos T contra la proteína hPSMA de longitud completa en esplenocitos mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y. Para los ratones C57BL/6, se sembraron suspensiones de células individuales de 5x105 esplenocitos de animales individuales por cada pocillo con 10 jg de proteína hPSMA purificada, solo 5x104 células TRAMP-C2 o células TRAMP-C2 que coexpresan hPSMA o la proteína de fusión PSMA-PSA-PSCA. Para los ratones transgénicos Pasteur (HLA-A2/DR1), se sembraron suspensiones de células individuales de 5x105 esplenocitos de animales individuales por pocillo con 5x104 células K562 que expresaban HLA-A2 humano que se habían pulsado con epítopos de linfocitos T CD8+ restringidos a HLA-A2 conocidos procedentes de la secuencia de proteína de PSMA humano (tabla 23). También se determinaron las respuestas en ratones Pasteur usando 10 jg/ml de proteína PSMA purificada o 5x104 células SK-Mel5 que se habían transducido con vectores adenovíricos que expresaban una proteína de control (AdeGFP) o la proteína PSMA humana de longitud completa (Ad-hPSMA). Cada condición se realizó por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C y CO2 al 5 %, se lavaron y se revelaron después de la incubación, según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de SFC de IFN-y mediante un lector de CTL. Los resultados se presentan en las figuras 19 y 20, que muestran el número medio de SFC específicos para PSMA/millón de esplenocitos /- la desviación típica por grupo.
Ensayo ELISA. Se midieron las respuestas de anticuerpos inducidas por las vacunas de PSMA modificado y de longitud completa en suero de cada animal recogido en el día 35. Se sometió al suero a un ELISA para determinar los títulos de anticuerpo anti-PSMA en el suero usando el ensayo ELISA como se describe en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en la figura 26, que muestra los títulos promedio /- la desviación típica del número de ratones por grupo.
Ensayo FACS. El suero también se sometió a un ensayo de FACS para medir la unión de anticuerpos a PSMA humanos expresados en la superficie celular de líneas celulares adecuadas, determinando de este modo si los anticuerpos generados mediante las vacunas de PSMA modificado y de longitud completa eran capaces de reconocer la conformación nativa de PSMA. El ensayo FACS se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento como se describe en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en la figura 29, que muestran el múltiplo de cambio medio en la IMF del suero de ratón frente al anticuerpo secundario anti-ratón solo / la desviación típica del número de ratones por grupo.
Tabla 23. Epítopos peptídicos restringidos a HLA-A2 evaluados en los ensayos llevados a cabo para los ratones transgénicos Pasteur (HLA-A2/DR1). Los péptidos se ensayaron individualmente a una concentración de 10 pg/ml.
Se indica la posición de aminoácido de los extremos N y C-terminales de cada péptido.
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Resultados. La figura 26 muestra los resultados de un estudio representativo para evaluar la respuesta inmunitaria de linfocitos T generada por PSMA humano modificado (aa 15-750) frente a PSMA humano de longitud completa (aa 1-750) en ratones C57BL/6 determinados mediante ensayo ELISPOT de IFN-y. Se cebó a cinco (5) ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con vacunas de ADN de PMED que expresan proteínas de hPSMA modificado o hPSMA de longitud completa en los días 14 y 28. En el día 35, la respuesta generada contra la proteína hPSMA de longitud completa se comparó determinado las respuestas de linfocitos T contra TRAMP C2-PSMA o proteína ECD de PSMA humano purificada (citada como proteína hPSMA purificada en la fig. 26) mediante ensayo ELISPOT de IFNy. Las células TRAMP C2 sirvieron como control de fondo para el ensayo. La magnitud de las respuestas de linfocitos T de IFN-y generadas por TRAMP C2-PSMA o proteína hPSMA purificada no fueron significativamente diferentes (ANOVA de dos vías, valor de p > 0,05) entre grupos. Estos resultados indican que las vacunas de ADN que expresan las proteínas de hPSMA modificado y hPSMA de longitud completa generan respuestas inmunitarias de linfocitos T equivalentes en ratones C57BL/6.
Las figuras 27A y 27B muestran los resultados de un estudio representativo para evaluar la respuesta inmunitaria de linfocitos T contra el antígeno PSMA humano modificado antígeno(aa 15-750) frente al antígeno PSMA humano de longitud completa (aa 1-750) en ratones transgénicos Pasteur (HLA-A2/DR1) mediante un ensayo ELISPOT de IFN-Y. Se cebó a diez (10) ratones por grupo en el día 0 y se les reforzó con vacunas de ADN de PMED que codifican proteínas de hPSMA modificado o hPSMA de longitud completa en los días 14 y 28. En el día 35, se determinó la respuesta de linfocitos T generada contra la proteína hPSMA de longitud completa mediante ensayo ELISPOT de IFN -□□ usando (A) péptidos restringidos a HLA-A2 derivados de PSMA que representan epítopos conocidos de CD8+ y (B) células SK-Mel5 transducidas con Ad-hPSMA o proteína hPSMA purificada de longitud completa. El péptido hHER2 106 y SK-Mel5 Ad-eGFP sirvieron como controles negativos en los ensayos. La vacuna de hPSMA modificado generó la mayor magnitud de respuestas inmunitarias de linfocitos T de IFN-y contra los epítopos de linfocitos T CD8+ restringidos a HLA-A2, aunque la diferencia entre grupos no fue significativa (ANOVA de dos vías, valor de p > 0,05). De forma similar, la vacuna de hPSMA modificado generó la mayor magnitud de respuesta inmunitaria contra las células SK-Mel5 transducidas con Ad-hPSMA y de manera significativa (ANOVA de dos vías, valor de p > 0,05) mayores frecuencias de IFN-y SFC contra la proteína hPSMA purificada. Estos datos demuestran que la vacuna de ADN que expresa la proteína hPSMA modificada es más potente a la hora de inducir respuestas de linfocitos T contra la proteína hPSMA que la proteína hPSMA de longitud completa en ratones transgénicos Pasteur (HLA-A2/DR1).
La figura 28 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de PSMA humano modificado y de longitud completa mediante títulos de anticuerpos anti-PSMA. En resumen, se cebó a los ratones en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14 y 28. Se vacunó a nueve ratones Pasteur con PSMA modificado, se vacunó a 10 ratones Pasteur con PSMA de longitud completa y se vacunó a 5 ratones C57BL/6 por grupo con PSMA o modificado o de longitud completa. En el día 35, se evaluaron mediante ELISA los títulos séricos de anticuerpo anti-PSMA. Como era de esperar, los ratones C57BL/6 generaron títulos de anticuerpo anti-PSMA significativamente mayores, en comparación con los ratones Pasteur (ANOVA de una vía). Comparando los títulos de anticuerpo entre las mismas estirpes de ratón, no hubo una diferencia significativa en los títulos de anticuerpo entre ratones vacunados con PSMA modificado y de longitud completa (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05). En general, estos resultados demuestran que la vacunación con la versión de longitud completa de PSMA humano genera un título de anticuerpos anti-PSMA equivalente, en comparación con la vacuna de PSMA humano modificado.
La figura 29 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa la inmunogenicidad de las vacunas de PSMA humano modificado y de longitud completa mediante la unión de anticuerpos anti-PSMA a la superficie celular. En resumen, se cebó a 5 ratones C57BL/6 por grupo en el día 0 y se les reforzó con PMED en los días 14 y 28. En el día 35, se evaluó el reconocimiento de PSMA nativo en la superficie celular mediante la unión de anticuerpos séricos a células LNCaP y PC3. Las células PC3 sirvieron como control de fondo para el ensayo. No hubo diferencias significativas en la unión de anticuerpos anti-PSMA a células LNCaP entre ratones vacunados con PSMA modificado o de longitud completa (ANOVA de una vía, valor de p > 0,05). El múltiplo de cambio frente al anticuerpo secundario solo para el mAb J591-A fue de 14,3 (datos no mostrados). En general, estos datos demuestran que es factible generar anticuerpos específicos anti-PSMA que reconocen a PSMA nativo después de la vacunación con PSMA modificado o de longitud completa.
Ejemplo 8. Efecto del anticuerpo anti-CTLA-4 en la respuesta inmunitaria inducida por vacunas
Se investigó en un estudio en monos el efecto de la administración local de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) sobre las respuestas inmunitarias inducidas por una molécula de ácido nucleico de PSMA humano proporcionada por la divulgación, en el que se evaluó la respuesta inmunitaria midiendo las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA usando un ensayo ELISPOT de IFNy.
Tratamiento de animales y recogida de muestras. Se inmunizó a tres grupos de macacos rhesus de la India, de cinco a seis (n.° 1 a 5 o 6) por cada grupo de ensayo, con un ácido nucleico (SEQ ID NO: 10) que codifica un antígeno de PSMA humano modificado (SEQ ID NO: 9) suministrado por adenovirus (1e11 P.V. inyectadas por vía intramuscular) seguido de 2 inmunizaciones con ADN (8 pulsaciones/inmunización, 4 pulsaciones por cada lado derecho e izquierdo del abdomen inferior) mediante PMED a intervalos de 6 y 9 semanas, respectivamente. Los animales en los grupos 2 y 3 recibieron además inyecciones intradérmicas bilaterales de 3 mg de CpG (PF-03512676) a continuación después de la inmunización con PMED próximas al ganglio linfático que drena en la ingle. El grupo 2 también recibió inyecciones intravenosas de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) a 10mg/kg y el grupo 3 recibió inyecciones intradérmicas de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) a 5 mg/kg en proximidad al ganglio linfático inguinal que drena la vacuna en el momento de la segunda inmunización de PMED.
Se recogieron muestras de sangre periférica de cada animal dieciséis días después de la última inmunización de PMED. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de las muestras y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA. En resumen, se sembraron 4e5 PBMC de animales individuales por pocillo con grupos de péptidos específicos de PSMA, cada uno a 2 ug/ml de proteína ECD de hPSMA a 10 ug/ml, proteína ECD de PSMA de rhesus a 10 ug/ml o péptidos de control no específicos (grupo de péptido de HER2 humana) cada uno a 2 ug/ml en placas de ELISPOT de IFNy. En la tabla 24A se proporciona la composición de cada uno de los grupos de péptido específicos de PSMA. Las placas se incubaron durante 16 h a 37 °C y CO2 al 5 % y se lavaron y revelaron tras la incubación según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de células formadoras de puntos de IFN-y (SFC) mediante un lector de CTL. Cada condición se realizó por duplicado. Los resultados se presentan en la tabla 24B, que muestra el número promedio de SFC específicos de PSMA de los triplicados, restando el número medio de SFC de los péptidos de control no específicos normalizados a 1e6 PBMC. A indica que el recuento no es preciso debido a que el número de puntos era demasiado numeroso como para contarlo.
Procedimiento de ensayo ELISPOT de IFNy. Se recubrió una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con un anticuerpo de captura específico para IFNy (□BD Bioscience, n.° 51-2525kc) en una microplaca durante una noche a 4 °C. La placa se bloquea con suero/proteína para evitar la unión no específica al anticuerpo. Después de bloquear, se añaden células efectoras (tales como esplenocitos aislados de ratones inmunizados o PBMC aisladas de macacos rhesus) y dianas (tales como péptidos de PSMA de bibliotecas de péptidos, células dianas pulsadas con péptidos o células tumorales que expresan los antígenos relevantes) a los pocillos y se incuban durante una noche a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Las citocinas secretadas por células efectoras son capturadas por el anticuerpo de recubrimiento sobre la superficie de la membrana de PVDF. Después de retirar las células y los medios de cultivo, se añadieron 100 pl de un anticuerpo policlonal biotinilado anti-IFNY humano a cada uno de los pocillos para la detección. Los puntos se visualizaron añadiendo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y el sustrato precipitado, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), para producir un punto de color rojo, según el protocolo del fabricante (Mabtech). Cada punto representa un solo linfocito T productor de citocinas.
Resultados. La tabla 24B muestra los resultados de un ensayo representativo de ELISPOT de IFNy que evalúa y compara las respuestas de linfocitos T inducidas por la vacuna sin (grupo 1) o con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) administrado o sistémicamente o por inyecciones intravenosas (grupo 2) o por vía local mediante inyecciones intradérmicas próximas al ganglio linfático que drena la vacuna (grupo 3). Como se muestra en la tabla 1B, la vacuna de PSMA indujo respuestas de linfocitos T de IFNy medibles contra múltiples péptidos específicos de PSMA y proteínas en ausencia de CpG (PF-03512676) y anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206). Se mejoraron modestamente las respuestas mediante la adición de CpG (PF-03512676) y la administración sistémica del anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206; grupo 2). Sin embargo, se observó una mejora más potente y significativa de la respuesta a múltiples péptidos de PSMA y a la proteína de PSMA cuando se administró localmente el anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206) mediante inyecciones intradérmicas próximas al ganglio linfático que drena la vacuna (grupo 3).
Tabla 24A. Grupos de péptido de PSMA: Cada grupo de péptido (es decir, P1, P2, P3, H1, H2, R1 y R2) está formado por secuencias de péptidos 15-meros de proteína PSMA humana (proteína hPSMA) o proteína PSMA de rhesus (rPSMA), como se indican a continuación. Se indica la posición de aminoácido de los extremos N y C-terminales de cada péptido.
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Ejemplo 9. Exposición sistémica de anticuerpo anti-CTLA-4 tras la administración en monos Se investigaron los niveles en sangre del anticuerpo anti-CTLA-4, Tremelimumab (CP675206) en macacos rhesus de la India después de administrar el anticuerpo mediante inyecciones intradérmicas o intravenosas.
Tratamiento de animales y recogida de muestras. Se inyectó a tres animales por grupo de tratamiento el anticuerpo anti-CTLA-4, Tremelimumab, a 10 mg/kg, ya sea mediante una sola inyección intravenosa en la vena safena o múltiples inyecciones intradérmicas bilaterales de 0,2 ml en el muslo superior próximas a los ganglios linfáticos drenantes inguinales. Se recogieron muestras de sangre a las 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 y 48 horas después de la inyección en tubos Vaccutainer de 2,0 ml que contenían litio-heparina como anticoagulante. Se recogió el plasma del sobrenadante en los tubos Vaccutainer después de la centrifugación a 1500 xg a 4 °C durante 10 min. Se midieron los niveles de Tremelimumab en el plasma mediante un ensayo ELISA cuantitativo, de acuerdo con el procedimiento proporcionado a continuación.
Procedimiento de ensayo de ELISA cuantitativo de Tremelimumab. Se recubrieron las placas de ensayo de alta unión de 384 pocillos (VWR-Greiner Bio-One n.° de cat. 82051-264) con 25 pl/pocillo de CD-152 (CTlA-4; Ancell Immunology Research Products, n.° de cat. 501-020) a 10 pg/ml en tampón de recubrimiento de carbonatobicarbonato 100 mM y se incubaron durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron x6 con 1xPBS-Tween (PBS 0,01M, pH 7,4/Tween 20 al 0,05%) y se bloquearon usando 40 pl/ pocillo de FBS al 5 %/1xPBS-Tween y se incubaron con agitación a 600 rpm a TA durante 1 hora. Los patrones se prepararon efectuando las siguientes diluciones de Tremelimumab: 200, 67, 22, 7,4, 2,5, 0,82, 0,27, 0,09 y 0,03 ng/ml. Las muestras se diluyeron a 1:100, 1:1.000 y 1:10.000. El diluyente consistió en sueros de macaco cinomolgo no expuesto previamente al 1 % y FBS al 5% en 1xPBS-Tween (PBS 0,01M, pH 7,4/Tween 20 al 0,05%). Se transfirieron 25 pl/pocillo de cada patrón, muestra y control de diluyente por duplicado a la placa y se incubó con agitación a 600 rpm a TA durante 1 hora. Tras lavar x 6 con 1xPBS-Tween, se añadieron 25 pl/pocillo de anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG humana-HRP, Southern Biotech n.° de cat. 9042-05) a una dilución de 1:5.000 con 1xPBS-Tween y después se incubaron con agitación a 600 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar x 6 con 1xPBS-Tween, se añadieron 25 pl/pocillo de sustrato de TMB peroxidasa EIA (solución A+B) (Bio-Rad n.° de cat. 172-1067) y las placas se incubaron a TA durante 4 minutos. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de 12,5 pl/pocillo de ácido sulfúrico 1N y después se leyó la absorbancia a 450 nm. Se cuantificó la cantidad de Tremelimumab en cada muestra usando la curva patrón con 0,27 a 67 ng/ml usado como intervalo cuantitativo.
Resultados. Los niveles plasmáticos de anti-CTLA-4 de un estudio representativo se presentan en la fig. 30. Como se muestra, la inyección intradérmica del anticuerpo anti-CTLA-4 Tremelimumab presenta una cinética de liberación más lenta del anticuerpo en la sangre y un menor perfil de exposición sistémica (ABCü.24= 4,9 x106 ngh/ml) que las inyecciones intravenosas (ABCü.24= 7,2 x106 ng-h/ml).
Ejemplo 10. Efecto del anticuerpo anti-CTLA-4 en las respuestas inmunitarias inducidas por vacunas en ratones
Procedimiento del estudio. Se cebó y reforzó a ratones BALB/c, 6 por grupo, con ADN que expresa rHer-2 mediante PMED separado por un intervalo de cuatro semanas. Se administraron 150 pg del anticuerpo monoclonal específico para CTLA-4 de ratón (clon 9H10, Bioxcell o n.° BE0131) o anticuerpos monoclonales de control de isotipo (Bioxcell n.° BE0091) en los días de administración de PMED y 100 pg en los días después de PMED mediante inyecciones intradérmicas locales o intraperitoneales sistémicas como se indica en las leyendas. Las respuestas inmunitarias de linfocitos T polifuncionales (positivas a múltiples citocinas) se midieron de esplenocitos aislados de ratones individuales 7 días después de la última inmunización con PMED mediante ensayo ICS. Tras una estimulación de 5 h con un péptido epitópico específico de vacuna (antígeno específico rHer-2 específico de CD8 (p66), epítopo CD4 (p169) o péptido de VHB irrelevante (antígeno core p87)) a 10 pg/ml, se tiñeron los esplenocitos en primer lugar para CD4, CD3 y CD8, lo que fue seguido de permeabilización y tinción para la expresión de IFNa, TNFa e IL-2 que se analizó mediante citometría de flujo. Se calculó el número total de linfocitos T positivos a una, dos o tres citocinas específicos de antígeno por bazo total de cada animal restando las respuestas al péptido de VHB irrelevante de las respuestas específicas de vacuna y se normalizaron por el número total de esplenocitos aislados por bazo.
Resultados. Las figuras 31A y 31B muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (clon 9H10) en la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante un ensayo de tinción de citocinas intracelulares. Siete días después del último PMED, se observaron aumentos significativos en las respuestas de linfocitos T CD8 positivos a una sola y a dos citocinas específicos de antígeno mediante el suministro intradérmico local de anti-CTLA-4 y respuestas de linfocitos T CD8 positivos a dos y tres citocinas mediante suministro sistémico. Adicionalmente, se observaron aumentos significativos en los linfocitos T CD4 positivos a una sola citocina específicos de antígeno mediante suministro intradérmico y células positivas a dos citocinas mediante suministro sistémico de anti-CTLA-4 (*indica P<0,05 mediante la prueba de la t de Student).
Ejemplo 11. Efecto sinérgico de sunitinib en combinación con una vacuna contra el cáncer Procedimiento del estudio. Se investigó la eficacia antitumoral de sunitinib malato en combinación con una vacuna de ADN contra el cáncer en ratones hembra transgénicos BALB/neuT. Se implantaron por vía subcutánea 1e6 células TUBO que expresan rHer-2 que proceden de los tumores mamarios espontáneos de ratones BALB/neuT a ratones hembra transgénicos heterocigotos BALB/neuT que expresan el antígeno asociado con tumores Her-2 de rata (rHer-2). Transcurridos 7 días después del implante de tumores, se administró a los ratones una vez al día por vía oral o vehículo o sunitinib malato a las dosis indicadas en las leyendas. Tres días después de iniciar la terapia con sunitinib malato, se inmunizó a los ratones con regímenes formados por (a) vacuna de control que expresa un antígeno que no se expresa en el tumor o el ratón o (b) vacuna de ADN contra el cáncer que expresa un antígeno Her-2 de rata de SEQ ID NO: 54 (rHER2) que se expresa en el tumor y en el ratón. Se analizó la velocidad de crecimiento de tumores midiendo el diámetro largo (a) y corto (b) de los tumores TUBO subcutáneos dos veces a la semana y calculando el volumen como a x b2 x 0,5 mm3 Se representan la media y el error típico de la media de los volúmenes tumorales de 10 ratones por cada grupo de tratamiento frente a los días después del implante del tumor.
Resultados. La figura 32 muestra los resultados de un estudio representativo que evalúa y compara la velocidad de crecimiento de tumores subcutáneos tras el tratamiento con sunitinib malato como monoterapia o en combinación con la vacuna para el cáncer de ADN. Aunque los tumores de ratones que recibieron la vacuna contra el cáncer de ADN (rHER2: inyección intramuscular de 1e9 P.V. de adenovirus que expresan rHer-2, seguido de dos pulsaciones cada dos semanas de ADN que expresa rHer-2 mediante PMED) continuaron creciendo rápidamente, los tumores de ratones que recibieron sunitinib malato a dosis de 20 mg/kg o 40 mg/kg con vacunas de control (control: inyección intramuscular de 1e9 P.V. de adenovirus que expresa eGFP, seguido de dos pulsaciones cada dos semanas de ADN que expresa antígeno core de VHB mediante PMED) redujeron significativamente la velocidad de crecimiento tumoral, con 20 mg/kg presentando una eficacia subóptima, en comparación con la dosis de 40 mg/kg. Sin embargo, cuando se coadministró la vacuna contra el cáncer junto con la dosis subóptima de sunitinib malato a 20 mg/kg, los tumores crecieron a una tasa de crecimiento mucho más lenta que en los ratones tratados con la misma dosis de sunitinib malato coadministrado con una vacuna de control y similar a la de los ratones tratados con sunitinib malato a una dosis más alta. La vacuna contra el cáncer proporciona un beneficio terapéutico adicional a los ratones que recibieron dosis subóptimas de sunitinib malato.
Las figuras 33A-33D muestran las tasas de crecimiento de tumores individuales de ratones de un estudio representativo que evalúa y compara la eficacia antitumoral del sunitinib malato a 20 mg/kg con el control (control) o la vacuna contra el cáncer de ADN (rHER2). En resumen, transcurridos 7 días después del implante de tumores, diez ratones por grupo de tratamiento recibieron una dosis oral diaria de vehículo o 20 mg/kg de sunitinib malato (Sutent) durante 34 días. Tres días después del inicio de la dosificación de Sutent, se inició una serie de inmunizaciones, cebadas por adenovirus seguido de PMED, que continuaron después de detener la terapia con Sutent. Específicamente, se inmunizó a los ratones o con vacuna de control formada por una inyección intramuscular de 1e9 P.V. de adenovirus que expresa eGFP seguida posteriormente de dos pulsaciones bisemanales, dos cada 9 días y cuatro semanales de ADN que expresa core de VHB y antígenos de la superficie mediante PMED o vacuna contra el cáncer formada por adenovirus que expresa rHer-2 y ADN en su lugar. Los tumores de los animales que recibieron vehículo con la vacuna de control se hicieron visible aproximadamente en el día 7 y continuaron creciendo hasta alcanzar 2000 mm3 después de 50 días después del implante del tumor. El crecimiento tumoral de los animales que recibieron Sutent con la vacuna de control se deterioró significativamente hasta que se suspendió la terapia con Sutent. Los tumores mostraron una tasa de crecimiento rápido inmediatamente después de la interrupción de Sutent, la mayoría alcanzando los 2000 mm3 después de 50 días después del implante tumoral. La tasa de crecimiento tumoral de los animales que solo recibieron las vacunas contra el cáncer fue moderadamente más lenta que la de los animales que no recibieron la vacuna contra el cáncer o Sutent. La combinación de la vacuna contra el cáncer con Sutent no solo suprimió el crecimiento del tumor durante la terapia con Sutent (figura 33), sino que también afectó significativamente a la progresión del tumor en el 60% de los animales después de la interrupción del tratamiento con Sutent.
La figura 34 muestra la curva de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones del estudio descrito en la Fig. 2B que evalúa la eficacia antitumoral de Sutent con el control (control) o la vacuna contra el cáncer (rHER2). Los ratones fueron sacrificados cuando el volumen del tumor alcanzó 2000 mm3 de acuerdo con las directrices de la IAUCUC. Solo los ratones tratados con Sutent (a 20 mg/kg) y la vacuna contra el cáncer mostraron una supervivencia significativamente prolongada en comparación con los ratones tratados con vehículo y con la vacuna de control, vacuna contra el cáncer sin Sutent o Sutent sin vacuna contra el cáncer (* P <0,01 mediante la prueba de rangos logarítmicos). Las figuras 35A-35D muestran el porcentaje de células supresoras derivadas de mieloides (Gr1+CD11b+) y Treg que contienen células CD25+CD4+ en sangre periférica de ratones tratados en la Fig. 2B. En resumen, se tiñeron las PBMC y se analizaron mediante citometría de flujo respecto de la expresión de Gr1, CD11b, CD3, CD4 y CD25 de sangrados submandibulares de cinco ratones de cada grupo en el d27 (20 días después del inicio del tratamiento con Sutent o vehículo). Se muestran la media y el error típico de la media de cada grupo de tratamiento. Se observó una reducción estadísticamente significativa del % de células supresoras derivadas de mieloides en ratones tratados con Sutent con control o con vacuna contra el cáncer en comparación con ratones que no recibieron Sutent ni vacuna contra el cáncer (vehículo+control). Sin embargo, se observaron células supresoras derivadas de mieloides significativamente más bajas en ratones tratados con la combinación de Sutent con la vacuna contra el cáncer (Sutent+rHER2) en comparación con los ratones que fueron tratados con la vacuna contra el cáncer sin Sutent (vehículo+rHER2) o Sutent sin la vacuna contra el cáncer (Sutent+control). Se observó una reducción estadísticamente significativa de Treg que contiene linfocitos T CD25+CD4+ en la población de CD4 mediante Sutent con vacuna contra el cáncer. Estos ratones tenían un porcentaje significativamente menor de Treg que contenía linfocitos T CD25+CD4+ en la población de CD4 que los ratones que fueron tratados con la vacuna contra el cáncer sin Sutent o Sutent sin vacuna contra el cáncer en su sangre. * indica P<0,05 mediante la prueba de la t de Student.
Las figuras 36A-36C muestran el número total de células supresoras derivadas de mieloides (Gr1+CD11b+), Treg (CD4+CD25+Foxp3+) y linfocitos T CD8 PD-1+ aislados de tumores de ratones. En resumen, los ratones recibieron una dosis oral diaria única de vehículo o Sutent a 20 mg/kg tres días después de la implantación con células TUBO durante 28 días. Los mismos ratones se inmunizaron con una vacuna de control que comprendía una inyección intramuscular de 1e9 P.V. de adenovirus que expresaba eGFP, seguido de dos administraciones cada dos semanas de ADN que expresaba el antígeno core del VHB administrado por PMED o una vacuna contra el cáncer compuesta de adenovirus y ADN que expresaba rHer-2. Se administró una inyección intradérmica de 50 |jg de CpG (PF-03512676) con las administraciones de PMED cerca del ganglio linfático de drenaje inguinal del lado derecho. Siete días después de la segunda administración de PMED y CpG, se aislaron tumores individuales, de 6 ratones por grupo de tratamiento. La suspensión de células individuales preparada a partir de los tumores subcutáneos aislados se tiñó con anticuerpos específicos para Gr1, Cd11b, CD3, CD8, CD25, FoxP3 y PD-1 y se analizó mediante citometría de flujo. Se representa la media y el error típico de la media del número total de células específicas, como se indica en las cifras por jg de tumor de cada grupo de tratamiento. (*indica P <0,05 mediante la prueba de la T de Student). Si bien no hubo diferencias significativas en la frecuencia de Treg supresoras inmunes o MDSC encontrado en el tumor cuando los ratones recibieron la vacuna contra el cáncer (A y B) en comparación con los ratones que recibieron la vacuna de control (A y B), se observó una reducción significativa cuando los ratones se trataron con Sutent (A y B) en comparación con los ratones que recibieron solo la vacuna contra el cáncer. También se observó una reducción de los linfocitos T PD-1+CD8 en ratones que fueron tratados con Sutent (C) en comparación con los ratones que recibieron la vacuna contra el cáncer (C) solamente. En conjunto, estos datos demuestran que los agentes que reducen Tregs, MDSC o linfocitos T CD8+PD-1+ en combinación con la vacuna serían beneficiosos para reducir la carga tumoral en animales portadores de tumores.
Ejemplo 12. Eficacia contra el cáncer de la vacuna en combinación con sunitinib y el anticuerpo anti-CTLA-4 La eficacia antitumoral de una vacuna contra el cáncer en combinación con sunitinib y anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (clon 9D9) se investigó en ratones BALB/neuT portadores de tumores TUBO subcutáneos.
Procedimiento del estudio. En resumen, diez ratones por cada grupo recibieron una dosis oral diaria de vehículo o sunitinib malato a 20 mg/kg a partir del día 10 después del implante del tumor hasta el día 64. La vacunación con construcciones de ADN que no codifican ningún antígeno (vacuna de control) o un antígeno Her-2 de rata de SEQ ID NO: 54 (vacuna contra el cáncer) como vectores de adenovirus iniciada el día 13, seguida de dos inmunizaciones semanales, dos inmunizaciones cada dos semanas y siete inmunizaciones semanales de antígenos respectivos (antígenos de VHB o rHer-2) con ADN. Los grupos de ratones (círculo cerrado y triángulo abierto) que se trataron con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 murino fueron inyectados por vía intraperitoneal con 250 jg del anticuerpo en el día 20, 27, 41, 55, 62, 69, 76, 83, 90 y 97 justo después de las inyecciones de PMED.
Resultados. La figura 37 muestra la curva de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la eficacia antitumoral de sunitinib y el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 murino (clon 9D9) en combinación con una vacuna contra el cáncer. Se observó un tiempo de supervivencia aumentado en ratones tratados con Sutent con vacuna de control (círculo abierto), anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 murino (triángulo abierto) o vacuna contra el cáncer (triángulo cerrado). Se observó un aumento adicional de la supervivencia en ratones tratados con Sutent y vacuna contra el cáncer en combinación con anti-CTLA-4 murino (círculo cerrado). Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rangos logarítmicos.
Ejemplo 13. Exposición sistémica de sunitinib y eficacia contra el cancer de la vacuna contra el cancer en combinación con sunitinib a baja dosis
Estudio de exposición sistémica a sunitinib.
Se investigó la cinética de sunitinib en sangre en ratones BALB/neuT con tumores TUBO subcutáneos. En resumen, 20 ratones por cada grupo de tratamiento recibieron Sutent por vía oral, a 20 mg/kg una vez al día (SID) o a 10 mg/kg dos veces al día (BID) con intervalos de 6 horas, 6 días después de la implantación del tumor. Se recogió sangre submandibular de 2-3 ratones en tubos de heparina de litio en varios puntos de tiempo después de la administración de Sutent según lo indicado (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 24 horas). El sobrenadante de plasma se recuperó de los tubos después de la centrifugación a x1000 g durante 15 min y los niveles de sunitinib de las muestras de plasma se midieron por CL/EM/EM. Se representa la media y el error típico de la media de cada grupo en cada punto de tiempo.
Los resultados se presentan en la figura 38. Se representa la media y el error típico de la media de cada grupo en cada punto de tiempo. La línea de puntos horizontal marca el nivel mínimo de sunitinib en sangre, 50 ng/ml, que es necesario para inhibir eficazmente el crecimiento tumoral en monoterapia (Mendel, D., y col.: "In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationship". Clinical Cáncer Research, 203, 9:327-337). Como se muestra, los niveles de sunitinib en sangre en los ratones que recibieron 20 mg/kg SID o 10 mg/kg BID solo mantienen la dosis efectiva diana de 50 ng/ml que inhibe eficazmente el crecimiento del tumor de forma transitoria dentro de las 24 h. Los niveles en sangre en el grupo de 20 mg/kg SID alcanzaron un máximo por encima de 50 ng/ml a las 2 horas, cayeron a 50 ng/ml a las 6 horas y se eliminaron del organismo a las 12 horas de la dosis de Sutent. Los niveles en el grupo que recibió 10 mg/kg BID alcanzaron un máximo superior a 50 ng/ml a las 2 horas, pero cayeron rápidamente por debajo de 50 ng/ml a las 4 horas, alcanzando un máximo nuevamente 2 horas después de la segunda dosis. Los niveles se redujeron rápidamente a 50 ng/ml a las 4 horas y se eliminaron de la sangre 18 horas después de la segunda dosis. A pesar del régimen de dosificación cada dos días, los animales que recibieron 10 mg/kg, siguieron mostrando una menor duración de la exposición a una concentración diana que el régimen de dosificación de una vez al día con 20 mg/kg.
Estudio de eficacia antitumoral.
Se investigó la eficacia antitumoral de la administración a largo plazo de sunitinib a baja dosis con una vacuna contra el cáncer en ratones BALB/neuT con tumores TUBO subcutáneos. En resumen, se administró a los ratones sunitinib malato (Sutent) durante 31 días a 20 mg/kg SID o durante 104 días a 10 mg/kg BID y recibieron una vacuna de control o una vacuna contra el cáncer. La vacuna de control, que no libera antígeno y la vacuna contra el cáncer, que libera un antígeno her-2 de rata (rHer-2) de SEQ ID NO: 54, se administró mediante adenovirus el día 9, seguido de cinco administraciones cada dos semanas del ADN mediante PMED que administró antígenos de VHB o rHer-2, respectivamente.
Los resultados se presentan en la figura 39. Aunque la vacuna contra el cáncer mejoró la supervivencia de ratones a los que se administró Stutent a 20 mg/kg, hubo una mejora significativa uniforme de la supervivencia de ratones a los que se administró Stutent a 10 mg/kg (*P=0,05 mediante la prueba de rangos logarítmicos).
Ejemplo 14. Efecto del agonista de CPG o CD40 sobre las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna contra el cancer
Estudios de inmunogenicidad en ratones BALB/c
Se investigó el efecto de la administración local de moduladores inmunitarios en la magnitud y la calidad de respuestas inmunitarias específicas de antígeno inducidas por un cáncer en ratones BALB/c, en los que se evaluó la respuesta inmunitaria midiendo las respuestas de linfocitos T específicas de rHER2 usando un ensayo ELISPOT de IFNy o un ensayo de tinción de citocinas intracelulares. En resumen, como se indicó, se inmunizó a 4 a 6 ratones BALB/c por grupo con construcciones de expresión de plásmido de ADN que codifican secuencias de antígeno de rHER2 (SEQ ID NO: 54) mediante el sistema de suministro de PMED. Los moduladores inmunitarios, CpG7909 (PF-03512676) y el anticuerpo agonista monoclonal anti-CD40, se administraron localmente mediante inyecciones intradérmicas en la proximidad del ganglio linfático inguinal que drena la vacuna posteriormente después de las pulsaciones de PMED. Se midieron las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno mediante ELISPOT de IFNy o ensayo de tinción de citocinas intracelulares de acuerdo con el procedimiento descrito más adelante.
Ensayo de tinción intracelular de citocinas (ICS)
Se midieron las respuestas inmunitarias de linfocitos T polifuncionales (positivos a múltiples citocinas) específicos para rHer-2 a partir de esplenocitos o PBMC aisladas de animales individuales mediante ensayo de ICS. Normalmente, se incubaron 1e6 esplenocitos con Brefeldina A a 1 pg/ml y péptido estimulante (CD8 p66 específico de rHer-2, CD4 p169 específico de rHer-2 o p87 de VHB irrelevante) a 10 pg/ml durante 5 horas a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5%. Después de la estimulación, los esplenocitos se lavaron y se bloquearon con el bloqueador de Fcy (anti-CD16/CD32 de ratón) durante 10 min a 4 °C seguido de una tinción de 20 min con tinción Live/Dead Aqua, CD3ePE-Cy7 anti-ratón, anti-CD8a de ratón Pacific blue y anti-CD45R/B220 de ratón PerCP-Cy5.5. Se lavaron las células, se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante una noche a 4 °C, se permeabilizaron con solución BD fix/perm durante 30 min a TA y se incubaron con APC anti-IFNY de ratón, anti-TNFa Alexa488 de ratón y anti-IL-2 de ratón PE durante 30 min a TA. Se lavaron las células y se adquirieron 20.000 linfocitos T CD4 o CD8 para su análisis por citometría de flujo. Se calculó el número total de linfocitos T positivos a una, dos o tres citocinas específicos de antígeno por bazo total de cada animal restando las respuestas específicas de rHer-2 al péptido de VHB irrelevante de las respuestas específicas de vacuna y se normalizaron por el número total de esplenocitos aislados del bazo.
Resultados del ensayo ELISPOT de IFNy
La figura 40 muestra los resultados del ELISPOT de IFNy de grupos de ratones de un estudio representativo que evalúa la magnitud de las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno inducidas por la vacuna rHER2 cuando se administra con los moduladores inmunitarios como se indica. En resumen, se inmunizó a cada ratón por grupo de tratamiento (n = 4) con construcciones de expresión de plásmidos de ADN que codifican secuencias de antígeno rHER2 (SEQ ID NO: 54) por PMED inmediatamente seguido por 100 pg de anticuerpo monoclonal IgG de rata de control (Bioxcell n.° BE0089: mAb de control) o 50 pg de CpG7909 o 100 pg de anticuerpo monoclonal anti-CD40 (Bioxcell n.° BE0016-2: mAb a-CD40) como se indica. Las respuestas inmunitarias específicas de antígeno se midieron mediante el ensayo ELISPOT de IFNy a partir de 5e5 esplenocitos mezclados con péptidos p66 específicos de control o rHer-2 a una concentración de 10 |jg/ml, 7 días después de la pulsación de PMEd . Se calculó el número total de células secretoras de IFNy de esplenocitos que contienen 1e5 linfocitos T CD8 a partir de los resultados de ELISPOT de animales individuales y se representa el porcentaje de linfocitos T c D8 en esplenocitos y se representan la media y el error típico de la media de cada grupo. Como se muestra, tanto CpG7909 como el anticuerpo monoclonal anti-CD40 aumentaron significativamente la magnitud de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno inducidas por el ADN de rHer-2 en comparación con los ratones que recibieron anticuerpos de control.
Resultados del ensayo de tinción intracelular de atocinas (ICS). Las figuras 41A y 41B muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de CpG 7909 en la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante un ensayo de tinción de citocinas intracelulares. En resumen, se inmunizó a cada animal dos veces con las construcciones de expresión del plásmido de ADN que codifican las secuencias del antígeno rHER2 (SEQ ID NO: 54) administradas por PMED con un intervalo de 4 semanas. Los ratones de cada grupo (n = 5) recibieron inyecciones intradérmicas de PBS (grupo de PMED) o 50 jg de CpG 7909 (grupo de PMED+CpG) en la proximidad del ganglio linfático inguinal que drena la vacuna inmediatamente después de ambas inmunizaciones mediante PMED. Siete días después de la última inmunización por PMED, se realizó un ensayo de ICS en los esplenocitos aislados de cada ratón individual para detectar linfocitos T CD8 o CD4 polifuncionales específicos de antígeno que secretan IFNy, TNFa y/o IL-2. Se detectó un aumento significativo en las respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 positivos a múltiples citocinas específicos para rHer-2 de ratones tratados con la administración local de CpG 7909 en comparación con PBS. Se observó un aumento en la población de CD8 positivos a una sola citocina en animales que recibieron administración local de CpG7909, en comparación con PBS (*indica P<0,05 mediante la prueba de la t de Student).
Las figuras 42A y 42B muestran los resultados de un estudio representativo que evalúa la actividad inmunomoduladora de un anticuerpo monoclonal agonista anti-CD40 en la calidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna mediante un ensayo de tinción de citocinas intracelulares. En resumen, se inmunizó a cada animal dos veces mediante construcciones de expresión del plásmido de ADN que codifican las secuencias del antígeno rHER2 (SEQ ID NO: 54) administradas por PMED con un intervalo de 4 semanas. A los ratones de cada grupo (n = 6) se les administraron 100 jg de inyecciones intradérmicas de isotipo IgG de control (PMED con IgG) o anticuerpo monoclonal anti-CD40 (PMEd con aCD40) cerca del ganglio linfático inguinal del lado derecho donde drena la vacuna, un día después de administrarse la primera inmunización administrada mediante PMED. Siete días después del último PMED, se realizó un ensayo de ICS en los esplenocitos aislados de cada ratón individual para detectar linfocitos T CD8 o CD4 polifuncionales específicos de rHer-2 que secretan IFNy, TNFa y/o IL-2. Se detectó un aumento significativo en las respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 positivos a tres citocinas específicos de rHer-2 de ratones tratados con el suministro local de anticuerpo monoclonal anti-CD40, en comparación con la IgG de control de isotipo. También hubo aumentos significativos en los linfocitos T CD4 positivos a una sola y a dos citocinas específicos de rHer-2 mediante el anticuerpo monoclonal anti-CD40 administrado localmente (*indica P<0,05 mediante la prueba de la t de Student).
Ejemplo 15. Eficacia anticáncer de la vacuna contra el cáncer en combinación con bajas dosis de sunitinib Se investigó la eficacia antitumoral de la vacuna contra el cáncer en combinación con sunitinib a dosis baja en ratones BALB/neuT con tumores espontáneos en el panículo mamario.
Tratamiento de animales. En resumen, se administró por vía oral sunitinib malato (Sutent) a 5 mg/kg durante 112 días dos veces al día a ratones hembra de 13-14 semanas de edad. La vacuna de control, que no administra antígeno y la vacuna contra el cáncer que suministra un antígeno Her-2 de rata de SEQ ID NO: 54 (rHer-2), se administraron mediante inyecciones de adenovirus en el día 3 como cebado, seguido de 7 administraciones cada dos semanas mediante PMED de ADN que suministra antígenos de VHB (vacuna de control) o rHer-2 (vacuna contra el cáncer), respectivamente. Se determinó el criterio de valoración de supervivencia cuando los diez panículos mamarios se volvieron positivos a tumores o cuando el volumen de cualquiera de los tumores mamarios alcanzó 2000 mm3. Los resultados se presentan en la figura 43.
Resultados. En comparación con el perfil farmacocinético publicado anteriormente de Sutent (Mendel, D., Laird, D., y col.: "In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationship". Clinical Cancer Research, 203, 9:327-337) y datos anteriores (figura 38), se espera que la Cméx de Sutent en ratones a los que se dosifican dos veces al día a razón de 5 mg/kg sea significativamente menor que los niveles sanguíneos mínimos necesarios para lograr una eficiente eficacia antitumoral en ratones y seres humanos. Los datos muestran una mejora rápida y temporal en la supervivencia de los ratones tratados con monoterapia con Sutent en dosis bajas. Sin embargo, cuando se administra con la vacuna contra el cáncer, se observó una mejoría más persistente y significativa de la supervivencia (P <0,0001 mediante la prueba de rangos logarítmicos).
Ejemplo 16. Mejora de las respuestas inmunitarias inducidas por vacunas mediante administración local de CPG
La potenciación inmune de la administración local de CpG (PF-03512676) en las respuestas inmunitarias inducidas por ácido nucleico de PSMA humano proporcionadas por la divulgación se investigó en un estudio en monos, en el que se evaluó la respuesta inmunitaria midiendo las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA usando un ensayo ELISPOT de IFNy.
Tratamiento de animales y recogida de muestras. Se inmunizó a seis grupos de macacos cinomolgos chinos, seis por cada grupo de ensayo (n.° 1 a 6), con un ADN plasmídico que codifica el antígeno de PSMA modificado (aminoácidos 15-750 de SEQ ID NO: 1) administrado mediante electroporación. En resumen, todos los animales recibieron inyecciones intramusculares bilaterales de 5 mg de ADN plasmídico seguido de electroporación (ADN EP) en el día 0. Posteriormente, justo después de la electroporación, el grupo 2 recibió inyecciones intramusculares bilaterales de 2 mg de CpG mezcladas con 1 mg de alumbre cerca de los sitios de inyección de ADN. Los grupos 3 y 4 recibieron inyecciones intramusculares bilaterales de 2 mg de CpG administradas sin alumbre cerca de los sitios de inyección de ADN, ya sea en el día 0 o en el día 3, respectivamente. El grupo 5 recibió 2 mg de inyecciones intradérmicas bilaterales de CpG administradas cerca de los ganglios linfáticos inguinales donde drena la vacuna en el día 3. El grupo 6 recibió inyecciones bilaterales de 200 |jg de CpG mezclado con la solución de ADN que se coelectroporó en el músculo el día 0.
Procedimiento de ensayo ELISPOT de IFNy. Se recogieron muestras de sangre periférica de cada animal quince días después de la inmunización con ADN. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de las muestras de sangre y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA. En resumen, se sembraron 4e5 PBMC de animales individuales por pocillo con grupos de péptidos específicos de PSMA o péptidos de control no específicos (grupo de péptido de HER2 humano), cada uno a 2 ug/ml en placas de ELISPOT de IFNy. En la tabla 1A se proporciona la composición de cada uno de los grupos de péptido específicos de PSMA. Las placas se incubaron durante 16 h a 37 °C y CO2 al 5 % y se lavaron y revelaron tras la incubación según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de células formadoras de puntos de IFN-y (SFC) mediante un lector de CTL. Cada condición se realizó por duplicado. En la tabla 1B se muestra el resultado de un experimento representativo. La respuesta específica de PSMA informada se calcula restando el número promedio de SFC de los péptidos de control no específicos (conjunto de péptidos HER2 humanos) del número promedio de SFC de los conjuntos de péptidos de PSMA y se normaliza al SFC observado con 1e6 PBMC. a indica que el recuento no es preciso debido a que el número de puntos era demasiado numeroso como para contarlo. Nd indica no determinado.
Resultados. La tabla 28 muestra el resultado de un ensayo ELISPOT de IFNy representativo que evalúa y compara las respuestas de linfocitos T de IFNy inducidas por la vacuna sin (grupo 1) o con CpG (PF-03512676) administrada localmente por vía intramuscular (grupos 2, 3, 4 y 5) o inyecciones intradérmicas (grupo 6). Los resultados de la tabla 1B se representan en la Fig. 1. Como se muestra en la tabla 1B y la Fig. 1, las respuestas de linfocitos T de IFNy específicos de PSMA se detectaron para múltiples grupos de péptido específico de PSMA en ausencia de CpG (PF-03512676) en los seis animales (grupo 1). La respuesta total a los péptidos de PSMA medida fue moderadamente más alta en unos pocos animales que recibieron adicionalmente inyecciones de CpG (PF-03512676) por inyecciones intramusculares (grupo 4: 3/6) o intradérmicas (grupo 5: 2/6) 3 días después de la electroporación del ADN. Sin embargo, cuando se administró posteriormente CpG justo después de la electroporación el mismo día (grupos 2 y 3), hubo varios animales que no produjeron respuestas altas (grupo 2: 4/6 y grupo 3: 3/6), esté mezclado o no con alumbre. Sin embargo, se detectaron mayores respuestas netas en 4/6 animales cuando se electroporó conjuntamente una dosis diez veces menor de CpG con la solución de ADN en el músculo (grupo 6) con una respuesta estadísticamente significativa (P<0,05) a los grupos de péptido H1 y R1, en comparación con los animales que no recibieron CpG (grupo 1). Los datos muestran que una dosis baja de CpG puede mejorar eficazmente las respuestas de linfocitos T de IFNy inducidas por una vacuna de ADN cuando se coelectroporan en el músculo.
Tabla 28. las respuestas de linfocitos T de IFNy específicas para PSMA inducidas por la vacuna de ADN sin (grupo 1) o con CpG (grupos 2, 3, 4, 5 y 6) se miden mediante un ensayo ELISPOT de IFNy a partir de PBMC, 15 días después de la electroporación del ADN.
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continuación
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Ejemplo 17. Mejora de las respuestas inmunitarias inducidas por vacunas mediante administración local de anticuerpo anti-CTLA-4
Se investigó el efecto de la administración subcutánea a baja dosis de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) en las respuestas inmunitarias inducidas por un ácido nucleico de PSMA de rhesus en un estudio en monos, en el que se evaluó la respuesta inmunitaria midiendo las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA usando un ensayo ELISPOT de IFNy. El ácido nucleico de PSMA de rhesus usado en el estudio tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 56) y codifica un polipéptido PSMA inmunogénico de SEQ ID NO: 55.
Tratamiento de animales y recogida de muestras. Se inmunizó a cinco grupos de macacos rhesus de la Indica, siete por cada grupo de ensayo (n.° 1 a 7), con un adenovirus que codifica un polipéptido modificado de PSMA administrado mediante inyecciones intramusculares bilaterales (2x 5e10 P.V.). Inmediatamente después de las inyecciones de adenovirus, el grupo 1 recibió el vehículo y los grupos 2 a 4 recibieron inyecciones subcutáneas bilaterales de anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206) en dosis de 2x 25 mg, 2x 16,7 mg y 2x 8,4 mg, respectivamente en la proximidad del ganglio linfático que drena la vacuna.
Nueve días después de la inmunización, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada animal y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA. En resumen, se sembraron 4e5 PBMC de animales individuales por cada pocillo con grupos de péptidos específicos de PSMA de rhesus (P1, P2, P3 o R1 R2 definidos en la tabla 24A) o péptidos de control no específicos (grupo de péptido de HER2 humana) cada uno a 2 ug/ml en placas de ELISPOT de IFNy. Las placas se incubaron durante 16 h a 37 °C y CO2 al 5 % y se lavaron y revelaron tras la incubación según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de células formadoras de puntos de IFN-y (SFC) mediante un lector de CTL. Cada condición se realizó por duplicado. El promedio de los duplicados de la SFC ajustada en el fondo de los conjuntos de péptidos específicos de rhesus PSMA se normalizó a la respuesta en 1e6 PBMC. Las respuestas individuales y de suma a los grupos de péptidos de cada animal individual se presentan en la tabla 29.
Procedimiento de ensayo ELISPOT de IFNy. Se recubrió una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con un anticuerpo de captura específico para IFNy (BD Bioscience, n.° 51-2525kc) en una microplaca durante una noche a 4 °C. La placa se bloquea con suero/proteína para evitar la unión no específica al anticuerpo. Después de bloquear, se añaden células efectoras (tales como esplenocitos aislados de ratones inmunizados o PBMC aisladas de macacos rhesus) y dianas (tales como péptidos de PSMA de bibliotecas de péptidos, células dianas pulsadas con péptidos o células tumorales que expresan los antígenos relevantes) a los pocillos y se incuban durante una noche a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Las citocinas secretadas por células efectoras son capturadas por el anticuerpo de recubrimiento sobre la superficie de la membrana de PVDF. Después de retirar las células y los medios de cultivo, se añadieron 100 pl de un anticuerpo policlonal biotinilado anti-IFNY humano a cada uno de los pocillos para la detección. Los puntos se visualizaron añadiendo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y el sustrato precipitado, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), para producir un punto de color rojo, según el protocolo del fabricante (Mabtech). Cada punto representa un solo linfocito T productor de citocinas.
Resultados. La tabla 29 muestra los resultados de un ELISPOT de IFNy representativo que compara las respuestas de linfocitos T inducidas por la vacuna sin (grupo 1) o con (grupos 2-4) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 (CP-675, 206) administrada mediante inyecciones subcutáneas en la proximidad al ganglio linfático que drena la vacuna. La vacuna generó una respuesta inmunitaria (grupo 1) que mejoró significativamente mediante la administración local del anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206) a una dosis de 50 mg (grupo 2, P= 0,001 mediante la prueba de la T de Student usando valores subestimados). La respuesta también se mejoró significativamente con dosis bajas de anticuerpo anti-CTLA-4 a 33,4 mg (grupo 3: P = 0.004 por la prueba de la T de Student utilizando valores subestimados) y 16,7 mg (grupo 4: P=0,05 mediante la prueba de la T de Student) respectivamente. Los datos sugieren que las dosis bajas de anti-CTLA-4 administradas por inyección subcutánea pueden mejorar significativamente las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna.
Tabla 29. Respuestas de linfocitos T de IFNy inducidas por la vacuna sin (grupo 1) o con inyecciones subcutáneas de anticuerpo anti-CTLA-4 (CP-675, 206). A indica que el conteo está subestimado debido a los altos números de puntos. TNTC significa demasiado numeroso para contar.
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continuación
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Ejemplo 18. Inmunomodulación de células supresoras derivadas de mieloides mediante baja dosis de sunitinib
El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar los efectos inmunomoduladores de las dosis bajas de sunitinib en las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) in vivo, en un modelo de ratón no tumoral.
Procedimientos de estudio.
Para generar esplenocitos enriquecidos de MDSC, se implantaron células TUBO (1x106) en los flancos de 5 ratones BALB/neuT y se dejaron durante aprox. 20-30 días hasta que el volumen del tumor alcanzó entre 1000-1500 mm3 Se sacrificó a los ratones, se extrajeron los bazos y se recuperaron los esplenocitos enriquecidos en MDSC. Los esplenocitos se marcaron durante 10 minutos con 5 pM de CFSE, se lavaron con PBS y se contaron. Las células marcadas se resuspendieron posteriormente a 5x107 esplenocitos/ml en solución de PBS y se transfirieron de forma adoptiva a través de una inyección intravenosa en la vena caudal en ratones sin tratamiento con BALB/c. Tres días antes de la transferencia adoptiva, se comenzó en los ratones receptores la dosificación dos veces al día de vehículo o sunitinib malato (Sutent) a 5 mg/kg, 10 mg/kg y 20 mg/kg. Tras la transferencia adoptiva, los ratones receptores siguieron recibiendo una dosis cada dos días de vehículo o sunitinib durante dos días más, después de lo cual los ratones fueron sacrificados, se extirparon los bazos, se recuperaron los esplenocitos y se procesaron para el análisis fenotípico.
Se contaron y resuspendieron los esplenocitos a 5x106 células/ml en tampón de tinción de FACS (PBS, seroalbúmina bovina al 0,2 % (p/v) y azida de sodio al 0,02 % (p/v)). Para la tinción para citometría de flujo de los esplenocitos, primero se incubaron 2,5x106 células con anticuerpos contra CD16/CD32, 10 minutos a 4 °C, para bloquear los receptores Fc y minimizar la unión no específica. Los esplenocitos se tiñeron luego durante 20 minutos a 4 °C con los anticuerpos conjugados con fluoróforo adecuados (Biolegend) contra marcadores de superficie celular murinos. Para linfocitos T (anti-CD3 (Pacific Blue), clon 17A2) y para MDSC (anti-GR-1 (APC), clon RB6-8C5 y anti-CD11b (PerCp Cy5.5), clon M1/70). También se incluyó una tinción de vivas/muertas. Después de la incubación del anticuerpo, se lavaron los esplenocitos teñidos con 2 ml de tampón de FACS, se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 0,2 ml de tampón de FACS antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo bD CANTO II. Para monitorizar el efecto de sunitinib o vehículo en la supervivencia de las MDSC transferidas de manera adoptiva, se calculó el porcentaje de CFSE+,CD3-,GR1+, CD11b+ en la ventana lógica singlete de vivas. Posteriormente, se determinó el número de MDSC transferidas de manera adoptiva por bazo, calculando qué número real de células representaba el porcentaje del recuento total de esplenocitos. Los datos se analizaron mediante los programas informáticos FloJo y Graph Pad.
Resultados. Los datos presentados en la tabla 31 representan el número medio de células CSFE+, CD3-, GR1+, CD11b+ transferidas de manera adoptiva recuperadas por bazo (n=7/grupo), 2 días después de la transferencia adoptiva, de ratones a los que se administró cada dos días o vehículo o 5 mg/kg, 10 mg/kg y 20 mg/kg de sunitinib. Los datos demuestran que Sunitinib, dosificado cada dos días, in vivo, tiene un efecto inmunomodulador en MDSC, incluso cuando se administra en dosis tan bajas como 5 mg/kg, dando como resultado una reducción estadísticamente significativa en los números recuperados en comparación con el grupo de control tratado con vehículo.
Tabla 31. Número medio de MDSC CFSE+, CD3-, GR1+, CD11b+ recuperadas del bazo, 7 ratones por grupo y el error típico correspondiente. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía usando la prueba de comparación múltiple de Dunnett, que compara los grupos a los que se administró Sunitinib contra el grupo de 0 mg/kg (vehículo).
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Ejemplo 19. Inmunogenicidad de construcciones de adenovirus y ADN de triple antígeno
El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar la capacidad de las construcciones de vacuna de triple antígeno (tanto en forma de vector adenovírico o de plásmido de ADN) que expresan tres antígenos, PSMA, PSCA y PSA proporcionados por la invención para provocar respuestas de linfocitos T específicos contra los tres antígenos codificados en primates no humanos.
Procedimientos de estudio in vivo. La inmunogenicidad de linfocitos T de cinco vectores de adenovirus que expresan cada uno tres antígenos (PSMA, PSCA y PSA; Ad-733, Ad-734, Ad-735, Ad-796 y Ad-809) proporcionados por la invención se compararon con la mezcla de tres vectores de adenovirus, cada uno expresando solo un único antígeno (PSMA, PSA o PSCA), 9 días después del cebado. La respuesta a un solo adenovirus que expresa un antígeno único (grupos 1-3) se evaluó para demostrar la especificidad. En resumen, Se inyectó por vía intramuscular a macacos rhesus de la Indica (n=6 para los grupos 1 y 3, n=7 para el grupo 2 y n=8 para los grupos 4-9) con un total de 1e11 P.V., seguido de inyecciones intradérmicas de anti-CTLA-4 a 10 mg/kg en el mismo día. Nueve días después de las inyecciones, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada animal y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy para medir las respuestas de linfocitos T específicas de PSMA, pSa y PSCA.
Trece semanas después de las inyecciones de adenovirus y anti-CTLA-4 cuando las respuestas de los linfocitos T se habían contraído, los monos recibieron vacunaciones de refuerzo de ADN (grupo 1: PSMA, plásmido 5166; grupo 2: PSA, plásmido 5297; grupo 3: PSCA, plásmido 5259; grupo 4: mezcla de Ps Ma , PSA y pScA, plásmidos 5166, 5259 y 5297; grupo 4: plásmido 457; grupo 6: plásmido 458; grupo 7: plásmido 459; grupo 8: plásmido 796 y grupo 9: plásmido 809) administradas por electroporación. En resumen, cada animal recibió un total de 5 mg de ADN plasmídico proporcionado por la invención que suministra el mismo casete de expresión codificado en el adenovirus utilizado en el cebado. Nueve días después de la vacunación de refuerzo, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada animal y se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFNy.
Ensayo ELISPOT de IFNy. En resumen, 4e5 PBMC de animales individuales se colocaron en placas por pocillo con los grupos de péptidos específicos de PSMA P1, P2, P3 o H1 y H2 (tabla 24A), grupo 1 o 2 específico de PSA (tabla 25), grupo específico de PSCA (tabla 26) o péptidos de control no específicos (grupo de péptido de HER2 humano) cada uno a 2 ug/ml en placas de ELISPOT de IFNy. Las placas se incubaron durante 16 h a 37 °C y CO2 al 5 % y se lavaron y revelaron tras la incubación según las instrucciones del fabricante. Se contó el número de células formadoras de puntos de IFN-y (SFC) mediante un lector de CTL. Cada condición se realizó por duplicado. El promedio de los duplicados de la SFC ajustada en el fondo de los conjuntos de péptidos específicos de antígeno se normalizó a la respuesta en 1e6 PBMC. Las respuestas específicas de antígeno en las tablas presentan la suma de las respuestas a los correspondientes péptidos o grupos de péptidos específicos de antígeno.
Resultados: La tabla 27 representa un estudio que evalúa la inmunogenicidad de linfocitos T de cinco adenovirus diferentes, cada uno de los cuales expresa los tres antígenos en comparación con la mezcla de tres adenovirus que expresan cada uno un único antígeno en macacos de rhesus de la India mediante ELISPOT de IFNy. La mayoría de los animales que solo recibieron inyecciones de Ad-PSMA (grupo 1) indujeron respuestas específicas a Ps Ma pero no a PSA o PSCA (prueba de la T de Student, P<0,03. Un animal (n.° 4) que indujo respuestas a PSCA preferentemente se eliminó del análisis estadístico). Los animales que solo recibieron inyecciones de Ad-PSA (grupo 2) indujeron respuestas específicas a PSA pero no a PSMA o PSCA (prueba de la T de Student, P<0,02). Los animales que solo recibieron inyecciones de Ad-PSCA (grupo 3) indujeron respuestas específicas a PSCA pero no a PSMA o PSA (prueba de la T de Student, P<0,03). Los cinco vectores de adenovirus que expresan triple antígeno (grupos 5-9) indujeron respuestas de linfocitos T de IFNy a los tres antígenos cuya magnitud varió según el animal. La magnitud de las respuestas a PSCA inducidas por el adenovirus que expresa triple antígeno fue similar a la mezcla de vectores individuales (grupo 4). Sin embargo, la magnitud de las respuestas a PSMA inducidas por Ad-809 (grupo 9) y las respuestas a PSA inducidas por Ad-796 (grupo 8) fueron cada una significativamente superiores a la mezcla (prueba de la T de Student, P=0,04 y P=0,02) respectivamente. Estos resultados indican que la vacunación con un adenovirus que expresa antígenos triples puede provocar respuestas inmunes de linfocitos T equivalentes o superiores a la vacunación con la mezcla de adenovirus individuales en primates no humanos.
La tabla 28 que muestra los resultados del ELISPOT de IFNy representa un estudio que evalúa la inmunogenicidad de los cinco casetes de expresión de triple antígeno diferentes proporcionados en la invención, administrados mediante un cebado con adenovirus en combinación con anti-CTLA-4, seguido de un refuerzo de electroporación del ADN plasmídico correspondiente. Las respuestas inmunitarias se compararon con la mezcla de tres construcciones que expresan un solo antígeno administrado de manera similar mediante un cebado con adenovirus con anti-CTLA-4 e inmunizaciones de refuerzo con electroporación de ADN.
Todos los animales que solo recibieron Ad-PSMA con anti-CTLA-4 seguido de inmunizaciones con plásmido-PSMA (grupo 1) indujeron respuestas específicas a PSMA pero no a PSA o PSCA. De manera similar, todos los animales que solo recibieron Ad-PSA con anti-CTLA-4 seguido de inmunizaciones con plásmido-PSA (grupo 2) indujeron respuestas específicas a PSA pero no a PSMA o PSCA y finalmente a todos los animales que solo recibieron inmunizaciones con Ad-PSCA con anti-CTLA-4 seguido de plásmido-PSCA (grupo 3) indujeron respuestas específicas a PSCA pero no a PSMA o PSA (prueba de la T de Student, P<0,01).
Todos los animales que se han inmunizado con los vectores de expresión de antígeno triple (grupos 5-9) o la mezcla (grupo 4) indujeron respuestas de linfocitos T de IFNy contra los tres antígenos. La frecuencia de linfocitos T de IFNy específicos para PSCA o PSA fue similar en todos estos grupos (grupos 4-9), respectivamente. Sin embargo, los grupos de construcciones 7 y 9 que recibieron vacunas de vector de expresión de antígeno triple produjeron una frecuencia significativamente mayor de respuestas a PSMA que la mezcla de tres construcciones de expresión de antígeno únicas (grupo 4). Estos resultados indican que las vacunas de adenovirus y ADN que expresan tres antígenos en un casete pueden generar respuestas de linfocitos T de IFNy equivalentes o superiores a la mezcla de adenovirus y ADN que expresan los antígenos individuales en primates no humanos.
Tabla 25. Grupos de péptido de PSA: Se muestra la posición de los aminoácidos y la secuencia de quince péptidos de aminoácidos que se superponen con trece aminoácidos de la biblioteca de péptidos de PSA.
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Tabla 26. Grupo de péptidos de PSCA: Se muestra la posición de los aminoácidos y la secuencia de quince péptidos de aminoácidos que se superponen con trece aminoácidos de la biblioteca de péptidos de PSCA.
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Tabla 27. Respuestas de linfocitos T de IFNy inducidas por el antígeno individual (grupo 1: Ad-PSMA; grupo 2: Ad-PSA; grupo 3: Ad-PSCA; grupo 4: mezcla de Ad-PSMA, Ad-PSA y Ad-PSCA) o vectores de adenovirus que expresan antígeno triple (Grupo 4: Ad-733; grupo 6: Ad-734; grupo 7: Ad-735; grupo 8: Ad-796 y grupo 9: Ad-809) después del cebado con adenovirus con anti-CTLA-4 analizado mediante ensayo ELISPOT.
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continuación
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Tabla 28. Respuestas de linfocitos T de IFNy inducidas por el antígeno individual (grupo 1: PSMA; grupo 2: PSA; grupo 3: PSCA; grupo 4: mezcla de PSMA, PSA y PSCA) o vectores de expresión de antígeno triple (Grupos 5 - 9) después del cebado de adenovirus con anti-CTLA-4 e inmunizaciones de refuerzo de electroporación de ADN
analizadas mediante ensayo ELISPOT.
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continuación
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Ejemplo 20. Reducción de la fosforilación de STAT3 mediante sunitinib
El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar la capacidad de sunitinib para inhibir directamente la fosforilación de STAT3 (transductor de señal del activador de la transcripción 3), un mediador clave de la supresión inmunitaria en el bazo.
Procedimiento del estudio. Se investigó el efecto agudo de Stutent en el estado de fosforilación de STAT3 en el hígado en un modelo de ratón de tumor subcutáneo para evaluar los efectos inmunomoduladores directos del compuesto. En resumen, se implantaron en ratones BALB/neuT hembra de 10-12 semanas de edad 1e6 células TUBO por vía subcutánea en el flanco derecho. Después de cuarenta y un días después del implante del tumor, se administró Stutent mediante sonda oral a 20 mg/kg. A las 0, 1, 3, 7 y 24 h después de la dosificación de Stutent, se sacrificó a tres animales por cada punto de tiempo conforme a las guías de la IAUCUC y se congelaron inmediatamente los bazos en nitrógeno líquido para conservar el estado de fosforilación. Se congelaron los bazos de ratones BALB/c hembra para su uso como controles de ratones sanos.
Procedimientos de ensayo de STAT3. Se homogeneizaron los bazos congelados instantáneamente a 100 mg de tejido por cada 500 pl de tampón de lisis (NaCl 70 mM, p-glicerol fosfato 50 mM, HEPES 10 mM, Triton X-100 al 1%, Na3VO4 100 mM, PMSF 100 mM, 1 mg/ml de leupeptina) utilizando un homogeneizador de tejidos Polytron. Las digestiones resultantes se centrifugaron a 10.000 g durante 15 minutos. Se aisló el sobrenadante y se determinaron las concentraciones de proteína utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, Illinois). Se agregaron cuarenta microgramos de proteína a cada pocillo de un kit ELISA de STAT3 total (eBioscience, n. ° de cat. 85­ 86101-11) o fosfo-STAT3 (eBioscience, n.° de cat. 85-86102-11). Los niveles relativos de cualquiera de las proteínas se compararon con los patrones proporcionados en el kit y con los patrones adquiridos de forma independiente (Signaling Technologies, n.° de cat. 9333-S).
Resultados. La tabla 29 muestra el resultado de un ensayo de STAT representativo que evalúa el efecto de Stutent en el estado de fosforilación de STAT3 en el bazo. Ambos extractos de bazo de ratones sanos o portadores de tumores mostraron niveles similares de proteína STAT3 mediante ELISA (STAT3 total). Sin embargo, en comparación con BALB/c sanos, los extractos de ratones portadores de tumores tuvieron niveles significativamente mayores de STAT3 fosforilado (prueba de la T de Student, P<0,001). Los niveles de fosforilación disminuyeron rápidamente a niveles similares a los de los animales sanos solo 1 hora después del tratamiento con Sutent y se mantuvieron en niveles más bajos que los ratones no tratados hasta las 7 horas. A las 24 horas, los niveles de fosforilación de STAT3 se recuperaron completamente a niveles antes del tratamiento con Sutent. La cinética de la fosforilación refleja los niveles de Sutent circulante en la sangre. La respuesta rápida de la fosforilación de STAT3 en el bazo que refleja el perfil farmacocinético de Sutent sugiere una función inmunomoduladora directa de Sutent en animales portadores de tumores.
Tabla. 29. Los niveles relativos de STAT3 fosforilado y de STAT3 total de ratones BALB/c sanos y de ratones BALB/neuT portadores de tumores antes o después del tratamiento con Sutent en múltiples puntos de tiempo.
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LISTADO DE SECUENCIAS EN BRUTO
SEQ ID NO: 1. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PSMA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHN
MKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDV
LLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDL
VYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPA
DYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVG
LPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKM
HIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSVWFGGIDPQSGAAWHEIVRSF
GTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGN
YTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLG
SGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYH
LTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDS
LFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRH
VIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSE
VA SEQ ID NO: 2. SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA EL PSMA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA DE SEQ ID NO: 1
atgtggaatctccttcacgaaaccgactcggctgtggccaccgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctgg tgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctcttcgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaa gcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatt tagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgag ctagcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatg agattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctct cctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacat gaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagc tggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttg gaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacc cagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatg atgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgcc ctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgac aagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggac tcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaa aggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtg ggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactaca ctctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaagg ctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagca aattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattg ggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatcc aatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagctagccaattccatagtgctcccttttga ttgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaag acatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccagg actttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccatta gggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattccc aggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagattt atgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO: 3. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE ANTÍGENO 1 DE PSMA REORDENADO
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNISPQHNVKAFLDEMKAE
NIKKFLYLFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQAEWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNETHPNY
ISIIDEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENISDVVPPYSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFF
KLERELKINCSGKILIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGIILYSDPADYFAPGVKSYPDG
WNLPGGGVQRGNVLNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRELAEAVGLPSIPVHPIGYYDA QKLLEKMGGSAPPDSSWKGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVI GTIRGAVEPDRYVILGGHRDAWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKKGWRPRRTII
FASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLV
YNLTKELQSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGVPRINKLGSGNDFEVFFQRLGIAS GRARYTKNWKTNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGLVFELAD SIVLPFDCQDYAWLRKYADKIYNLAMKHPEELKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFNQ
RLQDFDKNNPLLVRMLNDQLMFLERAFVDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESF
PGIYDAL F DI ES KVD PS KAWG E VKRQIYVAAFTVQAAAETLS EVA SEQ ID NO: 4. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINIÁCIDOS DE ANTÍGENO 1 DE PSMA REORGANIZADO DE SEQ ID NO: 3 atggctagcgccagacggcccagatggctgtgcgccggagccctggtgctggccggaggattcttcctgctgggcttcct gttcggctggttcatcaagagcagcagcgaggccaccaacatcagcccccagcacaacgtgaaggcctttctggacg agatgaaggccgagaacatcaagaagtttctgtacctgttcacccagatcccccacctggccggcaccgagcagaact tccagctggccaagcagattcaggctgagtggaaagagttcggcctggacagcgtggagctggcccactacgacgtg ctgctgtcctaccccaacgagacacaccccaactacatcagcatcatcgacgaggacggcaacgagattttcaacacc agcctgttcgagccccctccccctggctacgagaacatctccgacgtggtgcccccctacagcgccttcagccctcagg gaatgcctgaaggcgacctggtgtacgtgaactacgcccggaccgaggacttcttcaagctggaacgggagctgaag atcaactgcagcggcaagatcctgatcgccagatacggcaaggtgttccggggcaacaaagtgaagaacgcacagc tggctggagccaagggcatcatcctgtacagcgaccccgccgactacttcgcccctggcgtgaagtcctaccctgacgg ctggaacctgcctggcggcggagtgcagcggggcaacgtgctgaacctgaacggagccggcgaccctctgacccca ggctaccccgccaacgagtacgcctaccggcgggagctggccgaagccgtgggcctgcccagcatccccgtgcacc ccatcggctactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggcagcgcccctcccgacagcagctggaagg gcagcctgaaggtgccctacaacgtgggccctggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaagatgcacatc cacagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcaccatcagaggcgccgtggagcccgacagatac gtgatcctgggcggccaccgggacgcctgggtgttcggcggcatcgacccccagagcggagccgccgtggtgcacg agatcgtgcggagcttcggcaccctgaagaagaagggctggcggcccagacggaccatcatcttcgccagctgggac gccgaggaattcggactgctgggctctaccgagtgggccgaggaaaacagcagactgctgcaggaacggggcgtcg cctacatcaacgccgacagctccatcgagggcaactacaccctgcgggtggactgcacccccctgatgtacagcctgg tgtacaacctgaccaaagagctgcagagccccgacgagggcttcgagggcaagagcctgtacgagagctggacca agaagtcccccagccccgagttcagcggcgtgccccggatcaacaagctgggcagcggcaacgacttcgaggtgttc ttccagaggctgggcattgccagcggcagagcccggtacaccaagaactggaaaaccaacaagttctccggctaccc cctgtaccacagcgtgtacgagacatacgaactggtggagaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgaccgtg gcccaggtccggggagggctggtgttcgaactggccgacagcatcgtgctgcccttcgactgccaggactatgctgtggt gctgcggaagtacgccgacaaaatctacaacctggccatgaagcaccccgaggaactgaaaacctacagcgtgtcct tcgacagcctgttcagcgccgtgaagaacttcaccgagatcgccagcaagttcaaccagcggctgcaggacttcgaca agaacaaccccctgctggtccggatgctgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcgtggaccccctgggcct gcctgaccggcccttctaccggcacgtgatctatgcccccagcagccacaacaagtacgctggcgagagcttccccgg catctacgatgccctgttcgacatcgagagcaaggtggaccccagcaaggcctggggcgaagtgaagcggcagatat acgtggccgccttcacagtgcaggccgctgccgagacactgagcgaggtggcc
SEQ ID NO: 5. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE ANTÍGENO 2 DE PSMA REORDENADO
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPQHNVKAFLDELKAEN
IKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFELAKQIQAQWKEFGLDSVELSHYDVLLSYPNETHPNYI
SIIDEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENISDVVPPYSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFK
LERDMKINCSGKILIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGIILYSDPADYFAPGVKSYPDG
WNLPGGGVQRGNVLNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDA QKLLEKMGGAAPPDSSWKGSLQVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVI GTLKGAVEPDRYVILGGHRDAWVFGGIDPQSGAAWHEIVRSFGTLKKKGWRPRRTI
LFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSL
VYNLTKELQSPDEGFEGKSLFDSWTEKSPSPEFSGLPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIA SGRARYTKDWKTSKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGIVFELA
NSVVLPFDCQDYAWLKKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKF
NQRLQDFDKNNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGES FPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA SEQ ID NO: 6. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINIÁCIDOS DE ANTÍGENO 2 DE PSMA REORGANIZADO DE SEQ ID NO: 5 atggctagcgccagacggcccagatggctgtgtgctggcgccctggtgctggctggcggctttttcctgctgggcttcctgtt cggctggttcatcaagagcagcagcgaggccaccaacatcaccccccagcacaacgtgaaggcctttctggacgag ctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacccagatcccccacctggccggcaccgagcagaacttc gagctggccaagcagatccaggcccagtggaaagagttcggcctggacagcgtggaactgagccactacgacgtgc tgctgagctaccccaacgagacacaccccaactacatcagcatcatcgacgaggacggcaacgagattttcaacacc agcctgttcgagccccctccacccggctacgagaacatcagcgacgtggtgcccccctacagcgcattcagtccacag ggaatgcccgagggcgacctggtgtacgtgaactacgcccggaccgaggacttcttcaagctggaacgggacatgaa gatcaactgcagcggcaagatcctgatcgccagatacggcaaggtgttccggggcaacaaagtgaagaacgcccag ctggcaggcgccaagggcatcatcctgtacagcgaccccgccgactacttcgcccctggcgtgaagtcctaccccgac ggctggaacctgcctggcggcggagtgcagaggggcaacgtgctgaacctgaacggcgctggcgaccctctgaccc ctggctaccccgccaacgagtacgcctacagacggggaatcgccgaggccgtgggcctgcctagcatccctgtgcac cccatcggctactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggagccgcccctcccgacagctcttggaagg gcagcctgcaggtcccctacaacgtgggccctggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaagatgca catee acagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcaccctgaagggcgccgtggaacccgacagatacgt gatcctgggcggccaccgggacgcctgggtgttcggaggcatcgaccctcagagcggcgctgccgtggtgcacgaga tcgtgcggagcttcggcacactgaagaagaagggctggcggcccagacggaccatcctgttcgccagctgggacgcc gaggaattcggcctgctgggcagcaccgagtgggccgaggaaaacagtcggctgctgcaggaacggggcgtcgcct acatcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcgggtggactgcacccccctgatgtacagcctggtg tacaacctgaccaaagagctgcagagccccgacgagggcttcgagggcaagtccctgttcgactcctggaccgagaa gtcccccagccccgagttcagcggcctgcccagaatcagcaagctgggcagcggcaacgacttcgaggtgttcttcca gcggctgggaatcgccagcggcagagcccggtacaccaaggactggaaaaccagcaagttctccggctaccccctg taccacagcgtgtacgagacatacgagctggtggaaaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgaccgtggccc aggtccgaggcggcatcgtgttcgaactggccaacagcgtggtgctgccattcgattgtcaggactacgccgtggtgctg aagaagtacgccgacaaaatctacaacatcagcatgaagcacccccaggaaatgaaaacctacagcgtgtccttcg acagcctgttcagcgccgtgaagaatttcaccgagatcgcctccaagttcaaccagagactgcaggacttcgacaaga acaaccccatcctgctgcggatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcgaccccctgggcctgcc cgaccggcccttttaccggcacgtgatctatgcccccagcagccacaacaaatacgccggcgagagtttccccggcat ctacgatgccctgttcgatatcgagagcaaggtggaccccagcaaggcctggggcgaagtgaagcggcagatttacgt ggccgcattcacagtgcaggctgctgccgagacactgagcgaggtggcc
SEQ ID NO: 7. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE ANTÍGENO 3 DE PSMA REORDENADO
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAE
NIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPN
YISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDF
FKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYP
DGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYY
DAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPG FTGNFSAQKLKLHIHSNTKVTRIYN
VIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSVWFGGIDPQSGAAVVHEIVRTFGTLKKKGWRPRR
TILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLLHS
LVYNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPELSGLPRISKLGSGNDFEVFFQRLGI
SSGRARYTKDWKTSKFSSYPLYHSIYETYELWKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFEL
ANSIVLPFDCRDYAVALKNHAENLYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKF
SERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGES
FPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA SEQ ^ ID NO: 8. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINIÁCIDOS DE ANTIGENO 3 DE PSMA REORGANIZADO DE SEQ ID NO: 7 atggctagcgccagacggcccagatggctgtgtgctggcgccctggtgctggctggcggctttttcctgctgggcttcctgtt cggctggttcatcaagagcagcaacgaggccaccaacatcacccccaagcacaacatgaaggcctttctggacgag ctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacccagatcccccacctggccggcaccgagcagaacttc cagctggccaagcagatccagagccagtggaaagagttcggcctggacagcgtggaactggcccactacgacgtgc tgctgagctaccccaacaagacccaccccaactacatcagcatcatcaacgaggacggcaacgagattttcaacacc agcctgttcgagccccctccacccggctacgagaacgtgtccgacatcgtgcccccattcagcgcattcagtccacagg gaatgcccgagggcgacctggtgtacgtgaactacgcccggaccgaggacttcttcaagctggaacgggacatgaag atcaactgcagcggcaagatcgtgatcgccagatacggcaaggtgttccggggcaacaaagtgaagaacgcccagc tggcaggcgccaagggcgtgatcctgtatagcgaccccgccgactacttcgcccctggcgtgaagtcctaccccgacg gctggaacctgcctggcggcggagtgcagcggggcaacatcctgaacctgaacggcgctggcgaccccctgacccct ggctatcccgccaacgagtacgcctacagacggggaatcgccgaggccgtgggcctgcctagcatccctgtgcaccc catcggctactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggcagcgcccctcccgatagctcttggagaggca gcctgaaggtgccctacaacgtgggccctggcttcaccggcaacttcagcgcccagaagctgaagctgcacatccaca gcaacaccaaagtgacccggatctacaacgtgatcggcaccctgagaggcgccgtggaacccgacagatacgtgat cctgggcggccaccgggacagctgggtgttcggcggcatcgaccctcagtctggcgccgctgtggtgcacgagatcgt gcggacctttggcaccctgaagaagaagggctggcggcccagacggaccatcctgttcgccagctgggacgccgag gaattcggcctgctgggcagcaccgagtgggccgaggaaaacagtcggctgctgcaggaacggggcgtcgcctaca tcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcgggtggactgcacccccctgctgcacagcctggtgtac aacctgaccaaagagctgaagtcccccgacgagggcttcgagggcaagagcctgtacgagagctggaccaagaag tcccccagccccgagctgagcggcctgcccagaatcagcaagctgggcagcggcaacgacttcgaggtgttcttccag cggctgggcatcagcagcggcagagcccggtacaccaaggactggaaaaccagcaagttcagcagctaccccctgt accacagcatctacgagacatacgagctggtggtcaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgaccgtggccca ggtccgaggcggcatggtgttcgagctggccaacagcatcgtgctgcccttcgactgccgggactacgccgtggccctg aagaaccacgccgagaacctgtacagcatcagcatgaagcacccccaggaaatgaaaacctacagcgtgtccttcg acagcctgttcagcgccgtgaagaatttcaccgagatcgcctccaagttcagcgagcggctgcaggacttcgacaaga gcaaccccatcgtgctgagaatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcgaccccctgggcctgcc cgaccggcccttttaccggcacgtgatctatgcccccagcagccacaacaaatacgccggcgagagtttccccggcat ctacgatgccctgttcgacatcgagagcaaggtggaccccagcaaggcctggggcgaagtgaagcggcagatttacg tggccgcattcacagtgcaggccgctgccgagacactgagcgaggtggcc
SEQ ID NO: 9. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSMA UNIDO A MEMBRANA
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAE
NIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPN
YISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDF
FKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYP
DGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYY
DAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIY
NVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSVWFGGIDPQSGAAWHEIVRSFGTLKKEGWRPR RTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMY
SLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRL
GIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMV
FELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIA
SKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYA GESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA SEQ ID NO: 10. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO PSMA UNIDO A MEMBRANA DE SEQ ID NO: 9 atggctagcgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctggtgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctctt cgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaa gctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgca aagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctggcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaa taagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctc caggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtat gttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgcca gatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccga ccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaata tcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgca gaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggct cagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttct acacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagagga gcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtgg agcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgt ttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagc gtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacag cttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggacta aaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttcc aacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgta tcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcg aggagggatggtgtttgagctggccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgct gacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagta aagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaat gatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcat ctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaa agtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcaga gactttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO: 11. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO DE PSMA CITOSÓLICO MASKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQ WKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVP
PFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKN
AQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGY
PANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNV
GPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGID
PQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQE
RGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSP
SPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETY
ELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAWLRKYADKIYSISMK
HPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAF
IDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYV
AAFTVQAAAETLSEVA SEQ ID NO: 12. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO DE PSMA DE SEQ ID NO: 11 atggctagcaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagct gagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaa gcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctggcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaata agactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctcc aggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgt taactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccag atatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgac cctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatat cctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcag aggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctc agcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttcta cacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggag cagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtgga gcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgttt gcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgt ggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagctt ggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaa aaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaa cgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatc acagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcga ggagggatggtgtttgagctggccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctg acaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaa agaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatg atgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatct atgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaa gtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagag actttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO: 13. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO DE PSMA SECRETADO
MASETDTLLLVWLLLVWPGSTGDAAKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYN
FTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDG
NEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMK
INCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPG
GGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEK
MGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGA
VEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWD AEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKE
LKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARY
TKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLP
FDCRDYAWLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQD
FDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYD
ALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA SEQ ID NO: 14. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO PSMA SECRETADO DE SEQ ID NO: 13 atggctagcgaaaccgacactttgttgttgtgggtgcttttgctttgggtacccggatctactggtgatgctgctaaatcctcca atgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttct tatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtgg aaagaatttggcctggattctgttgagctagcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacat ctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcgg atattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaa gacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagag gaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcct ggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgca ggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagt attcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcag ctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgc acatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagat atgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaatt gtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaa gaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgct gactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaa agagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagt tcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcagg cagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatat gagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagct agccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttcta tgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgctt ccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgttt ctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccaca acaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcct ggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcc SEQ ID NO: 15. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PSA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA
MASVWPWFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLV HPQVWLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRP GDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKK LQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGI TSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
SEQ ID NO: 16. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PSA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA DE SEQ ID NO: 15 atggctagctgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtg ggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggt gttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcaca gcttgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcct gaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctc acggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctgggg cagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcg caagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggt gattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaa aggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccc
SEQ ID NO: 17. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO DE PSA CITOSÓLICO
MASIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQVWLTAAHCIRNKSVILLGR
HSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTD
AVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQK VTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKW HYRKWIKDTIVANP SEQ ID NO: 18. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO DE PSA DE SEQ ID NO: 17
atggctagcattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcaggg cagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttg ctgggtcggcacagcttgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctac gatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcaga gcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacg cctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttcca atgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaa gcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatg tgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaa cccc
SEQ ID NO: 19. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UN ANTÍGENO PSA UNIDO A MEMBRANA
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPGIVGGWECEKHSQP
WQVLVASRGRAVCGGVLVHPQVWLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVS
HSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGT
TCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGK
STCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKWHYRKWIKDTIVANP
SEQ ID NO: 20. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEL ANTÍGENO PSA UNIDO A MEMBRANA DE SEQ ID NO: 19 atggctagcgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctggtgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctctt cgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaggaattgtgggaggctgggagtgcgagaagcatt cccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctc acagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcttgtttcatcctgaagacacaggcc aggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggt gatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacc tgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttg accccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgacc aagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaat ggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggt gcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctga
SEQ ID NO: 21. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PSCA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA MASKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRA VGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPAL GLLLWGPGQL SEQ ID NO: 22. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PSCA HUMANO DE LONGITUD COMPLETA DE SEQ ID NO: 21
atggctagcaaggctgtgctgcttgccctgttgatggcaggcttggccctgcagccaggcactgccctgctgtgctactcct gcaaagcccaggtgagcaacgaggactgcctgcaggtggagaactgcacccagctgggggagcagtgctggaccg cgcgcatccgcgcagttggcctcctgaccgtcatcagcaaaggctgcagcttgaactgcgtggatgactcacaggacta ctacgtgggcaagaagaacatcacgtgctgtgacaccgacttgtgcaacgccagcggggcccatgccctgcagccgg ctg ccg cea tccttg cg ctg ctccctg cactcg g cctg ctg etetg g g g acccg g cea g cta
SEQ ID NO: 23. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5166
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C
AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAATACCATATTT TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG G AG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G ATGGCAAGAT CCT GGTATCGGTCT GCG ATT CCG ACT CGT CCAACAT CAAT ACAAC
CT ATT AATTT CCCCT CGTCAAAAAT AAG GTT AT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G
ACG ACT G AAT CCG GTG AG AAT GG CAAAAG CTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTTC AACAGG CCAG CCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA TT CATT CGT GATT GCGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACGCG AT CGCT GTT AAAAGG AC AATT ACAAACAG G AAT CAAAT GCAACCG GCG CAG G AACACT GCCAGCG CAT CAAC AATATTTT CACCT G AAT CAG G AT ATT CTT CT AATACCT G G AAT G CTGTTTT CCCGG
GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT
G GT CGG AAG AG GCATAAATT CCGT CAG CCAG TTT AGTCT G ACCAT CT CAT CTGTA
ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCATGTTT CAGAAACAACT CTGGCGCAT CGG
G CTT CCCAT ACAAT CG ATAG ATT GT CGCACCT GATT GCCCG ACATTAT CG CG AGC
CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC
AAGACGTTT CCCGTT G AAT ATGGCT CAT AACACCCCTTGTATT ACT GTTTATGTAA
G CAG AC AG G T CG ACAAT ATT G G CT ATT G G CCATT G CAT ACG TT G TATCTATAT CAT
AATATGTACATTT AT ATT GGCT CAT GT CCAATAT G ACCG CCAT GTT G ACATT GATT A TTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG
GAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC
G ACCCCCG CCCATT G ACGT CAATAAT G ACGTATGTT CCCAT AGTAACGCCAAT AG
G G ACTTT CCATT G ACGT CAAT GG GTG G AGTATTT ACG GT AAACT G CCCACTT GG C
AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGT AAAT GGCCCGCCTGGCATT AT GCCCAGT ACAT G ACCTT ACGGG ACTTT CCT ACTT GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC CCCATT G ACGT CAATGGG AGTTT GTTTT GGCACCAAAAT CAACGGG ACTTT CCAA AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGT GGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAC GCCAT CCACGCT GTTTT G ACCT CCATAGAAGACACCGGGACCG AT CCAGCCT CC GCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCA CCGTCCGGATCTCAGCAAGCAGGTATGTACTCTCCAGGGTGGGCCTGGCTTCCC CAG T CAAG ACT CCAG G G ATTT G AGG G ACG CTGTGG G CT CTT CT CTT ACATGTACC TTTT GCTT G CCT CAACCCT G ACT AT CTT CCAG GT CAG G AT CCCAG AGT CAG G GGT CT GTATTTT CCT GCT GGT GGCT CCAGTT CAGG AACAGT AAACCCT GCT CCG AAT A TTGCCT CT CACAT CT CGTCAAT CT CCGCGAGG ACT GGGGACCCT GT G ACG AACAT GGCTAGCGCGCGCCGCCCGCGCTGGCTGTGCGCTGGGGCGCTGGTGCTGGCG GGTGGCTTCTTTCTCCTCGGCTTCCTCTTCGGGTGGTTTATAAAATCCTCCAATGA AG CT ACT AACATT ACT CC AAAG CAT AAT AT G AAAGCATTTTT G G AT G AATT G AAAG CT GAG AACAT CAAG AAGTT CTTATATAATTTT ACACAG AT ACCACATTT AGCAGG A ACAGAACAAAACTTT CAGCTT GCAAAGCAAATT CAAT CCCAGTGG AAAG AATTT GG CCTGG ATT CT GTT G AGCTGGCAC ATT AT G AT GT CCT GTT GT CCT ACCCAAAT AAG A CT CAT CCCAACT ACAT CT CAAT AATT AAT G AAG AT G G AAAT G AG ATTTT CAACACAT CATT ATTT G AACCACCT CCT CCAGGATAT GAAAATGTTT CGGATATT GTACCACCT TT CAGTGCTTT CT CT CCT CAAGGAAT GCCAG AGGGCGAT CT AGT GTATGTT AACT A T GCACGAACTG AAGACTT CTTTAAATT GG AACGGG ACAT G AAAAT CAATTGCT CT G G G AAAATT GT AATT G CC AG ATATG G G A AAG TTTT C AG AG G AAAT AAG G TT AAAA AT GCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTCATTCTCTACTCCGACCCTGCTGACTAC TTTGCTCCTGGGGTGAAGTCCTATCCAGATGGTTGGAATCTTCCTGGAGGTGGTG T CCAGCGT GG AAATAT CCT AAAT CT G AATGGTGCAGG AG ACCCT CT CACACCAGG TTACCCAGCAAATGAATATGCTTATAGGCGTGGAATTGCAGAGGCTGTTGGTCTT CCAAGT ATT CCTGTT CAT CCAATT G G ATACTATG ATG CAC AG AAG CTCCT AG AAAA AATGGGTGGCTCAGCACCACCAGATAGCAGCTGGAGAGGAAGTCTCAAAGTGCC CT AC AAT GTTGGACCTGG CTTT ACTG G AAACTTTT CT AC AC AA AAAGT CAAG ATG C ACAT CCACT CT ACC AAT GAAGTGACAAG AATTT ACAAT GTG AT AGGTACT CT CAGA GGAGCAGTGGAACCAGACAGATATGTCATTCTGGGAGGTCACCGGGACTCATGG GTGTTTGGTGGTATTGACCCTCAGAGTGGAGCAGCTGTTGTTCATGAAATTGTGA GGAGCTTT GG AACACT G AAAAAGG AAGGGT GG AG ACCT AGAAGAACAATTTT GTT T GCAAGCT GG G AT G CAG AAG AATTT G GT CTT CTT G GTTCTACT G AGT G GG CAG AG G AG AATT CAAG ACT CCTT CAAG AG CGT G GCGTG GCTT AT ATTAAT GCT G ACT CAT CT AT AG AAG G AAACT ACACT CT G AG AGTT G ATT GTAC ACCG CT G ATGT AC AGCTT G GT ACACAACCTAACAAAAG AG CT G AAAAG CCCT G AT G AAG GCTTT G AAG GCAAA T CT CTTTAT G AAAGTT GG ACT AAAAAAAGT CCTT CCCCAG AGTT CAGT GGCAT GCC CAG GAT AAGCAAATTGGG AT CT GG AAAT G ATTTT G AGGT GTT CTT CCAACGACTT G G AATT GCTT CAG G CAG AG C ACG GT ATACT AAAAATT G G G AAAC AAAC AAATT CAG CGGCTATCCACTGTATCACAGTGTCTATGAAACATATGAGTTGGTGGAAAAGTTTT AT GAT CCAAT GTTTAAAT AT CACCT CACT GTGGCCCAGGTT CG AGG AGGG AT GGT GTTTGAGCTGGCCAATTCCATAGTGCTCCCTTTTGATTGTCGAGATTATGCTGTAG TTTT AAG AAAGT AT G CT G ACAAAAT CT ACAGTATTT CT AT G AAACAT CCACAG G AAA T G AAG ACATAC AGT G TAT C ATTT G ATT C ACTTTTTT CTG CAG T AAAG AATTTT AC AG AAATT G CTT CCAAGTT CAGT G AG AG ACT CCAGG ACTTTG ACAAAAGCAACCCAAT A GTATT AAG AAT GAT G AAT GAT CAACT CATGTTT CT G G AAAG AG CATTTATT G ATCC ATT AGG GTT ACCAG ACAGGCCTTTTTATAGG CAT GT CAT CTATGCT CCAAGCAGC C AC AAC AAGT ATG C AG G G G AG T C ATT C CC AG G AATTTATGATGCTCTG TTT G AT AT T G AAAG CAAAG T G G ACCCTT CCAAGG CCT G GG G AG AAGT G AAG AGACAG ATTT AT GTTGCAGCCTTCACAGTGCAGGCAGCTGCAGAGACTTTGAGTGAAGTAGCCTAAA GATCTGGGCCCTAACAAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCCTAAACTTCATGGGTTA CGTAATTGGAAGTTGGGGGACATT GCCACAAGAT CATATTGTACAAAAGAT CAAA CACT GTTTTAG AAAACTT CCTGT AAAC AG GCCT ATT G ATT GG AAAGTAT GTCAAAG G ATT G TG G G T CTTTT GGGCTTTGCTGCT CC ATTT ACAC AAT GTGGATATCCTGCCT T AAT G CCTTT GTATG CAT GTAT ACAAG CT AAA CAG GCTTT CACTTT CT CG CCAACT T ACAAGG CCTTT CT AAGT AAACAGT ACAT G AACCTTT ACCCCGTT GCT CGGCAAC GGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGG CCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATAC T GCGGAACT CCT AGCCGCTT GTTTT GCT CGCAGCCGGT CTGGAGCAAAGCT CAT A GGAACT G ACAATT CT GTCGTCCT CT CGCGG AAATATACAT CGTTT CG AT CT ACGT A T GAT CTTTTT CCCT CT GCCAAAAATT AT GGGG ACAT CAT G AAGCCCCTT GAGCAT C T GACTT CTGGCT AAT AAAGG AAATTTATTTT CATT GCAAT AGT GT GTT GGAATTTTT TGTGTCTCTCACTCGGAAGGAATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGA GAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGC G CTCG GTCGTTCG G CT GCGG CG AGCG GTAT CAG CT CACT CAAAG GCG GT AAT AC GGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCC AGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGC T CCG CCCCCCT G ACG AG CAT CACAAAAAT CG ACG CT CAAGT CAG AG GT GG CG AA ACCCGACAGG ACT AT AAAGAT ACCAGGCGTTT CCCCCT GG AAGCT CCCT CGTGC
GCT CT CCT GTT CCGACCCT GCCGCTTACCGGATACCT GT CCGCCTTT CT CCCTT C
GGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAG
GTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGC
TGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTAT
CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCG
GTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGT
ATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGC TCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGC AG CAG ATTACG CGCAG AAAAAAAG G AT CT CAAG AAG AT CCTTT G AT CTTTT CT ACG
GGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGAT
T AT CAAAAAG G AT CTT CACCT AG AT CCTTTTAAATT AAAAAT G AAGTTTT AAAT CAA T CT AAAGT AT AT AT G AGT AAACTTGGTCT GACAGTT ACCAATGCTT AAT CAGTG AG
GCACCT AT CT CAGCG AT CTGT CTATTT CGTT CAT CCAT AGTT GCCT G ACT C
SEQ ID NO: 24. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5259
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAAT ACCATATTT TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG G AG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G ATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAAC
CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAGGTTAT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G
ACG ACT G AAT CCG GTG AG AAT GG CAAAAG CTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTTC AACAGG CCAG CCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA TT CATT CGT G ATT GCG CCT G AG CGAG ACG AAAT ACG CG ATCGCTGTT AAAAGG AC AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC AATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGG
GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT
G GT CGG AAG AG GCATAAATT CCGT CAG CCAG TTT AGTCT G ACCAT CT CAT CTGTA
ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCATGTTT CAGAAACAACT CTGGCGCAT CGG
GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT G ATT GCCCG ACATT AT CGCG AGC
CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC
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SEQ ID NO: 25. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5297
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SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 460 GAATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTG GGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGC GGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAG GGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACC GTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGC AT CACAAAAAT CG ACGCT CAAGT CAGAGGT GGCGAAACCCG ACAGGACT AT AAAG ATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTG CCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTC ATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGG CT GT GT GCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGT CTT G AGT CCAACCCGGTAAG ACACG ACTTAT CG CCACT GG CAG CAG CCACT GGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAG TGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGC T GAAGCCAGTT ACCTT CGGAAAAAG AGTT GGTAGCT CTT G AT CCGGCAAACAAAC CACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAA AAAG G AT CT CAAG AAG AT CCTTT G AT CTTTT CTACGG GGTCT G ACG CT CAGT G G A ACG AAAACT 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SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 451
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CGT G GCGTG G CTT AT ATTAAT GCT G ACT CAT CT AT AG AAG G AAACT ACACT CT G AG AGTT G ATT GTACACCG CT G ATGT ACAGCTT G GTACACAACCTAACAAAAG AG CTG AAAAG CCCTG ATG AAG GCTTTG AAG GCAAA T CT CTTTAT G AAAGTT GG ACT AAAAAAAGT CCTT CCCCAG AGTT CAGT GGCAT GCC CAGGAT AAGCAAATTGGGAT CT GGAAATGATTTTGAGGT GTT CTT CCAACGACTT G G AATT GCTT CAGGCAG AGCACGGT AT ACT AAAAATTGGG AAACAAACAAATT CAG CGG CTAT CCACT GTAT CACAGTGT CT AT G AAAC AT AT G AG TTG GT GG AAAAGTTTT AT G AT CCAAT GTTTAAAT AT CACCT CACTGTGGCCCAGGTT CGAGG AGGG AT GGT G TTT G AG CTG G CC AATT CC AT AG TG CT CCCTTTT G ATT G T CG AG ATT ATG CTG TAG TTTT AAG AA AG TATG CT G AC AAAAT CT AC AG T ATTT CTAT G AAAC AT CC AC AG G A AA T G AAG ACATAC AGT G TAT C ATTT G ATT C ACTTTTTT CTG C AG T AAAG AATTTT AC AG AAATT G CTT CCAAGTT CAGT G AG AG ACT CCAGG ACTTT G ACAAAAGCAACCCAAT A GTATT AAG AAT G AT G AAT G AT C AACT CATGTTT CT G G AAAG AG CATTTATT G ATCC ATTAGGGTTACCAGACAGGCCTTTTTATAGGCATGTCATCTATGCTCCAAGCAGC CACAACAAGT AT GCAGGGG AGTCATT CCCAGG AATTTAT G ATGCT CT GTTT G ATAT T G AAAG CAAAG T G G ACCCTT CCAAGG CCT G GG G AG AAGT G AAG AGACAG ATTT AT GTTGCAGCCTTCACAGTGCAGGCAGCTGCAGAGACTTTGAGTGAAGTAGCCGGA TCCGAAGGTAGGGGTTCATTATTGACCTGTGGAGATGTCGAAGAAAACCCAGGAC CCGCAAGCAAGGCT GTGCT GCTT GCCCT GTT G ATGGCAGGCTTGGCCCT GCAGC CAG GCACT G CCCTG CTGTG CT ACT CCT G CAAAG CCCAG GT G AGCAACG AGG ACT GCCTGCAGGTGGAGAACTGCACCCAGCTGGGGGAGCAGTGCTGGACCGCGCGC ATCCGCGCAGTTGGCCTCCTGACCGTCATCAGCAAAGGCTGCAGCTTGAACTGC GTG G AT G ACT CACAG G ACT ACT ACGT G GG CAAG AAG AACAT CACGT GCT GTG AC ACCGACTTGTGCAACGCCAGCGGGGCCCATGCCCTGCAGCCGGCTGCCGCCAT CCTTGCGCTGCTCCCTGCACTCGGCCTGCTGCTCTGGGGACCCGGCCAGCTATA G AG AT CTGG G CCCT AACAAAACA AAAAG AT GG GGTTATT CCCT AAACTT C AT GG G TTACGT AATT GG AAGTT G GG G G ACATT G CCACAAG AT CATATT GTACAAAAG AT CA AACACT GTTTT AG AAAACTT CCTGTAAACAGG CCTATT G ATT GG AAAGTATGT CAA AG G ATT G TG G G T CTTTT G G G CTTT G CTG CT CC ATTT AC AC AAT GTGGATATCCTGC CTTAAT GCCTTT GTATG CAT G TAT ACAAGCT AAACAG GCTTT CACTTT CT CGCCAA CTTACAAG GCCTTT CT AAGT AAACAGTACAT G AACCTTT ACCCCGTT G CTCG G CAA CGGCCTGGT CT GT GCCAAGT GTTT GCT G ACGCAACCCCCACT GGCT GGGG CTT G GCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATA CTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCAT AGGAACT G ACAATT CT GT CGT CCT CT CGCGG AAAT AT ACAT CGTTT CGAT CT ACGT ATGATCTTTTT CCCT CT GCCAAAAATTAT GGGG ACAT CAT G AAGCCCCTT GAGCAT CT G ACTT CTGG CTAAT AAAG G AAATTT ATTTT CATT G CAAT AGT GT GTT GG AATTTT TTGTGTCTCT C ACT CG G AAG G AATT CT G CATT AAT G AAT CG GCCAACG CGCG GG G AGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTG CGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATA CG G TTAT CC AC AG AAT C AG G G G ATA AC G CAG G AAAG AACAT GTG AG C AAAAG G C CAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG
CTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA
AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGC
GCT CT CCT GTT CCGACCCT GCCGCTTACCGGATACCT GT CCGCCTTT CT CCCTT C
GGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAG GTCGTT CGCT CCAAGCT GGGCT GT GTGCACG AACCCCCCGTT CAGCCCGACCGC TGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTAT CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCG
GTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGT
ATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGC T CTT GAT CCG GCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGT G GTTTTTTTGTTT GCAAGC AG CAG ATTACG CG CAG AAAAAAAG G AT CT CAAG AAG AT CCTTT G AT CTTTT CT ACG GGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGAT T AT CAAAAAG GAT CTT CACCT AG AT CCTTTTAAATT AAAAAT G AAG TTTT AAAT CAA TCTAAAG TATATATG AGT AAACTT G G TCT G AC AG TTACC AAT G CTT AAT CAG T G AG
GCACCT AT CT CAGCG AT CTGT CTATTT CGTT CAT CCAT AGTT GCCT G ACT C
SEQ ID NO: 28. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 454
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C ATC G AG CAT C AAAT G AAACT G C AATTTATT CATAT C AG G ATTAT C AATACCATATTT TT G AAAAAGCCGTTT CT GTAAT G AAGG AGAAAACT CACCGAGGCAGTT CCAT AGG ATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAAC CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAG GTT AT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G ACG ACT G AAT CCG GTG AG AAT GG CAAAAG CTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTTC AAC AGG CCAG CCATTACGCTCGTCATC AAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA TT CATT CGT GATT GCGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACGCG AT CGCT GTT AAAAGG AC AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC AATATTTT CACCTG AAT CAG GAT ATT CTT CT AATACCT G G AAT G CTGTTTT CCCGG GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT GGT CGG AAG AGGCATAAATT CCGTCAGCCAGTTT AGT CT G ACCAT CT CAT CT GT A ACATCATTGGCAACGCT ACCTTTGCCATGTTT CAGAAACAACT CTGGCGCAT CGG GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT GATT GCCCG ACATT AT CGCG AGC CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC AAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAA GCAGACAGGTCG AC A AT ATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCAT AATATGTACATTT AT ATT GGCT CAT GT CCAATAT G ACCG CCAT GTT G ACATT GATT A TT G ACT AGTT ATTAAT AGTAAT CAATTACGG GGT CATT AGTT CATAGCCCAT AT AT G GAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG G G ACTTT CCATT G ACGT CAAT GG GT G G AGTATTT ACG GT AAACT G CCCACTT GG C AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGT AAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTT GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC CCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAA AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGT GGG AGGT CTATATAAGCAGAGCT CGTTT AGT GAACCGT CAG AT CGCCT GG AG AC GCCAT CCACGCT GTTTT G ACCT CCATAGAAG ACACCGGGACCG AT CCAGCCT CC GCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCA CCGTCCGGATCTCAGCAAGCAGGTATGTACTCTCCAGGGTGGGCCTGGCTTCCC CAG T CAAG ACT CCAG G G ATTT G AGG G ACG CTGTGG G CT CTT CT CTT ACATGTACC TTTT GCTT G CCT CAACCCT G ACT AT CTT CCAG GT CAG G AT CCCAG AGT CAG G GGT CT GTATTTT CCT GCT GGT GGCT CCAGTT CAGG AACAGT AAACCCTGCT CCG AAT A TTGCCT CT CACAT CT CGTCAAT CT CCGCGAGG ACT GGGGACCCT GT G ACG AACAT GGCTAGCAAGGCTGTGCTGCTTGCCCTGTTGATGGCAGGCTTGGCCCTGCAGCC AGGCACTGCCCTGCTGTGCTACTCCTGCAAAGCCCAGGTGAGCAACGAGGACTG CCTGCAGGTGGAGAACTGCACCCAGCTGGGGGAGCAGTGCTGGACCGCGCGCA TCCGCGCAGTTGGCCTCCTGACCGTCATCAGCAAAGGCTGCAGCTTGAACTGCG TGG AT G ACT CACAG G ACT ACT ACGTG G G CAAG AAG AACAT CACGT GCTGT G ACAC CGACTTGTGCAACGCCAGCGGGGCCCATGCCCTGCAGCCGGCTGCCGCCATCC TTGCGCT GCT CCCTGCACT CGGCCT GCT GCT CT GGGGACCCGGCCAGCTAGGAT CCCAG ACCCT G AACTTT G AT CT GCT G AAACT G GCAG G CG AT G T GG AAAGCAACC CAGGCCCAATGGCAAGCGCGCGCCGCCCGCGCTGGCTGTGCGCTGGGGCGCT GGTGCTGGCGGGTGGCTTCTTTCTCCTCGGCTTCCTCTTCGGGTGGTTTATAAAA T CCT CCAAT GAAGCT ACT AACATT ACT CCAAAGCATAAT AT GAAAGCATTTTT GG AT G AATT G AAAGCT GAG AACAT CAAG AAG TT CTTATAT AATTTTACACAG AT ACCACAT TTAG C AG G AACAG A ACAA AACTTT C AGCTTG C AAAG C AAATT CAAT CCC AGT G G AA AGAATTTGGCCTGGATTCTGTTGAGCTGGCACATTATGATGTCCTGTTGTCCTACC CAAATAAG ACT CAT CCCAACT ACAT CT CAAT AATT AAT G AAG AT GG AAAT GAG ATTT T CAAC ACAT CATT ATTT G AACCACCT CCT CCAG G AT AT G AAAATGTTT CG G AT ATT GTACCACCTTTCAGTGCTTTCTCTCCTCAAGGAATGCCAGAGGGCGATCTAGTGT AT GTT AACTAT G CACG AACT G AAG ACTT CTTT AAATT G G AACG G G ACAT G AAAAT C AATT GCT CT GG G AAAATT GT AATT G CCAG ATATG G G AAAG TTTT CAG AG G AAAT AA GGTTAAAAATGCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTCATTCTCTACTCCGACCCT GCT G ACT ACTTT GCT CCTGGGGT GAAGTCCT AT CCAGAT GGTTGG AAT CTT CCT G GAGGTGGTGTCCAGCGTGGAAATATCCTAAATCTGAATGGTGCAGGAGACCCTCT C AC ACCAG GTT ACCC AG C AAAT G AAT AT G CTTAT AG GCGTG G AATT G C AG AG GCT GTTGGTCTTCCAAGTATTCCTGTTCATCCAATTGGATACTATGATGCACAGAAGCT CCTAG AAAAAAT GG GTG GCT CAG CACCACCAG AT AG CAG CT GG AG AG G AAGT CT C AAAGT G CCCT ACAATGTT G G ACCTG G CTTT ACT G G AAACTTTT CT ACACAAAAAG T CAAG AT GCACAT CCACT CT ACCAAT G AAGT G ACAAG AATTTACAAT GTG AT AGGT ACT CT CAGAGG AGCAGTGGAACCAG ACAGAT AT GT CATT CT GG GAGGT CACCGG G ACT CAT GGGTGTTT GGTGGTATT G ACCCT CAG AGT GG AGCAGCT GTT GTT CAT G AAATTGT GAGG AGCTTT GG AACACT G AAAAAGGAAGGGT GG AG ACCT AG AAGAAC AATTTTGTTT GCAAGCT GGG ATG CAG AAG AATTT GGT CTT CTT G GTTCT ACT GAGT GGGCAGAGGAGAATTCAAGACTCCTTCAAGAGCGTGGCGTGGCTTATATTAATGC T GACT CAT CTATAGAAGG AAACT ACACT CT GAG AGTT G ATT GT ACACCGCT G ATGT ACAGCTT GGTACACAACCT AACAAAAGAGCT GAAAAGCCCT GAT G AAGGCTTT GA AGGCAAAT CT CTTT AT GAAAGTT GG ACT AAAAAAAGTCCTT CCCCAG AGTT CAGT G G CAT G CCC AG GATAAGCAAATT G G G ATCT GG AAAT G ATTTT G AG GTGTT CTT CC A ACG ACTT G G AATT G CTT CAG G C AG AG C ACG G TAT ACT AAAAATT G G G AAAC AAAC AAATTCAGCGGCTATCCACTGTATCACAGTGTCTATGAAACATATGAGTTGGTGGA AAAGTTTTAT GATCCAATGTTTAAATATCACCT CACT GTGGCCCAGGTT CGAGGAG GGATGGTGTTTGAGCTGGCCAATTCCATAGTGCTCCCTTTTGATTGTCGAGATTAT G CT GTAGTTTT AAG AAAGT AT GCT G ACAAAAT CTACAGT ATTT CT AT G AAACAT CC A CAG GAAAT GAAG ACAT ACAGTGT AT CATTT G ATT CACTTTTTT CTGCAGT AAAGAAT TTT ACAG AAATTGCTT CCAAG TT CAGT G AG AG ACT CCAG G ACTTT G ACAAAAG CAA CCCAAT AGTATT AAG AAT GAT G AAT GAT CAACT CAT GTTT CT GG AAAG AG CATTT A TTG AT CCATT AGGGTT ACCAG ACAGGCCTTTTT AT AGGCATGTCAT CT AT GCT CCA AGCAGCCACAACAAGTATGCAGGGGAGTCATTCCCAGGAATTTATGATGCTCTGT TTGATATTGAAAGCAAAGTGGACCCTTCCAAGGCCTGGGGAGAAGTGAAGAGACA G ATTT AT GTT GCAGCCTT CACAGT GCAGGCAGCT GCAG AG ACTTTG AGT G AAGT A G CCT AAAG ATCTGGGCCCT AAC A AA AC AAAAAG AT G G G G TT ATT CCCTAAACTT C A TGGGTTACGTAATT GGAAGTTGGGGGACATTGCCACAAGATCATATTGT AC AA AA GAT CAAACACTGTTTT AG AAAACTT CCT GT AAACAG GCCTATT G ATT GG AAAGTAT G T C AA AG GATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCTCCATTT AC ACAAT G TG G AT AT
CCTGCCTTAAT GCCTTT GTAT GCATGTAT ACAAGCT AAACAGGCTTT CACTTT CT C
GCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTACATGAACCTTTACCCCGTTGCTC
GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGG
G CTT GG CCAT AG GCCAT CAG CGCAT G CGTG G AACCTTT GTG GCTCCTCT G CCG A
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CT ACGT AT GAT CTTTTT CCCT CTGCCAAAAATT AT GGGGACAT CAT GAAGCCCCTT
G AGCAT CT G ACTT CTGGCT AAT AAAGG AAATTT ATTTT CATT GCAATAGT GTGTTG
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GCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGAC
TCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCG
GTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAA
AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCC AT AGGCT CCGCCCCCCT GACG AGCAT CACAAAAAT CG ACGCT CAAGT CAGAGGT
GGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCC
TCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCT
CCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG
GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCC
GACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACG ACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATG TAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAG AACAG TATTT G GTATCTGCG CTCTG CT G AAGCCAGTTACCTT CGG AAAAAG AGTT
G GT AG CT CTT GAT CCGG CAAACAAACCACCG CT G GTAG CG GTG GTTTTTTT GTTT
GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT CT CAAGAAGAT CCTTT GATCTT
TT CT ACG GG GT CT G ACG CT CAGT GG AACG AAAACT CACGTT AAG G G ATTTT G GTC AT G AGATT AT CAAAAAGG AT CTT CACCT AG AT CCTTTT AAATT AAAAAT GAAGTTTT AAAT CAAT CTAAAGTATAT AT G AGT AAACTT G GTCT G ACAG TT ACCAAT G CTT AAT C AGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACT C SEQ ID NO: 29. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 5300
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C
ATCG AG CAT C AAAT G AAACT G C AATTT ATT CATAT CAG G ATT AT CAAT ACC AT ATTT
TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG GAG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G
ATGGCAAGAT CCT GGTAT CGGTCT GCG ATT CCG ACT CGT CCAACAT CAAT ACAAC CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAGGTT AT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G ACG ACT G AAT CCGGTG AG AAT GGCAAAAGCTT ATGCATTT CTTT CCAG ACTTGTT C AACAGGCCAGCCATTACGCT CGTCAT C AAAAT CACT CGCAT CAACCAAACCGTT A TT CATT CGT G ATTGCG CCT G AG CGAG ACG AAAT ACG CG ATCGCTGTT AAAAGG AC AATT ACAAACAGGAAT CAAAT GCAACCGGCGCAGG AACACT GCCAGCGCAT CAAC AAT ATTTT C ACCT G AAT CAGG AT ATT CTT CT AAT ACCT G G AAT G CT GTTTT CCCGG GGAT CGCAGT GGT GAGT AACCATGCAT CAT CAGG AGTACGG AT AAAAT GCTT G AT G GT CGG AAG AG GCATAAATT CCGT CAG CCAGTTT AGT CT G ACC AT CT CAT CTGTA ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCAT GTTT CAG AAACAACT CTGGCGCAT CGG GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT G ATT GCCCG ACATT AT CGCG AG C CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC AAG ACGTTT CCCGTT G AAT ATG GCT CAT AACACCCCTTGTATT ACT GTTT ATGTAA G CAG AC AG G T CG ACAAT ATTG G CT ATT G G CC ATT G CAT ACG TTG TATCTATAT CAT AATAT GTACATTT AT ATT GGCT CAT GT CCAATAT G ACCG CCAT GTT G ACATT G ATT A TTG ACT AGTT ATT AAT AGTAAT CAATTACGGGGT CATT AGTT CATAGCCCAT AT AT G G AGTT CCGCGTT ACAT AACTT ACGGT AAAT GGCCCGCCT GGCT GACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG G G ACTTT CCATT G ACGT CAAT GG GT G G AGTATTT ACGGT AAACT G CCC ACTT GG C AGTACAT CAAGT GT AT CAT AT GCCAAGT CCGCCCCCT ATT G ACGT CAAT G ACGGT AAAT GGCCCGCCTGGCATT AT GCCCAGT ACAT G ACCTT ACGGG ACTTT CCT ACTT GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC CCCATT G ACGT CAATGGG AGTTT GTTTT GGCACCAAAAT CAACGGG ACTTT CCAA AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGT GGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAC GCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCC GCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCA CCGTCCGGATCTCAGCAAGCAGGTATGTACTCTCCAGGGTGGGCCTGGCTTCCC CAG T CAAG ACT CCAG G G ATTT G AGG G ACG CTGTGG G CT CTT CT CTT ACATGTACC TTTT GCTT GCCT CAACCCT G ACT AT CTT CCAG GT CAG G AT CCCAG AGT CAG G GGT CT GTATTTT CCT GCT GGT GGCT CCAGTT CAGG AACAGT AAACCCT GCT CCG AAT A TTGCCT CT CACAT CT CGTCAAT CT CCGCGAGG ACT GGGGACCCT GT G ACG AACAT GGCTAGCATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGT GCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCA GTG GGT CCT CACAGCT GCCCACT GCAT CAGGAACAAAAGCGTG AT CTT GCT GGG T CG GCACAGCTT GTTT CAT CCT G AAG ACACAG GCCAG GT ATTT CAG GT CAG CCAC AGCTT CCCACACCCGCT CT ACG AT AT G AGCCT CCT G AAG AAT CGATT CCT CAGGC CAG GTG ATG ACTCCAGCCACG ACCTCATGCTGCTCCGCCTGTCAGAGCCTGCCG AGCTCACGGATGCTGTGAAGGTCATGGACCTGCCCACCCAGGAGCCAGCACTGG GGACCACCTGCTACGCCTCAGGCTGGGGCAGCATTGAACCAGAGGAGTTCTTGA CCCCAAAGAAACTTCAGTGTGTGGACCTCCATGTTATTTCCAATGACGTGTGTGC GCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGAC AGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGG TGTG CTT CAAG GTAT C ACGT CAT G GG G CAGT G AACCAT G TGCCCTG CCCG AAAG GCCTTCCCTGTACACCAAGGTGGTGCATTACCGGAAGTGGATCAAGGACACCATC GTG GCCAACCCCGGAT CCCAG ACCCT G AACTTT G AT CT GCT GAAACT GGCAGGC GATGTGGAAAGCAACCCAGGCCCAATGGCAAGCGCGCGCCGCCCGCGCTGGCT GTGCGCTGGGGCGCTGGTGCTGGCGGGTGGCTTCTTTCTCCTCGGCTTCCTCTT CGG GTG GTTTATAAAAT CCT CCAAT G AAGCT ACT AACATT ACT CCAAAGCATAAT A T G AAAG C ATTTTT G G ATG AATT G AAAG CT G AG AAC AT CAAG AAG TT CTT AT AT AATT TTACACAG ATACCACATTT AG CAG G AACAG AAC AAAACTTT CAGCTT G CAAAG CAA ATT CAAT CCCAGT G G AAAG AATTT G GCCT GG ATT CTGTT G AG CTG G CACATTAT G A TGTCCTGTTGT CCT ACCC AAAT AAG ACT CAT CCCAACT ACAT CT C AATAATT AAT G A AG AT G G AAAT G AG ATTTT CAAC ACAT CATT ATTT G AACCACCT CCT CCAG G AT AT G AAAAT GTTT CG G ATATT GTACCACCTTT CAGT GCTTT CT CT CCT CAAG G AAT GCCA G AGGGCG AT CTAGTGTAT GTT AACT ATGCACGAACT GAAG ACTT CTTT AAATT GG A ACGGGACATGAAAATCAATTGCTCTGGGAAAATTGTAATTGCCAGATATGGGAAA GTTTTCAGAGGAAATAAGGTTAAAAATGCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTCA TT CT CT ACT CCG ACCCT GCT G ACT ACTTTGCT CCT GGGGTG AAGT CCT AT CCAG A TGGTTGGAATCTTCCTGGAGGTGGTGTCCAGCGTGGAAATATCCTAAATCTGAAT 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SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 449
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAATACCATATTT TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG G AG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G AT GGCAAG AT CCTGGT AT CGGT CTGCG ATT CCG ACT CGT CCAACAT CAAT ACAAC CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAGGTT AT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G ACG ACT GAAT CCGGTGAGAAT GGCAAAAGCTTAT GCATTTCTTT CCAGACTT GTT C AACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTA TT CATT CGT GATT GCGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACGCG AT CGCT GTT AAAAGGAC AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC AATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGG GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT G GT CGG AAG AG GCATAAATT CCGT CAG CCAGTTT AGTCT G ACCAT CT CAT CTGTA ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTTGCCATGTTT CAGAAACAACT CT G GCGCAT CGG GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT GATT GCCCG ACATT AT CGCG AGC CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC AAGACGTTT 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SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 603
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAATACCATATTT TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG G AG AAAACT CACCG AGG CAGTT CCAT AG G ATGGCAAGAT CCT GGTAT CGGTCT GCG ATT CCG ACT CGT CCAACAT CAAT ACAAC CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAGGTT AT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G ACG ACT G AAT CCG GTG AG AAT GG CAAAAG CTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTTC AACAGG CCAG CCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA TT C ATT CGT G ATT G CGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACG CG AT CG CTG TTAAAAGG AC AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC AATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGG GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT GGT CGG AAG AGGCATAAATT CCGTCAGCCAGTTTAGT CT GACCAT CT CAT CT GT A ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCATGTTT CAGAAACAACT CTGGCGCAT CGG GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT G ATT GCCCG ACATT AT CGCG AGC CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC 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T CAT CCATAGTT G CCT G ACT C SEQ ID NO: 32. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 455
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTT ATT CAT AT CAG G ATT AT CAATACCATATTT
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GGCTAGCAAGGCTGTGCTGCTTGCCCTGTTGATGGCAGGCTTGGCCCTGCAGCC AGGCACTGCCCTGCTGTGCTACTCCTGCAAAGCCCAGGTGAGCAACGAGGACTG CCTGCAGGTGGAGAACTGCACCCAGCTGGGGGAGCAGTGCTGGACCGCGCGCA TCCGCGCAGTTGGCCTCCTGACCGTCATCAGCAAAGGCTGCAGCTTGAACTGCG TGG AT GACT CACAGGACT ACT ACGTGGG CAAG AAG AACAT CACGT GCT GT GACAC CGACTTGTGCAACGCCAGCGGGGCCCATGCCCTGCAGCCGGCTGCCGCCATCC TTGCGCTGCTCCCTGCACTCGGCCTGCTGCTCTGGGGACCCGGCCAGCTATAGA GATCTGACCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGC GTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCC GGAAACCTGGCCCT GT CTT CTT G ACG AGCATT CCT AGGGGT CTTT CCCCT CT CGC CAAAGG AATGCAAGGT CT GTT GAAT GT CGT GAAGG AAGCAGTT CCT CTGG AAGCT T CTT G AAG ACAAACAACGT CTGT AG CG ACCCTTT G CAG GCAG CG G AACCCCCCA CCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCA AAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTC AAAT GGCTCT CCT CAAGCGTATT CAACAAGGGGCT GAAGGATGCCCAGAAGGTAC CCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTA GTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT 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AAAACTT CCT GT AAACAGGCCT ATT GATTGG AAAGT AT GT CAAAGGATTGT GGGT CTTTT GG GCTTTGCTGCT CC ATTT AC AC AAT GTGGATATCCTGCCTTAAT G CCTTT G TATG C A TGTAT AC AAG CT AAAC AG G CTTT C ACTTT CTC G CC AACTTACA AG G CCTTT CT AAG TAAACAGTACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAA GTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGC ATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCG CTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCATAGGAACTGACAATTCTGT CGTCCTCT CG CG G AAAT AT ACAT CGTTT CG AT CT ACGTAT G AT CTTTTT CCCTCTG CCAAAAATT AT GG GG ACAT CAT G AAG CCCCTT G AG CAT CT G ACTT CTG GCT AAT AA AGGAAATTTATTTT CATT GCAATAGTGT GTT GGAATTTTTTGTGT CT CT CACT CGGA AGGAATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAT TGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCT GCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATC AGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAA CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAA AG AT ACCAGGCGTTT CCCCCTGGAAGCT CCCT CGT GCGCT CT CCT GTT CCG ACC CTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTT CTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCT GGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAA CT AT CGT CTT G AGT CCAACCCGGTAAG ACACG ACTTAT CG CCACT G GCAG CAG CC ACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGA AGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCT GCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAA ACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAA AAAAAGG AT CT CAAG AAG AT CCTTT G AT CTTTT CTACGGGGTCT GACGCT CAGT G G AACG AAAACT CACGTTAAG G G ATTTT G GT CAT G AG ATT AT CAAAAAG G AT CTT CA CCTAG AT CCTTTT AAATT AAAAAT G AAGTTTT AAAT CAAT CT AAAGT ATATAT G AGT A AACTT GGTCT G ACAGTT ACCAAT GCTT AAT CAGT GAGGCACCT AT CT CAGCG AT CT GTCT ATTT CGTT CAT CCATAG TTGCCT G ACT C SEQ ID NO: 33. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 456
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAATACCATATTT TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG GAG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G ATGGCAAGAT CCT GGTAT CGGTCT GCG ATT CCG ACT CGT CCAACAT CAAT ACAAC CTATTAATTT CCCCT CGT CAAAAATAAGGTTAT CAAGT GAGAAATCACCATGAGT G ACG ACT G AAT CCG GTG AG AAT GG CAAAAG CTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTTC AACAGG CCAG CCATTACGCT CGTCAT CAAAAT CACT CG CAT CAACCAAACCGTT A TT CATT CGT GATT GCGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACGCG AT CGCT GTT AAAAGG AC AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC AATATTTT CACCT G AAT CAGG AT ATT CTT CT AAT ACCT GG AAT G CTGTTTT CCCG G GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT G GT CGG AAG AG GCATAAATT CCGT CAG CCAG TTT AGTCT G ACCAT CT CAT CTGTA ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCAT GTTT CAGAAACAACT CTGGCGCAT CGG GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT G ATT GCCCG ACATT AT CGCGAGC CCATTT AT ACCCAT AT AAAT C AG C AT CC ATGTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC AAGACGTTT CCCGTTG AAT ATGGCT CAT AACACCCCTTGTATT ACT GTTTATGTAA G CAG AC AG G T CG AC AAT ATTG G CT ATT G G CC ATT G C AT ACG TTG TATCTATAT C AT AATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTA TTG ACT AGTT ATTAAT AGTAAT CAATT ACGG GGT CATTAGTT CAT AGCCCAT AT AT G GAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG G G ACTTTCCATTG ACGTCAATGG GTG G AGTATTTACG GTAAACTG CCCACTTGG C AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGT AAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTT GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC CCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAA AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGT GGG AGGT CTATATAAGCAGAGCT CGTTT AGT GAACCGT CAG AT CGCCT GG AG AC GCCAT CCACGCT GTTTT G ACCT CCATAGAAG ACACCGGGACCG AT CCAGCCT CC GCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCA CCGTCCGGATCTCAGCAAGCAGGTATGTACTCTCCAGGGTGGGCCTGGCTTCCC CAG TCAAG ACTCCAG G G ATTTG AG G G ACG CTGTGG GCTCTTCTCTTACATGTACC TTTT GCTT GCCT CAACCCT G ACT AT CTT CC AG GT CAG G AT CCCAG AGT CAG G GGT CT GTATTTT CCT GCT GGT GGCT CCAGTT CAGG AACAGT AAACCCTGCT CCG AAT A TTGCCT CT CACAT CT CGTCAAT CT CCGCGAGG ACT GGGGACCCT GT G ACG AACAT GGCTAGCATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGT GCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCA GTG GGT CCT CACAGCT GCCCACTGCAT CAGGAACAAAAGCGTG AT CTT GCTGGG T CG GCACAGCTT GTTT CAT CCT G AAG ACACAG GCC AG GT ATTT C AG GT CAG CCAC AGCTT CCCACACCCGCT CT ACG AT AT G AGCCT CCT G AAG AAT CGATTCCT CAGGC CAG GT G AT G ACT CCAGCCACG ACCT CAT GCTGCTCCG CCTGT CAG AG CCT G CCG AGCTCACGGATGCTGTGAAGGTCATGGACCTGCCCACCCAGGAGCCAGCACTGG G G ACCACCTGCTACG CCTC AG GCTGG G GCAG CATTG AACCAG AG G AGTTCTTG A CCCCAAAG AAACTT CAGTGTGTG G ACCT CCAT GTT ATTT CCAAT GACGTGTGTGC GCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGAC AGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGG TGTG CTT CAAG GTAT CACGT CAT G GG G CAGT G AACCAT G TGCCCT GCCCG AAAG GCCTT CCCT GT ACACCAAGGT GGTGCATT ACCGG AAGT GG AT CAAGG ACACCAT C GTGGCCAACCCCGGATCCCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAACTGGCAGGC GATGTGGAAAGCAACCCAGGCCCAATGGCAAGCGCGCGCCGCCCGCGCTGGCT GTGCGCTGGGGCGCTGGTGCTGGCGGGTGGCTTCTTTCTCCTCGGCTTCCTCTT CGGGTGGTTT AT AAAAT CCT CCAATG AAGCT ACT AACATTACT CCAAAGCAT AAT A T G AAAG C ATTTTT G G ATG AATT G AAAG CT G AG AAC AT CAAG AAGTT CTT AT ATAATT TTACACAG ATACCACATTT AG CAG G AACAG AACAAAACTTT CAGCTT G CAAAG CAA ATT CAAT CCCAGTGGAAAGAATTTGGCCTGG ATT CTGTT G AGCTGGCACATT AT GA TGTCCTGTTGT CCT ACCCAAAT AAG ACT CAT CCCAACT ACAT CT CAATAATT AAT G A AG AT GG AAAT GAGATTTT CAACACAT CATTATTT GAACCACCT CCT CCAGG AT AT G AAAAT GTTT CG G ATATT GTACC ACCTTT CAGT GCTTT CT CT CCT CAAG G AAT GCC A G AGGGCG AT CT AGTGTAT GTT AACT ATGCACGAACT GAAG ACTT CTTT AAATT GG A ACG GG ACAT G AAAAT CAATT G CT CT GG G AAAATT GT AATT GCCAG AT AT GG G AAA GTTTTCAGAGGAAATAAGGTTAAAAATGCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTCA TT CT CT ACT CCG ACCCT GCT G ACT ACTTTGCT CCT GGGGTG AAGT CCT AT CCAG A TGGTT GG AAT CTT CCT GG AGGTGGT GT CCAGCGT GG AAATAT CCT AAAT CT GAAT GGTGCAGGAGACCCTCTCACACCAGGTTACCCAGCAAATGAATATGCTTATAGGC GTGGAATTGCAGAGGCTGTTGGTCTTCCAAGTATTCCTGTTCATCCAATTGGATAC TATGATGCACAGAAGCTCCTAGAAAAAATGGGTGGCTCAGCACCACCAGATAGCA G CT GG AG AGG AAGT CT CAAAGTG CCCTACAAT GTTGG ACCT GG CTTT ACT G G AAA CTTTT CT ACACAAAAAGTCAAG AT GCACAT CCACTCT ACC AAT G AAGT G ACAAG AA TTT ACAAT GTG ATAG GT ACT CT CAG AGG AG CAGTG G AACCAG ACAG AT ATGT CAT TCTGGGAGGTCACCGGGACTCATGGGTGTTTGGTGGTATTGACCCTCAGAGTGG AG CAG CTGTTG TT CAT G AAATT G T G AGG AGCTTT G G AAC ACT G AAAAAG G AAGG G TGGAGACCTAGAAGAACAATTTTGTTTGCAAGCTGGGATGCAGAAGAATTTGGTC TT CTT G GTTCT ACT G AGT GG G CAG AGG AG AATT CAAG ACT CCTT CAAG AGCGTG G CGT GGCTT AT ATTAATGCT G ACT CAT CT AT AG AAGGAAACT ACACT CT G AG AGTT G ATT G T ACACCG CT G ATGT ACAG CTT G GTACACAACCT AACAAAAG AG CT G AAAAG CCCT G AT GAAG GCTTT G AAGGCAAAT CT CTTTAT GAAAGTT GG ACT AAAAAAAGT C CTTCCCCAGAGTTCAGTGGCATGCCCAGGATAAGCAAATTGGGATCTGGAAATGA TTTT G AGGTGTT CTT CCAACG ACTT G G AATT G CTT CAG GCAG AG CACG GTAT ACT A AAAATTGGGAAACAAAC AAATT CAGCGGCT AT CCACT GT AT CACAGT GT CT AT GAA ACATATGAGTTGGTGGAAAAGTTTTATGATCCAATG TTT AAATATCACCTCACTGT GGCCCAGGTTCGAGGAGGGATGGTGTTTGAGCTGGCCAATTCCATAGTGCTCCC TTTT G ATT GT CG AG ATTATGCTGT AGTTTTAAG AAAGTAT G CT G ACAAAAT CT ACAG T ATTT CT AT G AAACAT CCACAGG AAAT G AAG ACATACAGT GTAT CATTT G ATT CACT TTTTT CT G C AGT AAAG AATTTTACAG AAATT GCTT CCAAG TT CAGTG AG AG ACT CC AGGACTTT GACAAAAGCAACCCAATAGTATTAAGAAT GATGAAT GAT CAACT CAT G TTT CT GG AAAGAGCATTT ATT G AT CCATT AGG GTT ACCAG ACAGGCCTTTTT AT AG G CAT G TC ATCT ATG CT CCAAG C AG CC AC AAC AAG TATG C AG G G G AG T C ATT CCC A G G AATTTATG ATG CT CT GTTT GAT ATTG AAAG CAAAGT GG ACCCTT CC AAG GCCT G GGG AG AAGTG AAGAG ACAGATTTAT GTT GCAGCCTT CACAGT G CAGGCAGCT GC AG AG ACTTT G AGTG AAGT AGCCT AAAG AT CT GACCCCCT AACGTTACTGGCCG 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TCCCTGCACTCGGCCTGCTGCTCTGGGGACCCGGCCAGCTATAGGGATCTGGGC CCTAACAAAACAAAAAG AT G G GGTT ATT CCCT AAACTT CAT GG GTT ACGTAATT GG AAGTTGGGGG ACATT GCCACAAG AT CAT ATT GT ACAAAAG AT CAAACACT GTTTT A GAAAACTTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGGATTGTGGGT CTTTT GG GCTTT G CTG CT CCATTTACACAAT GTGG ATATCCT GCCTTAAT G CCTTT GTATG CAT GTATAC AAG CT A AAC AG G CTTT C ACTTT CT CG CC AACTT ACAAGGCCT TTCT AAGTAAACAGT ACAT G AACCTTT ACCCCGTTGCT CGGCAACGGCCTGGT CT GTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCA T CAGCGCAT GCGT GG AACCTTTGTGGCT CCT CT GCCGAT CCAT ACT G CGG AACT C CTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCATAGGAACTGACA ATT CTGTCGTCCTCT CG CGG AAAT AT ACAT CGTTT CG AT CT ACGTAT G AT CTTTTT C CCTCTG CCAAAAATT AT G GG G ACAT CAT G AAGCCCCTT G AG CAT CT G ACTT CTG G CT AAT AAAGG AAATTT ATTTT CATTGCAAT AGT GT GTT GG AATTTTTT GT GT CT CT C ACTCGGAAGGAATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT TGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGT TCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCAC AG AAT C AG G G G ATAACG C AG G AAAG AAC AT G T G AG C AAAAG G CC AG C AAAAG G C CAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCC T GACG AGCAT CACAAAAAT CG ACGCT CAAGT CAG AGGT GGCGAAACCCGACAGG ACT AT AAAG AT ACCAGGCGTTT CCCCCT GG AAGCT CCCT CGTGCGCT CT CCT GTT CCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG GCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCT CCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTAT CCGGTAACT AT CGTCTT GAGT CCAACCCGGTAAGACACGACTT AT CGCCACTGGC AG CAG CCACT G GT AACAG G ATTAGCAG AG CG AG GT ATGT AG GCG GT G CT ACAGA GTT CTT G AAGT G GTGG CCT AACT ACG G CTACACT AG AAG AACAGT ATTT G GTATCT GCGCT CTGCT GAAGCCAGTTACCTT CGGAAAAAGAGTT GGTAGCT CTT G AT CCGG CAAACAAACCACCG CT G GT AG CGGTG GTTTTTTT GTTT G CAAGCAG CAG ATT ACG CGCAG AAAAAAAGG AT CT CAAG AAG AT CCTTT G AT CTTTT CTACG GG GTCTG ACG CT CAGT GG AACG AAAACT CACGTT AAGGGATTTT GGT CAT G AGATTAT CAAAAAG G AT CTT CACCT AG AT CCTTTT AAATT AAAAAT GAAGTTTT AAAT CAAT CT AAAGTAT A TATG AG TAAACTT G GTCT G AC AG TTACCAAT G CTT AAT CAG T G AG G C ACCTATCTC AG CG AT CTGTCT ATTT CGTT CAT CCAT AGTT GCCT G ACT C SEQ ID NO: 34. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 457
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C
AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAATACCATATTT
TT G AAAAAG CCGTTT CTGT AAT G AAG GAG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G
ATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAAC
CT ATTAATTT CCCCT CGT CAAAAAT AAGGTT AT CAAGT GAG AAAT CACCAT GAGT G
ACG ACT GAAT CCGGTG AG AAT GGCAAAAGCTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTT C
AACAGG CCAG CCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA
TT CATT CGT GATT GCGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACGCG AT CGCT GTT AAAAGG AC
AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC
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GCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGGATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCTC CATTTACACAAT GTGG ATAT CCTGCCTT AAT G CCTTT GTAT GCAT GTAT ACAAGCT AAAC AG G CTTT C ACTTT CT CG CC AACTT AC AAG G CCTTT CT AAG T AAAC AG TACAT GAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGAC GCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACC TTT GTGGCT CCT CT GCCG AT CCAT ACT GCGGAACT CCT AGCCGCTT GTTTT GCTC GCAGCCGGT CTGGAGCAAAGCT CAT AGG AACT G ACAATT CT GT CGT CCTCT CGC GG AAATATACAT CGTTT CG AT CTACGT AT G AT CTTTTT CCCT CTGCC AAAAATT AT G G GG ACAT CAT G AAG CCCCTT G AG CAT CT G ACTT CTG GCT AAT AAAG G AAATTT ATT TT CATT GCAAT AGTGTGTT GG AATTTTTTGT GT CT CT CACT CGG AAGGAATT CTGC ATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTT CCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGG T AT CAGCT CACTCAAAGGCGGTAATACGGTT AT CCACAGAAT CAGGGG AT AACGC AG G AAAG AAC ATGT G AG CAAAAG G CCAG CAAAAG GCCAG G AACCGTAAAAAG G C CGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAT
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T ACCTT CGGAAAAAGAGTT GGTAGCT CTT GAT CCGGCAAACAAACCACCGCT GGT
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ACAGTTACCAAT GCTT AAT CAGT GAGG CACCTAT CT CAG CG AT CTGTCT ATTT CGT
T CAT CCATAGTT G CCT G ACT C SEQ ID NO: 35. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 458
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C AT CG AGCAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CATAT CAGG ATTAT CAATACCATATTT
TTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGG
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CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAGGTT AT CAAGT G AG AAAT CACCAT G AGT G
ACG ACT G AAT CCG GTG AG AAT GG CAAAAG CTT AT GCATTT CTTT CCAG ACTT GTTC AACAGG CCAG CCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA
TT CATT CGT G ATT GCG CCT G AG CGAG ACG AAAT ACG CG AT CGCTGTT AAAAGG AC
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ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCATGTTT CAGAAACAACT CTGGCGCAT CGG
GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT G ATT GCCCG ACATT AT CGCG AGC
CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CG GCCT CG AGC
AAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAA G CAG ACAG G T CG ACAAT ATT G G CTATT G G CCATT G CAT ACGTT G TATCTATAT CAT AATATGTACATTT AT ATT GGCT CAT GT CCAATAT G ACCG CCAT GTTG ACATTG ATT A TT G ACT AGTT ATTAAT AGTAAT CAATTACGG GGT CATT AGTT CATAGCCCAT AT AT G GAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG G G ACTTT CCATT G ACGT CAAT GG GT G G AGTATTT ACG GT AAACT G CCCACTT GG C AGT ACAT CAAGT GT AT CAT AT GCCAAGT CCGCCCCCT ATTG ACGT CAAT G ACGGT AAATGGCCCGCCTGGCATT AT GCCCAGT ACAT G ACCTT ACGGG ACTTT CCT ACTT GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC CCCATT G ACGT CAATGGG AGTTT GTTTT GGCACCAAAAT CAACGGG ACTTT CCAA AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGT GGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAC GCCAT CCACGCT GTTTT G ACCT CCATAGAAG ACACCGGGACCG AT CCAGCCT CC GCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCA CCGTCCGGATCTCAGCAAGCAGGTATGTACTCTCCAGGGTGGGCCTGGCTTCCC CAG T CAAG ACT CCAG G G ATTT G AGG G ACG CTGTGG G CT CTT CT CTT ACATGTACC TTTT GCTT G CCT CAACCCT G ACT AT CTT CCAG GT CAG G AT CCCAG AGT CAG G GGT CT GTATTTT CCT GCT GGT GGCT CCAGTT CAGG AACAGT AAACCCT GCT CCG AAT A TTG CCT CT CACAT CT CGTCAAT CT CCG CG AGG ACT GG GG ACCCT GT G ACG AACAT GGCTAGCATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGT GCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCA GTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGG T CGGCACAGCTT GTTT CAT CCT G AAG ACACAGGCCAGGT ATTT CAGGT CAGCCAC AGCTT CCCACACCCGCT CT ACG AT AT G AGCCT CCT G AAG AAT CGATT CCT CAGGC CAG GT G AT G ACT CCAGCCACG ACCT CAT GCTGCT CCGCCTGTCAGAGCCT GCCG AGCTCACGGATGCTGTGAAGGTCATGGACCTGCCCACCCAGGAGCCAGCACTGG G G ACCACCT GCTACG CCT CAG GCT GG G GCAG CATT G AACCAG AG G AGTT CTTG A CCCCAAAGAAACTTCAGTGTGTGGACCTCCATGTTATTTCCAATGACGTGTGTGC GCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGAC AGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGG TGTGCTTCAAGGTATCACGTCATGGGGCAGTGAACCATGTGCCCTGCCCGAAAG GCCTTCCCTGTACACCAAGGTGGTGCATTACCGGAAGTGGATCAAGGACACCATC GTG GCCAACCCCGG AT CCG AAGGT AGGGGTT CATT ATT GACCT GT GG AG AT GT C G AAG AAAACCCAGG ACCCGCT AGCAAGGCTGT GCTGCTT GCCCTGTT G ATGGCA GGCTTGGCCCTGCAGCCAGGCACTGCCCTGCTGTGCTACTCCTGCAAAGCCCAG GTGAGCAACGAGGACTGCCTGCAGGTGGAGAACTGCACCCAGCTGGGGGAGCA GTGCTGGACCGCGCGCATCCGCGCAGTTGGCCTCCTGACCGTCATCAGCAAAGG CTGCAGCTT G AACTGCGT GG AT G ACT CACAGGACT ACT ACGTGGGCAAG AAG AA CATCACGTGCTGTGACACCGACTTGTGCAACGCCAGCGGGGCCCATGCCCTGCA GCCGGCTGCCGCCATCCTTGCGCTGCTCCCTGCACTCGGCCTGCTGCTCTGGGG ACCCGG CC AG CT AG G AT CCCAG ACCCT G AACTTT G AT CT G CT G AAACT GGC AG G CGATGTGGAAAGCAACCCAGGCCCAATGGCAAGCGCGCGCCGCCCGCGCTGGC TGTGCGCTGGGGCGCTGGTGCTGGCGGGTGGCTTCTTTCTCCTCGGCTTCCTCT T CGGGT GGTTT ATAAAAT CCT CCAAT GAAGCTACT AACATT ACT CCAAAGCAT AAT AT G AAAG CATTTTT GG AT G AATT G AAAG CT G AG AACAT C AAG AAGTT CTT AT ATAAT TTT ACACAG AT ACCAC ATTTAGCAG G AACAG AACAAAACTTT CAGCTT G CAAAGC A AATTCAATCCCAGTGGAAAGAATTTGGCCTGGATTCTGTTGAGCTGGCACATTATG ATGTCCTGTTGTCCT ACCCAAATAAG ACT CAT CCC AACT AC AT CT CAAT AATT AAT G AAG AT G G AAAT G AG ATTTT CAACACAT CATT ATTT G AACC ACCT CCT CCAGG AT AT G AAAATGTTT CGG AT ATT GT ACCACCTTT C AGTG CTTT CT CT CCT CAAGG AAT G CC AG AGGG CG AT CT AGTGTAT GTT AACT AT G CACG AACT G AAG ACTT CTTT AAATT G G AACGGGACAT GAAAAT CAATT GCT CT GGGAAAATT GTAATT GCCAGATATGGGAA AGTTTTCAGAGGAAATAAGGTTAAAAATGCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTC ATT CT CT ACT CCG ACCCT GCTG ACT ACTTTGCT CCT GGGGTG AAGT CCT AT CCAG ATGGTTGGAATCTTCCTGGAGGTGGTGTCCAGCGTGGAAATATCCTAAATCTGAA TGG TG C AG GAG ACCCT CT C AC ACCAG GTT ACCCAG C AAAT G AAT AT G CTTAT AG G CGTGGAATTGCAGAGGCTGTTGGTCTTCCAAGTATTCCTGTTCATCCAATTGGATA CTAT GATGCACAGAAGCT CCTAGAAAAAATGGGTGGCT CAGCACCACCAGATAGC AGCT GG AG AGGAAGT CT CAAAGT GCCCTACAAT GTT GG ACCT GGCTTT ACT GG AA ACTTTT CTACACAAAAAGT C AAG AT G CACAT CCACT CT ACC AAT G AAGT G ACAAG A ATTTACAAT GTG AT AGGT ACT CT CAG AGG AGCAGT G G AACCAG ACAG AT ATGT CA TT CT GGGAGGTCACCGGG ACT CAT GGGT GTTT GGT GGTATT GACCCT CAG AGT G G AG CAG CTG TTG TT CAT G AAATT GT GAG G AG CTTT G G AAC ACT G AAAAAG G AAG G GTGGAGACCTAGAAGAACAATTTTGTTTGCAAGCTGGGATGCAGAAGAATTTGGT CTT CTT G GTTCTACT G AGTGG G CAG AG GAG AATT CAAG ACT CCTT CAAG AG CGT G GCGTGGCTTAT ATT AAT G CTG ACT CAT CTATAG AAG G AAACT AC ACT CTGAGAGTT G ATTGTACACCG CT G ATGT ACAG CTT GGT ACACAACCT AACAAAAG AGCT G AAAA GCCCTGATGAAGGCTTTGAAGGCAAATCTCTTTATGAAAGTTGGACTAAAAAAAGT CCTT CCCCAG AGTT CAGT GGCATGCCCAGG AT AAGCAAATT GGG AT CT GG AAAT G ATTTTGAGGTGTTCTTCCAACGACTTGGAATTGCTTCAGGCAGAGCACGGTATACT AAAAATT G G G AAAC AAAC AAATT C AG CG G CTAT CC ACT G TAT C AC AGT G TCT ATG A AACAT AT GAGTT GGTGGAAAAGTTTT AT GAT CCAAT GTTT AAAT AT CACCT CACTGT GGCCCAGGTTCGAGGAGGGATGGTGTTTGAGCTGGCCAATTCCATAGTGCTCCC TTTT GATT GT CG AG ATTAT GCT GT AGTTTT AAGAAAGTATGCT G ACAAAAT CT ACAG T ATTT CT AT GAAACAT CCACAGGAAAT G AAG ACAT ACAGT GTAT CATTT G ATT CACT TTTTT CT G C AGT AAAG 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AACT G ACAATT CTGTCGTCCTCTCGC GG AAATATACAT CGTTT CG AT CTACGT AT GAT CTTTTT CCCT CTGCC AAAAATT AT G GGG ACAT CAT GAAGCCCCTT GAGCAT CT GACTT CTGGCT AAT AAAGG AAATTT ATT TT CATT GCAAT AGT GTGTTGG AATTTTTT GTGTCTCT CACT CGG AAGGAATT CTGC ATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTT CCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGG TAT CAGCT CACT CAAAGGCGGTAATACGGTT AT CCACAGAATCAGGGGATAACGC AG G AAAG AAC ATGT G AG CAAAAG G CCAG CAAAAG GCCAG G AACCGT AAAAAGG C CGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAT CGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCG TTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCG GATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACG CT GTAGGT AT CT CAGTT CGGT GT AGGT CGTT CGCT CCAAGCT GGGCTGT GTGCAC GAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT CCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGA
TTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTA
ACTACG GCT ACACT AG AAG AACAGT ATTT GGTATCTG CG CTCTG CT G AAG CCAGT TACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGT AGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTC AAGAAGAT CCTTT G AT CTTTT CTACGGGGTCT G ACGCT CAGTGGAACGAAAACT C ACGTT AAGGGATTTT G GTCAT GAG ATTAT CAAAAAGGAT CTT CACCT AG AT CCTTT
T AAATTAAAAAT G AAG TTTTAAAT CAAT CTAAAG TATAT AT G AG T AAACTT G G TCTG
ACAGTTACCAAT GCTT AAT CAGT GAGGCACCTAT CT CAGCG AT CTGTCT ATTT CGT T CAT CCATAGTT G CCT G ACT C SEQ ID NO: 36. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL PLÁSMIDO 459
G GCGT AAT G CT CT G CCAGT GTTACAACCAATTAACCAATT CT G ATT AG AAAAACT C
AT CG AG CAT CAAAT G AAACT G CAATTTATT CAT AT CAG G ATT AT CAAT ACCATATTT
TT G AAAAAG CCGTTT CT GTAAT G AAG G AG AAAACT CACCG AG G CAGTT CCAT AG G
ATGGCAAGAT CCT GGTAT CGGTCT GCG ATT CCG ACT CGT CCAACAT CAAT ACAAC
CT ATTAATTT CCCCTCGT CAAAAAT AAGGTT AT CAAGT GAG AAAT CACCAT G AGT G
ACG ACT GAAT CCG GTG AG AATGGCAAAAGCTT AT GCATTT CTTT CCAGACTT GTTC
AACAGG CCAG CCATTACGCTCG TCATCAAAATCACTCG CATCAACCAAACCGTTA
TT CATT CGT GATT GCGCCT GAGCGAG ACG AAAT ACG CG AT CGCT GTT AAAAGG AC AATTACAAACAGGAATCAAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAAC
AATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGG
GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGAT
G GT CGG AAG AG GCATAAATT CCGT CAG CCAG TTT AGTCT G ACCAT CT CAT CTGTA
ACAT CATTGGCAACGCT ACCTTT GCCATGTTT CAGAAACAACT CT G GCGCAT CGG
GCTT CCCATACAAT CG AT AG ATT GT CGCACCT GATT GCCCG ACATT AT CGCG AGC
CCATTT AT ACCCAT AT AAAT CAG CAT CCAT GTT GG AATTT AAT CG CGG CCT CG AGC
AAG ACGTTT CCCG TT GAAT ATGG CT CAT AACACCCCTTGTATT ACT GTTTATGTAA
G CAG AC AG G T CG AC AAT ATT G G CT ATT G G CCATT G CAT ACGTT G TATCTATAT CAT AATATGTACATTT AT ATT GGCT CAT GT CCAATAT G ACCGCCAT GTT G ACATT GATT A TTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG
G AGTT CCGCGTT ACATAACTT ACGGT AAATGGCCCG CCT GGCT G ACCGCCCAAC
G ACCCCCG CCCATT G ACGT CAATAAT GACGTATGTT CCCAT AGTAACGCCAAT AG
G G ACTTT CCATT G ACGT CAAT GG GTG G AGTATTT ACGGT AAACT G CCCACTT GG C
AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGT
AAAT GG CCCG CCT G GCATT AT GCCCAGT ACAT G ACCTT ACG GG ACTTT CCT ACTT GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC CCCATT G ACGT CAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAAT CAACGGG ACTTT CCAA AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGT GGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAC GCCAT CCACGCT GTTTT G ACCT CCATAGAAG ACACCGGGACCG AT CCAGCCT CC GCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCA CCGTCCGGATCTCAGCAAGCAGGTATGTACTCTCCAGGGTGGGCCTGGCTTCCC C AGTCAAG ACT CCAG G G ATTT G AGG G ACG CTGTGG G CT CTT CT CTT ACAT GTACC TTTT GCTT G CCT CAACCCT G ACT AT CTT CC AG GT CAG G AT CCCAG AGT CAG G GGT CT GT ATTTT CCT GCT GGT GGCT CCAGTT CAGG AACAGT AAACCCT GCT CCG AAT A TTGCCT CT CACAT CT CGTCAAT CT CCGCGAGG ACT GGGGACCCT GT G ACG AACAT GGCTAGCAAGGCTGTGCTGCTTGCCCTGTTGATGGCAGGCTTGGCCCTGCAGCC AGGCACTGCCCTGCTGTGCTACTCCTGCAAAGCCCAGGTGAGCAACGAGGACTG CCTGCAGGTGGAGAACTGCACCCAGCTGGGGGAGCAGTGCTGGACCGCGCGCA T CCGCGCAGTTGGCCT CCT G ACCGTCAT CAGCAAAGGCTGCAGCTT G AACT GCG T GG AT GACT CACAGGACT ACT ACGTGGGCAAG AAGAACAT CACGT GCT GT GACAC CGACTTGTGCAACGCCAGCGGGGCCCATGCCCTGCAGCCGGCTGCCGCCATCC TTGCGCT GCT CCCT GCACT CGGCCT GCTGCT CT GGGG ACCCGGCCAGCT AGG AT CCCAG ACCCT GAACTTT G AT CT GCT GAAACTGGCAGGCGATGTGG AAAGCAACC CAGGCCCAATGGCAAGCGCGCGCCGCCCGCGCTGGCTGTGCGCTGGGGCGCT GGTGCTGGCGGGTGGCTTCTTTCTCCTCGGCTTCCTCTTCGGGTGGTTTATAAAA T CCT CCAAT GAAGCT ACT AACATT ACT CCAAAGCATAAT AT GAAAGCATTTTT GG AT G AATT G AAAGCT GAG AACAT CAAG AAGTT CTTAT AT AATTTT ACACAG ATACCACAT TTAG C AG G AAC AG A AC AA AACTTT C AGCTT G C AAAG C AAATT C AAT CCCAG TG G AA AGAATTTGGCCTGGATTCTGTTGAGCTGGCACATTATGATGTCCTGTTGTCCTACC CAAATAAG ACT CAT CCCAACT ACAT CT CAAT AATT AAT G AAG AT GG AAAT GAG ATTT T CAAC ACAT CATT ATTT G AACCACCT CCT CCAG G AT AT G AAAATGTTT CG G AT ATT GT ACCACCTTT C AGTGCTTT CT CT CCT CAAG G AAT G CCAG AGGG CG AT CT AG TGT AT GTT AACTAT G CACG AACT G AAG ACTT CTTT AAATT G G AACG GG ACAT G AAAAT C AATT GCT CT GG G AAAATT GT AATT G CCAG ATATG G G AAAG TTTT CAG AG G AAAT AA GGTTAAAAATGCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTCATTCTCTACTCCGACCCT G CT GACT ACTTT GCTCCTGGGGT G AAGT CCT AT CCAG AT GGTT GG AAT CTT CCTG GAGGTGGTGTCCAGCGTGGAAATATCCTAAATCTGAATGGTGCAGGAGACCCTCT CACACCAGGTT ACCCAG CAAAT G AATAT G CTT AT AG GCGTG G AATT G CAG AG GCT GTT GGTCTT CCAAGT ATT CCTGTT CAT CCAATT GG AT ACTAT G AT GCACAG AAG CT CCTAGAAAAAATGGGTGGCTCAGCACCACCAGATAGCAGCTGGAGAGGAAGTCT C AAAGTGCCCT ACAATGTT G G ACCT G G CTTT ACT G G AAACTTTT CT ACACAAAAAG T CAAG AT GCACATCCACT CT ACCAAT GAAGT G ACAAGAATTTACAAT GT G AT AGGT ACT CT CAG AGG AG CAGT G G AACCAG ACAG AT ATGT CATT CT GG G AG GT CACCGG GACTCATGGGTGTTTGGTGGTATTGACCCTCAGAGTGGAGCAGCTGTTGTTCATG AAATTGT GAGG AGCTTT GG AACACT G AAAAAGGAAGGGT GG AG ACCT AG AAGAAC AATTTT GTTTGCAAGCT GGGAT GCAGAAGAATTT GGT CTT CTTGGTTCTACT GAGT GGGCAGAGGAGAATTCAAGACTCCTTCAAGAGCGTGGCGTGGCTTATATTAATGC T GACT CAT CTATAGAAGG AAACT ACACT CT GAG AGTT G ATT GT ACACCGCT G ATGT ACAGCTT G GTACACAACCT AACAAAAG AGCT G AAAAGCCCT G AT G AAG G CTTT G A AGGCAAAT CT CTTT AT GAAAGTT GG ACT AAAAAAAGTCCTT CCCCAG AGTT CAGT G G CAT G CCC AG G ATAAG C AAATT G G G ATCT G G AAAT G ATTTT GAG G TG TTCTT CC A ACG ACTT G G AATT G CTT CAG G CAG AG CACGGTATACTAAAAATT G G G AAAC AAAC AAATTCAGCGGCTATCCACTGTATCACAGTGTCTATGAAACATATGAGTTGGTGGA AAAGTTTTAT GATCCAATGTTTAAATATCACCT CACT GTGGCCCAGGTT CGAGGAG GGATGGTGTTTGAGCTGGCCAATTCCATAGTGCTCCCTTTTGATTGTCGAGATTAT G CT GTAGTTTT AAG AAAGT AT GCT G ACAAAAT CT ACAGT ATTT CT AT G AAACAT CCA CAGGAAAT GAAG ACAT ACAGTGT AT CATTT G ATT CACTTTTTT CTGCAGT AAAGAAT TTT ACAG AAATTGCTT CCAAG TT CAGT G AG AG ACT CCAG G ACTTT G ACAAAAG CAA CCCAAT AGTATT AAG AAT G AT G AAT G AT CAACT CAT GTTT CT GG AAAG AG CATTT A TT G AT CCATT AG G G TT ACC AG AC AG G CCTTTTT ATAGG C ATG T CAT CTATG CT CCA AGCAGCCACAACAAGTAT GCAGGGGAGT CATT CCCAGGAATTTAT GATGCT CT GT TT G AT ATT GAAAGCAAAGT GG ACCCTT CCAAGGCCTGGGG AG AAGTG AAGAG ACA G ATTT AT GTT GCAGCCTT CACAGT GCAGGCAGCT GCAGAG ACTTTG AGT GAAGT A G CCT AAAG AT CT G ACCCCCT AACGTT ACT GG CCG AAGCCG CTT G G AAT AAGGCC GGTGT GCGTTT GT CTATAT GTT ATTTT CCACCAT ATT GCCGTCTTTTGGCAAT GT G AGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCC CCT CT CGCCAAAGGAAT GCAAGGT CT GTT GAAT GT CGTG AAGGAAGCAGTT CCT C TGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAA CCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATAC ACCT GCAAAGGCGGCACAACCCCAGT GCCACGTT GTG AGTT GG AT AGTTGT GG A AAGAGT CAAAT GGCT CT CCT CAAGCGTATT CAACAAGGGGCT GAAGG AT GCCCAG AAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACAT GTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGT TTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCAGCATTGTGGGAGGCTGGGAGTG CGAGAAGCATT CCCAACCCTGGCAGGT GCTT GT GGCCT CT CGTGGCAGGGCAGT CTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCAT CAGGAACAAAAGCGT GAT CTT GCTGGGTCGGCACAGCTT GTTT CAT CCT G AAG AC ACAGG CCAGGTATTT CAG GT CAG CCACAGCTT CCCACACCCG CT CT ACG AT AT G A G CCT CCT G AAG AAT CG ATT CCT CAGG CCAGGTG AT G ACT CCAG CC ACG ACCT CAT G CTGCTCCG CCT GTCAG AG CCT GCCG AG CT CACG G AT G CTG T G AAG GT CAT G G A CCT G CCCACCCAG G AGCCAG CACT G GG G ACCACCT G CTACG CCT CAG GCT G GG GCAGCATT GAACCAGAGG AGTT CTT GACCCCAAAG AAACTT CAGTGTGT GG ACCT CCATGTTATTTCCAATGACGTGTGTGCGCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAG TTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGACAGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGAT TCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGGTGTGCTTCAAGGTATCACGTCATGGGGCA GT G AACCAT GTGCCCT GCCCG AAAGGCCTT CCCTGT ACACCAAGGT GGT GCATT A CCGGAAGTGGATCAAGGACACCATCGTGGCCAACCCCTGAGGATCTGGGCCCTA ACAAAACAAAAAGATGGGGTT ATT CCCT AAACTT CAT GGGTTACGT AATT GG AAGT T GG GG G AC ATT G CCACAAG AT CAT ATT GTAC AAAAG AT CAAACACT GTTTTAG AAA ACTT CCT GTAAACAGGCCT ATT G ATT GG AAAGT AT GT CAAAGGATT GTGGGT CTTT TGG GCTTTG CTG CTCCATTTACACAATGTG G ATATCCTG CCTTAATG CCTTTGTAT G CAT G TATAC AAG CTA AAC AG G CTTT C ACTTT CT CG CC AACTT AC AAG G CCTTT CT AAGTAAACAGTACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGC CAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAG CGCATGCGTGGAACCTTT GTGGCT CCT CTGCCG AT CCAT ACT GCGGAACT CCT AG CCGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCATAGGAACTGACAATTC TGTCGTCCTCT CG CGG AAAT AT ACAT CGTTT CG AT CTACGT AT GAT CTTTTT CCCT CTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTA AT AAAG G AAATTTATTTT C ATT G C AAT AG TG TGTT G G AATTTTTT GTGTCTCT CACT CGGAAGGAATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGC GTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCG GCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGA AT CAG GG GATAACGCAGG AAAG AACAT GT G AGCAAAAGG CC AG CAAAAG GCCAG G AACCGT AAAAAGGCCGCGTT GCT GGCGTTTTT CCATAGGCT CCGCCCCCCT G A CGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACT ATAAAGATACCAGGCGTTT CCCCCT GGAAGCT CCCT CGTGCGCT CT CCT GTTCCG ACCCT GCCGCTT ACCGG AT ACCT GT CCGCCTTT CT CCCTT CGGG AAGCGTGGCG CTTT CT CAT AG CT CACG CTG T AG GT AT CT CAGTT CGGTGTAG GT CGTTCG CT CCA AGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCG GT AACTAT CGT CTT G AGTCCAACCCGGTAAG ACACG ACTTAT CGCCACTGGCAGC AGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTT CTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGC GCT CTGCT G AAGCCAGTT ACCTT CGG AAAAAGAGTTGGT AGCT CTT G AT CCGGCA AACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCG CAG AAAAAAAGG AT CT CAAG AAGAT CCTTT G AT CTTTT CT ACGGGGT CT GACGCT C AGT GG AACG AAAACT CACGTT AAGGGATTTTGGT CAT G AG ATT AT CAAAAAGGAT C TT CACCT AG AT CCTTTTAAATTAAAAAT G AAGTTTT AAAT CAAT CT AAAGT AT AT AT G AGTAAACTT GGTCT G ACAGTT ACCAATGCTTAAT CAGT GAGGCACCT AT CT CAGC G ATCTGTCT ATTT CGTT CAT CCAT AGTT G CCT G ACT C SEQ ID NO: 37. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DE PSHUTTLE IRES
CAT CAT CAAT AATATACCTTATTTT G G ATT G AAGCCAAT AT G AT AAT G AGG GG GT G GAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGT GGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGG CAAAAGT G ACGTTTTT GGTGTGCGCCGGTGT ACACAGG AAG T G ACAATTTT CG CG CGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCA TTTT CGCGGG AAAACT GAATAAGAGG AAGTG AAAT CT G AAT AATTTT GTGTT ACT C ATAGCGCGTAATACTGTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCAT ATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC CAACG ACCCCCGCCCATT G ACGT CAATAAT G ACGT AT GTT CCCAT AGTAACG CCA ATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACT TGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCT ACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTG GCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC CACCCCATT G ACGTCAAT GGG AGTTT GTTTT GGCACCAAAAT CAACGGG ACTTT C CAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTAC GGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGA GATCCACCATGGCTAGCGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTC T CAAG G ACCACCG CAT CT CT ACATT CAAG AACT G GCCCTT CTT GG AG G G CTG CGC CTGCGCCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGA ACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGG AGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTT CCTTT CTGT CAAG AAGCAGTTT G AAG AATT AACCCTT G GT G AATTTTT G AAACT G G ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGA ATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCAT GGATTAGAGATCTGACCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGC CGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGT GAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTC CCCT CT CGCCAAAGGAAT GCAAGGT CTGTT G AATGT CGT GAAGG AAGCAGTT CCT CTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGA ACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATA CACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGG AAAG AGT CAAAT GGCTCT CCT CAAGCGTATT CAACAAGGGGCT G AAGG AT GCCCA GAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACA TGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGG TTTT CCTTT G AAAAACACG AT AAT ATGGCGGCCGCT CG AGCCT AAG CTT CT AG AT A AG AT AT CCG AT CCACCGG AT CT AG AT AACTG AT CATAAT CAG CCAT ACCACATTT G T AG AGGTTTT ACTT G CTTT AAAAAACCT CCCACACCT CCCCCT G AACCT G AAACAT AAAAT G AAT GCAATT GTTGTTGTT AACTT GTTT ATT GC AG CTTAT AAT G GTT ACAAA T AAAG C AATAG CAT C AC AAATTT C AC AAAT AAAG C ATTTTTTT C ACT G C ATT CT AG T T GT GGTTT GT CCAAACT CAT CAAT GTAT CTT AACGCGG AT CT GGGCGT GGTTAAG GGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAG CAG CCGCCGCCG CCAT G AG CACCAACT CGTTT G AT G G AAG C ATT GT G AGCT CAT ATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCT CCAGCATT G AT GGTCGCCCCGTCCT G CCCG CAAACT CT ACT ACCTT G ACCT ACG A G ACCGT GT CT GG AACGCCGTT GG AG ACT GCAGCCT CCGCCGCCGCTT CAGCCG CT GCAG CCACCGCCCG CGG G ATT GT G ACT G ACTTT GCTTT CCT GAG CCCG CTT G CAAGCAGT GCAGCTT CCCGTT CAT CCGCCCGCG AT G ACAAGTT G ACGGCT CTTTT G GCACAATT G G ATT CTTT G ACCCGG G AACTT AATGT CGTTT CT CAGCAG CTGTTG GATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTT AAAAC AT AAAT AA AAAACC AG ACT CT G TTT G G ATTT G G ATC AAG CAAG TG TCTTG C TGTCTTTATTTAGGGGTTTTGCGCGCGCGGTAGGCCCGGGACCAGCGGTCTCGG TCGTTGAGGGTCCTGTGTATTTTTTCCAGGACGTGGTAAAGGTGACTCTGGATGT TCAGATACATGGGCATAAGCCCGTCTCTGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAG CTTCATGCTGCGGGGTGGTGTTGTAGATGATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGG CGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGGGGCAGGCCCTT GGTGTAAGTGTTTACAAAGCGGTTAAGCTGGGATGGGTGCATACGTGGGGATAT GAGATGCATCTTGGACTGTATTTTTAGGTTGGCTATGTTCCCAGCCATATCCCTCC GGGGATTCATGTTGTGCAGAACCACCAGCACAGTGTATCCGGTGCACTTGGGAA ATTTGT CAT GT AGCTT AG AAGG AAAT GCGTGGAAG AACTTGG AG ACGCCCTT GT G ACCTCCAAGATTTTCCATGCATTCGTCCATAATGATGGCAATGGGCCCACGGGCG GCGGCCTGGGCGAAGATATTTCTGGGATCACTAACGTCATAGTTGTGTTCCAGGA TGAGATCGTCATAGGCCATTTTTACAAAGCGCGGGCGGAGGGTGCCAGACTGCG GTATAATGGTTCCATCCGGCCCAGGGGCGTAGTTACCCTCACAGATTTGCATTTC CCACGCTTTGAGTTCAGATGGGGGGATCATGTCTACCTGCGGGGCGATGAAGAA AACGGTTTCCGGGGTAGGGGAGATCAGCTGGGAAGAAAGCAGGTTCCTGAGCAG CTGCGACTTACCGCAGCCGGTGGGCCCGTAAATCACACCTATTACCGGCTGCAA CTGGTAGTTAAGAGAGCTGCAGCTGCCGTCATCCCTGAGCAGGGGGGCCACTTC GTT AAGCAT GTCCCT GACT CGCAT GTTTT CCCT G ACCAAAT CCGCCAGAAGGCGC TCGCCGCCCAGCGATAGCAGTTCTTGCAAGGAAGCAAAGTTTTTCAACGGTTTGA GACCGTCCGCCGTAGGCATGCTTTTGAGCGTTTGACCAAGCAGTTCCAGGCGGT CCCACAG CTCG GT CACCT GCTCTACG GCAT CT CG AT CCAG CAT AT CT CCT CGTTT CGCGGGTTGGGGCGGCTTTCGCTGTACGGCAGTAGTCGGTGCTCGTCCAGACG GGCCAGGGTCATGTCTTTCCACGGGCGCAGGGTCCTCGTCAGCGTAGTCTGGGT CACGGTGAAGGGGTGCGCTCCGGGCTGCGCGCTGGCCAGGGTGCGCTTGAGGC TGGTCCTGCTGGTGCTGAAGCGCTGCCGGTCTTCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGT AGCATTTGACCATGGTGTCATAGTCCAGCCCCTCCGCGGCGTGGCCCTTGGCGC GCAGCTTGCCCTTGGAGGAGGCGCCGCACGAGGGGCAGTGCAGACTTTTGAGG GCGTAGAGCTTGGGCGCGAGAAATACCGATTCCGGGGAGTAGGCATCCGCGCC GCAGGCCCCGCAGACGGTCTCGCATTCCACGAGCCAGGTGAGCTCTGGCCGTTC GGGGT CAAAAACCAGGTTT CCCCCAT GCTTTTT G AT GCGTTT CTT ACCT CTGGTTT CCATGAGCCGGTGTCCACGCTCGGTGACGAAAAGGCTGTCCGTGTCCCCGTATA CAGACTTGAGAGGGAGTTTAAACGAATTCAATAGCTTGTTGCATGGGCGGCGATA T AAAAT GCAAGGT GCTGCT CAAAAAAT CAGGCAAAGCCT CGCGCAAAAAAG AAAG CACAT CGT AGTCATGCT CAT GCAG AT AAAGGCAGGT AAGCT CCGG AACCACCACA G AAAAAG ACACCATTTTT CT CT CAAACAT GTCT GCG G GTTT CT GCATAAACACAAA AT AAAAT AACAAAAAAACATTTAAACATT AG AAGCCT GT CTTACAACAG G AAAAACA ACCCTTATAAGCATAAGACGGACTACGGCCATGCCGGCGTGACCGTAAAAAAACT GGTCACCGTGATTAAAAAGCACCACCGACAGCTCCTCGGTCATGTCCGGAGTCAT AAT G T AAG ACT CG G TAAAC AC AT C AG GTT G ATT CACAT CG G T C AG TG CT AAAAAG CGACCGAAATAGCCCGGGGGAATACATACCCGCAGGCGTAGAGACAACATTACA G CCCCCAT AG G AGGTAT AACAAAATT AAT AG G AG AG AAAAAC AC AT AAAC ACCT G AAAAACCCT CCT GCCT AGGCAAAAT AGCACCCT CCCGCT CCAG AACAACAT ACAG CGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAACCTA TTAAAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAG G GCC AAGT GCAG AGCG AGT AT AT AT AG G ACT AAAAAAT G ACGT AACGGTTAAAGT CCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCC AAAAAACCCACAACTT CCT CAAAT CGT CACTT CCGTTTT CCCACGTTACGT CACTT CCCATTTT AAG AAAACTACAATT CCCAACACAT ACAAGTT ACT CCG CCCTAAAACC TACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCT CATT AT CAT ATT G GCTT C AAT CCAAAAT AAG GT AT ATT ATT G AT G ATGTT AATTAAC ATGCATGGATCCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATA CCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGT TCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCAC AG AAT C AG G G G AT AACG C AG G AAAG AAC AT G T G AG C AAAAG G CC AG C AAAAG G C CAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCC T GACG AGCAT CACAAAAAT CG ACGCT CAAGT CAGAGGT GGCGAAACCCG ACAGG ACT AT AAAG AT ACCAGGCGTTT CCCCCTGGAAGCT CCCT CGT GCGCT CTCCTGTT CCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG G CG CTTT CT CAT AGCT CACG CT GT AG GT AT CT CAGTT CGGTGT AG GTCGTT CG CT CCAAGCT GGGCT GT GTGCACG AACCCCCCGTT CAGCCCG ACCGCT GCGCCTT AT CCGGTAACT AT CGT CTT G AGT CCAACCCGGTAAGACACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTT CTT G AAGT G GTGG CCT AACT ACG GCT AC ACT AG AAGG AC AGT ATTTGGT AT C TGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCG GCAAACAAACCACCGCT GGTAGCGGT GGTTTTTTT GTTT GCAAGCAGCAG ATT AC GCGCAG AAAAAAAGG AT CT CAAG AAG AT CCTTT GAT CTTTT CT ACGGGGT CT G AC GCT CAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTT GGT CATGAGATTAT CAAAAA G GAT CTT CACCT AG AT CCTTTTAAATT AAAAAT G AAGTTTT AAAT CAAT CT AAAGT A T AT AT GAGT AAACTTGGT CT G ACAGTTACCAATGCTT AAT CAGT G AGGCACCT AT C T CAG CG AT CTGTCT ATTT CGTT CAT CCATAGTT GCCT G ACT CCCCGT CGTGTAG AT AACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCG AG ACCC ACG CT C ACCG GCT CCAG ATTT AT CAGCAAT AAACCAG CCAGCCG G AAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGT CCT GCAACTTT AT CCGCCT CCAT CCAGT CTATT AAT T GTT GCCGGG AAGCTAG AGT AAGT AGTT CGCCAGTT AAT AGTTT GCGCAACGTT G TT G CC ATT G CTG CAGCCATG AG ATT AT CAAAAAG G AT CTT CACCT AG AT CCTTTT C ACGTAGAAAGCCAGT CCGCAGAAACGGT GCT GACCCCGG AT G AATGTCAGCT AC TGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGC AGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAA CCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTA AACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCT
GATCAAGAGACAGGAT GAGGAT CGTTT CGCAT GATT GAACAAGAT GGATT GCACG
CAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAAC
AGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGC
CCGGTT CTTTTT GT CAAG ACCG ACCT GT CCGGTGCCCT G AAT GAACT GCAAGACG
AGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTG
CTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCG
G GG CAGG AT CTCCTGT CAT CT CACCTT G CT CCT G CCG AG AAAGT AT CCAT CAT G G
CTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACC
ACCAAGCGAAACAT CGCAT CG AGCGAGCACGT ACT CGGATGGAAGCCGGT CTT G T CG AT CAG G AT G AT CT G G ACG AAG AG CAT CAG GGG CT CG CGCCAG CCG AACT G T TCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCAT
GGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCA
TCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTA
CCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGC
TTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGA
CG AGTT CTT CT G AATTTT GTT AAAATTTTTGTTAAAT CAG CT CATTTTTT AACCAAT A
GGCCGAAATCGGCACCATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTG
AGTGTTGTT CCAGTTT GG AACAAGAGT CCACT ATT AAAG AACGT GG ACT CCAACG T CAAAGGGCG AAAAACCGT CT AT CAGGGCG ATGGCCCACT ACGT G AACCAT CAC CCTAATCAAGTTTTTTGTGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAA
GGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAA
GGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGG TCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGC GTCCATT CG CCATT CAGG AT CG AATTAATT CTTAATT AA SEQ ID NO: 38. Secuencia de aminoácidos del antígeno Her-2:
MASELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQ WQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNY ALAVLDNGDPLDSVAPAAGATPGGLQELQLRSLTEILKGGVLIRRSPQLCHQDTVLWE DVFRKNNQLALVLMDTNRSRACHPCAPMCKANHCWGESSQDCQTLTRTICTSACAR CKAPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMP
NPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCA
RVCYGLGMEHLREARAITSANVQDFVGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASGTAPLQPEQ
LQVFETLEEITGYLYISAWPDSFPNLSVFQNLRVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGL
RSLQELGSGLALVHRNARLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHSGNRPEEDCVGEGFVC
YSLCAHGHCWGPGPTQCVNCSHFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPE CQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEG ACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAWGILLVWLGVVFGILIKRRQQK IRKYTMRRNEDLGPSSPMDSTFYRSLLEDEDMGELVDAEEYLVPQQGFFCPDPTPGT GSTAHRRHRSSSARNGGGDLTLGMEPSGEGPPRSPRAPSEGTGSDVFDGDLAVGV TKGLQSLSPQDLSPLQRYSEDPTLPLPSETDGKVAPLSCSPQPEFVNQSDVQPKSPL TPEGPPSPARPTGATLERAKTLSPGKNGVVKDVFTFGGAVENPEFLAPREGTASPPH PSPAFSPAFDNLFFWDQNSSEQGPPPSNFEGTPTAENPEFLGLDVPV
(secuencia de señal subrayada)
SEQ ID NO: 39. Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del antígeno Her-2 de SEQ ID NO: 38 ATGGCTAGCGAGCTGGCCGCCCTGTGTAGATGGGGACTGCTGCTGGCTCTGCTG CCT CCT G G AG CCGCTT CTACACAG GT CT G CACCG GCACCG ACAT G AAG CT GAGA CTGCCCGCCAGCCCCGAGACACACCTGGACATGCTGCGGCACCTGTACCAGGG CTGCCAGGTGGTCCAGGGGAATCTGGAACTGACCTACCTGCCCACCAACGCCAG CCTGAGCTTCCTGCAGGACATCCAGGAAGTGCAGGGCTACGTCCTGATCGCCCA CAACCAGGTCCGCCAGGTGCCCCTGCAGCGGCTGAGAATCGTGCGGGGCACCC AGCTGTTCGAGGACAACTACGCCCTGGCCGTGCTGGACAACGGCGACCCTCTGG ATAGCGTGGCCCCTGCTGCTGGGGCTACACCTGGCGGACTGCAGGAACTGCAG CTGCGGAGCCTGACCGAGATCCTGAAGGGCGGCGTGCTGATCAGGCGGAGCCC TCAGCTGTGCCACCAGGACACCGTGCTGTGGGAGGACGTGTTCCGGAAGAACAA CCAGCTGGCCCTCGTGCTGATGGACACCAACAGAAGCCGGGCCTGCCACCCCTG CGCCCCCATGTGCAAGGCCAATCACTGCTGGGGAGAGAGCAGCCAGGACTGCC AGACCCTGACCCGGACCATCTGCACCAGCGCCTGCGCCAGATGCAAGGCCCCC CTGCCTACCGACTGCTGCCACGAACAGTGCGCCGCTGGCTGCACCGGCCCCAA GCACAGCGATTGCCTGGCCTGCCTGCACTTCAACCACAGCGGCATCTGCGAGCT G CACT GCCCTGCCCTGGT G ACAT ACAACACCG ACACCTT CG AG AGCAT G CCCAA CCCCGAGGGCCGGTACACCTTCGGCGCCAGCTGTGTGACCGCCTGCCCCTACAA CTACCTGAGCACCGACGTGGGCAGCTGCACCCTGGTGTGCCCCCTGCACAACCA GGAAGTGACCGCCGAGGACGGCACCCAGAGATGCGAGAAGTGCAGCAAGCCTT GCGCCAGAGTGTGCTACGGCCTGGGCATGGAACACCTGAGAGAGGCCAGAGCC AT CACCAGCGCCAACGTGCAGG ACTT CGTGGGCT GCAAGAAG ATTTT CGGCT CC CT GGCCTT CCT GCCCGAGAGCTT CGACGGCGATCCT GCCT CT GGCACCGCCCCT CT GCAG CCT G AG CAG CT G CAG GT CTT CG AG ACACT GG AAG AG AT CACCG GCT AC CT GT ACAT CAGCGCCT GGCCCGACAGCTT CCCCAACCT G AGCGT GTT CCAG AAC CTGAGAGTGATCCGGGGCAGAATCCTGCACAACGGCGCCTACAGCCTGACCCTG CAGGGCCTGGGAATCAGCTGGCTGGGCCTGCGGAGCCTGCAGGAACTGGGATC TGGCCTGGCTCTGGTGCACCGGAACGCCCGGCTGTGCTTCGTGCACACCGTGCC CT GG G ACCAGCT GTT CAG AAACCCCCACCAG GCT CTG CTG CACAG CGG CAACCG GCCCGAAGAGGATTGCGTGGGCGAGGGCTTCGTGTGCTACTCCCTGTGCGCCCA CGGCCACTGTTGGGGACCTGGCCCTACCCAGTGCGTGAACTGCAGCCACTTCCT GCGGGGCCAAGAATGCGTGGAAGAGTGCCGGGTGCTGCAGGGACTGCCCCGGG AATACGT GAACG CCAG ACACT GCCT GCCTT GCCACCCCG AGTGCCAGCCCCAG A ATGGCAGCGTGACCTGCTTCGGACCCGAGGCCGATCAGTGTGTGGCCTGCGCC CACTACAAGGACCCCCCATTCTGCGTGGCCAGATGCCCCAGCGGCGTGAAGCCC GACCTGAGCTACATGCCCATCTGGAAGTTCCCCGACGAGGAAGGCGCCTGCCAG CCTTGCCCCATCAACTGCACCCACAGCTGCGTGGACCTGGACGACAAGGGCTGC CCT GCCGAGCAGAG AGCCAGCCCCCT GACCAGCAT CAT CAGCGCCGTGGTGGG AATCCTGCTGGTGGTGGTGCTGGGCGTGGTGTTCGGCATCCTGATCAAGCGGCG GCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACCATGCGGCGGAACGAGGACCTGGGCCCCT CT AGCCCCAT G G ACAGCACCTT CT ACCG GT CCCTG CTG G AAG AT G AG G ACAT GG GCGAGCTGGTGGACGCCGAGGAATACCTGGTGCCTCAGCAGGGCTTCTTCTGCC CCGACCCTACCCCTGGCACCGGCTCTACCGCCCACAGACGGCACAGAAGCAGCA GCGCCAGAAACGGCGGAGGCGACCTGACCCTGGGAATGGAACCTAGCGGCGAG GGACCTCCCAGAAGCCCTAGAGCCCCTAGCGAGGGCACCGGCAGCGACGTGTT CGATGGCGATCTGGCCGTGGGCGTGACCAAGGGACTGCAGAGCCTGAGCCCCC AGGACCTGTCCCCCCT GCAGAGAT ACAGCG AGGACCCCACCCT GCCCCT GCCCA GCGAGACAGATGGCAAGGTGGCCCCCCTGAGCTGCAGCCCTCAGCCCGAGTTC GTGAACCAGAGCGACGTGCAGCCCAAGTCCCCCCTGACACCCGAGGGACCTCCA AGCCCTGCCAGACCTACCGGCGCCACCCTGGAAAGAGCCAAGACCCTGAGCCC CGGCAAGAACGGCGT GGT GAAAG ACGTGTT CACCTT CGG AGGCGCCGT GG AAAA CCCCGAGTTCCTGGCCCCCAGAGAGGGCACAGCCAGCCCTCCACACCCCAGCC CAG CCTT CT CCCCCG CCTT CG ACAACCTGTT CTT CTG G G ACCAG AACAG CAG CG A GCAGGGCCCACCCCCCAGCAATTTCGAGGGCACCCCCACCGCCGAGAATCCTGA GTTCCTGGGCCTGGACGTGCCCGTGTGA SEQ ID NO: 40. Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 CP870.893:
MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHW
VRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDT
AVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES
TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGT
QTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
PEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQD
WLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
SEQ ID NO: 41. Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 CP870.893: MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQ QKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPL TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC.
SEQ ID NO: 42. Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-CTLA-4 tremelimumab QVQLVESGGGVVQPG RSLRLSCAASG FTFSSYG M HWVRQAPG KG LEVWAVIWYDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGM
DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT
ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 43. Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-CTLA-4 tremelimumab
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFI
FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 44. Secuencia de nucleótidos de CpG 7909
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'
SEQ ID NO: 45. Secuencia de nucleótidos de CpG 24555
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'
SEQ ID NO: 46. Secuencia de nucleótidos de CpG 10103
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'
SEQ ID NO: 47. Secuencia de aminoácidos de eGFP
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEV KFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGI
TLGMDELYK SEQ ID NO: 48. Secuencia de aminoácidos del antígeno core de VHB MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAI
LCWGELMTLATVWGNNLEDPASRDLWNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVL
EYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP
RRRRSQSRESQC SEQ ID NO: 49. Secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie del VHB MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTS NHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTSTG PCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLL VPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLVWYI SEQ ID NO: 50. Secuencia de aminoácidos de la proteína ECD de PSMA de rhesus:
MASETDTLLLVWLLLVWPGSTGDAAHHHHHHKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENI
KKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYI
SIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFK
LERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPADYFAPGVKSYPDG
WNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDA QKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVI GTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTI
LFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSL
VYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIAS GRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELA NSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFS
ERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESF
PGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA SEQ ID NO: 51. Secuencia de aminoácidos del péptido p66 de Her-2 de rata (epítopo de linfocitos T de H-2d)
TYVPANASL SEQ ID NO: 52. Secuencia de aminoácidos del péptido p169 de Her-2 de rata (epítopo de linfocitos T de H 2d)
DMVLWKDVFRKNNQL SEQ ID NO: 53. Secuencia de aminoácidos del péptido p87 del antígeno core de VHB SYVNTNMGL SEQ ID NO: 54. Secuencia de aminoácidos del antígeno Her-2 de rata (rHer-2):
MASELAAWCRWGFLLALLPPGIAGTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQ WQGNLELTYVPANASLSFLQDIQEVQGYMLIAHNQVKRVPLQRLRIVRGTQLFEDKY ALAVLDNRDPQDNVAASTPGRTPEGLRELQLRSLTEILKGGVLIRGNPQLCYQDMVL WKDVFRKNNQLAPVDIDTNRSRACPPCAPACKDNHCWGESPEDCQILTGTICTSGC ARCKGRLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFES MHNPEGRYTFGASCVTTCPYNYLSTEVGSCTLVCPPNNQEVTAEDGTQRCEKCSKP CARVCYGLGMEHLRGARAITSDNVQEFDGCKKIFGSLAFLPESFDGDPSSGIAPLRPE QLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLRDLSVFQNLRIIRGRILHDGAYSLTLQGLGIHSLGL RSLRELGSGLALIHRNAHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHSGNRPEEDCGLEGLVCN SLCAHGHCWGPGPTQCVNCSHFLRGQECVEECRVWKGLPREYVSDKRCLPCHPEC QPQNSSETCFGSEADQCAACAHYKDSSSCVARCPSGVKPDLSYMPIWKYPDEEGIC QPCPINCTHSCVDLDERGCPAEQRASPVTFIIATVVGVLLFLILWWGILIKRRRQKIRK YTMRRNEDLGPSSPMDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFSPDPTPGTGS TAHRRHRSSSTRSGGGELTLGLEPSEEGPPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLAMGVTKG
LQSLSPHDLSPLQRYSEDPTLPLPPETDGYVAPLACSPQPEFVNQSEVQPQPPLTPE
GPLPPVRPAGATLERPKTLSPGKNGWKDVFAFGGAVENPEFLVPREGTASPPHPSP AFSPAFDNLFFWDQNSSEQGPPPSNFEGTPTAENPEFLGLDVPV SEQ ID NO: 55. Secuencia de aminoácidos del antígeno PSMA de rhesus:
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIK
KFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISII
NEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERD
MKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGG
GVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGG
SASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMH1HSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRY
VILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGS
TEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGK
SLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPL
YHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKI
YNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFL
ERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQ
ISIATFTVQAAAETLSEVA SEQ ID NO: 56 Secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno PSMA de rhesus de SEQ ID NO: 55"

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:
- al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA unido a membrana seleccionado entre el grupo que consiste en:
1) un polipéptido que comprende los aminoácidos 15-750 de la SEQ ID NO: 1;
2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5;
4) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;
5) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 9;
6) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 3;
7) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 5;
8) un polipéptido que comprende los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 7; y
9) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9;
- al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de PSA citosólico inmunogénico que comprende los aminoácidos 4-240 de la SEQ Id NO: 17; y
- al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSCA de los aminoácidos 4-123 de la SEQ ID NO: 21.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido inmunogénico de PSA de la SEQ ID NO: 17 o aminoácidos 4-240 de la SEQ ID NO: 17 y en la que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico de PSMA se selecciona entre el grupo que consiste en:
1) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2;
2) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4;
3) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6;
4) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8;
5) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10;
6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 4; 7) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 6; 8) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 8; y 9) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 10.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 33 a 36 o una variante degenerada de cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID NO: 33 a 36.
4. Una construcción de plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una construcción de plásmido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, que es una composición de vacuna.
8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, para su uso en un procedimiento para inhibir la proliferación celular anormal en un mamífero.
9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
10. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer de próstata en un ser humano.
11. Una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una construcción de plásmido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5, para su uso en combinación con un modulador inmunitario en un procedimiento para tratar el cáncer de próstata en un ser humano.
12. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de PSMA se selecciona entre el grupo que consiste en:
1) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 4;
2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 6;
3) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 8;
4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 10 - 2217 de la SEQ ID NO: 10; y una variante degenerada de cualquiera de las secuencias de nucleótidos.
13. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 11,
en la que el polipéptido inmunogénico de PSMA se selecciona entre el grupo que consiste en:
1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9;
2) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 3;
3) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 4 -739 de la SEQ ID NO: 5; y
4) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 4 - 739 de la SEQ ID NO: 7,
en la que el polipéptido inmunogénico de PSA se selecciona entre el grupo que consiste en:
1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o los aminoácidos 4-240 de la SEQ ID NO: 17;
2) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o los aminoácidos 4-240 de la SEQ ID NO: 17;
3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o los aminoácidos 4-281 de la SEQ ID NO: 19; y
4) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o los aminoácidos 4-281 de la SEQ ID NO: 19; y
en la que el polipéptido inmunogénico de PSCA es PSCA humano de longitud completa.
14. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el modulador inmunitario se selecciona entre un inhibidor de proteína cinasa, inhibidor de COX-2, inhibidor de PDE5; inhibidor de CTLA-4, agonista de CD40, agonista de TLR, agonista de 4-1BB, agonista de OX40, agonista de GITR, antagonista de PD-1 o antagonista de PD-L1.
15. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35 o una variante degenerada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35.
16. Una construcción de plásmido, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35 o una variante degenerada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35.
17. Un vector, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35 o una variante degenerada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35.
18. Una composición, que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 15, una construcción de plásmido de acuerdo con la reivindicación 16 o un vector de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Una vacuna, que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 15, una construcción de plásmido de acuerdo con la reivindicación 16 o un vector de acuerdo con la reivindicación 17.
20. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 15, composición, construcción de plásmido de acuerdo con la reivindicación 16, vector de acuerdo con la reivindicación 17, composición de acuerdo con la reivindicación 18 o vacuna de acuerdo con la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un ser humano.
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