ES2747230T3 - Método de elaboración de copolímeros de polihidroxialcanoato (3HB-co-4HB) - Google Patents
Método de elaboración de copolímeros de polihidroxialcanoato (3HB-co-4HB) Download PDFInfo
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Abstract
Método de elaboración de una composición de copolímero de polihidroxialcanoato que comprende una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, en el que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de >= 80% correspondiente a la cantidad de carbono de base biológica como porcentaje en peso (masa) de carbono orgánico total tal como se define en la norma ASTM D6866-12 y (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa, y además en el que la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -60ºC a -5ºC, comprendiendo el método: cultivar un organismo en presencia de uno o más materiales de partida de carbono en condiciones en las que (a) el uno o más materiales de partida de carbono se convierten en 3-hidroxibutiril-CoA y 4- hidroxibutiril-CoA y (b) la 3-hidroxibutiril-CoA y la 4-hidroxibutiril-CoA se polimerizan para formar las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, formando de ese modo la composición, en la que: el organismo se ha modificado por ingeniería genética mediante la incorporación estable de genes que codifican para una polihidroxialcanoato sintasa, una acetil-CoA acetiltransferasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una succinato-semialdehído deshidrogenasa, una semialdehído succínico reductasa y una CoA transferasa en el organismo, mediante la introducción de uno o más plásmidos estables que comprenden los genes y/o mediante la integración de los genes en el genoma del organismo, para comprender actividades enzimáticas de los productos génicos y para no comprender actividades enzimáticas de o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ o ambas, y el uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, tienen un contenido de base biológica de >= 80%.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de elaboración de copolímeros de polihidroxialcanoato (3HB-co-4HB)
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos de elaboración de composiciones de copolímero de polihidroxialcanoato, y más particularmente a métodos de elaboración de composiciones de copolímero de polihidroxialcanoato que comprenden una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, en los que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de > 80%, (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa, y además en los que la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -60°C a -5°C. Dichos métodos comprenden cultivar un organismo que se ha modificado por ingeniería genética, incluyendo la incorporación estable de genes en presencia de uno o más materiales de partida de carbono.
Antecedentes
Los polihidroxialcanoatos son materiales termoplásticos biodegradables y biocompatibles que pueden producirse a partir de recursos renovables y que tienen una amplia gama de aplicaciones industriales y biomédicas. Los polihidroxialcanoatos pueden producirse como homopolímeros, tales como poli-3-hidroxibutirato (también denominado “PHB”) y poli-4-hidroxibutirato (también denominado “P4HB”), o como copolímeros, tales como poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) (también denominado “PHB-co-4HB”). Los copolímeros de poli(3-hidroxibutiratoco-4-hidroxibutirato) son de interés por su potencial de producirse a partir de recursos renovables y de usarse para conferir elasticidad similar al caucho en combinaciones de polímeros. Por tanto, por ejemplo, la producción de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) con altas cantidades de incorporación de monómero de 4HB en el copolímero se ha descrito previamente en la bibliografía usando diversos microorganismos, pero esto sólo se logró cuando se proporcionaron precursores inmediatos de 4-hidroxibutiril-CoA, tales como por ejemplo 4-hidroxibutirato, ybutirolactona y/o 1,4-butanodiol con otras fuentes de carbono. Por ejemplo, Kunioka et al., Polymer Communications 29:174-176 (1988); Doi et al., Polymer Communications 30:169-171 (1989); Kimura et al., Biotechnol. Letters 14(6):445-450 (1992); Nakamura et al., Macromolecules 25(17):4237-4241 (1992); Saito y Doi, Int. J. Biol. Macromol.
16(2):99-104 (1994); Lee et al., Biotechnol. Letters 19(8):771 -774 (1997); Choi et al., Appl. Environm. Microbiol.
65(4):1570-1577 (1999); Hsieh et al., J. Taiwan Inst. Chem. Engin. 40:143-147 (2009). La producción de copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) a partir de glucosa como única fuente de carbono en células de Escherichia coli modificadas por ingeniería genética también se ha logrado, pero los porcentajes molares monoméricos notificados de monómeros de 4-hidroxibutirato de los copolímeros resultantes han sido bajos, por ejemplo del 12,5% o menos durante la fase estacionaria, a menos que se alimenten conjuntamente otras fuentes de carbono. Chen et al., publicación estadounidense n.° 2012/0214213; véase también Dennis y Valentin, patente estadounidense n.° 6.117.658; Valentin y Dennis, J. Biotechnol. 58:33-38 (1997), Chen et al., solicitud de patente china CN 102382789 A; Li et al., Metab. Eng. 12:352-359 (2010). La producción de homopolímero de poli-4-hidroxibutirato a partir de una biomasa microbiana modificada por ingeniería genética que metaboliza una materia prima renovable, tal como glucosa, también se ha descrito, pero los títulos de homopolímero de poli-4-hidroxibutirato a modo de ejemplo fueron de menos del 50% en peso de los títulos de biomasa, y en cualquier caso el homopolímero de poli-4-hidroxibutirato no tenía las mismas propiedades que el copolímero de poli(3-hidroxibutiratoco-4-hidroxibutirato). Van Walsem et al., documento WO 2011/100601.
Zheng-Jun Li et al. (Metabolic Engineering 12 (2010) 352-359) dan a conocer el uso de plásmidos inestables para la transformación de E. coli, con el fin de obtener un microorganismo modificado por ingeniería genética útil para la producción de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) [P(3HB-co-4HB)] a partir de fuentes de carbono no relacionadas. La E. coli modificada metabólicamente produjo P(3HB-co-4HB al 11,1% en moles) usando glucosa como fuente de carbono. La presencia de alfa-cetoglutarato o citrato potenció el contenido de monómero de 4HB desde el 11,1% hasta el 22,61%.
El documento EP 2855584 (fecha de publicación: 12 de diciembre de 2013) da a conocer una composición de polímero biodegradable ramificado que comprende una combinación de (a) poli(ácido láctico); y (b) un polímero de polihidroxialcanoato (PHA) biodegradable que tiene una temperatura de transición vítrea de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente -50°C y un peso molecular de entre 450 y 1500 kDa. El polímero de PHA es un copolímero de (i) 3-hidroxibutirato; y (ii) uno o más monómeros seleccionados de 4-hidroxibutirato, 5-hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato y 3-hidroxioctanoato, en el que el uno o más monómeros son de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 85% del peso del polímero de PHA. El documento EP 2855584 no da a conocer métodos de elaboración de composiciones de copolímero de polihidroxialcanoato, cuyos métodos que comprenden cultivar un organismo modificado por ingeniería genética.
Sumario
Se proporciona un método de elaboración de una composición de copolímero de polihidroxialcanoato. La
composición comprende una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato. Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de > 80% y (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa. Además, la composición tiene una temperatura de transición vitrea de -60°C a -5°C. El método comprende cultivar un organismo en presencia de uno o más materiales de partida de carbono en condiciones en las que (a) el uno o más materiales de partida de carbono se convierten en 3-hidroxibutiril-CoA y 4-hidroxibutiril-CoA y (b) la 3-hidroxibutiril-CoA y la 4-hidroxibutiril-CoA se polimerizan para formar las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, formando de ese modo la composición. El organismo se ha modificado por ingeniería genética mediante la incorporación estable de genes que codifican para una polihidroxialcanoato sintasa, una acetil-CoA acetiltransferasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una succinato-semialdehído deshidrogenasa, una semialdehído succínico reductasa y una CoA transferasa, y para no comprender actividades enzimáticas de o bien una succinatosemialdehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ o ambas. El uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, tienen un contenido de base biológica de > 80%.
Breve descripción del dibujo
La figura 1 es un diagrama esquemático de las rutas metabólicas centrales de E. coli a modo de ejemplo que muestra reacciones que se modificaron o introdujeron en los ejemplos o que podrían modificarse en el futuro. Las reacciones que se eliminaron delecionando los genes correspondientes en determinados ejemplos están marcadas con una “X”. Abreviaturas: “PEP”, fosfoenolpiruvato; “PYR”, piruvato; “Ac-CoA”, acetil-CoA; “AcAc-CoA”, acetoacetil-CoA; “3HB-CoA”, 3-hidroxibutiril-CoA; “CIT”, citrato; “ICT”, isocitrato; “aKG”, alfa-cetoglutarato; “SUC-CoA”, succinil-CoA; “SUC”, succinato; “Fum”, fumarato; “MAL”, L-malato; “OAA”, oxaloacetato; “SSA”, semialdehído succínico; “4HB”, 4-hidroxibutirato; “4HB-P”, 4-hidroxibutiril-fosfato; “4HB-CoA”, 4-hidroxibutiril-CoA; “PHB-co-4HB”, poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato). Reacciones numeradas: “1”, acetil-CoA acetiltransferasa (también conocida como beta-cetotiolasa); “2”, acetoacetil-CoA reductasa; “3”, succinato-semialdehído deshidrogenasa; “4”, alfacetoglutarato descarboxilasa; “5”, semialdehído succínico reductasa; “6”, CoA transferasa; “7”, butirato cinasa; “8”, fosfotransbutirilasa; “9”, polihidroxialcanoato sintasa; “10”, succinato-semialdehído deshidrogenasa; “11”, fosfoenolpiruvato carboxilasa; “12”, 4-hidroxibutiril-CoA-tioesterasa.
Descripción detallada
La invención se refiere a un método de elaboración de una composición de copolímero de polihidroxialcanoato. La composición resultante comprende una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato. La composición puede ser, por ejemplo, una composición de biomasa, por ejemplo un organismo que ha producido, y comprende en la misma, la pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, una composición libre de biomasa distinta a polihidroxialcanoato, por ejemplo una composición que comprende moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que se han aislado y/o purificado a partir de un organismo que ha producido las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, o una composición bioplástica, por ejemplo una composición homogénea o combinada que comprende las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato y adecuada para su uso como bioplástico.
Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato. Por consiguiente, cada molécula de copolímero de polihidroxialcanoato comprende tanto monómeros de 3-hidroxibutirato como monómeros de 4-hidroxibutirato. Tales moléculas pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante copolimerización mediada por PHA-sintasa de 3-hidroxibutiril-CoA y 4-hidroxibutiril-CoA para dar moléculas del copolímero, por ejemplo copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato). Se describen PHA sintasas adecuadas en los ejemplos a continuación. Cada molécula de copolímero de polihidroxialcanoato también puede comprender opcionalmente monómeros adicionales, por ejemplo monómeros de 5-hidroxivalerato, por ejemplo basándose en la presencia adicional de precursores polimerizables de los monómeros adicionales durante la copolimerización mediada por PHA-sintasa de 3-hidroxibutiril-CoA y 4-hidroxibutiril-CoA.
Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%. Por consiguiente, del 23,5 al 75% de las unidades monoméricas de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, tomadas juntas, son monómeros de 4-hidroxibutirato, con del 25 al 76,5% restante de las unidades monoméricas de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato correspondiente a monómeros de 3-hidroxibutirato y opcionalmente monómeros adicionales. Preferiblemente, sustancialmente todo, por ejemplo > 95% o > 99%, del 25 al 76,5% restante de las unidades monoméricas corresponde a monómeros de 3-hidroxibutirato, correspondiendo el resto a monómeros adicionales. Preferiblemente, todo del 25 al 76,5% restante de las unidades monoméricas corresponde a monómeros de 3-hidroxibutirato, de modo que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no incluyen monómeros adicionales. Por tanto, por ejemplo con respecto al copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) en particular, del 25 al 76,5% restante de las unidades monoméricas de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato corresponde a monómeros de 3-hidroxibutirato. Los métodos adecuados a modo de ejemplo para determinar el porcentaje molar monomérico de monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de
polihidroxialcanoato se describen en los ejemplos a continuación.
En algunas realizaciones, el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato elaborado según la invención puede ser del 25 al 70%. El porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato puede ser, por ejemplo, del 30 al 40%, del 40 al 50%, del 50 al 60% o del 60 al 70%.
Los porcentajes molares monoméricos de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato afectan a las propiedades de las composiciones de los mismos, por ejemplo con respecto a temperaturas de fusión, elongación a la rotura, temperaturas de transición vítrea, y similares. Por ejemplo, cuando los porcentajes molares monoméricos de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) aumentan por encima del 10%, la temperatura de fusión disminuye por debajo de 130°C y la elongación a la rotura aumenta por encima del 400%. Saito Y. et al., 39 Polym. Int. 169 (1996). Por tanto, pueden usarse las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen porcentajes molares monoméricos de monómeros de 4-hidroxibutirato en cada uno de los diversos intervalos dados a conocer anteriormente para modificar por ingeniería composiciones para que tengan propiedades deseadas particulares.
Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un contenido de base biológica de > 80%. Contenido de base biológica, tal como se usa el término en el presente documento, significa la cantidad de carbono de base biológica en un material o producto como porcentaje del peso (masa) del carbono orgánico total del material o producto, tal como se define en la norma ASTM D6866-12, métodos de prueba convencionales para determinar el contenido de base biológica de muestras sólidas, líquidas y gaseosas usando análisis de radiocarbono (ASTM International, EE.UU., 2012). Tal como se comenta en la norma ASTM D6866-12, el carbono orgánico total puede incluir tanto carbono de base biológica como carbono fósil. El carbono de base biológica corresponde a carbono orgánico que incluye radiocarbono, es decir 14C, en una cantidad indicativa de ciclos recientes a través de la biosfera, por ejemplo incorporación reciente de CO2 atmosférico, incluyendo un porcentaje conocido de 14C, en carbono orgánico. El carbono fósil corresponde a carbono orgánico que incluye poco o ningún radiocarbono porque la edad del carbono fósil, cuando se mide a partir de la fecha de incorporación de CO2 atmosférico, es mucho mayor que la semivida de 14C, es decir todo o esencialmente todo el 14C que se había incorporado se ha descompuesto. Por consiguiente, cuando se aplica a las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, contenido de base biológica significa la cantidad de carbono de base biológica en las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato como porcentaje del peso (masa) del carbono orgánico total de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato. El contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato puede medirse, por ejemplo, según la norma ASTM D6866-12, basándose en la determinación del contenido de 14C y 12C en el CO2 derivado de la combustión del polihidroxialcanoato, y corrigiendo la inyección de 14C por la bomba posterior a 1950 en la atmósfera, entre otros métodos. Por tanto, las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un contenido de base biológica de > 80% tal como se mide según la norma ASTM D6866-12. También pueden usarse otros enfoques adecuados para medir el contenido de base biológica tal como se conoce en la técnica. Las diferencias en el contenido de base biológica entre diferentes moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato son indicativas de diferencias estructurales, es decir, diferencias en las razones de 14C respecto a 12C de las mismas, entre las diferentes moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato.
En algunas realizaciones, el contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato elaborado según la invención es > 95%. Preferiblemente, el contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es > 99%. Por tanto, por ejemplo, el contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato puede ser > 95%, o > 99% o del 100% en cada caso, de nuevo tal como se mide según la norma ASTM D6866-12.
Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen el contenido de base biológica indicado anteriormente pueden usarse para la fabricación de plásticos de base biológica en los que la mayoría o todo el carbono fósil se ha reemplazado por carbono de base biológica renovable, con beneficios adicionales acompañantes. Además, las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen el contenido de base biológica indicado anteriormente pueden distinguirse fácilmente de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato y otros polímeros y compuestos que no tienen el contenido de base biológica indicado anteriormente, basándose en las diferencias estructurales indicadas anteriormente asociadas con diferencias en el contenido de base biológica, con beneficios reguladores acompañantes.
Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kilodalton (“kDa”) a 2,0 megadalton (“MDa”). Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato pueden producirse en una distribución con respecto a sus pesos moleculares, y las propiedades físicas y propiedades reológicas de las composiciones de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato pueden depender de la distribución. Los pesos moleculares de polímeros pueden calcularse de diversas formas. El peso molecular promedio en peso, también denominado Mw, es la suma de los pesos de las diversas longitudes de cadena por el peso molecular de la cadena, dividido entre el peso total de todas las cadenas (£N¡MÍ2/£N¡MÍ). El peso molecular promedio en número, también denominado Mn, es la suma del número de cadenas de una longitud dada por el peso molecular de la cadena, dividido entre el número total de cadenas (£^Mi/£Ni). El índice de polidispersidad proporciona una medición
de la amplitud de una distribución de peso molecular de un polímero y se calcula como el peso molecular promedio en peso dividido entre el peso molecular promedio en número. Tal como se usa en el presente documento, el término peso molecular se refiere a peso molecular promedio en peso a menos que el contexto indique lo contrario.
El peso molecular promedio en peso de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de dispersión de luz y cromatografía de permeación en gel con patrones de poliestireno. Puede usarse cloroformo tanto como el eluyente para la cromatografía de permeación en gel y como el diluyente para los polihidroxialcanoatos. Pueden generarse curvas de calibración para determinar pesos moleculares usando poliestirenos lineales como patrones de peso molecular y un método de calibración basado en el logaritmo del peso molecular en función del volumen de elución.
En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato elaboradas según la invención es de 1,5 MDa a 2,0 MDa, por ejemplo tal como se determina mediante el uso de dispersión de luz y cromatografía de permeación en gel con patrones de poliestireno. Preferiblemente, el peso molecular promedio en peso de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es de 1,7 MDa a 2,0 MDa, por ejemplo de nuevo tal como se determina mediante el uso de dispersión de luz y cromatografía de permeación en gel con patrones de poliestireno.
Inesperadamente, se ha observado en este caso que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, por ejemplo del 25 al 70%, del 30 al 40%, del 40 al 50%, del 50 al 60% o del 60 al 70%, pueden obtenerse en títulos de polihidroxialcanoato > 50% en peso de títulos de biomasa según los métodos descritos a continuación, por ejemplo cultivar un organismo en presencia de uno o más materiales de partida de carbono, tal como se comenta a continuación, en el que el organismo se ha modificado por ingeniería genética, tal como se comenta también a continuación. Más específicamente, se ha observado que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato pueden obtenerse en títulos de polihidroxialcanoato que superan el 50% en peso de títulos de biomasa cultivando el organismo en presencia de glucosa como única fuente de carbono, y por tanto en ausencia de compuestos que son precursores inmediatos de 4-hidroxibutiril-CoA y/o compuestos que se fabrican normalmente a partir de recursos no renovables. También se ha observado que durante el cultivo de un organismo, no modificado por ingeniería genética, en presencia de glucosa y 1,4-butanodiol, que es un compuesto que es tanto un precursor inmediato de 4-hidroxibutiril-CoA como fabricado normalmente a partir de recursos no renovables, aumentando la cantidad de 1,4-butanodiol, mientras es útil para lograr porcentajes molares monoméricos relativamente mayores de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, da como resultado rendimientos relativamente menores de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato y pesos moleculares promedio en peso relativamente menores de las mismas. Sin desear limitarse por la teoría, se cree que los títulos de polihidroxialcanoato > 50% en peso de títulos de biomasa de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que pueden obtenerse mediante los métodos descritos a continuación son indicativos de pesos moleculares inesperadamente mayores asociados con las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato. Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen pesos moleculares promedio en peso en los intervalos indicados anteriormente pueden usarse para preparar composiciones de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen propiedades físicas y propiedades reológicas deseadas.
La composición resultante tiene una temperatura de transición vítrea de -60°C a -5°C. La temperatura de transición vítrea es la temperatura por encima de la que las moléculas de polímero comienzan movimientos moleculares coordinados. Físicamente, el módulo del polímero comienza a caer varios órdenes de magnitud hasta que el polímero alcanza finalmente un estado gomoso. Preferiblemente, la temperatura de transición vítrea de la composición es, por ejemplo, de -50°C a -15°C, de -50°C a -20°C o de -45°C a -15°C. Las composiciones que tienen temperaturas de transición vítrea en los intervalos indicados anteriormente pueden usarse para garantizar que las composiciones están en un estado gomoso a las temperaturas de uso deseadas.
La composición puede ser una en la que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato. Tal como se indicó anteriormente, las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato pueden producirse en una distribución con respecto a sus pesos moleculares. Los porcentajes molares monoméricos de monómeros de 4-hidroxibutirato pueden variar entre moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato individuales. Una composición en la que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato puede ser, por ejemplo, una composición en la que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en el extremo superior de la distribución de peso molecular no es menor que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en el extremo inferior de la distribución de peso molecular. Por tanto, por ejemplo, la composición puede ser una en la que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no varía sustancialmente, por ejemplo para nada, con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, por ejemplo el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en el extremo superior de la distribución de peso
molecular es esencialmente el mismo, por ejemplo idéntico, al de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en el extremo inferior de la distribución de peso molecular. Además por ejemplo, la composición puede ser una en la que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato aumenta con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, por ejemplo el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en el extremo superior de la distribución de peso molecular es mayor que el de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en el extremo inferior de la distribución de peso molecular.
Inesperadamente, se ha observado en este caso que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato que tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, y más particularmente de aproximadamente el 50 al 60%, pueden obtenerse en formas en las que los porcentajes molares monoméricos de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato de un cultivo de un organismo no disminuyen durante las etapas posteriores del cultivo del organismo, por ejemplo durante la fase estacionaria, según los métodos descritos a continuación, por ejemplo cultivar un organismo en presencia de uno o más materiales de partida de carbono, tales como glucosa como única fuente de carbono, tal como se comenta a continuación, en el que el organismo se ha modificado por ingeniería genética, tal como se comenta también a continuación. También se ha observado que durante el cultivo de un organismo no modificado por ingeniería genética, en presencia de glucosa y 1,4-butanodiol, cantidades decrecientes de 1,4-butanodiol que son típicas de etapas posteriores de tal cultivo (por ejemplo, reflejando el consumo de la mayoría del 1,4-butanodiol que había estado presente) dan como resultado porcentajes molares monoméricos decrecientes de monómeros de 4-hidroxibutirato de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato de un cultivo del organismo con pesos moleculares promedio en peso crecientes concomitantes de las moléculas de copolímero. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que la ausencia de una disminución del porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato de un cultivo de un organismo durante las etapas posteriores del cultivo del organismo, según los métodos descritos a continuación, es indicativa de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en las que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato. Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato en las que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato pueden usarse para garantizar propiedades físicas y estructurales consistentes de composiciones de las mismas.
La composición resultante es una en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato se producen en un proceso de fermentación usando uno o más materiales de partida de carbono que, tomados juntos, tienen un contenido de base biológica de > 80%; comprendiendo el uno o más materiales de partida de carbono preferiblemente una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa, y mezclas de los mismos; y el rendimiento es mayor de 0,25 g de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato por gramo de la fuente de carbono. Por ejemplo, el rendimiento puede ser mayor de 0,30 g, o mayor de 0,35 g, o mayor de 0,40 g, de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato por gramo de la fuente de carbono.
Los métodos de elaboración de estas composiciones de copolímero de polihidroxialcanoato, tal como se describió anteriormente, se dan a conocer a continuación.
También se da a conocer una composición de combinación de polímeros en el presente documento. La composición de combinación de polímeros comprende una composición de polihidroxialcanoato y una pluralidad de moléculas de un segundo polímero. La composición de polihidroxialcanoato puede ser cualquiera de las composiciones de polihidroxialcanoato tal como se describió anteriormente, concretamente moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de > 80%, (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa, y además en la que la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -60°C a -5°C. Además, la composición de polihidroxialcanoato puede ser una, por ejemplo, en la que (a) el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es del 25 al 70%, del 30 al 40%, del 40 al 50%, del 50 al 60% o del 60 al 70%, (b) el contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es > 95%, > 99% o del 100%, (c) las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un peso molecular promedio en peso de 1,5 MDa a 2,0 MDa, o de 1,7 MDa a 2,0 MDa, (d) la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -50°C a -15°C, de -50°C a -20°C o de -45°C a -15°C, (e) el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato.
El segundo polímero puede ser, por ejemplo, un polímero de base biológica o un polímero de base no biológica. Los polímeros de base biológica adecuados incluyen, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(succinato de butileno), poli(succinato-adipato de butileno), poli(tereftalato-adipato de butileno) y/o poli(carbonato de propileno), en los que
los polímeros de los plásticos de base biológica se derivan de ácido succínico de base biológica, ácido adípico de base biológica, 1,4-butanodiol de base biológica, poli(óxido de propileno) de base biológica y/o dióxido de carbono. Los polímeros de base biológica adecuados también incluyen, por ejemplo, polihidroxialcanoatos adicionales distintos de copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato), tales como, por ejemplo, homopolímeros tales como homopolímero de poli-3-hidroxibutirato y homopolímero de poli-4-hidroxibutirato, otros copolímeros, tales como poli-3-hidroxibutirato-co-hidroxivalerato y poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato, y combinaciones de éstos y otros polihidroxialcanoatos. Los polímeros de base no biológica adecuados incluyen, por ejemplo, poli(cloruro de vinilo).
La composición de combinación de polímeros puede usarse para una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo película de empaquetamiento, basándose en la optimización de las propiedades mecánicas (por ejemplo, resistencia a la tracción, resistencia a la punción y elongación), propiedades térmicas (por ejemplo, temperatura de distorsión térmica) y/o propiedades ópticas (por ejemplo, claridad). La composición de combinación de polímeros en la que el segundo polímero es un polímero de base biológica puede usarse, en particular, para optimizar las propiedades de rendimiento y para lograr un alto contenido de base biológica. La composición de combinación de polímeros en la que el segundo polímero es poli(cloruro de vinilo) tiene propiedades mejoradas incluyendo procesamiento mejorado en comparación con poli(cloruro de vinilo) solo. La composición de combinación de polímeros puede combinarse mediante métodos adecuados que se conocen en la técnica.
La composición de combinación de polímeros puede ser una, por ejemplo, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato están presentes a del 5 al 95% en peso de la composición de combinación de polímeros. Por ejemplo, la composición de combinación de polímeros puede ser una en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato están presentes a del 20 al 40% en peso, del 25 al 35% en peso o del 28 al 33% en peso, de la composición de combinación de polímeros. La composición de combinación de polímeros también puede ser, por ejemplo, continua o cocontinua. La composición de combinación de polímeros también puede ser una, por ejemplo, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato y las moléculas del segundo polímero forman una única fase, por ejemplo en la que el segundo polímero es poli(cloruro de vinilo). La composición de combinación de polímeros también puede ser una, por ejemplo, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato y las moléculas del segundo polímero forman más de una única fase, por ejemplo en la que el segundo polímero es poli(ácido láctico). La composición de combinación de polímeros también puede tener, por ejemplo, una menor capacidad de cristalización, es decir cristalinidad teórica máxima, que una composición correspondiente que carece de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato.
También se da a conocer una composición de biomasa en el presente documento. La composición de biomasa comprende una composición de polihidroxialcanoato, por ejemplo cualquiera de las composiciones de polihidroxialcanoato tal como se describió anteriormente, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato están presentes a > 50% en peso de la composición de biomasa. Por tanto, de nuevo, la composición de copolímero de polihidroxialcanoato es una que comprende una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de > 80%, (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa, y además en la que la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -60°C a -5°C. Además, la composición de polihidroxialcanoato puede ser una, por ejemplo, en la que (a) el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es del 25 al 70%, del 30 al 40%, del 40 al 50%, del 50 al 60% o del 60 al 70%, (b) el contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es > 95%, > 99% o del 100%, (c) las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un peso molecular promedio en peso de 1,5 MDa a 2,0 MDa, o de 1,7 MDa a 2,0 MDa, (d) la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -50°C a -15°C, de -50°C a -20°C o de -45°C a -15°C, (e) el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato.
Tal como se indica, las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato están presentes a > 50% en peso de la composición de biomasa. Tal como se usa en el presente documento, % en peso de la composición de biomasa se refiere al peso seco de la composición de biomasa, por ejemplo peso seco celular. Las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato pueden estar presentes, por ejemplo, a > 60, > 70, > 80, > 85 o > 90% en peso de la composición de biomasa.
El método comprende cultivar un organismo modificado por ingeniería genética en presencia de uno o más materiales de partida de carbono en condiciones en las que (a) el uno o más materiales de partida de carbono se convierten en 3-hidroxibutiril-CoA y 4-hidroxibutiril-CoA y (b) la 3-hidroxibutiril-CoA y la 4-hidroxibutiril-CoA se polimerizan para formar las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, formando de ese modo la composición.
El cultivo puede comprender, por ejemplo, cultivar el organismo mediante fermentación, cultivo en matraces con agitación, y similares. Puede llevarse a cabo la fermentación, por ejemplo, a escalas que oscilan entre escala de
laboratorio, por ejemplo 1 l, y escala de fabricación industrial, por ejemplo de 20.000 a 100.000 l. En los ejemplos a continuación se describen enfoques de cultivo adecuados adicionales.
El organismo puede ser, por ejemplo, una cepa microbiana o una cepa de alga. Las cepas microbianas adecuadas incluyen, por ejemplo, una cepa de Escherichia coli o una cepa de Ralstonia eutropha. Las cepas de algas adecuadas incluyen, por ejemplo, una cepa de Chlorella. Se describen organismos adecuados adicionales en los ejemplos a continuación.
El uno o más materiales de partida de carbono pueden comprender un material de partida de carbono que puede usarse en un proceso industrial, por ejemplo para proporcionar carbono u otra fuente de energía a células de un proceso de fermentación, y/o que es renovable, por ejemplo material derivado de organismos vivos o sus subproductos metabólicos incluyendo material derivado de biomasa, que consiste a menudo en componentes infrautilizados como paja o forraje. Por ejemplo, el uno o más materiales de partida de carbono pueden comprender una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa, y mezclas de los mismos. Además por ejemplo, el uno o más materiales de partida de carbono pueden comprender uno o más de melaza, almidón, un ácido graso, un aceite vegetal, un material lignocelulósico, etanol, ácido acético, glicerol, un gas de síntesis derivado de biomasa y metano que se origina a partir de un gas de vertedero.
Considerando el uno o más materiales de partida de carbono adicionales, en algunas realizaciones, el uno o más materiales de partida de carbono pueden consistir esencialmente en una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa, y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más materiales de partida de carbono pueden consistir en una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa, y mezclas de los mismos. Por tanto, en algunas realizaciones el uno o más materiales de partida de carbono pueden consistir esencialmente en una única fuente de carbono, por ejemplo glucosa. Además, en algunas realizaciones el uno o más materiales de partida de carbono pueden consistir en una única fuente de carbono, de nuevo por ejemplo glucosa.
El uno o más materiales de partida de carbono también pueden excluir compuestos particulares, tales como compuestos que son precursores inmediatos de 4-hidroxibutiril-CoA y/o compuestos que se fabrican normalmente a partir de recursos no renovables, por ejemplo de petróleo, basándose en un coste sustancialmente menor en comparación con la fabricación de los mismos a partir de recursos renovables, por ejemplo cultivos. La incorporación de tales compuestos para la producción de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato puede ser costosa, particularmente con respecto a la escala de fabricación industrial, por ejemplo mediante fermentación usando recipientes de 20.000 a 100.000 l, basándose en el requisito de alimentaciones adicionales y, por tanto, infraestructura y control de calidad, y puede dar como resultado la necesidad de un control más estricto con el fin de lograr composiciones de copolímero de polihidroxialcanoato con consistencia estructural. El uno o más materiales de partida de carbono pueden ser, por ejemplo, unos que no comprenden y-butirolactona, 1,4-butanodiol, 4-hidroxibutirato, 3-hidroxibutirato, a-cetoglutarato, oxaloacetato, malato, fumarato, citrato, succinato o 3-hidroxibutirato, y por tanto que excluyen cada uno de estos compuestos. Por tanto, por ejemplo, el cultivo del organismo puede llevarse a cabo en ausencia de y-butirolactona, 1,4-butanodiol, 4-hidroxibutirato, 3-hidroxibutirato, a-cetoglutarato, oxaloacetato, malato, fumarato, citrato, succinato y 3-hidroxibutirato, es decir, sin añadir ninguno de estos compuestos de manera exógena antes, durante o después del cultivo.
Las condiciones pueden ser condiciones que son adecuadas, por ejemplo típicas y/u óptimas, para el cultivo del organismo, por ejemplo con respecto a temperatura, oxigenación, título inicial del organismo, tiempo de cultivo, etc. Se proporcionan condiciones adecuadas a modo de ejemplo en los ejemplos a continuación.
El uno o más materiales de partida de carbono pueden convertirse en 3-hidroxibutiril-CoA y 4-hidroxibutiril-CoA mediante enzimas expresadas por el organismo, tal como se comenta en detalle en los ejemplos. La 3-hidroxibutiril-CoA y la 4-hidroxibutiril-CoA también pueden polimerizarse para formar las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, formando de ese modo la composición, mediante enzimas expresadas por el organismo, de nuevo tal como se comenta en detalle en los ejemplos.
Según el método, el organismo se ha modificado por ingeniería genética mediante la incorporación estable de genes que codifican para una polihidroxialcanoato sintasa, una acetil-CoA acetiltransferasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una succinato-semialdehído deshidrogenasa, una semialdehído succínico reductasa y una CoA transferasa, y para no comprender actividades enzimáticas de o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ o ambas.
El organismo puede modificarse por ingeniería genética para comprender estas actividades enzimáticas transformando el organismo con uno o más genes que codifican para cada una de las actividades enzimáticas. Los genes se incorporan de manera estable en el organismo, por ejemplo mediante la introducción en uno o más plásmidos estables y/o mediante la integración en el genoma del organismo. El organismo también puede modificarse por ingeniería genética para comprender las actividades enzimáticas, por ejemplo, alterando las
regiones promotoras de uno o más genes que codifican para cada una de las actividades enzimáticas, por ejemplo, reemplazando los promotores que se producen de manera natural con promotores más fuertes y/o eliminando las secuencias represoras. Además, pueden usarse combinaciones de estos enfoques y similares. Usar enfoques tales como éstos puede dar como resultado la integración de los genes en el organismo con alta estabilidad, por ejemplo mayor que 50 generaciones del organismo, y alta expresión, suficiente para producción industrial, por ejemplo, mediante la fermentación usando recipientes de 20.000 a 100.000 l. Se comentan enfoques a modo de ejemplo adecuados en más detalle a continuación.
El organismo se modifica por ingeniería genética adicionalmente para no comprender actividades enzimáticas de o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ o ambas, por ejemplo, introduciendo una o más mutaciones o secuencias inhibidoras en el organismo para inhibir la expresión de cualquiera o ambas actividades, delecionando del genoma del organismo los genes correspondientes que codifican para cualquiera o ambas actividades, alterando cualquiera o ambos de los genes correspondientes parcial o completamente mediante recombinación homóloga, y/o interfiriendo con la expresión de cualquiera o ambos de los genes correspondientes tal como expresando ARNip que interfiere con la expresión de los genes correspondientes. Se comentan enfoques a modo de ejemplo adecuados en más detalle a continuación.
Según el método, el organismo puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para comprender actividades enzimáticas de una alfa-cetoglutarato descarboxilasa o 2-oxoglutarato descarboxilasa, y una L-1,2-propanodiol oxidorreductasa. El organismo también puede modificarse por ingeniería genética para no comprender actividades enzimáticas de una o más de una tioesterasa II, una acil-CoA tioesterasa I y proteasa I y lisofosfolipasa L multifuncionales, una acil-CoA tioesterasa y una aldehído deshidrogenasa.
Además según el método, el uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, tienen un contenido de base biológica de > 80%. Mediante esto quiere decirse que la cantidad de carbono de base biológica en el uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, es > 80% del peso (masa) del carbono orgánico total del uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, tal como se mide según la norma ASTM D6866-12. Esto puede lograrse, por ejemplo, incluyendo al menos un material de partida de carbono correspondiente a un recurso renovable, por ejemplo glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa, y mezclas de los mismos, de modo que el contenido de base biológica del recurso renovable es del 100% y que > 80% del peso (masa) del carbono orgánico total del uno o más materiales de partida de carbono se corresponde con el recurso renovable. El uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, pueden tener, por ejemplo, un contenido de base biológica de > 95%, > 99% o del 100%.
El método también puede comprender aislar las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato del organismo, de modo que la composición de copolímero de polihidroxialcanoato está sustancialmente libre del organismo. En la técnica se conocen enfoques a modo de ejemplo adecuados para tal aislamiento.
Una composición de copolímero de polihidroxialcanoato elaborada según los métodos descritos anteriormente también se da a conocer en el presente documento, pero no es parte del objeto reivindicado. La composición de copolímero de polihidroxialcanoato comprende una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, en la que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de > 80%, (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa, y además en la que la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -60°C a -5°C. Además, la composición de polihidroxialcanoato puede ser una, por ejemplo, en la que (a) el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es del 25 al 70%, del 30 al 40%, del 40 al 50%, del 50 al 60% o del 60 al 70%, (b) el contenido de base biológica de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es > 95%, > 99% o del 100%, (c) las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato tienen un peso molecular promedio en peso de 1,5 MDa a 2,0 MDa, o de 1,7 MDa a 2,0 MDa, (d) la composición tiene una temperatura de transición vítrea de -50°C a -15°C, de - 50°C a -20°C, o de -45°C a -15°C, (e) el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato no disminuye con el peso molecular creciente de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato.
Ejemplos
La presente tecnología se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que describen varias herramientas de biotecnología y métodos para la construcción de cepas que generan un producto de interés. Se describen cepas huésped adecuadas, la fuente potencial y una lista de genes recombinantes usados en estos ejemplos, vectores extracromosómicos adecuados, estrategias adecuadas y elementos reguladores para controlar la expresión génica recombinante, y una selección de técnicas de construcción para sobreexpresar genes en o inactivar genes de organismos huésped. Estas herramientas de biotecnología y métodos los conocen bien los expertos en la técnica.
Cepas huésped adecuadas
En algunas realizaciones, la cepa huésped es la cepa K-12 de E. coli LS5218 (Spratt et al., J. Bacterio!. 146 (3):1166-1169 (1981); Jenkins y Nunn, J. Bacteriol. 169 (1):42-52 (1987)) o la cepa MG1655 (Guyer et al., Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 45:135-140 (1981)). Otras cepas huésped K-12 de E. coli incluyen, pero no se limitan a, WG1 y W3110 (Bachmann Bacteriol. Rev. 36(4):525-57 (1972)). Alternativamente, la cepa W de E. coli (Archer et al., BMC Genomics 2011, 12:9 doi:10.1186/1471-2164-12-9) o la cepa B de E. coli (Delbruck y Luria, Arch. Biochem.
1:111-141 (1946)) y sus derivados tales como REL606 (Lenski et al., Am. Nat. 138:1315-1341 (1991)) son otras cepas huésped E. coli adecuadas.
Otras cepas huésped microbianas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: Ralstonia eutropha, Zoogloea ramigera, Allochromatium vinosum, Rhodococcus ruber, Delftia acidovorans, Aeromonas caviae, Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942, Tiocapsa pfenigii, Bacillus megaterium, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter bailyi, Clostridium kluyveri, Metilobacterium extorquens, Nocardia corralina, Nocardia salmonicolor, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp. 6-19, Pseudomonas sp. 61-3 y Pseudomonas putida, Rhodobacter sphaeroides, Alcaligenes latus, Klebsiella oxitoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxidans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor y Clostridium acetobutilicum. Las levaduras o los hongos a modo de ejemplo incluyen especies seleccionads de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Pichia pastoris.
Las cepas de algas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: cepas de Chlorella, especies seleccionadas de: Chlorella minutissima, Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp. o Chlorella protothecoides.
Fuente de genes recombinantes
Las fuentes de ácidos nucleicos codificantes para una enzima de la ruta de PHB-co-4HB pueden incluir, por ejemplo, cualquier especie en la que el producto génico codificado pueda catalizar la reacción de referencia. Tales especies incluyen tanto organismos procariotas como eucariotas incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias, incluyendo arqueas y eubacterias, y eucariotas, incluyendo levadura, planta, insecto, animal y mamífero, incluyendo ser humano. Las especies a modo de ejemplo para tales fuentes incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechococcus sp. PCC 7002, Chlorogleopsis sp. PCC 6912, Chloroflexus aurantiacus, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutilicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutilacetonicum, Clostridium perjringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium tetanomorphum, Clostridium tetani, Clostridium propionicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium subterminale, Clostridium sticklandii, Ralstonia eutropha, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Porphyromonas gingivalis, Arabidopsis thaliana, Thermus thermophilus, especies de Pseudomonas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Chlorella minutissima, Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp., Chlorella protothecoides, Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus, Rhodobacter sphaeroides, Thermoanaerobacter brockii, Metallosphaera sedula, Leuconostoc mesenteroides, Roseiflexus castenholzii, Erythrobacter, Simmondsia chinensis, especies de Acinetobacter, incluyendo Acinetobacter calcoaceticus y Acinetobacter bailyi, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Bacillus pumilus, Rattus norvegicus, Klebsiella pneumonía, Klebsiella oxitoca, Euglena gracilis, Treponema denticola, Moorella thermoacetica, Thermotoga maritima, Halobacterium salinarum, Geobacillus stearothermophilus, Aeropyrum pernix, Sus scrofa, Caenorhabditis elegans, Corynebacterium glutamicum, Acidaminococcus fermentans, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterobacter aerogenes, Candida sp., Aspergillus terreus, Pedicoccus pentosaceus, Zymomonas mobilus, Acetobacter pasteurians, Kluyveromyces lactis, Eubacterium barkeri, Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, Natranaerobius thermophilus, Campilobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Citrobacter amalonaticus, Myxococcus xanthus, Fusobacterium nuleatum, Penicillium chrysogenum, proteobacteria marina gamma y bacteria productora de butirato. Por ejemplo, los huéspedes microbianos (por ejemplo, organismos) que tienen producción biosintética de PHB-co-4HB se proporcionan a modo de ejemplo en el presente documento con referencia a un huésped de E. coli. Sin embargo, con la secuencia genómica completa disponible actualmente para más de 550 especies (con más de la mitad de éstas disponibles en bases de datos públicas tales como el NCBI), incluyendo genomas de 395 microorganismos y una variedad de genomas de levaduras, hongos, plantas y mamíferos, la identificación de genes que codifican para la actividad biosintética de PHB-co-4HB requerida para uno o más genes en especies relacionadas o distantes, incluyendo por ejemplo, desplazamientos de genes homólogos, ortólogos, parálogos y no ortólogos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones genéticas entre organismos, es rutina y se conoce bien en la técnica. Por consiguiente, las alteraciones metabólicas que permiten la biosíntesis de PHB-co-4HB y otros compuestos de la divulgación en el presente documento con referencia a un organismo particular tal como E. coli pueden aplicarse fácilmente a otros microorganismos, incluyendo organismos procariotas y eucariotas similares. Dadas las enseñanzas y la guía proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán que una alteración metabólica a modo
de ejemplo en un organismo puede aplicarse igualmente a otros organismos.
Producción de huésped transgénico para producir 4HB
Se modifican por ingeniería genética huéspedes transgénicos (recombinantes) para producir PHB-co-4HB usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. Los genes clonados y/o evaluados para las cepas huésped que producen PHB-co-4HB se presentan a continuación en la tabla 1A, junto con las referencias y el número de comisión de enzima (número EC) apropiado. Algunos genes se sintetizaron para la optimización de codones mientras que otros se clonaron mediante PCR a partir del ADN genómico del huésped nativo o de tipo natural. Tal como se usa en el presente documento, “heterólogo” significa de otro huésped. El huésped puede ser de la misma o de diferente especie. La figura 1 es una ruta a modo de ejemplo para producir PHB-co-4HB.
Tabla 1A. Genes sobreproducidos o delecionados en cepas huésped microbianas que producen PHB-co-4HB según la figura 1. Un asterisco (*) después del nombre del gen indica que la secuencia de nucleótidos se optimizó para la expresión en E. coli.
Pueden descubrirse otras proteínas que pueden catalizar las reacciones enumeradas en la tabla 1A consultando la bibliografía científica, las patentes, las búsquedas BRENDA (http://www.brenda-enzymes.info/) y/o las búsquedas BLAST frente a, por ejemplo, las bases de datos de nucleótidos o proteínas en el NCBi (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los genes sintéticos pueden crearse para proporcionar una ruta fácil desde las bases de datos de secuencias hasta el ADN físico. Tales genes sintéticos están diseñados y fabricados desde cero, usando codones para mejorar la expresión de proteínas heterólogas y optimizando las características necesarias para el sistema de expresión y el huésped. Empresas tales como, por ejemplo, DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025, EE.UU.) proporcionarán tal servicio de rutina. Las proteínas que pueden catalizar algunas de las reacciones bioquímicas enumeradas en la tabla 1A se proporcionan en las tablas 1B a 1X.
Tabla 1B. Homólogos adecuados para la proteína PhaA5 (beta-cetotiolasa, de Zoogloea ramigera, n.° EC 2.3.1.9, que actúa sobre acetil-CoA acetil-CoA para producir acetoacetil-CoA; n.° de registro de proteína 2VU2_A).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
acetil-CoA acetiltransferasa YP_002827756
acetil-CoA acetiltransferasa YP_002283310
acetil-CoA acetiltransferasa YP_002733453
acetil-CoA acetiltransferasa ZP_01011874
acetil-CoA acetiltransferasa ZP_00961105
acetil-CoA acetiltransferasa YP_426557
acetil-coenzima A acetiltransferasa 3 NP_694791
acetil-CoA acetiltransferasa YP_003153095
acetil-CoA acetiltransferasa CCF95917
acetil-CoA acetiltransferasa ZP_07454459
Tabla 1C. Homólogos adecuados para la proteína PhaB5 (acetoacetil-CoA reductasa, de Zoogloea ramigera, n.° EC 1.1.1.36, que actúa sobre la acetoacetil-CoA para producir 3-hidroxibutiril-CoA; n.° de registro de proteína P23238).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
acetoacetil-CoA reductasa YP_002827755
producto del gen phaB YP_770184
acetoacetil-CoA reductasa ZP_08627619
Molibdopterina-guanina dinucleótido proteína de biosíntesis A ZP_01901796
acetoacetil-CoA reductasa YP_006369576
Supuesto Phab de acetoacetil-CoA reductasa ZP_09394630
acetoacetil-CoA reductasa YP_001352246
acetoacetil-CoA reductasa ZP_02467262
acetoacetil-CoA reductasa ZP_01985557
Tabla 1D. Homólogos adecuados para la proteína SucD (succinato-semialdehído deshidrogenasa, de Clostrídium kluyveri, n.° EC 1.2.1.76, que actúa sobre succinil-CoA para producir succinato-semialdehído; n.° de registro de
proteína YP_001396394).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de CoAsa AAA92347
succinato-semialdehído deshidrogenasa [NAD(P)+] ZP_06559980
succinato-semialdehído deshidrogenasa [NAD(P)+] ZP_05401724
proteína de la familia de aldehído-alcohol deshidrogenasa ZP_07821123
succinato-semialdehído deshidrogenasa [NAD(P)+] ZP_06983179
succinato-semialdehído deshidrogenasa YP_001928839
proteína hipotética CLOHYLEM_05349 ZP_03778292
succinato-semialdehído deshidrogenasa [NAD(P)+] YP_003994018
succinato-semialdehído deshidrogenasa NP_904963
Tabla 1E. Homólogos adecuados para la proteína KgdM (alfa-cetoglutarato descarboxilasa, de Tuberculosis micobacteriana, n.° EC 4.1.1.71, que actúa sobre el alfa-cetoglutarato para producir succinato-semialdehído y dióxido de carbono; n.° de registro de proteína NP_335730).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_001282558
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_854934
2-oxoglutarato deshidrogenasa sucA ZP_06454135
2-oxoglutarato deshidrogenasa sucA ZP_04980193
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_961470
alfa-cetoglutarato descarboxilasa Kgd YP_001852457
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_301802
alfa-cetoglutarato descarboxilasa ZP_05215780
alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_001702133
Tabla 1F. Homólogos adecuados para la proteína KgdP (alfa-cetoglutarato descarboxilasa, de Pseudonocardia dioxanivorans CB1190, n.° EC 4.1.1.n, que actúa sobre el alfa-cetoglutarato para producir succinato-semialdehído y dióxido de carbono; n.° de registro de proteína YP_004335105).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
alfa-cetoglutarato descarboxilasa ZP_08119245
2-oxoglutarato deshidrogenasa, componente E1 ZP_09743222
alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_705947
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_961470
alfa-cetoglutarato descarboxilasa ZP_08024348
alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_003343675
producto del gen kgd NP_737800
complejo de 2-oxoglutarato deshidrogenasa, YP_004223349
componente (E1) de deshidrogenasa
oxoglutarato deshidrogenasa (transferencia de EJF35718
succinilo), componente E1
Tabla 1G. Homólogos adecuados para la proteína KgdS (2-oxoglutarato descarboxilasa, de Synechococcus sp. PCC 7002, n.° EC 4.1.1.n, que actúa sobre el alfa-cetoglutarato para producir succinato-semialdehído y dióxido de carbono; n.° de registro de proteína ACB00744.1).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_001282558
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_854934
2-oxoglutarato deshidrogenasa sucA ZP_06454135
2-oxoglutarato deshidrogenasa sucA ZP_04980193
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_961470
alfa-cetoglutarato descarboxilasa Kgd YP_001852457
alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_301802
alfa-cetoglutarato descarboxilasa ZP_05215780
alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_001702133
Tabla 1H. Homólogos adecuados para la proteína SsaRAt (semialdehído succínico reductasa, de Arabidopsis thaliana, n.° EC 1.1.1.61, que actúa sobre el succinato-semialdehído para producir 4-hidroxibutirato; n.° de registro de proteína AAK94781).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
proteína que contiene el dominio de unión a 
NAD de 6-fosfogluconato deshidrogenasa
isoforma de proteína hipotética 1 XP_002266252
proteína prevista XP_002320548
isoforma de proteína hipotética 2 XP_002266296
desconocido ACU22717
3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, supuesta XP_002524571
desconocida ABK22179
desconocida ACJ85049
proteína prevista XP_001784857
Tabla 1I. Homólogos adecuados para la proteína FucOi6l-l7v (L-1,2-propanodiol oxidorreductasa, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 1.1.1.77, que actúa sobre el succinato-semialdehído para producir 4 hidroxibutirato).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
L-1,2-propanodiol oxidorreductasa YP_001459571
lactaldehído reductasa ZP_12475782
L-1,2-propanodiol oxidorreductasa YP_001455658
lactaldehído reductasa ZP_17109585
L-1,2-propanodiol oxidorreductasa YP_003294352
L-1,2-propanodiol oxidorreductasa YP_002988900
L-1,2-propanodiol oxidorreductasa ZP_09185179
lactaldehído reductasa ZP_06759418
alcohol deshidrogenasa ZP_05943499
Tabla 1J. Homólogos adecuados para la proteína OrfZ (CoA transferasa, de Clostrídium kluyveri DSM 555, n.° EC 2.8.3.n, que actúa sobre 4-hidroxibutirato para producir 4-hidroxibutiril CoA; n.° de registro de proteína AAA92344).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa YP 001396397
acetil-CoA hidrolasa/transferasa ZP_05395303
acetil-CoA hidrolasa/transferasa YP_001309226
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa NP_781174
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa ZP_05618453
acetil-CoA hidrolasa/transferasa ZP_05634318
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa ZP_00144049
proteína hipotética ANASTE_01215 ZP_02862002
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa ZP 07455129
Tabla 1K. Homólogos adecuados para la proteína OrfZ150 (CoA transferasa, de Porphyromonas gingivalis W83, n.° EC 2.8.3.n, que actúa sobre 4-hidroxibutirato para producir 4-hidroxibutiril CoA; n.° de registro de proteína NP_904965).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
4-hidroxibutirato CoA-transferasa YP_005014371
proteína hipotética FUAG_02467 ZP_10973595
acetil-CoA hidrolasa/transferasa ZP_10325539
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa ZP_10895308
4-hidroxibutirato CoA-transferasa ZP_15973607
acetil-CoA hidrolasa/transferasa YP_003639307
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa ZP_08514074
succinil:benzoato coenzima A transferasa YP_006721017
4-hidroxibutirato CoA-transferasa YP 003961374
Tabla 1L. Homólogos adecuados para la proteína Buk1 (butirato cinasa I, de Clostridium acetobutylicum ATCC824, n.° EC 2.7.2.7, que actúa sobre 4-hidroxibutirato para producir fosfato de 4-hidroxibutirilo).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
butirato cinasa YP_001788766
butirato cinasa YP_697036
butirato cinasa YP_003477715
butirato cinasa YP_079736
acetato y butirato cinasa ZP_01667571
butirato cinasa YP_013985
butirato cinasa ZP_04670620
butirato cinasa ZP_04670188
butirato cinasa ZP_07547119
lecuados para la proteína Buk2 (butirato cinasa II, de Clostridium ,
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
butirato cinasa YP_001311072
proteína hipotética CLOSPO_00144 ZP_02993103
proteína hipotética COPEUT_01429 ZP_02206646
butirato cinasa EFR5649
butirato cinasa ZP_0720132
butirato cinasa YP_0029418
butirato cinasa YP_002132418
butirato cinasa ZP_05389806
fosfato butiriltransferasa ADQ27386
Tabla 1N. Homólogos adecuados para la proteína Ptb (fosfotransbutirilasa, de Clostrídium acetobutylicum ATCC824, n.° EC 2.3.1.19, que actúa sobre el fosfato de 4-hidroxibutirilo para producir 4-hidroxibutiril CoA).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
fosfato butiriltransferasa YP_001884531
proteína hipotética COPCOM_01477 ZP_03799220
fosfato butiriltransferasa YP_00331697
fosfato butiriltransferasa YP_004204177
fosfato acetil/butiriltransferasa ZP_05265675
supuesta fosfato acetil/butiriltransferasa ZP_05283680
enoil-CoA hidratasa/fosfato acetiltransferasa bifuncional YP_426556
proteína hipotética CLOBOL_07039 ZP_02089466
fosfato butiriltransferasa YP_003564887
Tabla 1O. Homólogos adecuados para la proteína PhaC3/C5 (proteína de fusión de polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida y Zoogloea ramigera, n.° CE 2.3.1.n, que actúa sobre (R)-3-hidroxibutiril-CoA o 4-hidroxibutiril-CoA [(R)-3-hidroxibutanoato-co-4-hidroxibutanoato]n para producir [(R)-3-hidroxibutanoato-co-4-hidroxibutanoato](n 1) CoA y también actúa sobre 4-hidroxibutiril-CoA [4-hidroxibutanoato]n para producir [4-hidroxibutanoato](n 1) CoA).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
PHB polimerasa AAB06755
ácido polihidroxialcanoico sintasa ZP_10443466
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa, clase I ZP_10719804
poli (3-hidroxibutirato) polimerasa PhaC YP_004685292
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa, clase I ZP_02382303
poli-beta-hidroxibutirato polimerasa YP_003977718
producto del gen phaC2 YP_583821
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa YP_001003639
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa YP_283333
Tabla 1P. Homólogos adecuados para la proteína PhaC3/C1 (proteína de fusión de polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida y Ralstonia eutropha JMP134, n.° EC 2.3.1.n, que actúa sobre (R)-3-hidroxibutiril-CoA o 4 hidroxibutiril-CoA [(R)-3-hidroxibutanoato-co-4-hidroxibutanoato]n para producir [(R)-3-hidroxibutanoato-co-4-hidroxibutanoato](n 1) CoA y también actúa sobre 4-hidroxibutiril-CoA [4-hidroxibutanoato]n para producir [4-hidroxibutanoato](n 1) CoA).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa, clase I YP_295561
poli(3-hidroxibutirato) polimerasa YP_725940
ácido polihidroxialcanoico sintasa AAW65074
ácido polihidroxialcanoico sintasa YP_002005374
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa, clase I YP_583508
polihidroxialcanoato sintasa intracelular ADM24646
poli(3-hidroxialcanoato) polimerasa ZP_00942942
ácido polihidroxialcanoico sintasa YP_003752369
PhaC AAF23364
Tabla 1Q. Homólogos adecuados para la proteína PhaC3/C33 (proteína de fusión de polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida y Delftia acidovorans 89-11-102, n.° EC 2.3.1.n, que actúa sobre (R)-3-hidroxibutiril-CoA o 4-hidroxibutiril-CoA [(R)-3-hidroxibutanoato-co-4-hidroxibutanoato]n para producir [(R)-3-hidroxibutanoato-co-4-hidroxibutanoato](n 1) CoA y también actúa sobre 4-hidroxibutiril-CoA [4-hidroxibutanoato]n para producir [4-hidroxibutanoato](n 1) CoA).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
polihidroxibutirato sintasa AAL17611
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa, clase I ZP_04764634
proteína de poli-beta-hidroxibutirato polimerasa CAQ36337
poli-beta-hidroxibutirato polimerasa YP_004360851
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa, clase I ZP_08961344
poli(R)-ácido hidroxialcanoico sintasa YP_983028
ácido polihidroxialcanoico sintasa EGF41868
poli-beta-hidroxibutirato polimerasa ZP_02489627
polihidroxialcanoato sintasa ABN71571
Tabla 1R. Homólogos adecuados para la proteína Ynel (Sad) (succinato-semialdehído deshidrogenasa, dependiente de NAD+, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 1.2.1.24, que actúa sobre el semialdehído de glutarato (semialdehído succínico) para producir glutarato (succinato); n.° de registro de proteína NP_416042 (Führer et al. J Bacteriol. Noviembre de 2007; 189 (22): 8073-8. Dennis y Valentin, patente estadounidense n.° 6.117.658)).
Nombre de la proteína N.° de registro
de proteína
succinato-semialdehído NP_805238
deshidrogenasa
supuesta aldehído deshidrogenasa YP_002919404
aldehído deshidrogenasa NP_745295
aldehído deshidrogenasa ZP_03269266
aldehído deshidrogenasa ZP_05726943
aldehído deshidrogenasa YP_001906721
proteína hipotética BAF01627
aldehído deshidrogenasa ZP_03739186
succinato-semialdehído NP_637690
deshidrogenasa
Tabla 1S. Homólogos adecuados para la proteína GabD (succinato-semialdehído deshidrogenasa, dependiente de NADP+, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 1.2.1.20, que actúa sobre el semialdehído de glutarato (o semialdehído succínico) para producir glutarato (o succinato); n.° de registro de proteína NP_417147 (Riley et al. Nucleic Acids Res. 34 (1), 1 -9 (2006))).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
succinato-semialdehído deshidrogenasa I ZP_05433422
succinato-semialdehído deshidrogenasa (NAD(P)(+)) YP_001744810
proteína hipotética CIT292_04137 ZP_ 03838093
succinato-semialdehído deshidrogenasa YP_ 002638371
succinato-semialdehído deshidrogenasa I YP_ 001333939
succinato-semialdehído deshidrogenasa I NP_ 742381
succinato-semialdehído deshidrogenasa [NADP+] (ssdh) YP_002932123
semialdehído succínico deshidrogenasa YP_ 001951927
succinato-semialdehído deshidrogenasa YP_ 298405
Tabla 1T. Homólogos adecuados para la proteína AstD (aldehído deshidrogenasa de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 1.2.1.71, que actúa sobre el succinato-semialdehído para producir succinato); n.° de registro de proteína NP_416260.
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa YP_002382476
proteína hipotética D186_18882 ZP_16280274
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa YP_003942089
succinilglutamato-semialdehído deshidrogenasa ZP_16225314
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa AstD YP_005933902
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa YP_005431041
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa ZP_10352779
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa ZP_10036944
semialdehído succinilglutámico deshidrogenasa YP_004730031
Tabla 1U. Homólogos adecuados para la proteína Ppc (fosfoenolpiruvato carboxilasa, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 4.1.1.31, que actúa sobre fosfoenolpiruvato y dióxido de carbono para producir oxaloacetato; n.° de registro de proteína NP_418391).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
fosfoenolpiruvato carboxilasa ZP_02904134
fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_002384844
fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_003367228
fosfoenolpiruvato carboxilasa ZP_02345134
fosfoenolpiruvato carboxilasa ZP_04558550
fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_003615503
fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_002241183
fosfoenolpiruvato carboxilasa CBK84190
fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_003208553
Tabla 1V. Homólogos adecuados para la proteína TesA (acil-CoA tioesterasa I y proteasa I y lisofosfolipasa L1 multifuncionales, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 3.1.1.5 y 3.1.2.14, que actúa sobre 4 hidroxibutiril-CoA para producir 4-hidroxibutirato; n.° de registro de proteína NP_415027).
Nombre de la proteína N.° de registro de proteína
acil-CoA tioesterasa I/proteasa I/lisofosfolipasa L1 multifuncionales ZP_16276771
acil-CoA tioesterasa I/proteasa I/lisofosfolipasa L1 multifuncionales YP_001175703
tesA; acil-CoA tioesterasa I ZP_06549555
precursor de arilesterasa ZP_16338589
acil-CoA tioesterasa I/proteasa I/lisofosfolipasa L1 multifuncionales YP_006343946 lisofosfolipasa YP_002986681
acil-CoA tioesterasa I y proteasa I y lisofosfolipasa L1 multifuncionales YP_049328
acil-CoA tioesterasa I y proteasa I y lisofosfolipasa L1 multifuncionales ZP 10113091
proteína hipotética PROSTU 03568 ZP 02997848
Tabla 1W. Homólogos adecuados para la proteína TesB (tioesterasa II, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 3.1.2.20, que actúa sobre 4-hidroxibutiril-CoA para producir 4-hidroxibutirato; n.° de registro de proteína ZP_08342109).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
Tabla 1X. Homólogos adecuados para la proteína YciA (acil-CoA tioesterasa, de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655, n.° EC 3.1.2.20, que actúa sobre 4-hidroxibutiril-CoA para producir 4-hidroxibutirato; n.° de registro de proteína NP_415769).
Nombre de la proteína N.° de registro de
proteína
acil-CoA tioéster hidrolasa YP_002382845
acil-CoA tioéster hidrolasa YP_001570262
proteína de la superfamilia de tioesterasa YP_005019613
acil-CoA tioéster hidrolasa YP_050409
acil-CoA tioéster hidrolasa YP_002151085
acil-CoA tioéster hidrolasa YciA NP_777876
proteína hipotética VC1701 NP_231337
proteína de la superfamilia de tioesterasa YP_002893359
acil-CoA tioéster hidrolasa ZP_11128814
Vectores y plásmidos extracromosómicos adecuados
Un “vector”, tal como se usa en el presente documento, es un replicón extracromosómico, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el que puede insertarse otro segmento de ADN para lograr la replicación del segmento insertado. Los vectores varían en número de copias, dependiendo de su origen de replicación y tamaño. Los vectores con diferentes orígenes de replicación pueden propagarse en la misma célula microbiana a menos que estén estrechamente relacionados, tales como pMB1 y ColE1. Los vectores adecuados para expresar proteínas recombinantes pueden constituir vectores pUC con un origen de replicación pMB1 que tienen 500-700 copias por célula, vectores pBluescript con un origen de replicación ColE1 que tienen 300-500 copias por célula, pBR322 y derivados con un origen de replicación pMB1 que tienen 15-20 copias por célula, pACYC y derivados con un origen de replicación p15A que tienen 10-12 copias por célula, y pSC101 y derivados con un origen de replicación pSC101 que tienen aproximadamente 5 copias por célula tal como se describe en el manual de purificación de plásmidos QIAGEN® (encontrado en la red informática mundial en: //kirshner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAGENPlasmidPurification_EN.pdf). Un vector ampliamente utilizado es pSE380 que permite la expresión de genes recombinantes a partir de un promotor trc inducible por IPTG (Invitrogen, La Jolla, CA).
Estrategias adecuadas y secuencias de control de la expresión para expresión génica recombinante
Se han descrito ampliamente estrategias para lograr la expresión de genes recombinantes en E. coli en la bibliografía (Gross, Chimica Oggi 7(3):21 -29 (1989); Olins y Lee, Cur. Op. Biotech. 4:520-525 (1993); Makrides, Microbiol. Rev. 60(3):512-538 (1996); Hannig y Makrides, Trends in Biotech. 16:54-60 (1998)). Las secuencias de
control de la expresión pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción y similares que se conocen bien en la técnica. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, Pa c, Ptac, Ptrc, Pr, Pl, PphoA, Para, PuspA, Prpsu, Psyn (Rosenberg y Court, Ann. Rev. Genet. 13:319-353 (1979); Hawley y McClure, Nucl. Acids Res. 11 (8):2237-2255 (1983); Harley y Raynolds, Nucl. Acids Res.
15:2343-2361 (1987); también en la red informática mundial en ecocyc.org y partsregistry.org).
Los promotores a modo de ejemplo son: PsynA (5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC -3’) (SEQ ID NO: 1), Psync (5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTGTGCTAGC -3’) (SEQ ID NO: 2), PsynE (5’-TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTATGCTAGC -3’) (SEQ ID NO: 3), PsynH (5-CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC -3’) (SEQ ID NO 4), Psyn k(5’-TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC -3’) (SEQ ID NO: 5), PsynM (5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTATGCTAGC -3’) (SEQ ID NO: 6), Px (5’-TCGCCAGTCTGGCCTGAACATGATATAAAAT -3’) (SEQ ID NO: 7), PuspA (5-AACCACTATCAATATATTCATGTCGAAAATTTGTTTATCTAACGAGTAAGCAAGGCGGAT TGACGGATCATCCGGGTCGCTATAAGGTAAGGATGGTCTTAACACTGAATCCTTACGGCT GGGTTAGCCCCGCGCACGTAGTTCGCAGGACGCGGGTGACGTAACGGCACAAGAAACG-3’) (SEQ ID NO: 8), Prpsu (5'-ATGCGGGTTGATGTAAAACTTTGTTCGCCCCTGGAGAAAGCCTCGTGTATACTCCTCACC CTTATAAAAGTCCCTTTCAAAAAAGGCCGCGGTGCTTTACAAAGCAGCAGCAATTGCAGT AAAATTCCGCACCATTTTGAAATAAGCTGGCGTTGATGCCAGCGGCAAAC -3’) (SEQ ID NO: TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC - 3’) (SEQ ID NO: 10), y 
TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC - 3’) (SEQ ID NO: 11).
Los terminadores a modo de ejemplo son: TtpL (5’- CTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA -3’) (SEQ ID NO: 12:), T1006 (5- AAAAAAAAAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTTTTTTT -3’) (SEQ ID NO: 13), TrmBi (5-ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTAT -3’) (SEQ ID NO: 14), y TrmB2 (5-AGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT -3’) (SEQ ID NO: 15).
Construcción de huéspedes recombinantes
Pueden construirse huéspedes recombinantes que contienen los genes necesarios que codificarán para la ruta enzimática para la conversión de un sustrato de carbono en PHB-co-4HB usando técnicas bien conocidas en la técnica.
Los métodos de obtención de los genes deseados a partir de un organismo fuente (huésped) son comunes y se conocen bien en la técnica de biología molecular. Tales métodos se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md (1999). Por ejemplo, si la secuencia del gen se conoce, el ADN puede amplificarse a partir de ADN genómico usando reacción en cadena de la polimerasa (Mullis, patente estadounidense n.° 4.683.202) con cebadores específicos para el gen de interés para obtener cantidades de ADN adecuadas para ligación en vectores apropiados. Alternativamente, el gen de interés puede sintetizarse químicamente de novo con el fin de tomar en consideración el sesgo de codón del organismo huésped para potenciar la expresión de proteína heteróloga. Pueden unirse secuencias de control de la expresión tales como promotores y terminadores de la transcripción a un gen de interés mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores modificados por ingeniería genética que contienen tales secuencias. Otra forma es introducir el gen aislado en un vector que ya contiene las secuencias de control necesarias en el orden adecuado mediante ligación y digestión de endonucleasas de restricción. Un ejemplo de este último enfoque es la tecnología BioBrick™ (www.biobricks.org) en la que múltiples fragmentos de ADN pueden ensamblarse secuencialmente juntos de manera normalizada usando los dos mismos sitios de restricción.
Además de usar vectores, pueden introducirse genes que son necesarios para la conversión enzimática de un sustrato de carbono en PHB-co-4HB en un organismo huésped mediante la integración en el cromosoma usando o bien un enfoque dirigido o bien aleatorio. Para la integración dirigida en un sitio específico en el cromosoma, se usa el método generalmente conocido como modificación por ingeniería genética mediada por recombinación (recombineering) de Red/ET tal como describieron originalmente Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645). La integración aleatoria en el cromosoma implica usar un enfoque mediado por un transposón mini-Tn5 tal como describen Huisman et al. (patentes estadounidenses n.os 6.316.262 y 6.593.116).
Cultivo de huésped para producir biomasa de PHB-co-4HB
En general, el huésped recombinante se cultiva en un medio con una fuente de carbono y otros nutrientes esenciales para producir la biomasa de PHB-co-4HB mediante técnicas de fermentación o bien discontinuas o bien usando métodos de funcionamiento continuo conocidos en la técnica. También pueden añadirse aditivos adicionales, por ejemplo agentes antiespumantes y similares, para lograr las condiciones de crecimiento deseadas. La fermentación es particularmente útil para la producción a gran escala. Un método a modo de ejemplo usa biorreactores para cultivar y procesar el caldo de fermentación hasta el producto deseado. Otras técnicas tales como técnicas de separación pueden combinarse con la fermentación para la producción a gran escala y/o continua.
Tal como se usa en el presente documento, el término “materia prima” se refiere a una sustancia usada como material de partida de carbono en un proceso industrial. Cuando se usa en referencia a un cultivo de organismos tales como organismos microbianos o de algas tales como un proceso de fermentación con células, el término se refiere al material de partida usado para proporcionar un carbono u otra fuente de energía para las células. Las fuentes de carbono útiles para la producción de PHB-co-4HB incluyen fuentes simples y económicas, por ejemplo, glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa y similares, solos o en combinación. En otras realizaciones, la materia prima es melaza, almidón, un ácido graso, un aceite vegetal, un material lignocelulósico y similares, de nuevo solos o en combinación. En todavía otras realizaciones, la materia prima puede ser etanol, ácido acético, glicerol y similares, solos o en combinación. También es posible usar organismos para producir la biomasa de PHB-co-4HB que crecen en gas de síntesis (CO2, CO e hidrógeno) producido a partir de recursos de biomasa renovables, es decir un gas de síntesis derivado de biomasa y/o metano que se origina a partir de un gas de vertedero.
La introducción de genes de la ruta de PHB-co-4HB permite flexibilidad en el uso de materias primas fácilmente disponibles y económicas. Una materia prima “renovable” se refiere a una fuente de energía renovable tal como un material derivado de organismos vivos o sus subproductos metabólicos incluyendo material derivado de biomasa, que consiste a menudo en componentes infrautilizados como paja o forraje. Los productos agrícolas cultivados específicamente para su uso como materias primas renovables incluyen, por ejemplo, maíz, habas de soja, pasto varilla y árboles tales como chopo, trigo, linaza y colza, azúcar de caña y aceite de palma. Como fuentes de energía y materiales de partida renovables, las materias primas agrícolas basadas en cultivos son el reemplazo definitivo para las reservas de petróleo en declive. Las plantas usan energía solar y la fijación de dióxido de carbono para elaborar miles de sustancias bioquímicas complejas y funcionales más allá de la capacidad actual de la química de síntesis moderna. Éstas incluyen sustancias químicas finas y a granel, sustancias farmacéuticas, productos nutricéuticos, flavonoides, vitaminas, perfumes, polímeros, resinas, aceites, aditivos alimenticios, biocolorantes, adhesivos, disolventes y lubricantes.
Extracción de copolímeros de PHB-co-4HB a partir de biomasa
Se extrajo el copolímero de PHB-co-4HB tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 7.713.720 y 7.252.980.
Determinación del peso molecular usando cromatografía de permeación en gel (GPC)
Se estima el peso molecular de PHA mediante cromatografía de permeación en gel usando un sistema de HPLC Waters Alliance equipado con un detector de índice de refracción. El conjunto de columnas es una serie de tres columnas PLGel 10 pm Mixed-B (Polymer Labs, Amherst, MA) con cloroformo como fase móvil bombeadas a 1 ml/min. El conjunto de columnas está calibrado con patrones de poliestireno de distribución estrecha. La muestra de PHA se disuelve en cloroformo a una concentración de 2,0 mg/ml a 60°C. La muestra se filtra con un filtro de jeringa de teflón de 0,2 pm. Se usa un volumen de inyección de 50 pl para el análisis. El cromatograma se analiza con el software de análisis Waters Empower GPC. Se notifican los pesos moleculares como pesos moleculares equivalentes de poliestireno.
Medición de las propiedades térmicas
La transición vítrea de los copolímeros de PHB-co-4HB se midió usando un calorímetro de barrido diferencial (DSC) TA Instruments Q100 con inyector automático. Se pesaron cuidadosamente 8-12 mg de una muestra de PHA en un recipiente de aluminio y se sellaron con una tapa de aluminio. La muestra se colocó luego en el DSC bajo una purga de nitrógeno y se analizó usando un ciclo de calor-frío-calor. El intervalo de calentamiento/enfriamiento fue de -80°C a 200°C con una velocidad de calentamiento de 10°C/min y una velocidad de enfriamiento de 5°C/min.
Determinación del contenido de base biológica
El contenido de base biológica del copolímero de PHB-co-4HB se midió mediante datación por radiocarbono basada en la norma ASTM D6866. La norma ASTM D6866 es el método aprobado por el Departamento de Agricultura de EE. UU. para determinar el contenido renovable/de base biológica de los materiales de variedad natural. El método proporciona una determinación porcentual del contenido de carbono fósil frente al contenido de carbono renovable o de biomasa de un producto o una combinación de combustible. La norma ASTM D6866 se usa ampliamente para certificar el contenido de base biológica de los bioplásticos.
Ejemplo 1: producción de PHB-co-4HB con contenido de comonómero de 4HB del 50% o más a partir de glucosa como única fuente de carbono
Este ejemplo muestra la producción de PHB-co-4HB con contenido de comonómero de 4HB del 50% o más a partir de glucosa como única fuente de carbono en células huésped de E. coli modificadas por ingeniería genética. Las cepas usadas en este ejemplo se enumeran en la tabla 2. Todas estas cepas se construyeron usando las
herramientas y los métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Todas contenían deleciones cromosómicas de ynel y gabD con la excepción de las cepas 31 y 32 que también contenían deleciones cromosómicas de tesB, tesA, yciA y astD.
Tabla 2. Cepas usadas en el ejemplo 1.
Las cepas se evaluaron en un ensayo de placa de agitación. El medio de producción consistió en sales mínimas E2 1x, sales mínimas E0 1x, MgSO45 mM y disolución de sales traza 1x. La fuente de carbono consistió en 40 g/l de glucosa para las cepas 31, 32 y 33, mientras que para todas las demás cepas en los ejemplos 1 a 5, la concentración de glucosa fue de 20 g/l. La disolución madre E250x consiste en NaNH4HPO4-4H2O 1,28 M, K2HPO4 1,64 M y KH2CO41,36 M. La disolución madre E0 50x consiste en Na2HPO41,28 M, K2HPO4 1,64 M y KH2CO4 1,36 M. La disolución de sales traza 1000x se prepara añadiendo por 1 l de HCl 1,5 N: 50 g de FeSO4-7H2O, 11 g de ZnSO4-7H2O, 2,5 g de MnSO4-4H2O, 5 g de CusO4-5H2O, 0,5 g de (NH4)sMo7O24'4H2O, 0,1 g de Na2B4O7 y 10 g de CaCl2-2H2O.
Para examinar la producción de PHB-co-4HB, las cepas se cultivaron por triplicado durante la noche en tubos estériles que contenían 3 ml de LB y antibióticos apropiados. Después de completar el cultivo, se retiraron 60 ^l de un tubo y luego se añadieron a 1440 ^l de medio de producción. Los cultivos de 1500 ^l resultantes se añadieron luego a tres pocillos de una placa de pocillos profundos Duetz como alícuotas de 500 ^l. La placa de agitación se incubó a 37°C con agitación durante 6 horas y luego se cambió a 30°C durante 40 horas con agitación para todas las cepas de los ejemplos 1 a 5, excepto las cepas 31,32 y 33 que se incubaron a 37°C con agitación durante 6 horas y luego se cambió a 28°C durante 42 horas con agitación. Posteriormente, se combinaron cultivos de los tres pocillos (1,5 ml en total) y se analizó el contenido de polímero. Al final del experimento, los cultivos se centrifugaron a 4150 rpm, se lavaron una vez con agua destilada, se congelaron a -80°C durante al menos 30 minutos y se liofilizaron durante la noche. Al día siguiente, se añadió una cantidad medida de sedimento celular liofilizado a un tubo de vidrio, seguido de 3 ml de reactivo de butanolisis que consiste en una mezcla de igual volumen de n-butanol al 99,9% y HCl 4,0 N en dioxano con 2 mg/ml de difenilmetano como patrón interno. Después de tapar los tubos, se agitaron brevemente en vórtex y se colocaron en un bloque de calor ajustado a 93°C durante seis horas con agitación en vórtex periódica. Posteriormente, el tubo se enfrió hasta temperatura ambiente antes de añadir 3 ml de agua destilada. El tubo se sometió a vórtex durante aproximadamente 10 s antes de centrifugar a 620 rpm (centrífuga de mesa Sorvall Legend RT) durante 2 minutos. Se pipeteó 1 ml de la fase orgánica en un vial de GC, que luego se analizó por cromatografía de gases-detección de ionización por llama (GC-FID) (Hewlett-Packard 5890 Serie II). La cantidad de PHA en el sedimento celular se determinó mediante la comparación con las curvas de calibración tanto para 3HB como 4HB (para el análisis de PHB-co-4HB). La curva de calibración de 4HB se generó añadiendo diferentes cantidades de una disolución al 10% de y-butirolactona (GBL) en butanol para separar las reacciones de butanolisis. La curva de calibración de 3HB se generó añadiendo diferentes cantidades de 3-hidroxibutirato de etilo al 99% para separar las reacciones de butanolisis.
Todos los exámenes para la producción de PHB-co-4HB se realizaron por triplicado tal como se indicó anteriormente. Se examinaron algunas cepas para la producción de polímeros de esta manera en diferentes días. Los resultados representativos para cada cepa sometida a prueba se muestran en la tabla 3, y demuestran que el % de contenido de 4HB para cada composición de copolímero fue del 50% o más.
Tabla 3. Producción de polímero de PHB-co-4HB a partir de cepas microbianas.
* mediciones de réplicas no disponibles
Ejemplo 2: producción de PHB-co-4HB con contenido de comonómero de 4HB entre el 40% y el 50% a partir de glucosa como única fuente de carbono
Este ejemplo muestra la producción de PHB-co-4HB con un contenido de comonómero de 4HB entre el 40 y el 50% a partir de glucosa como única fuente de carbono en células huésped de E. coli modificadas por ingeniería genética. Las cepas usadas en este ejemplo se enumeran en la tabla 4. Todas estas cepas se construyeron usando las herramientas y los métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Todas contenían deleciones cromosómicas de ynel y gabD.
Tabla 4. Cepas usadas en el ejemplo 2.
Las cepas se hicieron crecer y el contenido de polímero se analizó de la misma manera que se describe en el ejemplo 1. Los resultados representativos para cada cepa sometida a prueba se muestran en la tabla 5, y demuestran que el % del contenido de 4 HB para cada composición de copolímero estaba entre el 40% y el 50%. Tabla 5. Producción de polímero de PHB-co-4HB a partir de cepas microbianas.
Ejemplo 3: producción de PHB-co-4HB con contenido de comonómero de 4HB entre el 30% y el 40% a partir de glucosa como única fuente de carbono
Este ejemplo muestra la producción de PHB-co-4HB con un contenido de comonómero de 4HB entre el 30 y el 40% a partir de glucosa como única fuente de carbono en células huésped de E. coli modificadas por ingeniería genética. Las cepas usadas en este ejemplo se enumeran en la tabla 6. Todas estas cepas se construyeron usando las herramientas y los métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Todas contenían deleciones cromosómicas de ynel y gabD.
Tabla 6. Cepas usadas en el ejemplo 3.
Las cepas se hicieron crecer y el contenido de polímero se analizó de la misma manera que se describe en el ejemplo 1. Los resultados representativos para cada cepa sometida a prueba se muestran en la tabla 7, y demuestran que el % de contenido de 4HB para cada composición de copolímero estaba entre el 30% y el 40%. Tabla 7. Producción de polímero de PHB-co-4HB a partir de cepas microbianas.
Ejemplo 4: producción de PHB-co-4HB con contenido de comonómero de 4HB entre el 20% y el 30% a partir de glucosa como única fuente de carbono
Este ejemplo muestra la producción de PHB-co-4HB con un contenido de comonómero de 4HB entre el 20 y el 30% a partir de glucosa como única fuente de carbono en células huésped de E. coli modificadas por ingeniería genética. Las cepas usadas en este ejemplo se enumeran en la tabla 8. Todas estas cepas se construyeron usando las herramientas y los métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Todas contenían deleciones cromosómicas de ynel y gabD.
Tabla 8. Cepas usadas en el ejemplo 4.
Las cepas se hicieron crecer y el contenido de polímero se analizó de la misma manera descrita en el ejemplo 1. Los resultados representativos para cada cepa sometida a prueba se muestran en la tabla 9, y demuestran que el % de contenido de 4HB para cada composición de copolímero estaba entre el 20% y el 30%.
Tabla 9. Producción de polímero de PHB-co-4HB a partir de cepas microbianas.
Ejemplo 5: producción de PHB-co-4HB con contenido de comonómero 4HB entre el 1% y el 20% a partir de glucosa como única fuente de carbono [fuera del alcance de la invención]
Este ejemplo muestra la producción de PHB-co-4HB con un contenido de comonómero de 4HB entre el 1 y el 20% a partir de glucosa como única fuente de carbono en células huésped de E. coli modificadas por ingeniería genética. Las cepas usadas en este ejemplo se enumeran en la tabla 10. Todas estas cepas se construyeron usando las herramientas y los métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Todas contenían deleciones cromosómicas de ynel y gabD.
Tabla 10. Cepas usadas en el ejemplo 5.
Las cepas se hicieron crecer y el contenido de polímero se analizó de la misma manera descrita en el ejemplo 1. Los resultados representativos para cada cepa sometida a prueba se muestran en la tabla 11, y demuestran que el % de contenido de 4HB para cada composición de copolímero estaba entre el 1% y el 20%.
Tabla 11. Producción de polímero de PHB-co-4HB a partir de cepas microbianas.
Ejemplo 6: extracción de copolímeros de PHB-co-4HB y determinación de pesos moleculares y polidispersidad Para la purificación de cantidades mayores de copolímeros de PHB-co-4HB, las cepas 1, 5 y 12 con diversas composiciones de PHA tal como se muestra en el ejemplo 1 se cultivaron en primer lugar en 20 ml de medio LB en matraces de agitación de 250 ml a 37°C durante la noche. Todo el volumen se transfirió luego a matraces de agitación aforados de 1 litro que contenían 500 ml de un medio de producción compuesto por sales mínimas E21x, sales mínimas E01x, MgSÜ45 mM, 30 g/l de glucosa y disolución de sales traza 1x. Las sales mínimas E2 y E0 y la disolución de sales traza se describen en el ejemplo 1. Los cultivos de 500 ml se incubaron a 37°C con agitación durante 6 horas y luego se cambiaron a 28°C durante 70 horas con agitación. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron a 6000 x g, se lavaron una vez con agua destilada, se congelaron a -80°C durante al menos 30 minutos y se liofilizaron durante la noche.
El copolímero de las cepas 1, 5 y 12 se purificó a partir de biomasa seca extrayendo en primer lugar con ciclohexanona a 65-70°C durante 30 minutos antes de centrifugar a 2000 x g durante 5 minutos. Posteriormente, se decantó el sobrenadante y se mezcló con un volumen igual de heptano a 5-10°C. El polímero precipitado resultante se filtró y se secó durante la noche a temperatura ambiente.
Los pesos moleculares de los copolímeros purificados se determinaron usando cromatografía de permeación en gel (GPC) usando un sistema de HPLC Waters Alliance. La tabla 12 muestra los pesos moleculares promedio en peso (Mw), los pesos moleculares promedio en número (Mn) y el índice de polidispersidad (PD) medidos a partir de los copolímeros purificados de las cepas 1, 5 y 12.
Tabla 12. Pesos moleculares y polidispersidad de copolímeros producidos por las cepas 1,5 y 12.
Ejemplo 7: determinación de la composición de PHA y la temperatura de transición vítrea de los copolímeros de PHB-co-4HB
Los copolímeros purificados de las cepas 1, 5 y 12 tal como se describe en el ejemplo 6 se usaron para determinar la composición de PHA tal como se resalta en el ejemplo 1. La temperatura de transición vítrea (Tg) se midió usando análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC). La tabla 13 enumera el contenido de 4HB y la Tg medidos a partir de los copolímeros purificados de las cepas 1, 5 y 12. La temperatura de transición vítrea disminuyó con un mayor contenido de 4HB en el copolímero.
Tabla 13. Producción de polímero de PHB-co-4HB y Tg medidos a partir de los copolímeros purificados de las cepas 1,5 y 12.
Ejemplo 8: determinación del contenido de base biológica de un copolímero PHB-co-4HB
El copolímero purificado de la cepa 1 tal como se describe en el ejemplo 6 se usó para determinar el contenido de base biológica mediante datación por radiocarbono basada en la norma ASTM D6866 de Beta Analytic (Miami, Florida, EE. UU.). Se determinó que el copolímero purificado de la cepa 1 contenía un contenido de base biológica del 97%.
Ejemplo 9: producción de PHB-co-4HB a partir de glicerol como única fuente de carbono
Las cepas 1 y 6 se hicieron crecer y el contenido de polímero se analizó de la misma manera tal como se describió en el ejemplo 1, con la excepción de que el hidrato de carbono alimentado fue 30 g/l de glicerol en lugar de 20 g/l de glucosa. Un resultado representativo para ambas cepas se muestra en la tabla 14.
Tabla 14. Producción de polímero de PHB-co-4HB a partir de glicerol como única fuente de carbono.
Secuencia de nucleótidos de ID del gen 001: gen sucD* de succinato-semialdehído deshidrogenasa de Clostridium kluyveri
ATGTCCAACGAGGTTAGCATTAAGGAGCTGATTGAGAAGGCGAAAGTGGCGC
AGAAAAAGCTGGAAGCGTATAGCCAAGAGCAAGTTGACGTTCTGGTCAAGGCGCTGGGTAAAGTTGTG
TACGACAACGCCGAGATGTTCGCGAAAGAGGCGGTGGAGGAAACCGAGATGGGTGTTTACGAGGATAA
AGTGGCTAAATGTCATCTGAAATCTGGTGCAATCTGGAATCACATTAAAGATAAGAAAACCGTTGGTA
TTATCAAGGAAGAACCGGAGCGTGCGCTGGTGTACGTCGCGAAGCCTAAAGGTGTTGTGGCGGCGACG
ACCCCTATCACCAATCCTGTGGTTACCCCGATGTGTAACGCGATGGCAGCAATTAAAGGTCGCAACAC
CATCATTGTCGCCCCGCATCCGAAGGCGAAGAAGGTGAGCGCGCACACCGTGGAGCTGATGAATGCAG
AACTGAAAAAGTTGGGTGCGCCGGAAAACATTATCCAGATCGTTGAAGCCCCAAGCCGTGAAGCAGCC
AAGGAGTTGATGGAGAGCGCAGACGTGGTTATCGCCACGGGTGGCGCAGGCCGTGTTAAAGCAGCGTA
CTCCTCCGGCCGTCCGGCATACGGTGTCGGTCCGGGCAATTCTCAGGTCATTGTCGATAAGGGTTACG
ATTATAACAAAGCTGCCCAGGACATCATTACCGGCCGCAAGTATGACAACGGTATCATTTGCAGCTCT
GAGCAGAGCGTGATCGCACCGGCGGAGGACTACGACAAGGTCATCGCGGCTTTCGTCGAGAATGGCGC
GTTCTATGTCGAGGATGAGGAAACTGTGGAGAAATTCCGTAGCACGCTGTTCAAGGATGGCAAGATCA
ATAGCAAAATCATCGGTAAATCCGTGCAGATCATCGCTGACCTGGCTGGTGTCAAGGTGCCGGAAGGC
ACCAAGGTGATCGTGTTGAAGGGCAAGGGTGCCGGTGAAAAGGACGTTCTGTGCAAGGAGAAAATGTG
CCCGGTCCTGGTTGCCCTGAAATATGACACCTTTGAGGAGGCGGTCGAGATCGCGATGGCCAACTATA
TGTACGAGGGTGCGGGCCATACCGCCGGTATCCACAGCGATAACGACGAGAATATCCGCTACGCGGGT
ACGGTGCTGCCAATCAGCCGTCTGGTTGTCAACCAGCCAGCAACTACGGCCGGTGGTAGCTTTAACAA
TGGTTTTAATCCGACCACCACCTTGGGCTGCGGTAGCTGGGGCCGTAACTCCATTAGCGAGAACCTGA
CGTATGAGCATCTGATTAATGTCAGCCGTATTGGCTATTTCAATAAGGAGGCAAAAGTTCCTAGCTAC
GAGGAGATCTGGGGTTAA (SEQ ID NO: 16)
Secuencia de aminoácidos de ID del gen 001: gen SucD* de succinato-semialdehído deshidrogenasa de Clostridium kluyveri
MSNEVSIKELIEKAKVAQKKLEAYSQEQVDVLVKALGKVVYDNAEMFAKEAV
EETEMGVYEDKVAKCHLKSGAIWNHIKDKKTVGIIKEEPERALVYVAKPKGWAATTPITNPVVTPMC
NAMAAIKGRNTIIVAPHPKAKKVSAHTVELMNAELKKLGAPENIIQIVEAPSREAAKELMESADVVIA
TGGAGRVKAAYSSGRPAYGVGPGNSQVIVDKGYDYNKAAQDIITGRKYDNGIICSSEQSVIAPAEDYD
KVIAAFVENGAFYVEDEETVEKFRSTLFKDGKINSKIIGKSVQIIADLAGVKVPEGTKVIVLKGKGAG
EKDVLCKEKMCPVLVALKYDTFEEAVEIAMANYMYEGAGHTAGIHSDNDENIRYAGTVLPISRLVVNQ
PATTAGGSFNNGFNPTTTLGCGSWGRNSISENLTYEHLINVSRIGYFNKEAKVPSYEEIWG (SEQ ID
NO: 17)
Secuencia de nucleótidos de ID del gen 002: gen SsaRAt* de semialdehído succínico reductasa de Arabidopsis
thaliana
ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATGA
ACCTGCTGAAAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAACCGCACTCTGTCTAAATGTGATGAACTGGTT
GAACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCTGAGGTGATCAAGAAATGCAAATACACGATCGCGAT
GCTGAGCGATCCGTGTGCAGCTCTGTCTGTTGTTTTCGATAAAGGCGGTGTTCTGGAACAGATCTGCG
AGGGTAAGGGCTACATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCTGAAAATTAACGAAGCGATC
ACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCTGTTAGCGGTTCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCA
GCTGATCATCCTGGCAGCAGGCGACAAAGCACTGTTCGAGGAATCCATCCCGGCCTTTGATGTACTGG
GCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGTGGGTAACGGTGCGAAAATGAAACTGATTGTTAACATGATC
ATGGGTTCTATGATGAACGCGTTTAGCGAAGGTCTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGA
CACGCTGCTGGATATTCTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCCA
TGACTAAATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAAGACATGCGTCTGGCTCTG
GCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCGGTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGC
CCGTAGCCTGGGCCTGGGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAAATTCTCTCGTGAAT
AA (SEQ ID NO: 18)
Secuencia de aminoácidos de ID del gen 002: gen SsaRAt* de semialdehído succínico reductasa de Arabidopsis thaliana
MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPAE
VIKKCKYTIAMLSDPCAALSVVFDKGGVLEQICEGKGYIDMSTVDAETSLKINEAITGKGGRFVEGPV
SGSKKPAEDGQLIILAAGDKALFEESIPAFDVLGKRSFYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFSEGL
VLADKSGLSSDTLLDILDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLALALGDENAVSMPV
AAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE (SEQ ID NO: 19)
Secuencia de nucleótidos de ID del gen 003: L-1,2-propanodiol oxidorreductasa fucOI6L-L7V de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655
ATGATGGCTAACAGAATGCTGGTGAACGAAACGGCATGGTTTGGTCGGGGTG
CTGTTGGGGCTTTAACCGATGAGGTGAAACGCCGTGGTTATCAGAAGGCGCTGATCGTCACCGATAAA
ACGCTGGTGCAATGCGGCGTGGTGGCGAAAGTGACCGATAAGATGGATGCTGCAGGGCTGGCATGGGC
GATTTACGACGGCGTAGTGCCCAACCCAACAATTACTGTCGTCAAAGAAGGGCTCGGTGTATTCCAGA
ATAGCGGCGCGGATTACCTGATCGCTATTGGTGGTGGTTCTCCACAGGATACTTGTAAAGCGATTGGC
ATTATCAGCAACAACCCGGAGTTTGCCGATGTGCGTAGCCTGGAAGGGCTTTCCCCGACCAATAAACC
CAGTGTACCGATTCTGGCAATTCCTACCACAGCAGGTACTGCGGCAGAAGTGACCATTAACTACGTGA
TCACTGACGAAGAGAAACGGCGCAAGTTTGTTTGCGTTGATCCGCATGATATCCCGCAGGTGGCGTTT
ATTGACGCTGACATGATGGATGGTATGCCTCCAGCGCTGAAAGCTGCGACGGGTGTCGATGCGCTCAC
TCATGCTATTGAGGGGTATATTACCCGTGGCGCGTGGGCGCTAACCGATGCACTGCACATTAAAGCGA
TTGAAATCATTGCTGGGGCGCTGCGAGGATCGGTTGCTGGTGATAAGGATGCCGGAGAAGAAATGGCG
CTCGGGCAGTATGTTGCGGGTATGGGCTTCTCGAATGTTGGGTTAGGGTTGGTGCATGGTATGGCGCA
TCCACTGGGCGCGTTTTATAACACTCCACACGGTGTTGCGAACGCCATCCTGTTACCGCATGTCATGC
GTTATAACGCTGACTTTACCGGTGAGAAGTACCGCGATATCGCGCGCGTTATGGGCGTGAAAGTGGAA
GGTATGAGCCTGGAAGAGGCGCGTAATGCCGCTGTTGAAGCGGTGTTTGCTCTCAACCGTGATGTCGG
TATTCCGCCACATTTGCGTGATGTTGGTGTACGCAAGGAAGACATTCCGGCACTGGCGCAGGCGGCAC
TGGATGATGTTTGTACCGGTGGCAACCCGCGTGAAGCAACGCTTGAGGATATTGTAGAGCTTTACCAT
ACCGCCTGGTAA (SEQ ID NO: 20)
Secuencia de aminoácidos de ID del gen 003: L-1,2-propanodiol oxidorreductasa fucOi6L-L7v de Escherichia colicepa K-12 subcepa MG1655
MANRMLVNETAWFGRGAVGALTDEVKRRGYQKALIVTDKTLVQCGWAKVTD
KMDAAGLAWAIYDGWPNPTITWKEGLGVFQNSGADYLIAIGGGSPQDTCKAIGIISNNPEFADVRS
LEGLSPTNKPSVPILAIPTTAGTAAEVTINYVITDEEKRRKFVCVDPHDIPQVAFIDADMMDGMPPAL
KAATGVDALTHAIEGYITRGAWALTDALHIKAIEIIAGALRGSVAGDKDAGEEMALGQYVAGMGFSNV
GLGLVHGMAHPLGAFYNTPHGVANAILLPHVMRYNADFTGEKYRDIARVMGVKVEGMSLEEARNAAVE
AVFALNRDVGIPPHLRDVGVRKEDIPALAQAALDDVCTGGNPREATLEDIVELYHTAW (SEQ ID
NO: 21)
Secuencia de nucleótidos de ID del gen 004: gen de fusión phaC3/C5 de polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGCAGTGGCAATCCTGGTTCAGCAAGG
CGCCCACCACCGAGGCGAACCCGATGGCCACCATGTTGCAGGATATCGGCGTTGCGCTCAAACCGGAA
GCGATGGAGCAGCTGAAAAACGATTATCTGCGTGACTTCACCGCGTTGTGGCAGGATTTTTTGGCTGG
CAAGGCGCCAGCCGTCAGCGACCGCCGCTTCAGCTCGGCAGCCTGGCAGGGCAATCCGATGTCGGCCT
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(SEQ ID NO: 22)
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A (SEQ ID NO: 24)
Secuencia de aminoácidos de ID del gen 005: gen de fusión phaC3/C1* de polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida/Ralstonia eutropha JMP134 *
MSNKNNDELATGKGAAASSTEGKSQPFKFPPGPLDPATWLEWSRQWQGPEGN
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AKA (SEQ ID NO: 25)
Secuencia de nucleótidos de ID del gen 006: gen de fusión phaC3/C33 de polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida/Delftia acidovorans 89-11-102
ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGGCGAATTTCGACCCGCTGGCTGGCC
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TATGTTGAGCACCGCGTTGGCGGTTCTGCAAGCCCGCCACGACCGCGAGCACGGCGCAGTCGCAGCAC
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CTCCAGGCCGCTACGTTTTGGTCAAGGCGTAA (SEQ ID NO: 26)
Secuencia de aminoácidos de ID del gen 006: gen de fusión phaC3/C33 de polihidroxialcanoato sintasa de
Claims (7)
- REIVINDICACIONESi . Método de elaboración de una composición de copolímero de polihidroxialcanoato que comprende una pluralidad de moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, en el que las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato (i) comprenden monómeros de 3-hidroxibutirato y monómeros de 4-hidroxibutirato, (ii) tienen un porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato del 23,5 al 75%, (iii) tienen un contenido de base biológica de > 80% correspondiente a la cantidad de carbono de base biológica como porcentaje en peso (masa) de carbono orgánico total tal como se define en la norma ASTM D6866-12 y (iv) tienen un peso molecular promedio en peso de 250 kDa a 2,0 MDa, y además en el que la composición tiene una temperatura de transición vitrea de -60°C a -5°C, comprendiendo el método:cultivar un organismo en presencia de uno o más materiales de partida de carbono en condiciones en las que (a) el uno o más materiales de partida de carbono se convierten en 3-hidroxibutiril-CoA y 4-hidroxibutiril-CoA y (b) la 3-hidroxibutiril-CoA y la 4-hidroxibutiril-CoA se polimerizan para formar las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato, formando de ese modo la composición, en la que:el organismo se ha modificado por ingeniería genética mediante la incorporación estable de genes que codifican para una polihidroxialcanoato sintasa, una acetil-CoA acetiltransferasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una succinato-semialdehído deshidrogenasa, una semialdehído succínico reductasa y una CoA transferasa en el organismo, mediante la introducción de uno o más plásmidos estables que comprenden los genes y/o mediante la integración de los genes en el genoma del organismo, para comprender actividades enzimáticas de los productos génicos y para no comprender actividades enzimáticas de o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ o bien una succinato-semialdehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ o ambas, yel uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, tienen un contenido de base biológica de > 80%.
- 2. Método según la reivindicación 1, en el que el organismo se ha modificado por ingeniería genética adicionalmente (a) para comprender actividades enzimáticas de (i) una alfa-cetoglutarato descarboxilasa o 2-oxoglutarato descarboxilasa y (ii) una L-1,2-propanodiol oxidorreductasa, y (b) para no comprender actividades enzimáticas de una o más de (i) una tioesterasa II, (ii) una acil-CoA tioesterasa I y proteasa I y lisofosfolipasa L multifuncionales, (iii) una acil-CoA tioesterasa y (iv) una aldehído deshidrogenasa.
- 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el uno o más materiales de partida de carbono comprenden una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, levoglucosano, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa, y mezclas de los mismos.
- 4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el uno o más materiales de partida de carbono comprenden uno o más de melaza, almidón, un ácido graso, un aceite vegetal, un material lignocelulósico, etanol, ácido acético, glicerol, un gas de síntesis derivado de biomasa y metano que se origina a partir de un gas de vertedero.
- 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el uno o más materiales de partida de carbono no comprenden y-butirolactona, 1,4-butanodiol, 4-hidroxibutirato, 3-hidroxibutirato, a-cetoglutarato, oxaloacetato, malato, fumarato, citrato, succinato o 3-hidroxibutirato.
- 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el uno o más materiales de partida de carbono, tomados juntos, tienen un contenido de base biológica de > 95%.
- 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el porcentaje molar monomérico de monómeros de 4-hidroxibutirato de las moléculas de copolímero de polihidroxialcanoato es del 25 al 70%.
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