ES2741830T3 - Celobiosa deshidrogenasa - Google Patents
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Abstract
El procedimiento de obtención de una celobiosa deshidrogenasa (CDH) que tiene actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior, en el que dicha actividad se define como que comprende la transferencia de electrones intramolecular (IET) o la transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), en el que IET o DET se determinan mediante un ensayo de cyt c o en un electrodo DET, respectivamente, y tienen una actividad específica para la oxidación de la glucosa determinada mediante un ensayo de citocromo c a pH 7,4 superior a 0,5 U/mg, comprendiendo el procedimiento la etapa de aislamiento de la CDH de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hematostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi, o la modificación de la CDH de Myriococcum thermophilum, comprende una flavina y un dominio hemo, en el que la transferencia de electrones de la flavina al dominio hemo se ha incrementado en comparación con el de CDH tipo silvestre de Myriococcum thermophilum por una mutación del dominio hemo en uno cualquiera de los aminoácidos 172-203, preferiblemente de uno cualquiera de los aminoácidos 176, 179-182, 195, 196, 198, 201 correspondiente a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1 y/o del dominio de flavina en uno cualquiera de los aminoácidos 565-577 correspondientes a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1.
Description
DESCRIPCIÓN
Celobiosa deshidrogenasa
La presente invención se refiere a enzimas de celobiosa deshidrogenasa (CDH), modificaciones de las mismas y usos electroquímicos.
La celobiosa deshidrogenasa (EC 1,1,99,18, CDH) se descubrió por primera vez en 1974 en el sistema enzimático extracelular de Phanerochaete chrysosporium y luego en varios otros hongos basidiomicetos. Una característica especial de esta enzima es su composición: la combinación de un dominio de flavina catalíticamente activo, que alberga un FAD unido no covalentemente, y un dominio hemo, con un hemo b como cofactor. Ambos dominios están conectados por un enlazador flexible. Por su actividad catalítica, el sustrato natural de la celobiosa se oxida en una reacción que reduce el FAD del dominio de flavina. Posteriormente, el FAD puede ser reoxidado por la acción del dominio hemo. Las características espectrales de una CDH típico muestran claramente la presencia de ambos cofactores. Otra característica descrita es la fuerte discriminación de la glucosa de todas las enzimas bien caracterizadas. Hasta el descubrimiento del hongo ascomiceto Myriococcum thermophilum (Stoica et al., 2005, Biosensors and Bioelectronics 20: 2010-2018; Harreither et al., 2007, Electroanalysis 19: 172-180), se creía que CDH inhibía fuertemente la conversión de glucosa (Henriksson et al., 1998, Biochimica Biophysica Acta 1383: 48-54). De manera similar, durante mucho tiempo solo se conocieron CDH que presentaban una actividad ácida óptima, especialmente cuando el dominio del hemo está involucrado en la catálisis, ya que depende de la transferencia de electrones intramolecular (IET), que es necesaria para transferir electrones a través del hemo al aceptor de electrones. Este es el caso del citocromo c en los ensayos enzimáticos, así como en las superficies de los electrodos, en los que el dominio hemo permite la transferencia directa de electrones (DET) al electrodo.
Las aplicaciones electroquímicas descritas en la literatura son la detección de celobiosis, celooligosacáridos, celodextrinas solubles en lactosa y maltosa, compuestos orto- y para-difenólicos (Lindgren et al., 1999, Analyst 124: 527-532) y catecolaminas (Stoica et al., 2004, Analytical Chemistry, 76: 4690-4696) principalmente por transferencia de electrones mediada (MET). Hasta ahora, la aplicación en biosensores de glucosa basada en las propiedades de transferencia directa de electrones (DET) de CDH se evitó mediante i) un recambio de glucosa muy bajo o nulo, ii) el pH ácido óptimo de la mayoría de las CDH conocidas y iii) un mal desempeño de algunas CDH en electrodos.
Aunque se conoce una CDH con IET que funciona bien a valores de pH neutro o alcalino (del hongo Humicola insolens), se demostró que no convierte la glucosa (Schou et al., 1998, Biochemical Journal 330: 565-571). En los cultivos de Myriococcum thermophilum (Harreither et al., 2007, Electroanalysis 19: 172-180) se encontró una CDH actualmente conocido para convertir la glucosa con un volumen de rotación significativo. Sin embargo, esta enzima tiene un pH ácido óptimo para el IET y no muestra actividad en condiciones de pH fisiológico (pH 7,4). Otra obstrucción es la comunicación electrónica a veces mala de una CDH con una superficie de electrodo, como e1Humicola insolens y las CDH de Sclerotium rolfsii (Lindgren et al., 2001, Journal of Electroanalytical Chemistry 496: 76-81), lo que da como resultado densidades de corriente muy bajas y por lo tanto señales bajas incluso con el sustrato natural celobiosa.
Harreither et al. (Electroanalysis, 19 (2-3) (2007): 172-180) describe los ensayos de actividad de transferencia de electrones directa de CDH medidos en un electrodo. La actividad a diferentes valores de pH se determinó con lactosa o celobiosa como sustratos. Aunque, la glucosa se acepta como un sustrato en el pH óptimo, no se proporciona información de la actividad de CDH en la glucosa a un pH de 7,4. Como se muestra en los ejemplos comparativos de este documento, la actividad de la CDH de tipo silvestre de M. thermophilum disminuye bruscamente a valores de pH neutro por encima de pH 5,5 y no tiene actividad en la glucosa a pH 7,4.
Zamocky et al. (Prot. Expr. Pur. Acad. Press; 59 (2) (2007): 258-265) describe la CDH de M. thermophilum de tipo silvestre y su actividad DCIP cuando se usa citrato como sustrato. La actividad DCIP no se relaciona con la actividad IEP de la catálisis de las reacciones de oxidación de carbohidratos en un electrodo.
Base de datos UniProt, Acc. No. A9XK88 describe la secuencia CDH de tipo silvestre de M. thermophilum.
El documento US 6 033 891 A describe una CDH de Humicola insolens que no tiene una actividad oxidante de la glucosa.
Base de datos EMBL, Acc. No. AF074951, AAY82220 y AAZ95701 proporcionan secuencias de CDH de Thielavia heterothallica. Esta enzima no tiene actividad sobre la glucosa a pH 7,4.
Zamocky et al. (Current protein and peptide science, 7 (3) (2006); 255-280) proporciona una revisión de las CDH de basidomicetos y ascomicetos.
Por lo tanto, la actividad de CDH en glucosa en condiciones neutrales, que es necesaria para aplicaciones en, por ejemplo, fluidos fisiológicos, no es satisfactoria, en particular para la medición electroquímica de la glucosa o la generación de electricidad en células de biocombustibles. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una enzima alternativa adecuada para convertir la glucosa en intervalos de pH fisiológico, en particular en electrodos basados en DET.
Por lo tanto, en una primera realización, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener una celobiosa deshidrogenasa (CDH) que tiene actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior, en el que dicha actividad se define como que comprende la transferencia de electrones intramolecular (IET) o la transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), y que tiene una actividad específica para la oxidación de la glucosa determinada por un ensayo del citocromo c a un pH de 7,4 u superior a 0,5 U/mg, comprendiendo el procedimiento la etapa de aislar la CDH de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi, o la modificación de la CDH de Myriococcum thermophilum, que comprende una flavina y un dominio hemo, en el que la transferencia de electrones de la flavina al dominio hemo se incrementa en comparación con la CDH natural de Myriococcum thermophilum por una modificación de la dominio hemo en cualquiera de los aminoácidos 172-203, preferiblemente de cualquiera de los aminoácidos 176, 179-182, 195, 196, 198, 201 correspondientes a la M. thermophilum CDH de SEQ ID NO: 1 y/o del dominio de flavina en cualquiera de los aminoácidos 565-577 correspondientes a M. thermophilum CDH de SEQ ID NO: 1. La invención proporciona además una celobiosa deshidrogenasa que tiene actividad de oxidación de glucosa en un pH de 7,4 o superior, en la que dicha actividad se define como la transferencia de electrones intramolecular (IET) o la transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), y que tiene una actividad específica para la oxidación de la glucosa determinada por un ensayo de citocromo c a pH 7,4 o superior de 0,5 U/mg,
i) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o
ii) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 90 %, idéntica a la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11; o iii) que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 90 %, idéntica a los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos tiene al menos sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos adicional a la secuencia de SEQ ID NO: 1, que aumenta la transferencia de electrones desde la flavina al dominio hemo en comparación con la CDH de -tipo silvestre de M. thermophilum de SEQ ID NO: 1 y la modificación es una modificación del dominio hemo de cualquiera de los aminoácidos 172-203, preferiblemente de cualquiera de los aminoácidos 176, 179-182, 195, 196, 198, 201 correspondientes al M. thermophilum CDH de la s Eq ID NO: 1 y/o del dominio de flavina de uno cualquiera de los aminoácidos 565-577 correspondientes a la M. thermophilum CDH de la SEQ ID NO: 1. Según la invención, se ha encontrado sorprendentemente que ciertos CDH tienen una actividad oxidante de la glucosa adecuada en condiciones de pH fisiológico. Además, la invención proporciona la modificación de las CDH ácidas para aumentar su actividad a pH 7,4 y superior.
El término "celobiosa deshidrogenasa" se define aquí como una enzima que consiste en un dominio de flavina y un dominio hemo conectado por un enlazador peptídico, que oxida carbohidratos como sus sustratos naturales celobiosa y celooligosacáridos y otros como lactosa, maltosa y en particular glucosa para usos de la invención preferidos. La reoxidación del cofactor del dominio de flavina se puede lograr mediante oxidación directa mediante aceptores de dos electrones, incluidas quinonas como 2,6-dicloroindofenol, o- o p-benzoquinona o sus derivados, azul de metileno, verde de metileno, azul de Meldola o receptores de un electrón como ferricianuro de potasio, hexafluorofosfato de ferricenio, FeCh o por transferencia intramolecular de electrones (IET) al cofactor del dominio del hemo y además a un aceptor de electrones terminal como el citocromo c (cyt c) o una superficie de electrodo.
El dominio flavina de la CDH, que es responsable de la actividad de oxidación de la glucosa y el dominio hemo, responsable de la regeneración del dominio de la flavina, puede tener dos valores óptimos de pH diferentes, como en el caso de la CDH natural de Myriococcum thermophilum. En principio, el dominio del hemo se puede omitirPARR14 proporcionando al dominio de la flavina oxidantes como el 2,6-dicloroindofenol, que puede reoxidar directamente el dominio de la flavina sin el dominio del hemo. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, debe entenderse que la CDH tiene una actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 por la acción tanto de la flavina como del dominio hemo (IET) como puede, por ejemplo. medirse por el ensayo cyt c o por medición después de la inmovilización en la superficie de un electrodo (DET -transferencia directa de electrones- al electrodo). El dominio hemo actúa como un transmisor de electrones intermedio entre cyt c y el dominio de flavina o entre la superficie del electrodo y el dominio de flavina, respectivamente.
La CDH natural de tipo silvestre de M. thermophilum no tiene la actividad de oxidación de la glucosa de la invención a un pH de 7,4 por acción tanto de la flavina como del dominio hemo. La presente invención ha proporcionado ahora por primera vez una modificación de la CDH de M. thermophilum que tiene la actividad de oxidación de glucosa deseada. Esta modificación de acuerdo con la presente invención debe entenderse ahora en el sentido de que la CDH de M. thermophilum de la invención se desvía de la CDH de M. thermophilum de tipo silvestre por el aumento sustancial de la actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4. Esta modificación se puede facilitar aumentando la interacción entre la flavina y los dominios hemo, por ejemplo. modificando aminoácidos clave específicos responsables de esa interacción como se describe más adelante en este documento. Preferiblemente, aumentar la interacción incluye aumentar los contactos o la energía de interacción entre los dominios. Una predicción de tales modificaciones puede hacerse fácilmente mediante procedimientos computacionales usando, por ejemplo, campos de fuerza basados en cálculos de energía. Además, la interacción puede determinarse midiendo la actividad de la proteína como se describe en el presente documento. Además, es posible aumentar la dependencia del pH del dominio hemo a un pH más básico. El pH óptimo del dominio de flavina de la CDH natural de M. thermophilum podría en principio tener las
propiedades de pH requeridas para oxidar la glucosa, como es el caso, por ejemplo. mostrado en la Figura 2f (mediante la medición del ensayo de 2,6-dicloroindofenol (DCIP)).
También se proporcionan preparaciones de enzimas que comprenden nuevas CDH. El término "enzima" o "preparación de enzima", como se usa en el presente documento, se refiere a una celobiosa deshidrogenasa de un organismo específico que es al menos aproximadamente 20 % puro, preferiblemente al menos aproximadamente 40 % puro, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 60 % puro, incluso más preferiblemente al menos 80 % de pureza y lo más preferiblemente al menos 90 % de pureza como se determina por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).
La presente invención se refiere a celobiosa deshidrogenasas aisladas de nuevos productores o modificadas por ingeniería genética a partir de andamios de proteínas existentes, que son capaces de oxidar la glucosa más eficazmente que las celobiosas deshidrogenasas conocidas actualmente. Las constantes cinéticas de las enzimas responsables de este efecto son, preferiblemente, un valor Km más bajo y un valor kcat más alto para la glucosa que las enzimas caracterizadas actualmente (por ejemplo, Phanerochaete chrysosporium CDH: Km = 1600 mM, kcat = 2,64 s-1, Henriksson et al., 1998, Biochimica and Biophysica Acta 1383: 48-54; Humicola insolens CDH: no se detectó conversión de glucosa, Schou et al., 1998, Biochemical Journal 330: 565-571; Trametes villosa CDH: Km = 1300 mM, kcat = 1,92 s-1, Ludwig et al., 2004, Applied Microbiology and Biotechnology 64: 213-222). Además, los valores de km y kcat para la oxidación de la glucosa de las enzimas de la invención deben estar a un pH de 7,4.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una celobiosa deshidrogenasa de la SEQ ID NO: 5 (Chaetomium atrobrunneum), la SEQ ID NO: 7 (Corynascus thermophilum), la SEQ ID NO: 3 (Hypoxylon hemoatostroma), la SEQ ID NO: 11 (Neurospora crassa) y SEQ ID NO: 9 (Stachybotrys bisbyi). Además, se proporcionan enzimas homólogas que tienen actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos El 98 %, en particular, prefirió al menos el 99 %, idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.
En realizaciones preferidas, la CDH de Chaetomium atrobrunneum comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. La CDH está fácilmente disponible en C. atrobrunneum utilizando los procedimientos de aislamiento descritos en este documento. En un aspecto relacionado adicional, la presente invención también proporciona una CDH que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 83 %, preferiblemente al menos 85 %, al menos 88 %, al menos 90 % , al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, idéntico a la SEQ ID NO: 5.
En realizaciones preferidas, la CDH de Corynascus thermophilum comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. La CDH está fácilmente disponible en C. thermophilum utilizando los procedimientos de aislamiento descritos en este documento. En un aspecto relacionado adicional, la presente invención también proporciona una CDH que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 76 %, preferiblemente al menos 78 %, al menos 80 %, al menos 83 % , al menos el 85 %, al menos el 88 %, al menos el 90 %, al menos el 92 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, idéntico a la SEQ ID NO: 7.
En realizaciones preferidas, la CDH de Hypoxylon hemoatostroma comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. La CDH está fácilmente disponible en H. hemoatostroma usando los procedimientos de aislamiento descritos en el presente documento. En un aspecto relacionado adicional, la presente invención también proporciona una CDH que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 76 %, preferiblemente al menos 78 %, al menos 80 %, al menos 80 %, al menos el 83 %, al menos el 85 %, al menos el 88 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, idéntico a la SEQ ID NO: 3.
En realizaciones preferidas, la CDH de Neurospora crassa comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. La CDH está fácilmente disponible en N. crassa usando los procedimientos de aislamiento descritos en este documento. En un aspecto relacionado adicional, la presente invención también proporciona una CDH que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 76 %, preferiblemente al menos 78 %, al menos 80 %, al menos 82 % , al menos el 84 %, al menos el 86 %, al menos el 88 %, al menos el 90 %, al menos el 92 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, idéntico a la SEQ ID NO: 11.
En realizaciones preferidas, la CDH de Stachybotrys bisbyi comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. La CDH está fácilmente disponible en S. bisbyi utilizando los procedimientos de aislamiento descritos en el presente documento. En un aspecto relacionado adicional, la presente invención también proporciona una CDH que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 76 %, preferiblemente al menos 78 %, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos el 84 %, al menos el 86 %, al menos el 88 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, idéntico a la SEQ ID NO: 9.
Preferiblemente, una CDH homóloga o modificada de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, al menos 11, al menos 13, al menos 15, al menos 17, al menos 20, a al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 80, al menos 100 y/o hasta 100, hasta 80, hasta 60, hasta 50, hasta 40, hasta a 30, hasta 30, hasta 20, hasta 15 sustituciones, eliminaciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos, y cualquier rango entre estos valores, en comparación con cualquiera de las CDH de las SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9 o 11.
La presente invención proporciona nuevas secuencias de CDH de Chaetomium atrobrunneum (SEQ ID NO: 5), Corynascus thermophilum (SEQ ID NO: 7), Hypoxylon hemoatostroma (SEQ ID NO: 3), Neurospora crassa (SEQ ID NO: 11) y Stachybotrys bisbyi (SEQ ID NO: 9). Las CDH de estas secuencias, así como los homólogos con al menos el 75 % de identidad de secuencia con los mismos, son nuevas CDH que también cumplen las propiedades inventivas de tener una actividad de oxidación de glucosa a un pH de 7,4. La modificación de enzimas homólogas a las mismas con al menos 75 % de identidad de secuencia son preferiblemente de aminoácidos que no disminuyen el requerimiento de pH en la actividad de oxidación de la glucosa. Cualquier modificación de este tipo se puede probar fácilmente mediante una prueba de oxidación de glucosa, por ejemplo una superficie de electrodo o mediante un ensayo de cyt c, utilizando cyt c para reoxidar el hemo y posteriormente el dominio de flavina de la CDH. Los homólogos se pueden identificar fácilmente mediante comparaciones de secuencias, como mediante la alineación de secuencias, utilizando herramientas disponibles públicamente, como BLASTP.
La CDH de la invención puede ser una CDH modificada de Myriococcum thermophilum, que comprende una flavina y un dominio hemo, en la que la transferencia de electrones desde la flavina al dominio hemo se incrementa en comparación con la CDH de tipo silvestre de M. thermophilum, preferiblemente según lo medido por el cyt c ensayo. Por lo tanto, la invención se refiere a la ingeniería genética de una CDH para mejorar la actividad de las enzimas en la dirección de un alto IET en condiciones de pH neutro o alcalino. Los procedimientos para la modificación pueden ser cualesquiera conocidos en la técnica, tales como mutaciones de aminoácidos, que incluyen sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos. También se describen modificaciones/derivaciones químicas de cadenas laterales de aminoácidos, en particular cadenas laterales de aminoácidos ácidos.
Como se mencionó anteriormente, la invención incluye secuencias homólogas a las CDH de la invención de SEQ ID N.° 1 (M. thermophilum con modificaciones adicionales para mejorar la dependencia del pH como se mencionó anteriormente), SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9 u 11 con al menos el 50 %, preferiblemente al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, preferiblemente al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, de identidad de secuencia con las secuencias anteriores de las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9 u 11. Preferiblemente, el sitio catalítico tiene un mínimo de modificaciones de, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos o incluso están exentos de modificaciones en comparación con los sitios catalíticos de tipo silvestre. El sitio catalítico es de Phe 251 a Ala 287 (Rossman Fold, flavin binding), Val 334 a Leu 345 y Met 724 a Asp 732 de la secuencia M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1. También existen aminoácidos correspondientes para las CDH de Chaetomium atrobrunneum (SEQ ID NO: 5), Corynascus thermophilum (SEQ ID NO: 7), Hypoxylon hemoatostroma (SEQ ID NO: 3), Neurospora crassa (SEQ ID NO: 11) y Stachybotrys bisbyi (SEQ ID NO: 9).
Preferiblemente, cualquiera de las CDH de la invención muestra IET (la transferencia de electrones de la flavina al dominio hemo) en condiciones de pH neutro, alcalino o preferentemente fisiológico (pH 7,4). Para garantizar una actividad electrocatalítica suficientemente alta de la enzima en esas condiciones, el IET medido con el ensayo cyt c a pH 7,4 debe ser al menos aproximadamente el 10 % del valor máximo del valor IET medido en condiciones de pH ácido, o más preferiblemente alrededor del 20 %, o más preferiblemente aproximadamente el 40 %, o más preferiblemente aproximadamente el 60 %, o incluso más preferiblemente aproximadamente el 80 %, o lo más preferiblemente si el pH óptimo de IET ya sea neutro o alcalino.
Las celobiosas deshidrogenasas muestran preferiblemente una tasa de transferencia de electrones directa (DET) suficientemente alta de la enzima al electrodo para obtener una respuesta suficientemente alta a bajas concentraciones de sustrato para un límite de detección bajo y una sensibilidad alta. Solo las enzimas que presentan una corriente DET suficientemente alta en el sobrepotencial aplicado de 300 mV frente a Ag|AgCl (en KCl 0,1 M) para dar como resultado un límite de detección de glucosa (el límite inferior del rango lineal del electrodo se definió como el límite de detección) con una configuración de electrodo de grafito espectrográfico por debajo de 4 mM (la concentración habitual de glucosa en sangre en un ser humano sano es de 4-7 mM).
Preferiblemente, la CDH de la invención tiene una actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior y comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, preferiblemente al menos 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, idéntico a los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos tiene al menos sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos adicional a la secuencia de SEQ ID NO: 1, que aumenta la transferencia de electrones de la flavina al dominio hemo en comparación con la CDH de tipo silvestre de Myriococcum thermophilum de SEQ ID NO: 1, preferiblemente como se mide por el ensayo cyt c. En la SEC. ID. NO: 1 se encuentra la CDH de thermophilum de tipo silvestre que no tiene la actividad de oxidación de glucosa requerida a un pH de 7,4. La secuencia de SEQ ID NO: 1 tiene además un péptido señal hasta el aminoácido 21 que puede no estar presente en la enzima procesada final. Ahora se puede demostrar que, de acuerdo con la presente invención, mediante una
única (o más) sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos de la CDH con la secuencia final de CDH de M. thermophilum, el pH óptimo de la actividad de oxidación de la glucosa se puede cambiar a un nivel más alto. pH básico, en particular a un pH fisiológicamente relevante de 7,4. Los expertos en la técnica pueden elegir fácilmente entre las posibles modificaciones de aminoácidos dada la extensa secuencia y la información funcional representada en este documento y, además, pueden probar sin carga excesiva la CDH modificada mediante un simple ensayo cyt c como se describe en este documento. Preferiblemente, la CDH modificada de la invención de M. thermophilum tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, al menos 11, al menos 13, al menos 15, al menos 17, al menos 20 , al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 80, al menos 100 y/o hasta 100, hasta 80, hasta 60, hasta 50, hasta 40 , hasta 30, hasta 30, hasta 20, hasta 15 sustituciones, eliminaciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos, y cualquier rango entre estos valores.
En una realización adicional, la transferencia de electrones de la CDH modificada aumenta al aumentar la interacción electrostática entre la flavina y el dominio hemo, preferiblemente a un pH de 7,4. La interacción electrostática puede aumentarse optimizando las interacciones de carga a pH 7,4 de los aminoácidos básicos y ácidos del dominio de flavina y hemo mediante mutagénesis dirigida, la repulsión electrostática puede reducirse o la atracción electrostática puede aumentar. A partir de la secuencia y la información estructural disponibles, los expertos en la técnica pueden elegir fácilmente entre una gran cantidad de tales mutaciones posibles que aumentan la interacción a pH 7,4, y preferiblemente dan como resultado un aumento de la actividad en un ensayo de cyt c.
Como se ha señalado, la tasa de transferencia de electrones intramolecular (IET) entre el dominio flavina y el dominio hemo depende en gran medida del pH. Por ejemplo en el basidiomiceto Trametes villosa CDH IET es rápido a pH 3,5, disminuye significativamente a pH 5,0 y está virtualmente ausente por encima de pH 6,0. Contrariamente, el IET de la CDH de ascomycete H. insolens no se ve afectado por condiciones alcalinas, con un pH óptimo de alrededor de 8,0. A partir de los datos cinéticos de Humicola insolens CDH, es obvio un pH alcalino óptimo para la reducción de cyt c y el DET medido para esa enzima fue el más alto con un pH > 7 y, por lo tanto, es una excepción hasta ahora para las CDH. Curiosamente, aunque es una CDH de ascomiceto, la CDH de Myriococcum thermophilum tiene un comportamiento de IET similar a las enzimas de basidiomicetos. Preferiblemente, los aminoácidos anteriores se modifican en el M. thermophilum CDH para aumentar la actividad a un pH de 7,4 como se mide en un ensayo de cyt c. Además, se ha encontrado que estos aminoácidos son de particular interés para la actividad de la enzima. Aminoácidos correspondientes a estos aminoácidos en CDHs de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi con modificaciones preferiblemente, de acuerdo con los homólogos a las secuencias de las SEQ ID NOs : 3, 5, 7, 9 y 11 en otros aminoácidos que en aquellos correspondientes a los aminoácidos anteriores de Myriococcum thermophilum de la SEQ ID NO: 1.
Los cambios en los aminoácidos mencionados anteriormente de la SEQ ID NO: 1 para aumentar la actividad a pH 7,4 son preferiblemente para aumentar la interacción electrostática entre la flavina y el dominio hemo como se mencionó anteriormente.
Una modificación descrita de la CDH es una modificación del dominio hemo de cualquiera de los aminoácidos 90-100, 115-124, 172-203, preferiblemente de cualquiera de los aminoácidos 176, 179-182, 195, 196, 198, 201 correspondiente al M. thermophilum CDH de la SEQ ID NO: 1 y/o del dominio de flavina de uno cualquiera de los aminoácidos 311-333, 565-577, 623-625, 653-664, 696-723, preferiblemente de uno cualquiera de los aminoácidos 318, 325, 326, 328, 568, 571, 574, 575, 624, 654, 663, 702, 709, 712, 717, corresponde a la M. thermophilum CDH de la SEQ ID NO: 1, o cualquiera combinación de los mismos.
Las posibles modificaciones incluyen (i) el intercambio de aminoácidos ácidos por residuos neutros (polares o apolares) (por ejemplo, Ser, Thr, Ala) para disminuir el número de cargas negativas y debilitar el campo de fuerza electrostática en el dominio hemo o flavina en valores de pH neutro/alcalino. (ii) El intercambio de aminoácidos ácidos por residuos alcalinos (Lys, Arg) para aumentar el número de cargas positivas y debilitar el campo de fuerza electrostática en el hemo o en el dominio de flavina a valores de pH neutro/alcalino, y (iii) introducción de residuos alcalinos (Lys, Arg) en lugar de residuos neutros (Hidrófobos o hidrófilos) para aumentar el número de cargas positivas y debilitar el campo de fuerza electrostática negativa a pH neutro/alcalino.
En particular, la modificación puede incluir un aumento de la carga positiva en los aminoácidos 172-203 correspondientes a M. thermophilum CDH de la SEQ ID NO: 1, preferiblemente del aminoácido 181, en particular, se prefiere una mutación D181K o D181R, y/o preferiblemente del aminoácido 198, en particular se prefiere una mutación D198K o D198N, y/o una disminución de una carga negativa de los aminoácidos 565-577 correspondientes a la M. thermophilum CDH de la SEQ ID NO: 1, preferiblemente del aminoácido (s) 568 y/o 571 y/o 574, en particular, prefieren una mutación D568S y/o E571S y/o una mutación D574S, o cualquier combinación de las mismas, en particular la mutación triple D568S/E571S/D574S.
En realizaciones adicionales, la actividad de la CDH de la invención es una actividad de la glucosa deshidrogenasa y puede ser una oxidación electrocatalítica de la glucosa.
La CDH inventiva se puede aislar, en particular de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi o cualquier célula modificada genéticamente para expresar
de forma recombinante la CDH inventiva. El aislamiento se puede realizar mediante diafiltración y la posterior cromatografía de intercambio iónico mediante la recopilación de fracciones con actividad CDH. La CDH se puede purificar adicionalmente, es decir, utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica.
La CDH de la invención también puede comprender un enlazador o ser parte de una proteína de fusión. Un polipéptido CDH inventivo que comprende las secuencias inventivas puede ser de hasta 500 kDa, hasta 400 kDa, hasta 300 kDa, hasta 200 kDa o incluso hasta 150 kDa.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una CDH de la invención. Se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una celobiosa deshidrogenasa que tiene actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior, en la que dicha actividad se define como la transferencia de electrones intramolecular (IET) o la transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), y tiene un actividad para la oxidación de la glucosa determinada por un ensayo de citocromo c a un pH de 7,4 superior a 0,5 U /mg, y que comprende un
• secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs 4, 6, 8, 10 o 12, o
• el marco de lectura abierto de SEQ ID NOs 4, 6, 8, 10 o 12 o
• una secuencia de nucleótidos con al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, preferida al menos el 99 %, identidad con la SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10 o 12 o el marco de lectura abierto de los SEQ ID NOs : 4, 6, 8, 10 o 12,
• una secuencia de nucleótidos que se hibrida con cualquiera de las SEQ ID NOs : 4, 6, 8, 10 o 12 en condiciones rigurosas, o
• una secuencia de nucleótidos que codifica una celobiosa deshidrogenasa como se define en las reivindicaciones.
Las "condiciones rigurosas" se refieren a reacciones de hibridación en condiciones de hibridación definidas que son función de factores como la concentración de sal o formamida en el tampón de hibridación, la temperatura de la hibridación y las condiciones de lavado posthibridación. Tales condiciones son, por ejemplo, la hibridación a 68°C en un tampón de hibridación SSC estándar que contiene SDS al 0,1 % seguido de un lavado riguroso en un tampón de lavado a la misma temperatura. El lavado riguroso se puede realizar, por ejemplo, lavando dos veces con tampón 2xSSC seguido de dos pasos de lavado con tampón 0,5xSSC. Las condiciones de hibridación rigurosas implicarán preferiblemente una temperatura de 15°C a 25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm), por lo que la Tm de un producto de hibridación de una sonda de ácido nucleico se puede calcular utilizando una fórmula basada en el g c contenido en los ácidos nucleicos y que tienen en cuenta las longitudes de la cadena, como la fórmula Tm = 81,5 to 16,6 (log [na+]) 0,41 ( % G C) - 600/N), en la que N = longitud de la cadena (Sambrook et al. (1989). En la práctica, una Tm estimada para una sonda oligonucleotídica a menudo se confirma y, por lo tanto, un experto en la técnica puede calcular la Tm para cualquier sonda elegida cuya secuencia de nucleótidos sea conocida.
Una secuencia de ácido nucleico de M. thermophilum puede definirse por la SEQ ID NO: 2 o el marco de lectura abierto de la SEQ ID NO: 2, incluidos homólogos con al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, prefería al menos el 99 %, identidad con la SEQ ID NO: 2 o el marco de lectura abierto de la SEQ ID NO: 2, que además comprende una mutación de codón, sustitución, eliminación o inserción para codificar una CDH con actividad de oxidación de glucosa a un pH de 7,4 o superior, preferiblemente de los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1 con una sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos adicionales. Preferiblemente, la CDH codificada es de la secuencia de aminoácidos con la modificación de aminoácidos mencionada anteriormente.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican una CDH con actividad oxidante de glucosa a pH 7,4 pueden aislarse o purificarse. Las moléculas de ácido nucleico de la invención, en particular su marco de lectura abierto, pueden estar comprendidas en un vector, preferiblemente un vector de expresión o clonación. Una molécula de nucleótido inventiva podría contener además elementos tampones tales como promotores y potenciadores. Dicha molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de la invención puede consistir en hasta 1,000,000 nucleótidos, hasta 900,000 nucleótidos, hasta 800,000 nucleótidos, hasta 700,000 nucleótidos, hasta 600,000 nucleótidos, hasta 500,000 nucleótidos, hasta 400,000 nucleótidos, hasta 300,000 nucleótidos, hasta 200,000 nucleótidos, hasta 100,000 nucleótidos, hasta 50,000 nucleótidos o hasta 25,000 nucleótidos.
Los beneficios particulares de las CDH de la invención son i) una alta tasa de recambio de glucosa, ii) actividad suficiente del dominio de flavina e IET a pH 7,4 y iii) buenas características DET. Se encontró además que Estas CDH y otros CDH conocidos son en particular adecuados como material anódico en un bioelectrodo como, por ejemplo biosensor o célula de biocombustible.
Un enfoque fue identificar CDHs de diferentes cepas de hongos del phylum de ascomycota. Se encontró que algunos CDHs, por ejemplo de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi son capaces de convertir la glucosa con altas tasas de recambio a un pH de 7,4 y además tienen muy buenas propiedades DET. Algunos de las CDH encontrados son nuevos per se, como se mencionó anteriormente. Un aspecto adicional de la presente invención es el uso de todos las CDH descritos en este documento
en un electrodo, en una celda electroquímica, en particular en un biosensor para medir la glucosa, preferiblemente a un pH fisiológico tal como pH 7,4.
Además, se encontró que las CDH de M. thermophilum, que se sabe que oxidan la glucosa y tienen buenas propiedades DET pero no muestran IET a valores de pH por encima de pH 7,0, pueden modificarse genéticamente para aumentar el rango de pH de IET a condiciones más alcalinas mediante de mutagénesis dirigida al sitio. Estas CDH eran particularmente adecuadas para dispositivos electroquímicos.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un electrodo que comprende una CDH inmovilizada que tiene actividad de oxidación de glucosa a un pH de 7,4 o superior y que tiene al menos 10 %, al menos 12 %, al menos 14 %, al menos 16 %, preferiblemente al menos el 18 %, al menos el 19 %, en particular prefirió al menos el 20 %, al menos el 21 %, o incluso al menos el 22 %, al menos el 23 %, al menos el 24 %, al menos el 25 %, al menos el 26 %, al menos el 27 %, al menos el 28 %, al menos el 29 % o al menos el 30 % de actividad oxidante de la glucosa, la lactosa o la celobiosa a un pH de 7,4 en comparación con su actividad máxima a un pH más bajo según lo determinado por el ensayo cyt c. Preferiblemente, la CDH inmovilizada también tiene una actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior y tiene al menos el 10 %, al menos el 12 %, preferiblemente al menos el 18 %, al menos el 19 %, en particular, se prefiere al menos el 20 %, al menos 21 %, o incluso al menos 22 %, al menos 23 %, al menos 24 %, al menos 25 %, al menos 26 %, al menos 27 %, al menos 28 %, al menos 29 % o al menos 30 %, La actividad oxidante de la glucosa, la lactosa o la celobiosa a un pH de 7,4 en comparación con su actividad máxima a un pH más bajo según lo determinado por un ensayo de 2,6-dicloroindofenol (DCIP). Un electrodo es generalmente una superficie conductora, es decir, adecuado para un elemento electroquímico.
La medición de la actividad mediante el ensayo cyt c o DCIP se puede facilitar rápidamente en un sistema modelo. La CDH se puede usar directamente con el sustrato (glucosa, pero también lactosa o celobiosa) y un agente reoxidante que puede ser cyt c para la reoxidación en el dominio hemo o DCIP para la reoxidación en el dominio flavina. La CDH se prueba a un pH de 7,4 en cualquier tampón adecuado, por ejemplo, un tampón de fosfato de potasio o sodio. Para determinar el máximo de la actividad de CDH, la actividad se mide continuamente a diferentes valores de pH, por ejemplo desde pH 3 hasta pH 7,4 o superior y determinando la actividad máxima. El pH de 7,4 se compara con esta actividad máxima y debe tener la fracción de actividad requerida mencionada anteriormente. La actividad puede por ejemplo darse como valores absolutos en U/mg o como valores relativos. Preferiblemente, la CDH de la invención tiene la porción de actividad requerida en comparación con la actividad máxima tanto en un ensayo de cyt c como en un ensayo DCIP. Estos valores de actividad también se aplican preferiblemente a los nuevas c Dh descritos anteriormente, como tales, independientemente de su fijación en un electrodo. Preferiblemente, el ensayo para determinar la CDH de la invención en el electrodo se realiza por oxidación de glucosa. Alternativamente, también es posible el uso de lactosa.
El electrodo puede ser de cualquier material adecuado para inmovilizar la CDH, por ejemplo carbono como grafito, carbono vítreo, diamante dopado con boro, electrodos de oro modificados con promotores, por ejemplo, tioles, electrodos serigrafiados, electrodos serigrafiados que contienen nanotubos de carbono (de pared simple o múltiple). Puede contener otras nanopartículas para aumentar el área de superficie específica. Los usos particulares de los electrodos de la invención se encuentran en la provisión de biosensores y células de biocombustibles enzimáticos, más específicamente para los biosensores de glucosa y los ánodos de células de biocombustibles que oxidan la glucosa utilizando las propiedades de transferencia directa de electrones (DET) de la celobiosa deshidrogenasa (CDH) para medir la concentración de glucosa en un punto muerto, alcalino o, preferentemente, pH fisiológico (en fluidos corporales humanos, por ejemplo, 7,4 en sangre) o se usa glucosa para la generación de una corriente eléctrica en células de biocombustible en las mismas condiciones de pH.
La actividad específica para la oxidación de la glucosa mediante el uso del ensayo cyt c a pH 7,4 es mayor que 0,5 U/mg, preferiblemente al menos 0,6 U/mg, al menos 0,7 U/mg, al menos 0,8 U/mg, al menos 0,9 U/mg, al menos 1 U /mg, o al menos 1,2 U/mg de CDH, o una densidad de corriente superior a 80 nA/cm2 a pH 7,4.
En otras realizaciones preferidas, el valor Km aparente de la CDH para glucosa en solución (ensayos DCIP con una actividad óptima) es inferior a 1,7 M, preferiblemente inferior a 1,5, inferior a 1,2, preferiblemente inferior a 1 M o, cuando se mide en electrodos un aparente valor de Km por debajo de 200 mM, preferiblemente por debajo de 150 mM.
En otra realización, la presente invención proporciona un electrodo, en el que la CDH es de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi o una CDH modificada de Myriococcum thermophilum con una actividad incrementada a pH de 7,4 como se definió anteriormente, o homólogos con ciertas identidades de secuencia, modificaciones de aminoácidos, etc., como se definió anteriormente.
En el electrodo, la CDH puede inmovilizarse por adsorción, preferiblemente también atrapamiento físico, formación de complejos, preferiblemente a través de un engarzador de complejación adicional, unión covalente, en particular reticulación, o unión iónica y/o la celobiosa deshidrogenasa inmovilizada puede ser reticulada, en particular por agentes bifuncionales, para aumentar la estabilidad o la actividad. Se ha demostrado que la reticulación con agentes bifuncionales, como los agentes con dos grupos reactivos que hacen una conexión con la CDH, pueden estabilizar la CDH e incluso aumentar su actividad en electrodos de grafito medibles mediante los procedimientos amperométricos
descritos aquí. Esta ventaja puede llevar a una mayor sensibilidad y disminuir el límite de detección de glucosa. Dicho agente de reticulación es por ejemplo glutaraldehído o cualquier otro dialdehído.
Los electrodos se pueden usar en forma de un solo electrodo o pilas de electrodos. Más específicamente, la aplicación de estas enzimas es en dispositivos (bio)electroquímicos como los biosensores de glucosa o los ánodos de células de biocombustible. El electrodo se puede utilizar como biosensor o como ánodo de celda de biocombustible.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una celda electroquímica que comprende un electrodo como se describe anteriormente como un elemento anódico y un elemento catódico.
En realizaciones preferidas de la celda electroquímica, el fluido anódico puede ser una solución que contiene glucosa. Preferiblemente, el electrodo es adecuado para la medición en sangre, suero y otros fluidos corporales.
La celda electroquímica puede comprender además una solución de al menos pH 6,0, preferiblemente al menos pH 6,5 o al menos pH 6,7, en particular se prefiere al menos pH 7,0, aún más preferido al menos pH 7,1, o al menos pH 7,2, o al menos pH 7,3, especialmente preferido al menos 7,4, como fluido anódico.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar o cuantificar glucosa en una muestra que comprende
• proporcionar una CDH de la invención que tiene actividad de oxidación de glucosa a un pH de 7,4 o superior, • poner en contacto con una muestra de fluido que tiene un pH de al menos 6,0, preferiblemente al menos 6,5, o al menos 6,7, más preferiblemente al menos 7,0, al menos 7,1, al menos 7,2, en particular preferido al menos 7,3, especialmente preferido al menos 7,4, con la CDH, y
• detectar una oxidación de la glucosa de la muestra por la CDH.
Preferiblemente, la oxidación se detecta electroquímicamente, preferiblemente con una CDH inmovilizada en un electrodo, en particular se prefiere como se definió anteriormente.
Una de las principales causas de muerte y discapacidad en el mundo es la diabetes. El diagnóstico y manejo de la diabetes mellitus requiere un monitoreo continuo de los niveles de glucosa en la sangre. Los electrodos de enzimas amperométricas, basados en la glucosa oxidasa, desempeñan un papel cada vez más importante y han sido un objetivo de investigación sustancial. La mayoría de los sensores se utilizan para el monitoreo individual y diario de la diabetes, pero la demanda de monitoreo continuo en vivo de los pacientes también es importante. Las mediciones en -tiempo real son muy deseadas en las unidades de cuidados intensivos, durante la cirugía o para el tratamiento de la diabetes, en las que los cambios bioquímicos rápidos pueden pasarse por alto por mediciones discretas. Dicha monitorización requiere sensores miniaturizados, biocompatibles y estables. Aunque la investigación ha alcanzado el nivel de implantación a corto plazo, aún no se ha realizado un sensor de glucosa implantable que posea estabilidad a -largo plazo. Además del desafío obvio de la biocompatibilidad, algunos sensores son propensos a errores debido a la baja tensión de oxígeno o interferencias electroactivas. Los biosensores de tercera generación dependen de enzimas que pueden permitir la transferencia directa de electrones (DET) entre el material del electrodo y el centro activo rédox. Por lo general, esto se ve obstaculizado por la encapsulación del centro rédox por la estructura de la proteína. Sin embargo, como se ha mostrado aquí, la CDH de la invención puede exhibir comunicación eléctrica con soportes de electrodo.
En ciertas realizaciones, la CDH tiene al menos el 10 %, o al menos el 12 %, preferiblemente al menos el 14 %, o al menos el 16 %, en particular, preferido al menos el 18 %, o al menos el 20 %, al menos el 21 %, o incluso al menos el 22 %, al menos el 23 %, al menos el 24 %, al menos el 25 %, al menos el 26 %, al menos el 27 %, al menos el 28 %, al menos el 29 %, o al menos el 30 %, glucosa, lactosa o actividad oxidante de la celobiosa a un pH de 7,4 en comparación con la actividad máxima a un pH por debajo de 7,4 según lo determinado por un ensayo de cyt c y/o un ensayo DCIP.
La muestra de fluido puede ser cualquier fluido que comprenda potencialmente glucosa, incluida sangre, suero y otros fluidos corporales.
En realizaciones particularmente preferidas, la CDH es de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi o una CDH modificada de Myriococcum thermophilum con una actividad incrementada a un pH de 7,4 como se define anteriormente.
La celobiosa deshidrogenasa de la presente invención puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, el término "obtenido de" como se usa en el presente documento en relación con una fuente dada significará que la enzima es producida por la fuente o por una célula en la que la secuencia de ácido nucleico del gen de la celobiosa deshidrogenasa tiene la fuente. ha sido insertado. La enzima o su secuencia de ácido nucleico se puede obtener de cualquier fuente de hongos y en una realización preferida del género Chaetomium, Corynascus, Hypoxylon, Myriococcum, Neurospora o Stachybotrys. En una realización más preferida, las enzimas o las secuencias de ácido nucleico se obtienen de la especie Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hemoatostroma, Myriococcum thermophilum, Neurospora crassa o Stachybotrys bisbyi.
En la realización más preferida, las enzimas o las secuencias de ácido nucleico se obtienen de las cepas Chaetomium atrobrunneum CBS 238,71, Corynascus thermophilus CBS 405,69, Hypoxylon hemoatostroma CBS. 255,63, Myriococcum thermophilum CBS 208,89, Neurospora crassa DSMZ 2968 o Stachybotrys bisbyi DSMZ 63042.
Se entenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.
Se entiende que un experto en la técnica puede diseñar las celobiosas deshidrogenasas mencionadas u otras para obtener las especificaciones resumidas de las enzimas y variantes de enzimas descritas en el presente documento para obtener enzimas modificadas utilizando los principios descritos en este documento como el enfoque racional a través de mutagénesis dirigida al sitio o enfoques de evolución dirigida (por ejemplo, mezcla de genes, PCR propensa a errores) y selección subsiguiente de la diversidad generada. Las técnicas para introducir una mutación en la secuencia de ácido nucleico para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido con el objetivo de intercambiar un aminoácido por otro en la proteína resultante se pueden lograr mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos sin limitarse a ellos.
Figuras:
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos optimizada por codón (SEQ ID NO: 33) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de CDH de Myriococcum thermophilum utilizada para la mutagénesis dirigida al sitio. Los sitios de mutaciones preferidos no limitantes se indican con "*" y los sitios preferidos no limitativos particulares están marcados con "+".
La Figura 2 muestra los perfiles de pH de las CDH de ascomiceto seleccionada de CDH variante D547S/E550S de Chaetomium atrobrunneum CDH, 2.a; Corynascus thermophilus CDH, 2.b; Hypoxylon hemoatostroma CDH, 2.c; Neurospora crassa CDH, 2.d; Stachybotrys bisbyi CDH, 2.e; Myriococcum thermophilum CDH, 2.f; y las variantes enzimáticas modificadas genéticamente Myriococcum thermophilum CDH variante D181K, 2.g; Myriococcum thermophilum, 2 h. usando lactosa y un aceptor de electrones soluble, 2,6-dicloroindofenol (DCIP, puntos, líneas grises) o cyt c (líneas sólidas, negras) como sustratos y tampón de citrato de fosfato 50 mM (pH 3,0-8,0). La Figura 2i muestra la corriente de transferencia de electrones directa relativa de Myriococcum thermophilum CDH de tipo silvestre con glucosa 5 mM.
La Figura 3 es una alineación de secuencias de secuencias de aminoácidos de CDH de Chaetomium atrobrunneum (SEQ ID NO: 5), Corynascus thermophilum (SEQ ID NO: 7), Hypoxylon hemoatostroma (SEQ ID NO: 3), Myriococcum thermophilum (SEQ ID NO: 1), Neurospora crassa (Se Q ID NO: 11) y Stachybotrys bisbyi (SEQ ID NO: 9).
La Figura 4 muestra una configuración del electrodo de chorro de pared y los instrumentos auxiliares. El conjunto del sensor (A) se lavó continuamente con tampón y las muestras se aplicaron a través de una válvula de inyección ultrarrápida. Se registró la corriente obtenida a un potencial de 300 mV. El sistema de chorro de flujo (A) consistía en un electrodo de trabajo de carbono (WE), un electrodo contador de platino (CE) y un electrodo de referencia de plata (RE) conectado a un potenciostato.
Figura 5: Configuración de medición del sistema de celda de flujo.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Materiales
Los productos químicos utilizados en tampones y medios de fermentación fueron productos comerciales y al menos de grado analítico, si no se indica lo contrario. La peptona de la carne y la celulosa microcristalina fueron de VWR International (Viena, Austria), la alfa-celulosa de Sigma-Aldrich (Viena, Austria). Los sustratos para estudios cinéticos fueron lactosa, glucosa, 2,6-dicloroindofenol (DCIP) y citocromo c de corazón de caballo (cyt c) de Sigma-Aldrich en el grado más alto de pureza disponible. Los tampones se prepararon utilizando agua purificada y desionizada (18 MQ) con un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA), los medios de fermentación contenían agua de ósmosis inversa (0,1 MQ).
Ejemplo 2: Ensayos de Enzimas
La actividad enzimática de la celobiosa deshidrogenasa se detectó mediante dos ensayos. El ensayo DCIP, que mide la actividad del dominio de flavina, se realizó midiendo la reducción dependiente del tiempo de DCIP 300 pM en tampón citrato-fosfato 50 mM al pH indicado (3,0-8,0), que contiene lactosa 30 mM a 520 nm y 30°C. El coeficiente de absorción para DCIP depende del pH, pero difiere a 520 nm solo alrededor del 3 % con un pH de 3,0 a 8,0 y se determinó que era de 6,8 mM'1 cirr1 (Karapetyan et al., 2005 Journal of Biotechnology 121: 34-48).
Alternativamente, la actividad enzimática se determinó mediante la reducción del citocromo c a 30°C y 550 nm (cyt c, £550 = 19,6 mM-1 cm-1, Canevascini et al., 1991, European Journal of Biochemistry 198: 43-52) en un ensayo que contiene cyt c 20 pM y lactosa 30 mM, que detecta específicamente la actividad de la enzima completa (dominio flavina y hemo). El ensayo cyt c proporciona así también una medida de la eficiencia de la transferencia de electrones intramolecular (IET) entre ambos dominios como una indicación de la respuesta de la enzima en electrodos en un rango de pH de 3,0 a 8,0 (tampón de citrato de sodio 50 mM). Para la detección de la actividad con glucosa se usaron los ensayos mencionados anteriormente, pero la lactosa se intercambió por glucosa 100 mM.
Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que oxida 1 pmol de lactosa por minuto en las condiciones del ensayo. Se eligió lactosa en lugar del sustrato natural celobiosa, ya que no muestra inhibición del sustrato con CDH. La estequiometría de la reacción con carbohidratos es 1 para el aceptor DCIP de dos electrones, pero 2 para el citador aceptor de un electrón.
Ejemplo 3: Cinética enzimática
Las soluciones madre de carbohidratos utilizadas para medir la actividad y las constantes cinéticas con los ensayos DCIP y cyt c se prepararon en el tampón apropiado varias horas antes del experimento para permitir que la mutorrotación alcance el equilibrio. Los perfiles de pH se determinaron utilizando tampón de citrato-fosfato 50 mM (3,0-8,0). Para asegurar una temperatura de ensayo de 30°C, las cubetas se incubaron en una cámara termostatizada durante al menos 20 minutos. Después de la medición, se comprobó nuevamente el pH en las cubetas. Las constantes cinéticas se calcularon ajustando los datos observados a la ecuación de Henri-Michaelis-Menten o al modelo adaptado para la inhibición del sustrato mediante regresión no lineal de mínimos cuadrados y el programa SigmaPlot (Systat Software, San Jose, CF, USA).
Ejemplo 4: Caracterización de proteínas
La concentración de proteína se determinó mediante el procedimiento de tinción con colorante de Bradford usando un ensayo prefabricado de Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA y albúmina de suero bovino como estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Para la caracterización espectral, se diluyó CDH aparentemente homogénea (en estado oxidado) a una absorción de ~1 a 280 nm y el espectro de 260 a 700 nm se tomó con un espectrofotómetro Hitachi U3000 (Tokio, Japón). Después de la reducción con lactosa (concentración final 1 mM) se tomó el espectro reducido.
Para la caracterización electroforética, SDS-PAGE se llevó a cabo en una unidad de electroforesis vertica1Hoefer SE 260 Mighty Small II. Los geles (10,5x10 cm; 10 % T, 2,7 % C) se moldearon y corrieron de acuerdo con las modificaciones de los fabricantes del sistema Laemmli. El enfoque isoeléctrico en el rango de pH 2,5 a 6,5 se realizó en un sistema Multiphor II usando geles secos prefabricados rehidratados con Ampholytes (GE Healthcare Biosiences, Viena, Austria). Las bandas de proteína en la SDS-PAGE se tiñeron con plata, las bandas en el gel IEF con azul de Coomassie R-250, de acuerdo con las instrucciones.
Ejemplo 5: Selección de las celobiosa deshidrogenasas adecuadas
Cepas fúngicas (Chaetomium atrobrunneum CBS 238,71, Corynascus thermophilus CBS 405,69, Hypoxylon hemoatostroma CBS 255,63, Myriococcum thermophilum CBS 208,89, Neurospora crassa DSMZ 2968 y Stachybotrys bisbyi DSMZ 63042) se obtuvieron de Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Utrecht, Países Bajos) y Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) en forma liofilizada o de crecimiento activo en inclinaciones de agar y se subcultivaron periódicamente en placas de agar con dextrosa de patata (PDA). Se cultivaron placas de agar recién inoculadas a 25 o 30°C, dependiendo de las temperaturas de crecimiento publicadas de los cultivos hasta alcanzar un diámetro de 5 cm y luego se utilizan para inocular matraces agitadores. El medio utilizado para los cultivos sumergidos contenía (por litro): 20 g de alfa celulosa, 5 g de peptona de la carne y 0,3 ml de una solución de oligoelementos. La solución de oligoelementos contenida (por litro): 1 g de ZnSO4-7H2O, 0,3 g de M n C h ^ O , 3 g de H3BO3, 2 g de C o C h ^ O , 0,1 g de CuSO4'5H2O, 0,2 g de N iC h ^ O , 4 ml de H2SO4 (Sachslehner et al., 1997, Applied Biochemistry and Biotechnology 6365: 189-201). Para el cultivo en matraces agitadores, se llenaron matraces Erlenmeyer de 1 l con 0,3 l de medio. Después de la esterilización, los matraces se inocularon con 3 cm2 de micelio finamente cortado de placas de PDA y se incubaron en un agitador rotatorio (110 rpm, excentricidad = 1,25 cm) a 25 o 30°C. Se tomaron muestras regularmente y se monitorizó la producción de CDH.
Ejemplo 6: Producción y purificación de CDH a partir de fuentes fúngicas
La producción de CDH se realizó en hasta 16 cultivos de matraz de agitación en paralelo por cepa usando condiciones idénticas a las del procedimiento de selección. Los cultivos fueron cosechados en el día exhibiendo actividad máxima de citoc. El sobrenadante del cultivo se separó de la celulosa residual y la biomasa fúngica por centrifugación (20 min, 6000 x g) y se concentró y se diafiltró utilizando un módulo de flujo cruzado de fibra hueca de polietersulfona con un corte de 10 kDa (Microza UF module SLP-1053, Pall Corporation) hasta alcanzar una conductividad de 2 mS cm'1. La preparación de enzima concentrada se aplicó a una columna de DEAE Sepharose (equipo de cromatografía de GE Healthcare Biosciences) montada en un sistema ÁKTA Explorer y equilibrada con un tampón de acetato de sodio 50
mM, pH 5,5. La columna se eluyó con un gradiente de sal lineal (0 a 0,5 M de NaCI en el mismo tampón) en 10 volúmenes de columna (CV). Las fracciones con una alta actividad específica de CDH se agruparon, se añadió lentamente una solución saturada de sulfato de amonio a una saturación final de 4°C a 20 % y se aplicó a una columna PHE-Source equilibrada con tampón de acetato de sodio 100 mM, pH 5,5 que contiene (NH^SO 4(20 % de saturación) y 0,2 M NaCl. La columna se eluyó con un gradiente lineal (0 a 100 % de tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5) en 10 CV. Las fracciones de CDH más puras se agruparon, se desalaron con tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, se concentraron y se congelaron a -70°C para su uso posterior.
Ejemplo 7: Obtención de secuencias de nucleótidos y proteínas de nuevas CDH.
El micelio para los aislamientos de ácidos nucleicos se recolectó de cultivos en crecimiento inducidos por celulosa después de 5 días. El micelio se congeló en nitrógeno líquido y se homogeneizó utilizando mortero y mano. Se utilizaron porciones de 100 mg de micelio para la extracción de a Dn (Liu et al., 2000, Journal of Clinical Microbiology, 38: 471). El ARN total se aisló utilizando TriFast (Peqlab, Erlangen, Alemania). La síntesis de ADNc se realizó con el kit de síntesis de ADNc de First Strand (Fermentas, Vilnius, Lituania) y el cebador de anclaje (5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'). Se usó un cebador degenerado sobre la base de secuencias de CDH de ascomicetas conocidas para amplificar fragmentos de ADN genómico que codifican CDH. Para la amplificación de la región ascendente adyacente, se utilizó el kit de premezcla de DNA Walking SpeedUp (Seegene, Seoul, Korea). Para la amplificación de la región 3' se usó ADNc como plantilla. Para obtener clones de ADNc de longitud completa que codifiquen las proteínas CDH, se realizó una PCR anidada con dos cebadores directos hacia arriba del codón de inicio putativo y dos cebadores inversos, uno específico para una secuencia poco más abajo del codón de parada y el cebador universal (5-GTACTAGTCGACGCGTGGCC -3') complementario al cebador de anclaje. Los nombres en la siguiente tabla de cebadores se abrevian de la siguiente manera: Chaetomium atrobrunneum, CA; Corynascus thermophilus, CT; Hypoxylon hemoatostroma, HH; Neurospora crassa, NC; Stachybotrys bisbyi, SB.
Los productos de PCR obtenidos se secuenciaron completamente para obtener la secuencia completa de ácido nucleico del gen cdh respectivo.
Ejemplo 8: Generación de variantes de CDH de Myriococcum thermophilum por mutagénesis dirigida al sitio
Para la producción mejorada de Myriococcum thermophilum CDH (Zamocky et al., 2008,) en Pichia pastoris, el gen (gene bank accession code EF 492052, GI:164597963) fue un codón optimizado (FIGURA 1) para la expresión en P. pastoris y se sintetizó por GenScript (Piscataway, NJ, USA). El gen muestra una similitud máxima con CDH de Thielavia heterothallica (74 % de identidad) y solo 63 % de identidad con el gen de Humicola insolens. En el nivel de proteínas, la similitud es más alta para CDH de Thielavia heterothallica (93 % de identidad, 97 % de positivos, 0 % de brechas) y bastante baja para Humicola insolens CDH (61 % de identidad, 71 % de positivos, 2 % de brecha).
El gen sintético CDH de M. thermophilum se mutó mediante un protocolo de mutagénesis dirigida al sitio en dos pasos utilizando PCR y digestión/Dpnl. El vector de levadura pPICZ A que lleva el gen CDH sintético se usó como plantilla para la PCR mutagénica. Para la sustitución de Asp160 con Lys, se utilizaron los cebadores 5'-TCCAAGCTTTTAAAGATCCAGGTAAC-3' (Mt CDH-D181K-fw) y 5'-AAAAGCTTGGACCCAACCAAG-3' (Mt CDH-D181K-rv). Para los cebadores D547S/E550S con doble mutante 5'-GTCTTCTATTCTTTTTACTCTGCTTGGGATG -3' (Mt CDH-D547S/E550S -fw) y 5'- ATAGAAGACCACATCAGGG -3' (Mt CDH- D547S/E550S -rv). Los sitios de mutación se indican con letras en negrita en los cebadores directos mutagénicos. La PCR se realizó en las siguientes condiciones: 98°C durante 30 s, luego 32 ciclos de 98°C durante 10 s; 62°C durante 20 s; 72°C durante 2 minutos, con una extensión final de 10 minutos a 72°C. La mezcla de reacción de 50 pl contenía el tampón Phusion HF (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 0,1 pg de ADN plasmídico, 1 unidad de ADN polimerasa de Phusion (New England Biolabs), 10 pM de cada dNTP y 5 pmol de cada cebador.
Las reacciones de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y las bandas a 6 kB se purificaron utilizando el gel Wizard SV y el sistema de limpieza por PCR (Promega, Madison, WI, USA). El fragmento de PCR purificado se digirió con Dpnl (Fermentas, Vilnius, Lituania) para eliminar el ADN metilado. Se utilizaron 10 pl de esta reacción para transformar células NEB-5-Alpha E. coli químicamente competentes (New England Biolabs) según el fabricante. Para cada mutación, se comprobaron 3 colonias mediante secuenciación para detectar la presencia de la mutación correcta. El plásmido purificado de un clon positivo se linealizó con SacI y se utiliza para transformar células competentes de X-33 P. pastoris. Las colonias que crecían en placas de agar de zeocina YPD (100 mg/l) se verificaron mediante PCR para la integración del constructo. Dos clones positivos de cada mutación se cultivaron adicionalmente en condiciones inducidas y se analizaron para determinar la producción de CDH. Los clones con mayor rendimiento fueron seleccionados para la fermentación.
Ejemplo 9: Producción de CDH recombinante
Se inoculó un precultivo durante la noche de un transformante de Pichia pastoris (seleccionado de una placa YPD con 100 mg/l de Zeocina) en 0,3 l de medio de la etapa de producción en un multifermentador Infors h T (Bottmingen, Suiza). El medio de la etapa de producción contenía por litro: 26,7 ml de H3PO4 (85 %); 0,93 g de CaSO4-2H2O; 14,9 g de MgSO4-7H2O; 18,2 g de K2SO4; 4,13 g de KOH; 4 % (v/v) glicerol; 1,45 ml de solución de oligoelemento PTM1 para P. pastoris según el manual de Invitrogen 053002 Ver. B (Carlsbad, CF, USA). La solución de elementos traza PTM1 contiene por litro: 6 g de CuSO4-5H2O, 0,08 g de Nal, 3 g de MnSO4H2O, 0,2 g de NaMoO4-2H2O, 0,02 g de H3BO3, 0,5 g de CoCh, 20 g de ZnCh, FeSO4-7H2O, 0,2 g de biotina, 5 ml de ácido sulfúrico. Se realizó una alimentación de glicerol con una adición de 9 gl-1 h-1 hasta que el peso celular húmedo superó los 150 g por litro. Tan pronto como se consumió el glicerol residual (determinado al controlar el aumento de la tensión de oxígeno disuelto), se suministró una alimentación de metanol (100 % de metanol que contiene 12 ml de solución de elementos traza PTM1 por litro) con una adición promedio de 3 gl-1 h-1 se inició y continuó durante 72 horas a 30°C y 20 % de tensión de oxígeno. El sobrenadante del cultivo se separó de la biomasa residual mediante centrifugación (20 min, 6000 x g) y se concentró y se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba. Para ello, se añadió lentamente una solución saturada de sulfato de amonio al sobrenadante de cultivo claro a una temperatura de 4°C a 20 % de saturación final. Después de una segunda etapa de centrifugación (30 minutos, 30,000 xg), la solución se aplicó a una columna PHE-Source (GE Healthcare Biosciences) equilibrada con tampón de acetato de sodio 100 mM, pH 5,5 que contiene (NH4)2SO4 (20 % de saturación) y 0,2 M NaCl. La columna se eluyó con un gradiente lineal (0 a 100 % de tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5) en 10 CV. Las fracciones de CDH más puras se agruparon, se desalaron con tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, se concentraron y se almacenaron para su uso posterior.
Ejemplo 10: Equipo electroquím ico
Se usó un flujo de tres electrodos a través de una celda de pared amperométrica (Appelqvist et al, Anal. Chim. Acta, 169 (1985) 237-47) y contenía el electrodo de trabajo (electrodo de grafito modificado con CDH), un electrodo de referencia (Ag|AgCl en 0,1 M KCl) y un contraelectrodo hecho de un alambre de platino, conectado a un potenciostato (Zata Elektronik, Hoor, Suecia). El electrodo modificado con enzima se ajustó a presión en un soporte de teflón y se insertó en la celda de inyección de pared y se mantuvo a una distancia constante (aproximadamente 1 mm) de la boquilla de entrada. Las corrientes de respuesta se registraron en un registrador de gráficos de banda (Kipp & Zonen, Delft, Países Bajos). La celda electroquímica se conectó en línea a un sistema de inyección de flujo de una sola línea (Fl), en el que el flujo del portador se mantuvo a un caudal constante de 0,5 ml min'1 mediante una bomba peristáltica (Gilson, Villier-le-Bel, Francia). El inyector era una válvula de seis puertos controlada eléctricamente (Rheodyne, Cotati, CA, USA), y el volumen del bucle de inyección era de 50 pl.
Para los electrodos serigrafiados se utilizó un flujo de chorro de pared de metacrilato especial para el análisis de inyección de flujo (FIA) de DropSense (Oviedo, España). La celda electroquímica consta de un electrodo de trabajo de carbono (4 mm de diámetro), un contraelectrodo de carbono y un electrodo de referencia de plata conectado a un potenciostato (Zata Elektronic). Las corrientes de respuesta se registraron en un registrador de gráficos de banda (Kipp & Zonen). La celda electroquímica se conectó en línea a un sistema de inyección de flujo único (Fl), en el que el flujo del portador se mantuvo a un caudal constante de 0,5 ml min-1 mediante una bomba peristáltica (Gilson). Para la inyección, se utilizó una válvula de seis-puertos controlada electrónicamente (Rheodyne) y un bucle de inyección (50 pl).
Ejemplo 11: Preparación de Electrodos de Grafito Modificados con Enzimas
La CDH se inmovilizó mediante una simple adsorción quimiofísica sobre la superficie de electrodos de grafito espectroscópicos sólidos (diámetro = 3,05 mm, Ringsdorff Spektralkohlestabe, SGL Carbon Sigri Greatlakes Carbon Group Ringsdorff-Werke GmbH, Bonn, Alemania). El electrodo se cortó y se pulió sobre papel de lija húmedo (Tufbak, Durite, P400) y luego se enjuagó cuidadosamente con agua Milli-Q y se secó. Luego se esparcieron 5 pl de solución de enzima sobre toda la superficie activa del electrodo (0,0731 cm2). El electrodo se secó a temperatura ambiente y luego se almacenó durante la noche a 4°C. Antes de su uso, el electrodo se enjuagó completamente con agua Milli-Q para eliminar cualquier enzima adsorbida débilmente y se conectó en la celda de la pared que ya contenía el tampón. Luego, se aplicó el potencial requerido hasta que se obtuvo una corriente de fondo estable antes de que se inyectara cualquier sustrato en el sistema de flujo.
Ejemplo 12: Preparación de electrodos impresos en pantalla modificados con enzima
Se colocaron cinco pl de solución de enzima en el electrodo a base de carbono (DropSens, Oviedo, España) para que toda el área estuviera completamente cubierta con solución. La inmovilización se dejó proceder durante la noche a 4°C. Antes de su uso, los electrodos se enjuagaron con agua. La reticulación del biocomponente se llevó a cabo mediante modificación química con glutaraldehído, en la que se aplicó 1 pl de una solución acuosa de glutaraldehído al 1 % sobre la capa de enzima a 37°C durante 10-15 min. Después de enjuagar, los electrodos se dejaron secar a temperatura ambiente.
El óptimo para el potencial aplicado se determinó con una solución de lactosa 10 mM. El potencial se varió por etapas de - 250 to 600 mV frente a Ag|AgCl en 0,1 M KCl y 300 mV seleccionados para experimentos adicionales.
Ejemplo 13: Perfiles de pH de CDH inmovilizadas en electrodos
La actividad frente al perfil de pH para la transferencia de electrones directa (DET) de la enzima adsorbida se determinó electroquímicamente utilizando un sistema de inyección de flujo. El sustrato fue lactosa con una concentración de 5 mM. Como los ensayos enzimáticos deben realizarse bajo condiciones de sustrato saturante, de modo que las variaciones leves en la concentración absoluta no tengan influencia en la velocidad de reacción, debe estar presente una cantidad al menos 10 veces mayor que el valor de Km. Se utilizaron los siguientes tampones en los experimentos: tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 3,0-6,5), tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,0-9,0). Los tampones se desgasificaron antes de su uso para evitar las microburbujas en el sistema de flujo.
Ejemplo 14: Cinética de enzimas heterogéneas en electrodos
Los parámetros cinéticos Km (constante de Michaelis-Menten) y vmax (actividad volumétrica máxima), en este caso igual a Imax (respuesta máxima en corriente), se determinaron para una serie de sustratos en el modo DET (el aceptor de electrones es el electrodo de grafito). Todos los parámetros cinéticos se calcularon mediante regresión por mínimos cuadrados no lineales, ajustando los datos observados a la ecuación de Henri-Michaelis-Menten. Estos cálculos se realizaron después de corregir los valores de concentración del sustrato utilizando el factor de dispersión del sistema de flujo utilizado, incluida la célula de chorro de pared, dividiendo la corriente de estado estable registrada para una solución de ferrocianuro 50 mM con la de la corriente máxima para la muestra inyectada que tiene el mismo valor. concentración de ferrocianuro y uso de un potencial aplicado de 400 mV (Ruzicka and Hansen, Flow Injection Analysis, 2nd ed., Wiley, New York 1988). En nuestro caso, para una distancia de 1 mm entre el electrodo y la boquilla de entrada y un caudal de 0,5 ml min'1, el factor de dispersión D fue igual a 1,18 (Figura 5).
Ejemplo 15: CDH de Chaetomium atrobrunneum
Una celobiosa deshidrogenasa con altas tasas de recambio de glucosa y actividad en condiciones de pH fisiológico se obtuvo a partir de cultivos líquidos de Chaetomium atrobrunneum. El cultivo se hizo crecer y se cribó como se describe. La actividad máxima en las condiciones elegidas fue de 90 U/l (ensayo cyt c, pH 6,0, día 11). Para la producción de enzimas y la purificación, los procedimientos descritos se aplicaron y dieron como resultado una preparación de CDH con una actividad específica de 11,7 U/mg (Ensayo DClP, pH 6,0), un peso molecular aparente de 90 kDa según lo determinado por SDS-PAGE y un punto isoeléctrico de 4,6. El peso molecular calculado de la secuencia proteica obtenida es de 86,047 kDa y se ajusta bien a la CDH nativa. El punto isoeléctrico calculado es 5,0. El espectro de CDH de Chaetomium atrobrunneum es típico y muestra las bandas hemo alfa, beta y gamma de la enzima reducida a 563, 533 y 430 nm. En la enzima oxidada, la banda gamma tiene su máximo de absorción a 421 nm con un hombro a 450 nm, que desaparece después de la reducción con lactosa y corresponde al pico de absorción del cofactor FAD. La caracterización cinética con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un perfil de pH neutro con un máximo de actividad a pH 5,0 y todavía una actividad relativa del 18 % a pH 7,4 (FIGURA 2.a). La actividad específica a pH 7,4 fue de 0,88 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. El pH óptimo del dominio de flavina se obtuvo con el ensayo DCIP y muestra un pH óptimo más ácido, sin embargo, el dominio de flavina es suficientemente activo a pH 7,4 también con este aceptor de electrones. Las constantes cinéticas para la glucosa (obtenidas con el ensayo cyt c a pH 5,0) son un Km de 240 mM y un kcat de 17,5 s-1 para la glucosa, lo que muestra, en comparación con las enzimas conocidas actualmente, una compatibilidad mucho mejor de esta enzima para la solicitud propuesta.
Para probar el comportamiento electroquímico de Chaetomium atrobrunneum CDH en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en una superficie de electrodo de grafito espectroscópico. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es 5,6 y el 48 % de la corriente máxima se obtuvo a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo en la superficie del electrodo era 80 mM e Imax = 30 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aprox. cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 233 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 3-15 mM.
Ejemplo 16: CDH de Corynascus therm ophilus
Una celobiosa deshidrogenasa con altas tasas de recambio de glucosa y actividad en condiciones de pH fisiológico se obtuvo a partir de cultivos líquidos de Corynascus thermophilus. La actividad máxima obtenida fue de 1400 U/l (ensayo cyt c, pH 6,0, 6° día). Para la producción y purificación de enzimas, los procedimientos descritos se aplicaron y dieron como resultado una preparación de CDH con una actividad específica de 17,9 U/mg, un peso molecular aparente de 87 kDa según lo determinado por SDS-PAGE y un punto isoeléctrico de 4,1. El peso molecular calculado de la secuencia proteica obtenida es de 81,946 kDa y se ajusta bien a la CDH nativa. El punto isoeléctrico calculado es 4,64. El espectro de C. thermophilus CDH es típico y muestra las bandas hemo a, p y y de la enzima reducida a 562, 533 y 429 nm. En la enzima oxidada, la banda y tiene su máximo de absorción a 420 nm con un hombro a 450 nm, que desaparece después de la reducción con lactosa y corresponde al pico de absorción del cofactor FAD. La caracterización cinética con el ensayo de cyt c dio como resultado un perfil de pH con un máximo de actividad a pH 7,5 y una actividad relativa del 98% a pH 7,4 (FIGURA 2.b). La actividad específica a pH 7,4 fue de 3,6 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. El pH óptimo del dominio de flavina se obtuvo con el ensayo DCIP y muestra un pH óptimo más ácido, sin embargo, el dominio de flavina es suficientemente activo a pH 7,4 también con este aceptor de electrones. Las constantes cinéticas para la glucosa (obtenidas con el ensayo cyt c a pH 5,0) son un Km de 950 mM y un kcat de 32 s-1 para la glucosa.
Para probar el comportamiento electroquímico de C. thermophilus CDH en electrodos, la preparación de enzima purificada se inmovilizó por adsorción en una superficie de electrodo de grafito espectroscópico. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es de 8,5 y el 96 % de la corriente máxima se obtuvo a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo en la superficie del electrodo era de 188 mM e Imax = 190 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aproximadamente cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 3500 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 1-15 mM.
Ejemplo 17: CDH de Hipoxilon hematostroma
Una celobiosa deshidrogenasa con altas tasas de recambio de glucosa y actividad en condiciones de pH fisiológico se obtuvo a partir de cultivos líquidos de Hypoxylon hemoatostroma. El cultivo se hizo crecer y se cribó como se describe. La actividad máxima en las condiciones elegidas fue de 65 U/l (ensayo cyt c, pH 6,0, noveno día). Para la producción de enzimas y la purificación, los procedimientos descritos se aplicaron y dieron como resultado una preparación de CDH con una actividad específica de 15,3 U/mg (Ensayo DCIP, pH 6,0), un peso molecular aparente de 85 Da según lo determinado por SDS-PAGE y un punto isoeléctrico de 4,1. El peso molecular calculado de la secuencia proteica obtenida es de 87,514 kDa y se ajusta bien a la CDH nativa. El punto isoeléctrico calculado es 6,37. El espectro de Hypoxylon hipoestroma de CDH es típico y muestra las bandas alfa, beta y gamma de la enzima reducida a 563, 533 y 429 nm. En la enzima oxidada, la banda gamma tiene su máximo de absorción a 421 nm con un hombro a 450 nm, que desaparece después de la reducción con lactosa y corresponde al pico de absorción del cofactor FAD. La caracterización cinética con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un perfil de pH neutro con un máximo de actividad a pH 5,5 y todavía una actividad relativa del 65 % a pH 7,4 (FIGURA 2.c). La actividad específica a pH 7,4 fue de 2,73 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. El pH óptimo del dominio de flavina se obtuvo con el ensayo DCIP y muestra un pH óptimo más ácido, sin embargo, el dominio de flavina es suficientemente activo a pH 7,4 también con este aceptor de electrones. Las constantes cinéticas para la glucosa (obtenidas con el ensayo cyt c a pH 5,5) corresponden a un Km de 260 mM y un kcat de 8,8 s-1 para la glucosa, lo que muestra en comparación con las enzimas conocidas actualmente una compatibilidad mucho mejor de esta enzima para la propuesta solicitud.
Para probar el comportamiento electroquímico de Hypoxylon hematostroma CDH en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en una superficie de electrodo de grafito espectroscópico. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es de 7,5 y la corriente máxima se obtuvo a este pH y a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo (7,4) en la superficie
del electrodo para la glucosa era 49 mM e Imax = 55 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aproximadamente cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 383 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 2-20 mM.
Ejemplo 18: CDH de Neurospora crassa
Una celobiosa deshidrogenasa con altas tasas de recambio de glucosa y actividad en condiciones de pH fisiológico se obtuvo de cultivos líquidos de Neurospora crassa. El cultivo se hizo crecer y se cribó como se describe. La actividad máxima en las condiciones elegidas fue de 156 U/l (ensayo cyt c, pH 6,0, día 18). Para la producción y purificación de enzimas, los procedimientos descritos se aplicaron y dieron como resultado una preparación de CDH con una actividad específica de 10,6 U/mg (ensayo DCIP, pH 6,0), un peso molecular aparente de 90 kDa según lo determinado por SDS-PAGE y un punto isoeléctrico. de 4,3. El peso molecular calculado de la secuencia proteica obtenida es de 86,283 kDa y se ajusta bien a la CDH nativa. El punto isoeléctrico calculado es 6,68. El espectro de CDH de Neurospora crassa es típico y muestra las bandas alfa, beta y gamma de la enzima reducida a 563, 533 y 430 nm. En la enzima oxidada, la banda gamma tiene su máximo de absorción a 421 nm con un hombro a 450 nm, que desaparece después de la reducción con lactosa y corresponde al pico de absorción del cofactor FAD. La caracterización cinética con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un perfil de pH neutro con un máximo de actividad a pH 6,0 y una actividad relativa del 52 % a pH 7,4 (FIGURA 2.d). La actividad específica a pH 7,4 fue de 1.04 U/mg utilizando el ensayo de cyt c y la glucosa como sustrato. El pH óptimo del dominio de flavina se obtuvo con el ensayo DCIP y muestra un pH óptimo más ácido, sin embargo, el dominio de flavina es suficientemente activo a pH 7.4 también con este aceptor de electrones. Las constantes cinéticas para la glucosa (obtenidas con el ensayo de cyt c a pH 5,5) son un Km de 1680 mM y un kcat de 15,9 s-1 para la glucosa, lo que muestra en comparación con otras enzimas conocidas una capacidad mucho mejor de esta enzima para la solicitud propuesta.
Para probar el comportamiento electroquímico de Neurospora crassa CDH en electrodos, la preparación de enzima purificada se inmovilizó por adsorción en una superficie de electrodo de grafito espectroscópico. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es 5,0 y el 31 % de la corriente máxima se obtuvo a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo en la superficie del electrodo era 90 mM e Imax = 5 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aproximadamente cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 82 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 2-10 mM.
Ejemplo 19: CDH de Stachybotris bisbyi
Una celobiosa deshidrogenasa con altas tasas de recambio de glucosa y actividad en condiciones de pH fisiológico se obtuvo a partir de cultivos líquidos de Stachybotris bisbyi. El cultivo se hizo crecer y se cribó como se describe. La actividad máxima en las condiciones elegidas fue de 154 U/l (ensayo cyt c, pH 6,0, día 24). Para la producción y purificación de enzimas, los procedimientos descritos se aplicaron y dieron como resultado una preparación de CDH con una actividad específica de 7,9 U/mg (ensayo DCIP, pH 6,0), un peso molecular aparente de 100 kDa según lo determinado por SDS-PAGE y un punto isoeléctrico de 4,5. El peso molecular calculado de la secuencia proteica obtenida es 86,212 kDa y se adapta bien a la CDH nativa cuando se considera una glicosilación del 14 % de CDH de S. bisbyi, un valor que se encuentra dentro del rango observado (2-15 %, Zámocky et al., 2006, Current Protein and Peptide Science, 7: 255-280). El punto isoeléctrico calculado es 6,37. El espectro de Stachybotris bisbyi CDH es típico y muestra las bandas alfa, beta y gamma de la enzima reducida a 562, 533 y 430 nm. En la enzima oxidada, la banda gamma tiene su máximo de absorción a 420 nm con un hombro a 450 nm, que desaparece después de la reducción con lactosa y corresponde al pico de absorción del cofactor FAD. La caracterización cinética con el ensayo de cyt c dio como resultado un perfil de pH con un máximo de actividad a pH 5,5 y una actividad relativa del 60 % a pH 7,4 (FIGURA 2.e). La actividad específica a pH 7,4 fue de 0,58 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. El pH óptimo del dominio de flavina se obtuvo con el ensayo DCIP y muestra una tendencia similar que indica que la oxidación del sustrato por la enzima es eficiente a pH 7,4. Las constantes cinéticas para la glucosa (obtenidas con el ensayo cyt c a pH 5,5) son un Km de 950 mM y un kcat de 14,1 s_1 para la glucosa, lo que muestra, en comparación con las enzimas conocidas actualmente, una compatibilidad mucho mejor de esta enzima para la propuesta solicitud.
Para probar el comportamiento electroquímico de Stachybotris bisbyi CDH en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en una superficie de electrodo de grafito espectroscópico. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es 5,0 y el 27 % de la corriente máxima se obtuvo a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo en la superficie del electrodo era 131 mM e Imax = 65 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aproximadamente cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 237 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 3-15 mM.
Ejemplo 20: CDH de Myriococcum thermophilum
Se descubrió que la CDH de Myriococcum thermophilum oxida la glucosa muy eficientemente (Harreither et al., 2007, Electroanalysis 19: 172-180), pero no en condiciones fisiológicas. Se usó como un andamio de proteínas para el cual se desarrolló la DET a pH neutro mediante ingeniería genética. Las variantes de enzima D181K y D547S/ E550S se obtuvieron de acuerdo con los procedimientos descritos para aumentar el IET a pH 7,4 y, por lo tanto, la respuesta del electrodo para optimizar la enzima para aplicaciones en condiciones de pH neutro o alcalino.
Para la producción de enzimas y la purificación de la enzima del productor nativo, se siguió el protocolo dado en (Harreither et al., 2007, Electroanalysis 19: 172-180) y dio como resultado una preparación de CDH con una actividad específica de 10,7 U/mg (Ensayo DCIP, pH 6,0), un peso molecular aparente de 94 kDa y un punto isoeléctrico de 3,8. El peso molecular calculado de la secuencia proteica es 86,701 kDa y se ajusta bien a la CDH nativa. El punto isoeléctrico calculado es 4,62. El espectro de CDH obtenido de M. thermophilum es típico y muestra las bandas alfa, beta y gamma de la enzima reducida a 563, 533 y 429 nm. En la enzima oxidada, la banda gamma tiene su máximo de absorción a 421 nm con un hombro a 450 nm, que desaparece después de la reducción con lactosa y corresponde al pico de absorción del cofactor FAD. La caracterización cinética con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un perfil de pH neutro con un máximo de actividad entre pH 4,0-4,5 y 0 % de actividad relativa a pH 7,4 (FIGURA 2.f). La actividad específica a pH 7,4 también fue de 0 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. El pH óptimo del dominio de flavina se obtuvo con el ensayo DCIP y muestra un pH óptimo mucho menos ácido (6,0), lo que indica que la oxidación del sustrato en el dominio de flavina se realiza de manera eficiente incluso en condiciones neutras y ligeramente alcalinas, pero el IET es limitante de velocidad. Las constantes cinéticas obtenidas para la glucosa (ensayo DCIP, pH 6,0; Km = 250 mM, kcat = 14,2 s_1) muestran que aunque la conversión de glucosa es muy eficiente, M. thermophilum CDH no es adecuada para la aplicación propuesta porque no se midió la IET por encima de pH 7,0.
Las variantes de enzimas recombinantes se produjeron de forma heteróloga en P. pastoris de acuerdo con las rutinas explicadas. Los pesos moleculares, puntos isoeléctricos o propiedades espectrales no difirieron significativamente de la enzima nativa producida por el hongo.
La caracterización cinética de D181K con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad de 5,0 y 24 % de actividad relativa a pH 7,4 (FIGURA 2.g). La actividad específica a pH 7,4 fue de 1,01 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de D181K en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en un electrodo impreso en pantalla. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es 5,5 y el 52 % de la corriente máxima se obtuvo a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo en la superficie del electrodo era 133 mM e Imax = 105 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aproximadamente cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 513 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 0,5-20 mM.
La caracterización cinética de D181R con el ensayo cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad de 5,0 y una actividad relativa del 20 % a pH 7,4. La actividad específica a pH 7,4 fue de 0,73 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de D181R en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en un electrodo impreso en pantalla. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para pH 5,0 y 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contenía NaCl 100 mM. La densidad de corriente DET obtenida a pH 5,0 y 7,4 fue de 485 nA/cm2 y 168 nA/cm2, respectivamente. El electrodo tenía un 42 % de la corriente máxima a pH 7,4.
La caracterización cinética de D198K con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad de 5,0 y 22 % de actividad relativa a pH 7,4. La actividad específica a pH 7.4 fue de 0,62 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de D198K en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en un electrodo impreso en pantalla. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para pH 5,0 y 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contenía NaCl 100 mM. La densidad de corriente DET obtenida a pH 5,0 y 7,4 fue de 259 nA/cm2 y 108 nA/cm2, respectivamente. El electrodo tenía un 42 % de la corriente máxima a pH 7,4.
La caracterización cinética de D198N con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad de 5,0 y 22 % de actividad relativa a pH 7,4. La actividad específica a pH 7.4 fue de 0,69 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de D198N en electrodos, la preparación enzimática purificada se inmovilizó por adsorción en un electrodo impreso en pantalla. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para pH 5,0 y 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que
contenía NaCI 100 mM. La densidad de corriente DET obtenida a pH 5,0 y 7,4 fue de 353 nA/cm2 y 140 nA/cm2, respectivamente. El electrodo tenía un 40 % de la corriente máxima a pH 7,4.
La caracterización cinética de D568S/E571S con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad entre 4,5 y 5,0 y 13 % de actividad relativa a pH 7,4 (FIGURA 2.h). La actividad específica a pH 7,4 fue de 0,70 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de D568S/E571S en electrodos, la preparación de enzima purificada se inmovilizó por adsorción en una superficie de electrodo de grafito. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para determinar el pH óptimo, la corriente a pH óptimo y la corriente a pH 7,4. El pH óptimo en las condiciones elegidas es 5,5 y el 24 % de la corriente máxima se obtuvo a pH 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contiene NaCl 100 mM. Se determinó que el valor de Km de la enzima heterogenizada a pH óptimo en la superficie del electrodo era 55 mM e Imax = 30 nA. Por lo tanto, las corrientes obtenidas en las mediciones de glucosa deben seguir una relación casi lineal para concentraciones de aproximadamente cinco veces por debajo del valor de Km. La densidad de corriente DET obtenida a pH 7,4 fue de 241 nA/cm2 y el rango lineal para la detección de glucosa a pH 7,4 con la configuración elegida dentro de 1-20 mM.
La caracterización cinética de D568S/E571S/D574S con el ensayo cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad de 5,5 y una actividad relativa del 43 % a pH 7,4. La actividad específica a pH 7,4 fue de 2,49 U/mg utilizando el ensayo de cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de D568S/E571S/D574S en electrodos, la preparación de enzima purificada se inmovilizó por adsorción en un electrodo de serigrafía. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para pH 5,0 y 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contenía NaCl 100 mM. La densidad de corriente DET obtenida a pH 5,0 y 7,4 fue de 455 nA/cm2 y 184 nA/cm2, respectivamente. El electrodo tenía un 40 % de la corriente máxima a pH 7,4.
La caracterización cinética de E571K con el ensayo de cyt c y la lactosa como donante de electrones dio como resultado un pH con un máximo de actividad de 5,0 y 17 % de actividad relativa a pH 7,4. La actividad específica a pH 7,4 fue de 0,50 U/mg utilizando el ensayo cyt c y la glucosa como sustrato. Para probar el comportamiento electroquímico de E571K en electrodos, la preparación de enzima purificada se inmovilizó por adsorción en un electrodo impreso en pantalla. Usando una celda de flujo e inyecciones subsiguientes de glucosa 50 mM, se determinaron las corrientes de DET para pH 5,0 y 7,4 en solución salina regulada con fosfato (PBS) 10 mM que contenía NaCl 100 mM. La densidad de corriente DET obtenida a pH 5,0 y 7,4 fue de 595 nA/cm2 y 197 nA/cm2, respectivamente. El electrodo tenía un 33 % de la corriente máxima a pH 7,4.
Ejemplo Comparativo 21: CDH de Myriococcum thermophilum - Perfil de pH de glucosa con enzima de tiposilvestre utilizando electrodos de grafito.
Se descubrió que la CDH de Myriococcum thermophilum oxida muchos carbohidratos, uno de ellos es la glucosa (Harreither et al., 2007, Electroanalysis 19: 172-180). A partir de un perfil de pH medido con celobiosa o lactosa 5 mM (Figura 3A Harreither et al. 2007) se puede ver una corriente DET a pH 7,5 con aprox. 17 % y 20 %, respectivamente, del valor del pico máximo a pH 5. Se podría especular que la glucosa también podría detectarse mediante este procedimiento, por lo que se realizó una medición comparativa utilizando las mismas condiciones experimentales, procedimientos de preparación de enzimas y electrodos (tampón de citrato de sodio 50 mM, pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,5, 7,5; potencial 400 mV vs. Ag|AgCl en 0,1 M KCl), intercambiando la celobiosa 5 mM o lactosa 5 mM originalmente utilizada por glucosa 5 mM. Los resultados se muestran en la Figura 2.i y muestran una fuerte disminución de la corriente detectada en pH 6,5. A pH 7,5 no se pudo detectar ninguna señal y, por lo tanto, no se calculó ningún valor ya que la respuesta estaba dentro del ruido electrónico de la medición (2 nA). El motivo de este comportamiento radica en el mayor valor de Km de M. thermophilum CDH para glucosa (Km = 240 mM) que para celobiosa (Km = 0,027 mM) o lactosa (Km = 0,055 mM, todos los datos de Harreither et al. 2007) lo que reduce la corriente obtenida a pH 7,5 por debajo del límite de detección.
Ejemplo 22: Secuencias
>M.thermophilum (SEQ ID NO: 1)
mrtssrligalaaallpsalaqnnvpntftdpdsgitfntwgldedspqtqggftfgvalpsdalttdasefigylkcarndesgw cgislggpmtnsllitawphedtvytslrfatgyampdvyegdaeitqvsssvnsthfslifrcknclqwshggssggastsggvl vlgwvqafddpgnptcpeqitlqqhdngmgiwgaqlntdaaspsytdwaaqatktvtgdcegptetsvvgvpvptgvsfdyivvgg gaggipaadklseagksvlliekgfastantggtlgpewleghdltrfdvpglcnqiwvdskgiacedtdqmagcvlgggtavnag lwfkpysldwdylfpdgwkyndvqpainralsripgtdapstdgkryyqegfevlskglaaggwtsvtannapdkknrtfahapfm faggerngplgtyfqtakkrnnfdvwlntsvkrviregghitgvevepfrdggyegivpvtkvtgrvilsagtfgsakillrsgig pedqlevvaasekdgptmignsswinlpvgynlddhlntdtvishpdvvfydfyeawddpiesdknsylesrtgilaqaapnigpm fweeivgadgivrqlqwtarvegslgapnghtmtmsqylgrgatsrgrmtitpslttivsdvpylkdpndkeaviqgiinlqnalq nvanltwlfpnstitpreyvesmvvspsnrrsnhwmgtnklgtddgrkggsavvdldtrvygtdnlfvidasifpgvpttnptsyi vvaaehassrilalpdlepvpkygqcggrewtgsfvcadgstceyqnewysqcl
> H.hemoatostroma (SEQ ID NO: 3)
mgrlgslaklllavglnvqqcfgqngpptpytdsetgitfatwsggnglapwggltfgvalpenalttdateligylkcgsngttt dawcglsfggpmtnslllmawphedeiltsfrfasgytrpdlytgdakltqisstidkdhftlifrcqnclawnqdgasgsastsa gslilgwasalraptnagcpaeinfnfhnngqmiwgatldesaanpsysewaakatatvtgdcggatpttttttttsvptatgipv ptgtydyivvgagaggipladklseagksvlliekgppssgrwggtlkpewlkdtnltrfdvpglcnqiwvnsagvactdtdqmag cvlgggtavnaglwwkpynldwdynfprgwksrdmaaatrrvfsripgtdnpsmdgkrylqqgfeilagglkaagwtevtandapn kknhtyshspfmfsggerggpmgtylvsasrrknfhlwtgtavkrvvrtgghitglevepfvnggytgvvnvtsitgrvvlsagaf gsakillrsgigpedqleivksstdgptmisdsswitlpvgynledhtntdtvvthpdvvfydfyeaghpnvtdkdlylnsragil aqaapnigpmfweeikgrdgvvrqlqwtarvegsagtpngyamtmsqylgrgaksrgrmtitkalttvvstvpylqdkndveaviq giknlqaalsnvknltwayppsnttvedfvnnmlvsytnrrsnhwigtnklgtddgrsrggsavvdlntkvygtdnlfvvdagifp ghittnptsyiviaaeraserildlpparaqprfaqcggrtwtgsfqcaapytcqyrnerysqcr
> C.attrobruneum (SEQ ID NO: 5)
mrpssrfvgalaaaasflpsalaqnnaavtftdpdtgivfnswglangapqtqggftfgvalpsdalttdatefigylecasadnq gwcgvsmggpmtnsllitawphednvytslrfatgyampdvysgdatitqisssinathfklifrcqnclqwthdgasggastsag vlvlgwvqafpspgnptcpdqitleqhnngmgiwgavmdsnvanpsytewaaqatktveaecdgpsetdivgvpvptgttfdyivv gggaggiptadklseagksvlliekgiastaehggtlgpewlegndltrfdvpglcnqiwvdskgiacedtdqmagcvlgggtavn aglwfkpysldwdylfpsgwkyrdiqaaigrvfsripgtdapstdgkryyqqgfdvlagglsaggwnkvtansspdkknrtfsnap fmfsggerggplatyltsakkrsnfnlwlntsvkrviregghvtgvevepfrtggyqgivnvtavsgrvvlsagtfgsakillrgg igpadqlevvkaskidgptmisnaswiplpvgynlddhlntdtvithpdvafydfyeawntpieadknsylssrtgilaqaapnig pmmweeikgadgivrqlqwtarvegsfdtpngqamtisqylgrgatsrgrmtitpslttvvsdvpylkdpndkeaviqgivnlqna lknvagltwtypnssitpreyvdnmvvspsnrranhwmgtakigtddgrlaggsavvdlntkvygtdnlfvvdasifpgtpttnps ayivtaaehasqrilglaapkpvgkwgqcggrqwtgsfqcvsgtkcevvnewysqcl
> C.thermophilum (SEQ ID NO: 7)
mkllsrvgatalaatlslkqcaaqmtegtytheatgitfktwtpsdgstftfglalpgdaltndateyigllrcqitdpsspgycg ishgqsgqmtqalllvawasedvvytsfryatgytlpelytgdakltqiassvsgdsfevlfrcencfswdqngatgsvstsngal vlgyaasksgltgatcpdtaefgfhnngfgqwgavlegatsdsyeewaqlatitppttcdgngpgdkvcvpapedtydyivvgaga ggitvadklseaghkvlliekgppstglwngtmkpewlegtdltrfdvpglcnqiwvdsagiactdtdqmagcvlgggtavnaglw wkphpadwddnfphgwkssdladatervfsripgtwhpsqdgklyrqegfevisqglanagwrevdanqepseknrtyshsvfmfs ggerggplatylasaaqrsnfnlwvntsvrrairtgprvsgvelecladggfngtvnlkegggvifsagafgsaklllrsgigped qleivasskdgetfiskndwiklpvghnlidhlntdliithpdvvfydfyaawdnpitedkeaylnsrsgilaqaapnigplmwee vtpsdgitrqfqwtcrvegdssktnsthamtlsqylgrgvvsrgrmgitsgltttvaehpylhndgdleaviqgiqnvvdalsqvp dlewvlpppnttveeyvnslivspanrranhwmgtakmglddgrsggsavvdlntkvygtdnlfvvdasifpgmstgnpsamiviv aeqaaqrilslry
> S.bisbyi (SEQ ID NO: 9)
mlfklsnwllalalfvgnvvaqlegptpytdpdtgivfqswvnpagtlkfgytypanaatvaatefigflecqgagwcsvslggsm lnkplvvaypsgdevlaslkwatgyanpepyggnhklsqisssvtsagfrvvyrcegclawnyqgieggsptngasmpigwaysas svlngdcvdntvliqhdtfgnygfvpdesslrteyndwtelptrvvrgdcggstttssvpsstappqgtgipvptgasydyivvgs gaggipiadklteagkkvlliekgppssgrydgklkptwlegtnltrfdvpglcnqiwvdsagiacrdtdqmagcvlgggtavnag lwwkpnpidwdynfpsgwkssemigatnrvfsriggttvpsqdgktyyqqgfnvlssglkaagwtsvslnnapaqrnrtygagpfm fsggerggplatylatakkrgnfdlwtntqvkrvirqgghvtgvevenyngdgykgtvkvtpvsgrvvlsagtfgsaklllrsgig pkdqlaivknstdgptmaserdwinlpvgynledhtntdivishpdvvhydfyeawtasiesdktaylgkrsgilaqaapnigplf fdevrgadnivrsiqytarvegnsvvpngkamvisqylgrgavsrgrmtisqglntivstapylsnvndleavikslenianslts kvknlkiewpasgtsirdhvtnmpldpatrranhwigtnkigtkngrltggdsvvdlntkvygtdnlfvvdasifpgmvttnpsay iviaaehaaskilslptakaaakyeqcggleyngnfqcasgltctwlndyywqct
> N.crassa (SEQ ID NO: 11)
MRTTSAFLSGLAAVASLLSPAFAQTAPKTFTHPDTGIVFNTWSASDSQTKGGFTVGMALPSNALTTDATE FIGYLECSSAKNGANSGWCGVSLRGAMTNNLLITAWPSDGEVYTNLMFATGYAMPKNYAGDAKITQIASS VNATHFTLVFRCQNCLSWDQDGVTGGISTSNKGAQLGWVQAFPSPGNPTCPTQITLSQHDNGMGQWGAAF DSNIANPSYTAWAAKATKTVTGTCSGPVTTSIAATPVPTGVSFDYIVVGGGAGGIPVADKLSESGKSVLL IEKGFASTGEHGGTLKPEWLNNTSLTRFDVPGLCNQIWKDSDGIACSDTDQMAGCVLGGGTAINAGLWYK PYTKDWDYLFPSGWKGSDIAGATSRALSRIPGTTTPSQDGKRYLQQGFEVLANGLKASGWKEVDSLKDSE QKNRTFSHTSYMYINGERGGPLATYLVSAKKRSNFKLWLNTAVKRVIREGGHITGVEVEAFRNGGYSGII PVTNTTGRVVLSAGTFGSAKILLRSGIGPKDQLEVVKASADGPTMVSNSSWIDLPVGHNLVDHTNTDTVI QHNNVTFYDFYKAWDNPNTTDMNLYLNGRSGIFAQAAPNIGPLFWEEITGADGIVRQLHWTARVEGSFET PDGYAMTMSQYLGRGATSRGRMTLSPTLNTVVSDLPYLKDPNDKAAVVQGIVNLQKALANVKGLTWAYPS ANQTAADFVDKQPVTYQSRRSNHWMGTNKMGTDDGRSGGTAWDTNTRVYGTDNLYVVDASIFPGVPTTN PTAYIWAAEHAAAKILAQPANEAVPKWGWCGGPTYTGSQTCQAPYKCEKQNDWYWQCV
> M.thermophilum (SEQ ID NO: 2)
atgaggacctcctctcgtttaatcggagcccttgcggcggcacttttgccgtctgcccttgcccagaacaatgtcccgaatacttt taccgaccctgactcgggcatcacettcaacacgtggggtctcgacgaggattctccccagactcagggcggtttcacettcggcg ttgccctgccctctgatgccctcacaaccgacgcctcggaatttatcggttacttgaaatgcgcaaggaatgatgagagcggttgg tgtggcatttcccttggcgggcctatgaccaactcgctcctcatcacagcctggccgcacgaggacacggtctacaccagtcttcg gttcgcgaccggttacgccatgccggatgtctacgagggggacgccgagattacccaggtctcttcctctgttaattcgacgcact tcagtctcatcttcaggtgcaagaactgcctgcaatggagccacggcggctcctccggcggcgcctctacctcgggcggcgtgttg gtactcggctgggttcaggcattcgacgatcccggcaatccaacctgccccgagcagatcacactccagcagcacgacaacggcat gggtatctggggtgcccagctcaacacggatgctgccagcccgtcctacactgactgggccgcccaggctaccaagaccgtcaccg gtgactgcgagggccccaccgagacttctgtcgtcggcgtccccgttccgacgggtgtctcgttcgattatattgttgtcggcggc ggcgccgggggcatccccgcagctgacaagctcagcgaggccggcaagagtgtgttgctcatcgagaagggctttgcttcgaccgc aaacaccggaggtactctcggccctgaatggcttgagggccatgatctgacccgcttcgacgtgccgggtctgtgcaaccagatct gggtcgattccaaggggatcgcttgcgaggataccgaccagatggctggctgtgttctcggcggcggcaccgccgtgaatgctggc ctgtggttcaagccctactcgctcgactgggactacctcttccccgatggttggaagtacaatgacgtccagcctgccatcaaccg cgccctctcgcgcatcccaggcaccgacgccccttctaccgacggaaagcgctactaccaggagggttttgaggtcctctccaagg gcctggccgccggcggctggacctcagtcacggccaataatgcgcccgacaagaagaaccgcaccttcgcccatgctcccttcatg tttgccggcggcgagcgcaatggccctctgggtacctacttccagactgccaagaagcgcaacaatttcgatgtctggctcaacac gtcggtcaagcgcgtcatccgtgagggtggccacatcaccggcgtcgaggtcgagccgttccgtgacggtggttacgagggcattg tccccgtcaccaaggttaccggccgcgttatcctgtctgccggcaccttcggcagtgcaaagattctgttaaggagcggtattggc ccggaagatcagctagaagttgtcgcggcctccgagaaggacggccctaccatgatcggcaactcgtcctggatcaacctgcctgt cgggtacaacctcgatgaccatctcaacaccgacacagtcatctcccaccccgatgtcgtgttctacgacttttacgaggcgtggg atgatcccatcgagtctgacaagaatagctatctcgaatcgcgtacgggcatcctcgcccaagccgctcccaacattggccctatg ttctgggaagagatcgtgggcgcggacggcatcgttcgccagctccagtggactgcccgtgtcgagggtagcctgggcgctcccaa cggccacactatgaccatgtcgcagtaccttggccgtggtgccacctcacgcggccgcatgaccatcaccccgtctctgacgacta tcgtctcagacgtgccttacctcaaagaccccaacgacaaggaggctgtcatccaaggcatcatcaacctgcagaacgcccttcag aacgtcgccaacctgacttggctcttccccaactctaccattacgccgcgcgaatacgttgagagcatggtcgtctccccgagcaa ccggcggtccaaccactggatgggcaccaacaagctcggtaccgacgacgggcggaagggtggctccgctgtcgtcgacctcgaca ccagggtctacggtactgacaacctcttcgtcatcgacgcctccatcttccccggcgtgcccaccacgaatcctacttcgtacatc gtggtagcggcagagcacgcttcgtcccgcatcctcgccctgcccgacctcgagcccgtccccaagtacggccagtgtggcggtcg cgaatggaccggtagcttcgtctgcgccgatggttccacgtgcgagtaccagaatgagtggtactcgcagtgcttgtga > H. hemoatostroma (SEQ ID NO: 4) atgggtcgcctaggctctctcgcgaagttgcttctcgcagtcggcttgaatgttcagcaatgcttcgggcaaaacggacccccgac cccctacactgatagtgagaccggtatcactttcgccacctggtccggcggaaacggcttagcaccctggggcggcttgactttcg gtgttgcgttacctgaaaatgccctgaccaccgacgctaccgagctgattggatacctgaaatgcggttccaatggcacaaccaca gatgcgtggtgtggtctgtcgtttgggggcccgatgactaacagcctccttctcatggcctggccgcacgaagacgagatcttgac atcattccgttttgccagtggatataccagaccagacctatacaccggcgatgccaaattaacgcagatatcatccaccatcgata aagatcactttactctaattttcaggtgccagaactgtctagcgtggaaccaagacggcgcgtctggttccgcttcaactagtgcc ggctccttgatattaggctgggccagtgcgcttcgggccccgacgaatgcaggctgtccggctgaaatcaacttcaacttccacaa caatggccagatgatatggggcgctacattagacgagagcgccgcaaacccatcatattcggaatgggctgccaaagccaccgcta cggttaccggtgactgcggcggtgcaacccctacgaccactactaccaccaccacgtccgtccctaccgccacaggtatcccagtg
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> C.attrobruneum (SEQ ID NO: 6)
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> C.thermophilum (SEQ ID NO: 8)
atgaagcttctcagccgcgttggggccaccgccctagcggcgacgttgtccctgaaacaatgtgcagctcagatgaccgaagggac gtacacccatgaggctaccggtatcacgttcaagacatggactccttccgacggctcgactttcactttcggcttggccctccctg gggacgcgctgacaaatgatgccaccgagtacattggtctcctgcgttgccaaatcaccgatccctcttcgcccggctactgtggc atctcccacggccagtccggccagatgacgcaggcgctgctgctggtcgcttgggccagcgaggatgtcgtctacacgtcgttccg ctacgccaccggctacacactccccgagctctacacgggcgacgccaagctgacccagatcgcctcctcggtcagcggggacagct tcgaggtgctgttccgctgcgagaactgcttctcctgggaccagaacggcgccacgggcagtgtctcgaccagcaacggcgccctg gttctcggctacgctgcctcgaagagtggtttgacgggcgccacgtgcccggacacggccgagtttggcttccacaacaatggttt cggacagtggggtgcagtgctcgagggtgcgacctcggactcgtatgaggagtgggctcagctggccactatcacgcccccgacca cctgcgatggcaacggccctggcgacaaggtgtgcgttccggctcccgaagacacgtatgattacatcgttgtcggcgccggcgcc ggcggcatcacggtcgccgacaagctcagcgaggccggccacaaggtcctccttatcgagaagggtcctccgtcgaccggcctgtg gaacgggaccatgaagcccgagtggctcgagggtaccgacctcaeccgcttcgacgtccccggtctgtgcaaccagatctgggtcg actctgccggcattgcctgcaccgataccgaccagatggcgggctgcgttctcggcggtggcaccgctgtcaatgctggtctgtgg tggaagccccaccccgctgactgggacgacaacttccctcatggctggaagtcgagcgatctcgcggatgcgaccgagcgtgtctt cagccgcattcccggcacgtggcacccgtcgcaggatggcaaactgtaccgccaggagggcttcgaggtcatcagccagggcctgg ccaacgccggctggagggaagtcgacgccaaccaggagcccagcgagaagaaccgcacgtattcccacagtgtgttcatgttctcg ggcggtgagcgcggcggccccctggcgacgtacctcgcctcggctgcccagcgcagcaacttcaacttgtgggtcaacacttcggt ccggagggccatccgcaccggccccagggtcagtggcgtcgaactcgagtgccttgcggacggcggcttcaacggtactgtcaacc tgaaggagggtggtggtgtcatcttttcggctggcgctttcggctcggccaagctgctccttcgcagcggcatcggtcctgaggac cagctcgagattgtggcgagctccaaggacggcgagaccttcatttccaagaatgattggatcaagctccccgtcggccataacct gatcgatcatctcaacaccgacctcattattactcacccggatgtcgttttctatgacttctacgcggcttgggacaatcccatca ccgaggacaaggaggcctacctgaactcgcggtccggcattctcgcccaagcggcgcccaacatcggccctctgatgtgggaggaa gtcacgccatccgacggcatcacccgccagttccagtggacatgccgtgttgagggcgacagctccaagaccaactcgacccacgc catgaccctcagccagtatctcggccgtggcgtcgtctcgcgcggccggatgggcatcacttccgggctgaccacgacggtggccg agcacccgtacctgcacaacgacggcgacctggaggcggtgatccagggtatccagaacgtggtggacgcgctcagccaggtgccc gacctcgagtgggtgctcccgccgcccaacacgacggtggaggaatacgtcaacagcctgatcgtgtctccggctaaccgccgggc caaccactggatgggcacggccaagatgggcctcgatgacggccgctcgggcggctccgcggtcgtcgacctcaacacaaaggtgt atggcaccgacaacctgtttgtcgtcgacgcctccatcttccctggcatgtcgacgggcaacccgtcggctatgatcgtcatcgtg gccgagcaggcggcccagcgcatcctgtccctgcggtattag
> S.bisbyi (SEQ ID NO: 10) atgctgttcaagctctcaaattggttgctagcgcttgcgctctttgttggcaatgtcgttgctcaactcgaggggcctaccccgta cacggatccagataccggcattgtctttcagtcctgggtcaatccagcagggaccctgaagtttggttacacttaccccgcaaatg ctgctacggttgccgccacggaatttatcggtttcctggaatgccaaggggctggatggtgtagcgtctcactcggtggctccatg cttaacaagccgcttgttgttgcctaccctagtggcgatgaagtcctcgcttctttgaagtgggccacaggctacgcgaatccaga gccttacggcggcaatcacaagctgtcccagatcagctcgtccgtcacctctgctggcttcagggtcgtctatcgatgtgagggat gtctcgcctggaactaccagggaattgagggagggagccccaccaatggtgcgtccatgcctatcggttgggcttacagcgcaagt tctgtactcaacggggattgtgtggataacactgttctcattcaacatgacacctttggcaattatggcttcgtacctgatgaatc atctcttcgcacggagtacaatgactggacggagcttccgaccagggttgtcaggggagactgcggcggttccacaactacctctt cggtgccctcctcaacggcgcctcctcaaggtactggcataccggttcctactggcgcaagctatgactacatagttgttggctcg ggtgctggaggtattcccattgcggataagcttaccgaggctggcaaaaaggttttgttgattgagaagggaccaccctcttctgg tcgctacgatggaaagctaaagccgacgtggcttgagggaactaatctcacccgattcgatgtgcctggcctctgcaaccaaatat gggtcgactccgctggcattgcatgccgtgataccgatcagatggctggttgtgttcttggcggtggtactgctgtcaatgcaggt ctatggtggaagcctaaccctattgattgggactataatttcccttcaggctggaagtcaagcgagatgataggcgcgacaaaccg tgtcttttcacgtattggtggtactactgttccttcgcaggacggaaagacctactatcagcaaggtttcaacgttctttccagcg gtctcaaggctgcgggctggacatctgttagcctgaataacgcccctgcgcaaaggaaccgcacctatggtgctggccctttcatg ttctctggtggagagcgaggtggacctttggccacctacctggccactgccaagaagagaggaaacttcgacctctggacgaatac ccaagttaagcgtgtaattcgacagggaggtcatgttactggagtggaggtcgaaaactataacggtgatgggtacaagggcactg tcaaggtgactcctgtatctgggcgagttgtcctatctgctggtacctttggcagtgctaagcttttgctccgaagcggtatcggt cccaaggatcaactagctattgtcaagaactcgactgatggccctactatggcttccgagagggactggattaatcttcccgttgg ctacaacttggaggaccatactaacaccgacattgtcatctcccatccagatgtggtccattacgacttctatgaggcttggacag cgtcaatcgagtctgacaagactgcttatttgggcaagcgttctggcatcctcgctcaagccgcccccaacatcgggcctctcttc tttgacgaagttcgcggtgctgacaacattgtccgctcaattcagtacactgctcgtgtggagggcaacagtgtggtccctaatgg caaggccatggtgatcagccagtaccttggtcgtggcgctgtttccaggggtcgaatgaccatctctcaaggtctcaatacgattg tttccaccgctccatacctctcaaacgtcaatgatctcgaggccgtcattaagagccttgagaacatagcgaacagcttgacgtca aaggttaaaaacctcaagattgaatggcctgcctctggtacatccattcgcgatcacgtcacgaatatgcctctcgacccggccac ccgccgagcgaatcattggattggcactaacaagatcggaaccaagaatggtcgactgacaggtggtgattccgtcgttgatttga acactaaggtctatggtacagacaatctgtttgtggtcgatgcttctattttccctggcatggttacgaccaacccctcggcctac attgtaattgccgctgagcatgctgcatcgaagattctgagcctacctactgctaaggctgccgcgaagtacgaacaatgtggtgg ccttgaatataatggtaactttcagtgtgcgtctggattaacctgcacttggttaaacgactactactggcagtgtacttaa > N.crassa (SEQ ID NO: 12) atgaggaccacctcggcctttctcagcggcctggcggcggtggcttcattgctgtcgcccgccttcgcccaaaccgctcccaagac cttcactcatcctgataccggcattgtcttcaacacatggagtgcttccgattcccagaccaaaggtggcttcactgttggtatgg ctctgccgtcaaatgctcttactaccgacgcgactgaattcatcggttatctggaatgctcctccgccaagaatggtgccaatagc ggttggtgcggtgtttctctcagaggcgccatgaccaacaatctactcattaccgcctggccttctgacggagaagtctacaccaa
Claims (15)
1. El procedimiento de obtención de una celobiosa deshidrogenasa (CDH) que tiene actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior, en el que dicha actividad se define como que comprende la transferencia de electrones intramolecular (IET) o la transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), en el que IET o DET se determinan mediante un ensayo de cyt c o en un electrodo DET, respectivamente, y tienen una actividad específica para la oxidación de la glucosa determinada mediante un ensayo de citocromo c a pH 7,4 superior a 0,5 U/mg, comprendiendo el procedimiento la etapa de aislamiento de la CDH de Chaetomium atrobrunneum, Corynascus thermophilus, Hypoxylon hematostroma, Neurospora crassa o Stachybotris bisbyi, o la modificación de la CDH de Myriococcum thermophilum, comprende una flavina y un dominio hemo, en el que la transferencia de electrones de la flavina al dominio hemo se ha incrementado en comparación con el de CDH tipo silvestre de Myriococcum thermophilum por una mutación del dominio hemo en uno cualquiera de los aminoácidos 172-203, preferiblemente de uno cualquiera de los aminoácidos 176, 179-182, 195, 196, 198, 201 correspondiente a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1 y/o del dominio de flavina en uno cualquiera de los aminoácidos 565-577 correspondientes a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1.
2. Celobiosa deshidrogenasa que tiene actividad de oxidación de glucosa a un pH de 7,4 o superior, en la que dicha actividad se define como que comprende la transferencia de electrones intramolecular (IET) o la transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), en la que IET o DET se determinan por un ensayo cyt c o en un electrodo DET, respectivamente, y que tienen una actividad específica para la oxidación de la glucosa determinada por un ensayo de citocromo c a pH 7,4 superior a 0,5 U/mg,
i) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o
ii) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 90 %, idéntica a la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11; o
iii) que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 90 %, idéntica a los aminoácidos 22 a 828 de la SEQ ID NO: 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos tiene al menos una sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos adicional a la secuencia de SEQ ID NO: 1, aumentando la transferencia de electrones desde la flavina al dominio hemo en comparación con las CDH de tipo silvestre de M. thermophilum de SEQ ID NO: 1, en la que la transferencia de electrones aumenta al aumentar u optimizar las interacciones electrostáticas entre la flavina y el dominio hemo, y la mutación es una mutación del dominio hemo de uno cualquiera de los aminoácidos 172-203, preferiblemente de uno cualquiera de los aminoácidos 176, 179-182, 195, 196, 198, 201 correspondientes a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1 y/o del dominio de flavina de uno cualquiera de los aminoácidos 565-577 correspondientes a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1.
3. CDH según la reivindicación 2, ítem iii), caracterizada porque la mutación es una mutación del dominio de flavina en uno cualquiera de los aminoácidos 568, 571, 574, 575, correspondiente a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1, o cualquier combinación de los mismos; y/o en la que la mutación es un aumento de la carga positiva en los aminoácidos 172-203 que corresponde a la CDH de M. thermophilum de la SEQ ID NO: 1, preferiblemente del aminoácido 181, en particular, se prefiere una mutación D181K o D181R, y/o una disminución de una carga negativa de los aminoácidos 565-577 correspondiente a la M. thermophilum CDH de la SEQ ID NO: 1, preferiblemente del aminoácido (s) 568 y/o 571 y/o 574, en particular se prefiere una mutación D568S y/o E571S y/o D574S, o cualquier combinación de los mismos.
4. CDH según la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque la actividad de oxidación de la glucosa es una actividad de la glucosa deshidrogenasa o una oxidación electrocatalítica de la glucosa.
5. CDH según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que se aísla mediante diafiltración, cromatografía de intercambio iónico recolectando fracciones con actividad de CDH, preferiblemente purificada adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba.
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica una celobiosa deshidrogenasa que tiene actividad de oxidación de la glucosa a un pH de 7,4 o superior, en la que dicha actividad se define como que comprende transferencia de electrones intramolecular (IET) o transferencia de electrones directa a un electrodo (DET), y que tiene una actividad específica para la oxidación de la glucosa determinada por un ensayo de citocromo c a pH 7,4 o superior a 0,5 U/mg, y que comprende
• una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs 4, 6, 8, 10 o 12, o
• el marco de lectura abierto de SEQ ID NOs 4, 6, 8, 10 o 12 o
• una secuencia de nucleótidos con al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, en particular, preferido al menos el 99 %, identidad con la SEQ ID NO: 4 , 6, 8, 10 o 12 o el marco de lectura abierto de las Se Q ID NO: 4, 6, 8, 10 o 12,
• una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 o 12 en condiciones rigurosas, o
• una secuencia de nucleótidos que codifica una celobiosa deshidrogenasa según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
7. Un electrodo que comprende una CDH inmovilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
8. El electrodo de la reivindicación 7 que tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 14 %, en particular, se prefiere al menos 18 %, o al menos 20 %, al menos 21 %, o incluso al menos 22 %, al menos 23 %. al menos el 24 %, al menos el 25 %, al menos el 26 %, al menos el 27 %, al menos el 28 %, al menos el 29 %, o al menos el 30 %, de actividad oxidante de glucosa, lactosa o celobiosa a un pH de 7,4 en comparación a su actividad máxima a un pH más bajo según lo determinado por el ensayo cyt c, preferiblemente también en comparación con su actividad máxima a un pH más bajo según lo determinado por el ensayo DCIP; preferiblemente, en el que el ensayo de cyt c se realiza por oxidación de celobiosa o glucosa.
9. Electrodo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la actividad de oxidación de glucosa a pH 7,4 es al menos 0,5 U/mg de celobiosa deshidrogenasa y/o en el que el valor de Km de la CDH para una reacción de oxidación de glucosa a pH 7,4 es inferior a 1M.
10. Electrodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la CDH está inmovilizada por adsorción, formación de complejos, preferiblemente a través de un enlace enlazador complejante adicional, covalente o iónico, y/o en el que la celobiosa deshidrogenasa inmovilizada está reticulada, en particular por agentes bifuncionales, para aumentar la estabilidad o la actividad.
11. Una celda electroquímica que comprende un electrodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 como un elemento anódico y un elemento catódico, que comprende preferiblemente una solución que contiene glucosa como fluido anódico y/o que comprende preferiblemente una solución de al menos pH 6,0, más preferido al menos pH 6,5, en particular más preferido al menos pH 7,0, aun más preferido al menos pH 7,2, como fluido anódico.
12. Procedimiento de detección o cuantificación de glucosa en una muestra usando cualquiera de las CDH según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o electrodos según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o el procedimiento según la reivindicación 1 que comprende
• proporcionar la CDH
• poner en contacto una muestra de fluido con un pH de al menos 6,5, preferiblemente al menos 7,0, en particular, preferible al menos 7,3, especialmente preferido al menos 7,4, con la CDH, y
• detectar una oxidación de la glucosa de la muestra por la CDH.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la oxidación se detecta electroquímicamente, preferiblemente con una CDH inmovilizada en un electrodo, en particular es preferido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
14. El procedimiento de la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque la CDH tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 14 %, en particular, preferido al menos 18 %, o al menos 20 %, al menos 21 %, o incluso al menos 22 %, al menos 23 %, al menos 24 %, al menos 25 %, al menos 26 %, al menos 27 %, al menos 28 %, al menos 29 % o al menos 30 %, de actividad oxidante de glucosa, lactosa o celobiosa a un pH de 7,4 en comparación con la actividad máxima a un pH por debajo de 7,4 según lo determinado por un ensayo de cyt c.
15. El procedimiento de la reivindicación 12 a 14, caracterizado porque la CDH es según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5; preferiblemente en el que la celobiosa deshidrogenasa que tiene actividad de oxidación de glucosa a un pH de 7,4 o superior comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 75 %, preferiblemente al menos 90 %, idéntica a la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.
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