ES2747099T3 - Células T redirigidas por receptores de antígenos quiméricos específicos de CD123, y métodos de su uso - Google Patents

Células T redirigidas por receptores de antígenos quiméricos específicos de CD123, y métodos de su uso Download PDF

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Abstract

Un gen del receptor de antígeno quimérico de CD123 (CD123CAR), que comprende una región de scFv anti- CD123 fusionada en el marco a una región bisagra de IgG4 modificada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una sustitución de aminoácidos S228P y una sustitución de aminoácidos L235E; y un dominio de señalización de cadena zeta de un receptor de células T (TCR), en el que la región bisagra de IgG4 modificada comprende además una secuencia nucleotídica que codifica una sustitución N297Q.

Description

DESCRIPCIÓN
Células T redirigidas por receptores de antígenos quiméricos específicos de CD123, y métodos de su uso INTERÉS DEL GOBIERNO
La presente invención se obtuvo con el apoyo del Gobierno bajo las cesiones P50 CA107399, P01 CA030206, y M01 RR0004 del NIH. El Gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.
ANTECEDENTES
La leucemia mieloide aguda (AML) es una enfermedad caracterizada por la rápida proliferación de células mieloides inmaduras en la médula ósea, que da como resultado hematopoyesis disfuncional [1]. Los tratamientos de primera línea para la leucemia mieloide aguda (AML) se han mantenido prácticamente sin cambios durante casi 50 años, y la AML sigue siendo una enfermedad de mal pronóstico. Aunque la quimioterapia de inducción estándar puede inducir remisiones completas, muchos pacientes recaen y sucumben eventualmente a la enfermedad [2]. Por lo tanto, es crucial el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para la AML.
El trasplante alogénico de células hematopoyéticas puede lograr la cura de la enfermedad en pacientes seleccionados, y destaca la susceptibilidad de la AML a la inmunoterapia derivada del donante. Adicionalmente, la cadena alfa del receptor de interleucina 3 (CD123) se ha identificado como una diana inmunoterapéutica potencial, puesto que se sobreexpresa en la AML en comparación con células madre hematopoyéticas normales.
Los recientes avances en el inmunofenotipado de las células de AML han revelado varios antígenos de superficie celular asociados a AML que pueden actuar como dianas para terapias futuras [3]. De hecho, se han descrito investigaciones pre-clínicas que usan anticuerpos dirigidos contra CD44, CD47, proteína-3 con dominio de mucina e inmunoglobulina de células T (TIM-3), y la cadena alfa del receptor de interleucina 3 (IL-3Ra; CD123) para el tratamiento de AML, y han mostrado actividad anti-leucémica prometedora en modelos murinos [3, 4]. CD123 se expresa en diversas neoplasias, incluyendo leucemia mieloide aguda y crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda de estirpe de células B, y neoplasias de células dendríticas plasmacitoides blásticas. Adicionalmente, CD123 no se expresa típicamente en células madre hematopoyéticas normales, haciendo de esta manera a CD123 una diana inmunoterapéutica ideal. Adicionalmente, se han completado dos ensayos de fase I para sustancias terapéuticas específicas de CD123, presentando ambos fármacos buenos perfiles de seguridad (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 y NCT00397579). Desafortunadamente, estos fármacos dirigidos contra CD123 tuvieron eficacia limitada, sugiriendo que se pueden requerir terapias alternativas, y más potentes, dirigidas contra CD123 para observar actividad anti-leucémica.
Una terapia alternativa posiblemente más potente para el tratamiento de AML es el uso de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CARs) que redirigen la especificidad de las células T hacia antígenos asociados a tumores de superficie celular (TAAs) de una manera independiente de MHC [5]. En la mayoría de casos, los CARs incluyen un fragmento variable monocatenario (scFv) de un anticuerpo monoclonal fusionado al dominio de señalización de CD3Z, y pueden contener un endodominio co-estimulante [5]. Se han desarrollado varios grupos de CARs dirigidos contra diversos antígenos para el tratamiento de neoplasias de células B [6-10], y muchos han continuado para evaluar células T que expresan CAR en ensayos clínicos de fase I [11-15]. En contraste, las células T diseñadas de CAR para el tratamiento de AML siguen siendo escasas [16, 17].
Aunque los regímenes de tratamiento actuales para la AML pueden lograr respuestas completas en pacientes seleccionados, muchos recaerán eventualmente, subrayando la necesidad de nuevas sustancias terapéuticas que pueden conducir a repuestas más duraderas. Actualmente se están desarrollando diversas inmunoterapias dirigidas contra la AML, incluyendo linfocitos T citotóxicos específicos de antígenos, células exterminadoras naturales alorreactivas, y vacunas de células dendríticas. Por ejemplo, Oka y colegas han mostrado que la vacunación del péptido del Tumor 1 de Wilms puede conducir a respuestas clínicas e inmunológicas en pacientes con AML [33]. Sin embargo, estas terapias dirigidas dependen de HLA. Para este fin, sería deseable diseñar una sustancia terapéutica seleccionada, tal como un CAR, que pueda redirigir la especificidad de células T para seleccionar selectivamente células de AML de manera independiente de HLA.
Armen Mardiros et al. describen en Blood, vol. 120, no. 21, no. 21 (2012-11-16 a 2012-12-11), en la página 950, que células T redirigidas por receptores de antígenos quiméricos específicos de CD123 exhiben una potente actividad citolítica y múltiples funciones efectoras frente a leucemia mieloide aguda sin alterar la formación de colonias hematopoyéticas normal in vitro.
Thokala Radhika et al. describen en BLOOD, vol. 118, no. 21 (2011-11-18 a 2011-12-13, en la página 1908, una dianización de leucemias mediante un receptor de antígenos quiméricos específicos de CD123.
SUMARIO
La presente invención se define mediante la reivindicación independiente 1. Las reivindicaciones dependientes representan otras realizaciones de la invención.
Se desarrolló una familia de receptores de antígenos quiméricos (CARs) que contienen un scFv específico de CD123, para seleccionar como dianas a epitopos diferentes en CD123. En algunas realizaciones, tal gen del receptor de antígeno quimérico de CD123 (CD123CAR) incluye una región de scFv anti-CD123 fusionada en el marco a una región bisagra de IgG4 modificada que comprende una alteración de una región espaciadora de IgG4 que eliminaría la unión al receptor de Fc. En una realización, la región bisagra de IgG4 modificada incluye una sustitución S228P, una sustitución L235E, y una sustitución N297Q. El gen CD123CAR también incluye al menos un dominio de señalización co-estimulante, y un dominio de señalización de la cadena zeta del receptor de células T (TCR). En algunas realizaciones, el gen CD123CAR incluye una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, el gen CD123CAR codifica una secuencia de aminoácidos que incluye SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:12.
Según las realizaciones descritas más abajo, los genes CD123CAR pueden ser parte de un casete de expresión que se inserta en un vector (por ejemplo, un vector vírico). Como tal, una población de células T humanas se puede transducir por el vector, dando por resultado la expresión de los genes CD123CAR por las células T. Cuando se expresan en células T de donantes sanos (CD4/CD8), los CD123CARs redirigen la especificidad de células T y median la potente actividad efectora contra líneas de células CD123+ así como muestras de pacientes con AML primarias. Las células T de CD123CAR no alteran significativamente la formación de colonias de granulocitos/macrófagos y eritroides in vitro, sugiriendo un efecto diferencial en células de AML, en oposición a las células inmunes.
Además, las células T obtenidas de pacientes con AML activa se pueden modificar para que expresen genes CD123CAR y sean capaces de lisar los blastos de AML autólogos in vitro. Estos resultados sugieren que las células T transducidas con CD123CAR se pueden usar como una inmunoterapia para el tratamiento de AML de alto riesgo. De esta manera, según algunas realizaciones, se proporcionan composiciones para uso en métodos para tratar AML en un sujeto, en el que tales métodos incluyen una etapa de administrar una primera población de células T transducidas con un primer gen CD123CAR al sujeto. Los métodos pueden comprender además una etapa adicional de administrar al sujeto la primera población de células T transfectadas con el primer gen CD123CAR en combinación con una segunda población de células T transducidas con un segundo gen CD123CAR. En algunas realizaciones, el primer gen CD123CAR incluye una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4. El segundo gen CD123CAR también puede incluir una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4; sin embargo, la secuencia nucleotídica del segundo gen CD123CAR puede no ser la misma que la seleccionada para el primer gen CD123CAR. Esto da como resultado un tratamiento de combinación de AML usando dos o más poblaciones diferentes de células T transducidas con CD123CAR, que pueden provocar un efecto sinérgico cuando se comparan con el uso de una única población de células T transducidas con CD123CAR.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra que los CARs específicos de CD123 se pueden expresar en células T humanas de donantes sanos. (A) Diagrama esquemático del CAR que contiene una bisagra de IgG4 modificada, un dominio transmembránico y de señalización intracelular modificado de CD28, y el dominio de señalización de CD3Z. También se indican la secuencia de omisión ribosómica T2A y el marcador de transducción de EGFR truncado (EGFRt). (B) Fenotipo representativo de células T transducidas simuladamente y lentitransducidas derivadas de un único donante sano. Tras la selección inmunomagnética y un ciclo y de expansión, las células T modificadas con CAR se tiñeron con anticuerpo anti-Fc biotinilado o anticuerpo anti-EGFR biotinilado, seguido de estreptavidina conjugada con PE y anti-TCRa/p, anti-CD4, o anti-CD8, y se analizaron mediante citometría de flujo. La colocación del cuadrante se basa en la tinción con controles isotípicos, y se indica el porcentaje de células que caen en cada cuadrante. (C) Expresión de marcadores de superficie celular indicados procedentes de tres estirpes de células T de donantes sanos diferentes tras la selección inmunomagnética y un ciclo de expansión. Los datos representan valores medios ± SEM.
La Figura 2 muestra que células T que expresan CAR específicos de CD123 lisan estirpes celulares tumorales que expresan CD123. (A) Análisis quilométrico de flujo de células 293T transfectadas transitoriamente para expresar CD123 (parte superior, línea negra) o CD19 (parte inferior, línea negra). Células 293T progenitoras transducidas simuladamente se tiñeron con anticuerpos anti-CD123 o anti-CD19 (relleno en gris, parte superior e inferior) para determinar los niveles de expresión del fondo. (B) Citotoxicidad específica de células T que expresan CD123-CAR (26292 y 32716) frente a células 293T que expresan CD123 (293T-CD123) o CD19 (293T-CD19) mediante ensayo de liberación de cromo. Los datos representan valores medios de pocillos por triplicado ± S.D. (C) Análisis quilométrico de flujo de CD123 en la estirpe celular de AML KG1a, la estirpe celular de LCL transformada con EBV, y la estirpe celular de CML K562. En cada histograma se indica el porcentaje de células positivas para la tinción de CD123 (línea negra) con respecto a los controles de isotipo (relleno en gris). (D) Citotoxicidad específica de células T que expresan CD123-CAR (26292 y 32716) frente a la estirpe celular de LCL CD19+ CD123+ y la estirpe celular CD19- CD123+ KG1 a mediante el ensayo de liberación de cromo. Como estirpes celulares de control positivo y negativo, se usaron respectivamente las estirpes celulares de LCL que expresa OKT3 (LCL-OKT3) y la K562 CD19- CD123-. Los datos representan valores medios de pocillos por triplicado S.D.
La Figura 3 muestra que células T específicas de CD123 liberan INF-g y TNF-a, y proliferan en respuesta a células diana que expresan CD123. Células T que expresan CD123-CAR, o células T equivalentes de control, procedentes de tres donantes sanos, se cocultivaron con las estirpes celulares indicadas durante 24 horas en una E:T de 10:1, y la liberación de IFN-g y TNF-a se cuantificó mediante tecnología de perlas multiplex Luminex. (B) Células T específicas de CD19 o de CD123 marcadas con CFSE con pares coincidentes se cocultivaron con las estirpes celulares estimulantes indicadas durante 96 horas a una E:T de 2:1, y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la dilución de CFSE. Como controles de proliferación de células T de línea base, se usaron células T sin estimular (histogramas llenos).
La Figura 4 muestra la activación de múltiples funciones efectoras de CD4 y CD8 por los CARs específicos de CD123 tras el cocultivo con muestras de AML primarias. Células T modificadas mediante CAR con pares coincidentes se cocultivaron durante seis horas con tres muestras de pacientes con AML primarias diferentes (AML 179, 373, y 605), y se analizaron para determinar la expresión de CD107a en la superficie y la producción intracelular de IFN-y o TNF-a. (A, gráficas de barras) Porcentaje de células DAPI-CD3+CD8+ EGFRt+ que expresan CD107a. Los datos representan valores medios S.D. (A, gráficas circulares). Las fracciones de células CD3+CD8+ EGFRt+ que sufren desgranulación y que producen IFN-g y/o TNF-a se representan gráficamente en las gráficas circulares. (B) Datos de la población de DAPI-CD3+CD4+EGFRt+ procedente del mismo experimento como se describe en A y B. (C) Células T específicas de CD19 o de CD123 marcadas con CFSE con pares coincidentes se cocultivaron con las células estimulantes indicadas durante 72 horas a un E:T de 2:1, y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la dilución de CFSE en la población DAPICD3+ EGFRt+. Las estirpes celulares LCL y K562 sirvieron como 27 controles positivos y negativos, respectivamente. Pre B-ALL 802 es una muestra de paciente primaria doblemente positiva para CD19 y CD123. La colocación del cuadrante se basa en células T sin estimular.
La Figura 5 muestra que células de AML primarias son seleccionadas específicamente como dianas por células T específicas de CD123. (A) Células T específicas de CD19 o de CD123 con pares coincidentes se cocultivaron durante 4 horas con muestras de AML primarias CD34+ marcadas con 51Cr, a una E:T de 25:1. Las estirpes celulares LCL y K562 sirven como controles positivos y negativos, respectivamente. Pre B-ALL 802 es una muestra de paciente primaria doblemente positiva para CD19 y CD123. Los datos representan valores medios de pocillos por triplicado S.D. (B) Lisis específica de blastos de AML procedentes de las tres muestras de pacientes con AML primarias en (A). Los datos representan valores medios ± SEM. *, p < 0,05 y **, p < 0,0005 usando la prueba de la t de Student no emparejada, que compara 26292 y 32716 con CD19R.
La Figura 6 muestra el efecto de células T que expresan CD123 CAR en células progenitoras normales y leucémicas in vitro. (A y B) Células sanguíneas del cordón (CB) CD34+ (n = 3) se seleccionaron inmunomagnéticamente mediante CD34, y se cocultivaron con células T con pares coincidentes específicas de CD19 o de CD123, o con medio solo (sin tratar), durante 4 horas a una E:T de 25:1. Las células se colocaron entonces en placas en cultivo progenitor de metilcelulosa semisólido durante 14-18 días, y se puntuaron para la presencia de unidad formadora de colonias de granulocitos-macrófagos (CFU-GM, A) y colonias de eritroides de unidades formadoras de ruptura (BFU-E, B). Los porcentajes se normalizan a los controles de células T específicas de CD19. Los datos representan valores medios ± SEM para tres muestras de CB diferentes. (C) Muestras de pacientes con AML primarias CD34+ (AML 493, 519, o 545) se seleccionaron inmunomagnéticamente y se cocultivaron con células T con pares coincidentes específicas de CD19 o CD123, o con medio solo (sin tratar) durante 4 horas a una E:T de 25:1. Las células se colocaron entonces en placas en cultivo progenitor de metilcelulosa semisólido durante 14-18 días, y se puntuaron para la presencia de unidades formadoras de colonias de leucemia (CFU-L). Los porcentajes se normalizan a controles de células T específicas de CD19. Los datos representan valores medios ± SEM para tres muestras de pacientes con AML primarias diferentes. *, p < 0,05 usando la prueba de la t de Student no emparejada, que compara 26292 y 32716 con CD19R. (D) Formación de colonias combinadas de CB de (A) o células de AML de (C) tratadas con constructo de CAR dirigido contra CD123 (26292 o 32716) normalizadas a CD19R. *, p < 0,05 usando la prueba de la t de Student no emparejada.
La Figura 7 muestra que células T redirigidas por CD123 CAR, derivadas de pacientes con AML, lisan específicamente blastos autólogos in vitro. (A) Células T procedentes de tres pacientes con AML se transdujeron con lentivirus para expresar los CARs específicos de CD19R, 26292, o 32716. Se muestran estirpes de células T de AML 722 19 días tras la transducción. (B) Expresión de CD123 en células diana usadas en ensayo de liberación de 51Cr. Se indica el porcentaje de células CD123+ y el índice de fluorescencia relativa (RFI) de cada muestra. (C) Resultados de ensayos de exterminio autólogos de 4 horas usando células T manipuladas procedentes de tres muestras de pacientes con AML como efectoras, y blastos enriquecidos con CD34 autólogos marcados con 51Cr como células diana. Los datos representan valores medios de pocillos por triplicado S.D.
La Figura 8 muestra cambios en el tamaño tumoral como se muestra mediante formación de imágenes bioluminiscentes de ratones NSG que se trataron cinco días tras la inyección de la estirpe celular de AML KG1a modificada para expresar luciferasa de luciérnaga (día 5) con células T transducidas con CD123CAR (26292) que contienen las mutaciones S228P+L235E o las mutaciones S228P+L235E+N297Q.
La Figura 9 muestra un diagrama esquemático de un receptor de antígeno quimérico (CAR) que tiene una Fv monocatenaria específica del antígeno, una región bisagra, un dominio de señalización coestimulante, y un dominio de señalización de la cadena zeta del receptor de células T, según algunas realizaciones. (Imagen procedente de Urba WJ y Longo DL N Engl J Med 2011; 365:754-757).
La Figura 10 muestra un diagrama esquemático del constructo 32716CAR que tiene una mutación L235E y una mutación S228P (“32716CAR(S228P+L235E)”), junto con la secuencia nucleotídica del constructo 32716CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO:1 - hebra antisentido (hebra numerada en la parte superior); SEQ ID NO:5 - hebra codificante (hebra no numerada en la parte inferior)), y la secuencia de aminoácidos del constructo 32716CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO:9). Las mutaciones se muestran en negrita.
La Figura 11 muestra un diagrama esquemático del constructo 26292CAR que tiene una mutación L235E y una mutación S228P (“26292CAR(S228P+L235E)”), junto con la secuencia nucleotídica del constructo 26292CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO:2 - hebra antisentido (hebra numerada en la parte superior); SEQ ID NO:6 - hebra codificante (hebra no numerada en la parte inferior)), y la secuencia de aminoácidos del constructo 26292CAR(S228P+L235E) (SEQ ID NO:10). Las mutaciones se muestran en negrita.
La Figura 12 muestra un diagrama esquemático del constructo 32716CAR que tiene una mutación L235E, una mutación S228P y una mutación N297Q (“32716CAR(S228P+L235E+N297Q)”), junto con la secuencia nucleotídica del constructo 32716CAR(S228p+L235E+N297Q) (SEQ ID NO:3 - hebra antisentido (hebra numerada en la parte superior); SEQ ID NO:7 - hebra codificante (hebra no numerada en la parte inferior)), y la secuencia de aminoácidos del constructo 32716CAR(S228P+L235E+N297Q) (SEQ ID NO:11), según algunas realizaciones. Las mutaciones se muestran resaltadas, en negrita y subrayadas. El código de bases de IUPAC R corresponde a una A o G, y el código de bases de IUPAC Y corresponde a una T o C.
La Figura 13 muestra un diagrama esquemático del constructo 26292CAR que tiene una mutación L235E, una mutación S228P y una mutación N297Q (“26292CAR(S228P+L235E+N297Q)”), junto con la secuencia nucleotídica del constructo 26292CAR(S228p+L235E+N297Q) (SEQ ID NO:4 - hebra antisentido (hebra numerada en la parte superior); SEQ ID NO:8 - hebra codificante (hebra no numerada en la parte inferior)), y la secuencia de aminoácidos del constructo 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) (SEQ ID NO:12), según algunas realizaciones. Las mutaciones se muestran en negrita. El código de bases de IUPAC R corresponde a una A o G, y el código de bases de IUPAC Y corresponde a una T o C.
La Figura 14 muestra la expresión de CD123 en muestras de AML primarias y sangre del cordón umbilical. (A) Ejemplo representativo de expresión de CD123 en células de AML primarias. Las células se acotaron en la población DAPI-linaje-CD34+, y se evaluaron para determinar la expresión de CD123 (negro - control de isotipo, rojo - anti-CD123). (B) Porcentaje de células positivas a CD123 expresadas en la población DAPI-linaje-CD34+. Cada punto representa una muestra individual. (C) Índice de fluorescencia relativa (RFI) de CD123 en la población en la población DAPI-linaje-CD34+. El RFI se calcula dividiendo la mediana de células anti-CD123 entre la mediana de células teñidas con el control de isotipo. (D) Superposición de histogramas de la expresión de CD123 en AML 605 (rojo), AML 722 (azul), y muestra de sangre del cordón (gris). El control de isotipo se muestra en negro.
La Figura 15 ilustra una estrategia de acotamiento usada para investigar la activación de múltiples funciones efectoras por células T específicas de CD123 en respuesta a la incubación con muestras de pacientes con AML primarias. La estrategia de acotación para citometría de flujo policromática, para identificar las funciones efectoras de células T, se muestra para células T específicas de CD123 CAR (basadas en 26292) tras el cocultivo con AML 373. (A) Se establece una acotación inicial en células CD3+. (B) Se establece en células EGFRt+ una acotación secundaria, establecida usando un control de fluorescencia menos uno. (C) Se establece una acotación terciaria para poblaciones CD4+ y CD8+. (D) Se establece una acotación final en células CD107a+. (E) Producción de IFN-y y TNF-a en las poblaciones CD107a+. Los cuadrantes se establecieron usando muestras teñidas con el control de isotipo. Se señalan los porcentajes en cada cuadrante.
La Figura 16 muestra CFSE que se diluye en las poblaciones tanto de CD4 como de CD8 de células T que expresan CAR. Se muestran aquí las subpoblaciones de CD4 (A) y CD8 (B) de las células mostradas en la Figura 5C. Tras un acotamiento inicial en células DAPI-CD3+EGFRt+, las células CD4 y CD8 se analizaron para determinar la dilución de CFSE tras el cocultivo con muestras de pacientes con AML primarias. La colocación del cuadrante se basa en células T sin estimular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Ciertas realizaciones de la invención se describen con detalle, usando ejemplos específicos, secuencias, y dibujos. Las realizaciones enumeradas no están destinadas a limitar la invención a esas realizaciones, ya que la invención está destinada a cubrir todas las alternativas, modificaciones, y equivalentes, que se pueden incluir en el alcance de la presente invención como se define mediante las reivindicaciones. Un experto en la técnica reconocerá que, en la práctica de la presente invención, se podrían usar muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí.
En algunas realizaciones, se proporciona un gen que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido contra un tumor. Según ciertas realizaciones, el gen codifica un CAR específico de CD123 (CD123CAR). Un gen CD123CAR incluye una región de Fv monocatenario (scFv) anti-CD123 y uno o más de los siguientes dominios: una región bisagra, un dominio de señalización coestimulante, un dominio de señalización intracelular, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, un gen CD123CAR puede incluir, pero no se limita a, una región de Fv monocatenario (scFv) anti-CD123, una región bisagra, opcionalmente, al menos un dominio de señalización coestimulante, y opcionalmente, un dominio de señalización intracelular.
En ciertas realizaciones, un gen CD123CAR puede incluir, pero no se limita a, una región de Fv monocatenario (scFv) anti-CD123, una región bisagra, al menos un dominio de señalización coestimulante, y un dominio de señalización intracelular (Figura 9).
La región de scFv anti-CD123 puede incluir una secuencia nucleotídica que, cuando se expresa, se puede unir a un epítopo de CD123. En algunas realizaciones, la región de scFv anti-CD123 incluye un nucleótido que codifica un dominio VH y un dominio VL de inmunotoxinas recombinantes (RITs) 26292 y 32716 [18]. Un gen CD123CAR que selecciona como diana a 26292, y un gen CD123CAR que selecciona como diana a 32716, también se denomina aquí como 26292CAR y 32716CAR, respectivamente. En ciertas realizaciones, una región de scFv anti-CD123 puede incluir una secuencia nucleotídica seleccionada de lo siguiente:
nucleótidos 82-814 de SEQ ID NO:3 para un 32716CAR
nucleótidos 82-792 de SEQ ID NO:4 para un 26292CAR; o
Dichas secuencias nucleotídicas codifican secuencias de aminoácidos seleccionadas de lo siguiente:
restos 23-266 de SEQ ID NO:11 cuando se usan en un 32716CAR; o
restos 23-259 de SEQ ID NO:12 cuando se usan en un 26292CAR.
En ciertas realizaciones, la región de scFv anti-CD123 se puede modificar para potenciar la unión o para reducir la inmunogenicidad. Por ejemplo, en un aspecto, la región de scFv anti-CD123 puede ser una región de scFv anti-CD123 humanizada.
La región bisagra puede incluir al menos una porción de una inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) que se encuentra entre los dominios CH2-CH3. En algunas realizaciones, las regiones bisagra es una bisagra modificada. La bisagra modificada puede tener una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos que contribuyen a reducir los efectos inespecíficos de los CD123CAR, incrementando de ese modo su especificidad y eficacia. Una “modificación de aminoácido” o una “sustitución de aminoácido” o una “sustitución”, como se usa aquí, significa una sustitución, inserción, y/o supresión de aminoácido en una secuencia proteica o peptídica. Una “sustitución de aminoácido” o “sustitución”, como se usa aquí, significa el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia peptídica o proteica progenitora, por otro aminoácido. Por ejemplo, la sustitución S228P se refiere a una proteína o péptido variante, en el que la serina en la posición 228 se sustituye por prolina.
Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer mediante mutación de manera que un codón particular en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o péptido se cambia por un codón que codifica un aminoácido diferente. Tal mutación se obtiene generalmente haciendo los menores cambios nucleotídicos posibles. Se puede obtener una mutación de sustitución de este tipo para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de una manera no conservativa (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular por un aminoácido que pertenece a otro grupo), o de una manera conservativa (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular por un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Tal cambio conservativo conduce generalmente a menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante.
Los siguientes son ejemplos de diversos agrupamientos de aminoácidos:
• Aminoácidos con grupos R no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina
• aminoácidos con grupos R polares no cargados: glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina
• aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente a pH 6,0): ácido aspártico, ácido glutámico
• aminoácidos básicos (cargados positivamente a pH 6,0): lisina, arginina, histidina (a pH 6,0)
Otro grupo puede ser aquellos aminoácidos con grupos fenilo: fenilalanina, triptófano, tirosina.
Otro grupo puede ser según el peso molecular (es decir, tamaño de los grupos R), como se muestra más abajo:
Figure imgf000007_0001
En ciertas realizaciones, la bisagra modificada deriva de una IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 que incluye uno o más restos de aminoácido sustituidos por un resto de aminoácido diferente del que está presente en una bisagra sin modificar. El uno o más restos de aminoácido sustituidos se seleccionan de, pero no se limitan a, uno o más restos de aminoácido en las posiciones 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, o una combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la bisagra modificada deriva de una IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 que incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes sustituciones de restos de aminoácido: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, E233P, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, T299A, Y300L, V305I, V309L, E318A, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, E333A, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L, o una combinación de las mismas (50).
En algunas realizaciones, la bisagra modificada deriva de una bisagra de IgG4 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
POS. 219ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQ EDPEVQFNWY
Pos. 279VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISK Pos. 339AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL Pos. 399DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQID
NO:13)
En ciertas realizaciones, la bisagra modificada deriva de IgG4 que incluye uno o más restos de aminoácidos sustituidos por un resto de aminoácido diferente del que está presente en una bisagra sin modificar. El uno o más restos de aminoácidos sustituidos se seleccionan de, pero no se limitan a, uno o más restos de aminoácidos en las posiciones 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331,332, 333, 334, 336, 339, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la bisagra modificada deriva de una IgG4 que incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes sustituciones de restos de aminoácidos: 220S, 226S, 228P, 229S, 230S, 233P, 234A, 234V, 234F, 234A, 235A, 235E, 236A, 237A, 238S, 239D, 243L, 247I, 267E, 268Q, 280H, 290S, 290E, 290N, 292P, 297A, 297Q, 298A, 298G, 298D, 298V, 299A, 300L, 305I, 309L, 318A, 326A, 326W, 326E, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332E, 333A, 333S, 333S, 334A, 339D, 339Q, 396L, o una combinación de las mismas, en el que el aminoácido en la bisagra sin modificar se sustituye por los aminoácidos identificados anteriormente en la posición indicada.
En algunas realizaciones, la bisagra de IgG4 modificada incluye, pero no se limita a, una sustitución de prolina (P) en lugar de serina (S) en la posición 228 (S228P), una sustitución de leucina (L) en lugar de ácido glutámico (E) en la posición 235 (L235E), una sustitución de asparagina (N) en lugar de glutamina (Q) en la posición 297 (N297Q). En ciertas realizaciones, una región bisagra de IgG4 modificada puede incluir una secuencia nucleotídica seleccionada de lo siguiente:
nucleótidos 814-1500 de SEQ ID NO:3 para un 32716CAR; o
nucleótidos 793-1479 de SEQ ID NO:4 para un 26292CAR.
Dichas secuencias nucleotídicas codifican secuencias de aminoácidos seleccionadas de lo siguiente:
restos 267-495 de SEQ ID NO:3 cuando se usan en un 32716CAR; o
restos 260-488 de SEQ ID NO:14 cuando se usan en un 26292CAR
En un ejemplo, la región bisagra de IgG4 modificada incluye una sustitución S228P y una sustitución L235E (“S228P+L235E”) (véanse las Figuras 10 y 11). En otra realización, la región bisagra de IgG4 modificada incluye una sustitución S228P, una sustitución L235E, y una sustitución N297Q (“S228P+L235E+N297Q”) (véanse las Figuras 12 y 13).
En algunas realizaciones, la bisagra se puede modificar para sustituir la región espaciadora de Fc en el C123CAR por un espaciador que no tenga unión de Fc, tal como la región bisagra de CD8a. Como alternativa, la región espaciadora de Fc de la bisagra se puede suprimir. Tales sustituciones reducirían o eliminarían la unión de Fc. El término “posición”, como se usa aquí, es una localización en la secuencia de una proteína. Las posiciones se pueden numerar secuencialmente, o según un formato establecido, por ejemplo una posición de Kabat o una posición EU o índice EU como en Kabat. Para todas las posiciones explicadas aquí, la numeración es según el índice EU o esquema de numeración EU (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). El índice EU o índice EU como en Kabat, o esquema de numeración EU, se refiere a la numeración del anticuerpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85). Las posiciones de Kabat, aunque también son bien conocidas en la técnica, pueden variar con respecto a la posición EU para una posición dada. Por ejemplo, las sustituciones S228P y L235E descritas anteriormente se refieren a la posición EU. Sin embargo, estas sustituciones también pueden corresponder a las posiciones de Kabat 241 (S241P) y 248 (L248E) [21].
El dominio de señalización coestimulante puede incluir cualquier dominio coestimulante adecuado que incluya, pero no se limite a, un dominio coestimulante 4-1BB, un dominio coestimulante OX-40, un dominio coestimulante CD27, o un dominio coestimulante CD28. Según las realizaciones descritas aquí, un CD123CAR puede incluir al menos un dominio de señalización coestimulante. En un aspecto, el CD123CAR tiene un único dominio de señalización coestimulante, o puede incluir dos o más dominios de señalización coestimulantes, tales como los descritos anteriormente. En otro aspecto, el dominio coestimulante puede estar formado por un único dominio coestimulante, tal como los descritos anteriormente, o como alternativa, puede estar formado por dos o más porciones de dos o más dominios coestimulantes. Como alternativa, en algunas realizaciones, el CD123CAR no incluye un dominio de señalización coestimulante.
En una realización, el CD123CAR incluye un dominio de señalización coestimulante que es un dominio coestimulante CD28. El dominio de señalización CD28 puede incluir un dominio transmembránico CD28 modificado. En una realización, tal dominio transmembránico CD28 modificado tiene una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos, que incluyen, pero no se limitan a, una sustitución de leucina-leucina (LL) por glicina-glicina (GG) en los restos de aminoácidos 530-531 de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12; o los restos 523-524 de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 (por ejemplo, RLLH —— RGGII [22]). En ciertas realizaciones, una región modificada de dominio de señalización coestimulante puede incluir una secuencia nucleotídica seleccionada de lo siguiente:
nucleótidos 1501-1707 de SEQ ID NO:3 para un 32716CAR; o
nucleótidos 1480-1686 de SEQ ID NO:4 para un 26292CAR.
Dichas secuencias nucleotídicas codifican secuencias de aminoácidos seleccionadas de lo siguiente:
restos 498-564 de SEQ ID NO:3 cuando se usan en un 32716CAR; o
restos 489-557 de SEQ ID NO:4 cuando se usan en un 26292CAR.
El dominio de señalización intracelular puede incluir cualquier complejo del receptor de células T (TCR) adecuado, porción de dominio de señalización del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización de la cadena zeta (cadena Z) de TCR. En ciertas realizaciones, un dominio de señalización de la cadena Z puede incluir una secuencia nucleotídica seleccionada de lo siguiente:
nucleótidos 1717-2052 de SEQ ID NO:3 para un 32716CAR; o
nucleótidos 1696-2031 de SEQ ID NO:4 para un 26292CAR.
Dichas secuencias nucleotídicas codifican secuencias de aminoácidos seleccionadas de lo siguiente:
restos 568-679 de SEQ ID NO:3 cuando se usan en un 32716CAR;
restos 561-672 de SEQ ID NO:4 cuando se usan en un 26292CAR.
Por lo tanto, según las realizaciones descritas anteriormente, el gen CD123CAR puede incluir una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4. En otras realizaciones, el gen CD123CAR puede codificar una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12. (Figuras 10, 11, 12, 13).
Expresión de genes CD123CAR y transducción de células T
En algunas realizaciones, el gen CD123CAR es parte de un casete de expresión. En algunas realizaciones, el casete de expresión también puede incluir - además del gen CD123CAR - un gen accesorio. Cuando se expresa mediante una célula T, el gen accesorio puede servir como un marcador de selección de células T transducidas, un marcador de rastreo in vivo, o un gen suicida para células T transducidas.
En algunas realizaciones, el gen accesorio es un gen de EGFR truncado (EGFRt). Un EGFRt se puede usar como una herramienta de selección no inmunogénica (por ejemplo, selección inmunomagnética que usa cetuximab biotinilado en combinación con microperlas anti-biotina para el enriquecimiento de células T que se han transducido lentivíricamente con constructos que contienen EGFRt), como un marcador de rastreo (por ejemplo, análisis citométrico de flujo para rastrear el injerto de células T), y como gen suicida (por ejemplo, vía rutas de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) mediada por Cetuximab/Erbitux®). Un ejemplo de un gen de EGFR truncado (EGFRt) que se puede usar según las realizaciones descritas aquí se describe en la Solicitud Internacional n° PCT/US2010/055329. En otras realizaciones, el gen accesorio es un gen de CD19 truncado (CD19t).
En otra realización, el gen accesorio es un gen suicida inducible. Un gen suicida es un gen recombinante que hará que la célula en la que se expresa el gen sufra la muerte celular programada o el aclaramiento mediado por anticuerpo en el momento deseado. En una realización, un gen suicida inducible que se puede usar como un gen accesorio es un gen de caspasa 9 inducible (véase Straathof et al. (2005) An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. June 1; 105(11): 4247-4254).
En algunas realizaciones, el casete de expresión que incluye un gen CD123CAR descrito anteriormente se puede insertar en un vector para el suministro - vía transducción o transfección - de una célula diana. Se puede usar cualquier vector adecuado, por ejemplo un vector bacteriano, un vector vírico, o un plásmido. En algunas realizaciones, el vector es un vector vírico seleccionado de un vector retrovírico, un vector lentivírico, un vector poxvírico, un vector adenovírico, o un vector vírico adenoasociado. En algunas realizaciones, el vector puede transducir una población de células T sanas. Las células diana transducidas o transfectadas con éxito expresan el uno o más genes que son parte del casete de expresión.
Como tal, una o más poblaciones de células T se pueden transducir con un gen CD123CAR. En algunas realizaciones, el gen CD123CAR incluye una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En consecuencia, en algunas realizaciones, las células T transducidas expresan un gen CD123CAR que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. (Figuras 10, 11, 12, 13). Las células T transducidas pueden ser de un donante, o pueden ser de un sujeto que tiene AML y que necesita tratamiento para AML. En algunas realizaciones, las células T transducidas se usan en tratamiento de inmunoterapia adoptiva, para el tratamiento de AML
Además, la una o más poblaciones de células T puede ser parte de una composición farmacéuticamente aceptable para el suministro para la administración a un sujeto. Además de las células T transducidas con CD123CAR, la composición farmacéuticamente eficaz puede incluir uno o más portadores farmacéuticamente eficaces. Un “portador farmacéuticamente aceptable”, como se usa aquí, se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable que está implicado en portar o transportar un tratamiento de interés desde un tejido, órgano, o porción del cuerpo a otro tejido, órgano, o porción del cuerpo. Tal portador puede comprender, por ejemplo, una carga líquida, sólida, o semisólida, disolvente, tensioactivo, diluyente, excipiente, adyuvante, aglutinante, amortiguador, auxiliar de la disolución, disolvente, material de encapsulamiento, agente secuestrante, agente dispersante, conservante, lubricante, disgregante, espesante, emulsionante, agente antimicrobiano, antioxidante, agente estabilizante, agente colorante, o alguna combinación de los mismos.
Cada componente del portador es “farmacéuticamente aceptable”, por cuanto debe ser compatible con los otros ingredientes de la composición, y debe ser adecuado para el contacto con cualquier tejido, órgano, o porción del cuerpo que pueda encontrar, queriendo decir que no puede presentar un riesgo de toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad, o cualquier otra complicación que supere excesivamente sus beneficios terapéuticos.
Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) polímeros naturales tales como gelatina, colágeno, fibrina, fibrinógeno, laminina, decorina, hialuronano, alginato y quitosano; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de alazor, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles tales como propilenglicol; (11 ) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como carbonato de trimetileno, oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico (o alginato); (16) agua libre de pirógenos; (17) disolución salina isotónica; (18) disolución de Ringer; (19) alcohol, tal como alcohol etílico y propanol; (20) disoluciones amortiguadoras de fosfato; (21) termoplásticos, tales como poliácido láctico, poliácido glicólico, (22) poliésteres, tal como policaprolactona; (23) péptidos que se autoensamblan; y (24) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas, tal como acetona.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes que ajustan y amortiguan el pH, agentes que ajustan la toxicidad, y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, y similares.
En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es un portador acuoso, por ejemplo disolución salina amortiguada, y similar. En ciertas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es un disolvente polar, por ejemplo acetona y alcohol.
La concentración de células T transducidas con CD123CAR en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, tamaño del órgano, peso corporal, y similar, según el modo particular de administración seleccionado, y las necesidades del sistema biológico.
En ciertas realizaciones, las poblaciones de células T transducidas con un gen CD124CAR (es decir, células T transducidas con CD124CAR), tales como aquellas células descritas aquí usadas en los métodos para seleccionar y exterminar células de AML, se pueden hacer crecer en un cultivo celular. En ciertos aspectos de esta realización, el método se puede usar en un marco in vitro o de investigación, para investigar el papel de CD123 en la etiología de AML, o para evaluar las capacidades dianizadoras de nuevos constructos de CD123CAR.
Tratamiento de AML con células T transducidas con CD123CAR
Según algunos ejemplos, los genes CD123CAR y las poblaciones de células T que se transducen con genes CD123CAR, tales como las descritas anteriormente, se pueden usar en composiciones para uso en métodos para tratar AML en un sujeto. Tales métodos pueden incluir una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una población de células T transducidas con al menos un gen CD123CAR. En estas realizaciones, la población de células T transducidas con CD123CAR expresa uno o más genes CD123CAR, tales como los descritos anteriormente. En ciertas realizaciones, las células T se transducen con y expresan un constructo génico 32716CAR(S228P+L235E+N297Q) (Figura 12) o un constructo génico 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) (Figura 13). Cuando tales células se administran vía un tratamiento de inmunoterapia adoptiva, las células T transducidas seleccionan específicamente como diana y lisan células que expresan CD123 (es decir, células de AML) in vivo, suministrando de ese modo su efecto terapéutico de eliminar células cancerosas. Como se describe en los Ejemplos más abajo, los constructos del gen CD123CAR que tienen las mutaciones S228P y L235E en el intervalo de la bisagra proporcionan protección suficiente frente a efectos inespecíficos para generar una respuesta suficiente en células cultivadas in vitro. Sin embargo, este dato no se debería extrapolar a estos efectos de los constructos in vivo. Los investigadores dan a menudo una gran diferencia a datos in vitro con respecto a su transferibilidad de un efecto de tratamiento a datos in vivo. Algunas veces, los datos in vitro no coinciden con los datos in vivo. Sin embargo, esta correlación es impredecible, debido a que, como muestra la Figura 8, los constructos génicos CD123CAR(S228P+L235E) (Figuras 10-11), que mostraron un efecto celular antitumoral muy eficaz in vitro, no tuvieron los mismos efectos in vivo. En consecuencia, se llevó a cabo una mutación adicional en la región bisagra (N297Q) para generar los constructos CD123CAR(S228P+L235E+N297Q).
En contraste con los constructos génicos CD123CAR(S228P+L235E), la administración de estos constructos dio como resultado una reducción significativa de la carga leucémica.
La población o poblaciones de células T transducidas con el gen o genes CD123CAR que se pueden usar según los métodos descritos aquí se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada de administración, solos o como parte de una composición farmacéutica. Una vía de administración se puede referir a cualquier ruta de administración conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, intracraneal, parenteral, o transdérmica. “Parenteral” se refiere a una vía de administración que está generalmente asociada con inyección, incluyendo infraorbital, infusión, intraarterial, intracapsular, intracardíaca, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intratumoral, intrauterina, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutánea, transmucosal, o transtraqueal. En ciertas realizaciones, las células T transducidas se administran intravenosa o intratecalmente.
La expresión “cantidad eficaz”, como se usa aquí, se refiere a una cantidad de un agente, compuesto, tratamiento o terapia que produce un efecto deseado. Por ejemplo, una población de células se puede poner en contacto con una cantidad eficaz de un agente, compuesto, tratamiento o terapia para estudiar su efecto in vitro (por ejemplo, cultivo celular) o para producir un efecto terapéutico deseado ex vivo o in vitro. Una cantidad eficaz de un agente, compuesto, tratamiento o terapia se puede usar para producir un efecto terapéutico en un sujeto, tal como prevenir o tratar una afección diana, aliviar los síntomas asociados con la afección, o producir un efecto fisiológico deseado. En tal caso, la cantidad eficaz de un compuesto es una “cantidad terapéuticamente eficaz”, “concentración terapéuticamente eficaz” o “dosis terapéuticamente eficaz”. La cantidad eficaz precisa o cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de la composición que producirá los resultados más eficaces en términos de eficacia de tratamiento en un sujeto dado o población de células. Esta cantidad variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo, pero sin limitarse a, las características del compuesto (incluyendo actividad, farmacocinética, farmacodinámica, y biodisponibilidad), el estado fisiológico del sujeto (incluyendo edad, sexo, tipo de enfermedad y etapa, condición física general, respuesta a una dosis dada, y tipo de medicación) o células, la naturaleza del portador o portadores farmacéuticamente aceptables en la formulación, y la vía de administración. Además, una cantidad eficaz o terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de si el compuesto se administra solo o en combinación con otro compuesto, fármaco, terapia u otro método o modalidad terapéutica. El experto en las técnicas clínicas y farmacológicas será capaz de determinar una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz a través de la experimentación habitual, a saber, monitorizando una respuesta de las células o del sujeto a la administración de un compuesto, y ajustando la dosis en consecuencia. Para una guía adicional, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005. Los agentes, compuestos, tratamientos o terapias que se pueden usar en una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz para producir un efecto deseado según las realizaciones descritas aquí pueden incluir, pero no se limitan a, un gen CD123CAR, un casete de expresión que incluye un gen CD123CAR, un vector que suministra un casete de expresión que incluye un gen CD123CAR a una célula diana, tal como una célula T, y una población de células T que se transducen con un gen CD123CAR.
Los términos “tratar” o “tratamiento” de una afección se pueden referir a prevenir la afección, ralentizar el comienzo o velocidad de desarrollo de la afección, reducir el riesgo de desarrollar la afección, prevenir o retrasar el desarrollo de síntomas asociados con la afección, reducir o terminar los síntomas asociados con la afección, generar una regresión total o parcial de la afección, o alguna combinación de los mismos. El tratamiento también puede significar un tratamiento profiláctico o preventivo de una afección.
El término “sujeto”, como se usa aquí, se refiere a un ser humano o animal, incluyendo todos los mamíferos, tales como primates (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejo, y vaca. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En ciertos ejemplos, las composiciones para uso en métodos para tratar AML pueden incluir una etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una primera población de células T transducidas con un primer gen CD123CAR, en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de una segunda población de células T transducidas con un segundo gen CD123CAR.
En otras realizaciones, las células T transducidas con CD123CAR se pueden administrar en combinación con una o más terapias contra el cáncer adicionales. “En combinación” o “en combinación con”, como se usa aquí, significa en el transcurso del tratamiento del mismo cáncer en el mismo sujeto usando dos o más agentes, fármacos, sustancias terapéuticas, procedimientos, regímenes de tratamiento, modalidades de tratamiento, o una combinación de los mismos, en cualquier orden. Esto incluye la administración simultánea, así como en un orden temporalmente espaciado de hasta varios días separados. Tal tratamiento de combinación también puede incluir más de una única administración de uno o más de los agentes, fármacos, sustancias terapéuticas, procedimientos, regímenes de tratamiento, y modalidades de tratamiento. Además, la administración de los dos o más agentes, fármacos, sustancias terapéuticas, procedimientos, regímenes de tratamiento, modalidades de tratamiento, o una combinación de los mismos, puede ser mediante las mismas vías de administración o diferentes.
Las terapias contra el cáncer adicionales que se pueden usar según los métodos descritos aquí pueden incluir uno o más procedimientos contra el cáncer, modalidades de tratamiento, sustancias terapéuticas contra el cáncer, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las células T transducidas con CD123CAR se pueden administrar en combinación con uno o más procedimientos contra el cáncer o modalidades de tratamiento, que incluyen, pero no se limitan a, transplante de células madre (por ejemplo, transplante de médula ósea o transplante de células madre de sangre periférica usando células madre alogénicas, células madre autólogas; o un transplante no mieloablativo), terapia de radiación, o resección quirúrgica. En otras realizaciones, las células T transducidas con CD123CAR se pueden administrar en combinación con una o más sustancias o fármacos contra el cáncer que se pueden usar para tratar AML, incluyendo, pero sin limitarse a, sustancias quimioterapéuticas y otros fármacos contra el cáncer, sustancias inmunoterapéuticas, sustancias terapéuticas dirigidas, o una combinación de los mismos. Las sustancias quimioterapéuticas y otros fármacos contra el cáncer que se pueden administrar en combinación con las células T transducidas con CD123CAR según las realizaciones descritas aquí incluyen, pero no se limitan a, ácido todo-trans-retinoico (ATRA), trióxido arsénico, antibióticos antraciclínicos y sus sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, hidrocloruro de doxorrubicina, hidrocloruro de daunorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, laromustina), análogos antimetabolitos (citarabina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, metotrexato), agentes desmetilantes (por ejemplo, decitabina, 5-azacitidina), inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, hidroxiurea), inhibidores de topoisomerasas (por ejemplo, etopósido), alcaloides de la vinca (por ejemplo, sulfato de vincristina), o una combinación de los mismos (por ejemplo, “ADE”, que es un tratamiento de combinación que incluye una combinación de citarabina (Ara-C), hidrocloruro de daunorrubicina, y etopósido).
Las sustancias inmunoterapéuticas que se pueden administrar en combinación con las células T transducidas con CD123CAR según las realizaciones descritas aquí incluyen, pero no se limitan a, agentes moduladores inmunes (por ejemplo, inhibidores de STAT3, lenalidomida) y anticuerpos monoclonales terapéuticos. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos se pueden diseñar (i) para dirigirlos contra uno o más antígenos de AML, incluyendo, pero sin limitarse a, CD33 (por ejemplo, gemtuzumab, lintuzumab), MUC1 (por ejemplo, cantuzumab ravtansina, clivatuzumab tetraxetán, pemtumomab); (i) un antígeno de células B (por ejemplo, rituximab, ofatumumab); o un modulador de la vasculatura, tal como VEGF o VEGFR (por ejemplo, alacizumab pegol, bevacizumab, icrucumab, ramucirumab, ranibizumab).
Las sustancias terapéuticas dirigidas que se pueden administrar en combinación con las células T transducidas con CD123CAR según las realizaciones descritas aquí incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de tirosina cinasas (imatinib, dasatinib, nilotinib, sunitinib), inhibidores de farnesil transferasa (por ejemplo, tipifarnib), inhibidores de FLT, e inhibidores de c-Kit (o CD117) (imatinib, dasatinib, nilotinib).
EJEMPLO1:CÉLULASTTRANSDUCIDASCONCD123CAREXHIBENUNAPOTENTEACTIVIDADCITOLÍTICA Y MÚLTIPLESFUNCIONESEFECTORASFRENTEAAMLINVITRO
Materiales y métodos
Estirpes celulares. Excepto que se señale de otro modo, todas las estirpes celulares se mantienen en RPMI 1640 (Irvine Scientific) suplementado con L-glutamina 2 mM, HEPES 25 mM, y 10% de FCS inactivado por calor (Hyclone), denominado aquí en lo sucesivo como medio completo (CM). Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se transformaron con el virus de Epstein-Barr para generar estirpes celulares linfoblastoides (LCL) como se describió previamente [19]. Las células LCL-OKT3 expresan OKT3 unido a la membrana, y se hacen crecer en CM suplementado con 0,4 mg/ml de higromicina [20]. Las células K562 se obtuvieron de ATCC, y se cultivaron como se recomendó. Las células KG1a (proporcionadas amablemente por el Dr. Ravi Bhatia) se mantuvieron en IMDM (Irvine Scientific) con HEPES 25 mM, L-glutamina 4 mM (Irvine Scientific), y 20% de fCs . Las células 293T (un regalo procedente amablemente del Center for Biomedicine and Genetics en City of Hope) se mantuvieron en DMEM 10% de FCS inactivado por calor.
Muestras de AML primarias. Las muestras de AML primarias se obtuvieron de sangre periférica de pacientes (denominadas aquí como ID de Muestra de AML nos 179, 373, 493, 519, 545, 559, 605, 722 y 813). En la Tabla 1 , a continuación, se resumen las características de las muestras.
[La Tabla 1 está en la siguiente página]
Tabla 1. Características de muestras de AML primarias
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Citometría de flujo. Los controles de isotipo conjugados con fluorocromo, anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor ab de células T (TCRab), anti-CD123 (9F5), anti-CD34 (8G12), y anti-CD38 (HIT2) se adquirieron de BD Biosciences. Anti-Fc biotinilado se adquirió de Jackson ImmunoResearch Laboratories. Cetuximab biotinilado (Erbitux) se adquirió de la farmacia COH, y se ha descrito previamente [20]. Anti-CD2, anti-CD3, anti-CD7, anti-CD10, anti-CD11b, anti-CD19, anti-CD33, y anti-CD235A biotinilados se adquirieron de eBioscience. La adquisición de los datos se llevó a cabo en un FACSCalibur, LSRII (BD Biosciences), o MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec), y se analizó usando FCS Express, Versión 3 (De Novo Software).
Transfección de células 293T con CD123. ADNc de CD123 se amplificó a partir de CD123-pMD18-T (Sino Biological Inc.) usando la reacción en cadena de la polimerasa y los cebadores (CD123-F: 5’-ATAAGGCCTGCCGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACG-3’ y CD123-R 5’-ATAGCTAGCTCAAGTTTTCTGCACGACCTGTACTTC-3’). El producto de la PCR se clonó en pMGPac usando los sitios de restricción StuI y NheI. Las células 293T se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. 24 horas después de la transfección, la expresión de CD123 se confirmó mediante citometría de flujo.
Generación de vectores lentivíricos. Para generar los constructos de CAR usados en este estudio, se sintetizaron (GENEART) secuencias de ADN con codones optimizados que codifican las cadenas VH y VL, una bisagra de IgG4 modificada y un dominio transmembránico de CD28 modificado (RLLH ^ RGGH [22]), y se clonaron en CD19RCAR-T2AEGFRt_epHIV7 [20] usando los sitios Nhel y RsrlI para sustituir el CD19RCAR. El lentivirus se produjo transfectando células 293T con un vector lentivírico y los vectores de empaquetamiento pCMV-Rev2, pCHGP-2, y pCMV-G usando el kit de transfección de células de mamífero CalPhosTM (Clontech). Estos constructos de CAR 26292 y 32716 también se denominan aquí como 26292CAR(S228P+L235E) o 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) (Figuras 11 y 13) y 32716CAR(S228P+L235E) o 32716CAR(S228P+L235E+N297Q) (Figuras 10 y 12). Los sobrenadantes lentivíricos se recogieron a 24, 48 y 72 horas tras la transfección, y se concentraron mediante ultracentrifugación.
Transducción de PBMCs de donantes sanos y de pacientes con AML. Se obtuvieron PBMCs despersonalizados a partir de donantes sanos y de pacientes bajo protocolos aprobados por la junta de revisión institucional. Para los donantes sanos, las células T se activaron usando OKT3 (30 ng/ml) en CM suplementado 3 veces una semana con 25 U/ml de IL-2 y 0,5 ng/ml de IL-15 (denominado aquí como medio de células T). 72 horas tras la activación, las células T se inocularon de forma centrífuga con lentivirus a una MOI = 3 centrifugando durante 30 minutos a 800g y 32°C. La expresión de CAR se analizó mediante citometría de flujo 12-14 días tras la transducción lentivírica. Las células T que expresan EGFRt se enriquecieron como se describió previamente [20]. Las células T se expandieron en medio de células T mediante el método de expansión rápida [23].
Para la modificación genética de células T procedentes de pacientes con AML, sangre periférica descongelada o producto de aféresis se estimuló usando Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28 (Life Technologies), a una relación de perlas:células CD3+ de 3:1 en medio de células T. 72 horas tras la estimulación de las perlas, las células se inocularon de forma centrífuga con lentivirus a una MOI = 3. Las perlas se retiraron 9-14 días después de la estimulación inicial usando un imán DynaMag™-50 (Life Technologies), y las células T se mantuvieron en medio de células T. Las estirpes de células T derivadas de pacientes con AML que expresan CAR no se seleccionaron inmunomagnéticamente antes del uso en ensayos de exterminio.
Ensayo de proliferación de CFSE. Células T se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína 0,5 pM (CFSE; Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante. Las células T marcadas se cocultivaron con, o sin, células estimulantes, a una relación E:T de 2:1 en CM suplementado con 10 U/ml de IL-2. Después de 72-96 horas, las células se cosecharon y se tiñeron con cetuximab biotinilado, así como con yoduro de propidio o DAPI, para excluir del análisis a las células muertas. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la proliferación de células vivas EGFRt positivas mediante dilución de CFSE.
Ensayo de liberación de cromo y ensayo de secreción de citocina. Las células diana se marcaron durante 1 hora con 51Cr (PerkinElmer), se lavaron cinco veces, y se repartieron en alícuotas por triplicado a 5 X 103 células/pocillo con células efectoras a diversas relaciones de efector a diana (E:T). Tras un cocultivo durante 4 horas, los sobrenadantes se cosecharon, y la radioactividad se midió usando un contador gamma o un Topcount (PerkinElmer). La lisis específica en porcentaje se calculó como se describió previamente [24]. La producción de citocina tras un cocultivo de 24 horas a una relación E:T de 10:1 se midió como se describió previamente [25].
Desgranulación de CD107a y producción de citocina intracelular. Se cocultivaron células T con células diana a una E:T de 2:1 durante seis horas a 37°C en presencia de GolgiStop™ (BD Biosciences) y anticuerpo anti-clon H4A3 de CD107a o anti-control de isotipo coincidente. Al finalizar las seis horas de incubación, las células se cosecharon, se lavaron y se tiñeron con anti-CD3, CD4, CD8, y cetuximab biotinilado, seguido de una tinción secundaria usando estreptavidina conjugada con PE. Las células se fijaron entonces y se permeabilizaron (Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante, y se tiñeron con anti-IFN-_ (clon B27 de BD Biosciences) y anti-TNF-a (clone MAb11 de BD Biosciences). La adquisición de datos se llevó a cabo usando el analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec), y el análisis se realizó usando FCS Express Versión 3 (De Novo Software).
Ensayo celular formador de colonias. Se seleccionaron células CD34+ procedentes de células mononucleares de sangre del cordón (CB) o muestras de AML primarias, usando separación en columna inmunomagnética (Miltenyi Biotech). Se cocultivaron 103 células CB CD34+ con 25 X 103 células efectoras durante 4 horas antes de la siembra en placas en cultivo progenitor de metilcelulosa semisólido en pocillos por duplicado [26]. 14 a 18 días más tarde, se enumeraron las colonias de granulocitos-macrófagos de unidades formadoras de colonia (CFU-GM) y de eritroides de unidades formadoras de estallido (BFUE). Para las muestras de AML, se cocultivaron 5 X 103 células de AML CD34+ con 125 X 103 células efectoras durante 4 horas antes de la siembra en placas en cultivo progenitor de metilcelulosa semisólido en pocillos por duplicado.
Análisis estadístico. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando Graphpad Prism v5.04. Para identificar diferencias significativas entre grupos de tratamiento, se usó la prueba de la t de Student no emparejada.
Resultados
Generación de células T que expresan CD123 CAR
Para redirigir la especificidad de células T, se desarrollaron vectores lentivíricos que codifican CD123 CARs. Cada uno de los CARs incluye secuencias con codones optimizados que codifican uno de dos scFvs específicos de CD123, 26292 y 32716 [18], respectivamente. Los scFvs se fusionan en el marco a la región de Fc de IgG4 humana, un dominio coestimulante de CD28, y el dominio de señalización de CD3Z. Justo en dirección 3’ de la secuencia de CAR se encuentra una secuencia de omisión de ribosoma T2A y un marcador de transducción de EGFR humano truncado (EGFRt) (Figura 1A). Las PBMCs estimuladas con OKT3 procedentes de donantes sanos se transdujeron lentivíricamente, y las células T que expresan CAR se aislaron mediante selección inmunomagnética usando anticuerpo Erbitux biotinilado, seguido de una tinción secundaria con perlas magnéticas anti-biotina. Tras un ciclo de REM, las células aisladas se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión superficial de CAR y el fenotipo de las células T. Tanto la expresión de FC como de EGFRt fue mayor que 90% en las estirpes de células T generadas procedentes de tres donantes sanos, y los productos de células T finales consistieron en una mezcla de células T CD4 y CD8 positivas (Figura 1B, 1C).
Células T modificadas por CD123 CAR seleccionan específicamente a estirpes celulares tumorales que expresan CD123
Para confirmar la especificidad de las células T modificadas con CD123 CAR, se examinó la capacidad de las células T genéticamente modificadas para lisar células 293T transfectadas transitoriamente para expresar CD123 (293T-CD123; Figura 2A). Ambas células T modificadas con CD123 CAR generadas lisaron eficientemente células 293T-CD123, pero no células 293T transfectadas transitoriamente para expresar CD19, demostrando el reconocimiento específico de CD123 (Figura 2B). A continuación, se investigó la capacidad citolítica in vitro de células T específicas de CD123 frente a estirpes celulares tumorales que expresan endógenamente CD123. La expresión de CD123 en las estirpes celulares LCL y KG1a se confirmaron mediante citometría de flujo (Figura 2C). Ambas estirpes de células T específicas de CD123 lisaron eficientemente las estirpes diana LCL y KG1a, pero no la estirpe celular CD123-K562 (Figura 2C). Las células T específicas de CD19 con pares coincidentes lisaron eficazmente las dianas de LCL CD19+, pero no las dianas CD19- KG1a o K562 (Figura 2D). Las células progenitoras transducidas de forma simulada lisaron solamente la estirpe celular LCL-OKT3 de control positivo (Figura 2D).
Células T modificadas con CD123 CAR activan múltiples funciones efectoras cuando se cocultivan con células diana CD123-positivas
Para examinar la función efectora de células T específicas de CD123, se midió la secreción de IFN-g y TNF-a tras el cocultivo con diversas estirpes celulares tumorales. Los productos de células T que expresan CD123 CAR produjeron tanto IFN-y como TNF-a cuando se cocultivaron con células diana CD123+, mientras que las células T específicas de CD19 con pares coincidentes segregaron estas citocinas solamente cuando se cocultivaron con la estirpe celular CD19+ LCL o LCL-OKT3 Figura 3A). Adicionalmente, ambas estirpes de células T específicas de CD123 proliferaron cuando se cocultivaron con cualquiera de las estirpes celulares CD123+ LCL, LCL-OKT3, o KG1a, pero no con la estirpe celular CD123- K562 (Figura 3B). Por el contrario, las células T que expresan CD19 CAR con pares coincidentes proliferaron solamente cuando se cocultivaron con LCL o LCL-OKT3 (Figura 3B).
Células T modificadas con CD123 CAR activan múltiples funciones efectoras cuando se cocultivan con muestras de AML primarias
La sobreexpresión de CD123 en muestras de AML primarias está bien documentada [27-29], y se confirmó en este estudio (Figura 14). Las respuestas de células T de múltiples facetas son críticas para respuestas inmune robustas frente a infecciones y vacunas, y también pueden desempeñar un papel en la actividad antitumoral de células T redirigidas por CAR [30]. Para investigar la capacidad de células T modificadas con CD123 CAR para activar múltiples rutas efectoras frente a muestras de AML primarias, se cocultivaron células T modificadas con tres muestras de pacientes con AML diferentes (179, 373, y 605) durante 6 horas, y se evaluaron para determinar el aumento de CD107a y la producción de IFN-y y TNF-a usando citometría de flujo policromática (estrategia de acotamiento mostrada en la Figura 15). La movilización en la superficie celular de CD107a se observó tanto en los compartimentos de CD4 como de CD8 de células T específicas de CD123, mientras que las células T específicas de CD19R con pares coincidentes no produjeron desgranulación apreciable frente a muestras de AML primarias (Figura 4A, gráfica de barras). Además, las subpoblaciones de células T CD107a+ CD123 CAR también produjeron IFN-y , TNF-a, o ambas citocinas (Figura 4A, gráficas circulares). Esta respuesta multifuncional se observó para las poblaciones tanto de CD4 como de CD8 (Figura 4A y 4B). Adicionalmente, se examinó la capacidad de células T modificadas con CAR para proliferar en respuesta al cocultivo con muestras de AML primarias. Ambas estirpes de células T específicas de CD123 fueron capaces de proliferar tras el cocultivo con muestras de AML 813 o B-ALL 802 (Figura 4C). Se observó proliferación para las poblaciones tanto de CD4 como de CD8 (Figura 16). Las células T específicas de CD19 con pares coincidentes proliferaron cuando se cocultivaron con CD19+ pre B-ALL 802, pero no cuando se cocultivaron con AML 813.
Células T que expresan CD123 CAR se dirigen contra células de AML primarias in vitro
Células T específicas de CD123 no eliminan la formación de colonias por células de sangre de cordón in vitro Dado que CD123 se expresa en progenitores mieloides comunes (CMPs) [31], se investigó el efecto de las células T modificadas sobre la capacidad formadora de colonias de muestras de sangre de cordón (CB) normales enriquecidas con CD34. La formación de colonias mieloides y eritroides por las muestras de CB no se redujo significativamente tras un cocultivo de 4 horas con células T que expresan CD123-CAR a una E:T de 25:1, cuando se comparan con células T que expresan CD19R CAR T con pares coincidentes (Figura 6 A y B). A continuación, se examinó in vitro la capacidad de las células T específicas de CD123 para inhibir el crecimiento de células AML clonogénicas primarias. Ambas estirpes de células T que expresan CD123 CAR disminuyeron significativamente la formación de colonias leucémicas en comparación con células T que expresan CD19R con pares coincidentes (Figura 6C). En particular, las células T específicas de CD123 tuvieron un mayor impacto sobre la formación de colonias leucémicas en comparación con la formación de colonias mieloides normales (Figura 6D, reducción de 69% frente a reducción de 31%, respectivamente).
Células T procedentes de pacientes con AML se pueden modificar genéticamente para expresar CD123 CARs y seleccionar específicamente células tumorales autólogas
Se sabe que las células T derivadas de pacientes con AML no repolarizan bien la actina, y forman sinapsis inmunes defectuosas con blastos autólogos [32]. Adicionalmente, según nuestro conocimiento, las células T que expresan CAR derivadas de pacientes con AML todavía se han de describir. Por lo tanto, se determinó si las células T procedentes de pacientes con AML se podrían modificar genéticamente para expresar CARs específicos de CD123. PBMCs crioconservadas (AML 605 y AML 722) o producto de aféresis (AML 559) se estimularon con perlas de CD3/CD28, y se transdujeron lentivíricamente para expresar los CARs de CD123 o un CAR de control de CD19R. Todas las células T derivadas de muestras de las tres muestras de pacientes expresaron el 26292 CAR (eficiencia de la transducción 40-65%), el 32716 CAR (eficiencia de la transducción 46-70%) y el CD19R CAR (para evaluar la capacidad de las células T específicas de CD123 para exterminar células de AML primarias, se cocultivaron células T que expresan CD19R CAR o CD123 CAR con pares coincidentes con muestras de pacientes con AML enriquecidas con CD34 primarias, en un ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas. En contraste con las células T de CD19R con pares coincidentes, ambas estirpes de células T de CD123 CAR lisaron robustamente todas las muestras de pacientes con AML primarias ensayadas (Figura 5A). Adicionalmente, mientras que no se observó diferencia estadística entre la capacidad citolítica de las células T que expresan CD123 CAR, ambas células T específicas de CD123 demostraron una citotoxicidad significativamente potenciada cuando se comparan con las células T de CD19R-CAR con pares coincidentes (Figura 5B).
23-37% de eficiencia de la transducción). Un ejemplo representativo del fenotipo de células T de CAR derivadas de pacientes con AML se muestra en la Figura 7A. A continuación, se examinó el potencial citolítico de células T de CAR derivadas de pacientes con AML frente a células diana enriquecidas con CD34 autólogas en un ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas. Todas las células enriquecidas con CD34 autólogas expresaron CD123, aunque en porcentajes e intensidades variables (Figura 7B). Las células T derivadas de AML 605 y 722 lisaron eficientemente blastos autólogos, mientras que las células T derivadas de AML 559 presentaron bajos niveles de lisis de blastos autólogos, probablemente debido a la expresión baja y heterogénea de CD123 en blastos de AML 559 (Figura 7C).
Discusión
Las realizaciones descritas aquí incluyen la generación de dos nuevos CARs dirigidos contra CD123 usando scFvs procedente de inmunotoxinas recombinantes (RITs), 26292 y 32716, que se unen a epítopos distintos y tienen afinidades de unión similares por CD123 [18]. Cuando se expresan mediante una población de células T, estos CARs dirigidos contra CD123 redirigen la especificidad de las células T frente a células que expresan CD123. Usando un ensayo de liberación de cromo 51 (51Cr) de 4 horas estándar, células T de donantes sanos que se manipularon para expresar los CD123 CARs lisaron eficientemente estirpes celulares CD123+ y muestras de pacientes con AML primaria. Adicionalmente, ambas células T CD123 CAR activaron múltiples funciones efectoras tras el cocultivo con estirpes celulares CD123+ y muestras de pacientes con AML primaria. Además, las células T dirigidas contra CD123 no redujeron significativamente el número de colonias de granulocitos-macrófagos de unidades formadoras de colonias (CFU-GM) o de colonias de eritroides de unidades formadoras de estallido (BFU-E) procedentes de sangre del cordón (CB) cuando se compararon con células T CD19 CAR. En particular, mientras que las células T específicas de CD19 tuvieron poco impacto sobre la formación de colonias leucémicas de muestras de AML primarias, las células T dirigidas contra CD123 redujeron significativamente la formación de colonias leucémicas in vitro. También se mostró que las células T derivadas de pacientes con AML pueden expresar CD123 CARs y lisar blastos autólogos in vitro.
Las células T que expresan cualquiera de los dos CARs específicos de CD123 pueden lisar específicamente estirpes celulares que expresan CD123 y muestras de pacientes con AML primarias, y activan múltiples funciones efectoras de una manera específica del antígeno in vitro, demostrando que ambos epítopos son dianas potenciales para el tratamiento. No se observaron diferencias importantes entre las estirpes de células T modificadas con CD123 CAR con respecto al exterminio de células diana, con respecto a la secreción de citocina, o con respecto a la proliferación, cuando se cocultivan con células CD123+. Una posible explicación para esto son las afinidades de unión de los scFvs específicos de CD123 usados en los CD123-CARs, que están en el intervalo nanomolar y difieren en menos de 3 veces, y de este modo no ofrecen ninguna ventaja significativa en la unión al antígeno diana conferida por cualquiera de los scFv [18].
La expresión de múltiples antígenos de la superficie celular en células de AML se ha documentado bien [4, 27, 34]. La dianización de algunos de estos antígenos vía células T que expresan CAR puede no ser factible. Por ejemplo, el antígeno TIM-3 asociado a AML se expresa en un subconjunto de células T agotadas [35, 36], y la dianización de TIM-3 usando células T modificadas con CAR puede dar como resultado la autolisis de células genéticamente modificadas. Adicionalmente, CD47 se expresa ubicuamente [37], y de este modo no puede ser seleccionable como diana por las células T manipuladas con CAR. El antígeno de diferenciación CD33 se expresa predominantemente en células mieloides, y actualmente se usan en marcos clínicos y preclínicos inmunoterapias dirigidas contra CD33, tales como gemtuzumab ozogamicina, anticuerpos que se acoplan a células T biespecíficos de CD33/CD3, y un CD33 CAR [17, 38, 39]. Al igual que TIM-3, CD33 es expresado en un subconjunto de células T, haciéndolo una diana no ideal para una terapia a base de CAR [40]. Adicionalmente, la actividad antileucémica de terapias dirigidas contra CD33 iba acompañada a menudo con una lenta recuperación de la hematopoyesis y de citopenias, probablemente el resultado de la expresión de CD33 en células madre hematopoyéticas normales que se autorrenuevan a largo plazo (HSCs) [41]. Además, las hepatotoxicidades son un efecto secundario común de tratamientos dirigidos contra CD33, y son posiblemente debidas a la dianización no pretendida de células de Kupffer CD33+ [42].
La expresión de CD123 está ausente en células T, restringida predominantemente a células de la estirpe mieloide [43], y está muy ausente en HSCs [27]. Juntas, estas observaciones hacen a CD123 una diana atractiva para la terapia con células T mediada por CAR. Las sustancias terapéuticas específicas para CD123 han presentado perfiles de seguridad favorables en ensayos clínicos de fase I (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 y NCT00397579). Desafortunadamente, estas terapias han fracasado para inducir respuestas en la inmensa mayoría de los pacientes tratados. Las células T que expresan CD123-CAR generadas presentan aquí una potente capacidad citolítica in vitro frente a estirpes celulares CD123+ y muestras de AML primarias. Los estudios descritos más abajo muestran que las muestras primarias procedentes de pacientes con AML de bajo riesgo fueron susceptibles a citotoxicidad mediada por células T CD123 CAR. Colectivamente, en la pequeña cohorte de muestras primarias usada para ensayos de citotoxicidad a corto plazo, las muestras de pacientes con AML que exhibieron características de alto riesgo en el diagnóstico y/o son quimiorresistentes fueron sensibles al exterminio mediante CD123 CAR, de forma similar a lo que se observó en experimentos usando estirpes de células CD123+. Se necesitará realizar más análisis para confirmar que estos resultados serán ciertos para una cohorte más grande de muestras.
Respuestas de células T multifuncionales se correlacionan con el control de la infección vírica, y pueden ser importantes en una respuesta de células T CAR antitumoral [44]. De hecho, los pacientes sensibles a la terapia con células T CD19 CAR tienen respuestas de células T detectables (es decir, desgranulación, secreción o proliferación de citocinas) tras la terapia en respuesta a dianas CD19+ ex vivo [11, 12, 14]. En los Ejemplos más abajo, se demostró que la funcionalidad de células T que expresan CD123-CAR analizando el aumento de CD107a, la producción de citocinas inflamatorias y la proliferación de células T específicas de CD123 en respuesta tanto a estirpes de células CD123+ como a muestras de AML primarias. Además, se observó multifuncionalidad en los compartimentos tanto de CD4+ como de CD8+, que puede promover actividad antileucémica sostenida y alentar la actividad antileucémica en el microentorno tumoral [45, 46]. La inclusión de otros dominios coestimulantes, tal como 4-1BB, y el uso de células T “más jóvenes” menos diferenciadas pueden aumentar adicionalmente las respuestas de CD123 CAR, y son un área de investigación activa [9, 47].
Además, las células T específicas de CD123 no inhiben la formación de colonias progenitoras normales - incluso a una E:T de 25:1. La expresión de CD123 en células linaje-CD34+CD38- es un signo distintivo de la célula progenitora mieloide común, y de este modo una diana probable de células T CD123 CAR [31]. Mientras que se observó una disminución en el porcentaje relativo de colonias derivadas de mieloides cuando se incubaron células de CB con células T específicas de CD123, la disminución no fue significativamente menor que las células T CD19R CAR con pares coincidentes. Es posible que el tamaño limitado de las muestras se atribuya a este resultado, y una experimentación adicional puede revelar una disminución significativa en la formación de CFU-GM en muestras de sangre de cordón tratadas con células T CD123 CAR. Adicionalmente, el cocultivo durante 4 horas de células T y células de CB antes de la colocación en placas puede no ser un período de tiempo suficientemente grande para observar un efecto sobre la formación de colonias progenitoras mieloides normales, y que tiempos de incubación más largos pueden disminuir el número de colonias derivadas de mieloides observadas. Sin embargo, usando la misma metodología como la que se usó para células de CB, se observó una disminución sustancial en el número de colonias leucémicas formadas cuando se incubaron muestras de pacientes con AML enriquecidas con CD34 primarias con células T CD123 CAR, sugiriendo que el tiempo de incubación de 4 horas es suficiente para observar un efecto entre la formación de colonias leucémicas y colonias normales. Como alternativa, la menor expresión relativa de CD123 en células de CB, en comparación con células de AML, puede dar en parte como resultado la incapacidad de las células T CD123 CAR para alterar la formación de colonias derivadas de mieloides in vitro. Mientras otros han demostrado que CD123 se expresa solamente en una pequeña fracción de las HSCs linaje-CD34+CD38-, y dos ensayos de fase I que usan agentes dirigidos contra CD123 no revelaron mielosupresión a largo plazo, se necesitan estudios adicionales para evaluar el efecto de la terapia de células T CD123 CAR sobre la hematopoyesis. A fin de controlar toxicidades indeseadas inespecíficas, se incluyó EGFRt en el constructo lentivírico para permitir la ablación de células T que expresan CAR. Otras estrategias para modular la actividad de células T que expresan CAR, tales como el intercambio de apoptosis de caspasa 9 inducible [48] o la electroporación de ARNm de CAR [49], también son de interés, dado el potencial para exterminar células normales que expresan CD123.
Además, se demostró que las PBMCs crioconservadas procedentes de pacientes con AML con enfermedad activa se pueden modificar genéticamente para expresar CD123 CARs y exhibir actividad citotóxica potente frente a blastos leucémicos autólogos en 2/3 de las muestras. Mientras que las células T que expresan CD123 CAR procedentes de AML 559 fracasaron a la hora de lisar blastos autólogos que expresaron niveles bajos de CD123, estas células T de CAR sí lisaron las estirpes celulares CD123+ LCL y KG1a (datos no mostrados), sugiriendo que las células T generadas tienen el potencial de dianizar células diana que expresan CD123. Según nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de que las células T derivadas de pacientes con AML se pueden manipular para expresar un CAR y exhiben citotoxicidad específica del antígeno redirigida contra blastos autólogos. Colectivamente, los resultados de los estudios descritos en los Ejemplos más abajo demuestran que las células T CD123 CAR pueden distinguir entre células CD123+ y CD123-, y pueden activar múltiples funciones efectoras de células T frente a un panel de muestras de pacientes con AML primarias de bajo riesgo. En particular, células T específicas de CD123 no alteraron significativamente la formación de colonias progenitoras normales, pero redujeron considerablemente el crecimiento de progenitores leucémicos mieloides clonogénicos in vitro. También se demostró que células T derivadas de pacientes con AML se pueden modificar genéticamente para expresar CARs específicos de CD123 y lisar blastos autólogos in vitro. Por lo tanto, las células T CD123 CAR son un candidato prometedor para la inmunoterapia de AML.
EJEMPLO2:CÉLULASTTRANSDUCIDASCON CD123CARRETRASAN LAPROGRESIÓN LEUCÉMICAIN VIVO
Constructos de CD123CAR. Los constructos 26292CAR(S228P+L235E) y 32716CAR(S228P+L235E) se generaron como se describió en el Ejemplo 1 anterior. También se generaron dos constructos adicionales de CD123CAR, que incluyeron una mutación adicional en la bisagra de IgG4 en la posición 297 (N297Q) para cada scFv (“26292CAR(S228P+L235E+N297Q)” y “32716CAR(S228P+L235E+N297Q)”) (Figuras 12 y 13, mutaciones en negrita y subrayadas).
Se implantaron a ratones NSG células tumorales de AML (día 0), y se trataron con 5,0x106 células T CAR+ que expresan el 26292CAR(S228P+L235E) o el 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) en el día 5, y se monitorizó la progresión leucémica mediante formación de imágenes bioluminiscentes. Como se muestra en la Figura 8, la carga leucémica progresó en el día 8 en comparación con el día de tratamiento en ratones tratados con células T transducidas con 26292CAR(S228P+L235E), indicando que las células transducidas con el constructo de CD123CAR que tiene mutaciones en la región bisagra en las posiciones S228P y L235E no tuvieron ningún efecto in vivo. Por el contrario, los ratones tratados con células T transducidas con 26292CAR(S228P+L235E+N297Q) mostraron una reducción en el tamaño tumoral en comparación con el día de tratamiento, indicando que la adición de una mutación en la región bisagra en la posición 297 (N297Q) da como resultado un constructo de CD123CAR que es capaz de retrasar la progresión leucémica in vivo.
REFERENCIAS
Las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas enumeradas más abajo son todas las referencias citadas en la memoria descriptiva.
1. Eaves, C.J. and R.K. Humphries, Acute myeloid leukemia and the Wnt pathway. N Engl J Med, 2010. 362(24): p. 2326-7.
2. Dohner, H., et al., Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2010. 115(3): p. 453-74.
3. Majeti, R., Monoclonal antibody therapy directed against human acute myeloid leukemia stem cells. Oncogene, 2011.30(9): p. 1009-19.
4. Kikushige, Y., et al., TIM-3 is a promising target to selectively kill acute myeloid leukemia stem cells. Cell Stem Cell, 2010. 7(6): p. 708-17.
5. Jena, B., G. Dotti, and L.J. Cooper, Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood, 2010. 116(7): p. 1035-44.
6. Cooper, L.J., et al., T-cell clones can be rendered specific for CD19: toward the selective augmentation of the graft-versus-B-lineage leukemia effect. Blood, 2003. 101(4): p. 1637-44.
7. Hudecek, M., et al., The B-cell tumor-associated antigen ROR1 can be targeted with T cells modified to express a ROR1-specific chimeric antigen receptor. Blood, 2010. 116(22): p.4532-41.
8. Kochenderfer, J.N., et al., Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother, 2009. 32(7): p. 689-702.
9. Milone, M.C., et al., Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther, 2009. 17(8): p. 1453-64.
10. Brentjens, R.J., et al., Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human T lymphocytes costimulated by CD80 and interleukin-15. Nat Med, 2003. 9(3): p. 279-86.
11. Brentjens, R.J., et al., Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory Bcell leukemias. Blood, 2011. 118(18): p.4817-28.
12. Kochenderfer, J.N., et al., B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric antigen-receptor-transduced T cells. Blood, 2011.
13. Savoldo, B., et al., CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptormodified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest, 2011. 121 (5): p. 1822-6.
14. Kalos, M., et al., T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced Leukemia. Sci Transl Med, 2011.3(95): p. 95ra73.
15. Till, B.G., et al., CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and 4-1BB domains: pilot clinical trial results. Blood, 2012.
16. Peinert, S., et al., Gene-modified T cells as immunotherapy for multiple myeloma and acute myeloid leukemia expressing the Lewis Y antigen. Gene Ther, 2010. 17(5): p. 678-86.
17. Dutour, A., et al., In Vitro and In Vivo Antitumor Effect of Anti-CD33 Chimeric Receptor-Expressing EBV-CTL against CD33 Acute Myeloid Leukemia. Adv Hematol, 2012. 2012: p. 683065.
18. Du, X., M. Ho, y I. Pastan, New immunotoxins targeting CD123, a stem cell antigen on acute myeloid leukemia cells. J Immunother, 2007. 30(6): p. 607-13.
19. Pelloquin, F., J.P. Lamelin, y G.M. Lenoir, Human B lymphocytes mmortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev Biol, 1986. 22(12): p. 689-94.
20. Wang, X., et al., A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood, 2011. 118(5): p. 1255-63.
21. Reddy, M.P., et al., Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol, 2000. 164(4): p. 1925-33.
22. Nguyen, P., I. Moisini, y T.L. Geiger, Identification of a murine CD28 dileucine motif that suppresses singlechain chimeric T-cell receptor expression and function. Blood, 2003. 102(13): p. 4320-5.
23. Jensen, M.C., et al., Human T lymphocyte genetic modification with naked DNA. Mol Ther, 2000. 1(1): p. 49­ 55.
24. Riddell, S.R. y P.D. Greenberg, The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. J Immunol Methods, 1990. 128(2): p. 189-201.
25. Brown, C.E., et al., Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Res, 2009. 69(23): p. 8886-93.
26. Bhatia, R., et al., Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: role of malignant stromal macrophages. Blood, 1995. 85(12): p. 3636-45.
27. Jordan, C.T., et al., The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia, 2000. 14(10): p. 1777-84.
28. Jin, L., et al., Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells. Cell Stem Cell, 2009. 5(1): p. 31-42.
29. Munoz, L., et al., Interleukin-3 receptor alpha chain (CD123) is widely expressed in hematologic malignancies. Haematologica, 2001.86(12): p. 1261 -9.
30. Seder, R.A., P.A. Darrah, and M. Roederer, T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol, 2008. 8(4): p. 247-58.
31. Manz, M.G., et al., Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(18): p. 11872-7.
32. Le Dieu, R., et al., Peripheral blood T cells in acute myeloid leukemia (AML) patients at diagnosis have abnormal phenotype and genotype and form defective immune synapses with AML blasts. Blood, 2009. 114(18): p. 3909-16.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un gen del receptor de antígeno quimérico de CD123 (CD123CAR), que comprende una región de scFv anti-CD123 fusionada en el marco a una región bisagra de IgG4 modificada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una sustitución de aminoácidos S228P y una sustitución de aminoácidos L235E; y
un dominio de señalización de cadena zeta de un receptor de células T (TCR), en el que la región bisagra de IgG4 modificada comprende además una secuencia nucleotídica que codifica una sustitución N297Q.
2. El gen de CD123CAR de la reivindicación 1, en el que la región de scFv anti-CD123 codifica un dominio VH y un dominio VL de la inmunotoxina recombinante 26292 o 32716.
3. El gen de CD123CAR de la reivindicación 1, en el que la región de scFv anti-CD123 está humanizada.
4. El gen de CD123CAR de la reivindicación 1, que comprende además al menos un dominio de señalización coestimulante seleccionado de un dominio de señalización coestimulante de CD27, un dominio de señalización coestimulante de CD28, un dominio de señalización coestimulante de 4-1BB, un dominio de señalización coestimulante de OX40, o cualquier combinación de los mismos.
5. El gen de CD123CAR de la reivindicación 1, que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 4.
6. El gen de CD123CAR de la reivindicación 1, en el que el gen codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12.
7. El gen de CD123CAR de la reivindicación 1, en el que el gen es parte de un casete de expresión que se inserta en un vector vírico.
8. El gen de CD123CAR de la reivindicación 7, en el que el casete de expresión comprende además un gen accesorio seleccionado de un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt), un gen de CD19 truncado (CD19t), o un gen de caspasa 9 inducido.
ES14765454T 2013-03-15 2014-03-14 Células T redirigidas por receptores de antígenos quiméricos específicos de CD123, y métodos de su uso Active ES2747099T3 (es)

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US13/844,048 US9657105B2 (en) 2013-03-15 2013-03-15 CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
PCT/US2014/029109 WO2014144622A2 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Cd123-specific chimeric antigen receptor redirected t cells and methods of their use

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ES14765454T Active ES2747099T3 (es) 2013-03-15 2014-03-14 Células T redirigidas por receptores de antígenos quiméricos específicos de CD123, y métodos de su uso

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US (3) US9657105B2 (es)
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JP (4) JP6588004B2 (es)
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RU (1) RU2711114C2 (es)
WO (1) WO2014144622A2 (es)

Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4282419A1 (en) 2012-12-20 2023-11-29 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
EP3974520A1 (en) 2013-05-14 2022-03-30 Board of Regents, The University of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2014190273A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
JP6585041B2 (ja) 2013-07-18 2019-10-02 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫細胞の能力を増強する方法
US20160333108A1 (en) * 2014-01-13 2016-11-17 Stephen J. Forman CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs) HAVING MUTATIONS IN THE FC SPACER REGION AND METHODS FOR THEIR USE
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
CA3190002A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors and methods of making
US9944709B2 (en) * 2014-03-19 2018-04-17 Cellectis CD123 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
IL322264A (en) * 2014-04-07 2025-09-01 Novartis Ag Cancer treatment using chimeric antigen receptor (CAR) against CD19
US9212225B1 (en) 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
JP6736540B2 (ja) 2014-07-21 2020-08-05 ノバルティス アーゲー Ｃｌｌ−１キメラ抗原受容体を使用した癌の処置
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
US20170209492A1 (en) * 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
SG11201700770PA (en) 2014-08-19 2017-03-30 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
EP2990416B1 (en) 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
EP3587446A1 (en) * 2014-09-19 2020-01-01 City of Hope Costimulatory chimeric antigen receptor t cells targeting il13 r alpha 2
KR20170075785A (ko) * 2014-11-05 2017-07-03 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 유전자 변형된 면역 효과기 세포 및 면역 효과기 세포의 증식용 가공된 세포
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
EP3812398A3 (en) 2015-01-23 2021-07-21 Sanofi Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
EP3250611B1 (en) 2015-01-26 2021-04-21 The University of Chicago Car t-cells recognizing cancer-specific il 13r-alpha2
JP7264592B2 (ja) 2015-01-26 2023-04-25 ザ ユニバーシティー オブ シカゴ ＩＬ１３Ｒα２結合剤及び癌治療におけるその使用
WO2016120218A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 Cellectis ANTI-CLL1 SPECIFIC SINGLE-CHAIN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (scCARS) FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
CN107530376A (zh) 2015-02-18 2018-01-02 恩立夫克治疗有限责任公司 用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
WO2016164308A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 Subdomain, Llc De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof
US10100118B2 (en) * 2015-04-08 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD123
MX2017012939A (es) 2015-04-08 2018-05-22 Novartis Ag Terapias cd20, terapias cd22 y terapias de combinacion con una celula que expresa un receptor quimerico de antigeno (car) de cd19.
IL287500B2 (en) 2015-04-21 2023-12-01 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
WO2016180467A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
EP4190814A1 (en) 2015-05-29 2023-06-07 Amphivena Therapeutics, Inc. Methods of using bispecific cd33 and cd3 binding proteins
CN115927474A (zh) 2015-06-19 2023-04-07 塞巴斯蒂安·科博尔德 Pd-1-cd28融合蛋白及其在医学中的用途
CN107709356A (zh) 2015-06-26 2018-02-16 南加利福尼亚大学 用于肿瘤特异性活化的掩蔽嵌合抗原受体t细胞
AU2016297605A1 (en) 2015-07-21 2018-02-15 City Of Hope T cells for expression of chimeric antigen receptors and other receptors
US10975148B2 (en) * 2015-08-05 2021-04-13 CellabMED Inc. Chimeric antigen receptors, and T cells in which chimeric antigen receptor is expressed
KR20180053744A (ko) * 2015-09-23 2018-05-23 사이토이뮨 테라퓨틱스 엘엘씨 면역 요법을 위한 flt3 유도된 car 세포
US11466097B2 (en) * 2015-10-06 2022-10-11 City Of Hope Chimeric antigen receptors targeted to PSCA
AU2016337525B2 (en) 2015-10-16 2022-01-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
JP7018387B2 (ja) 2015-10-16 2022-02-10 ルードヴィッヒ－マクシミリアン－ユニヴェルシタート ミュンヘン 腫瘍標的療法のためのｃｘｃｒ６形質導入ｔ細胞
CN116059316A (zh) 2015-10-23 2023-05-05 优瑞科生物技术公司 抗体/t细胞受体嵌合构建体及其用途
EP3368075B1 (en) 2015-10-27 2020-01-29 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof
CN108779174B (zh) * 2015-11-04 2022-11-29 希望之城公司 靶向her2的嵌合抗原受体
CN108884140B (zh) 2015-12-03 2022-10-25 朱诺治疗学股份有限公司 修饰的嵌合受体及相关组合物和方法
US11052111B2 (en) 2015-12-08 2021-07-06 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices and DE CAR polypeptides for treating disease and methods for enhancing immune responses
BR112018013074A2 (en) 2015-12-30 2018-12-11 Novartis Ag immune effector cell therapies with enhanced efficacy
CA3014885A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
CA3016287A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017172981A2 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
US12144850B2 (en) 2016-04-08 2024-11-19 Purdue Research Foundation Methods and compositions for car T cell therapy
EP3443096B1 (en) 2016-04-15 2023-03-01 Novartis AG Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
AU2017291262A1 (en) 2016-06-30 2019-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved adoptive T-cell therapy
EP3490590A2 (en) 2016-08-01 2019-06-05 Novartis AG Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
CN107793481A (zh) * 2016-08-31 2018-03-13 南京传奇生物科技有限公司 一种靶向人cd123的嵌合受体配体及其应用
CN107840889A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 上海吉倍生物技术有限公司 高亲和力的抗cd123抗体及其应用
PL3532497T3 (pl) 2016-10-26 2024-11-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Zmodyfikowane regiony zawiasowe immunoglobuliny dla zmniejszania hemaglutynacji
IL317416A (en) * 2016-11-16 2025-02-01 Ablynx Nv T cell-recruiting polypeptides capable of binding CD123 and TCR alpha/beta
US20200095547A1 (en) 2016-12-02 2020-03-26 Darya ALIZADEH Methods for manufacturing t cells expressing of chimeric antigen receptors and other receptors
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
AU2018219226B2 (en) 2017-02-07 2024-12-19 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents
ES3010559T3 (en) 2017-02-28 2025-04-03 Endocyte Inc Compositions and methods for car t cell therapy
WO2018176159A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Zymeworks Inc. Tumor antigen presentation inducer constructs and uses thereof
US11344578B2 (en) 2017-04-19 2022-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Immune cells expressing engineered antigen receptors
AU2018258045B2 (en) 2017-04-26 2024-02-29 Eureka Therapeutics, Inc. Chimeric antibody/T-cell receptor constructs and uses thereof
WO2019103857A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
EP3650539A4 (en) * 2017-07-07 2021-08-18 Hanmi Pharm. Co., Ltd. NEW THERAPEUTIC ENZYMFUSION PROTEIN AND ITS USAGE
CN111148533A (zh) 2017-09-19 2020-05-12 麻省理工学院 用于嵌合抗原受体t细胞疗法的组合物及其用途
KR20200086278A (ko) 2017-10-18 2020-07-16 노파르티스 아게 선택적 단백질 분해를 위한 조성물 및 방법
CN107759700A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd19抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用
WO2019084288A1 (en) * 2017-10-25 2019-05-02 Novartis Ag METHODS FOR DESIGNING CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTOR EXPRESSION CELLS
EP3707165A4 (en) * 2017-11-07 2021-09-08 The Board of Regents of The University of Texas System LILRB4 TARGETING WITH CAR-T OR CAR-NK CELLS IN THE TREATMENT OF CANCER
US11464803B2 (en) 2017-11-14 2022-10-11 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof
WO2019099440A1 (en) 2017-11-14 2019-05-23 Arcellx, Inc. Multifunctional immune cell therapies
BR112020009136A2 (pt) 2017-11-14 2020-10-13 Arcellx, Inc. polipeptídeos que contêm domínio d e usos dos mesmos
GB201719646D0 (en) * 2017-11-27 2018-01-10 Bivictrix Therapeutics Ltd Therapy
US11311576B2 (en) 2018-01-22 2022-04-26 Seattle Children's Hospital Methods of use for CAR T cells
CN108276495B (zh) * 2018-01-24 2022-03-18 博生吉医药科技(苏州)有限公司 靶向csf1r嵌合抗原受体修饰的nk92mi细胞和t细胞及其制法和应用
WO2019156795A1 (en) 2018-02-06 2019-08-15 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against fl-ple labelled tumors
WO2019165121A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for activation and expansion of natural killer cells and uses therof
CA3091674A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
CN111918877A (zh) 2018-03-14 2020-11-10 美国卫生和人力服务部 抗cd33嵌合抗原受体及其用途
WO2019195583A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-10 Mustang Bio, Inc. Manufacturing methods for cell-based therapeutic compositions
EP3773632A4 (en) 2018-04-06 2022-05-18 The Regents of The University of California METHODS OF TREATMENT OF EGFRVIII-EXPRESSING GLIOBLASTOMA
CA3095757A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 The Regents Of The University Of California Methods of treating glioblastomas
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
AU2019284911B2 (en) 2018-06-13 2026-04-09 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
US20210268028A1 (en) * 2018-07-02 2021-09-02 Cellectis Chimeric antigen receptors (car)-expressing cells and combination treatment for immunotherapy of patients with relapse refractory adverse genetic risk aml
EP3820484A4 (en) 2018-07-10 2022-05-04 Precigen, Inc. ROR-1 SPECIFIC CHIMERA ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
AU2019346335B2 (en) 2018-09-28 2024-07-25 Massachusetts Institute Of Technology Collagen-localized immunomodulatory molecules and methods thereof
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
EP3873540A4 (en) 2018-10-31 2022-07-27 Mayo Foundation for Medical Education and Research METHODS AND MATERIALS FOR THE TREATMENT OF CANCER
CA3116412A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Humanigen, Inc. Materials and methods for treating cancer
WO2020092839A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
WO2020113054A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Mustang Bio, Inc. Methods of treatment using decitabine and a cd123-targeted therapy
WO2020128972A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
BR112021015672A2 (pt) 2019-02-15 2021-10-05 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona substituída e usos dos mesmos
ES3032659T3 (en) 2019-02-15 2025-07-23 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
EP3927738A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 City of Hope Baff-r/cd19 targeted chimeric antigen receptor-modified t cells and use thereof
KR20210136050A (ko) 2019-03-01 2021-11-16 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도
US20220143087A1 (en) 2019-03-08 2022-05-12 Klinikum Der Universitat Munchen Ccr8 expressing lymphocytes for targeted tumor therapy
WO2020205751A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 City Of Hope Methods for manufacturing t cells expressing of chimeric antigen receptors and other receptors
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
US11642409B2 (en) 2019-06-26 2023-05-09 Massachusetts Insttute of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
EP3769816A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-27 Ospedale Pediatrico Bambino Gesù Car-cd123 vector and uses thereof
WO2021061648A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for stimulation of endogenous t cell responses
CN110904048A (zh) * 2019-12-04 2020-03-24 合肥中科干细胞再生医学有限公司 一种car-cd123t2嵌合抗原受体t细胞及其应用
JP2023506501A (ja) * 2019-12-16 2023-02-16 ワシントン・ユニバーシティ キメラ抗原受容体樹状細胞（ｃａｒ－ｄｃ）ならびにこれを作製および使用する方法
KR20220116257A (ko) 2019-12-20 2022-08-22 노파르티스 아게 골수섬유증 및 골수이형성 증후군을 치료하기 위한, 데시타빈 또는 항 pd-1 항체 스파르탈리주맙을 포함하거나 또는 포함하지 않는, 항 tim-3 항체 mbg453 및 항 tgf-베타 항체 nis793의 조합물
KR20220163940A (ko) 2020-02-04 2022-12-12 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 항-디니트로페놀 키메라 항원 수용체
CA3173527A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for generating engineered memory-like nk cells and compositions thereof
US11896619B2 (en) 2020-03-10 2024-02-13 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for immunotherapy of NPM1c-positive cancer
CN113493772B (zh) * 2020-04-08 2022-10-18 华中农业大学 可分泌性表达免疫毒素的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞
US12264190B2 (en) * 2020-04-24 2025-04-01 Astrazeneca Ab Compositions and methods of treating cancer with chimeric antigen receptors
WO2021221782A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
WO2021221783A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
CN116096862A (zh) 2020-06-11 2023-05-09 诺华股份有限公司 Zbtb32抑制剂及其用途
CN115916199A (zh) 2020-06-23 2023-04-04 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案
US20230271940A1 (en) 2020-08-03 2023-08-31 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CN112079927B (zh) * 2020-09-18 2021-12-28 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 一种cd123结合蛋白、含其的car及其应用
CN112521505B (zh) * 2020-12-11 2022-07-29 华道(上海)生物医药有限公司 抗cd123抗体及其应用
CN112646033B (zh) * 2020-12-16 2022-04-12 北京艺妙神州医药科技有限公司 靶向cd123的嵌合抗原受体及其用途
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
EP4387991A1 (en) 2021-08-18 2024-06-26 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Hybrid tumor/cancer therapy based on targeting the resolution of or inducing transcription-replication conflicts (trcs)
US20260083848A1 (en) 2021-11-03 2026-03-26 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
AU2023205629A1 (en) 2022-01-05 2024-08-15 Fundació De Recerca Clinic Barcelona-Institut D’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer Anti-cd84 antibodies and chimeric antigen receptors
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2024094004A1 (zh) * 2022-11-03 2024-05-10 重庆精准生物技术有限公司 靶向cd123的全人源抗体及其应用
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024123835A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Dynamic Cell Therapies, Inc. Engineered switches for immune cell activity and methods of use thereof
EP4630043A1 (en) 2022-12-06 2025-10-15 Dynamic Cell Therapies, Inc. Immune-activating complexes
EP4720059A1 (en) 2023-05-24 2026-04-08 Kumquat Biosciences Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
CN117430721B (zh) * 2023-10-25 2024-06-25 北京景达生物科技有限公司 Cd123靶向car-nk细胞的制备及其应用
EP4599843A1 (en) 2024-02-09 2025-08-13 Fundació Institut de recerca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Car and modified cd200r combination
WO2025255266A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Dynamic Cell Therapies, Inc. Engineered polypeptides for immune cell activation

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102264A1 (en) 2000-10-18 2002-08-01 Cheung Nai-Kong V. Uses of monoclonal antibody 8H9
US8414892B2 (en) 2000-10-18 2013-04-09 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
WO2005076843A2 (en) 2004-02-06 2005-08-25 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating tumors and metastatic disease
WO2008127735A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Stemline Therapeutics, Inc. Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof
CN101952454B (zh) 2008-02-08 2014-06-04 米迪缪尼有限公司 具有减弱的Fc配体亲和性的抗IFNAR1抗体
US8822647B2 (en) * 2008-08-26 2014-09-02 City Of Hope Method and compositions using a chimeric antigen receptor for enhanced anti-tumor effector functioning of T cells
BRPI1006998A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Biogen Idec Inc Polipeptídeos fc estabilizados com função efetora reduzida e métodos de uso
ES2717629T3 (es) * 2009-11-03 2019-06-24 Hope City Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) para selección de células T transducidas
EP2614077B1 (en) 2010-09-08 2016-08-17 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
PL2718322T3 (pl) * 2011-06-06 2019-07-31 Novo Nordisk A/S Lecznicze przeciwciała
EP3594245A1 (en) 2012-02-13 2020-01-15 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
KR20140127816A (ko) 2012-02-22 2014-11-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암의 치료에 유용한 t 세포의 지속성 집단을 생성시키기 위한 조성물 및 방법
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
US20160333108A1 (en) 2014-01-13 2016-11-17 Stephen J. Forman CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs) HAVING MUTATIONS IN THE FC SPACER REGION AND METHODS FOR THEIR USE
EP3587446A1 (en) 2014-09-19 2020-01-01 City of Hope Costimulatory chimeric antigen receptor t cells targeting il13 r alpha 2

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