ES2740827T3 - GLUT-1 como receptor de envolturas del HTLV y sus usos - Google Patents

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Abstract

Uso de polipéptidos en un método in vitro para diagnosticar el síndrome de deficiencia de la proteína transportadora de glucosa tipo I (GLUT1), en el que dichos polipéptidos consisten en las proteínas de la envoltura del PTLV, o fragmentos derivados de las mismas, seleccionándose dichos polipéptidos o fragmentos por su capacidad para unirse específicamente al transportador universal de glucosa en vertebrados GLUT1 que consiste en la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
GLUT-1 como receptor de envolturas del HTLV y sus usos
La memoria descriptiva se refiere al uso del transportador universal de glucosa en vertebrados GLUT1 representado por la SEQ ID NO: 2, o de fragmentos o secuencias derivadas del mismo, para el diagnóstico in vitro de cánceres, cuando se usa como marcador tumoral, o para selección de compuestos útiles para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV, o patologías relacionadas con una sobreexpresión de GLUT1 en superficies celulares, o la detección in vitro de GLUT1 en superficies celulares. La memoria descriptiva también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen GLUT1, o fragmentos o secuencias derivadas del mismo, y sus usos, como en el marco de la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV.
El virus de la leucemia de células T humanas (HTLV) está asociado con la leucemia y los síndromes neurológicos. El papel de las envolturas virales en la fisiopatología del HTLV no está claro y el receptor de la envoltura, que se encuentra en todas las líneas celulares de vertebrados, permanece sin identificar.
Las glicoproteínas de la envoltura del HTLV inducen la formación de sincitio in vitro pero sus efectos fisiopatológicos no están claros. Todas las líneas celulares de vertebrados expresan receptores funcionales de la envoltura de1HTLV, incluidas las células resistentes a la formación de sincitio mediada por la envoltura de1HTLV. Se encontró que la expresión del dominio de unión al receptor del HTLV disminuyó la producción de lactato debido a un menor consumo de glucosa, mientras que los mutantes de la envoltura de unión defectuosa no alteraron el metabolismo de la glucosa. La falta de glucosa aumentó la expresión del receptor del HTLV, que recuerda las respuestas de detección de nutrientes. En consecuencia, la sobreexpresión de GLUT1, el transportador universal de glucosa en vertebrados, incrementó específicamente la unión de la envoltura del HTLV y GLUT1 colocalizado con envolturas de1 HTLV. Además, la unión de la envoltura del HTLV fue más alta en los eritrocitos humanos, donde GLUT1 se expresa abundantemente y es la única isoforma del transportador de glucosa. Estos resultados demuestran que GLUT1 es un receptor de la envoltura del HTLV, y que esta interacción ligando/receptor probablemente participa en los trastornos inmunológicos y neurológicos asociados con la infección por HTLV. Klepper y Voit (Eur. J. Pedriatr. 2002, vol. 161, 295-304) divulgan el diagnóstico del síndrome de deficiencia de GLUT1 mediante inmunodetección o análisis molecular.
Por lo tanto, la memoria descriptiva se relaciona con el uso del transportador universal de glucosa en vertebrados GLUT1 representado por la SEQ ID NO: 2 o de fragmentos o secuencias derivadas del mismo, dichos fragmentos o secuencias derivadas pueden unirse a las proteínas de la envoltura de los virus de la leucemia de células T de primates (PTLV) o de células que expresan GLUT1, para:
- la selección de compuestos útiles para:
* la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con PTLV,
* la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una sobreexpresión de GLUT1 en las superficies celulares,
* la detección in vitro de GLUT1 en las superficies celulares,
dichos compuestos se seleccionan por su capacidad para unirse específicamente a dicho GLUT1,
- la detección, concentración y/o purificación de PTLV o variantes del mismo, o de proteínas de la envoltura de PTLV, o fragmentos de las mismas,
- la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías vinculadas a una infección de un individuo o un animal con un PTLV, como HTLV-1, HTLV-2, STLV-1, STLV-2, STLV-3, o sus variantes, o vinculadas a la presencia de secuencias relacionadas con SU del PTLV en tales individuos o animales,
- el diagnóstico in vitro de cánceres, cuando se utiliza como marcador tumoral.
Con fines ilustrativos, los compuestos seleccionados mencionados anteriormente pueden seleccionarse por su capacidad para unirse específicamente a dicho GLUT1, o fragmentos de GLUT1, de acuerdo con el siguiente método que utiliza un componente de unión a GLUT1 etiquetado con EGFP derivado del RBD (dominio de unión al receptor) del PTLV como un ejemplo de dicho compuesto capaz de unirse a GLUT1.
Un componente de unión a Glut1 etiquetado con EGFP derivado del RBD del PTLV se aplica a una suspensión viva o fija o a células unidas. Después de los lavados con el tampón apropiado, las células se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavan y se analizan o cuantifican como unidas en un soporte apropiado en un microscopio de fluorescencia o como una suspensión de células individuales en un clasificador de células de análisis fluorescente (FACS). Alternativamente, un componente de unión a GLUT1 no fluorescente derivado del RBD del PTLV se aplica como se describió anteriormente y se revela con un reactivo marcado con fluorocromo secundario, tal como un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo dirigido contra el RBD del PTLV o contra una etiqueta sin fluorocromo unida a dicho componente RBD del PTLV.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso tal como se definió anteriormente, de fragmentos de GLUT1 elegidos entre los siguientes:
- SEQ ID NO: 25: NAPQKVIEEFY,
- SEQ ID NO: 26: NQTWVHRYGESILPTTLTTLWS,
- SEQ ID NO: 27: KSFEMLILGR,
- SEQ ID NO: 28: DSIMGNKDL,
- SEQ ID NO: 29: YSTSIFEKAGVQQP,
- SEQ ID NO: 30: EQLPWMSYLS,
- SEQ ID NO: 31: QYVEQLC,
- SEQ ID NO: 32: IVGMCFQYVEQLC.
Estos fragmentos de GLUT1 corresponden a los bucles extracelulares predichos de GLUT1 humano como se describe por Mueckler, M. y C. Makepeace. 1997. Identification of an amino acid residue that lies between the exofacial vestibule
and exofacial substrate-binding site of the GLUT1 sugar permeation pathway. J Biol Chem. 272 (48): 30141-6.
La memoria descriptiva también se refiere al uso de compuestos seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se definió anteriormente, para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV, tal como patologías correspondientes a la leucemia de células T adultas (ATL), mielopatía asociada a HTLV-I/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), así como a otros síndromes asociados a HTLV, como la leucemia de linfocitos granulares grandes (lGl) (Loughran, Tp, KG Hadlock, R. Perzova, TC Gentile, Q. Yang, SK Foung y BJ Poiesz. 1998. Epitope mapping of HTLV envelope seroreactivity in LGL leukemia. Br J Haematol. 101(2): 318-24.), uveitis (Mochizuki, M., A. Ono, E. Ikeda, N. Hikita, T. Watanabe, K. Yamaguchi, K. Sagawa, and K. Ito. 1996. HTLV-I uveitis. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 13 Suppl 1: S50-6.), dermatitis infecciosa (La Grenade, L., RA Schwartz y CK Janniger. 1996. Childhood dermatitis in the tropics: with special emphasis on infective dermatitis, a marker for infection with human T-cell leukemia virus-I. Cutis. 58(2): 115-8), artropatías (Nishioka, K., T. Sumida y T. Hasunuma. 1996. Human T lymphotropic virus type I in arthropathy and autoimmune disorders. Arthritis Rheum. 39(8): 1410-8.), linfoma cutáneo de células T (micosis fungoide) (1. Hall, WW, CR Liu, O. Schneewind, H. Takahashi, MH Kaplan, G. Roupe y A. Vahlne.
1991. Deleted HTLV-I provirus in blood and cutaneous lesions of patients with mycosis fungoides. Science. 253(5017): 317-20. 2. Zucker-Franklin, D., B., A., Pancake, M. Marmor, y P. M. Legler. 1997. Reexamination of human T cell lymphotropic virus (HTLV-I/II) prevalence. Proc Natl Acad Sci USA. 94(12): 6403-7), polimiositis (Saito M, Higuchi I, Saito A, Izumo S, Usuku K, Bangham CR, Osame M. Molecular analysis of T cell clonotypes in muscle-infiltrating lymphocytes from patients with human T lymphotropic virus type 1 polymyositis. J Infect Dis. 2002 Nov 1; 186(9): 1231­ 41), y posiblemente otras enfermedades idiopáticas en las que pueden estar involucradas secuencias de PTLV o PTLV.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV, de compuestos elegidos entre los siguientes:
- esteroides androgénicos (36: May JM, Danzo BJ. Photolabeling of the human erythrocyte glucose carrier with androgenic steroids. Biochim Biophys Acta. Agosto 18 de 1988; 943 (2): 199-210),
- citocalasina B, forskolina, dipiridamol, isobutilmetilxantina (20: Hellwig B, Joost HG). Differentiation of erythrocyte-(GLUT1), liver-(GLUT2), and adipocyte-type (GLUT4) glucose transporters by binding of the inhibitory ligands cytochalasin B, forskolin, dipyridamole, and isobutylmethylxanthine. Mol Pharmacol. Septiembre de 1991; 40 (3): 383­ 9),
- etanol (Krauss SW, Diamond I, Gordon AS. Selective inhibition by ethanol of the type 1 facilitative glucose transporter (GLUT1). Mol Pharmacol. Junio de 1994; 45 (6): 1281-6),
- genisteína (Vera JC, Reyes AM, Carcamo JG, Velásquez FV, Rivas CI, Zhang RH, Strobel P, Iribarren R, Scher HI, Slebe JC, et al. Genistein is a natural inhibitor of hexose and dehydroascorbic acid transport through the glucose transporter, GLUT1. J Biol Chem. 12 de abril de 1996; 271 (15): 8719-24),
- cadmio (Lachaal M, Liu H, Kim S, Spangler RA, Jung CY. Cadmium increases GLUT1 substrate binding affinity in vitro while reducing its cytochalasin B binding affinity. Biochemistry. 26 de noviembre de 1996; 35 (47): 14958-62),
- barbitúrico (el-Barbary A, Fenstermacher JD, Haspel HC. Barbiturate inhibition of GLUT-1 mediated hexose transport in human erythrocytes exhibits substrate dependence for equilibrium exchange but not unidirectional sugar flux. Biochemistry. 3 de diciembre de 1996; 35 (48): 15222- 7),
- ácido deshidroascórbico (Rumsey SC, Kwon O, Xu GW, Burant CF, Simpson I, Levine M. Glucose transporter isoforms GLUT1 and GLUT3 transport dehydroascorbic acid. J Biol Chem. 25 de julio de 1997; 272 (30): 18982-9),
- antidepresivos tricíclicos (Pinkofsky HB, Dwyer DS, Bradley RJ. The inhibition of GLUT1 glucose transport and cytochalasin B binding activity by tricyclic antidepressants. Life Sci. 2000; 66 (3): 271-8),
- estradiol, genisteína y antiestrógenos, faslodex (ICI 182780), tamoxifeno (Afzal I, Cunningham P, Naftalin RJ. Interactions of ATP, oestradiol, genistein and the anti-oestrogens, faslodex (ICI 182780) and tamoxifen, with the human erythrocyte glucose transporter, GLUT1. Biochem J. 1 de agosto de 2002; 365 (Pt 3): 707-19),
- agonistas gamma de los receptores activados por el proliferador de peroxisoma (PPAR), como la tiazolidindiona (troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona) (("TZDs modify astrocyte metabolism and mitochondrial function, which could be beneficial in neurological conditions where glucose availability is reduced" de Dello Russo C, Gavrilyuk V, Weinberg G, Almeida A, Bolanos JP, Palmer J, Pelligrino D, Galea E, Feinstein DL. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma thiazolidinedione agonists increase glucose metabolism in astrocytes. J Biol Chem. 21 de febrero de 2003; 278 (8): 5828-36).
La memoria descriptiva también se refiere al uso de compuestos seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se definió anteriormente, para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una sobreexpresión de GLUT1 en superficies celulares, tales como:
- cánceres, tales como:
• carcinoma de células escamosas (Kunkel M, Reichert TE, Benz P, Lehr HA, Jeong JH, Wieand S, Bartenstein P, Wagner W, Whiteside TL. Cancer. 15 de febrero de 2003; 97 (4): 1015-24),
• carcinoma hipofaríngeo (Mineta H, Miura K, Takebayashi S, Misawa K, Araki K, Misawa Y, Ueda Y. Anticancer Res. Nov-Dic. de 2002; 22 (6B): 3489-94),
• cáncer de mama (Brown RS, Wahl RL. Overexpression of Glut-1 glucose transporter in human breast cancer. An immunohistochemical study. Cancer. 15 de noviembre de 1993; 72 (10): 2979-85),
• carcinoma cervical (Mendez LE, Manci N, Cantuaria G, Gomez-Marin O, Penalver M, Braunschweiger P, Nadji M. Expression of glucose transporter-1 in cervical cancer and its precursors. Gynecol Oncol. Agosto de 2002; 86 (2): 138­ 43),
• carcinoma de ovario (Cantuaria G, Fagotti A, Ferrandina G, Magalhaes A, Nadji M, Angioli R, Penalver M, Mancuso S, Scambia G. GLUT-1 expression in ovarian carcinoma: association with survival and response to chemotherapy. Cancer. 1 de septiembre de 2001; 92 (5): 1144-50),
• cáncer de pulmón (Ito T, Noguchi Y, Satoh S, Hayashi H, Inayama Y, Kitamura H. Expression of facilitative glucose transporter isoforms in lung carcinomas: its relation to histologic type, differentiation grade, and tumor stage. Mod Pathol. Mayo de 1998; 11 (5): 437-43. Younes M, Brown RW, Stephenson M, Gondo M, Cagle PT. Overexpression of Glut1 and Glut3 in stage I nonsmall cell lung carcinoma is associated with poor survival. Cancer. 15 de septiembre de 1997; 80 (6): 1046-51),
• cáncer de páncreas (Reske SN, Grillenberger KG, Glatting G, Port M, Hildebrandt M, Gansauge F, Beger HG. Overexpression of glucose transporter 1 and increased FDG uptake in pancreatic carcinoma. J Nucl Med. Septiembre de 1997; 38 (9): 1344 -8),
• insulinoma (1: Boden G, Murer E, Mozzoli M. Glucose transporter proteins in human insulinoma. Ann Intern Med.
15 de julio de 1994; 121 (2): 109-12,
- afecciones inflamatorias,
- enfermedades inmunes o autoinmunes, tales como:
• miocarditis autoinmune (Tokita N, Hasegawa S, Tsujimura E, Yutani K, Izumi T, Nishimura T. Serial changes in 14C-deoxyglucose and 201T1 uptake in autoimmune myocarditis in rats. J Nucl Med. Febrero de 2001; 42 (2): 285­ 91),
• en el marco de la activación de células T CD28 (Frauwirth KA, Riley JL, Harris MH, Parry RV, Rathmell JC, Plas DR, Elstrom RL, June CH, Thompson CB. The CD28 signaling pathway regulates glucose metabolism. Immunity. Junio de 2002; 16 (6): 769-77),
• en el marco de la inmunomodulación (Moriguchi S, Kato M, Sakai K, Yamamoto S, Shimizu E. Decreased mitogen response of splenic lymphocytes in obese Zucker rats is associated with the decreased expression of glucose transporter 1 (GLUT-1). Am J Clin Nutr. Junio de 1998; 67 (6): 1124-9),
- trastornos del sistema nervioso central, como el síndrome de deficiencia de la proteína transportadora tipo 1 facilitada por glucosa (GLUT1) (revisión en Klepper J, Voit T, Eur J Pediatr. Junio de 2002; 161 (6): 295-304).
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una sobreexpresión de Gl UT1 en superficies celulares, de compuestos elegidos entre los siguientes:
- compuestos polipeptídicos correspondientes a las proteínas de la envoltura del PTLV, o fragmentos o secuencias derivadas de los mismos, dichos fragmentos o secuencias derivadas pueden unirse a GLUT1,
- glucosa o derivados tales como galactosa, 2-fluorodesoxiglucosa, 2-desoxiglucosa, 3-O-metilglucosa,
esteroides androgénicos, citocalasina B, forskolina, dipiridamol, isobutilmetilxantina, etanol, genisteína, cadmio, barbitúrico, ácido deshidroascórbico, antidepresivos tricíclicos, estradiol, antiestrógenos, Faslodex (ICI 182780), tamoxifeno, agonistas gamma de receptores activados por l proliferador de peroxisoma (PPAR) tales como la tiazolidindiona, troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, como se mencionó anteriormente.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso de polipéptidos correspondientes a las proteínas de la envoltura del PTLV, o fragmentos o secuencias derivadas de los mismos, seleccionándose dichos polipéptidos por su capacidad para unirse específicamente al transportador universal de glucosa en vertebrados GLUT1 representado por la SEQ ID No .: 2, para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una sobreexpresión de g Lu T1 en superficies celulares y el diagnóstico in vitro de dichas patologías. La invención se refiere al diagnóstico in vitro del síndrome de deficiencia de GLUT1.
La invención se refiere más particularmente al uso como se definió anteriormente, de polipéptidos capaces de unirse a al menos uno de los fragmentos de GLUT1 mencionados anteriormente correspondientes a la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 , SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, y SEQ ID NO: 32.
La invención se refiere más particularmente al uso como se definió anteriormente, de polipéptidos capaces de unirse a al menos el fragmento de GLUT1 correspondiente a la SEQ ID NO: 32.
La invención se refiere más particularmente al uso tal como se definió anteriormente, de los polipéptidos de unión a GLUT1 mencionados anteriormente elegidos entre los siguientes:
- la proteína de la envoltura del HTLV-1 expuesta por la SEQ ID NO: 4, o de la HTLV-2 expuesta por la SEQ ID NO: 6, o de la STLV-1 expuesta por la SEQ ID No : 8, o de la STLV-2 expuesta por la SEQ iD NO: 10, o de la STLV-3 expuesta por la SEQ ID NO: 12,
- fragmentos de las proteínas de la envoltura del PTLV, estando dichos fragmentos de polipéptidos delimitados en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 1 a 90, o en la posición 75 a 90, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 135 a 245, o en la posición 135 a 150, de dichas proteínas de la envoltura del PTLV, expuesta por las SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12,
- fragmentos de las proteínas de la envoltura del PTLV, correspondiendo dichos fragmentos a los siguientes polipéptidos:
• el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 83 a 89, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 139 a 145, de la proteína de la envoltura de la cepa MT-2 del HTLV-1 expuesto por la SEQ ID NO: 4,
* el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 79 a 85, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 135 a 141, de la proteína de la envoltura de la cepa NRA de HTLV-2 expuesta por la SEQ ID NO: 6,
* el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 83 a 89, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 139 a 145, de la proteína de la envoltura del STLV-1 expuesta por la SEQ ID NO: 8,
* el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 79 a 85, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 135 a 141, de la proteína de la envoltura del STLV-2 expuesta por la SEQ ID NO: 10,
* el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 82 a 88, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 138 a 144, de la proteína de la envoltura del STLV-3 expuesta por la SEQ ID NO: 12,
* el polipéptido correspondiente a la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 14,
Figure imgf000006_0001
* el polipéptido correspondiente a la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 16,
V K K P N R N G G G Y Y L A S Y S D P C S L K C P Y L G C Q S W T C
P Y T G A V S S P Y W K F Q Q D V
* el polipéptido correspondiente a la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 18,
Figure imgf000006_0002
* el polipéptido correspondiente a la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 20,
I K K P N R N G G G Y Y L A S Y S D P C S L K C P Y L G C Q S W T C P
Y T G P V S S P Y W K F Q Q D V
* el polipéptido correspondiente a la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 22,
I K K P N R N G G G Y H S A S Y S D P C S L K C P Y L G C Q S W T C P
Y A G A V S S P Y W K F Q Q D V N F T Q E V
* el polipéptido correspondiente a la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-2, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 24,
I R K P N R Q G L G Y Y S P S Y N D P C S L Q C P Y L G S Q S W T C P Y
T A P V S T P S W N F H S D V .
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso mencionado anteriormente de polipéptidos de unión a GLUT1 como se definió anteriormente, caracterizado porque las patologías tratadas o detectadas son las siguientes:
- tumores sólidos, tales como tumores cerebrales, carcinoma de células escamosas, carcinoma hipofaríngeo, cáncer de mama, carcinoma cervical, carcinoma de ovario, cáncer de páncreas, insulinoma,
- afecciones inflamatorias, tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide,
- enfermedades inmunes o autoinmunes, tales como la miocarditis autoinmune, o en el marco de la activación de las células T CD28, o en el marco de inmunomodulación, o lupus eritematoso sistémico,
- trastornos del sistema nervioso central, tales como el síndrome de deficiencia de la proteína transportadora tipo 1 de facilitada por glucosa (GLUT1).
La invención se refiere más particularmente al uso de compuestos seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se mencionó anteriormente, y más particularmente a polipéptidos de unión a GLUT1 como se definió anteriormente, para la detección in vitro de GLUT1 en superficies celulares en el marco de procesos para el diagnóstico in vitro del síndrome de deficiencia de GLUT1, comprendiendo dichos procesos los siguientes etapas:
- poner en contacto una muestra biológica (como biopsias o células o tejido que se manifiesta o con un presunto perfil de expresión de GLUT1 aberrante) de un individuo con compuestos, y más particularmente polipéptidos, seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se definió anteriormente, estando opcionalmente dichos compuestos o polipéptidos marcados, o susceptibles de ser reconocidos por una molécula marcada,
- determinar el nivel de dichos compuestos o polipéptidos unidos a las células contenidas en la muestra biológica y la comparación con el nivel de unión de dichos compuestos a células contenidas en la muestra biológica de un individuo sano.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso de compuestos como se definió anteriormente para el diagnóstico in vitro de cánceres, caracterizado porque los compuestos usados se eligen entre los compuestos definidos anteriormente seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso tal como se definió anteriormente, de polipéptidos de unión a GLUT1, para la preparación de vectores de fármacos que contienen en su superficie dichos polipéptidos, siendo dichos vectores útiles para dirigirse a células que sobreexpresan GLUT1 para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con la sobreexpresión de GLUT1 en las superficies celulares, dichos vectores contienen moléculas activas contra dichas patologías, o que contienen genes en el marco de la terapia génica de estas patologías.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso tal como se definió anteriormente, de polipéptidos de unión a GLUT1, para la preparación de vectores de farmacológicos que contienen en su superficie polipéptidos de unión a GLUT1, siendo dichos vectores útiles para dirigirse a células tumorales que sobreexpresan GLUT1, o células involucradas en el mecanismo inflamatorio, o células activadas del sistema inmunológico, o células del sistema nervioso central, para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas como se definió anteriormente.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente al uso de polipéptidos de unión a GLUT1, para la preparación de vectores de fármacos como se definió anteriormente, en la que las moléculas activas contra las patologías son moléculas antitumorales, o moléculas contra condiciones inflamatorias, enfermedades inmunes o autoinmunes, o Trastornos del sistema nervioso central.
La memoria descriptiva también se refiere al uso de secuencias de nucleótidos que codifican compuestos de polipéptidos seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se definió anteriormente, tales como secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos definidos anteriormente, o fragmentos de los mismos, para la preparación, por sustitución de uno o varios nucleótidos de dichas secuencias de nucleótidos, de secuencias de nucleótidos mutantes que codifican polipéptidos mutantes correspondientes incapaces de unirse a GLUT1.
La memoria descriptiva también se refiere al uso de polipéptidos mutantes que no pueden unirse a GLUT1 como se definió anteriormente:
- como control negativo en el marco de la selección de compuestos capaces de unirse específicamente a los polipéptidos correspondientes no mutados y, por lo tanto, susceptibles de ser utilizados en el marco de la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV,
- para la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV.
La invención se refiere más particularmente al uso como se definió anteriormente, de polipéptidos mutantes correspondientes a los polipéptidos definidos anteriormente, en la que:
- D en la posición 106 y/o Y en la posición 114 de la proteína de la envoltura de HTLV-1 correspondiente a la SEQ ID NO: 4,
- D en la posición 102 y/o Y en la posición 110 o de HTLV-2 correspondiente a la SEQ ID NO: 6, - D en la posición 106 y/o Y en la posición 114 o de STLV-1 correspondiente a la SEQ ID NO: 8,
- D en la posición 102 y/o Y en la posición 110 o de STLV-2 correspondiente a la SEQ ID NO: 10,
- D en la posición 105 y/o Y en la posición 113 o de STLV-3 correspondiente a la SEQ ID NO: 12,
- D en la posición 18 y/o Y en la posición 26 de los polipéptidos correspondientes a las SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22 y 24,
están sustituidos por otro aminoácido, natural o no, tal como polipéptidos mutantes correspondientes a los polipéptidos mencionados anteriormente en los que dichos residuos D y/o A están sustituidos por A.
La memoria descriptiva también se refiere al uso de secuencias de nucleótidos mutantes que codifican polipéptidos mutantes correspondientes incapaces de unirse a GLUT1 como se definió anteriormente, para la preparación de células de mamíferos transgénicas que expresan dichos polipéptidos mutantes, teniendo dichas células un efecto transdominante negativo con respecto a PTLV, evitando así la infección y la diseminación de este último en el organismo.
La memoria descriptiva también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen GLUT1 representado por la SEQ ID NO: 2, o fragmentos o secuencias derivadas de las mismas, siendo dichos fragmentos o secuencias derivadas capaces de unirse a las proteínas de la envoltura de los virus de leucemia de células T de primates (PTLV), en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente a composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos mutantes correspondientes a los polipéptidos definidos anteriormente, en los que:
- D en la posición 106 y/o Y en la posición 114 de la proteína de la envoltura de HTLV-1 correspondiente a la SEQ ID NO: 4,
- D en la posición 102 y/o Y en la posición 110 o de HTLV-2 correspondiente a la SEQ ID NO: 6,
- D en la posición 105 y/o Y en la posición 113 o de STLV-3 correspondiente a la SEQ ID NO: 12,
- D en la posición 18 y/o Y en la posición 26, de los polipéptidos correspondientes a las SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22 y 24,
están sustituidos por otro aminoácido, natural o no, tal como polipéptidos mutantes correspondientes a los polipéptidos mencionados anteriormente en los que dichos residuos D y/o A están sustituidos por A,
en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.
La memoria descriptiva también se refiere a células de mamíferos transgénicos que expresan polipéptidos mutantes incapaces de unirse a GLUT1 como se definió anteriormente, teniendo dichas células un efecto transdominante negativo con respecto a PTLV, evitando así la infección y diseminación de este último en el organismo.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente a composiciones farmacéuticas que contienen células de mamíferos transgénicas como se definió anteriormente, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable. La memoria descriptiva también se refiere a vectores terapéuticos útiles para dirigirse a células que sobreexpresan GLUT1 en patologías relacionadas con una sobreexpresión de GLUT1 en superficies celulares, tal como se definió anteriormente, conteniendo dichos vectores en su superficie polipéptidos de unión a GLUT1 elegidos entre aquellos definidos anteriormente, y que contienen moléculas activas contra dichas patologías, como se definió anteriormente, o que contiene genes en el marco de la terapia génica.
La memoria descriptiva se refiere más particularmente a composiciones farmacéuticas que contienen vectores terapéuticos como se describió anteriormente, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.
La memoria descriptiva también se refiere a un método para la selección de compuestos útiles para:
* la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una infección de un individuo con un PTLV,
* la preparación de fármacos para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una sobreexpresión de GLUT1 en las superficies celulares,
* la detección in vitro de GLUT1 en las superficies celulares,
comprendiendo dicho método:
- el contacto de GLUT1 representado por la SEQ ID NO: 2, o de fragmentos o secuencias derivadas del lo mismo, siendo dichos fragmentos o secuencias derivadas capaces de unirse a las proteínas de la envoltura de los virus de leucemia de células T de primate (PTLV), o de células que expresan GLUT1, con los compuestos a ensayar,
- la selección de compuestos capaces de unirse específicamente a GLUT1, o fragmentos o secuencias derivadas de los mismos, como por ejemplo de acuerdo con el método mencionado anteriormente.
La memoria descriptiva se relaciona más particularmente con un método para la selección de compuestos útiles para la prevención o el tratamiento de patologías relacionadas con una sobreexpresión de GLUT1 en superficies celulares, y el diagnóstico in vitro de dichas patologías, que comprende las etapas descritas anteriormente:
La invención también se refiere a un método para el diagnóstico in vitro del síndrome de deficiencia de GLUT1, caracterizado porque comprende:
- poner en contacto una muestra biológica (como biopsias o células o tejido que se manifiesta o con un presunto perfil de expresión GLUT1 aberrante) de un individuo con compuestos, y más particularmente polipéptidos, seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se definió anteriormente, estando dichos compuestos o polipéptidos marcados opcionalmente, o susceptibles de ser reconocidos por una molécula marcada,
- determinar el nivel de dichos compuestos o polipéptidos unidos a las células contenidas en la muestra biológica y la comparación con el nivel de unión de dicho compuesto a células contenidas en la muestra biológica de un individuo sano.
La invención se refiere más particularmente a un método como se definió anteriormente para el diagnóstico in vitro de patologías mencionadas anteriormente.
La memoria descriptiva también se refiere a un kit para el diagnóstico in vitro de patologías relacionadas a una sobreexpresión de GLUT1 en superficies celulares, como se describió anteriormente, que comprende compuestos y más particularmente polipéptidos, seleccionados por su capacidad para unirse específicamente a GLUT1 como se definió anteriormente, estando dichos compuestos o polipéptidos opcionalmente marcados y, si es necesario, reactivos para la detección de la unión de dichos compuestos o polipéptidos a GLUT1 inicialmente presentes en las superficies celulares en la muestra biológica.
La invención se ilustra adicionalmente con la descripción detallada a continuación de la determinación de GLUT1 como un receptor específico para el RBD del PTLV.
Los virus de la leucemia de células T humanas (HTLV) tipo 1 y 2 están presentes en todas las áreas del mundo como agentes infecciosos endémicos o esporádicos [Slattery, 1999]. El papel etiológico de HTLV-1 en leucemia de células T adultas (ATL) y en la paraparesia espástica tropical/mielopatía asociada a1 HTLV (TSP/HAM) ha sido bien establecida [Poiesz, 1980; Yoshida, 1982; Gessain, 1985; Osame, 1986]. El tropismo aparentemente restringido del HTLV a linfocitos T en pacientes infectados [Cavrois, 1996; Hanon, 2000] contrasta con la capacidad de la glicoproteína de la envoltura codificada por el virus (Env) para unirse y dirigir la entrada en todos los tipos de células de vertebrados probados in vitro [Sutton, 1996; Trejo, 2000; Kim, 2003]. Las infecciones retrovirales dependen de las interacciones tempranas entre Env y los receptores celulares. La identificación de receptores celulares y correceptores para otras envolturas retrovirales ha ayudado a dilucidar ciertos aspectos de la fisiopatología del retrovirus, así como su transmisión y propagación dentro de organismos y poblaciones [Berger, 1999; Clapham, 2001; Weiss, 2002]. Sin embargo, no se ha establecido una asociación clara entre Env del HTLV y enfermedades asociadas con e1HTLV y a permanecido esquiva la identidad del receptor o receptores para Env del HTLV-1 y HTLV-2.
Se ha demostrado que numerosos componentes de la superficie celular desempeñan un papel en la formación de sincitios mediada por Env del HTLV [Niyogi, 2001; Daenke, 1999; Hildreth, 1997]. Sin embargo, la fusión de la membrana celular dependiente de Env del HTLV y la formación de sincitios parecen ser diferentes de la unión del receptor por sí misma [Denesvre, 1996; Daenke, 2000; Kim, 2000; Kim, 2003]. La búsqueda del receptor de Env del HTLV se ha visto obstaculizada en parte por su presencia universal [Sutton, 1996; Trejo, 2000; Jassal, 2001; Kim, 2003]. Además, la inducción de la formación rampante de sincitio en cultivo celular tras la expresión de Env de1HTLV [Hoshino, 1983; Nagy, 1983] ha impedido la expresión eficiente y persistente de Env. Con base en esta observación de que el dominio del terminal amino de Env del HTLV comparte una sorprendente homología estructural y funcional con la de los virus de la leucemia murina (MLV), se definió el dominio de unión al receptor de Env de1HTLV (RBD) y las herramientas derivadas de Env del HTLV que superan el problema de formación de sincitios [Kim, 2000; Kim, 2003]. Por lo tanto, se pudo seguir las interacciones específicas entre el RBD de Env y un receptor de1HTLV primario. Usando estas herramientas, se ha demostrado previamente que el receptor de1HTLV se expresa en la superficie en los linfocitos T, el reservorio principal del HTLV in vivo, solo después de la activación del receptor de células T [Manel, 2003].
En el presente documento se describen alteraciones metabólicas sorprendentes en cultivos celulares después de la expresión de envolturas del HTLV así como también dominios de unión del receptor de1HTLV. Estas alteraciones se caracterizan por un defecto en la acidificación del medio de cultivo celular asociado con una disminución de la producción de lactato y una disminución en el consumo y la captación de glucosa. Estas observaciones, así como el conocimiento de que los receptores de Env para el MLV relacionado y la mayoría de los retrovirus gamma pertenecen a la familia de transportadores que abarcan múltiples membranas [Overbaugh, 2001], nos indujo a probar las moléculas asociadas al transporte universal de glucosa y lactato como receptores para Env de1HTLV. Se mostró que el transportador universal de glucosa GLUT1, presente en todos los vertebrados, es un componente esencial y específico del receptor para HTLV. Además, la interacción de GLUT1 con las envolturas completas de HTLV-1 y HTLV-2, así como los RBD truncados de HTLV-1 y HTLV-2 altera el metabolismo de la glucosa.
Las envolturas del HTLV alteran el metabolismo del lactato.
La proliferación celular en medios de cultivo estándar está acompañada por una acidificación del medio que se traduce en un cambio de color de rojo a amarillo en presencia del indicador de pH rojo fenol. Después de la transfección de envolturas de HTLV-1 y HTLV-2 altamente sincitiales, o una envoltura quimérica no sincitial que alberga el RBD de HTLV-1 en la cadena principal de Env del MLV (H-^FEnv), el medio de cultivo no se acidificó fácilmente, y albergó tonos rojos durante varios días después de la transfección (Figura 1a). Además, la expresión de proteínas solubles del RBD del HTLV fusionadas con las etiquetas GFP, HA o rFc también inhibió la acidificación del medio. Por el contrario, ningún constructo de la envoltura que carecía del RBD del HTLV, que incluía diferentes envolturas del grupo de MLV, Env lentivirales y retrovirales de Jaagsiekte de felinos y porcinos, así como las glicoproteínas de VSV-G y Ébola, tenían este efecto. La falta de acidificación asociada con la expresión de Env de HTLV-1 o HTLV-2 no fue una consecuencia indirecta de su actividad sincitial, ya que (i) se observó una acidificación del medio en células que expresaban una Env de MLV anfotrópica sincitial (A-MLV desprovista del péptido R) (Figura 1a) y (ii) la acidificación del medio se bloqueó cuando Env del HTLV se expresó en células que son resistentes a la formación de sincitios mediada por Env del HTLV (células NIH3T3 TK-) [Kim, 2003].
La disminución del pH en el cultivo celular se debe principalmente a la acumulación extracelular de lactato [Warburg, 1956]. El lactato es el principal subproducto de la glucólisis anaeróbica in vitro y su excreción está mediada por un simportador de H+/lactato [Halestrap, 1999]. Se monitorizó el contenido de lactato en sobrenadantes de cultivo después de la transfección de varias envolturas retrovirales y RBD. La acumulación de lactato fue consistentemente 3 veces menor en las células transfectadas con H-^FEnv y RBD del HTLV que en las células de control o transfectadas con Env del MLV (Figura 1b). Esta disminución en la acumulación de lactato extracelular después de la transfección de RBD del HTLV fue dependiente de la dosis de ADN. Además, se encontró que la disminución en la acumulación de lactato después de la transfección del RBD del HTLV fue evidente tan pronto como 4 horas después de la adición de medio fresco.
Unión al receptor y metabolismo del lactato
Para examinar si existe una relación directa entre la unión del receptor de la envoltura de1HTLV y la disminución de la acidificación extracelular y la acumulación de lactato, se intentó generar mutantes del RBD de HTLV-1 (H1rbd) con capacidades alteradas de unión al receptor. Con este fin, las mutaciones que dieron lugar a sustituciones de alanina individuales se introdujeron en dos posiciones diferentes en H1rbd, D106 y Y114, que están altamente conservadas entre los virus linfotrópicos T de primate. Aunque tanto los mutantes del RBD D106A como los de Y114A se expresaron y se secretaron tan eficientemente como la H1rbd de tipo silvestre (Figura 3a), mostraron una unión significativamente reducida (D106A) o no detectable (Y114A) al receptor del HTLV detectada por el análisis FACS (Figura 3b). Además, las perturbaciones en el metabolismo del lactato se correlacionaron con la unión al receptor de1HTLV: la acumulación de lactato no se redujo en las células que expresan el mutante del RBD Y114A que no se une y se redujo mínimamente en las células que albergan el RBD D106 (Figura 3c). Se obtuvieron resultados similares con H2rbd que albergaba las mismas mutaciones alélicas. Estos datos favorecen una asociación directa entre las alteraciones metabólicas relacionadas con el lactato y la unión al receptor de Env del HTLV.
El lactato extracelular se acumula en cultivos celulares después de su transporte a través de las membranas celulares por el transportador de monocarboxilato MCT1 [Garcia, 1994]. Debido a que HTLV y MLV comparten una organización común de la envoltura extracelular [Kim, 2000] y los receptores para Env de MLV son transportadores de múltiples tramos de metabolitos [Overbaugh, 2001], se evaluó si RLV del HTLV se une a MCT1. Además, de manera similar a los datos anteriores relacionados con la expresión del receptor del HTLV en células T [Manel, 2003], la expresión de MCT1 chaperona de CD147 [Kirk, 2000] aumenta durante la activación de células T [Kasinrerk, 1992]. Sin embargo, la sobreexpresión separada y combinada de MCT1 y CD147 no resultó en un aumento de la unión de H1rbd, argumentando en contra de un papel para estas moléculas como receptores para Env de1HTLV.
Receptor del HTLV y metabolismo de la glucosa.
Además de una disminución en la acumulación de lactato extracelular, la expresión del RBD de1HTLV también condujo a una disminución del contenido de lactato intracelular, indicativo de alteraciones metabólicas secuencia arriba del transporte de lactato. En los cultivos celulares, la acumulación de lactato resulta de la degradación de la glucosa durante la glucólisis anaeróbica. Por lo tanto, se evaluó si la disminución de la acumulación de lactato observada tras la expresión del RBD del HTLV estaba relacionada con el metabolismo de la glucosa. Se midió el consumo de glucosa normalizado al contenido de proteína celular. El consumo de glucosa de las células que expresan un RBD de1HTLV dentro del contexto de la envoltura completa de H-^FEnv o el H1rbd se redujo significativamente en comparación con las células de control (Figura 1b) y este defecto fue detectable tan pronto como 8 horas después de la transfección. Para determinar si esta disminución en el consumo de glucosa correspondió a una disminución en el transporte de glucosa a través de la membrana celular, se midió la captación de 2-desoxiglucosa y fructosa en las células de control y en las células que expresan RBD del HTLV (Figura 1c). Se observó que la expresión del RBD de HTLV-1 o HTLV-2 indujo una disminución de aproximadamente 4 veces en la captación de 2-desoxiglucosa, mientras que RBD de A-MLV tuvo solo un efecto menor. Los inhibidores de la captación de glucosa, la citocalasina B y la floretina, también inhibieron la captación de glucosa. Estos resultados también fueron ciertos para el transporte de 3-O-metilglucosa. La captación de fructosa en las mismas células no se vio alterada por la presencia del RBD de HTLV-1 o HTLV-2; sin embargo, el RBD de A-MLV indujo una ligera disminución. A continuación, se evaluó el efecto de la privación de glucosa en la disponibilidad del receptor del HTLV tanto en células 293T humanas adherentes como en células T Jurkat en suspensión. Después del cultivo de células durante la noche en ausencia de glucosa, la unión de H1rbd se incrementó consistentemente dos veces en ambos tipos de células (Figura 1d). Este efecto de la privación de glucosa fue específico para HTLV, ya que la unión de RBD de MLV anfotrópico (Arbd) se vio afectada solo marginalmente (Figura 1d). Este fenómeno recuerda a un circuito general de retroalimentación de transporte de metabolitos, por lo que la disponibilidad del transportador en la superficie celular aumenta con la inanición del sustrato [Martineau, 1972].
Las envolturas del HTLV se unen al transportador 1 de glucosa
Un modelo simple mediante el cual la envoltura de HTLV inhibe el consumo de glucosa a través de la unión directa a un transportador de glucosa puede explicar los efectos metabólicos descritos anteriormente. Tras la evaluación de los diferentes candidatos del transportador de glucosa, GLUT1 parece ser el único que abarca todas las propiedades conocidas del receptor del HTLV. De hecho, la expresión de GLUT1 aumenta con la privación de glucosa y transporta la glucosa en todas las células de vertebrados [Mueckler, 1985], mientras que la fructosa es transportada por GLUT5. Además, GLUT1 no se expresa en células T primarias en reposo y su expresión se induce con la activación de células T [Rathmell, 2000; Chakrabarti, 1994] con cinéticas que son sorprendentemente similares a aquellas que se han informado para el receptor del HTLV [Manel, 2003]. Dado que se ha descrito que los eritrocitos humanos, pero no los murinos, son las células que presentan la mayor concentración de GLUT1 [Mueckler, 1994], se evaluó la disponibilidad del receptor del HTLV en los glóbulos rojos recién aislados. La unión de H1rbd en los eritrocitos humanos fue sorprendentemente eficiente, alcanzando niveles más altos que los observados en cualquier otro tipo de célula analizada, mientras que la unión de Arbd a los eritrocitos fue mínima (Figura 2a). Sin embargo, en eritrocitos murinos, no se pudo detectar una unión significativa a H1rbd, a pesar de una unión a Arbd similar en eritrocitos murinos y humanos. Además, los hepatocitos humanos primarios no expresan GLUT1. En consecuencia, fue imposible detectar la unión de H1rbd a los hepatocitos primarios humanos, mientras que la unión a Arbd se pudo detectar fácilmente.
Para probar directamente la capacidad de las envolturas del HTLV para unirse a GLUT1, se derivó un vector de expresión GLUT1 etiquetado y se sobreexpresó esta proteína en células HeLa. Tanto la unión de H1rbd como la de H2rbd aumentaron dramáticamente con la sobreexpresión de GLUT1 (Figura 4a). Esta interacción fue específica ya que el mutante defectuoso de la unión de HTLV-2, D102A, así como su contraparte HTLV-1, D106A, no se unieron a GLUT1 (Figura 4a). Además, la unión de H1 rbd y I I2rbd se mantuvo en niveles de fondo tras la sobreexpresión del receptor de la envoltura del MLV anfotrópico, el transportador de fosfato inorgánico PiT2 [Miller, 1994]. Por el contrario, la unión de Arbd no aumentó después de la sobreexpresión de GLUT1, pero como se esperaba, esta interacción aumentó con la transfección de PiT2 (Figura 4a). GLUT3 es la isoforma más cercana a GLUT1, y transporta la glucosa con una cinética similar a la de GLUT1. Por lo tanto, se derivó un vector de expresión GLUT3 etiquetado. Aunque similar los niveles de sobreexpresión de GLUT1 y GLUT3 en células 293T, GLUT3 no indujo ningún aumento en la unión de H1rbd (Figura 4b), lo que sugiere que el aumento de la unión de H1rbd en las células que sobreexpresan GLUT1 no es una consecuencia indirecta de una mayor captación de glucosa. Para determinar si las células transfectadas con GLUT1 fueron directamente responsables del aumento observado en la unión de H1RBD, se derivaron GLUT1 y GLUT3 etiquetados con fluorescencia para identificar inequívocamente las células que sobreexpresan GLUT en el curso de los análisis FACS. En este contexto, solo las células que sobreexpresan GLUT1-DsRed2 mostraron un aumento significativo en la unión a H1rbd, mientras que la sobreexpresión de GLUT3-DsRed2 no tuvo efecto en la unión a H1rbd. En consecuencia, se probó si las glicoproteínas de HTLv interactúan directamente con las proteínas GLUT1. Con este fin, se evaluó la capacidad de H1rbd para inmunoprecipitar GLUT1. Como se muestra en la Figura 4c, GLUT1 podría detectarse fácilmente tras la inmunoprecipitación con perlas Fc anticonejo cuando se coexpresó con I I1rbd, pero no se pudo detectar cuando se expresó solo o con el mutante I I1rbd Y114A.
Además, un RBD de HTLV-2 etiquetado con GFP se colocalizó con GLUT1 pero no con PiT2 según lo evaluado por microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, el transportador de glucosa GLUT1 es un componente esencial del receptor de la envoltura del HTLV.
La interacción de GLUT1 con su ligando citocalasina B inhibe el transporte de glucosa [Kasahara, 1977]. Dado que se mostró que la unión de las envolturas del HTLV a GLUT1 inhibe el consumo y la captación de glucosa, se probó si la citocalasina B anularía la unión del RBD del HTLV. De hecho, el tratamiento con citocalasina B de las células T Jurkat inhibió drásticamente la unión de H1rbd, mientras que la unión de Arbd no se vio afectada (Figura 5). Por lo tanto, el transporte de glucosa dirigido por GLUT1, así como la unión de las envolturas de1HTLV a GLUT1, son inhibidos de manera similar por el ligando citocalasina B. En conjunto, estos datos demuestran que GLUT1 es un receptor para envolturas del HTLV.
El receptor vírico permite la entrada y, por lo tanto, la infección. No existe actualmente ningún sistema celular que carezca de expresión de GLUT1. Por lo tanto, se desarrolló un sistema en el que la infección por e1HTLV se inhibe específicamente a nivel de la interacción envoltura-receptor. En este sistema, la sobreexpresión del RBD de HTLV-2 interfiere con la infección de partículas del HTLV entrantes y reduce específicamente los títulos de1HTLV en al menos 2 log, mientras que no se detecta ningún efecto en los títulos de A-MLV de control. Para determinar si GLUT1 es un receptor de entrada para HTLV, se sobreexpresó GLUT1, GLUT3 o Pit2 además de1H2rbd interferente. Mientras que Pit2 y GLUT3 no tuvieron efecto en los títulos del HTLV, GLUT1 alivió completamente la interferencia a la infección inducida por H2rbd (Figura 5). Curiosamente, tanto GLUT1 como GLUT3, pero no Pit2, aliviaron la alteración del metabolismo de la glucosa inducida por el RBD del HTLV. Por lo tanto, GLUT1 es un receptor de entrada para HTLV.
Discusión
En el presente se muestra que las envolturas de HTLV-1 y HTLV-2 interactúan con GLUT1 a través de sus dominios de unión al receptor. Esta interacción inhibe fuertemente el consumo de glucosa y la captación de glucosa, lo que conduce a una menor producción de lactato y un bloqueo en la acidificación del medio extracelular. Las mutaciones que alteraron específicamente la unión del receptor de las envolturas del HTLV-1 y HTLV-2 liberaron el bloqueo en el consumo de glucosa, lo que indica una correlación directa entre los determinantes de la unión del receptor en las envolturas del HTLV y el transporte de glucosa. La falta de glucosa fue seguida rápidamente por un aumento de la unión de las envolturas del HTLV, destacando un circuito de retroalimentación negativa que detecta los nutrientes entre la disponibilidad de glucosa y la expresión del receptor del HTLV de la superficie celular. Evidencia adicional convergió para identificar a GLUT1 como el receptor, incluido un aumento de la unión de RBD de1 HTLV tras la sobreexpresión de GLUT1 pero no de GLUT3, la inmunoprecipitación de GLUT1 por H1rbd pero no el mutante H1rbd Y114A de unión al receptor, la unión principal del RBD del HTLV en eritrocitos humanos donde GLUT1 es la isoforma principal del transportador de glucosa, y no hay unión del RBD del HTLV en hepatocitos primarios humanos y eritrocitos murinos, donde GLUT1 se expresa de manera mínima. Finalmente, GLUT1 podría aliviar específicamente la interferencia a la infección inducida por RBD del HTLV. GLUT1 se ajusta a todas las demás propiedades conocidas del receptor del HTLV. De hecho, como se demostró anteriormente para el receptor de1HTLV [Manel, 2003], GLUT1, pero no las isoformas GLUT 2-4, no se expresan en linfocitos T en reposo [Chakrabarti, 1994; Korgun, 2002] y se induce tras la activación inmunológica [Frauwirth, 2002; Yu, 2003] o farmacológica [Chakrabarti, 1994]. Además, los ortólogos de GLUT1 están altamente conservados entre los vertebrados, pero son altamente divergentes entre los vertebrados y los insectos [Escher, 1999].
Por lo tanto, GLUT1 es un nuevo miembro de los transportadores de metabolitos que abarcan múltiples membranas que sirven como receptores para envolturas retrovirales. Curiosamente, hasta ahora, todos las envolturas que reconocen estos receptores han sido codificadas por retrovirus que tienen la llamada organización genética simple, tal como el MLV, los virus de la leucemia felina, el retrovirus endógeno porcino y el virus de la leucemia del mono gibón [Overbaugh, 2001], mientras que HTLV pertenece a los llamados retrovirus complejos que codifican varias proteínas reguladoras adicionales. Sin embargo, se ha demostrado que, a diferencia de la amplia divergencia filogenética de su ARN genómico, las envolturas del HTLV y MLV comparten una organización modular similar con algunos motivos de aminoácidos altamente conservados en sus respectivos dominios de unión al receptor [Kim, 2000].
El contacto célula a célula parece ser necesario para la transmisión del HTLV, y el citoesqueleto parece jugar un papel importante en este proceso [Igakura, 2003]. De hecho, se observó que el receptor de1HTLV, a pesar de la expresión pancelular, se concentra específicamente en las regiones móviles de la membrana y en las áreas de contacto de célula a célula. Por lo tanto, se debe esperar que el receptor de la envoltura de1HTLV esté asociado al citoesqueleto. De manera importante, se ha informado que un asociado de unión citoplásmica de GLUT1, GLUT1CBP, que codifica un dominio PDZ, vincula GLUT1 al citoesqueleto [Bunn, 1999]. Por lo tanto, será interesante evaluar las funciones respectivas de la envoltura del HTLV, sus socios celulares asociados al citoesqueleto, tales como GLUT1, GLUT1CBP y sus componentes celulares de interacción inmediata.
Debido a que la expresión del receptor del HTLV se induce tras la inanición de la glucosa, la transmisión de1HTLV puede ser más eficiente en células que carecen localmente de glucosa, tal como los linfocitos en los ganglios linfáticos [Yu, 2003]. Además, la capacidad de los eritrocitos circulantes para acoplar e1HTLV, como se muestra en este documento, podría proporcionar un medio para distribuir el HTLV a dichos tejidos.
La identificación de GLUT1 como un receptor para envolturas del HTLV proporciona pistas adicionales en cuanto a la expresión in vitro universal del receptor en líneas celulares y la restricción paradójica del tropismo de1HTLV a linfocitos T in vivo. Es probable que se produzcan alteraciones metabólicas rápidas y dramáticas asociadas con el bloqueo del consumo de glucosa tras la expresión de la envoltura del HTLV in vivo, inmediatamente después de la infección. Por lo tanto, se propone que in vivo, la infección por HTLV se propaga inicialmente con un gran tropismo; sin embargo, temprano después de la infección, la gran mayoría de las células que dependen en gran medida de la actividad de GLUT1 se eliminan rápidamente. Por el contrario, los linfocitos T en reposo que tienen una tasa metabólica extremadamente baja y como tales dependen mucho menos de la captación de glucosa, pueden tolerar este efecto y, por lo tanto, se mantienen in vivo. Además, los desequilibrios locales en el acceso a la glucosa después de la infección por HTLV pueden conducir a alteraciones fisiológicas específicas [Akaoka, 2001]. En este sentido, será de interés estudiar la posible relación entre las neuropatologías asociadas a HTLV y la dependencia específica de las neuronas en el consumo de glucosa mediado por GLUT1 [Siegel, 1998].
Métodos
Cultivo celular. Se cultivaron células 293T de riñón embrionario humano y de carcinoma cervica1HeLa en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa (4,5 g/L) y se cultivaron células T Jurkat en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 °C en una atmósfera de aire del 95% y 5% de CO2. Para los experimentos de inanición de glucosa, las células se cultivaron en DMEM sin glucosa (Life Technologies) o RPMI sin glucosa (Dutscher) con FBS dializado al 10% (Life Technologies) y se complementó con glucosa (1 g/L) cuando se indico.
Vectores de expresión. Los vectores de expresión de envoltura de longitud completa para HTLV-1 (pCEL/2 [Denesvre, 1995]) y MLV ecotrópico Friend (pCEL/F [Denesvre, 1995]), se han descrito previamente. Para la envoltura de1HTLV-2, se insertó un fragmento de pHTE2 [Rosenberg, 1998] que abarca los genes tax, rex y env y inserto LTR 3' en el vector pCSI [Battini, 1999] (pCSIX.H2). Los vectores de expresión de envoltura de longitud completa para MLV anfotrópico (pCSI.A), o desprovistos de su péptido R (pCSI.AAR), y H-isaFEnv que contiene los 183 aminoácidos del terminal N del dominio de unión al receptor de HTLV-1 en el fondo de la envoltura de F-MLV, así como vectores de expresión de envoltura truncados, derivados de pCSI y que codifican cualquiera de los primeros 215 residuos de SU de HTLV-1 (H1 rbd), los primeros 178 residuos del IITI—^/-2-SU (I H2rbd) o los pri^neros 397 residuos de SU del virus de leucemia murina anfotrópica de SU (MLV) (Arbd), fusionado a una etiqueta Fc de IgG de conejo en el terminal C (rFc) o a EGFP (H2rbd-GFP). Todas las mutaciones puntuales introducidas en los constructos del RBD de HTLV-1 y HTLV-2 se generaron utilizando el método de mutagénesis dirigida al sitio de QuikChange y las mutaciones se verificaron mediante secuenciación. El ADNc de Glutl y Glut3 humanos se amplificó mediante PCR a partir de la biblioteca de ADNc de pLib HeLa (Clontech), y se insertaron en pCHIX, una versión modificada del vector pCSI que contiene un casete que comprende un sitio de escisión del factor Xa, dos copias de la etiqueta de hemaglutinina (HA), y una etiqueta de histidina. El constructo resultante (pCHIX.hGLUT1) codifica una proteína GLUT1 con una etiqueta HA-His en el extremo terminal C. GLUT1 y GLUT3 también se insertaron en un vector pCSI modificado que contiene una etiqueta en el terminal C de DsRed2. De manera similar, se amplificó CD147 humana a partir de a Rn total de 293T mediante RT-PCR y se insertó en la cadena de pCHIX en el marco con la etiqueta HA-His (pCHIX.hCD147).
Expresión de la envoltura y mediciones metabólicas. Se transfectaron células 293T con los diversos vectores de expresión de la envoltura usando una versión modificada del método de fosfato de calcio. Después de una transfección durante la noche, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadió medio fresco. Los medios se recolectaron en los puntos de tiempo indicados, se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 |jm y el lactato y la glucosa se midieron con kits de diagnóstico enzimático (Sigma). Los valores se normalizaron al contenido de proteína celular utilizando el ensayo de Bradford (Sigma) después de la solubilización de células en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, dodecil sulfato de sodio al 0,1%, Nonidet P-40 al 1,0%, desoxicolato al 0,5%) y clarificación por centrifugación.
Ensayo de captación de hexosa. Se obtuvieron 2-desoxi-D[1-3H]glucosa, D[U-14C]fructosa y 3-O-[14C]metil-D-glucosa a través de Amersham. El ensayo de captación de hexosa se adaptó de Harrison et al., (REF. HARRISON 1991). Después de la transfección, se sembraron aproximadamente 250.000 /pozo en placas de 24 pozos. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces en PBS, se incubaron en DMEM sin suero, se lavaron una vez en DMEM sin suero sin glucosa y se incubaron durante 20' en 500 jL de inhibidores del módulo DMEM sin suero sin glucosa (citocalasina B 20 jM , floretina 300 jM ; SIGMA). La captación se inició mediante la adición de hexosas marcadas hasta una concentración final de 0,1 mM (2 jC i/mL para 2-2-desoxi-D[1-3H]glucosa y 0,2 jC i/mL para D[U-14C]fructosa y 3-O-[14C]metil-D-glucosa] y las células se incubaron durante 5' minutos adicionales. Las células se resuspendieron luego en 500 jL de DMEM sin suero sin glucosa frío, se lavaron una vez en DMEM sin suero sin glucosa y se solubilizaron en 400 jL de SDS al 0,1%. Se utilizaron 3 jL para la normalización de Bradford, mientras que el resto se usó para la detección de 3H o 14C mediante centelleo líquido en un contador Beckman.
Transferencias Western. Se sometieron el medio de cultivo (10 j L) de células 293T que expresan RBD de HTLV-1 de tipo silvestre o mutante, y/o vector de expresión de GLUT1 o GLUT3 a electroforesis en geles de acrilamida al 15% con SDS, se transfirieron a nitrocelulosa (Protran; Schleicher & Schuell), se bloquearon en PBS que contenía leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,5%, se probaron con una dilución 1:5000 de inmunoglobulina anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante o dilución 1:2000 de anticuerpo monoclonal anti-HA 12CA5 (Roche) seguido por una dilución 1:5000 de inmunoglobulina anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante, y se visualizaron usando con un kit de quimioluminiscencia mejorado (Amersham).
Ensayos de unión. Los ensayos de unión se llevaron a cabo como se describió anteriormente [Manel, 2003]. Brevemente, se incubaron 5 x 105 células (293T, HeLa, Jurkat o eritrocitos humanos recién aislados) con 500 j L de sobrenadantes de H1rbd, H2rbd o Arbd durante 30 min a 37 °C, se lavaron con PBA (BSA al 1%, y azida de sodio 0,1% en PBS), y se incubaron con un anticuerpo anti-IgG de conejo de oveja conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Sigma). Cuando se indicó, se añadió citocalasina B (20 j M; Sigma) a las células durante 1 hora antes de los análisis de unión. La unión se analizó en un FACSCalibur (Becton Dickinson) y el análisis de los datos se realizó con los software CellQuest (Becton Dickinson) y WinMDI (Scripps).
Infecciones. Se transfectaron células 293T en una placa de 6 pozos y, un día después de la transfección, el medio se reemplazó por DMEM con alto contenido de glucosa complementado con fructosa (5 g/L) y aminoácidos no esenciales. Al día siguiente, la infección se inició mediante la adición de sobrenadantes que contenían partículas MLV pseudotipadas ya sea con envolturas de HTLV-2 o A-MLV. Al día siguiente, se añadió medio fresco y, 24 horas después, las células se fijaron y se tiñeron para determinar la actividad de fosfatasa alcalina y se contó el foco oscuro de la infección. Las partículas virales se obtuvieron transfectando células 293T con pLAPSN, pGagPol y pCSIX.H2 o pCSI.A, y se recogieron los sobrenadantes filtrados a través de 0,45 jm 24 horas después.
Leyenda de la Figuras
Figura 1. La expresión del dominio de unión al receptor del HTLV altera el metabolismo celular. a) Acidificación del medio y formación de sincitios en células 293T un día después de la transfección con vectores de expresión de ADN o Env de control, incluidos Env de HTLV-1 y el Env del HTLV-2 de tipo silvestre sincitiales, un H-^FEnv quimérico no sincitial, y Env de A-MLV AR sincitial. b) el lactato extracelular y la glucosa en el medio de cultivo de células 293T se midieron dos días después de la transfección con un ADN irrelevante (control), vectores de expresión de Env de F-MLV, H-i8aFEnv, RBD de HTLV-1 (H1 rbd) o RBD del MLV (Arbd) anfotrópico. Las concentraciones de lactato y glucosa se normalizaron al contenido de proteína celular. c) Captación de 2-desoxiglucosa y fructosa después de la transfección de 293T con un ADN irrelevante (control), vectores de expresión H1rbd, H2rbd o Arbd. Las células de control también se incubaron con inhibidores del transportador de glucosa citocalasina y floretina. Los datos son las media de las mediciones por triplicado y son representativos de dos a tres experimentos independientes. d) Se monitorizó la expresión de los receptores del HTLV y de MLV anfotrópicos en células 293T (1) y T Jurkat (2) cultivadas durante la noche en presencia o ausencia de glucosa mediante la unión de H1rbd y Arbd, respectivamente.
Figura 2. Las propiedades del receptor de HTLV se correlacionan con las propiedades de GLUT1. a) Expresión de los receptores de HTLV y MLV anfotrópico en la superficie de eritrocitos humanos y murinos, así como hepatocitos primarios humanos. b) Unión de H1rbd y Arbd a células Jurkat en ausencia o presencia del inhibidor citocalasina B de GLUT1.
Figura 3. La unión del receptor de HTLV se correlaciona con el metabolismo alterado de lactato. a) La expresión de H1 rbd y los mutantes derivados D106A y Y114A se monitorizaron mediante análisis de transferencia Western de los sobrenadantes de células 293T después de la transfección con los diversos plásmidos de expresión. b) unión de H1rbd y los mutantes D106A y Y114A al receptor del HTLV en células HeLa. c) Lactato extracelular en el medio de células 293T un día después de la transfección con un ADN irrelevante (control), H1rbd o los mutantes D106A y Y114A de H1 rbd. L—os datos son representativos de tres experî nentos independientes.
Figura 4. GLUT1 es un receptor para envolturas del HTLV. a) La unión de H1rbd, H2rbd, mutante D102A de H2rbd y Arbd a células 293T de control o células 293T que sobreexpresan GLUT1 o PiT2. b) unión de H2rbd-EGFP a células que sobreexpresan GLUT1-HA o GLUT3-HA, y las correspondientes inmunotransferencias utilizando un anticuerpo anti-HA. c) Inmunoprecipitación de GLUT1-HA de células 293T transfectadas con un constructo irrelevante, GLUT1 únicamente, H1rbd únicamente, Y114A de H1rbd únicamente, GLUT1 con H1rbd o GLUT1 con vectores de expresión Y114A de H1 rbd. La inmunoprecipitación se realizó utilizando perlas Fc anti-conejo y se sondearon con un anticuerpo anti-HA. Los extractos celulares totales se transfirieron usando un Fc anti-conejo o un anticuerpo anti-HA.
Figura 5. GLUT1 es un receptor de entrada para HTLV. El título de las infecciones de pseudotipos de partículas de MLV con envolturas de HTLV-2 o A-MLV en células 293T después de la transfección de un vector de expresión de H2rbd irrelevante o interferente solo o además de los vectores de expresión GLUT1, GLUT3 o Pit2.
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Uso de polipéptidos en un método in vitro para diagnosticar el síndrome de deficiencia de la proteína transportadora de glucosa tipo I (GLUT1), en el que dichos polipéptidos consisten en las proteínas de la envoltura del PTLV, o fragmentos derivados de las mismas, seleccionándose dichos polipéptidos o fragmentos por su capacidad para unirse específicamente al transportador universal de glucosa en vertebrados GLUT1 que consiste en la SEQ ID NO: 2.
2. El uso de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método in vitro para diagnosticar el síndrome de deficiencia de GLUT1 comprende las siguientes etapas:
- poner en contacto una muestra biológica de un individuo con dicho polipéptido, estando dicho polipéptido opcionalmente marcado, o susceptible de ser reconocido por una molécula marcada, y
- determinar el nivel de dicho polipéptido unido a las células contenidas en la muestra biológica y comparar dicho nivel con el nivel de unión de dicho polipéptido a células contenidas en la muestra biológica de un individuo sano.
3. El uso de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los polipéptidos pueden unirse a al menos uno de los siguientes fragmentos de GLUT1:
- SEQ ID NO: 25: NAPQKVIEEFY,
- SEQ ID NO: 26: NQTWVHRYGESILPTTLTTLWS,
- SEQ ID NO: 27: KSFEMLILGR,
- SEQ ID NO: 28: DSIMGNKDL,
- SEQ ID NO: 29: YSTSIFEKAGVQQP,
- SEQ ID NO: 30: EQLPWMSYLS,
- SEQ ID NO: 31: QYVEQLC,
- SEQ ID NO: 32: IVGMCFQYVEQLC.
4. El uso de polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los polipéptidos pueden unirse a al menos el siguiente fragmento de GLUT1:
- SEQ ID NO: 32: IVGMCFQYVEQLC.
5. El uso de polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los polipéptidos de unión a GLUT1 se eligen entre los siguientes:
- la proteína de la envoltura del HTLV-1 expuesta por la SEQ ID NO: 4, o de la HTLV-2 expuesta por la SEQ ID NO: 6. o de la STLV-1 expuesta por la SEQ ID No : 8, o de la STLV-2 expuesta por la SEQ iD NO: 10, o de la STLV-3 expuesta por la SEQ ID NO: 12,
- fragmentos de las proteínas de la envoltura del PTLV, estando dichos fragmentos de polipéptidos delimitados en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 1 a 90, o en la posición 75 a 90, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 135 a 245, o en la posición 135 a 150, de dichas proteínas de la envoltura del PTLV, expuesta por las SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12,
- fragmentos de las proteínas de la envoltura del PTLV, correspondiendo dichos fragmentos a los siguientes polipéptidos:
o el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 83 a 89, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 139 a 145, de la proteína de la envoltura de la cepa MT-2 del HTLV-1 expuesto por la SEQ ID NO: 4,
o el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 79 a 85, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 135 a 141, de la proteína de la envoltura de la cepa NRA de HTLV- 2 expuesta por la SEQ ID NO: 6,
o el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 83 a 89, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 139 a 145, de la proteína de la envoltura del STLV-1 expuesta por la SEQ ID NO: 8,
o el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 79 a 85, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 135 a 141, de la proteína de la envoltura del STLV-2 expuesta por la SEQ ID NO: 10,
o el polipéptido delimitado en su extremo terminal N por el aminoácido ubicado en la posición 82 a 88, y en su extremo terminal C por el aminoácido ubicado en la posición 138 a 144, de la proteína de la envoltura del STLV-3 expuesta por la SEQ ID NO: 12,
o el polipéptido que consiste en la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1 , teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 14,
o el polipéptido que consiste en la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1 , teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 16,
o el polipéptido que consiste en la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1 , teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 18,
o el polipéptido que consiste en la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1 , teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 20,
o el polipéptido que consiste en la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-1 , teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 22,
o el polipéptido que consiste en la proteína de la envoltura de una variante de HTLV-2, teniendo dicho polipéptido la siguiente secuencia SEQ ID NO: 24.
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