ES2744903T3

ES2744903T3 - Métodos y composiciones para proteínas del factor IX modificadas

Info

Publication number: ES2744903T3
Application number: ES13857297T
Authority: ES
Inventors: Darrel W Stafford; Dengmin Feng
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2020-02-26
Anticipated expiration: 2033-11-20
Also published as: US20200362328A1; CA2892038C; EP2922871A4; EP2922871A1; EP2922871B1; JP2015536148A; US20190249164A1; AU2013348029A1; WO2014081831A1; BR112015011462A2; US20150307863A1; US20200095565A1; CA2892038A1; US20220073894A1

Abstract

Una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, en donde Xaa es leucina.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para proteínas del factor IX modificadas

Declaración de apoyo gubernamental

Esta invención se realizó con apoyo gubernamental con la Subvención Núm. HL006350 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

Declaración sobre la presentación electrónica de un listado de secuencia

Se proporciona un listado de secuencia en formato de texto ASCII, enviado bajo el C.F.R. 37 § 1.821, titulado 5470-643WO_ST25.txt, de 26,453 bytes de tamaño, generado el 18 de noviembre de 2013 y presentado a través de EFS-Web, en lugar de una copia en papel.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La invención se refiere a proteínas del Factor IX que contienen modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína del Factor IX, así como también constructos de ácido nucleico que codifican las proteínas del Factor IX.

Antecedentes de la invención

El Factor IX está disponible comercialmente tanto como un producto derivado del plasma (Mononine®) o como una proteína recombinante (Benefix®). El Mononine® tiene la desventaja de que existe un potencial de transmitir enfermedades mediante la contaminación con bacterias y virus (tales como el VIH, la hepatitis) que se transmiten a través del procedimiento de purificación. El uso de un proteína recombinante (por ejemplo, Benefix®) evita estos problemas. Sin embargo, las propiedades farmacocinéticas del Factor IX recombinante (rFactor IX, por ejemplo, Benefix®) no se comparan bien con las propiedades del Factor IX derivado del plasma humano (pdFactor IX, por ejemplo, Mononine®) después de la infusión por bolo intravenoso (i.v.) en sistemas de modelos de animales de laboratorio y en humanos. Debido a las propiedades farmacocinéticas menos favorables del rFactor IX, se requiere generalmente dosis un 20-30 % más altas del rFactor IX para lograr el mismo nivel de actividad procoagulante que el pdFactor IX (White y otros, (Abril de 1998) Seminars in Hematology vol. 35, núm. 2 Supl. 2: 33-38; Roth y otros, (15 de diciembre de 2001) Blood vol. 98 (13): 3600-3606).

El documento WO 2008/127655 se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos del factor de coagulación sanguínea y/o para reducir el daño articular asociado con el sangrado mediante tratamientos suministrados a la articulación en un sujeto. La presente invención proporciona proteínas del Factor IX (FIX) que tienen sitios de glicosilación adicionales y modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Las proteínas del Factor IX de esta invención tienen una actividad específica más alta y una función de coagulación útil más larga con relación a la proteína del Factor IX de tipo silvestre o no modificada.

Resumen de la invención

La presente invención se define adicionalmente como se expone en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:3): Tyr Asn Ser Gly Arg Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu

Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn

Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp

Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie

Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val

Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro

Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg

Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu

Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie

Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly

Glu His Asn lie Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg

lie lie Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie

Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

Cys lie Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln

Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Xaa Ser Thr Lys Phe

Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe

Leu Thr Gly lie lie Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly

lie Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu

Thr (SEQ ID NO::3),

en donde Xaa es leucina.

En una modalidad adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína del FIX aislada que comprende el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO:3, en donde Xaa es leucina. La molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos (secuencia optimizada en codón FIX 24-K5R con secuencia de propéptido y una sustitución R338L) (SEQ ID NO:5):

ATG CAG CGG GTGAAT ATGATC ATG GCT GAG AGT CCA GGA CTT ATC ACC ATA TGC TTG CTG GGG TATCTC CTC TCC GCT GAG TGC ACC GTA TTC CTC GAT CAC GAG AAC GCC AAC AAA ATCCTT AACAGA CGT AGG CGA TAC AAC AGT GGC CGA CTG GAG GAG TTT GTC CAA GGTAAC CTGGAA CGG GAA TGT ATG GAG GAG AAG TGT AGT TTC GAG GAG GCT CGG GAGGTGTTT GAG AAC ACA GAA AGA ACA ACC GAA TTT TGGAAG CAA TAT GTC GAT GGTGAC CAATGT GAG TCTAAC CCT TGT CTT AAT GGA GGC TCA TGC AAA GAC GAC ATTAAC AGTTAT GAA TGT TGG TGT CCC TTT GGC TTC GAG GGA AAG AAT TGT GAG CTGGAC GTGACC TGC AAT ATT AAG AAC GGA AGG TGC GAG CAG TTT TGC AAA AAC AGTGCT GAT AAC AAG GTG GTA TGT TCT TGCACC GAA GGT TAC CGT CTT GCT GAA AATCAG AAGAGC TGT GAA CCA GCC GTT CCC TTT CCC TGT GGA CGT GTA AGC GTT TCTCAG ACATCA AAA CTG ACC CGG GCT GAG ACT GTG TTC CCT GAC GTC GAT TAC GTTAAC TCT ACC GAA GCC GAA GGA AGC CCC GGC AGC GGG TCA GCT AAC GCA ACC GGCCCT AGCGGT GAA GGC TCC GCT CCT TCC GAA GGA AAC GCA ACC GGA CCA GGT ACCTCC GGAGGA AGC CCA GCC AAC TCC ACA GGG GGG TCC CCT GCC GAG GGG AGC CCTGGC AGTGAG ATC CTG GAT AAC ATC ACA CAG AGC ACA CAG AGC TTT AAT GAC TTCACC CGT GTG GTG GGA GGC GAG GAT GCA AAG CCC GGA CAG TTT CCA TGG CAG GTGGTC CTGAAC GGC AAG GTG GAT GCC TTT TGC GGA GGA TCT ATC GTG AAT GAA AAGTGGATTGTG ACT GCT GCC CAC TGT GTG GAG ACT GGT GTG AAA ATC ACT GTG GTAGCA GGAGAA CAC AAT ATT GAG GAG ACC GAG CAT ACC GAG CAG AAG CGC AAT GTGATC CGC ATC ATA CCT CAC CAT AAC TAC AAT GCA ACA ATT AAT AAG TAC AAC CATGAC ATCGCC CTG TTG GAG CTG GAT GAG CCC CTG GTG CTC AAT TCT TAT GTG ACACCAATCTGC ATA GCT GAC AAG GAA TAC ACT AAC ATT TTC CTG AAG TTT GGC AGTGGATACGTG TCA GGA TGG GGC AGA GTG TTC CAC AAG GGA CGC TCT GCT CTC GTGCTT CAGTAC CTG CGA GTG CCT TTG GTG GAT CGG GCA ACA TGT TTG NNN AGC ACAAAATTT ACT ATT TACAAC AAT ATG TTT TGC GCC GGC TTC CAC GAA GGA GGG CGAGAT TCATGC CAG GGA GAC AGT GGC GGT CCA CAC GTG ACT GAA GTC GAA GGC ACCTCT TTT TTG ACC GGA ATC ATC TCT TGG GGT GAA GAG TGT GCC ATG AAA GGA AAGTAT GGC ATA TAC ACA AAG GTG TCC CGC TAT GTG AAC TGG ATC AAG GAG AAG ACCAAACTC ACC TAG,

en donde NNN es cualquier codón de tres nucleótidos que codifica leucina.

La presente invención proporciona, además, una proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico, el vector y/o la célula de esta invención para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico.

En la presente descripción se describe como referencia una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende una sustitución K5R (sustitución de Lys por Arg en la posición 5) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1: Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg lie lie Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

275 280 285

Cys lie Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser

370 375 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415 ,

La presente invención proporciona una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende al menos tres sitios de glicosilación adicionales con relación al FIX humano de tipo silvestre, una sustitución K5R y una sustitución R338X de la secuencia de aminoácidos del FIX de SEQ ID NO:1, en donde X es leucina.

SEQ ID NO:1:

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg lie lie Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

275 280 285

Cys lie Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser

370 375 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415 ,

En la presente descripción se describe una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2): YNSGRLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ CESNPCLNGG SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK NSADNKWCS CTEGYRLAEN QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF PDVDYVNSTE AEGSPGSGSA NATGPSGEGS APSEGNATGP GTSGGSPANS TGGSPAEGSP GSEILDNITQ STQSFNDFTR WGGEDAKPG QFPWQWLNG KVDAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT WAGEHNIEE TEHTEQKRNV IRIIPHHNYN ATINKYNHDI ALLELDEPLV LNSYVTPICI ADKEYTNIFL KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VDRATCLXST KFTIYNNMFC AGFHEGGRDS CQGDSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK VSRYVNWIKE KTKLT,

en donde X es cualquier aminoácido excepto R (arginina).

En la presente descripción se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos (secuencia optimizada en codón FIX24-K5R con secuencia de propéptido) (s Eq ID NO:4):

ATG CAG CGG GTGAAT ATG ATC ATGGCT GAGAGT CCAGGA CTT ATC ACCATATGC

TTG CTG GGG TATCTC CTC TCC GCTGAG TGCACC GTATTCCTC GAT CACGAGAAC GCC AAC AAAATCCTT AAC AGA CGTAGG CGATAC AACAGTGGC CGA CTGGAGGAG TTT GTC CAA GGTAAC CTG GAA CGGGAA TGTATG GAGGAGAAG TGT AGTTTCGAG GAG GCT CGG GAGGTG TTT GAG AACACA GAAAGA ACAACCGAA TTT TGGAAGCAA TAT GTC GAT GGTGAC CAA TGT GAGTCT AACCCT TGTCTTAAT GGA GGCTCATGC AAA GAC GAC ATTAAC AGT TAT GAATGT TGGTGT CCCTTTGGC TTC GAGGGAAAG AAT TGT GAG CTGGAC GTG ACC TGCAAT ATTAAG AACGGAAGG TGC GAGCAG TTT TGC AAA AACAGTGCT GAT AAC AAGGTG GTATGT TCTTGCACC GAA GGTTAC CGT CTT GCT GAA AATCAG AAG AGC TGTGAA CCAGCC GTTCCC TTT CCC TGTGGACGT GTAAGC GTT TCTCAG ACA TCA AAACTG ACCCGG GCTGAGACT GTG TTCCCT GAC GTC GAT TAC GTTAAC TCT ACC GAAGCC GAAGGA AGCCCCGGC AGC GGGTCAGCT AAC GCA ACC GGCCCT AGC GGT GAAGGC TCCGCT CCTTCCGAA GGA AACGCAACC GGA CCA GGT ACCTCC GGA GGA AGCCCA GCCAAC TCCACAGGG GGG TCCCCT GCC

GAG GGG AGC CCTGGC AGT GAG ATCCTG GATAAC ATCACACAG AGC ACACAGAGC TTT AAT GAC TTCACC CGT GTG GTGGGA GGCGAG GATGCAAAG CCC GGACAG TTT CCA TGG CAG GTGGTC CTG AAC GGCAAG GTGGAT GCCTTT TGC GGA GGATCTATC GTG AAT GAAAAGTGG ATT GTG ACTGCT GCCCAC TGTGTGGAG ACT GGTGTGAAA ATC ACT GTGGTAGCA GGA GAA CACAAT ATTGAG GAGACCGAG CAT ACCGAGCAG AAG CGC AAT GTGATC CGC ATC ATACCT CACCAT AACTACAAT GCA ACAATTAAT AAG TAC AAC CATGAC ATC GCC CTGTTG GAGCTG GATGAGCCC CTG GTGCTCAAT TCT TAT GTGACACCA ATC TGC ATAGCT GACAAG GAATACACT AAC ATTTTCCTG AAG TTT GGC AGTGGA TAC GTG TCAGGA TGGGGC AGAGTGTTC CAC AAGGGACGC TCT GCT CTC GTGCTT CAG TAC CTGCGA GTGCCT TTGGTGGAT CGG GCAACA TGT TTGAGG AGCACAAAA TTT ACT ATTTAC AACAAT ATGTTT TGC GCC GGCTTCCAC GAA GGA GGGCGAGAT TCA TGC CAGGGA GACAGT GGCGGTCCA CAC GTGACTGAA GTC GAA GGC ACCTCT TTT TTG ACCGGA ATCATC TCTTGG GGT GAA GAGTGT GCC ATGAAA GGAAAGTAT GGC ATA TACACA AAGGTG TCCCGC TAT GTG AACTGGATC AAG GAG AAGACCAAA CTC ACC TAG

Adicionalmente, se proporciona un método para aumentar la biodisponibilidad de una proteína del Factor IX en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico y/o la célula como se describe en la presente descripción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la capacidad del FIX de tipo silvestre (FIXWT) y sus variantes K5A (FIXK5A) y K5R (FIXK5R) para proteger a ratones con hemofilia B de la hemorragia 7 días después de la inyección. Ratones C57BL/6 con ablación del gen del Factor IX se sometieron a una incisión en la vena safena 7 días después de la inyección del FIX o una de sus variantes. El número de veces que el sangrado se detuvo espontáneamente se determinó hasta un límite de 30 minutos, como se describe en la presente descripción. La mediana de NOD (número de rupturas) para FIXK5R fue 19 y para FIXK5Afue 8 (P < 0,05, prueba t no pareada). FIXWT se encuentra en el medio con 14 rupturas. Cada punto representa un solo ratón.

La Figura 2 muestra el tamaño de las variantes del FIX con diferentes modificaciones de la glicosilación. Carril 1. FIX wt; Carril 2. FIX 15, que tiene tres sitios de glicosilación adicionales en el péptido de activación; Carril 3. FIX 19. Además de los mismos tres sitios de glicosilación adicionales en el péptido de activación como FIX15, FIX 19 tiene un sitio de glicosilación más en la región catalítica; Carril 4. FIX 23, que también tiene tres sitios de glicosilación adicionales en el péptido de activación. En comparación con FIX15, se introdujeron más aminoácidos entre cada sitio; Carril 6. FIX 24, además de los tres sitios adicionales en FIX 23, FIX 24 tiene un sitio de glicosilación más en la región catalítica.

Figura 3. Los ratones con hemofilia B recibieron una inyección por bolo (0,9 mg/kg) de: FIXK5R, que se une más fuertemente que el de tipo silvestre al colágeno IV; FIXWT; y FIXK5A, que se une más débilmente que el de tipo silvestre al colágeno IV. Siete días después de la inyección, la capacidad de estas moléculas para promover la hemostasia en una prueba de sangrado por la vena safena se comparó con ratones de tipo silvestre y con hemofilia B. Los valores de P son de un modelo unilateral de Mann-Whitney. El valor de P para FIX^k5rfrente a FIX^k5afue 0,003.

Otros aspectos, características y ventajas de esta invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada de las modalidades que siguen a continuación.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología que se usa en la descripción de la invención en la presente es con el propósito de describir modalidades particulares y no se pretende que sean limitativas de la invención.

Definiciones

Como se usa en la presente, "una", "un" o "el/la" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una sola célula o una multiplicidad de células.

Además, como se usa en la presente, "y/o" se refiere y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como también la ausencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").

El término “aproximadamente”, como se usa en la presente, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad (por ejemplo, una cantidad de metilación) y similares, significa que incluye variaciones del ±20 %, ±10 %, ±5 %, ±1 %, ±0,5 %, o incluso ±0,1 % de la cantidad especificada.

Como se usa en la presente, la frase de transición "que consiste esencialmente en" significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse como que abarca los materiales o etapas enumerados en la reivindicación, "y aquellos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)" de la invención reivindicada. Ver, En re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); ver, además MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente en", cuando se usa en una reivindicación de esta invención, no pretende interpretarse como equivalente a "que comprende".

El término "propiedades farmacocinéticas" tiene su significado usual y acostumbrado y se refiere a la absorción, distribución, metabolismo y excreción de la proteína del Factor IX.

El significado usual y acostumbrado de "biodisponibilidad" es la fracción o cantidad de una dosis administrada de un fármaco biológicamente activo que alcanza la circulación sistémica. En la presente descripción se describe el término "biodisponibilidad" que incluye el significado usual y acostumbrado pero, además, se considera que tiene un significado más amplio para incluir el grado al cual la proteína del Factor IX es bioactiva. En el caso del Factor IX, por ejemplo, una medida de "biodisponibilidad" es la actividad procoagulante de la proteína del Factor IX obtenida en la circulación después de la infusión.

"Modificación postraduccional" tiene su significado usual y acostumbrado e incluye, pero no se limita a, la eliminación de la secuencia líder, Y-carboxilación de residuos de ácido glutámico, p-hidroxilación de residuos de ácido aspártico, glicosilación ligada a N de residuos de asparagina, glicosilación ligada a O de residuos de serina y/otreonina, sulfatación de residuos de tirosina, fosforilación de residuos de serina y cualquiera de sus combinaciones.

Como se usa en la presente, la "actividad biológica" se determina con referencia a un estándar derivado del plasma humano. Para el Factor IX, el estándar es MONONINE® (ZLB Behring). Se considera que la actividad biológica del estándar es del 100 %.

El término "proteína del Factor IX" o "proteína del FIX", como se usa en la presente, incluye la proteína del Factor IX de tipo silvestre, así como también proteínas de origen natural o artificiales (por ejemplo, el dimorfismo T/A en el péptido de activación del FIX humano en la posición 148 (numeración basada en la secuencia de aminoácidos del FIX humano maduro de SEQ ID NO:1, que muestra una T en la posición 148) como se describe en Graham y otros, ("The Malmo polymorphism of coagulation factor IX, an immunologic polymorphism due to dimorphism of residue 148 that is in linkage disequilibrium with two other FIX polymorphisms" Am. J. Hum. Genet. 42:573-580 (1988)). En la presente descripción se describe una proteína del FIX que incluye una proteína del FIX que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, en donde el aminoácido en la posición 148 puede ser una T o una A y un sujeto puede ser o bien heterocigoto u homocigoto ya sea para T o A en este sitio. Una proteína del FIX descrita en la presente descripción puede incluir además formas mutadas del FIX como se conocen en la literatura (ver, por ejemplo, Chang y otros, "Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity" J. Biol. Chem. 273:12089-94 (1998); Cheung y otros, "Identification of the endothelial cell binding site for factor IX" PNAS EE.UU. 93:11068-73 (1996); Horst, Molecular Pathology, página 361 (458 páginas) CRC Press, 1991). Una proteína del FIX, como se describe en la presente descripción, incluye además cualquier otra proteína del FIX humano de origen natural o proteína del FIX humano artificial conocida ahora o identificada posteriormente, y derivados y fragmentos activos/dominios activos de esta, como se conoce en la técnica. Una proteína del Factor IX de esta invención incluye, además, la forma activa farmacológicamente del FIX, que es la molécula a partir de la cual el péptido de activación se ha escindido de la proteína por la acción de proteasas (o se elimina de la proteína por ingeniería genética al eliminarla en el nivel de ácido nucleico), lo que resulta en dos cadenas de polipéptidos no contiguos para el FIX (cadena ligera y cadena pesada) plegadas como el factor de coagulación FIX funcional. Específicamente, las proteínas del Factor IX que tienen una modificación para aumentar el grado de glicosilación se incluyen específicamente en el término amplio.

El término "vida media" es un término amplio que incluye el significado usual y acostumbrado, así como también el significado usual y acostumbrado que se encuentra en la literatura científica para el Factor IX. Se incluye específicamente en esta definición una medición de un parámetro asociado con el Factor IX, que define el tiempo posterior a la infusión para una disminución a partir de un valor inicial medido en el momento de la infusión hasta la mitad del valor inicial. En algunas modalidades, la vida media del FIX puede medirse en sangre y/o en componentes sanguíneos mediante el uso de un anticuerpo contra el Factor IX en una variedad de inmunoensayos, como se conocen bien en la técnica y como se describen en la presente descripción. Alternativamente, la vida media puede medirse como una disminución en la actividad del Factor IX mediante el uso de ensayos funcionales, lo que incluye ensayos de coagulación estándar, como se conocen bien en la técnica y como se describen en la presente descripción.

El término "recuperación", como se usa en la presente, incluye la cantidad del FIX, según se mide mediante cualquier método aceptable lo que incluye, pero no se limita a, niveles de antígeno del FIX o proteasa del FIX o niveles de actividad de coagulación, detectada en la circulación de un animal o sujeto humano receptor tras la extracción, lo más inmediato posible desde el punto de vista práctico, de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de sangre o producto de la sangre) con el propósito de medir el nivel del FIX después de su infusión, inyección, suministro o administración de cualquier otra manera. Con las metodologías actuales, el tiempo de muestreo biológico más inmediato para medir la recuperación del FIX generalmente se encuentra dentro de los primeros 15 minutos después de la infusión, inyección o suministro/administración de cualquier otra manera del FIX, de lo contrario, pero es razonable esperar tiempos de muestreo más rápidos a medida que las tecnologías científicas y/o clínicas mejoradas. En esencia, el valor de recuperación para el FIX pretende representar aquí la fracción máxima del FIX infundido, inyectado o suministrado/administrado de cualquier otra manera que puede medirse en la circulación del receptor en el punto de tiempo más inmediato posible después de la infusión, inyección u otro suministro a un animal o paciente receptor.

El término "sitio(s) de glicosilación" es un término amplio que tiene su significado usual y acostumbrado. En el contexto de la presente solicitud, el término se aplica tanto a sitios que potencialmente podrían aceptar un resto de carbohidratos, así como también a los sitios dentro de la proteína, específicamente del FIX, en los que se ha unido realmente un resto de carbohidratos e incluye cualquier secuencia de aminoácidos que podría actuar como aceptor de oligosacáridos y/o carbohidratos.

El término "aislado" puede referirse a un ácido nucleico o polipéptido que se encuentra sustancialmente libre de material celular, material viral y/o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante), o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetiza químicamente). Además, un "fragmento aislado" es un fragmento de un ácido nucleico o polipéptido que no es de origen natural como un fragmento y no se encontraría en el estado natural.

Una "célula aislada" se refiere a una célula que se separa de otras células y/o componentes tisulares con los que se asocia normalmente en su estado natural. Por ejemplo, una célula aislada es una célula que forma parte de un cultivo celular. Una célula aislada puede ser, además, una célula que se administra o se introduce en un sujeto, por ejemplo, para impartir un efecto terapéutico o beneficioso de cualquier otra manera.

Composiciones de la invención

En la presente descripción se describe una proteína aislada del Factor IX (FIX) que comprende una sustitución K5R en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1:

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg lie lie Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

275 280 285

Cys lie Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr ValSer Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val LeuGln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser

370 375 380

Trp Gly GluGlu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser ArgTyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415.

En algunos casos, la Lys en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 puede sustituirse con treonina, leucina o isoleucina, como ejemplos no limitantes. Se describe en la presente descripción cualquier sustitución de la Lys en la posición 5 que resulta en una molécula del Factor XI que aumenta la afinidad entre el Factor IX y el colágeno de tipo IV.

En otros casos de la proteína del FIX descritos en la presente descripción, la valina (Val) en la posición 10 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 puede sustituirse con los siguientes ejemplos no limitantes: leucina, isoleucina, metionina o fenilalanina, histidina o treonina.

La proteína del FIX descrita en la presente descripción puede ser una proteína del FIX con una sustitución en la posición 5 como se describe en la presente descripción y/o una sustitución en la posición 10 como se describe en la presente descripción y/o una sustitución de la fenilalanina (Phe) en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con cualquier otro aminoácido.

La proteína del FIX descrita en la presente descripción puede ser una proteína del FIX con una sustitución en la posición 5 como se describe en la presente descripción y/o una sustitución en la posición 10 como se describe en la presente descripción y/o una sustitución de la fenilalanina (Phe) en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con cualquier otro aminoácido y/o una sustitución de la glutamina (Gln) en la posición 11 con los siguientes ejemplos no limitantes: asparagina, lisina o arginina.

Las sustituciones, como se describen en la presente descripción en las posiciones 5, 9, 10 y 11 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, pueden presentarse individualmente o en cualquier combinación.

La proteína del Factor IX con las sustituciones como se describe en la presente descripción en las posiciones 5, 9, 10 y 11, individualmente o en combinación, puede comprender, además, uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etcétera) sitios de glicosilación adicionales con relación al FIX humano de tipo silvestre.

SEQ ID NO:1:

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg lie lie Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

275 280 285

Cys lie Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser

370 375 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415 ,

En la presente descripción se describe una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende al menos tres sitios de glicosilación adicionales con relación al FIX humano de tipo silvestre, una sustitución K51R y/o una sustitución R384X de la secuencia de aminoácidos del FIX de SEQ ID NO:6, en donde X es un aminoácido distinto de la arginina.

M Q R V N M IM A E SPG LITICLL G Y LLSAE C TV F LD H E N A N K I LNRRRRYNSG

KLEEFVQGNLERECM EEKCSFEEAREVFENTERTTEFW KQ YVDGDQCESNPCLN GGSCKDDIN S YEC W CPF GFEGKN CEFD V T C N IK N GRCEQF CKN S A D N K V V C S CT EG YRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGSPGS GSANATGPSGEGSAPSEGNATGPGTSGGSPANSTGGSPAEGSPGSEILDNITQSTQ SFNDFTRV Y GGED AKPGQFP W Q W L N G K YD AFC G G SIYN EKW IYT A A H C YET G Y K ITV V A G E H N IE E T E H T E Q K R N V IR IIP H H N Y N A T IN K Y N H D IA LLE LD E P LV LN S Y VTPIC IAD KEYTN IFLKFG SG YVSG W G RVFHKG R SALVLQ YLR VPLVDR ATC LRST KFTIYNNM FCAGFHEGG RDSCQG DSGGPHVTEVEGTSFLTGIISW GEECAM KGKY G IY T K V S R Y V N W IK E K T K LT (SEQ ID NO:6).

En la presente descripción se describe una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:7) de:

M Q R V N M IM A E SPG LITICLL G YLLSAEC TV FLD H E N A N K I LNRRRRYNSG RLEEFVQGNLERECM EEKCSFEEAREVFENTERTTEFW KQYVDGDQCESNPCLN GGSCKDDIN S YEC W CPF GFEGKN CELD V T C N IK N GRCEQF CKN S A D N K V V C S CT EG YRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGSPGS GSANATGPSGEGSAPSEGNATGPGTSGGSPANSTGGSPAEGSPGSEILDNITQSTQ SFNDFTRV V GGED AKPGQFP W Q V V L N G K VD AFCGGSI V N E K W IV T A A H C VET G V K ITV V A G E H N IE E T E H T E Q K R N V IR IIP H H N Y N A T IN K Y N H D IA LLE LD E P LV LN S Y VTPIC IAD KEYTN IFLKFG SG YVSG W G R VFH KG R SALVLQ YLR VPLVD R ATC LXS TK FT IY N N M F C AGFHEGGRD S CQGD S GGPH V TE VEG T SFLT G il S WGEEC A M K G K

Y G IY T K V S R Y V N W IK E K TK LT (SEQ ID NO:7),

en donde X es cualquier aminoácido excepto R (arginina).

Además, en la presente descripción se describe una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2):

YNSGRLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ CESNPCLNGG SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK NSADNKWCS CTEGYRLAEN QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF PDVDYVNSTE AEGSPGSGSA NATGPSGEGS APSEGNATGP GTSGGSPANS TGGSPAEGSP GSEILDNITQ STQSFNDFTR WGGEDAKPG QFPWQWLNG KVDAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT WAGEHNIEE TEHTEQKRNV IRIIPHHNYN ATINKYNHDI ALLELDEPLV LNSYVTPICI ADKEYTNIFL KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VDRATCLXST KFTIYNNMFC AGFHEGGRDS CQGDSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK VSRYVNWIKE KTKLT,

en donde X es cualquier aminoácido excepto R (arginina).

Además, en la presente descripción se proporciona una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:3):

Tyr Asn SerGly Arg Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

Met Glu GluLys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu

Arg Thr ThrGlu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn

Pro Cys LeuAsn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp

Cys Pro PheGly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie

Lys Asn GlyArg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val

Cys Ser CysThr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro

Ala Val ProPhe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

Arg Ala GluThr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

Thr lie LeuAsp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg

Val Val GlyGly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu

Asn Gly LysVal Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie

Val Thr AlaAla His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly

Glu His Asnlie Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg

lie lie ProHis His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie

Ala Leu LeuGlu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

Cys lie AlaAsp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

Val Ser GlyTrp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln

Tyr Leu ArgVal Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Xaa Ser Thr Lys Phe

Thr lie TyrAsn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser

Cys Gln GlyAsp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe

Leu Thr Glylie lie Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly

lie Tyr ThrLys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu

Thr,

en donde Xaa es leucina. En algunos casos descritos en la presente descripción, Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto arginina, lo que incluye, por ejemplo, cualquiera de los aminoácidos enumerados en la presente descripción en la Tabla 1.

Además, en la presente descripción se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos (secuencia optimizada en codón FIX24-K5R con secuencia de propéptido) (SEC ID NO:4):

ATG CAG CGG GTG AAT ATG ATC ATG GCT GAG AGT CCA GGA CTT ATC ACC ATA TGC TTG CTG GGG TAT CTC CTC TCC GCT GAG TGC ACC GTA TTC CTC GAT CAC GAG AAC GCC AAC AAA ATC CTT AAC AGA CGT AGG CGA TAC AAC AGT GGC CGA CTG GAG GAG TTT GTC CAA GGT AAC CTG GAA CGG GAA TGT ATG GAG GAG AAG TGT AGT TTC GAG GAG GCT CGG GAG GTG TTT GAG AAC ACA GAA AGA ACA ACC GAA TTT TGG AAG CAA TAT GTC GAT GGT GAC CAA TGT GAG TCT AAC CCT TGT CTT AAT GGA GGC TCA TGC AAA GAC GAC ATT AAC AGT TAT GAA TGT TGG TGT CCC TTT GGC TTC GAG GGA AAG AAT TGT GAG CTG GAC GTG ACC TGC AAT ATT AAG AAC GGA AGG TGC GAG CAG TTT TGC AAA AAC AGT GCT GAT AAC AAG GTG GTA TGT TCT TGC ACC GAA GGT TAC CGT CTT GCT GAA AAT CAG AAG AGC TGT GAA CCA GCC GTT CCC TTT CCC TGT GGA CGT GTA AGC GTT TCT CAG ACA TCA AAA CTG ACC CGG GCT GAG ACT GTG TTC CCT GAC GTC GAT TAC GTT AAC TCT ACC GAA GCC GAA GGA AGC CCC GGC AGC GGG TCA GCT AAC GCA ACC GGC CCT AGC GGT GAA GGC TCC GCT CCT TCC GAA GGA AAC GCA ACC GGA CCA GGT ACC TCC GGA GGA AGC CCA GCC AAC TCC ACA GGG GGG TCC CCT GCC GAG GGG AGC CCT GGC AGT GAG ATC CTG GAT AAC ATC ACA CAG AGC ACA CAG AGC TTT AAT GAC TTC ACC CGT GTG GTG GGA GGC GAG GAT GCA AAG CCC GGA CAG TTT CCA TGG CAG GTG GTC CTG AAC GGC AAG GTG GAT GCC TTT TGC GGA GGA TCT ATC GTG AAT GAA AAG TGG ATT GTG ACT GCT GCC CAC TGT GTG GAG ACT GGT GTG AAA ATC ACT GTG GTA GCA GGA GAA CAC AAT ATT GAG GAG ACC GAG CAT ACC GAG CAG AAG CGC AAT GTG ATC CGC ATC ATA CCT CAC CAT AAC TAC AAT GCA ACA ATT AAT AAG TAC AAC CAT GAC ATC GCC CTG TTG GAG CTG GAT GAG CCC CTG GTG CTC AAT TCT TAT GTG ACA CCA ATC TGC ATA GCT GAC AAG GAA TAC ACT AAC ATT TTC CTG AAG TTT GGC AGT GGA TAC GTG TCA GGA TGG GGC AGA GTG TTC CAC AAG GGA CGC TCT GCT CTC GTG CTT CAG TAC CTG CGA GTG CCT TTG GTG GAT CGG GCA ACA TGT TTG AGG AGC ACA AAA TTT ACT ATT TAC AAC AAT ATG TTT TGC GCC GGC TTC CAC GAA GGA GGG CGA GAT TCA TGC CAG GGA GAC AGT GGC GGT CCA CAC GTG ACT GAA GTC GAA GGC ACC TCT TTT TTG ACC GGA ATC ATC TCT TGG GGT GAA GAG TGT GCC ATG AAA GGA AAG TAT GGC ATA TAC ACA AAG GTG TCC CGC TAT GTG AAC TGG ATC AAG GAG AAG ACC AAA CTC ACC TAG

En modalidades adicionales, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos (secuencia optimizada en codón FIX 24-K5R con secuencia de propéptido y una sustitución R338L) (SEQ ID NO:5):

ATG CAG CGG GTG AAT ATG ATC ATG GCT GAG AGT CCA GGA CTT ATC ACC ATA TGC TTG CTG GGG TAT CTC CTC TCC GCT GAG TGC ACC GTA TTC CTC GAT CAC GAG AAC GCC AAC AAA ATC CTT AAC AGA CGT AGG CGA TAC AAC AGT GGC CGA CTG GAG GAG TTT GTC CAA GGT AAC CTG GAA CGG GAA TGT ATG GAG GAG AAG TGT AGT TTC GAG GAG GCT CGG GAG GTG TTT GAG AAC ACA GAA AGA ACA ACC GAA TTT TGG AAG CAA TAT GTC GAT GGT GAC CAA TGT GAG TCT AAC CCT TGT CTT AAT GGA GGC TCA TGC AAA GAC GAC ATT AAC AGT TAT GAA TGT TGG TGT CCC TTT GGC TTC GAG GGA AAG AAT TGT GAG CTG GAC GTG ACC TGC AAT ATT AAG AAC GGA AGG TGC GAG CAG TTT TGC AAA AAC AGT GCT GAT AAC AAG GTG GTA TGT TCT TGC ACC GAA GGT TAC CGT CTT GCT GAA AAT CAG AAG AGC TGT GAA CCA GCC GTT CCC TTT CCC TGT GGA CGT GTA AGC GTT TCT CAG ACA TCA AAA CTG ACC CGG GCT GAG ACT GTG TTC CCT GAC GTC GAT TAC GTT AAC TCT ACC GAA GCC GAA GGA AGC CCC GGC AGC GGG TCA GCT AAC GCA ACC GGC CCT AGC GGT GAA GGC TCC GCT CCT TCC GAA GGA AAC GCA ACC GGA CCA GGT ACC TCC GGA GGA AGC CCA GCC AAC TCC ACA GGG GGG TCC CCT GCC GAG GGG AGC CCT GGC AGT GAG ATC CTG GAT AAC ATC ACA CAG AGC ACA CAG AGC TTT AAT GAC TTC ACC CGT GTG GTG GGA GGC GAG GAT GCA AAG CCC GGA CAG TTT CCA TGG CAG GTG GTC CTG AAC GGC AAG GTG GAT GCC TTT TGC GGA GGA TCT ATC GTG AAT GAA AAG TGG ATT GTG ACT GCT GCC CAC TGT GTG GAG ACT GGT GTG AAA ATC ACT GTG GTA GCA GGA GAA CAC AAT ATT GAG GAG ACC GAG CAT ACC GAG CAG AAG CGC AAT GTG ATC CGC ATC ATA CCT CAC CAT AAC TAC AAT GCA ACA ATT AAT AAG TAC AAC CAT GAC ATC GCC CTG TTG GAG CTG GAT GAG CCC CTG GTG CTC AAT TCT TAT GTG ACA CCA ATC TGC ATA GCT GAC AAG GAA TAC ACT AAC ATT TTC CTG AAG TTT GGC AGT GGA TAC GTG TCA GGA TGG GGC AGA GTG TTC CAC AAG GGA CGC TCT GCT CTC GTG CTT CAG TAC CTG CGA GTG CCT TTG GTG GAT CGG GCA ACA TGT TTG NNN AGC ACA AAA TTT ACT ATT TAC AAC AAT ATG TTT TGC GCC GGC TTC CAC GAA GGA GGG CGA GAT TCA TGC CAG GGA GAC AGT GGC GGT CCA CAC GTG ACT GAA GTC GAA GGC ACC TCT TTT TTG ACC GGA ATC ATC TCT TGG GGT GAA GAG TGT GCC ATG AAA GGA AAG TAT GGC ATA TAC ACA AAG GTG TCC CGC TAT GTG AAC TGG ATC AAG GAG AAG ACC AAA CTC ACC TAG,

en donde NNN es cualquier codón de tres nucleótidos que codifica leucina.

La presente invención proporciona, además, una proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico, el vector y/o la

célula de cualquiera de esta invención para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico.

Algunas modalidades de la invención se dirigen a proteínas del Factor IX que tienen uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etcétera) sitios de glicosilación adicionales. Por sitios de glicosilación "adicionales" o

"nuevos" se entiende que el número de sitios de glicosilación en la proteína del FIX es superior al número de sitios de

glicosilación presentes normalmente en una forma de "tipo silvestre" del Factor IX. Una proteína del Factor IX de esta

invención puede incluir FIX derivado del plasma, así como también formas recombinantes del FIX. Generalmente, las

modalidades de la invención se dirigen a aumentar el número de sitios de glicosilación en una molécula del FIX de esta

invención. Sin embargo, debe entenderse que una proteína del Factor IX de esta invención que puede modificarse para

aumentar el número de sitios de glicosilación y/o aumentar el número de cadenas de azúcar no se limita a una secuencia

de aminoácidos del FIX de "tipo silvestre" en particular, debido a que las proteínas del FIX de origen natural o artificiales

también pueden modificarse de acuerdo con los métodos de esta invención para aumentar el número de sitios de

glicosilación y/o para aumentar el número de cadenas de azúcar.

La presente invención se dirige, además, a proteínas del FIX que contienen una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, etcétera) cadenas de azúcar adicionales. Dichas cadenas laterales de azúcar adicionales pueden

presentarse en uno o más de los sitios de glicosilación adicionales introducidos en las proteínas del FIX de esta invención

mediante los métodos descritos en la presente descripción. Alternativamente, las cadenas laterales de azúcar adicionales

pueden presentarse en sitios en la proteína del FIX como resultado de métodos químicos y/o enzimáticos para introducir

dichas cadenas de azúcar en la molécula del FIX, como se conocen bien en la técnica. Por cadenas de azúcar

"adicionales" o "nuevas" se entiende que el número de cadenas de azúcar en la proteína del FIX es mayor que el número

de cadenas de azúcar presentes normalmente en una forma de "tipo silvestre" del Factor IX. En diversas modalidades,

pueden añadirse de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 cadenas laterales de azúcar adicionales (por ejemplo, 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 3 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50).

En algunas modalidades, al menos un sitio de glicosilación adicional se encuentra en el péptido de activación del Factor

IX (por ejemplo, el péptido de activación del FIX humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1). La

proteína del FIX descrita en la presente descripción puede tener una inserción de un segmento peptídico que introduce

uno o más sitios de glicosilación entre la posición N157 y la N167 de la secuencia de aminoácidos del Factor IX de la SEC

ID NO:1.

La(s) inserción(es) puede(n) introducirse en una proteína del FIX descrita en la presente descripción para aumentar el

número de sitios de glicosilación y dicha(s) inserción(es) puede(n) incluir de aproximadamente uno a aproximadamente

100 residuos de aminoácidos, lo que incluye cualquier número de residuos de aminoácidos de uno a 100 (por ejemplo, 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 3 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,

69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y

100).

En algunos casos, la inserción puede incluirtodo o al menos parte (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15 o más residuos de aminoácidos) de un péptido de activación del Factor IX de una especie no humana, tal como

el ratón. Esta secuencia peptídica insertada puede modificarse posteriormente para introducir sitios de glicosilación

adicionales de acuerdo con las enseñanzas en la presente descripción.

El(los) sitio(s) de glicosilación puede(n) ser sitio(s) de glicosilación ligado(s) a N. En algunas modalidades, el(los) sitio(s)

de glicosilación añadido(s) incluye(n) sitio(s) de glicosilación ligado(s) a N y la secuencia de consenso es NXT/S, siempre

y cuando X no sea prolina.

En algunas modalidades, pueden añadirse de aproximadamente uno a aproximadamente 15 sitios de glicosilación a la

secuencia de aminoácidos del FIX. En diversas modalidades, pueden añadirse de aproximadamente 1 a

aproximadamente 50 sitios de glicosilación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50). En la

presente descripción se describen proteínas del FIX en las que se ha creado un sitio de glicosilación por inserción, deleción

o sustitución de aminoácidos específicos. En casos particulares, la inserción, deleción y/o sustitución se produce en la

región del péptido de activación. La secuencia de aminoácidos del péptido de activación del FIX humano se proporciona

en la presente descripción como: Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp

Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg (SEQ ID NO:11).

Se contempla que los sitios de glicosilación adicionales introducidos en una secuencia de aminoácidos del FIX pueden

introducirse en cualquier lugar a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX. Por lo tanto, en algunos

casos, el sitio o los sitios de glicosilación adicionales se introducen en el péptido de activación (aminoácidos 146-180 de

la secuencia de aminoácidos del FIX humano maduro de SEC ID NO:1). En algunas modalidades, el sitio o los sitios de

glicosilación adicionales se introducen fuera del péptido de activación (por ejemplo, antes y/o después del péptido de activación). En algunos casos, el sitio o los sitios de glicosilación adicionales se introducen tanto dentro del péptido de activación como fuera del péptido de activación. Por lo tanto, basado en la numeración de los 415 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX humano maduro como se muestra en la SEQ ID NO:1, puede introducirse un sitio de unión de glicosilación mediante la inserción de residuos de aminoácidos adicionales entre o en cualquiera de los aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,

121, 122,123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140,141, 142, 143, 144,

145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192,

193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415 y cualquiera de sus combinaciones. Como se usa en la presente, un "sitio de unión de glicosilación" o "sitio de glicosilación" puede significar una secuencia de consenso de unión de azúcar (es decir, una serie de aminoácidos que actúan como una secuencia de consenso para unir un azúcar (mono-, oligo- o poli-sacárido) a una secuencia de aminoácidos o puede significar el residuo de aminoácido real al que se une covalentemente el resto de azúcar. El resto de azúcar puede ser un monosacárido (molécula de azúcar simple), un oligosacárido o un polisacárido.

En casos particulares, pueden insertarse aminoácidos adicionales entre y/o sustituirse en cualquiera de los residuos de aminoácidos que forman el péptido de activación, tal como entre cualquiera de los aminoácidos 145, 146, 147, 148, 149,

150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173,

174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 y cualquiera de sus combinaciones. Además, el mismo inserto de este caso puede introducirse múltiples veces en la misma y/o en diferentes ubicaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX, lo que incluye dentro del péptido de activación. Además, pueden introducirse diferentes insertos y/o los mismos insertos una o más veces en la misma y/o en diferentes ubicaciones entre los residuos de aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX, lo que incluye dentro del péptido de activación. En un ejemplo no limitante, puede añadirse un sitio de glicosilación en los aminoácidos 103, 151 y 228.

Se conoce bien en la técnica que algunas proteínas pueden soportar una gran cantidad de cadenas laterales de azúcar y la distancia entre los sitios de glicosilación ligados a N puede ser tan pequeña como tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos

(ver, por ejemplo, Lundin y otros, "Membrane topology ofthe Drosophila OR83b odorant receptor" FEBS Letters 581:5601-5604 (2007); Apweiler y otros, "On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis ofthe SWISS-PROT database" Biochimica et Biophysica Acta 1473:4-8 (19991)).

Además, la proteína del FIX definida en la presente descripción puede modificarse mediante mutación (por ejemplo, sustitución, adición y/o deleción de aminoácidos) para introducir sitios de glicosilación ligados a N. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos en la superficie de la proteína del FIX funcional pueden identificarse de acuerdo con métodos de modelado molecular estándar en la técnica que serían adecuados para la modificación (por ejemplo, mutación) para introducir uno o más sitios de glicosilación.

Las proteínas del FIX de esta invención que tienen sitios de glicosilación adicionales pueden producirse mediante métodos recombinantes tales como mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de PCR. Alternativamente, la proteína del Factor

IX de esta invención puede sintetizarse químicamente para preparar una proteína del Factor IX con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etcétera) sitios de glicosilación adicionales.

Está dentro de la habilidad de un experto en la técnica modificar cualquier residuo o residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos del FIX maduro de acuerdo con métodos que se conocen bien en la técnica y como se enseña en la presente descripción y evaluar cualquier proteína del FIX resultante para determinar la actividad, estabilidad, recuperación, vida media, etcétera, de acuerdo con métodos que se conocen bien y como se describe en la presente descripción (ver, por ejemplo, Elliott y otros, "Structural requirements for additional N-linked carbohydrate on recombinant human erythropoietin" J. Biol. Chem 279:16854-62 (2004)).

Las modalidades de la invención se dirigen a proteínas del Factor IX recombinantes en las que se han añadido sitios de glicosilación para mejorar la recuperación y/o la vida media y/o la estabilidad del Factor IX. Los sitios de glicosilación pueden ser sitios de glicosilación ligados a N. En modalidades específicas, se añade al menos un sitio de glicosilación ligado a N.

Como se señala en la presente descripción, en algunas modalidades, se introduce al menos un sitio de glicosilación adicional en la secuencia de aminoácidos del FIX en un sitio que se encuentra fuera del péptido de activación. En algunas modalidades, el al menos un sitio de glicosilación adicional corresponde a un sitio que se glicosila en la forma nativa de un homólogo no humano del Factor IX. Una modificación de la secuencia de aminoácidos del FIX humano para introducir una serina o treonina en el aminoácido 262 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, que es la forma madura (es decir, secretada) del FIX humano, introduciría un sitio de glicosilación ligado a N adicional en la proteína humana. En diversos casos, el homólogo no humano es de perro, cerdo, vaca o ratón.

Adicionalmente, se proporciona en la presente descripción un ácido nucleico que comprende, que consiste esencialmente en y/o que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del FIX de esta invención. Dichos ácidos nucleicos pueden presentarse en un vector, tal como un casete de expresión. Por lo tanto, otras modalidades de la invención se dirigen a casetes de expresión diseñados para expresar una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas del Factor IX de esta invención. Los ácidos nucleicos y/o vectores de esta invención pueden presentarse en una célula. Por lo tanto, diversas modalidades de la invención se dirigen a células huésped recombinantes que contienen el vector (por ejemplo, casete de expresión). Dicha célula puede aislarse y/o presentarse en un animal transgénico no humano. Por lo tanto, ciertas modalidades de la invención se dirigen, además, a un animal transgénico no humano que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas del Factor IX de la presente invención.

Una comparación de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del FIX de humano, ratón, cobaya y ornitorrinco revela que la secuencia de aminoácidos del FIX del ratón tiene nueve aminoácidos adicionales presentes en su péptido de activación, la secuencia de aminoácidos del FIX de cobaya tiene diez residuos de aminoácidos adicionales presentes en su péptido de activación y el ornitorrinco tiene 14 residuos de aminoácidos adicionales presentes en su péptido de activación. Estos aminoácidos adicionales se encuentran entre los dos sitios de glicosilación de origen natural (N 157 y N 167) en el Factor IX humano.

El FIX humano y el de ratón tienen estructuras idénticas esencialmente y la enzima humana puede funcionar en el ratón. Como el FIX humano funciona sin el segmento adicional de nueve aminoácidos que se encuentra en el ratón, esta región de la molécula del Factor IX puede tolerar modificaciones dentro de su secuencia, lo que incluye inserciones, sustituciones y/o deleciones, sin una pérdida sustancial en la integridad estructural, bioquímica o de cualquier otra manera funcional de la molécula. Los nueve aminoácidos insertados en el ratón son más probablemente residuos de superficie (de acuerdo con los estudios estructurales) y por lo tanto son accesibles para la modificación mediante las enzimas de glicosilación. En el factor IX humano nativo, los dos sitios de glicosilación ligados a N están 12 y 14 aminoácidos distantes de los sitios de escisión de amino y carboxilo, respectivamente, del péptido de activación. Por lo tanto, en algunos casos descritos en la presente descripción, pueden añadirse residuos de aminoácidos adicionales entre N157 y N167 de la proteína del Factor IX humano de SEQ ID NO:1 para añadir sitios de glicosilación para mejorar la vida media y/o la biodisponibilidad. En diversos casos, los sitios de glicosilación se añaden por inserción, deleción y/o modificación de la secuencia nativa para incluir una secuencia de unión para secuencias de consenso para la glicosilación ligada a N.

La secuencia humana para el péptido de activación comienza en el residuo 146 de la proteína madura. Los sitios de glicosilación naturales están en N157 y N167 (SEQ ID NO:1). En algunos casos descritos en la presente descripción, pueden insertarse residuos de aminoácidos adicionales entre los dos sitios de glicosilación normales (entre N157 y N167 en la secuencia madura) para proporcionar sitios de glicosilación adicionales. En algunos casos descritos en la presente descripción, se añaden de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos adicionales. En otros casos descritos en la presente descripción, se añaden de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. En otros casos descritos en la presente descripción, se añaden aproximadamente de 5 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos. En aún otros casos descritos en la presente descripción, se añaden de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos. Típicamente, los residuos de aminoácidos se eligen entre los 20 aminoácidos biológicos siempre y cuando la prolina no se use como "X" en el sitio de glicosilación NXT/S, que es la secuencia de consenso para la glicosilación ligada a N. La Tabla 1 muestra 20 aminoácidos biológicos comunes y sus abreviaturas.

Pueden añadirse sitios de N-glicosilación. Las secuencias de consenso para la adición de sitios de glicosilación se conocen en la técnica e incluyen la secuencia de consenso "NXT/S" para la N-glicosilación donde X no es prolina.

En algunos casos descritos en la presente descripción, las secuencias de unión endógenas ligadas a N de ratones, humanos y otras secuencias del Factor IX de mamíferos se insertan en el péptido de activación. Estas pueden insertarse individualmente o en combinación. En ciertos casos descritos en la presente descripción, el segmento insertado incluye una región espaciadora entre los sitios de glicosilación, que puede presentarse individualmente, en repeticiones en tándem, en múltiples, etcétera. Una región espaciadora de esta invención puede ser de uno a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100). En algunos casos, por ejemplo, la región espaciadora puede ser de uno a aproximadamente 20 aminoácidos. En otros casos la región espaciadora puede ser de uno a aproximadamente diez aminoácidos. En otros casos, la región espaciadora puede ser de uno a aproximadamente cinco residuos de aminoácidos.

Se incluye una región espadadora descrita en la presente descripción entre los sitios de unión de carbohidratos añadidos y/o entre los sitios de glicosilación de origen natural y los sitios de glicosilación añadidos para reducir o eliminar el impedimento estérico y proporcionar un reconocimiento eficiente mediante la glicosiltransferasa apropiada. Una región espaciadora descrita en la presente descripción puede comprender cualquier combinación de residuos de aminoácidos, siempre y cuando no sean cisteína o prolina y siempre y cuando la secuencia de aminoácidos del espaciador no tenga más de aproximadamente 10 % de residuos que son hidrófobos (por ejemplo, triptófano, tirosina, fenilalanina y valina).

En algunas modalidades, NXT/S se incorpora en la secuencia de aminoácidos insertada para añadir uno o más sitios de glicosilación adicionales. "X" puede ser cualquier aminoácido biológico, excepto que se desfavorece la prolina. En algunas modalidades, se añade al menos un sitio de glicosilación adicional a la proteína del Factor IX. En otras modalidades, se añaden dos sitios de glicosilación adicionales. En modalidades adicionales, se añaden tres sitios de glicosilación adicionales. En aún otras modalidades, se añaden cuatro sitios de glicosilación adicionales. En modalidades adicionales, se añaden cinco sitios de glicosilación adicionales. En algunas modalidades, se añaden seis sitios de glicosilación adicionales. En otras modalidades, se añaden más de seis sitios de glicosilación adicionales.

En un caso descrito en la presente descripción, la Ala en la posición 161 de la secuencia de aminoácidos del FIX maduro (SEQ ID NO: 1) se reemplaza con Asn para proporcionar un sitio de glicosilación adicional. En un caso adicional descrito en la presente descripción, la secuencia VFIQDNITD (SEQ ID NO:8) se inserta entre los residuos 161 y 162 de la secuencia de aminoácidos del FIX humano maduro de SEQ ID NO:1 para introducir un sitio de glicosilación ligado a N en la secuencia del FIX humano. En aún otro caso descrito en la presente descripción, se añade otro nuevo sitio de glicosilación mediante el reemplazo de Asp con Asn en el inserto VFIQDNITD. La secuencia insertada daría VFIQDNITN (SEQ ID NO:9). Las modalidades analizadas anteriormente podrían combinarse para proporcionar de uno a cuatro sitios de glicosilación adicionales en la proteína del Factor IX humano.

En otra modalidad, se añade la secuencia siguiente, que proporciona cinco sitios de glicosilación adicionales. Los sitios de glicosilación se muestran en negrita y subrayados. AETVFPDVDYVNSTENETIQDNITDNETILDNITQSTQSFNDFTR (SEQ ID NO: 10)

En algunas modalidades, los sitios de glicosilación se añaden en sitios fuera del péptido de activación. Estos sitios adicionales pueden seleccionarse, por ejemplo, al alinear la secuencia de aminoácidos del Factor IX del ser humano con la secuencia de aminoácidos del Factor IX de otras especies y determinar la posición de los sitios de glicosilación en las especies no humanas. La posición homóloga o equivalente en la secuencia de aminoácidos del FIX humano se modifica después para proporcionar un sitio de glicosilación. Este método puede usarse para identificar tanto sitios potenciales de N-glicosilación como de O-glicosilación.

Las proteínas del FIX de acuerdo con la invención se producen y caracterizan por métodos que se conocen bien en la técnica y como se describe en la presente descripción. Estos métodos incluyen la determinación del tiempo de coagulación (ensayo de tiempo parcial de tromboplastina (PPT)) y la administración de la proteína del FIX a un animal de prueba para determinar la recuperación, la vida media y la biodisponibilidad mediante un inmunoensayo y/o un ensayo de actividad apropiados, como se conocen bien en la técnica.

La proteína del Factor IX, el ácido nucleico, el vector y/o la célula de esta invención pueden incluirse en una composición farmacéutica. Algunas modalidades se dirigen a un kit que incluye la proteína del Factor IX de esta invención.

La proteína del Factor IX de esta invención puede usarse en el tratamiento de un trastorno hemorrágico en un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) que necesita de esto. Por lo tanto, la presente invención proporciona, además, el uso de la proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico, el vector y/o la célula de esta invención para el tratamiento de un trastorno hemorrágico.

Además, se describe en la presente descripción un método para aumentar la biodisponibilidad de una proteína del Factor IX en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico y/o la célula descritas en la presente descripción.

Los trastornos hemorrágicos que pueden tratarse de acuerdo con esta invención incluyen una deficiencia del FIX, hemofilia B y enfermedad de Christmas. Dichos protocolos de tratamiento y regímenes de dosificación para administrar o suministrar el Factor IX a un sujeto que necesita de esto se conocen bien en la técnica.

Pueden usarse muchos vectores de expresión para crear células modificadas genéticamente. Algunos vectores de expresión se diseñan para expresar grandes cantidades de proteínas recombinantes después de la amplificación de las células transfectadas en una variedad de condiciones que favorecen las células de alta expresión seleccionadas. Algunos vectores de expresión se diseñan para expresar grandes cantidades de proteínas recombinantes sin la necesidad de amplificación con presión de selección. La presente invención incluye la producción de células modificadas genéticamente de acuerdo con métodos estándar en la técnica y no depende del uso de ningún vector de expresión o sistema de expresión específico.

Para crear una célula modificada genéticamente para producir grandes cantidades de una proteína del Factor IX, las células se transfectan con un vector de expresión que contiene el ADNc que codifica la proteína. En algunas modalidades, la proteína objetivo se expresa con enzimas cotransfectadas seleccionadas que provocan que se produzca una modificación postraduccional adecuada de la proteína objetivo en un sistema celular dado.

La célula puede seleccionarse de una variedad de fuentes, pero es, de cualquier otra manera, una célula que puede transfectarse con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico, preferentemente, un ADNc que codifica una proteína del Factor IX.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2da ed. (1989); DNA Cloning, Vols. I y II (D. N Glover, ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); las series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), particularmente los Vols. 154 y 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds., respectivamente); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos, eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Mayer y Walker, eds. (Academic Press, Londres, 1987); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 2da ed. 1987 (Springer-Verlag, Nueva York); y Handbook of Experimental Immunology Vols I-IV (D. M. W eiryC . C. Blackwell, eds 1986).

Técnicas de Ingeniería Genética

Se conoce bien la producción de genes clonados, ADN recombinante, vectores, células huésped transformadas, proteínas y fragmentos de proteínas mediante ingeniería genética. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Núm. 4,761,371 de Bell y otros de la columna 6, línea 3 a la columna 9, línea 65; Patente de Estados Unidos Núm. 4,877,729 de Clark y otros de la columna 4, línea 38 a la columna 7, línea 6; Patente de Estados Unidos Núm. 4,912,038 de Schilling de la columna 3, línea 26 a la columna 14, línea 12; y Patente de Estados Unidos Núm. 4,879,224 de Wallner de la columna 6, línea 8 a la columna 8, línea 59.

Un vector es un constructo de ADN replicable. Los vectores se usan en la presente descripción ya sea amplificar el ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX y/o para expresar el ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX. Un vector de expresión es un constructo de ácido nucleico replicable en el que una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del Factor IX se une operativamente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión de la secuencia de nucleótidos para producir una proteína del Factor IX en un huésped adecuado. La necesidad de dichas secuencias de control variará en dependencia del huésped seleccionado y el método de transformación elegido. Generalmente, las secuencias de control incluyen un promotor transcripcional, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión ribosómica de ARNm adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.

Los vectores comprenden plásmidos, virus (por ejemplo, adenovirus, citomegalovirus), fagos y fragmentos de ADN integrables (es decir, fragmentos integrables en el genoma del huésped mediante recombinación). El vector se replica y funciona independientemente del genoma del huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. Los vectores de expresión pueden contener un promotor y sitios de unión a ARN que se unen operativamente al gen que se expresa y son operables en el organismo huésped.

Las regiones de ADN o secuencias de nucleótidos se unen operativamente o se asocian operativamente cuando se relacionan funcionalmente entre sí. Por ejemplo, un promotor se une operativamente a una secuencia de codificación si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une operativamente a una secuencia de codificación si se coloca de manera que permita la traducción de la secuencia.

Las células huésped transformadas son células que se han transformado, transducido y/o transfectado con vector(es) de proteína del Factor IX construido mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

Las células huésped adecuadas incluyen células procariotas, levaduras o eucariotas superiores tales como células de mamífero y células de insecto. Las células derivadas de organismos multicelulares son un huésped adecuado particularmente para la síntesis de proteína del Factor IX recombinante, y se prefieren particularmente las células de mamífero. La propagación de dichas células en cultivo celular se ha convertido en un procedimiento de rutina (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)). Ejemplos de líneas celulares huésped útiles son las células VERO y HeLa, las líneas celulares de ovario de hámster chino (Ch O) y las líneas celulares WI138, HEK 293, BHK, COS-7, CV y MDCK. Los vectores de expresión para dichas células incluyen normalmente (si es necesario) un origen de replicación, un promotor ubicado aguas arriba de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína del Factor IX a expresarse y asociada operativamente con este, junto con un sitio de unión a ribosoma, un sitio de empalme de ARN (si se usa ADN genómico que contiene un intrón), un sitio de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción. En una modalidad preferida, la expresión se lleva a cabo en células de ovario de hámster chino (CHO) mediante el uso del sistema de expresión de la Patente de Estados Unidos Núm. 5,888,809.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción en los vectores de expresión a usarse en células de vertebrados transformantes se proporcionan a menudo mediante fuentes virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, y Virus del Simio 40 (SV40). Ver por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 4,599,308.

Un origen de replicación podría proporcionarse ya sea mediante la construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como podría derivarse del SV40 u otra fuente viral (por ejemplo, polioma, adenovirus, VSV, o BPV), o podría proporcionarse mediante el mecanismo de replicación cromosomal de la célula huésped. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula huésped, a menudo es suficiente lo último.

En lugar de usar vectores que contienen orígenes virales de replicación, pueden transformarse células de mamífero mediante el método de cotransformación con un marcador seleccionable y el ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados son la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa. Este método se describe, además, en la Patente de Estados Unidos Núm. 4,399,216.

Otros métodos adecuados para la adaptación a la síntesis de la proteína del Factor IX en el cultivo de células de vertebrados recombinantes incluyen los descritos en Gething y otros, Nature 293:620 (1981); Mantei y otros, Nature 281:40; y Levinson y otros, Solicitudes EPO Núms. 117,060A y 117,058A.

Las células huésped tales como células de insecto (por ejemplo, células cultivadas de Spodoptera frugiperda) y vectores de expresión tales como el vector de expresión de baculovirus (por ejemplo, vectores derivados de Autographa califomicaMNPV, Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV, o Galleria ouMNPV) pueden emplearse para llevar a cabo la presente invención, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Núms. 4,745,051 y 4,879,236 de Smith y otros. En general, un vector de expresión de baculovirus comprende un genoma de baculovirus que contiene la secuencia de nucleótidos a expresar insertada en el gen de polihedrina en una posición que varía de la señal de inicio transcripcional de polihedrina hasta el sitio de inicio ATG y bajo el control transcripcional de un promotor de polihedrina de baculovirus.

Las células huésped procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Escherichia coli (E. coli) o bacilos. Las células superiores eucariotas incluyen líneas celulares establecidas de origen de mamíferos, como se describe a continuación. Las células huésped ilustrativas son E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli B, E. coliX1776 (ATCC 31,537) y E. coli 294 (ATCC 31,446). Se dispone de una amplia variedad de vectores procariotas y microbianos adecuados. La E. coli se transforma típicamente mediante el uso de pBR322. Los promotores usados más comúnmente en los vectores de expresión microbiana recombinante incluyen los sistemas promotores de betalactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang y otros, Nature 275:615 (1978); y Goeddel y otros, Nature 281:544 (1979)), un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) y Solicitud de Publicación EPO Núm. 36,776) y el promotor tac (De Boer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80:21 (1983)). El promotor y la secuencia Shine-Dalgarno (para la expresión del huésped procariota) se unen operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX, es decir, se colocan para promover la transcripción del ARN mensajero del Factor IX a partir del ADN.

Los microbios eucariotas tales como los cultivos de levadura pueden transformarse, además, con vectores que codifican proteínas (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 4,745,057). El Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo huésped más comúnmente usado entre los eucariotas inferiores, aunque se dispone comúnmente de un número de otras cepas. Los vectores de levadura pueden contener un origen de replicación a partir del plásmido de levadura de 2 micras o una secuencia de replicación autónoma (ARS), un promotor, un ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX, secuencias de poliadenilación y la terminación de la transcripción, y un gen de selección. Un plásmido ilustrativo es YRp7, (Stinchcomb y otros, Nature 282:39 (1979); Kingsman y otros, Gene 7:141 (1979); Tschemper y otros, Gene 10:157 (1980)). Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); y Holland y otros, Biochemistry 17:4900 (1978)). Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en R. Hitzeman y otros, Publicación EPO Núm. 73,657.

Las secuencias de codificación clonadas descritas en la presente descripción invención pueden codificar el FIX de cualquier especie de origen, lo que incluye ratón, rata, perro, zarigüeya, conejo, gato, cerdo, caballo, oveja, vaca, curiel, zarigüeya, ornitorrinco, y ser humano, pero codifican, preferentemente, la proteína del Factor IX de origen humano. Además, se abarca el ácido nucleico que codifica el Factor IX que puede hibridarse con el ácido nucleico que codifica las proteínas descritas en la presente descripción. La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida o incluso en condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones rigurosas como las representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, SDS al 0,1 % a 60 °C o incluso 70 °C) al ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX descrita en la presente descripción en un ensayo de hibridación in situ estándar. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2da Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory).

Las proteínas del FIX producidas de acuerdo con la invención pueden expresarse en animales transgénicos no humanos mediante métodos conocidos. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 6,344,596. En resumen, los animales transgénicos pueden incluir, pero no se limitan a, animales de granja (por ejemplo, cerdos, cabras, ovejas, vacas, caballos, conejos y similares) roedores (tales como ratones, ratas y cobayas), y mascotas domésticas (por ejemplo, gatos y perros). Se prefiere particularmente, en algunas modalidades, ganado animal, tal como cerdos, ovejas, cabras y vacas.

El animal transgénico no humano de esta invención se produce mediante la introducción en un embrión no humano de células individuales un polinucleótido apropiado que codifica una proteína del Factor IX humano de esta invención de manera que el polinucleótido se integra establemente en el ADN de las células de la línea germinal del animal maduro, y se hereda del modo Mendeliano normal. El animal transgénico no humano de esta invención tendría un fenotipo de producir la proteína del FIX en fluidos corporales y/o tejidos. La proteína del FIX se extraería de estos fluidos y/o tejidos y se procesaría, por ejemplo, para su uso terapéutico. (Ver, por ejemplo, Clark y otros "Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep" Bio/Technology 7:487-492 (1989); Van Cott y otros, "Haemophilic factors produced by transgenic livestock: abundance can enable alternative therapies worldwide" Haemophilia 10(4):70-77 (2004)).

Las moléculas de ADN pueden introducirse en embriones no humanos mediante una variedad de medios que incluyen, pero no se limitan a, microinyección, precipitación mediada por fosfato de calcio, fusión de liposomas, o infección retroviral de células madre totipotentes o pluripotentes. Las células transformadas pueden entonces introducirse en embriones no humanos e incorporarse a ellos para formar animales transgénicos no humanos. Los métodos para obtener animales transgénicos no humanos se describen, por ejemplo, en Transgenic Animal Generation and Use por L. M. Houdebine, Harwood Academic Press, 1997. Los animales transgénicos pueden generarse, además, mediante el uso de métodos de transferencia nuclear o clonación mediante el uso de líneas celulares embrionarias o adultas como se describe, por ejemplo, en Campbell y otros, Nature 380:64-66 (1996) y Wilmut y otros, Nature 385:810-813 (1997). Además, puede usarse una técnica que usa la inyección citoplasmática de ADN como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm.

5,523,222.

Pueden obtenerse animales transgénicos no humanos productores del Factor IX mediante la introducción de un constructo quimérico que comprende secuencias que codifican el Factor IX. Se conocen bien los métodos para obtener animales transgénicos. Ver, por ejemplo, Hogan y otros, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort y otros, Bio/Technology 9:88 (1991); Palmiter y otros, Cell 41:343 (1985), Kraemer y otros, GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammery otros, Nature 315:680 (1985); Wagner y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 5,175,385; Krimpenfort y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 5,175,384, Janne y otros, Ann. Med. 24:273 (1992), Brem y otros, Chim. Oggi. 11:21 (1993), Clark y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 5,476,995.

En algunas modalidades, pueden usarse regiones reguladoras que actúan en cis que son "activas" en el tejido mamario, porque los promotores son más activos en el tejido mamario que en otros tejidos en las condiciones fisiológicas en que se sintetiza la leche. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la proteína ácida de suero (WAP) corta y larga, caseína a, p y k corta y larga, a-lactoalbúmina y p-lactoglobulina ("BLG"). Las secuencias señal pueden usarse, además, de acuerdo con esta invención que dirige la secreción de las proteínas expresadas a otros fluidos corporales, particularmente sangre y orina. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen los péptidos señal de factores de coagulación secretados, lo que incluye péptidos señal del Factor IX, proteína C y activador de plasminógeno de tipo tejido.

Entre las secuencias útiles que regulan la transcripción, además de los promotores analizados anteriormente, están los potenciadores, las señales de empalme, las señales de terminación de la transcripción, los sitios de poliadenilación, las secuencias reguladoras, las secuencias de procesamiento de ARN y otras secuencias que regulan la expresión de transgenes.

Preferentemente, el sistema de expresión o constructo incluye una región no traducida de 3' aguas abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante deseada. Esta región puede aumentar la expresión del transgén. Entre las regiones no traducidas de 3' útiles con respecto a esto están las secuencias que proporcionan una señal poli A.

Pueden derivarse secuencias no traducidas de 3' heterólogas adecuadas, por ejemplo, a partir del antígeno t pequeño de SV40, la región no traducida de 3' de caseína, u otras secuencias no traducidas de 3' que se conocen bien en esta técnica. Los sitios de unión del ribosoma también son importantes para aumentar la eficiencia de expresión del FIX. Igualmente, las secuencias que regulan la modificación postraduccional del FIX son útiles en la invención.

Las secuencias de codificación del Factor IX, junto con los vectores y las células huésped para la expresión de estas, se describen en la solicitud de Patente Europea núm. 373012, solicitud de Patente Europea núm. 251874, solicitud de Patente PCT núm. 8505376, solicitud de Patente PCT núm. 8505125, solicitud de Patente Europea núm. 162782, y solicitud de Patente PCT núm. 8400560.

Composiciones de la invención

En la presente descripción se describe una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende al menos tres sitios de glicosilación adicionales con relación al FIX humano de tipo silvestre, una sustitución K5R y una sustitución R338X de la secuencia de aminoácidos del FIX de SEQ ID NO:1, en donde X es un aminoácido distinto de la arginina.

SEQ ID NO:1:

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp lie Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser lie Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val lie Arg lie lie Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie

275 280 285

Cys lie Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser

370 375 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415 ,

En la presente descripción se describe una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende al menos tres sitios de glicosilación adicionales con relación al FIX humano de tipo silvestre, una sustitución K51R y una sustitución R384X de la secuencia de aminoácidos FIX de SEQ ID NO:6, en donde X es un aminoácido distinto de la arginina.

M Q R V N M IM A E SPG LITICLL G YLLSAEC TV FLD H E N A N K I LNRRRRYNSG KLEEFVQGNLERECM EEKCSFEEAREVFENTERTTEFW KQ YVDGDQCESNPCLN GGSCKDDIN S YEC W CPF GFEGKN CEFD Y T C N IK N GRCEQF CKN S A D N K V V C S CT EG YRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAEGSPGS GSANATGPSGEGSAPSEGNATGPGTSGGSPANSTGGSPAEGSPGSEILDNITQSTQ SFNDFTR VVG G ED AKPG Q FPW Q VVLN G KVD AFC G G SIVNEKW IVTAAH CVETG V K ITV V A G E H N IE E T E H T E Q K R N V IR IIP H H N Y N A T IN K Y N H D IA LLE LD E P LV LN S Y VTPIC IAD KEYTN IFLKFG SG YVSG W G RVFHKG R SALVLQ YLR VPLVDR ATC LRST KFTIYNNM FCAGFHEGG RDSCQG DSGGPHVTEVEGTSFLTGIISW GEECAM KGKY G IY T K V S R Y V N W IK E K T K LT (SEQ ID NO:6).

Además, en la presente descripción se describe una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos: M Q R V N M IM A E SPG LITICLL G YLLSAEC TV FLD H E N A N K I LNRRRRYNSG RLEEFVQGNLERECM EEKCSFEEAREVFENTERTTEFW KQYVDGDQCESNPCLN GGSCKDDIN S YEC W CPF GFEGKN CEFD V T C N IK N GRCEQF CKN S A D N K V V C S CT EG YRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDYDYVNSTEAEGSPGS GSANATGPSGEGSAPSEGNATGPGTSGGSPANSTGGSPAEGSPGSEILDNITQSTQ SFNDFTRV V GGED AKPGQFP W Q V V L N G K VD AFC G G SIVN EKW I V T A A H C VET G V K ITV V A G E H N IE E T E H T E Q K R N V IR IIP H H N Y N A T IN K Y N H D IA LLE LD E P LV LN S Y VTPIC IAD KEYTN IFLKFG SG YVSG W G R VFH KG R SALVLQ YLR VPLVD R ATC LXS TKFTIYNNM FCAGFHEGGRDSCQG DSGGPHVTEVEGTSFLTG IISW GEECAM KGK Y G IY T K V S R Y V N W IK E K T K LT (SEQ ID NO:7),

en donde X es cualquier aminoácido excepto R (arginina).

Adicionalmente, en la presente descripción se describe una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos: YNSGRLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ CESNPCLNGG SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK NSADNKWCS CTEGYRLAEN QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF PDVDYVNSTE AEGSPGSGSA NATGPSGEGS APSEGNATGP GTSGGSPANS TGGSPAEGSP GSEILDNITQ STQSFNDFTRWGGEDAKPG QFPWQWLNG KVDAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT WAGEHNIEE TEHTEQKRNV IRIIPHHNYNATINKYNHDI ALLELDEPLV LNSYVTPICI ADKEYTNIFL KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VDRATCLXST KFTIYNNMFC AGFHEGGRDS CQGDSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK VSRYVNWIKE KTKLT (SEQ IDNO:2),

en donde X es cualquier aminoácido excepto R (arginina).

La invención proporciona una proteína del FIX que comprende la secuencia de aminoácidos:

Tyr Asn Ser Gly Arg Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn LeuGlu Arg Glu Cys

Met Glu Glu LysCysSer Phe GluGlu Ala Arg Glu Val PheGlu Asn Thr Glu

Arg Thr Thr Glu PheTrp Lys GlnTyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn

Pro Cys LeuAsnGly Gly Ser CysLys AspAsp lie Asn SerTyr Glu Cys Trp

Cys Pro PheGly PheGlu Gly Lys Asn CysGlu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie

en donde Xaa es leucina.

Además, en la presente descripción se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos (secuencia optimizada en codón 24-K5R del FIX con secuencia de propéptido):

ATG CAG CGG GTG AAT ATG ATC ATG GCT GAG AGT CCA GGA CTT ATC ACC ATA TGC

TTG CTG GGG TAT CTC CTC TCC GCT GAG TGC ACC GTA TTC CTC GAT CAC GAG AAC GCC AAC AAA ATC CTT AAC AGA CGT AGG CGA TAC AAC AGT GGC CGA CTG GAG GAG TTT GTC CAA GGT AAC CTG GAA CGG GAA TGT ATG GAG GAG AAG TGT AGT TTC GAG GAG GCT CGG GAG GTG TTT GAG AAC ACA GAA AGA ACA ACC GAA TTT TGG AAG CAA TAT GTC GAT GGT GAC CAA TGT GAG TCT AAC CCT TGT CTT AAT GGA GGC TCA TGC AAA GAC GAC ATT AAC AGT TAT GAA TGT TGG TGT CCC TTT GGC TTC GAG GGA AAG AAT TGT GAG CTG GAC GTG ACC TGC AAT ATT AAG AAC GGA AGG TGC GAG CAG TTT TGC AAA AAC AGT GCT GAT AAC AAG GTG GTA TGT TCT TGC ACC GAA GGT TAC CGT CTT GCT GAA AAT CAG AAG AGC TGT GAA CCA GCC GTT CCC TTT CCC TGT GGA CGT GTA AGC GTT TCT CAG ACA TCA AAA CTG ACC CGG GCT GAG ACT GTG TTC CCT GAC GTC GAT TAC GTT AAC TCT ACC GAA GCC GAA GGA AGC CCC GGC AGC GGG TCA GCT AAC GCA ACC GGC CCT AGC GGT GAA GGC TCC GCT CCT TCC GAA GGA AAC GCA ACC GGA CCA GGT ACC TCC GGA GGA AGC CCA GCC AAC TCC ACA GGG GGG TCC CCT GCC GAG GGG AGC CCT GGC AGT GAG ATC CTG GAT AAC ATC ACA CAG AGC ACA CAG AGC TTT AAT GAC TTC ACC CGT GTG GTG GGA GGC GAG GAT GCA AAG CCC GGA CAG TTT CCA TGG CAG GTG GTC CTG AAC GGC AAG GTG GAT GCC TTT TGC GGA GGA TCT ATC GTG AAT GAA AAG TGG ATT GTG ACT GCT GCC CAC TGT GTG GAG ACT GGT GTG AAA ATC ACT GTG GTA GCA GGA GAA CAC AAT ATT GAG GAG ACC GAG CAT ACC GAG CAG AAG CGC AAT GTG ATC CGC ATC ATA CCT CAC CAT AAC TAC AAT GCA ACA ATT AAT AAG TAC AAC CAT GAC ATC GCC CTG TTG GAG CTG GAT GAG CCC CTG GTG CTC AAT TCT TAT GTG ACA CCA ATC TGC ATA GCT GAC AAG GAA TAC ACT AAC ATT TTC CTG AAG TTT GGC AGT GGA TAC GTG TCA GGA TGG GGC AGA GTG TTC CAC AAG GGA CGC TCT GCT CTC GTG CTT CAG TAC CTG CGA GTG CCT TTG GTG GAT CGG GCA ACA TGT TTG AGG AGC ACA AAA TTT ACT ATT TAC AAC AAT ATG TTT TGC GCC GGC TTC CAC GAA GGA GGG CGA GAT TCA TGC CAG GGA GAC AGT GGC GGT CCA CAC GTG ACT GAA GTC GAA GGC ACC TCT TTT TTG ACC GGA ATC ATC TCT TGG GGT GAA GAG TGT GCC ATG AAA GGA AAG TAT GGC ATA TAC ACA AAG GTG TCC CGC TAT GTG AAC TGG ATC AAG GAG AAG ACC AAA CTC ACC TAG (SEQ ID NO:4D

En modalidades adicionales, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos (secuencia optimizada en codón FIX 24-K5R con secuencia de propéptido y una sustitución R338L):

ATG CAG CGG GTG AAT ATG ATC ATG GCT GAG AGT CCA GGA CTT ATC ACC ATA TGC TTG CTG GGG TAT CTC CTC TCC GCT GAG TGC ACC GTA TTC CTC GAT CAC GAG AAC

GCC AAC AAA ATC CTT AAC AGA CGT AGG CGA TAC AAC AGT GGC CGA CTG GAG GAG TTT GTC CAA GGT AAC CTG GAA CGG GAA TGT ATG GAG GAG AAG TGT AGT TTC GAG GAG GCT CGG GAG GTG TTT GAG AAC ACA GAA AGA ACA ACC GAA TTT TGG AAG CAA TAT GTC GAT GGT GAC CAA TGT GAG TCT AAC CCT TGT CTT AAT GGA GGC TCA TGC AAA GAC GAC ATT AAC AGT TAT GAA TGT TGG TGT CCC TTT GGC TTC GAG GGA AAG AAT TGT GAG CTG GAC GTG ACC TGC AAT ATT AAG AAC GGA AGG TGC GAG CAG TTT TGC AAA AAC AGT GCT GAT AAC AAG GTG GTA TGT TCT TGC ACC GAA GGT TAC CGT CTT GCT GAA AAT CAG AAG AGC TGT GAA CCA GCC GTT CCC TTT CCC TGT GGA CGT GTA AGC GTT TCT CAG ACA TCA AAA CTG ACC CGG GCT GAG ACT GTG TTC CCT GAC GTC GAT TAC GTT AAC TCT ACC GAA GCC GAA GGA AGC CCC GGC AGC GGG TCA GCT AAC GCA ACC GGC CCT AGC GGT GAA GGC TCC GCT CCT TCC GAA GGA AAC GCA ACC GGA CCA GGT ACC TCC GGA GGA AGC CCA GCC AAC TCC ACA GGG GGG TCC CCT GCC GAG GGG AGC CCT GGC AGT GAG ATC CTG GAT AAC ATC ACA CAG AGC ACA CAG AGC TTT AAT GAC TTC ACC CGT GTG GTG GGA GGC GAG GAT GCA AAG CCC GGA CAG TTT CCA TGG CAG GTG GTC CTG AAC GGC AAG GTG GAT GCC TTT TGC GGA GGA TCT ATC GTG AAT GAA AAG TGG ATT GTG ACT GCT GCC CAC TGT GTG GAG ACT GGT GTG AAA ATC ACT GTG GTA GCA GGA GAA CAC AAT ATT GAG GAG ACC GAG CAT ACC GAG CAG AAG CGC AAT GTG ATC CGC ATC ATA CCT CAC CAT AAC TAC AAT GCA ACA ATT AAT AAG TAC AAC CAT GAC ATC GCC CTG TTG GAG CTG GAT GAG CCC CTG GTG CTC AAT TCT TAT GTG ACA CCA ATC TGC ATA GCT GAC AAG GAA TAC ACT AAC ATT TTC CTG AAG TTT GGC AGT GGA TAC GTG TCA GGA TGG GGC AGA GTG TTC CAC AAG GGA CGC TCT GCT CTC GTG CTT CAG TAC CTG CGA GTG CCT TTG GTG GAT CGG GCA ACA TGT TTG NNN AGC ACA AAA TTT ACT ATT TAC AAC AAT ATG TTT TGC GCC GGC TTC CAC GAA GGA GGG CGA GAT TCA TGC CAG GGA GAC AGT GGC GGT CCA CAC GTG ACT GAA GTC GAA GGC ACC TCT TTT TTG ACC GGA ATC ATC TCT TGG GGT GAA GAG TGT GCC ATG AAA GGA AAG TAT GGC ATA TAC ACA AAG GTG TCC CGC TAT GTG AAC TGG ATC AAG GAG AAG ACC AAA CTC ACC TAG (SEQ ID NO:5),

en donde NNN es cualquier codón de tres nucleótidos que codifica leucina.

La presente invención proporciona, además, el uso de la proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico, el vector y/o la célula de esta invención para el tratamiento de un trastorno hemorrágico.

Algunas modalidades de la invención se dirigen a proteínas del Factor IX que tienen uno o más (por ejemplo, 1 ,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etcétera) sitios de glicosilación adicionales. Por sitios de glicosilación "adicionales" o "nuevos" se entiende que el número de sitios de glicosilación en la proteína del FIX es superior al número de sitios de glicosilación presentes normalmente en una forma de "tipo silvestre" del Factor IX. Una proteína del Factor IX de esta invención puede incluir FIX derivado del plasma, así como también formas recombinantes del FIX. Generalmente, las modalidades de la invención se dirigen a aumentar el número de sitios de glicosilación en una molécula del FIX de esta invención. Sin embargo, debe entenderse que una proteína del Factor IX de esta invención que puede modificarse para aumentar el número de sitios de glicosilación y/o aumentar el número de cadenas de azúcar no se limita a una secuencia de aminoácidos del FIX de "tipo silvestre" en particular, debido a que las proteínas del FIX de origen natural o artificiales también pueden modificarse de acuerdo con los métodos de esta invención para aumentar el número de sitios de glicosilación y/o para aumentar el número de cadenas de azúcar.

La presente invención se dirige, además, a proteínas del FIX que contienen una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etcétera) cadenas de azúcar adicionales. Dichas cadenas laterales de azúcar adicionales pueden presentarse en uno o más de los sitios de glicosilación adicionales introducidos en las proteínas del FIX de esta invención mediante los métodos descritos en la presente descripción. Alternativamente, las cadenas laterales de azúcar adicionales pueden presentarse en sitios en la proteína del FIX como resultado de métodos químicos y/o enzimáticos para introducir dichas cadenas de azúcar en la molécula del FIX, como se conocen bien en la técnica. Por cadenas de azúcar "adicionales" o "nuevas" se entiende que el número de cadenas de azúcar en la proteína del FIX es mayor que el número de cadenas de azúcar presentes normalmente en una forma de "tipo silvestre" del Factor IX. En diversas modalidades, pueden añadirse de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 cadenas laterales de azúcar adicionales (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50).

En algunas modalidades, al menos un sitio de glicosilación adicional se encuentra en el péptido de activación del Factor IX (por ejemplo, el péptido de activación del FIX humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1). Como se describe en la presente descripción, la proteína del FIX tiene una inserción de un segmento peptídico que introduce uno o más sitios de glicosilación entre la posición N157 y la N167 de la secuencia de aminoácidos del Factor IX de SEQ ID NO:1.

La(s) inserción(es) puede(n) introducirse en una proteína del FIX descrita en la presente descripción para aumentar el número de sitios de glicosilación ytal(es) inserción(es) puede(n) incluir de aproximadamente uno a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, lo que incluye cualquier número de residuos de aminoácidos de uno a 100 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100).

En algunos casos, la inserción puede incluir todo o al menos parte (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más residuos de aminoácidos) de un péptido de activación del Factor IX de una especie no humana, tal como el ratón. Esta secuencia peptídica insertada puede modificarse posteriormente para introducir sitios de glicosilación adicionales de acuerdo con las enseñanzas en la presente descripción.

El(los) sitio(s) de glicosilación puede(n) ser sitio(s) de glicosilación ligado(s) a N. En algunas modalidades, el(los) sitio(s) de glicosilación añadido(s) incluye(n) sitio(s) de glicosilación ligado(s) a N y la secuencia de consenso es NXT/S, siempre y cuando X no sea prolina.

En algunas modalidades, pueden añadirse de aproximadamente uno a aproximadamente 15 sitios de glicosilación a la secuencia de aminoácidos del FIX. En diversas modalidades, pueden añadirse de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 sitios de glicosilación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50). En la presente descripción se describen proteínas del FIX en las que se ha creado un sitio de glicosilación por inserción, deleción o sustitución de aminoácidos específicos. En casos particulares, la inserción, deleción y/o sustitución se encuentra en la región del péptido de activación. La secuencia de aminoácidos del péptido de activación del FIX humano se proporciona en la presente descripción como: Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg (SEQ ID NO:11).

Se contempla que los sitios de glicosilación adicionales introducidos en una secuencia de aminoácidos del FIX pueden introducirse en cualquier lugar a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX. Por lo tanto, en algunos casos, el sitio o sitios de glicosilación adicionales se introducen en el péptido de activación (aminoácidos 146-180 de la secuencia de aminoácidos del FIX humano maduro de SEQ ID NO:1), fuera del péptido de activación (por ejemplo, antes y/o después del péptido de activación) o ya sea dentro del péptido de activación como fuera del péptido de activación. Por lo tanto, basado en la numeración de los 415 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX humano maduro como se muestra en la SEQ ID NO:1, puede introducirse un sitio de unión de glicosilación mediante la inserción de residuos de aminoácidos adicionales entre cualquiera de los aminoácidos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140,141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415 y cualquiera de sus combinaciones. Como se usa en la presente, un "sitio de unión de glicosilación" o "sitio de glicosilación" puede significar una secuencia de consenso de unión de azúcar (es decir, una serie de aminoácidos que actúan como una secuencia de consenso para unir un azúcar (mono-, oligo- o poli-sacárido) a una secuencia de aminoácidos o puede significar el residuo de aminoácido real al que se une covalentemente el resto de azúcar. El resto de azúcar puede ser un monosacárido (molécula de azúcar simple), un oligosacárido o un polisacárido.

En casos particulares, pueden insertarse aminoácidos adicionales entre y/o sustituidos en cualquiera de los residuos de aminoácidos que forman el péptido de activación, tal como entre cualquiera de los aminoácidos 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 y cualquiera de sus combinaciones. Además, el mismo inserto en este caso en particular puede introducirse múltiples veces en la misma y/o en diferentes ubicaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX, lo que incluye dentro del péptido de activación. Además, pueden introducirse diferentes insertos y/o los mismos insertos una o más veces en la misma y/o en diferentes ubicaciones entre los residuos de aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína del FIX, lo que incluye dentro del péptido de activación.

Se conoce bien en la técnica que algunas proteínas pueden soportar una gran cantidad de cadenas laterales de azúcar y la distancia entre los sitios de glicosilación ligados a N puede ser tan pequeña como tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos (ver, por ejemplo, Lundin y otros, "Membrane topology ofthe Drosophila OR83b odorant receptor" FEBS Letters 581:5601-5604 (2007); Apweiler y otros, "On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis ofthe SWISS-PROT database" Biochimica et Biophysica Acta 1473:4-8 (19991).

Además, la proteína del FIX descrita en la presente descripción puede modificarse mediante mutación (por ejemplo, sustitución, adición y/o deleción de aminoácidos) para introducir sitios de glicosilación ligados a N. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos en la superficie de la proteína del FIX funcional pueden identificarse de acuerdo con métodos de modelado molecular estándar en la técnica que serían adecuados para la modificación (por ejemplo, mutación) para introducir uno o más sitios de glicosilación.

Las proteínas del FIX descritas en la presente descripción que tienen sitios de glicosilación adicionales pueden producirse mediante métodos recombinantes tales como mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de PCR. Alternativamente, la proteína del Factor IX de esta invención puede sintetizarse químicamente para preparar una proteína del Factor IX con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etcétera) sitios de glicosilación adicionales.

Está dentro de la habilidad de un experto en la técnica modificar cualquier residuo o residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos del FIX maduro de acuerdo con métodos que se conocen bien en la técnica y como se enseña en la presente descripción y evaluar cualquier proteína resultante del FIX para determinar la actividad, estabilidad, recuperación, vida media, etcétera, de acuerdo con métodos que se conocen bien y como se describe en la presente descripción (ver, por ejemplo, Elliott y otros, "Structural requirements for additional N-linked carbohydrate on recombinant human erythropoietin" J. Biol. Chem. 279:16854-62 (2004).

Como se indica en la presente descripción, se introduce al menos un sitio de glicosilación adicional en la secuencia de aminoácidos del FIX en un sitio que se encuentra fuera del péptido de activación. En algunos casos, el al menos un sitio de glicosilación adicional corresponde a un sitio que se glicosila en la forma nativa de un homólogo no humano del Factor IX. Una modificación de la secuencia de aminoácidos del FIX humano para introducir una serina o treonina en el aminoácido 262 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, que es la forma madura (es decir, secretada) del FIX humano, introduciría un sitio de glicosilación ligado a N adicional en la proteína humana. En diversos casos, el homólogo no humano es de perro, cerdo, vaca o ratón.

Una comparación de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del FIX de humanos, ratones, cobayas y ornitorrinco revela que la secuencia de aminoácidos del FIX de ratones tiene nueve aminoácidos adicionales presentes en su péptido de activación, la secuencia de aminoácidos del FIX de cobayas tiene diez residuos de aminoácidos adicionales presentes en su péptido de activación y el ornitorrinco tiene 14 residuos de aminoácidos adicionales presentes en su péptido de activación (Figura 5). Estos aminoácidos adicionales se encuentran entre los dos sitios de glicosilación de origen natural (N 157 y N 167) en el Factor IX humano.

El FIX humano y el de ratón tienen estructuras idénticas esencialmente y la enzima humana puede funcionar en el ratón. Como el FIX humano funciona sin el segmento adicional de nueve aminoácidos que se encuentra en el ratón, esta región de la molécula del Factor IX puede tolerar modificaciones dentro de su secuencia, lo que incluye inserciones, sustituciones y/o deleciones, sin una pérdida sustancial en la integridad estructural, bioquímica o de cualquier otra manera funcional de la molécula. Los nueve aminoácidos insertados en el ratón son más probablemente residuos de superficie (de acuerdo con los estudios estructurales) y por lo tanto son accesibles para la modificación mediante las enzimas de glicosilación. En el factor IX humano nativo, los dos sitios de glicosilación ligados a N están 12 y 14 aminoácidos distantes de los sitios de escisión de amino y carboxilo, respectivamente, del péptido de activación. Por lo tanto, en algunos casos, pueden añadirse residuos de aminoácidos adicionales entre N157 y N167 de la proteína del Factor IX humano de SEQ ID NO:1 para añadir sitios de glicosilación para mejorar la vida media y/o la biodisponibilidad. En diversos casos, los sitios de glicosilación se añaden por inserción, deleción y/o modificación de la secuencia nativa para incluir una secuencia de unión para secuencias de consenso para la glicosilación ligada a N.

La secuencia humana para el péptido de activación comienza en el residuo 146 de la proteína madura. Los sitios de glicosilación naturales están en N157 y N167 (SEQ ID NO:1). En algunos casos, pueden insertarse residuos de aminoácidos adicionales entre los dos sitios de glicosilación normales (entre N157 y N167 en la secuencia madura) para proporcionar sitios de glicosilación adicionales. En algunos casos, se añaden de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos adicionales. En otros casos, se añaden de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. En otros casos, se añaden de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos. En aún otros casos, se añaden de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos. Típicamente, los residuos de aminoácidos se eligen entre los 20 aminoácidos biológicos siempre y cuando la prolina no se use como "X" en el sitio de glicosilación NXT/S, que es la secuencia de consenso para la glicosilación ligada a N. La Tabla 1 muestra 20 aminoácidos biológicos comunes y sus abreviaturas.

En algunos casos, las secuencias de unión endógenas ligadas a N de ratones, humanos y otras secuencias del Factor IX de mamíferos se insertan en el péptido de activación. Estas pueden insertarse individualmente o en combinación. En ciertos casos, el segmento insertado incluye una región espaciadora entre los sitios de glicosilación, que puede presentarse individualmente, en repeticiones en tándem, en múltiples, etcétera. Una región espaciadora descrita en la presente descripción puede tener de uno a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100). En algunos casos, por ejemplo, la región espaciadora puede ser de uno a aproximadamente 20 aminoácidos. En otros casos la región espaciadora puede ser de uno a aproximadamente diez aminoácidos. En otros casos, la región espaciadora puede ser de uno a aproximadamente cinco residuos de aminoácidos.

Se incluye una región espaciadora descrita en la presente descripción entre los sitios de unión de carbohidratos añadidos y/o entre los sitios de glicosilación de origen natural y los sitios de glicosilación añadidos para reducir o eliminar el impedimento estérico y proporcionar un reconocimiento eficiente mediante la glicosiltransferasa apropiada. Una región espaciadora descrita en la presente descripción puede comprender cualquier combinación de residuos de aminoácidos, siempre y cuando no sean cisteína o prolina y siempre y cuando la secuencia de aminoácidos del espaciador no tenga más de aproximadamente 10 % de residuos que son hidrófobos (por ejemplo, triptófano, tirosina, fenilalanina y valina).

En algunos casos, se incorpora NXT/S en la secuencia de aminoácidos insertada para añadir uno o más sitios de glicosilación adicionales. "X" puede ser cualquier aminoácido biológico, excepto que se desfavorece la prolina. En algunas modalidades, se añade al menos un sitio de glicosilación adicional a la proteína del Factor IX. En otras modalidades, se añaden dos sitios de glicosilación adicionales. En modalidades adicionales, se añaden tres sitios de glicosilación adicionales. En aún otras modalidades, se añaden cuatro sitios de glicosilación adicionales. En modalidades adicionales, se añaden cinco sitios de glicosilación adicionales. En algunas modalidades, se añaden seis sitios de glicosilación adicionales. En otras modalidades, se añaden más de seis sitios de glicosilación adicionales.

En un caso, la Ala en la posición 161 de la secuencia de aminoácidos del FIX maduro (SEQ ID NO:1) se reemplaza con Asn para proporcionar un sitio de glicosilación adicional. En otro caso, la secuencia VFIQDNITD (SEQ ID NO:8) se inserta entre los residuos 161 y 162 de la secuencia de aminoácidos del FIX humano maduro de SEQ ID NO:1 para introducir un sitio de glicosilación ligado a N en la secuencia del FIX humano. En aún otro caso, se añade otro sitio de glicosilación nuevo mediante el reemplazo de Asp con Asn en el inserto VFIQDNITD. La secuencia insertada daría VFIQDNITN (SEQ ID NO:9). Los casos analizados anteriormente podrían combinarse para proporcionar de uno a cuatro sitios de glicosilación adicionales en la proteína del Factor IX humano.

La proteína del Factor IX, el ácido nucleico, el vector y/o la célula de esta invención pueden incluirse en una composición farmacéutica. Algunas modalidades se dirigen a un kit que incluye la proteína del Factor IX de esta invención. La proteína del Factor IX de esta invención puede usarse para tratar un trastorno hemorrágico mediante la administración de una cantidad eficaz de la proteína del Factor IX a un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) que necesita de esto. Por lo tanto, la presente invención proporciona, además, el uso de la proteína del Factor IX, la molécula de ácido nucleico, el vector y/o la célula de esta invención para el tratamiento de un trastorno hemorrágico. Los trastornos hemorrágicos que pueden tratarse de acuerdo con los usos de esta invención incluyen una deficiencia del FIX, hemofilia B y la enfermedad de Christmas. Dichos protocolos de tratamiento y regímenes de dosificación para administrar o suministrar el Factor IX a un sujeto que necesita de esto se conocen bien en la técnica.

Técnicas de Ingeniería Genética

Se conoce bien la producción de genes clonados, ADN recombinante, vectores, células huésped transformadas, proteínas y fragmentos de proteínas mediante ingeniería genética. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Núm. 4,761,371 de Bell y otros de la columna 6, línea 3 a la columna 9, línea 65; Patente de Estados Unidos Núm. 4,877,729 de Clark y otros de la columna 4, línea 38 a la columna 7, línea 6; Patente de Estados Unidos Núm. Núm. 4,912,038 de Schillingde la columna 3, línea 26 a la columna 14, línea 12; y la Patente de Estados Unidos 4,879,224 de Wallner de la columna 6, línea 8 a la columna 8, línea 59.

Las células huésped procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Escherichia coli (E. coli) o bacilos. Las células superiores eucariotas incluyen líneas celulares establecidas de origen de mamíferos, como se describe a continuación. Las células huésped ilustrativas son E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli B, E. coliX1776 (ATCC 31,537) y E. coli 294 (ATCC 31,446). Se dispone de una amplia variedad de vectores procariotas y microbianos adecuados. La E. coli se transforma típicamente mediante el uso de pBR322. Los promotores usados más comúnmente en los vectores de expresión microbiana recombinante incluyen los sistemas promotores de betalactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang y otros, Nature 275:615 (1978); y Goeddel y otros, Nature 281:544 (1979)), un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) y Solicitud de Publicación EPO Núm. 36,776) y el promotor tac (De Boer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80:21 (1983)). El promotor y la secuencia Shine-Dalgarno (para la expresión del huésped procariota) se unen operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX, es decir, se colocan para promover la transcripción del ARN mensajero del Factor IX a partir del ADN.

Las secuencias de codificación clonadas descritas en la presente descripción pueden codificar el FIX de cualquier especie de origen, lo que incluye ratones, ratas, perros, zarigüeyas, conejos, gatos, cerdos, caballos, ovejas, vacas, cobayas, zarigüeyas, ornitorrincos y humanos, pero codifican, preferentemente, la proteína del Factor IX de origen humano. Además, se abarca el ácido nucleico que codifica el Factor IX que puede hibridarse con el ácido nucleico que codifica las proteínas descritas en la presente descripción. La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida o incluso en condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones rigurosas como las representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, SDS al 0,1 % a 60 °C o incluso 70 °C) al ácido nucleico que codifica la proteína del Factor IX descrita en la presente descripción en un ensayo de hibridación in situ estándar. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2da Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory).

Las proteínas del FIX producidas de acuerdo con la invención pueden expresarse en animales transgénicos no humanos mediante métodos conocidos. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 6,344,596. En resumen, los animales transgénicos no humanos pueden incluir, pero no se limitan a, animales de granja (por ejemplo, cerdos, cabras, ovejas, vacas, caballos, conejos y similares) roedores (tales como ratones, ratas y cobayas), y mascotas domésticas (por ejemplo, gatos y perros). Se prefiere particularmente, en algunas modalidades, ganado animal, tal como cerdos, ovejas, cabras y vacas.

El animal transgénico no humano de esta invención se produce mediante la introducción en un embrión no humano de células individuales un polinucleótido apropiado que codifica una proteína del Factor IX humano de esta invención de manera que el polinucleótido se integra establemente en el ADN de las células de la línea germinal del animal maduro, y se hereda del modo Mendeliano normal. El animal transgénico no humano de esta invención tendría un fenotipo de producir la proteína del FIX en fluidos corporales y/o tejidos. La proteína del FIX se extraería de estos fluidos y/o tejidos y se procesaría, por ejemplo, para su uso terapéutico. (Ver, por ejemplo, Clark y otros, "Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep" Bio/Technology 7:487-492 (1989); Van Cott y otros, "Haemophilic factors produced by transgenic livestock: abundance can enable alternative therapies worldwide" Haemophilia 10(4):70-77 (2004).

5,523,222.

Pueden obtenerse animales transgénicos no humanos productores del Factor IX mediante la introducción de un constructo quimérico que comprende secuencias que codifican el Factor IX. Se conocen bien los métodos para obtener animales transgénicos. Ver, por ejemplo, Hogan y otros, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort y otros, Bio/Technology 9:88 (1991); Palmiter y otros, Cell 41:343 (1985), Kraemer y otros, GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammery otros, Nature 315:680 (1985); Wagner y otros, Patente de Estados Unidos 5,175,385; Krimpenfort y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 5,175,384, Janne y otros, Ann. Med. 24:273 (1992), Brem y otros, Chim. Oggi. 11:21 (1993), Clark y otros, Patente de Estados Unidos Núm. 5,476,995.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. (Ejemplo comparativo)

Resumen de la invención. El Factor IX (FIX) tiene una vida media inusual; alrededor del 50-70 % desaparece de la circulación dentro de ~ 5 minutos después de la inyección. En la práctica, la vida media se calcula a partir de la segunda disminución exponencial del FIX que permanece en circulación. Este estudio muestra que el FIX protege a ratones con hemofilia B del sangrado después de que sus niveles en sangre están más abajo del 1 %. Se cree que este efecto protector se debe a la unión del FIX específica y reversiblemente al colágeno tipo IV y que aún se encuentra disponible para la coagulación a pesar de que ha desaparecido de la sangre. Consistente con esto, el FIXK5R, que se une más estrechamente al colágeno tipo IV que el FIXK5A, protege mejor 7 días después de la inyección que como lo hace el FIXK5A.

Este estudio demuestra una correlación entre la afinidad del FIX por el colágeno tipo IV y su capacidad para proteger a ratones con hemofilia B del sangrado mediante un modelo de sangrado por la vena safena.

Modelo de sangrado por la vena safena. En este estudio se usaron ratones con fondo C57BL/6 con hemofilia B de seis a ocho semanas de edad. Las proteínas variantes del FIX se inyectaron en ratones a través de la vena de la cola con una dosis de 0,9 ug/g de peso corporal. Después de 7 días, se realizó el modelo de sangrado por la vena safena. Brevemente, los ratones se anestesiaron con Avertin al 2,5 % y se realizó una incisión longitudinal en la vena safena izquierda. La sangre se evacuó suavemente con un papel tisú hasta que se produjo la hemostasia. Después, el coágulo se rompió y la sangre se evacuó de nuevo hasta que se produjo la hemostasia. La ruptura del coágulo se repitió después de cada incidencia de hemostasia durante 30 minutos después de la lesión inicial. Se registró el número de rupturas del coágulo observadas para cada ratón.

Los datos proporcionados en la presente descripción muestran que, no solo el FIXK5R protege durante más tiempo de lo que cabría esperar de su vida media, sino que el FIXWT protege, además, a ratones con hemofilia B del sangrado durante mucho más tiempo de lo que cabría esperar de su vida media observada. La Figura 1 muestra que los ratones inyectados con el FIX humano todavía se protegen significativamente contra el sangrado siete días después de la inyección. El potencial de coagulación se evalúa mediante la medición del número de rupturas del coágulo para cada ratón. Esta protección se presenta a pesar del hecho de que la vida media del FIX humano en ratones con hemofilia B es de aproximadamente 7 horas; esto significa que han transcurrido 24 vidas medias desde la inyección, y que el nivel del FIX circulante es inferior al 1 % desde ~el día 2,5.

Además, en la Figura 1 puede verse que después de 7 días, el FIXK5R protege mejor significativamente a ratones con hemofilia del sangrado que el FIXK5A (P <0,05, prueba t no pareada). El FIXK5R se une al colágeno tipo IV más fuertemente que el FIXWT, mientras que FIXK5A tiene una afinidad muy reducida al colágeno.

En resumen, la cantidad del FIX medida en sangre es mucho menor que la cantidad total del FIX disponible para la coagulación. Además, el FIX protege del sangrado mucho más tiempo de lo que cabría esperar basado en su vida media medida.

Ejemplo 2.

La secuencia de ADN del FIX 24 optimizado en codón con sitios de glicosilación adicionales se sintetizó por Blueheron Biotech, LLC. La secuencia sintetizada se insertó en el vector pDEF38 y se transfectó en células CHO DG44. Los clones individuales se escogieron por CDI Bioscience, Inc. Se recolectó el medio acondicionado de estos clones y se examinó mediante transferencia de Western con anticuerpo anti-FIX.

Como se muestra en la Figura 2, con la adición de más sitios de glicosilación, el tamaño del FIX aumenta. El FIX 24 tiene el mayor peso molecular. Las proteínas del Factor IX modificadas de esta invención se usarán en estudios de vida media en ratones y en perros, de acuerdo con protocolos conocidos. Las proteínas del Factor IX de esta invención se evaluarán, además, en un estudio de modelo por vena safena en ratones durante períodos de tiempo más largos (por ejemplo, 3 semanas) para determinar cuánto tiempo las proteínas protegen a los ratones. La tasa de activación de las proteínas del Factor IX modificadas se determinará por el FVIIa-TF y por el factor Xia. Además, se determinarán las actividades específicas, así como también el estado de glicosilación y carboxilación, de acuerdo con métodos conocidos.

Ejemplo 3.

Los datos proporcionados en la presente descripción muestran que, no solo el FIXK5R protege durante más tiempo de lo que cabría esperar de su vida media, sino que el FIXWT protege, además, a ratones con hemofilia B del sangrado durante mucho más tiempo de lo que cabría esperar de su vida media observada. La Figura 3 muestra que los ratones inyectados con el FIX humano todavía se protegen significativamente contra el sangrado siete días después de la inyección. El potencial de coagulación se evalúa mediante la medición del número de rupturas del coágulo para cada ratón. Esta protección se presenta a pesar del hecho de que la vida media del FIX humano en ratones con hemofilia B es de aproximadamente 7 horas; esto significa que han transcurrido 24 vidas medias desde la inyección, y que el nivel del FIX circulante es inferior al 1 % desde ~el día 2,5.

Además, en la Figura 3 puede verse que después de 7 días, el FIXK5R protege mejor significativamente a ratones con hemofilia del sangrado que el FIXK5A (P <0,05, prueba t no pareada). El FIXK5R se une al colágeno tipo IV más fuertemente que el FIXWT, mientras que FIXK5A tiene una afinidad muy reducida al colágeno.

Los estudios que se describen en la presente descripción se diseñaron para evaluar si el FIX infundido podría proteger a ratones con hemofilia B del sangrado por más tiempo de lo esperado basado en la vida media y si el FIX^ksrprotege mejor que el FIX^ksa. La Figura 3 revela que el FIX infundido protege mucho más tiempo de lo que se predeciría por su vida media; por lo tanto, existe una buena protección 7 días después de la inyección, aun cuando los niveles plasmáticos de todas las moléculas del FIX infundidas estuvieron más abajo del uno por ciento hacia el día 3 después de la infusión. Estos resultados demuestran que el FIX unido al colágeno IV extravascular, proporciona una función coagulante importante en ausencia del FIX circulante. Además, existe un claro gradiente de protección que se correlaciona con la afinidad de las moléculas por el colágeno IV.

Para el FIX, la vida media terminal (p) se considera generalmente el parámetro relevante, mientras que la vida media de distribución (a) se ignora. El objetivo de la profilaxis en pacientes con hemofilia B grave es mantener niveles mínimos de actividad del FIX en la circulación por encima del 1 %.

En conclusión, en la presente descripción se proporciona evidencia de que el FIX previene eficazmente el sangrado incluso después de que su nivel en sangre ha estado muy por debajo del uno por ciento durante varios días. Además, siete días después de una infusión en bolo, una variante del FIX que se une más fuertemente al colágeno IV proporciona una protección hemostática mejor significativamente en ratones con hemofilia B que una molécula de FIX con menor afinidad por el colágeno IV. Esto demuestra que la unión al colágeno IV por el FIX proporciona un reservorio extravascular más duradero del FIX en una ubicación funcional hemostáticamente. Además, estos resultados sugieren que un enfoque terapéutico limitado al aumento de la vida media plasmática terminal del FIX solo a expensas de su distribución tisular puede no ser el enfoque óptimo para el tratamiento de la hemofilia B.

Ejemplo 4.

Con la adición de más sitios de glicosilación, el tamaño del FIX aumenta. Las proteínas del Factor IX modificadas de esta invención se usarán en estudios de vida media en ratones y en perros, de acuerdo con protocolos conocidos. Las proteínas del Factor IX de esta invención se evaluarán, además, en un estudio de modelo por vena safena en ratones durante períodos de tiempo más largos (por ejemplo, 3 semanas) para determinar cuánto tiempo las proteínas protegen a los ratones. La tasa de activación de las proteínas del Factor IX modificadas se determinará por el FVIIa-TF y por el factor Xia. Además, se determinarán las actividades específicas, así como también el estado de glicosilación y carboxilación, de acuerdo con métodos conocidos.

La invención se define mediante las siguientes reivindicaciones, donde se incluyen los equivalentes de las reivindicaciones.

Tabla 1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína del Factor IX (FIX) aislada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, en donde Xaa es leucina.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína del FIX aislada de conformidad con la reivindicación 1.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5

4. Un vector o célula transformada que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2.

5. Un animal transgénico no humano que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2 o el vector o célula transformada de conformidad con la reivindicación 4.

6. La proteína del Factor IX aislada de conformidad con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico, seleccionada opcionalmente del grupo que consiste en una deficiencia del FIX, hemofilia B y enfermedad de Christmas.

7. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico, seleccionada opcionalmente del grupo que consiste en una deficiencia del FIX, hemofilia B y enfermedad de Christmas.

El vector o célula transformada de conformidad con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico, seleccionado opcionalmente del grupo que consiste en una deficiencia del FIX, hemofilia B y enfermedad de Christmas.