ES2748054T3

ES2748054T3 - Composición inmunogénica que comprende elementos de proteínas CdtB y/o CdtA de C. difficile

Info

Publication number: ES2748054T3
Application number: ES13817931T
Authority: ES
Inventors: Cindy Castado
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2012-12-23
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2020-03-12
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: US9669083B2; JP6515036B2; GB201223342D0; US20180043005A1; BR112015014727B1; BR112015014727B8; CN105120892A; CA2894951C; CN105120892B; AR094275A1; AU2013366450A1; SG11201504701UA; BR112015014727A2; JP2016504993A; EP2934579A1; EP2934579B1; US20150313985A1; CA2894951A1; WO2014096393A1

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende proteína CDTb de Clostridium difficile aislada en la que la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio correspondiente a los aminoácidos 48-211 de la SEQ ID NO: 3 o el equivalente en una toxina binaria aislada de una cepa diferente de C. difficile, que comprende el dominio de unión a receptor en el que la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada comprende: (i) SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51; o (ii) Una variante de CDTb que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 51 y la composición inmunogénica comprende una proteína CDTa de Clostridium difficile aislada que contiene una mutación de glutamato a un aminoácido diferente en la posición 428 o 430 que reduce su actividad ADPribosiltransferasa, en la que la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada es (i) SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o (ii) una variante de CDTa que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO:54; o (iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición inmunogénica que comprende elementos de proteínas CdtB y/o CdtA de C. diffiále

Antecedentes

C. diffiále es la causa más importante de infecciones intestinales nosocomiales y es la principal causa de colitis pseudomembranosa en seres humanos (Bartlett y col., Am. J. Clin. Nutr. 11 supl: 2521-6 (1980)). Se calculó que la tasa de mortalidad global asociada para individuos infectados por C. diffiále era del 5,99 % en un plazo de 3 meses desde el diagnóstico, asociándose la mortalidad más alta con la edad avanzada, siendo del 13,5% en pacientes mayores de 80 años de edad (Karas y col., Journal o f Infection 561:1-9 (2010)). El tratamiento actual para la infección por C. diffiále es la administración de antibióticos (metronidazol y vancomicina), aunque han aparecido indicios de cepas que son resistentes a estos antibióticos (Shah y col., Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5), 555-564 (2010)). En consecuencia, existe la necesidad de composiciones inmunogénicas capaces de inducir anticuerpos frente a C. difficile y/o una respuesta inmunitaria protectora frente a C. difficile.

La enterotoxicidad de C. diffiále se debe principalmente a la acción de dos toxinas, la toxina A y la toxina B.

Estas son ambas potentes citotoxinas (Lyerly y col Current Microbiology 21:29-32 (1990)).

Se ha demostrado que fragmentos de la toxina A, en particular fragmentos del dominio C-terminal, pueden conducir a una respuesta inmunitaria protectora en hámsteres (Lyerly y col., Current Microbiology 21:29-32 (1990)), documentos WO96/12802 y WO00/61762. No obstante, los presentes inventores han demostrado que los anticuerpos frente a la toxina A y a la toxina B solos no son suficientes para prevenir la enfermedad causada por determinadas cepas, en concreto las cepas de los serogrupos 078 y 027. Por esta razón, todavía se necesitan vacunas que son capaces de proteger contra estas cepas.

Algunas cepas, pero no todas, también expresan la toxina binaria (CDT). De un modo similar a otras muchas toxinas binarias, la CDT está compuesta por dos componentes, un componente enzimáticamente activo (CDTa) y un componente de transporte catalíticamente inerte (CDTb). El componente catalíticamente inerte facilita la traslocación de la CDTa a la célula diana.

CDTa tiene una actividad de ribosilación de ADP, que transfiere el resto de ADP-ribosa de NAD/NADPH a la actina monomérica (G-actina) en la célula diana y, de este modo, evita su polimerización en F-actina y tiene como resultado la rotura del citoesqueleto y, en última instancia, la muerte celular (Sundriyal y col., Protein expression and Purification 74 (2010) 42-48).

El documento WO2013/112867 (Merck) describe vacunas contra Clostridium diffiále que comprende proteínas de toxina A y toxina B y toxina A binaria de C. diffiále (CDTa) que comprenden mutaciones definidas de manera específica en relación con la secuencia de toxina nativa que se describen como reductoras sustanciales o eliminadoras de la toxicidad, en combinación con toxina B binaria (CDTb). También se describe toxina binaria en el documento WO 2011/060431, Barth H y col. Microbiology and Molecular Biology Reviews vol 68, 373-402 (2004), Carter GP y col. J. Bacteriol. Vol 189, 7290-7301 (2007), WO 2010/093801 y Gulke I y col. Infect.Immun. vol 69, 6004-6011 (2001).

Los presentes inventores han encontrado que la toxina binaria se puede usar para proporcionar una vacuna mejorada contra C. diffiále, en particular proporcionar protección contra varias de las cepas más importantes de C. diffiále (tales como las cepas 027 y 078). Además, los presentes inventores han demostrado, por primera vez, que solo son necesarias CDTa o CDTb (no ambas) con el fin de generar anticuerpos que sean capaces de neutralizar cepas que expresan la toxina binaria. Además, los inventores han demostrado, por primera vez, que las proteínas CDTa que comprenden mutaciones que reducen la actividad de ribosilación de a Dp de CDTa, todavía son capaces de provocar una respuesta inmunitaria. Además, los inventores han demostrado que las proteínas CDTb truncadas son capaces de provocar una respuesta inmunitaria. De un modo similar, los inventores han demostrado que las proteínas CDTb truncadas son capaces de provocar una respuesta inmunitaria, que CDTb puede provocar una respuesta inmunitaria cuando está en forma monomérica o polimérica y que las proteínas de fusión que comprenden CDTa y CDTb o CDTb fusionado con toxina A aislada y/o toxina B aislada son capaces de provocar una respuesta inmunitaria. Por último, los inventores han demostrado que una composición inmunogénica que comprende la toxina binaria pueden mejorarse añadiendo un adyuvante, en particular un adyuvante que comprende una saponina inmunológicamente activa presentada en forma de un liposoma o de una emulsión de aceite en agua.

Sumario de la invención

1. En un primer aspecto de la invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende la proteína CDTb de Clostridium diffiále en la que la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es una proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio, que comprende el dominio de unión al receptor en el que la proteína CDTb de Clostridium diffiále comprende;

(i) SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51; o

Una variante de CDTb que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51; y la composición inmunogénica comprende una proteína CDTa de Clostridium difficile que contiene una mutación de glutamato a un aminoácido diferente en la posición 428 o 430 que reduce su actividad ADP-ribosiltransferasa, en la que la proteína CDTa de Clostridium difficile es (i) SeQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o (ii) una variante de CDTa que tiene al menos identidad de secuencia de 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o (iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión que comprende una proteína CDTa y una proteína CDTb, en la que la proteína CDTb está truncada y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 51 y la proteína CDTa es (i) SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o (ii) una variante de CDTa que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o (iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende la composición inmunogénica de una cualquiera de los aspectos descritos anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona la composición inmunogénica de uno cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o la vacuna del tercer aspecto para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad, por ejemplo, enfermedad por C. difficile.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición inmunogénica de uno cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o la vacuna del tercer aspecto en la preparación de un medicamente para la prevención o el tratamiento de enfermedad, por ejemplo, enfermedad por C. difficile.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile.

En un aspecto adicional de la divulgación se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile aislada o una proteína CDTa aislada pero no comprende tanto una proteína CDTb aislada como una proteína CDTa aislada.

Nuevos polipéptidos y nucleótidos como se definen en el presente documento también forman aspectos adicionales de la invención.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 (que comprende las Figuras 1a-1h) - Gráficos que describen la distribución por tamaño de las diferentes construcciones de CdtA, CdtB y fusión CdtA-CdtB como se determina mediante ultracentrifugación analítica de la velocidad de sedimentación:

Figura 1a: ABC de C67 (CdtA (aa44-463) mut E428Q-E430Q

Figura 1b: ABC de C67 C69 CdtA (aa44-463) mut. R345A-Q350A-N385A-R402A-S388F-E428Q-E430Q Figura 1c: ABC de C50 (CdtA N-term sin conector (aa44-260)

Figura 1d: ABC de C61 (fusión CdtA N term con conector-CdtBcorto)

Figura 1e: ABC de C62 (fusión CdtA N term sin conector-CdtBlargo)

Figura 1f: ABC de C52 (CdtB largo)

Figura 1g: ABC de C53 (CdtB corto)

Figura 1h: ABC de prodominio CdtB A (aa. 212-876)

FIG. 2 (que comprende las Figuras 2a-2c) - Perfiles de SDS PAGE de construcciones de CdtA, CdtB y fusión CdtA-CdtB después de la purificación:

Figura 2a: SDS PAGE de construcciones de fusión CdtA-CdtB purificadas. Carril 1: Marcador de peso molecular Novex Sharp preteñido. Carril 2: 5 |jg de C61 CdtA N-term conector (aa 44-268)-CdtB RBD corto (aa 636-876). Carril 3: 5 jg de C62 CdtA N-term (aa. 44-260)-CdtB RBD largo (aa 621-876).

Figura 2b: SDS PAGE de construcciones de CdtA purificadas. Carril 1: Marcador de peso molecular Novex Sharp preteñido. Carril 2: 5 jg de C50 CdtA sin conector (44-260). Carril 3: 5 jg de C67 CdtA de longitud completa (aa 44-463) mut. E428QE430Q. Carril 4: 5 jg de C69 CdtA de longitud completa (aa 44-463) mut. R345A-Q350A-N385A-R402A-S388F-E428Q-E430Q.

Figura 2c: SDS PAGE de construcciones de CdtB purificadas. Carril 1: Marcador de peso molecular Novex Sharp preteñido. Carril 2: 5 jg de C37 CdtB' secuencia señal A (aa 43-876) GST N-term después de la retirada del GST N-term y activación por escisión de prodominio con quimotripsina. Carril 3: 5 jg de C55 CdtB prodomio A (aa 212-876). Carril 4: 5 |jg de C52 CdtB dominio de unión a receptor largo (aa 621-876). Carril 5: Marcador de peso molecular. Carril 6: 5 jg de C38 CdtB' secuencia señal A (aa 43-876).

FIG. 3 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTb en ratones inmunizados con componente A de la toxina binaria de C. difficile o componente B de la toxina binaria de C. diffidle, en ambos casos formulados con adyuvante. FIG. 4 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTa en ratones inmunizados con componente A de la toxina binaria de C. difficile o componente B de la toxina binaria de C. difficile, en ambos casos formulados con adyuvante. FIG. 5 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad en células HCT116 de ratones inmunizados con componente A de la toxina binaria de C. difficile o componente B de la toxina binaria de C. difficile, en ambos casos formulados con adyuvante.

FlG. 6 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad en células HT29 de ratones inmunizados con componente A de la toxina binaria de C. difficile o componente B de la toxina binaria de C. difficile, en ambos casos formulados con adyuvante.

FlG. 7 -G ráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTb en ratones inmunizados con Cdtb de C. difficile (activado o inactivado con y sin fusión F2 que comprende fragmentos de toxina A y toxina B) formulado con adyuvante. FlG. 8 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-ToxA en ratones inmunizados con Cdtb de C. difficile (activado o inactivado con y sin fusión F2 que comprende fragmentos de toxina A y toxina B) formulado con adyuvante. FlG. 9 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-ToxB en ratones inmunizados con Cdtb de C. difficile (activado o inactivado con y sin fusión F2 que comprende fragmentos de toxina A y toxina B) formulado con adyuvante. FlG. 10 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox A en células h T29 de ratones inmunizados con Cdtb de C. difficile (activado o inactivado con y sin fusión F2 que comprende fragmentos de toxina A y toxina B) formulado con adyuvante.

FlG. 11 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox B en células HT29 de ratones inmunizados con Cdtb de C. difficile (activado o inactivado con y sin fusión F2 que comprende fragmentos de toxina A y toxina B) formulado con adyuvante.

FlG. 12 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria en células HT29 de ratones inmunizados con componente A de la toxina binaria de C. difficile o componente B de la toxina binaria de C. difficile, en ambos casos formulados con adyuvante.

FlG. 13 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTb en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 14 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTa en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 15 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-ToxB en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 16 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-ToxA en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 17 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria en células HCT116 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 18 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria en células HT29 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 19 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox A en células HT29 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 20 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox B en células HCT116 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 21 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTb en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 22 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTa en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 23 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-Tox B en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 24 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-Tox A en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante. FlG. 25 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de la toxina binaria en células HCT116 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 26 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de la toxina binaria en células HT29 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 27 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox A en células HT29 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 jg/dosis en una formulación con adyuvante.

FlG. 28 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox B en células HCT116 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 pg/dosis en una formulación con adyuvante.

FIG. 29 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTb en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante. FIG. 30 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-CDTa en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante. FIG. 31 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-Tox B en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante. FIG. 32 - Gráfico que muestra inmunogenicidad anti-Tox A en ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante. FIG. 33 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de la toxina binaria en células HCT116 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante.

FIG. 34 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de la toxina binaria en células HT29 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante.

FIG. 35 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox A en células HT29 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante.

FIG. 36 - Títulos de inhibición de la citotoxicidad de Tox B en células HCT116 de ratones inmunizados con diferentes candidatos a vacuna para la toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvante.

Descripción detallada

Toxina binaria

La toxina binaria de Clostridium difficile comprende dos proteínas diferentes, CDTa y CDTb. Durante la infección se activa CDTb mediante escisión proteolítica con una proteasa de tipo quimotripsina para producir una proteína CDTb que carece del prodominio (también denominado CDTb''). Cabe destacar que CDTb” también carece de la secuencia señal de CDTb, una proteína CDTb que carece de la secuencia señal pero que no carece del prodominio se denomina CDTb'. Después de la activación proteolítica, la CDTb oligomeriza y se une a CDTa para formar la “toxina binaria” completa. La unión de la toxina binaria a los receptores celulares conduce a la endocitosis mediada por el receptor. Cuando el endosoma se acidifica, el dominio de unión de CDTb sufre cambios conformacionales que permiten que el oligómero de CDTb forme un poro, la formación del poro desencadena la translocación del dominio de la ADP-ribosiltransferasa (CDTa) a la célula diana.

CDTb

La presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile aislada. La presente divulgación también proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile aislada como el único antígeno de C. difficile. Como se usa en el presente documento, la expresión “como el único antígeno de C. diffíále" significa que la composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile aislada como el único antígeno de C. difficile no comprende también otro antígeno de C. difficile, por ejemplo, la composición inmunogénica no comprende tampoco una toxina A, toxina B o proteína CDTa.

La presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile aislada en la que la composición no comprende además una proteína aislada que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de similitud con las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32. Según la invención como se describe en el presente documento la expresión “proteína CDTb” abarca SEQ ID NO: 3 o fragmentos o variantes de la SEQ ID NO: 3.

En una realización de este primer aspecto de la divulgación, la composición no comprende una proteína CDTa de Clostridium difficile aislada.

En una realización de este aspecto la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es o comprende

(i) SEQ ID NO: 3

(ii) una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3; o

(iii) un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 3.

En uno de dichos aspectos se proporciona una composición inmunogénica en la que la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto se proporciona una composición inmunogénica en la que la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 u 850 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 3.

CDTb comprende múltiples dominios, en particular CDTb comprende un péptido señal y un prodominio, ambos de los cuales se escinden como se explica en la sección titulada “Toxina binaria” anteriormente. En una realización de la divulgación, la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el péptido señal. La expresión “proteína CDTb truncada en la que se ha eliminado el péptido señal” hace referencia a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 3 en el que se ha eliminado sustancialmente todo el péptido señal (por lo tanto, que no comprende los aminoácidos correspondientes a sustancialmente todo el péptido señal), pueden quedar varios aminoácidos del péptido señal, por ejemplo, pueden quedar 2, 5, 10, 15 o 20 aminoácidos del péptido señal. El péptido señal corresponde a aminoácidos 1-48 (que abarca aminoácidos 1-42) de la SEQ ID NO: 3 o sus equivalentes en una proteína toxina binaria aislada de una cepa diferente de C. difficile, por ejemplo los aminoácidos 1-42 de la secuencia de aminoácidos de CDTb de la cepa CD196 (Perelle, M. y col Infect. Immun., 65 (1997), págs. 1402-1407).

Convenientemente, en esta realización la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es o comprende

(i) SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 16; o

(ii) una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 16; o

(iii) un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 u 800 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 16. En una realización, la proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el péptido señal es o comprende una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 16. En una realización adicional, la proteína CDTb truncada aislada con el péptido señal retirado es o comprende un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 u 800 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 16.

En una realización la proteína CDTb de Clostridium difficile es una proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio. La expresión “proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio” se refiere a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 3 en el que se ha eliminado sustancialmente todo el prodominio (por lo tanto, que no comprende los aminoácidos correspondientes a sustancialmente todo el prodominio), pueden quedar varios aminoácidos del prodominio, por ejemplo, pueden quedar 2, 5, 10, 15 o 20 aminoácidos del prodominio. El prodominio corresponde a los aminoácidos 48-211 (que abarcan los aminoácidos 48-166) de la SEQ ID NO: 3 o sus equivalentes en una proteína toxina binaria aislada de una cepa diferente de C. difficile. Opcionalmente la proteína CDTb truncada con el prodominio eliminado también carece de la secuencia señal de CDTb, la secuencia señal CDTb corresponde a los aminoácidos 1-48 (que abarcan los aminoácidos 1-42) de la SEQ ID NO: 3 o sus equivalentes en una cepa diferente. La expresión “proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio” también puede referirse a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 3 que es capaz de oligomerizar y unirse con CDTa. En esta realización de la invención, la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51; o

(ii) una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51; o

(iii) un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 o 650 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51.

En una realización, la proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio es o comprende una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9. En una realización adicional, la proteína CDTb truncada aislada de la que se ha aislado el prodominio es o comprende un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 u 800 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 9.

CDTb también comprende un dominio de unión a receptor. En una realización la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTb truncada que comprende el dominio de unión a receptor. La expresión “proteína CDTb truncada que comprende el dominio de unión a receptor” se refiere a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 3 en el que se ha eliminado sustancialmente todo excepto el dominio de unión a receptor (por lo tanto, que no comprende los aminoácidos correspondientes a sustancialmente toda la proteína excepto por el dominio de unión a receptor), pueden quedar varios aminoácidos además del dominio de unión a receptor, por ejemplo, 2, 5, 10, 15 o 20 aminoácidos excepto por/además del dominio de unión a receptor. En una versión, el dominio de unión a receptor corresponde a los aminoácidos 620-876 de la SEQ ID NO: 3 o sus equivalentes en una proteína toxina binaria aislada de una cepa diferente de C. difficile. En otra versión, el dominio de unión a receptor corresponde a los aminoácidos 636-876 de la SEQ ID NO: 3 o sus equivalentes en una proteína de toxina binaria aislada de una cepa diferente de C. difficile

En esta realización, la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36; o

(ii) una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36; o

(iii) un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150 o 200 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36.

En otra realización de este aspecto de la divulgación, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es una proteína CDTb mutada incapaz de unirse con CDTa.

En esta realización, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 50; o

(ii) una variante de CDTb que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 50; o

(iii) un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 50.

La secuencia de aminoácidos de la proteína CDTb varía entre cepas diferentes, por esta razón la numeración de los aminoácidos puede diferir entre cepas. Por esta razón, la expresión “equivalentes en una cepa diferente” hace referencia a aminoácidos que corresponden a los de una cepa de referencia (p. ej., C. diffiále R20291 de la que proceden las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3), pero que se encuentran en una toxina de una cepa diferente y que, por tanto, pueden estar numerados de forma diferente. Una región de aminoácidos “equivalentes” se puede determinar alineando las secuencias de las toxinas de las diferentes cepas. Las cepas productoras de toxina binaria ejemplares incluyen CD196, CCUG 20309, R8637, IS81, IS93, IS51, IS58, R6786, R7605, R10456 y R5989. Los números de aminoácidos proporcionados en todo el documento se refieren a los de la cepa de referencia R20291.

En una realización adicional, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es un monómero de CDTb. En una realización adicional, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es un multímero de CDTb. En una realización adicional, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es un multímero de CDTb. En una realización adicional, la proteína CDTb de Clostridium diffiále es un heptámero de CDTb. En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada en la que la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es una proteína CDTb truncada que comprende el dominio de unión a receptor. En una realización de este aspecto, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36; o

(iii) un fragmento de CDTb que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150 o 200 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36.

En un tercer aspecto, la divulgación proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada en la que la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada es una proteína CDTb mutada incapaz de unirse con CDTa. En una realización de este aspecto, la proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 50; o

En una realización del primer aspecto de la invención, la composición inmunogénica comprende/comprende adicionalmente una proteína CDTa de Clostridium diffiále aislada que comprende

(i) SEQ ID NO: 1; o

(ii) una variante de CDTa que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con la SEQ Id NO: 1; o

(iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1.

CDTa

La presente divulgación también proporciona composiciones inmunogénicas que comprende una proteína CDTa de Clostridium diffiále aislada. La presente invención también proporciona composiciones inmunogénicas que comprende una proteína CDTa de Clostridium diffiále aislada como el único antígeno de C. diffiále. Como se usa en el presente documento, la expresión “como el único antígeno de C. diffiále" significa que la composición inmunogénica que comprende una proteína CDTa de Clostridium diffiále como el único antígeno de C. diffiále tampoco comprende otro antígeno de C. diffiále, p. ej., la composición inmunogénica tampoco comprende una toxina A, toxina B o proteína CDTb. Según la invención, como se describe en el presente documento, la expresión “proteína CDTa" abarca la SEQ ID NO: 1 o fragmentos o variantes de la SEQ ID NO: 1. En una realización, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada comprende una variante de CDTa que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada comprende un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1.

CDTa comprende dos dominios, el dominio C terminal es responsable de la actividad ADP ribosiltransferasa, mientras que el dominio N terminal es responsable de la interacción con CDTb.

En un aspecto de la divulgación, la composición inmunogénica comprende/comprende adicionalmente una proteína CDTa de Clostridium difficile aislada. Convenientemente, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTa truncada. “Una proteína CDTa truncada” como se usa en el presente documento significa una proteína CDTa que no consigue su longitud completa o su forma apropiada y, por tanto, carece de algunos de los restos de aminoácidos que están presentes en CDTa de longitud completa de la SEQ ID NO: 1 y que no puede realizar la función que se pretendía porque su estructura es incapaz de hacerlo, p. ej., actividad ADP ribosiltransferasa y/o interacción con CDTb.

Convenientemente, la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTa truncada que no comprende el dominio C terminal. La expresión “CDTa truncada que no comprende el dominio C terminal” hace referencia a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 1 que no comprende una porción sustancial del dominio C terminal, pueden quedar varios aminoácidos del dominio C terminal, por ejemplo, pueden quedar 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 50 aminoácidos del dominio C terminal. El dominio C terminal corresponde a los aminoácidos 267-463 de la SEQ ID NO: 1 o sus equivalentes en una proteína CDTa aislada de una cepa diferente de C. difficile. En este aspecto de la divulgación, la proteína CDTa de Clostridium difficile truncada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15

(ii) una variante de CDTa que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; o

(iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150 o 190 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.

En una realización, la proteína CDTa de Clostridium difficile truncada que no comprende el dominio C terminal es una variante de CDTa que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con la SEQ ID NO: 13. En una realización adicional la proteína CDTa truncada que no comprende el dominio C terminal es una variante de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150 o 190 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 13.

En un aspecto, la divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende proteína CDTa de Clostridium difficile aislada en la que la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTA truncada que no comprende el dominio C terminal. En una realización de este aspecto la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; o

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada contiene adecuadamente una mutación que reduce su actividad de ADP-ribosiltransferasa. Por ejemplo, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada tiene una mutación de glutamato a otro aminoácido en la posición 428. La expresión “tiene una mutación en la posición 428” se refiere a proteínas CDTa que tienen una mutación en esta localización exacta pero también a una proteína CDTa que está aislada de una cepa diferente y que tiene una mutación en una posición equivalente. La secuencia de aminoácidos de la proteína CDTa varía entre cepas diferentes, por esta razón la numeración de los aminoácidos puede diferir entre cepas, por tanto una proteína CDTa de una cepa diferente puede tener un correspondiente glutamato que no es el número 428 en la secuencia. En una realización, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada tiene una mutación de glutamato a glutamina en a posición 428.

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada tiene una mutación de glutamato a un aminoácido diferente en la posición 430. La expresión “tiene una mutación en la posición 430” se refiere a proteínas que tienen esta localización exacta pero también a una proteína CDTa que está aislada de una cepa diferente y que tiene una mutación en una posición equivalente. En una realización, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada tiene una mutación de glutamato a glutamina en la posición 430.

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la invención, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o

(ii) una variante de CDTa que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con la SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o

(iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54.

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 48; o

(ii) una variante de CDTa que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con la SEQ ID NO: 48; o

(iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 48.

Composiciones inmunogénicas con CDTa y/o CDTb

En una realización adicional se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb pero que no comprende una proteína CDTa, por ejemplo, la composición inmunogénica no comprende una variante de CDTa que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de CDTa que tiene al menos 250, 400 o 450 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1.

En una realización adicional se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTa pero que no comprende una proteína CDTb, por ejemplo, la composición inmunogénica no comprende una variante de CDTb que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de CDTb que tiene al menos 700, 750 u 800 aminoácidos contiguos de CDTb.

En una realización adicional se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína CDTb de Clostridium difficile aislada o una proteína CDTa aislada pero no comprende una proteína CDTb aislada y una proteína CDTa aislada.

En una realización adicional se proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína CDTa y una proteína CDTb. En otra realización se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden una proteína de fusión que comprende una proteína CDTa y una proteína CDTb.

Proteínas de fusión que comprenden una proteína CDTa y una proteína CDTb

En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden una proteína de fusión que comprende una proteína CDTa y una proteína CDTb. En una realización de este aspecto, la proteína CDTa está convenientemente truncada. Por ejemplo, la proteína CDTa convenientemente no comprende el dominio C terminal. En este aspecto, la proteína CDTb está convenientemente truncada. En esta realización, la proteína CDTb comprende convenientemente el dominio de unión a receptor.

En una realización de este aspecto de la invención, la proteína de fusión convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; o SEQ ID NO: 43; o

(ii) una variante que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % con la SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; o SEQ ID NO: 43; o

(iii) un fragmento que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; o SEQ ID NO: 43.

“Polipéptido de fusión” o “proteína de fusión” hace referencia a una proteína que tiene al menos dos polipéptidos heterólogos (p. ej., al menos dos polipéptidos de Mycobacterium sp) unidos covalentemente, bien directamente o bien mediante un conector de aminoácidos. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están unidos normalmente extremo C con extremo N, aunque también pueden estar unidos extremo C con extremo C, extremo N con extremo N o extremo N con extremo C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Esta expresión también se refiere a variantes modificadas de forma conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, fragmentos inmunogénicos y homólogos entre especies de los antígenos que forman la proteína de fusión.

El término “fusionado” se refiere a la unión, p. ej. covalente entre dos polipéptidos en una proteína de fusión. Los polipéptidos normalmente están unidos mediante un enlace peptídico, bien directamente entre sí o mediante un conector aminoacídico. Opcionalmente, los péptidos se pueden unir a través de enlaces covalentes no peptídicos conocidos por los expertos en la técnica.

Se puede usar una secuencia conectora peptídica para separar el primero y el segundo componentes polipeptídicos una distancia suficiente para garantizar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia conectora peptídica se incorpora en la proteína de fusión usando técnicas convencionales bien conocidas en este campo. Las secuencias conectoras peptídicas adecuadas se pueden elegir basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primero y el segundo polipéptido; y (3) la falta de restos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Secuencias conectoras peptídicas preferidas contienen restos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también se pueden usar en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden usar de forma útil como conectores incluyen los divulgados en Maratea y col., Gene 40:39-46 (1985); Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); la patente de EE.UU. N° 4.935.233 y la patente de EE.Uu . N° 4.751.180. La secuencia conectora puede tener una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, una longitud de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos. No son necesarias secuencias conectoras cuando el primero y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos no esenciales N terminales que se pueden usar para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

En una realización de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la composición inmunogénica induce anticuerpos que neutralizan CDTa o CDTb o ambos. En una realización adicional, la composición induce anticuerpos que neutralizan la toxina binaria. Si una composición induce anticuerpos contra una toxina se puede medir inmunizando ratones con la composición inmunogénica, recogiendo los sueros y analizando los títulos de anti-toxina de los sueros usando ELISA. Los sueros se compararán con una muestra de referencia obtenida de ratones que no se han inmunizado. La composición de la divulgación induce anticuerpos que neutralizan la CDTa si los sueros contra los polipéptidos dan una lectura en el ELISA superior a 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % mayor que la muestra de referencia.

En una realización adicional, las composiciones inmunogénicas de la invención provocan una respuesta inmunitaria protectora en un huésped mamífero contra cepas de C. diffiále. En una realización, el huésped mamífero se selecciona del grupo que consiste en ratón, conejo, cobaya, cerdo, primate no humano, mono y ser humano. En una realización, el huésped mamífero es un ratón. En una realización adicional, el huésped mamífero es un ser humano.

Usando un ensayo de exposición se puede determinar si una composición inmunogénica provoca una respuesta inmunitaria protectora en un huésped mamífero contra cepas de C. diffiále. En dicho ensayo se vacuna al huésped mamífero con la composición inmunogénica y se le expone a C. diffiále, se compara el tiempo durante el que el mamífero sobrevive después de la exposición con el tiempo que sobrevive un mamífero de referencia que no ha sido inmunizado con la composición inmunogénica. Una composición inmunogénica provoca una respuesta inmunitaria protectora si un mamífero inmunizado con la composición inmunogénica sobrevive al menos 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 80 %, 90 % o 100 % más que un mamífero de referencia que no ha sido inmunizado después de la exposición a C. diffiále.

Toxina A y Toxina B

En una realización de cualquiera de los aspectos de la divulgación, las composiciones inmunogénicas de la divulgación comprenden además una proteína toxina A de Clostridium diffiále aislada y/o una proteína toxina B de C. diffiále aislada.

La expresión “proteína toxina A de Clostridium diffiále aislada” hace referencia a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 31. En una realización, la proteína toxina A de Clostridium diffiále aislada es un que comprende 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 o 2500 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 31. En una realización, la proteína toxina A de Clostridium diffiále aislada es una variante que comprende una identidad de secuencia de 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 31.

La expresión “proteína toxina B de Clostridium diffiále aislada” hace referencia a un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 32. En una realización, la proteína toxina B de Clostridium diffiále aislada es un fragmento que comprende 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 aminoácidos de la SEQ ID NO: 32. En una realización, la proteína toxina B de Clostridium diffiále es una variante que comprende una identidad de secuencia de 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 32.

En una realización, la proteína toxina A de Clostridium diffiále aislada comprende un fragmento de dominio de repetición. La expresión “dominio de repetición de la toxina A” hace referencia al dominio C terminal de la proteína toxina A de C. diffiále, que comprende secuencias repetidas. El dominio de repetición de la toxina A hace referencia a los aminoácidos 1832-2710 de la toxina A de la cepa VPI10463 (ATCC43255) y sus equivalentes en una cepa diferente, la secuencia de aminoácidos 1832-2710 de la cepa VPI10463 (ATCC43255) corresponde a los aminoácidos 1832-2710 de la SEQ ID NO: 31. En una realización adicional, la proteína toxina A de Clostridium diffiále aislada comprende un fragmento del dominio N-terminal de la toxina A. El dominio N-terminal de la toxina A hace referencia a los aminoácidos 1-1831 de la toxina A de la cepa VPI10463 (ATCC43255) y sus equivalentes en una cepa diferente, la secuencia de aminoácidos 1-1831 de la SEQ ID NO: 31.

En una realización, la proteína toxina B de Clostridium diffiále aislada comprende un fragmento de dominio de repetición de la toxina B. La expresión “dominio de repetición de la toxina B” hace referencia al dominio C-terminal de la proteína toxina B de C. diffiále. Este dominio hace referencia a los aminoácidos 1834-2366 de la cepa VPI10463 (ATCC43255) y sus equivalentes en una cepa diferente, la secuencia de aminoácidos 1834-2366 de la cepa VPI10463 (ATCC43255) corresponde a los aminoácidos 1834-2366 de la SEQ ID NO: 32. En una realización adicional, la proteína toxina B de Clostridium difficile aislada comprende un fragmento del dominio N-terminal de la toxina B. El dominio N-terminal de la toxina B hace referencia a los aminoácidos 1-1833 de la toxina B de la cepa VPI10463 (ATCC43255) y sus equivalentes en una cepa diferente, la secuencia de aminoácidos 1-1833 de la SEQ ID NO: 32. Las toxinas A y B de C. difficile son proteínas conservadas, aunque la secuencia difiere en una cantidad pequeña entre cepas, además, la secuencia de aminoácidos para las toxinas A y B en cepas diferentes puede diferir en el número de aminoácidos.

Por estas razones, las expresiones dominio de repetición de la toxina A y/o dominio de repetición de la toxina B hacen referencia a una secuencia que es una variante con una identidad de secuencia de 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con los aminoácidos 1832-2710 de la SEQ ID NO: 31 o una variante con una identidad de secuencia de 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con los aminoácidos 1834-2366 de SEQ ID NO: 32. De forma similar, las expresiones dominio N-terminal de la toxina A y/o dominio N-terminal de la toxina B hacen referencia a una secuencia que es una variante con una identidad de secuencia de 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con los aminoácidos 1-1831 de la SEQ ID NO: 31 o una variante con una identidad de secuencia de 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con los aminoácidos 1-1833 de la SEQ ID NO: 32.

Además, la numeración de los aminoácidos puede diferir entre los dominios C-terminales de la toxina A (o toxina B) de una cepa y la toxina A (o toxina B) de otra cepa. Por esta razón, la expresión “equivalentes en una cepa diferente” hace referencia a aminoácidos que corresponden a los de una cepa de referencia (p. ej., C. difficile VPI10463), pero que se encuentran en una toxina de una cepa diferente y que, por tanto, pueden estar numerados de forma diferente. Una región de aminoácidos “equivalentes” se puede determinar alineando las secuencias de las toxinas de las diferentes cepas. Los números de los aminoácidos proporcionados a lo largo del documento hacen referencia a los de la cepa VPI10463.

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la proteína toxina A de C. difficile aislada y la proteína toxina B de C. difficile forman una proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión es 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 24, 26, 28 y 30. En una realización adicional, la proteína de fusión es un fragmento de al menos 800, 850, 900 o 950 aminoácidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21,22, 24, 26, 28 y 30.

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la composición inmunogénica comprende/comprende además una proteína de fusión entre una proteína de toxina A aislada de Clostridium difficile y/o una proteína toxina B aislada de Clostridium difficile fusionadas con una proteína CDTb o con una proteína CDTb truncada. En una realización se proporciona una proteína de fusión que comprende un fragmento de la toxina A, un fragmento de la toxina B y una proteína CDTb, por ejemplo la proteína de fusión puede comprender un fragmento o variante de las SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 24, 26, 28 o 30 fusionado con una proteína CDTb. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un fragmento o variante de las SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 24, 26, 28 o 30 fusionado con una proteína CDTb truncada.

En una realización la proteína de fusión convenientemente es o comprende

(i) SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45; o

(ii) una variante que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45; o

(iii) un fragmento de al menos 800, 850, 900 o 950 aminoácidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45.

Fragmentos

El término “fragmento” como se define en el presente documento puede hacer referencia a un fragmento que comprende un epítopo de linfocitos T. Los epítopos de linfocitos T son tramos de aminoácidos contiguas y cortas que son reconocidas por linfocitos T (p. ej., linfocitos T CD4+ o CD8+). La identificación de los epítopos de linfocitos T se puede conseguir mediante experimentos de mapeo de epítopos que son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (1993); Beipbarth y col Bioinformatics 2005 21(Supl. 1):i29-i37).

Convenientemente, los fragmentos de la divulgación son fragmentos inmunogénicos. Los “fragmentos inmunogénicos” según la presente invención normalmente comprenderán al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia polipeptídica de longitud completa (p. ej., al menos 10), tal como al menos 12 aminoácidos contiguos (p. ej., al menos 15 o al menos 20 aminoácidos contiguos), en particular al menos 50 aminoácidos contiguos, tal como al menos 100 aminoácidos contiguos (p. ej., al menos 200 aminoácidos contiguos). Convenientemente, los fragmentos inmunogénicos tendrán al menos 20 %, tal como al menos 50 %, al menos 70 % o al menos 80 % de la longitud de la secuencia polipeptídica de longitud completa.

Se entenderá que en una población no consanguínea diversa, tales como los seres humanos, diferentes tipos de HLA significan que epítopos específicos pueden no ser reconocidos por todos los miembros de la población. En consecuencia, para maximizar el nivel de reconocimiento y escala de la respuesta inmunitaria a un polipéptido, generalmente es deseable que un fragmento inmunogénico contenga una pluralidad de los epítopos de la secuencia de longitud completa (idóneamente todos los epítopos).

Variantes

“Variantes” o "variantes modificadas de forma conservadora” se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, “variantes modificadas de forma conservadora” se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas.

En cuanto a las variantes de una secuencia de proteínas, el experto en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales en un polipéptido que alteren, añadan o supriman un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos es una “variante modificada de forma conservadora” en la que la o las alteraciones tienen como resultado la sustitución de un aminoácido con una funcionalidad similar al aminoácido o la sustitución/deleción/adición de restos que no afectan sustancialmente a la función biológica de la variante.

En la técnica son bien conocidas tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas variantes modificadas de forma conservadora son, además de y sin excluir, variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.

Un polipéptido de la invención (tal como una proteína CDTa o una proteína CDTb) puede contener una serie de sustituciones conservadoras (por ejemplo, 1-50, tal como 1-25, en particular 1-10 y especialmente 1 resto de aminoácido, pueden estar alterados) cuando se comparan con la secuencia de referencia. En general, dichas sustituciones conservadoras entrarán dentro de los agrupamientos de aminoácidos especificados más adelante, aunque en algunas circunstancias pueden ser posibles otras sustituciones sin que ello afecte sustancialmente a las propiedades inmunogénicas del antígeno. Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que normalmente son sustituciones conservadoras uno de otro:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins 1984).

Idóneamente, dichas sustituciones no se producen en la región de un epítopo y, por tanto, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

Las variantes polipeptídicas también pueden incluir aquellas en las que se insertan aminoácidos adicionales en comparación con la secuencia de referencia, por ejemplo, dichas inserciones pueden producirse en 1-10 localizaciones (tal como 1-5 localizaciones, idóneamente 1 o 2 localizaciones, en particular 1 localización) y pueden implicar, por ejemplo, la adición de 50 o menos aminoácidos en cada localización (tal como 20 o menos, en particular 10 o menos, especialmente 5 o menos). Idóneamente, dichas inserciones no se producen en la región de un epítopo y, por tanto, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye un tramo corto de restos de histidina (p. ej., 2-6 restos) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.

Las variantes polipeptídicas incluyen aquellas en las que se han suprimido aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, por ejemplo dichas deleciones pueden producirse en 1-10 localizaciones (tal como 1-5 localizaciones, idóneamente 1 o 2 localizaciones, en particular 1 localización) y pueden implicar, por ejemplo, la deleción de 50 o menos aminoácidos en cada localización (tal como 20 o menos, en particular 10 o menos, especialmente 5 o menos). Idóneamente, dichas deleciones no se producen en la región de un epítopo y, por tanto, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

El experto en la técnica reconocerá que una variante polipeptídica concreta puede comprender sustituciones, deleciones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).

Las variantes exhiben, preferentemente, una identidad de al menos aproximadamente 70 %, más preferentemente una identidad de al menos aproximadamente 80 % y, lo más preferentemente, una identidad de al menos aproximadamente 90 % (tal como al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 %) con la secuencia de referencia asociada.

Los términos “ idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, una identidad del 70 %, opcionalmente una identidad del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %sobre una región especificada), cuando se comparan y alinean según la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada medida usando, por ejemplo, uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Por tanto, se dice que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere a la complementaria de una secuencia problema. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos u, opcionalmente, sobre una región que tiene una longitud de 75-100 aminoácidos o nucleótidos. Idóneamente, la comparación se realiza sobre una ventana correspondiente con la longitud completa de la secuencia de referencia.

Para comparar secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias problema. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias problema y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencias, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parámetros por defecto del programa o parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias problema con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se usa en el presente documento, hace referencia a un segmento en el que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de forma óptima. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de las secuencias para comparar se puede efectuar mediante, por ejemplo, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el procedimiento de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds. 1995 suplemento)).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones pareadas progresivas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También representa un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El procedimiento usado es similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación pareada de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Después, este grupo se alinea con la siguiente secuencia más relacionada o grupo de secuencias alineadas. Dos grupos de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación apareada de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones pareadas progresivas. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros del programa. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otras secuencias problema para determinar la relación del porcentaje de identidad de secuencia usando los parámetros siguientes: peso del hueco por defecto (3,00), peso de la longitud del hueco por defecto (0,10) y huecos terminales ponderados. PILEUP se puede obtener del paquete de software para análisis de secuencia GCG, p. ej. la versión 7.0 (Devereaux y col., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984).

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLASt 2.0, que se describen en Altschul y col. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible para el público a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (sitio web en www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que coinciden o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y col., supra). Estas coincidencias de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo lo que la puntuación de alineación acumulada se pueda incrementar. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos equivalentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no equivalentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de la alineación acumulada se salga de la cantidad X a partir de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menor, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos que puntúan negativo; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca al azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico problema con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y, lo más preferentemente, inferior a aproximadamente 0,001.

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS

Los polinucleótidos que codifican las proteínas CDTa, CDTb, Toxina A y Toxina B de Clostridium difficile de la invención se pueden identificar, preparar y/o manipular usando cualquiera de diversas técnicas bien establecidas. Por ejemplo, se puede identificar un polinucleótido, como se describirá con más detalle más adelante, mediante exploración de una micromatriz de ADNc. Dichas exploraciones se pueden realizar usando, por ejemplo, una micromatriz Synteni (Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante (y esencialmente como describen Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619 (1996) y Heller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155 (1997)). Como alternativa, los polinucleótidos se pueden amplificar a partir de ADNc preparado de células que expresan las proteínas descritas en el presente documento, tales como células de M. tuberculosis. Dichos polinucleótidos se pueden amplificar mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este enfoque, se pueden diseñar cebadores específicos de secuencia basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento, y se pueden adquirir o sintetizar.

Se puede usar una porción amplificada de un polinucleótido para aislar un gen de longitud completa de una biblioteca adecuada (p. ej., una biblioteca de ADNc de M. tuberculosis) usando técnicas bien conocidas. En dichas técnicas, se explora una biblioteca (de ADNc o genómica) usando una o más sondas o cebadores polinucleotídicos adecuados para amplificación. Preferentemente, una biblioteca se selecciona por tamaño de modo que incluya moléculas mayores. También se pueden preferir bibliotecas cebadas aleatorias para identificar las regiones de los genes 5' y cadena arriba. Se prefieren las bibliotecas genómicas para obtener intrones y extender las secuencias en 5'.

Para las técnicas de hibridación, se puede marcar una secuencia parcial (p. ej., mediante traslación de muescas o marcaje del extremo libre con 32P) usando técnicas bien conocidas. Generalmente se explora una biblioteca bacteriana o de bacteriófagos mediante hibridación de filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o céspedes que contienen placas de fagos) con la sonda marcada (véase Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). Las colonias o placas que hibridan se seleccionan y expanden, y el ADN se aísla para su posterior análisis. Los clones de ADNc se pueden analizar para determinar la cantidad de secuencia adicional mediante, por ejemplo, PCR usando un cebador a partir de la secuencia parcial y un cebador del vector. Se pueden generar mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones solapantes. Después, la secuencia completa se puede determinar usando técnicas convencionales, que pueden implicar generar una serie de clones de deleción. Después, las secuencias solapantes resultantes se pueden ensamblar en una única secuencia contigua. Se puede generar una molécula de ADNc de longitud completa uniendo fragmentos adecuados usando técnicas bien conocidas.

Como alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia de codificación de longitud completa a partir de una secuencia parcial de ADNc. En dichas técnicas, la amplificación generalmente se realiza mediante PCR. Se puede usar cualquiera de diversos kits disponibles en el mercado para realizar la etapa de amplificación. Los cebadores se pueden diseñar usando, por ejemplo, software bien conocido en la técnica. Preferentemente, los cebadores tienen una longitud de 22-30 nucleótidos, tienen un contenido en GC de al menos 50 % e hibridan con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68 °C a 72 °C. La región amplificada se puede secuenciar como se ha descrito anteriormente y las secuencias solapantes se ensamblan en una secuencia contigua.

Una de estas técnicas de amplificación es la PCR inversa (véase Triglia y col., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)), que usa enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. A continuación, el fragmento se circulariza mediante ligamiento intramolecular y se usa como molde para la PCR con cebadores divergentes derivados de la región conocida. En un enfoque alternativo, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial se pueden recuperar mediante amplificación con un cebador a una secuencia conectora y un cebador específico de una región conocida. Las secuencias amplificadas normalmente se someten a un segundo ciclo de amplificación con el mismo cebador de unión y un segundo cebador específico de la región conocida. Una variación de este procedimiento, que usa dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas desde la secuencia conocida, se describe en el documento WO 96/38591. Otra de estas técnicas se conoce como “amplificación rápida de los extremos del ADNc” o RACE. Esta técnica implica el uso de un cebador interno y un cebador externo, que hibridan con una región poliA o secuencia de vector, para identificar las secuencias que están en 5' y 3' de una secuencia conocida. Técnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)) y PCR de desplazamiento (Parker y col., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). Otros procedimientos que usan amplificación también se pueden usar para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.

En ciertos casos es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante análisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de marcadores de secuencia expresados (EST), tales como las disponibles en GenBank. Las búsquedas de EST solapantes pueden realizarse, en general, usando programas bien conocidos (p. ej., búsquedas NCBI BLAST) y dichos EST se pueden usar para generar una secuencia contigua de longitud completa. Las secuencias de ADN de longitud completa también se pueden obtener mediante análisis de los fragmentos genómicos.

EXPRESIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS EN CÉLULAS HUÉSPED

Las secuencias polinucleotídicas o fragmentos de las mismas que codifican las proteínas CDTa, CDTb, Toxina A y Toxina B de Clostridium difficile o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas se pueden usar en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido en células huésped adecuadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden producir otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente y estas secuencias se pueden usar para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como los expertos en la técnica entenderán, en algunos casos puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos que posean codones de origen no natural. Por ejemplo, se pueden seleccionar codones preferidos por un huésped procariota o eucariota concreto para incrementar el índice de expresión de proteínas o producir un trascrito de ARN recombinante que posee propiedades deseables, tales como una semivida mayor que la de un transcrito generado a partir de la secuencia de origen natural.

Además, las secuencias polinucleotídicas se pueden modificar por ingeniería técnica usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican polipéptidos por diversas razones, incluyendo, entre otras, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, para modificar por ingeniería genética de las secuencias nucleotídicas se puede usar reordenamiento de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos. Además, se puede usar mutagénesis dirigida para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glucosilación, cambiar la preferencia codónica, producir variantes de corte y empalme o introducir mutaciones, etc.

Las secuencias de ácido nucleico naturales, modificadas o recombinantes se pueden unir a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para seleccionar en bibliotecas peptídicas inhibidores de la actividad polipeptídica puede ser útil codificar una proteína quimérica que pueda ser reconocida por un anticuerpo disponible en el mercado. Una proteína de fusión también se puede modificar por ingeniería genética para contener un sitio de escisión localizado entre la secuencia que codifica el polipéptido y la secuencia de la proteína heteróloga, de modo que el polipéptido se puede escindir y purificar del resto heterólogo.

Las secuencias que codifican un polipéptido deseado se pueden sintetizar, completamente o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase, Caruthers, M. H. y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. págs. 215-223 (1980), Horn y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. págs. 225-232 (1980)). Como alternativa, la propia proteína se puede producir usando procedimientos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción de la misma. Por ejemplo, la síntesis peptídica se puede realizar usando varias técnicas en fase sólida (Roberge y col., Science 269:202-204 (1995)) y se puede realizar síntesis automática usando, por ejemplo, el sintetizador peptídico ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, ^{c A ) .}

Un péptido recién sintetizado se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía preparativa de líquidos de alto rendimiento (p. ej., Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) u otras técnicas comparables disponibles en la materia. La composición de los péptidos sintéticos se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (p. ej., el método de degradación de Edman). Adicionalmente, durante la síntesis directa, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o cualquier parte del mismo, se puede alterar y/o combinar mediante procedimientos químicos con otras secuencias de otras proteínas, o cualquier parte de las mismas, para producir una variante del polipéptido.

Con el fin de expresar un polipéptido deseado, las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido, o equivalentes funcionales, se pueden insertar en un vector de expresión adecuado, es decir un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Se pueden usar procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican un polipéptido de interés y los elementos adecuados de control de la transcripción y la traducción. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (actualizado anualmente).

Se pueden usar diversos sistemas de expresión de vector/huésped para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, ente otros, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión con ADN recombinante de bacteriófago, plásmido o cósmido, levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (p. ej., baculovirus), sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (p. ej., plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.

Los “elementos control” o “secuencias reguladoras” presentes en un vector de expresión son las regiones no traducidas del vector, potenciadores, promotores y regiones no traducidas en 5' y 3', que interaccionan con las proteínas de las células huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. La fuerza y especificidad de tales elementos pueden variar. Dependiendo del sistema de vector y del huésped utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, al clonar en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y similares. En los sistemas de células de mamíferos, se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, los vectores basados en SV40 o EBV se pueden usar de forma ventajosa con un marcador seleccionable adecuado.

En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar numerosos vectores de expresión en función del uso previsto para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades para, por ejemplo, la inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que dirijan la expresión de altos niveles de proteínas de fusión que se purifican con facilidad. Dichos vectores incluyen, entre otros, los vectores de expresión y de clonación multifuncionales de E. coli tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifique el polipéptido de interés se puede ligar en el vector en el marco con las secuencias para el aminoácido Met en el extremo amino y los siguientes 7 residuos de p-galactosidasa, de modo que se produce una proteína híbrida; los vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)) y similares. También se pueden usar vectores pGEX (Promega, Madison, Wis; GE Healthcare.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse con facilidad a partir de células lisadas mediante adsorción en perlas de glutatión-agarosa, seguida por elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas hechas en tales sistemas se pueden diseñar para que incluyan heparina, trombina o sitios de escisión por la proteasa del factor Xa de modo que el polipéptido clonado de interés se pueda liberar de la fracción GST a voluntad.

En levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia tal como Pichia pastoris, se puede usar una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa y PGH. Otros vectores que contienen promotores constitutivos e inducibles incluyen GAP, PGK, GAL y ADH. Para recapitulaciones, véase, Ausubel, y col. (supra) y Grant y col., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987) y Romas y col., Yeast 8423-88 (1992).

En los casos en los que se usan vectores de expresión en plantas, la expresión de las secuencias que codifican polipéptidos puede estar dirigida por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores 35S y 19S del CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia líder omega del TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Como alternativa, se pueden usar promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores del choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie y col., Science 224:838-843 (1984); y Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construcciones se pueden introducir en células vegetales mediante transformación directa de ADN o mediante transfección mediada por patógenos. Dichas técnicas se describen en una serie de recapitulaciones disponibles generalmente (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill Yearbook o f Science and Technology págs. 191-196 (1992)).

También se puede usar un sistema de insectos para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de estos sistemas se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o de Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifican el polipéptido se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y se pueden colocar bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción satisfactoria de la secuencia que codifica el polipéptido inactivará el gen de polihedrina y producirá virus recombinante que carece de la proteína de recubrimiento. Los virus recombinantes se pueden usar entonces para infectar células de, por ejemplo, S. frugiperda o Trichoplusia larvae, en las que se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 :3224-3227 (1994)).

En células huésped de mamífero generalmente hay disponibles numerosos sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en los que como vector de expresión se usa un adenovirus, las secuencias que codifican un polipéptido de interés se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción del adenovirus que consista en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células huésped infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Además, se pueden usar potenciadores de la transcripción, tal como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresión en células huésped de mamífero. Procedimientos y protocolos para trabajar con vectores de adenovirus se repasan en Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Referencias adicionales sobre el uso de vectores de adenovirus se pueden encontrar en Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

También se pueden usar señales de iniciación específicas para conseguir una traducción más eficaz de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Tales señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en las que las secuencias codificadoras del polipéptido, su codón de iniciación y sus secuencias cadena arriba se insertan en el vector de expresión adecuado, pueden no ser necesarias las señales adicionales de control de la transcripción o de la traducción. No obstante, en los casos en los que solo se inserta la secuencia codificadora, o un fragmento de la misma, se deberán proporcionar señales exógenas de control de la traducción (incluido el codón de iniciación ATG). Además, el codón de iniciación deberá estar en el correcto marco de lectura para garantizar la traducción de todo el inserto. Los elementos exógenos traduccionales y los codones de iniciación pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de potenciadores que son adecuados para el sistema celular concreto que se use, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf. y col., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Además, una cepa de célula huésped se puede escoger por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada del modo deseado. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, entre otras, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro” de la proteína también se puede usar para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correctas. Diferentes células huésped, tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales, se pueden escoger para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña.

Para la producción a largo plazo y con un rendimiento alto de proteínas recombinantes, generalmente se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable un polinucleótido de interés se pueden transformar usando vectores de expresión que pueden contener varios orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógena y un gen de un marcador seleccionable en el mismo vector o en otro diferente. Tras la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. La proliferación de clones resistentes de células transformadas de forma estable se puede realizar usando técnicas de cultivo tisular adecuadas al tipo de célula.

Para recuperar las líneas celulares transformadas se puede usar cualquier número de sistemas de selección. Estos incluyen, entre otros, los genes de la timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., Cell 11:223-32 (1977)) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22:817-23 (1990)), que se pueden emplear en células tk.sup.-o aprt.sup.-, respectivamente. Asimismo se puede usar resistencia a antimetabolitos, a antibióticos o a herbicidas como la base de la selección; por ejemplo, dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia al clorosulfurón y a la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como las antocianinas, p-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, siendo ampliamente usados no solo para identificar los transformantes sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).

Aunque la presencia/ausencia de expresión de un gen marcador sugiere que también está presente el gen de interés, puede ser necesario confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, si la secuencia que codifica un polipéptido se inserta dentro de una secuencia del gen marcador, las células recombinantes que contienen secuencias se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, se puede introducir un gen marcador en tándem con una secuencia que codifique un polipéptido bajo el control de un promotor sencillo. La expresión del gen marcador como respuesta a la inducción o selección normalmente indica la expresión del gen en tándem también.

Como alternativa, las células huésped que contienen y expresan una secuencia polinucleotídica deseada se pueden identificar mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, entre otros, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas, que incluyen tecnologías de membrana, solución o basadas en circuitos para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína.

En la técnica se conocen diversos protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados en polinucleótidos, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos del producto. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Para algunas aplicaciones se puede preferir un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales usando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos no interferentes sobre un polipéptido dado, pero también se puede emplear un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen en, entre otros lugares, Hampton y col., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Maddox y col., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).

Los expertos en la técnica conocen una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación, y se pueden usar en diversos ensayos con ácido nucleico y aminoácidos. Entre los medios para producir sondas de hibridación o de PCR marcadas para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos se incluyen oligomarcaje, traslación de muesca, marcaje del extremo libre o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, se pueden clonar en un vector las secuencias o cualquier porción de las mismas para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición una ARN polimerasa adecuada, tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden realizar usando diversos kits disponibles comercialmente. Entre las moléculas indicadoras o marcadores adecuados que pueden usarse se incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Las células huésped transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida mediante una célula recombinante puede secretarse o estar contenida en el interior de la célula dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, se pueden diseñar vectores de expresión que contienen polinucleótidos de modo que contengan secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Se pueden usar otras construcciones recombinantes para unir las secuencias que codifican un polipéptido de interés a una secuencia nucleotídica que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles. Tales dominios que facilitan purificación incluyen, entre otros, péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio usado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de secuencias conectoras que se pueden escindir tales como las específicas del factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado se puede usar para facilitar la purificación. Uno de estos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 restos de histidina que preceden a la tiorredoxina o un sitio de escisión para enterocinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados) como se describe en Porath y col., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992), mientras que el sitio de escisión de la enterocinasa proporciona un medio de purificación del polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. Un análisis de vectores que contienen proteínas de fusión se proporciona en Kroll y col., DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993)).

COMPOSICIONES POLIPEPTÍDICAS

Generalmente, un polipéptido de uso en la divulgación (por ejemplo, las proteínas CDTa, CDTb, Toxina A y Toxina B de Clostridium difficile) será un polipéptido aislado (es decir, separado de los componentes con los que normalmente se encuentra en la naturaleza).

Por ejemplo, una proteína de origen natural está aislada si está separada de algunos o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferentemente, dichos polipéptidos tienen una pureza de al menos aproximadamente 90 %, más preferentemente de al menos aproximadamente 95 % y, lo más preferentemente, de al menos aproximadamente 99 %. Un polinucleótido se considera aislado si, por ejemplo, está clonado en un vector que no forma parte del entorno natural.

Los polipéptidos se pueden preparar usando cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de ADN como se ha descrito anteriormente se pueden preparar fácilmente a partir de las secuencias de ADN usando cualquiera de diversos vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica. La expresión se puede conseguir en cualquier célula huésped adecuada que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Entre las células huésped adecuadas se incluyen procariotas, levaduras y células eucariotas superiores, tales como células de mamífero y células vegetales. Preferentemente, las células huésped usadas son E. coli, levaduras o una línea celular de mamífero tal como COS o CHO. Los sobrenadantes de sistemas de huésped/vector adecuados que secretan proteína o polipéptido recombinante en el medio de cultivo se pueden concentrar primero usando un filtro comercialmente disponible. Tras la concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Por último, se pueden usar una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante.

Los polipéptidos para usar en la divulgación, fragmentos inmunogénicos de los mismos y otras variantes que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos y, generalmente, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, también se pueden generar por medios sintéticos usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos se pueden sintetizar usando cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, tal como el procedimiento de síntesis de fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963). El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible comercialmente en proveedores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) y se pueden manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En ciertas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos como se describe en el presente documento o que comprende al menos un polipéptido como se describe en el presente documento y una secuencia no relacionada, ejemplos de dichas proteínas incluyen las proteínas del tétanos, tuberculosis y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute y col., New Engl. J. Med. 336:86-91 (1997)). Un compañero de fusión puede, por ejemplo, ayudar a proporcionar epítopos de linfocitos T auxiliares (un compañero de fusión inmunológico), preferentemente epítopos de linfocitos T auxiliares por seres humanos, o puede ayudar en la expresión de la proteína (un potenciador de la expresión) con rendimientos más elevados que la proteína recombinante nativa. Determinados compañeros de fusión preferidos son compañeros de fusión tanto inmunológicos como potenciadores de la expresión. Se pueden seleccionar otros compañeros de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir dirigir la proteína a los compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión más incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.

Las proteínas de fusión se pueden preparar generalmente usando técnicas convencionales, incluida conjugación química. Preferentemente, una proteína de fusión se expresa como proteína recombinante, permitiendo la producción de niveles incrementados, respecto a una proteína no fusionada, en un sistema de expresión. En resumen, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos pueden ensamblarse por separado y ligarse en un vector de expresión adecuado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico está ligado, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico de modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción en una única proteína de fusión que conserva la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Se puede usar una secuencia conectora peptídica para separar el primero y el segundo componentes polipeptídicos una distancia suficiente para garantizar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia conectora peptídica se incorpora en la proteína de fusión usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Las secuencias conectoras peptídicas adecuadas se pueden elegir basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primero y el segundo polipéptido; y (3) la falta de restos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Secuencias conectoras peptídicas preferidas contienen restos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también se pueden usar en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden usar de forma útil como conectores incluyen los divulgados en Maratea y col., Gene 40:39-46 (1985); Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); la patente de EE.UU. N° 4.935.233 y la patente de EE.UU. N° 4.751.180. La secuencia conectora puede tener en general una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. Las secuencias conectoras no se requieren cuando el primero y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos no esenciales en el extremo N que se pueden usar para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Adyuvantes

En una realización adicional de cualquiera de los aspectos de la divulgación, la composición inmunogénica comprende además un adyuvante. En una realización, el adyuvante comprende hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. Como alternativa, la composición inmunogénica de la invención puede comprender un adyuvante sin aluminio, la composición inmunogénica está formulada con adyuvante que carece de aluminio o de sales de aluminio, es decir un adyuvante o sistema adyuvante que carece de aluminio.

En ciertas realizaciones, la composición inmunogénica está formulada con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa presentada en forma de un liposoma. El adyuvante puede comprender además un lipopolisacárido. El adyuvante puede incluir QS21. Por ejemplo, en una realización, el adyuvante contiene QS21 en una formulación liposómica. En una realización, el sistema adyuvante incluye 3D-MPL y QS21. Por ejemplo, en una realización, el adyuvante contiene 3D-MPL y QS21 en una formulación liposómica. Opcionalmente, el sistema adyuvante también contiene colesterol. En una realización específica, el adyuvante incluye QS21 y colesterol. Opcionalmente, el sistema adyuvante contiene 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DOPC). Por ejemplo, en un sistema adyuvante específico contiene colesterol, DOPC, 3D-MPL y QS21.

En un ejemplo específico, la composición inmunogénica incluye un adyuvante formulado en una dosis que incluye: de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 mg de colesterol; de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 2 mg de DOPC; de aproximadamente 10 |jg a aproximadamente 100 |jg de 3D-MPL; y de aproximadamente 10 |jg a aproximadamente 100 jg de QS21. En otro ejemplo específico, la composición inmunogénica incluye un adyuvante formulado en una dosis que incluye: de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 mg de colesterol; de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 2 mg de DOPC; de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 70 jg de 3D-MPL; y de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 70 jg de QS21. En una formulación específica, el adyuvante está formulado en una única dosis que contiene: aproximadamente 0,25 mg de colesterol; aproximadamente 1,0 mg de DOPC; aproximadamente 50 jg de 3D-MPL; y aproximadamente 50 jg de QS21. En otras realizaciones, la composición inmunogénica está formulada con una dosis fraccional (es decir, una dosis que es una fracción de las formulaciones de dosis única precedentes, tal como la mitad de la cantidad precedente de los componentes (colesterol, DOPC, 3D-MPL y QS21), % de la cantidad precedente de los componentes u otra dosis fraccional (p. ej., 1/3, 1/6, etc.) de la cantidad precedente de los componentes.

En una realización, las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la divulgación incluyen un adyuvante que contiene combinaciones de lipopolisacárido y saponinas de Quillaja que se han divulgado anteriormente, por ejemplo en el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando un lipopolisacárido (3D-MPL) se combinó con una saponina de Quillaja (QS21).

El adyuvante puede comprender además oligonucleótidos inmunoestimuladores (por ejemplo, CpG) o un vehículo.

Una saponina particularmente adecuada para usar en la presente divulgación es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol de Sudamérica Quillaja Saponaria Molina y Dalsgaard y col. en 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, p243-254) describieron por primera vez que tenía actividad adyuvante. Mediante HPLC se han aislado fragmentos purificados de Quil A que conservan actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (documento EP 0362 278), por ejemplo QS7 y QS21 (también conocidas como QA7 y QA21). La QS21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, células TH1 y una respuesta de anticuerpos IgG2a predominante, y es una saponina preferida en el contexto de la presente divulgación.

Cuando el adyuvante comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa presentada en forma de un liposoma, el adyuvante puede comprender además un esterol. Idóneamente, el esterol se proporciona a una relación de saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p, tal como de 1:1 a 1:10 p/p; o 1:1 a 1:5 p/p.

En una realización específica, la QS21 se proporciona en su composición menos reactogénica, en la que se inactiva con un esterol exógeno, tal como, por ejemplo, colesterol. Existen varias formas concretas de composiciones menos reactogénicas en las que QS21 se inactiva con un colesterol exógeno. En una realización específica, la saponina/esterol está en forma de una estructura de liposoma (documento WO 96/33739, Ejemplo 1). En esta realización, los liposomas contienen idóneamente un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que es, idóneamente, no cristalino a temperatura ambiente, por ejemplo, fosfatidilcolina de yema de huevo, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) o dilaurilfosfatidilcolina. Los liposomas pueden también contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura de liposoma-QS21 para liposomas compuestos por lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado es, idóneamente, 1-20 % peso/peso, preferentemente 5-10 %. La proporción entre esterol y fosfolípidos es 1 50 % (mol/mol), idóneamente 20-25 %.

Esteroles adecuados incluyen p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una realización particular, la composición adyuvante comprende colesterol como esterol. Estos esteroles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo el colesterol se divulga en el Índice de Merkc, 11a Ed., página 341, como esterol natural que se encuentra en la grasa animal.

Cuando la fracción de saponina activa es QS21, la proporción de QS21:Esterol será normalmente del orden de 1:100 a 1:1 (peso/peso), idóneamente entre 1:10 a 1:1 (peso/peso) y, preferentemente, de 1:5 a 1:1 (peso/peso). Idóneamente hay un exceso de colesterol, siendo la proporción QS21:esterol de al menos 1:2 (p/p). En una realización, la proporción QS21:esterol es de 1:5 (p/p). El esterol es, idóneamente, colesterol.

En una realización, la divulgación proporciona una dosis de una composición inmunogénica que comprende saponina inmunológicamente activa, preferentemente QS21, a nivel de aproximadamente 1 - aproximadamente 70 |jg por dosis, por ejemplo, a una cantidad de aproximadamente 50 |jg.

En una realización, la divulgación proporciona una dosis de una composición inmunogénica que comprende saponina inmunológicamente activa, preferentemente QS21, a nivel de 60 jg o menos, por ejemplo entre 1 y 60 jg . En una realización, la dosis de la composición inmunogénica comprende QS21 a un nivel de aproximadamente alrededor de 50 jg , por ejemplo entre 45 y 55 jg , idóneamente entre 46 y 54 jg o entre 47 y 53 jg o entre 48 y 52 jg o entre 49 y 51 jg , o 50 jg .

En otra realización, la dosis de la composición inmunogénica comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 25 jg , por ejemplo entre 20 y 30 jg , idóneamente entre 21 y 29 jg o entre 22 y 28 jg o entre 23 y 27 jg o entre 24 y 26 jg , o 25 jg .

En otra realización, la dosis de la composición inmunogénica comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 10 jg , por ejemplo entre 5 y 15 jg , idóneamente entre 6 y 14 jg , por ejemplo entre 7 y 13 jg o entre 8 y 12 jg o entre 9 y 11 jg , o 10 jg .

Específicamente, un volumen de dosis de vacuna de 0,5 ml contiene 25 jg o 50 jg de QS21 por dosis. Específicamente, un volumen de dosis de vacuna de 0,5 ml contiene 50 jg de QS21 por dosis.

En composiciones que comprenden un lipopolisacárido, el lipopolisacárido puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1 - aproximadamente 70 jg por dosis, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 50 jg .

El lipopolisacárido puede ser un derivado no tóxico del lípido A, particularmente monofosfosrilo lípido A o, más particularmente, monofosfosrilo lípido A 3-desacilado (3D - MPL).

El 3D-MPL se comercializa con el nombre MPL de GlaxoSmithKline Biologicals S.A. y a lo largo de todo el documento se denomina MPL o 3D-MPL. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.436.727, 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094. 3D-MPL estimula principalmente las respuestas de linfocitos T CD4+ con un fenotipo de IFN-y (Th1). El 3D-MPL se puede producir de acuerdo con los procedimientos divulgados en el documento GB 2 220 211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforilo lípido A 3-desacilado con cadenas 3,4,5 o 6 aciladas. Preferentemente, en las composiciones de la presente invención se usa 3D-MPL de partícula pequeña. El 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula tal que se puede esterilizar por filtrado a través de un filtro de 0,22 |im. Dichas preparaciones se describen en el documento WO 94/21292.

Por tanto, la invención proporciona una dosis de una composición inmunogénica que comprende lipopolisacárido, preferentemente 3D-MPL, a nivel de 75 |jg o menos, por ejemplo entre 1 y 60 |jg.

En una realización, la dosis de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 50 jg , por ejemplo entre 45 y 55 jg , idóneamente entre 46 y 54 jg o entre 47 y 53 jg o entre 48 y 52 jg o entre 49 y 51 jg , o 50 jg .

En una realización, la dosis de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 25 jg , por ejemplo entre 20 y 30 jg , idóneamente entre 21 y 29 jg o entre 22 y 28 jg o entre 23 y 27 jg o entre 24 y 26 jg , o 25 jg .

En otra realización, la dosis de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 jg , por ejemplo entre 5 y 15 jg , idóneamente entre 6 y 14 jg , por ejemplo entre 7 y 13 jg o entre 8 y 12 jg o entre 9 y 11 jg , o 10 jg .

En una realización, el volumen de la dosis es de 0,5 ml. En una realización adicional, la composición inmunogénica está en un volumen adecuado para una dosis cuyo volumen es superior a 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, la dosis humana está entre 1 ml y 1,5 ml.

Específicamente, un volumen de dosis de vacuna de 0,5 ml contiene 25 jg o 50 jg de 3D-MPL por dosis. Específicamente, un volumen de dosis de vacuna de 0,5 ml contiene 50 jg de 3D-MPL por dosis.

La dosis de la composición inmunogénica de acuerdo con cualquier aspecto de la divulgación idóneamente hace referencia a la dosis humana. Por la expresión “dosis humana” se entiende una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano. En general, esta está entre 0,3 y 1,5 ml. En una realización, una dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, una dosis humana es superior a 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, una dosis humana está entre 1 ml y 1,5 ml.

Las composiciones adecuadas de la divulgación son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sin MPL (como se describe en el documento WO 96/33739) y después se añade MPL, idóneamente como partículas pequeñas de menos de 100 nm o partículas que son susceptibles a filtración en esterilidad a través de una membrana de 0,22 jm . Por tanto, el MPL no está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL externo). Las composiciones en las que el MPL está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL interno) también forman un aspecto de la invención. El polipéptido que comprende un fragmento de la toxina A de C. difficile y/o un fragmento de la toxina B de C. difficile puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula.

En una realización específica, QS21 and 3D-MPL están presentes a la misma concentración final por dosis de la composición inmunogénica, es decir la proporción de QS21:3D-MPL es 1:1. En un aspecto de la presente realización, una dosis de la composición inmunogénica comprende un nivel final de 25 jg de 3D-MPL y 25 jg de QS21 o 50 jg de 3D-MPL y 50 jg de QS21.

En una realización, el adyuvante incluye una emulsión de aceite en agua. En una realización, el adyuvante comprende una emulsión de aceite en agua, en el que la emulsión de aceite en agua comprende un aceite metabolizable, un tocol y un emulsionante. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua puede incluir una fase oleosa que incorpora un aceite metabolizable y un componente en fase oleosa adicional, tal como un tocol. La emulsión de aceite en agua puede también contener un componente acuoso, tal como una solución salina tamponada (p. ej., solución salina tamponada con fosfato). Además, la emulsión de aceite en agua normalmente contiene un emulsionante. En una realización, el aceite metabolizable es escualeno. En una realización, el tocol es alfa-tocoferol. En una realización, el emulsionante es un emulsionante tensioactivo no iónico (tal como monooleato de polioxietilensorbitán, Polysorbate® 80, TWEEN80™). En realizaciones de ejemplo, la emulsión de aceite en agua contiene escualeno y alfa-tocoferol en una proporción que es igual o inferior a 1 (peso/peso).

El aceite metabolizable en la emulsión de aceite en agua puede estar presente en una cantidad de 0,5-10 mg. El tocol en la emulsión de aceite en agua puede estar presente en una cantidad de 0,5-11 mg. El agente emulsionante puede estar presente en una cantidad de 0,4 - 4 mg.

Con el fin de que cualquier composición de aceite en agua sea adecuada para administración a seres humanos, la fase oleosa del sistema de emulsión tiene que comprender un aceite metabolizable. El significado de la expresión aceite metabolizable es bien conocido en la técnica. Metabolizable se puede definir como “capaz de ser transformado mediante metabolismo” (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a edición (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintético, que no es tóxico para el receptor y es capaz de ser transformado mediante metabolismo. Nueces, semillas y granos son fuentes habituales de aceites vegetales. Los aceites sintéticos también forman parte de la presente invención y pueden incluir aceites disponibles comercialmente tales como NEOBEE® (triglicéridos de ácido caprílico/cáprico elaborados usando glicerol de fuentes de aceite vegetal y ácidos grasos de cadena media (TCM) de aceites de coco o de palma) y otros. Un aceite metabolizable particularmente adecuado es escualeno. El escualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno) es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón y en cantidades menores en el aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz y levadura, y es un aceite particularmente preferido para usar en la presente invención. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un intermedio en la biosíntesis de colesterol (Índice de Merck, 10a Edición, entrada n° 8619).

Idóneamente, el aceite metabolizable está presente en la composición adyuvante en una cantidad de 0,5-10 mg, preferentemente 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 o 5-6 mg (p. ej., 2-3, 5-6 o 9-10 mg), específicamente aproximadamente 5,35 mg o aproximadamente 2,14 mg por dosis.

En la técnica se conocen bien los tocoles y se describen en el documento EP0382271. Idóneamente, el tocol es atocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E). Dicho tocol está presente idóneamente en una cantidad de 0,5-11 mg, preferentemente 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 mg (p. ej., 10-11, 5-6, 2,5-3,5 o 1-3 mg). En una realización específica, el tocol está presente en una cantidad de aproximadamente 5,94 mg o aproximadamente 2,38 mg por dosis.

La emulsión de aceite en agua comprende además un agente emulsionante. El agente emulsionante puede ser, idóneamente, monooleato de polioxietilensorbitán. En una realización concreta, el agente emulsionante puede ser Polysorbate® 80 (monooleato de polioexietilen (20) sorbitán) o Tween® 80.

Dicho agente emulsionante está presente en la composición adyuvante idóneamente en una cantidad de 0,1-5, 0,2-5, 0,3-4, 0,4-3 o 2-3 mg (p. ej., 0,4-1,2, 2-3 o 4-5 mg) del agente emulsionante. En una realización específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad de aproximadamente 0,97 mg o aproximadamente 2,425 mg.

En una realización, las cantidades de los componentes específicos presentes en la composición son las cantidades presentes en una dosis humana de 0,5 ml. En una realización adicional, la composición inmunogénica está en un volumen adecuado para una dosis humana cuyo volumen es superior a 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, la dosis humana está entre 1 ml y 1,5 ml.

Cuando el adyuvante está en forma líquida y se va a combinar con una forma líquida de una composición polipeptídica, la composición adyuvante en una dosis humana será una fracción del volumen final previsto de la dosis humana, por ejemplo aproximadamente la mitad del volumen final previsto de la dosis humano, por ejemplo, un volumen de 350 pl para una dosis humana prevista de 0,7 ml o un volumen de 250 pl para una dosis humana prevista de 0,5 ml. La composición adyuvante está diluida cuando se combina con la composición de antígeno polipeptídico para proporcionar la dosis humana final de la vacuna. El volumen final de dicha dosis variará, por supuesto, en función del volumen inicial de la composición adyuvante y el volumen de la composición de antígeno polipeptídico añadido a la composición adyuvante. En una realización alternativa, se usa un adyuvante líquido para reconstituir una composición polipeptídica liofilizada. En esta realización, la dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se añade al vial que contiene la composición polipeptídica liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml.

El procedimiento de producción de las emulsiones de aceite en agua es bien conocido por el experto en la técnica. Habitualmente, el procedimiento comprende mezclar la fase oleosa que contiene tocol con un tensioactivo tal como una solución de PBS/monooleato de polioxietilensorbitán, seguido de homogeneización usando un homogeneizador. Quedaría claro para un experto en la técnica que un procedimiento que comprende pasar la mezcla dos veces a través de una aguja con jeringa sería adecuado para homogeneizar volúmenes pequeños de líquido. Igualmente, el experto en la técnica podría adaptar el procedimiento de emulsificación en un microfluidizador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 pases durante un periodo de 2 minutos a una presión máxima de entrada de 6 bares (presión de salida de aproximadamente 850 bares)) para producir volúmenes de emulsión más pequeños o más grandes. La adaptación se podrá conseguir mediante experimentación de rutina, que comprende la medición de la emulsión resultante hasta alcanzar una preparación con gotas de aceite del diámetro requerido.

En una emulsión de aceite en agua, el aceite y el emulsionante deberían estar en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Preferentemente, los sistemas de emulsión de aceite en agua de la presente invención tienen un tamaño de gota del aceite pequeño, en el orden de los submicrómetros. Idóneamente, los tamaños de la gota estarán en el intervalo de 120 a 750 nm, más preferentemente tamaños de 120 a 600 nm de diámetro. Lo más preferentemente, la emulsión de aceite en agua contiene gotas de aceite de las que al menos el 70 % por intensidad tienen un diámetro inferior a 500 nm, más preferentemente al menos el 80 % por intensidad tienen un diámetro inferior a 300 nm, más preferentemente al menos el 90 % por intensidad tienen un diámetro en el intervalo de 120 a 200 nm.

En una realización, la composición inmunogénica no es 3|jg o 10 |jg de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 7 combinada con un adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua que tiene 0,125 ml de la emulsión SB62 (volumen total), 5,35 mg de escualeno, 5,94 mg de DL-a-tocoferol y 2,425 mg de polisorbato 80 por dosis de 0,5 ml. En una realización, la composición inmunogénica no es 3 jg o 10 jg de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 7 combinada con un adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, 5,35 mg de escualeno, 5,94 mg de DL-a-tocoferol y 2,425 mg de polisorbato 80 por dosis de 0,5 ml. En una realización, la composición inmunogénica no contiene un adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua que tiene escualeno, DL-a-tocoferol y polisorbato 80.

Composiciones inmunogénicas y vacunas de la invención

En una realización, la composición inmunogénica tiene un volumen de 0,5 a 1,5 ml.

En una realización, la composición inmunogénica comprende además antígenos adicionales. En una realización, los antígenos adicionales son antígenos derivados de una bacteria seleccionada del grupo que consiste en S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, M. catarrhalis, Clostridium tetani (tétanos), Corynebacterium diphtheria (difteria), Bordetella pertussis (pertussis), S. epidermidis, enterococos, S. aureus y Pseudomonas aeruginosa. En una realización adicional, la composición inmunogénica de la invención puede comprender otros antígenos de C. difficile, por ejemplo, las proteínas de la capa S (documento WO01/73030). Opcionalmente, la composición inmunogénica comprende además un sacárido de C. difficile.

Además, se proporciona una vacuna que comprende una composición inmunogénica de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las preparaciones de vacunas que contienen composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden usar para proteger a un mamífero susceptible a la infección por C. difficile o para tratar a un mamífero con una infección C. difficile, administrando dicha vacuna por medio de una vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis única, los componentes de la misma también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o a tiempos diferentes (por ejemplo, los conjugados de sacáridos neumocócicos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración de cualquier componente de la proteína bacteriana de la vacuna para coordinar las respuestas inmunitarias unas con respecto de otras). Además de una única vía de administración, se pueden usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, los sacáridos o conjugados sacáridos se pueden administrar por vía intramuscular (IM) o intradérmica (ID) y las proteínas bacterianas se pueden administrar por vía intranasal (IN) o intradérmica (ID). Además, las vacunas de la invención se pueden administrar IM para las dosis de sensibilización e IN para las dosis de refuerzo.

El contenido de toxinas en la vacuna normalmente estará en el intervalo de 1-250 jg , preferentemente 5-50 jg , más habitualmente en el intervalo de 5-25 jg . Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente. La preparación de las vacunas está descrita en general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M. F. y Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nueva York). La encapsulación en liposomas la describe Fullerton, en la patente de EE.UU. 4.235.877.

En un aspecto de la invención se proporciona un kit de vacuna, que comprende un vial que contiene una composición inmunogénica de la invención, opcionalmente en forma liofilizada y que además comprende un vial que contiene un adyuvante como se describe en el presente documento. Se ha concebido que en este aspecto de la invención, el adyuvante se use para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada.

Un aspecto adicional de la divulgación es un procedimiento de prevenir o tratar la infección por C. difficile que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición inmunogénica o vacuna o kit de la invención. En una realización, se proporciona un procedimiento de prevenir o tratar episodios primarios y/o recurrentes de la infección por C. difficile, que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición inmunogénica o vacuna o kit de la invención.

En una realización de la invención se proporciona una composición inmunogénica o vacuna de la invención para usar en el tratamiento o prevención de la enfermedad por C. difficile. En una realización adicional de la invención se proporciona una composición inmunogénica o vacuna de la invención para usar en el tratamiento o prevención de la enfermedad causada por una cepa de C. difficile seleccionada del grupo que consiste en 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 y 571. Preferentemente, la cepa es la cepa 078.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un uso de una composición inmunogénica o vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la enfermedad por C. difficile. En una realización adicional, la enfermedad es una enfermedad causada por una cepa de C. difficile seleccionada del grupo que consiste en 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 y 571. Preferentemente, la cepa es la cepa 078. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento de prevención o tratamiento de la enfermedad por C. difficile, que comprende administrar la composición inmunogénica de la invención o la vacuna de la invención a un sujeto mamífero tal como un sujeto humano. En una realización adicional, la enfermedad es una enfermedad causada por una cepa de C. difficile seleccionada del grupo que consiste en 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 y 571. Preferentemente, la cepa es la cepa 078.

General

“Alrededor de” o “aproximadamente” se definen con dentro de un 10 % más o menos de la cifra dada para los fines de la invención.

Los inventores pretenden que las expresiones “que comprende”, “comprenden” y “comprende”, en el presente documento, puedan opcionalmente sustituirse con las expresiones “que consiste en”, “consisten en" y “consiste en”, respectivamente, en cada caso. El término “comprende” significa “incluye”. Por tanto, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como “comprenden” o “que comprende” implica la inclusión de un compuesto o composición indicado (p. ej., ácido nucleico, polipéptido, antígeno) o etapa o grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro compuesto, composición, etapas o grupos de los mismos. La abreviatura, “e. g.” (p. ej.) deriva del latín exempli gratia y se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por tanto, la abreviatura, “e. g.” (p. ej.) es sinónimo de la expresión "por ejemplo". La numeración de aminoácidos usada en el presente documento procede de las secuencias para CDTa, CDTb, Toxina A y Toxina B presentadas en el presente documento como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 que se deben considerar secuencias de referencia para estas proteínas.

Las realizaciones en el presente documento relacionadas con “composiciones de vacuna” de la invención también son aplicables a realizaciones relacionadas con “composiciones inmunogénicas” de la invención y viceversa. A menos que se explique de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la que concierne esta divulgación. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y col. (eds), The Encyclopedia o f Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd; 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los términos singulares “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De un modo similar, con la palabra “o” se pretende incluir “y”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término “pluralidad” se refiere a dos o más. Además debe entenderse que todos los tamaños de las bases o los tamaños de los aminoácidos y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, proporcionados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, pueden ser aproximadas.

Con el fin de que la presente invención se entienda mejor, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención de ningún modo.

Ejemplos

El adyuvante AS01B al que se hacer referencia es un adyuvante que tiene 50 |jg de QS21 presentado en forma de un liposoma, 50 jg de 3D-MPL, 0,25 mg de colesterol y 1,0 mg de DOPC por cada 0,5 ml de dosis. Una dosis de 50 j l adecuada para inmunizar ratones contiene 5 jg de QS21, 5 jg de 3D-MPL, 0,025 mg de colesterol y 0,1 mg de DOPC.

Ejemplo 1: Diseño de antígenos de toxinas binarias

La toxina binaria (otro nombre: toxina de ADP-ribosiltransferasa) está compuesta por dos componentes: el componente enzimático, denominado CDTa y el transporte y componente de unión, denominado CDTb.

Basándose en los datos de la bibliografía y la estructura tridimensional conocida de CDTa (J. Biol. Chem. 2009, vol.

284: 28713-28719), esta proteína podría dividirse en dos dominios. El dominio N terminal se une a CDTb y el dominio C terminal contiene la actividad enzimática. Ambos dominios están unidos por un péptido flexible.

Basándose en datos de bibliografía e información disponible para otros componentes B de otras toxinas binarias bacterianas, CDTb podría dividirse en cinco dominios. El primero es el prodominio, su escisión por una enzima que tiene una actividad de quimotripsina permite la heptamerización de la proteína madura. El segundo dominio permite la unión con CDTa. El tercer y el cuarto están implicados en la oligomerización y la inserción en membrana. Finalmente, el último dominio es el dominio de unión a receptor de la célula huésped.

Ejemplo 1a: Diseño de antígenos de CDTa

Para permitir que actúe con CDTa y CDTb juntos, debe inactivarse CDTa. Se evaluaron dos posibilidades de inactivación. La primera es el diseño de mutantes de CDTa que anulan la actividad enzimática y la segunda es el uso del dominio N terminal de CDTa solo. Este último dominio permite la unión con CDTb y no contiene restos implicados en la actividad enzimática.

El primer conjunto de mutantes se diseñó basándose en la información bibliográfica (Infection & Immunity, 2001, vol.

69: 6004-6011). Los autores demostraron que las proteínas mutantes CDTa E428Q, E430Q, S388A y R345K tienen una actividad reducida significativa. Basándose en datos mostrados en la publicación, se prefieren dos mutaciones entre las cuatro: mutante de CDTa E428Q y E430Q. En la publicación, estos mutantes anulan completamente la actividad enzimática de CDTa. Para clasificar estos mutantes, se realizaron algunos análisis estructurales para estos restos: accesibilidad a superficie de los restos glutamato 428 (E428) y glutamao 430 (E430), efecto de sus mutaciones en la estructura tridimensional circundante. Basándose en estos análisis, el mutante de CDTa E428Q se eligió como mutación preferida y el mutante de CDTa E430Q se seleccionó como segunda elección. También se generó un mutante doble E428Q, E430Q para garantizar que se anule la actividad enzimática.

Se diseñó un segundo conjunto de mutantes debido a que los primeros resultados de citotoxicidad, obtenidos con el primer conjunto de mutantes, no fueron convincentes.

En este segundo conjunto, se diseñó un mutante de CDTa que contiene 7 mutaciones (incluyendo las dos mutaciones ya descritas). Todas estas mutaciones se diseñaron basándose en la información bibliográfica (disponible para CDTa o sus homólogos de Clostridium perfringens Ia) y análisis de estructuras tridimensionales. Todos los restos mutados se localizan alrededor del sitio catalítico de CDTa. Estos restos se han modificado para evitar la unión al ligando o moléculas de agua. Este “supermutante” de CDTa contiene las mutaciones R345A, Q350A, N385A, R402A, S388F, E428Q y E430Q.

Basándose en esta CDTa “supermutada”, se evaluaron otras dos variantes mutadas de CDTa para eliminar las mutaciones E428Q y E430Q (la construcción C108 contiene la mutación E430Q pero no la mutación E428Q, la construcción C107 no contiene ambas mutaciones).

Dominio N terminal de CDTa solo

Se ha descrito en la bibliografía (Infection & Immunity, 2001, vol. 69 : 6004-6011) que la CDTa1-240 es el fragmento de CDTa mínimo que aún permite una unión con Ib (componente B de toxina binaria de Clostridium perfringens). Este fragmento se ensayará en el laboratorio pero basándose en la estructura tridimensional conocida, se ha sugerido que este dominio probablemente no será óptimo con respecto al plegamiento correcto de este dominio de CDTa.

Se realizó diseño de antígenos basándose en la estructura tridimensional conocida (número de referencia del banco de datos de proteínas: 2WN4, J. Biol. Chem., 2009, vol. 284 : 28713-28719) para mejorar la expresión y el plegamiento de un dominio N terminal de CDTa aislado. En la estructura tridimensional, un péptido conector de ocho aminoácidos permite la separación entre los dominios N y C terminales de CDTa. Se diseñaron dos dominios N terminales de CDTa aislados, el primero contiene este péptido flexible y el segundo no.

CDTa: sumario de secuencias

Se presenta un sumario de todas las secuencias de CDTa en la tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo 1b: Diseño de antígenos de CDTb

CDTb madura

Para evitar la etapa de activación de quimotripsina en el procedimiento de CDTb, se intentó expresar solamente la proteína CDTb madura (sin su péptido señal y prodominio).

En la bibliografía (Protein Expression and Purification, 2010, vol. 74: 42-48), se describió que la CDTb madura comienza en la Leucina 210. Esta CDTb madura se denominó CDTb''.

Después de datos experimentales internos, parece que la CDTb activada comienza en la Serina 212. Este resultado fue apoyado por un análisis de una estructura modelada tridimensional de CDTb. Este modelo se construyó usando SwissModel (Bioinformatics, 2006, vol. 22: 195-201). El molde usado para el modelo de homología fue el componente B de Bacillus anthracis, denominado Antígeno Protector o PA (número de referencia del Banco de Datos de Proteínas: 3TEW).

Dominio de unión a receptor de CDTb solo

Dado el hecho de que una fusión que contiene solamente los dominios de unión a receptor de Toxina A y B es suficiente para inducir anticuerpos neutralizantes, se decidió producir y evaluar el dominio de unión a receptor de CDTb solo. El modelo de estructura tridimensional obtenido para CDTb es preciso para los cuatro primeros dominios de CDTb pero no para el dominio de unión al receptor (estos dominios de CDTb y PA son demasiado diferentes). Para diseñar construcciones que expresan solo este dominio, la parte C terminal del cuarto dominio se analizó en el modelo de estructura tridimensional para decidir dónde comenzará el último dominio.

Se diseñaron dos versiones del dominio de unión a receptor de CDTb. En la primera, este dominio comienza justo después de la estructura tridimensional modelada del cuarto dominio. En esta versión, el dominio de unión a receptor de CDTb probablemente tendrá un péptido flexible largo en su parte N terminal. La segunda versión comienza donde las estructuras predichas bidimensionales realizadas en la parte C terminal de CDTb (predicciones realizadas usando el programa Psipred, Bioinformatics, 2000, vol. 16: 404-405) se vuelven más compactas después de una falta de estructuras secundarias predichas. Esto podría indicar el comienzo de un nuevo dominio estructural. En esta segunda versión, no está presente ningún péptido flexible en la parte N terminal del dominio de unión a receptor de CDTb aislado.

Mutación del motivo de unión a Ca2+ de CDTb

Siguiendo la información de la bibliografía, las mutaciones en el dominio de unión a Ca2+ del componente B de la toxina Iota de Clostridium perfringens (Ib) anulan la unión con el componente A de esta toxina binaria (Ia). Estas mutaciones podrían ser muy interesantes en el caso de una composición de vacuna que contenga una mezcla de la proteína CDTb madura y una proteína CDTa de tipo silvestre.

Usando alineación de múltiples secuencias proteicas, estas mutaciones se localizaron en la secuencia de CDTb y se mutaron. Se refiere a los restos ASp220, Asp222 y Asp224. Se mutaron a restos de Ala.

Prodominio de CDTb

Para intentar reducir los problemas de degradación observados con C55 en gel, se evaluaron algunos ensayos de coexpresión. La hipótesis de trabajo para hacerlo es que mejora el plegamiento de la CDTb madura.

Se han propuesto dos límites de prodominio. El primero comienza en el resto 43 de CDTb (después de la escisión del péptido señal) y termina en el resto Met211 (dado que el primer resto determinado de forma experimental de la CDTb madura es Ser212). El segundo prodominio se diseñó basándose en la estructura tridimensional predicha de CDTb. El conector existente entre el prodominio y el primer dominio estructural de la proteína CDTb madura se retira en esta construcción.

CDTb: sumario de secuencias

Se presenta un sumario de todas las secuencias de CDTb en la tabla 2.

Tabla 2

(continuación)

Ejemplo 1c: Diseño de fusiones de CDTa - CDTb

Información de antecedentes

El objetivo de estas construcciones es obtener ambos componentes de la Toxina Binaria en un proceso. Podrían diseñarse muchos tipos diferentes de fusiones pero, como prueba de concepto, la primera fusión evaluada es la combinación del dominio N terminal de CDTa (denominado CDTaNADconector y CDTaNAD) con dominio de unión a receptor de CDTb (denominado CDTbCsh y CDTbClg).

Fusión CDTaNTterm - dom inio de unión a receptor de CDTb solamente

Sin datos experimentales adicionales acerca de cada compañero de la fusión, se iniciaron todas las posibles combinaciones pero siempre con el dominio de CDTa como primer compañero de la fusión.

En estas fusiones, el CDTaNADconector y los dominios de CDTaNAD tienen dos y un resto menos que los dominios aislados diseñados, respectivamente. Estos aminoácidos adicionales de CDTa se mantuvieron en los diseños aislados para evitar problemas potenciales durante el proceso de expresión.

Se presenta un sumario de todas las secuencias de fusión de CDTa-CDTb en la tabla 3.

Tabla 3

Ejemplo 1d: diseño de la fusión de ToxA-ToxB- dom inio de unión a receptor de CDTb

El objetivo de esta fusión es la combinación de dominios de unión a receptor de las tres toxinas principales de Clostridium difficile en una construcción.

Dado el hecho de que no se supone que los dominios F2 y de unión a receptor de CDTb adopten el mismo pliegue, debe usarse un conector / espaciador entre los dos compañeros de la fusión para permitir un plegamiento independiente correcto de los mismos. Se diseñaron dos fusiones.

En la primera (denominada F2_CDTbClg), la versión diseñada larga del dominio de unión a receptor se fusiona en la parte C terminal de F2. En esta versión, el péptido N terminal flexible largo del dominio de unión a receptor de CDTb actuará como espaciador.

En la segunda fusión (denominada F2_GG_NVCDTbCsh), la versión diseñada corta del dominio de unión a receptor se fusiona en la parte C terminal de F2. Para permitir un plegamiento correcto de los dos compañeros, debe aumentarse la longitud del conector creado en esta fusión. Para hacer esto, el dominio de unión a receptor de CDTb se extendió con dos restos naturales, asimismo se añadieron dos Glicinas exógenas entre F2 y la versión más larga de CDTbCsh.

Se presenta un sumario de todas las secuencias de fusión de F2-CDTb en la tabla 4.

Tabla 4

Ejemplo 2: Clonación, expresión y purificación de la proteína CdtA

Plásmido de expresión y cepa recombinante: CdtA de longitud completa

Los genes que codifican la proteína de longitud completa sin péptido señal de CdtA con y sin mutaciones (véase tablas posteriores) y un marcador His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción NdeI/Xhol usando procedimientos convencionales. Se generaron construcciones finales mediante la transformación de la cepa de E. coli HMS174 (DE3) o BLR (DE3) pLysS (C34) con cada vector de expresión recombinante por separado según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109 135.).

Cepa huésped:

HMS 174 (DE3). Las cepas HMS174 proporcionan la mutación recA en un fondo de K-12. Las cepas que tienen la designación (DE3) son lisogénicas para un profago A que contiene una ARN polimerasa T7 inducible por IPTG. Se diseñan lisógenos de ADE3 para expresión de proteínas a partir de vectores pET. Genotipo: F -recAI hsdR(r<12- mi<i2+) (RifR).

BLR(DE3) pLysS. BLR es un derivado de recA de BL21. Las cepas que tienen la designación (DE3) son lisogénicas para un profago A que contiene una ARN polimerasa T7 inducible por IPTG. Se diseñan lisógenos A DE3 para expresión de proteínas a partir de vectores pET. Esta cepa también es deficiente en las proteasas Ion y ompT, las cepas de pLysS expresan lisozima T7 que suprime adicionalmente la expresión basal de la ARN polimerasa T7 antes de la inducción.

Genotipo: cepa E.coli BLR::DE3, F- ompThsdSe(re' me') gal dcm (DE3) A(srl-recA)306::Tn 10 pLysS (CamR, TetR).

Expresión de las proteínas recombinantes:

Se desprendieron transformantes de E. coli de la placa de agar y se usaron para inocular 200 ml de caldo de cultivo LBT 1 % (p/v) de glucosa kanamicina (50 pg/ml) para obtener D.O.600 nm entre 0,1-0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

Cada cultivo de una noche se diluyó hasta 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 pg/ml) y se cultivaron a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

A D.O.600 nm de aproximadamente 0,6, los cultivos se enfriaron antes de inducir la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubó durante una noche a 23 °C, 250 RPM.

Después de inducción durante una noche (aproximadamente 16 horas), se evaluó la D.O.600 nm después de la inducción y el cultivo se centrifugó a 14.000 RPM durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

Plásmido de expresión y cepa recombinante: CdtA- extremo N

Los genes que codifican la proteína del extremo N, sin péptido señal de CdtA (véase tablas posteriores) y un marcador de His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción de Ndel/Xhol usando procedimientos convencionales. Se generaron construcciones finales mediante la transformación de la cepa de E. coli HMS174 (DE3) con cada vector de expresión recombinante por separado según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Cepa huésped:

HMS 174 (DE3). Las cepas HMS174 proporcionan la mutación recA en un fondo de K-12. Las cepas que tienen la designación (DE3) son lisogénicas para un profago A que contiene una ARN polimerasa T7 inducible por IPTG. Se diseñan lisógenos ADE3 para expresión de proteínas a partir de vectores pET.

Genotipo: F- recA I hsdR(r<¹²~ m<12+) (RifR).

Expresión de las proteínas recombinantes:

Se desprendieron transformantes de E. coli de la placa de agar y se usaron para inocular 200 ml de caldo de cultivo LBT 1 % (p/v) de glucosa kanamicina (50 pg/ml) para obtener D.O.600 nm entre 0,1 y 0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

A D.O.600 nm de aproximadamente 0,6, el cultivo se enfrió antes de inducir la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubó durante una noche a 23 °C, 250 RPM.

Purificación

El siguiente procedimiento se usó para purificar las construcciones C34, C44, C49, C50, C54, C67, C69, C107 y C110.

Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en tampones de bicina 20 mM o 50 mM (pH 7,5 o pH 8,0), que contenían NaCl 500 mM, TCEP 0 mM o 5 mM (Thermo Scientific Pierce, clorhidrato de (2-carboxietil)fosfina) y una mezcla de inhibidores de proteasa (Complete, Roche, sin EDTA). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa francesa de 3 X 137,86 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron por centrifugación a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

Las proteínas marcadas con 6-His se purificaron en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con el mismo tampón usado para la resuspensión bacteriana. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 20 mM o 50 mM (pH 7,5 o pH 8,0), que contenían NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, TCEP 5 mM. La elución se realizó usando un tampón de bicina 50 mM, pH 7,6, NaCl 500 mM, TCEP 1 mM e imidazol (250 mM o 500 mM).

Después de etapas de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) y concentración (Amicon Ultra 10kDa), el producto se cargó en cromatografía SeC (SUPERDEX™ 75 o 200) en tampón de bicina 20 mM o 50 mM (pH 7,5 o pH 8,0), NaCl 150 mM, TCEP 1 mM, para una etapa de purificación adicional.

Se seleccionaron fracciones que contenían antígeno de Cdta basándose en la pureza por SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteínas RC/DC de Lowry de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 pm y se almacenó a -80 °C.

Ejemplo 4 - Clonación, expresión y purificación de proteína CdtB de C. difficile

Plásmido de expresión y cepa recombinante: CdtB de longitud completa.

Los genes que codifican la proteína truncada de CdtB sin péptido señal (Pro-CdtB') y un marcador de His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pGEX-6p1 (GE Healthcare) usando los sitios de restricción BamHI/Xhol usando procedimientos convencionales. Este vector incluyó GST (Glutatión-S-transferasa) como compañero de fusión en el extremo N de CdtB'(GST-Pro-Cdtb'). La construcción final se generó mediante la transformación de la cepa de E. coli BL21 (DE3) con el vector de expresión recombinante según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Los genes que codifican la proteína truncada de CdtB sin péptido señal (Pro-CdtB': C38) y sin péptido señal y prodominio (CdtB'': C40 o C55) y un marcador His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción Ndel/Xhol usando procedimientos convencionales. Se generaron construcciones finales mediante la transformación de la cepa modificada de E. coli B834 (DE3) para C55 y BL21(DE3) para C38 y C40 con los vectores de expresión recombinante apropiados según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Cepa huésped

BL21(DE3). BL21(DE3) es un auxótrofo sin metionina derivado de B834. Las cepas que tienen la designación (DE3) son lisogénicas para un profago A que contiene una ARN polimerasa T7 inducible por IPTG. Los lisógenos A DE3 se diseñan para expresión de proteínas a partir de vectores pET. Esta cepa también es deficiente en las proteasas Ion y ompT.

Genotipo: Cepa de E. coliBL21 ::DE3, F- ompThsdSs(rB me') gal dcm (DE3).

B834 es la cepa parental para BL21. Estos huéspedes deficientes en proteasa son auxótrofos de metionina. Los lisógenos ADE3 se diseñan para expresión de proteínas a partir de vectores pET. Esta cepa también es deficiente en las proteasas Ion y ompT.

Modificación: Inclusión del gen de PGL para evitar la fosfogluconoilación en el locus de biotina (La cepa es auxótrofa para biotina):

Genotipo: Cepa B834 ::DE3, F- om pThsdSB(rB- mB-) gal dcm met (DE3) Modificación: A(bioA-bioD)::PGL Expresión de las proteínas recombinantes

Se desprendieron transformantes de E. coli de la placa de agar y se usaron para inocular 200 ml de caldo de cultivo LBT 1 % (p/v) de glucosa /- kanamicina (50 pg/ml) o ampicilina (100 pg/ml) para obtener D.O.600 nm entre 0,1-0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

Los cultivos de una noche se diluyeron a 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía /- kanamicina (50 pg/ml) o ampicilina (100 pg/ml) y se cultivaron a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

A una D.O. a 600 nm de aproximadamente 0,6, los cultivos se enfriaron antes de inducir la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubaron durante una noche a 23 °C, 250 RPM.

Después de las inducciones de una noche (aproximadamente 16 horas), se evaluaron las D.O. a 600 nm después de la inducción y los cultivos se centrifugaron a 14.000 RPM durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

Plásmido de expresión y cepa recombinante

Los genes que codifican la proteína truncada de CdtB sin prodominio CdtB madura, inactivación del sitio de unión a Ca++ (inhiben la unión de CdtA con CdtB) y un marcador de His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción Ndel/Xhol usando procedimientos convencionales. La construcción final se generó mediante la transformación de la cepa modificada de E.coli B834 (DE3) con el vector de expresión recombinante según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Cepa huésped

B834 es la cepa parental para BL21. Estos huéspedes deficientes en proteasa son auxótrofos de metionina. Se diseñan lisógenos A DE3 para expresión de proteínas a partir de vectores pET. Esta cepa también es deficiente en las proteasas Ion y ompT.

Genotipo: Cepa B834 ::DE3, F- ompThsdSB(rB~ mB') gal dcm met (DE3) Modificación: A(bioA-bioD)::PGL Expresión de las proteínas recombinantes:

Se desprendió un transformante de E. coli de la placa de agar y se usó para inocular 200 ml de caldo de cultivo LBT 1 % (p/v) de glucosa kanamicina (50 pg/ml) para obtener D.O.600 nm entre 0,1 y 0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

Este cultivo de una noche se diluyó hasta 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 pg/ml) y se cultivó a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

A una D.O. a 600 nm de aproximadamente 0,6, el cultivo se enfrió antes de inducir la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubó durante una noche a 23 °C, 250 RPM.

Después de la inducción durante una noche (aproximadamente 16 horas), se evaluó la D.O. a 600 nm después de la inducción y el cultivo se centrifugó a 14.000 RPM durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

Purificación

C37

El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de bicina 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCI 500 mM, TCEP 5 mM (Thermo Scientific Pierce, clorhidrato de (2-carboxietil)fosfina) y una mezcla de inhibidor de proteasa (Complete, Roche). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa Francesa de 3 X 137,86 MPa. Se separaron los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) por centrifugaron a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con el mismo tampón usado para la resuspensión bacteriana. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 50 mM pH 8,0, que contenía NaCl 150 mM, imidazol 25 mM, TCEP 1 mM. Se realizó elución usando un tampón de bicina a 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, imidazol 250 mM, TCEP 1 mM.

Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM y TCEP 1 mM, el producto se trató (durante una noche a 4 °C) con proteasa PreScission (GE-Healthcare) para escindir el marcador de GST. Después del tratamiento durante una noche, se añadió Tween 200,2 % a la mezcla de digestión.

Después la proteína se pasó a través de una columna de afinidad GST (GE GSTrap FF) pre-equilibrada con tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, TCEP 1 mM, Tween 20 0,2 % y glutatión reducido 20 mM, para retirar el marcador escindido, la proteína de fusión no escindida y la proteasa PreScission.

La proteína sin GST se recogió en el flujo continuo y se cargó de nuevo en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre equilibrada con tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, TCEP 1 mM, Tween 20 0,2 %. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, Tween 20 0,2 %, TCEP 1 mM e imidazol 10 mM. Se realizó elución usando un tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, Tween 200,2 %,TCEP 1 mM e imidazol 500 mM.

Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, TCEP 1 mM y Tween 200,2 %, el producto se trató con a-quimotripsina (de páncreas bovino - Sigma) seguido de tratamiento con inhibidor de tripsina (a partir de clara de huevo - Sigma). La activación completa de Cdtb mediante quimotripsina se supervisó mediante SDS-PAGE.

El producto completamente activado se cargó en cromatografía SEC (SUPERDEX™ 75) en tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 300 mM, TCEP 1 mM. Las fracciones que contenían antígeno de CdtB se seleccionaron basándose en la pureza mediante SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteínas de Lowry RC/DC de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 |jm y se almacenó a -80 °C.

C38

El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de bicina 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 150 mM, TCEP 5 mM (Thermo Scientific Pierce, clorhidrato de (2-carboxietil)fosfina), empigen 0,4 % y una mezcla de inhibidor de proteasa (Complete, Roche). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa Francesa de 3 X 137,86 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron mediante centrifugación a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con tampón de bicina 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 150 mM, TCEP 1 mM (Thermo Scientific Pierce, clorhidrato de (2-carboxietil)fosfina) y empigen 0,15 %. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 50 mM pH 8,0, que contenía NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, TCEP 1 mM y Tween 20 0,2 %. Se realizó elución usando un tampón de bicina 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, imidazol 500 mM, TCEP 1 mM y Tween 20 0,2 %.

Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, TCEP 1 mM y Tween 20 0,2 %, el producto se trató a-quimotripsina (de páncreas bovino - Sigma) seguido de tratamiento con un inhibidor de tripsina (a partir de clara de huevo - Sigma). La activación completa de Cdtb mediante quimotripsina se supervisó mediante SDS-PAGE.

El producto completamente activado se cargó en cromatografía SEC (SUPERDEX™ 75) en tampón de bicina 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM. Las fracciones que contenían proteína Cdtb se seleccionaron basándose en la pureza mediante SDS-PAGE y se cargaron de nuevo en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con tampón de bicina 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM, TCEP 1 mM. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 50 mM pH 8,0, que contenía NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, TCEP 1 mM. Se realizó elución usando un tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 300 mM, imidazol 500 mM, TCEP 1 mM.

Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, se determinó la concentración de proteína usando Ensayo de Proteínas RC/DC de Lowry de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 jm y se almacenó a -80 °C.

C40

El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de bicina 20 mM (pH 8,0), que contenían NaCI 500 mM, CaCh 5 mM y una mezcla de inhibidor de proteasa (Complete, Roche). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa Francesa de 3 X 137,86 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron mediante centrifugación a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 1 ml (GE) pre-equilibrada con tampón de bicina 20 mM (pH 8,0), que contenían NaCl 500 mM, CaCl25 mM. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 20 mM pH 8,0, que contenía NaCl 500 mM, CaCl25 mM e imidazol 5 mM. Se realizó elución usando un tampón de bicina 20 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, CaCl25 mM e imidazol 250 mM.

Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 20 mM pH 8,0, que contenía NaCl 150 mM, TCEP 1 mM el producto se cargó en cromatografía SEC (SUPERDEX™ 75) en el mismo tampón. Las fracciones que contenían antígeno de Cdtb se seleccionaron basándose en la pureza mediante SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteínas RC/DC de Lowry de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 pm y se almacenó a -80 °C.

C55

El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de bicina 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 150 mM, TCEP 5 mM (Thermo Scientific Pierce, clorhidrato de (2-carboxietil)fosfina), empigen 0,4 % y una mezcla de inhibidores de proteasa (Complete, Roche). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa Francesa 3 X 137,86 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron mediante centrifugación a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con tampón de bicina 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 150 mM, empigen 0,15 %, TCEP 1 mM. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 50 mM pH 8,0, que contenía NaCl 150 mM, Tween 200,2 %, imidazol 20 mM y TCEP 1 mM. Se realizó elución usando un tampón de bicina a 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, Tween 200,2 %, imidazol 500 mM y TCEP 1 mM.

Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 300 mM, TCEP 1 mM el producto se cargó en cromatografía Se C (SUPERDEX™ 75) en el mismo tampón. Las fracciones que contenían antígeno de CdtB se seleccionaron basándose en la pureza mediante SDS-PAGE. La concentración de proteínas se determinó usando Ensayo de Proteínas RC/DC de Lowry de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 pm y se almacenó a -80 °C.

Expresión de las proteínas recombinantes: dominio de unión a receptor de CdtB:

Plásmido de expresión y cepa recombinante

Los genes que codifican la proteína truncada de CdtB solo con dominio de unión a receptor (C52-C53) y un marcador His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción Ndel/Xhol usando procedimientos convencionales. Las construcciones finales se generaron mediante la transformación de la cepa modificada de E. coli B834 (DE3) con el vector de expresión recombinante según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Cepa huésped

Genotipo: Cepa B834 ::DE3, F- ompThsdSB(rB~ mB') gal dcm met (DE3) Modificación: A(bioA-bioD)::PGL

Expresión de las proteínas recombinantes:

Estos cultivos de una noche se diluyeron a 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 pg/ml) y se cultivaron a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

Después de las inducciones de una noche (aproximadamente 16 horas), se evaluaron las D.O a 600 nm después de la inducción y los cultivos se centrifugaron a 14.000 RPM durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

Purificación

C52 y C53

Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en tampón de bicina 50 mM pH 8,0, que contenían NaCl 500 mM y una mezcla de inhibidores de proteasa (Complete, Roche, sin EDTA). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa Francesa de 3 X 137,86 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron mediante centrifugación a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

Las proteínas marcadas con 6-His se purificaron en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con el mismo tampón usado para la resuspensión bacteriana. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 20 mM pH 7,5, que contenía NaCl 500 mM, imidazol 25 mM. Se realizó elución realizó usando un tampón de bicina 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM e imidazol 250 mM.

Después de las etapas de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) y concentración (Amicon Ultra 10 kDa), el producto se cargó en cromatografía Se C de (SUPERDEX™ 75) en tampón 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM.

Las fracciones que contenían antígeno de Cdtb se seleccionaron basándose en la pureza mediante SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó usando Ensayo de Proteínas RC/DC de Lowry de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 pm y se almacenó a -80 °C.

Ejemplo 6 - Clonación, expresión y purificación de proteínas de fusión del extremo N de CdtA de C. d ilfic ile y el dom inio de unión a receptor de CdtB

Plásmido de expresión y cepa recombinante

Los genes que codifican la proteína de fusión de CdtA extremo N (C49 o C50) con proteína de dominio de unión a receptor de CdtB versión larga o corta (C61 o C62) y un marcador de His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción Ndel/Xhol usando procedimientos convencionales. Las construcciones finales se generaron mediante la transformación de la cepa modificada de E. coliB834 (DE3) con el vector de expresión recombinante apropiado según procedimientos convencionales con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Cepa huésped

Genotipo: Cepa de E.coli BL21 ::DE3, F- ompThsdSs(rB me') gal dcm (DE3)

Genotipo: Cepa B834 ::DE3, F- om pThsdSB(rB- mB-) gal dcm met (DE3) Modificación : A(bioA-bioD)::PGL

Expresión de las proteínas recombinantes:

Se desprendieron transformantes de E. coli de cada placa de agar y se usaron para inocular 200 ml de caldo de cultivo LBT 1 % (p/v) de glucosa kanamicina (50 pg/ml) para obtener D.O.600 nm entre 0,1 y 0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

Estos cultivos de una noche se diluyeron hasta 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 pg/ml) y se cultivaron a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

Después de la inducción de una noche (aproximadamente 16 horas), se evaluó la D.O a 600 nm después de la inducción y el cultivo se centrifugó a 14.000 RPM durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

Purificación

C61

El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de bicina 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 300 mM, TCEP 5 mM (Thermo Scientific Pierce, clorhidrato de (2-carboxietil)fosfina), empigen 0,4 % y una mezcla de inhibidores de proteasa (Complete, Roche). Las bacterias se lisaron usando un sistema de Prensa Francesa de 3 X 137,86 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron mediante centrifugaron a 20.000 g durante 30 min a 4 °C.

La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE Histrap de 5 ml (GE) pre-equilibrada con tampón de bicina 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM, empigen 0,15 %, TCEP 1 mM. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con un tampón de bicina 50 mM pH 8,0, que contenía NaCl 300 mM, tween 200,2 %, imidazol 25 mM y TCEP 1 mM. Se realizó elución usando un tampón de bicina a 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, tween 20 0,2 %, imidazol 500 mM y TCEP 1 mM. Después de la etapa de desalación (Desalación BIORAD Bio-Gel P6) en tampón de bicina 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, el producto se cargó en cromatografía SEC (SUPERDEX™ 200) en el mismo tampón. Las fracciones que contenían el antígeno recombinante se seleccionaron basándose en la pureza mediante SDS-PAGE. La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteínas RC/DC de Lowry de BioRad. El volumen purificado se esterilizó por filtración en 0,22 pm y se almacenó a -80 °C.

Ejemplo 7 - Clonación y expresión de CdtB de C. difficile madura co-expresada (C55) con prodominio de CdtB C58

Plásmido de expresión y cepa recombinante

Los genes que codifican el prodominio de CdtB sin marcador de His se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción Ndel/Xhol usando procedimientos convencionales. La construcción final se generó mediante la transformación de la cepa modificada de E. coli B834 (DE3) con el vector de expresión recombinante de prodominio CdtB y proteína madura CdtB C55-información acerca de la clonación de C55 véase ejemplo 3 según el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): pág. 109-135.).

Cepa huésped

Modificación: Inclusión del gen de PGL para evitar la fosfogluconoilación en el locus de biotina (La cepa es auxótrofa para biotina).

Genotipo: Cepa B834 ::DE3, F- om pThsdSB(rB- mB-) gal dcm met (DE3) Modificación: A(bioA-bioD)::PGL

Expresión de las proteínas recombinantes

Se desprendió un transformante de E. coli de la placa de agar y se usó para inocular 200 ml de caldo de cultivo LBT 1 % (p/v) de glucosa kanamicina (50 pg/ml) y ampicilina (100 pg/ml) para obtener D.O.600 nm entre 0,1-0,2. El cultivo se incubó durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

Este cultivo de una noche se diluyó hasta 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 pg/ml) y ampicilina (100 pg/ml) y se cultivó a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

Después de la inducción de una noche (aproximadamente 16 horas), la D.O a 600 nm se evaluó después de la inducción y el cultivo se centrifugó a 14.000 RPM durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

Purificación

Igual que C55 producido solo

Ejemplo 8: Evaluación del peso molecular de construcciones de CdtA, CdtB y fusión CdtA-CdtB

Se usó ultracentrifugación analítica para determinar la homogeneidad y la distribución de tamaños en solución de las diferentes especies en una muestra de proteínas midiendo la velocidad a las que se mueven las moléculas en respuesta a una fuerza centrífuga. Esto se basa en el cálculo de los coeficientes de sedimentación de las diferentes especies que se obtienen mediante experimento de velocidad de sedimentación, que dependen de su forma y masa molecular.

1. Las muestras proteicas se centrifugan en una ultracentrífuga analítica Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1 a 8.000 RPM, 25.000 RPM o 42.000 RPM dependiendo del tamaño de la proteína diana, después de haberse equilibrado el rotor AN-60Ti a 15 °C.

2. Para recogida de datos, las exploraciones se registraron a 280 nm cada 5 minutos.

3. Se realizó análisis de datos usando el programa SEDFIT para determinación de la distribución de C(S). La determinación del volumen específico parcial de las proteínas se realizó con el software SEDNTERP a partir de su secuencia de aminoácidos. También se usó SEDNTERP para determinar la viscosidad y la densidad del tampón.

4. La determinación del peso molecular de las diferentes especies se ha determinado a partir del diagrama de distribución de C(S) (concentración frente a coeficiente de sedimentación), considerando que es una mejor representación de los datos sin procesar que la distribución de C(M) (concentración frente a peso molecular) para caracterizar la distribución de tamaños de una mezcla.

Las Figuras 1a a 1h describen la distribución de tamaños de las diferentes construcciones de CdtA, CdtB y fusión CdtA-CdtB como se determina mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación.

El peso molecular calculado de la especie principal para proteína CdtA de longitud completa mutada C67 y C69 puede corresponder con un monómero, mientras que la construcción N terminal de CdtA truncada C50 está presente en solución como una mezcla de monómero y dímero (figuras 1a, 1b y 1c).

Las fusiones tanto C61 como C62 de CdtA-CdtB son principalmente diméricas, con una menor proporción de monómeros (figuras 1d y 1e).

Las construcciones del dominio de unión a receptor de CdtB C52 y C52 son principalmente diméricas con presencia de una cantidad pequeña de monómero (figuras 1f y 1g).

La CdtB de longitud completa sin prodominio C55 está muy agregada después de la purificación, presentando una distribución de tamaños heterogénea mediante ABC (figura 1h).

Ejemplo 9: perfil de SDS PAGE de construcciones de CdtA, CdtB y fusión CdtA-CdtB después de purificación

Se separaron proteínas purificadas de cada construcción en SDS PAGE desnaturalizante y reductor para evaluar la integridad de secuencia.

La Figura 2a muestra que las construcciones de fusión CdtA-CdtB C61 y C62 están presentes en su mayoría en el peso molecular esperado. Se realizan las mismas observaciones para construcciones de CdtA en la figura 2b.

Se muestra en la figura 2c que la activación con quimotripsina de la construcción de CdtB C37 (aa. 43-876) da como resultado el truncamiento del prodominio para la obtención de una proteína (carril 2) a un peso molecular comparable a la CdtB madura representada en el carril 3 mediante C55 (aa. 212-876). El perfil de SDS-PAGE de C55 contiene una cantidad significativa de productos secundarios que no podrían separarse de la proteína completa, lo que es coherente con el perfil muy agregado observado por ABC en la figura 2h.

Se purificó CdtB expresada con prodominio C38 (aa. 43-876) como una preparación heterogénea compuesta en su mayoría de un doblete del peso molecular esperado que contiene una cantidad significativa de productos secundarios. Ejemplo 9: Inmunización de ratones con proteínas de subunidades de CtdA y CdtB de C. dilfic ile en una formulación de AS01B

Inmunización de ratones

Se inmunizaron grupos de 25 ratones hembra Balb/C IM los días 0, 14 y 28 con 5 |jg de subunidades purificadas de toxina binaria CdtA y CdtB completas. Estos antígenos se inyectaron en una formulación de AS01B.

Se determinaron los títulos de ELISA anti-Cdta y anti-CdtB en sueros individuales recogidos el día 42 (Post III 14). Los resultados se muestran en las Figuras 3-4.

También se realizó un ensayo de inhibición de citotoxicidad de toxina binaria en sueros Post III agrupados (día 42). Los resultados se muestran en las Figuras 5-6.

Respuesta de ELISA anti-CdtA y anti-CdtB: Protocolo

Se recubrieron subunidades de CdtA completo (C34) o CdtB completo (C37) a 1 jg/m l o 2 jg/m l (para CdtB) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de alta unión (Nunc MAXISORP™), durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 min a TA con agitación. Los antisueros de ratones se prediluyeron 1/500 en PBS-BSA 0,2 %-TWEEN™ 0,05 %. A continuación, se realizaron diluciones dobles adicionales en microplacas y se incubaron a TA durante 30 min. Después de lavar, se detectó el anticuerpo de ratón unido usando Anti-Ratón (ref. 110-035-003) conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. diluido 1:5000 en PBS-BSA 0,2 %-TWEEN™ 0,05%. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con agitación. El color se reveló usando 4 mg de O-fenilendiamina (OPD) 5 j l de H2O2 por cada 10 ml de tampón citrato 0,1 M pH 4,5 durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 j l de HCl, y la densidad óptica (DO) se leyó a 490 nm en relación con 620 nm.

El nivel de anticuerpos anti-CdtA o anti-CdtB se expresa en títulos de puntos medios. Se calculó un GMT para 25 muestras en cada grupo de tratamiento.

Ensayo de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria

Se cultivaron células epiteliales colónicas humanas (células HT29 o HCT-116) a 37 °C con CO25 % en DMEM suero bovino fetal al 10% glutamina 1 % antibióticos 1 % (penicilina-estreptomicina-anfotericina) y se sembraron en placas de cultivo tisular negras de 96 pocillos (Greiner Bio-one, Ref: 655090) a una densidad de 4x104 células/pocillo para HT29 y 1x104 células/pocillo para HCT166.

Después de 24 h, los medios celulares se retiraron de los pocillos.

Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:50 en medios celulares y después se realizaron diluciones triples adicionales en microplacas (NUNC, Ref: 163320). Se añadieron 50 j l de diluciones en serie de antisueros agrupados de ratones a las placas negras. Después se añadieron 50 j l de una mezcla de CdtA (25 ng/ml) y CdtB activada por quimotripsina (75 ng/ml) y las placas negras se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 6 días.

Después de 6 días, se retiró la mezcla de antisueros y toxina de los pocillos y se añadieron 100 j l de tinción de Hoescht (BD Pharmingen, Ref: 561908) diluida 1:500 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cada pocillo durante 2 horas en oscuridad a temperatura ambiente.

Después de la coloración, la tinción de Hoescht se retiró de los pocillos y se midió la fluorescencia de las células usando un microscopio Axiovision.

La superficie cubierta por tinción fluorescente se determinó en cada pocillo y los títulos de inhibición de citotoxicidad se definieron como la dilución recíproca que inducía una inhibición del 50 % de la señal fluorescente.

Ejemplo 10: Inmunización de ratones con CdtB de C. d ilfic ile activada o no por quimotripsina, mezclada o no con F2, formulada en AS01B.

Inmunización de ratones

Se inmunizaron grupos de 25 ratones hembra Balb/C IM los días 0, 14 y 28 con 5 jg de subunidad purificada de toxina binaria CdtB activada o no por quimotripsina, mezclada o no con 5 jg de F2. Estos antígenos se inyectaron en una formulación de AS01B.

Se determinaron los títulos de ELISA anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB en sueros individuales recogidos el día 42 (Post III 14). Los resultados se muestran en las Figuras 7-9.

También se realizó un ensayo de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB en sueros agrupados Post III (día 42). Los resultados se muestran en las Figuras 10-12.

Respuesta de ELISA anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB: Protocolo

Se recubrieron subunidad de CdtB completo (C37), F2 Cter ToxA y F2 Cter ToxB a 0,5 |jg/ml (para CdtB), 2 |jg/ml (para ToxA F2 Cter) y 1 jg/m l (para ToxB F2 Cter) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de alta unión (Nunc MAXISORP™), durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 min a TA con agitación. Los antisueros de ratones se prediluyeron 1/500 en PBS-BSA 0,2 %-TWEEN™ 0,05 % y después se realizaron diluciones dobles adicionales en microplacas y se incubaron a TA durante 30 min. Después de lavar, el anticuerpo de ratón unido se detectó usando Anti-Ratón (ref. 110-035-003) conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. diluido 1:5000 en PBS-BSA 0,2 %-TWEEN™ 0,05%. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con agitación. El color se reveló usando 4 mg de O-fenilendiamina (OPD) 5 j l de H2O2 por cada 10 ml de tampón citrato 0,1 M pH 4,5 durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 j l de HCl, y la densidad óptica (DO) se leyó a 490 nm en relación con 620 nm.

El nivel de anticuerpos anti-CdtB se expresa en títulos de puntos medios.

El nivel de anticuerpos anti-F2Cter ToxA y F2Cter ToxB presentes en cada suero individual se determina por comparación con un suero de referencia añadido a cada placa y se expresa en jg/ml.

Se calculó un GMT para las 25 muestras en cada grupo de tratamiento.

Ensayo de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB

Después de 24 h, los medios celulares se retiraron de los pocillos.

Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:5 para g1 y g2 y 1:20 para g3 y g4 en medios celulares, para ensayo de citotoxicidad de inhibición de ToxA, 1:10 para ensayo de citotoxicidad de inhibición de ToxB y 1:50 para ensayo de inhibición de toxina binaria. Después, se realizaron diluciones triples adicionales en microplacas (NUNC, Ref: 163320). Se añadieron 50 j l de diluciones en serie de antisueros agrupados de ratones a las placas negras. Después se añadieron 50 j l de ToxA (0,01 jg/m l) en HT29, ToxB (0,022 jg/m l) en HCT116 y una mezcla de CdtA (25 ng/ml) y CdtB activada por quimotripsina (75 ng/ml) en HT29 y HT116 en las placas negras y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 6 días.

Después de 6 días, la mezcla de antisueros y toxina se retiraron de los pocillos y se añadieron 100 j l de tinción de Hoescht (BD Pharmingen, Ref: 561908) diluida 1:500 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cada pocillo durante 2 horas en oscuridad a temperatura ambiente.

Después de la coloración, la tinción de Hoescht se retiró de los pocillos y la fluorescencia de las células se midió usando un microscopio Axiovision.

Ejemplo 11: Inmunización de ratones con diferentes candidatos a vacuna de toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 6 jg /do s is en una formulación de AS01B

Inmunización de ratones

Se inmunizaron grupos de 25 ratones hembra Balb/C IM los días 0, 14 y 28 con 6 jg de fusión CdtA-CdtB (C61 y C62) o 3 jg de CdtA (C34, C50 o C67) y/o 3 jg de CdtB (C37, C52, C55 o C55/C58) mezcladas o no con 6 jg de F2. Estos antígenos se inyectaron en una formulación de AS01B.

Se determinaron los títulos de ELISA anti-CdtA, anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB en sueros individuales recogidos el día 42 (Post III 14). Los resultados se muestran en las Figuras 13-16.

También se realizó un ensayo de inhibición de la citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB en sueros agrupados Post III (día 42). Los resultados se muestran en las Figuras 17-20.

Respuesta de ELISA anti-CdtA, anti-CdtB, anti-ToxA F2Cter y anti-ToxB F2 Cter: Protocolo

Se recubrieron CdtA mut E428Q (C44), subunidades de CdtB completa (C37), F2 Cter ToxA y F2 Cter ToxB a 1 |jg/ml (para CdtA), 0,5 jg/m l (para CdtB), 2 jg/m l (para ToxA F2 Cter) y 1 jg/m l (para ToxB F2 Cter) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de alta unión (Nunc MAXISORP™), durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 min a TA con agitación. Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:100 (para CdtA, CdtB, ToxB) o 1:200 (para ToxA) para Post II y 1:500 (para CdtA y ToxA), 1:500 o 1:2000 (para CdtB) y 1:250 (para ToxB) para Post III en PBS-BsA 0,2 %-TWEEN™ 0,05 %. Después se realizaron diluciones dobles adicionales en microplacas y se incubaron a TA durante 30 min. Después de lavar, se detectó anticuerpo de ratón unido usando Anti-Ratón (ref. 110-035-003) conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. diluido 1:5000 en PBS-BSA 0,2 %-tween 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con agitación. El color se reveló usando 4 mg de O-fenilendiamina (OPD) 5 j l de H2O2 por cada 10 ml de tampón de citrato 0,1 M pH 4,5 durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 j l de HCl y la densidad óptica (DO) se leyó a 490 nm en relación con 620 nm.

El nivel de anticuerpos anti-CdtA, anti-CdtB, anti- F2Cter ToxA y F2Cter ToxB presentes en cada suero individual se determina mediante comparación con un suero de referencia añadido en cada placa y se expresa en jg/ml. Se calculó un GMT para las 20 muestras en cada grupo de tratamiento.

Ensayo de inhibición de citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB

Después de 24 h, los medios celulares se retiraron de los pocillos.

Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:50 en medios celulares, para ensayo de citotoxicidad de inhibición de ToxA, 1:10 para ensayo de citotoxicidad de inhibición de ToxB y 1:50 para ensayo de inhibición de toxina binaria en HT29 y 1:30 (para Post II) y 1:30 o 1:100 (para Post III) para ensayo de inhibición de toxina binaria en HCT166. Después, se realizaron diluciones triples adicionales en microplaca (NUNC, Ref: 163320). Se añadieron 50 j l de diluciones en serie de antisueros agrupados de ratones a las placas negras. Después se añadieron 50 j l de ToxA (0,025 jg/m l) en HT29, ToxB (0,6 jg/m l) en HCT116 y una mezcla de CdtA (25 ng/ml) y CdtB activada por quimotripsina (75 ng/ml) en HT29 y HT116 en las placas negras y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 6 días.

Después de 6 días, la mezcla de antisueros y toxinas se retiró de los pocillos y se añadieron 100 j l de tinción de Hoescht (BD Pharmingen, Ref: 561908) diluida 1:500 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cada pocillo durante 2 horas en oscuridad a temperatura ambiente.

La superficie cubierta por tinción fluorescente se determinó en cada pocillo y los títulos de inhibición de citotoxicidad se definieron como la dilución recíproca que inducía a una inhibición del 50 % de la señal fluorescente.

Ejemplo 12: Inmunización de ratones con diferentes candidatos a vacuna de toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 2 pg/dosis en una formulación de AS01B

Inmunización de ratones

Se inmunizaron grupos de 20 ratones hembra Balb/C IM los días 0, 14 y 28 con 2 jg de fusión CdtA-CdtB (C61 y C62) o 1 jg de CdtA (C34, C50 o C67) y/o 1 jg de CdtB (C37, C52, C55 o C55/C58) mezcladas o no con 2 jg de F2. Estos antígenos se inyectaron en una formulación de AS01B.

Se determinaron los títulos de ELISA anti-CdtA, anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB en sueros individuales recogidos el día 42 (Post III 14). Los resultados se muestran en las Figuras 21-24.

También se realizó un ensayo de inhibición de citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB en sueros agrupados Post III (día 42). Los resultados se muestran en las Figuras 25-28.

Respuesta de ELISA anti-CdtA, anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB: Protocolo

Se recubrieron CdtA mut E428Q (C44), subunidades de CdtB completa (C37), F2 Cter ToxA y F2 Cter ToxB a 1 jg/m l (para CdtA), 0,5 jg/m l (para CdtB), 2 jg/m l (para ToxA F2 Cter) y 1 jg/m l (para ToxB F2 Cter) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de alta unión (Nunc MAXISORP™), durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA al 1 % durante 30 min a TA con agitación. Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:100 (para CdtA, ToxA, ToxB) y 1:100 o 1:250 (para CdtA) para Post II y 1:500 para Post III en PBS-BSA 0,2 %-TWEEN™ 0,05 %. Después se realizaron diluciones dobles adicionales en microplacas y se incubaron a TA durante 30 min. Después de lavar, se detectó el anticuerpo de ratón unido usando Anti-Ratón (ref. 110-035-003) conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. diluido 1:5000 en PBS-BSA 0,2 %-tween 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con agitación. Se reveló el color.

Ejemplo 13: Inmunización de ratones con diferentes candidatos a vacuna de toxina binaria (CdtA/CdtB) combinados con F2 a 10 pg/dosis en una formulación sin adyuvantes

Inmunización de ratones

Se inmunizaron grupos de 20 ratones hembra Balb/C IM los días 0, 14 y 28 con 10 jg de fusión de CdtA-CdtB (C61 y C62) o 5 |jg de CdtA (C34, C50 o C67) y/o 5 jg de CdtB (C37, C52, C55 o C55/C58) mezclados o no con 10 jg de F2. Estos antígenos se inyectaron en una formulación sin adyuvantes.

Se determinaron los títulos de ELISA anti-CdtA, anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB en sueros individuales recogidos el día 42 (Post III 14). Los resultados se muestran en las Figuras 29-32.

También se realizó un ensayo de inhibición de citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB en sueros agrupados Post III (día 42). Los resultados se muestran en las Figuras 33-36.

Respuesta de ELISA anti-CdtA, anti-CdtB, anti-ToxA y anti-ToxB: Protocolo

Se recubrieron CdtA mut E428Q (C44), subunidades de CdtB completa (C37), F2 Cter ToxA y F2 Cter ToxB a 1 jg/m l (para CdtA), 0,5 jg/m l (para CdtB), 2 jg/m l (para F2 Cter ToxA) y 1 jg/m l (para F2 Cter ToxB) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de alta unión (Nunc MAXISORP™), durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA al 1 % durante 30 min a TA con agitación. Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:100 (para CdtA, ToxA, ToxB) para Post II y 1:100 (para CdtA, ToxA, ToxB) 1:100 o 1:200 (para CdtB) para Post III en PBS-BSA 0,2 %-TWEe N ™ 0,05%. Después, se realizaron diluciones dobles adicionales en microplacas y se incubaron a TA durante 30 min. Después de lavar, se detectó el anticuerpo de ratón unido usando Anti-Ratón (ref. 110-035-003) conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. diluido 1:5000 en PBS-BSA 0,2 %-tween 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con agitación. El color se reveló usando 4 mg de O-fenilendiamina (OPD) 5 j l de H2O2 por cada 10 ml de tampón citrato 0,1 M pH 4,5 durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 j l de HCl, y la densidad óptica (DO) se leyó a 490 nm en relación con 620 nm.

Se calculó un GMT para las 20 muestras en cada grupo de tratamiento.

Ensayo de inhibición de citotoxicidad de toxina binaria, ToxA y ToxB: protocolo

Se cultivaron células epiteliales colónicas humanas (células HT29 o HCT-116) a 37 °C con CO2 al 5 % en DMEM suero bovino fetal al 10 % glutamina 1 % antibióticos 1 % (penicilina-estreptomicina-anfotericina) y se sembraron en placas de cultivo tisular negras de 96 pocillos (Greiner Bio-one, Ref: 655090) a una densidad de 4x104 células/pocillo para HT29 y 1x104 células/pocillo para HCT166.

Después de 24 h, los medios celulares se retiraron de los pocillos.

Los antisueros de ratones se prediluyeron 1:50 en medios celulares, para ensayo de citotoxicidad de inhibición de ToxA, 1:10 para ensayo de citotoxicidad de inhibición de ToxB, 1:50 para ensayo de inhibición de toxina binaria en HT29 y 1:30 (para Post II) y 1:30 o 1:100 (para Post III) para ensayo de inhibición de toxina binaria en HCT166. Después, se realizaron diluciones triples adicionales en microplaca (NUNC, Ref: 163320). Se añadieron 50 j l de diluciones en serie de antisueros agrupados de ratones a las placas negras. Después se añadieron 50 j l de ToxA (0,025 jg/m l) en HT29, ToxB (0,6 jg/m l) en HCT116 y una mezcla de CdtA (25 ng/ml) y CdtB activada por quimotripsina (75 ng/ml) en HT29 y HT116 en las placas negras y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 6 días.

Después de 6 días, la mezcla de antisueros y toxinas se retiraron de los pocillos y se añadieron 100 j l de tinción de Hoescht (BD Pharmingen, Ref: 561908) diluida 1:500 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cada pocillo durante 2 horas en oscuridad a temperatura ambiente.

Ejemplo 14: Clonación y expresión de proteínas de fusión de F2 y dom inio de unión a receptor de CdtB de C. difficile

Plásmido de expresión y cepa recombinante.

Los genes que codifican la proteína de fusión de proteína F2 con proteína de dominio de unión a receptor de CdtB versión larga o corta (C64 y C65) y un marcador de His en el extremo C se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción NdeI/XhoI usando procedimientos convencionales.

Resumen de la secuencia (Tabla A)

(continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende proteína CDTb de Clostridium diffiále aislada en la que la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada es una proteína CDTb truncada de la que se ha eliminado el prodominio correspondiente a los aminoácidos 48-211 de la SEQ ID NO: 3 o el equivalente en una toxina binaria aislada de una cepa diferente de C. difficile, que comprende el dominio de unión a receptor en el que la proteína CDTb de Clostridium difficile aislada comprende:

(i) SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 51; o

(ii) Una variante de CDTb que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 51

y la composición inmunogénica comprende una proteína CDTa de Clostridium difficile aislada que contiene una mutación de glutamato a un aminoácido diferente en la posición 428 o 430 que reduce su actividad ADP-ribosiltransferasa, en la que la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada es (i) SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54; o (ii) una variante de CDTa que tiene al menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO:54; o (iii) un fragmento de CDTa que tiene al menos 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; o SEQ ID NO: 54.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada tiene una mutación de glutamato a glutamina en la posición 428.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que la proteína CDTa de Clostridium difficile aislada tiene una mutación de glutamato a glutamina en la posición 430.

4. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación precedente, en la que la composición inmunogénica comprende además una proteína toxina A de Clostridium difficile aislada y/o una proteína toxina B de Clostridium difficile aislada.

5. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que la composición inmunogénica comprende una proteína toxina A de Clostridium difficile aislada y una proteína toxina B de C. difficile aislada en la que la proteína toxina A de Clostridium difficile aislada y la proteína toxina B de C. difficile aislada forman una proteína de fusión.

6. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la vacuna de la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad por C. difficile.

8. Un uso de la composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad por C. difficile.