ES2745599T3 - Partículas no replicantes derivadas de rhabdovirus, y sus usos - Google Patents

Abstract

Una partícula no replicante derivada de Rhabdovirus para uso en el tratamiento de leucemia, en el que la partícula es capaz de unirse a la superficie de una célula y ser internalizada, y en el que dicha partícula derivada de Rhabdovirus comprende un polinucleótido de ARN, cuya estructura de ARN está reticulada o escindida para formar segmentos discontinuos de ARN.

Description

DESCRIPCIÓN

Partículas no replicantes derivadas de rhabdovirus, y sus usos

CAMPO

La presente descripción se refiere, en general, a una partícula no replicante derivada de virus, y a su uso como un agente anticanceroso.

ANTECEDENTES

El siguiente análisis de antecedentes no implica o no significa la admisión de que algo de lo que se describe a continuación forme parte de la técnica anterior o de los conocimientos de los expertos en la técnica en cualquier país.

Los virus oncolíticos (OV) han sido diseñados a través de la atenuación de mutaciones o supresiones que permiten que el virus se replique exclusivamente en las células que están asociadas con una respuesta inmunitaria deteriorada o una actividad metabólica intensificada, que son dos características claves de la tumorigénesis. Ejemplos de agentes terapéuticos oncolíticos avanzados actuales incluyen el Virus del Herpes Simple OncoVEXGM-CSF y el virus de la vacuna (JX594). Hasta la fecha, el campo de los Ov ha estado enfocado principalmente al desarrollo de plataformas en las que el virus vivo tiene una capacidad de replicación/propagación preferente dentro del entorno local del tumor.

Actualmente los rhabdovirus (RV), tales como el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y el virus Maraba, están siendo estudiados como agentes terapéuticos anticancerosos. En los tumores, la propagación vírica es precipitada por actividades metabólicas descontroladas y programas antivirales disfuncionales. La susceptibilidad tumoral al tratamiento con RV es aún mayor debido a la predisposición hacia la apoptosis mediada por virus.

En el área de los Rhabdovirus, las plataformas oncolíticas desarrolladas hasta la fecha usan un virus competente para la replicación en las que el virus se propaga entre las células tumorales. De hecho, los informes que describen el uso de rhabdovirus vivos competentes para la replicación/expresión como una viroterapia directa para el cáncer normalmente comparan la eficacia con controles de virus que no se replican/expresan, en los que no se observa una eficacia medible. En estos informes, se concluye que la replicación y/o expresión del genoma del Rhabdovirus es un componente crítico y esencial de la citotoxicidad tumoral y la eficacia terapéutica.

La falta de efectos oncolíticos en estos estudios previos se refleja en los métodos usados para interrumpir la replicación y/o expresión del genoma del virus, así como en el número de partículas de virus usadas. De hecho, cuando se usan los métodos anteriores para interrumpir la replicación y/o expresión del genoma del virus, no se observa ninguna bioactividad del virus. Además, en estos estudios, se aplican como controles de virus no replicantes en la misma dosis que sus virus homólogos vivos, y no a dosis más altas para asegurar que cada célula encuentre una partícula no replicante.

Se desean enfoques alternativos, y preferentemente más efectivos, para tratar y curar la mayoría de las formas de cáncer. Por ejemplo, el desenlace para la mayoría de los pacientes adultos que sufren de leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide aguda sigue siendo sombrío. Esto es en parte debido a la naturaleza significativamente inmunodeprimida de la enfermedad. Para la minoría de los pacientes, las respuestas inmunitarias antitumorales son parcialmente restauradas a través del trasplante alogénico de células madre tras el acondicionamiento mieloablativo. Esta terapia es potencialmente curativa; sin embargo, está asociada con frecuentes eventos adversos y una significativa mortalidad relacionada con el tratamiento. Para muchos pacientes con leucemia mieloide crónica (CML) en fase crónica, la terapia con inhibidores de tirosina cinasas (TKI) específicos ofrece un control excelente de la enfermedad. Sin embargo, cuando la leucemia evoluciona en crisis blásticas de leucemia aguda, existen opciones terapéuticas muy limitadas debido al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos y a la rápida cinética de esta forma de leucemia recalcitrante.

Por lo tanto, existe la necesidad de agentes anticancerosos alternativos, en particular para pacientes inmunodeprimidos. El agente anticanceroso, en virtud de su diseño y sus componentes, sería preferentemente capaz de abordar las necesidades clínicas actualmente no satisfechas y/o superar al menos algunos de los problemas anteriormente discutidos.

SUMARIO

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Si bien para tratar una variedad de distintos tipos de tumores se han empleado estrategias relacionadas con OV vivos, su aplicación en neoplasias hematopoyéticas, en particular, se vuelve complicada por varios factores. La producción limitada de viriones y la reducida propagación entre las células leucémicas requiere la aplicación de terapia viral de altas dosis para superar estas ineficiencias. Sin embargo, la propagación incontrolada del virus vivo y los efectos inespecíficos sobre el tejido normal comprometen la seguridad de este enfoque, especialmente en pacientes inmunodeprimidos.

Los problemas asociados con el uso de virus vivos incluyen: 1) la seguridad, que depende de la capacidad del Rhabdovirus vivo para propagarse solamente en el tejido tumoral enfermo, dejando el tejido sano solo; 2) dosis bajas de administración, ya que la introducción en un paciente de virus vivos con capacidad de propagarse hace necesaria la administración de dosis relativamente bajas de estos agentes virales vivos para garantizar la seguridad; 3) la desviación de la respuesta inmunitaria del tumor hacia el virus vivo, lo que disminuye efectivamente la eficiencia de las respuestas inmunitarias antitumorales; y 4) los virus vivos diseñados genéticamente para presentar proclividad hacia tumores a menudo tienen una capacidad productiva disminuida en comparación con el virus de tipo silvestre, y, en consecuencia, la eficiencia en la formulación y los costes de producción son sub-óptimos desde la perspectiva de la fabricación.

Se ha mostrado previamente que la inyección intra-tumoral con VSV diseñado de manera que presenta una deleción del gen de la glicoproteína (VSVDG) que impide el ensamblaje final del virión y su propagación, provoca respuestas inmunitarias antitumorales. Sin embargo, el tratamiento con VSVDG no puede proporcionar una reducción significativa de la masa tumoral diseminada, debido, en parte, a la incapacidad para fabricar y suministrar las dosis terapéuticamente efectivas.

Los autores son conscientes de no hay informes que detallen el uso de una plataforma derivada de Rhabdovirus que no sea capaz de replicarse ni de expresarse como un agente terapéutico anticanceroso. Las partículas no replicantes derivadas de virus (NVRP) de la presente descripción, y las partículas no replicantes derivadas de rhabdovirus (NRRP), en particular, son partículas de virus de tipo silvestre modificadas de tal manera que carecen de la capacidad de propagarse entre las células. Una vez modificada, la partícula no replicante derivada de virus (NVRP) no puede mantener la replicación del virión.

Las NVRPs son únicas por el hecho de que conservan el tropismo, tal como el tropismo citolítico, frente a células inmortalizadas. Esto significa que las NVRPs inducirán la muerte celular preferentemente en células inmortalizadas tales como células tumorales o cancerosas y células inmortalizadas transformadas. Ejemplos específicos de NVRPs tienen propiedades inmunoestimulantes innatas y/o adaptativas contra células inmortalizadas.

En un aspecto, la presente descripción describe una partícula no replicante derivada de rhabdovirus que carece de la capacidad para propagarse entre las células mientras que tiene tropismo frente a células inmortalizadas. El tropismo puede ser un tropismo citolítico. La partícula no replicante derivada de rhabdovirus puede tener propiedades inmunoestimulantes innatas y/o adaptativas contra células inmortalizadas.

En todavía otro aspecto, la presente descripción proporciona un uso de una partícula no replicante derivada de rhabdovirus para tratar una población de células hiperproliferativas o células cancerosas. La población de células hiperproliferativas es preferentemente de naturaleza hematopoyética, y preferentemente son células leucémicas. La población de células hiperproliferativas pueden ser células de tumores sólidos.

En todavía otro aspecto, la presente descripción describe tratar un paciente que tiene una población de células hiperproliferativas o células cancerosas, que incluye administrar al paciente partículas no replicantes derivadas de rhabdovirus. La población de células hiperproliferativas puede ser preferentemente de naturaleza hematopoyética, preferentemente células leucémicas. La población de células hiperproliferativas pueden ser células de tumores sólidos.

Otros aspectos y características de la presente descripción serán evidentes para los expertos normales en la técnica tras revisar la siguiente descripción de realizaciones específicas en conjunto con las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las realizaciones de la presente descripción se describirán ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas.

La Fig. 1A es una gráfica que muestra el impacto de la dosis UV sobre la citotoxicidad mediada por NRRP en células Vero y HDFN. No se detectó señal de GFP después de la generación de NRRP inducida por UV. La viabilidad se cuantificó usando el ensayo con resazurina 72 h después de la infección. La MOI de este experimento se fijó en 100 partículas por célula. Las barras de error representan la desviación estándar entre los experimentos por triplicado.

La Fig. 1B es una gráfica que muestra el impacto de la MOI sobre la citotoxicidad inducida por NRRPs en células Vero y HDFN como se ilustra por la viabilidad como una función de la MOI. La viabilidad se cuantificó usando el ensayo con resazurina 72 h después de la infección. Las barras de error representan la desviación estándar entre los experimentos por triplicado.

La Fig. 2A es un conjunto de imágenes que muestra la citotoxicidad de las NRRPs sobre células Vero inmortalizadas a través de imágenes de microscopía de fluorescencia y de campo claro de células Vero tratadas con PBS, VSV-GFP vivo o NRRPs, tomadas 24 y 72 horas después de la infección o después del tratamiento. La multiplicidad de infección (MOI) usada en estos experimentos se fijó en 100 partículas por célula.

La Fig. 2B es una gráfica que muestra la citotoxicidad de las NRRPs a través de la cuantificación de la viabilidad celular con resazurina 72 h después del tratamiento. Las barras de error representan la desviación estándar entre los experimentos por triplicado.

La Fig. 2C es una gráfica que muestra los títulos virales producidos. NAN significa “no como un número”, ya que no se detectaron viriones.

La Fig. 3A es un conjunto de imágenes de microscopía fluorescente (4X) de células leucémicas (L1210) y células Vero tratadas con p Bs , virus Maraba vivo y NRRPs derivadas del virus Maraba. Las imágenes fueron tomadas 24 h después del tratamiento.

La Fig. 3B es una gráfica que muestra los títulos virales obtenidos de células tumorales.

La Fig. 3C es una gráfica que muestra la cuantificación con resazurina de la viabilidad celular de células leucémicas L1210 y células normales HDF, 72 h después de la infección.

La Fig. 4A es un conjunto de imágenes que muestran imágenes fluorescentes de células L1210 y Vero tratadas con PBS, VSV-GFP vivo, o NRRPs.

La Fig. 4B es una gráfica que muestra los títulos virales generados por células de leucemia aguda L1210 y células inmortalizadas Vero.

La Fig. 5 es una imagen de una transferencia Western de la expresión del genoma de NRRP comparada con la expresión del genoma de un virus expuesto a una dosis UV de 20.000 mJ/cm2, en la que se observó pérdida de citotoxicidad, y un virus vivo como un control. La referencia a 1x o 2x da cuenta de la cantidad de proteína cargada en el gel. Las proteínas se extrajeron 15 h después de la infección.

La Fig. 6A es un conjunto de imágenes fluorescentes y de campo claro de células Vero tratadas con NRRPs generadas químicamente o generadas con busulfán.

La Fig. 6B es una imagen de microscopía de campo claro de células Vero tratadas con busulfán solo, a la misma dosis usada para generar NRRPs en la Fig. 6A, durante 15 horas.

La Fig. 6C es un conjunto de imágenes fluorescentes y de campo claro de células Vero tratadas con VSV-GFP vivo. La Fig. 7A es un conjunto de imágenes de campo claro y de fluorescencia de células Vero tratadas con NRRPs, generadas tomando 1E10 de VSV congelado de tipo silvestre e irradiando esta preparación con 15 kGy de cobalto-60.

La Fig. 7B es un conjunto de imágenes de campo claro y de fluorescencia de células Vero tratadas con VSV-GFP vivo de tipo silvestre.

La Fig. 7C es un conjunto de imágenes de campo claro y de fluorescencia de células Vero en PBS.

La Fig. 8A es un conjunto de imágenes de campo claro de células L1210 y HDF tratadas con PBS o NRRPs a una MOI de 100.

La Fig. 8B es una gráfica que muestra la cuantificación de viabilidad con resazurina en líneas celulares de leucemia y normales. Las líneas celulares murinas se indican mediante un *.

La Fig. 8C es un conjunto de imágenes de microscopía de fluorescencia de tratamientos con PBS, VSV-GFP vivo, o NRRP en líneas celulares de leucemia aguda murina de células T Jurkat humanas, leucemia linfoblástica murina de células B A20, leucemia linfoblástica de células T A301, y leucemia promielocítica aguda HL60, y líneas celulares normales GM38 y HDF.

La Fig. 9 es un conjunto de gráficas que muestra el análisis de citometría de flujo de tinción con Anexina V-APC y 7-AAD de células L1210 tratadas con PBS o NRRPs.

La Fig. 10 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de leucemia aguda L1210 tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con bendamustina (300 mM).

La Fig. 11 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de leucemia aguda L1210 tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con dexametasona (45 mM).

La Fig. 12 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de leucemia aguda L1210 tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRP generadas por UV con doxorrubicina (0,025 mM).

La Fig. 13 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de leucemia aguda L1210 tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con vincristina (0,0125 pM).

La Fig. 14 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular K562 de leucemia mieloide Ph positiva tomada 15 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con idarrubicina (0,05 pM).

La Fig. 15A es una ilustración de un modelo fenómenológico desarrollado por Le Boeuf et al. para simular la citotoxicidad de las NRRPs en células normales y en tumores con defectos en las rutas de señalización antivirales. Para describir la cinética de las NRRPs, se modificó el modelo original eliminando la replicación del virus (X). Las líneas discontinuas describen los defectos de IFN asociados con células tumorales.

La Fig. 15B es una gráfica que muestra la relación simulada entre los defectos en la ruta de señalización antiviral y la viabilidad después del tratamiento con NRRPs a las 72 horas.

La Fig. 15C es una gráfica que muestra la relación in vitro entre la MOI y la viabilidad 72 h después de la infección con NRRPs en células HDF normales en presencia o ausencia de IFN.

La Fig. 15D es una gráfica que muestra la relación in vitro entre la MOI y la viabilidad 72h después del tratamiento con NRRPs en células L1210 leucémicas en presencia o ausencia de iFn.

La Fig. 16A es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro de dos muestras de pacientes con crisis blástica de leucemia mieloide crónica tratadas con PBS o NRRPs.

La Fig. 16B es un conjunto de imágenes de microscopía fluorescente (4X) de leucemia aguda (crisis blástica de CML) procedente de muestras de sangre periférica de pacientes humanos. Las muestras enriquecidas en leucemia se obtuvieron de sangre periférica tratada con PBS, VSV-GFP vivo, o NRRPs codificadas para GFP. Las imágenes se obtuvieron 24 h después de la infección a una MOI = 100.

La Fig. 16C es un diagrama de citometría de flujo que complementa los datos presentados en las Fig. 16A y 16C de tinción con Anexina-V y CD33 en dos muestras de pacientes en crisis blástica de CML tratadas con PBS o NRRPs (MOI = 100) 48h después del tratamiento. La población blástica CD33+ fue enriquecida mediante cultivo a largo plazo de las células.

La Fig. 16D son gráficos que muestran análisis de citometría de flujo de la tinción con CD33 en las dos muestras de pacientes con crisis blástica de CML tratadas con PBS o NRRPs.

La Fig. 17A es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro de una muestra de médula ósea sana tratada con PBS o NRRPs durante 18 horas.

La Fig. 17B es una gráfica que muestra la cuantificación de la tinción con Anexina-V en la muestra de médula ósea sana tratada con PBS o NRRPs durante 65 horas.

La Fig. 18A es una gráfica que muestra la curva de supervivencia en un modelo murino de tratamiento de crisis blástica. Después de la exposición a L1210 en ratones en el día 1, los ratones recibieron tres dosis diarias de NRRPs o PBS.

La Fig. 18B es un conjunto de gráficas que muestran la cuantificación basada en Luminex de citocinas inducidas por NRRPs en ratones portadores de L1210 durante crisis blásticas agudas. Todas las citocinas identificadas fueron inducidas más de 2 veces en ratones tratados con NRRP, y son estadísticamente significativas (prueba de la t no pareada pV <0,05). pV se ha corregido para tener en cuenta el ensayo de múltiples hipótesis (Método de Benjamini y Hochberg).

La Fig. 19 es una gráfica que muestra la curva de supervivencia en un modelo murino inmunocompetente de apoptosis inmunogénica. Antes de la exposición a L1210 en el día 1, los ratones recibieron tres dosis semanales de células L1210 irradiadas con radiación g, incubadas o no incubadas con NRRPs.

La Fig. 20 es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro de líneas celulares de mieloma MPC-11 y RPMI-8226 tomadas 15 h después del tratamiento con PBS o NRRPs. Las NRRPs fueron administradas a una MOI = 250, una dosis que se determinó previamente no tenía ningún impacto en la viabilidad de células normales.

La Fig. 21 es una gráfica que muestra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para líneas celulares de mieloma MPC-11 y RPMI-8226, tomada 15 horas después del tratamiento con NRRPs administradas a una MOI 250. SR4987 es una línea celular de células estrómicas de médula ósea normal.

La Fig. 22 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de mieloma múltiple MPC-11, tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con melfalán (20 pM).

La Fig. 23 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de mieloma múltiple MPC-11, tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con el compuesto mimético del segundo activador de caspasa derivado de la mitocondria (SMAC), LCL161 (15 pM).

La Fig. 24 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de mieloma múltiple RPMI-8226, tomada 72 horas después del tratamiento con NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con carfilzomib (5 nM).

La Fig. 25A es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro de una línea celular de glioblastoma de tumor cerebral tardío (DBT) en ratón, tomadas 24 horas después del tratamiento con PBS o NRRPs.

La Fig. 25B es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro de una línea celular de astrocitoma (K1491), tomadas 24 horas después del tratamiento con PBS o NRRPs.

La Fig. 25C es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro de una línea celular de glioma de ratón (GL261), tomadas 24 horas después del tratamiento con PBS o NRRPs.

La Fig. 26 es una gráfica que muestra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para las líneas celulares de cáncer cerebral DBT, K1491, K1492, CT2A, y GL261 con respecto al control normal HDFN.

La Fig. 27 es una gráfica que ilustra la viabilidad celular después de un ensayo de cuantificación con resazurina para la línea celular de glioblastoma CT2A, tomada 72 horas después del tratamiento con las NRRPs generadas por UV, y el efecto combinatorio de las NRRPs generadas por UV con el inhibidor de HDAC SAHA (10 pM).

La Fig. 28A es un conjunto de imágenes de microscopía fluorescente (4X) de la citotoxicidad mediada por NRRP sobre células tumorales en líneas celulares resistentes de tumores sólidos. El conjunto de imágenes muestra células cancerosas mamarias o de mama de ratón (4T1) y riñón humano (786-0) tratadas con PBS, VSV vivo y NRRPs. Las imágenes fueron tomadas 24 h después de la infección.

La Fig. 28B es un conjunto de imágenes de microscopía de campo claro, tomadas 72 h después de la infección, de la citotoxicidad de células tumorales mediada por NRRP en líneas celulares resistentes de tumores sólidos, en células cancerosas de mama (4T1) y riñón (786-0) tratadas con PBS, VSV vivo y NRRPs.

La Fig. 28C es una gráfica que muestra la cuantificación con resazurina de la viabilidad celular en líneas celulares resistentes de tumores sólidos, de células cancerosas de mama (4T1) y riñón (786-0) tratadas con PBS, VSV vivo y NRRPs, 72 h después de la infección.

La Fig. 29 es una gráfica que ilustra la ventaja en la supervivencia en el cáncer de colon subcutáneo CT-26 tratado con 2E9 de NRRPs generadas por UV en los días 16, 18 y 21 después de la implantación del tumor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En general, la presente descripción proporciona una partícula no replicante derivada de virus y su uso como un agente anticanceroso. Una partícula no replicante derivada de virus (NRVP) es una partícula derivada de un virus que es capaz de unirse y ser internalizada por una célula, pero que ha sido modificada para evitar la formación, o reducir sustancialmente la formación, de nuevas partículas de virus cuando la NRVP está en la célula. Un ejemplo de una NRVP es una partícula no replicante derivada de rhabdovirus (NRRP).

La NRVP incluye: una envoltura que tiene un número suficiente de proteínas G funcionales en la superficie de la envoltura para permitir que la partícula derivada de virus se una a la superficie de una célula y sea internalizada. También incluye un polinucleótido de ARN con una secuencia que codifica todas las proteínas necesarias para el ensamblaje de nuevas partículas virales, y una mezcla de proteínas que forman una estructura alrededor del polinucleótido de ARN. Sin embargo, la estructura del ARN de la NRVP está suficientemente reticulada o se ha escindido de tal manera que forma segmentos discontinuos de ARN, de modo que el genoma de la NRVP no puede ser usado para producir las proteínas necesarias para la formación de nuevo virus. Por ejemplo, cuando la partícula está en una célula, la secuencia de ARN no puede ser transcrita en ARNm, traducida en proteína, o ambas. El deterioro o la falta de transcripción y/o traducción significa que se producen insuficientes proteínas en la célula, y no se pueden ensamblar nuevas partículas virales.

La proteína G funcional puede tener una secuencia que incluye la SEQ ID NO: 1, que se muestra a continuación, que es la secuencia del péptido maduro de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular Indiana. Esta proteína G funcional tiene número de acceso NCBI NP 955548.1.

kftivfphnq kgnwknvpsn yhycpsssdl nwhndlígta iqvkmpkshk aiqadgwinch

askwvttcdf rwygpkyítq sirsftpsve qckesieqtk qgtwlnpgfp pqscgyatvt

daeavivqvt phhvlvdeyt gewvdsqfin gkcsnyicpt vhnsttwhsd ykvkglcdsn

lismditffs edgelsslgk egtgfrsnyf ayetggkack mqyckhwgvr lpsgvwfema

dkdlfaaarf pecpegssis apsqtsvdvs liqdverild yslcqetwsk iraglpispv

dlsylapknp gtgpaftíin gtlkyfetry irvdiaapil srmvgmisgt tterelwddw

apyedveigp ngvlrtssgy kfplymighg mldsdlhlss kaqvfehphi qdaasqlpdd

eslffgdtgl sknpielveg wfsswkssia sfffiiglii glflvlrvgi hlciklkhtk

krqiytdiem nrlgk (SEQ ID NO: 1)

Como alternativa, la proteína G funcional puede tener una secuencia que es al menos 75% idéntica a SEQ ID NO: 1, con tal de que sea capaz de unirse a una superficie de una célula y efectuar la internalización de la partícula. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos sin anular la capacidad de la proteína para unirse a la superficie de una célula y efectuar la internalización de la partícula. Ejemplos de sustituciones conservativas se muestran a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1- Sustituciones conservativas de aminoácidos

Se pueden realizar sustituciones menos conservativas en porciones de la proteína G que no toman parte en la unión a la superficie celular (tal como en un dominio transmembránico), mientras que se podrían necesitar sustituciones más conservativas en porciones de la proteína que interactúan con un receptor de la proteína G. Las proteínas G son conocidas en la técnica, y un experto en la técnica podría ser capaz de determinar qué sustituciones de aminoácidos sería posible realizar sin anular la capacidad de la proteína para unirse a la superficie de una célula y efectuar la internalización de la partícula.

La mezcla de proteínas que forman una estructura alrededor del ARN puede incluir al menos las proteínas N, P, M, y L. Una NRVP que tiene las proteínas N, P, M, G y L puede incluir una NRVP derivada de rhabdovirus. Las NRVPs derivadas de Rhadbovirus se pueden denominar como partículas no replicantes derivadas de rhabdovirus (NRRPs). Para los fines de la presente descripción, el término “Rhabdovirus” (NCBI Taxonomy ID: 11270) puede incluir uno cualquiera de los siguientes género de virus y variantes de los mismos: Cytorhabdovirus (NCBI Taxonomy ID: 11305), Ephemerovirus (NCBI Taxonomy ID: 32613), Vesiculovirus (NCBI Taxonomy ID: 11271), supergrupo Dimarhabdovirus sin clasificar (NcBI Taxonomy ID: 349166), Lyssavirus (NCBI Taxonomy ID: 11286), Novirhabdovirus (NCBI Taxonomy ID: 186778), Nucleorhabdovirus (NCBI Taxonomy ID: 11306), rhabdovirus sin asignar (NCBI Taxonomy ID: 686606) y rhabdovirus sin clasificar (NCBI Taxonomy ID: 35303). Las especies dentro de la familia del Rhabdovirus incluyen, sin limitaciones, el virus Maraba, el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y el virus de Farmington.

La proteína N puede tener una secuencia que incluye SEQ ID NO: 2, que se muestra a continuación, que es la secuencia de la proteína de la nucleocápside del virus de la estomatitis vesicular Indiana. Esta proteína N tiene un número de acceso de NCBI NC 041712.1.

msvtvkriid ntvivpklpa nedpveypad yfrkskeipl yinttkslsd lrgyvyqglk

sgnvsiihvn sylygalkdi rgkldkdwss fginigkagd tigifdlvsl kaldgvlpdg vsdasrtsad dkwlplyllg lyrvgrtqmp eyrkklmdgl tnqckmineq feplvpegrd

ifdvwgndsn ytkivaavdm ffhmfkkhec asfrygtivs rfkdcaalat fghlckitgm stedvttwil nrevademvq mmlpgqeidk adsympylid fglsskspys svknpafhfw

gqltalllrs trarnarqpd dieytsltta gllyayavgs sadlaqqfcv gdnkytpdds

tgglttnapp qgrdvvewlg wfedqnrkpt pdrrmqyakra vmslqglrek tigkyaksef dk (SEQ ID NO: 2)

Como alternativa, la proteína N puede tener una secuencia que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2, siempre y cuando sea capaz de participar en la formación de la estructura de la proteína. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos sin anular la capacidad de la proteína para participar en la formación de la estructura de la proteína. Los ejemplos de sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1.

La proteína P puede tener una secuencia que incluye SEQ ID NO: 3, que se muestra a continuación, que es la secuencia de la proteína NS del virus de la estomatitis vesicular Indiana. Esta proteína P tiene un número de acceso de NCBI NC 041713.1.

mdnltkvrey lksysrldqa vgeideieaq raeksnyelf qedgveehtk psyfqaadds

dtesepeied nqglyaqdpe aeqvegfiqg plddyadeev dwftsdwkp pelesdehgk

tlrltspegl sgeqksqwls tikawqsak ywnlaectfe asgegvimke rqitpdvykv

tpvmnthpsq seavsdvwsl sktsmtfqpk kaslqpltis ldelfssrge fisvggdgrm

shkeaillgl rykklynqar vkysl (SEQ ID NO: 3)

Como alternativa, la proteína P puede tener una secuencia que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 3, siempre y cuando sea capaz de participar en la formación de la estructura de la proteína. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos sin anular la capacidad de la proteína para participar en la formación de la estructura de la proteína. Los ejemplos de sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1.

La proteína M puede tener una secuencia que incluye SEQ ID NO: 4, que se muestra a continuación, que es la secuencia de la proteína de la matriz del virus de la estomatitis vesicular Indiana. Esta proteína M tiene un número de acceso de NCBI NC 041714.1.

msslkkilgl kgkgkkskkl giapppyeed tsmeyapsap idksyfgvde mdtydpnqlr yekffftvkm tvrsnrpfrt ysdvaaavsh wdhmyigmag krpfykilaf lgssnlkatp avladqgqpe yhthcegray lphrmgktpp mlnvpehfrr pfniglykgt ieltmtiydd esleaapmiw dhfnsskfsd frekalmfgl ivekkasgaw vldsishfk (SEQ ID NO: 4)

Como alternativa, la proteína M puede tener una secuencia que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 4, siempre y cuando sea capaz de participar en la formación de la estructura de la proteína. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos sin anular la capacidad de la proteína para participar en la formación de la estructura de la proteína. Los ejemplos de sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1.

La proteína L puede tener una secuencia que incluye SEQ ID NO: 5, que se muestra a continuación, que es la secuencia de la proteína polimerasa del virus de la estomatitis vesicular Indiana. Esta proteína L tiene un número de acceso de NCBI NC 041716.1.

mevhdfetde fndfneddya treflnpder mtylnhadyn lnsplisddi dnlirkfnsl

pipsmwdskn wdgvlemlts cqanpistsq mhkwmgswlm sdnhdasqgy sflhevdkea

eitfdwetf irgwgnkpie yikkerwtds fkilaylcqk fldlhkltli lnavsevell

nlartfkgkv rrsshgtnic rirvpslgpt fisegwayfk kldilmdrnf llmvkdviig

rmqtvlsmvc ridnlfseqd ifsllniyri gdkiverqgn fsydlikmve picnlklmkl

aresrplvpq fphfenhikt svdegakidr girflhdqim svktvdltlv iygsfrhwgh

pfidyytgle klhsqvtmkk didvsyakal asdlarivlf qqfndhkkwf vngdllphdh

pfkshvkent wptaaqvqdf gdkwhelpli kcfeipdlld psiiysdksh smnrsevlkh

vrmnpntpip skkvlqtmld tkatnwkefl keidekgldd ddliiglkgk erelklagrf

fslmswklre yfviteylik thfvpmfkgl tmaddltavi kkmldsssgq glksyeaici

anhidyekwn nhqrklsngp vfrvmgqflg ypslierthe ffeksliyyn grpdlmrvhn

ntlinstsqr vcwqgqeggl eglrqkgwti lnllviqrea kirntavkvl aqgdnqvict

qyktkksrnv velqgalnqm vsnnekimta ikigtgklgl linddetmqs adylnygkip

ifrgvirgle tkrwsrvtcv tndqiptcan imssvstnal tvahfaenpi namiqynyfg

tfarlllmmh dpalrqslye vqdkipglhs stfkyamlyl dpsiggvsgm slsrfliraf

pdpvteslsf wrfihvhars ehlkemsavf gnpeiakfri thidklvedp tslniamgms

panllktevk kcliesrqti rnqvikdati ylyheedrlr sflwsinplf prflsefksg

tflgvadgli slfqnsrtir nsfkkkyhre lddlivrsev sslthlgklh lrrgsckmwt

csathadtlr ykswgrtvig ttvphpleml gpqhrketpc apcntsgfny vsvhcpdgih

dvfssrgplp aylgsktses tsilqpwere skvplikrat rlrdaiswfv epdsklamti

lsnihsltge ewtkrqhgfk rtgsalhrfs tsrmshggfa sqstaaltrl mattdtmrdl

gdqnfdflfq atllyaqitt tvardgwits ctdhyhiack sclrpieeit ldssmdytpp

dvshvlktwr ngegswgqei kqiyplegnw knlapaeqsy qvgrcigfly gdlayrksth

aedsslfpls iqgrirgrgf lkglldglmr asccqvihrr slahlkrpan avyggliyli

dklsvsppfl sltrsgpird eletiphkip tsyptsnrdm gvivrnyfky qcrliekgky

rshysqlwlf sdvlsidfig pfsisttllq ilykpflsgk dknelrelan lssllrsgeg

wedihvkfft kdillcpeei rhackfgiak dnnkdmsypp wgresrgtít tipvyytttp

ypkmlemppr íqnpllsgir lgqlptgahy kirsilhgmg íhyrdflscg dgsggmtaal

lrenvhsrgi fnsllelsgs vmrgaspepp saletlggdk srcvngetcw eypsdlcdpr

twdyflrlka glglqidlív mdmevrdsst slkietnvrn yvhrildeqg vliyktygty

iceseknavt ílgpmfktvd lvqtefsssq tsevymvckg lkklidepnp dwssineswk

nlyafqsseq efarakkvst yftltgipsq fipdpfvnie tmlqifgvpt gvshaaalks

sdrpadllti slfymaiisy yninhirvgp ippnppsdgi aqnvgiaitg isfwlslmek

diplyqqcla viqqsfpirw eavsvkggyk qkwstrgdgl pkdtrtsdsl apignwirsl

elvrnqvrln pfneilfnql crtvdnhlkw snlrrntgmi ewinrriske drsilmlksd

lheenswrd (SEQ ID NO: 5)

Como alternativa, la proteína L puede tener una secuencia que es al menos 70% idéntica a SEQ ID NO: 5, siempre y cuando sea capaz de participar en la formación de la estructura de la proteína. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos sin anular la capacidad de la proteína para participar en la formación de la estructura de la proteína. Los ejemplos de sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1.

En algunos ejemplos, la NRVP puede producir las proteínas N, P, M y G funcionales después de que la NRVP se haya unido y haya sido internalizada por la célula. Sin embargo, la NRVP carece de la capacidad, o tiene una capacidad reducida, de producir la proteína L funcional. Sin la proteína L funcional, o sin la cantidad correcta de proteína L funcional, no se pueden ensamblar nuevas partículas virales.

En otros ejemplos, la NRVP pueden producir las proteínas N, P y M funcionales de que la NRVP se haya unido y haya sido internalizada por la célula. Sin embargo, la NRVP carece de la capacidad, o tiene una capacidad reducida, de producir las proteínas G y L funcionales. Sin proteínas G y L funcionales, o sin las cantidades o relaciones correctas de proteínas G y L funcionales, no se pueden ensamblar nuevas partículas virales.

En aún otros ejemplos, la NRVP puede producir las proteínas N y P funcionales de que la NRVP se haya unido y haya sido internalizada por la célula. Sin embargo, la NRVP carece de la capacidad, o tiene una capacidad reducida, de producir las proteínas M, G y L funcionales. Sin las proteínas M, G y L funcionales, o sin las cantidades o relaciones correctas de las proteínas M, G y L funcionales, no se pueden ensamblar nuevas partículas virales.

En aún otros ejemplos, la NRVP puede producir la proteína N funcional de que la NRVP se haya unido y haya sido internalizada por la célula. Sin embargo, la NRVP carece de la capacidad, o tiene una capacidad reducida, de producir las proteínas P, M, G y L funcionales. Sin las proteínas P, M, G y L funcionales, o sin las cantidades o relaciones correctas de proteínas P, M, G y L funcionales, no se pueden ensamblar nuevas partículas virales.

En aún otros ejemplos, la NRVP carece de la capacidad, o tiene una capacidad reducida, para producir las proteínas N, P, M, G y L funcionales. Sin las proteínas N, P, M, G y L funcionales, o sin las cantidades o relaciones correctas de proteínas N, P, M, G y L funcionales, no se pueden ensamblar nuevas partículas virales.

Para que la partícula no replicante derivada de virus sea capaz de unirse a la superficie de una célula y sea internalizada, la NRVP debe tener un número suficiente de proteínas G funcionales en la envoltura de la partícula viral. Se espera que una NRVP que tiene al menos 5% del número de proteínas G que se encuentran en la partícula del virus de tipo silvestre aún pueda ser capaz de unirse a una célula y ser internalizada. Preferentemente, la NRVP tendría al menos 50% del número de proteínas G que se encuentran en la partícula del virus de tipo silvestre, y más preferentemente la NRVP tendría al menos 100% del número de proteínas G que se encuentra en la partícula del virus de tipo silvestre. En ejemplos específicos, la NRVP tiene al menos 60 proteínas G funcionales por partícula, al menos 600 proteínas G funcionales por partícula, o al menos 1.200 proteínas G funcionales por partícula.

Como se señaló anteriormente, la NRVP incluye ARN que tiene una secuencia que codifica todas las proteínas necesarias para el ensamblaje de nuevas partículas virales. Una razón por la cual la secuencia de ARN pueda ser incapaz de producir estas proteínas cuando la NRVP está en una célula es cuando el ARN está reticulado en tal grado que se reduce o detiene la producción de proteínas. En algunos ejemplos, al menos 0,05% de los nucleótidos reticulados puede ser suficiente para reducir o detener la producción de proteínas a partir de la secuencia de ARN. En otros ejemplos, el ARN reticulado puede incluir al menos 0,5% de nucleótidos reticulados. Puede ser preferible tener al menos 1% de los nucleótidos reticulados, y más preferible tener al menos 10% o al menos 20% de los nucleótidos reticulados.

La reticulación de los nucleótidos puede aumentar la probabilidad de hacer que las proteínas G sean incapaces de unirse a una superficie celular. En consecuencia, puede ser preferible que menos del 80% de los nucleótidos esté reticulado.

Los nucleótidos en la estructura del ARN pueden estar reticulados con otros nucleótidos de ARN, con aminoácidos en una proteína en la estructura proteica alrededor del ARN, o con ambos.

Además de la estructura reticulada del ARN, la estructura proteica alrededor del ARN pueden incluir una proteína que tiene un aminoácido que está reticulado con otra proteína de la estructura proteica; reticulado con otro aminoácido de la misma proteína; reticulado con la estructura del ARN; o cualquier combinación de los anteriores.

Además, la estructura del ARN de la NRVP puede ser incapaz de replicarse por la ablación de la función de la actividad de ARN polimerasa de la NRVP codificada por las proteínas P y L. Esto puede lograrse por la reticulación suficiente de las proteínas P y L con la estructura del ARN, por la reticulación de las proteínas P y L con otras proteínas, o dañando la estructura proteica de la NRVP de modo que la función de las proteínas P y L se vea negativamente afectada.

Otra razón por la que la secuencia de ARN pueda ser incapaz de producir estas proteínas cuando la NRVP está en una célula es cuando la estructura del ARN se ha escindido para formar segmentos discontinuos de ARN. Los virus de ARN, tales como los rhabdovirus, tienen un solo polinucleótido continuo de ARN que incluye las secuencias de todos los genes que codifican las proteínas necesarias para la replicación viral. La escisión del único polinucleótido continuo en dos o más polinucleótidos discontinuos de ARN da como resultado la transcripción defectuosa del genoma, la traducción defectuosa del genoma, o ambas. Las proteínas que son codificadas en un polinucleótido sin un sitio de iniciación de la transcripción no pueden ser transcritas. Además, el genoma no puede experimentar una replicación de longitud completa, y no puede ser incorporado adecuadamente en una partícula viral naciente, evitando así la producción de partículas virales.

Las NRVPs pueden incluir al menos dos polinucleótidos discontinuos de ARN, solamente uno de los cuales comprende un sitio de iniciación de la transcripción. Sin embargo, puede ser preferible escindir el ARN en más de dos segmentos. En consecuencia, las NRVPs incluyen preferentemente al menos cinco, más preferentemente al menos 10, e incluso más preferentemente al menos 100 polinucleótidos de ARN discontinuos.

Los virus de ARN pueden tener una secuencia de ARN que está en el orden de los 11.000 nucleótidos. En los virus de ARN que tienen secuencias de ARN con 11.000 nucleótidos o más, puede ser deseable escindir el ARN en segmentos de no más de 10.000 nucleótidos. Una NRVP resultante de la escisión de un virus de ARN con 11.000 nucleótidos podría entonces tener al menos un segmento de ARN de menos de 10.000 nucleótidos y otro segmento de ARN de menos de 1.000 nucleótidos. Dado que sólo uno de los segmentos incluye el sitio de iniciación de la transcripción, o puesto que la secuencia que codifica la proteína es discontinua, el otro de los segmentos no puede ser transcrito o traducido, y cualquier proteína codificada en ese segmento no sería producida.

Puede ser preferible escindir el ARN en porciones más pequeñas. Por ejemplo, los polinucleótidos discontinuos de ARN pueden tener no más de 7000, no más de 5000, no más de 3000, o no más de 1000 nucleótidos.

Una partícula no replicante derivada de virus se produce a partir de un virus vivo que incluye ARN que tiene una secuencia que codifica las proteínas N, P, M, G y L: separando opcionalmente la partícula derivada de virus a partir de un compuesto que absorbe radiación UV; y sometiendo luego el virus vivo a un agente que daña el ARN, ya sea para reticular la estructura del ARN, o para escindir la estructura del ARN, evitando así que el ARN produzca las proteínas suficientes necesarias para el ensamblaje de nuevas partículas virales.

La estructura del ARN del virus vivo está suficientemente reticulada de manera que cuando la partícula derivada de virus está en una célula: se reduce la transcripción del ARN en ARNm; se reduce la traducción del ARNm en proteína; o ambas. Del mismo modo, la estructura del ARN del virus vivo es escindida en segmentos de ARN lo suficientemente discontinuos de modo que cuando la partícula derivada de virus está en una célula: se reduce la transcripción del ARN en ARNm; se reduce la traducción del ARNm en proteína; o ambas.

La reticulación del ARN puede lograrse sometiendo el virus vivo a la radiación electromagnética. La radiación electromagnética puede tener una longitud de onda de menos de alrededor de 1 mm. La energía asociada con la radiación electromagnética aumenta a medida que disminuye la longitud de onda. El aumento de energía está asociado con el daño al ADN, evidenciado por el aumento de las tasas de cáncer por exposición a la luz ultravioleta, rayos X y radiación gamma. Por consiguiente, es preferible si la radiación electromagnética tiene una longitud de onda de menos de alrededor de 500 mm, y más preferible si la longitud de onda es menor que alrededor de 280 nm. En ejemplos particulares, la longitud de onda está entre alrededor de 0,1 picometros y 280 nm.

Puede ser especialmente deseable usar radiación electromagnética que tenga una longitud de onda entre alrededor de 100 y alrededor de 280 nm, ya que tales longitudes de onda inducen preferentemente la reticulación en nucleótidos con respecto a la reticulación en proteínas. Cuando la radiación electromagnética está en el espectro UV, es decir, entre alrededor de 100 nm y alrededor de 400 nm, la disolución que contiene el virus vivo puede ser sometida a una dosis de radiación electromagnética entre alrededor de 100 mJ/cm2 y alrededor de 8.000 mJ/cm2. Preferentemente, la dosis está entre alrededor de 150 mJ/cm2 y alrededor de 5.000 mJ/cm2. Incluso más preferentemente, la dosis está entre alrededor de 150 mJ/cm2 y alrededor de 1.000 mJ/cm2. Todavía incluso más preferentemente, la dosis está entre alrededor de 150 mJ/cm2 y alrededor de 500 mJ/cm2. Más preferentemente, la dosis está entre alrededor de 150 mJ/cm2 y alrededor de 300 mJ/cm2.

La dosis real puede depender de las características de la disolución. Por ejemplo, si la disolución incluye colorantes que absorben la luz UV, entonces se requiere una dosis mayor. Del mismo modo, si la disolución es irradiada desde un solo punto y el recipiente es grande, puede haber virus vivo que no esté expuesto a la intensidad completa de la luz UV. En tal situación, puede ser beneficiosa una dosis mayor o mayor agitación de la disolución. Un experto en la técnica sería capaz de determinar los parámetros necesarios para proporcionar una dosis apropiada.

En situaciones en las que el medio que contiene el virus vivo es turbio, incluye colorante, o absorbe de alguna otra manera la luz UV, puede ser deseable el irradiar el virus vivo con rayos X (es decir, radiación electromagnética con una longitud de onda entre 0,01 y 10 nm) o rayos gamma (es decir, radiación electromagnética con una longitud de onda de menos de 10 picómetros). Cuando la radiación electromagnética es la radiación gamma, el virus vivo puede ser sometido a una dosis entre alrededor de 1 kGy y alrededor de 50 kGy. Más preferentemente, la dosis está entre alrededor de 5 kGy y alrededor de 20 kGy. La radiación gamma puede ser generada desde cobalto-60.

El virus vivo puede ser sometido a radiación electromagnética a una temperatura de 4°C o inferior. Por ejemplo, el virus vivo puede ser sometido a radiación UV a una temperatura de alrededor de 4°C. En otro ejemplo, el virus vivo puede ser sometido a radiación gamma a una temperatura de alrededor de -80°C. En aún otro ejemplo, el virus vivo puede ser sometido a radiación gamma a una temperatura de alrededor de -130°C.

Como se señaló anteriormente, la estructura del ARN puede estar reticulada, o escindida en segmentos de ARN suficientemente discontinuos como para reducir o evitar la transcripción del ARN en ARNm; la traducción del ARNm en proteína; o ambas. Además de la radiación electromagnética discutida anteriormente, esto también puede lograrse mediante la exposición del virus vivo a un agente químico, tal como un agente alquilante capaz de reticular el ARN, o un agente formador de radicales libres capaz de escindir el ARN. Ejemplos de tales agentes de reticulación incluyen busulfán, ciclofosfamida, melfalán, formaldehído, carbodiimida y suberato de bis-sulfosuccinimidilo. Ejemplos de agentes formadores de radicales libres incluyen peróxidos, bromuro de hidrógeno, persulfato de amonio y radical hidroxilo.

El virus vivo puede ser separado de un compuesto absorbente de la luz UV fraccionando el medio de cultivo usado para generar las partículas virales. El medio de cultivo se puede fraccionar, por ejemplo, en un gradiente de sacarosa. Una vez que se ha preparado la NRVP, ésta se puede separar por fraccionamiento o filtrar el diluyente que contiene las partículas derivadas de virus. El diluyente se puede fraccionar, por ejemplo, en un gradiente de sacarosa o se puede filtrar por filtración de flujo tangencial.

La presente descripción también incluye estimular una respuesta inmunitaria mediante la administración de partículas no replicantes derivadas de virus, como se describió anteriormente, a un paciente. La administración de las NRVPs induce la expresión y la liberación de citocinas en el paciente. Ejemplos de citocinas que pueden ser liberadas en el paciente incluyen: interleucinas, interferones, citocinas inflamatorias, miembros de la familia de las quimiocinas CXC, miembros de la familia del factor de necrosis tumoral, o cualquier combinación de los mismos. Estos factores pueden dar como resultado la presentación o el reconocimiento de antígenos tumorales.

La descripción también incluye inducir la muerte celular de las células cancerosas en un paciente, que incluye administrar partículas no replicantes derivadas de virus, como se describe anteriormente, al paciente.

La descripción incluye además inducir preferentemente la muerte celular en las células cancerosas o células no cancerosas, mediante la administración de partículas no replicantes derivadas de virus, como se describe anteriormente, al paciente.

La muerte celular puede ser a través de apoptosis, por ejemplo causada por la presencia de las NRVPs, o de constituyentes de las NRVPs en la célula. De forma alternativa, la muerte celular puede ser debida al reclutamiento de células efectoras del sistema inmune innato, células efectoras del sistema inmune adaptativo, o cualquier combinación de las mismas, por ejemplo causada por citocinas liberadas por la célula. Las células efectoras del sistema inmune adaptativo pueden ser células T, células B, o ambas. Las células efectoras del sistema inmune innato pueden incluir mastocitos, fagocitos (tales como macrófagos, neutrófilos, o células dendríticas), basófilos, eosinófilos, células asesinas naturales, células Ty8, o cualquier combinación de las mismas.

El paciente es tratado con un número suficiente de NRVP para estimular la respuesta inmunitaria o inducir la muerte celular de las células cancerosas. Dado que las NRVPs no forman partículas virales vivas, es deseable administrar las NRVPs en una cantidad que sea mayor que la que se administra en los tratamientos con virus competentes para la replicación. Al paciente se le puede administrar 1E10 a 1E15 partículas no replicantes derivadas de virus, aunque en los ejemplos preferidos se administra al paciente de 1E11 a 1E13 de partículas no replicantes derivadas de virus.

Puede existir un beneficio sinérgico cuando se combina el tratamiento de un paciente con NRVP y el tratamiento con un agente quimioterapéutico. El agente quimioterapéutico puede ser, por ejemplo: bendamustina, dexametasona, doxorrubicina, vincristina, imatinib, disatinib o idarrubicina. Estos agentes pueden mejorar la sensibilidad a la apoptosis mediada por NRVP, mejorar la secreción de citocinas, mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales, promover el cierre vascular, o cualquier combinación de los mismos.

Las NRVPs pueden usarse para tratar tumores sólidos o neoplasias sin tumores sólidos, tales como la leucemia. Sin embargo, ya que las NRVPs no forman partículas de virus vivos en una célula, es especialmente deseable el exponer todas las células cancerosas a las NRVPs inyectadas. Esto contrasta con la administración de virus competentes para la replicación, en los que la exposición de una parte de las células cancerosas al virus inyectado da como resultado la producción de virus adicional y la posterior exposición de las células cancerosas restantes a las partículas virales generadas.

En vista de la falta de producción de partículas virales, es preferible usar las NRVPs para tratar la leucemia, ya que la administración intravenosa de las NRVPs da como resultado que una fracción sustancial de las células leucémicas quede expuesta a las partículas. En contraste, en el caso de los tumores sólidos, una porción de las células en el tumor sólido puede no quedar expuesta a las NRVPs inyectadas. El modo de administración de partículas no replicantes derivadas de virus puede ser determinado según el tipo cáncer a tratar. Las NRVPs se pueden administrar al paciente por vía intratumoral, por vía intranasal, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intraarterial, intravenosa, subcutánea o intracraneal.

Las partículas no replicantes derivadas de virus (NRVPs) de la presente descripción pueden formarse a partir de partículas de Rhabdovirus de tipo silvestre modificadas de manera que carecen de la capacidad de propagarse entre las células. La partícula no replicante derivada de Rhabdovirus puede ser derivada de una partícula de Rhabdovirus de tipo silvestre competente para la replicación. Una vez modificada, la NRRP no puede mantener la replicación del virión.

Las NRRPs pueden retener su tropismo citolítico frente a células inmortalizadas. Los ejemplos específicos de NRRPs tienen propiedades inmunoestimulantes innatas y/o adaptativas frente a células inmortalizadas.

Para los fines de la presente descripción, la expresión “células inmortalizadas” significa células cuya división celular está descontrolada, e incluyen, sin limitación, células hiperproliferativas, células tumorales o cancerosas y células inmortalizadas transformadas. La o las células hiperproliferativas se refieren a cualquier neoplasia o célula o tejido crónicamente infectados. La neoplasia puede ser, por ejemplo, cualquier neoplasia benigna, neoplasia cística, carcinoma in situ, neoplasia maligna, neoplasia metastásica o neoplasia secundaria. La célula hiperproliferativa puede ser una célula cancerosa hematopoyética o una célula de un tumor sólido.

Las NRRPs, de acuerdo con la presente descripción, pueden retener su tropismo citolítico frente a las células inmortalizadas. Esto significa que las NRRPs inducirán muerte celular preferentemente en células inmortalizadas, tales como células tumorales o cancerosas y células inmortalizadas transformadas.

El Rhabdovirus de tipo silvestre puede modificarse para generar la NRRP por medios que interrumpen la replicación y/o expresión de su genoma. Esto significa que la replicación y/o expresión del genoma disminuye en comparación con la expresión parental de referencia. La expresión del genoma también podría ser alterada por ablación.

Para interrumpir la expresión del genoma del Rhabdovirus de tipo silvestre, se puede usar irradiación electromagnética (EM). La irradiación electromagnética puede incluir la irradiación UV, infrarroja, rayos X, gamma y otros tipos de irradiación en el espectro EM, tal como UVC (200-280 nanómetros). Para interrumpir la expresión del genoma del Rhabdovirus de tipo silvestre también se puede usar la interrupción inducida por medios químicos. Por ejemplo, se puede usar un agente dañino para el genoma, tal como el busulfán.

La dosis EM necesaria para interrumpir suficientemente la expresión del genoma del Rhabdovirus de tipo silvestre dependerá del método, y puede variar de acuerdo con parámetros tales como la concentración del virus, la turbidez de la preparación madre del virus, el volumen usado, la presencia de contaminantes o la pureza de la preparación madre del virus, el diluyente usado, y el receptáculo en el que se almacena la preparación del virus para el procedimiento (plástico, vidrio, etc.). La dosificación química también puede verse afectada por diversos parámetros.

En un ejemplo, 50 pl de un lote de 1E10 PFU/ml de Rhabdovirus de tipo silvestre purificado usando el método de colchón de sacarosa se irradió a 250 mJ/cm2 (durante alrededor de 40 segundos).

La presente descripción proporciona además una partícula no replicante derivada de Rhabdovirus que se genera a partir de una partícula derivada de Rhabdovirus de tipo silvestre. El virus de tipo silvestre ha sido modificado para que carezca de la capacidad de propagarse entre células, pero para retener propiedades inmunoestimulantes innatas y/o adaptativas.

La presente descripción también proporciona un uso de una NRVP, y específicamente una NRRP, para tratar una población de células inmortalizadas.

Para los fines de la presente descripción, el término “tratar” se debe entender que significa aplicaciones en las que se usa la NRVP o NRRP sola o en combinación con terapia de radiación, quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, terapias basadas en virus oncolíticos u otras terapias basadas en virus.

Una persona experta en la técnica entenderá que el término “quimioterapias” incluye, pero no está limitado a, las terapias que implican el uso de inhibidores mitóticos, IMiDS tales como lenalidomida o pomalidomida, agentes modificadores de cromatina, inhibidores de HDAC como SAHA, agentes hipometilantes, agentes alquilantes, inhibidores de mTOR, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores del proteasoma, antimetabolitos, agentes que dañan el ADN o regulan el ADN, inhibidores de la fosfodiesterasa, compuestos miméticos de SMAC como LCL161, corticosteroides y citocinas/quimiocinas.

Por ejemplo, la quimioterapia podría incluir terapias que usan: agentes alquilantes, agentes que dañan el ADN o agentes reguladores del ADN, inhibidores mitóticos, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores del proteasoma, IMiDS, antimetabolitos, inhibidores de mTOR, agentes modificadores de la cromatina, inhibidores de HDAC, agentes hipometilantes, inhibidores de la fosfodiesterasa, corticosteroides y citocinas/quimiocinas. Quimioterapias específicas incluyen, pero no están limitadas a: bendamustina, busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, lomustina, melfalán, temozolomida, tiotepa, oxaliplatino, procarbazina, pentostatina, cladribina, clofarabina, citarabina, fludarabina, gemcitabina, hidroxiurea, mercaptopurina, nelarabina, fluorouracilo, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina. doxorrubicina, doxorrubicina liposomial, idarrubicina, mitoxantrona, capecitabina, topotecán, irinotecán, etopósido, paclitaxel, tenipósido, tioguanina, omacetaxina, altretamina, asparaginasa, asparaginasa, pegaspargasa, isotretinoína, ácido retinoico, arsénico, vinblastina, vincristina, vincristina liposomial, bosutinib, dasatinib, imatinib, nilotinib, sunitinib, vemurafenib, regorafenib, bortezomib, carfilzomib, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, metotrexato, pralatrexato, everolimus, temsirolimus, vorinostat, romidepsina, ácido valproico, decitabina, azacitidina, anagrelida, cortisona, dexametasona, prednisona y triamcinolona, interferón alfa 2a, interferón alfa 2b, peginterferón alfa 2b, interferón beta 1b, aldesleuquina/IL-2, denileuquina diftitox, factor estimulante de colonias de granulocitos y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos.

Para los fines de la presente descripción, el término “inmunoterapias” se entenderá que significa inmunoterapias dirigidas a CD20 (tal como rituximab, ibritumomabtiuxetano y tositumomab), CD47, CD33, CD38, CD138, CS1, CD52 (tal como alemtuzimab), VEGF (tal como bevacizumab), Her2/Neu (tal como trastuzumab), EGFR (tales como cetuximab y nimotuzumab), CTLA4 (tal como ipilimumab) o IGF-1 (tal como ganitumab). Otras inmunoterapias conocidas por los expertos en la técnica también pueden ser incluidas dentro del alcance del término “inmunoterapias”.

La referencia a “terapias basadas en virus oncolíticos” incluye aquellas conocidas en la técnica, incluyendo terapias basadas en el poxvirus (virus basados en el virus de la vacuna), terapias basadas en el virus del herpes simple (OncoVEXGM-CSF), terapias basadas en Rhabdovirus (MG1, VSV-IFNb, VSVd51), Reovirus (Reolysin), terapias basadas en adenovirus (ONYX 015), terapias basadas en el virus del sarampión, terapias basadas en el virus de la enfermedad de New Castle, terapias basadas en virus alfa, y terapias basadas en parvovirus.

Las NRVPs y NRRPs se puede administrar por vía intratumoral, intranasal, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intraarterial, intravenosa, subcutánea o intracraneal.

Se demostraron las propiedades oncolíticas de las NRRPs en varios modelos in vitro e in vivo diferentes usando dos cepas diferentes derivadas de Rhabdovirus y varios tipos de células diferentes, incluyendo muestras de pacientes, como se discute en mayor detalle a continuación.

La citotoxicidad específica del tumor se caracterizó en una serie de ensayos que incluyen la caracterización microscópica del fenotipo celular, cuantificación de la citotoxicidad con resazurina, y citometría de flujo para determinar la destrucción de células tumorales.

El uso de un modelo de protección inmune contra L1210 indica que la activación por NRRP de las rutas de muerte celular programada conduce a la generación de una respuesta inmunitaria innata y adaptativa contra el tumor. Como tal, el tratamiento con NRRP no requiere que cada célula sea infectada para mantener la eficacia, y por lo tanto se puede usar como un tratamiento por sí solo o como un adyuvante en regímenes terapéuticos anticancerosos.

También se realizó la cuantificación basada en Luminex de citocinas inducidas por NRRP en ratones portadores de L1210 durante crisis blástica aguda. Todas las citocinas identificadas fueron inducidas más de 2 veces en ratones tratados con NRRP y son estadísticamente significativas (prueba de la t no pareada pV <0,05). pV se ha corregido para tener en cuenta la prueba de múltiples hipótesis (Método de Benjamini y Hochberg).

Este experimento muestra también que las NRRPs pueden ser efectivas de forma óptima cuando se aplica una alta relación de NRRP a célula (es decir, > 1). Esta mayor dosificación asegura que la mayoría de las células dentro de una población celular encuentre una NRRP citotóxica. Esto contrasta con las terapias de OV vivo, que dependen de la propagación viral para lograr la esperada eficacia terapéutica y que por su naturaleza usan una baja relación de OV a célula para promover la entrega segura al receptor.

Ejemplos

Para todas las figuras excepto la Fig. 1A, las NRRPs fueron generadas por irradiación UVC de una muestra de 5O pl de 1E10 PFU/ml de VSV-GFP vivos a una dosis de irradiación de 250 mJ/cm2, se purificaron usando un método de colchón de sacarosa en el que la preparación de virus se centrifugó a través de un colchón de sacarosa al 20% (p/v) en agua (5 ml) a 148.000 x g durante 120 minutos.

Ejemplo 1: NRRPs basadas en VSV generadas por irradiación con radiación electromagnética

El daño fotónico del Rhabdovirus por radiación UV se puede usar para generar una partícula no replicante derivada de virus que retiene su bioactividad. El uso de altas dosis de irradiación UV ablaciona el genoma de los Rhabdovirus, volviendo al virus biológicamente inerte. Sin embargo, ahora se ha descubierto que la irradiación UV se puede aplicar a una dosis que todavía permite que el virus se una y sea internalizado por una célula, pero que detiene, o sustancialmente reduce, la capacidad de la partícula para formar nuevas partículas virales cuando la partícula viral se encuentra dentro de la célula. De acuerdo con ello, el virus pierde su capacidad de replicarse, sin embargo, mantiene las actividades biológicas.

Se determinó que la irradiación de VSV purificado (un Rhabdovirus) que expresa la proteína fluorescente verde con una dosis entre alrededor de 100 y alrededor de 1000 mJ/cm2 de fluencia UV genera una NRRP que retiene tropismo citolítico frente a células inmortalizadas (Figs. 1A y 1B), pero que carece de la capacidad de propagarse entre las células (Fig. 2A).

Se aplicó una dosis de 250 mJ/cm2 de irradiación UV a la cepa de VSV de tipo silvestre para generar NRRPs basadas en VSV de acuerdo con la presente descripción. En la Fig. 1A, la dosis UV 1E2 corresponde a 100 mJ/cm2. Como tal, cuando se irradia VSV-eGFP con una dosis de 250 mJ/cm2), éste pierde sus capacidades de expresión, sin embargo mantiene una potente citotoxicidad contra la línea celular de producción inmortalizada (Vero) (Fig. 2B). La titulación del virus después de la infección confirmó que la partícula resultante era incapaz de replicarse en estas células, en marcado contraste con la infección de virus vivos (Fig. 2C). Este efecto se observó igualmente cuando se usaron otros miembros de la familia del Rhabdovirus, incluyendo el virus Maraba (Fig. 3A, 3B y 3C).

Las curvas de respuesta a la dosis, que se muestran en la Fig. 1A, indican que la citotoxicidad se reduce a dosis de UV por encima de 1000 mJ/cm2 y queda completamente suprimida a una dosis de UV de 10.000 mJ/cm2. Se cree que la citotoxicidad queda suprimida a esta dosis porque las proteínas G están reticuladas en tal grado que no son capaces de permitir que el virus tratado se una a la superficie celular y/o sea internalizado por la célula. Al comparar y contrastar con fibroblastos dérmicos humanos (HDF) neonatales normales (Figs. 1A y 1B), parece que la citotoxicidad ataca preferentemente a las células cancerosas frente a las células no cancerosas. De hecho, las células no cancerosas parecen requerir alrededor de 10 veces más virus para volverse sensibles a la citotoxicidad mediada por NRRP (Fig. 1B).

Para confirmar la ausencia de replicación y propagación de las NRRPs en las células de leucemia aguda, se cuantificaron la síntesis de GPF y los títulos virales después del tratamiento in vitro de una línea celular de una forma agresiva de leucemia linfoblástica aguda en murina (L1210), junto con la línea celular Vero de control (células epiteliales normales de riñón). En ambas líneas celulares sometidas a tratamiento no se observó virus vivo detectable (Figs. 4A y 4B).

El análisis de transferencia Western del genoma viral indica que las NRRPs tienen una expresión genómica global reducida (Fig. 5). Las dosis de UV que bloquean la producción de viriones y disminuyen la expresión del genoma están asociadas con la actividad oncolítica marcada. En estos experimentos se puede usar una alta (mayor o igual a 1) multiplicidad de infección (MOI), o una alta relación de partículas a células, para asegurarse de que cada célula tumoral se encuentre con una NRRP e induzca una muerte celular exhaustiva en toda la población (Fig. 1B).

Ejemplo 2: NRRPs basadas en VSV generadas por la exposición a un agente alquilante de ARN

En otro ejemplo, las NRRPs fueron generadas de forma química mediante el tratamiento de VSV con 6 mg/ml de busulfán a 4°C durante 24 horas, y se añadieron a células Vero durante 24 horas. Menos de 4% de las células Vero continuaron siendo viables después del tratamiento (Fig. 6A). Este efecto se atribuyó a las NRRPs, ya que el tratamiento solo con busulfán durante 24 horas mostró que alrededor del 82% de las células Vero siguieron siendo viables (Fig. 6B). La Fig. 6C muestra el efecto citopático en las células Vero infectadas con VSV-GFP vivo a las 24 horas, y que este lote de virus vivo (VSV-GFP), del cual se derivaron las NRRPs, era, de hecho, competente para la replicación - lo que quedó en evidencia por la expresión de GFP.

Ejemplo 3: NRRPs basadas en VSV generadas por exposición a radiación gamma

En todavía otro ejemplo, las NRRPs fueron generadas mediante la irradiación de 1E10 de VSV congelado con 15 kGy de cobalto-60 a -80°C, y se añadieron 1000 partículas por célula a células Vero durante 48 horas. Una vez más, el efecto citopático de las NRRPs fue claramente evidente en estas células inmortalizadas (Fig. 7A). Los efectos morfológicos de apoptosis celular y muerte inducidos por las NRRPs se compararon con los efectos citopáticos producidos por el tratamiento de las mismas células con VSV-GFP vivo, durante el mismo período de tiempo de 48 horas (Fig. 7B). Las células Vero tratadas solo con PBS continuaron siendo completamente viables, sin efectos citopáticos, y no mostraron fluorescencia (Fig. 7C).

Ejemplo 4: Las NRRPs son un tratamiento efectivo in vitro contra células leucémicas

Se investigó si las células de leucemia aguda son susceptibles a la muerte celular mediada por NRRP usando NRRPs basadas en VSV generadas por el método que emplea radiación UV. En primer lugar, se determinó la citotoxicidad inducida en la línea celular L1210 y la observada en fibroblastos dérmicos humanos normales (HDF). Aunque ambas líneas celulares fueron susceptibles a la infección por el virus vivo, las NRRPs indujeron la muerte únicamente en las células leucémicas L1210 (Fig. 8A). En las células L1210 de leucemia aguda se observó el fenotipo apoptótico clásico, caracterizado por una reducción del diámetro de la célula, la apariencia de “encogida” con numerosos cuerpos apoptóticos y el contenido nuclear fragmentado. La citotoxicidad se cuantificó usando un ensayo estándar con resazurina en varias líneas celulares humanas y murinas. En estos experimentos, las leucemias agudas fueron altamente susceptibles a la muerte celular mediada por NRRP preservándose, al mismo tiempo, la viabilidad de las células normales (Fig. 8B). Resultados similares se determinaron usando las NRRPs basadas en Maraba, una cepa alternativa de Rhabdovirus (Fig. 3A y 3B). La ausencia de expresión genómica se confirmó por microscopía de fluorescencia (Fig. 8C).

El nivel de apoptosis en las líneas celulares L1210 se cuantificó mediante citometría de flujo. Treinta horas después del tratamiento, las NRRPs indujeron una extensa apoptosis (84% de la población) temprana/tardía (Fig. 9). Se ha demostrado que la apoptosis inducida por VSV se correlaciona directamente con el nivel presente de estrés del retículo endoplasmático (ER) (10). Curiosamente, cuando se destruye la capacidad de la célula de mitigar el estrés del ER, se puede inducir apoptosis inmunogénica (16). Las NRRPs inducen esta forma única de muerte celular como se describe más adelante.

En otros ejemplos, las células de leucemia L1210 fueron tratadas con las NRRPs en combinación con bendamustina 300 pM (Fig. 10); dexametasona 45 pM (Fig. 11); doxorrubicina 0,025 pM (Fig. 12) o vincristina 0,0125 pM (Fig. 13) durante 72 horas. Las NRRPs han mostrado que por sí solas son capaces de inducir efectos citotóxicos de la manera habitual, sin embargo en combinación con los fármacos anteriores se observa un efecto citotóxico adicional y/o sinérgico. Esto demuestra que cuando la terapia de NRRP se combina con otros agentes quimioterapéuticos/farmacológicos se produce un efecto de potenciación terapéutica que es único.

En aún otro ejemplo, se trataron células leucémicas mieloides K562 positivas para Ph con las NRRPs generadas por UV en combinación con idarrubicina 0,05 pM (Fig. 14) durante 72 horas. Igualmente en este ejemplo, la línea celular de leucemia mieloide fue altamente susceptible a la muerte celular mediada por NRRP y se observó de nuevo un efecto de potenciación al usar esta clase de agente quimioterapéutico en combinación con las NRRPs. Estas observaciones indican que la terapia con NRRP puede verse de hecho aumentada por el uso de agentes terapéuticos adicionales. Esto representa una estrategia alternativa para tratar el cáncer, en particular para tratar las formas recalcitrantes de cáncer que pueden requerir este enfoque combinatorio único para obtener una mayor eficacia.

Ejemplo 5: Modelado que representa la especificidad antitumoral de las NRRPs

El modelo usado para describir la especificidad de las NRRPs contra células con defectos en las rutas de señalización antivirales fue adaptado de nuestro trabajo anterior descrito en LeBoeuf et al. 2013 (Fig. 15A). Brevemente, este modelo está representado por un subconjunto de seis ecuaciones diferenciales ordinarias que describen la transición entre las poblaciones de células (UP, IP, AP y PP) en función de la concentración de las NRRPs (N) y el interferón (IFN) en el medio ambiente. Estas ecuaciones son:

dPP

dt

₊ [ipuy-

Los parámetros usados en las ecuaciones anteriores representan la velocidad de internalización de NRRP (KNI), la velocidad de activación de la señalización de IFN (K^ifn on), la tasa de inactivación de la señalización de IFN (K^ifn off), la EC⁵⁰ de IFN (EC⁵⁰), la velocidad de muerte celular (gc) y la velocidad de aclaramiento de las NRRPs (K^nc).

El siguiente subconjunto de ecuaciones describe la dinámica de las NVRPs (N) y el interferón (IFN) según la cual:

^ - - K vly[V]y[UP]-YvX[n

d!FN

— ^K-IFN 1 X[fP] K^{i f n i} .ⁱ X [AP] K if n 22 X [ P P ] - Y , f n X t F N .

~ d t

Los parámetros descritos en las ecuaciones anteriores representan la velocidad de internalización NRRP (Kni), la degradación de NRRP (gN), la producción de IFN a partir de IP, AP y PP (KIFN1, KIFN21 y KIFN2.2, respectivamente) y la degradación de IFN (gIFN).

Se realizó la simulación de Monte Carlo variando aleatoriamente los parámetros anteriores dentro de una ventana de 1 log (Tabla 2) alrededor al parámetro fisiológico derivado de la bibliografía y las pruebas experimentales (18). Las simulaciones se realizaron en Matlab usando ODE15s imponiendo una restricción de no-negatividad. Las tendencias descritas en la Fig. 15B representan el valor de la mediana de alrededor de 1000 simulaciones. El número de células usadas en estas simulaciones fue de 2,5E5, el volumen de los medios se fijó en 1 ml, y la relación de PFU a célula se fijó en 100 partículas por célula. En estas simulaciones, los defectos en las rutas de señalización de IFN fueron simulados disminuyendo los valores de Kfn1, Kifn2.1, Kfn2.2, KVc y Kifn on desde 100% a 1% de su valor original.

Para investigar el mecanismo por el cual se logra la especificidad contra las células tumorales, los autores de la presente descripción simularon la citotoxicidad inducida por las NRRPs en células normales y tumorales. Recientemente, los autores de la presente descripción desarrollaron un modelo basado en población que describe la relación entre la citotoxicidad y la dinámica de replicación de virus oncolíticos vivos en células normales y tumorales. Según este modelo, un ciclo de infección comienza cuando población no infectada de células (UP) se encuentra con los viriones. Esto permite que la población UP se infecte, y, en el contexto del virus vivo, los viriones y las citocinas conocidas como interferones (IFN) se liberan al medio ambiente.

A medida que los IFN aumentan gradualmente, la población de células activa la señalización antiviral (AP), que con el tiempo permite que esta población aclare la infección viral y quede protegida contra daños posteriores (Pp). Para adaptar este modelo a las NRRPs, los autores de la presente descripción eliminaron la dinámica de replicación del virus del modelo, y simularon la relación entre la citotoxicidad mediada por NRRP y la extensión de los defectos en las rutas de señalización de IFN, un proceso que se sabe se produce en ~80% de los cánceres. Estos defectos se simularon mediante la disminución de la velocidad de producción de IFN, la velocidad de activación de la señalización de IFN y la velocidad de aclaramiento de NRRP entre células tumorales y células normales. Para asegurarse de que esta observación es sistemática, se usó una plataforma de simulación de Monte-Carlo. En ella, todos los parámetros cinéticos se hicieron variar dentro de una ventana de 1 log alrededor de las estimaciones derivadas de la bibliografía o pruebas experimentales (Tabla 2).

Después de la simulación a través de 1000 parejas de parámetros aleatorios (Fig. 15B), los autores de la presente descripción determinaron que como las células cancerosas pierden su capacidad de señalización o respuesta a los IFN, estas células se vuelven más sensibles a la citotoxicidad mediada por NRRP. Para validar esta observación, los autores de la presente descripción investigaron el impacto de los IFN sobre la citotoxicidad mediada por NRRP en células normales (HDF) y leucémicas (L1210). Curiosamente, mientras que el IntronA (IFN recombinante) podía aumentar aún más la protección de las células normales contra el daño de las NRRPs (Fig. 15C), el IntronA no tuvo un impacto detectable sobre las células leucémicas (Fig. 15D).

Tabla 2: Lista de los parámetros estimados alrededor de las pruebas experimentales y pruebas de la bibliografía descritas por Le Boeuf et al. (2013)

Tabla 2

Parámetro Intervalo utilizado

K ^vi 7,5E-5 a 7,5E-4 ( V 'V )

EC50 0,25e-12 a 2,5e-12 (M)

K _{if n on} In(2)/(0,2 a 2,0) (h-1)

K _lFNoff In(2)/(5 a 50) (h-1)

_gc In(2)/(2,5 a 25) (h-1)

K _vc In(2)/(0,25 a 2,5) (h-1)

K _{if n 1} K ^{if n 2} x 10 a 100% (M/h)

K _lFN2.1 &K _lFN2.2 8,3e-18 a 8,3e-17 (M/célula/h)

(es decir, 5000-50000 moléculas/célula/h)

_glFN In(2)/(5 a 50) (h-1)

_gN In(2)/(2,5 a 25) (h-1)

Ejemplo 6: Actividad de las NRRPs en la crisis blástica de AML

Se investigó el potencial de traslación de la plataforma de NRRP en muestras clínicas. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de dos pacientes humanos con crisis blástica aguda de alta carga, y se puso a prueba la susceptibilidad a la muerte celular mediada por NRRP. Los pacientes tenían blastos circulantes con un fenotipo CD33 positivo. Ambos habían recibido previamente un exhaustivo tratamiento contra la leucemia mieloide crónica (CML) y desarrollaron resistencia al tratamiento con inhibidores de la tirosina cinasa (TKI). Las muestras de los pacientes, de forma similar a lo observado en los blastocitos L1210, desarrollaron una obvia apoptosis inducida por NRRP con la morfología clásica (Fig. 16A). La microscopía de fluorescencia confirmó la ausencia de la expresión genómica de las NRRPs (Fig. 16B). De hecho, después del tratamiento con NRRP, estas células leucémicas CD33+ fueron fuertemente teñidas por el marcador de apoptosis Anexina V (Fig. 16C). Se usaron muestras no cultivadas de pacientes para evaluar la especificidad de esta respuesta. De hecho, en ambos pacientes, la población de células leucémicas CD33+ predominante después del tratamiento con NRRP fue ablacionada, dejando las células normales como células dominantes en la muestra (Fig. 16D).

Para asegurarse que las NRRPs no afectan a los glóbulos blancos normales, se trataron células mononucleares de médula ósea aisladas de un donante sano con PBS o las NRRPs. En puntos temporales tempranos (18 horas) y tardíos (65 horas), las NRRPs no indujeron apoptosis dentro de estas muestras (Fig. 17A y 17B).

Ejemplo 7: Actividad anti-leucémica de las NRRPs in vivo

Se usó un modelo murino de crisis blástica leucémica para evaluar el potencial de las NRRPs como un agente terapéutico. En resumen, el primer día, los ratones DBA/2 se expusieron a una dosis de 1x106 blastocitos L1210. Al día siguiente, los ratones comenzaron un régimen de 3x109 NRRP administradas por vía intravenosa durante tres días consecutivos, y se monitorizó la supervivencia. En paralelo, cohortes separadas de ratones fueron tratadas con VSV vivo con una MTD de 2x106 virus por inyección (19), o PBS bajo el mismo programa de tratamiento. Los ratones tratados con NRRP lograron una supervivencia del 80% hasta el día 40, lo que representa una ventaja significativa frente a los ratones tratados con PBS (P < 0,0045) o virus vivo (P < 0,044) (Fig. 18A). Las NRRPs fueron bien toleradas y se administraron a la dosis máxima factible para este experimento particular, lo que representaba una dosis 1500 veces más alta que la MTD de virus vivo. Dado que la leucemia aguda frecuentemente se disemina al sistema nervioso central, y que el VSV de tipo silvestre es altamente neurotóxico, se realizaron inyecciones intracraneales de las NRRPs y del virus vivo. Mientras que los ratones fueron capaces de tolerar la dosis de producción máxima para inyecciones intracraneales de 1x108 partículas, todos los ratones sucumbieron rápidamente a una dosis de 1x104 de virus vivo.

Estimulados por la eficacia y la MTD diferencial ofrecida por la terapia con NRRP, sería interesante saber si el sistema inmune se activa después del tratamiento. 20 horas después del tratamiento con PBS o NRRP se recolectó suero sanguíneo murino de ratones portadores de tumores de células L1210 (Fig. 18B). En este análisis, queda claro que tras el tratamiento con NRRP se inducen las citocinas que normalmente son conocidas por reclutar y diferenciar las células T. Ejemplos de tales citocinas inmunomoduladoras significativamente inducidas por el tratamiento con NRRP incluyen el factor LIF inhibidor de la leucemia, IL-2, IL-4, CCL-2, RANTES y MIP-1a (Fig. 18B).

Para confirmar la estimulación del sistema inmunitario, en particular la activación de células T, los autores de la presente descripción adoptaron la estrategia vacunal ya descrita en publicaciones anteriores. Experimentalmente, esta plataforma consiste en inyectar células apoptóticas en animales inmunocompetentes y medir la inmunidad adaptativa protectora contra el desafío tumoral posterior. De hecho, las células L1210 tratadas con NRRP desarrollan una apoptosis marcada como puede verse en la Fig. 16C por el aumento de la tinción con anexina-V. Por ello, se adoptó este enfoque experimental clásico para examinar si las NRRPs eran capaces de desencadenar apoptosis inmunogénica.

Dos cohortes de ratones DBA/2 (singénicos con L1210) recibieron tres dosis intravenosas semanales de 1x106 células L1210 irradiadas con radiación g pretratadas con NRRPs. Otra cohorte recibió el mismo número de células L1210 irradiadas con radiación g. Después de una semana de este régimen, se administró un desafío con células L1210 leucémicas (1x106 células) a través de la vena de la cola, y se registró la supervivencia. La cohorte que recibió las células L1210 tratadas con NRRP presentaron un 80% de protección después del desafío leucémico, que fue de otro modo uniformemente letal en las cohortes no tratadas administradas con L1210 (Fig. 19). Los ratones supervivientes se mantuvieron durante > 150 días para garantizar una protección prolongada. Esto es consistente con la noción de que las células de leucemia aguda tratadas con NRRP sufren apoptosis inmunogénica.

Usando líneas celulares de leucemia linfoblástica y mieloide aguda, así como células primarias de leucemia de pacientes con CML en crisis blástica aguda intensamente pretratados, se demuestra que las NRRPs son al menos agentes citolíticos específicos para la leucemia. A través de los experimentos in vitro e in vivo detallados anteriormente, se confirma que las NRRPs ofrecen una plataforma terapéutica multimodal.

Ejemplo 8: Actividad de las NRRPs en líneas celulares de mieloma múltiple, cáncer cerebral y cáncer de colon

Además de los experimentos detallados anteriormente, las NRRPs también mostraron ser citopáticas en líneas celulares de mieloma múltiple MCP-11 y RPMI-8226 (Fig. 20) cuando las líneas celulares fueron tratadas durante 15 horas con PBS o NRRPs derivadas de VSV. Específicamente, la Fig. 21 muestra la viabilidad celular después de un ensayo con resazurina o de citotoxicidad con azul Alamar para líneas celulares de mieloma, medida 72 horas después del tratamiento con las NRRPs administradas a una MOI = 250. En este experimento, SR4987 es una línea de células estromales de médula normal. Como se ve en la Fig. 21, SR4987 demostró resistencia a las NRRPs ya que es una célula no maligna. Cuando se generaron las NRRPs no se encontró replicación genómica de las NRRPs o VSV, ya que no se produjo GFP codificado por el virus (datos no presentados).

En otro ejemplo, la línea celular de mieloma múltiple MCP-11 fue tratada con melfalán 20 pM (Fig. 22) o con el compuesto mimético de SMAC LCL161 15 pM (Fig. 23) en combinación con las NRRPs. La terapia de combinación aumentó el efecto citopático de las NRRPs en ambos casos. La actividad sinérgica entre el compuesto mimético de SMAC y las NRRPs representa un enfoque prometedor. Se observa que la actividad antitumoral del compuesto mimético de SMAC aumenta significativamente, o en algunos casos es esencialmente dependiente de la coadministración de NRRP.

En aún otro ejemplo, la línea celular de mieloma múltiple RPMI-8226 fue tratada con carfilzomib 5 nM con efecto citotóxico potenciador (Fig. 24). Se demuestra que la coadministración de las NRRPs con un agente alquilante (por ejemplo, melfalán), un inhibidor del proteasoma (como carfilzomib) o un compuesto mimético de SMAC (tal como LCL161) representa una estrategia alternativa de tratamiento para diversos tipos de cáncer, y es particularmente prometedora en los cánceres de base hematopoyética, tal como el mieloma múltiple.

La utilidad de las NRRPs como una terapia anticancerosa se demuestra además por su efecto sobre líneas celulares de tumores cerebrales. Se determinó la citotoxicidad mediada por NRRP en la línea celular de glioblastoma CT2A, línea celular de glioblastoma de tumor cerebral tardío (DBT) (Fig. 25A), líneas celulares de astrocitoma K1491 (Fig. 25B) y K1492, y la línea celular de glioma de ratón (GL261) (Fig. 25C), en comparación con la de células normales HDNF, cuando estas células fueron tratadas durante 24 horas con PBS o NRRP (Fig. 26).

Además, en todavía otro ejemplo, la línea celular de glioblastoma CT2A fue tratada con 10 pM del inhibidor de HDAC SAHA en combinación con las NRRPs y se observó un efecto citopático de potenciación en comparación con las NRRPs con PBS (Fig. 27). La inhibición de HDAC ha mostrado ser algo prometedora como un agente anticanceroso. Sin embargo, en combinación con las NRRPs se observó una actividad significativa, lo que representa un enfoque muy prometedor para el tratamiento de tumores malignos que abarcan a los glioblastomas, una necesidad clínica insatisfecha.

Las líneas celulares de cáncer renal (786-0) y de mama (4T1) son igualmente sensibles a los efectos citopáticos de las NRRPs (Figs. 28A, 28B, 28C). En esta serie de experimentos, las líneas celulares fueron tratadas con las NRRPs a una MOI = 250, y la viabilidad se cuantificó mediante ensayos con resazurina durante un período de 72 h. Ensayos de microscopía de fluorescencia realizados durante todo el experimento confirmaron la ausencia de expresión genómica.

En otro ejemplo, células subcutáneas de cáncer de colon CT26 se implantaron en ratones. Los ratones posteriormente fueron tratados con 2E9 NRRP en el día 16, 18 y 21 postimplantación del tumor (Fig. 29). A pesar de la gran carga tumoral que había antes del tratamiento con NRRP, cuando se administraron las NRRPs a través de rutas intratumoral o intravenosa se obtuvieron supervivencias prolongadas y curas. Los ratones tratados con PBS de control alcanzaron todos rápidamente el desenlace fatal. Este modelo representa la prueba adicional de que los tumores sólidos también pueden ser susceptibles a regímenes basados en NRRP.

Los ejemplos anteriores muestran a través de ensayos in silico e in vitro que las NRRPs, de forma análoga al virus vivo, son selectivas para tumores dado que explotan defectos en las rutas inmunitarias innatas que son comunes a la mayoría de los tumores. Sin embargo, el margen de seguridad ofrecido por la plataforma NRRP se ve ejemplificado por la observación de que la administración de un alto título de NRRP por vía intracraneal fue bien tolerada por los receptores murinos.

El desenlace para la mayoría de pacientes adultos que sufren de leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide aguda sigue siendo desalentador. Para una minoría de los pacientes, el trasplante alogénico de células madre después del acondicionamiento mieloablativo es potencialmente curativo, sin embargo este procedimiento está asociado con frecuentes eventos adversos y una significativa mortalidad relacionada con el tratamiento. Para muchos pacientes con CML en fase crónica, la terapia dirigida con inhibidores de tirosina cinasa ofrece un control excelente de la enfermedad. Cuando se produce la progresión en crisis blástica aguda, existen opciones terapéuticas muy limitadas debido al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos y la rápida cinética de esta forma de leucemia recalcitrante.

Las NRRPs exhiben tanto propiedades citolíticas directas como propiedades inmunogénicas en varios modelos murinos de leucemia aguda. Una forma peculiar de muerte celular programada involucra la inducción de una respuesta inmunitaria adaptativa contra la célula moribunda. Este proceso comúnmente conocido como apoptosis inmunogénica, es esencial para la eficacia de varios agentes quimioterapéuticos actuales y es necesaria para la defensa del huésped contra la infección viral incluyendo RV vivos. Los resultados in vivo anteriores indican que las NRRPs inducen un proceso similar y que son un factor determinante para la eficacia del tratamiento.

Más relevantes aún son las observaciones de que los mieloblastos primarios resistentes a múltiples fármacos de pacientes con crisis blásticas de CML son forzados a la apoptosis y son finalmente erradicados mediante el tratamiento con NRRP. Además, los glóbulos blancos no leucémicos procurados desde médula ósea sana no se vieron afectados de manera adversa. Esta observación sugiere que a pesar de la potente actividad tumoricida de las NRRPs, es posible evitar la leucopenia comúnmente observada después de la quimioterapia estándar de inducción y consolidación. Esto puede disminuir significativamente los eventos adversos relacionados con el tratamiento. Además, dado que las NRRPs preservan los glóbulos blancos normales durante la citorreducción leucémica, la mayoría de los pacientes que no son candidatos a altas dosis de la radio-quimioterapia seguida de trasplante alogénico de células madre pueden obtener simultáneamente la inducción de una respuesta inmunitaria anti-leucémica efectiva. Después de la inducción de apoptosis inmunogénica generada por NRRP, se liberan una amplia gama de citocinas inmunomoduladoras y probablemente ayuden al desarrollo de una actividad inmune adaptativa efectiva - un componente crítico para lograr respuestas curativas duraderas.

Los ejemplos demuestran la producción de NRRP con altos títulos. Las NRRPs albergan varias propiedades anticancerosas que se demuestran a través de la inducción de lisis celular principalmente a través de las rutas de muerte celular programada, y respuestas inmunitarias sistémicas e intratumorales, incluyendo la activación de células asesinas naturales así como la activación de células dendríticas, o el cierre de la vasculatura dentro del tumor. Estas características pueden ser explotadas usando las NRRPs solas o como un adyuvante en combinación con terapias de radiación, quimioterapias, inmunoterapias, cirugía, plataformas terapéuticas derivadas de virus oncolíticos u otras plataformas terapéuticas derivadas de virus.

En la descripción anterior, para los fines de explicación, se describen numerosos detalles con el fin de proporcionar una comprensión completa de los ejemplos. Sin embargo, será evidente para un experto en la técnica que estos detalles específicos no son necesarios.

Los ejemplos descritos anteriormente están destinados solo a servir de ejemplo. Los expertos en la técnica podrán efectuar alteraciones, modificaciones y variaciones a los ejemplos particulares sin apartarse del alcance, que se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas a la presente.

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13. Willmon CL, Saloura V, Fridlender ZG, Wongthida P, Diaz RM, Thompson J, et al. Expression of IFN-p enhances both efficacy and safety of oncolytic vesicular stomatitis virus for therapy of mesothelioma. Cancer Res 2009; 69: 7713-7720.

14. Galivo F, Diaz RM, Wongthida P, Thompson J, Kottke T, Barber G, et al. Single-cycle viral gene expression, rather than progressive replication and oncolysis, is required for VSV therapy of B16 melanoma. Gene Ther 2010; 17: 158-170.

15. Swarna Bais, Eric Bartee, Masmudur M. Rahman, Grant McFadden, Christopher R. Cogle. Oncolytic Virotherapy for Hematological Malignancies. Advances in Virology 2012; 8.

16. Zitvogel L, Kepp O, Senovilla L, Menger L, Chaput N, Kroemer G. Immunogenic tumor cell death for optimal anticancer therapy: The calreticulin exposure pathway. Clinical Cancer Research 2010; 16: 3100-3104.

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18. Finke J, Nagler A. Viewpoint: What is the role of allogeneic haematopoietic cell transplantation in the era of reduced-intensity conditioning - Is there still an upper age limit? A focus on myeloid neoplasia. Leukemia 2007; 21: 1357-1362.

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una partícula no replicante derivada de Rhabdovirus para uso en el tratamiento de leucemia, en el que la partícula es capaz de unirse a la superficie de una célula y ser internalizada, y en el que dicha partícula derivada de Rhabdovirus comprende un polinucleótido de ARN, cuya estructura de ARN está reticulada o escindida para formar segmentos discontinuos de ARN.

2. La partícula derivada de Rhabdovirus para uso según la reivindicación 1, en la que dicha partícula derivada de Rhabdovirus exhibe:

nucleótidos en la estructura de ARN reticulados a otros nucleótidos de ARN, a aminoácidos en una proteína en la estructura proteica alrededor del ARN, o ambos; o

la estructura proteica alrededor del ARN incluye una proteína que tiene un aminoácido que está reticulado a otra proteína de otra estructura proteica, o reticulado a otro aminoácido de la misma proteína; reticulado a la estructura de ARN; o cualquier combinación de los mismos.

3. La partícula derivada de Rhabdovirus para uso según la reivindicación 1, en la que dicho ARN reticulado comprende al menos 0,05% de nucleótidos reticulados.

4. La partícula derivada de Rhabdovirus para uso según la reivindicación 1, en la que dicha partícula derivada de Rhabdovirus exhibe al menos 60 proteínas G funcionales por partícula.

5. La partícula derivada de Rhabdovirus para uso según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de leucemia en combinación con un agente quimioterapéutico.

6. La partícula derivada de Rhabdovirus para uso según la reivindicación 1, producida mediante el método de someter Rhabdovirus vivo a un agente que daña el ARN para reticular la estructura de ARN del Rhabdovirus, o escindir la estructura de ARN del Rhabdovirus, o ambos.

7. La partícula derivada de Rhabdovirus para uso según la reivindicación 1, en la que se administran al paciente 1x1010 a 1x1015 partículas.

8. Un método para producir la partícula derivada de Rhabdovirus de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

someter Rhabdovirus vivo a un agente que daña el ARN para reticular la estructura de ARN del Rhabdovirus, o escindir la estructura de ARN del Rhabdovirus, o ambos.

9. El método de la reivindicación 8, en el que someter el Rhabdovirus vivo a un agente que daña el ARN comprende someter el Rhabdovirus vivo a radiación electromagnética, o exponer el Rhabdovirus vivo a un agente químico que daña el ARN, o ambos.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la radiación electromagnética tiene una longitud de onda menor que alrededor de 1 mm.

11. El método de la reivindicación 9, en el que la radiación electromagnética está en el espectro UV y en el que el Rhabdovirus vivo se somete a una dosis de radiación electromagnética de entre alrededor de 100 mJ/cm2 y alrededor de 8000 mJ/cm2, o en el que la radiación electromagnética es radiación gamma y en el que el Rhabdovirus vivo se somete a una dosis de radiación electromagnética de entre 1 kGy y alrededor de 50 kGy.