ES2737649T3 - Anticuerpos anti-Notch3 - Google Patents

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William M Winston
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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en: (a) (i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10; (b) (i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10; (c) (i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10; (d) (i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-Notch3
Campo de la invención
El campo de la invención es la biología molecular, la inmunología y la oncología. Más en particular, el campo son los anticuerpos que se unen a Notch3 humana.
Antecedentes
La vía de señalización de Notch está involucrada en numerosos procesos celulares, incluida la determinación del destino de la célula, la diferenciación, la proliferación, la apoptosis, la migración y la angiogénesis. En mamíferos, hay cuatro proteínas Notch (a veces llamadas "receptores Notch"), designadas Notchl-Notch4. Las cuatro proteínas Notch tienen una estructura de dominio similar, que incluye un dominio extracelular, una región reguladora negativa (NRR por sus siglas en inglés), un dominio transmembrana de un solo paso y un dominio intracelular. El dominio extracelular contiene una serie de repeticiones similares a EGF que están involucradas en la unión al ligando. Durante la maduración, el polipéptido Notch se escinde por una proteasa similar a la furina. Esta escisión divide la proteína Notch en dos subunidades que se mantienen unidas por interacciones no covalentes de la NRR. En ausencia de unión al ligando, el dominio NRR funciona para mantener la proteína Notch en una conformación resistente a la proteasa. El dominio intracelular es un factor de transcripción denominado dominio intracelular de Notch (NICD, por sus siglas en inglés), que se libera tras la escisión proteolítica por la gamma secretasa, en respuesta a la unión de la proteína Notch por un ligando. En mamíferos, los ligandos de Notch son de tipo Delta (por ejemplo, DLL1 y DLL4) y Jagged (también conocido como Jag, por ejemplo, Jag1 y Jag2). Cuando se libera el NICD, viaja al núcleo, donde activa la transcripción de los genes que responden a Notch, HES1, HES5, NRARP, Deltexl y c-MYC. Para las revisiones de la biología relacionada con Notch, véase, por ejemplo, Bray, 2006, NATURE REVIEWS 7: 678-689; Kopan et al., 2009, CELL 137: 216-233.
Mientras que las proteínas Notch juegan un papel crucial en el desarrollo normal, la desregulación de las proteínas Notch está asociada con varios tipos de cáncer, incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico agudo de linfocitos T (T-All), cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. Véase, por ejemplo, Miele et al., 2006, CURRENT CANCER DRUG TARGETS 6: 313-323. Por consiguiente, un enfoque terapéutico para el tratamiento del cáncer es la inhibición de la vía de señalización de Notch. La inhibición de la vía de señalización de Notch se ha logrado utilizando anticuerpos monoclonales (Wu et al., 2010, NATURE 464:1052-1057; Aste-Amézaga et al., 2010, PLOS ONE 5:1-13 e9094).
El documento WO 2010/005566 se relaciona con los agentes de unión a Notch y los antagonistas de Notch y los métodos de uso de los agentes y/o antagonistas para tratar enfermedades tales como el cáncer.
Los anticuerpos naturales son proteínas multiméricas que contienen cuatro cadenas polipeptídicas (Figura 1). Dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas pesadas de inmunoglobulina (cadenas H), y dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas ligeras de inmunoglobulina (cadenas L). Las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina están conectadas por un enlace disulfuro entre cadenas. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina están conectadas por enlaces disulfuro entre cadenas. Una cadena ligera consiste en una región variable (Vl en la Figura 1) y una región constante (Cl en la Figura 1). La cadena pesada consiste en una región variable (Vh en la Figura 1) y al menos tres regiones constantes (CH1 CH2 y CH3 en la Figura 1). Las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo.
Cada región variable contiene tres regiones hipervariables conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR) flanqueadas por cuatro regiones relativamente conservadas conocidas como regiones estructurales (FR). Las tres CDR, denominadas CDR1 CDR2 y CDR3, contribuyen a la especificidad de unión al anticuerpo. Los anticuerpos de origen natural se han utilizado como material de partida para anticuerpos de ingeniería, tales como los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos humanizados.
Existe la necesidad de anticuerpos mejorados que neutralicen la actividad biológica de la Notch3 humana y que puedan usarse como agentes terapéuticos para tratar pacientes humanos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se basa en el descubrimiento de anticuerpos que se unen específicamente a Notch3 humana. Los anticuerpos descritos en este documento contienen sitios de unión a Notch3 basados en las CDR de los anticuerpos anti-Notch3 descritos en el presente documento. Los anticuerpos descritos previenen o inhiben la activación de Notch3 humana. Lo hacen al impedir que Notch3 se una a los ligandos de Notch, es decir, Jag1, Jag2, DLL1 y DLL4. Los anticuerpos descritos pueden usarse para inhibir la proliferación de células tumorales in vitro y/o in vivo. Cuando se administra a un paciente humano con cáncer, los anticuerpos inhiben o reducen el crecimiento del tumor en el paciente humano.
La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10;
(b)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10;
(c)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10;
(d)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
La presente invención también se refiere a un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H); (b) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H);
(c) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q); (d) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q);
(e) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y); (f) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
La presente invención se refiere además a un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa);
(b) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa);
(c) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa);
(d) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa);
(e) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa);
(f) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado, un vector de expresión o vectores de expresión, una célula hospedadora, un método para producir anticuerpos y un método in vitro y uso médico.
Estos y otros aspectos y ventajas de la invención se ilustran en las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones. Tal como se utiliza en el presente documento, "incluyendo" significa sin limitación, y los ejemplos citados no son limitativos. Tal como se utiliza en el presente documento, "anticuerpo 4F11" significa anticuerpo 4F11, o variantes humanizadas del mismo.
Descripción de los dibujos
La invención se puede entender más completamente con referencia a los siguientes dibujos.
La Figura 1 (técnica anterior) es una representación esquemática de un anticuerpo típico de origen natural. La Figura 2 proporciona la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular (ECD; aminoácidos 40 a 1643) de Notch3 humana (SEQ ID NO: 95).
La Figura 3 proporciona la secuencia de aminoácidos correspondiente a las repeticiones 1-11 de tipo EGF (aminoácidos 40 a 467 del dominio extracelular mostrado en la Figura 2) de Notch3 humana (SEQ ID NO: 96). La Figura 4 es un gráfico de barras que resume los resultados de un experimento para determinar la especificidad de la unión del anticuerpo 4F11 a Notch3 humana recombinante unido a Fc (rhNotch3) usando Octeto. Los resultados demuestran que la especificidad de unión del anticuerpo 4F11 para rhNotch3 es mucho mayor que para rhNotch1 o rhNotch2.
La Figura 5A es un gráfico de barras que ilustra la capacidad del anticuerpo 4F11 para neutralizar la unión del ligando Jag1 a la proteína Notch3 humana. El gráfico muestra que el anticuerpo 4F11 y un control específico de Notch3, pero no la inmunoglobulina humana (hIgG), fueron capaces de bloquear la unión de Jag1 unido a Fc humano recombinante (Jag1-Fc) a rhNotch3, Según lo detectado por la interferometría de biocapa (BLI).
La Figura 5B es un gráfico de barras que ilustra la capacidad del anticuerpo 4F11 para neutralizar la unión del ligando Jag2 a la proteína Notch3 humana. El gráfico muestra que el anticuerpo 4F11 y un control específico de Notch3, pero no hlgG, fueron capaces de bloquear la unión de Jag2 unido a Fc humano recombinante (Jag2-Fc) a rhNotch3, según lo detectado por BLI.
La Figura 5C es un gráfico de barras que ilustra la capacidad del anticuerpo 4F11 para neutralizar la unión del ligando DLL1 a la proteína Notch3 humana. El gráfico muestra que el anticuerpo 4F11 y un control específico de Notch3, pero no hlgG, bloquean la unión de DLL1 unida a Fc humana recombinante (DLLl-Fc) a rhNotch3, en mayor medida que la IgG, según lo detectado por BLI.
La Figura 5D es un gráfico de barras que ilustra la capacidad del anticuerpo 4F11 para neutralizar la unión del ligando DLL4 a la proteína Notch3 humana. El gráfico muestra que el anticuerpo 4F11 y un control específico de Notch3, pero no hlgG, fueron capaces de bloquear la unión de DLL4 unido a Fc humano recombinante (DLL4-Fc) a rhNotch3, según lo detectado por BLI.
La Figura 6A es una curva de dosis-respuesta que resume los resultados de un ensayo de indicador de Notch3 que muestra que el anticuerpo 4F11 inhibe la expresión del gen indicador dependiente de Notch3 en presencia del ligando Jag2 unido a Fc (Jag2-Fc). El gráfico muestra la relación entre la inhibición de la actividad del indicador estimulado por Jag2-Fc (% de inhibición) por el anticuerpo 4F11 en células transducidas, en relación con la cantidad de ligando Jag2-Fc. La actividad del indicador de células transducidas con el indicador de luciferasa dependiente de RBP-Jk, expuesto a cualquier ligando activador, y tratado con IgG de ratón (mIgG) se definió como un 100 % de actividad para cada ligando. La actividad del indicador de las células transducidas no expuestas al ligando pero tratadas con IgG de ratón se definió como una actividad del 0 %.
La Figura 6B es un gráfico de barras que resume los resultados de los ensayos de indicador de Notch3 que muestran que el anticuerpo 4F11, pero no la IgG de ratón (mIgG), inhibe la expresión del gen indicador dependiente de Notch3 inducida por los ligandos hJag1, hJag2, hDLL1 y hDLL4. La actividad del indicador de células transducidas con el indicador de luciferasa dependiente de RBP-Jk, expuesto a cualquier ligando activador, y tratado con IgG de ratón (mIgG) se definió como un 100 % de actividad para cada ligando. La actividad del indicador de las células transducidas no expuestas al ligando pero tratadas con IgG de ratón se definió como una actividad del 0 %.
La Figura 7 es un alineamiento de secuencias que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina completa de la región variable de 4F11 quimérico indicada como Ch4F11 y las regiones variables de la cadena pesada de 4F11 humanizado designadas como Sh4F11 Hv3-23, Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S, Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S, Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S y Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S. Las secuencias de aminoácidos para cada región variable de la cadena pesada están alineadas unas con otras, y las secuencias CDR1 CDR2 y CDR3 (definición de Kabat) se identifican en recuadros. Las secuencias sin recuadro representan secuencias estructurales (FR).
La Figura 8 es un alineamiento de secuencias que muestra las secuencias aisladas CDR1 CDR2 y CDR3 para cada una de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina en la Figura 7.
La Figura 9 es un alineamiento de secuencias que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina completa de 4F11 quimérico designada como Ch4F11 y las regiones variables de la cadena ligera de 4F11 humanizado designadas como Hu4F1 Kv2D-29, Hu4F11 Kv2D-29 N28H, Hu4F11 Kv2D-29 N28Q y Hu4F11 Kv2D-29 N28Y. Las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera están alineadas entre sí y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 (definición de Kabat) se identifican en recuadros. Las secuencias sin recuadro representan secuencias estructurales (FR).
La Figura 10 es un alineamiento se secuencias que muestra las secuencias aisladas CDR1, CDR2 y CDR3 para cada una de las secuencias de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina en la Figura 9.
La Figura 11 es un gráfico que ilustra la capacidad de los anticuerpos 4F11 humanizados seleccionados (es decir, Hu4F11 -70, Hu4F11 -72, Hu4F11 -74 y Hu4F11 -78) para inhibir la escisión de ICD de Notch3 inducida por ligando en las células MDA-MB-468 cultivadas en Jag2mFc. Las células MDA-MB-468 expuestas a cualquiera de los anticuerpos 4F11 o hIgG se colocaron en pocillos recubiertos con hJag2-mFc, se incubaron durante la noche, se lavaron y sus lisados se recogieron para la detección de NICD por transferencia de Western. El gráfico muestra la intensidad de la banda de NICD escindida en cada muestra según lo detectado por transferencia de Western. Las transferencias también se exploraron con tubulina anti-p como control, y las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageLab. Como control negativo, las células expuestas a hIgG se colocaron en placas recubiertas con mFc (Fc) en lugar de Jag2mFc.
La Figura 12A y la Figura 12B son gráficos que resumen los resultados de un ensayo de indicador de Notch3 que muestra que las variantes humanizadas de 4F11 inhiben la expresión del gen indicador dependiente de Notch3 inducida por el ligando Jag2. Las células CHO transfectadas con el vector de expresión de ADNc Jag2 se incubaron durante 24 horas con una mezcla de células indicadoras HCC1143 y 0,1 mg/ml, 1 mg/ml o 10 mg/ml de variantes del anticuerpo 4F11 (es decir, Hu4F11-32, Hu4F11-69, Hu4F11-70, Hu4F11-71, Hu4F11-72, Hu4F11 -73, Hu4F11 -74, Hu4F11-75, Hu4F11-76, Hu4F11-77, Hu4F11-78, Hu4F11-79, o Hu4F11-80), un anticuerpo de control negativo (Control Ab Neg) o inmunoglobulina G humana (IgG), o se dejaron sin tratar. 24 horas después de exponer las células indicadoras a células CHO que expresan Jag2, las células se procesaron utilizando el protocolo de análisis de indicadores Bright Glo (Promega, Madison, WI) y se detectaron unidades de luz relativa promedio (RLU) en un luminómetro GloMax (Promega) (figura 12A y figura 12B).
La Figura 13 es un gráfico que ilustra la capacidad de los anticuerpos 4F11 humanizados seleccionados (es decir, Hu4F11-70, Hu4F11-72 y Hu4F11-78) para inhibir la activación del receptor Notch3 in vivo después del tratamiento de ratones portadores de tumores de xenoinjerto HCC2429. Los ratones inoculados con matrigel y células HCC2429 que expresan Notch3 pudieron desarrollar tumores de 300-400 mm3, en cuyo punto tres ratones (m1, m2 y m3 en la figura 13) fue tratado cada uno con 20 mg/kg de hIgG, 4F11 o anticuerpo humanizado de Notch3. A continuación, se recogieron los tumores y los lisados, y se realizó una transferencia de Western utilizando un anticuerpo específico para el extremo C de Notch3 con el fin de detectar la extensión de la escisión del dominio intracelular de Notch. Se calculó la intensidad de la banda de transferencia de Western del fragmento de dominio intracelular de Notch escindido, normalizando al control de carga de p-tubulina.
Descripción detallada
Los anticuerpos descritos en el presente documento se basan en los sitios de unión al antígeno de ciertos anticuerpos monoclonales que se han seleccionado en función de la unión y neutralización de la actividad de Notch3 humana. Los anticuerpos contienen secuencias de CDR de región variable de inmunoglobulina que definen un sitio de unión para Notch3 humana.
Debido a la actividad neutralizante de estos anticuerpos, son útiles para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de ciertas células cancerosas y tumores. Los anticuerpos pueden diseñarse por ingeniería (por ejemplo, humanizarse) para minimizar o eliminar una respuesta inmune cuando se administran como un anticuerpo terapéutico a un paciente humano. Varias características y aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación. Tal como se utiliza en el presente documento, salvo que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" significa un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal intacto) o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo intacto o un fragmento de unión al antígeno que ha sido modificado, diseñado por ingeniería o químicamente conjugado. Los ejemplos de anticuerpos que han sido modificados o diseñados por ingeniería son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2, Fv, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), minicuerpos y diacuerpos. Un anticuerpo conjugado con un resto de toxina es un ejemplo de un anticuerpo conjugado químicamente.
I. Anticuerpos que se unen a Notch3 humana
Como se desvela en el presente documento, los anticuerpos pueden comprender: (a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRh 1-CDRh 2-CDRh3 y (b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRl 1-CDRl2-CDRl3, en la que la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera definen juntas un único sitio de unión para unir Notch3 humana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRh 1-CDRh2-CDRh3 y (b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina, en la que la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera definen juntas un único sitio de unión para unir Notch3 humana. Una CDRh 1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 y SEQ ID NO:61; una CDRh2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO:53; y una CDRh3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:16. (Las regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina que incluyen las secuencias de CDR referenciadas se pueden encontrar en la Tabla 10 y las figuras 7-8.)
Como se describe en el presente documento; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 11, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 56, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 57, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
Preferentemente, las secuencias CDRh 1, CDRH2y CDRh3 se interponen entre las secuencias FR de inmunoglobulina humana o humanizada.
En otras realizaciones, el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRl 1-CDRl2-CDRl3 y (b) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la región variable de la cadena ligera de IgG y la región variable de la cadena pesada de IgG definen juntas un único sitio de unión para unir Notch3 humana. Como se describe en el presente documento, CDRl 1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66 y SEQ ID NO:67; una CDRl2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:9 o la secuencia de aminoácidos de KVS; y una CDRl3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. (Las regiones variables de la cadena ligera de inmunoglobulina que incluyen las secuencias de CDR referenciadas se pueden encontrar en la Tabla 11 y en las figuras 9-10.)
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Preferentemente, las secuencias CDRl 1, CDRL2y CDRl 3 se interponen entre las secuencias FR de la inmunoglobulina humana o humanizada.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRh 1-CDRh2-CDRh3 y (b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRl 1-CDRl2-CDRl3, en la que la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera definen juntas un único sitio de unión para unir Notch3 humana. Como se describe en el presente documento, CDRh 1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 y SEQ ID NO:61; la CDRh2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO:53; y la CDRh3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la s Eq ID NO:7 y la SEQ ID NO:16. La CDRl 1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66 y SEQ ID NO:67; la CDRl2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:9 o la secuencia de aminoácidos de KVS; y la CDRl3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO:11, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO:11; una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62; una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO:11; una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63; una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO:11; una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64; una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10. Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:52 y la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:52 y la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:52 y la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:52 y la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO: 57, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO: 57, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO: 57, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRh 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO: 57, una CDRh2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 y una CDRh3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRl 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRl2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRl3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
Los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S); y la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S); y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina. Como una conveniencia para el lector, ciertas SEQ ID NO van seguidas por un paréntesis que incluye la designación del anticuerpo que fue el origen de la secuencia. Por ejemplo, "SEQ ID NO:2 (4F11, Ch4F11 quimérica)"significa que la SEQ ID NO:2 proviene del anticuerpo murino 4F11. La SEQ ID NO:2 también se encuentra en la secuencia de 4F11 quimérica.
En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H); la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q); y la s Eq ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y); y una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la s Eq ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S); y la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S); y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H); SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q); y SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 (4F11, Ch4F11 quimérica) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4 (4F11, Ch4F11 quimérica).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 (4F11, Ch4F11 quimérica) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 (Hu4F11 Kv2D-29).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34 (Sh4F11 Hv3-23), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4 (4F11, Ch4F11 quimérica).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34 (Sh4F11 Hv3-23) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 (Hu4F11 Kv2D-29).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S) y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H t 62S); y la SEQ ID NO:80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S); y una cadena ligera de inmunoglobulina.
En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa); SEQ ID NO:92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa); y SEQ ID NO:94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa); y una cadena pesada de inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S) y; la SEQ ID NO:80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S); y una cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa); SEQ ID NO:92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa); y la SEQ ID NO:94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 (4F11) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 (4F11).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74 (Ch4F11) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 86 (Ch4F11).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74 (Ch4F11) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 (Hu4F11 Kv2D-29).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76 (Sh4F11 Hv3-23) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 86 (Ch4F11).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76 (Sh4F11 Hv3-23) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 (Hu4F11 Kv2D-29).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID nO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4Fll Kv2D-29 N28H Kappa). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID nO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4Fll Kv2D-29 N28Q Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID nO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
Como se describe en el presente documento, el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
Como se describe en el presente documento; un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % idéntica a la región variable completa o la secuencia FR de la SEQ ID NO:2 (4F11, Ch4F11 quimérica); la SEQ ID NO:34 (Sh4F11 Hv3-23); la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S); la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S); la SEQ ID NO:40 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S); o la SEQ ID NO:42 (Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S).
Como se describe en el presente documento, un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana comprende una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % idéntica a la región variable completa o la secuencia FR de la s Eq ID NO:4 (4F11, Ch4F11 quimérica); la SEQ ID NO:44 (Hu4F11 Kv2D-29); la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H); la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q); o la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
La identidad de secuencias se puede determinar de varias maneras que están en la experiencia de un experto en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BlAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El análisis de BLAST (Herramienta de búsqueda básica de alineamiento local) utilizando el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87: 2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36: 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25: 3389-3402 están diseñados para búsquedas de similitud de secuencias. Para un debate de los problemas básicos en la búsqueda de bases de datos de secuencias, véase Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6: 119-129. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir un alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Los parámetros de búsqueda para histogramas, descripciones, alineamientos, suposición (es decir, el umbral de significación estadística para informar coincidencias contra las secuencias de la bases de datos), corte, matriz y filtración se encuentran en la configuración predeterminada. La matriz de puntuación predeterminada utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 10915-10919. Los siguientes parámetros de Blastn pueden ajustarse de la siguiente manera: Q=10 (penalización de creación de hueco); R=10 (penalización de extensión de hueco); wink=1 (genera aciertos de palabra en cada posición de wink a lo largo de la consulta); y gapw=16 (establece el ancho de la ventana dentro del cual se generan los alineamientos con huecos). Los ajustes de los parámetros de Blastp equivalentes pueden ser Q=9; R=2; wink= l y gapw=32. También se pueden realizar búsquedas utilizando el parámetro de Opción Avanzada BLAST del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) (por ejemplo: -G, Coste para abrir el hueco [Integer]: predeterminado = 5 para nucleótidos / 11 para proteínas; -E, Coste para extender la brecha [Integer]: predeterminado = 2 para nucleótidos/ 1 para proteínas; -q, Penalización por desajuste de nucleótidos [Integer]: predeterminado = -3; -r, recompensa para la concordancia de nucleótidos [Integer]: predeterminado = 1; -e, valor esperado [Real]: predeterminado = 10; -W, tamaño de letra [Integer]: predeterminado = 11 para nucleótidos/ 28 para megablasto/ 3 para proteínas; -y, Dropoff (X) para extensiones de blastos en bits: predeterminado = 20 para blastn/ 7 para otros; -X, valor de caída X para el alineamiento con huecos (en bits): predeterminado = 15 para todos los programas, no aplicable a blastn; y -Z, el valor final de caída X para el alineamiento con huecos (en bits): 50 para blastn, 25 para otros). También se puede usar ClustalW para alineamientos de proteínas por pares (los parámetros predeterminados pueden incluir, por ejemplo, matriz Blosum62 y penalización de apertura de hueco = 10 y penalización de extensión de hueco = 0,1). Una comparación de Bestfit entre secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, utiliza los parámetros de ADN GAP = 50 (penalización de creación de hueco) y LEN = 3 (penalización de extensión de hueco) y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP=8 y LEN=2.
Las secuencias de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y/o las secuencias de la región variable de la cadena ligera que se unen a Notch3 humana pueden contener alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 10 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos) en las regiones estructurales de las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado se une a Notch3 humana con una Kd de unos 35 nM, 25 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM o menos. A menos que se especifique de otro modo, los valores Kd se determinan mediante métodos de resonancia de plasmón superficial en las condiciones descritas en los Ejemplos 3 y 9.
Los anticuerpos monoclonales pueden unirse al mismo epítopo en Notch3 humana que el anticuerpo 4F11. Los anticuerpos monoclonales pueden competir por la unión a Notch3 humana con el anticuerpo 4F11. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden competir por la unión al dominio extracelular (ECD) de Notch3 con el anticuerpo 4F11 (la secuencia de aminoácidos correspondiente al ECD de Notch3 humana se muestra en la Figura 2). En otro ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden competir por la unión a las repeticiones 1-11 de tipo EGF de Notch3 humana con el anticuerpo 4F11 (la secuencia de aminoácidos correspondiente a las repeticiones 1-11 de tipo EGF de Notch3 humana se muestra en la Figura 3).
Los ensayos de competencia para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, el anticuerpo 4F11 son conocidos en la técnica. Los ensayos de competencia ejemplares incluyen inmunoensayos (por ejemplo, ensayos ELISA, ensayos RIA), análisis BIAcore, interferometría de biocapa y citometría de flujo.
Típicamente, un ensayo de competencia implica el uso de un antígeno (por ejemplo, una proteína Notch3 humana o un fragmento de la misma) unido a una superficie sólida o expresado en una superficie celular, un anticuerpo anti-Notch3 de ensayo y un anticuerpo de referencia (es decir, el anticuerpo 4F11). El anticuerpo de referencia está marcado y el anticuerpo de prueba no está marcado. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de anticuerpo de referencia marcado unido a la superficie sólida o a las células en presencia del anticuerpo de prueba. Por lo general, el anticuerpo de prueba está presente en exceso (por ejemplo, 1x, 5x, 10x, 20x o 100x). Los anticuerpos identificados por ensayo de competencia (es decir, anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo, o epítopos similares (por ejemplo, superpuestos), como el anticuerpo de referencia, y los anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente proximal al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que ocurra una impedancia estérica.
En un ensayo de competencia ejemplar, un anticuerpo anti-Notch3 de referencia (es decir, el anticuerpo 4F11) se biotinila utilizando reactivos disponibles en el mercado. El anticuerpo de referencia biotinilado se mezcla con diluciones en serie del anticuerpo de prueba o el anticuerpo de referencia no marcado (control de autocompetencia), lo que da como resultado una mezcla de varias relaciones molares (por ejemplo, 1x, 5x, 10x, 20x o 100x) del anticuerpo de prueba (o anticuerpo de referencia sin marcar) al anticuerpo de referencia marcado. La mezcla de anticuerpos se agrega a una placa ELISA recubierta con el polipéptido Notch3 humano (por ejemplo, dominio extracelular de Notch3 humano). A continuación, se lava la placa y se agrega a la placa peroxidasa de rábano picante (HRP)-estrepavidina como reactivo de detección. La cantidad de anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno diana se detecta después de la adición de un sustrato cromogénico (por ejemplo, TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbencidina) o ABTS (2,2"-azino-di-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)), que se conocen en la técnica. Las lecturas de densidad óptica (unidades de DO) se miden utilizando un espectrómetro M2 SpectraMax® (Molecular Devices). Las unidades de DO correspondientes al cero por ciento de inhibición se determinan desde los pocillos sin ningún anticuerpo de competencia. Las unidades de DO correspondientes al 100 % de inhibición, es decir, los antecedentes del ensayo se determinan a partir de pocillos sin ningún anticuerpo de referencia o anticuerpo de prueba marcado. El porcentaje de inhibición del anticuerpo de referencia marcado para Notch3 por el anticuerpo de prueba (o el anticuerpo de referencia no marcado) en cada concentración se calcula de la siguiente manera: % de inhibición = [1 -(DOmuestra - DO100% inhib.) / (DOü% Inhib. - DO100% inhib )]*100. Los expertos en la materia apreciarán que el ensayo de competencia se puede realizar utilizando diversos sistemas de detección conocidos en la técnica. Se puede realizar un ensayo de competencia en ambas direcciones para asegurar que la presencia de la etiqueta no interfiera o inhiba de otra manera la unión. Por ejemplo, en la primera dirección, el anticuerpo de referencia está marcado y el anticuerpo de prueba no está marcado, y en la segunda dirección, el anticuerpo de prueba está marcado y el anticuerpo de referencia no está marcado.
Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia para la unión específica al antígeno si un exceso de un anticuerpo (por ejemplo, 1x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del otro anticuerpo, por ejemplo, en al menos un 50 %, un 75 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % según se mide en un ensayo de unión competitiva.
Se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se puede determinar que dos anticuerpos se unen a epítopos solapantes si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
II. Producción de anticuerpos
Los métodos para producir anticuerpos de la invención son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican las regiones variables de la cadena ligera y/o las regiones variables de la cadena pesada pueden sintetizarse químicamente utilizando la información de secuencias que se proporciona en este documento. Las moléculas de ADN sintético pueden ligarse a otras secuencias de nucleótidos apropiadas, incluyendo, por ejemplo, las secuencias de codificación de región constante, y las secuencias de control de expresión, para producir construcciones de expresión génica convencionales que codifican el anticuerpo deseado. La producción de constructos génicos definidos está dentro de la experiencia habitual en la materia. Como alternativa, las secuencias proporcionadas en el presente documento pueden clonarse a partir de hibridomas mediante técnicas de hibridación convencionales o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando sondas sintéticas de ácidos nucleicos cuyas secuencias se basan en la información de secuencias proporcionada en el presente documento, o información de secuencias de la técnica anterior con respecto a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos en las células de hibridoma.
Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos deseados pueden incorporarse (ligarse) en vectores de expresión, que pueden introducirse en células hospedadoras mediante técnicas de transfección o transformación convencionales. Las células hospedadoras ejemplares son células de E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y células de mieloma que de lo contrario no producen proteína IgG. Las células hospedadoras transformadas se pueden cultivar en condiciones que permitan a las células hospedadoras expresar los genes que codifican las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada de la inmunoglobulina.
Las condiciones específicas de expresión y purificación variarán dependiendo del sistema de expresión empleado. Por ejemplo, si un gen ha de expresarse en E. coli, primero se clona en un vector de expresión posicionando el gen diseñado por ingeniería a partir de un promotor bacteriano adecuado, por ejemplo, Trp o Tac, y una secuencia señal procariota. La proteína secretada expresada se acumula en cuerpos refractiles o de inclusión, y puede ser recogida después de la ruptura de las células por medio de una prensa francesa o sonicación. Los cuerpos refráctiles se solubilizan, y las proteínas se repliegan y escinden por métodos conocidos en la técnica.
Si el gen creado por ingeniería se expresa en células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, células CHO, primero se inserta en un vector de expresión que contiene un promotor eucariótico adecuado, una señal de secreción, una secuencia poli A y un codón de parada, y, opcionalmente, puede contener potenciadores y varios intrones. Este vector de expresión contiene opcionalmente secuencias que codifican toda o parte de una región constante, permitiendo que toda, o una parte de, una cadena pesada o ligera se exprese. La construcción génica puede introducirse en células hospedadoras eucariotas usando técnicas convencionales. Las células hospedadoras expresan fragmentos Vl o Vh , heterodímeros Vl-Vh , polipéptidos monocatenarios Vh-Vl o Vl-Vh , cadenas de inmunoglobulina pesadas o ligeras completas, o partes de las mismas, cada uno de los cuales puede estar unido a un resto que tiene otra función (por ejemplo, citotoxicidad). En algunas realizaciones, una célula hospedadora se transfecta con un solo vector que expresa un polipéptido que expresa toda, o parte de, una cadena pesada (por ejemplo, una región variable de la cadena pesada) o una cadena ligera (por ejemplo, una región variable de la cadena ligera). En otras realizaciones, una célula hospedadora se transfecta con un único vector que codifica (a) un polipéptido que comprende una región variable de la cadena pesada y un polipéptido que comprende una región variable de la cadena ligera, o (b) una cadena pesada de inmunoglobulina completa y una cadena ligera de inmunoglobulina completa. En otras realizaciones más, una célula hospedadora se cotransfecta con más de un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión que codifica un polipéptido que comprende toda, o parte de, una cadena pesada o región variable de la cadena pesada, y otro vector de expresión que codifica un polipéptido que comprende toda, o parte de, una cadena ligera o una región variable de la cadena ligera.
Un polipéptido que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o región variable de la cadena ligera puede producirse cultivando una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica dicha región variable, en condiciones que permitan la expresión del polipéptido. Después de la expresión, el polipéptido se puede recoger y purificar o aislar usando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, etiquetas de afinidad como las etiquetas de glutatión-S-transferasa (GST) y de histidina.
Un anticuerpo monoclonal que se une a Notch3 humana, o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, se puede producir cultivando una célula hospedadora transfectada con: (a) un vector de expresión que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina completa o parcial, y un vector de expresión separado que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina completa o parcial; o (b) un solo vector de expresión que codifica ambas cadenas (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras completas o parciales), en condiciones que permitan la expresión de ambas cadenas. El anticuerpo intacto (o el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo) puede recogerse y purificarse o aislarse usando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, Proteína A, Proteína G, etiquetas de afinidad como las etiquetas de glutatión-S-transferasa (GST) y de histidina. Un experto en la materia expresará la cadena pesada y la cadena ligera de un solo vector de expresión o de dos vectores de expresión separados.
III. Modificaciones de anticuerpos
Los métodos para reducir o eliminar la antigenicidad de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son conocidos en la técnica. Cuando se administran a un ser humano, los anticuerpos descritos preferiblemente están "humanizados" para reducir o eliminar la antigenicidad en seres humanos. Preferentemente, los anticuerpos humanizados tienen la misma, o sustancialmente la misma, afinidad por el antígeno que el anticuerpo de ratón no humanizado del que se derivó.
En un enfoque de humanización, se crean proteínas quiméricas en las que las regiones constantes de inmunoglobulina de ratón se reemplazan con regiones constantes de inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, Morrison et al., 1984, PROC. NAT. ACAD. SCI. 81:6851-6855, Neuberger et al., 1984, NATURE 312:604-608; las patentes de los EE.UU. n.° 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); y 4.816.567 (Cabilly).
En un enfoque conocido como injerto de CDR, las CDR de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se injertan en las regiones estructurales de otras especies. Por ejemplo, Las CDR murinas se pueden injertar en las FR humanas. En algunas realizaciones de la invención, las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti-Notch3 se injertan en las FR humanas o las FR humanas de consenso. Para crear FR humanas de consenso, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o ligera humana se alinean para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. El injerto de CDR se describe en las patentes de los EE.UU. n.27.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Carter); 5.693.762 (Queen); 5.859.205 (Adair); 5.693.761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536; y Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94.
En un enfoque llamado "SUPERHUMANIZATION™" las secuencias de CDR humanas se eligen de genes de la línea germinal humana, basándose en la similitud estructural de las CDR humanas con las del anticuerpo de ratón que se debe humanizar. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 6.881.557 (Foote); y Tan et al., 2002, J. IMMUNOL 169: 1119-1125.
Otros métodos para reducir la inmunogenicidad incluyen la "reconformación" "hiperquimerización" y "rechapado/rebarnizado". Véase, por ejemplo, Vaswami et al., 1998, ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81: 105; Roguska et al., 1996, PROT. ENGINEER 9:895-904; y la patente de los EE. UU. n.26.072.035 (Hardman). En el enfoque de rechapado/rebarnizado, los restos de aminoácidos accesibles en la superficie en el anticuerpo murino se reemplazan por los restos de aminoácidos que se encuentran con mayor frecuencia en las mismas posiciones en un anticuerpo humano. Este tipo de rebarnizado de anticuerpos se describe, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n.° 5.639.641 (Pedersen).
Otro enfoque para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para uso médico en seres humanos se conoce como tecnología ACTIVMAB™ (Vaccinex, Inc., Rochester, Nueva York), que involucra un vector basado en el virus vaccinia para expresar anticuerpos en células de mamíferos. Se dice que se producen altos niveles de diversidad combinatoria de cadenas pesadas y ligeras de IgG. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.° 6.706.477 (Zauderer); 6.800.442 (Zauderer); y 6.872.518 (Zauderer).
Otro enfoque para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para uso en serfes humanos es la tecnología practicada comercialmente por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Esta tecnología implica el uso de una biblioteca "aceptora" humana patentada para producir una biblioteca "enfocada en epítopo" para la selección de anticuerpos.
Otro enfoque para modificar un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para uso médico en seres humanos es la tecnología HUMAN ENGINEERING™, que se practica comercialmente por XOMA (US) LLC. Véase, por ejemplo, la publicación de PCT n.° WO 93/11794 y las patentes de los EE.UU. n.° 5.766.886 (Studnicka); 5.770.196 (Studnicka); 5.821.123 (Studnicka); y 5.869.619 (Studnicka).
Cualquier enfoque adecuado, incluyendo cualquiera de los enfoques anteriores, se puede usar para reducir o eliminar la inmunogenicidad humana de un anticuerpo de la invención.
El anticuerpo puede conjugarse con un resto efector tal como una toxina de molécula pequeña o un radionúclido usando las químicas de conjugación in vitro estándar. Si el resto efector es un polipéptido, El anticuerpo puede conjugarse químicamente al efector o unirse al efector como una proteína de fusión. La construcción de proteínas de fusión está dentro de la experiencia habitual en la materia.
IV. Uso de anticuerpos
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden diseñarse (por ejemplo, humanizarse) para su administración a seres humanos. Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar diversas formas de cáncer, por ejemplo, cánceres de mama, de ovario, de próstata, cervical, colorrectal, de pulmón, pancreático, gástrico, de cabeza y de cuello. Las células cancerosas se exponen a una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo para inhibir o reducir la proliferación de las células cancerosas. En algunas realizaciones, los anticuerpos inhiben la proliferación de células cancerosas en al menos un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 %.
En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados pueden inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral mediante la inhibición de la unión de Notch3 humana a un ligando, por ejemplo, Jag1, Jag2, DLL1 y DLL4. Los anticuerpos descritos se pueden usar para inhibir el crecimiento tumoral en un paciente humano. El uso comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo.
Los cánceres asociados con la sobreexpresión y/o activación de Notch3 incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer cerebral (por ejemplo, glioblastoma, astrocitoma, neuroblastoma), melanomas, cánceres gastrointestinales (por ejemplo, colorrectal, pancreático y gástrico), cáncer de cabeza y cuello, sarcomas (por ejemplo, rabdomiosarcoma, osteosarcoma) y cánceres de células hematopoyéticas, (por ejemplo, mieloma múltiple, leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de precursores T (T-ALL), leucemia linfoblástica aguda de precursores B (B-ALL) y la leucemia linfoblástica crónica de linfocitos B (B-CLL).
Tal como se utiliza en el presente documento, "tratar", "tratando" y "tratamiento" significan el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano. Esto incluye: (a) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la patología.
Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz de componente activo está en el intervalo de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por ejemplo, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg. La cantidad administrada dependerá de variables como el tipo y la extensión de la enfermedad o la indicación a tratar, la salud general del paciente, la potencia in vivo del anticuerpo, La formulación farmacéutica y la vía de administración. La dosis inicial se puede aumentar más allá del nivel superior para alcanzar rápidamente el nivel de sangre o tejido deseado. Como alternativa, la dosis inicial puede ser más pequeña que la óptima, y la dosis diaria puede incrementarse progresivamente durante el curso del tratamiento. La dosificación humana puede ser optimizada, por ejemplo, en un estudio de aumento escalonado de la dosis de Fase I diseñado para una prueba de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. La frecuencia de dosificación puede variar, dependiendo de factores como la vía de administración, la cantidad de dosis, la vida media sérica del anticuerpo y la enfermedad a tratar. Las frecuencias de dosificación de ejemplo son una vez por día, una vez por semana y una vez cada dos semanas. Una vía de administración preferida es parenteral, por ejemplo, infusión intravenosa. La formulación de fármacos basados en anticuerpos monoclonales está dentro de la experiencia habitual en la materia. En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal se liofiliza, y luego se reconstituye en solución salina tamponada, en el momento de la administración.
Para uso terapéutico, un anticuerpo preferiblemente se combina con un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" significa tampones, portadores y excipientes adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. El vehículo o vehículos debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible(s) con los ingredientes de la formulación y no ser perjudicial(es) para el receptor de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen tampones, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos descritos en el presente documento pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método adecuado. Una composición farmacéutica se formula típicamente para que sea compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración son la administración por vía intravenosa (IV), intradérmica, por inhalación, transdérmica, tópica, transmucosa y rectal. Una vía de administración preferida para anticuerpos monoclonales es la infusión IV. Las formulaciones útiles se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, véase Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, 1990). Los componentes de formulación adecuados para la administración parenteral incluyen un diluyente estéril, como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como EDTA; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa.
Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen suero salino fisiológico, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o suero salino tamponado con fosfato (PBS). El vehículo debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse contra los microorganismos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos.
Las formulaciones farmacéuticas son preferiblemente estériles. La esterilización se puede realizar por cualquier método adecuado, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización por filtración puede realizarse antes o después de la liofilización y la reconstitución.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o el contenido de la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1: Producción de anticuerpos monoclonales anti-hNotch3
Las inmunizaciones, las fusiones y las pantallas primarias se realizaron utilizando métodos convencionales siguiendo el protocolo de sitios múltiples de inmunización repetitiva (RIMMS). Cinco ratones AJ y cinco ratones Balb/c se inmunizaron con una proteína que contenía los aminoácidos 1 -428 de Notch3 humana fusionados a la porción Fc de la IgG humana. Además, se inmunizaron cinco ratones AJ y cinco Balb/c con una proteína concatemérica que contiene dos repeticiones de la región de Notch3 que comprende los dominios 9-12 de tipo EGF. De cada estrategia de inmunización, se seleccionaron dos ratones AJ y 2 ratones Balb/c que tenían sueros que mostraban una alta unión al inmunógeno mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la fusión posterior. Se recogieron los bazos y los ganglios linfáticos de los ratones seleccionados. Las células B se recogieron y fusionaron con una línea de mieloma. Los productos de fusión de los ratones AJ y ratones Balb/c se diluyeron en serie en cuarenta placas de 96 pocillos hasta casi la clonalidad. Se seleccionaron un total de 5.280 sobrenadantes de las fusiones celulares para determinar su unión a Notch3 humana en la superficie de las células CHO, utilizando un ensayo de electroquimioluminiscencia de mesoescala (MSD). En total, se identificaron cuatrocientos veinte sobrenadantes que se unieron a Notch3 humana en este ensayo a partir de las fusiones AJ y Balb/c. Estos productos de fusión se caracterizaron además por ensayos bioquímicos y celulares in vitro, como se analiza a continuación. Se seleccionó un panel de hibridomas, los hibridomas se subclonaron y los hibridomas monoclonales se expandieron. Los anticuerpos se expresaron a partir de las líneas celulares del hibridoma y se purificaron mediante cromatografía de afinidad en resina de Proteína G en condiciones estándar.
Ejemplo 2: Análisis de secuencias de anticuerpos monoclonales anti-Notch3
El isotipo de cadena ligera y el isotipo de cadena pesada del anticuerpo monoclonal, 4F11, en el Ejemplo 1 se determinó usando el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip ™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Se determinó que el anticuerpo era una cadena ligera kappa y una cadena pesada de IgG 1.
Las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal de ratón se secuenciaron utilizando RACE (Amplificación rápida de extremos de ADNc) en 5'. El ARN total se extrajo de la línea celular de hibridoma usando el kit RNeasy Miniprep según las instrucciones del vendedor (Qiagen, Valencia, CA). El ADNc de primera hebra de longitud completa que contiene extremos 5' se generó usando el kit de amplificación de ADNc SMARTer™ RACE (Clontech, Mountain View, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando cebadores aleatorios para RACE en 5'.
Las regiones variables de las cadenas ligera (kappa) y pesada (IgGl) se amplificaron por PCR, utilizando KOD Hot Start Polymerase (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la amplificación de los extremos del ADNc en 5' junto con el kit de amplificación de ADNc SMARTer™ RACE, el cebador Universal Primer Mix A (Clontech), una mezcla de 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3' (SEQ ID NO: 13) y 5' CTAATACGACTCACTATAGGGC 3' (SEQ ID NO: 17), se usó como cebador 5'. La región variable de la cadena pesada se amplificó utilizando los cebadores 5' anteriores y un cebador específico de la región constante de IgG1 3', 5' TATGCAAGGCTTACAACCACA 3' (SEQ ID NO: 18). La región variable de la cadena kappa se amplificó con los cebadores 5' anteriores y un cebador específico de la región constante kappa 3', 5' CGACTGAGGCACCTCCAGATGTT 3' (SEQ ID NO: 19).
Los productos de la PCR individuales se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron utilizando el kit Qiaquick Gel Purification de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los productos de la PCR se clonaron posteriormente en el pCR®4Blunt utilizando el kit Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) y se transformaron en bacterias DH5-a (Invitrogen) mediante técnicas estándar de biología molecular. El ADN plasmídico aislado de clones bacterianos transformados se secuenció utilizando los cebadores M13 Directo (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') (SEQ ID NO: 21) y M13 Inverso (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3') (SEQ ID NO: 30) de Beckman Genomics (Danvers, MA), utilizando métodos de secuenciación de ADN didesoxi estándar para identificar la secuencia de las secuencias de la región variable. Las secuencias se analizaron utilizando el software Vector NTI (Invitrogen) y el servidor web IMGT/V-Quest (http://imgt.cines.fr) para identificar y confirmar las secuencias de las regiones variables.
A continuación, se resumen las secuencias de ácidos nucleicos que codifican y las secuencias de proteínas que definen las regiones variables de los anticuerpos monoclonales murinos (no se muestran las secuencias de péptidos señal amino terminales). Las secuencias de CDR (definición de Kabat) se muestran en negrita y están subrayadas en las secuencias de aminoácidos.
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 4F11 (SEQ ID NO: 1)
i gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 61 tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 121 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtcgtg gtggtggtag cacctactat 181 ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 241 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgg aagacatgct 301 actacggcct actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 4F11 (SEQ ID NO: 2)
1 evqlvesggg lvkpggslkl scaasgfafs sydmswvrqt pekrlewva^ isrqqqstyy
61 pdtvkqrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycgrha ttaywyfdvw gagttvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena Kappa del anticuerpo 4F11 (SEQ ID NO: 3)
1 gatgttgtgatgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
61 atctcttgcagatctagtca gagccttgta cacactaatg gcaacaccta tttacattgg
121 tacctgcagaagccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt
181 tctggggtcccagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
241 agcagagtggaggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg
301 tggacgttcggtggaggcac caagctggaa atcaaa
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena Kappa del anticuerpo 4F11 (SEQ ID NO: 4)
1 dvvmtqtpls lpvslgdqas iscrssqslv htnqntylhw ylqkpgqspk lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yfcsqsthvp vrtfgggtkle ik
1 dvvmtqtpls lpvslgdqas iscrssqslvhtngntylhw ylqkpgqspk lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgvyfcsqsthvp wtfgggtkle ik
La Tabla 1 es un gráfico de concordancia que muestra la SEQ ID NO. de cada secuencia descrita en este Ejemplo.
Tabla 1
Figure imgf000019_0002
Las secuencias de CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón (Kabat, Chothia y definiciones de IMGT) para 4F11 se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000019_0001
___________________
continuación
Figure imgf000020_0001
Las secuencias de CDR de cadena ligera kappa de anticuerpos monoclonales de ratón (Kabat, Chothia y definiciones de IMGT) para 4F11 se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000020_0002
Para crear las secuencias completas de anticuerpos de cadena pesada o kappa, cada secuencia variable anterior se combina con su respectiva región constante. Por ejemplo, una cadena pesada completa comprende una secuencia variable pesada seguida de la secuencia constante de la cadena pesada de IgG1 murina, y una cadena kappa completa comprende una secuencia variable kappa seguida de la secuencia constante de la cadena ligera kappa murina.
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG1 murina (SEQ ID NO: 22)
1 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 61 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc
121 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac
181 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc
241 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg
301 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc
361 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg
421 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag
481 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc
541 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc
601 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg
661 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc
721 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg
781 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct
841 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc
901 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac
961 tctcctggta aa
Secuencia de proteínas que define la región constante de la cadena pesada de IgG1 murina (SEQ ID NO: 23)
1 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd
61 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif
121 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv
181 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv
241 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf
301 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de la cadena ligera Kappa murina (SEQ ID NO: 24)
i cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct
61 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 121 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 181 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 241 cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 301 agcttcaaca ggaatgagtg t
Secuencia de proteínas que define la región constante de la cadena ligera kappa murina (SEQ ID NO: 25)
1 radaaptvsi fppsseqlts ggasvvcfln nfypkdinvk wkidgserqn gvlnswtdqd
61 skdstysmss tltltkdeye rhnsytceat hktstspivk sfnrnec
Las siguientes secuencias representan las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa reales o contempladas (es decir, que contienen las secuencias de las regiones variable y constante) para el anticuerpo 4F11 descrito en este Ejemplo. Las secuencias señal para la secreción adecuada de los anticuerpos (por ejemplo, secuencias señal en el extremo 5' de las secuencias de ADN o el extremo amino terminal de las secuencias de proteínas) no se muestran en las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa descritas en el presente documento y no están incluidas en la proteína secretada final. Tampoco se muestran los codones de parada para la terminación de la traducción requerida en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Un experto habitual en la materia seleccionará una secuencia señal y/o un codón de parada para la expresión de las secuencias de cadena pesada y ligera de IgG de longitud completa descritas. También se contempla que las secuencias de la región variable pueden ligarse a otras secuencias de la región constante para producir cadenas pesadas y ligeras de IgG de longitud completa activas.
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de cadena pesada de longitud completa (región variable de la cadena pesada y región constante de IgG1)) de 4F11 (SEQ ID NO: 26)
1 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
61 tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agctatgaca tgtcttgggt tcgccagact
121 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtcgtg gtggtggtag cacctactat
181 ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac
241 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgg aagacatgct
301 actacggcct actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca
361 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac
421 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc
481 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac
541 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc
601 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg
661 gattgtggttgtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc
721 cccccaaagcccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg
781 gtagacatcagcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag
841 gtgcacacagctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc
901 agtgaacttcccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc
961 aacagtgcagctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 1021 aaggctccacaggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 1081 agtctgacctgcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 1141 aatgggcagccagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 1201 tacttcgtctacagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 1261 acctgctctgtgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 1321 tctcctggta aa
Secuencia de proteínas que define la secuencia de cadena pesada de longitud completa (región variable de la cadena pesada y región constante de IgG 1) de 4F11 (SEQ ID NO: 27)
i evqlvesggg lvkpggslkl scaasgfafs sydmswvrqt pekrlewvay isrgggstyy
61 pdtvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycgrha ttaywyfdvw gagttvtvss 121 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 181 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvf if 241 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 301 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de la cadena ligera de longitud completa (región variable y región constante de la cadena Kappa) de 4F11 (SEQ ID NO: 28)
1 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 61 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacactaatg gcaacaccta tttacattgg
121 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt
181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg
301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta
361 tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc
421 ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga
481 caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg
541 agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag
601 gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgt
Secuencia de proteínas que define la secuencia de la cadena ligera de longitud completa (región variable y región constante de la cadena Kappa) de 4F11 (SEQ ID NO: 29)
1 dvvmtqtpls lpvslgdqas iscrssqslv htngntylhw ylqkpgqspk lliykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yfcsqsthvp wtfgggtkle ikradaaptv
121 sifppsseql tsggasvvcf lnnfypkdin vkwkidgser qngvlnswtd qdskdstysm
181 sstltltkde yerhnsytce athktstspi vksfnrnec
La Tabla 4 es un gráfico de concordancia que muestra la correspondencia entre las secuencias de longitud completa de los anticuerpos analizados en este Ejemplo con los presentados en el Listado de secuencias.
Tabla 4
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 3: Afinidades de unión
La afinidad de unión y la cinética de la unión del anticuerpo 4F11 a la proteína de fusión Fc (rhNotch3-Fc (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)) del dominio extracelular de Notch3 humano recombinante (que contiene los dominios 1-11 de tipo EGF) se midieron por resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento Biacore® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Se inmovilizaron anti-IgG de ratón de conejo (GE Healthcare) en chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina, según un protocolo estándar. Los análisis se realizaron a 25 °C y 37 0C utilizando PBS que contiene 0,05 % de tensioactivo P20 como tampón de ejecución. El anticuerpo se capturó en células de flujo individuales a una velocidad de flujo de 10 pl/minuto. El tiempo de inyección se varió para cada anticuerpo para producir una Rmax entre 30 y 60 unidades de resonancia (RU). El tampón o rhNotch3-Fc diluido en tampón de ejecución se inyectó secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a probar) durante 240 segundos a 60 pl/minuto. La fase de disociación fue controlada durante hasta 1500 segundos. A continuación, la superficie se regeneró con dos inyecciones de 60 segundos de glicina-HCl 10 mM, pH 2,25, a un caudal de 30 pl/minuto. El rango de concentración de rhNotch3-Fc analizado fue de 100 nM a 3,125 nM (dilución 2 veces).
Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando la función cinética del software BIAevaluation (GE Healthcare) con doble resta de referencia. Se determinaron los parámetros cinéticos para el anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y Kd (constante de disociación de equilibrio). Los valores cinéticos del anticuerpo monoclonal 4F11 en rhNotch3-Fc a 25 0C y 37 0C se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000023_0001
Los datos en la Tabla 5 demuestran que el anticuerpo 4F11 se une a rhNotch3-Fc con una Kd de aproximadamente 1 nM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM o 200 pM o menos.
La unión a Notch3 humana de la superficie celular por el anticuerpo 4F11 se midió a 4 °C, utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). CHO N3 (células Flp-In-CHO (Invitrogen) transfectadas de forma estable con Notch3 humana), Las células HCC2429 y las células RL-952 que expresan Notch3 humana se lavaron una vez con PBS que contenía cloruro de calcio y cloruro de magnesio (Invitrogen) y se recogieron usando un tampón de disociación celular (Invitrogen). Las células se lavaron por segunda vez con PBS y se volvieron a suspender en tampón FACS (PBS con BSA (Sigma-Aldrich) al 0,5 % para una concentración celular final de 250.000 células por pocillo en una placa con fondo en V de 96 pocillos. Los anticuerpos purificados se diluyeron en tampón FACS en un intervalo de concentración de 100 nM a 0,1 nM. Las células se incubaron a 4 0C con 100 pl de anticuerpo durante una hora, se lavaron con tampón FACS dos veces y se volvieron a suspender en 100 pl de anticuerpo conjugado con PE de cabra antirratón (Jackson Immuno Research). Las células se incubaron a 4 0C durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron una vez con tampón FACS y luego se analizaron con un instrumento Beckman Coulter Cytomics FC 500. La media geométrica de la intensidad fluorescente se calculó luego para cada concentración de anticuerpo. Estos valores se introdujeron en el software Prism (GraphPad, La Jolla, Ca) y se utilizaron para generar una curva de unión mediante el trazado de la media geométrica frente a la concentración de anticuerpos. De la curva de unión, se usó la siguiente ecuación para calcular el intervalo Kd y Kd de unión del 4F11 a Notch3 humana en la superficie celular de las tres líneas celulares.
Ecuación: Un sitio de unión (hipérbola)
Y=Bmax*X/(KD +X)
*describe la unión de un ligando a un receptor que sigue la ley de la acción de masas. Dmax es la unión máxima, y Kd es la concentración de ligando requerida para alcanzar la mitad de la unión máxima.
Los resultados se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6
Figure imgf000023_0002
Los resultados en la Tabla 6 demuestran que el anticuerpo 4F11 se une a la superficie celular Notch3 con una Kd de aproximadamente 1 nM, 750 pM, 650 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM o 200 pM o menos.
Ejemplo 4: Especificidad de unión
El anticuerpo 4F11 se ensayó para determinar su unión a las proteínas Notch 1 humana, Notch2 humana, o Notch3 humana. Las mediciones de unión se realizaron mediante interferometría de biocapa (BLI), utilizando un instrumento ForteBio Octet® QK (ForteBio, Menlo Park, CA). Los sensores anti-Fc humanos se empaparon en PBS que contenía 1 mg/ml de BSA durante cinco minutos antes de la unión de los anticuerpos. A continuación, se permitió que las siguientes proteínas (400 nM, en PBS que contenía 1 mg/ml de BSA) se unieran a los sensores: rhNotch1-Fc (R&D Systems, Mineápolis, MN; n.° de cat. 3647-TK-050), rhNotch2-Fc (R&D n.° de cat. 3735-NT-050), rhNotch3-Fc (r&D n.° de cat. 1559-NT-050), o rmNotch3-Fc (R&D n.° de cat. 1308-NT-050). Los sensores unidos a la proteína Notch se sumergieron en una solución de anticuerpo (50 pg/ml) para permitir la unión del anticuerpo a la proteína Notch. La unión se detectó por cambios en el patrón de interferencia. Estos resultados demostraron que los anticuerpos se unen específicamente a la proteína Notch3 humana, pero no se unen a la proteína Notch2 humana o Notch1 humana (Figura 4).
Se produjeron líneas celulares estables que expresan receptores Notch transfectando células CHO FlpIn™ o 293 FlpIn™ (Life Technologies, Grand Island, NY) con ADNc de longitud completa de Notchl humana, Notch2, Notch3 o Notch4 se clonaron en el vector pcDNA5FRT utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células CHO se dividieron en medio F12 que contenía FBS al 10 %, 2 mM de L-glutamina y 700 pg/ml de higromicina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para seleccionar las células transfectadas. 293 células se dividieron en medios DMEM que contenían FBS al 10 %, 2 mM de L-glutamina y 200 pg/ml de higromicina B. La expresión de los receptores Notch se confirmó mediante análisis FACS utilizando PE anti-Notch1 humana (BioLegend, San Diego, CA), PE anti-Notch2 (eBioscience, San Diego, CA), o PE anti-Notch3 humana (BioLegend, San Diego, CA).
Para determinar la especificidad de la unión a las proteínas Notch de la superficie celular, el anticuerpo 4F11 se ensayó para determinar su unión a Notchl humana, Notch2 humana, Notch3 humana y Notch4 humana expresadas en la superficie de las células CHO mediante electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery). También se produjo una línea CHO que carece de cualquier proteína Notch humana para su uso como control negativo. Las células se cultivaron en condiciones estándar (37 0C, F12 FBS al 10 %). Para estudios de unión, las células se lavaron en PBS que contenía calcio y magnesio, y se retiraron de la placa mediante tratamiento con tampón de disociación celular (Life Technologies) durante diez minutos a 37 °C.
Las células se sembraron a una densidad de 30.000 células por pocillo, en medios de hibridoma, en placas de unión estándar de 96 pocillos (Meso Scale Discovery, n° de cat. L15XA-6). Las células se incubaron durante una hora a 37 °C. Se agregaron anticuerpos o IgG de control a 5 pg/ml, en medios de hibridoma de 50 pl, y se incubaron durante una hora a 37 0C. Las placas se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 3 %. La unión de los anticuerpos a la superficie celular se detectó utilizando 2 pg/ml de anticuerpo secundario de ratón anti-IgG de MSD (Meso Scale Discovery, n.° de cat. R32AC-1) durante una hora a 4 0C. Las placas se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 3 % y se añadieron 150 pl de tampón de lectura (Meso Scale Discovery, n.° de Cat. R92TC-1). Las placas se analizaron en un instrumento Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Este análisis demostró que el anticuerpo 4F11 se une a Notch3 humana mostrada en las superficies de las células, pero no se une a Notch1, Notch2, o Notch4 humanas mostradas en las superficies de las células. El anticuerpo 4F11 tampoco se une a las células CHO-EV (vector vacío) que expresan las proteínas Notch de hámster endógenas. Estos resultados indican que el anticuerpo 4F11 se une específicamente a la proteína Notch3 humana mostrada en una superficie celular in vitro. Ejemplo 5: Inhibición de la unión de Notch3-ligando
El anticuerpo 4F11 fue ensayado por su capacidad para inhibir la unión de rhNotch3 a Jag1 humano, Jag2, DLL1 y DLL4. Las mediciones de unión se realizaron mediante interferometría de biocapa (BLI), utilizando un instrumento ForteBio Octet® QK (ForteBio, Menlo Park, CA). Los ligandos ensayados fueron rhJagl-Fc (R&D n.° de Cat. 1277-JG-050), rhJag2-Fc (R&D N.2 de Cat. 1726-JG-050), rhDLLl-Fc (R&D n.2 de Cat. 5026-DL-050), y su etiqueta rhDLL4 (R&D n.2 de Cat. 1506-D4-050).
Para determinar el grado de inhibición de la unión del ligando Notch3 por el anticuerpo 4F11, los sensores Octet se cargaron con Notch3 humana recombinante y se permitió que el anticuerpo se uniera, como se describe en el Ejemplo 4. En muestras de control positivas, se usó un anticuerpo policlonal Notch3 disponible comercialmente, capaz de bloquear la unión del ligando a Notch3 humana recombinante (control específico de Notch3) en lugar del anticuerpo 4F11. Luego, los sensores se sumergieron en 500 pg/ml de IgG humana, para bloquear la unión no específica. Los ligandos se prepararon a una concentración de 400 nM en PBS que contenía BSA al 3 %, y se dejaron unir. La velocidad de activación y la velocidad de desactivación para la unión del ligando se detectaron utilizando el instrumento y el software Octet QK. El anticuerpo 4F11 bloqueó la unión de los cuatro ligandos a rhNotch3-Fc (Figura 5A - 5D).
Ejemplo 6: Inhibición de la escisión de ICD de Notch3 inducida por ligando
La activación de los receptores Notch da como resultado la escisión del dominio intracelular de Notch (NICD), el cual puede ser detectado por transferencia de Western. Se ensayó el efecto del anticuerpo 4F11 en la activación de la escisión de ICD de Notch3.
Para crear ligandos solubles de Notch, se usó la PCR para amplificar las secuencias correspondientes a los dominios extracelulares del ADNc de Jag1 humano o Jag2 humano y fusionarlas en marco con la secuencia codificante de Fc de IgG humana. Esta construcción se subclonó a continuación en el vector de expresión pEE14.4 (Lonza), se transfectó en células CHOK1SV y se seleccionó para producir líneas celulares estables que secretan la proteína de fusión hJagl-hFc o hJag2-hFc. Se recubrieron las placas Immunosorp ELISA de 96 pocillos (Nalgene Nunc, Rochester, NY) con 5 pg/ml de anti-Fc humano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) durante la noche a 4 °C. Después de lavar los pocillos con PBS/BSA al 0,5 %, se añadieron 5 pg/ml de proteína de fusión hJagl-hFc soluble y se dejó unir a temperatura ambiente durante dos horas. La proteína no unida se eliminó lavando con PBS/BSA al 0,5 %. Las células 293 FlpIn™ diseñadas para expresar hNotch3 (como se describe en el Ejemplo 4) se colocaron en placas en el ligando Jagl-hFc o hFc en presencia de 10 pg/ml de anticuerpo de control 4F11 o mIgG. Las células se lisaron 24 horas después en tampón RIPA (Boston BioProducts, Ashland, MA) que contenía inhibidores de proteasa. La inducción de NICD escindida se detectó explorando la transferencia con un anticuerpo Notch3 contra el extremo C (Cell Signaling, Danvers, MA) que detecta tanto la proteína de longitud completa como el ICD escindido. La activación inducida por ligando y la escisión de ICD de Notch3 fueron inhibidas por el anticuerpo 4F11.
Ejemplo 7: Inhibición de la transcripción dependiente de Notch3
Las líneas celulares indicadoras dependientes de Notch3 se produjeron mediante la introducción lentivírica de un gen indicador de luciferasa dependiente de RBP-Jk (SABiosciences, Frederick, MD) en las células 293-FlpIn de Notch3, células de cáncer de endometrio RL95-2, células de cáncer de mama HCC1143 y células de cáncer de mama MDA-MB-468. Para activar la señalización y transcripción dependiente de Notch3, las células se colocaron en placas recubiertas con ligando preparadas como se describe en el Ejemplo 6. Las células se preincubaron con una serie de dilución de 3 veces de concentraciones de anticuerpo Notch3 que oscilan entre 0 y 300 pg/ml, durante una hora a 37 0C, antes de sembrar 100 pl de la suspensión en placas de 96 pocillos recubiertas con ligando o hFc. Las células se incubaron en pocillos recubiertos con ligando o con Fc humano durante cuatro o veinticuatro horas a 37 0C, en CÜ2al 5 %. A continuación, 100 pl de Promega Bright Glo™ (Promega, Madison, WI) se añadieron a cada pocillo. Se dejó que la reacción transcurriera durante cinco minutos en la oscuridad, y a continuación todo el volumen de 200 pl se transfirió a placas de paredes blancas y se leyó con un luminómetro. Los anticuerpos policlonales contra Notch1 (AF1057, R&D Systems), Notch2 (AF1190, R&D Systems) o Notch3 (AF1559, R&D Systems) se usaron como controles para confirmar que la actividad indicadora estimulada por ligando en cada línea celular dependía específicamente del receptor Notch introducido. Como se muestra en la Figura 6A, el anticuerpo 4F11 de Notch3 inhibió la transcripción dependiente de Notch3 estimulada por el ligando Jag2. La activación de la transcripción dependiente de Notch3 por cada uno de los ligandos Jag1, Jag2, DLL1, y DLL4 también fue inhibida por el anticuerpo 4F11 de Notch3 (Figura 6B y Tabla 7).
Tabla 7
Figure imgf000025_0002
Ejemplo 8: Humanización de anticuerpos anti-Notch3
Este ejemplo describe la humanización y quimerización del anticuerpo 4F11 anti-Notch3 humano, y la caracterización de los anticuerpos humanizados resultantes. Los anticuerpos anti-Notch3 humanizados fueron diseñados, la afinidad maduró mediante mutagénesis por CDR dirigida, y se optimizó usando métodos conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácidos se convirtieron en secuencias de ADN optimizadas en codones y se sintetizaron para incluir (en el siguiente orden): sitio de restricción HindIII en 5', secuencia de consenso Kozak, secuencia señal amino terminal, región variable humanizada, región constante de IgG 1 o Kappa humana, codón de parada, y un sitio de restricción EcoRI en 3'.
También se construyeron cadenas quiméricas (región variable murina y región constante humana) de 4F11 pesadas (IgG 1 humana) y ligeras (Kappa humana). Para generar anticuerpos quiméricos, las regiones variables murinas se fusionaron con la región constante humana, y se sintetizaron secuencias de ADN optimizadas con codones, Incluyendo (en el siguiente orden): sitio de restricción HindIII en 5', secuencia de consenso Kozak, secuencia señal amino terminal, región variable de ratón, región constante de IgG1 o Kappa humana, codón de parada y sitio de restricción EcoRI en 3'.
Las cadenas pesadas humanizadas y quiméricas se subclonaron en pEE6.4 (Lonza, Basilea, Suiza) a través de los sitios HindIII y EcoRI utilizando la clonación por PCR In-Fusion™ (Clontech, Mountain View, CA). Las cadenas ligeras de Kappa humanizadas y quiméricas se subclonaron en pEE14.4 (Lonza) a través de los sitios HindIII y EcoRI usando la clonación de PCR In-Fusion™.
Las cadenas de anticuerpos humanizados o las cadenas de anticuerpos quiméricos se transfectaron transitoriamente en células 293T para producir anticuerpos. El anticuerpo se purificó o se usó en el sobrenadante de medios de cultivo celular para su posterior análisis in vitro. La unión de los anticuerpos quiméricos y humanizados a Notch3 se midió como se describe a continuación. Los resultados se resumen en las Tablas 14-16.
Combinaciones ejemplares de las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina y de cadena ligera de inmunoglobulina de 4F11 quimérico o humanizado se exponen a continuación en la Tabla 8.
Tabla 8
Figure imgf000025_0001
continuación
Figure imgf000026_0001
Las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de proteínas codificadas que definen las regiones variables de los anticuerpos 4F11 quiméricos y humanizados se resumen a continuación (no se muestran las secuencias de péptidos señal amino terminales). Las secuencias de CDR (definición de Kabat) se muestran en negrita y están subrayadas en las secuencias de aminoácidos.
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada quimérica Ch4F11 (SEQ ID NO: 31)
1 gaggtacagc ttgtcgagtcgggaggagga ttggtaaaac cgggtgggtc actcaaattg
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatttgcgttttcg tcgtatgata tgtcgtgggt gcgccagacg
121 ccggaaaaac gattggaatgggtcgcgtat atctcccgag ggggaggttc gacatactat
181 cccgacacgg tcaaagggcgcttcacgatt tcacgggaca atgcgaaaaa cacgctttat
241 cttcaaatgt cgtcgttgaaatcggaagat accgcgatgt attactgcgg gaggcatgcg
301 acgacggcgt attggtatttcgatgtgtgg ggagccggaa cgacggtgac ggtgtcgtcg
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada quimérica Ch4F11 (SEQ ID NO: 2)
1 evqlvesggg lvkpggslkl scaasgfafs sydmswvrgt pekrlewva^ isrqqqstyy
61 pdtvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycgrha ttaywyfdvw gagttvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 (SEQ ID NO: 33)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt cgcgttttca tcgtatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca
121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac
181 ccggatacgg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat
241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg
301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 (SEQ ID NO: 34)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgfafs sydmswvrqa pgkglewvsy isrqqqstyy
61 pdtvkqrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (SEQ ID NO: 35)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt caccttttca cactatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca
121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac
181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat
241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg
301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (SEQ ID NO: 36)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs hydmswvrqa pgkglewvs^ isrqqqstyy
61 pdsvkqrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (SEQ ID NO: 37)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt cgcgttttca cactatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca
121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac
181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat
241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg
301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (SEQ ID NO: 38)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgfafs hydmswvrqa pgkglewvsy isrqqqstyy
61 pdsvkqrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S (SEQ ID NO: 39)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt caccttttca aactatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca
121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac 181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat 241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg 301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S (SEQ ID NO: 40)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs nydmswvrqa pgkglewvsy isrqqqstyy 61 pdsvkqrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (SEQ ID NO: 41)
1 gaagtacagttgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt 61 tcgtgtgcggcgtcgggatt caccttttca tcgtatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca 121 ccggggaaagggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac 181 ccggattccgtgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat 241 cttcagatgaactcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg 301 acgacggcgtattggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena pesada Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (SEQ ID NO: 42)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs sydmswvrqa pgkglewvs^ isrgggstyy
61 pdsvkqrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena kappa quimérica Ch4F11 (SEQ ID NO: 32)
1 gacgtggtaa tgacgcagac gccgttgtcc cttcctgtct cgctcggaga tcaggcgtcg 61 atctcgtgta gaagctcgca gtcactcgtc cataccaacg ggaatacata tcttcactgg 121 tatttgcaaa agcccggaca gtcaccgaag ctcttgatct acaaagtatc caatcggttt 181 tcgggggtgc ccgaccgatt ctcgggatcg ggttcgggga cggattttac gttgaagatt 241 tcgcgggtgg aagcggagga tctcggtgtc tacttttgtt cgcagtcaac gcatgtcccg 301 tggacgttcg gaggcgggac aaaacttgag atcaag
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena kappa quimérica Ch4F11 (SEQ ID NO: 4)
1 dvvmtqtpls lpvslgdqas iscrssqslv htngntylhw ylqkpgqspk lliykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yfcsqsthvp vrtfgggtkle ik
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 (SEQ ID NO: 43)
1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca
61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacaaacg gtaatacgta tctccattgg
121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt 181 tcgggggtgc cggatcggtt ctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt 241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc 301 tggacgtttg ggcaggggac gaaggtggaa atcaag
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 (SEQ ID NO: 44)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv htngntylhw ylqkpgqspq lliykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp vrtfgqgtkve ik
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (SEQ ID NO: 45)
1 gatgtagtca tgacccaaacgccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca 61 atctcgtgtc ggtcatcgcagtcgttggta cacacacacg gtaatacgta tctccattgg 121 tatctccaga agcccggccagtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt 181 tcgggggtgc cggatcggttctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt 241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc 301 tggacgtttg ggcaggggacgaaggtggaa atcaag
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (SEQ ID NO: 46)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv hthgntylhw ylqkpgqspq 11iykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp vrtfgqgtkve ik
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (SEQ ID NO: 47)
1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca
61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacacaag gtaatacgta tctccattgg
121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt
181 tcgggggtgc cggatcggtt ctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt
241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc
301 tggacgtttg ggcaggggac gaaggtggaa atcaag
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (SEQ ID NO: 48)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv htqqntylhw ylqkpgqspq 11iykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp vrtfgqgtkve ik
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (SEQ ID NO: 49)
1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca
61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacatacg gtaatacgta tctccattgg
121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt
181 tcgggggtgc cggatcggtt ctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt
241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc
301 tggacgtttg ggcaggggac gaaggtggaa atcaag
Secuencia de proteínas que define la región variable de la cadena Kappa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (SEQ ID NO: 50)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv htyqntylhw ylqkpgqspq 11iykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp vrtfgqgtkve ik
Las secuencias de aminoácidos que definen las regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina para los anticuerpos producidos en el Ejemplo 8 se alinean en Figura 7. No se muestran las secuencias de péptidos señal amino terminales (para la expresión/secreción adecuada). CDR1, CDR2 y CDR3 (Definición de kabat) se identifican mediante recuadros. La Figura 8 muestra una alineación de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 separadas para cada una de las secuencias de la región variable mostradas en la Figura 7.
Las secuencias de aminoácidos que definen las regiones variables de la cadena ligera de inmunoglobulina para los anticuerpos en el Ejemplo 8 se alinean en la Figura 9. No se muestran las secuencias de péptidos señal amino terminales (para la expresión/secreción adecuada). CDR1, CDR2 y CDR3 se identifican mediante recuadros. La Figura 10 muestra una alineación de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 separadas para cada una de las secuencias de la región variable mostradas en Figura 9.
La Tabla 9 es un gráfico de concordancia que muestra la SEQ ID NO. de cada secuencia discutida en este Ejemplo.
Tabla 9
Figure imgf000029_0001
Continuación
Figure imgf000030_0001
Secuencias CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humanizado (Kabat, Chothia, y las definiciones de IMGT) se muestran en Tabla 10.
Tabla 10
Figure imgf000031_0001
Secuencias de CDR de cadena ligera Kappa de anticuerpo monoclonal humanizado (Kabat, Chothia, y las definiciones de IMGT) se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11
Figure imgf000032_0001
Para crear las secuencias de anticuerpos de cadena pesada o kappa quiméricas y humanizadas completas, cada secuencia variable anterior se combina con su región constante humana respectiva. Por ejemplo, una cadena pesada completa comprende una secuencia variable pesada seguida de una secuencia constante de cadena pesada de IgG1 humana. Una cadena kappa completa comprende una secuencia variable kappa seguida de la secuencia constante de la cadena ligera kappa humana.
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 68)
1 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg 61 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc 121 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct 181 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc 241 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 301 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 361 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 421 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 481 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 541 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 601 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 661 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 721 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 781 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 841 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 901 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 961 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la región constante de la cadena pesada de IgG 1 humana (SEQ ID NO: 69)
1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhytqkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de la cadena ligera kappa humana (versión 1) (SEQ ID NO: 70)
1 cgcacagttg ctgcccccag cgtgttcatt ttcccaccta gcgatgagca gctgaaaagc 61 ggtactgcct ctgtcgtatg cttgctcaac aacttttacc cacgtgaggc taaggtgcag 121 tggaaagtgg ataatgcact tcaatctgga aacagtcaag agtccgtgac agaacaggac 181 agcaaagact caacttattc actctcttcc accctgactc tgtccaaggc agactatgaa 241 aaacacaagg tatacgcctg cgaggttaca caccagggtt tgtctagtcc tgtcaccaag 301 tccttcaata ggggcgaatg t
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante de la cadena ligera kappa humana (versión 2) (SEQ ID NO: 71)
1 cgcacagttg cagcccccag cgtgttcatt ttcccaccta gcgatgagca gctgaaaagc 61 ggtactgcct ctgtcgtatg cttgctcaac aacttttacc cacgtgaggc taaggtgcag 121 tggaaagtgg ataatgcact tcaatctgga aacagtcaag agtccgtgac agaacaggac 181 agcaaagact caacttattc actctcttcc accctgactc tgtccaaggc agactatgaa 241 aaacacaagg tatacgcctg cgaggttaca caccagggtt tgtctagtcc tgtcaccaag 301 tccttcaata ggggcgaatg t
Secuencia de proteínas que define la región constante de la cadena ligera kappa humana (las versiones 1 y 2 de ácidos nucleicos codifican la misma secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 72)
1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd
61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec
Las siguientes secuencias representan la secuencia de cadena pesada y ligera de longitud completa real o contemplada (es decir, que contienen las secuencias de las regiones variable y constante) para cada anticuerpo descrito en este Ejemplo. Las secuencias señal para la secreción adecuada de los anticuerpos (por ejemplo, secuencias señal en el extremo 5' de las secuencias de ADN o el extremo amino terminal de las secuencias de proteínas) no se muestran en las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa descritas en el presente documento y no están incluidas en la proteína secretada final. Tampoco se muestran los codones de parada para la terminación de la traducción requerida en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Un experto habitual en la técnica seleccionará una secuencia señal y/o un codón de parada para la expresión de las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de longitud completa descritas. También se contempla que las secuencias de la región variable pueden ligarse a otras secuencias de la región constante para producir cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de longitud completa activas.
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada quimérica de longitud completa Ch4F11 (región variable de la cadena pesada de ratón y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 73)
i gaggtacagc ttgtcgagtc gggaggagga ttggtaaaac cgggtgggtc actcaaattg
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt tgcgttttcg tcgtatgata tgtcgtgggt gcgccagacg
121 ccggaaaaac gattggaatg ggtcgcgtat atctcccgag ggggaggttc gacatactat
181 cccgacacgg tcaaagggcg cttcacgatt tcacgggaca atgcgaaaaa cacgctttat
241 cttcaaatgt cgtcgttgaa atcggaagat accgcgatgt attactgcgg gaggcatgcg
301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggagccggaa cgacggtgac ggtgtcgtcg
361 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg
421 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc
481 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct
541 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc
601 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc
661 a a r f a r f r , ' F r f r , r f acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact ■ n 1" r r r r r r r T r r r l "
721 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc
781 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg
841 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat
901 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa
961 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt
1021 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa
1081 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc
1141 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg
1201 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg
1261 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc
1321 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la cadena pesada quimérica de longitud completa Ch4F11 (región variable de la cadena pesada de ratón y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 74)
1 evqlvesggg lvkpggslkl scaasgfafs sydmswvrqt pekrlewvay isrgggstyy 61 pdtvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycgrha ttaywyfdvw gagttvtvss 121 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 181 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 241 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 301 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 361 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 421 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 75)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt
61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt cgcgttttca tcgtatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca
121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac
181 ccggatacgg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat
241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg
301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg
361 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg
421 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc
481 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct
541 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc
601 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 661 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 721 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 781 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 841 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 901 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 961 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 1021 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 1081 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1141 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 1201 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 1261 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 1321 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 76)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgfafs sydmswvrqa pgkglewvsy isrgggstyy
61 pdtvkgrftisrdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
121 astkgpsvfplapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
181 glyslssvvtvpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg
241 psvflfppkpkdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
301 styrvvsvltvlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree
361 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw
421 qqgnvfscsvmhealhnhyt qkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG 1 humana) (SEQ ID NO: 77)
l gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt 61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt caccttttca cactatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca 121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac 181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat 241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg 301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg 361 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg 421 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc 481 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct 541 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc 601 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 661 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 721 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 781 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 841 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 901 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 961 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 1021 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 1081 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1141 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 1201 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 1261 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 1321 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 78) 1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs hydmswvrqa pgkglewvsy isrgggstyy
61 pdsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
121 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
181 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 241 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 301 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 361 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 421 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 79)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt 61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt cgcgttttca cactatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca 121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac 181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat 241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg 301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg 361 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg 421 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc 481 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct 541 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc 601 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 661 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 721 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 781 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 841 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 901 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 961 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 1021 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 1081 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1141 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 1201 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 1261 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 1321 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 80)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgfafs hydmswvrqa pgkglewvsy isrgggstyy
61 pdsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss
121 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss
181 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg
241 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
301 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree
361 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw
421 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG 1 humana) (SEQ ID NO: 81) i gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt 61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt caccttttca aactatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca 121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac 181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat 241 cttcagatga actcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg 301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg 361 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg 421 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc 481 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct 541 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc 601 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc 661 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt 721 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc 781 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 841 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat 901 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa 961 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 1021 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 1081 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1141 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 1201 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 1261 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 1321 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 A28T S31N T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 82)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs nydmswvrqa pgkglewvsy isrgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss 121 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 181 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 241 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 301 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 361 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 421 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 83)
1 gaagtacagt tgttggagtc aggaggaggg ttggtccagc cgggtggatc gttgcggctt 61 tcgtgtgcgg cgtcgggatt caccttttca tcgtatgaca tgtcgtgggt gaggcaggca 121 ccggggaaag ggcttgaatg ggtatcgtac atttcgagag ggggaggatc gacgtattac 181 ccggattccg tgaaaggaag gtttacgatc tcgcgcgaca attcaaagaa tacgctttat 241 cttcagatgaactcgctccg agcggaagat acggcggtat actattgcgg tcgccatgcg 301 acgacggcgt attggtattt cgatgtgtgg ggacaaggga cgatggtcac ggtgtcgtcg
361 gcctcaacaa aaggaccaag tgtgttccca ctcgccccta gcagcaagag tacatccggg
421 ggcactgcag cactcggctg cctcgtcaag gattattttc cagagccagt aaccgtgagc
481 tggaacagtg gagcactcac ttctggtgtc catacttttc ctgctgtcct gcaaagctct
541 ggcctgtact cactcagctc cgtcgtgacc gtgccatctt catctctggg cactcagacc
601 tacatctgta atgtaaacca caagcctagc aatactaagg tcgataagcg ggtggaaccc
661 aagagctgcg acaagactca cacttgtccc ccatgccctg cccctgaact tctgggcggt
721 cccagcgtct ttttgttccc accaaagcct aaagatactc tgatgataag tagaacaccc
781 gaggtgacat gtgttgttgt agacgtttcc cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg
841 tacgttgatg gagtcgaagt acataatgct aagaccaagc ctagagagga gcagtataat
901 agtacatacc gtgtagtcag tgttctcaca gtgctgcacc aagactggct caacggcaaa
961 gaatacaaat gcaaagtgtc caacaaagca ctcccagccc ctatcgagaa gactattagt 1021 aaggcaaagg ggcagcctcg tgaaccacag gtgtacactc tgccacccag tagagaggaa 1081 atgacaaaga accaagtctc attgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1141 gccgttgagt gggagagtaa cggtcagcct gagaacaatt acaagacaac ccccccagtg 1201 ctggatagtg acgggtcttt ctttctgtac agtaagctga ctgtggacaa gtcccgctgg 1261 cagcagggta acgtcttcag ctgttccgtg atgcacgagg cattgcacaa ccactacacc 1321 cagaagtcac tgagcctgag cccagggaag
Secuencia de proteínas que define la cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 84)
1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs sydmswvrqa pgkglewvsy isrgggstyy
61 pdsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycgrha ttaywyfdvw gqgtmvtvss 121 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 181 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 241 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 301 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 361 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 421 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera quimérica de longitud completa Ch4F11 (región variable de la cadena kappa del ratón y región constante de kappa humana) (SEQ ID NO: 85)
1 gacgtggtaa tgacgcagac gccgttgtcc cttcctgtct cgctcggaga tcaggcgtcg
61 atctcgtgta gaagctcgca gtcactcgtc cataccaacg ggaatacata tcttcactgg 121 tatttgcaaa agcccggaca gtcaccgaag ctcttgatct acaaagtatc caatcggttt 181 tcgggggtgc ccgaccgatt ctcgggatcg ggttcgggga cggattttac gttgaagatt 241 tcgcgggtgg aagcggagga tctcggtgtc tacttttgtt cgcagtcaac gcatgtcccg 301 tggacgttcg gaggcgggac aaaacttgag atcaagcgca cagttgctgc ccccagcgtg 361 ttcattttcc cacctagcga tgagcagctg aaaagcggta ctgcctctgt cgtatgcttg 421 ctcaacaact tttacccacg tgaggctaag gtgcagtgga aagtggataa tgcacttcaa 481 tctggaaaca gtcaagagtc cgtgacagaa caggacagca aagactcaac ttattcactc 541 tcttccaccc tgactctgtc caaggcagac tatgaaaaac acaaggtata cgcctgcgag 601 gttacacacc agggtttgtc tagtcctgtc accaagtcct tcaatagggg cgaatgt
Secuencia de proteínas que define la cadena ligera quimérica de longitud completa Ch4F11 (región variable de la cadena Kappa del ratón y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO: 86)
1 dvvmtqtplslpvslgdqas iscrssqslv htngntylhw ylqkpgqspk lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yfcsqsthvpwtfgggtkle ikrtvaapsv 121 fifppsdeql ksgtasvvcllnnfypreak vqwkvdnalqsgnsqesvte qdskdstysl 181 sstltlskad yekhkvyacevthqglsspv
Figure imgf000038_0001
tksfnrgec
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de kappa humana (versión 1)) (SEQ ID NO: 87) 1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca
61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacaaacg gtaatacgta tctccattgg
121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt
181 tcgggggtgc cggatcggtt ctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt
241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc
301 tggacgtttg ggcaggggac gaaggtggaa atcaagcgca cagttgctgc ccccagcgtg
361 ttcattttcc cacctagcga tgagcagctg aaaagcggta ctgcctctgt cgtatgcttg
421 ctcaacaact tttacccacg tgaggctaag gtgcagtgga aagtggataa tgcacttcaa
481 tctggaaaca gtcaagagtc cgtgacagaa caggacagca aagactcaac ttattcactc
541 tcttccaccc tgactctgtc caaggcagac tatgaaaaac acaaggtata cgcctgcgag
601 gttacacacc agggtttgtc tagtcctgtc accaagtcct tcaatagggg cgaatgt
Secuencia de proteínas que define la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de kappa humana) (SEQ ID NO: 88)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv htngntylhw ylqkpgqspq lliykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp wtfgqgtkve ikrtvaapsv
121 fifppsdeql ksgtasvvcl lnnfypreak vqwkvdnalq sgnsqesvte qdskdstysl
181 sstltlskad yekhkvyace vthqglsspvtksfnrgec
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de kappa humana (versión 2)) (SEQ ID NO: 89)
1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca
61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacacacg gtaatacgta tctccattgg
121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt
181 tcgggggtgc cggatcggtt ctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt
241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc
301 tggacgtttg ggcaggggac gaaggtggaa atcaagcgca cagttgcagc ccccagcgtg
361 ttcattttcc cacctagcga tgagcagctg aaaagcggta ctgcctctgt cgtatgcttg
421 ctcaacaact tttacccacg tgaggctaag gtgcagtgga aagtggataa tgcacttcaa
481 tctggaaaca gtcaagagtc cgtgacagaa caggacagca aagactcaac ttattcactc
541 tcttccaccc tgactctgtc caaggcagac tatgaaaaac acaaggtata cgcctgcgag
601 gttacacacc agggtttgtc tagtcctgtc accaagtcct tcaatagggg cgaatgt
Secuencia de proteínas que define la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO: 90)
1 dvvmtqtplslsvtpgqpas iscrssqslv hthgntylhw ylqkpgqspq lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgsgsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp wtfgqgtkve ikrtvaapsv 121 fifppsdeqlksgtasvvcl lnnfypreak vqwkvdnalq sgnsqesvte qdskdstysl 181 sstltlskadyekhkvyace vthqglsspv tksfnrgec
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de kappa humana (versión 2)) (SEQ ID NO: 91)
1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca 61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacacaag gtaatacgta tctccattgg 121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcag ctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt 181 tcgggggtgc cggatcggtt ctcgggatcg gggtcaggaa cggacttcac gcttaagatt 241 tcgagggtcg aggcggagga tgtcggagtc tacttttgtt cgcagtccac acatgtcccc 301 tggacgtttg ggcaggggac gaaggtggaa atcaagcgca cagttgcagc ccccagcgtg 361 ttcattttcc cacctagcga tgagcagctg aaaagcggta ctgcctctgt cgtatgcttg 421 ctcaacaact tttacccacg tgaggctaag gtgcagtgga aagtggataa tgcacttcaa 481 tctggaaaca gtcaagagtc cgtgacagaa caggacagca aagactcaac ttattcactc 541 tcttccaccc tgactctgtc caaggcagac tatgaaaaac acaaggtata cgcctgcgag 601 gttacacacc agggtttgtc tagtcctgtc accaagtcct tcaatagggg cgaatgt
Secuencia de proteínas que define la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO: 92)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv htqgntylhw ylqkpgqspq lliykvsnrf
61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp wtfgqgtkve ikrtvaapsv
121 fifppsdeql ksgtasvvcl lnnfypreakvqwkvdnalq sgnsqesvte qdskdstysl 181 sstltlskad yekhkvyace
Figure imgf000040_0001
vthqglsspv tksfnrgec
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de kappa humana (versión 2)) (SEQ ID NO: 93)
1 gatgtagtca tgacccaaac gccgctttcg ttgtcggtga cgcccggaca gcccgcgtca
61 atctcgtgtc ggtcatcgca gtcgttggta cacacatacg gtaatacgta tctccattgg
121 tatctccaga agcccggcca gtcgccgcagctcttgatct acaaagtgag caatcgcttt 181 tcgggggtgc cggatcggtt
Figure imgf000040_0003
ctcgggatcg gggtcaggaa
Figure imgf000040_0002
cggacttcac gcttaagatt 241 tcgagggtcg aggcggagga
Figure imgf000040_0005
tgtcggagtc tacttttgtt
Figure imgf000040_0004
cgcagtccac acatgtcccc 301 tggacgtttg ggcaggggac
Figure imgf000040_0006
gaaggtggaa atcaagcgca
Figure imgf000040_0007
cagttgcagc ccccagcgtg 361 ttcattttcc cacctagcga
Figure imgf000040_0009
tgagcagctgaaaagcggta
Figure imgf000040_0008
ctgcctctgt cgtatgcttg 421 ctcaacaact tttacccacg
Figure imgf000040_0011
tgaggctaaggtgcagtgga
Figure imgf000040_0010
aagtggataa tgcacttcaa 481 tctggaaaca gtcaagagtc
Figure imgf000040_0013
cgtgacagaacaggacagca
Figure imgf000040_0012
aagactcaac ttattcactc 541 tcttccaccc tgactctgtc
Figure imgf000040_0015
caaggcagac tatgaaaaac
Figure imgf000040_0014
acaaggtata cgcctgcgag 601 gttacacacc agggtttgtc
Figure imgf000040_0016
tagtcctgtc accaagtcct
Figure imgf000040_0017
tcaatagggg cgaatgt
Secuencia de proteínas que define la cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de kappa humana) (SEQ ID NO: 94)
1 dvvmtqtpls lsvtpgqpas iscrssqslv htygntylhw ylqkpgqspq lliykvsnrf 61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yfcsqsthvp wtfgqgtkve ikrtvaapsv
121 fifppsdeql ksgtasvvcl lnnfypreak vqwkvdnalq sgnsqesvte qdskdstysl
181 sstltlskad yekhkvyace vthqglsspv tksfnrgec
Tabla 12 es un gráfico de concordancia que muestra la SEQ ID NO. de cada secuencia descrita en este Ejemplo.
Tabla 12
Figure imgf000040_0018
continuación
Figure imgf000041_0001
La Tabla 13 a continuación muestra los anticuerpos que contienen cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina quimérica y combinaciones ejemplares de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina quimérica o humanizada de longitud completa.
Tabla 13
Figure imgf000041_0002
continuación
Figure imgf000042_0001
La construcción del anticuerpo que contiene las cadenas pesada y ligera quiméricas de longitud completa se designa a continuación: 4F11 quimérico (Hu4F11-1) = Cadena pesada quimérica de longitud completa Ch4F11 (región variable de la cadena pesada de ratón y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO: 74) más cadena ligera quimérica de longitud completa Ch4F11 (región variable de la cadena de Kappa de ratón y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO: 86)
A continuación se describen trece de las posibles construcciones de anticuerpos que contienen las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de longitud completa que contienen regiones variables humanizadas:
Hu4F11-32 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:76) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) SEQ ID NO:88) Hu4F11-69 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:82) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:90)
Hu4F11-70 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:78) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:90)
Hu4F11-71 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:84) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:90)
Hu4F11-72 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:80) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28H (región variable de la cadena de Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:90)
Hu4F11-73 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:82) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:94)
Hu4F11-74 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:78) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:94)
Hu4F11-75 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:84) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:94)
Hu4F11-76 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:80) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Y (región variable de la cadena de Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:94)
Hu4F11-77 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31N T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:82) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:92)
Hu4F11-78 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:78) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (región variable de la cadena Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:92)
Hu4F11-79 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 A28T T62S (región variable humanizada de la cadena pesada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:84) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (región variable de la cadena kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:92)
Hu4F11-80 = Cadena pesada de longitud completa Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S (región variable de la cadena pesada humanizada y región constante de IgG1 humana) (SEQ ID NO:80) más cadena ligera de longitud completa Hu4F11 Kv2D-29 N28Q (región variable de la cadena de Kappa humanizada y región constante de Kappa humana) (SEQ ID NO:92)
Ejemplo 9: Afinidades de unión de anticuerpos monoclonales anti-Notch3 humanizados y quiméricos Las afinidades de unión y la cinética de la unión de anticuerpos quiméricos y humanizados a la proteína de fusión (rhNotch3 monomérico) del dominio extracelular de Notch3 monomérico recombinante humano (que contiene los dominios 1-11 de tipo EGF) y la proteína de fusión (rcNotch3 monomérica) del dominio extracelular de Notch3 monomérico recombinante de mono Cynomologus (que contiene dominios extracelulares de EGF 1-12) se midió por resonancia de plasmón superficial, utilizando un instrumento BIAcore® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Anti-IgG humanas de cabra (específicas del fragmento Fc, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se inmovilizaron en chips sensores CM4 de dextrano carboximetilados mediante acoplamiento de amina, según un protocolo estándar. Los análisis se realizaron a 25 y 37 0C utilizando PBS que contiene 0,05 % de tensioactivo P20 como tampón de ejecución. Los anticuerpos se capturaron en células de flujo individuales a un caudal de 10 pl/minuto. El tiempo de inyección se varió para cada anticuerpo para producir una Rmax entre 30 y 60 RU. El tampón o proteína Notch3 diluido en tampón de ejecución se inyectó secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo que se debe ensayar) durante 240 segundos a 60 pl/minuto. La fase de disociación fue controlada durante hasta 900 segundos. A continuación, la superficie se regeneró con dos inyecciones de 60 segundos de glicina-HCl 10 mM, pH 2,25, a un caudal de 30 pl/minuto. El intervalo de concentración de Notch3 ensayado fue de 50 nM a 6,25 nM.
Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando la función cinética del software BIAevaluation (GE Healthcare) con doble resta de referencia. Se determinaron los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y Kd (constante de disociación de equilibrio). Los valores cinéticos de los anticuerpos monoclonales purificados en rcNotch3 monomérico a 25 0C se resumen en la Tabla 14.
Tabla 14
Figure imgf000043_0001
continuación
Figure imgf000044_0001
Se realizaron mediciones cinéticas adicionales para cada anticuerpo mostrado en la Tabla 14. Estas mediciones confirmaron que los anticuerpos tienen afinidades que van desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 25 nM para rcNotch3 monomérico a 25 0C.
Los valores cinéticos de los anticuerpos monoclonales purificados en rcNotch3 monomérico a 37 0C se resumen en la Tabla 15.
Tabla 15
Figure imgf000044_0002
Se realizaron mediciones cinéticas adicionales para cada anticuerpo mostrado en la Tabla 15. Estas mediciones confirmaron que los anticuerpos tienen afinidades que van desde aproximadamente 9 nM a aproximadamente 35 nM para rcNotch3 monomérico a 37 0C.
Los valores cinéticos de los anticuerpos monoclonales purificados en rhNotch3 monomérico a 37 0C se resumen en la Tabla 16.
Tabla 16
Figure imgf000044_0003
Se realizaron mediciones cinéticas adicionales para cada anticuerpo mostrado en la Tabla 16. Las mediciones adicionales se promediaron junto con las presentadas en la Tabla 16. Estas mediciones combinadas indicaron que los anticuerpos tienen afinidades que van desde aproximadamente 7 nM a aproximadamente 16 nM para rhNotch3 monomérico a 37 0C (Tabla 17).
Tabla 17
Figure imgf000044_0004
continuación
Figure imgf000045_0001
Los resultados en las Tablas 14-17 demuestran que los anticuerpos quiméricos y cada uno de los humanizados, tienen velocidades de asociación rápidas (ka), velocidades de disociación muy lentas (kd) y afinidades muy elevadas (Kd). En particular, los anticuerpos tienen afinidades que van desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 35 nM.
Ejemplo 10: Unión de anticuerpos 4F11 humanizados a Notch3 expresado en la superficie celular
La unión de las variantes de 4F11 humanizadas al receptor Notch3 de la superficie celular se confirmó mediante FACS. Las líneas de CHO FlpIn™ que expresan Notch3 humano de forma estable, o líneas de CHO FlpIn™ que no expresan receptores Notch humanos, se utilizaron para experimentos de unión. Las células CHO se recogieron utilizando un tampón de disociación celular (Life Technologies, Grand Island, NY) y se volvieron a suspender en 2,5 x 106 células/ml en PBS/BSA al 0,5 %. Se agregaron 100 pl de suspensión celular por muestra a una placa con fondo en V de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos humanizados 4F11 o IgG humana a 5 pg/ml a los pocillos, se mezclaron e incubaron en hielo durante una hora. Después de lavar con PBS/BSA al 0,5 %, se añadió anticuerpo secundario conjugado con PE humano a una dilución 1:100 en PBS/BSA al 0,5 % y se dejó incubar en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron con PBS/BSA al 0,5 %, luego se resuspendió en 300 ul de PBS/BSA al 0,5 % y se realizó un análisis FACS. La expresión del receptor Notch3 humano se confirmó utilizando PE anti-Notch3 humano (BioLegend, San Diego, CA) como control positivo. El análisis FACS confirmó que las variantes del anticuerpo 4F11 humanizado se unen a Notch3 humano expresado en la superficie celular.
Ejemplo 11: Inhibición de la escisión de ICD de Notch3 inducida por ligando con anticuerpos 4F11 humanizados
Se ensayaron las variantes de 4F11 humanizadas seleccionadas para determinar su capacidad para inhibir la activación de Notch3 inducida por ligando, como se mide por la presencia de ICD escindido. La línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468, que expresa Notch3 humano endógeno, se colocó en placas de 96 pocillos previamente recubiertas con proteína de fusión hJag2-mFc. Los pocillos se prepararon diluyendo Fc de ratón a (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a 5 pg/ml en un tampón de recubrimiento de carbonato-bicarbonato esterilizado por filtración, pH 9,4 (Thermo Fisher Scientific, Rockland, MD). A continuación, se agregaron 100 pl del anticuerpo diluido a cada pocillo de una placa Maxisorp™ de 96 pocillos y se incubó durante la noche a 4 0C. Al día siguiente, los pocillos se lavaron tres veces con PBS/BSA al 0,5 % antes de agregar 100 pl de proteína de fusión Jag2-mFc soluble o Fc de IgG de ratón (Jackson Immunolabs) diluida a 5 pg/ml en PBS/BSA al 0,5 %. Después de incubar durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador orbital, los pocillos se lavaron tres veces con PBS/BSA al 05 % para eliminar el ligando no unido. Las células MDA-MB-468 se contaron y se volvieron a suspender en medios de crecimiento frescos a 0,4 x 106 células/ml. Las células se preincubaron con 10 pg/ml de los anticuerpos humanizados 4F11 durante 30 minutos a 37 0C, antes de sembrar 100 pl de la suspensión en placas de 96 pocillos recubiertas con ligando hJag2-mFc o mFc. Estas se incubaron durante la noche a 37 0C. Al día siguiente, los pocillos se lavaron suavemente con PBS enfriado con hielo, a continuación, las células se recogieron agregando tampón RIPA que contiene inhibidores de proteasa directamente al pocillo. Los lisados se clarificaron por centrifugación en una microcentrífuga refrigerada. Los sobrenadantes se hirvieron con tampón de muestra SDS 5X antes de cargarlos en un gel SDS PAGE y transferencia de Western. Las transferencias se exploraron con un anticuerpo a-Notch3 para detectar el dominio intracelular escindido (Cell Signaling, Danvers, MA). Las mismas transferencias también se sondaron con anti-p tubulina (Cell Signaling) para usar como control de carga. Las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageLab (BioRad, Hercules, CA) y los valores se ajustaron en relación con sus respectivos controles de carga. A continuación, cada muestra se normalizó con respecto al valor de la banda de ICD de Notch3 de las células colocadas en placas en pocillos sin ligando en presencia del anticuerpo de control hIgG.
Las variantes del anticuerpo 4F11 humanizado inhiben significativamente la escisión inducida por ligando de ICD de Notch3 como se resume en la Figura 11.
Ejemplo 12: Inhibición de la transcripción dependiente de Notch3 por anticuerpos 4F11 humanizados Se usaron ensayos de indicador de luciferasa para evaluar la capacidad de ciertos anticuerpos 4F11 humanizados para inhibir la señalización del receptor Notch3 dependiente de ligando y la actividad transcripcional. Las líneas de indicador HCC1143 cocultivadas con células CHO que expresan ligandos Notch se utilizaron para estos ensayos. Se produjeron líneas estables que expresaban ligandos de Notch de longitud completa en la superficie celular transfectando células CHO FlpIn™ con Jag1, Jag2, Los ADNc de DLL1 o DLL4 se clonaron en el vector pcDNA5FRT utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células CHO se dividieron en medio F12 que contenía FBS al 10 %, 2 mM de L-glutamina y 700 pg/ml de higromicina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para seleccionar las células transfectadas. La expresión de los ligandos de Notch se confirmó mediante análisis FACS utilizando anticuerpos contra Jag1 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), Jag2 (R&D Systems), DLL1 (R&D Systems) y DLL4 (BioLegend, San Diego, CA). Las líneas de CHO FlpIn™ que expresan de forma estable los ligandos de Notch se tripsinizaron, se contaron y se sembraron en placas de 96 pocillos a 60K células/pocillo en 100 pl de medio F12 K de Ham sin higromicina B. Al día siguiente, Las células indicadoras HCC1143 se centrifugaron y se volvieron a suspender en medios RPMI que contenían un 2 % de FBS a 0,2x10.6 células/ml. Los anticuerpos se diluyeron en serie en RPMI sin FBS, y se agregaron 100 pl de solución de anticuerpo a un volumen igual de células indicadoras durante 30 minutos a 37 0C en una incubadora con CO2 al 5 %. Después de eliminar de los medios las células CHO hJag2, se añadieron 100 pl de la mezcla de indicador/anticuerpo HCC1143 a las células que expresaban el ligando y se dejaron incubar a 37 0C durante la noche. Veinticuatro horas después, se colocaron las placas de 96 pocillos a temperatura ambiente durante 20 minutos, después, se procesaron con el protocolo de ensayo indicador Bright Glo (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Los lisados se transfirieron a placas de 96 pocillos de pared blanca (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) y se leyeron en un luminómetro GloMax (Promega) usando el programa Bright Glo.
Como se muestra en la Figura 12A-B, las variantes del anticuerpo 4F11 humanizadas inhiben la activación de la transcripción inducida por ligando en la línea celular indicadora HCC1143.
Ejemplo 13: Inhibición de la escisión de ICD de Notch3 In vivo
Los anticuerpos 4F11 humanizados seleccionados (es decir, Hu4F11-70, Hu4F11-72, Hu4F11-78) se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir la escisión de ICD de Notch3 expresado en tumores HCC2429 in vivo. Todos los ratones fueron tratados de acuerdo con la Política del Servicio de Salud Pública de la OLAW sobre Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Guía ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los estudios in vivo se realizaron siguiendo los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales AVEO. HCC2429 es una línea celular de cáncer de pulmón que alberga una translocación del cromosoma 19 que produce una sobreexpresión del receptor Notch3. Para los experimentos de escisión de ICD de Notch3, ratones lampiños de NCR de aproximadamente trece semanas de edad (Taconic, Germantown, NY) se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho con 5x106 células en 1:1 DMEM Matrigel (Invitrogen, Carlsbad, CA)/Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Las mediciones tumorales se tomaron dos veces por semana, utilizando pinzas de vernier. El volumen tumoral se calculó usando la siguiente fórmula: V = 0,5 x ancho x ancho x largo. Cuando los tumores se acercaron a un volumen de 300-400 mm3, los ratones se asignaron al azar en grupos de tres animales cada uno (corresponde al ratón 1 (m1) al ratón 3 (m3), como se designa en la Figura 13). Al día siguiente, los ratones se trataron con 20 mg/kg de hIgG (control), o 20 mg/kg de anticuerpos Hu4F11-70, Hu4F11-72, Hu4F11-78 o 4F11 murino (mu4F11) por inyección intraperitoneal. Los ratones se dosificaron una vez, y los tumores se recogieron 24 horas después y se congelaron rápidamente.
Para evaluar los niveles de ICD de Notch3 escindido, los tumores se pulverizaron utilizando un impactador cryoPREP™ de Covaris (Covaris, Woburn, MA), se volvieron a suspender en tampón RIPA (Boston BioProducts) que contenía inhibidores de proteasa y se rotaron a 4 °C durante 1 hora. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 14k rpm durante 15 minutos en una microcentrífuga refrigerada. La concentración de proteínas para cada muestra se midió utilizando el ensayo de proteínas DC de BioRad (BioRad). Concentraciones iguales de proteína de cada muestra se cargaron en un gel de SDS PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa mediante transferencia de Western. Las transferencias se exploraron con anticuerpo contra el extremo C de Notch3 (Cell Signaling) para detectar los niveles del ICD escindido. Las transferencias también se exploraron con el anticuerpo contra p-tubulina (Cell Signaling) para su uso como control de carga. Las bandas se cuantificaron utilizando el software Image Lab 3.0 (BioRad) y la intensidad de las bandas de ICD de Notch3 se normalizó a su respectivo control de carga de p-tubulina. Todos los anticuerpos 4F11 humanizados ensayados (es decir, Hu4F11 -70, Hu4F11 -72, Hu4F11-78) inhiben significativamente la activación de Notch3 in vivo, según lo medido por los niveles de ICD de Notch3 presentes en tumores 24 horas después del tratamiento con anticuerpos de dosis única (Figura 13).
Las realizaciones anteriores se deben considerar en todos los aspectos ilustrativos en lugar de limitarse a la invención descrita en este documento. De este modo, el alcance de la invención se indica por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior, y todos los cambios que vienen dentro del significado y del intervalo de equivalencia de las reivindicaciones se pretende que se incluyan en el mismo.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10;
(b)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10;
(c)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:63, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10;
(d)
(i) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53, y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7; y (ii) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:64, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde las secuencias de CDR están interpuestas entre secuencias estructurales humanas o humanizadas.
3. Un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H); (b) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H);
(c) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q); (d) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q);
(e) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y); (f) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y).
4. Un anticuerpo aislado que se une a Notch3 humana que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa);
(b) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 (Hu4F11 Kv2D-29 N28H Kappa);
(c) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa);
(d) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Q Kappa);
(e) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 (Sh4F11 Hv3-23 A28T S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa);
(f) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 (Sh4F11 Hv3-23 S31H T62S), y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 (Hu4F11 Kv2D-29 N28Y Kappa).
5. Un ácido nucleico o ácidos nucleicos aislado(s) que comprende(n) una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4.
6. Un vector o vectores de expresión que comprende(n) el ácido nucleico o ácidos nucleicos de la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora que comprende el vector o vectores de expresión de la reivindicación 6.
8. Un método para producir un anticuerpo que se une a Notch3 humana o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, comprendiendo el método:
(a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones para que la célula hospedadora exprese un polipéptido o polipéptidos que comprende(n) la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina, de este modo, produciendo el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo; y
(b) purificar el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo.
9. Un método para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral in vitro que comprende exponer la célula a una cantidad eficaz del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para inhibir o reducir la proliferación de la célula tumoral.
10. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto humano, opcionalmente, en donde el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de piel, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y de cuello, y leucemia.
11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo tiene una KD de 35 nM o inferior, 25 nM o inferior, 15 nM o inferior, 5 nM o inferior o 1 nM o inferior, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial.
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