ES2749733T3 - Atenuación de virus de ARN mediante alteración de la robustez mutacional y el espacio de secuencia - Google Patents
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Abstract
Un proceso de producción de un virus de ARN atenuado o de un clon de ADNc atenuado del mismo, mediante la atenuación de un virus de ARN infeccioso o de un clon de ADNc infeccioso del mismo, en donde dicho virus de ARN infeccioso o clon de ADNc infeccioso del mismo comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN, en donde dicho proceso comprende proporcionar un virus de ARN infeccioso o un clon de ADNc infeccioso del mismo, en donde dicho clon de ADNc infeccioso comprende la secuencia de ADNc, que es la retrotranscripción de la CDS del genoma de dicho virus de ARN, que modifica el genoma de ARN de dicho virus de ARN infeccioso o la secuencia de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc, respectivamente, en donde dicha modificación comprende reemplazar al menos un codón, que codifica Leu, Ser, Arg o Gly en dicho virus de ARN infeccioso o clon de ADNc infeccioso, por un codón diferente pero sinónimo, en donde dicho codón diferente pero sinónimo es un codón, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA.
Description
DESCRIPCIÓN
Atenuación de virus de ARN mediante alteración de la robustez mutacional y el espacio de secuencia
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, a la atenuación de un virus de ARN o de un clon del mismo e implica la alteración, más particularmente la reducción, de la robustez mutacional de virus de ARN o clon. Los medios de la divulgación están dedicados, más particularmente, a la atenuación de un virus de ARN o clon infeccioso, para la producción de una composición inmunogénica o vacuna.
Antecedentes de la invención
Los virus de ARN tienen frecuencias de mutación muy elevadas. Cuando se replica un virus de ARN, se generan mutaciones de nucleótidos, dando como resultado una población de variantes. La secuencia consenso, que se usa para definir a un virus de ARN, representa la media genética de cada posición de nucleótidos a lo largo del genoma. La población de variantes de virus de ARN es una red de variantes organizadas en el espacio de secuencia alrededor de la secuencia consenso. Este espectro de mutación normalmente se denomina cuasiespecie.
Esta diversidad genética crea una nube de mutaciones que son potencialmente beneficiosas para la supervivencia vírica, mediante la que se crea una deriva antigénica que requiere actualizaciones frecuentes de las vacunas y proporciona la base para la resistencia a los agentes antivíricos. Se sabe que la alteración de la capacidad de un virus de ARN para generar una frecuencia normal de mutación, reduce la aptitud vírica (es decir, la capacidad relativa de un virus dado para generar virus descendientes, teniendo en cuenta todos los aspectos del ciclo de vida del virus, incluyendo la replicación) y atenúa el virus durante la infección in vivo.
La reducción de la aptitud de los virus de ARN también puede lograrse afectando a la replicación o la traducción, por diversos medios, incluyendo la alteración del sesgo de codones.
Otra característica que puede afectar a la aptitud de los virus de ARN es la robustez mutacional y/o el espacio de secuencia. La robustez mutacional es la capacidad para conservar el fenotipo a la luz de cambios genéticos (mutación neutra). Sin embargo, se sabe poco acerca de los efectos inducidos por la alteración de la robustez mutacional de los virus de ARN. Algunos estudios abordan la alteración indirecta de la robustez mutacional de los virus de ARN, usando construcciones diseñadas para alterar la aptitud por otros mecanismos, tales como la desoptimización de codones (por ejemplo, la alteración del sesgo de codones y el sesgo de pares de codones). Por lo tanto, estos estudios no abordan la robustez mutacional per se (Lauring et al. 2012; Coleman et al. 2008).
La atenuación de los virus de ARN para la producción de vacunas se enfrenta al problema de la inestabilidad genética y del riesgo asociado de reversión o mutación genética a un fenotipo patógeno.
El método convencional para la atenuación de virus de ARN implica en la actualidad la introducción de una mutación génica aleatoria o pases en condiciones no naturales, mediante lo que se introducen más mutaciones que las realmente necesarias para la atenuación, pero reduciendo el riesgo de reversión genética. Esta etapa es mayormente empírica y es bastante específica del tipo o especie de virus de ARN que se esté atenuando.
Por lo tanto, el presente método para atenuación de virus de ARN implica eventos, que dependen del azar y no pueden aplicarse universalmente a una variedad de tipos de virus.
La divulgación proporciona medios para la atenuación de virus de ARN, que no son empíricos y que pueden aplicarse a todos los virus de ARN.
Los medios están basados racionalmente en la alteración de la robustez mutacional y/o de la localización del virus en el espacio de secuencia.
Sumario de la invención
La divulgación proporciona medios para la atenuación de virus de ARN, que implican la robustez mutacional como rasgo modificable.
Los inventores demuestran que la robustez mutacional (y el espacio de secuencia) de una población de virus de ARN puede modificarse sin afectar a la replicación de proteínas y el empaquetamiento de la descendencia del virus y sin afectar necesariamente a la secuencia de proteína.
Los medios implican reducir la robustez mutacional (o restringir el espacio de secuencia viable). Se basan en el armazón de la cuasiespecie del virus de ARN, colocando al virus de ARN en una región precaria de su espacio de secuencia genético, donde se convierte en una víctima de su naturalmente elevada tasa de mutación, de tal forma que
las mutaciones dejan de ser toleradas y neutras, sino que se vuelven letales o perjudiciales para el virus de ARN. Los medios logran, por lo tanto, la atenuación del virus de ARN.
Más particularmente, los medios de la divulgación implican el reemplazo de codones, que codifican Leu, Ser, Arg o Gly, por codones diferentes pero sinónimos. Estos codones diferentes pero sinónimos se seleccionan para que difieran en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA. Por ejemplo, el codón CUU, que codifica Leu, se reemplaza por el codón UUA, que también codifica Leu, pero que (a diferencia del codón CUU) difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (es decir, del codón de PARADA UAA). Un virus de ARN o clon de la invención modificado de este modo difiere del virus de ARN o clon de tipo silvestre (por ejemplo, infeccioso) en su secuencia de nucleótidos, pero no en su secuencia de aminoácidos (al menos no antes del primer ciclo de replicación).
Como alternativa o de manera complementaria, más particularmente de manera complementaria, los medios pueden implicar el reemplazo de codones, que codifican Thr o Ala, por codones diferentes y no sinónimos, en donde estos codones diferentes y no sinónimos codifican Ser y difieren en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA. Por ejemplo, el codón ACA, que codifica Thr, puede reemplazarse por el codón UCA, que codifica Ser, que a su vez difiere del codón de PARADA UAA por tan solo un nucleótido. Dicho reemplazo de codones modifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas y por lo tanto, se seleccionan para no modificar (sustancialmente) la antigenicidad de estas proteínas.
El virus de ARN (o clon) modificado de la invención es hipersensible a la mutación, a la vez que sigue conservando la capacidad de replicación necesaria para la producción de vacunas y sigue siendo reconocido por el sistema inmunitario del hospedador de manera similar a cómo reconocería al virus de ARN de tipo silvestre (infeccioso).
Los medios de la divulgación tienen la ventaja de ser aplicables a cualquier virus de ARN y permiten una atenuación del virus de ARN eficaz y segura para una composición inmunogénica o vacuna antivírica.
Por lo tanto, la invención se refiere a un virus de ARN atenuado o a un clon atenuado del mismo, así como a medios de derivación, que comprenden o implican dicho virus de ARN atenuado o clon atenuado, tal como una composición inmunogénica o vacuna que comprende un virus de ARN atenuado o un clon atenuado de la invención.
La divulgación se refiere, más particularmente, a medios para producir dicho virus de ARN atenuado o clon atenuado, incluyendo medios informáticos.
De manera notable, la divulgación se refiere a procesos de producción de un virus de ARN atenuado o de un clon atenuado del mismo, a un proceso de atenuación de un virus de ARN o un clon del mismo, más particularmente, a un proceso de atenuación de un virus de ARN infeccioso o de un clon infeccioso del mismo, así como a un proceso de producción de una composición inmunogénica o vacuna de virus de ARN.
Breve descripción de las figuras
Algunas de las figuras, a las que hace referencia la presente invención, son en color. La invención según se presentó contiene la impresión en color de las figuras, que por lo tanto pueden consultarse inspeccionando el archivo de la invención en la oficina de patentes.
Figura 1. Se muestra la organización genética del genoma del virus Coxsackie B3, con la estructura de ARN necesaria para la replicación, la traducción y el empaquetado conocida. La región P1 (resaltada en rosa) codifica las proteínas estructurales. En esta región se encuentran 117 codones de leucina y serina que pertenecen a las tres categorías de robustez y se han convertido exclusivamente en codones de "parada" (es decir, 1-hasta-parada), "más" volátiles (es decir, Más-i) y "menos" volátiles (es decir, Menos-i) en cada una de las tres construcciones (virus SynSyn), sin alterar las secuencias codificantes de aminoácidos del genoma.
En la figura 1, los colores de los codones son, de izquierda a derecha,
- para "ts" (secuencia de tipo silvestre): rojo, verde, rojo, púrpura, verde, púrpura, rojo y púrpura;
- para "parada" (secuencia de 1-hasta-parada): púrpura, púrpura, púrpura, púrpura, púrpura, púrpura y púrpura; - para "Más" (secuencia de Más-i): rojo, rojo, rojo, rojo, rojo, rojo y rojo;
- para "Menos" (secuencia Menos-i): verde, verde, verde, verde, verde, verde y verde.
Figura 2. El intercambio de codones no altera la síntesis de ARN durante la replicación del genoma. Se llevaron a cabo ensayos de replicación in vitro usando extractos de células HeLa y ARN genómico transcrito in vitro. Las formas monocatenarias de sentido positivo (SS+) y replicativas (RF) se visualizan mediante transferencia de Northern, se cuantifican y se normalizan respecto del virus de tipo silvestre (TS). No se observaron diferencias significativas para cualquiera de las tres construcciones.
(TS = tipo silvestre; P1+ = Más-i; P1- = Menos-i; P1S =1-hasta-parada)
Figura 3. El intercambio de codones para alterar codones de serina y leucina en las presentes construcciones no altera la frecuencia de CpG y UpA (eje y), que se ha demostrado que atenúan a los virus. No se observaron diferencias significativas entre las construcciones de tipo silvestre (TS), "más" (P1+), "menos" (P1-) y "parada"
(P1S) (barra de la izquierda, CpG; barra de la derecha, UpA).
(TS = tipo silvestre; P1+ = Más-i; P1- = Menos-i; P1S =1-hasta-parada)
Figuras 4A, 4B y 4C. Cinética de replicación de variantes de robustez. (4A y 4B) Se infectaron células HeLa a una MOI de 0,1 o una MOI de 1 con soluciones madre de pase 1 de tipo silvestre (TS) u otras variantes y en los tiempos indicados después de la infección, se cuantificó la descendencia vírica mediante ensayo en placa convencional. (4C) Curvas de crecimiento usando soluciones madre de pase 5 de las mismas variantes. (A, B y C: TS = •; P1 = ■; P1- = A; P1S = V)
(TS = tipo silvestre; p 1+ = Más-i; P1- = Menos-i; P1S = 1-hasta-parada)
Figuras 5A y 5B. Aptitud individual (5A) y media (5B) de poblaciones de tipo silvestre y variantes de robustez, medidas por el tamaño de la placa. Se infectaron células HeLa con diluciones seriadas de cada población de virus y se llevó un ensayo de placa convencional. Posteriormente, las placas se visualizaron y midieron mediante el programa informático ImageJ (Rasband 1997-2014; Schneider et al. 2012; Abramoff et al. 2004). Cada placa se categorizó de acuerdo con el tamaño. (5A) Se muestra el número de placas (eje y) que presentan placas pequeñas->grandes (eje y) para cada variante. (5B) Se determinó el tamaño medo de placa de la población a partir de los valores en (5a ).
Figura 5A, de izquierda a derecha, TS = tipo silvestre; P1menos = Menos-i; P1más = Más-i; P1parada = 1-hastaparada; las barras en la figura 5B siguen el mismo orden (de izquierda a derecha: TS, P1Less, P1más, P1parada). Figura 6. Aptitud relativa de construcciones de tipo silvestre (azul), "más" (rojo), "menos" (verde) y "parada" (púrpura). La línea de puntos indica la aptitud neutra del genoma de referencia. De izquierda a derecha: primera barra = tipo silvestre; segunda barra = Más-i; tercera barra = Menos-i; cuarta barra = 1-hasta-parada.
Figura 7. Evidencias directas de la reducción de la robustez mutacional mediante intercambio de codones. Las células HeLa se trataron con ribavirina (RBV), 5-fluorouracilo (5-FU) o 5-azacitidina (AZC), se infectaron con soluciones madre de virus y se cuantificó la descendencia infecciosa del virus superviviente mediante ensayo en placa. (TS = tipo silvestre; P1+ = Más-i; P1- = Menos-i; P1S =1-hasta-parada; para cada uno de RBV, AZC y 5FU, las barras se encuentran en el siguiente orden, de izquierda a derecha: TS; P1+; P1-; P1S).
Figura 8. Número total de codones de PARADA observados en las poblaciones de virus descendientes. Se llevó a cabo secuenciación profunda en los virus de tipo silvestre (azul), "menos" (verde), "más" (rojo) y "parada" (púrpura) que se pasaron durante 5 generaciones en condiciones poco mutagénicas. Se analizó el número total de lecturas que presentan codones de Leu/Ser que se habían mutado a codones de PARADA para los 117 sitios alterados en la región P1. (TS = tipo silvestre; P1+ = Más-i; P1- = Menos-i; P1S = 1-hasta-parada).
Figuras 9A y 9B. Atenuación del virus Coxsackie B3 mediante reducción de la robustez mutacional. Se infectó a ratones con 106 UFP de cada construcción de virus y se determinaron los títulos de virus descendientes en los órganos diana clave, corazón (9A) y páncreas (9B) mediante ensayo en placa convencional. No se detectó virus para la construcción de "parada" del día 7, mostrada como valor 10, el límite de detección. (TS = tipo silvestre; más = Más-i; menos = Menos-i; parada = 1-hasta-parada).
Figura 10. Curva de supervivencia de ratones infectados con variantes de robustez. Se infectó a ratones por vía i.p. con 105 TCID50 en 0,20 ml de cada población de virus y se monitorizó la supervivencia a lo largo de un periodo de 14 días. Eje x: porcentaje de supervivencia; eje y: días después de la infección; parada = 1-hasta-parada; más = Más-i.
Figuras 11A, 11B, 11C y 11D. Valores individuales para cada construcción del número de mutaciones de PARADA presentadas en la población de virus descendientes.
Figura 11A: Menos = Menos-i; Figura 11B: Más = Más-i; Figura 11C: TS = tipo silvestre; Figura 11D: Parada = 1-hasta-parada.
Figuras 12A, 12B y 12C. (A) Esquema de 8 segmentos individuales del virus de la gripe A con los marcos abiertos de lectura que codifican cada proteína. El gen PA, en vista expandida, muestra los 110 codones de Ser/Leu que se alteraron para cada virus de 1-hasta-parada. (B) Frecuencia de dinucleótidos de CpG (barras sólidas) y UpA (barras huecas) en construcciones de virus de Coxsackie de tipo silvestre y 1-hasta-parada (CVB3), en relación con el virus E7 de tipo silvestre anteriormente publicado y sus construcciones demuestran afectar a la atenuación del virus. Los valores indican el número real de dinucleótidos presentes en el genoma de tipo silvestre y aumento 0 reducción (+/- n) en la región alterada de variantes modificadas por ingeniería genética. (C) Sesgo de pares de codones de CVB3 de tipo silvestre y 1-hasta-parada, en comparación con poliovirus (PV) de tipo silvestre y construcciones previamente publicadas modificadas por ingeniería genética para atenuar el virus mediante desoptimización de pares de codones: PV-AB, construcción que contiene únicamente codones escasos; PV-SD, en la que se reordenaron aleatoriamente los codones; PV-Máx, en la que se maximizó el sesgo de pares de codones; PV-Mín, en la que se minimizó el sesgo de pares de codones.
Figuras 13A, 13B, 13C, 13D, 13E, 13F y 13G. El virus 1-hasta-parada es hipersensible a la mutación. (A) Aptitud relativa mediante ensayo de competición directa. El virus de tipo silvestre (barras huecas) y 1-hasta-parada (barras sólidas) compitieron contra un virus Coxsackie de tipo silvestre de referencia comercializado. La aptitud relativa del 1-hasta-parada es significativamente menor que la del tipo silvestre en presencia de 200 pM de ribavirina (riba, P<0,0005), 5-fluorouracilo (5-FU, P<0,0005), 5-azacitidina (AZC, P=0,0004) o amilorida (P=0,0011) o manganeso 1 mM (P=0,0017). Se muestran la media y el EEM, n=3, prueba de la t no emparejada de dos colas. (B) Tamaño de placa como medida alternativa de la aptitud. Se cultivaron virus en presencia de tres mutágenos diferentes a 200 pM y se determinó el tamaño medio de la placa y el EEM. Prueba de Mann-Whitney, n=1000, ** P=0,0026; *** P<0,0001. (C) Distribución de valores de aptitud. La proporción (eje y, número de muestras) de valores de aptitud individuales (eje x, log10 de la aptitud) de poblaciones de tipo silvestre y de 1-hasta-parada procedentes de condiciones simuladas o mutagénicas. (D) El cambio relativo en la aptitud de 1-hasta-parada en comparación con
el tipo silvestre, en cada condición de crecimiento. Las diferencias entre el tipo silvestre y 1-hasta-parada son significativas (P=9,656077e-08, prueba de la t de dos colas). (E) Exploración del espacio de secuencia del virus de Coxsackie. Mapa de calor que interroga a los 117 codones de Ser/Leu en 15 poblaciones de tipo silvestre y 15 de 1-hasta-parada (1 población por fila) pasadas 5 veces en cultivo tisular. Las columnas muestran cada uno de los 64 posibles codones que pueden generarse y la intensidad del color revela aquellos que se producen con la máxima frecuencia. (F-G) La frecuencia de mutaciones de parada observadas en las lecturas de secuencia de las poblaciones de tipo silvestre y de 1-hasta-parada pasadas en mutágenos de ARN 50 pM (F) y 200 pM (G), todas las condiciones mutagénicas combinadas. Los diagramas de cajas muestran los valores medios y los intervalos de confianza del 25 % y el 75 %, los bigotes muestran los valores mínimos y máximos, los valores anómalos se muestran como símbolos ; n=45, *** p<0,0001, prueba de la t no emparejada de dos colas.
Figuras 14A, 14B y 14C. 1-hasta-parada se atenúa in vivo. (A) Infectividad específica de virus de tipo silvestre (W) y 1-hasta-parada (S) de muestras del día 3 y 7 de páncreas y corazón. *** P<0,0001, n=6, prueba de la t de dos colas. (B) Curva de supervivencia de ratones infectados con 106 TCID50 de virus de tipo silvestre (línea continua) o 1-hasta-parada (línea discontinua). * P=0,011, n=10, prueba de Mantel-Cox. (C) La frecuencia de mutaciones de parada observadas en lecturas de secuencia de poblaciones de tipo silvestre y de 1-hasta-parada de tejidos infectados (combinación de corazón y páncreas). El diagrama de cajas muestra los valores medios y los intervalos de confianza del 25 % y el 75 %, los bigotes muestran los valores mínimos y máximos, los valores anómalos se muestran como símbolos ; n=62, *** P<0,0001, prueba de la t no emparejada de dos colas.
Figuras 15A, 15B, 15C, 15D y 15E. La construcción de 1-hasta-parada del virus de la gripe A tiene un rendimiento similar (región PA). (A-B) Cinética de replicación de virus de tipo silvestre (línea continua) y 1-hasta-parada (línea discontinua) del pase 5 a una baja moi = 0,1 (A) y una alta moi = 10 (B) en células MDCk . No se observó una significación estadística para A, P=0,962 y B, P=0,695, prueba de la t emparejada de dos colas, n=3. (C) Mapa de calor que interroga a los 100 codones de Ser/Leu en 20 poblaciones de tipo silvestre y 20 de 1-hasta-parada (1 población por fila) pasadas 5 veces en cultivo tisular. Las columnas muestran cada uno de los 64 posibles codones que pueden generarse y la intensidad del color revela aquellos que se producen con la máxima frecuencia. (D) La frecuencia de mutaciones de parada observadas en las lecturas de secuencia de las poblaciones de tipo silvestre y 1-hasta-parada pasadas en mutágenos de ARN 50 pM, todas las condiciones mutagénicas combinadas. Los diagramas de cajas muestran los valores medios y los intervalos de confianza del 25 % y el 75 %, los bigotes muestran los valores mínimos y máximos, los valores anómalos se muestran como símbolos ; n=20, *** p<0,0001, prueba de la t no emparejada de dos colas. (E) Títulos in vivo en el tracto respiratorio (UFP/g de órgano) de ratones infectados por vía intranasal con virus de tipo silvestre (TS) o 1-hasta-parada (parada). Los tejidos se recogieron después de 3 y 5 días de infección. Se muestran los valores medios (barras) y valores individuales (puntos). Figuras 16A, 16B, 16C y 16D. Construcción "suicida": 1-hasta-parada acoplada con polimerasa mutadora. (A-C) Títulos de virus en bazos (A), páncreas (B) y corazones (C) de ratones infectados con 105 TCID50 de virus de tipo silvestre (TS), 1-hasta-parada (S) o 1-hasta-parada acoplado con la mutación de polimerasa de baja fidelidad RdRp-I230F (SBajaFi). Los diagramas de dispersión indican valores individuales (puntos), las medias (barras) y el EEM. Los valores del día 7 de 1-hasta-parada se establecen en el límite de detección. Para A, ** P=0,002, *** P=0,0002, **** P<0,0001; para B, * P=0,03, ** P=0,02, *** P=0,003, **** P<0,0001; para C, * P=0,05, ** P=0,001, **** p<0,0001; n=5, prueba de la t no emparejada de dos colas. (D) Curva de supervivencia de ratones infectados con 106 TCID50 de virus de tipo silvestre (línea continua), 1-hasta-parada (guiones largos) o 1-hasta-parada-bajafidelidad (guiones cortos). * P=<0,0001, n=17, prueba de Mantel-Cox.
Figuras 17A y 17B. (A) Tasa de supervivencia de ratones que recibieron una dosis letal de virus Coxsackie de tipo silvestre (TS) o de virus Coxsackie 1-hasta-parada de la invención (S), o de virus Coxsackie 1-hasta-parada de la invención en donde se ha mutado la polimerasa 3D dando la polimerasa de baja fidelidad I230F (SBajaFi). (B) Anticuerpos neutralizantes después de la inmunización de ratones con virus Coxsackie 1-hasta-parada de la invención (1-hasta-parada) o con virus Coxsackie 1-hasta-parada de la invención con polimerasa de baja fidelidad (1-hasta-parada BajaFi) o con PBS.
Figuras 18A y 18B. Mutantes de gripe de 1-hasta-parada (región HA). Títulos de virus en los pases 1 y 3 (m.o.i. = 0,001; recogidos a las 48 h.d.i.) en condiciones poco mutagénicas (ribavirina o 5-fluorouracilo o 5-azacitidina 5 pM) o en células tranqueo-bronquiales humanas (Calu) o células traqueales porcinas (NPTr). (A) ts = gripe de tipo silvestre; (B) HA-1-hasta-Parada = Gripe con HA mutada de acuerdo con la invención.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a la materia objeto como se define en las reivindicaciones. En la invención, a menos que se especifique de otro modo o a menos que el contexto dicte lo contrario, todos los términos tienen su significado convencional en los campos relevantes. Un método para atenuar los virus de ARN a fin de preparar vacunas ha sido un objetivo largamente perseguido que no se ha logrado mediante mutación convencional, debido a que la mutación convencional implica la introducción de mutación génica al azar o pases en condiciones no naturales, es decir, etapas específicas del virus, que normalmente fracasan más allá del nivel de especie. Se ha explorado la alteración del uso de codones en lo referente a: a) uso de codones desoptimizados, b) uso de codones optimizados, c) uso de emparejamiento de codones raro, d) reordenamiento de codones. Todas estas estrategias se basaron en la alteración de la estructura de ARN y/o de la traducción de proteínas.
Por el contrario, los medios de la divulgación no requieren la alteración de la estructura del ARN y no requieren necesariamente la alteración de la traducción de proteínas. Más bien, los medios implican el reemplazo de codones
por codones distintos, que se seleccionan para que difieran en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA.
Dichos codones diferentes, que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA, pueden citase en el presente documento como codones de "1-hasta-parada".
El reemplazo de codones sitúa al virus de ARN en una región precaria de su espacio de secuencia, donde se vuelve una víctima de su naturalmente alta tasa de mutación, de tal forma que se generan codones de PARADA mediante la mutación de dichos codones de "1-hasta-parada".
Ventajosamente, los medios de la divulgación implican el reemplazo de codones por otros codones, que difieren de los codones a los que (respectivamente) reemplazan y se seleccionan para que difieran en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA y que son sinónimos a los codones a los que (respectivamente) reemplazan. Más particularmente, los medios implican el reemplazo de codones que codifican Leu, Ser, Arg o Gly, por codones, que son sinónimos a los codones a los que (respectivamente) reemplazan y que difieren en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA.
La secuencia inicial de los virus de ARN, que se modifica de este modo por codones sinónimos, codifica la misma secuencia de aminoácidos que el virus de ARN no modificado (es decir, de tipo silvestre y/o infeccioso). Por lo tanto, al menos antes del primer ciclo de replicación, el virus de ARN modificado de este modo codifica las mismas proteínas que el virus de ARN de tipo silvestre y/o infeccioso y por lo tanto, el organismo hospedador lo reconoce de un modo similar a como lo haría con el virus de ARN no modificado (es decir, de tipo silvestre y/o infeccioso). Por lo tanto, el virus de ARN modificado de este modo de la invención induce una respuesta inmunitaria, que es la misma respuesta inmunitaria (o tipo de respuesta) que la que se induciría por el virus de ARN de tipo silvestre y/o infeccioso. Más particularmente, induce al menos un anticuerpo (o anticuerpos), que tiene la misma antigenicidad que un anticuerpo que se podría inducir por el virus o clon de tipo silvestre (es decir, infeccioso).
Como alternativa o de manera complementaria, la divulgación puede implicar el reemplazo de codones por codones, que difieren de los codones a los que (respectivamente) reemplazan y se seleccionan para que difieran en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA y que no son sinónimos a los codones a los que (respectivamente) reemplazan. Más particularmente, la divulgación puede implicar el reemplazo de codones que codifican Thr o Ala por codones, que codifican Ser y que difieren en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA. Dicho reemplazo de codones no sinónimos modifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas y por lo tanto, se seleccionan para no modificar (sustancialmente) la antigenicidad de las proteínas codificadas.
El virus modificado de la invención es hipersensible a las mutaciones perjudiciales o letales. La mutación se induce por la fidelidad insuficiente o defectuosa de la replicación vírica y puede acelerarse o aumentarse adicionalmente mediante la aplicación de agentes o factores mutagénicos.
Por lo tanto, el virus de ARN de la invención pierde su aptitud con el paso del tiempo (por la mutación de los codones de "1-hasta-parada" en codones de PARADA), es decir, el virus de ARN modificado de este modo es avirulento o no patógeno, con un alto grado de certidumbre.
Además, debido a que el reemplazo de codones se lleva a cabo en la región codificante, las regiones 5' y 3' (no codificantes), que son necesarias para la replicación y el empaquetamiento del virus, no se ven afectadas. Los virus modificados de la invención retienen de este modo la capacidad de replicación necesaria para la producción de vacunas.
En la invención, cuando se hace referencia a un virus (de ARN), se hace referencia igualmente (e implícitamente) a un clon de dicho virus (de ARN), tal como un clon de ARN, ADN o ADNc, más particularmente, un clon de ADN o ADNc, más particularmente, un clon de ADNc.
Por lo tanto, la invención se refiere a procesos de producción de un virus de ARN atenuado o de un clon atenuado del mismo, así como a un proceso de atenuación de un virus de ARN o un clon del mismo, más particularmente, a un proceso de atenuación de un virus de ARN infeccioso o de un clon infeccioso del mismo.
La invención también se refiere al virus de ARN o al clon atenuado en sí.
El proceso de la invención implica la atenuación, más particularmente la atenuación genética, de un virus de ARN o de un clon del mismo, más particularmente, de un virus de ARN infeccioso o de un clon infeccioso del mismo. Dicha atenuación o atenuación genética implica notablemente la alteración, más particularmente la reducción de, la robustez mutacional de dicho virus de ARN o un clon del mismo.
Dicho virus de ARN (infeccioso) o clon del mismo es un virus de ARN o un clon, que comprende una ADN polimerasa dependiente de ARN (por ejemplo, un retrovirus, tal como el VIH) o que comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN.
Ventajosamente, dicho virus de ARN (infeccioso) o clon del mismo es un virus de ARN o un clon, que comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN.
Más particularmente, dicho virus de ARN (infeccioso) o clon del mismo es un virus de ARN o un clon, que implementa una ARN polimerasa dependiente de ARN para la replicación.
Por lo tanto, el proceso de la invención comprende (o consiste en) la modificación del genoma de ARN de un virus de ARN (infeccioso), más particularmente, la modificación de la secuencia codificante de dicho genoma de ARN, es decir, la secuencia de CDS, que codifica la poliproteína del virus de ARN.
La invención también se refiere al virus o clon modificado en sí.
Puede usarse un clon (infeccioso) en lugar de dicho virus de ARN (infeccioso). El término "clon" se emplea en el presente documento de acuerdo con su significado convencional en el campo y abarca un clon de ARN, ADN o ADNc, más particularmente, un clon de ADN o ADNc, más particularmente, un clon de ADNc. Un clon es una célula recombinante. Un clon de ARN, ADN o ADNc comprende una secuencia de ARN, ADN o ADNc recombinante, respectivamente.
Más particularmente, un clon de ARN de un virus es una célula recombinante, que comprende una secuencia de ARN (recombinante), que es la secuencia codificante del genoma de dicho virus de ARN (es decir, que es la CDS, que codifica la poliproteína del virus de ARN). Por lo tanto, un clon de ARN puede comprender (de manera recombinante), el genoma de ARN de longitud completa o un fragmento del mismo, que ha conservado la CDS del mismo (por ejemplo, en donde dicho fragmento de genoma ha conservado la secuencia, que codifica la poliproteína de dicho virus de ARN). Más particularmente, un clon de ADN de un virus es una célula recombinante, que comprende una secuencia de ADN (recombinante), que es la versión de ADN de la CDS del genoma de dicho virus de ARN (es decir, la secuencia de ARN modificada mediante el reemplazo de cada nucleótido de U por un nucleótido de T). Por lo tanto, dicho clon de ADN puede comprender (de manera recombinante) la versión de ADN del genoma de longitud completa de dicho virus de aRn o un fragmento del genoma de longitud completa de dicho virus de ARN, en donde dicho fragmento de genoma ha conservado la secuencia de CDS de dicho genoma (por ejemplo, en donde dicho fragmento de genoma ha conservado la secuencia, que codifica la poliproteína de dicho virus de ARN).
Más particularmente, un clon de ADNc de un virus es una célula recombinante, que comprende una secuencia de ADNc (recombinante), que es la retrotranscripción de la CDS del genoma de dicho virus de ARN. Por lo tanto, dicho clon de ADNc puede comprender (de manera recombinante) la secuencia de ADNc, que es la retrotranscripción del genoma de longitud completa de dicho virus de ARN o la retrotranscripción de un fragmento del genoma de longitud completa de dicho virus de ARN, en donde dicho fragmento de genoma ha conservado la secuencia de CDS de dicho genoma (por ejemplo, en donde dicho fragmento de genoma ha conservado la secuencia, que codifica la poliproteína de dicho virus de ARN).
Más particularmente, dicho clon (de ARN, ADN o ADNc) comprende y puede expresar dicha secuencia (de ARN, ADN o ADNc). Más particularmente, dicho clon (de ARN, AdN o aDnc) comprende dicha secuencia (de ARN, ADN o ADNc) como un inserto de expresión en un vector de expresión, tal como un plásmido. Más particularmente, dicho clon (de ARN, ADN o ADNc) codifica (o expresa) partículas víricas de un virus de ARN.
Dicho clon (de ARN, ADN o ADNc) puede, por ejemplo, ser una célula humana recombinante, tal como una célula HeLa recombinante (ATCC® CCL-2 ™).
Dicho vector de expresión, más particularmente dicho plásmido, por lo tanto, puede ser, por ejemplo, un vector de expresión, más particularmente un plásmido, para la expresión recombinante en una célula humana, tal como una célula HeLa (ATCC® CCL-2™). Dicho vector de expresión, más particularmente dicho plásmido, puede comprender, por lo tanto, un promotor para la expresión recombinante de dicha secuencia (de ARN, ADN o ADNc) en dicha célula. El clon de un virus de ARN infeccioso es un clon infeccioso.
Por lo tanto, cuando se parte de un clon (infeccioso) de dicho virus de ARN (infeccioso), el proceso de la invención por lo tanto comprende (o consiste en) la modificación de la secuencia (recombinante) (es decir, la secuencia que se porta de manera recombinante por el clon (infeccioso) y que comprende la secuencia codificante del virus de ARN (infeccioso) o la versión en ADN o ADNc del mismo), más particularmente, la secuencia codificante (recombinante) de dicho clon.
El término "infeccioso" se emplea en el presente documento de acuerdo con su significado convencional en el campo y pretende abarcar "virulento" o la capacidad de inducir un fenotipo patógeno, más particularmente una enfermedad o trastorno. Un virus (de ARN) infeccioso puede infectar a un organismo diana, más particularmente a un animal diana (humano diana y/o animal no humano diana). Más particularmente, un virus (de ARN) infeccioso puede provocar una enfermedad o trastorno en dicho animal diana. Por ejemplo, un virus de la gripe infeccioso es un virus de la gripe, que puede infectar a un ser humano o a un mamífero no humano o a un ave (por ejemplo, a un ser humano), más particularmente, que puede provocar gripe en un ser humano o un mamífero no humano o un ave (por ejemplo, un ser humano).
Atenuación se emplea en el presente documento de acuerdo con su significado convencional en el campo. Más particularmente, la expresión "virus (de ARN) atenuado" o "clon (de ARN, ADN o ADNc) atenuado" indica un virus (de ARN) o un clon (de aRn, ADN o ADNc), que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus de tipo silvestre (es decir, en comparación con un virus infeccioso y/o virulento), más particularmente, en comparación con un virus de tipo silvestre del mismo género, especie, tipo o subtipo (es decir, en comparación con un virus infeccioso y/o virulento del mismo género, especie, tipo o subtipo).
Los términos "género", "especie", "tipo" y "subtipo" se emplean en el presente documento de acuerdo con su
significado convencional en el campo. Por ejemplo:
- virus de la gripe A es un género, mientras que virus de la gripe A H1N1 es un subtipo,
- virus de Coxsackie es un tipo de virus, mientras que el virus de Coxsackie B es un subtipo,
- el virus de la fiebre amarilla es una especie de virus (del género Flavivirus,
- el virus Chikunguña es una especie de virus (del género Alfavirus),
- el virus O'Nyong Nyong es una especie de virus (del género Alfavirus).
Los términos "género", "especie", "tipo" y "subtipo" abarcan por tanto el virus de Coxsackie (más particularmente el virus de Coxsackie A o B, más particularmente el virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente el virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente el virus de Coxsackie B, más particularmente el virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B4 o B6, más particularmente el virus de Coxsackie B3), virus de la fiebre amarilla, virus Chikunguña, virus O'Nyong Nyong y virus de la gripe (más particularmente, virus de la gripe A, B o C, más particularmente, virus de la gripe A, más particularmente, virus de la gripe A subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, virus de la gripe A subtipo H1N1).
Por ejemplo:
- un virus de Coxsackie o clon atenuado es un virus de Coxsackie o clon, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus de Coxsackie o clon infeccioso;
- un virus de Coxsackie B o clon atenuado es un virus de Coxsackie B o clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus de Coxsackie B o clon infeccioso;
- un virus de la fiebre amarilla o clon atenuado es un virus de la fiebre amarilla o clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con el virus de la fiebre amarilla o clon infeccioso;
- un virus Chikunguña o clon atenuado es un virus Chikunguña o un clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus Chikunguña o clon infeccioso;
- un virus O'Nyong Nyong o clon atenuado es un virus O'Nyong Nyong o clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus O'Nyong Nyong o clon infeccioso;
- un virus de la gripe o clon atenuado es un virus de la gripe o un clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus de la gripe o clon infeccioso;
- un virus de la gripe A o clon atenuado es un virus de la gripe A o un clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus de la gripe A o clon infeccioso; y
- un virus de la gripe A subtipo H1N1 o clon atenuado es un virus de la gripe A subtipo H1N1 o un clon del mismo, que tiene un fenotipo patógeno reducido en comparación con un virus de la gripe A subtipo H1N1 o clon infeccioso.
Los términos "género", "especie", "tipo" y "subtipo" abarca de manera similar Poliovirus (más particularmente, Poliovirus de los subtipos I, II y III), Enterovirus 71 (EV71), Enterovirus 68 (EV68), el virus de la fiebre aftosa, virus de la hepatitis A, virus Chikunguña, el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), el virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), el virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS), coronavirus del síndrome respiratorio de oriente medio (MERS), virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la fiebre del dengue, virus del Nilo occidental, virus del Zika (ZIKV), virus del Ébola, virus de la fiebre de Lassa, lisavirus.
Un fenotipo patógeno reducido abarca una capacidad infecciosa reducida y/o una capacidad replicativa reducida y/o un tropismo tisular reducido y/o restringido y/o un fallo o defecto en el ensamblaje de las partículas víricas, más particularmente, una capacidad infecciosa reducida.
Un fenotipo patógeno reducido, más particularmente, una capacidad infecciosa reducida, abarca una infección (vírica), que se impide, obstruye o retrasa, especialmente cuando se atenúan, retrasan o alivian los síntomas que acompañan o siguen a la infección o cuando el virus que infecta se elimina del hospedador.
Por ejemplo, un virus de Coxsackie o clon atenuado es un virus de Coxsackie o clon, que no provoca los síntomas de una enfermedad por virus de Coxsackie o que provoca síntomas atenuados, retrasados o más leves de una enfermedad de virus de Coxsackie.
Por ejemplo, un virus de la fiebre amarilla o clon atenuado es un virus de la fiebre amarilla o clon, que no provoca los síntomas de la fiebre amarilla o que provoca síntomas atenuados, retrasados o más leves de la fiebre amarilla.
Por ejemplo, un virus Chikunguña o clon atenuado es un virus Chikunguña o un clon, que no provoca los síntomas de la enfermedad del virus Chikunguña o que provoca síntomas atenuados, retrasados o más leves de la enfermedad del Chikunguña.
Por ejemplo, un virus O'Nyong Nyong o clon atenuado es un virus O'Nyong Nyong o clon, que no provoca los síntomas de la enfermedad de O'Nyong Nyong o que provoca síntomas atenuados, retrasados o más leves de la enfermedad de O'Nyong Nyong.
Por ejemplo, un virus de la gripe o clon atenuado, es un virus de la gripe o clon, que no provoca los síntomas de la enfermedad gripal o que provoca síntomas atenuados, retrasados o más leves de la enfermedad gripal.
De acuerdo con la invención, dicha modificación comprende o consiste en, el reemplazo de al menos un codón, es decir, uno o más codones, más particularmente, más de dos codones, en dicho virus de ARN (infeccioso) o clon (infeccioso). Cada codón que se reemplaza se reemplaza por un codón, que es diferente.
Dicho codón diferente puede ser un codón sinónimo o un codón no sinónimo, pero siempre difiere en tan solo un
nucleótido de un codón de PARADA.
Los codones de PARADA son UAA, UAG y UGA. La versión de ADN o ADNc de los codones de PARADA es TAA, TAG y TGA.
Ventajosamente, dicho codón diferente es un codón sinónimo, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA. El reemplazo por un codón diferente pero sinónimo se aplica notablemente a codones, que codifican Leu, Ser, Arg o Gly.
Por ejemplo, el codón CUU (que codifica Leu) y el codón AGU (que codifica Ser) se reemplazan por los codones UUA y UCG, respectivamente, debido a que:
- UUA codifica Leu y difiere en tan solo un nucleótido del codón de PARADA UAA (o del codón de PARADA UGA) y debido a que
- UCG codifica Ser y difiere en tan solo un nucleótido del codón de PARADA UAG.
El reemplazo por codones sinónimos no modifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas, al menos no antes del primer ciclo de replicación (es decir, al menos no antes de que se produzca la mutación en los codones de PARADA).
Por lo tanto, un virus de ARN o clon modificado de la invención, que se modifica únicamente mediante dichos reemplazos por codones sinónimos, difiere en la secuencia de nucleótidos del virus de ARN o clon (infeccioso) precursor, pero al menos antes del primer ciclo de replicación no difiere en su secuencia de aminoácidos (es decir, codifica las mismas partículas víricas que el virus de ARN o clon (infeccioso) precursor).
Como alternativa o de manera complementaria, más particularmente de manera complementaria, dichos codones diferentes pueden ser un codón no sinónimo, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA. El reemplazo por un codón diferente pero no sinónimo se aplica notablemente a codones, que codifican Thr o Ala, más particularmente a codones, que codifican Thr o Ala y que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de Ser. Los codones, que lo reemplazan (cada uno de ellos), son ventajosamente un codón, que codifica Ser y que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (es decir, el codón UCA o UCG).
Por ejemplo, el codón ACA, que codifica Thr, puede reemplazarse por el codón UCA, que difiere en tan solo un nucleótido del codón ACA, pero que codifica Ser y difiere del codón de PARADA UAA en tan solo un nucleótido.
El reemplazo por codones sinónimos modifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas. Más particularmente, aumenta el número o la proporción de codones de Ser. El reemplazo de codones no sinónimos se selecciona ventajosamente para que no modifique (sustancialmente) la antigenicidad de las proteínas que se codifican por la CDS modificada de este modo.
En otras palabras, un virus o clon atenuado de la invención difiere en su secuencia de nucleótidos pero no necesariamente en su secuencia de aminoácidos (al menos no antes del primer ciclo de replicación) del virus de tipo silvestre, en comparación con el cual tiene un fenotipo patógeno reducido.
El reemplazo de codones sinónimos y/o no sinónimos, más particularmente de sinónimos, aumenta drásticamente la sensibilidad del virus o clon (infeccioso) a la mutación perjudicial o letal, es decir, a mutaciones que introducen codones de PARADA en lugar de codones para aminoácidos.
El virus modificado o el clon modificado, que resulta de dicho reemplazo de codones, tiene un fenotipo patógeno atenuado en comparación con el virus de ARN o clon (infeccioso) precursor.
El reemplazo de codones por codones, que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA, aumenta las probabilidades de que dichos codones reemplazados se muten en un codón de PARADA después de uno o varios ciclos de replicación.
Esto es aún más cierto debido a que la ADN polimerasa dependiente de ARN y la ARN polimerasa dependiente de ARN, más particularmente, la ARN polimerasa dependiente de ARN, son polimerasas con baja fidelidad de incorporación, es decir, polimerasas, que tienden a introducir errores de replicación o mutaciones en la secuencia codificante. Se estima que la tasa de error de la ARN polimerasa dependiente de ARN es tan alta como de 10'3 a 10'6 por nucleótido copiado (en comparación con de 10'8 a 10'11 para la ADN polimerasa dependiente de ADN). Cuanto mayor sea el número de ciclos de replicación, mayores serán las probabilidades de que se generen codones de PARADA (mediante la mutación de los codones de "1-hasta-parada").
Por lo tanto, la divulgación proporciona medios para la atenuación genética de un virus de ARN (infeccioso) o de un clon (infeccioso) del mismo, que permiten al virus de ARN o clon atenuado replicarse hasta un punto tal que es suficiente para inducir una respuesta inmunitaria, pero que no es suficiente para inducir la enfermedad.
Un codón, que difiere en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA, puede citarse en el presente documento como un codón de "1-hasta-parada".
Dicho al menos un codón, que se reemplaza por un codón de "1-hasta-parada" pero sinónimo, es ventajosamente al menos un codón, que codifica Leu, Ser, Arg o Gly en dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso. La tabla 4 a continuación muestra los diferentes codones que codifican Leu, Ser, Arg y Gly e identifica aquellos codones, que son codones de "1-hasta-parada" (identificados por el símbolo "+" en la columna de la derecha).
T l 4: n in nim "1-h - r "
Por ejemplo, entre los codones, que codifican Leu, los codones CUU, CUC, CUA y CUG son adecuados para su reemplazo por el codón de "1-hasta-parada" UUA o UUG.
De manera similar, entre los codones, que codifican Ser, los codones UCU, UCC, AGU y AGC son adecuados para su reemplazo por el codón de "1-hasta-parada" UCA o UCG.
Entre los codones, que codifican Arg, los codones CGU, CGC, CGG, AGA, AGG son adecuados para su reemplazo por el codón de "1-hasta-parada" CGA.
Entre los codones, que codifican Gly, los codones GGU, GGC y GGG son adecuados para su reemplazo por el codón de "1-hasta-parada" GGA.
En otras palabras, dicho al menos un codón, que codifica Leu en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso (más particularmente en dicho clon de ADNc) y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo de "1-hasta-parada", se selecciona ventajosamente entre CUU, CUC, CUA y CUG en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, o entre CTT, cTc, CTA y CTG en dicho clon de aDn o ADNc infeccioso. El codón de Leu diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, se selecciona entre UUA o UUG para la atenuación de dicho virus de ARN o dicho clon de ARN o entre tAa y TTG para la atenuación de dicho clon de ADN o ADNc, respectivamente.
Dicho al menos un codón, que codifica Ser en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso (más particularmente en dicho clon de ADNc) y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo de "1-hasta-parada", se selecciona ventajosamente entre aGu, AGC, UCU y UCC en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, o entre AGT, AGC, TCT y TCC en dicho clon de ADN o ADNc infeccioso. El codón de Ser diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, se selecciona entre UCA y UCG para la atenuación de dicho virus de ARN o dicho clon de ARN o entre TCA y TCG para la atenuación de dicho clon de ADN o ADNc, respectivamente.
Dicho al menos un codón, que codifica Arg en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso (más particularmente en dicho clon de ADNc) y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo de "1-hasta-parada", se selecciona ventajosamente entre AGA, AGG, CGU, CGC o CGG en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, o entre AGA, AGG, CGT, CGC o CGG en dicho clon de ADN o ADNc infeccioso. El codón de Arg diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, es CGA para la atenuación de dicho virus de ARN o clon de ARN o para la atenuación de dicho clon de ADN o ADNc, respectivamente. Dicho al menos un codón, que codifica Gly en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso (más particularmente en dicho clon de ADNc) y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo de "1-hasta-parada", se selecciona ventajosamente entre Gg G, GGU o GGC en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, o entre GGG, GGT o GGC en dicho clon de ADN o ADNc infeccioso. El codón de Gly diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, es GGA para la atenuación de dicho virus de ARN o dicho clon de ARN o para la atenuación de dicho clon de ADN o ADNc, respectivamente.
Más particularmente, dicho al menos un codón, que codifica Ser en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso (más particularmente en dicho clon de ADNc) y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo de "1-hasta-parada", se selecciona entre AGU y AGC en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, o entre AGT y AGC en dicho clon de ADN o ADNc infeccioso. El codón de Ser diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, se selecciona entre UCA y UCG para la atenuación de dicho virus de ARN o en dicho clon de ARN o entre t Ca y TCG para la atenuación de dicho clon de ADN o ADNc, respectivamente.
Más particularmente, dicho al menos un codón, que codifica Arg en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso (más particularmente en dicho clon de ADNc) y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo de "1-hasta-parada", se selecciona entre AGA y AGG en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ARN, ADN o ADNc infeccioso. El codón de Arg diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, es CGA para la atenuación de dicho virus de ARN o para la atenuación de dicho clon de ARN, ADN o ADNc, respectivamente.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu o
- al menos un codón que codifica Ser o
- al menos un codón, que codifica Arg o
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón que codifica Ser y
- al menos un codón, que codifica Arg.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón que codifica Ser y
- al menos un codón, que codifica Arg y
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón, que codifica Arg y
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón que codifica Ser y
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón que codifica Ser y
- al menos un codón, que codifica Arg y
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón que codifica Ser.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Arg y
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón, que codifica Arg.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Leu y
- al menos un codón, que codifica Gly.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón que codifica Ser y
- al menos un codón, que codifica Arg.
De acuerdo con la invención, dicho reemplazo de codones sinónimos (es decir, dicho reemplazo por codones de "1-hasta-parada" diferentes pero sinónimos) puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón que codifica Ser y
- al menos un codón, que codifica Gly.
Como alternativa o de manera complementaria, más particularmente de manera complementaria, para dicho reemplazo de codones sinónimos, la divulgación puede comprender el reemplazo de codones por codones de "1-hasta-parada", que no son sinónimos a los codones a los que (respectivamente) reemplazan.
Dicho al menos un codón, que se reemplaza por un codón de "1-hasta-parada" pero no sinónimo, es ventajosamente al menos un codón, que codifica Thr o Ala en dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso. Dicho al menos un codón, que codifica Thr o Ala en dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso y que se va a reemplazar por un codón de Ser de "1-hasta-parada" no sinónimo, es ventajosamente un codón de Thr o Ala, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de Ser.
Los codones de "1-hasta-parada" pero no sinónimos, que los reemplazan, son codones, que codifican Ser y que difieren en tan solo un nucleótido respecto de un codón de PARADA, es decir, los codones de "1-hasta-parada" pero no sinónimos, que los reemplazan, son un codón, que se selecciona (cada uno independientemente) entre los codones UCA o UCG.
Dicho reemplazo por codones no sinónimos puede comprender el reemplazo de:
- al menos un codón, que codifica Thr en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que es ACA, en donde el codón, que codifica Ser y que lo reemplaza, es UCA para la atenuación de dicho virus de ARN o TCA para la atenuación de dicho clon de ADNc y/o
al menos un codón, que codifica Thr en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que es ACG, en donde el codón, que codifica Ser y que lo reemplaza, es UCG para la atenuación de dicho virus de ARN o TCG para la atenuación de dicho clon de ADNc y/o
al menos un codón, que codifica Ala en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que es GCA, en donde el codón, que codifica Ser y que lo reemplaza, es UCA para la atenuación de dicho virus de ARN o TCA para la atenuación de dicho clon de ADNc y/o
al menos un codón, que codifica Ala en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que es GCG, en donde el codón, que codifica Ser y que lo reemplaza, es UCG para la atenuación de dicho virus de ARN o TCG para la atenuación de dicho clon de ADNc.
A lo largo de la presente descripción, las expresiones "al menos un codón" (o expresiones equivalentes, tales como codones) abarcan cada una independientemente uno o más codones, más particularmente, varios codones, es decir, al menos dos codones, más particularmente, al menos 10 codones, más particularmente, al menos 20 codones, más particularmente, al menos 30 codones, más particularmente, al menos 40 codones.
Un número de al menos 50 codones o al menos 60 o al menos 70 o al menos 80 o al menos 90 o al menos 100 o al menos 110 codones, por ejemplo, un número de 117 codones o un número de al menos 150, también está abarcado independientemente en el presente documento por cada aparición de la expresión "al menos un codón".
Un número de al menos 500 o al menos 550 o al menos 600 codones, también está abarcado independientemente en el presente documento por cada aparición de la expresión "al menos un codón".
El reemplazo de codones de la invención (es decir, el reemplazo de al menos un codón (de Leu, Ser, Arg, Gly) por un codón de "1-hasta-parada" sinónimo y/o el reemplazo de al menos un codón (de Thr, Ala) por un codón (de Ser) de "1-hasta-parada" no sinónimo, más particularmente, el reemplazo de al menos un codón (de Leu, Ser, Arg, Gly) por un codón de "1-hasta-parada" sinónimo, comprende ventajosamente el reemplazo de varios de dichos al menos un codón.
Por ejemplo, al menos dos codones seleccionados entre codones de Leu, Ser, Arg y Gly se reemplazan cada uno por un codón diferente pero sinónimo (véase la tabla 4 anterior).
Por ejemplo, al menos dos codones seleccionados entre codones de Thr y Ala, que difieren cada uno en tan solo un nucleótido de un codón de Ser, se reemplazan cada uno por un codón de Ser, que en sí difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (es decir, por el codón UCA o UCG).
Por ejemplo, al menos dos codones seleccionados entre codones de Leu, Ser, Arg y Gly se reemplazan cada uno por un codón diferente pero sinónimo (véase la tabla 4 anterior) y al menos uno o dos codones seleccionados entre codones de Thr y Ala, que difieren cada uno en tan solo un nucleótido de un codón de Ser, se reemplazan (cada uno) por un codón de Ser, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (es decir, por el codón UCA o UCG).
Ventajosamente, no se reemplazan todos los codones de Leu, Ser, Arg y Gly del genoma vírico por un codón de "1-hasta-parada" sinónimo.
Ventajosamente, no se reemplazan todos los codones de Thr y Ala del genoma vírico por un codón de "1-hastaparada" no sinónimo (de Ser).
Ventajosamente, dicho reemplazo de codones se lleva a cabo en una región de nucleótidos de dicho virus de ARN o clon, cuya estructura secundaria no está implicada en la replicación vírica y/o en el empaquetado de las partículas víricas.
Por lo tanto, todos los codones, que se seleccionan para el reemplazo de acuerdo con la invención, más particularmente para el reemplazo por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención, están ubicados ventajosamente en una región de nucleótidos de dicho virus de ARN o clon, cuya estructura secundaria no está implicada en la replicación vírica y/o en el empaquetado de las partículas víricas.
Los ejemplos de estructuras secundarias, que están implicadas en la replicación vírica y/o en el empaquetado de las partículas víricas, comprenden destacablemente un bucle (tal como un bucle en horquilla, bucle protuberante, bucle interior o bucle con múltiples ramificaciones), un seudonudo, un tallo, un tallo-bucle.
Estas estructuras secundarias se ubican generalmente en los extremos 5' y 3' del genoma de ARN (región 5' no traducida o UTR y región 3' no traducida o 3'-UTR).
Algunas estructuras secundarias, que están implicadas en la replicación vírica y/o en el empaquetado de las partículas víricas, también pueden encontrarse en la región codificante del genoma de ARN (por ejemplo, el elemento de replicación de acción en Cis (CRE) en los Picornavirus). Ventajosamente, los reemplazos de codones de la invención (por codones de "1-hasta-parada") se llevan a cabo en una región codificante, que no comprende ninguna estructura secundaria que está implicada en la replicación vírica y/o en el empaquetado de las partículas víricas.
Por ejemplo, en el caso del virus de Coxsackie, la región P1 de la poliproteína no comprende estructura secundaria alguna que esté implicada en la replicación vírica y/o el empaquetado de las partículas víricas y por lo tanto, es una diana ventajosa para el reemplazo de codones de acuerdo con la invención.
Por ejemplo, en el caso del virus de la gripe, más particularmente del virus de la gripe A, más particularmente del virus de la gripe A, subtipo H1N1, la región PA no comprende estructura secundaria alguna que esté implicada en la replicación vírica y/o el empaquetado de las partículas víricas y por lo tanto, es una diana ventajosa para el reemplazo de codones de acuerdo con la invención (véase el ejemplo 5 más adelante). De manera similar, la región de HA del virus de la gripe, más particularmente del virus de la gripe A, más particularmente del virus de la gripe A, subtipo H1N1, no comprende estructura secundaria alguna que esté implicada en la replicación vírica y/o el empaquetado de las partículas víricas y por lo tanto, es una diana ventajosa para el reemplazo de codones de acuerdo con la invención (véase el ejemplo 7 más adelante).
Por ejemplo, en el caso del virus Chikunguña, la poliproteína C-E3-E2-6K-E1, más particularmente, la región E2-6K-E1 de la poliproteína, más particularmente la proteína E1 y/o la proteína E2, no comprende estructura secundaria alguna que esté implicada en la replicación vírica y/o el empaquetado de las partículas víricas y por lo tanto, es una diana ventajosa para el reemplazo de codones de acuerdo con la invención (véase el ejemplo 8 más adelante).
De acuerdo con la invención, los codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos), más particularmente al menos los codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos, pueden ubicarse en la misma secuencia codificante de proteína en la poliproteína codificada por el genoma de ARN de dicho virus de ARN infeccioso o codificado por la secuencia recombinante de dicho clon, respectivamente (por ejemplo, codificada por la secuencia de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc). Por ejemplo, en el caso del virus de Coxsackie, los codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos pueden estar ubicados en la proteína P1.
Por ejemplo, en el caso del virus de la gripe, más particularmente del virus de la gripe A, más particularmente del virus de la gripe A, subtipo H1N1, los codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos pueden estar todos ubicados en la proteína PA y/o en la proteína HA.
Por ejemplo, en el caso del virus Chikunguña, los codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos pueden estar ubicados en la poliproteína C-E3-E2-6K-E1, más particularmente, en la región E2-6K-E1 de la poliproteína, más particularmente en la proteína E1 y/o en la proteína E2.
La proporción de codones que se reemplazan de acuerdo con la invención (es decir, por codones sinónimos y/o no sinónimos de "1-hasta-parada"), más particularmente, la proporción de codones que se reemplazan por codones sinónimos de "1-hasta-parada" de acuerdo con la invención, puede ser, por ejemplo, del 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2 15 % o 2-10 %, más particularmente del 2-10 %, del número total de codones del genoma de dicho virus de ARN infeccioso o del número total de codones de la secuencia recombinante de dicho clon (por ejemplo, de la secuencia de CDS de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc). Dicha proporción puede, por ejemplo, ser una proporción del 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % o 30 %, más particularmente, una proporción del 3-29 %, 3-24 %, 3-19 %, 3-14 % o 3-9 % o del 4-30 %, 4-25 %, 4-20 %, 4-15 % o 4-10 %, por ejemplo, una proporción del 4-28 %, 4 23 %, 4-18 %, 4-13 % o 4-8 %, por ejemplo, una proporción del 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3 25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 %, por ejemplo, una proporción del 4-6 % o 5-6 %.
La secuencia codificante (CDS) del genoma de dicho virus de ARN infeccioso o la secuencia recombinante de dicho clon (por ejemplo, la secuencia de ADN retrotranscrita de dicho clon de ADNc) puede, por ejemplo, comprender más de 2.000 nucleótidos. Puede, por ejemplo, consistir en 2.000 - 30.000 nucleótidos, es decir, 666 - 10.000 codones. El número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos) de acuerdo con la invención, más particularmente, el número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención, puede variar, por lo tanto, de 13 a 199 codones (2-30 %), más particularmente, de 13 a 66 codones (2-10 %), para una CDS de genoma de 2.000 nucleótidos o de 200 a 3.000 codones (2-30 %), más particularmente, de 200 a 1.000 codones (2-10 %), para una CDS de genoma de 30.000 nucleótidos.
El número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos) de acuerdo con la invención, más particularmente, el número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención, puede, por ejemplo, ser de 13 o más, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 110 o más.
El número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos) de acuerdo con la invención, más particularmente, el número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención, puede, por ejemplo, ser de 3.000 o menos, 2.500 o menos, 2.000 o menos, 1.500 o menos, 1.000 o menos, 900 o menos, 800 o menos, 700 o menos, 600 o menos, 500 o menos, 400 o menos, 300 o menos, 200 o menos, 150 o menos, 120 o menos. Cada combinación del número máximo y mínimo de codones reemplazados está abarcada explícitamente por la invención. Por ejemplo, el número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos) de acuerdo con la invención, más particularmente, el número de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención, puede, por ejemplo, ser de 13-3.000, 13-2.500, 13-2.000, 13-1.500, 13-1.000, de 13-500, de 15-500, de 20-200, de 80-200 o de 100-120, por ejemplo, de 117 o 110.
El número o la proporción de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos) de acuerdo con la invención, más particularmente, el número o la proporción de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención, se selecciona para ser lo suficientemente elevada como para lograr el nivel de reducción deseado del fenotipo patógeno (por ejemplo, reducción del tropismo tisular y/o de la capacidad de replicación), pero lo suficientemente baja como para evitar la inactivación vírica (es decir, para lograr atenuación, mientras se conserva la viabilidad del virus o el clon modificado). El número o la proporción de codones que se reemplazan por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos) de acuerdo con la invención, más particularmente, el número de codones que se reemplazan por codones de "1-hastaparada" sinónimos de acuerdo con la invención, es ventajosamente lo suficientemente baja como para no perder la capacidad para inducir una respuesta inmunitaria, más particularmente, para seguir produciendo una respuesta inmunitaria o un tipo de respuesta inmunitaria, que es similar al que podría inducirse por el virus o el clon infeccioso (es decir, no modificado).
Por ejemplo, para un virus de Coxsackie, pueden reemplazarse todos los codones de Leu y Ser o todos los codones
de Leu, Ser, Arg y Gly de la proteína P1 por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención (véanse los ejemplos 1, 5 y 6 más adelante). Por ejemplo, para un virus de la gripe, pueden reemplazarse todos los codones de Leu y Ser o todos los codones de Leu, Ser, Arg y Gly de la proteína PA y/o la proteína HA por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención (véanse los ejemplos 1, 5 y 7 más adelante). Por ejemplo, para un virus Chikunguña, pueden reemplazarse todos los codones de Leu y Ser o todos los codones de Leu, Ser, Arg y Gly de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 por codones de "1-hasta-parada" sinónimos de acuerdo con la invención (véanse los ejemplos 1, 5 y 8 más adelante).
Ventajosamente, un virus o clon atenuado de la invención sigue siendo un virus o clon vivo. Más particularmente, un virus o clon atenuado de la invención sigue siendo capaz de lograr al menos un ciclo de replicación, por ejemplo, al menos dos ciclos de replicación (más particularmente, al menos dos ciclos de replicación en el animal o ser humano diana, que es la diana natural del virus o clon infeccioso).
Ventajosamente, un virus o clon atenuado de la invención estimula o es capaz de estimular una respuesta inmunitaria cuando se administra a dicho animal.
La expresión "respuesta inmunitaria" se emplea de acuerdo con su significado convencional en el campo e incluye uno o varios de producción de anticuerpos, inducción de inmunidad mediada por células, activación del complemento, desarrollo de tolerancia inmunológica, alteración de la producción de citocinas y alteración de la producción de quimiocinas, más particularmente, producción de anticuerpos. La producción de anticuerpos abarca la producción de anticuerpos neutralizantes, más particularmente, la seroneutralización.
Ventajosamente, el reemplazo de codones (sinónimos y/o no sinónimos) de la invención, más particularmente, al menos el reemplazo de codones sinónimos de la invención, no modifica (sustancialmente) la naturaleza de la respuesta inmunitaria humoral que de otro modo se induciría por el virus o clon infeccioso. Ventajosamente, el reemplazo de codones (sinónimos y/o no sinónimos) de la invención, más particularmente, al menos el reemplazo de codones sinónimos de la invención, no modifica (sustancialmente) la naturaleza de la inmunidad humoral y mediada por células que de otro modo se induciría por el virus o clon infeccioso. Ventajosamente, el reemplazo de codones (sinónimos y/o no sinónimos) de la invención, más particularmente, al menos el reemplazo de codones sinónimos de la invención, no modifica (sustancialmente) la naturaleza y el alcance de la respuesta humoral que de otro modo se induciría por el virus o clon infeccioso.
Ventajosamente, el reemplazo de codones (sinónimos y/o no sinónimos) de la invención, más particularmente, al menos el reemplazo de codones sinónimos de la invención, no modifica (sustancialmente) la naturaleza y el alcance de la respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células que de otro modo se induciría por el virus o clon infeccioso. Más particularmente, el reemplazo de codones (sinónimos y/o no sinónimos) de la invención, más particularmente, al menos el reemplazo de codones sinónimos de la invención, no modifica (sustancialmente) las propiedades antigénicas de las proteínas codificadas, es decir, las propiedades antigénicas de la proteína (o de aquellas proteínas), que están codificadas por una CDS, que se ha modificado mediante dicho reemplazo de codones (es decir, la CDS modificada de acuerdo con la invención pero antes de las mutaciones del codón de PARADA). En otras palabras, dichas proteínas codificadas (es decir, aquellas proteínas, que están codificadas por una CDS, que se han modificado mediante dicho reemplazo de codones) inducen (todas ellas) al menos un anticuerpo, que tiene la misma antigenicidad (es decir, la misma propiedad de unión a antígeno) que un anticuerpo que de otro modo se induciría por el virus o clon infeccioso.
Dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso es ventajosamente un virus de ARN o un clon infeccioso, que es un patógeno humano y/o un patógeno animal.
En la presente invención, el término "humano" abarca un recién nacido o neonato (más particularmente, de 1 día de edad a menos de 4 semanas de edad), un bebé (más particularmente, de 4 semanas de edad a menos de 1 año de edad), un niño (más particularmente, de 1 año de edad a menos de 12 años de edad), un adolescente (más particularmente, de 12 años de edad a menos de 18 años de edad), un adulto (más particularmente, de 18 años de edad a 60 años de edad y un anciano (de más de 60 años de edad, más particularmente, de más de 65 años de edad, más particularmente, de más de 70 años de edad, más particularmente, de más de 75 años de edad, más particularmente, de más de 80 años de edad). Dicho ser humano puede, por ejemplo, ser un ser humano inmunodeprimido, más particularmente, un adulto inmunodeprimido.
Dicho ser humano puede, por ejemplo, ser un recién nacido o neonato, un niño, un adulto inmunodeprimido o un anciano.
En la presente invención, el término "animal" abarca un mamífero o un ave, más particularmente un mamífero no humano o un ave.
Dicho mamífero no humano puede, por ejemplo, ser un caballo, ganado (más particularmente una vaca), un cerdo (más particularmente, Sus domesticus), un mono (más particularmente, un grivet, un macaco Rhesus o un macaco cangrejero) o un roedor (más particularmente, un ratón).
Dicho ave puede, por ejemplo, ser un ave doméstica, más particularmente aves de corral, más particularmente, una Galliforme o Anseriforme, más particularmente una Galliforme, más particularmente, un pavo, ave silvestre o pollo, más particularmente, pollos.
Dicho virus de ARN (infeccioso) es ventajosamente un virus de ARN monocatenario, más particularmente, un virus de ADN monocatenario de sentido positivo o un virus de ARN monocatenario de sentido negativo. Ventajosamente, dicho
virus de ADN (infeccioso) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo o sentido negativo, que comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN, más particularmente, un virus de ARN monocatenario de sentido positivo o sentido negativo, que implementa una ARN polimerasa dependiente de ARN para la replicación.
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente un virus de ARN, más particularmente, un virus de ARN patógeno humano y/o animal, que es de la familia Picornaviridae o de la familia Togaviridae o de la familia Coronaviridae o de la familia Flaviviridae (virus de ARN monocatenarios de sentido positivo, que comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN).
Dicho virus de ARN (infeccioso) de la familia Picornaviridae es ventajosamente un Enterovirus, un Apthovirus o un Hepatovirus.
Más particularmente, dicho Enterovirus es un Enterovirus A, B, C o D, más particularmente, un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente un virus de Coxsackie B3), Enterovirus 71 (EV71) un Poliovirus (PV-1, PV-2 o PV-3) o Enterovirus 68 (EV68).
Dicho Enterovirus es ventajosamente un Enterovirus A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, un virus de Coxsackie B (más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente un virus de Coxsackie B3), Enterovirus 71 (EV71). Dicho Enterovirus es ventajosamente un virus de Coxsackie A2 o un virus de Coxsackie B (más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), más particularmente, un virus de Coxsackie B (más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), por ejemplo un virus de Coxsackie cuya secuencia de CDS de ADNc comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 (véase el ejemplo 1 más adelante).
Dicho enterovirus es ventajosamente un patógeno humano.
Más particularmente, dicho Aphtovirus es el virus de la fiebre aftosa, más particularmente, el virus, que provoca la enfermedad de la fiebre aftosa en el ganado, más particularmente en vacas.
Dicho Aphtovirus es, ventajosamente, un patógeno animal, más particularmente, un patógeno de mamífero no humano, más particularmente, un patógeno de ganado, más particularmente, un patógeno de vacas.
Más particularmente, dicho Hepatovirus es un virus de la Hepatitis A. Dicho Hepatovirus es ventajosamente un patógeno humano.
Más particularmente, dicho virus de ARN infeccioso de la familia Togaviridae es un Alphavirus, más particularmente, un virus Chikunguña, un virus O'Nyong Nyong (ONNV), un virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), un virus de la encefalitis equina oriental (EEEV) o un virus de la encefalitis equina occidental (WEEV).
Dicho virus de ARN de la familia Togaviridae es ventajosamente un patógeno humano, tal como un virus Chikunguña o un ONNV, más particularmente, un virus Chikunguña.
Por ejemplo, dicho virus Chikunguña es el virus Chikunguña, cepa CHIKV 06-049 del sublinaje de las islas del Océano Índico (n.° de referencia de GENBANK AM258994 versión 1) o una de las siguientes cepas del virus Chikunguña: cepa 05-115 (n.° de referencia de GENBANK AM258990 versión 1), cepa 05-209 (n.° de referencia de GENBANK AM258991 versión 1), cepa 06-021 (n.° de referencia de GENBANK AM258992 versión 1), cepa 06-027 (n.° de referencia de GENBANK aM258993 versión 1), cepa 06-049 (n.° de referencia de GENBANK AM258994 versión 1), cepa 05-061 (n.° de referencia de GENBANK AM258995 versión 1) (véase Schuffenecker et al. 2006; véase el ejemplo 4 más adelante), cepa M100 (n.° de referencia de GENBANK LN898093.1), cepa G100 (n.° de referencia de GeNBANK LN898094.1), cepa M101 (n.° de referencia de GENBANK LN898095.1), cepa M102 (n.° de referencia de GENBANK LN898096.1), cepa G101 (n.° de referencia de GENBANK LN898097.1), cepa G102 (n.° de referencia de GENBANK LN898098.1), cepa G103 (n.° de referencia de GENBANK LN898099.1), cepa M103 (n.° de referencia de GENBANK LN898100.1), cepa M104 (n.° de referencia de GENBANK LN898101.1), cepa G104 (n.° de referencia de GENBANK LN898102.1), cepa G105 (n.° de referencia de GENBANK LN898103.1), cepa M105 (n.° de referencia de GENBANK LN898104.1), cepa M106 (n.° de referencia de GENBANK LN898105.1), cepa M107 (n.° de referencia de GENBANK LN898106.1), cepa M108 (n.° de referencia de GENBANK LN898107.1), cepa M109 (n.° de referencia de GENBANK LN898108.1), cepa M110 (n.° de referencia de GENBANK LN898109.1), cepa G106 (n.° de referencia de GENBANK LN898110.1), cepa G107 (n.° de referencia de GENBANK LN898111.1) o cepa Mill (n.° de referencia de GENBANK LN898112.1).
Por ejemplo, dicho virus O'Nyong Nyong es el virus O'Nyong Nyong cepa (n.° de referencia de GENBANK M20303.1). Dicho virus de ARN infeccioso de la familia Togaviridae es ventajosamente un patógeno animal, más particularmente, un patógeno de mamífero no humano, más particularmente, un patógeno de caballos, tal como un VEEV, EEEV o WEEV.
Más particularmente, dicho virus de ARN infeccioso de la familia Coronaviridae es un virus de la subfamilia Coronavirinae, más particularmente, un coronavirus del Síndrome respiratorio agudo grave (SARS) o un coronavirus del síndrome respiratorio de oriente medio (MERS).
Dicho virus de aRn infeccioso de la familia Coronaviridae es ventajosamente un patógeno humano.
Más particularmente, dicho virus de ARN infeccioso de la familia Flaviviridae es un Flavivirus, más particularmente, un virus de la encefalitis japonesa (JEV), un virus del Dengue, un virus del Nilo occidental, un virus de la fiebre amarilla o un virus del Zika (ZIKV). Por ejemplo, dicho virus de la fiebre amarilla es el virus de la fiebre amarilla, cepa Asibi (n.° de referencia de GeNBANK AY640589; véase el ejemplo 3 más adelante).
Dicho virus de ARN infeccioso de la familia Flaviviridae es ventajosamente un patógeno humano.
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente un virus de ARN, más particularmente, un virus de ARN patógeno humano y/o animal, que es de la familia Orthomyxoviridae (virus de ARN monocatenarios de sentido negativo, que comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN).
Dicho virus de ARN de la familia Orthomyxoviridae es ventajosamente un virus de la gripe A, B o C, más particularmente un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente un virus de la gripe A subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A subtipo H1N1.
Por ejemplo, dicho virus de la gripe A es el virus de la gripe, cepa ATCC® VR-1337™ (virus de la gripe tipo A subtipo H1N1; véanse los ejemplos 2 y 5 más adelante).
Por ejemplo, dicho virus de la gripe A es un virus de la gripe de tipo A, subtipo H1N1, que comprende una o varias de las siguientes características:
la secuencia codificante de PB2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 59,
la secuencia codificante de PB1 es la secuencia de la SEQ ID NO: 62,
la secuencia codificante de PB1-F2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 64,
la secuencia codificante de NP es la secuencia de la SEQ ID NO: 70,
la secuencia codificante de NA es la secuencia de la SEQ ID NO: 73,
la secuencia codificante de M1 es la secuencia de la SEQ ID NO: 76,
la secuencia codificante de M2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 78,
la secuencia codificante de NS1 es la secuencia de la SEQ ID NO: 81 y la secuencia codificante de NS2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 83.
Dicho virus de la gripe de tipo A, subtipo H1N1 puede comprender además una de las siguientes características:
la secuencia codificante de PA es la secuencia de la SEQ ID NO: 49 o 51 o
la secuencia codificante de HA es la secuencia de la SEQ ID NO: 67.
Dicho virus de ARN infeccioso es de la familia Orthomyxoviridae, ventajosamente, es un patógeno humano y/o un patógeno animal, más particularmente, un patógeno humano y/o de animal no humano y/o aviar, más particularmente, un patógeno humano y/o de cerdo (Sus domesticus) y/o de foca y/o de caballo y/o aviar, más particularmente, un patógeno humano.
El término ave abarca notablemente aves domésticas, más particularmente aves de corral, más particularmente, Galliformes y/o Anseriformes, más particularmente, Galliformes, más particularmente, pavos y/o aves silvestres y/o pollos, más particularmente, pollos.
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie b3) o Enterovirus 71 (EV71) o
- el virus de la fiebre aftosa, más particularmente, el virus, que provoca la enfermedad de la fiebre aftosa en el ganado, más particularmente, en vacas o
- un virus Chikunguña o un virus O'Nyong Nyong o un VEEV, un EEEV o un WEEV o
- un coronavirus, más particularmente, un coronavirus del SARS o un coronavirus del MERS o
- un virus de la encefalitis japonesa (JEV), un virus de la fiebre del dengue, un virus del Nilo occidental, un virus de la fiebre amarilla o un virus del Zika (ZIKV) o
- un virus de la gripe, más particularmente un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1.
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie b3) o Enterovirus 71
(EV71) o
- un virus Chikunguña o un virus O'Nyong Nyong o
- un coronavirus, más particularmente, un coronavirus del SARS o un coronavirus del MERS o
- un virus de la encefalitis japonesa (JEV), un virus de la fiebre del dengue, un virus del Nilo occidental, un virus de la fiebre amarilla o un virus del Zika (ZIKV) o
- un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- el virus de la fiebre aftosa, más particularmente, el virus, que provoca la enfermedad de la fiebre aftosa en el ganado, más particularmente, en vacas o
- un VEEV, un EEEV o un WEEV o
- un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B3) o Enterovirus 71 (EV71) o
- un virus de la encefalitis japonesa (JEV), un virus de la fiebre del dengue, un virus del Nilo occidental, un virus de la fiebre amarilla o un virus del Zika (ZIKV) o
- un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie b 3) o Enterovirus 71 (EV71) o
- un virus de la fiebre amarilla o
- un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B3) o
- un virus de la fiebre amarilla o
- un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente
- un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B3 o
- un virus de la fiebre amarilla o
- un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2
o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente un virus de Coxsackie, más particularmente, un virus de Coxsackie A o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B o A1, más particularmente, un virus de Coxsackie A2 o B, más particularmente, un virus de Coxsackie A2, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus de Coxsackie B3.
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, B o C, más particularmente, un virus de la gripe A o B, más particularmente un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2 o H5N1 o H7N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1 o H3N2, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1).
Dicho virus de ARN infeccioso es ventajosamente un virus Chikunguña o un virus O'Nyong Nyong, más particularmente, un virus Chikunguña.
Las características de la familia, tipo o subtipo de virus, que se han indicado anteriormente para definir adicionalmente el virus de ARN infeccioso, se aplican al clon infeccioso, así como al virus o clon atenuado de la invención, haciendo los cambios necesarios.
Un clon infeccioso de un virus de ARN infeccioso por lo general es de la misma familia, género, especie, tipo o subtipo que un virus de ARN infeccioso. El virus o clon atenuado de la invención es ventajosamente de la misma familia, género, especie, tipo o subtipo que dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
Por ejemplo, cuando dicho virus de ARN infeccioso es un virus de la gripe, el virus atenuado de la invención es un virus de la gripe (vivo y) atenuado. En caso de que dicho virus de la gripe sea de la especie A, el virus atenuado de la invención es un virus (vivo y) atenuado de la invención que es generalmente un virus de la gripe de la especie A. De manera similar, en caso de que dicho virus de la gripe A infeccioso sea del subtipo H1N1, el virus atenuado de la invención es un virus (vivo y) atenuado de la invención que es generalmente un virus de la gripe A de subtipo H1N1. Por ejemplo, el virus de a Rn infeccioso puede ser un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1), en donde la secuencia de ADNc que codifica la proteína PA de dicho virus de la gripe infeccioso es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 o 51. El virus de la gripe (vivo y) atenuado de la invención puede ser, por lo tanto, un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, más particularmente un virus de la gripe A, subtipo H1N1), en donde la secuencia de ADN que codifica la proteína PA de dicho virus de la gripe atenuado es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 54 o 56, respectivamente (véase el ejemplo 5 más adelante).
Por ejemplo, el virus de ARN infeccioso puede ser un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, más particularmente, un virus de la gripe A, subtipo H1N1), en donde la secuencia de ADNc que codifica la proteína HA de dicho virus de la gripe infeccioso es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 67. El virus de la gripe (vivo y) atenuado de la invención puede ser, por lo tanto, un virus de la gripe (más particularmente, un virus de la gripe A, más particularmente un virus de la gripe A, subtipo H1N1), en donde la secuencia de ADN que codifica la proteína HA de dicho virus de la gripe atenuado es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 87 (véase el ejemplo 7 más adelante).
De manera similar, cuando dicho virus de ARN infeccioso es un virus de Coxsackie, el virus atenuado de la invención es un virus de Coxsackie (vivo y) atenuado. En caso de que dicho virus de Coxsackie infeccioso sea del subtipo B, el virus atenuado de la invención es un virus (vivo y) atenuado de la invención que generalmente es un virus de Coxsackie de subtipo B.
Por ejemplo, el virus de ARN infeccioso puede ser un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), en donde la secuencia de ADNc que codifica la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie infeccioso es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4. El virus de Coxsackie (vivo y) atenuado de la invención puede ser, por lo tanto, un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), en donde la secuencia de ADNc que codifica la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie atenuado es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14. La secuencia de la SEQ ID NO: 4 es la secuencia codificante de P1 de ADNc de tipo silvestre de un virus de Coxsackie infeccioso (más particularmente, un virus de Coxsackie B infeccioso, más particularmente, de un virus de Coxsackie B3 infeccioso). La secuencia de SEQ ID NO: 14 es la secuencia de SEQ ID NO: 4 modificada de acuerdo con la invención mediante el reemplazo de un total de 117 codones de Leu y Ser por codones de "1-hasta-parada" (de Leu y Ser). Téngase a bien ver el ejemplo 1 más adelante. Como alternativa, el virus de Coxsackie (vivo y) atenuado de la invención puede ser un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), en donde la secuencia de ADNc que codifica la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie atenuado es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 85 (véase el ejemplo 6 más adelante).
Por ejemplo, cuando el virus de ARN infeccioso es un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), en donde la secuencia de ADNc que codifica la poliproteína de dicho virus de Coxsackie infeccioso es la secuencia de SEQ ID NO: 2 o 1, el virus de Coxsackie (vivo y) atenuado de la invención puede ser un virus de Coxsackie (más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente, un virus de Coxsackie B3), en donde la secuencia de ADNc que codifica la poliproteína de dicho virus de Coxsackie
atenuado es la secuencia de SEQ ID NO: 13 o 12, respectivamente.
La secuencia de la SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADNc del genoma de longitud completa de un virus de Coxsackie infeccioso (más particularmente, un virus de Coxsackie B, más particularmente un virus de Coxsackie B3). La secuencia de SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ADNc de la CDS de este virus de Coxsackie infeccioso. La secuencia de SEQ ID NO: 12 es la secuencia de SEQ ID NO: 1 modificada de acuerdo con la invención mediante el reemplazo de un total de 117 codones de Leu y Ser de la proteína P1 por codones de "1-hasta-parada" (de Leu y Ser). La secuencia de SEQ ID NO: 13 es la secuencia de SEQ ID NO: 2 modificada de acuerdo con la invención mediante el reemplazo de un total de 117 codones de Leu y Ser de la proteína P1 por codones de "1-hasta-parada" (de Leu y Ser). Téngase a bien ver el ejemplo 1 más adelante.
De manera similar, cuando dicho virus de ARN infeccioso es un virus Chikunguña, el virus atenuado de la invención es un virus Chikunguña (vivo y) atenuado.
Por ejemplo, el virus de ARN infeccioso es un virus Chikunguña, en donde la secuencia de ADNc que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 de dicho virus Chikunguña infeccioso es o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 104. El virus Chikunguña (vivo y) atenuado de la invención puede ser, por lo tanto, un virus Chikunguña, en donde la secuencia de ADNc que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 de dicho virus Chikunguña es o comprende la secuencia de SEQ ID No : 101 o de s Eq ID NO: 102 (véase el ejemplo 8 más adelante).
En la invención, la CDS del virus de ARN infeccioso o del clon infeccioso del mismo se modifica mediante el reemplazo de ciertos codones por codones diferentes pero sinónimos. Este cambio de codones puede afectar a algunas características de la secuencia de nucleótidos, tales como:
- el sesgo de pares de codones (CPB) y/o
- el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o TpA para secuencias de ADN o ADNc) y/o
- el contenido de GC.
El cambio de codones puede dar como resultado un cambio (significativo) del CPB o, por el contrario, una ausencia de cambio (significativo) en el CPB.
El sesgo de pares de codones (CPB) se emplea de acuerdo con su significado convencional en el campo. El CPB es el hecho observado de que dentro de una CDS, ciertos codones, que corresponden a dos aminoácidos (diferentes), se encuentran directamente adyacentes entre sí, con frecuencias menores o mayores de las esperadas en caso de que estos codones se situasen aleatoriamente próximos entre sí. El CPB puede cuantificarse basándose en estadística y el sesgo general de una CDS dada (excluyendo pares de codones de parada) puede determinarse por un experto habitual en la materia.
De acuerdo con la invención, el CPB del virus de ARN infeccioso o el clon infeccioso del mismo puede estar no cambiado significativamente, más particularmente, no cambiado. Por lo tanto, el CPB del virus modificado o clon modificado de la invención (es decir, el virus o clon atenuado de la invención) puede no ser diferente o no significativamente diferente al CPB de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
Como alternativa, el CPB del virus de ARN infeccioso o el clon infeccioso del mismo puede estar cambiado. Por lo tanto, el CPB del virus modificado o el clon modificado de la invención (es decir, el virus o clon atenuado de la invención) puede ser diferente o significativamente diferente al CPB de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso, por ejemplo, para aumentar la representación de pares de codones infrarrepresentados.
El sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA se emplea de acuerdo con su significado convencional en el campo. El sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA es el hecho observado de que estos dinucleótidos se producen con una frecuencia mucho menor en la secuencia de virus de ARN que la que podría esperarse debido al azar.
El cambio de codones puede dar como resultado un cambio (significativo) del sesgo de dinucleótidos de CpG y/o en el sesgo de dinucleótidos de UpA (o TpA) o, por el contrario, en ausencia de un cambio (significativo) en el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o en el sesgo de dinucleótidos de UpA (o TpA).
De acuerdo con la invención, el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o TpA) del virus de ARN infeccioso o el clon infeccioso del mismo puede no estar cambiado significativamente, más particularmente, no cambiado.
Por lo tanto, el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o T pA) del virus modificado o el clon modificado de la invención (es decir, del virus atenuado o el clon atenuado de la invención) puede no ser (significativamente) diferente al sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o TpA) de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
Más particularmente, el sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA (o TpA) del virus modificado o el clon modificado de la invención (es decir, del virus atenuado o el clon atenuado de la invención) puede no ser (significativamente) diferente al sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA (o TpA) de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
Más particularmente, el sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA del virus modificado puede no ser (significativamente) diferente al sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA de dicho virus de ARN infeccioso y el sesgo de dinucleótidos de CpG y TpA de dicho clon de ADNc modificado puede no ser (significativamente) diferente al sesgo de dinucleótidos de CpG y TpA de dicho clon de ADNc infeccioso.
Como alternativa, el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o TpA) del virus de ARN infeccioso o el clon infeccioso del mismo puede estar cambiado, por ejemplo, para aumentar el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o TpA).
Por lo tanto, el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o T pA) del virus modificado o el clon modificado de la invención (es decir, del virus o clon atenuado de la invención) puede ser (significativamente diferente) de, más particularmente (significativamente) mayor que, el sesgo de dinucleótidos de CpG y/o UpA (o TpA) de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
Más particularmente, el sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA del virus modificado puede ser (significativamente) diferente de, más particularmente (significativamente) mayor que, el sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA de dicho virus de ARN infeccioso y el sesgo de dinucleótidos de CpG y TpA de dicho clon de ADNc modificado puede ser (significativamente) diferente de, más particularmente (significativamente) mayor que, el sesgo de dinucleótidos de CpG y TpA de dicho clon de ADNc infeccioso.
El cambio de codones puede dar como resultado un cambio (significativo) del contenido de GC o, por el contrario, en ausencia de un cambio (significativo) en el contenido de GC. Por lo tanto, el contenido de GC del virus modificado o el clon modificado de la invención (es decir, del virus o el clon atenuado de la invención) puede ser o no (significativamente) diferente al contenido de GC de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso. Más particularmente, el contenido de GC del virus modificado o el clon modificado de la invención (es decir, del virus o el clon atenuado de la invención) no es (significativamente) diferente al contenido de GC de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
El reemplazo por un codón de "1-hasta-parada" (sinónimo o no sinónimo, más particularmente sinónimo) de la invención puede ser el único tipo de modificación efectuado en la secuencia de nucleótidos de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso.
Como alternativa, las modificaciones efectuadas en la secuencia de nucleótidos de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso puede comprender modificaciones distintas de las de dicho reemplazo por codones de "1-hastaparada" (sinónimo o no sinónimo, más particularmente, sinónimo) de la invención. Dichas otras modificaciones pueden efectuarse por un experto habitual en la materia, por ejemplo, para reducir la fidelidad de la replicación para aumentar la tasa de mutación o para aumentar la fidelidad de replicación para reducir la frecuencia de mutación o para aumentar adicionalmente la atenuación o para mejorar la tasa de replicación.
Más particularmente, las modificaciones efectuadas en la secuencia de nucleótidos de dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso pueden comprender el reemplazo de la secuencia codificante para la polimerasa (ADN polimerasa dependiente de ARN o ARN polimerasa dependiente de ARN) del virus o clon infeccioso por una secuencia (ARN, ADN o ADNc) que codifica una polimerasa (ADN polimerasa dependiente de ARN o ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente), que tiene una fidelidad de incorporación de nucleótidos menor o mayor.
Más particularmente, en referencia a los virus de ARN o clones infecciosos, que comprenden una ARN polimerasa dependiente de ARN (más particularmente, que la implementan para replicación), las modificaciones efectuadas en la secuencia de nucleótidos del virus de ARN infeccioso o el clon infeccioso pueden comprender el reemplazo de la secuencia que codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus o clon infeccioso por una secuencia (de ARN, ADN o ADNc) que codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN, que tiene una fidelidad de incorporación de nucleótidos menor o mayor.
Al menos en lo referente al virus de Coxsackie, los ejemplos de ARN polimerasa dependiente de ARN, que tiene una menor fidelidad de incorporación de nucleótidos (es decir, una menor fidelidad de copia), comprenden de manera destacable el mutante de A239G, Y268W, I230F, Y268H, P48K, S299T o F232Y de una ARN polimerasa dependiente de ARN de un virus de Coxsackie B3 de tipo silvestre (es decir, infeccioso), por ejemplo, el mutante de A239G, Y268W, I230F, Y268H, P48K, F232Y o S299T de SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21, respectivamente.
El mutante de A239G de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de A239G de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRL 5O
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDGSLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDYLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 15
El mutante de Y268W de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de Y268W de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDASLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDWLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 16
El mutante de I230F de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de I230F de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLFAFDYSGYDASLSPVWFACLK 250
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 17
El mutante de Y268H de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo
silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de Y268H de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKE PAVLRSGDPRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDASLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDHLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 18
El mutante de P48K de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de P48K de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDKRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDASLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDYLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 19
El mutante de F232Y de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de F232Y de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAYDYSGYDASLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDYLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 20
El mutante de S999T de la polimerasa (es decir, de la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de S299T de la secuencia de SEQ ID NO: 11; 462 aa]:
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDASLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDYLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNTM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQ ID NO: 21
Al menos en lo referente al virus Chikunguña, los ejemplos de ARN polimerasa dependiente de ARN, que tiene una menor fidelidad de incorporación de nucleótidos (es decir, una menor fidelidad de copia), comprenden notablemente el mutante de C483A o C483W o C483G de una Ar N polimerasa dependiente de Ar N de un virus Chikunguña B3 de tipo silvestre (es decir, infeccioso), más particularmente, la poliproteína NSp1234.
La secuencia de la poliproteína NSp1234 (de tipo silvestre) es la SEQ ID NO: 89:
MDPVYVDIDADSAFLKALQRAYPMFEVEPRQVTPNDHANARAFSHLAIKLIEQEIDPDST
ILDIGSAPARRMMSDRKYHCVCPMRSAEDPERLANYARKLASAAGKVLDRNISGKIGDLQ
AVMAVPDTETPTFCLHTDVSCRQRADVAIYQDVYAVHAPTSLYHQAIKGVRVAYWVGFDT
TPFMYNAMAGAYP SYSTNWADEQVLKAKNIGLC STDLTEGRRGKL SIMRGKKLKPC DRVL
FSVGSTLYPESRKLLKSWHLPSVFHLKGKLSFTCRCDTVVSCEGYVVKRITMSPGLYGKT
TGYAVTHHADGFLMCKTTDTVDGERVSFSVCTYVPATICDQMTGILATEVTPEDAQKLLV
GLNQRIVVNGRTQRNTNTMKNYLLPVVAQAFSKWAKECRKDMEDEKLLGVRERTLTCCCL
WAFKKQKTHTVYKRPDTQSIQKVQAEFDSFVVPSLWSSGLSIPLRTRIKWLLSKVPKTDL
IPYSGDAREARDAEKEAEEEREAELTREALPPLQAAQEDVQVEIDVEQLEDRAGAGIIET
PRGAIKVTAQPTDHVVGEYLVLSPQTVLRSQKLSL1HALAEQVKTCTHNGRAGRYAVEAY
DGRVLVPSGYAISPEDFQSLSESATMVYNEREFVNRKLHHIAMHGPALNTDEESYELVRA
ERTEHEYVYDVDQRRCCKKEEAAGLVLVGDLTNPPYHEFAYEGLKIRPACPYKIAVIGVF
GVPGSGKSAIIKNLVTRQDLVTSGKKENCQEITTDVMRQRGLEISARTVDSLLLNGCNRP
VDVLYVDEAFACHSGTLLALIALVRPRQKVVLCGDPKQCGFFNMMQMKVNYNHNICTQVY
HKSISRRCTLPVTAIVSSLHYEGKMRTTNEYNKPIVVDTTGSTKPDPGDLVLTCFRGWVK
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ILETAGIKLNDRQWSQIIQAFKEDKAYSPEVALNEICTRMYGVDLDSGLFSKPLVSVYYA
DNHWDNRPGGKMFGFNPEAASILERKYPFTKGKWNINKQICVTTRRIEDFNPTTNIIPAN
RRLPHSLVAEHRPVKGERMEWLVNKINGHHVLLVSGYNLALPTKRVTWVAPLGVRGADYT
YNLELGLPATLGRYDLVVIN1HTPFR1HHYQQCVDHAMKLQMLGGDSLRLLKPGGSLLIR
AYGYADRTSERVICVLGRKFRSSRALKPPCVTSNTEMFFLFSNFDNGRRNFTTHVMNNQL
NAAFVGQVTRAGCAPSYRVKRMDIAKNDEECVVNAANPRGLPGDGVCKAVYKKWPESFKN
SATPVGTAKTVMCGTYPV1HAVGPNFSNYSESEGDRELAAAYREVAKEVTRLGVNSVAIP
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EQVCLYALGESIESIRQKCPVDDADASSPPKTVPCLCRYAMTPERVTRLRMNHVTSIIVC
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AGGYIFSSDTGPGHLQQKSVRQSVLPVNTLEEVHEEKCYPPKLDEAKEQLLLKKLQESAS
MANRSRYQSRKVENMKAAIIQRLKRGCRLYLMSETPKVPTYRTTYPAPVYSPPINVRLSN
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YHAPSIRSAVPSPFQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPTLDSAVFNVECFKKFACNQEY
WEEFAASPIRITTENLATYVTKLKGPKAAALFAKTHNLLPLQEVPMDRFTVDMKRDVKVT
PGTKHTEERPKVQVIQAAEPLATAYLCG1HRELVRRLNAVLLPNVHTLFDMSAEDFDAII
AAHFKPGDTVLETDIASFDKSQDDSLALTALMLLEDLGVDHSLLDLIEAAFGEISSCHLP
TGTRFKFGAMMKSGMFLTLFVNTLLNITIASRVLEDRLTKSACAAFIGDDNI1HGVVSDE
LMAARCATWMNMEVKIIDAVVSLKAPYFCGGFILHDTVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLA
AGDEQDEDRRRALADEVIRWQRTGLIDELEKAVYSRYEVQGISVVVMSMATFASSRSNFE
KLRGPVITLYGGPK SEQ ID NO: 89
La secuencia del mutante de C483A de la poliproteína NSp1234 (que codifica la polimerasa de baja fidelidad) es la SEQ ID NO: 90:
MDPVYVDIDADSAFLKALQRAYPMFEVEPRQVTPNDHANARAFSHLAIKLIEQEIDPDST
ILDIGSAPARRMMSDRKYHCVCPMRSAEDPERLANYARKLASAAGKVLDRNISGKIGDLQ
AVMAVPDTETPTFCLHTDVSCRQRADVAIYQDVYAVHAPTSLYHQAIKGVRVAYWVGFDT
T PFMYNAMAGAYP SYS TNWADEQVLKAKNIGLC STDLTE GRRGKL SIMRGKKLKPC DRVL
FSVGSTLYPESRKLLKSWHLPSVFHLKGKLSFTCRCDTVVSCEGYVVKRITMSPGLYGKT
TGYAVTHHADGFLMCKTTDTVDGERVSFSVCTYVPATICDQMTGILATEVTPEDAQKLLV
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WAFKKQKTHTVYKRPDTQSIQKVQAEFDSFVVPSLWSSGLSIPLRTRIKWLLSKVPKTDL
IPYSGDAREARDAEKEAEEEREAELTREALPPLQAAQEDVQVEIDVEQLEDRAGAGIIET
PRGAIKVTAQPTDHVVGEYLVLSPQTVLRSQKLSL1HALAEQVKTCTHNGRAGRYAVEAY
DGRVLVPSGYAISPEDFQSLSESATMVYNEREFVNRKLHHIAMHGPALNTDEESYELVRA
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HKSISRRCTLPVTAIVSSLHYEGKMRTTNEYNKPIVVDTTGSTKPDPGDLVLTCFRGWVK
QLQIDYRGYEVMTAAASQGLTRKGVYAVRQKVNENPLYASTSEHVNVLLTRTEGKLVWKT
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NAAFVGQVTRAGCAPSYRVKRMDIAKNDEECVVNAANPRGLPGDGVCKAVYKKWPESFKN
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AAHFKPGDTVLETDIASFDKSQDDSLALTALMLLEDLGVDHSLLDLIEAAFGEISSCHLP
TGTRFKFGAMMKSGMFLTLFVNTLLNITIASRVLEDRLTKSACAAFIGDDNI1HGVVSDE
LMAARAATWMNMEVKIIDAVVSLKAPYFCGGFILHDTVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLA
AGDEQDEDRRRALADEVIRWQRTGLIDELEKAVYSRYEVQGISVVVMSMATFASSRSNFE
KLRGPVITLYGGPK SEQID NO: 90
La secuencia del mutante de C483W de la poliproteína NSp1234 (que codifica la polimerasa de baja fidelidad) es la SEQ ID NO: 91:
MDPVYVDIDADSAFLKALQRAYPMFEVEPRQVTPNDHANARAFSHLAIKLIEQEIDPDST
ILDIGSAPARRMMSDRKYHCVCPMRSAEDPERLANYARKLASAAGKVLDRNISGKIGDLQ
AVMAVPDTETPTFCLHTDVSCRQRADVAIYQDVYAVHAPTSLYHQAIKGVRVAYWVGFDT
TP FMYNAMAGAYP S YSTNWADEQVLKAKNIGLC STDL TEGRRGKL SIMRGKKLKPC DRVL
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WAFKKQKTHTVYKRPDTQSIQKVQAEFDSFVVPSLWSSGLSIPLRTRIKWLLSKVPKTDL
IPYSGDAREARDAEKEAEEEREAELTREALPPLQAAQEDVQVEIDVEQLEDRAGAGIIET
PRGAIKVTAQPTDHVVGEYLVLSPQTVLRSQKLSL1HALAEQVKTCTHNGRAGRYAVEAY
DGRVLVPSGYAISPEDFQSLSESATMVYNEREFVNRKLHHIAMHGPALNTDEESYELVRA
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HKSISRRCTLPVTAIVSSLHYEGKMRTTNEYNKPIVVDTTGSTKPDPGDLVLTCFRGWVK
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NAAFVGQVTRAGCAPSYRVKRMDIAKNDEECVVNAANPRGLPGDGVCKAVYKKWPESFKN
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LMAARWATWMNMEVKIIDAVVSLKAPYFCGGFILHDTVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLA
AGDEQDEDRRRALADEVIRWQRTGLIDELEKAVYSRYEVQGISVVVMSMATFASSRSNFE
KLRGPVITLYGGPK SEQID NO: 91
La secuencia del mutante de C483G de la poliproteína NSp1234 (que codifica la polimerasa de baja fidelidad) es la SEQ ID NO: 92:
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DGRVLVPSGYAISPEDFQSLSESATMVYNEREFVNRKLHHIAMHGPALNTDEESYELVRA
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LSGDPWIKTLQNPPKGNFKATIKEWEVEHASIMAGICSHQMTFDTFQNKANVCWAKSLVP
DNHWDNRPGGKMFGFNPEAASILERKYPFTKGKWNINKQICVTTRRIEDFNPTTNIIPAN
RRLPHSLVAEHRPVKGERMEWLVNKINGHHVLLVSGYNLALPTKRVTWVAPLGVRGADYT
YNLELGLPATLGRYDLVVIN1HTPFR1HHYQQCVDHAMKLQMLGGDSLRLLKPGGSLLIR
AYGYADRTSERVICVLGRKFRSSRALKPPCVTSNTEMFFLFSNFDNGRRNFTTHVMNNQL
NAAFVGQVTRAGCAPSYRVKRMDIAKNDEECVVNAANPRGLPGDGVCKAVYKKWPESFKN
SATPVGTAKTVMCGTYPV1HAVGPNFSNYSESEGDRELAAAYREVAKEVTRLGVNSVAIP
LLSTGVYSGGKDRLTQSLNHLFTAMDSTDADVVIYCRDKEWEKKISEAIQMRTQVELLDE
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SSFPLPKYKIEGVQKVKCSKVMLFDHNVPSRVSPREYRSSQESAQEASTITSLTHSQFDL
SVDGEILPVPSDLDADAPALEPALDDGATHTLPSTTGNLAAVSDWVMSTVPVAPPRRRRG
RNLTVTCDEREGNITPMASVRFFRAELCPVVQETAETRDTAMSLQAPPSTATEPNHPPIS
FGASSETFPITFGDFNEGEIESLSSELLTFGDFLPGEVDDLTDSDWSTCSDTDDELXLDR
AGGYIFSSDTGPGHLQQKSVRQSVLPVNTLEEVHEEKCYPPKLDEAKEQLLLKKLQESAS
MANRSRYQSRKVENMKAAIIQRLKRGCRLYLMSETPKVPTYRTTYPAPVYSPPINVRLSN
PESAVAACNEFLARNYPTVSSYQITDEYDAYLDMVDGSESCLDRATFNPSKLRSYPKQHA
YHAPSIRSAVPSPFQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPTLDSAVFNVECFKKFACNQEY
WEEFAASPIRITTENLATYVTKLKGPKAAALFAKTHNLLPLQEVPMDRFTVDMKRDVKVT
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AGDEQDEDRRRALADEVIRWQRTGLIDELEKAVYSRYEVQGISVVVMSMATFASSRSNFE
KLRGPVITLYGGPK SEQID NO: 92
Las modificaciones efectuadas en la secuencia de nucleótidos de dicho virus de ARN o clon infeccioso pueden no comprender ninguna sustitución no sinónima (más particularmente, cualquier sustitución no sinónima en la región codificante de dicho virus o clon infeccioso) distinta de dicho reemplazo de la secuencia codificante de la polimerasa (es decir, distinta de dicha secuencia codificante de ADN polimerasa dependiente de ARN o secuencia codificante de ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente).
De acuerdo con la invención, dichos codones de "1-hasta-parada" (sinónimos y/o no sinónimos, más particularmente sinónimos) se mutan en un codón de PARADA tras uno o varios ciclos de replicación de dicho virus modificado o clon de ADNc modificado.
Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos del virus modificado o el clon modificado de la invención se muta durante la replicación vírica: la proporción de codones de PARADA generada por dichas mutaciones de nucleótidos es mayor que la observada en dicho virus de ARN infeccioso o clon infeccioso tras el mismo número de ciclos de replicación.
De hecho, el virus o clon modificado de la invención es un virus o clon (vivo), que está atenuado o que es susceptible a la atenuación (adicional), por ejemplo, un virus o clon, que está programado para atenuarse (adicionalmente) in vivo. De hecho, es (es decir, se ha vuelto) hipersensible a las mutaciones de nucleótidos, más particularmente, a mutaciones letales o perjudiciales. Dichas mutaciones (atenuantes o atenuantes adicionales), es decir, las mutaciones de codones de "1-hasta-parada" en codones de PARADA, pueden producirse in vivo, es decir, después de que el virus o clon modificado se haya administrado (por ejemplo, inyectado) a un organismo hospedador (por ejemplo, a un animal hospedador no humano o a un hospedador humano, que se ha de vacunar contra dicho virus de ARN infeccioso). De manera complementaria o como alternativa, dichas mutaciones (atenuantes o atenuantes adicionales) pueden producirse in vitro, por ejemplo, en un medio de cultivo in vitro, que contiene al menos un agente mutagénico o condición mutagénica y en presencia del cual se cultiva el virus o clon modificado, por ejemplo, para los pases de cultivo.
De hecho, a fin de aumentar las tasas de mutación o el alcance de las mutaciones, más particularmente para aumentar el número de codones (de "1-hasta-parada") que se mutan en codones de PARADA, el virus o el clon modificado de la invención puede ponerse en contacto (in vitro) con al menos un agente o compuesto mutagénico o puede colocarse (in vitro) en condiciones mutagénicas.
Los ejemplos de dicho al menos un agente o compuesto mutagénico comprenden notablemente:
- Ribavirina IUPAC, 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroxi-metil)oxolan-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida), - Favipiravir, también conocido como T-705 o Avigan, IUPAC, 5-Fluoro-2-oxo-1H-pirazin-3-carboxamida,
- 5-Fluorouracilo, IUPAC 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-diona,
- 5-Azacitidina IUPAC, 4-amino-1-b-D-ribofuranosil-1,3,5-triazin-2(1H)-ona o
- Amilorida, IUPAC, 3,5-diamino-6-cloro-N-(diaminometilen)pirazina-2-carboxamida,
- un compuesto de pirazincarboximida que muestra actividad antivírica (más particularmente, actividad antivírica contra uno o varios Flavivirus o Aphtovirus y/o Enterovirus, más particularmente, contra uno o varios virus de la fiebre amarilla y/o virus de la fiebre aftosa y/o virus de la gripe, más particularmente, contra uno o varios virus de la gripe), tales como Favipiravir (6-fluoro-3-hidroxi-2-pirazincarboxamida; véase Furuta et al. 2009).
Los ejemplos de condiciones mutagénicas comprenden notablemente un aumento de la temperatura de cultivo celular (por ejemplo, de 37 °C a 39 °C) y/o la alteración de los grupos de nucleótidos intracelulares (por ejemplo, un desequilibrio de nucleótidos, en donde se encuentran en exceso los nucleótidos U (o T) y/o A y/o G en comparación con el nucleótido de C).
Dicho al menos un agente mutagénico puede, por ejemplo, ponerse en contacto con el virus o clon modificado de la invención durante su pase en un medio de cultivo celular in vitro, más particularmente, un medio de cultivo celular in vitro, que contiene células en las que dicho virus o clon (modificado) puede pasarse para su crecimiento. Dicho al menos un agente mutagénico puede estar comprendido, por lo tanto, en dicho medio de cultivo celular in vitro, ventajosamente, a una concentración que es la concentración inhibidora CI50 del virus y/o a una concentración que es no tóxica para las células del medio de cultivo (más particularmente, a una concentración que es no tóxica para dichas células durante un periodo de 72 horas), más particularmente, a una concentración que es (o es la más próxima a) la concentración inhibidora CI50 del virus sin resultar tóxica para las células del medio de cultivo durante un periodo de 72 horas.
Dicha célula es una célula sensible a la infección por dicho virus o clon modificado, por ejemplo, una célula animal, más particularmente, una célula humana, una célula de mamífero no humano, una célula de ave, una célula de insecto.
Dicha célula humana puede, por ejemplo, ser una célula de una línea celular humana, tal como la línea celular HeLa [ATCC® CCL-2™]. Dicha célula de mamífero no humana puede, por ejemplo, ser una célula de caballo, una célula de ganado (más particularmente, una célula de vaca), una célula de cerdo (más particularmente, una célula de Sus domesticus), una célula de mono (más particularmente, una célula de grivet, una célula de macaco Rhesus o una célula de macaco cangrejero, tal como la línea celular VERO [ATCC® CCL-81TM]) o una célula de roedor (más particularmente, una célula de ratón). Dicha célula de ave puede, por ejemplo, ser una célula de ave doméstica, más particularmente, una célula de ave de corral, más particularmente, una célula de Galliforme o una célula de Anseriforme, más particularmente, una célula de Galliforme, más particularmente, una célula de pavo, una célula de ave silvestre o una célula de pollo, más particularmente una célula de pollo. Dicha célula de insecto puede, por ejemplo, ser una célula de mosquito, más particularmente, una célula de Aedes sp. o Anopheles sp.
Dicho medio de cultivo in vitro es un medio de cultivo in vitro, que es adecuado para el crecimiento de las células que contiene. Puede, por ejemplo, ser un medio de cultivo in vitro, que comprende aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas y fuentes de carbono.
Dichos aminoácidos pueden comprender varios (más particularmente todos de los) aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en glicina, L-alanil-L-glutamina, clorhidrato de L-arginina, 2HCl de L-cisteína, clorhidrato-H2O
de L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, clorhidrato de L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina y L-valina.
Dichas vitaminas pueden comprender (más particularmente, todas de las) vitaminas seleccionadas entre el grupo que consiste en cloruro de colina, pantotenato de D-calcio, ácido fólico, niacinamida, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, clorhidrato de tiamina e i-inositol.
Dichas sales inorgánicas pueden comprender varias (más particularmente todas de las) sales inorgánicas seleccionadas entre el grupo que consiste en cloruro de calcio (CaCl2-2H2O), nitrato férrico (Fe(NO3)3"9H2O), sulfato de magnesio (MgSO4-7H2O), cloruro de potasio (KCl), bicarbonato de sodio (NaHCO3), cloruro de sodio (NaCl) y fosfato de potasio monobásico (NaH2PO4-2H2O).
Dichas fuentes de carbono pueden comprender una o varias de las fuentes de carbono seleccionadas entre el grupo que consiste en glucosa (por ejemplo, D-glucosa) y piruvato (por ejemplo, piruvato de sodio). Más particularmente, dichas fuentes de carbono pueden comprender glucosa y piruvato, más particularmente, D-glucosa y piruvato de sodio.
Dicho medio de cultivo in vitro puede, por ejemplo, ser un medio de cultivo in vitro, tal como medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), que contiene D-glucosa a 4,5 g/l y piruvato de sodio a 110 mg/l, por ejemplo el DMEM de GlutaMAX™ (SIGMA-ALDRICH, n.° de producto 31966047).
Después de dicha puesta en contacto (in vitro) con dicho al menos un agente mutagénico, el virus o el clon modificado de la invención sigue vivo, es decir, está atenuado (adicionalmente) pero no está eliminado o inactivado.
La invención se refiere al virus o clon modificado en sí.
Dicho virus modificado es un virus de ARN. Dicho clon modificado es un clon de ARN, ADN o ADNc, más particularmente, un clon de ADN o ADNc, más particularmente, un clon de ADNc. El virus (de ARN) modificado de la invención puede ser un transcrito de ARN de un clon de (ADN o) ADNc de la invención, por ejemplo, el transcrito vírico de ARN, que puede obtenerse mediante la transcripción de un clon (de ADN o) ADNc de la invención usando una ARN polimerasa dependiente de ARN (tal como la T7 ARN polimerasa, por ejemplo, de FERMENTAS).
Dicho virus o clon modificado es ventajosamente un virus o clon atenuado, más particularmente, un virus o clon vivo y atenuado.
El virus o clon modificado puede obtenerse mediante el proceso de la invención, más particularmente, mediante las modificaciones genéticas descritas en la invención.
Las características descritas en relación con el proceso de la invención se aplican al virus o clon modificado, haciendo los cambios necesarios.
Más particularmente, la divulgación se refiere a un virus o clon modificado, más particularmente, a un virus de ARN vivo y atenuado, que es un virus de Coxsackie o clon, más particularmente, un virus de Coxsackie o clon de subtipo A2, B o A1, más particularmente, de subtipo A1, B1, B2, B3, B4, B5, B6 o A1, más particularmente, de subtipo A1 o B, más particularmente, de subtipo A1, B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, de subtipo B1, B2, B3, B4, B5 o B6, más particularmente, un virus o un clon de Coxsackie B3.
Más particularmente, la divulgación se refiere a un virus o clon modificado, más particularmente, a un virus de ARN vivo y atenuado, que es un virus o un clon de la gripe, más particularmente, un virus o clon de la gripe A, más particularmente, un virus o clon de la gripe A, subtipo H1N1.
Más particularmente, la divulgación se refiere a un virus o clon modificado, más particularmente, a un virus de ARN vivo y atenuado, que es un virus o clon de Chikunguña o un virus o clon de O'Nyong-Nyong, más particularmente, un virus o clon de Chikunguña.
La proporción de codones que son codones de TTA, TTG, TCA, TCG, CGA o GGA en la secuencia codificante de dicho virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención o la proporción de codones que son codones de UUA, UUG, UCA, UCG, CGA o GGA en el clon de virus de Coxsackie vivo y atenuado de la invención, puede, por ejemplo, ser un 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de TTA, TTG, TCA, TCG, CGA o GGA en un virus de Coxsackie infeccioso (de tipo silvestre), más particularmente, un 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de TTA, TTG, TCA, TCG, CGA y GGA en la secuencia de SEQ ID NO: 2 (la secuencia de la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de la CDS de ADNc de tipo silvestre de un virus de Coxsackie infeccioso).
La expresión "proporción de codones en una secuencia codificante" se emplea de acuerdo con su significado convencional en el campo. Por ejemplo, la proporción de codones que son codones de TTA, TTG, TCA, TCG, CGA o
GGA en una secuencia codificante es la proporción del número total de codones de TTA, TTG, TCA, TCG, CGA y GGA en dicha secuencia codificante al número total de codones en dicha secuencia codificante, multiplicándose esta relación por 100 para expresarla como un porcentaje.
Más particularmente, la proporción de codones que son codones de TTA o TTG en la secuencia codificante de dicho virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención o la proporción de codones que son codones de UUA o UUG en el clon de virus de Coxsackie vivo y atenuado de la invención, puede, por ejemplo, ser un 2-30 %, 2 25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de TTA o TTG en un virus de Coxsackie infeccioso (de tipo silvestre), más particularmente un 2-30 %, 2 25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de TTA o TTG en la secuencia de la SEQ ID NO: 2.
Más particularmente, la proporción de codones que son codones de TCA o TCG en la secuencia codificante de dicho virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención o la proporción de codones que son codones de UCA o UCG en el clon de virus de Coxsackie vivo y atenuado de la invención, puede, por ejemplo, ser un 2-30 %, 2 25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de TCA o TCG en un virus de Coxsackie infeccioso (de tipo silvestre), más particularmente un 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de TCA o TCG en la secuencia de la SEQ ID NO: 2.
Más particularmente, la proporción de codones que son codones de CGA en la secuencia codificante de dicho virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención o en el clon de virus de Coxsackie vivo y atenuado de la invención, puede, por ejemplo, ser un 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3 10 % mayor que la proporción de codones que son codones de CGA en un virus de Coxsackie infeccioso (de tipo silvestre), más particularmente del 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3 10 % mayor que la proporción de codones que son codones de CGA en la secuencia de SEQ ID NO: 2 (la secuencia de la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de la CDS de ADNc de tipo silvestre de un virus de Coxsackie infeccioso).
Más particularmente, la proporción de codones que son codones de GGA en la secuencia codificante de dicho virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención o en el clon de virus de Coxsackie vivo y atenuado de la invención, puede, por ejemplo, ser un 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3 10 % mayor que la proporción de codones que son codones de GGA en un virus de Coxsackie infeccioso (de tipo silvestre), más particularmente, un 2-10 % mayor que la proporción de codones que son codones de GGA en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 (la secuencia de la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de la CDS de ADNc de tipo silvestre de un virus de Coxsackie infeccioso).
Se aplican las mismas características al virus Chikunguña, el virus de O'Nyong-Nyong y el virus de la gripe, haciendo los cambios necesarios.
El genoma de ARN del virus Chikunguña consiste normalmente en 11.600 - 12.100 nucleótidos, por ejemplo, 11.605 12.005 nucleótidos, por ejemplo, 11.805 nucleótidos. Los ejemplos de secuencia de ADNc del virus Chikunguña de tipo silvestre comprenden la CDS de la secuencia de GENBANK AM258994 (extendiéndose la CDS de la posición 26 a la posición 7450; SEQ ID NO: 93).
La SEQ ID NO: 93 es:
atgga tcctgtgtac gtggacatag acgctgacag 61 cgcctttttg aaggccctgc aacgtgcgta ccccatgttt gaggtggaac caaggcaggt 121 cacaccgaat gaccatgcta atgctagagc gttctcgcat ctagctataa aactaataga 181 gcaggaaatt gaccccgact caaccatcct ggatatcggc agtgcgccag caaggaggat 241 gatgtcggac aggaagtacc actgcgtctg cccgatgcgc agtgcggaag atcccgagag 301 actcgccaat tatgcgagaa agctagcatc tgccgcagga aaagtcctgg acagaaacat 361 ctctggaaag atcggggact tacaagcagt aatggccgtg ccagacacgg agacgccaac 421 attctgctta cacacagacg tctcatgtag acagagagca gacgtcgcta tataccaaga 481 cgtctatgct gtacacgcac ccacgtcgct ataccaccag gcgattaaag gggtccgagt 541 ggcgtactgg gttgggttcg acacaacccc gttcatgtac aatgccatgg cgggtgccta 601 cccctcatac tcgacaaact gggcagatga gcaggtactg aaggctaaga acataggatt 661 atgttcaaca gacctgacgg aaggtagacg aggcaagttg tctattatga gagggaaaaa 721 gctaaaaccg tgcgaccgtg tgctgttctc agtagggtca acgctctacc cggaaagccg 781 caagctactt aagagctggc acctgccatc ggtgttccat ttaaagggca aactcagctt 841 cacatgccgc tgtgatacag tggtttcgtg tgagggctac gtcgttaaga gaataacgat 901 gagcccaggc ctttatggaa aaaccacagg gtatgcggta acccaccacg cagacggatt 961 cctgatgtgc aagactaccg acacggttga cggcgaaaga gtgtcattct cggtgtgcac 1021 atacgtgccg gcgaccattt gtgatcaaat gaccggcatc cttgctacag aagtcacgcc 1081 ggaggatgca cagaagctgt tggtggggct gaaccagaga atagtggtta acggcagaac 1141 gcaacggaat acgaacacca tgaaaaatta tctgcttccc gtggtcgccc aagccttcag 1201 taagtgggca aaggagtgcc ggaaagacat ggaagatgaa aaactcctgg gggtcagaga 1261 aagaacactg acctgctgct gtctatgggc attcaagaag cagaaaacac acacggtcta 1321 caagagacct gatacccagt caattcagaa ggttcaggcc gagtttgaca gctttgtggt 1381 accgagtctg tggtcgtccg ggttgtcaat ccctttgagg actagaatca aatggttgtt 1441 aagcaaggtg ccaaaaaccg acctgatccc atacagcgga gacgcccgag aagcccggga 1501 cgcagaaaaa gaagcagagg aagaacgaga agcagaactg actcgcgaag ccctaccacc 1561 tctacaggca gcacaggaag atgttcaggt cgaaatcgac gtggaacagc ttgaggacag 1621 agcgggcgca ggaataatag agactccgag aggagctatc aaagttactg cccaaccaac 1681 agaccacgtc gtgggagagt acctggtact ctccccgcag accgtactac gtagccagaa 1741 gctcagtctg attcacgctt tggcggagca agtgaagacg tgcacgcaca acggacgagc 1801 agggaggtat gcggtcgaag cgtacgacgg ccgagtccta gtgccctcag gctatgcaat 1861 ctcgcctgaa gacttccaga gtctaagcga aagcgcaacg atggtgtata acgaaagaga 1921 gttcgtaaac agaaagctac accatattgc gatgcacgga ccagccctga acaccgacga 1981 agagtcgtat gagctggtga gggcagagag gacagaacac gagtacgtct acgacgtgga 2041 tcagagaaga tgctgtaaga aggaagaagc cgcaggactg gtactggtgg gcgacttgac 2101 taatccgccc taccacgaat tcgcatatga agggctaaaa atccgccctg cctgcccata 2161 caaaattgca gtcataggag tcttcggagt accgggatct ggcaagtcag ctattatcaa 2221 gaacctagtt accaggcagg acctggtgac tagcggaaag aaagaaaact gccaagaaat 2281 caccaccgac gtgatgagac agagaggtct agagatatct gcacgtacgg ttgactcgct 2341 gctcttgaat ggatgcaaca gaccagtcga cgtgttgtac gtagacgagg cgtttgcgtg 2401 ccactctgga acgctacttg ctttgatcgc cttggtgaga ccaaggcaga aagttgtact 2461 ttgtggtgac ccgaagcagt gcggcttctt caatatgatg cagatgaaag tcaactataa 2521 tcacaacatc tgcacccaag tgtaccacaa aagtatctcc aggcggtgta cactgcctgt 2581 gaccgccatt gtgtcatcgt tgcattacga aggcaaaatg cgcactacga atgagtacaa 2641 caagccgatt gtagtggaca ctacaggctc aacaaaacct gaccctggag acctcgtgtt 2701 aacgtgcttc agagggtggg ttaaacaact gcaaattgac tatcgtggat acgaggtcat
2761 gacagcagcc gcatcccaag ggttaaccag aaaaggagtt tacgcagtta gacaaaaagt 2821 taatgaaaac ccgctctatg catcaacgtc agagcacgtc aacgtactcc taacgcgtac 2881 ggaaggtaaa ctggtatgga agacactttc cggcgacccg tggataaaga cgctgcagaa 2941 cccaccgaaa ggaaacttca aagcaactat taaggagtgg gaggtggagc atgcatcaat 3001 aatggcgggc atctgcagtc accaaatgac cttcgataca ttccaaaata aagccaacgt 3061 ttgttgggct aagagcttgg tccctatcct cgaaacagcg gggataaaac taaatgatag 3121 gcagtggtct cagataattc aagccttcaa agaagacaaa gcatactcac ctgaagtagc 3181 cctgaatgaa atatgtacgc gcatgtatgg ggtggatcta gacagcgggc tattttctaa 3241 accgttggtg tctgtgtatt acgcggataa ccactgggat aataggcctg gagggaaaat 3301 gttcggattt aaccccgagg cagcatccat tctagaaaga aagtatccat tcacaaaagg 3361 gaagtggaac atcaacaagc agatctgcgt gactaccagg aggatagaag actttaaccc 3421 taccaccaac atcataccgg ccaacaggag actaccacac tcattagtgg ccgaacaccg 3481 cccagtaaaa ggggaaagaa tggaatggct ggttaacaag ataaacggcc accacgtgct 3541 cctggtcagt ggctataacc ttgcactgcc tactaagaga gtcacttggg tagcgccgtt 3601 aggtgtccgc ggagcggact acacatacaa cctagagttg ggtctgccag caacgcttgg 3661 taggtatgac ctagtggtca taaacatcca cacacctttt cgcatacacc attaccaaca 3721 gtgcgtcgac cacgcaatga aactgcaaat gctcgggggt gactcattga gactgctcaa 3781 accgggcggc tctctattga tcagagcata tggttacgca gatagaacca gtgaacgagt 3841 catctgcgta ttgggacgca agtttagatc gtctagagcg ttgaaaccac catgtgtcac 3901 cagcaacact gagatgtttt tcctattcag caactttgac aatggcagaa ggaatttcac 3961 aactcatgtc atgaacaatc aactgaatgc agccttcgta ggacaggtca cccgagcagg 4021 atgtgcaccg tcgtaccggg taaaacgcat ggacatcgcg aagaacgatg aagagtgcgt 4081 agtcaacgcc gctaaccctc gcgggttacc gggtgacggt gtttgcaagg cagtatacaa 4141 aaaatggccg gagtccttta agaacagtgc aacaccagtg ggaaccgcaa aaacagttat 4201 gtgcggtacg tatccagtaa tccacgctgt tggaccaaac ttctctaatt attcggagtc 4261 tgaaggggac cgggaattgg cagctgccta tcgagaagtc gcaaaggaag taactaggct 4321 gggagtaaat agtgtagcta tacctctcct ctccacaggt gtatactcag gagggaaaga 4381 caggctgacc cagtcactga accacctctt tacagccatg gactcgacgg atgcagacgt 4441 ggtcatctac tgccgcgaca aagaatggga gaagaaaata tctgaggcca tacagatgcg 4501 gacccaagta gagctgctgg atgagcacat ctccatagac tgcgatattg ttcgcgtgca 4561 ccctgacagc agcttggcag gcagaaaagg atacagcacc acggaaggcg cactgtactc 4621 atatctagaa gggacccgtt ttcatcagac ggctgtggat atggcggaga tacatactat 4681 gtggccaaag caaacagagg ccaatgagca agtctgccta tatgccctgg gggaaagtat 4741 tgaatcgatc aggcagaaat gcccggtgga tgatgcagac gcatcatctc cccccaaaac 4801 tgtcccgtgc ctttgccgtt acgctatgac tccagaacgc gtcacccggc ttcgcatgaa 4861 ccacgtcaca agcataattg tgtgttcttc gtttcccctc ccaaagtaca aaatagaagg 4921 agtgcaaaaa gtcaaatgct ctaaggtaat gcta.tttga.c- cacaacgtgc catcgcgcgt 4981 aagtccaagg gaatatagat cttcccagga gtctgcacag gaggcgagta caatcacgtc 5041 actgacgcat agtcaattcg acctaagcgt tgatggcgag atactgcccg tcccgtcaga 5101 cctggatgct gacgccccag ccctagaacc agcactagac gacggggcga cacacacgct 5161 gccatccaca accggaaacc ttgcggccgt gtctgattgg gtaatgagca ccgtacctgt 5221 cgcgccgccc agaagaaggc gagggagaaa cctgactgtg acatgtgacg agagagaagg 5281 gaatataaca cccatggcta gcgtccgatt ctttagggca gagctgtgtc cggtcgtaca 5341 agaaacagcg gagacgcgtg acacagcaat gtctcttcag gcaccaccga gtaccgccac 5401 ggaaccgaat catccgccga tctccttcgg agcatcaagc gagacgttcc ccattacatt 5461 tggggacttc aacgaaggag aaatcgaaag cttgtcttct gagctactaa ctttcggaga 5521 cttcttacca ggagaagtgg atgacttgac agacagcgac tggtccacgt gctcagacac 5581 ggacgacgag ttatgactag acagggcagg tgggtatata ttctcgtcgg acaccggtcc 5641 aggtcattta caacagaagt cagtacgcca gtcagtgctg ccggtgaaca ccctggagga 5701 agtccacgag gagaagtgtt acccacctaa gctggatgaa gcaaaggagc aactattact 5761 taagaaactc caggagagtg catccatggc caacagaagc aggtatcagt cgcgcaaagt 5821 agaaaacatg aaagcagcaa tcatccagag actaaagaga ggctgtagac tatacttaat 5881 gtcagagacc ccaaaagtcc ctacttaccg gactacatat ccggcgcctg tgtactcgcc 5941 tccgatcaac gtccgattgt ccaatcccga gtccgcagtg gcagcatgca atgagttctt 6001 agctagaaac tatccaactg tctcatcata ccaaattacc gacgagtatg atgcatatct 6061 agacatggtg gacgggtcgg agagttgcct ggaccgagcg acattcaatc cgtcaaaact 6121 caggagctac ccgaaacagc acgcttacca cgcgccctcc atcagaagcg ctgtaccgtc 6181 cccattccag aacacactac agaatgtact ggcagcagcc acgaaaagaa actgcaacgt 6241 cacacagatg agggaattac ccactttgga ctcagcagta ttcaacgtgg agtgtttcaa 6301 aaaattcgca tgcaaccaag aatactggga agaatttgct gccagcccta ttaggataac 6361 aactgagaat ttagcaacct atgttactaa actaaaaggg ccaaaagcag cagcgctatt
6421 cgcaaaaacc cataatctac tgccactaca ggaagtacca atggataggt tcacagtaga 6481 tatgaaaagg gacgtaaagg tgactcctgg tacaaagcat acagaggaaa gacctaaggt 6541 gcaggttata caggcggctg aacccttggc gacagcatac ctatgtggga ttcacagaga 6601 gctggttagg aggctgaacg ccgtcctcct acccaatgta catacactat ttgacatgtc 6661 tgccgaggat ttcgatgcca tcatagccgc acactttaag ccaggagaca ctgttttgga 6721 aacggacata gcctcctttg ataagagcca agatgattca cttgcgctta ctgctttgat 6781 gctgttagag gatttagggg tggatcactc cctgctggac ttgatagagg ctgctttcgg 6841 agagatttcc agctgtcacc taccgacagg tacgcgcttc aagttcggcg ccatgatgaa 6901 atcaggtatg ttcctaactc tgttcgtcaa cacattgtta aacatcacca tcgccagccg 6961 agtgctggaa gatcgtctga caaaatccgc gtgcgcggcc ttcatcggcg acgacaacat 7021 aatacatgga gtcgtctccg atgaattgat ggcagccaga tgtgccactt ggatgaacat 7081 ggaagtgaag atcatagatg cagttgtatc cttgaaagcc ccttactttt gtggagggtt 7141 tatactgcac gatactgtga caggaacagc ttgcagagtg gcagacccgc taaaaaggct 7201 ttttaaactg ggcaaaccgc tagcggcagg tgacgaacaa gatgaagata gaagacgagc 7261 gctggctgac gaagtgatca gatggcaacg aacagggcta attgatgagc tggagaaagc 7321 ggtatactct aggtacgaag tgcagggtat atcagttgtg gtaatgtcca tggccacctt 7381 tgcaagctcc agatccaact tcgagaagct cagaggaccc gtcataactt tgtacggcgg 7441 tcctaaatag
Los ejemplos de secuencia de ADNc del virus O'Nyong-Nyong de tipo silvestre comprenden la CDS de la secuencia de GENBANK M20303.1 (extendiéndose la CDS de la posición 80 a la posición 7624, GENBANK M20303.1; SEQ ID NO: 94).
La SEQ ID NO: 94 es:
a tggattcagt gtatgtagac atagatgctg acagcgcgtt 121 tctgaaggcg ttgcagcaag cataccccat gtttgaggtg gaaccaaagc aggtcacgcc 181 aaatgaccat gcaaacgcta gagcattttc gcatctagca ataaaactga tagagcagga 241 aattgatcca gactcaacca ttctagacat tggtagcgca ccagctagga ggatgatgtc 301 tgatagaaaa taccactgcg tctgcccgat gcgcagcgca gaagaccctg agaggctcgc 361 gaattacgcg agaaaacttg cgtcagccgc tggaaaggtg acagataaaa acatctccgg 421 aaaaattaat gatctacaag ctgtgatggc cgtaccgaat atggaaacat ccacattctg 481 cctacacact gatgctacat gcaaacaaag aggagacgtc gccatttatc aagacgtcta 541 cgccgtccat gcacctacct cgctgtacca tcaggcgatt aaaggagtcc gcgtggcata 601 ctggataggg ttcgatacga cacctttcat gtacaatgca atggctggcg catacccatc 661 atattcaaca aactgggctg atgagcaggt actgaaagct aagaacatag ggctgtgttc 721 aacagaccta tctgagggta gacgaggcaa actatccatc atgagaggca aaaaattgaa 781 gccatgcgac cgagtgctat tctcggtcgg ctcaacactc taccctgaaa gtcgtaaact 841 tctacaaagc tggcatttac catcggtatt tcatctgaag ggtaaactca gcttcacctg 901 ccgctgtgac acgatcgtct catgcgaagg atacgttgtc aagagagtga ccatgagtcc 961 aggcatctac ggaaagacat cggggtatgc tgtaactcat catgccggcg gcttcctgat 1021 gtgcaagacg acagatacag tagacggcga aagggtatca ttctccgtgt gtacttacgt 1081 accagctact atctgcgacc agatgactgg aatccttgcc actgaggtaa ccccagaaga 1141 cgcacagaaa ctactggttg ggctaaacca acggatagtg gtcaatggca ggacgcaacg 1201 taatacaaac accatgaaaa actacctgct cccaatagtt gctcaggcct tcagcaagtg 1261 ggccaaagaa tgtcgaaagg acatggagga cgaaaaactc ttgggtgtcc gagagaggac 1321 cttaacgtgc tgttgcctat gggcatttag aaagcacaag acgcatacgg tgtacaaaag 1381 accggatacc cagtcaatcc aaaaggtccc tgccgaattt gacagctttg tgataccaag 1441 tctgtggtcg tcaggtttat caattccgct gagaaccaga atcaagtggc tcttgagcaa 1501 agctccaaaa tacgagcaac taccgcacag cggaaacgcc gaggaagcag cccaggctga 1561 aacagatgcg gtagaagaac aggaggcaga gctaacccga gaagctatgc caccattgca 1621 ggcgacacag gatgacattc aggtagaaat tgatgtagag caacttgaag accgagcagg 1681 agcgggcata gtcgaaacac caagaggagc aatcaaagtc acagcccaac cgtcagacct 1741 tgttgtcgga gagtacttag tactgacacc gcaggcggtc ctgcgcagcc aaaaactcag 1801 tctgattcac gcgcttgcag agcaggtaaa aacgtgcaca catagtgggc gagcaggcag 1861 gtacgcggtt gaagcatacg atgggcgtgt tctagtgccc tcgggctacg cgatacccca 1921 ggaagacttc cagagcttaa gcgaaagtgc caccatggta tttaacgagc gagagtttgt 1981 gaaccggaag ttacaccaca tcgccatgca cggcccagcg ctgaacactg atgaagagtc 2041 atatgaactg gtaagggtag agaaaacaga acacgagtac gtctatgacg ttgatcagaa 2101 gaaatgttgt aagagggagg aagcaacagg actagtgcta gtaggcgact taactagccc 2161 accataccat gagttcgcct acgaaggact aaaaatccgc ccagcatgtc catacaaaac 2221 ggcagttata ggtgtcttcg gagtaccggg ttctggcaag tcggctataa tcaaaaacct 2281 ggtaaccagg caagacttgg tgactagtgg aaaaaaagaa aactgccaag aaatctccaa 2341 tgacgtaatg cggcaaagga aattggagat atctgcacgt acagtcgact cactactcct 2401 gaatggatgt aacaagccag tggaagtact gtacgtggac gaggcattcg cttgtcattc 2461 gggaaccctg ttggcactga tagccatggt tagaccgcgt cagaaggtcg tactttgtgg 2521 cgacccaaag cagtgcggat tcttcaatat gatgcaaatg aaggtcaact ataatcacaa 2581 catctgcaca caggtgtacc ataaaagcat atcaaggcgg tgtacactgc ctgtaacagc 2641 catcgtgtcc tcgttgcatt acgagagcaa gatgcgcact acaaatgagt acaaccagcc 2701 aatcgtagtg gatactacgg gcataacaaa accagaaccc ggggacttag tgttaacgtg 2761 tttccgggga tgggttaagc agctgcaaat agactaccgt ggaaacgaag tcatgacagc 2821 agctgcttct caggggctga ccagaaaagg tgtttatgca gtaaggcaga aagtcaacga 2881 aaaccctctg tatgcaccaa catcagaaca cgttaacgtg ctattgacac gcacagaggg 2941 caagttgaca tggaagacac tctcaggcga cccatggata aagatactgc agaacccccc 3001 aaaaggggac tttaaggcaa caatcaagga gtgggaagca gaacacgcct ccatcatggc 3061 aggaatatgc aatcaccaga tggcttttga cacatttcag aacaaagcta atgtatgctg 3121 ggctaaatgc ctggtcccta ttcttgacac tgctggaatc aaattaagtg acaggcagtg 3181 gtctcagata gtgcaagctt ttaaagaaga tagggcctac tctccagaag ttgcactgaa 3241 tgaaatatgc actcgcatat atggggtaga cctggacagc ggactattct caaagccact 3301 gatatccgtc tactatgcag acaaccactg ggacaataga ccaggaggaa aaatgttcgg 3361 gttcaaccct gaggtggcac ttatgcttga aaagaaatat ccctttacaa aaggtaagtg 3421 gaacattaac aagcagatat gtataactac cagaaaggtt gacgaattta accccgaaac 3481 caacataata ccggccaacc gcagactgcc gcactcactc gtggctgaac accactcagt 3541 gagaggggaa agaatggaat ggctggtaaa caaaatcagc ggtcaccaca tgttgttggt 3601 tagcggtcat aatcttatat taccaacaaa aagagtcacc tgggtagcac cgttaggcac 3661 ccgaggtgca gactacacat ataacctgga acttggtcta ccagccacac taggcagata 3721 tgacctggta gttatcaata tccatactcc attccgcata catcattacc agcagtgtgt 3781 agatcacgca atgaagctcc agatgctagg gggggactct ctacggctgt taaagccggg 3841 aggttcactt ctgattagag cttacgggta cgccgaccga accagtgaaa gggtcattag 3901 cgtattggga cgcaagttca gatcgtccag ggctctgaaa cctcagtgca tcacgagcaa 3961 tacagaaatg ttcttcctat ttagccgatt cgacaatgga agaaggaact tcaccacaca 4021 tgttatgaac aaccagctga acgcagtgta tgcaggactg gccactagag cgggctgtgc 4081 cccgtcatac cgagtgaaac ggatggacat cgcaaagaac actgaggaat gcgtggtaaa 4141 cgccgccaat ccgcgcggag taccaggcga tggagtatgt aaagccgtgt atagaaaatg 4201 gccagaatca ttcagaaaca gtgcaacacc agtggggact gcaaagacaa tcatgtgcgg 4261 tcaatacccc gtcatccacg cagtaggccc taacttctca aactattctg aggctgaagg 4321 ggatagggaa ttggcttcag tgtatagaga agtggcgaaa gaagtgtcta ggctaggagt 4381 gagcagtgta gccatccctt tgctctca.a.c cggtgtgtac tcaggaggca aagacagact 4441 gctgcaatca ctaaaccatc ttttcgcagc gatggattcg acagatgcag acgttgtcat 4501 ctactgcagg gacaaggaat gggagaagaa gatcactgaa gccatatcac taagatccca 4561 ggtagaatta ctagatgatc acatctcagt ggattgcgac attgtacgcg ttcatccaga 4621 cagcagcttg gcaggccgaa aggggtacag cacagtagag ggagcactct actcgtacct 4681 agagggaaca agattccacc aaactgcagt agatatggca gagatatata ccatgtggcc 4741 gaaacaaact gaagccaacg aacaggtctg cctatatgct ctgggggaga gtatagagtc 4801 cgtcaggcaa aaatgtcccg tagacgacgc cgacgcctca ttccctccga aaacagtccc 4861 gtgcctatgc cgttatgcta tgacgcctga acgagttgca cgtctacgca tgaatcatac 4921 caccagcatc atagtgtgct cgtcttttcc gctgccgaaa tacaaaatcg agggcgtgca 4981 aaaagtaaaa tgttcgaaag cactcttgtt tgatcacaac gtaccgtctc gagtgagccc 5041 gagaacgtac aggcctgcgg acgaaatcat acagacacct caaacaccaa ctgaagcgtg 5101 tcaggacgca caactcgtgc agtcaataaa tgatgaagca gtgccagttc cctcagactt 5161 agaggcttgt gacgcaacta tggactggcc ctctatcggc accgtatcaa caagacaaag 5221 acacgactca tctgacagcg agtatagtgg ctccagaagt aacatacaac tagtgacggc 5281 ggacgtgcat gcaccaatgt acgcacattc gctggcgtcc agcggaggtt caatgctgtc 5341 gctgtccagt gaaccagctc agaacggcac aatgatacta cttgactcag aagacacaga 5401 cagtataagc agagtaagca caccgatcgc cccgcccaga agacgtttgg gaaggaccat 5461 aaatgtgacc tgcgacgagc gggaagggaa aatactccct atggccagcg acaggttctt 5521 cactgctaag ccatacactg tcgcactgag cgtatcaaca gcagatatga ctgtgtatcc 5581 catccaggca ccgctaggat tgataccacc acctaccctc gaaccgatca ctttcggaga 5641 cttcgccgaa ggtgaaatag acaacctcct gacaggggca ttgacatttg gggacttcga 5701 gccaggtgaa gtggaagagc tgacggatag cgagtggtca acgtgctcgg acacagacga 5761 agagttacga ctagacagag cagggggtta catattctcc tctgacactg gtcaaggtca 5821 tctacagcaa aaatcagtac gtcaaacgac gctaccggta aacattgttg aagaggtcca 5881 cgaagagaaa tgctatccac ctaaattgga tgagatcaaa gagcaactac tacttaagag 5941 acttcaggag agtgcttcca cggctaaccg gagtaggtac caatctagaa aagtggaaaa 6001 catgaaagcc acgattatcc acagactgaa agagggttgc agactctatt tggcgtcaga 6061 aacaccgagg gtcccatctt accgagtcac atacccggcg cccatctact cgccttcaat 6121 caatatcaaa ctgactaacc cagagactgc agtagcagtg tgtaacgagt ttttggccag 6181 aaactatcca actgtggcat cctaccaagt cactgacgag tacgacgcgt acttggatat 6241 ggtagacggg tccgaaagtt gcctagacag agctacattc aacccgtcta aactcaggag 6301 ttacccaaaa caacactctt accacgcacc caccatcaga agtgcagtgc catcaccatt 6361 ccaaaatacg ttgcagaatg tcttggcagc ggccacaaaa agaaactgca acgtaacgca 6421 gatgagggaa ctacccacta tggactccgc agtgtttaac gtggagtgtt ttaagaagta 6481 cgcttgcaac caagagtact ggagagagtt cgcctcaagc cctataaggg taacgacaga 6541 gaatctgaca atgtatgtga cgaaactaaa ggggcctaaa gcggcggcac tcttcgcaaa 6601 aacacacaac ttgctgccgc tacaagaggt accgatggac aggttcacaa tggacatgaa 6661 acgtgatgtg aaagtgacac caggtacaaa gcacaccgag gaaaggccga aagtacaggt 6721 catacaggcg gcagaaccac tggcaacagc atacctgtgt ggcatacaca gagagttggt 6781 gagaagacta aatgcagttc tgctaccgaa tgtccacaca ctgttcgata tgtcagccga 6841 agacttcgat gcaattatag ccacccattt caaaccgggc gatgctgtac tagaaactga 6901 catagcctca tttgataaga gtcaagacga ctcgcttgcg tcgaccgcca tgatgttgct 6961 agaagacctt ggggtagatc aacctatcct ggatctgata gaagcagcat tcggcgaaat 7021 atccagttgt catctaccga cgggtacgcg gttcaagttc ggcgcaatga tgaaatcagg 7081 catgtttcta accctgtttg tcaataccct cctgaacatc accattgcca gtcgggtgtt 7141 agaggagcga ttgactactt cagcctgtgc agctttcatt ggggacgaca acataataca 7201 tggggttgtc tctgacgcac taatggctgc acgttgtgct acgtggatga acatggaagt 7261 gaaaatcatc gatgcagtag tgtcagagaa ggcgccatac ttctgtgggg gatttatttt 7321 acacgacacg gtgacaggca cgtcgtgcag agtagcagac cctttaaaga gactgttcaa 7381 gctaggcaaa cctctggcag ctggagacga acaggatgag gacagaagac gtgctctggc 7441 agatgaggtt actagatggc aaagaaccgg cttagtcaca gaattggaaa aagcagtata 7501 ttcaaggtat gaagtacaag gaataacagc cgtaataaca tcaatggcta cctttgcgaa 7561 tagcaaagaa aactttaaga aactaagagg gcccgtcgta accttgtacg gcggacctaa 7621 atag
El genoma de ARN del virus de la gripe de tipo silvestre consiste generalmente en 13.300-13.800 nucleótidos, por ejemplo, 13.388-13.788 nucleótidos, por ejemplo, 13.588 nucleótidos.
Los ejemplos de secuencia de ADNc del virus de la gripe de tipo silvestre comprenden la CDS del genoma de ARN de la cepa ATCC® VR-1337™ (virus de la gripe tipo A, subtipo H1N1) o de un virus de la gripe de tipo A, subtipo H1N1, que comprende:
la secuencia codificante de PB2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 59,
la secuencia codificante de PB1 es la secuencia de la SEQ ID NO: 62,
la secuencia codificante de PB1-F2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 64,
la secuencia codificante de NP es la secuencia de la SEQ ID NO: 70,
la secuencia codificante de NA es la secuencia de la SEQ ID NO: 73,
la secuencia codificante de M1 es la secuencia de la SEQ ID NO: 76,
la secuencia codificante de M2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 78,
la secuencia codificante de NS1 es la secuencia de la SEQ ID NO: 81,
la secuencia codificante de NS2 es la secuencia de la SEQ ID NO: 83,
la secuencia codificante de PA es la secuencia de la SEQ ID NO: 49 o 51 y
la secuencia codificante de HA es la secuencia de la SEQ ID NO: 67 (véanse los ejemplos 2 y 5 más adelante).
En el virus (de ARN) de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión de ADNc de la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 14. De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 14.
El virus (de ARN) de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la proteína P1 (endógena) del virus de Coxsackie de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 4. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) (modificado o) vivo y atenuado del virus de Coxsackie de la invención,, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la proteína P1 (endógena) del virus de Coxsackie de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
La secuencia de la SEQ ID NO: 4 es la secuencia codificante de ADNc de P1 de tipo silvestre de un virus de Coxsackie
infeccioso. La secuencia de SEQ ID NO: 14 es la secuencia de SEQ ID NO: 4 modificada de acuerdo con la invención mediante el reemplazo de un total de 117 codones de Leu y Ser por codones de "1-hasta-parada" (de Leu y Ser). Téngase a bien ver el ejemplo 1 más adelante.
En el virus (de ARN) de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión en ADNc de la secuencia que codifica la poliproteína del virus de Coxsackie puede comprender o consistir en, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 13 o 12, más particularmente, de la SEQ ID NO: 13. De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la poliproteína del virus de Coxsackie puede comprender o consistir en, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 13 o 12, más particularmente, de la SEQ ID No : 13.
El virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la poliproteína (endógena) del virus de Coxsackie de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 1, más particularmente, la versión de ARN de la secuencia de SEQ ID NO: 2. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) (modificado o) vivo y atenuado del virus de Coxsackie de la invención,, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la poliproteína (endógena) del virus de Coxsackie de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 1, más particularmente, la secuencia de SEQ ID NO: 2.
La secuencia de SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADNc del genoma de longitud completa de un virus de Coxsackie infeccioso. La secuencia de SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ADNc de la CDS del virus de Coxsackie infeccioso. La secuencia de SEQ ID NO: 12 es la secuencia de SEQ ID NO: 1 modificada de acuerdo con la invención mediante el reemplazo de un total de 117 codones de Leu y Ser de la proteína P1 por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos de Leu y Ser). La secuencia de SEQ ID NO: 13 es la secuencia de SEQ ID NO: 2 modificada de acuerdo con la invención mediante el reemplazo de un total de 117 codones de Leu y Ser de la proteína P1 por codones de "1-hasta-parada" (sinónimos de Leu y Ser). Téngase a bien ver el ejemplo 1 más adelante.
En el virus (de ARN) de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión de ADNc de la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 85 (véase el ejemplo 6 más adelante). De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 85.
El virus (de ARN) de Coxsackie (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la proteína P1 (endógena) del virus de Coxsackie de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 4. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) (modificado o) vivo y atenuado del virus de Coxsackie de la invención,, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la proteína P1 (endógena) del virus de Coxsackie de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
En el virus (de ARN) de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión de ADNc de la secuencia que codifica la proteína PA del virus de la gripe comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 54 o 56. De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la proteína PA del virus de la gripe comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 54 o 56.
El virus (de ARN) de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la proteína PA (endógena) del virus de la gripe de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 49 o 51. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) del virus de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la proteína PA (endógena) del virus de la gripe de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 49 o 51.
El virus (de ARN) (modificado o) vivo y atenuado de la gripe de la invención puede comprender los segmentos PB2, PB1, NP, NA, M y NS de tipo silvestre de la gripe, por ejemplo, el segmento genómico de PB2 de SEQ ID NO: 59, el segmento genómico de p B1 de SEQ ID NO: 62, el segmento genómico de NP de SEQ ID NO: 70, el segmento genómico de NA de SEQ ID NO: 73, el segmento genómico de M1 de SEQ ID NO: 76, el segmento genómico de M2 de SEQ ID NO: 78, el segmento genómico de NS1 de SEQ ID NO: 81 y el segmento genómico de NS2 de SEQ ID NO: 83.
Téngase a bien ver el ejemplo 5 más adelante.
El virus (de ARN) de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede comprender el segmento de HA de tipo silvestre (SEQ ID NO: 67) o una HA mutada (tal como la SEQ ID NO: 87; véase el ejemplo 7 más adelante).
En el virus (de ARN) de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión de ADNc de la secuencia
que codifica la proteína PA del virus de la gripe comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 87. De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la proteína PA del virus de la gripe comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 87.
El virus (de ARN) de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la proteína PA (endógena) del virus de la gripe de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 67. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) del virus de la gripe (modificado o) vivo y atenuado de la invención, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la proteína PA (endógena) del virus de la gripe de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 67.
El virus (de ARN) (modificado o) vivo y atenuado de la gripe de la invención puede comprender los segmentos PB2, PB1, NP, NA, M y NS de tipo silvestre de la gripe, por ejemplo, el segmento genómico de PB2 de SEQ ID NO: 59, el segmento genómico de p B1 de SEQ ID NO: 62, el segmento genómico de NP de SEQ ID NO: 70, el segmento genómico de NA de SEQ ID NO: 73, el segmento genómico de M1 de SEQ ID NO: 76, el segmento genómico de M2 de SEQ ID NO: 78, el segmento genómico de NS1 de SEQ ID NO: 81 y el segmento genómico de NS2 de SEQ ID NO: 83.
Téngase a bien ver el ejemplo 7 más adelante.
El virus (de ARN) (modificado o) vivo y atenuado de la gripe de la invención puede comprender el segmento genómico de PA de SEQ ID NO: 49 o 51 o puede comprender un segmento de PA mutado (tal como la SEQ ID NO: 54 o 56; véase el ejemplo 3 más adelante).
En el virus (de ARN) Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión de ADNc de la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña puede comprender o consistir en la secuencia de SEQ ID NO: 101 (véase el ejemplo 8 más adelante). De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña puede comprender o consistir en la secuencia de SEQ ID NO: 101. El virus (de ARN) Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 (endógena) del virus Chikunguña de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 104. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) del virus Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 (endógena) del virus Chikunguña de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 104.
En el virus (de ARN) Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la versión de ADNc de la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña puede comprender o consistir en la secuencia de SEQ ID NO: 102 (véase el ejemplo 8 más adelante). De manera similar, en el clon (de ADN o ADNc) del virus Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención, la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña puede comprender o consistir en la secuencia de SEQ ID NO: 102. El virus (de ARN) Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención puede, ventajosamente, no comprender la secuencia codificante de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 (endógena) del virus Chikunguña de dicho virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede ventajosamente no comprender la versión de ARN de la secuencia de la SEQ ID NO: 100. De manera similar, el clon (de ADN o ADNc) del virus Chikunguña (modificado o) vivo y atenuado de la invención, puede ventajosamente no comprender la retrotranscripción de ADN o ADNc de la secuencia codificante de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 (endógena) del virus Chikunguña de un virus de ARN infeccioso, más particularmente, puede no comprender, ventajosamente, la secuencia de la SEQ ID NO: 100.
La divulgación se refiere más particularmente a un virus vivo y atenuado o a un clon de ADNc vivo y atenuado del virus, que es un virus de Coxsackie vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Leu en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo se seleccionan todos entre UUA y UUG para dicho virus vivo y atenuado o entre TTA y TTG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado y en donde los codones que codifican Ser en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo se seleccionan entre UCA y u Cg para dicho virus vivo y atenuado o entre TCA y TCG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado. Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención.
Por ejemplo, la invención se refiere a un virus de Coxsackie vivo y atenuado o a un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 14 o la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 14, respectivamente.
Como alternativa o de manera complementaria a dichos codones de Ser y Leu, los codones de Arg y Gly pueden ser
codones que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (véase el ejemplo 6 más adelante). El virus de Coxsackie vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado del mismo puede, por ejemplo, ser un virus de Coxsackie o un clon, en donde los codones que codifican Arg en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos CGA y en donde los codones que codifican Gly en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos GGA. Por ejemplo, el virus de Coxsackie vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado del mismo es un virus de Coxsackie o un clon, en donde la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 85 o la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 85, respectivamente.
Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención.
La divulgación se refiere más particularmente a un virus vivo y atenuado o a un clon de ADNc vivo y atenuado del virus, que es un virus de la gripe vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Leu en las proteínas pA y/o HA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo se seleccionan todos entre UUA y UUG para dicho virus vivo y atenuado o entre TTA y TTG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado y en donde los codones que codifican Ser en las proteínas PA y/o hA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo se seleccionan entre UCA y UCG para dicho virus vivo y atenuado o entre TCA y TCG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado. Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención. Por ejemplo, la invención se refiere a un virus de la gripe vivo y atenuado o a un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde
la secuencia que codifica la proteína PA de la gripe es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 54 o 56 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 54 o 56, respectivamente; o
en donde la secuencia codificante para la proteína HA de la gripe es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87, respectivamente; o
en donde la secuencia que codifica la proteína PA de la gripe es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID n O: 54 o 56 o la secuencia de ADNc de SEQ ID No : 54 o 56, respectivamente y en donde la secuencia que codifica la proteína HA de la gripe es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87, respectivamente.
Como alternativa o de manera complementaria a dichos codones de Ser y Leu, los codones de Arg y Gly pueden ser codones que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (véase el ejemplo 8 más adelante). El virus de la gripe vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado del mismo puede, por ejemplo, ser un virus de la gripe o un clon, en donde los codones que codifican Arg en las proteínas PA y/o Ha de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos CGA y en donde los codones que codifican Gly en las proteínas PA y/o HA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos GGA.
Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención.
La divulgación se refiere más particularmente a un virus vivo y atenuado o a un clon de ADNc vivo y atenuado del virus, que es un virus Chikunguña vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Leu en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo se seleccionan todos entre UUA y UUG para dicho virus vivo y atenuado o entre TTA y TTG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado y en donde los codones que codifican Ser en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo se seleccionan entre UCA y UCG para dicho virus vivo y atenuado o entre TCA y TCG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado. Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención.
Por ejemplo, la invención se refiere a un virus Chikunguña vivo y atenuado o a un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña es o comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de Se Q ID NO: 101 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 101, respectivamente.
Como alternativa o de manera complementaria a dichos codones de Ser y Leu, los codones de Arg y Gly pueden ser codones que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (véase el ejemplo 8 más adelante). El virus Chikunguña vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado del mismo puede, por ejemplo, ser un virus Chikunguña o un clon, en donde los codones que codifican Arg en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos CGA y en donde los codones que codifican Gly en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos GGA. Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención.
Por ejemplo, el virus de Coxsackie vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado del mismo es un virus Chikunguña o un clon, en donde la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 102 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 102, respectivamente.
Dicho virus vivo y atenuado o clon de ADNc puede obtenerse mediante el proceso de la invención.
Ventajosamente, un virus vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado de la invención genera codones de PARADA mediante mutación después de uno o varios ciclos de replicación.
La invención también se refiere a los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc) de dichos virus o clones atenuados, más particularmente, a cada uno de los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 14, 54, 56, 85, 87, 101 y 102. La invención también se refiere a un vector de ácido nucleico, tal como un plásmido, que comprende al menos uno de estos ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc).
La invención también se refiere a un medio de cultivo, más particularmente, a un medio de cultivo celular, que comprende al menos un virus o clon (modificado o atenuado) de la invención. Dicho medio de cultivo puede, por ejemplo, ser un medio de cultivo in vitro y/o de origen no natural. Más particularmente, dicho medio de cultivo (celular) puede ser el medio de cultivo (celular) in vitro descrito anteriormente, por ejemplo, un medio de cultivo (celular) in vitro, que comprende aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas y fuentes de carbono, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, un medio de cultivo DMEM, tal como el DMEM de GlutaMAX™.
Además de dicho al menos un virus (modificado o atenuado) o clon de la invención, dicho medio de cultivo puede comprender dichas células. Dichas células pueden, por ejemplo, ser una célula, que es sensible a la infección por dicho virus (modificado o atenuado) o clon de la invención y que puede cultivarse en dicho medio de cultivo (celular). Dichas células pueden, por ejemplo, ser una célula como se ha descrito anteriormente para el cultivo (celular) in vitro, por ejemplo, una célula de mamífero, más particularmente, una célula humana (por ejemplo, de una línea celular, tal como la línea celular HeLa [ATCC® CCL-2™]) o una célula animal no humana (por ejemplo, de una línea celular de mamífero no humano, tal como la línea celular VERO [ATCC® CCL-81™]).
La invención también se refiere a una composición. El término "composición" abarca una composición farmacéutica, composición antivírica, composición inmunogénica y vacuna, más particularmente, una composición antivírica, composición inmunogénica y vacuna, más particularmente una composición inmunogénica y vacuna.
La composición de la invención comprende al menos un virus o clon (modificado o atenuado) de la invención, más particularmente, al menos un virus o clon (de ADN o ADNc) vivo y atenuado de la invención.
La composición de la invención puede usarse en la prevención y/o el tratamiento y/o la paliación, más particularmente, en la prevención, de una infección por un virus de ARN o de una enfermedad o trastorno inducido por un virus de ARN. Por ejemplo, una composición de la invención, que comprende al menos un virus de Coxsackie (modificado o atenuado) o un clon (de ADN o ADNc) de la invención, puede usarse en la prevención y/o el tratamiento y/o la paliación, más particularmente, en la prevención, de una infección por un virus de Coxsackie o de una enfermedad o trastorno inducido por un virus de Coxsackie. Por ejemplo, una composición de la invención, que comprende al menos un virus de la gripe (modificado o atenuado) o un clon (de ADN o ADNc) de la invención, puede usarse en la prevención y/o el tratamiento y/o la paliación, más particularmente, en la prevención, de una infección por un virus de la gripe o de una enfermedad o trastorno inducido por un virus de la gripe. Por ejemplo, una composición de la invención, que comprende al menos un virus Chikunguña (modificado o atenuado) o un clon (de ADN o ADNc) de la invención, puede usarse en la prevención y/o el tratamiento y/o la paliación, más particularmente, en la prevención, de una infección por un virus Chikunguña o de una enfermedad o trastorno inducido por un virus Chikunguña. Por ejemplo, una composición de la invención, que comprende al menos un virus O'Nyong-Nyong (modificado o atenuado) o un clon (de ADN o ADNc) de la invención, puede usarse en la prevención y/o el tratamiento y/o la paliación, más particularmente, en la prevención, de una infección por virus O'Nyong-Nyong o de una enfermedad o trastorno inducido por un virus O'Nyong-Nyong.
Ventajosamente, dicha composición de la invención es adecuada para su administración a un hospedador, en particular, en un hospedador mamífero, especialmente, en un hospedador humano o animal.
Dicha composición de la invención puede comprender además un excipiente o portador y/o vehículo farmacéuticamente adecuado, cuando se usa para administración sistema o local. Un excipiente o portador y/o vehículo farmacéuticamente adecuado se refiere a una carga, diluyente, material de encapsulamiento o formulación sólida, semisólida o líquida no tóxica de cualquier tipo convencional. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" es no tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación; los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, soluciones de suero salino tamponado con fosfato, agua destilada, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de soluciones estériles de agentes humectantes y similares, dextrosa, glicerol, solución salina, etanol y combinaciones de los mismos.
Dicha composición de la invención puede comprender además un adyuvante inmunogénico, tal como adyuvantes de tipo Freund, usados generalmente en forma de una emulsión con una fase acuosa o pueden comprender sales inorgánicas insolubles en agua, tales como hidróxido de aluminio, sulfato de zinc, hidróxido de hierro coloidal, fosfato de calcio o cloruro de calcio.
En la composición de la invención, el virus o el clon de la invención está contenido ventajosamente en una dosis
suficiente para provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos, más particularmente, una respuesta inmunitaria de anticuerpos contra al menos una poliproteína, proteína o polipéptido expresado por dicho virus o clon de la invención. En una realización particular, dicha respuesta inmunitaria de anticuerpos es una respuesta humoral protectora. La respuesta humoral protectora da como resultado, principalmente, anticuerpos madurados, que tienen alta afinidad por el antígeno, tales como IgG. En una realización particular, la respuesta humoral protectora induce la producción de anticuerpos neutralizantes.
Se considera que la composición de la invención puede tener una capacidad protectora contra la infección por virus de ARN cuando después de la exposición del hospedador inmunizado a dicho virus de ARN, dicha composición retrasa y/o atenúa los síntomas normalmente provocados (en un hospedador animal no protegido) después de la infección con dicho virus de ARN contra el cual se busca la protección mediante la administración de la composición de la invención.
De acuerdo con una realización particular, dicha composición de la invención se formula para una administración por vía parenteral, tal como inyección subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.) o intravenosa (i.v.), más particularmente, inyección intradérmica (i.d.).
De acuerdo con otra realización particular, dicha composición de la invención se administra en una o múltiples dosis de administración, en particular, en un régimen de administración de cebado-refuerzo. La expresión "régimen de cebado-refuerzo" abarca generalmente una primera etapa de administración que genera una respuesta inmunitaria y una o varias etapas de administración posteriores que refuerzan la reacción inmunitaria. Por consiguiente, puede usarse un sistema de cebado-refuerzo eficaz para administración iterativa, que permite el cebado y refuerzo sucesivo de la respuesta inmunitaria en un hospedador, especialmente después de las inyecciones en un hospedador que lo necesite. El término "iterativo" significa que el principio activo se administra dos o más veces al hospedador. Puede administrarse la inmunización de cebado y refuerzo al hospedador a dosis diferentes o idénticas y pueden administrarse inyecciones a intervalos de varias semanas, en particular, a intervalos de cuatro semanas o más.
La cantidad a administrarse (dosis) depende del sujeto a tratar, incluyendo el estado del paciente, el estado del sistema inmunitario del individuo, la vía de administración y el tamaño del hospedador. Las dosis adecuadas pueden ajustarse por una persona normalmente versada en la materia.
La invención también se refiere al uso de un virus o un clon como se describe en el mismo en un método para tratar, prevenir o proteger, más particularmente, para prevenir o proteger contra la infección por un virus de ADN en un hospedador mamífero, especialmente en un hospedador humano o animal no humano, que comprende administrar dicho virus o clon de la invención a dicho hospedador mamífero.
Como se usa en el presente documento, la expresión "para proteger contra una infección por virus de ARN" se refiere a un método mediante el cual se obstruye o retrasa una infección por un virus de ARN, especialmente cuando los síntomas que acompañan o siguen a la infección se atenúan, retrasan o alivian o cuando el virus de ARN infeccioso se elimina del hospedador.
La invención también se refiere a un método para producir una composición, más particularmente, una composición inmunogénica o vacuna contra la infección por un virus de ARN, que comprende producir dicho virus o clon de la invención, por ejemplo, en forma de un clon o clon de ADNc en un medio de cultivo, opcionalmente recoger las partículas víricas o viriones producidas por dicho virus o clon y formular dicho virus o clon cultivado (o dichas partículas víricas recogidas) en una composición adecuada para su administración a un animal, más particularmente, a un ser humano o a un animal no humano.
La invención también se refiere a un producto de programa informático, para su almacenamiento en una memoria de una unidad de procesamiento o en un soporte de memoria extraíble para la cooperación con un lector de dicha unidad de procesamiento, en donde dicho producto de programa informático comprende instrucciones.
Dichas instrucciones pueden, por ejemplo, ser instrucciones para llevar a cabo un proceso de la invención.
Dichas instrucciones pueden, por ejemplo, ser instrucciones para identificar codones, que codifican Leu, Ser, Arg o Gly en la secuencia de ácido nucleico de un virus de ARN infeccioso o clon (de ADNc) infeccioso del mismo y para reemplazar una proporción de estos por un codón diferente pero sinónimo, en donde (cada uno de) dichos codones diferentes pero sinónimos es un codón, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (codón de "1-hasta-parada"; véase lo anterior). Dicha proporción es diferente del 0 % y diferente del 100 %. Por ejemplo, dicha proporción es una proporción del 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3-20 %, 3-15 % o 3-10 % del número total de codones del genoma de dicho virus de ARN infeccioso o del número total de codones de la secuencia de la CDS de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc, respectivamente (véase lo anterior).
Como alternativa o de manera complementaria, más particularmente de manera complementaria, dichas instrucciones pueden, por ejemplo, ser instrucciones para identificar codones, que codifican Thr o Ala en la secuencia de ácido nucleico de un virus de ARN infeccioso o un clon (de ADNc) infeccioso y que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de Ser y para reemplazar una proporción de estos Thr o Ala por un codón diferente pero no sinónimo, en donde (cada uno de) dichos codones diferentes pero no sinónimos es un codón, que codifica Ser y que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA (véase lo anterior). Dicha proporción es diferente del 0 % y diferente del 100 %.
Por ejemplo, dicha proporción es una proporción del 2-30 %, 2-25 %, 2-20 %, 2-15 %, 2-10 %, 3-30 %, 3-25 %, 3 20 %, 3-15 % o 3-10 % del número total de codones del genoma de dicho virus de ARN infeccioso o del número total de codones de la secuencia de la CDS de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc, respectivamente (véase lo anterior).
La invención también se refiere a un dispositivo informático, que comprende una unidad de procesamiento en cuya memoria se almacena un producto de programa informático de la invención. El dispositivo informático de la invención puede comprender además la secuencia de nucleótidos de un virus de ARN (infeccioso) o clon y/o instrucciones o valores de medida para la implementación del proceso o los medios de la invención, por ejemplo, instrucciones o valores de medición para el número de codones, que codifican Leu, Ser, Arg o Gly en la secuencia de ácido nucleico de un virus de ARN infeccioso o de un clon (de ADNc) infeccioso del mismo y/o para el número de codones, que codifican Thr o Ala en la secuencia de ácido nucleico de un virus de ARN infeccioso o clon (de ADNc) infeccioso del mismo y que difieren en tan solo un nucleótido de un codón de Ser.
La expresión "que comprende", que es sinónima de "que incluye" o "que contiene", es abierta y no excluye elementos, ingredientes o etapas del método adicionales no recitados, mientras que la expresión "consiste en" es una expresión cerrada, que excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente adicional que no se cite explícitamente.
La expresión "que consiste esencialmente en" es una expresión parcialmente abierta, que no excluye elementos, etapas o ingredientes adicionales no citados, en tanto que estos elementos, etapas o ingredientes adicionales no afecten materialmente a las propiedades básicas y novedosas de los medios de la invención.
Por lo tanto, la expresión "que comprende" (o "comprende") incluye la expresión "que consiste en" ("consiste en"), así como la expresión "que consiste esencialmente en" ("consiste esencialmente en"). Por consiguiente, la expresión "que comprende" (o "comprende"), en la presente descripción, pretende abarcar, más particularmente, la expresión "que consiste en" ("consiste en") y la expresión "que consiste esencialmente en" ("consiste esencialmente en").
En un intento de ayudar al lector de la presente descripción, la descripción se ha separado en diversos párrafos o secciones. No ha de considerarse que estas separaciones desconectan a la sustancia de un párrafo o sección de la sustancia de otro párrafo o sección. Por el contrario, la presente descripción abarca todas las combinaciones de las diversas secciones, párrafos y afirmaciones que puedan contemplarse.
Los siguientes ejemplos se presentan como ilustración y no como limitación.
Ejemplos
EJEMPLO 1:
Puede describirse la arquitectura genética de las poblaciones de virus de ARN como una red de variantes organizadas en el espacio de secuencia alrededor de secuencias maestras, citándose normalmente un espectro mutante como una cuasiespecie. Debido a sus extremas tasas de mutación, las poblaciones de virus de ARN existen peligrosamente próximas a un umbral de extinción, como se ha demostrado por numerosos estudios de mutagénesis letal. Los modelos genéticos de poblaciones sugieren que la replicación propensa a errores próxima a este umbral de extinción favorecerán la evolución de la robustez mutacional, mediante la cual las poblaciones amortiguan los efectos negativos de la mutación, migrando a regiones del espacio de secuencia correspondientes a paisajes de aptitud más neutros. A su vez, la robustez puede facilitar la capacidad de evolución aumentando el número de vías adaptativas disponibles en un paisaje dado.
Por lo tanto, se baraja la hipótesis de que los virus han desarrollado secuencias genómicas para su posicionamiento en regiones óptimas del espacio de secuencia donde se encuentran accesibles las mayores redes de secuencias vecinas mediante mutaciones de aptitud neutra.
En virología experimental, el concepto de la secuencia maestra se representa generalmente por la consenso, que es la media genética de cada nucleótido en cada posición de nucleótidos a lo largo del genoma. Los estudios de robustez mutacional en sistemas experimentales generalmente se han basado en la demostración de diferencias entre diferentes virus de diferentes familias taxonómicas o en el mejor de los casos, entre diferentes miembros de la misma familia taxonómica. Como resultado, estos virus no están ocupando el mismo espacio de secuencia y por lo tanto, no puede abordarse directamente la robustez en estos estudios.
En un estudio reciente, Lauring et al. 2012, evaluaron experimentalmente la robustez de los genomas de poliovirus que presentan secuencias con codones reordenados, lo que sugiere que la robustez, de hecho, se alteró y podría explicar potencialmente la atenuación de estas variantes in vivo. Sin embargo, el laboratorio que construyó inicialmente estas variantes proporciona una explicación alternativa para la atenuación basada en la desoptimización de pares de codones (Coleman et al. 2008). La validez de la robustez como un rasgo evolucionable y modificable sigue sin poder abordarse y confirmarse directamente.
En modelos evolutivos, la robustez puede vincularse con la degeneración del código genético. Es decir, múltiples secuencias pueden dar lugar al mismo aminoácido y por lo tanto, al mismo fenotipo. Aunque normalmente se cree que una mutación sinónima es selectivamente neutra, la variación observada en el uso de codones en los taxones tanto
víricos como de organismos sugiere la presencia de sesgo mutacional y/o de presión selectiva. En los virus de ARN, se ha considerado que las restricciones en las estructuras de ARN, la disponibilidad de ARNt, el contenido de dinucleótidos de CpG y el emparejamiento de codones desoptimizados son el motivo para el sesgo de codones y han impedido y confundido los intentos para demostrar el papel de la robustez genética o mutacional en la aptitud vírica.
Por tanto, los presentes inventores han abordado directa y experimentalmente la robustez y demuestran inequívocamente que de hecho, la robustez es un rasgo evolucionable optimizado que en caso de modificarse, da como resultado la atenuación de los virus de ARN.
Materiales y métodos
Generación de soluciones madre de virus e infecciones.
Basándose en la matriz de similitud química para aminoácidos de McLachlan (McLachan, 1971; McLachlan 1972; número de referencia MCLA720101) y el marco de referencia matemático de Archetti para predecir el efecto de una mutación puntual en codones sinónimos (Archetti 2009), los presentes inventores generaron virus sinónimos sintéticos (o SynSyn) que portan 117 codones sinónimos diferentes, en otras palabras, diferentes secuencias de nucleótidos, a la vez que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Todas las variantes "SynSyn" se modificaron genéticamente usando tecnología génica sintética "de novo" (EUROGENTEC) y el clon infeccioso de ADNc CVB3-Nancy (secuencia genómica de ADNc de SEQ ID NO: 1, secuencia de la CDS de Ad Nc de SEQ ID NO: 2). Todos los plásmidos de ADN recientemente generados se secuenciaron mediante el método de Sanger en su totalidad (GATC BIOTECH) para confirmar que se introdujeron cada una de las 117 posiciones. La presente estrategia se basó en los dos aminoácidos con el mayor intervalo de exploración del espacio de secuencia, es decir, serina y leucina, debido a que están codificados por seis codones diferentes. De manera importante, se alteraron estos codones sin afectar a la estructura, replicación, traducción, así como a las frecuencias de dinucleótidos del ARN. Estos codones pueden clasificarse en tres categorías (véase la figura 1):
A- Grupo de "1-hasta-parada", para un cambio de distancia de un codón de parada, de tal forma que una mutación en este codón tiene una probabilidad máxima de cambiarlo a un codón de parada tras una sola mutación puntual. B- Grupo "Más-i", para más volátil, significa que una nueva mutación en este codón tiene una mayor probabilidad de cambiar a un aminoácido con propiedades químicas distintas (aminoácidos más volátiles) y
C- Grupo "Menos-i", para menos volátil, significa que una mutación en este codón tiene una mayor probabilidad de ser silente o de mantener propiedades fisicoquímicas similares a las del aminoácido original. En la tabla 1 a continuación se proporciona una lista detallada de todos los cambios introducidos.
T l 1: Li l m i in r i n l vir n n m n "1-h - r "
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Las posiciones de codones en la secuencia de la CDS de la SEQ ID NO: 2 son iguales a aquellas en la SEQ ID NO: 1 menos 774.
Se linealizaron plásmidos de ADNc de CVB3 con Sal I. Los plásmidos linealizados se purificaron con el kit de purificación de la PCR MACHEREY-NAGEL. Se transcribieron in vitro 5 |jg de plásmido linealizado usando T7 ARN polimerasa (FERMENTAS). Se electroporaron 10 jg de transcrito en células HeLa que se lavaron dos veces en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) y se resuspendieron en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) a 107 células/ml. Las condiciones de la electroporación fueron las siguientes: cubeta de 0,4 mm, 25 mF, 700 V, resistencia máxima, reducción exponencial en un electroporador GenePulser XCell de BIO-RAD. Las células se recuperaron en DMEM (GlutaMAX™; SIGMA-ALDRICH, n.° de producto 31966047, que tiene 4,5 g/l de D-glucosa y que contiene 110 mg/l de piruvato de sodio). Se usaron 500 j l de soluciones de virus de p0 para infectar a monocapas frescas de células HeLa durante tres pases más. Para cada pase, el virus se recogió mediante un ciclo de congelación-descongelación y se clarificó centrifugando a 10 K rpm durante 10 minutos. Se generaron tres soluciones madre independientes para cada virus. La secuenciación consenso de las soluciones madre de virus usadas en los experimentos aguas abajo confirmaron la estabilidad de las mutaciones diseñadas y no detectó ninguna mutación adicional a lo largo del genoma.
Determinación de los títulos víricos:
Mediante TCID50: Se prepararon diluciones seriadas de factor diez de virus en placas de fondo redondo de 96 pocillos en medio DMEM asérico. Se llevaron a cabo diluciones en 12 replicados y se transfirieron 100 j l de dilución a 104 células Vero emplacadas en 100 j l de DMEM. Después de 5 días, las monocapas de células vivas se colorearon con cloruro de metilrosanilina. Los valores de TCID50 se determinaron mediante el método de Reed y Muensch.
Mediante ensayo en placa: Se sembraron células Vero o HeLa en placas de 6 pocillos y se diluyeron en serie preparaciones del virus (10 veces) en medio libre de DMEM. Las células se lavaron dos veces con PBS y se infectaron con 250 j l de dilución durante 30 minutos a 37 °C, tras lo cual se añadió una cubierta sólida que comprendía medio DMEM y agarosa al 1 % p/v (INVITROGEN). 2 días después de la infección, se fijaron las células y se tiñeron con cloruro de metilrosanilina al 0,2 % y se numeraron las placas.
Pases víricos en condiciones mutagénicas
Fármacos (SIGMA ALDRICH)
- Ribavirina IUPAC, 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroxi-metil)oxolan-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida); - 5-Fluorouracilo, IUPAc 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-diona;
- 5-Azacitidina IUPAC, 4-amino-1-b-D-ribofuranosil-1,3,5-triazin-2(1H)-ona;
- Amilorida, IUPAC, 3,5-diamino-6-cloro-N-(diaminometilen)pirazina-2-carboxamida.
Se pretrataron monocapas de células HeLa en placas de 6 pocillos durante 4 horas (ribavirina, AZC, 5FU, MnCl2 y compuestos de amilorida con diferentes concentraciones, de 50 a 300 j l de cada uno). Se seleccionaron y verificaron las concentraciones de compuestos que eran no tóxicas para las células a lo largo de un periodo de 72 horas. Para los compuestos de amilorida, se seleccionaron y confirmaron concentraciones correspondientes a valores de concentración inhibidora del virus (CI50) que no eran tóxicos para las células, como se determinan por Harrison et al.
2008. Después, se infectaron las células a una MOI = 0,1 con virus del pase 2. 48 horas después de la infección, el virus se recogió mediante un ciclo de congelación-descongelación y se determinaron los títulos de virus (TCID50 o ensayo de placa). Se llevó a cabo el mismo procedimiento durante cinco pases, cada uno en diferentes condiciones mutagénicas en tres replicados biológicos.
Cinética de replicación y cuantificación de los genomas víricos
Para la cinética de crecimiento, se infectaron células HeLa a una MOI de 0,1 y 1, se congelaron en diferentes puntos de tiempo después de la infección y posteriormente, se titularon mediante un ensayo de TCID50. Para los análisis por
qRT-PCR, se extrajo el ARN total de sobrenadantes de células infectadas con reactivo TRIzol (INVITROGEN) y se purificó. Se usó el kit de RT-PCR TaqMan RNA-to-Ctone-step (APPLIED BIOSYSTEMS) para cuantificar el ARN vírico. Cada reacción de 25 j l contenía 5 j l de ARN, 100 jM de cada cebador (directo 5'-GCATATGGTGATGATGTGATCGCTAGC-3' SEQ ID NO: 95 e inverso 5'-GGGGTACTGTTCATCTGCTCTAAA-3' SEQ ID NO: 96) y 25 pmol de sonda 5'-[6-Fam] GGTTACGGGCTGATCATG-3' en una máquina ABI 7000. La retrotranscripción se llevó a cabo a 50 °C durante 30 min y a 95 °C durante 10 min y fue seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y a 60 °C durante 1 min. Una curva patrón (y = -0,2837x 12.611, R2 = 0,99912) se generó usando ARN genómico transcrito in vitro.
Estimación cuantitativa de la aptitud
Los valores de aptitud relativa se obtuvieron mediante competición con cada virus SynSyn, obtenido de diferentes pases en cada ensayo de mutágeno/compuesto diferente, con un virus de referencia marcado que contiene cuatro mutaciones silentes adyacentes en la región de la polimerasa introducida por mutagénesis directa. Se llevaron a cabo coinfecciones por triplicado a una MOI de 0,01 usando una mezcla 1:1 de cada variante con el virus de referencia. Después de 24 h, se recogieron los sobrenadantes y se llevó a cabo una mezcla 1:1 con reactivo TRIzol (INVITROGEN) para conservar el ARN vírico. Se determinó la proporción de cada virus mediante RT-PCR en tiempo real con el ARN extraído usando una mezcla de sondas Taqman marcadas con dos colorantes indicadores fluorescentes diferentes. MGB_CVB3_WT detecta virus TS (que incluye las variantes SynSyn) con la secuencia CGCATCGTACCCATGG (SEQ ID NO: 97) y está marcado en el extremo 5' con un colorante de 6FAM (6-carboxifluoresceína) y MGB_CVB3_Ref que contiene las cuatro mutaciones silentes; CGCTAGCTACCCATGG (s Eq ID NO: 98) se marcó con un colorante 5' VIC. Cada reacción de 25 j l contenía 5 j l de ARN, 900 nM de cada cebador (cebador directo, 5'-GATCGCATATGGTGATGATGTGA-3' SEQ ID NO: 99; cebador inverso, 5'-AGCTTCAGCGAGTAAAGATGCA-3' SEQ ID NO: 100), y 150 nM de cada sonda. Usando un patrón conocido para el virus de TS y de referencia durante la q-RT-PCR, se pudo calcular la concentración de ARN para cada variante vírica con una sensibilidad extremadamente buena. Se determinó la aptitud relativa mediante el método descrito en el estudio de Carrasco et al, usando las determinaciones de ARN para cada virus. Brevemente, la fórmula W = representa la aptitud W de cada genotipo mutante en relación con la secuencia de referencia de competidor común, donde R(0) y R(t) representan la relación de densidades de virus mutante a de referencia en la mezcla de inoculación y t días después de la inoculación (1 día en este caso), respectivamente. Es importante mencionar que la aptitud del TS normal al virus de referencia fue de 1,019, lo que indica ausencia de diferencias significativas en la aptitud causadas por mutaciones silentes diseñadas en el virus de referencia (competidor).
Infección de ratones
Se mantuvo a ratones en las instalaciones para animales del Instituto PASTEUR en condiciones de bioseguridad de nivel 2, proporcionando agua y alimento a voluntad y se manejaron de acuerdo con guías institucionales de bienestar animal. Todos los estudios se llevaron a cabo en ratones macho BALB/c de entre 5 y 6 semanas de edad. Se infectó a los ratones por vía i.p. con 105 TCID50 en 0,20 ml. Para los estudios de tropismo de tejido, se recogieron órganos completos (bazo, páncreas y corazón) y se homogeneizaron los sueros en PBS usando un homogeneizador de tejidos Precellys 24 (BERTIN TECHNOLOGIES). El ARN vírico se extrajo usando reactivo TRIzol (INVITROGEN). La PCR de genoma completo, los títulos víricos mediante la TCID50 así como la PCR en tiempo real, se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.
Análisis de genoma completo mediante secuenciación profunda
Para estimar la diversidad de población de las variantes por secuenciación profunda, se prepararon bibliotecas de ADNc mediante H-menos RT (THERMOFISHER) de ARN extraído de virus generado en células HeLa o diferentes órganos de ratones y se amplificó el genoma vírico usando una polimerasa de alta fidelidad (PHUSION®) para generar 1 amplicón de 7,4 kb de longitud (genoma de longitud completa). Se fragmentaron las PCR (Fragmentasa), se multiplexaron, se agruparon, se secuenciaron en el mismo carril con la tecnología ILLUMINA cBot y GAIIX y se analizaron con herramientas de análisis de datos de secuenciación profunda establecidas y secuencias de comandos de desarrollo propio.
Espacio de secuencia
Los presentes inventores han propuesto una representación del espacio de secuencia diseñada para capturar la diversidad causada por diferencias en la robustez mutacional de los virus SynSyn. Para cada una de las 117 posiciones de codones que se modificaron en los presentes virus SynSyn, se estimó la fracción de mutantes que usaba cada uno de los 64 codones a partir de los datos de secuenciación profunda. Tomando el valor medio a lo largo de 117 posiciones, se obtuvieron las frecuencias medias de uso de codones, proporcionando una representación del espacio de secuencia de las muestras en 64 dimensiones. Aunque esta representación no refleja auténticamente el espacio de secuencia completo, es adecuada para estudiar los efectos de cambios en la robustez en un vecindario que contiene enjambres mutantes alrededor de los 4 virus.
Reducción de dimensiones
Se aplicó análisis de componentes principales (PCA) a los datos de secuencia transformados logarítmicamente para encontrar la estructura construir una baja representación dimensional.
El resultado del PCA se midió mediante la cantidad de varianza capturada en los componentes usados para la representación en pocas dimensiones y se pudieron visualizar mediante una trama de pantalla.
Reconstrucción del paisaje de aptitud
El acoplamiento de la representación en pocas dimensiones (preferentemente 2D) de cada muestra con el valor de aptitud de la muestra, se usaron métodos de interpolación para asignar un valor de aptitud a cualquier punto del espacio en pocas dimensiones. Se asumió que todos los puntos en el espacio de secuencia que se mapean en un punto específico en el espacio de pocas dimensiones tienen la misma aptitud. La reconstrucción del paisaje se efectuó con un suavizador de núcleo Gaussiano. Se estimó la aptitud de un punto como una media ponderada de las muestras vecinas, donde las ponderaciones se proporcionan por núcleos Gaussianos centrados en cada muestra y después se normalizaron para sumar hasta uno. La amplitud del núcleo determina el suavizado del paisaje. Se empleó validación cruzada para hallar la amplitud del núcleo que maximiza la potencia predictiva del paisaje.
Datos de secuencia (secuencias de tipo silvestre)
Secuencia de ADNc del genoma de ARN de un virus de Coxsackie humano B3 de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [7452 nt]:
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gttgtttgaccctccccgcgttttcaactctacgcaggaagtggttggactccttttagattagagacaatt tgaaataatttagattggcttaaccctactgtgctaaccgaaccagataacggtacagtaggggtaaattct ccgcattcggtgcggaaaaaaaaaaaaaaaaaagaa
SEQ ID NO: 1
Secuencia de ADNc del CDS del genoma de ARN de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [fragmento 774-7331 de SEQ ID NO: 1; 6558 nt]:
atgggagctcaagtatcaacgcaaaagactggggcacatgagaccaggctgaatgctagcggcaattccatc attcactacacaaatattaattattacaaggatgccgcatccaactcagccaatcggcaggatttcactcaa gacccgggcaagttcacagaaccagtgaaagatatcatgattaaatcactaccagctctcaactcccccaca gtagaggagtgcggatacagtgacagggcgagatcaatcacattaggtaactccaccataacgactcaggaa tgcgccaacgtggtggtgggctatggagtatggccagattatctaaaggatagtgaggcaacagcagaggac caaccgacccaaccagacgttgccacatgtaggttctatacccttgactctgtgcaatggcagaaaacctca ccaggatggtggtggaagctgcccgatgctttgtcgaacttaggactgtttgggcagaacatgcagtaccac tacttaggccgaactgggtataccgtacatgtgcagtgcaatgcatctaagttccaccaaggatgcttgcta gtagtgtgtgtaccggaagctgagatgggttgcgcaacgctagacaacaccccatccagtgcagaattgctg gggggcgatagcgcaaaggagtttgcggacaaaccggtcgcatccgggtccaacaagttggtacagagggtg gtgtataatgcaggcatgggggtgggtgttggaaacctcaccattttcccccaccaatggatcaacctacgc accaataatagtgctacaattgtgatgccatacaccaacagtgtacctatggataacatgtttaggcataac aacgtcaccctaatggttatcccatttgtaccgctagattactgccctgggtccaccacgtacgtcccaatt acggtcacgatagccccaatgtgtgccgagtacaatgggttacgtttagcagggcaccagggcttaccaacc atgaatactccggggagctgtcaatttctgacatcagacgacttccaatcaccatccgccatgccgcaatat gacgtcacaccagagatgaggatacctggtgaggtgaaaaacttgatggaaatagctgaggttgactcagtt gtcccagtccaaaatgttggagagaaggtcaactctatggaagcataccagatacctgtgagatccaacgaa ggatctggaacgcaagtattcggctttccactgcaaccagggtactcgagtgtttttagtcggacgctccta ggagagatcttgaactattatacacattggtcaggcagcataaagcttacgtttatgttctgtggttcggcc atggctactggaaaattccttttggcatactcaccaccaggtgctggagctcctacaaaaagggttgatgct atgcttggtactcatgtaatttgggacgtggggctacaatcaagttgcgtgctgtgtataccctggataagc caaacacactaccggtttgttgcttcagatgagtataccgcagggggttttattacgtgctggtatcaaaca aacatagtggtcccagcggatgcccaaagctcctgttacatcatgtgtttcgtgtcagcatgcaatgacttc tctgtcaggctattgaaggacactcctttcatttcgcagcaaaactttttccagggcccagtggaagacgcg ataacagccgctatagggagagttgcggataccgtgggtacagggccaaccaactcagaagctataccagca ctcactgctgctgagacgggtcacacgtcacaagtagtgccgggtgacactatgcagacacgccacgttaag aactaccattcaaggtccgagtcaaccatagagaacttcctatgtaggtcagcatgcgtgtactttacggag tataaaaactcaggtgccaagcggtatgctgaatgggtattaacaccacgacaagcagcacaacttaggaga aagctagaattctttacctacgtccggttcgacctggagctgacgtttgtcataacaagtactcaacagccc tcaaccacacagaaccaagatgcacagatcctaacacaccaaattatgtatgtaccaccaggtggacctgta ccagataaagttgattcatacgtgtggcaaacatctacgaatcccagtgtgttttggaccgagggaaacgcc ccgccgcgcatgtccataccgtttttgagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaa ttttccaggaacggagtttacggcatcaacacgctaaacaacatgggcacgctatatgcaagacatgtcaac
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tttgaagaggctatattttccaagtatataggaaatgtcaacacacacgtggatgagtacatgctggaagca gtggaccactacgcaggccaactagccaccctagatatcagcactgaaccaatgaaactggaggacgcagtg tacggtaccgagggtcttgaggcgcttgatctaacaacgagtgccggttacccatatgttgcactgggtatc aagaagagggacatcctctctaagaagactaaggacctaacaaagttaaaggaatgtatggacaagtatggc ctgaacctaccaatggtgacttatgtaaaagatgagctcaggtccatagagaaggtagcgaaaggaaagtct aggctgattgaggcgtccagtttgaatgattcagtggcgatgagacagacatttggtaatctgtacaaaact ttccacctaaacccaggggttgtgactggtagtgctgttgggtgtgacccagacctcttttggagcaagata ccagtgatgttagatggacatctcatagcatttgattactctgggtacgatgctagcttaagccctgtctgg tttgcttgcctaaaaatgttacttgagaagcttggatacacgcacaaagagacaaactacattgactacttg tgcaactcccatcacctgtacagggataaacattactttgtgaggggtggcatgccctcgggatgttctggt accagtattttcaactcaatgattaacaatatcataattaggacactaatgctaaaagtgtacaaagggatt gacttggaccaattcaggatgatcgcatatggtgatgatgtgatcgcatcgtacccatggcctatagatgca tctttactcgctgaagctggtaagggttacgggctgatcatgacaccagcagataagggagagtgctttaac gaagttacctggaccaacgccactttcctaaagaggtattttagagcagatgaacagtaccccttcctggtg catcctgttatgcccatgaaagacatacacgaatcaattagatggaccaaggatccaaagaacacccaagat cacgtgcgctcactgtgtctattagcttggcataacggggagcacgaatatgaggagttcatccgtaaaatt agaagcgtcccagtcggacgttgtttgaccctccccgcgttttcaactctacgcaggaagtggttggactcc ttttag
SEQID NO: 2
Poliproteína de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [codificado por la CDS de la SEQ ID NO: 2; 2185 aa]:
MGAQVSTQKTGAHETRLNASGNSI1HYTNINYYKDAASNSANRQDFTQDP 50 GKFTEPVKDIMIKSLPALNSPTVEECGYSDRARSITLGNSTITTQECANV 100 WGYGVWPDYLKD SEATAEDQPTQPDVATCRFYTLDSVQWQKTSPGWWWK 150 LPDALSNLGLFGQNMQYHYLGRTGYTVHVQCNASKFHQGCLLWCVPEAE 200 MGCATLDNTPSSAELLGGDSAKEFADKPVASGSNKLVQRWYNAGMGVGV 250 GNLTIFPHQWINLRTNNSATIVMPYTNSVPMDNMFRHNNVTLMVIPFVPL 300 DYCPGSTTYVPITVTIAPMCAEYNGLRLAGHQGLPTMNTPGSCQFLTSDD 350 FQS PSAMPQYDVT PEMRIPGEVKNLMEIAEVD SWPVQNVGEKVN SMEAY 400 QIPVRSNEGSGTQVFGFPLQPGYSSVFSRTLLGEILNYYTHWSGSIKLTF 450 MFCGSAMATGKFLLAY SPPGAGAPTKRVDAMLGTHVIWDVGLQS SCVLCI 500 PWISQTHYRFVASDEYTAGGFITCWYQTNIWPADAQSSCYIMCFVSACN 550 DFSVRLLKDTPFISQQNFFQGPVEDAITAAIGRVADTVGTGPTNSEAIPA 600 LTAAETGHTSQWPGDTMQTRHVKNYHSRSESTIENFLCRSACVYFTEYK 650 NSGAKRYAEWVLTPRQAAQLRRKLEFFTYVRFDLELTFVITSTQQPSTTQ 700 NQDAQILTHQIMYVPPGGPVPDKVDSYVWQTSTNPSVFWTEGNAPPRMSI 750 PFLSIGNAYSNFYDGWSEFSRNGVYGINTLNNMGTLYARHVNAGSTGPIK 800 STIRIYFKPKHVKAWIPRPPRLCQYEKAKNVNFQPSGVTTTRQSITTMTN 850 TGAFGQQSGAVYVGNYRWNRHLATSADWQNCVWESYNRDLLVSTTTAHG 900 CDIIARCQCTTGVYFCASKNKHYPISFEGPGLVEVQESEYYPRRYQSHVL 950 LAAGFSEPGDCGGILRCEHGVIGIVTMGGEGWGFADIRDLLWLEDDAME 1000 QGVKDYVEQLGNAFGSGFTNQICEQVNLLKESLVGQDSILEKSLKALVKI 1050 ISALVIWRNHDDLITVTATLALIGCTSSPWRWLKQKVSQYYGIPMAERQ 1100
NN SWLKKFTEMTNACKGMEWIAVKIQKFIEWLKVKILPEVREKHEFLNRL 1150 KQLPLLESQIATIEQSAPSQSDQEQLFSNVQYFAHYCRKYAPLYAAEAKR 1200 VFSLEKKMSNYIQFKSKCRIEPVCLLLHGSPGAGKSVATNLIGRSLAEKL 1250 NSSVYSLPPDPDHFDGYKQQAWIMDDLCQNPDGKDVSLFCQMVSSVDFV 1300 PPMAALEEKGILFTSPFVLASTNAGSINAPTVSDSRALARRFHFDMNIEV 1350 ISMYSQNGKINMPMSVKTCDDECCPVNFKKCCPLVCGKAIQFIDRRTQVR 1400 YSLDMLVTEMFREYNHRHSVGTTLEALFQGPPVYREIKISVAPETPPPPA 1450 IADLLKSVDSEAVREYCKEKGWLVPEINSTLQIEKHVSRAFICLQALTTF 1500 VSVAGIIYIIYKLFAGFQGAYTGVPNQKPRVPTLRQAKVQGPAFEFAVAM 1550 MKRNSSTVKTEYGEFTMLGIYDRWAVLPRHAKPGPTILMNDQEVGVLDAK 1600 ELVDKDGTNLELTLLKLNRNEKFRDIRGFLAKEEVEVNEAVLAINTSKFP 1650 NMYIPVGQVTEYGFLNLGGTPTKRMLMYNFPTRAGQCGGVLMSTGKVLGI 1700 HVGGNGHQGFSAALLKHYFNDEQGEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEP 1750 SVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRLKANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEA 1800 VDHYAGQLATLDISTEPMKLEDAVYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKK 1850 RDILSKKTKDLTKLKECMDKYGLNLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIE 1900 ASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHLNPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDG 1950 HLIAFDYSGYDASLSPVWFACLKMLLEKLGYTHKETNYIDYLCNSHHLYR 2000 DKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSMINNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAY 2050 GDDVIASYPWPIDASLLAEAGKGYGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKR 2100 YFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HESIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGE 2150 HEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPAFSTLRRKWLDSF SEQID NO: 3
T l : Vir x ki B i ilv r ir inf i
Secuencia de ADNc que codifica la región P1 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [fragmento 1-2562 de SEQ ID NO: 2; 2562 nt]:
atgggagctcaagtatcaacgcaaaagactggggcacatgagaccaggctgaatgctagcggcaattccatc attcactacacaaatattaattattacaaggatgccgcatccaactcagccaatcggcaggatttcactcaa gacccgggcaagttcacagaaccagtgaaagatatcatgattaaatcactaccagctctcaactcccccaca gtagaggagtgcggatacagtgacagggcgagatcaatcacattaggtaactccaccataacgactcaggaa tgcgccaacgtggtggtgggctatggagtatggccagattatctaaaggatagtgaggcaacagcagaggac caaccgacccaaccagacgttgccacatgtaggttctatacccttgactctgtgcaatggcagaaaacctca ccaggatggtggtggaagctgcccgatgctttgtcgaacttaggactgtttgggcagaacatgcagtaccac
t8.Ctt8.C[C[CCC[8.8.CtC[C[C[t8.t8.CCC[t8.C8.tC[tC[C8.C[tC[C8.3.tC[C8.tct8.8.C[ttCC8.CC8.8.C[C[8.tC[CttC[Ct8. gtagtgtgtgtaccggaagctgagatgggttgcgcaacgctagacaacaccccatccagtgcagaattgctg gggggcgatagcgcaaaggagtttgcggacaaaccggtcgcatccgggtccaacaagttggtacagagggtg gtgtataatgcaggcatgggggtgggtgttggaaacctcaccattttcccccaccaatggatcaacctacgc accaataatagtgctacaattgtgatgccatacaccaacagtgtacctatggataacatgtttaggcataac aacgtcaccctaatggttatcccatttgtaccgctagattactgccctgggtccaccacgtacgtcccaatt acggtcacgatagccccaatgtgtgccgagtacaatgggttacgtttagcagggcaccagggcttaccaacc atgaatactccggggagctgtcaatttctgacatcagacgacttccaatcaccatccgccatgccgcaatat gacgtcacaccagagatgaggatacctggtgaggtgaaaaacttgatggaaatagctgaggttgactcagtt gtcccagtccaaaatgttggagagaaggtcaactctatggaagcataccagatacctgtgagatccaacgaa ggatctggaacgcaagtattcggctttccactgcaaccagggtactcgagtgtttttagtcggacgctccta ggagagatcttgaactattatacacattggtcaggcagcataaagcttacgtttatgttctgtggttcggcc atggctactggaaaattccttttggcatactcaccaccaggtgctggagctcctacaaaaagggttgatgct atgcttggtactcatgtaatttgggacgtggggctacaatcaagttgcgtgctgtgtataccctggataagc caaacacactaccggtttgttgcttcagatgagtataccgcagggggttttattacgtgctggtatcaaaca aacatagtggtcccagcggatgcccaaagctcctgttacatcatgtgtttcgtgtcagcatgcaatgacttc tctgtcaggctattgaaggacactcctttcatttcgcagcaaaactttttccagggcccagtggaagacgcg ataacagccgctatagggagagttgcggataccgtgggtacagggccaaccaactcagaagctataccagca ctcactgctgctgagacgggtcacacgtcacaagtagtgccgggtgacactatgcagacacgccacgttaag aactaccattcaaggtccgagtcaaccatagagaacttcctatgtaggtcagcatgcgtgtactttacggag tataaaaactcaggtgccaagcggtatgctgaatgggtattaacaccacgacaagcagcacaacttaggaga aagctagaattctttacctacgtccggttcgacctggagctgacgtttgtcataacaagtactcaacagccc tcaaccacacagaaccaagatgcacagatcctaacacaccaaattatgtatgtaccaccaggtggacctgta ccagataaagttgattcatacgtgtggcaaacatctacgaatcccagtgtgttttggaccgagggaaacgcc ccgccgcgcatgtccataccgtttttgagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaa ttttccaggaacggagtttacggcatcaacacgctaaacaacatgggcacgctatatgcaagacatgtcaac gctggaagcacgggtccaataaaaagcaccattagaatctacttcaaaccgaagcatgtcaaagcgtggata cctagaccacctagactctgccaatacgagaaggcaaagaacgtgaacttccaacccagcggagttaccact actaggcaaagcatcactacaatgacaaatacgggcgcattt
SEQID NO: 4
Región P1 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [codificado por la SEQ ID NO: 4; 854 aa]:
MGAQVSTQKTGAHETRLNASGNSI1HYTNINYYKDAASNSANRQDFTQDP 5O
GKFTEPVKDIMIKSLPALNSPTVEECGYSDRARSITLGNSTITTQECANV 100
WGYGVWPDYLKD SEATAEDQPTQPDVATCRFYTLD SVQWQKT SPGWWWK 150
LPDALSNLGLFGQNMQYHYLGRTGYTVHVQCNASKFHQGCLLWCVPEAE 200
MGCATLDNTPSSAELLGGDSAKEFADKPVASGSNKLVQRWYNAGMGVGV 250
GNLTIFPHQWINLRTNNSATIVMPYTNSVPMDNMFRHNNVTLMVIPFVPL 300
DYCPGSTTYVPITVTIAPMCAEYNGLRLAGHQGLPTMNTPGSCQFLTSDD 350
FQSPSAMPQYDVT PEMRIPGEVKNLMEIAEVD SWPVQNVGEKVN SMEAY 400
QIPVRSNEGSGTQVFGFPLQPGYSSVFSRTLLGEILNYYTHWSGSIKLTF 450
MFCGSAMATGKFLLAYSPPGAGAPTKR.VDAMLGTHVIWDVGLQSSCVLCI 500
PWISQTHYRFVASDEYTAGGFITCWYQTNIWPADAQSSCYIMCFVSACN 550
DFSVRLLKDTPFISQQNFFQGPVEDAITAAIGRVADTVGTGPTNSEAIPA 600
LTAAETGHTSQWPGDTMQTRHVKNYHSRSESTIENFLCRSACVYFTEYK 650
NSGAKRYAEWVLTPRQAAQLRRKLEFFTYVRFDLELTFVITSTQQPSTTQ 700
NQDAQILTHQIMYVPPGGPVPDKVDSYVWQTSTNPSVFWTEGNAPPRMSI 750
PFLSIGNAYSNFYDGWSEFSRNGVYGINTLNNMGTLYARHVNAGSTGPIK 800
STIRIYFKPKHVKAWIPRPPRLCQYEKAKNVNFQPSGVTTTRQSITTMTN 850
TGAF SEQID NO: 5
Secuencia de ADNc que codifica la región P2 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [fragmento 2563-4287 de SEQ ID NO: 2; 1725 nt]:
ggacaacaatcaggggcagtgtatgtggggaactacagggtggtaaatagacatctagctaccagtgctgac tggcaaaactgtgtgtgggaaagttacaacagagacctcttagtgagcacgaccacagcacatggatgtgat attatagccagatgtcagtgcacaacgggagtgtacttttgtgcgtccaaaaacaagcactacccaatttcg tttgaaggaccaggtctagtagaggtccaagagagtgaatactaccccaggagataccaatcccatgtgctt ttagcagctggattttccgaaccaggtgactgtggcggtatcctaaggtgtgagcatggtgtcattggcatt gtgaccatggggggtgaaggcgtggtcggctttgcagacatccgtgatctcctgtggctggaagatgatgca atggaacagggagtgaaggactatgtggaacagcttggaaatgcattcggctccggctttactaaccaaata tgtgagcaagtcaacctcctgaaagaatcactagtgggtcaagactccatcttagagaaatctctaaaagcc ttagttaagataatatcagccttagtaattgtggtgaggaaccacgatgacctgatcactgtgactgccaca ctagcccttatcggttgtacctcgtccccgtggcggtggctcaaacagaaggtgtcacaatattacggaatc cctatggctgaacgccaaaacaatagctggcttaagaaatttactgaaatgacaaatgcttgcaagggtatg gaatggatagctgtcaaaattcagaaattcattgaatggctcaaagtaaaaattttgccagaggtcagagaa aaacacgagttcctgaacagacttaaacaactccccttattagaaagtcagatcgccacaatcgagcagagc gcgccatcccaaagtgaccaggaacaattattttccaatgtccaatactttgcccactattgcagaaagtac
gctcccctctacgcagctgaagcaaagagggtgttctcccttgagaagaagatgagcaattacatacagttc aagtccaaatgccgtattgaacctgtatgtttgctcctgcacgggagccctggtgccggcaagtcggtggca acaaacttaattggaaggtcgcttgctgagaaactcaacagctcagtgtactcactaccgccagacccagat cacttcgacggatacaaacagcaggccgtggtgattatggacgatctatgccagaatcctgatgggaaagac gtctccttgttctgccaaatggtttccagtgtagattttgtaccacccatggctgccctagaagagaaaggc attctgttcacctcaccgtttgtcttggcatcgaccaatgcaggatctattaatgctccaaccgtgtcagat agcagagccttggcaaggagatttcactttgacatgaacatcgaggttatttccatgtacagtcagaatggc aagataaacatgcccatgtcagtcaagacttgtgacgatgagtgttgcccggtcaattttaaaaagtgctgc cctcttgtgtgtgggaaggctatacaattcattgatagaagaacacaggtcagatactctctagacatgcta gtcaccgagatgtttagggagtacaatcatagacatagcgtggggaccacgcttgaggcactgttccag SEQID NO: 6
Región P2 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [codificado por la SEQ ID NO: 6; 575 aa]:
GQQ SGAVYVGNYRWNRHLAT SADWQNCVWE SYNRDLLVS TT TAHGCD11 50
ARCQCTTGVYFCASKNKHYPISFEGPGLVEVQESEYYPRRYQSHVLLAAG 100
FSEPGDCGGILRCEHGVIGIVTMGGEGWGFADIRDLLWLEDDAMEQGVK 150
DYVEQLGNAFGSGFTNQICEQVNLLKESLVGQDSILEKSLKALVKIISAL 200
VIWRNHDDLITVTATLALIGCTSSPWRWLKQKVSQYYGIPMAERQNNSW 250
LKKFTEMTNACKGMEWIAVKIQKFIEWLKVKILPEVREKHEFLNRLKQLP 300
LLESQIATIEQSAPSQSDQEQLFSNVQYFAHYCRKYAPLYAAEAKRVFSL 350
EKKMSNYIQFKSKCRIEPVCLLLHGSPGAGKSVATNLIGRSLAEKLNSSV 400
YSLPPDPDHFDGYKQQAWIMDDLCQNPDGKDVSLFCQMVSSVDFVPPMA 450
A1EEKGILFTSPFVLASTNAGSINAPTVSDSRALARRFHFDMNIEVISMY 500
SQNGKINMPMSVKTCDDECCPVNFKKCCPLVCGKAIQFIDRRTQVRYSLD 550
MLVTEMFREYNHRHSVGTTLEALFQ SEQID NO: 7
Secuencia de ADNc que codifica la región P3 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [fragmento 4288-6555 de SEQ ID NO: 2; 2268 nt]:
ggaccaccagtatacagagagatcaaaattagcgttgcaccagagacaccaccaccgcccgccattgcggac ctgctcaaatcggtagacagtgaggctgtgagggagtactgcaaagaaaaaggatggttggttcctgagatc aactccaccctccaaattgagaaacatgtcagtcgggctttcatttgcttacaggcattgaccacatttgtg tcagtggctggaatcatatatataatatataagctctttgcgggttttcaaggtgcttatacaggagtgccc aaccagaagcccagagtgcctaccctgaggcaagcaaaagtgcaaggccctgcctttgagttcgccgtcgca atgatgaaaaggaactcaagcacggtgaaaactgaatatggcgagtttaccatgctgggcatctatgacagg tgggccgttttgccacgccacgccaaacctgggccaaccatcttgatgaatgatcaagaggttggtgtgcta gatgccaaggagctagtagacaaggacggcaccaacttagaactgacactactcaaattgaaccggaatgag aagttcagagacatcagaggcttcttagccaaggaggaagtggaggttaatgaggcagtgctagcaattaac
accagcaagtttcccaacatgtacattccagtaggacaggtcacagaatacggcttcctaaacctaggtggc acacccaccaagagaatgcttatgtacaacttccccacaagagcaggccagtgtggtggagtgctcatgtcc accggcaaggtactgggtatccatgttggtggaaatggccatcagggcttctcagcagcactcctcaaacac tacttcaatgatgagcaaggtgaaatagaatttattgagagctcaaaggacgccgggtttccagtcatcaac acaccaagtaaaacaaagttggagcctagtgttttccaccaggtctttgaggggaacaaagaaccagcagta ctcaggagtggggatccacgtctcaaggccaattttgaagaggctatattttccaagtatataggaaatgtc aacacacacgtggatgagtacatgctggaagcagtggaccactacgcaggccaactagccaccctagatatc agcactgaaccaatgaaactggaggacgcagtgtacggtaccgagggtcttgaggcgcttgatctaacaacg agtgccggttacccatatgttgcactgggtatcaagaagagggacatcctctctaagaagactaaggaccta acaaagttaaaggaatgtatggacaagtatggcctgaacctaccaatggtgacttatgtaaaagatgagctc aggtccatagagaaggtagcgaaaggaaagtctaggctgattgaggcgtccagtttgaatgattcagtggcg atgagacagacatttggtaatctgtacaaaactttccacctaaacccaggggttgtgactggtagtgctgtt gggtgtgacccagacctcttttggagcaagataccagtgatgttagatggacatctcatagcatttgattac tctgggtacgatgctagcttaagccctgtctggtttgcttgcctaaaaatgttacttgagaagcttggatac acgcacaaagagacaaactacattgactacttgtgcaactcccatcacctgtacagggataaacattacttt gtgaggggtggcatgccctcgggatgttctggtaccagtattttcaactcaatgattaacaatatcataatt aggacactaatgctaaaagtgtacaaagggattgacttggaccaattcaggatgatcgcatatggtgatgat gtgatcgcatcgtacccatggcctatagatgcatctttactcgctgaagctggtaagggttacgggctgatc atgacaccagcagataagggagagtgctttaacgaagttacctggaccaacgccactttcctaaagaggtat tttagagcagatgaacagtaccccttcctggtgcatcctgttatgcccatgaaagacatacacgaatcaatt agatggaccaaggatccaaagaacacccaagatcacgtgcgctcactgtgtctattagcttggcataacggg gagcacgaatatgaggagttcatccgtaaaattagaagcgtcccagtcggacgttgtttgaccctccccgcg ttttcaactctacgcaggaagtggttggactccttt
SEQID NO: 8
Región P3 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [codificado por la SEQ ID NO: 8; 756 aa]:
GPPVYREIKISVAPETPPPPAIADLLKSVDSEAVREYCKEKGWLVPEINS 50
TLQIEKHVSRAFICLQALTTFVSVAGIIYIIYKLFAGFQGAYTGVPNQKP 100
RVPTLRQAKVQGPAFEFAVAMMKRNSSTVKTEYGEFTMLGIYDRWAVLPR 150
HAKPGPTILMNDQEVGVLDAKELVDKDGTNLELTLLKLNRNEKFRDIRGF 200
LAKEEVEVNEAVLAINTSKFPNMYIPVGQVTEYGFLNLGGTPTKRMLMYN 250
FPTRAGQCGGVLMSTGKVLG1HVGGNGHQGFSAALLKHYFNDEQGEIEFI 300
ESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKEPAVLRSGDPRLKANFEE 350
AIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDAVYGTEG 400
LEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGLNLPMVT 450
YVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHLNPGWT 500
GSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDASLSPVWFACLKMLLEKL 550
GYTHKETNYIDYLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSMINNIII 600
RTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKGYGLIMT 650
PADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HESIRWTK 700
DPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPAFSTLRR 750
KWLDSF SEQID NO: 9
Secuencia de ADNc codificante de la polimerasa (es decir, para la proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [fragmento 5170-6555 de SEQ ID NO: 2; 1386 nt] ggtgaaatagaatttattgagagctcaaaggacgccgggtttccagtcatcaacacaccaagtaaaacaaag ttggagcctagtgttttccaccaggtctttgaggggaacaaagaaccagcagtactcaggagtggggatcca cgtctcaaggccaattttgaagaggctatattttccaagtatataggaaatgtcaacacacacgtggatgag tacatgctggaagcagtggaccactacgcaggccaactagccaccctagatatcagcactgaaccaatgaaa ctggaggacgcagtgtacggtaccgagggtcttgaggcgcttgatctaacaacgagtgccggttacccatat gttgcactgggtatcaagaagagggacatcctctctaagaagactaaggacctaacaaagttaaaggaatgt atggacaagtatggcctgaacctaccaatggtgacttatgtaaaagatgagctcaggtccatagagaaggta gcgaaaggaaagtctaggctgattgaggcgtccagtttgaatgattcagtggcgatgagacagacatttggt aatctgtacaaaactttccacctaaacccaggggttgtgactggtagtgctgttgggtgtgacccagacctc ttttggagcaagataccagtgatgttagatggacatctcatagcatttgattactctgggtacgatgctagc ttaagccctgtctggtttgcttgcctaaaaatgttacttgagaagcttggatacacgcacaaagagacaaac tacattgactacttgtgcaactcccatcacctgtacagggataaacattactttgtgaggggtggcatgccc tcgggatgttctggtaccagtattttcaactcaatgattaacaatatcataattaggacactaatgctaaaa gtgtacaaagggattgacttggaccaattcaggatgatcgcatatggtgatgatgtgatcgcatcgtaccca tggcctatagatgcatctttactcgctgaagctggtaagggttacgggctgatcatgacaccagcagataag ggagagtgctttaacgaagttacctggaccaacgccactttcctaaagaggtattttagagcagatgaacag taccccttcctggtgcatcctgttatgcccatgaaagacatacacgaatcaattagatggaccaaggatcca aagaacacccaagatcacgtgcgctcactgtgtctattagcttggcataacggggagcacgaatatgaggag ttcatccgtaaaattagaagcgtcccagtcggacgttgtttgaccctccccgcgttttcaactctacgcagg aagtggttggactccttt
SEQID NO: 10
Polimerasa (es decir, proteína 3D) de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [codificado por la SEQ Id NO: 10; 462 aa]
GEIEFIESSKDAGFPVINTPSKTKLEPSVFHQVFEGNKE PAVLRSGDPRL 50
KANFEEAIFSKYIGNVNTHVDEYMLEAVDHYAGQLATLDISTEPMKLEDA 100
VYGTEGLEALDLTTSAGYPYVALGIKKRDILSKKTKDLTKLKECMDKYGL 150
NLPMVTYVKDELRSIEKVAKGKSRLIEASSLNDSVAMRQTFGNLYKTFHL 200
NPGWTGSAVGCDPDLFWSKIPVMLDGHLIAFDYSGYDASLSPVWFACLK 250
MLLEKLGYTHKETNYIDYLCNSHHLYRDKHYFVRGGMPSGCSGTSIFNSM 300
INNIIIRTLMLKVYKGIDLDQFRMIAYGDDVIASYPWPIDASLLAEAGKG 350
YGLIMTPADKGECFNEVTWTNATFLKRYFRADEQYPFLVHPVMPMKD1HE 400
SIRWTKDPKNTQDHVRSLCLLAWHNGEHEYEEFIRKIRSVPVGRCLTLPA 450
FSTLRRKWLDSF SEQID NO: 11
Datos de secuencia (secuencias de 1-hasta-parada)
Mutante de "1-hasta-parada" de la secuencia de ADNc del genoma de ARN de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de "1-hasta-parada" de la secuencia de SEQ ID NO: 1; 7452 nt]:
GGGAGACCCGAATTCTCCAAGACATCCCCCCCCCAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCC ACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACC CCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCA GCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCG GTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTG GAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCG CATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCAT GGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGT CGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCC TATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCC ATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGA AAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAAATGGGAGCTCAAGT ATCAACGCAAAAGACTGGGGCACATGAGACCAGGTTGAATGCTTCGGGCAATTCGATCAT TCACTACACAAATATTAATTATTACAAGGATGCCGCATCGAACTCAGCCAATCGGCAGGA TTTCACTCAAGACCCGGGCAAGTTCACAGAACCAGTGAAAGATATCATGATTAAATCATT ACCAGCTTTGAACTCGCCCACAGTAGAGGAGTGCGGATACTCAGACAGGGCGAGATCAAT CACATTAGGTAACTCGACCATAACGACTCAGGAATGCGCCAACGTGGTGGTGGGCTATGG AGTATGGC CAGATT ATTTAAAGGATT CAGAGGCAACAGC AGAGGAC CAACCGACCCAAC C AGACGTTGCCACATGTAGGTTCTATACCTTAGACTCAGTGCAATGGCAGAAAACCTCACC AGGATGGTGGTGGAAGTTGCCCGATGCTTTGTCGAACTTAGGATTGTTTGGGCAGAACAT GCAGTACCACTACTTAGGCCGAACTGGGTATACCGTACATGTGCAGTGCAATGCATCAAA GTTCCACCAAGGATGCTTGTTAGTAGTGTGTGTACCGGAAGCTGAGATGGGTTGCGCAAC
GTTAGACAACACCCCATCGTCAGCAGAATTGTTGGGGGGCGATACGGCAAAGGAGTTTGC GGACAAACCGGTCGCATCGGGGTCGAACAAGTTGGTACAGAGGGTGGTGTATAATGCAGG CATGGGGGTGGGTGTTGGAAACTTGACCATTTTCCCCCACCAATGGATCAACTTACGCACC AATAATTCAGCTACAATTGTGATGCCATACACCAACTCAGTACCTATGGATAACATGTTT AGGCATAACAACGTCACCTTAATGGTTATCCCATTTGTACCGTTAGATTACTGCCCTGGG TCAACCACGTACGTCCCAATTACGGTCACGATAGCCCCAATGTGTGCCGAGTACAATGGGT TACGTTTAGCAGGGCACCAGGGCTTACCAACCATGAATACTCCGGGGTCGTGTCAATTTT TGACATCAGACGACTTCCAATCACCATCGGCCATGCCGCAATATGACGTCACACCAGAGAT GAGGATACCTGGTGAGGTGAAAAACTTGATGGAAATAGCTGAGGTTGACTCAGTTGTCCC AGTCCAAAATGTTGGAGAGAAGGTCAACTCAATGGAAGCATACCAGATACCTGTGAGATC GAACGAAGGATCAGGAACGCAAGTATTCGGCTTTCCATTGCAACCAGGGTACTCGTCAGT TTTTTCACGGACGTTGTTAGGAGAGATCTTGAACTATTATACACATTGGTCAGGCTCGAT AAAGTTAACGTTTATGTTCTGTGGTTCGGCCATGGCTACTGGAAAATTCTTATTGGCATA CTCACCACCAGGTGCTGGAGCTCCTACAAAAAGGGTTGATGCTATGTTAGGTACTCATGT AATTTGGGACGTGGGGTTACAATCATCATGCGTGTTGTGTATACCCTGGATATCGCAAAC ACACTACCGGTTTGTTGCTTCAGATGAGTATACCGCAGGGGGTTTTATTACGTGCTGGTA TCAAACAAACATAGTGGTCCCAGCGGATGCCCAATCGTCGTGTTACATCATGTGTTTCGT GTCAGCATGCAATGACTTCTCAGTCAGGTTATTGAAGGACACTCCTTTCATTTCGCAGCA AAACTTTTTCCAGGGCCCAGTGGAAGACGCGATAACAGCCGCTATAGGGAGAGTTGCGGA TACCGTGGGTACAGGGCCAACCAACTCAGAAGCTATACCAGCATTGACTGCTGCTGAGAC GGGTCACACGTCACAAGTAGTGCCGGGTGACACTATGCAGACACGCCACGTTAAGAACTA CCATTCAAGGTCGGAGTCAACCATAGAGAACTTCTTATGTAGGTCAGCATGCGTGTACTT TACGGAGTATAAAAACTCAGGTGCCAAGCGGTATGCTGAATGGGTATTAACACCACGACA AGCAGCACAATTAAGGAGAAAGTTAGAATTCTTTACCTACGTCCGGTTCGACTTGGAGTT GACGTTTGTCATAACATCAACTCAACAGCCCTCAACCACACAGAACCAAGATGCACAGAT CTTAACACACCAAATTATGTATGTACCACCAGGTGGACCTGTACCAGATAAAGTTGATTC ATACGTGTGGCAAACATCAACGAATCCCTCAGTGTTTTGGACCGAGGGAAACGCCCCGCC GCGCATGTCGATACCGTTTTTGTCGATTGGCAACGCCTATTCAAATTTCTATGACGGATG GTCAGAATTTTCGAGGAACGGAGTTTACGGCATCAACACGTTAAACAACATGGGCACGTT ATATGCAAGACATGTCAACGCTGGATCGACGGGTCCAATAAAATCGACCATTAGAATCTA CTTCAAACCGAAGCATGTCAAAGCGTGGATACCTAGACCACCTAGATTGTGCCAATACGA GAAGGCAAAGAACGTGAACTTCCAACCCTCGGGAGTTACCACTACTAGGCAATCGATCAC TACAATGACAAATACGGGCGCATTTGGACAACAATCAGGGGCAGTGTATGTGGGGAACTA
CAGGGTGGTAAATAGACATCTAGCTACCAGTGCTGACTGGCAAAACTGTGTGTGGGAAAG TTACAACAGAGACCTCTTAGTGAGCACGACCACAGCACATGGATGTGATATTATAGCCAG ATGTCAGTGCACAACGGGAGTGTACTTTTGTGCGTCCAAAAACAAGCACTACCCAATTTC GTTTGAAGGACCAGGTCTAGTAGAGGTCCAAGAGAGTGAATACTACCCCAGGAGATACCA ATCCCATGTGCTTTTAGCAGCTGGATTTTCCGAACCAGGTGACTGTGGCGGTATCCTAAG GTGTGAGCATGGTGTCATTGGCATTGTGACCATGGGGGGTGAAGGCGTGGTCGGCTTTGC AGACATCCGTGATCTCCTGTGGCTGGAAGATGATGCAATGGAACAGGGAGTGAAGGACTA TGTGGAACAGCTTGGAAATGCATTCGGCTCCGGCTTTACTAACCAAATATGTGAGCAAGT CAACCTCCTGAAAGAATCACTAGTGGGTCAAGACTCCATCTTAGAGAAATCTCTAAAAGC CTTAGTTAAGATAATATCAGCCTTAGTAATTGTGGTGAGGAACCACGATGACCTGATCAC TGTGACTGCCACACTAGCCCTTATCGGTTGTACCTCGTCCCCGTGGCGGTGGCTCAAACAG AAGGTGTCACAATATTACGGAATCCCTATGGCTGAACGCCAAAACAATAGCTGGCTTAAG AAATTTACTGAAATGACAAATGCTTGCAAGGGTATGGAATGGATAGCTGTCAAAATTCAG AAATTCATTGAATGGCTCAAAGTAAAAATTTTGCCAGAGGTCAGAGAAAAACACGAGTTC CTGAACAGACTTAAACAACTCCCCTTATTAGAAAGTCAGATCGCCACAATCGAGCAGAGC GCGCCATCCCAAAGTGACCAGGAACAATTATTTTCCAATGTCCAATACTTTGCCCACTATT GCAGAAAGTACGCTCCCCTCTACGCAGCTGAAGCAAAGAGGGTGTTCTCCCTTGAGAAGA AGATGAGCAATTACATACAGTTCAAGTCCAAATGCCGTATTGAACCTGTATGTTTGCTCC TGCACGGGAGCCCTGGTGCCGGCAAGTCGGTGGCAACAAACTTAATTGGAAGGTCGCTTG CTGAGAAACTCAACAGCTCAGTGTACTCACTACCGCCAGACCCAGATCACTTCGACGGATA CAAACAGCAGGCCGTGGTGATTATGGACGATCTATGCCAGAATCCTGATGGGAAAGACGT CTCCTTGTTCTGCCAAATGGTTTCCAGTGTAGATTTTGTACCACCCATGGCTGCCCTAGAA GAGAAAGGCATTCTGTTCACCTCACCGTTTGTCTTGGCATCGACCAATGCAGGATCTATT AATGCTCCAACCGTGTCAGATAGCAGAGCCTTGGCAAGGAGATTTCACTTTGACATGAAC ATCGAGGTTATTTCCATGTACAGTCAGAATGGCAAGATAAACATGCCCATGTCAGTCAAG ACTTGTGACGATGAGTGTTGCCCGGTCAATTTTAAAAAGTGCTGCCCTCTTGTGTGTGGG AAGGCTATACAATTCATTGATAGAAGAACACAGGTCAGATACTCTCTAGACATGCTAGTC ACCGAGATGTTTAGGGAGTACAATCATAGACATAGCGTGGGGACCACGCTTGAGGCACTG TTCCAGGGACCACCAGTATACAGAGAGATCAAAATTAGCGTTGCACCAGAGACACCACCA CCGCCCGCCATTGCGGACCTGCTCAAATCGGTAGACAGTGAGGCTGTGAGGGAGTACTGC AAAGAAAAAGGATGGTTGGTTCCTGAGATCAACTCCACCCTCCAAATTGAGAAACATGTC AGTCGGGCTTTCATTTGCTTACAGGCATTGACCACATTTGTGTCAGTGGCTGGAATCATA TATATAATATATAAGCTCTTTGCGGGTTTTCAAGGTGCTTATACAGGAGTGCCCAACCAG
AAGCCCAGAGTGCCTACCCTGAGGCAAGCAAAAGTGCAAGGCCCTGCCTTTGAGTTCGCCG TCGCAATGATGAAAAGGAACTCAAGCACGGTGAAAACTGAATATGGCGAGTTTACCATGC TGGGCATCTATGACAGGTGGGCCGTTTTGCCACGCCACGCCAAACCTGGGCCAACCATCTT GATGAATGATCAAGAGGTTGGTGTGCTAGATGCCAAGGAGCTAGTAGACAAGGACGGCAC CAACTTAGAACTGACACTACTCAAATTGAACCGGAATGAGAAGTTCAGAGACATCAGAGG CTTCTTAGCCAAGGAGGAAGTGGAGGTTAATGAGGCAGTGCTAGCAATTAACACCAGCAA GTTTCCCAACATGTACATTCCAGTAGGACAGGTCACAGAATACGGCTTCCTAAACCTAGG TGGCACACCCACCAAGAGAATGCTTATGTACAACTTCCCCACAAGAGCAGGCCAGTGTGG TGGAGTGCTCATGTCCACCGGCAAGGTACTGGGTATCCATGTTGGTGGAAATGGCCATCA GGGCTTCTCAGCAGCACTCCTCAAACACTACTTCAATGATGAGCAAGGTGAAATAGAATT TATTGAGAGCTCAAAGGACGCCGGGTTTCCAGTCATCAACACACCAAGTAAAACAAAGTT GGAGCCTAGTGTTTTCCACCAGGTCTTTGAGGGGAACAAAGAACCAGCAGTACTCAGGAG TGGGGATCCACGTCTCAAGGCCAATTTTGAAGAGGCTATATTTTCCAAGTATATAGGAAA TGTCAACACACACGTGGATGAGTACATGCTGGAAGCAGTGGACCACTACGCAGGCCAACT AGCCACCCTAGATATCAGCACTGAACCAATGAAACTGGAGGACGCAGTGTACGGTACCGA GGGTCTTGAGGCGCTTGATCTAACAACGAGTGCCGGTTACCCATATGTTGCACTGGGTAT CAAGAAGAGGGACATCCTCTCTAAGAAGACTAAGGACCTAACAAAGTTAAAGGAATGTAT GGACAAGTATGGCCTGAACCTACCAATGGTGACTTATGTAAAAGATGAGCTCAGGTCCAT AGAGAAGGTAGCGAAAGGAAAGTCTAGGCTGATTGAGGCGTCCAGTTTGAATGATTCAGT GGCGATGAGACAGACATTTGGTAATCTGTACAAAACTTTCCACCTAAACCCAGGGGTTGT GACTGGTAGTGCTGTTGGGTGTGACCCAGACCTCTTTTGGAGCAAGATACCAGTGATGTT AGATGGACATCTCATAGCATTTGATTACTCTGGGTACGATGCTAGCTTAAGCCCTGTCTG GTTTGCTTGCCTAAAAATGTTACTTGAGAAGCTTGGATACACGCACAAAGAGACAAACTA CATTGACTACTTGTGCAACTCCCATCACCTGTACAGGGATAAACATTACTTTGTGAGGGG TGGCATGCCCTCGGGATGTTCTGGTACCAGTATTTTCAACTCAATGATTAACAATATCAT AATTAGGACACTAATGCTAAAAGTGTACAAAGGGATTGACTTGGACCAATTCAGGATGAT CGCATATGGTGATGATGTGATCGCATCGTACCCATGGCCTATAGATGCATCTTTACTCGCT GAAGCTGGTAAGGGTTACGGGCTGATCATGACACCAGCAGATAAGGGAGAGTGCTTTAAC GAAGTTACCTGGACCAACGCCACTTTCCTAAAGAGGTATTTTAGAGCAGATGAACAGTAC CCCTTCCTGGTGCATCCTGTTATGCCCATGAAAGACATACACGAATCAATTAGATGGACC AAGGATCCAAAGAACACCCAAGATCACGTGCGCTCACTGTGTCTATTAGCTTGGCATAAC GGGGAGCACGAATATGAGGAGTTCATCCGTAAAATTAGAAGCGTCCCAGTCGGACGTTGT TTGACCCTCCCCGCGTTTTCAACTCTACGCAGGAAGTGGTTGGACTCCTTTTAGATTAGAG
ACAATTTGAAATAATTTAGATTGGCTTAACCCTACTGTGCTAACCGAACCAGATAACGGT ACAGTAGGGGTAAATTCTCCGCATTCGGTGCGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAA SEQ ID NO: 12
El mutante de "1-hasta-parada" de SEQ ID NO: 12 sigue codificando la poliproteína (de tipo silvestre) de SEQ ID NO: 3.
Mutante de "1-hasta-parada" de la secuencia de ADNc de la CDS del genoma de ARN de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de "1-hasta-parada" de la secuencia de SEQ ID NO: 2; fragmento 774-7331 de la secuencia de SEQ ID No : 12; 6558 nt]:
ATGGGAGCTCAAGTATCAACGCAAAAGACTGGGGCACATGAGACCAGGTTGAATGCTTCG GGCAATTCGATCATTCACTACACAAATATTAATTATTACAAGGATGCCGCATCGAACTCA GCCAATCGGCAGGATTTCACTCAAGACCCGGGCAAGTTCACAGAACCAGTGAAAGATATC ATGATTAAATCATTACCAGCTTTGAACTCGCCCACAGTAGAGGAGTGCGGATACTCAGAC AGGGCGAGATCAATCACATTAGGTAACTCGACCATAACGACTCAGGAATGCGCCAACGTG GTGGTGGGCTATGGAGTATGGCCAGATTATTTAAAGGATTCAGAGGCAACAGCAGAGGAC CAACCGACCCAACCAGACGTTGCCACATGTAGGTTCTATACCTTAGACTCAGTGCAATGGC AGAAAACCTCACCAGGATGGTGGTGGAAGTTGCCCGATGCTTTGTCGAACTTAGGATTGT TTGGGCAGAACATGCAGTACCACTACTTAGGCCGAACTGGGTATACCGTACATGTGCAGT GCAATGCATCAAAGTTCCACCAAGGATGCTTGTTAGTAGTGTGTGTACCGGAAGCTGAGA TGGGTTGCGCAACGTTAGACAACACCCCATCGTCAGCAGAATTGTTGGGGGGCGATACGG CAAAGGAGTTTGCGGACAAACCGGTCGCATCGGGGTCGAACAAGTTGGTACAGAGGGTGG TGTATAATGCAGGCATGGGGGTGGGTGTTGGAAACTTGACCATTTTCCCCCACCAATGGA TCAACTTACGCACCAATAATTCAGCTACAATTGTGATGCCATACACCAACTCAGTACCTAT GGATAACATGTTTAGGCATAACAACGTCACCTTAATGGTTATCCCATTTGTACCGTTAGA TTACTGCCCTGGGTCAACCACGTACGTCCCAATTACGGTCACGATAGCCCCAATGTGTGCC GAGTACAATGGGTTACGTTTAGCAGGGCACCAGGGCTTACCAACCATGAATACTCCGGGG TCGTGTCAATTTTTGACATCAGACGACTTCCAATCACCATCGGCCATGCCGCAATATGACG TCACACCAGAGATGAGGATACCTGGTGAGGTGAAAAACTTGATGGAAATAGCTGAGGTTG ACTCAGTTGTCCCAGTCCAAAATGTTGGAGAGAAGGTCAACTCAATGGAAGCATACCAGA TACCTGTGAGATCGAACGAAGGATCAGGAACGCAAGTATTCGGCTTTCCATTGCAACCAG GGTACTCGTCAGTTTTTTCACGGACGTTGTTAGGAGAGATCTTGAACTATTATACACATT GGTCAGGCTCGATAAAGTTAACGTTTATGTTCTGTGGTTCGGCCATGGCTACTGGAAAAT TCTTATTGGCATACTCACCACCAGGTGCTGGAGCTCCTACAAAAAGGGTTGATGCTATGT
TAGGTACTCATGTAATTTGGGACGTGGGGTTACAATCATCATGCGTGTTGTGTATACCCT GGATATCGCAAACACACTACCGGTTTGTTGCTTCAGATGAGTATACCGCAGGGGGTTTTA TTACGTGCTGGTATCAAACAAACATAGTGGTCCCAGCGGATGCCCAATCGTCGTGTTACA TCATGTGTTTCGTGTCAGCATGCAATGACTTCTCAGTCAGGTTATTGAAGGACACTCCTT TCATTTCGCAGCAAAACTTTTTCCAGGGCCCAGTGGAAGACGCGATAACAGCCGCTATAG GGAGAGTTGCGGATACCGTGGGTACAGGGCCAACCAACTCAGAAGCTATACCAGCATTGA CTGCTGCTGAGACGGGTCACACGTCACAAGTAGTGCCGGGTGACACTATGCAGACACGCC ACGTTAAGAACTACCATTCAAGGTCGGAGTCAACCATAGAGAACTTCTTATGTAGGTCAG CATGCGTGTACTTTACGGAGTATAAAAACTCAGGTGCCAAGCGGTATGCTGAATGGGTAT TAACACCACGACAAGCAGCACAATTAAGGAGAAAGTTAGAATTCTTTACCTACGTCCGGT TCGACTTGGAGTTGACGTTTGTCATAACATCAACTCAACAGCCCTCAACCACACAGAACCA AGATGCACAGATCTTAACACACCAAATTATGTATGTACCACCAGGTGGACCTGTACCAGA TAAAGTTGATTCATACGTGTGGCAAACATCAACGAATCCCTCAGTGTTTTGGACCGAGGG AAACGCCCCGCCGCGCATGTCGATACCGTTTTTGTCGATTGGCAACGCCTATTCAAATTTC TATGACGGATGGTCAGAATTTTCGAGGAACGGAGTTTACGGCATCAACACGTTAAACAAC ATGGGCACGTTATATGCAAGACATGTCAACGCTGGATCGACGGGTCCAATAAAATCGACC ATTAGAATCTACTTCAAACCGAAGCATGTCAAAGCGTGGATACCTAGACCACCTAGATTG TGCCAATACGAGAAGGCAAAGAACGTGAACTTCCAACCCTCGGGAGTTACCACTACTAGG CAATCGATCACTACAATGACAAATACGGGCGCATTTGGACAACAATCAGGGGCAGTGTAT GTGGGGAACTACAGGGTGGTAAATAGACATCTAGCTACCAGTGCTGACTGGCAAAACTGT GTGTGGGAAAGTTACAACAGAGACCTCTTAGTGAGCACGACCACAGCACATGGATGTGAT ATTATAGCCAGATGTCAGTGCACAACGGGAGTGTACTTTTGTGCGTCCAAAAACAAGCAC TACCCAATTTC GTTTGAAGGACCAGGTC TAGTAGAGGTCCAAGAGAGTGAATAC TACCCC AGGAGATACCAATCCCATGTGCTTTTAGCAGCTGGATTTTCCGAACCAGGTGACTGTGGC GGTATCCTAAGGTGTGAGCATGGTGTCATTGGCATTGTGACCATGGGGGGTGAAGGCGTG GTCGGCTTTGCAGACATCCGTGATCTCCTGTGGCTGGAAGATGATGCAATGGAACAGGGA GTGAAGGACTATGTGGAACAGCTTGGAAATGCATTCGGCTCCGGCTTTACTAACCAAATA TGTGAGCAAGTCAACCTCCTGAAAGAATCACTAGTGGGTCAAGACTCCATCTTAGAGAAA TCTCTAAAAGCCTTAGTTAAGATAATATCAGCCTTAGTAATTGTGGTGAGGAACCACGAT GACCTGATCACTGTGACTGCCACACTAGCCCTTATCGGTTGTACCTCGTCCCCGTGGCGGT GGCTCAAACAGAAGGTGTCACAATATTACGGAATCCCTATGGCTGAACGCCAAAACAATA GCTGGCTTAAGAAATTTACTGAAATGACAAATGCTTGCAAGGGTATGGAATGGATAGCTG TCAAAATTCAGAAATTCATTGAATGGCTCAAAGTAAAAATTTTGCCAGAGGTCAGAGAAA
AACACGAGTTCCTGAACAGACTTAAACAACTCCCCTTATTAGAAAGTCAGATCGCCACAA TCGAGCAGAGCGCGCCATCCCAAAGTGACCAGGAACAATTATTTTCCAATGTCCAATACT TTGCCCACTATTGCAGAAAGTACGCTCCCCTCTACGCAGCTGAAGCAAAGAGGGTGTTCTC CCTTGAGAAGAAGATGAGCAATTACATACAGTTCAAGTCCAAATGCCGTATTGAACCTGT ATGTTTGCTCCTGCACGGGAGCCCTGGTGCCGGCAAGTCGGTGGCAACAAACTTAATTGG AAGGTCGCTTGCTGAGAAACTCAACAGCTCAGTGTACTCACTACCGCCAGACCCAGATCAC TTCGACGGATACAAACAGCAGGCCGTGGTGATTATGGACGATCTATGCCAGAATCCTGAT GGGAAAGACGTCTCCTTGTTCTGCCAAATGGTTTCCAGTGTAGATTTTGTACCACCCATG GCTGCCCTAGAAGAGAAAGGCATTCTGTTCACCTCACCGTTTGTCTTGGCATCGACCAATG CAGGATCTATTAATGCTCCAACCGTGTCAGATAGCAGAGCCTTGGCAAGGAGATTTCACT TTGACATGAACATCGAGGTTATTTCCATGTACAGTCAGAATGGCAAGATAAACATGCCCA TGTCAGTCAAGACTTGTGACGATGAGTGTTGCCCGGTCAATTTTAAAAAGTGCTGCCCTC TTGTGTGTGGGAAGGCTATACAATTCATTGATAGAAGAACACAGGTCAGATACTCTCTAG ACATGCTAGTCACCGAGATGTTTAGGGAGTACAATCATAGACATAGCGTGGGGACCACGC TTGAGGCACTGTTCCAGGGACCACCAGTATACAGAGAGATCAAAATTAGCGTTGCACCAG AGACACCACCACCGCCCGCCATTGCGGACCTGCTCAAATCGGTAGACAGTGAGGCTGTGAG GGAGTACTGCAAAGAAAAAGGATGGTTGGTTCCTGAGATCAACTCCACCCTCCAAATTGA GAAACATGTCAGTCGGGCTTTCATTTGCTTACAGGCATTGACCACATTTGTGTCAGTGGC TGGAATCATATATATAATATATAAGCTCTTTGCGGGTTTTCAAGGTGCTTATACAGGAGT GCCCAACCAGAAGCCCAGAGTGCCTACCCTGAGGCAAGCAAAAGTGCAAGGCCCTGCCTTT GAGTTCGCCGTCGCAATGATGAAAAGGAACTCAAGCACGGTGAAAACTGAATATGGCGAG TTTACCATGCTGGGCATCTATGACAGGTGGGCCGTTTTGCCACGCCACGCCAAACCTGGGC CAACCATCTTGATGAATGATCAAGAGGTTGGTGTGCTAGATGCCAAGGAGCTAGTAGACA AGGACGGCACCAACTTAGAACTGACACTACTCAAATTGAACCGGAATGAGAAGTTCAGAG ACATCAGAGGCTTCTTAGCCAAGGAGGAAGTGGAGGTTAATGAGGCAGTGCTAGCAATTA ACACCAGCAAGTTTCCCAACATGTACATTCCAGTAGGACAGGTCACAGAATACGGCTTCC TAAACCTAGGTGGCACACCCACCAAGAGAATGCTTATGTACAACTTCCCCACAAGAGCAG GCCAGTGTGGTGGAGTGCTCATGTCCACCGGCAAGGTACTGGGTATCCATGTTGGTGGAA ATGGCCATCAGGGCTTCTCAGCAGCACTCCTCAAACACTACTTCAATGATGAGCAAGGTG AAATAGAATTTATTGAGAGCTCAAAGGACGCCGGGTTTCCAGTCATCAACACACCAAGTA AAACAAAGTTGGAGCCTAGTGTTTTCCACCAGGTCTTTGAGGGGAACAAAGAACCAGCAG TACTCAGGAGTGGGGATCCACGTCTCAAGGCCAATTTTGAAGAGGCTATATTTTCCAAGT ATATAGGAAATGTCAACACACACGTGGATGAGTACATGCTGGAAGCAGTGGACCACTACG
CAGGCCAACTAGCCACCCTAGATATCAGCACTGAACCAATGAAACTGGAGGACGCAGTGT ACGGTACCGAGGGTCTTGAGGCGCTTGATCTAACAACGAGTGCCGGTTACCCATATGTTG CACTGGGTATCAAGAAGAGGGACATCCTCTCTAAGAAGACTAAGGACCTAACAAAGTTAA AGGAATGTATGGACAAGTATGGCCTGAACCTACCAATGGTGACTTATGTAAAAGATGAGC TCAGGTCCATAGAGAAGGTAGCGAAAGGAAAGTCTAGGCTGATTGAGGCGTCCAGTTTGA ATGATTCAGTGGCGATGAGACAGACATTTGGTAATCTGTACAAAACTTTCCACCTAAACC CAGGGGTTGTGACTGGTAGTGCTGTTGGGTGTGACCCAGACCTCTTTTGGAGCAAGATAC CAGTGATGTTAGATGGACATCTCATAGCATTTGATTACTCTGGGTACGATGCTAGCTTAA GCCCTGTCTGGTTTGCTTGCCTAAAAATGTTACTTGAGAAGCTTGGATACACGCACAAAG AGACAAACTACATTGACTACTTGTGCAACTCCCATCACCTGTACAGGGATAAACATTACT TTGTGAGGGGTGGCATGCCCTCGGGATGTTCTGGTACCAGTATTTTCAACTCAATGATTA ACAATATCATAATTAGGACACTAATGCTAAAAGTGTACAAAGGGATTGACTTGGACCAAT TCAGGATGATCGCATATGGTGATGATGTGATCGCATCGTACCCATGGCCTATAGATGCAT CTTTACTCGCTGAAGCTGGTAAGGGTTACGGGCTGATCATGACACCAGCAGATAAGGGAG AGTGCTTTAACGAAGTTACCTGGACCAACGCCACTTTCCTAAAGAGGTATTTTAGAGCAG ATGAACAGTACCCCTTCCTGGTGCATCCTGTTATGCCCATGAAAGACATACACGAATCAA TTAGATGGACCAAGGATCCAAAGAACACCCAAGATCACGTGCGCTCACTGTGTCTATTAG CTTGGCATAACGGGGAGCACGAATATGAGGAGTTCATCCGTAAAATTAGAAGCGTCCCAG TCGGACGTTGTTTGACCCTCCCCGCGTTTTCAACTCTACGCAGGAAGTGGTTGGACTCCTT TTAG SEQ ID NO: 13
El mutante de "1-hasta-parada" de SEQ ID NO: 13 sigue codificando la poliproteína (de tipo silvestre) de SEQ ID NO: 3.
Mutante de "1-hasta-parada" de la secuencia de ADNc que codifica la región P1 de un virus de Coxsackie B3 humano de tipo silvestre (es decir, infeccioso) [mutante de "1-hasta-parada" de la secuencia de SEQ ID NO: 4; fragmento 1 2562 de la secuencia de SEQ ID NO: 13; 2562 nt]:
ATGGGAGCTCAAGTATCAACGCAAAAGACTGGGGCACATGAGACCAGGTTGAATGCTTCG GGCAATTCGATCATTCACTACACAAATATTAATTATTACAAGGATGCCGCATCGAACTCA GCCAATCGGCAGGATTTCACTCAAGACCCGGGCAAGTTCACAGAACCAGTGAAAGATATC ATGATTAAATCATTACCAGCTTTGAACTCGCCCACAGTAGAGGAGTGCGGATACTCAGAC AGGGCGAGATCAATCACATTAGGTAACTCGACCATAACGACTCAGGAATGCGCCAACGTG GTGGTGGGCTATGGAGTATGGCCAGATTATTTAAAGGATTCAGAGGCAACAGCAGAGGAC
CAACCGACCCAACCAGACGTTGCCACATGTAGGTTCTATACCTTAGACTCAGTGCAATGGC AGAAAACCTCACCAGGATGGTGGTGGAAGTTGCCCGATGCTTTGTCGAACTTAGGATTGT TTGGGCAGAACATGCAGTACCACTACTTAGGCCGAACTGGGTATACCGTACATGTGCAGT GCAATGCATCAAAGTTCCACCAAGGATGCTTGTTAGTAGTGTGTGTACCGGAAGCTGAGA TGGGTTGCGCAACGTTAGACAACACCCCATCGTCAGCAGAATTGTTGGGGGGCGATACGG CAAAGGAGTTTGCGGACAAACCGGTCGCATCGGGGTCGAACAAGTTGGTACAGAGGGTGG TGTATAATGCAGGCATGGGGGTGGGTGTTGGAAACTTGACCATTTTCCCCCACCAATGGA TCAACTTACGCACCAATAATTCAGCTACAATTGTGATGCCATACACCAACTCAGTACCTAT GGATAACATGTTTAGGCATAACAACGTCACCTTAATGGTTATCCCATTTGTACCGTTAGA TTACTGCCCTGGGTCAACCACGTACGTCCCAATTACGGTCACGATAGCCCCAATGTGTGCC GAGTACAATGGGTTACGTTTAGCAGGGCACCAGGGCTTACCAACCATGAATACTCCGGGG TCGTGTCAATTTTTGACATCAGACGACTTCCAATCACCATCGGCCATGCCGCAATATGACG TCACACCAGAGATGAGGATACCTGGTGAGGTGAAAAACTTGATGGAAATAGCTGAGGTTG ACTCAGTTGTCCCAGTCCAAAATGTTGGAGAGAAGGTCAACTCAATGGAAGCATACCAGA TACCTGTGAGATCGAACGAAGGATCAGGAACGCAAGTATTCGGCTTTCCATTGCAACCAG GGTACTCGTCAGTTTTTTCACGGACGTTGTTAGGAGAGATCTTGAACTATTATACACATT GGTCAGGCTCGATAAAGTTAACGTTTATGTTCTGTGGTTCGGCCATGGCTACTGGAAAAT TCTTATTGGCATACTCACCACCAGGTGCTGGAGCTCCTACAAAAAGGGTTGATGCTATGT TAGGTACTCATGTAATTTGGGACGTGGGGTTACAATCATCATGCGTGTTGTGTATACCCT GGATATCGCAAACACACTACCGGTTTGTTGCTTCAGATGAGTATACCGCAGGGGGTTTTA TTACGTGCTGGTATCAAACAAACATAGTGGTCCCAGCGGATGCCCAATCGTCGTGTTACA TCATGTGTTTCGTGTCAGCATGCAATGACTTCTCAGTCAGGTTATTGAAGGACACTCCTT TCATTTCGCAGCAAAACTTTTTCCAGGGCCCAGTGGAAGACGCGATAACAGCCGCTATAG GGAGAGTTGCGGATACCGTGGGTACAGGGCCAACCAACTCAGAAGCTATACCAGCATTGA CTGCTGCTGAGACGGGTCACACGTCACAAGTAGTGCCGGGTGACACTATGCAGACACGCC ACGTTAAGAACTACCATTCAAGGTCGGAGTCAACCATAGAGAACTTCTTATGTAGGTCAG CATGCGTGTACTTTACGGAGTATAAAAACTCAGGTGCCAAGCGGTATGCTGAATGGGTAT TAACACCACGACAAGCAGCACAATTAAGGAGAAAGTTAGAATTCTTTACCTACGTCCGGT TCGACTTGGAGTTGACGTTTGTCATAACATCAACTCAACAGCCCTCAACCACACAGAACCA AGATGCACAGATCTTAACACACCAAATTATGTATGTACCACCAGGTGGACCTGTACCAGA TAAAGTTGATTCATACGTGTGGCAAACATCAACGAATCCCTCAGTGTTTTGGACCGAGGG AAACGCCCCGCCGCGCATGTCGATACCGTTTTTGTCGATTGGCAACGCCTATTCAAATTTC TATGACGGATGGTCAGAATTTTCGAGGAACGGAGTTTACGGCATCAACACGTTAAACAAC
ATGGGCACGTTATATGCAAGACATGTCAACGCTGGATCGACGGGTCCAATAAAATCGACC
ATTAGAATCTACTTCAAACCGAAGCATGTCAAAGCGTGGATACCTAGACCACCTAGATTG
TGCCAATACGAGAAGGCAAAGAACGTGAACTTCCAACCCTCGGGAGTTACCACTACTAGG
CAAT CGAT CACTACAAT GACAAAT ACGGGCGCATTT
SEQID NO: 14
El mutante de "1-hasta-parada" de la SEQ ID NO: 14 sigue codificando la región P1 (de tipo silvestre) de la SEQ ID NO: 4.
Resultados
Construcción de genomas del virus de Coxsackie B3 (CVB3) con robustez teórica y espacio de secuencia alterados.
A fin de alterar la robustez genética del genoma de CVB3, sin cambiar la secuencia de aminoácidos del virus, se aplicó una matriz de similitud química para aminoácidos de McLachlan (McLachlan, 1971; McLachlan 1972; número de referencia MCLA720101) y el marco de referencia matemático diseñado por Archetti que predice el efecto potencial de una mutación puntual a lo largo de codones sinónimos para cada aminoácido (Archetti 2009). Para evitar los efectos de confusión del cambio de cada codón y para abordar más directamente la cuestión de la robustez, en primer lugar la estrategia se centró en dos aminoácidos con la mayor degeneración del código genético y el potencial de robustez teórico: serina y leucina, debido a que están codificados por seis codones diferentes. Estos codones pueden clasificarse, por lo tanto, en tres categorías (figura 1):
A- Grupo de "1-hasta-parada" (púrpura), para un cambio de distancia de Parada, de tal forma que una mutación en este codón tiene una probabilidad máxima de cambiarlo a un codón de parada tras solo una sola mutación puntual;
B- Grupo "Más-i" (rojo), para más impacto por mutaciones puntuales, significa que una nueva mutación en este codón tiene una mayor probabilidad de cambiar a un aminoácido con propiedades químicas distintas (aminoácidos más volátiles);
C- Grupo "Menos-i" (verde), para menos impacto por mutaciones puntuales, significa que una mutación en este codón tiene una mayor probabilidad de ser silente o de mantener propiedades fisicoquímicas similares a las del aminoácido original (menos volátil).
Características de replicación de las variantes de robustez
Se modificaron de este modo 117 codones de serina y leucina en la región P1 del genoma, representando aproximadamente un 5 % de la secuencia genómica total, para generar construcciones que contienen exclusivamente una de las tres categorías de codones listadas anteriormente. Esta región no contiene ninguna estructura de ARN conocida requerida para la replicación o el empaquetado del virus. De hecho, no se observaron diferencias en la síntesis de ARN que pudieran sugerir defectos en la estructura del ARN (figura 2). Además, las presentes secuencias con codones alterados no afectaron al sesgo de pares de codones descrito por Coleman et al. 2008, ni al sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA que se había demostrado que afecta a la aptitud del virus por Atkinson et al. 2014 (figura 3). Tomados en conjunto, los presentes resultados sugieren que los codones alterados no tuvieron un impacto negativo en cualquiera de las propiedades que han demostrado dar como resultado atenuación en otros estudios de desoptimización de codones, lo que indica que las presentes construcciones permiten abordar la robustez en ausencia de efectos de confusión.
A continuación, se comprobó si las presentes variantes conservaban dinámicas de replicación de tipo silvestre en condiciones de crecimiento celular normales. Tanto a una alta (0,1) como una baja (1) m O i, todos los virus alcanzaron los mismos títulos víricos finales con una dinámica similar al tipo silvestre (no significativamente diferente), lo que indica que todas las construcciones podrían siembras de vacuna adecuadas para construir soluciones madre de virus mayores (figuras 4A y 4B). Curiosamente, la construcción de P1S que contenía codones que con alta probabilidad daban como resultado mutaciones de parada (es decir, la construcción de 1-hasta-parada) era la única variante que presentaba títulos significativamente inferiores en el ciclo de replicación inicial (a las 6 horas después de la infección). Para evaluar la estabilidad genética y fenotípica, se pasó cada variante 5 veces en células HeLa y se llevó a cabo una curva de crecimiento usando soluciones madre de pase 5 (figura 4C). Una vez más, cada virus se replicó de un modo similar al tipo silvestre y conservó la misma cinética que las soluciones madre del pase 1, confirmando la estabilidad general. Curiosamente, las construcciones de "menos" (es decir, las construcciones de Menos-I) diseñadas para ser más robustas que el virus de tipo silvestre lograron la capacidad replicativa más elevada en la solución madre del pase 5.
Una prueba directa de que la reducción de la robustez mutacional de un virus de ARN da como resultado una viabilidad
reducida.
Teóricamente, la alteración de la robustez genética hará que la población de virus sea más o menos sensible a la mutación y por consiguiente, más o menos apta. Debido a que la capacidad de un virus para generar una placa infecciosa en cultivo celular tiene una fuerte correlación con la aptitud del virus, se midió el tamaño de la placa para varios cientos de placas individuales de las poblaciones de tipo silvestre y la variante de robustez (figuras 5A y 5B). De acuerdo con la teoría, el tipo silvestre presentó una aptitud de amplio intervalo (tamaños de placas). La construcción de "menos" (es decir, la construcción de Menos-i), que se espera que sea menos robusta y que tenga un impacto menos negativo de la mutación, presentó más placas individuales de un tamaño que era incluso mayor que el tipo silvestre (mayor aptitud). La construcción de "más" (es decir, la construcción de Más-i), presentó una gran variedad de valores de aptitud, pero no tan amplia como el tipo silvestre, como se esperaba, ya que los codones volátiles tienen mayores probabilidades de dar como resultado cambios no compatibles. Finalmente, la población de "parada" (es decir, la población de 1-hasta-parada) presentó tamaños de placa significativamente menores, que indican menores variaciones de aptitud o supresión de la replicación, teóricamente el resultado de los codones de parada.
Para confirmar adicionalmente estas supuestas diferencias en la aptitud, se completaron más ensayos directos de aptitud en los que se hizo competir a cada población contra una secuencia de referencia neutra similar a la del tipo silvestre y se determinó la aptitud de cada construcción usando un ensayo cuantitativo bien establecido (Gnadig et al.
2012) (figura 6). Los resultados confirman la aptitud neutra del tipo silvestre, la mayor aptitud de los virus de "más" (es decir, los virus de Más-i) y la máxima aptitud de los virus de "menos" (Es decir, de los virus Menos-i). De manera importante, la construcción de "parada" (es decir, la construcción de 1-hasta-parada) tiene una aptitud significativamente menor que el tipo silvestre.
Finalmente, para obtener pruebas directas de que la reducción en la aptitud observada para la variante de "parada" (es decir, de la variante de 1-hasta-parada) era de hecho el resultado de una incidencia aumentada de las mutaciones de parada, se comparó la capacidad de cada variante para crecer en tres condiciones mutagénicas (figura 7): ribavirina (RBV), que sesga hacia mutaciones de transición de G-A y C-U; 5-fluorouracilo (5FU), que sesga fuertemente hacia mutaciones de U-C y A-G; y 5-azacitidina (AZC), que sesga hacia mutaciones de C-A y C-G. En estas condiciones en las que se potencia artificialmente la frecuencia de mutación del virus, la sensibilidad aumentada de la construcción de "parada" (es decir, de la construcción de "1-hasta-parada") resulta evidente en los tres tratamientos.
Para confirmar adicionalmente de manera experimental el vínculo entre la propensión teórica de estas construcciones para mutarse en codones de PARADA, se llevó a cabo una secuenciación profunda del genoma completo de las poblaciones de virus que se habían pasado en condiciones mutagénicas y se cuantificó el número de lecturas que de hecho se habían mutado a PARADA (figura 8, figura 11). Como cabía esperar, el virus de tipo silvestre presentó mutaciones de PARADA a lo largo de la región de P1, ya que este virus contiene naturalmente una proporción de Ser/Leu que pertenece a la categoría de "parada" (es decir, la categoría de 1-hasta-parada). Por otro lado, las poblaciones de "menos" y "más" (es decir, las poblaciones de Menos-i y de Más-i) que presentan menos poblaciones de PARADA, ya que su uso de codones ya no permite estas mutaciones con tan solo un cambio de nucleótidos. De manera importante, la población de virus de "parada" (es decir, la población de 1-hasta-parada) presentó una proporción significativamente mayor de mutaciones de PARADA en cada codón de Ser/Leu en la región de P1; mientras que presentó el mismo número de mutaciones de PARADA que el tipo silvestre en las regiones de P2 y P3, que no se alteraron genéticamente para modificar la robustez mutacional (no mostrado).
Tomados en conjunto, estos resultados demuestran y confirman que la robustez mutacional de una población de virus puede de hecho modificarse, sin afectar a su secuencia de proteína, su replicación y empaquetado de la descendencia de virus.
Atenuación in vivo mediante reducción de la robustez mutacional.
A continuación, se determinó si la construcción de "parada" (es decir, la construcción de 1-hasta-parada) con una reducción confirmada en la robustez mutacional se atenuó de hecho in vivo. Se infectó a ratones de 3-4 semanas de edad con 106 UFP de virus de tipo silvestre o cada una de las variantes de robustez y se determinó el título vírico durante el transcurso de una semana de la infección aguda (figuras 9A y 9B). El virus de tipo silvestre presentó altos títulos de virus en ambos órganos diana durante la infección, con una reducción característica en el título del periodo de siete días. No se observaron diferencias significativas para la construcción de "menos" (es decir, para la construcción Menos-i). Curiosamente, la construcción de "más" (es decir, para la construcción Más-i) presentó un nivel sostenido de replicación intensa a lo largo del periodo de siete días, siendo los valores significativamente mayores que el tipo silvestre. De manera importante, la construcción de "parada" se replicó bien durante los 5 primeros días, pero fue indetectable en ambos órganos el día siete, lo que confirma que la reducción de la robustez en esta construcción atenúa a este virus. Para confirmar adicionalmente la atenuación de la variante de "parada" (es decir, de la variante de 1-hasta-parada) con robustez mutacional reducida in vivo, se administró a los ratones una dosis letal de virus de tipo silvestre y la misma dosis de las variantes de "más" y de "parada" (es decir, de las variantes Más-i y Menos-i) y se monitorizó a diario la supervivencia a lo largo de un periodo de dos semanas. Todos los ratones infectados con el virus de tipo silvestre sucumbieron a la infección a los siete días. Para la construcción de "más", que tuvo un título mayor que el tipo silvestre en el experimento previo (figuras 9A y 9B), un 70 % de los ratones sucumbió a la infección.
De manera importante, todos los ratones que recibieron la construcción de "parada" sobrevivieron a la infección.
Análisis
En este trabajo, se proporciona una prueba directa de que la robustez mutacional de un organismo puede de hecho modificarse sin alterar la secuencia codificante de la proteína. Se demuestra que el aumento de la robustez teórica de un virus de ARN (construcción de "menos") da como resultado una población de virus que es más tolerante (resistente) a los efectos de la mutación. También se demuestra que hacer que un virus sea más plástico (construcción de "más") da como resultado una población de virus que es significativamente más diversa que el tipo silvestre. Además, aunque se espera que la mayoría de mutaciones en los virus de ARN sean perjudiciales, la mayor diversidad general en esta población puede resultar beneficiosa en algunas situaciones, por ejemplo, esta población se replicó mejor que el virus de tipo silvestre en los principales tejidos diana in vivo.
El aspecto más significativo de este trabajo es la confirmación biológica que la reducción de la robustez teórica de un organismo (construcción de "parada") de hecho hace que el virus sea hipersensible a sus propias ya de por sí altas frecuencias de mutación. In vivo, esta población de virus se atenuó significativamente, no provocó enfermedad en ratones y se eliminó en el día siete después de la infección. Estos resultados demuestran que la reducción de la robustez es una nueva estrategia válida y novedosa para atenuar las vacunas de virus vivo. Debido a que esta estrategia se basa en el código genético universal y ya que todos los virus de ARN tienen frecuencias de mutación extremas, esta estrategia es aplicable a cualquier virus de ARN para el que se encuentre disponible genética inversa y otras técnicas de modificación.
Se espera que el grado de atenuación sea una función del número de codones alterados, de tal forma que pueda determinarse para cada virus un punto óptimo entre la atenuación y la capacidad replicativa. Además, el gran número de sitios que pueden alterarse a la vez que se sigue manteniendo la viabilidad (en este caso, 117 codones) hace que estos candidatos para vacunas sean genéticamente estables. A diferencia de las vacunas de virus vivos tradicionales cuya atenuación puede atribuirse a pocos nucleótidos clave que pueden revertirse rápidamente al tipo silvestre (por ejemplo, vacunas contra la polio orales), estos candidatos no tienen dicha capacidad, debido a que cada uno de los > 100 codones contribuye igualmente a la atenuación.
Finalmente, estos estudios se llevaron a cabo usando virus de ARN con su frecuencia de mutación naturalmente alta. Una opción para ajustar adicionalmente la atenuación es incluir cambios de aminoácidos que alteran la fidelidad que 0 bien aumentan o reducen las tasas de mutación, como se ha descrito con anterioridad (Gnadig et al. 2012). El acoplamiento de la baja fidelidad de replicación con la baja robustez podría atenuar adicionalmente y más rápido a un virus; mientras que el aumento de la fidelidad podría generar una construcción aún más estable genéticamente. Por ejemplo, la construcción de 1-hasta-parada puede acoplarse a una ARN polimerasa dependiente de ARN, tal como el mutante A239G, Y268W, I230F, Y268H, P48K o F232Y de la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus de Coxsackie B3 (SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19 o 20, respectivamente).
EJEMPLO 2: VIRUS DE LA GRIPE
Se han producido mutantes de 1-hasta-parada del virus de la gripe aplicando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 a la cepa infecciosa del virus de la gripe ATCC® VR-1737™ (virus de la gripe tipo A, subtipo H1N1 [pdm09]).
EJEMPLO 3: VIRUS DE LA FIEBRE AMARILLA
Se han producido mutantes de 1-hasta-parada del virus de la fiebre amarilla aplicando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 a la cepa infecciosa del virus de la fiebre amarilla Asibi (número de registro de GENBANK AY640589).
EJEMPLO 4: VIRUS CHIKUNGUÑA
Se han producido mutantes de 1 de virus Chikunguña aplicando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 a la cepa infecciosa del virus Chikunguña CHIKV 06-049 del sublinaje de las islas del océano Índico, en el linaje ECSA (Oriental, Centroafricano y Sudafricano) (número de referencia de GENBANK AM258994 versión 1) y a las siguientes cepas de virus Chikunguña: cepa 05-115 (n.° de referencia de GENBANK AM258990 versión 1), cepa 05-209 (n.° de referencia de GENBANK AM258991 versión 1), cepa 06-021 (n.° de referencia de GENBANK AM258992 versión 1), cepa 06 027 (n.° de referencia de GENBANK AM258993 versión 1), cepa 06-049 (n.° de referencia de GENBANK AM258994 versión 1), cepa 05-061 (n.° de referencia de GENBANK AM258995 versión 1).
EJEMPLO 5: Mutantes de 1-hasta-parada del VIRUS COXACKIE (región P1) y del VIRUS DE LA GRIPE (región PA); experimentos in vivo
Procedimientos generales
Células y virus. Se mantuvieron células HeLa y HEK293T (ATCC® CCL-2™ y ATCC® CRL-3216™) en medio DMEM (GlutaMAX™; SIGMA-ALDRICH, n.° de producto 31966047, que contiene 4,5 g/l de D-glucosa y que contiene piruvato
de sodio a 110 mg/l) con suero de ternero neonato al 10 %, mientras que las células MDCK y MDCK-SIAT (SIGMA-ALDRICH, n.° de producto 85011435 y n.° de producto 05071502) se mantuvieron en medio MEM (MEM con sales de Earle, L-glutamina y bicarbonato de sodio; SIGMA-ALDRICH n.° de producto M4655) con suero fetal de ternero al 5 %. El virus de Coxsackie B3 de tipo silvestre (cepa Nancy; secuencia genómica de ADNc de SEQ ID NO: 1; secuencia de la CDS de ADNc de SEQ ID NO: 2) y las variantes SynSyn se generaron a partir de un plásmido de ADNc infeccioso pCB3-Nancy. El virus de la gripe A de tipo silvestre (A/París/2590/2009 (H1N1pdm09); ATCC® VR-1337™) y las variantes SynSyn se generaron a partir de plásmidos bidireccionales de genética inversa (Hoffmann et al. 2000), proporcionadas por la unidad de Genética Molecular de virus de ARN del INSTITUTO PASTEUR (París, Francia).
Se generaron virus de Coxsackie y de la gripe A de 1 hasta parada que portan 117 y 110 codones sinónimos diferentes, respectivamente, mediante tecnología génica sintética "de novo" (EUROGENTEC). Todos los plásmidos de ADN recién generados se secuenciaron mediante el método de Sanger en su totalidad (GATC Biotech) para confirmar cada una de las 117/110 posiciones. La lista de cambios de codones introducidos en el virus de Coxsackie se proporciona en la tabla 1 anterior (véase el ejemplo 1). El virus de 1-hasta-parada de baja fidelidad se generó mediante inserción de la mutación I230F en el gen de polimerasa 3D vírica mediante mutagénesis dirigida al sitio del clon infeccioso de 1-hasta-parada.
La lista de los cambios de codones introducidos en el virus de la gripe se proporciona en la tabla 5 a continuación.
T l :
(continuación)
(continuación)
Generación de soluciones madre de virus de Coxsackie mediante transcripción y transfección in vitro. Los plásmidos de ADNc de CVB3 se linealizaron con Sal 1. Los plásmidos linealizados se purificaron con el kit de purificación para la PCR MACHEREY-NAGEL. Se transcribieron in vitro 5 |jg de plásmido linealizado usando T7 ARN polimerasa (FERMENTAS). Se electroporaron 10 jg de transcrito en células HeLa que se lavaron dos veces en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) y se resuspendieron en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) a 107 células/ml. Las condiciones de la electroporación fueron las siguientes: cubeta de 0,4 mm, 25 mF, 700 V, resistencia máxima, reducción exponencial en un electroporador GenePulser XCell de BIO-RAD. Las células se recuperaron en DMEM (GlutaMAX™; SIGMA-ALDRICH, n.° de producto 31966047, que tiene 4,5 g/l de D-glucosa y que contiene 110 mg/l de piruvato de sodio). Se usaron 500 j l de soluciones de virus de p0 para infectar a monocapas frescas de células HeLa durante tres pases más. Para cada pase, el virus se recogió mediante un ciclo de congelación-descongelación y se clarificó centrifugando a 10 K rpm durante 10 minutos. Se generaron tres soluciones madre independientes para cada virus. La secuenciación consenso de las soluciones madre de virus usadas en los experimentos aguas abajo confirmaron la estabilidad de las mutaciones diseñadas y no detectó ninguna mutación adicional a lo largo del genoma.
Generación de soluciones madre de virus de la gripe A mediante genética inversa. Usando placas de 35 mm y DMEM (GlutaMAX™; SIGMA-ALDRICH, n.° de producto 31966047, que tiene 4,5 g/l de D-glucosa y que contiene 110 mg/l de piruvato de sodio) complementado con FCS al 10 %, se transfectaron cocultivos de células 293T (4,105/pocillo) y MDCK (3,105/pocillo) con los ocho plásmidos bidireccionales que tanto dirigen la expresión de proteína como dirigen
la síntesis del ARNv molde, usando 0,5 mg de cada plásmido y 18 |jl de FUGENE HD (ROCHE). En primer lugar, se mezclaron el ADN y el reactivo de transfección, después se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min y finalmente se añadieron a las células, que después se incubaron a 35 °C. Dieciséis horas después, se retiró la mezcla de reactivo de transfección de ADN, se lavaron dos veces las células en DMEM y se añadieron 2 ml de DMEM que contenía 1 jg/m l de tripsina tratada con L-1-tosilamido-2-fenil clorometil cetona (TPCK-tripsina, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron a 35 °C durante 2 días más, los sobrenadantes se recogieron y se aclararon y el virus se tituló mediante TCID50 como se ha descrito anteriormente. Se generaron tres soluciones madre independientes para cada virus. La secuenciación consenso de las soluciones madre de virus usadas en los experimentos aguas abajo confirmaron la estabilidad de las mutaciones diseñadas y no detectó ninguna mutación adicional a lo largo del genoma.
Títulos víricos mediante TCID50. Se prepararon diluciones seriadas de factor diez de virus en placas de fondo redondo de 96 pocillos en medio DMEM asérico. Las diluciones se llevaron a cabo en 12 replicados y se transfirieron 100 j l de dilución a 104 células Vero (ATCC® CCL-81 ™) para el virus de Coxsackie o a 104 MDCK (At CC® CCL-34™) para el virus de la gripe A, se sembraron en 100 j l de DMEM. Después de 5 días, las monocapas de células vivas se colorearon con cloruro de metilrosanilina.
Títulos víricos mediante ensayo de placa. Se sembraron células HeLa (ATCC® CCL-2™) -para el virus de Coxsackieo células MDCK-SIAT (SIGMA-Al Dr ICH, n.° de producto 05071502) -para el virus de la gripe A- en placas de 6 pocillos y se diluyeron en serie las preparaciones de virus (10 veces) en medio DMEM asérico. Las células se lavaron dos veces con PBS y se infectaron con 250 j l de dilución durante 30 minutos a 37 °C, tras lo cual se añadió una cubierta sólida que comprendía medio DMEM y agarosa al 1 % p/v (INVITROGEN). 2 días después de la infección, se fijaron las células y se tiñeron con cloruro de metilrosanilina al 0,2 % y se numeraron las placas.
Cinética de replicación y cuantificación de los genomas víricos. Para la cinética de crecimiento, Se infectaron células HeLa (para el virus de Coxsackie) o células MDCK (para el virus de la gripe A) a una MOI de 1, se congelaron en diferentes puntos de tiempo después de la infección y posteriormente, se titularon mediante el ensayo de TCID50. Los virus de Coxsackie se recogieron mediante un ciclo de congelación-descongelación y se recogieron los virus de la gripe A en sobrenadante clarificado. Para los análisis por qRT-PCR, se extrajo el ARN total de sobrenadantes de células infectadas con reactivo TRIzol (INVITROGEN) y se purificó. Se usó el kit de RT-PCR TaqMan RNA-to-Ctonestep (APPLIED BIOSYSTEMS) para cuantificar el ARN vírico. Cada reacción de 25 j l contenía 5 j l de ARN, 100 jM de cada cebador (directo 5'-GCATATGGTGATGATGTGATCGCTAGC-3' SEQ ID NO: 22 e inverso 5'-GGGGTACTGTTCATCTGCTCTAAA-3' SEQ ID NO: 23) y 25 pmol de sonda 5'-[6-Fam]-GGTTACGGGCTGATCATG-3' (SEQ ID NO: 24) en una máquina ABI 7000. La retrotranscripción se llevó a cabo a 50 °C durante 30 min y a 95 °C durante 10 min y fue seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y a 60 °C durante 1 min. Una curva patrón (y = -0,2837x 12.611; R2 = 0,99912) se generó usando ARN genómico transcrito in vitro.
Pases víricos en condiciones mutagénicas. Los compuestos mutagénicos usados fueron (SIGMA ALDRICH):
- Ribavirina IUPAC, 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroxi-metil)oxolan-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida); 50, 100 y 200 jM para los virus de Coxsackie; 5 y 20 jM para los virus de la gripe A;
- 5-Fluorouracilo, IUPAC 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-diona; 50, 100 y 200 jM para los virus de Coxsackie; 5 y 30 jM para los virus de la gripe A;
- 5-Azacitidina IUPAC, 4-amino-1-b-D-ribofuranosil-1,3,5-triazin-2(1H)-ona; 50, 100 y 200 jM para los virus de Coxsackie; 5 y 15 jM para los virus de la gripe A;
- Amilorida, IUPAC, 3,5-diamino-6-cloro-N-(diaminometilen)pirazina-2-carboxamida; 100 y 200 jM para los virus de Coxsackie;
- Manganeso (Mn2+); 0,5 mM y 1 mM para el virus de Coxsackie.
Se pretrataron monocapas de células HeLa (virus de Coxsackie) o MDCK (virus de la gripe A) en placas de 6 pocillos durante 4 horas con ribavirina, AZC, 5FU, MnCl2 y compuestos de amilorida con diferentes concentraciones. Después, las células se infectaron a una MOI = 0,1 para el virus de Coxsackie y de 0,001 para el virus de la gripe A con virus del pase 2. 48 horas después de la infección, Los virus de Coxsackie se recogieron mediante un ciclo de congelacióndescongelación y se recogieron los virus de la gripe A en sobrenadante clarificado. Se determinaron los títulos víricos (ensayo de TCID50 o en placa). Se llevó a cabo el mismo procedimiento durante cinco pases, cada uno en diferentes condiciones mutagénicas en tres replicados biológicos, excepto para los virus de la gripe A, que se pasaron únicamente en condiciones poco mutagénicas en ribavirina, 5-fluorouracilo y 5-azacitidina.
Medición del tamaño de la placa. Las mediciones de placas del virus de Coxsackie se llevaron a cabo en monocapas subconfluentes de 107 células HeLa en placas de 10 cm. Para asegurar placas no solapantes, se determinó empíricamente la cantidad de virus (40-70 por placa para Coxsackie). Cada placa se escaneó individualmente después de 30 h después de la infección a 300 dpi. Se analizaron archivos en dieciséis bits usando ImageJ™. Se usó el mismo protocolo para medir el fenotipo de placa de las poblaciones de virus pretratadas. Se sometió a los virus de TS y 1-hasta-parada a altas concentraciones de ribavirina, 5FU y AZC y se aumentó el tiempo después de la infección a 40 h a fin de recuperar mejor la viabilidad vírica para llevar a cabo mediciones de placa.
Medición cuantitativa de la aptitud. Para el virus de Coxsackie, se obtuvieron valores de aptitud relativos mediante
competición de cada uno de virus de TS y de 1-hasta-parada, obtenido de diferentes pases en cada ensayo de mutágeno/compuesto diferente, con un virus de referencia marcado que contiene cuatro mutaciones silentes adyacentes en la región de la polimerasa introducida por mutagénesis directa. Se llevaron a cabo coinfecciones por triplicado a una MOI de 0,01 usando una mezcla 1:1 de cada variante con el virus de referencia. Después de 24 h, se recogieron los sobrenadantes y se llevó a cabo una mezcla 1:1 con reactivo TRIzol (INVITROGEN) para conservar el ARN vírico. Se determinó la proporción de cada virus mediante RT-PCR en tiempo real con el ARN extraído usando una mezcla de sondas Ta QmAN™ marcadas con dos colorantes indicadores fluorescentes diferentes. MGB_CVB3_WT detecta virus de TS y 1-hasta-parada con la secuencia CGCATCGTACCCATGG (SEQ ID NO: 25) y se marca en el extremo 5' con un colorante de 6FAM (6-carboxifluoresceína) y MGB_CVB3_Ref que contenía las cuatro mutaciones silentes; CGCTAGCTACCCATGG (Se Q ID NO: 26) se marcó con un colorante 5' VIC. Cada reacción de 25 pl contenía 5 pl de ARN, 900 nM de cada cebador (cebador directo, 5'-GATCGCATATGGTGATGATGTGA-3' SEQ ID NO: 27); cebador inverso, 5'-AGCTTCAGCGAGTAAAGATGCA-3' SEQ ID NO: 28)) y 150 nM de cada sonda. Usando un patrón conocido para el virus de TS y de referencia durante la q-RT-PCR, se pudo calcular la concentración de ARN para cada variante vírica con una sensibilidad elevada. Se determinó la aptitud relativa mediante el método descrito en el estudio de Carrasco et al. 2007, usando las determinaciones de ARN para cada virus. Brevemente, la fórmula W =
Rj ty i / t
-R(0).
representa la aptitud W de cada genotipo mutante en relación con la secuencia de referencia de competidor común, donde R(0) y R(t) representan la relación de densidades de virus mutante a de referencia en la mezcla de inoculación y t días después de la inoculación (1 día en este caso), respectivamente. Es importante mencionar que la aptitud del TS normal al virus de referencia fue de 1,019, lo que indica ausencia de diferencias significativas en la aptitud causadas por mutaciones silentes diseñadas en el virus de referencia (competidor).
Cría de ratones y ética. Se mantuvo a los ratones en las instalaciones para animales del INSTITUTO PASTEUR (París, Francia) en condiciones de nivel 2 de bioseguridad, suministrándose agua y alimento a voluntad y se manejaron de acuerdo con las regulaciones del Comité para Animales del INSITUTO PASTER (París, Francia) de acuerdo con la directiva EU 2010/63 adoptada el 22 de septiembre de 2010 por el Parlamento Europeo y el Consejo de la Unión Europea. Los protocolos para ratones 2013-0101 y 2013-0021 fueron evaluados y aprobados por el comité de ética de experimentación con animales CETEA N.° 89 (INSTITUTO PASTEUR), trabajando con el Ministére de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche (MESR) nacional Francés. Todos los estudios se llevaron a cabo en ratones macho BALB/c de entre 5 y 6 semanas de edad.
Infecciones con virus de Coxsackie in vivo. Se infectó a los ratones por vía intraperitoneal con 105 TCID50 de virus TS o 1-hasta-parada en 0,20 ml. Para los estudios de tropismo de tejido, se recogieron los órganos completos (bazo, páncreas y corazón) 3, 5 y 7 días después de la infección y se homogeneizaron en PBS usando un homogeneizador de tejidos Precellys 24 (BERTIN TECHNOLOGIES). El ARN vírico se extrajo usando reactivo TRIzol (INVITROGEN). La PCR de genoma completo, los títulos víricos mediante la TCID50 así como la PCR en tiempo real, se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Se generaron curvas de supervivencia inyectando a ratones de 4 semanas de edad (n=8 ratones por virus) 5x106 TCID50 de virus y monitorizando la morbilidad y mortalidad durante 10 días después de la infección. Para los estudios de protección, se inmunizó a los ratones con PBS o 5 x 105 TCID50 de virus 1-hastaparada o 1-hasta-paradaBajaFi.21 días después de la inmunización, se recogió suero para cuantificar la producción de anticuerpos neutralizantes. Se expuso a los ratones a 1 x 106 de virus de tipo silvestre (cepa hipervirulenta 372V del virus de Coxsackie B3) y se monitorizó la supervivencia durante los 10 días posteriores.
Ensayo de neutralización. A las 3 semanas después de la inmunización, se recogió el suero y se diluyó en serie con DMEM y se inactivó por calor a 56 °C durante 30 min, mientras que la solución madre de CVB3 se diluyó a una concentración de trabajo de 3x103 TCID50. Se determinaron los títulos de anticuerpo neutralizantes mediante un ensayo de reducción de TCID50 en células Vero, se mezclaron 50 pl de cada uno diluido en muestra de suero con 50 pl de CVB3 a una concentración de trabajo y se añadieron a placas de 96 pocillos para su incubación a 37 °C durante 2 h. Después de la incubación, se usaron 8 replicados de cada una de las diluciones para infectar a 104 células Vero sembradas en una placa de 96 pocillos. A los 6 días después de la infección, las células se observaron al microscopio para evaluar la presencia de CPE. Se determinaron los títulos de neutralización como la máxima dilución de suero que pudo prevenir la CPE en >50 % de las células.
Infección con virus de la gripe in vivo. Se anestesió a los ratones y se les infectó por vía intranasal con 105 TCID50 de virus de TS o de 1-hasta-parada en 20 microlitros (diluido en PBS). Se recogieron los pulmones y la tráquea a los tres y cinco días después de la infección y se homogeneizaron en PBS usando un homogeneizador de tejidos Precellys 24 (BERTIN TECHNOLOGIES). El virus infeccioso en los tejidos homogeneizados se tituló mediante un ensayo en placa y los títulos se expresaron como unidades formadoras de placa por gramo de órgano (ufp/g). El ARN vírico se extrajo usando reactivo TRIzol (INVITROGEN). La variabilidad genómica del virus se evaluó mediante secuenciación profunda, tal como se describe más adelante, pero dirigiéndose solo al segmento PA de muestras positivas.
Análisis de genoma completo mediante secuenciación profunda. Para estimar la diversidad de población de las variantes por secuenciación profunda, Se efectuaron bibliotecas de ADNc del virus de Coxsackie usando el kit para síntesis de ADNc Maxima H Minus First Strand (THERMOFISHER) y oligo dT como cebador a partir del ARN extraído del virus generado en células HeLa o diferentes órganos de ratón. El genoma vírico se amplificó usando una polimerasa de alta fidelidad (PHUSION®) para generar un amplicón de 7,2 kb de longitud (genoma de longitud completa). Los cebadores y la PCR se diseñaron y optimizaron en el laboratorio (5'-GAAAACGCGGGGAGGGTCAAA-3' (SEQ ID NO: 29) y 5'-ACCCCCTCCCCCAACTGTAA-3' (SEQ ID NO: 30)). Para el virus de la gripe A recogido tras cinco pases en serie en condiciones mutagénicas leves, se extrajo el ARN del genoma vírico para los sobrenadantes de células infectadas (MACHEREY-NAGEL), se retrotranscribieron con el kit de síntesis de ADNc Accuscript High Fidelity 1st strand (AGILENT) usando el cebador 5'-AGCRAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 31) (donde R = A o G) y se amplificó mediante la PCR usando ARN polimerasa de alta fidelidad PHUSION® (THERMOSCIENTIFIC). Se diseñaron ocho PCR para abarcar las regiones codificantes de los ocho segmentos genómicos (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M y NS). Los conjuntos de cebadores, uno por cada segmento genómico, se usaron en los dos virus construidos (tipo silvestre; 1-hasta-parada). Las secuencias de los cebadores son:
PB2
>H1N1s/pPB2-2f
GCAAAAGCAGGTCAATTATATTC (SEQ ID NO: 32)
>H1N1pPN2-2333r
CAAGGTCGTTTTTAAACAATTCG (SEQ ID NO: 33)
PB1
>H1N1pPB1-3f
CAAAAGCAGGCAAACCATTT (SEQ ID NO: 34)
>H1N1pPB1-2302r
TTCATTATTTTTGCCGTCTGAG (SEQ ID NO: 35)
PA >H1N1pPA-1f
AGCAAAAGCAGGTACTGATCCA (SEQ ID NO: 36)
>H1N1pPA-2216r
TTTTTGGACAGTATGGATAGCAAA (SEQ ID NO: 37)
HA >H1N1pHA-4f
AAAAGCAGGGGAAAACAAAAG (SEQ ID NO: 38)
>H1N1pHA-1770r
ACAAGGGTGTTTTTCTCATGCT (SEQ ID NO: 39)
NP >H1N1s/pNP-2f
GCAAAAGCAGGGTAGATAATCA (SEQ ID NO: 40)
>H1N1pNP-1561r
GAAACAAGGGTATTTTTCCTCAAC (SEQ ID NO: 41)
NA >H1N1pNA-7f
AGCAGGAGTTTAAAATGAATCC (SEQ ID NO: 42)
>H1N1pNA-1425r
TGTCAATGGTAAATGGCAACTC (SEQ ID NO: 43)
M >H1N1pM-23f
AAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTC (SEQ ID NO: 44)
>H1N1pM-987r
CAAAATGACCATCGTCAACATC (SEQ ID NO: 45)
NS >H1N1pNS-2f
GCAAAAGCAGGGTGACAAA (SEQ ID NO: 46)
>H1N1pNS-860r
ATAAGCTGAAACGAGAAAGCTC (SEQ ID NO: 47)
Para los órganos de ratón, se extrajo ARN con reactivo TRIzol (INVITROGEN) y solo se usó PA como diana para la PCR. Los productos de la PCR se fragmentaron (Fragmentasa), se multiplexaron, se agruparon, se secuenciaron en el mismo carril con la tecnología ILLUMINA cBot y GAIIX y se analizaron con herramientas de análisis de datos de secuenciación profunda establecidas y secuencias de comandos de desarrollo propio.
Frecuencias de codones. Se alinearon las lecturas secuenciadas para cada muestra con sus respectivos genomas de referencia usando BWA (Li 2013). Se estimaron para cada muestra las frecuencias de codón por sitio, tomando en consideración las lecturas que abarcan el sitio dado. Solo se usaron las lecturas con todas las puntuaciones de calidad de base de Phred en el codón superiores s 30. Las estimaciones de ML (máxima probabilidad) de las frecuencias de codones, basadas en el número de recuentos de codones observados y sus puntuaciones de calidad, se computaron después numéricamente.
Reconstrucción del mapa de calor. Cada fila en los mapas de calor muestra una sola muestra. Las muestras se agrupan por construcción. La intensidad de color representa las frecuencias medias de codones transformadas logarítmicamente para los 64 codones a lo largo de los 117 (virus de Coxsackie) o 110 (virus de la gripe) sitios codones que se cambiaron en las construcciones.
Codones de parada. Se calculó la frecuencia media de los codones de parada observados para todas las muestras de tipo silvestre y de 1-hasta-parada, donde la media se tomó a lo largo de las 117/110 posiciones modificadas. Se usan diagramas de cajas para representan la distribución de la frecuencia a lo largo de las muestras de tipo silvestre y de 1-hasta-parada, respectivamente.
Gráficas de distribución de la aptitud. Se generaron histogramas que muestran los valores de aptitud empíricos, agrupándose las muestras por construcción y las condiciones mutagénicas. La diferencia en la aptitud (AAptitud) entre los pares de codones de tipo silvestre y de 1-hasta-parada procedentes de las mismas condiciones experimentales también se calcularon y se muestran en histogramas, nuevamente agrupados por mutágenos.
Datos de secuencia de virus. Los datos de secuencia del virus de Coxsackie se proporcionan en el ejemplo 1 anterior. Los datos de secuencia del virus de la gripe son los siguientes.
Segmentos de PA de la gripe de tipo silvestre:
>secuencia ARN de PA de tipo silvestre (SEQ ID NO: 48) que codifica la proteína PA y la proteína PA_X
5 ' -AGUAGAAACAAGGUACUUUUUUGGACAGUAUGGAUAGCAAAUAGUAGCAUUGCCACAACU ACUUCAGUGCAUGUGUGAGGAAGGAGUUGAACCAAGAUGCAUUAAGCAAAACCCAGGGAU CAUUAAUCAGGCACUCCUCGAUUGCUUCAUAUAGCCCCCCAAGAUCGAAGGUUCCAGGUU CCAGGUUGUCCCUAAGUGCCUGAACAAUGAGAAGCAAUUUUCUCGAUUCAGCCGAAAACC CCUCAAGUUGUGGAGACGCAUAUAGACUGUUGAAUACAGAUUUUGCCAGUAAGGUCCUGC ACACUUUCCCAAUAGAGCCUUCCUCCACUCCCCUGGGUGACUCUCCGAUUGGCCAUGUUU CCGAUUUGUUUUCAAAGAAUUCCUUGGUCAUGUCUUUCUCUUUGACAGAAGACUCGGCCU CAAUCAUGCUCUCAAUCUGCUGAAGAGACUGAAGAAGGCAGCGCCUCAUUUCCAUGCCCC AUUU CALTCUU GAUCUUGGAGGUU CC AUUGGUU CU CACAUAUAGGAAC AUGGGCCU CGAC A CUUGGCCUAUCGCAGUCCUCAAGAGCAUGUCUCCUAUUUCAAGAACACAGUAUUUUUCCC AUUUGUGUGGCUCCAGUCUCGGGUCAGUGAGUGAGAACUCCAUACUUACAAAGUUCACCA CAUCAGUAUCAUUUCUCAAAUGAGACCUUCCUUUUAUAAUGAACCCAUACAGGUUUGUUU UCCGUCUUCCUUCUUUGGUCCUACAUUUGCUUAUCAUUGGGAUCAGCUGAAAGUCAUCCA UGGCUGCACAGGAUGCAUUGAGCAAGGCCGUAUUUAUGUACACUCCCUUCAUUAUGUAUU CAGUAGCCCUGCAGUGGGACACUUCUGCUGUAAAAUAGUUCCUCCUCAUGCUUGCGAUAU GUUCAAUCGGGGCAACAUCUUCUCCUAUUUCAUCAAGUUCUAUCCAGCUUGAAUCAGUCA AUUCACAUGCCUUAUUGAAUUCAUUUUGGACCCAGCUUGCUAGAGAUCUGGGCUCUGGCU CAUCACUGUCAUACUGUUUAAGGUCUCCAACAUCUUUGCAGUCAUCAAAGUCUACUUUUU CUGGUGCCAUAUUUUCACCGAGUGCCCACUUCAAUUGGCUUGUUCUCUUCAUGUUCUUUG UCCUUGGGAUCUUCUCUUCAUUUUCAAUGUCCUGUAGCUCUGCUAGCACUUGCUUCCAAG CCAUGAGGUAAUUGGGAUUUAUGCCUUUCCCAUGUGGUUUGACUAUGUUAGGCUCUUUCC AGCCAAAGAAUGUCUUCAUGCAUUUGAUUGCAUCAUAUAGUGGUAUUCCCUCCCCCUCGU GACUCGGGUCUUCAAUACUUAAUUUCAGAGCAUCCAUCAGCAGGAACUUUGACCGCUGAU GGCAAAGAGGCCCAUCAGGCAAUCUGAGGGGGCGUGGUGUCGUCCUCAAGAAUGGUUCAA UUUUGGCGUUCACUUCUUUUGACAUUUGGGAAAGCUUGCCCUCAAUGCAGCCGUUCGGCU CGAAUCCAUCUACAUAGGCUCUAAAGUUUUCAAGGCUGGAGAAGUUCGGUGGGAGACUUU GGUCGGCAAGCUUGCGCAUAGUUCCUGUAAUCUCAAAUUUUUCUUCAAUUGUCUCUUCGC CUCUUUCGGACUGACGAAAGGAAUCCCAUAGACUCCUACUGGCCAUUUCUUGUCUUAUAG UGAAAAGCCUAGUUUUGAUUCUUGCCCUGCUCUCUUCGUCAAGGGUGUAGUCCGCUUUGG UGGCCAUCUCCUCUCCAGUGAAUGAAAAGAUGUGAAUGUGUGUCUUCUCAGAUUUUAUUU UGUUGGCUUUCUCUAGGUAAUAUAUGUGGACUUCCCUCCGUGUUACUCCAAUUUCAAUGA ACCGGUUCUCUUUGUAAUCAUACAAAUCAGGAAGAAAUUUAGGCUUCUCUACCCCUGUUG UGUUACAUAUACUGUUCACCACUGUCCAGGCCAUGAUUCGGUCUCUUCCUUCAAUUAUCU CAAAUCGGUGCUUCAAUAGUGCAUUCGGGUCACCAGAUUCUACAAUUAUUGAUUCACCCC GUUCGUCGAUGAAAUGGAAAUCCGAAUACAUGAAACAAACUUCCAAAUGUGUGCAUAUUG CAGCAAACUUGUUAGUUUCGAUUUUCGGAUCUUCCCCAUAUUCUUUCAUUGCCUUUUCCG CAAGCUCGACGAUCAUUGGAUUGAAGCAUUGUCGCACAAAGUCUUCCAUUUUGGAUCAGU ACCUGCUUUCGCU
>PA_CDS (SEQ ID NO: 49)
que codifica la proteína PA
5 ' -ATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCA ATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACTAACAAGTTTGCTGCAATATGCACA CATTTGGAAGTTTGTTTCATGTATTCGGATTTCCATTTCATCGACGAACGGGGTGAATCA ATAATTGTAGAATCTGGTGACCCGAATGCACTATTGAAGCACCGATTTGAGATAATTGAA GGAAGAGACCGAATCATGGCCTGGACAGTGGTGAACAGTATATGTAACACAACAGGGGTA GAGAAGCCTAAATTTCTTCCTGATTTGTATGATTACAAAGAGAACCGGTTCATTGAAATT GGAGTAACACGGAGGGAAGTCCACATATATTACCTAGAGAAAGCCAACAAAATAAAATCT GAGAAGACACACAT TCACAT CTTT TCAT TCACT GGAGAGGAGAT GGCC ACCAAAGCGGAC
TACACCCTTGACGAAGAGAGCAGGGCAAGAATCAAAACTAGGCTTTTCACTATAAGACAA GAAATGGCCAGTAGGAGTCTATGGGATTCCTTTCGTCAGTCCGAAAGAGGCGAAGAGACA ATTGAAGAAAAATTTGAGATTACAGGAACTATGCGCAAGCTTGCCGACCAAAGTCTCCCA CCGAACTTCTCCAGCCTTGAAAACTTTAGAGCCTATGTAGATGGATTCGAGCCGAACGGC TGCATTGAGGGCAAGCTTTCCCAAATGTCAAAAGAAGTGAACGCCAAAATTGAACCATTC TTGAGGACGACACCACGCCCCCTCAGATTGCCTGATGGGCCTCTTTGCCATCAGCGGTCA AAGTTCCTGCTGATGGATGCTCTGAAATTAAGTATTGAAGACCCGAGTCACGAGGGGGAG GGAATACCACTATATGATGCAATCAAATGCATGAAGACATTCTTTGGCTGGAAAGAGCCT AACATAGTCAAACCACATGGGAAAGGCATAAATCCCAATTACCTCATGGCTTGGAAGCAA GTGCTAGCAGAGCTACAGGACATTGAAAATGAAGAGAAGATCCCAAGGACAAAGAACATG AAGAGAACAAGCCAATTGAAGTGGGCACTCGGTGAAAATATGGCACCAGAAAAAGTAGAC TTTGATGACTGCAAAGATGTTGGAGACCTTAAACAGTATGACAGTGATGAGCCAGAGCCC AGATCTCTAGCAAGCTGGGTCCAAAATGAATTCAATAAGGCATGTGAATTGACTGATTCA AGCTGGATAGAACTTGATGAAATAGGAGAAGATGTTGCCCCGATTGAACATATCGCAAGC ATGAGGAGGAACTATTTTACAGCAGAAGTGTCCCACTGCAGGGCTACTGAATACATAATG AAGGGAGTGTACATAAATACGGCCTTGCTCAATGCATCCTGTGCAGCCATGGATGACTTT CAGCTGATCCCAATGATAAGCAAATGTAGGACCAAAGAAGGAAGACGGAAAACAAACCTG TATGGGTTCATTATAAAAGGAAGGTCTCATTTGAGAAATGATACTGATGTGGTGAACTTT GTAAGTATGGAGTTCTCACTCACTGACCCGAGACTGGAGCCACACAAATGGGAAAAATAC TGTGTTCTTGAAATAGGAGACATGCTCTTGAGGACTGCGATAGGCCAAGTGTCGAGGCCC ATGTTCCTATATGTGAGAACCAATGGAACCTCCAAGATCAAGATGAAATGGGGCATGGAA ATGAGGCGCTGCCTTCTTCAGTCTCTTCAGCAGATTGAGAGCATGATTGAGGCCGAGTCT TCTGT CAAAGAGAAAGACAT GACCAAGGAAT TC TTTGAAAACAAATCGGAAACAT GGCCA ATCGGAGAGTCACCCAGGGGAGTGGAGGAAGGCTCTATTGGGAAAGTGTGCAGGACCTTA CTGGCAAAATCTGTATTCAACAGTCTATATGCGTCTCCACAACTTGAGGGGTTTTCGGCT GAATCGAGAAAATTGCTTCTCATTGTTCAGGCACTTAGGGACAACCTGGAACCTGGAACC TTCGATCTTGGGGGGCTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTT TTGCTTAATGCATCTTGGTTCAACTCCTTCCTCACACATGCACTGAAGTAG
>proteína_PA (SEQ ID NO: 50)
MEDFVRQCFNPMIVELAEKAMKEYGEDPKIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHFIDERGES IIVESGDPNALLKHRFEIIEGRDRIMAWTVVNSICNTTGVEKPKFLPDLYDYKENRFIEI GVTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIRQ EMASRSLWDSFRQSERGEETIEEKFEITGTMRKLADQSLPPNFSSLENFRAYVDGFEPNG CIEGKLSQMSKEVNAKIEPFLRTTPRPLRLPDGPLCHQRSKFLLMDALKLSIEDPSHEGE GIPLYDAIKCMKTFFGWKEPNIVKPHGKGINPNYLMAWKQVLAELQDIENEEKIPRTKNM KRTSQLKWALGENMAPEKVDFDDCKDVGDLKQYDSDEPEPRSLASWVQNEFNKACELTDS SWIELDEIGEDVAPIEHIASMRRNYFTAEVSHCRATEYIMKGVYINTALLNASCAAMDDF QLIPMISKCRTKEGRRKTNLYGFIIKGRSHLRNDTDVVNFVSMEFSLTDPRLEPHKWEKY CVLEIGDMLLRTAIGQVSRPMFLYVRTNGTSKIKMKWGMEMRRCLLQSLQQIESMIEAES SVKEKDMTKEFFENKSETWPIGESPRGVEEGSIGKVCRTLLAKSVFNSLYASPQLEGFSA ESRKLLLIVQALRDNLEPGTFDLGGLYEAIEECLINDPWVLLNASWFNSFLTHALK*
>CDS_de_PA-X (SEQ ID NO: 51)
codificante de la proteína PA_X (secuencia de ADNc = fragmento 1-700 de SEQ ID NO: 50 eliminación del nucleótido 571)
5' -ATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCA ATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACTAACAAGTTTGCTGCAATATGCACA CATTTGGAAGTTTGTTTCATGTATTCGGATTTCCATTTCATCGACGAACGGGGTGAATCA ATAATTGTAGAATCTGGTGACCCGAATGCACTATTGAAGCACCGATTTGAGATAATTGAA GGAAGAGACCGAATCATGGCCTGGACAGTGGTGAACAGTATATGTAACACAACAGGGGTA
GAGAAGCCTAAATTTCTTCCTGATTTGTATGATTACAAAGAGAACCGGTTCATTGAAATT GGAGTAACACGGAGGGAAGTCCACATATATTACCTAGAGAAAGCCAACAAAATAAAATCT GAGAAGACACACAT TCAC ATC TTTTC ATTCAC TGGAGAGGAGAT GGCC ACC AAAGCGGAC TACACCCTTGACGAAGAGAGCAGGGCAAGAATCAAAACTAGGCTTTTCACTATAAGACAA GAAATGGCCAGTAGGAGTCTATGGGATTCCTTCGTCAGTCCGAAAGAGGCGAAGAGACAA TTGAAGAAAAATTTGAGATTACAGGAACTATGCGCAAGCTTGCCGACCAAAGTCTCCCAC CGAACTTCTCCAGCCTTGAAAACTTTAGAGCCTATGTAG
>proteína_PA-X (SEQ ID NO: 52)
MEDFVRQCFNPMIVELAEKAMKEYGEDPKIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHFIDERGES IIVESGDPNALLKHRFEIIEGRDRIMAWTVVNSICNTTGVEKPKFLPDLYDYKENRFIEI GVTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIRQ EMASRSLWDSFVSPKEAKRQLKKNLRLQELCASLPTKVSHRTSPALKTLEPM*
segmentos de PA de 1-hasta-parada:
>secuencia de ARN genómico de PA (ARNv) (SEQ ID NO: 53)
5 ' -AGUAGAAACAAGGUACUUUUUUGGACAGUAUGGAUAGCAAAUAGUAGCAUUGCCACAACU ACUUCAaUGCAUGUGUcAaGAAcGAGUUGAACCAuGAUGCAUUuAaCAAAACCCAGGGAU CAUUAAUCAaGCACUCCUCGAUUGCUUCAUAUAaCCCCCCuAaAUCGAAGGUUCCAGGUU CCAaGUUGUCCCUuAaUGCCUGAACAAUcAauAaCAAUUUUCUCGAUUCAGCCGAAAACC CCUCuAaUUGUGGuGACGCAUAUAaugaGUUGAAUACuGAUUUUGCCAaUAAGGUCCUGC ACACUUUCCCAAUuGAGCCUUCCUCCACUCCCCUGGGUGACUCUCCGAUUGGCCAUGUUU CCGAUUUGUUUUCAAAGAAUUCCUUGGUCAUGUCUUUCUCUUUGACuGAuGACUCGGCCU CAAUCAUcgaCUCAAUCUGCUGuAauGACUGuAauAaGCAGCGCCUCAUUUCCAUGCCCC AUUUCAUCUUGAUCUUcGAGGUUCCAUUGGUUCUCACAUAUAaGAACAUGGGCCUCGACA CUUGGCCUAUCGCAGUCCUCAAcAaCAUGUCUCCUAUUUCuAaAACACAGUAUUUUUCCC AUUUGUGUGGCUCCAaUCUCGGGUCAGUcAaUGAGAACUCCAUugaUACAAAGUUCACCA CAUCAGUAUCAUUUCUCAAAUGuGACCUUCCUUUUAUAAUGAACCCAUACAaGUUUGUUU UCCGUCUUCCUUCUUUGGUCCUACAUUUcgaUAUCAUUGGGAUCAaCUGAAAGUCAUCCA UGGCUGCACAcGAUGCAUUcAaCAAGGCCGUAUUUAUGUACACUCCCUUCAUUAUGUAUU CAGUAGCCCUGCAGUGcGACACUUCUGCUGUAAAAUAGUUCCUCCUCAUcgaUGCGAUAU GUUCAAUCGGGGCAACAUCUUCUCCUAUUUCAUCuAaUUCUAUCCAcgaUGAAUCAGUCA AUUCACAUGCCUUAUUGAAUUCAUUUUGGACCCAcgaUGCUAauGAUCUGGGCUCUGGCU CAUCugaGUCAUACUGUUUuAaGUCUCCAACAUCUUUGCAGUCAUCAAAGUCUACUUUUU CUGGUGCCAUAUUUUCACCcAaUGCCCACUUCAAUUGcgaUGUUCUCUUCAUGUUCUUUG UCCUUGGGAUCUUCUCUUCAUUUUCAAUGUCCUGUAaCUCUGCUAaCACUUGCUUCCAAG CCAUcAaGUAAUUGGGAUUUAUGCCUUUCCCAUGUGGUUUGACUAUGUUAGGCUCUUUCC AGCCAAAGAAUGUCUUCAUGCAUUUGAUUGCAUCAUAUAaUGGUAUUCCCUCCCCCUCGU GugaCGGGUCUUCAAUugaUAAUUUCAaAGCAUCCAUCAaCAaGAACUUUGACCGCUGAU GGCAuAaAGGCCCAUCAGGCAAUCUcAaGGGGCGUGGUGUCGUCCUCAAGAAUGGUUCAA UUUUGGCGUUCACUUCUUUUGACAUUUGcGAuAaCUUGCCCUCAAUGCAGCCGUUCGGCU CGAAUCCAUCUACAUAGGCUCUAAAGUUUUCuAacgacGAGAAGUUCGGUGGcAaugaUU GGUCGGCuAaCUUGCGCAUAGUUCCUGUAAUCUCAAAUUUUUCUUCAAUUGUCUCUUCGC CUCUUUCcGACUGACGAAAcGAAUCCCAUAaugaCCUugaGGCCAUUUCUUGUCUUAUAG UGAAuAaCCUAGUUUUGAUUCUUGCCCUcgaCUCUUCGUCuAaGGUGUAGUCCGCUUUGG UGGCCAUCUCCUCUCCAGUGAAUGAAAAGAUGUGAAUGUGUGUCUUCUCuGAUUUUAUUU UGUUGGCUUUCUCUAaGUAAUAUAUGUGGACUUCCCUCCGUGUUACUCCAAUUUCAAUGA ACCGGUUCUCUUUGUAAUCAUACAAAUCAGGuAaAAAUUUAGGCUUCUCUACCCCUGUUG
UGUUACAUAUugaGUUCACCACUGUCCAGGCCAUGAUUCGGUCUCUUCCUUCAAUUAUCU CAAAUCGGUGCUUCAAUAaUGCAUUCGGGUCACCuGAUUCUACAAUUAUUGAUUCACCCC GUUCGUCGAUGAAAUGGAAAUCCGAAUACAUGAAACAAACUUCCAAAUGUGUGCAUAUUG CAGCAAACUUGUUAGUUUCGAUUUUCGGAUCUUCCCCAUAUUCUUUCAUUGCCUUUUCCG
CuAaCUCGACGAUCAUUGGAUUGAAGCAUUGUCGCACAAAGUCUUCCAUUUUGGAUCAGU ACCUGCUUUCGCU
> P A _C D S (S E Q ID NO: 54)
5 ' -ATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGtTaGCGGAAAAGGCA ATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACTAACAAGTTTGCTGCAATATGCACA CATTTGGAAGTTTGTTTCATGTATTCGGATTTCCATTTCATCGACGAACGGGGTGAATCA ATAATTGTAGAATCaGGTGACCCGAATGCAtTATTGAAGCACCGATTTGAGATAATTGAA GGAAGAGACCGAATCATGGCCTGGACAGTGGTGAACtcaATATGTAACACAACAGGGGTA GAGAAGCCTAAATTTtTaCCTGATTTGTATGATTACAAAGAGAACCGGTTCATTGAAATT GGAGTAACACGGAGGGAAGTCCACATATATTACtTAGAGAAAGCCAACAAAATAAAATCa GAGAAGACACACATT CACAT CTTT TCAT TCACTGGAGAGGAGAT GGCCACCAAAGCGGAC TACACCtTaGACGAAGAGtcgAGGGCAAGAATCAAAACTAGGtTaTTCACTATAAGACAA GAAATGGCCtcaAGGtcatTATGGGATTCgTTTCGTCAGTCgGAAAGAGGCGAAGAGACA ATTGAAGAAAAATTTGAGATTACAGGAACTATGCGCAAGtTaGCCGACCAAtcatTgCCA CCGAACTTCTCgtcgtTaGAAAACTTTAGAGCCTATGTAGATGGATTCGAGCCGAACGGC TGCATTGAGGGCAAGtTaTCgCAAATGTCAAAAGAAGTGAACGCCAAAATTGAACCATTC TTGAGGACGACACCACGCCCCtTgAGATTGCCTGATGGGCCTtTaTGCCATCAGCGGTCA AAGTTCtTGtTGATGGATGCTtTGAAATTAtcaATTGAAGACCCGtcaCACGAGGGGGAG GGAATACCAtTATATGATGCAATCAAATGCATGAAGACATTCTTTGGCTGGAAAGAGCCT AACATAGTCAAACCACATGGGAAAGGCATAAATCCCAATTACtTgATGGCTTGGAAGCAA GTGtTAGCAGAGtTACAGGACATTGAAAATGAAGAGAAGATCCCAAGGACAAAGAACATG AAGAGAACAtcgCAATTGAAGTGGGCAtTgGGTGAAAATATGGCACCAGAAAAAGTAGAC TTTGATGACTGCAAAGATGTTGGAGACtTaAAACAGTATGACtcaGATGAGCCAGAGCCC AGATCatTAGCAtcgTGGGTCCAAAATGAATTCAATAAGGCATGTGAATTGACTGATTCA tcgTGGATAGAAtTaGATGAAATAGGAGAAGATGTTGCCCCGATTGAACATATCGCAtcg ATGAGGAGGAACTATTTTACAGCAGAAGTGTCgCACTGCAGGGCTACTGAATACATAATG AAGGGAGTGTACATAAATACGGCCTTGtTgAATGCATCgTGTGCAGCCATGGATGACTTT CAGtTGATCCCAATGATAtcgAAATGTAGGACCAAAGAAGGAAGACGGAAAACAAACtTG TATGGGTTCATTATAAAAGGAAGGTCaCATTTGAGAAATGATACTGATGTGGTGAACTTT GTAtcaATGGAGTTCTCAtTgACTGACCCGAGAtTGGAGCCACACAAATGGGAAAAATAC TGTGTTtTaGAAATAGGAGACATGtTgTTGAGGACTGCGATAGGCCAAGTGTCGAGGCCC ATGTTCtTATATGTGAGAACCAATGGAACCTCgAAGATCAAGATGAAATGGGGCATGGAA ATGAGGCGCTGCtTatTaCAGTCatTaCAGCAGATTGAGtcgATGATTGAGGCCGAGTCa TCaGTCAAAGAGAAAGACATGACCAAGGAATTCTTTGAAAACAAATCGGAAACATGGCCA ATCGGAGAGTCACCCAGGGGAGTGGAGGAAGGCTCaATTGGGAAAGTGTGCAGGACCTTA tTGGCAAAATCaGTATTCAACtcatTATATGCGTCaCCACAAtTaGAGGGGTTTTCGGCT GAATCGAGAAAATTGtTatTgATTGTTCAGGCAtTaAGGGACAACtTGGAACCTGGAACC TTCGATtTaGGGGGGtTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCtTGATTAATGATCCCTGGGTT TTGtTaAATGCATCaTGGTTCAACTCgTTCtTgACACATGCAtTGAAGTAG
>proteína_PA (SEQ ID NO: 55)
MEDFVRQCFNPMIVELAEKAMKEYGEDPKIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHFIDERGES IIVESGDPNALLKHRFEIIEGRDRIMAWTVVNSICNTTGVEKPKFLPDLYDYKENRFIEI GVTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIRQ EMASRSLWDSFRQSERGEETIEEKFEITGTMRKLADQSLPPNFSSLENFRAYVDGFEPNG CIEGKLSQMSKEVNAKIEPFLRTTPRPLRLPDGPLCHQRSKFLLMDALKLSIEDPSHEGE
GIPLYDAIKCMKTFFGWKEPNIVKPHGKGINPNYLMAWKQVLAELQDIENEEKIPRTKNM KRTSQLKWALGENMAPEKVDFDDCKDVGDLKQYDSDEPEPRSLASWVQNEFNKACELTDS SWIELDEIGEDVAPIEHIASMRRNYFTAEVSHCRATEYIMKGVYINTALLNASCAAMDDF QLIPMISKCRTKEGRRKTNLYGFIIKGRSHLRNDTDVVNFVSMEFSLTDPRLEPHKWEKY CVLEIGDMLLRTAIGQVSRPMFLYVRTNGTSKIKMKWGMEMRRCLLQSLQQIESMIEAES SVKEKDMTKEFFENKSETWPIGESPRGVEEGSIGKVCRTLLAKSVFNSLYASPQLEGFSA ESRKLLLIVQALRDNLEPGTFDLGGLYEAIEECLINDPWVLLNASWFNSFLTHALK*
>CDS_de_PA-X (SEQ ID NO: 56)
5' -ATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGtTaGCGGAAAAGGCA ATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACTAACAAGTTTGCTGCAATATGCACA CATTTGGAAGTTTGTTTCATGTATTCGGATTTCCATTTCATCGACGAACGGGGTGAATCA ATAATTGTAGAATCaGGTGACCCGAATGCAtTATTGAAGCACCGATTTGAGATAATTGAA GGAAGAGACCGAATCATGGCCTGGACAGTGGTGAACtcaATATGTAACACAACAGGGGTA GAGAAGCCTAAATTTtTaCCTGATTTGTATGATTACAAAGAGAACCGGTTCATTGAAATT GGAGTAACACGGAGGGAAGTCCACATATATTACtTAGAGAAAGCCAACAAAATAAAATCa GAGAAGACACACAT TCAC ATC TTTTCAT TCACTGGAGAGGAGAT GGCC ACC AAAGCGGAC TACACCtTaGACGAAGAGtcgAGGGCAAGAATCAAAACTAGGtTaTTCACTATAAGACAA GAAATGGCCtcaAGGtcatTATGGGATTCgTTCGTCAGTCgGAAAGAGGCGAAGAGACAA TTGAAGAAAAATTTGAGATTACAGGAACTATGCGCAAGtTaGCCGACCAAtcatTgCCAC CGAACTTCTCgtcgtTaGAAAACTTTAGAGCCTATGTAG
>Proteína PA-X (SEQ ID NO: 57)
MEDFVRQCFNPMIVELAEKAMKEYGEDPKIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHFIDERGES IIVESGDPNALLKHRFEIIEGRDRIMAWTVVNSICNTTGVEKPKFLPDLYDYKENRFIEI GVTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIRQ EMASRSLWDSFVSRKEAKRQLKKNLRLQELCAS*
Otros segmentos de la gripe (comunes para las construcciones de ts, 1-hasta-parada, MásV y MenosV):
Segmento PB2 de la gripe:
>secuencia de ARN genómico de PB2 (ARNv) (SEQ ID NO: 58)
5 ' -AGUAGAAACAAGGUCGUUUUUAAACAAUUCGACACUAAUUGAUGGCCAUCCGAAUUCUUU UGGUCGCUGUCUGGCUGUCAGUAAGUAUGCUAGAGUCCCGUUUUCGUUUCAUUACCAACA CUACGUCCCCUUGCCCAAUUAGCACAUUAGCCUUCUCUCCUUUUGCAAGAUUGCUCAGUU CAUUGAUGCUUAAUGCUGGGCCAUAUCUCUUGUCUUCUUUGCCCAAAAUGAGAAAUCCUC UCAGGACAGCAGACUCCACCCCAGAUGUGCCUUCAUCUGGAUCUUCAGUCAAUGCACCUG CAUCCUUUCCAAGAACUGUAAGUCGUUUGGUUGCCUUGUUGUAAUUGAAUACUGGAGAAU UGCCUCUUACCAGUAUCCUCAACCCUGAUCCUCUCACAUUCACAGUCAAUGAGGAAAAUU GCAUCCUACUCUGUUCUGGUGGAGCAGCAGCAAAGGGGAGAAGUUUUAUUAUUUGGACAG UGUCAAAUGUCCCAAGCACAUCCCGCAUUUGCUGGAACAGUGUCCUUACGAAUCCACUGU ACCGGCUUCUGGUUGCCUUAGGGACAAGAGACUGAAAUGGUUCAAAUUCCAUUUUGUUGU AUAACAUUGUGGGAUCUUGUGACCAUUGAAUUUUCACAAUUUCCCAGUUCCUGAUUAUCC AUUGAUAAGUGUUGACUAGCACUGACUCAGGGCCAUUGAUCUCCCACAUCAUUGAUGACG AAUAAGUUAUUGUCAACUUCUCAGUUCCUUGCGUUUCACUGACUUCUUCGGGAGACAAUA AUACGUUCCCUCUUUGAUCUCUAACCCUUAAAAAUCGGUCAAUACUCACUACCACUCUCU CCGUGCUGGAGUAUUCAUCUACUCCCAUUUUGCUGACUCUUAUCCCUCUCAGCGACAUCU CCGUGCUUGGGGUCAUGUCGGGCAGUAUUCCGAUCAUUCCCAUCACAUUGUCGAUGGAUU
CAAUUCCCCAGUUCUGGAAAAGCACUUUUGCAUCUUUUUGGAAAUGCCUCAAGAGUUGGU GCAUGGGGUUCAGUCGCUGGUUUGCCCUAUUGACAAAGUUCAGAUCGCCCCUAACUGCCU UGAUCAUGCAAUCCUCUUGUGAGAAUACCAUGGCCACAAUUAUUGCCUCAGCAAUUGACU GCUCGUCUCUCCCGCUUACUAUCAACUGGAUCAAUCUCCUGGUUGCCUUUCUGAGAAUAG CUGUUGCUCUUCUCCCAACCAUUGUGAAUUCUUCAUACCCUUCAUGUACUCUUAUUUUCA GUGUUUGGAGGUUGCCCGUUAGCACUUCUUCUUCUUUCUUGACUGAUGAUCCGCUUGUCC UUUUGAAAGUGAACCCACCAAAACUGAAAGAUGAGCUAAUCCUCAACCCUAUUGCUGCCU UGCAUAUGUCUACGGCUUGUUCCUCAGUUGGAUUCUGUCUAAGGAUGUCCACCAUCCUUA CUCCUCCAAUCUGUGUGCUGUGGCACAUUUCCAAGAGAGAUGCUAAUGGGUCUGCUGACA CUGCUGCUCUUCUUACUAUGUUUCUAGCAGCGAUAAUCAAACUUUGGUCAACAUCAUCAU UUCUCACUUCUCCUCCUGGAGUGUACAUCUGCUCCCAGCACGUCCCUUGGGUUAAGUGCA ACACUUCAAUAUAAACACUGCCUGUUCCGCCGGCUACUGGGAGAAACCUUGUUUUACGGA CCAAUUCUCUUUCUAGCAUGUACGCCACCAUCAAGGGAGCAAUUUUACAAUCCUGGAGCU CUUCUUUCUUCUCUUUUGUUAUUGCCAUUUGUGACUCUGAUGUCAGUAUUCUUGCCCCCA CUUCAUUUGGGAAAACAACUUCCAUAAUCACAUCCUGUGCCUCCUUGGCACUGAGAUCUG CAUGGCCAGGGUUUGUAUCAACUCUCCUCCUUAUUUUAACUUGAUUUCUGAAGUGGACAG GGCCGAAGGUACCAUGUUUCAACCUUUCGACCUUUUCGAAAUAAGUUUUAUAUACCUUAG GGUAAUGAACUGUACUUGUUGUUGGGCCAUUCCUAUUCCACCAUGUUACGGCCAGAGGUG AUACCAUCACUCGGUCUGAUCCAGCAUCGUUUGUUUUGCUCCAGAGGGUUUGUCCUUGUU CAUUCCUCUCUGGAAUCAUGUCCAUUAUUCUCUUGUCUGCUGUAAUUGGGUAUCUCAUUG CCAUCAUCCACUUCAUUCUGAGUGCGGGGUUCUUCUCUUGCCUUCCUGAUGUGUACUUUU UGAUUAUGGCCAUAUGGUCCACAGUGGUCUUAGUGAGUAUCUCGCGAGUGCGGGACUGCG ACAUUAGAUCUCUCAGUUCUUUUAUUCUCUCCAUAUUGAAUAUAUUUGACCUGCUUUCGC
U
> C D S _ d e _ P B 2 (S E Q ID NO: 59)
5 ' -ATGGAGAGAATAAAAGAACTGAGAGATCTAATGTCGCAGTCCCGCACTCGCGAGATACTC ACTAAGACCACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAAAAGTACACATCAGGAAGGCAAGAG AAGAACCCCGCACTCAGAATGAAGTGGATGATGGCAATGAGATACCCAATTACAGCAGAC AAGAGAATAATGGACATGATTCCAGAGAGGAATGAACAAGGACAAACCCTCTGGAGCAAA ACAAACGATGCTGGATCAGACCGAGTGATGGTATCACCTCTGGCCGTAACATGGTGGAAT AGGAATGGCCCAACAACAAGTACAGTTCATTACCCTAAGGTATATAAAACTTATTTCGAA AAGGTCGAAAGGTTGAAACATGGTACCTTCGGCCCTGTCCACTTCAGAAATCAAGTTAAA ATAAGGAGGAGAGTTGATACAAACCCTGGCCATGCAGATCTCAGTGCCAAGGAGGCACAG GATGTGATTATGGAAGTTGTTTTCCCAAATGAAGTGGGGGCAAGAATACTGACATCAGAG TCACAAATGGCAATAACAAAAGAGAAGAAAGAAGAGCTCCAGGATTGTAAAATTGCTCCC TTGATGGTGGCGTACATGCTAGAAAGAGAATTGGTCCGTAAAACAAGGTTTCTCCCAGTA GCCGGCGGAACAGGCAGTGTTTATATTGAAGTGTTGCACTTAACCCAAGGGACGTGCTGG GAGCAGATGTACACTCCAGGAGGAGAAGTGAGAAATGATGATGTTGACCAAAGTTTGATT ATCGCTGCTAGAAACATAGTAAGAAGAGCAGCAGTGTCAGCAGACCCATTAGCATCTCTC TTGGAAATGTGCCACAGCACACAGATTGGAGGAGTAAGGATGGTGGACATCCTTAGACAG AATCCAACTGAGGAACAAGCCGTAGACATATGCAAGGCAGCAATAGGGTTGAGGATTAGC TCATCTTTCAGTTTTGGTGGGTTCACTTTCAAAAGGACAAGCGGATCATCAGTCAAGAAA GAAGAAGAAGTGCTAACGGGCAACCTCCAAACACTGAAAATAAGAGTACATGAAGGGTAT GAAGAATTCACAATGGTTGGGAGAAGAGCAACAGCTATTCTCAGAAAGGCAACCAGGAGA TTGATCCAGTTGATAGTAAGCGGGAGAGACGAGCAGTCAATTGCTGAGGCAATAATTGTG GCCATGGTATTCTCACAAGAGGATTGCATGATCAAGGCAGTTAGGGGCGATCTGAACTTT GTCAATAGGGCAAACCAGCGACTGAACCCCATGCACCAACTCTTGAGGCATTTCCAAAAA GATGCAAAAGTGCTTTTCCAGAACTGGGGAATTGAATCCATCGACAATGTGATGGGAATG ATCGGAATACTGCCCGACATGACCCCAAGCACGGAGATGTCGCTGAGAGGGATAAGAGTC
AGCAAAATGGGAGTAGATGAATACTCCAGCACGGAGAGAGTGGTAGTGAGTATTGACCGA TTTTTAAGGGTTAGAGATCAAAGAGGGAACGTATTATTGTCTCCCGAAGAAGTCAGTGAA ACGCAAGGAACTGAGAAGTTGACAATAACTTATTCGTCATCAATGATGTGGGAGATCAAT GGCCCTGAGTCAGTGCTAGTCAACACTTATCAATGGATAATCAGGAACTGGGAAATTGTG AAAATTCAATGGTCACAAGATCCCACAATGTTATACAACAAAATGGAATTTGAACCATTT CAGTCTCTTGTCCCTAAGGCAACCAGAAGCCGGTACAGTGGATTCGTAAGGACACTGTTC CAGCAAATGCGGGATGTGCTTGGGACATTTGACACTGTCCAAATAATAAAACTTCTCCCC TTTGCTGCTGCTCCACCAGAACAGAGTAGGATGCAATTTTCCTCATTGACTGTGAATGTG AGAGGATCAGGGTTGAGGATACTGGTAAGAGGCAATTCTCCAGTATTCAATTACAACAAG GCAACCAAACGACTTACAGTTCTTGGAAAGGATGCAGGTGCATTGACTGAAGATCCAGAT GAAGGCACATCTGGGGTGGAGTCTGCTGTCCTGAGAGGATTTCTCATTTTGGGCAAAGAA GACAAGAGATATGGCCCAGCATTAAGCATCAATGAACTGAGCAATCTTGCAAAAGGAGAG AAGGCTAATGTGCTAATTGGGCAAGGGGACGTAGTGTTGGTAATGAAACGAAAACGGGAC TCTAGCATACTTACTGACAGCCAGACAGCGACCAAAAGAATTCGGATGGCCATCAATTAG
> P ro te ín a P B 2 (S E Q ID NO: 60 )
MERIKELRDLMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMRYPITAD KRIMDMIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDRVMVSPLAVTWWNRNGPTTSTVHYPKVYKTYFE KVERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDTNPGHADLSAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSE SQMAITKEKKEELQDCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTGSVYIEVLHLTQGTCW EQMYTPGGEVRNDDVDQSLIIAARNIVRRAAVSADPLASLLEMCHSTQIGGVRMVDILRQ NPTEEQAVDICKAAIGLRISSSFSFGGFTFKRTSGSSVKKEEEVLTGNLQTLKIRVHEGY EEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSQEDCMIKAVRGDLNF VNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVL FQNWGIE SIDNVMGMIGIL P DMTPSTEMSLRGIRV SKMGVDEYS STERVVVSIDRFLRVRDQRGNVLLS PEEVSETQGTEKLTITYS SSMMWEIN GPESVLVNTYQWIIRNWEIVKIQWSQDPTMLYNKMEFEPFQSLVPKATRSRYSGFVRTLF QQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGLRILVRGNSPVFNYNK ATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTSGVESAVLRGFLILGKEDKRYGPALSINELSNLAKGE KANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAIN*
Segmento PB1 de la gripe:
>secuencia de ARN genómico de PB1 (ARNv) (SEQ ID NO: 61)
5' -AGUAGAAACAAGGCAUUUUUUCAUGAAGGACAAGUUAAAUUCAUUAUUUUUGCCGUCUGA GUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUGAUCUCAGAGAACUCUUCUUUCUUGAUCCGUC CAGACUCGAAGUCGACCCUGGCAUCAAUCCGGGCCCUAGACACCAUGGCCUCCACCAUGC UAGAAAUUCCAACCGGUCUCCUAUAUGAACUGCUAGGGAAAAAUUUCUCGAAUAGAUUGC AGCACUUCUGGUACAUCUGUUCAUCCUCAAGAAUUCCCCUUUGGCUUGUGUUGAGAAUAG AACGAUUCCUCUUGGGAAUCCAGGAAUGUGUAGUUGCAACGGCAUCAUAUUCCAUGCUUU UGGCUGGACCAUGGGCUGGCAUUACCACAGCAUUGUUUACAGAAUCAAUCUCUUUAUGAC UGACAAAGGGAUUCAGGGGAUUACAAAGUCUUCCCCGAUAAUCAUCAUCCAUUAGCUCCC AUUUUAAGCAGACUUCAGGAAUGUGAAGAUUCCGUAUAUUGUAUAAGUUUGGUCCUCCAU CUGAUACUAAUAGCCCUACCUUUGAUUGGGUUUGAUCCCACAGCUUCUUUAACUCAAAUG AUCUUCUCGUCUGAAUUUGUGUGUCUCCCCUAUGGCACCUAUAUGUGUAUCUGUAGUCUU UGAUGAACAAUUGAAGAGCCAUCUGGGCCGUUGCAGGUCCAAGGUCAUUGUUUAUCAUGU UGUUCUUUAUCACUGUUACUCCAAUACUCAUGUCAGCUGAUUCAUUUACUCCAGACACUC CAAAGCUGGGUAGCUCCAUGCUAAAAUUAGCCACAAAUCCAUAGCGAUAAAAAAAGCUUG UGAAUUCAAAUGUCCCUGUCUUAUUUAUAUAGGACUUCUUUUUGCUCAUGUUGAUUCCCA CUAACUUGCAGGUCCUGUAGAAUCUGUCCACUCCUGCUUGUAUUCCCUCAUGGUUUGGUG
CAUUCACUAUGAGAGCAAAAUCGUCGGAUGAUUGGAGCCCAUCCCACCAGUAUAUUGUCU UGGUGUAUUUCUUUUGUCCAAGAUUCAGUAUCGAGACUCCCAAGACCGUACUUAGCAUGU UGAACAUGCCCAUCAUCAUCCCAGGACUCAGUGAUGCUGUGCCAUCUAUUAGAAGAGGCC UUAUUUUCUCAAUUUUCUUCUUUGUUGAUUCAUUGAAGUACUUCAGGUCAAUGCUUGCUA GCAUUUCUGCUGGUAUUUGUGUUCGAAUCUUCAUUCUUUUACUCUCGAACAUGUACCCUU UCCCUAGUCUUGCCAUUUUGUUUGAGAACAUUAUGGGUGCCAUGCUCAGGAUGUUUCUGA ACCACUCGGGUUGAUUUCUGGUGAUAUAUGUAAUCAUCGCCAGGAACAUUCGAGGAUUUU GAUUUUCAUUCCACUUAGUGUUGUCCCCAGUGAUUGUGAAAGAAAUCUCUGUGUCUUGUG AAUUAGUCAUCAUCUUUCUCACAACAUUUGCCAGUUUGGCCUUCUUUUCAUUGCCCCCUA CUGGGAGCCCAGACUGUUCAAGCUUUUCGCAAAUGCUCCUAGCUAAAGUUUCAACAAAGU AUACGAAACCUCUAAUCUGCAUCCCAGGUGUUGCGAUAGCCCUUCUUUUUAACUUGCCUC UCUCUGCAUCUUUGGUCAUCGUAUUUAAUGUCAGGGCUCUUAUUAGAUAGCCUCUCUUAU UCAGUCUUUGUUUUUUCUUCCCUAUUGUUCUUUGCGUGACCAUCUUCUUGGUCAUGUUGU CUCUUACUCUCCUUUUUCUUUGAAAGUGGGUUGUUAUCUCUAUUUCCUCUUUGUUCAUUG AUUCCAUUACAUCCUUUAAGAAAUCUAUUAGCCUUCCUGACUCAUUAGCUGUUAGGCCAU UCGAUCUAAAGACUUCUAUGGUGUUGGCCAAUGCAGUUGCUGCCGGUUGAUUUCUGUUUA AUGUCCAAUCAUAAGUCUGGCGACCUUGAGUUAGUUUAUCUACCCUUGUUUGUUGAACAA CUUCCAUUGUUUCAAGGCAUGAAUUCUCAAAUAUUCCUGGGUGGGAUUCUUCAAGGAAAG CCAUAGCCUCUAGAACACAGUCUGUUUGUGCAUACCCACUUGGUUCAUUAUCCUCAGGUA GUGGUCCAUCAAUCGGGUUGAGCUGGGGUGCACCAGUCUCUGUGUUUGUCGUCCACUUUC CCUUUUCUGAGUAUUGGUGUGUUCUGUUUACUGUGUCCAUGGUGUAUCCUGUUCCUGUUC CAUGGCUGUAUGGAGGAUCUCCAGUAUAAGGGAAUGUGGUGCUUAUGGCAUUUUGCGCUG GAAUUUUUAAGAAAAGUAGAGUCGGAUUGACAUCCAUUCAAAUGGUUUGCCUGCUUUCGC
U
>CDS_de_PB1 (SEQ ID NO: 62)
5 ' -ATGGATGTCAATCCGACTCTACTTTTCTTAAAAATTCCAGCGCAAAATGCCATAAGCACC ACATTCCCTTATACTGGAGATCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATG GACACAGTAAACAGAACACACCAATACTCAGAAAAGGGAAAGTGGACGACAAACACAGAG ACTGGTGCACCCCAGCTCAACCCGATTGATGGACCACTACCTGAGGATAATGAACCAAGT GGGTATGCACAAACAGACTGTGTTCTAGAGGCTATGGCTTTCCTTGAAGAATCCCACCCA GGAATATTTGAGAATTCATGCCTTGAAACAATGGAAGTTGTTCAACAAACAAGGGTAGAT AAACTAACTCAAGGTCGCCAGACTTATGATTGGACATTAAACAGAAATCAACCGGCAGCA ACTGCATTGGCCAACACCATAGAAGTCTTTAGATCGAATGGCCTAACAGCTAATGAGTCA GGAAGGCTAATAGATTTCTTAAAGGATGTAATGGAATCAATGAACAAAGAGGAAATAGAG ATAACAACCCACTTTCAAAGAAAAAGGAGAGTAAGAGACAACATGACCAAGAAGATGGTC ACGCAAAGAACAATAGGGAAGAAAAAACAAAGACTGAATAAGAGAGGCTATCTAATAAGA GCCCTGACATTAAATACGATGACCAAAGATGCAGAGAGAGGCAAGTTAAAAAGAAGGGCT ATCGCAACACCTGGGATGCAGATTAGAGGTTTCGTATACTTTGTTGAAACTTTAGCTAGG AGCATTTGCGAAAAGCTTGAACAGTCTGGGCTCCCAGTAGGGGGCAATGAAAAGAAGGCC AAAC TGGCAAAT GT TGTGAG AAAG ATGAT GACTAATT C ACAAG ACAC AGAGAT TTC TTTC ACAATCACTGGGGACAACACTAAGTGGAATGAAAATCAAAATCCTCGAATGTTCCTGGCG ATGATTACATATATCACCAGAAATCAACCCGAGTGGTTCAGAAACATCCTGAGCATGGCA CCCATAATGTTCTCAAACAAAATGGCAAGACTAGGGAAAGGGTACATGTTCGAGAGTAAA AGAATGAAGATTCGAACACAAATACCAGCAGAAATGCTAGCAAGCATTGACCTGAAGTAC TTCAATGAATCAACAAAGAAGAAAATTGAGAAAATAAGGCCTCTTCTAATAGATGGCACA GCATCACTGAGTCCTGGGATGATGATGGGCATGTTCAACATGCTAAGTACGGTCTTGGGA GTCTCGATACTGAATCTTGGACAAAAGAAATACACCAAGACAATATACTGGTGGGATGGG CTCCAATCATCCGACGATTTTGCTCTCATAGTGAATGCACCAAACCATGAGGGAATACAA GCAGGAGTGGACAGATTCTACAGGACCTGCAAGTTAGTGGGAATCAACATGAGCAAAAAG
AAGTCCTATATAAATAAGACAGGGACATTTGAATTCACAAGCTTTTTTTATCGCTATGGA TTTGTGGCTAATTTTAGCATGGAGCTACCCAGCTTTGGAGTGTCTGGAGTAAATGAATCA GCTGACATGAGTATTGGAGTAACAGTGATAAAGAACAACATGATAAACAATGACCTTGGA CCTGCAACGGCCCAGATGGCTCTTCAATTGTTCATCAAAGACTACAGATACACATATAGG TGCCAT AGGGGAGAC ACAC AAAT TCAGACGAGAAG ATC ATTT GAGTTAAAGAAGC TGT GG GATCAAACCCAATCAAAGGTAGGGCTATTAGTATCAGATGGAGGACCAAACTTATACAAT ATACGGAATCTTCACATTCCTGAAGTCTGCTTAAAATGGGAGCTAATGGATGATGATTAT CGGGGAAGACTTTGTAATCCCCTGAATCCCTTTGTCAGTCATAAAGAGATTGATTCTGTA AACAATGCTGTGGTAATGCCAGCCCATGGTCCAGCCAAAAGCATGGAATATGATGCCGTT GCAACTACACATTCCTGGATTCCCAAGAGGAATCGTTCTATTCTCAACACAAGCCAAAGG GGAAT TCTT GAGGAT GAAC AGAT GTACCAGAAGT GCTGC AAT CTATTCGAGAAAT TT TTC CCTAGCAGTTCATATAGGAGACCGGTTGGAATTTCTAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCT AGGGCCCGGATTGATGCCAGGGTCGACTTCGAGTCTGGACGGATCAAGAAAGAAGAGTTC TCTGAGAT CAT GAAGAT CTGTTCCACCATTGAAGAAC T CAGACGGCAAAAATAA
> p ro te ín a PB1 (S E Q ID NO: 63 )
MDVNPTLLFLKIPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSEKGKWTTNTE TGAPQLNPIDGPLPEDNEPSGYAQTDCVLEAMAFLEESHPGIFENSCLETMEVVQQTRVD KLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIEVFRSNGLTANE SGRLIDFLKDVME SMNKEEIE ITTHFQRKRRVRDNMTKKMVTQRTIGKKKQRLNKRGYLIRALTLNTMTKDAERGKLKRRA IATPGMQIRGFVYFVETLARSICEKLEQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTEISF TITGDNTKWNENQNPRMFLAMITYITRNQPEWFRNILSMAPIMFSNKMARLGKGYMFESK R MÜT T R T1n T Pa R M T .ZiQ T n T.VV R M R QR R VV T R V T R PT.T. T n O.RZiQT.qp C M M M Q M T O M T.QR\7T.(Z VSILNLGQKKYTKTIYWWDGLQSSDDFALIVNAPNHEGIQAGVDRFYRTCKLVGINMSKK KSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGVNESADMSIGVTVIKNNMINNDLG PATAQMALQLFIKDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFELKKLWDQTQSKVGLLVSDGGPNLYN IRNLHIPEVCLKWELMDDDYRGRLCNPLNPFVSHKEIDSVNNAVVMPAHGPAKSMEYDAV ATTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQKCCNLFEKFFPSSSYRRPVGISSMVEAMVS RARIDARVDFESGRIKKEEFSEIMKICSTIEELRRQK*
>CDS_de_PB1-F2 (SEQ ID NO: 64)
ATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTAA
>Proteína_PB1-F2 (SEQ ID NO: 65)
MEQEQDTPWTQ*
Segmento de HA de la gripe:
>secuencia de ARN genómico (ARNv) de HA (SEQ ID NO: 66)
5' -AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUCUCAUGCUUCUGAAAUCCUAAUGUUAAAUACAUAUUCUA CACUGUAGAGACCCAUUAGAGCACAUCCAGAAACUGAUUGCCCCCAGGGAGACUACCAGU ACCAAUGAACUGGCGACAGUUGAAUAGAUCGCCAAAAUCUGGUAAAUCCUUGUUGAUUCC AGCUUUACCCCAUCUAUUUCUUCUCUGUUUAAUUUUGCUUCCUCUGAGUAUUUUGGGUAG UCAUAAGUCCCAUUUUUGACACUUUCCAUGCACGUGUUAUCGCAUUUGUGGUAAAAUUCA AAGCAGCCGUUUCCAAUUUCCUUGGCAUUGUUUUUUAGCUGGCUUCUUACCUUUUCAUAU AAGUUCUUCACAUUUGAAUCGUGGUAGUCCAAAGUUCUUUCAUUUUCCAAUAGAACCAAC AGUUCGGCAUUGUAAGUCCAAAUGUCCAGGAAACCAUCAUCAACUUUUUUAUUUAAAUUC UCUAUUCUUUUUUCCAGGUGGUUGAACUCUUUACCUACUGCUGUGAACUGUGUAUUCAUC UUUUCAAUAACAGAAUUUACUUUGUUAGUAAUCUCGUCAAUGGCAUUCUGUGUGCUCUUC AGGUCGGCUGCAUAUCCUGACCCCUGCUCAUUUUGAUGGUGAUAACCGUACCAUCCAUCU
ACCAUCCCUGUCCACCCCCCUUCAAUGAAACCGGCAAUGGCCCCAAAUAGGCCUCUAGAU UGAAUAGACGGGACAUUCCUCAAUCCUGUGGCCAGUCUCAAUUUUGUGCUUUUUACAUAU UUUGGACAUUUUCCAAUUGUGAUCGGAUGUAUAUUCUGAAAUGGGAGGCUGGUGUUUAUA GCACCCUUGGGUGUCUGACAAGUUGUAUUGCAAUCGUGGACUGGUGUAUCUGAAAUGAUA AUACCAGAUCCAGCAUUUCUUUCCAUUGCGAAUGCAUAUCUCGGUACCACUAGAUUUCCA GUUGCUUCGAAUGUUAUUUUGUCUCCCGGCUCUACUAGUGUCCAGUAAUAGUUCAUUCUC CCCUCUUGAUCCCUCACUUUGGGUCUUAUUGCUAUUUCCGGCUUGAACUUCUUGCUGUAU CUUGAUGACCCCACAAAAACAUAUGCAUCUGCAUUCUGAUAGAGACUUUGUUGGUCAGCA CUAGUAGAUGGAUGGUGAAUGCCCCAUAGCACGAGGACUUCUUUCCCUUUAUCAUUAAUG UAGGAUUUGCUGAGCUUUGGGUAUGAAUUUCCUUUUUUAACUAGCCAUAUUAAAUUUUUG UAGAAGCUUUUUGCUCCAGCAUGAGGACAUGCUGCCGUUACACCUUUGUUCGAGUCAUGA UUGGGCCAUGAACUUGUCUUGGGGAAUAUCUCAAACCUUUCAAAUGAUGACACUGAGCUC AAUUGCUCUCUUAGCUCCUCAUAAUCGAUGAAAUCUCCUGGGUAACACGUUCCAUUGUCU GAACUAGAUGUUUCCACAAUGUAGGACCAUGAGCUUGCUGUGGAGAGUGAUUCACACUCU GGAUUUCCCAGGAUCCAGCCAGCAAUGUUACAUUUACCCAAAUGCAAUGGGGCUACCCCU CUUAGUUUGCAUAGUUUCCCGUUAUGCUUGUCUUCUAGAAGGUUAACAGAGUGUGUUACU GUUACAUUCUUUUCUAGUACUGUGUCUACAGUGUCUGUUGAAUUGUUCGCAUGAUAACCU AUACAUAAUGUGUCUGCAUUUGCGGUUGCAAAUGUAUAUAGCAGAACUACUAGUAUUGCC UUCAUUUUUGUUGCUUUUGUUUUCCCCUGCUUUUGCU
>CDS_de_HA (SEQ ID NO: 67)
5 ' -ATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTA TGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAAT GTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAA CTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGA AATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCT AGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAG CAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGG CCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGC TTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAA TCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCT ACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCA TCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAA GAGGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAA GCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCT GGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAG GGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGT CCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCT ATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGG ATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCC GACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATT GAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGA ATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCC GAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAG AACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGC TGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACT TATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTA AAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCA TTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTA CAGTGTAGAATATGTATTTAA
>Proteína_HA (SEQ ID NO: 68)
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCK LRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFIDYEELRE QLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSK SYINDKGKEVLVLWG1HHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQ EGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPK GAINTSLPFQN1HPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTG MVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKR IENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNG CFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASS LVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI*
Segmento NP de la gripe:
> se cu e n c ia de A R N g e n ó m ico (A R N v) de N P (S E Q ID NO: 69 )
5 ' -AGUAGAAACAAGGGUAUUUUUCCUCAACUGUCAUACUCCUCUGCAUUGUCUCCGAAGAAA UAAGACCCUUCAUUACUCAUGUCAAAGGAAGGCACGAUCGGGUUCGUUGCCUUUUCGUCC GAGAGCUCGAAGACUCCCCGCCCCUGGAAGGACAAAUCUUCUGGCUUUGCACUUUCCAUC AUUCUUAUAACUUCUGUUCGCAUGUCGGAUGUCCGUCCUUCAUUGUUCCCGCUGAAUGCU GCCAUAACGGUUGCUCUUUCAAAAGGGAGAUUCCGCUGCACUGAGAAUGUAGGCUGCACA CUGAUCUGGCCUGCGGAUGCCUUUUGUUGAUUGGUAUUUCCUCCACUCCUGGUCCUUAUG GCCCAGUAUCUGCUUCUCAGUUCCAGGGUAUUGGAGUCCAUGGUUUCCACAUUCUCAUUU GAAGCAAUCUGGACCCCUCUUGUGGAAAGCUUUCCUCUUGGAAUCACUUUCUUUCCUCUU AUGAAACUUGAUACUCUUAAAUCUUCAAAUGCAGCAGAGUGGCAUGCCAUCCACACCAAU UGACUCUUGUGAGCUGGGUUUUCAUUUGGCCUCAUCAGGCUGACCACUUGGCUGUUUUGG AGUAAUUUGAAUGGGUCUAUCCCGACCAGUGAGUACCCUUCCCUUUCAAAGUCAUGCCCA CUUGCUACUGCAAGCCCAUACACACAAGCAGGCAGGCAGGAUUUAUGUGCAACUGAUCCC CUCAGAAUGAGUGCUGACCGUGCCAGGAAAAUGAGGUCUUCAAUCUCAGCGUUUCCUGGG UUUCGACUUUCUCUUACUUGAUCCAUCAUUGCCCUCUGGGCAGCUGUUUGAAAUUUUCCU UUGAGGAUAUUGCACAUUCUUUCAUAAGCAACCCUUGUCCUUCGUCCAUUUUCACCCCUC CAGAAAUUUCGGUCAUUGAUUCCACGUUUGAUCAUUCUGAUUAACUCCAUUGCUAUUGUU CCAACUCCUUUCACCGCAGCACCUGCGGCACCAGACCUUCUGGGAAGUGUUGAACCUUGC AUUAGAGAGCACAUUCUGGGAUCCAUUCCGGUGCGAACAAGCGCUCUUGUUCUCUGAUAU GUGGCAUCAUUCAGGUUGGAAUGCCAAAUCAUGAUAUGAGUAAGACCUGCUGUUGCAUCU UCGCCAUUGUUUGCUUGGCGCCAAACUCUCCUUAUUUCUUCUUUGUCAUAAAGGAUGAGU UCUCUCAUCCACUUUCCGUCUACUCUUCUAUAUAUGGGUCCUCCUGUUUUCUUAGGGUCC UUCCCAGCACUGGGAUGCUCUUCUAGGUAUUUAUUUCUUCUCUCAUCAAAAGCAGAAAGC ACCAUCCUCUCUAUUGUUAUGCUAUUCUGGAUUAGUCGUCCAUCAUAAUCACUGAGUUUG AGUUCAGUGCACAUUUGGAUGUAGAAUCUCCCGAUUCCACCAAUCAUUCUUCCGACAGAU GCUCUGAUUUCUGUGGCAUCCUGGCGCUCCCCACCAGUCUCCAUUUGUUCAUAUGAUCGU UUGGUGCCUUGAGACGCCAUGGCUUCGAUGUCACUCAUUGAGUGAUUAUCUACCCUGCUU UUGCU
>CDS_de_NP (SEQ ID NO: 70)
5' -ATGGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCATATGAACAAATGGAGACTGGTGGGGAGCGCCAG GATGCCACAGAAATCAGAGCATCTGTCGGAAGAATGATTGGTGGAATCGGGAGATTCTAC ATCCAAATGTGCACTGAACTCAAACTCAGTGATTATGATGGACGACTAATCCAGAATAGC
ATAACAATAGAGAGGATGGTGCTTTCTGCTTTTGATGAGAGAAGAAATAAATACCTAGAA GAGCATCCCAGTGCTGGGAAGGACCCTAAGAAAACAGGAGGACCCATATATAGAAGAGTA GACGGAAAGTGGATGAGAGAACTCATCCTTTATGACAAAGAAGAAATAAGGAGAGTTTGG CGCCAAGCAAACAATGGCGAAGATGCAACAGCAGGTCTTACTCATATCATGATTTGGCAT TCCAACCTGAATGATGCCACATATCAGAGAACAAGAGCGCTTGTTCGCACCGGAATGGAT CCCAGAATGTGCTCTCTAATGCAAGGTTCAACACTTCCCAGAAGGTCTGGTGCCGCAGGT GCTGCGGTGAAAGGAGTTGGAACAATAGCAATGGAGTTAATCAGAATGATCAAACGTGGA ATCAATGACCGAAATTTCTGGAGGGGTGAAAATGGACGAAGGACAAGGGTTGCTTATGAA AGAATGTGCAATATCCTCAAAGGAAAATTTCAAACAGCTGCCCAGAGGGCAATGATGGAT CAAGTAAGAGAAAGTCGAAACCCAGGAAACGCTGAGATTGAAGACCTCATTTTCCTGGCA CGGTCAGCACTCATTCTGAGGGGATCAGTTGCACATAAATCCTGCCTGCCTGCTTGTGTG TATGGGCTTGCAGTAGCAAGTGGGCATGACTTTGAAAGGGAAGGGTACTCACTGGTCGGG ATAGACCCATTCAAATTACTCCAAAACAGCCAAGTGGTCAGCCTGATGAGGCCAAATGAA AACCCAGCTCACAAGAGTCAATTGGTGTGGATGGCATGCCACTCTGCTGCATTTGAAGAT TTAAGAGTATCAAGTTTCATAAGAGGAAAGAAAGTGATTCCAAGAGGAAAGCTTTCCACA AGAGGGGTCCAGATTGCTTCAAATGAGAATGTGGAAACCATGGACTCCAATACCCTGGAA CTGAGAAGCAGATACTGGGCCATAAGGACCAGGAGTGGAGGAAATACCAATCAACAAAAG GCATCCGCAGGCCAGATCAGTGTGCAGCCTACATTCTCAGTGCAGCGGAATCTCCCTTTT GAAAGAGCAACCGTTATGGCAGCATTCAGCGGGAACAATGAAGGACGGACATCCGACATG CGAACAGAAGTTATAAGAATGATGGAAAGTGCAAAGCCAGAAGATTTGTCCTTCCAGGGG CGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGAC ATGAGTAATGAAGGGTCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTATGACAGTTGA
>Proteína_NP (SEQ ID NO: 71)
MASQGTKRSYEQMETGGERQDATEIRASVGRMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYDGRLIQNS ITIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVDGKWMRELILYDKEEIRRVW RQANNGEDATAGLTHIMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAG AAVKGVGTIAMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRVAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMD QVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGHDFEREGYSLVG IDPFKLLQNSQVVSLMRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGKKVIPRGKLST RGVQIASNENVETMDSNTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQKASAGQISVQPTFSVQRNLPF ERATVMAAFSGNNEGRTSDMRTEVIRMMESAKPEDLSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFD MSNEGSYFFGDNAEEYDS *
Segmento NA de la gripe:
>secuencia de ARN genómico (ARNv) de NA (SEQ ID NO: 72)
5 ' -AGUAGAAACAAGGAGUUUUUUGAACAAAUUACUUGUCAAUGGUAAAUGGCAACUCAGCAC CGUCUGGCCAAGACCAACCCACAGUGUCACUGUUUACACCACAAAAGGAUAUGCUGCUCC CGCUAGUCCAGAUUGUGUUCUCUUUGGGUCGCCCUCUGAUUAGUUCAACCCAGAAGCAAG GUCUUAUACAAUCCAGCCCUGUUAGUUCUGGAUGCUGAACAAAACUCCCGCUAUAUCCUG ACCACUCAUUUAUUCCUACGAUAUCUUGCUUUAUUGAGAAGUUAUUGUCUGUCCCAGUCC AUCCGUUCGGAUCCCAAAUCAUCUCAAAACCGUUUCUUGAACUAAUGCUUUUAGUUCUCC CUAUCCAAACACCAUUGCCGUAUUUGAAUGAAAAUCCUUUUACUCCAUUUGCUCCAUUAG ACGAUACUGGACCACAACUGCCUGUCUUAUCAUUAGGGCGUGGAUUGUCUCCGAAAAUCC CACUGCAUAUGUAUCCUAUCUGAUAUUCCAGAUUCUGGUUGAAAGACACCCACGGUCGAU UCGAGCCAUGCCAGUUAUCCCUGCACACACAUGUGAUUUCACUAGAAUCAGGAUAACAGG AGCAUUCCUCAUAGUGAUAAUUAGGGGCAUUCAUUUCGACUGAUUUGACUAUCUUUCCCU UUUCUAUUCUGAAGAUCUUGUAUGAGGCCUGUCCAUUACUUGGUCCAUCGGUCAUUACAG
UAAAGCAAGAACCAUUUACACAUGCACAUUCAGACUCUUGUGUUCUCAAUAUAUUGUUUC UCCAACUCUUGAUAGUGUCUGUUAUUAUGCCGUUGUACUUUAACACAGCCACUGCCCCAU UGUCUGGGCCAGAAAUUCCAAUUGUUAGCCAAUUGAUGCCAUCAUGACAAGCACUUGCUG ACCAAGCGACUGACUCAAAUCUUGAGUUGUAUGGAGAGGGAACUUCACCAAUAGGACAGC UCAUUAGGGUUCGAUAUGGGCUCCUGUCUUUAAUGGUUCCAUUGGAAUGUUUGUCAUUUA GCAAGGCCCCUUGAGUCAAGAAGAAGGUUCUGCAUUCCAAGGGGGAGCAUGAUAUGAAUG GUUCCCUUAUGACAAACACAUCCCCCUUGGAACCGAUUCUUACACUGUUGUCUUUACUGU AUAUAGCCCAUCCACUAACAGGGCAGAGAGAGGAAUUGCCCGCUAAUUUCACGGAAACCA CUGACUGUCCAGCAGCAAAGUUGGUGUUGCUGAUGUUAACAUAUGUCUGAUUUACCCAAG UGUUGUUUUCAUAAGUAAUGACGCUUUGAUUGCAUGUUUCAAUCUGAUUUUGAUUCCCAA GUUGAAUUGAGUGGCUAAUCCAUAUUGAGAUUAUGUUUCCAAUUUGUAAUAUUAAGUUAG CCAUUCCAAUUGUCAUACAGACCGAACCAAUGGUUAUUAUCUUUUGGUUUGGAUUCAUUU UAAACUCCUGCUUUUGCU
>CDS_de_NA (SEQ ID NO: 73)
5 ' -ATGAATCCAAACCAAAAGATAATAACCATTGGTTCGGTCTGTATGACAATTGGAATGGCT AACTTAATATTACAAATTGGAAACATAATCTCAATATGGATTAGCCACTCAATTCAACTT GGGAATCAAAATCAGATTGAAACATGCAATCAAAGCGTCATTACTTATGAAAACAACACT TGGGTAAATCAGACATATGTTAACATCAGCAACACCAACTTTGCTGCTGGACAGTCAGTG GTTTCCGTGAAATTAGCGGGCAATTCCTCTCTCTGCCCTGTTAGTGGATGGGCTATATAC AGTAAAGACAACAGTGTAAGAATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTCATAAGGGAACCA TTCATATCATGCTCCCCCTTGGAATGCAGAACCTTCTTCTTGACTCAAGGGGCCTTGCTA AATGACAAACATTCCAATGGAACCATTAAAGACAGGAGCCCATATCGAACCCTAATGAGC TGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTCTCCATACAACTCAAGATTTGAGTCAGTCGCTTGGTCA GCAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAATTGGCTAACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAAT GGGGCAGTGGCTGTGTTAAAGTACAACGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGA AACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTACT GTAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATAGAAAAG GGAAAGATAGTCAAATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCC TGTTATCCTGATTCTAGTGAAATCACATGTGTGTGCAGGGATAACTGGCATGGCTCGAAT CGACCGTGGGTGTCTTTCAACCAGAATCTGGAATATCAGATAGGATACATATGCAGTGGG ATTTTCGGAGACAATCCACGCCCTAATGATAAGACAGGCAGTTGTGGTCCAGTATCGTCT AATGGAGCAAATGGAGTAAAAGGATTTTCATTCAAATACGGCAATGGTGTTTGGATAGGG AGAACTAAAAGCATTAGTTCAAGAAACGGTTTTGAGATGATTTGGGATCCGAACGGATGG ACTGGGACAGACAATAACTTCTCAATAAAGCAAGATATCGTAGGAATAAATGAGTGGTCA GGATATAGCGGGAGTTTTGTTCAGCATCCAGAACTAACAGGGCTGGATTGTATAAGACCT TGCTTCTGGGTTGAACTAATCAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATCTGGACTAGCGGG AGCAGCATATCCTTTTGTGGTGTAAACAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGT GCTGAGTTGCCATTTACCATTGACAAGTAA
>Proteina_NA (SEQ ID NO: 74)
MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQNQIETCNQSVITYENNT WVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREP FISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWS ASACHDGINWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFT VMTDGPSNGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSN RPWVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIG RTKSISSRNGFEMIWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRP CFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK*
Segmento M de la gripe:
>secuencia de ARN genómico (ARNv) de M (SEQ ID NO: 75)
5 ' -AGUAGAAACAAGGUAGUUUUUUACUCUAGCUCUAUGUUGACAAAAUGACCAUCGUCAACA UCCACAGCACUCUGCUGUUCCUGUUGAUAUUCUUCCCUCAUGGACUCAGGCACUCCUUCC GUAGAAGGCCCUCUUUUCAAACCGUAUUUAAAGCGACGAUAAAUACAUUUGAAAAAAAGA CGAUCAGUAAUCCACAAUAUCAGGUGCAAGAUCCCAAUGAUAUUUGCUGCAAUGACGAGA GGAUCACUUGAAUCGCUGCAUCUGCACUCCCAUUCGCUUCUGGUAGGCCUGCAAAUUUUC AAGAAGGUCAUCUUUCAGACCAGCACUGGAGCUAGGAUGAGUCCCAAUAGUUCUCAUUGC AUGUACCAUCUGCCUAGUCUGAUUAGCAACCUCCAUGGCCUCCGCUGCCUGUUCACUCGA UCCAGCCAUCUGUUCCAUAGCCUUUGCCGUAGUGCUAGCCAGCACCAUUCUGUUUUCAUG
AAUCUGUUCACAAGUGGCACACACUAGACCAAAAGCAGCUUCUGUGGUCACUGUUCCCAU CCUGUUGUAUAUGAGGCCCAUGCAACUGGCAAGUGCACCAGUUGAAUAGCUUAGUGACAC CUCCUUGGCCCCAUGGAACGUUAUUUCUCUUUUGAGCUUCUUGUAUAGUUUAACUGCUCU AUCCAUGUUGUUCGGGUCCCCAUUCCCAUUUAGGGCAUUUUGGACAAAGCGUCUACGCUG CAGUCCUCGCUCACUGGGCACGGUGAGCGUGAACACAAAUCCUAAAAUUCCCUUAGUCAG AGGUGACAAGAUUGGUCUUGUCUUUAGCCAUUCCAUGAGAGCCUCAAGAUCUGUGUUCUU UCCUGCAAAGACACUUUCCAGUCUCUGCGCGAUCUCGGCUUUGAGGGGGCCUGACGGGAU GAUAGAAAGAACGUACGUUUCGACCUCGGUUAGAAGACUCAUCUUUAAAUAUCUACCUGC UUUUGCU
>CDS_de_M1 (SEQ ID NO: 76)
5' -ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTTTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTC AAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAACACAGATCTTGAG GCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTA GGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTC CAAAATGCCCTAAATGGGAATGGGGACCCGAACAACATGGATAGAGCAGTTAAACTATAC AAGAAGCTCAAAAGAGAAATAACGTTCCATGGGGCCAAGGAGGTGTCACTAAGCTATTCA ACTGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGAACAGTGACCACA GAAGCTGCTTTTGGTCTAGTGTGTGCCACTTGTGAACAGATTGCTGATTCACAGCATCGG TCTCACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAAAACAGAATGGTG CTGGCTAGCACTACGGCAAAGGCTATGGAACAGATGGCTGGATCGAGTGAACAGGCAGCG GAGGCCATGGAGGTTGCTAATCAGACTAGGCAGATGGTACATGCAATGAGAACTATTGGG ACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAGATGACCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTAC CAGAAGCGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGA
>Proteína_Ml (SEQ ID NO: 77)
MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLESVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGIL GFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLYKKLKREITFHGAKEVSLSYS TGALASCMGLIYNRMGTVTTEAAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMATTTNPLIRHENRMV LASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVANQTRQMVHAMRTIGTHPSS SAGLKDDLLENLQAY QKRMGVQMQRFK*
> C D S _ d e _ M 2 (S E Q ID NO: 78)
5 ' -ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAAGCGAATGGGAGTGCAGATGCAGC GATTCAAGTGATCCTCTCGTCATTGCAGCAAATATCATTGGGATCTTGCACCTGATATTG TGGATTACTGATCGTCTTTTTTTCAAATGTATTTATCGTCGCTTTAAATACGGTTTGAAA
AGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCTGAGTCCATGAGGGAAGAATATCAACAGGAACAG CAGAGTGCTGTGGATGTTGACGATGGTCATTTTGTCAACATAGAGCTAGAGTAA
>Proteína_M2 (SEQ ID NO: 79)
MSLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDPLVIAANIIGILHLILWITDRLFFKCIYRRFKYGLK RGPSTEGVPESMREEYQQEQQSAVDVDDGHFVNIELE*
Segmento NS de la gripe:
>secuencia de ARN genómico (ARNv) de NS (SEQ ID NO: 80)
5' -AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUAUCAUUAAAUAAGCUGAAACGAGAAAGCUCUUAUCUCU UGUUCUACUUCAAGCAGUAGUUGUAAGGCUUGCAUAAAUGUUAUUUGUUCGAAACUAUUC UCUGUCGCUUUCAAUCUGUGCCGCAUUUCUUCAAUUAACCACCUUAUUUCCUCAAAUUUC UGUCCCAAUUGCUCUCGCCACUUUUCAUUUCUGCUCUGGAGGUAGUGAAGGUCUCCCAUU CUCAUCACAGUUUCUCCAAGCGAAUCUCUGUAUAUUUUCAGAGACUCGAACCGUGUUACC AUUCCAUUCAAGUCCUCCGAUGAGGACCCCAACUGCAUUUUUGACAUCCUCAUAAGUAUG UCCUGGAAGAGAAGGUGAUGGUGAAAUUUCUCCAACUAUUGCUCCCUCCUCAGUGAAAGC CCUUAGUAGUAUCAAGGUCUCUAAUCGGUUAAAGAUUACACUGAAGUUCGCUUUCAGUAC UAUGUUCUUUUCCAUGAUCGCCUGGUCCAAUCGCACGCAAAGAGGGCCUAUUAUCUUUUG CCUAGGCAUGAGCAUGAACCAGUCUCGUGACAUUUCCUCGAGGGUCAUGUCAGAAAGGUA GCGCGAAGUAGGUACAGAUGCAAUUGUCAUUCUAAGUGUCUCGCUGGAUUCCUCUUUCAA UAUCCAUUCCACGAUUUGUUUCCCAACAAGAGUGGCUGUUUCGAUAUCGAGGCCAAGGGU GUUGCCUCUUCCUUUUAAGGACUUUUGAUCUCGGCGGAGCCGAUCAAGGAAUGGGGCAUC ACCCAAUCCAUUGUCUGCAAAUCGCUUGCGGAUAUGCCAAAGGAAACAGUCUACCUGAAA GCUUGACAUGGUGUUGGAGUCCAUUAUGUUUUUGUCACCCUGCUUUUGCU
>CDS_de_NS1 (SEQ ID NO: 81)
5' -ATGGACTCCAACACCATGTCAAGCTTTCAGGTAGACTGTTTCCTTTGGCATATCCGCAAG CGATTTGCAGACAATGGATTGGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTCCGCCGAGATCAA AAGTCCTTAAAAGGAAGAGGCAACACCCTTGGCCTCGATATCGAAACAGCCACTCTTGTT GGGAAACAAATCGTGGAATGGATATTGAAAGAGGAATCCAGCGAGACACTTAGAATGACA ATTGCATCTGTACCTACTTCGCGCTACCTTTCTGACATGACCCTCGAGGAAATGTCACGA GACTGGTTCATGCTCATGCCTAGGCAAAAGATAATAGGCCCTCTTTGCGTGCGATTGGAC CAGGCGATCATGGAAAAGAACATAGTACTGAAAGCGAACTTCAGTGTAATCTTTAACCGA TTAGAGACCTTGATACTACTAAGGGCTTTCACTGAGGAGGGAGCAATAGTTGGAGAAATT TCACCATCACCTTCTCTTCCAGGACATACTTATGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGGGTC CTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGGTAACACGGTTCGAGTCTCTGAAAATATACAGAGA TTCGCTTGGAGAAACTGTGATGAGAATGGGAGACCTTCACTACCTCCAGAGCAGAAATGA
>P ro te ína _N S 1 (S E Q ID NO: 82)
MDSNTMSSFQVDCFLWHIRKRFADNGLGDAPFLDRLRRDQKSLKGRGNTLGLDIETATLV
GKQIVEWILKEESSETLRMTIASVPTSRYLSDMTLEEMSRDWFMLMPRQKIIGPLCVRLD
QAIMEKNIVLKANFSVIFNRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPSPSLPGHTYEDVKNAVGV
LIGGLEWNGNTVRVSENIQRFAWRNCDENGRPSLPPEQK*
>CDS_de_NS2 (SEQ ID NO: 83)
5' -
ATGGACTCCAACACCATGTCAAGCTTTCAGGACATACTTATGAGGATGTCAAAAATGCAG
TTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGGTAACACGGTTCGAGTCTCTGAAAATA
TACAGAGATTCGCTTGGAGAAACTGTGATGAGAATGGGAGACCTTCACTACCTCCAGAGC
AGAAATGAAAAGTGGCGAGAGCAATTGGGACAGAAATTTGAGGAAATAAGGTGGTTAATT
GAAGAAATGCGGCACAGATTGAAAGCGACAGAGAATAGTTTCGAACAAATAACATTTATG
CAAGCCTTACAACTACTGCTTGAAGTAGAACAAGAGATAAGAGCTTTCTCGTTTCAGCTT
ATTTAA
>Proteína_NS2 (SEQ ID NO: 84)
MDSNTMSSFQDILMRMSKMQLGSSSEDLNGMVTRFESLKIYRDSLGETVMRMGDLHYLQS
RNEKWREQLGQKFEEIRWLIEEMRHRLKATENSFEQITFMQALQLLLEVEQEIRAFSFQL
I*
Resultados
Reprogramación de un genoma vírico para que tenga una mayor proclividad a mutaciones no codificantes, sin tener impacto en la cinética de replicación. El objetivo fue evaluar el efecto del cambio de una ubicación de virus en el espacio de secuencia a regiones menos "hospitalarias" que aumentan su propensión a generar mutaciones no codificantes. Sin embargo, la alteración de la localización en el espacio de secuencia requiere cambios en la secuencia de nucleótidos, que puede dar como resultado factores de confusión, tales como cambios en la secuencia de aminoácidos o la estructura de ARN o la introducción del sesgo de nucleótidos y codones. Para minimizar estos factores, se eligió la región codificante de la proteína estructural P1 del genoma (véase el ejemplo 1 anterior) que no contiene elementos significativos de estructura de ARN o de replicación/traducción. De hecho, esta región puede eliminarse o reemplazarse por completo por secuencias exógenas, sin afectar a la replicación o empaquetado del genoma. Se eligió introducir únicamente cambios sinónimos, de tal forma que las proteínas producidas por el nuevo virus tienen la misma secuencia de aminoácidos y conservan las mismas funciones que el virus de tipo silvestre. También se eligió cambiar los codones por solo dos aminoácidos con la máxima redundancia de codones (leucina y serina) por dos motivos: 1) se quiso limitar el cambio general en la secuencia de nucleótidos a menos de un 5 % de la secuencia de genoma total y 2) se seleccionaron codones en los que las mutaciones podrían tener el impacto más significativo en la viabilidad. De los seis codones de Leu y los seis de Ser, se identificó una categoría que se denominó de "1-hasta-parada", debido a que los cambios de un solo nucleótido en estos codones podría dar como resultado mutaciones de parada (véase el ejemplo 1 anterior; véase la figura 1). Debido a que el genoma vírico se traduce en una sola poliproteína que se escinde en las proteínas víricas individuales necesarias para replicar el virus, una mutación de parada en la región P1 podría "matar" al virus. Por lo tanto, se generó un virus de Coxsackie de "1-hastaparada" en el que se cambiaron los 117 codones de Ser y Leu del virus de tipo silvestre de manera sinónima a los codones de la categoría de "1-hasta-parada". Anteriormente, Atkinson et al. demostraron que los aumentos en los dinucleótidos de CpG y UpA así como el reordenamiento de codones podrían ser responsables de la atenuación observada de virus de ARN en cultivo celular, mientras que las reducciones podrían mejorar la cinética de reacción (Atkinson et al. 2014). En comparación, no se introdujeron cambios significativos en la frecuencia de dinucleótidos de CpG y UpA el 1-hasta-parada (Fig. 12B) que pudieran confundir las presentes observaciones. En otros estudios de reordenamiento de codones, se observó que la introducción de sesgo de pares de codones era responsable de la atenuación del virus. Una vez más, se confirmó que el virus de 1-hasta-parada no presentó un cambio significativo en el sesgo de pares de codones (Fig. 12C). Además, se confirmó que los factores anteriormente mencionados y las potenciales alteraciones en el plegamiento de ARN no alteraron significativamente la cinética de replicación de la solución madre del virus de 1-hasta-parada y después de cinco pases en cultivo de tejido (véanse las figuras 4A-4E; véase el ejemplo 1). Ninguno de los 117 cambios de codones de Leu y Ser se revirtieron o mutaron al nivel de consenso durante el pase, lo que indica que las modificaciones del genoma eran genéticamente estables. La retención de la capacidad replicativa de tipo silvestre se confirmó adicionalmente mediante ensayos de replicación in vitro, en los que se dejó replicarse el ARN de virus transcrito in vitro en presencia de complejos de replicación aislados de células infectadas (véase la figura 2 y véase el ejemplo 1).
El virus de 1-hasta-parada tiene una menor aptitud y es hipersensible a la mutación. Dadas las altas tasas de mutación de los virus de ARN, podría esperarse que el virus de 1-hasta-parada sea más sensibles a los efectos de la mutación (menor robustez mutacional) debido a su mayor probabilidad de generar mutaciones de parada. Este efecto podría exacerbarse cuando se aumenta la tasa de mutación. Por tanto, se determinó la aptitud relativa de los virus de tipo silvestre y de 1-hasta-parada cuando se cultivaron con cinco tratamientos mutagénicos diferentes: los análogos de base mutagénica ribavirina, 5-fluorouracilo y 5-azacitidina; amilorida, que altera las concentraciones intracelulares de Mg2+ y Mn2+ que son cofactores esenciales de la polimerasa vírica; y Mn2 en sí, que aumenta la tasa de error de la polimerasa. En los cinco casos, el virus de 1-hasta-parada presentó una aptitud significativamente menor (Fig. 13A). Como otra medida del efecto de la mutación en la aptitud de los virus, se determinó el tamaño medio de la placa para los virus tratados con los tres análogos de base mutagénica. El virus de 1-hasta-parada produjo placas significativamente más pequeñas en los tres casos (Fig. 13B). La distribución de los valores de aptitud entre el virus de tipo silvestre y de 1-hasta-parada en condiciones mutagénicas revela que una mayor proporción de las muestras de tipo silvestre presenta una aptitud positiva en comparación con el virus de 1-hasta-parada (Fig. 13C) y que el cambio relativo en la aptitud para el virus de 1-hasta-parada en comparación con el tipo silvestre es altamente significativo (Fig. 13D). Debido a que se espera que los cambios por codones sinónimos del virus de 1-hasta-parada alteren el espacio de secuencia disponible para el virus y por lo tanto, los mutantes que esta población pueden generar, se pasaron 15 poblaciones de tipo silvestre y 15 de 1-hasta-parada durante cinco pases y se caracterizaron los cambios que surgieron por mutación en los 117 sitios codónicos alterados de Leu/Ser (Fig. 13E). Los datos demuestran que aunque son relativamente estables, los virus de 1-hasta-parada presentan variantes que han regenerado algunos codones de tipo silvestre con una baja frecuencia: por ejemplo, los codones de leucina de TAA/TTG de "1-hastaparada" se han mutado a CTA/CTG. Adicionalmente, el cambio del espacio de secuencia del virus de 1-hasta-parada ha impedido su capacidad para generar mutaciones de aminoácidos encontradas en todas las poblaciones de virus de tipo silvestre: por ejemplo, los mutantes de isoleucina y prolina. De manera importante, los datos demuestran que las poblaciones de virus de 1-hasta-parada generan más mutaciones de parada que los virus de tipo silvestre. Para cuantificar mejor esta observación, se llevó a cabo una secuenciación profunda de los virus de tipo silvestre y de 1-hasta-parada cultivados en bajas (Fig. 13F) y altas (Fig. 13G) de mutágenos de ARN. Las poblaciones de virus de 1-hasta-parada contienen una proporción significativamente mayor de genomas con mutaciones de Parada en comparación con el tipo silvestre.
El virus de 1-hasta-parada está atenuado y genera más mutaciones de parada in vivo. Para evaluar si el reposicionamiento del virus en una región de espacio de secuencia que aumenta su propensión por mutaciones sin sentido puede ocasionar atenuación, se administró a los ratones una dosis subletal de virus de tipo silvestre o de 1-hasta-parada y se determinaron los títulos víricos a lo largo de los siete días de la infección aguda. Aunque el virus de 1-hasta-parada se replicó con una cinética de tipo silvestre durante los cinco primeros días de infección, dejó de ser detectable en el páncreas y el corazón en el día siete (véanse las figuras 9A-9B; véase el ejemplo 1). Aunque el ARN siguió pudiendo detectarse a los sietes días de la infección, no pudo recuperarse virus viable de los tejidos y la infectividad específica de la población de virus descendiente fue significativamente menor que el tipo silvestre (Fig. 14A). Se evaluó adicionalmente el perfil atenuado del virus de 1-hasta-parada en ratones a los que se administró una dosis letal de virus de tipo silvestre y la dosis equivalente de virus de 1-hasta-parada, para el que se observó una proporción significativamente mayor de supervivencia (Fig. 14B). Finalmente, se secuenciaron en profundidad muestras de virus del corazón y el páncreas de ratones infectados para confirmar que el virus de 1-hasta-parada generó más mutaciones de parada in vivo (Fig. 14C), como se observó en cultivo tisular (Fig. 13E-G).
Puede aplicarse de manera más general direccionamiento de mutación sin sentido del virus en el espacio de secuencia. Para investigar la factibilidad de la alteración del espacio de secuencia para hacer que un virus sea más propenso a las mutaciones no codificantes de una manera más general, se aplicó una estrategia similar al virus de la gripe A, un virus de ARN considerablemente diferente con un genoma segmentado de sentido negativo. En este caso, se alteró el segmento que codifica el gen de PA polimerasa en todos de sus 100 codones de Ser/Leu para que presenten únicamente codones de la categoría de 1-hasta-parada (Fig. 12A). Se generaron soluciones madre de virus y se determinó la cinética de replicación de virus en el pase cinco a una multiplicidad de la infección baja (Fig. 15A) y alta (Fig. 15B). No se observaron diferencias significativas entre el virus de 1-hasta-parada y de tipo silvestre. Se pasaron 20 replicados de tipo silvestre y 20 de 1-hasta-parada cinco veces en cultivo tisular y se secuenciaron en profundidad las poblaciones para evaluar la minoría de mutaciones que surgen en cada población en los 100 sitios de codones alterados, como se llevó a cabo para el virus de Coxsackie (Fig. 13E). Los perfiles resultantes fueron similares a los observados para el virus de Coxsackie: tendencia a regenerar algunos codones de Ser/Leu de tipo silvestre; incapacidad para generar algunos aminoácidos diferentes (por ejemplo, prolinas, glutaminas, isoleucinas); una incidencia aumentada de mutaciones de parada (Fig. 15C). Se pasó virus de tipo silvestre y de 1-hasta-parada a bajas concentraciones de compuestos mutagénicos y se cuantificó el número de codones de parada en las lecturas de secuencia de estas muestras. Las poblaciones de 1-hasta-parada presentaron una frecuencia significativamente mayor de mutaciones de parada en las lecturas de secuenciación, en comparación con el virus de tipo silvestre (Fig. 15D). Finalmente, se infectó a los ratones por vía intranasal con 105 TCID50 de virus de tipo silvestre o de 1-hastaparada y se recogió tejido del tracto respiratorio completo a los tres y cinco días después de la infección. Los títulos de virus en estos tejidos fueron menores en los ratones infectados con 1-hasta-parada (Fig. 15E), lo que confirma su atenuación in vivo.
La combinación de un espacio de secuencia desfavorecedor y el aumento intrínseco de la tasa de mutación da como
resultado un virus atenuado de manera óptima. Los presentes resultados demuestran que la relocalización de un virus en una región no favorable del espacio de secuencia, donde el error de copia tiene una mayor probabilidad de generar mutaciones sin sentido, puede atenuar a los virus. El tratamiento de estos virus con mutágenos de ARN para aumentar extrínsecamente las tasas de error dio como resultado una pérdida aún mayor de la infectividad en tejido tisular. Anteriormente, se aislaron y caracterizaron variantes de polimerasa vírica que aumentan extrínsecamente las mutaciones con frecuencias de error que se asemejan al tratamiento mutagénico (Gnadig et al. 2012). Por lo tanto, se combinaron estas estrategias, insertando el cambio de aminoácidos I230F en la polimerasa vírica, que confiere baja fidelidad y aumenta la frecuencia de mutaciones en 3 veces, en el virus de 1-hasta-parada. Después, se infectó a los ratones con los virus de tipo silvestre, de 1-hasta-parada o de 1-hasta-parada I230F de baja fidelidad y se cuantificaron los títulos víricos en los páncreas (Fig. 16A), corazones (Fig. 16B) y bazos (Fig. 16C) a lo largo de los siete días de infección. Los resultados indican que el grado de atenuación aumenta significativamente para la versión de baja fidelidad del virus de 1-hasta-parada. Los títulos de virus son indetectables en los órganos de ratones tan pronto como tres días después de la infección y no son detectables en ningún órgano de los ratones a los siete días de la infección. Por consiguiente, una curva de supervivencia de ratones que recibieron una dosis letal de virus de tipo silvestre y una dosis equivalente de un virus de 1-hasta-parada de baja fidelidad reveló que este último estaba completamente atenuado (Fig. 16D).
Los virus de 1-hasta-parada y de 1-hasta-paradaBajaFidelidad protege frente a la exposición letal y genera altos niveles de anticuerpos neutralizantes. Para confirmar que la variante de 1-hasta-paradaBajaFidelidad también se atenuaba a altas dosis, se infectó a los ratones con una dosis letal de tipo silvestre y la dosis equivalente de ambas construcciones de 1-hasta-parada. La curva de supervivencia mostró que ambos virus de 1-hasta-parada estaban altamente atenuados (Fig. 17A). Antes de exponerse a la infección, se recogió sangre de los ratones y se cuantificó la cantidad de anticuerpo neutralizante (Fig. 17B). Todos los ratones inmunizados con cualquiera de las construcciones de 1-hasta-parada produjeron altos niveles de anticuerpo neutralizante.
EJEMPLO 6: Mutantes de "Súper-parada" del virus de Coxsackie (región P1)
Se generó un mutante de "súper-parada" del virus de Coxsackie como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior reemplazando los codones de Leu y Ser de la secuencia codificante de P1 por codones sinónimos de 1-hasta-parada (como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior) y adicionalmente, reemplazando los codones de Arg y Gly de la secuencia codificante de P1 por codones sinónimos de 1-hasta-parada.
La secuencia de la secuencia codificante de P1 de este mutante de "súper-parada" del virus de Coxsackie se muestra a continuación.
>Secuencia de ADN de súper-parada de CVB3 (2562nt; SEQ ID NO: 85)
ATGGGAGCTCAAGTATCAACGCAAAAGACTGGAGCACATGAGACCAGATTGAATGCTTCGGGAAATTCGA
TCATTCACTACACAAATATTAATTATTACAAGGATGCCGCATCGAACTCAGCCAATCGACAGGATTTCAC
TCAAGACCCGGGAAAGTTCACAGAACCAGTGAAAGATATCATGATTAAATCATTACCAGCTTTGAACTCG
CCCACAGTAGAGGAGTGCGGATACTCAGACAGAGCGAGATCAATCACATTAGGAAACTCGACCATAACGA
CTCAGGAATGCGCCAACGTGGTGGTGGGATATGGAGTATGGCCAGATTATTTAAAGGATTCAGAGGCAAC
AGCAGAGGACCAACCGACCCAACCAGACGTTGCCACATGTAGATTCTATACCTTAGACTCAGTGCAATGG
CAGAAAACCTCACCAGGATGGTGGTGGAAGTTGCCCGATGCTTTGTCGAACTTAGGATTGTTTGGACAGA
ACATGCAGTACCACTACTTAGGACGAACTGGATATACCGTACATGTGCAGTGCAATGCATCAAAGTTCCA
CCAAGGATGCTTGTTAGTAGTGTGTGTACCGGAAGCTGAGATGGGATGCGCAACGTTAGACAACACCCCA
TCGTCAGCAGAATTGTTGGGAGGAGATACGGCAAAGGAGTTTGCGGACAAACCGGTCGCATCGGGATCGA
ACAAGTTGGTACAGAGAGTGGTGTATAATGCAGGAATGGGAGTGGGAGTTGGAAACTTGACCATTTTCCC
CCACCAATGGATCAACTTACGAACCAATAATTCAGCTACAATTGTGATGCCATACACCAACTCAGTACCT
ATGGATAACATGTTTAGACATAACAACGTCACCTTAATGGTTATCCCATTTGTACCGTTAGATTACTGCC
CTGGATCAACCACGTACGTCCCAATTACGGTCACGATAGCCCCAATGTGTGCCGAGTACAATGGATTACG
ATTAGCAGGACACCAGGGATTACCAACCATGAATACTCCGGGATCGTGTCAATTTTTGACATCAGACGAC
TTCCAATCACCATCGGCCATGCCGCAATATGACGTCACACCAGAGATGAGAATACCTGGAGAGGTGAAAA
ACTTGATGGAAATAGCTGAGGTTGACTCAGTTGTCCCAGTCCAAAATGTTGGAGAGAAGGTCAACTCAAT
GGAAGCATACCAGATACCTGTGAGATCGAACGAAGGATCAGGAACGCAAGTATTCGGATTTCCATTGCAA
CCAGGATACTCGTCAGTTTTTTCACGAACGTTGTTAGGAGAGATCTTGAACTATTATACACATTGGTCAG
GATCGATAAAGTTAACGTTTATGTTCTGTGGATCGGCCATGGCTACTGGAAAATTCTTATTGGCATACTC
ACCACCAGGAGCTGGAGCTCCTACAAAAAGAGTTGATGCTATGTTAGGAACTCATGTAATTTGGGACGTG
GGATTACAATCATCATGCGTGTTGTGTATACCCTGGATATCGCAAACACACTACCGATTTGTTGCTTCAG
ATGAGTATACCGCAGGAGGATTTATTACGTGCTGGTATCAAACAAACATAGTGGTCCCAGCGGATGCCCA
ATCGTCGTGTTACATCATGTGTTTCGTGTCAGCATGCAATGACTTCTCAGTCAGATTATTGAAGGACACT
CCTTTCATTTCGCAGCAAAACTTTTTCCAGGGACCAGTGGAAGACGCGATAACAGCCGCTATAGGAAGAG
TTGCGGATACCGTGGGAACAGGACCAACCAACTCAGAAGCTATACCAGCATTGACTGCTGCTGAGACGGG
ACACACGTCACAAGTAGTGCCGGGAGACACTATGCAGACACGACACGTTAAGAACTACCATTCAAGATCG
GAGTCAACCATAGAGAACTTCTTATGTAGATCAGCATGCGTGTACTTTACGGAGTATAAAAACTCAGGAG
CCAAGCGATATGCTGAATGGGTATTAACACCACGACAAGCAGCACAATTAAGAAGAAAGTTAGAATTCTT
TACCTACGTCCGATTCGACTTGGAGTTGACGTTTGTCATAACATCAACTCAACAGCCCTCAACCACACAG
AACCAAGATGCACAGATCTTAACACACCAAATTATGTATGTACCACCAGGAGGACCTGTACCAGATAAAG
TTGATTCATACGTGTGGCAAACATCAACGAATCCCTCAGTGTTTTGGACCGAGGGAAACGCCCCGCCGCG
AATGTCGATACCGTTTTTGTCGATTGGAAACGCCTATTCAAATTTCTATGACGGATGGTCAGAATTTTCG
AGAAACGGAGTTTACGGAATCAACACGTTAAACAACATGGGAACGTTATATGCAAGACATGTCAACGCTG
GATCGACGGGACCAATAAAATCGACCATTAGAATCTACTTCAAACCGAAGCATGTCAAAGCGTGGATACC
TAGACCACCTAGATTGTGCCAATACGAGAAGGCAAAGAACGTGAACTTCCAACCCTCGGGAGTTACCACT
AC TAGACAATCGATCACTACAATGACAAATACGGGCGCAT TT SEQID NO: 85
La SEQ ID NO: 85 codifica la proteína P1 (de tipo silvestre) de SEQ ID NO: 105:
MGAQVSTQKTGAHETRLNASGNSIIHYTNINYYKDAASNSANRQDFTQDPGKFTEPVKDIMIKSLPALNS
PTVEECGYSDRARSITLGNSTITTQECANVWGYGVWPDYLKDSEATAEDQPTQPDVATCRFYTLDSVQW
QKTSPGWWWKLPDALSNLGLFGQNMQYHYLGRTGYTVHVQCNASKFHQGCLLWCVPEAEMGCATLDNTP
SSAELLGGDTAKEFADKPVASGSNKLVQRWYNAGMGVGVGNLTIFPHQWINLRTNNSATIVMPYTNSVP
MDNMFRHNNVTLMVIPFVPLDYCPGSTTYVPITVTIAPMCAEYNGLRLAGHQGLPTMNTPGSCQFLTSDD
FQSPSAMPQYDVTPEMRIPGEVKNLMEIAEVDSWPVQNVGEKVNSMEAYQIPVRSNEGSGTQVFGFPLQ
PGYSSVFSRTLLGEILNYYTHWSGSIKLTFMFCGSAMATGKFLLAYSPPGAGAPTKRVDAMLGTHVIWDV
GLQSSCVLCIPWISQTHYRFVASDEYTAGGFITCWYQTNIWPADAQSSCYIMCFVSACNDFSVRLLKDT
PFISQQNFFQGPVEDAITAAIGRVADTVGTGPTNSEAIPALTAAETGHTSQWPGDTMQTRHVKNYHSRS
ESTIENFLCRSACVYFTEYKNSGAKRYAEWVLTPRQAAQLRRKLEFFTYVRFDLELTFVITSTQQPSTTQ
NQDAQILTHQIMYVPPGGPVPDKVDSYVWQTSTNPSVFWTEGNAPPRMSIPFLSIGNAYSNFYDGWSEFS
RNGVYGINTLNNMGTLYARHVNAGSTGPIKSTIRIYFKPKHVKAWIPRPPRLCQYEKAKNVNFQPSGVTT
TRQSITTMTNTGAF SEQID NO: 105
EJEMPLO 7: Mutantes de 1-hasta-parada de la gripe (región HA)
Se generó un mutante de 1-hasta-parada del virus de la gripe A como se ha descrito en el ejemplo 5 anterior, pero mutando la región de HA en lugar de mutando la región de PA.
Por lo tanto, se reemplazaron los codones de Leu y Ser de la región HA por codones sinónimos de 1-hasta-parada.
La secuencia de ARN genómico de HA de este virus de la gripe A de 1-hasta-parada es la SEQ ID NO: 86 (los nucleótidos mutados se escriben en minúscula):
AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUCUCAUGCUUCUGAAAUCCUAAUGUUAAAUACAUAUUCUA CACUGUAauGACCCAUUuGAGCACAUCCAGAAugaGAUUGCCCCCAacGAGACUACCAaU ACCAAUGAugaGGCGACAGUUGAAUAGAUCGCCAAAAUCUGGUAAAUCCUUGUUGAUUCC AaCUUUACCCCAUCUAUUUCUUCUCUGUUUAAUUUUGCUUCCUCUGAGUAUUUUGGGUAG UCAUAAGUCCCAUUUUUGACugaUUCCAUGCACGUGUUAUCGCAUUUGUGGUAAAAUUCA AAGCAGCCGUUUCCAAUUUCCUUGGCAUUGUUUUUUAaCUGcgaUCUUACCUUUUCAUAU AAGUUCUUCACAUUUGAAUCGUGGUAGUCCAAAGUUCUUUCAUUUUCCAAUAaAACCAAC AaUUCGGCAUUGUAAGUCCAAAUGUCCAaGAAACCAUCAUCAACUUUUUUAUUUAAAUUC UCUAUUCUUUUUUCCAaGUGGUUGAACUCUUUACCUACUGCUGUGAACUGUGUAUUCAUC UUUUCAAUAACuGAAUUUACUUUGUUAGUAAUCUCGUCAAUGGCAUUCUGUGUcgaCUUC AaGUCGGCUGCAUAUCCUGACCCCUGCUCAUUUUGAUGGUGAUAACCGUACCAUCCAUCU ACCAUCCCUGUCCACCCCCCUUCAAUGAAACCGGCAAUGGCCCCAAAUAaGCCUCUuGAU UGAAUuGACGGGACAUUCCUCAAUCCUGUGGCCAaUCUCAAUUUUGUcgaUUUUACAUAU UUUGGACAUUUUCCAAUUGUGAUCGGAUGUAUAUUCUGAAAUGGcAacgaGGUGUUUAUA GCACCCUUGGGUGUCUGACAAGUUGUAUUGCAAUCGUGGACUGGUGUAUCUGAAAUGAUA AUACCuGAUCCAGCAUUUCUUUCCAUUGCGAAUGCAUAUCUCGGUACCACUAaAUUUCCA GUUGCUUCGAAUGUUAUUUUGUCUCCCGGCUCUACUAaUGUCCAGUAAUAGUUCAUUCUC CCCUCUUGAUCCCUCACUUUGGGUCUUAUUGCUAUUUCCGGCUUGAACUUCUUcgaGUAU CUUGAUGACCCCACAAAAACAUAUGCAUCUGCAUUCUGAUAcAaugaUUGUUGGUCAGCu gaAGUuGAUGGAUGGUGAAUGCCCCAUAaCACcAaGACUUCUUUCCCUUUAUCAUUAAUG UAcGAUUUcgacAaCUUUGGGUAUGAAUUUCCUUUUUUAACUAaCCAUAUUAAAUUUUUG UAGAAcgaUUUUGCUCCAGCAUGAGGACAUGCUGCCGUUACACCUUUGUUCGAGUCAUGA UUGGGCCAUGAugaUGUCUUGGGGAAUAUCUCAAACCUUUCAAAUGAUGACACUGAcgaC AAUUGCUCUCUUAaCUCCUCAUAAUCGAUGAAAUCUCCUGGGUAACACGUUCCAUUGUCU GAugauGAUGUUUCCACAAUGUAcGACCAUGAcgaUGCUGUcGAcAaUGAUUCACACUCU GGAUUUCCCAaGAUCCAGCCAGCAAUGUUACAUUUACCCAAAUGCAAUGGGGCUACCCCU CUUAaUUUGCAUAaUUUCCCGUUAUGCUUGUCUUCUAauAaGUUAACcGAGUGUGUUACU GUUACAUUCUUUUCUAaUACUGUGUCUACAGUGUCUGUUGAAUUGUUCGCAUGAUAACCU AUACAUAAUGUGUCUGCAUUUGCGGUUGCAAAUGUAUAUAaCAaAACUACUAaUAUUGCC UUCAUUUUUGUUGCUUUUGUUUUCCCCUGCUUUUGCU SEQID NO: 86
La secuencia de la CDS de ADNc de HA de este virus de la gripe A de 1-hasta-parada es la SEQ ID NO: 87 (los nucleótidos mutados se escriben en minúscula):
ATGAAGGCAATAtTAGTAGTTtTGtTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTA TGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTAtTAGAAAAGAAT GTAACAGTAACACACTCgGTTAACtTatTAGAAGACAAGCATAACGGGAAAtTATGCAAA tTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCtTGGGA AATCCAGAGTGTGAATCAtTgTCgACAGCAtcgTCATGGTCgTACATTGTGGAAACATCa tcaTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGtTAAGAGAG CAATTGtcgTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAtcaTCATGG
CCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAtcg TTCTACAAAAATTTAATATGGtTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGtTgtcgAAA TCgTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCtTgGTGtTATGGGGCATTCACCATCCATCa ACTtcaGCTGACCAACAAtcatTgTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCA TCAAGATACtcgAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAA GAGGGGAGAATGAACTATTACTGGACAtTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAA GCAACTGGAAATtTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCa
GGTGCTATAAACACCtcgtTgCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGT CCAAAATATGTAAAAtcgACAAAATTGAGAtTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCa ATTCAATCaAGAGGCtTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGG ATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCC GACtTGAAGtcgACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCaGTTATT GAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACtTGGAAAAAAGA ATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCtTGGACATTTGGACTTACAATGCC
AACTTATATGAAAAGGTAAGAtcgCAGtTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGC TGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAtcaGTCAAAAATGGGACT TATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTA AAGtTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCtcaTCA TTGGTAtTGGTAGTCTCgtTGGGGGCAATCtcaTTCTGGATGTGCTCaAATGGGTCatTA CAGTGTAGAATATGTATTTAA SEQID NO: 87
La proteína HA codificada por el virus de la gripe de 1-hasta-parada es idéntica a la HA de tipo silvestre (SEQ ID NO: 88):
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCK LRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFIDYEELRE QL SSVS SFERFEIFPKTS SWPNHDSNKGVTAACPHAGAKS FYKNLIWLVKKGNSYPKLSK SYINDKGKEVLVLWG1HHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQ EGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPK GAINTSLPFQN1HPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTG MVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKR IENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNG CFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASS LVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI SEQ ID NO: 88
La secuencia de la CDS de ADNc de HA del virus de la gripe A de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 67.
La tabla 6 a continuación lista las mutaciones de 1-hasta-parada efectuadas en la secuencia de ADNc de HA del virus de la gripe de tipo silvestre.
T l :
(continuación)
(continuación)
Las figuras 18A y 18B muestran los títulos de virus en los pases 1 y 3 (m.o.i. = 0,001; recogidos a las 48 h.d.i.) en condiciones poco mutagénicas (ribavirina o 5-fluorouracilo o 5-azacitidina 5 j M) o en células tranqueo-bronquiales humanas (Calu) o células traqueales porcinas (NPTr).
EJEMPLO 8: Mutantes de 1-hasta-parada y de "súper parada" del virus CHIKUNGUÑA (región E1-E2)
Se generaron mutantes de 1-hasta-parada y súper parada del virus Chikunguña, de acuerdo con la metodología descrita en el ejemplo 1 anterior.
La secuencia del virus Chikunguña de tipo silvestre fue GENBANK® AM258994.1. Se introdujeron las mutaciones de 1-hasta-parada y de Súper Parada en la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 de acuerdo con la metodología descrita en el ejemplo 1 anterior.
Las mutaciones de 1-hasta-parada son el reemplazo de los codones de Leu y Ser (de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1) por codones de 1-hasta-parada sinónimos.
Las mutaciones de Súper Parada son el reemplazo de los codones de Leu, Ser, Arg y Gly (de la poliproteína C-E3-E2-6K-E1) por codones de 1-hasta-parada sinónimos.
La secuencia del mutante de 1-hasta-parada del virus Chikunguña virus es la SEQ ID NO: 101:
ATGGAGTTCATCCCAACCCAAACTTTTTACAATAGGAGGTACCAGCCTCGACCCTGGACTCCGCGCCCTACT
ATCCAAGTCATCAGGCCCAGACCGCGCCCTCAGAGGCAAGCTGGGCAATTAGCCCAGTTGATCTCAGCAGTT
AATAAATTGACAATGCGCGCGGTACCCCAACAGAAGCCACGCAGGAATCGGAAGAATAAGAAGCAAAAGCAA
AAACAACAGGCGCCACAAAACAACACAAATCAAAAGAAGCAGCCACCTAAAAAGAAACCGGCTCAAAAGAAA
AAGAAGCCGGGCCGCAGAGAGAGGATGTGCATGAAAATCGAAAATGATTGTATTTTCGAAGTCAAGCACGAA
GGTAAGGTAACAGGTTACGCGTGCTTGGTGGGGGACAAAGTAATGAAACCAGCACACGTAAAGGGGACCATC
GATAACGCGGACTTGGCCAAATTGGCCTTTAAGCGGTCATCAAAGTATGACTTAGAATGCGCGCAGATACCC
GTGCACATGAAGTCGGACGCTTCGAAGTTCACCCATGAGAAACCGGAGGGGTACTACAACTGGCACCACGGA
GCAGTACAGTACTCAGGAGGCCGGTTCACCATCCCTACAGGTGCTGGCAAACCAGGGGACTCGGGCAGACCG
ATCTTCGACAACAAGGGACGCGTGGTGGCCATAGTCTTAGGAGGAGCTAATGAAGGAGCCCGTACAGCCTTG
TCGGTGGTGACCTGGAATAAAGACATTGTCACTAAAATCACCCCCGAGGGGGCCGAAGAGTGGTCATTAGCC ATCCCAGTTATGTGCTTGTTGGCAAACACCACGTTCCCCTGCTCGCAGCCCCCTTGCACGCCCTGCTGCTAC GAAAAGGAACCGGAGGAAACCTTACGCATGTTAGAGGACAACGTCATGAGACCTGGGTACTATCAGTTGTTA CAAGCATCGTTAACATGTTCA CCCCACCGCCAGCGACGCTCGACCAAGGACAACTTCAATGTCTATAAAGCCACAAGACCATACTTAGCTCAC TGTCCCGACTGTGGAGAAGGGCACTCGTGCCATTCACCCGTAGCATTAGAACGCATCAGAAATGAAGCGACA GACGGGACGTTGAAAATCCAGGTCTCGTTGCAAATCGGAATAAAGACGGATGACTCGCACGATTGGACCAAG TTGCGTTATATGGACAACCACATGCCAGCAGACGCAGAGAGGGCGGGGTTATTTGTAAGAACATCAGCACCG TGTACGATTACTGGAACAATGGGACACTTCATCTTGGCCCGATGTCCAAAAGGGGAAACTTTGACGGTGGGA TTCACTGACTCAAGGAAGATTTCACACTCATGTACGCACCCATTTCACCACGACCCTCCTGTGATAGGTCGG GAAAAATTCCATTCGCGACCGCAGCACGGTAAAGAGTTACCTTGCTCGACGTACGTGCAGTCGACCGCCGCA ACTACCGAGGAGATAGAGGTACACATGCCCCCAGACACCCCTGATCGCACATTAATGTCACAACAGTCGGGC AACGTAAAGATCACAGTCAATGGCCAGACGGTGCGGTACAAGTGTAATTGCGGTGGCTCAAATGAAGGATTA ACAACTACAGACAAAGTGATTAATAACTGCAAGGTTGATCAATGTCATGCCGCGGTCACCAATCACAAAAAG TGGCAGTATAACTCGCCTTTGGTCCCGCGTAATGCTGAATTAGGGGACCGAAAAGGAAAAATTCACATCCCG TTTCCGTTGGCAAATGTAACATGCAGGGTGCCTAAAGCAAGGAACCCCACCGTGACGTACGGGAAAAACCAA GTCATCATGTTATTGTATCCTGACCACCCAACATTGTTGTCGTACCGGAATATGGGAGAAGAACCAAACTAT CAAGAAGAGTGGGTGATGCATAAGAAGGAAGTCGTGTTAACCGTGCCGACTGAAGGGTTGGAGGTCACGTGG GGCAACAACGAGCCGTATAAGTATTGGCCGCAGTTATCAACAAACGGTACAGCCCATGGCCACCCGCACGAG ATAATTTTGTATTATTATGAGTTGTACCCCACTATGACTGTAGTAGTTGTGTCAGTGGCCACGTTCATATTG TTGTCGATGGTGGGTATGGCAGCGGGGATGTGCATGTGTGCACGACGCAGATGCATCACACCGTATGAATTG ACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCTTGTTATCGTTAATATGCTGCATCAGAACAGCTAAAGCGGCCACATAC CAAGAGGCTGCGATATACTTGTGGAACGAGCAGCAACCTTTGTTTTGGTTACAAGCCTTAATTCCGTTGGCA GCCTTGATTGTTTTATGCAACTGTTTGAGATTGTTACCATGCTGCTGTAAAACGTTGGCTTTTTTAGCCGTA ATGTCGGTCGGTGCCCACACTGTGTCGGCGTACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGTGGGAGTACCG TATAAGACTTTAGTCAATAGACCTGGCTACTCGCCCATGGTATTGGAGATGGAATTATTGTCAGTCACTTTG GAGCCAACATTATCGTTAGATTACATCACGTGCGAGTACAAAACCGTCATCCCGTCACCGTACGTGAAGTGC TGCGGTACAGCAGAGTGCAAGGACAAAAACTTACCTGACTACTCGTGTAAGGTCTTCACCGGCGTCTACCCA TTTATGTGGGGCGGCGCCTACTGCTTCTGCGACGCTGAAAACACGCAGTTGTCGGAAGCACACGTGGAGAAG TCGGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCAGCATACAGGGCTCATACCGCATCAGCATCAGCTAAGTTGCGC GTCTTATACCAAGGAAATAACATCACTGTAACTGCCTATGCAAACGGCGACCATGCCGTCACAGTTAAGGAC GCCAAATTCATTGTGGGGCCAATGTCATCAGCCTGGACACCTTTCGACAACAAAATTGTGGTGTACAAAGGT GACGTCTATAACATGGACTACCCGCCCTTTGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTTGGCGATATCCAATCACGC ACACCTGAGTCAAAAGACGTCTATGCTAATACACAATTGGTATTGCAGAGACCGGCTGTGGGTACGGTACAC GTGCCATACTCACAGGCACCATCAGGCTTTAAGTATTGGTTAAAAGAACGCGGGGCGTCGTTGCAGCACACA GCACCATTTGGCTGCCAAATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGGTGAACTGCGCCGTAGGGAACATGCCCATC TCGATCGACATACCGGAAGCGGCCTTCACTAGGGTCGTCGACGCGCCCTCATTAACGGACATGTCGTGCGAG GTACCAGCCTGCACCCATTCGTCAGACTTTGGGGGCGTCGCCATTATTAAATATGCAGCCTCGAAGAAAGGC AAGTGTGCGGTGCATTCGATGACTAACGCCGTCACTATTCGGGAAGCTGAGATAGAAGTTGAAGGGAATTCA CAGTTGCAAATCTCATTCTCGACGGCCTTAGCCTCGGCCGAATTCCGCGTACAAGTCTGTTCAACACAAGTA CACTGTGCAGCCGAGTGCCACCCCCCGAAGGACCACATAGTCAACTACCCGGCGTCACATACCACCTTGGGG GTCCAGGACATCTCGGCTACGGCGATGTCATGGGTGCAGAAGATCACGGGAGGTGTGGGATTGGTTGTTGCT GTTGCCGCATTGATTTTAATCGTGGTGTTATGCGTGTCGTTCTCGAGGCACTAA SEQID NO: 101
La secuencia del mutante de Súper-Parada del virus Chikunguña virus es la SEQ ID NO: 102:
ATGGAGTTCATCCCAACCCAAACTTTTTACAATAGAAGATACCAGCCTCGACCCTGGACTCCGCGACCTACT ATCCAAGTCATCAGACCCAGACCGCGACCTCAGAGACAAGCTGGACAATTAGCCCAGTTGATCTCAGCAGTT AATAAATTGACAATGCGAGCGGTACCCCAACAGAAGCCACGAAGAAATCGAAAGAATAAGAAGCAAAAGCAA AAACAACAGGCGCCACAAAACAACACAAATCAAAAGAAGCAGCCACCTAAAAAGAAACCGGCTCAAAAGAAA AAGAAGCCGGGACGAAGAGAGAGAATGTGCATGAAAATCGAAAATGATTGTATTTTCGAAGTCAAGCACGAA GGAAAGGTAACAGGATACGCGTGCTTGGTGGGAGACAAAGTAATGAAACCAGCACACGTAAAGGGAACCATC GATAACGCGGACTTGGCCAAATTGGCCTTTAAGCGATCATCAAAGTATGACTTAGAATGCGCGCAGATACCC GTGCACATGAAGTCGGACGCTTCGAAGTTCACCCATGAGAAACCGGAGGGATACTACAACTGGCACCACGGA GCAGTACAGTACTCAGGAGGACGATTCACCATCCCTACAGGAGCTGGAAAACCAGGAGACTCGGGAAGACCG ATCTTCGACAACAAGGGACGAGTGGTGGCCATAGTCTTAGGAGGAGCTAATGAAGGAGCCCGAACAGCCTTG TCGGTGGTGACCTGGAATAAAGACATTGTCACTAAAATCACCCCCGAGGGAGCCGAAGAGTGGTCATTAGCC ATCCCAGTTATGTGCTTGTTGGCAAACACCACGTTCCCCTGCTCGCAGCCCCCTTGCACGCCCTGCTGCTAC
GAAAAGGAACCGGAGGAAACCTTACGAATGTTAGAGGACAACGTCATGAGACCTGGATACTATCAGTTGTTA CAAGCATCGTTAACATGTTCA CCCCACCGACAGCGACGATCGACCAAGGACAACTTCAATGTCTATAAAGCCACAAGACCATACTTAGCTCAC TGTCCCGACTGTGGAGAAGGACACTCGTGCCATTCACCCGTAGCATTAGAACGAATCAGAAATGAAGCGACA GACGGAACGTTGAAAATCCAGGTCTCGTTGCAAATCGGAATAAAGACGGATGACTCGCACGATTGGACCAAG TTGCGATATATGGACAACCACATGCCAGCAGACGCAGAGAGAGCGGGATTATTTGTAAGAACATCAGCACCG TGTACGATTACTGGAACAATGGGACACTTCATCTTGGCCCGATGTCCAAAAGGAGAAACTTTGACGGTGGGA TTCACTGACTCAAGAAAGATTTCACACTCATGTACGCACCCATTTCACCACGACCCTCCTGTGATAGGACGA GAAAAATTCCATTCGCGACCGCAGCACGGAAAAGAGTTACCTTGCTCGACGTACGTGCAGTCGACCGCCGCA ACTACCGAGGAGATAGAGGTACACATGCCCCCAGACACCCCTGATCGAACATTAATGTCACAACAGTCGGGA AACGTAAAGATCACAGTCAATGGACAGACGGTGCGATACAAGTGTAATTGCGGAGGATCAAATGAAGGATTA ACAACTACAGACAAAGTGATTAATAACTGCAAGGTTGATCAATGTCATGCCGCGGTCACCAATCACAAAAAG TGGCAGTATAACTCGCCTTTGGTCCCGCGAAATGCTGAATTAGGAGACCGAAAAGGAAAAATTCACATCCCG TTTCCGTTGGCAAATGTAACATGCAGAGTGCCTAAAGCAAGAAACCCCACCGTGACGTACGGAAAAAACCAA GTCATCATGTTATTGTATCCTGACCACCCAACATTGTTGTCGTACCGAAATATGGGAGAAGAACCAAACTAT CAAGAAGAGTGGGTGATGCATAAGAAGGAAGTCGTGTTAACCGTGCCGACTGAAGGATTGGAGGTCACGTGG GGAAACAACGAGCCGTATAAGTATTGGCCGCAGTTATCAACAAACGGAACAGCCCATGGACACCCGCACGAG ATAATTTTGTATTATTATGAGTTGTACCCCACTATGACTGTAGTAGTTGTGTCAGTGGCCACGTTCATATTG TTGTCGATGGTGGGAATGGCAGCGGGAATGTGCATGTGTGCACGACGAAGATGCATCACACCGTATGAATTG ACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCTTGTTATCGTTAATATGCTGCATCAGAACAGCTAAAGCGGCCACATAC CAAGAGGCTGCGATATACTTGTGGAACGAGCAGCAACCTTTGTTTTGGTTACAAGCCTTAATTCCGTTGGCA GCCTTGATTGTTTTATGCAACTGTTTGAGATTGTTACCATGCTGCTGTAAAACGTTGGCTTTTTTAGCCGTA ATGTCGGTCGGAGCCCACACTGTGTCGGCGTACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGTGGGAGTACCG TATAAGACTTTAGTCAATAGACCTGGATACTCGCCCATGGTATTGGAGATGGAATTATTGTCAGTCACTTTG GAGCCAACATTATCGTTAGATTACATCACGTGCGAGTACAAAACCGTCATCCCGTCACCGTACGTGAAGTGC TGCGGAACAGCAGAGTGCAAGGACAAAAACTTACCTGACTACTCGTGTAAGGTCTTCACCGGAGTCTACCCA TTTATGTGGGGAGGAGCCTACTGCTTCTGCGACGCTGAAAACACGCAGTTGTCGGAAGCACACGTGGAGAAG TCGGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCAGCATACAGAGCTCATACCGCATCAGCATCAGCTAAGTTGCGA GTCTTATACCAAGGAAATAACATCACTGTAACTGCCTATGCAAACGGAGACCATGCCGTCACAGTTAAGGAC GCCAAATTCATTGTGGGACCAATGTCATCAGCCTGGACACCTTTCGACAACAAAATTGTGGTGTACAAAGGA GACGTCTATAACATGGACTACCCGCCCTTTGGAGCAGGAAGACCAGGACAATTTGGAGATATCCAATCACGA ACACCTGAGTCAAAAGACGTCTATGCTAATACACAATTGGTATTGCAGAGACCGGCTGTGGGAACGGTACAC GTGCCATACTCACAGGCACCATCAGGATTTAAGTATTGGTTAAAAGAACGAGGAGCGTCGTTGCAGCACACA GCACCATTTGGATGCCAAATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGGTGAACTGCGCCGTAGGAAACATGCCCATC TCGATCGACATACCGGAAGCGGCCTTCACTAGAGTCGTCGACGCGCCCTCATTAACGGACATGTCGTGCGAG GTACCAGCCTGCACCCATTCGTCAGACTTTGGAGGAGTCGCCATTATTAAATATGCAGCCTCGAAGAAAGGA AAGTGTGCGGTGCATTCGATGACTAACGCCGTCACTATTCGAGAAGCTGAGATAGAAGTTGAAGGAAATTCA CAGTTGCAAATCTCATTCTCGACGGCCTTAGCCTCGGCCGAATTCCGAGTACAAGTCTGTTCAACACAAGTA CACTGTGCAGCCGAGTGCCACCCCCCGAAGGACCACATAGTCAACTACCCGGCGTCACATACCACCTTGGGA GTCCAGGACATCTCGGCTACGGCGATGTCATGGGTGCAGAAGATCACGGGAGGAGTGGGATTGGTTGTTGCT GTTGCCGCATTGATTTTAATCGTGGTGTTATGCGTGTCGTTCTCGAGACACTAA SEQID NO: 102
El virus Chikunguña de tipo silvestre GENBANK® AM258994.1 es (SEQ ID NO: 103):
1 caaagcaaga gattaataac ccatcatgga tcctgtgtac gtggacatag acgctgacag 61 cgcctttttg aaggccctgc aacgtgcgta ccccatgttt gaggtggaac caaggcaggt 121 cacaccgaat gaccatgcta atgctagagc gttctcgcat ctagctataa aactaataga 181 gcaggaaatt gaccccgact caaccatcct ggatatcggc agtgcgccag caaggaggat 241 gatgtcggac aggaagtacc actgcgtctg cccgatgcgc agtgcggaag atcccgagag 301 actcgccaat tatgcgagaa agctagcatc tgccgcagga aaagtcctgg acagaaacat 361 ctctggaaag atcggggact tacaagcagt aatggccgtg ccagacacgg agacgccaac 421 attctgctta cacacagacg tctcatgtag acagagagca gacgtcgcta tataccaaga 481 cgtctatgct gtacacgcac ccacgtcgct ataccaccag gcgattaaag gggtccgagt 541 ggcgtactgg gttgggttcg acacaacccc gttcatgtac aatgccatgg cgggtgccta 601 cccctcatac tcgacaaact gggcagatga gcaggtactg aaggctaaga acataggatt 661 atgttcaaca gacctgacgg aaggtagacg aggcaagttg tctattatga gagggaaaaa 721 gctaaaaccg tgcgaccgtg tgctgttctc agtagggtca acgctctacc cggaaagccg 781 caagctactt aagagctggc acctgccatc ggtgttccat ttaaagggca aactcagctt
841 cacatgccgc tgtgatacag tggtttcgtg tgagggctac gtcgttaaga gaataacgat 901 gagcccaggc ctttatggaa aaaccacagg gtatgcggta acccaccacg cagacggatt 961 cctgatgtgc aagactaccg acacggttga cggcgaaaga gtgtcattct cggtgtgcac 1021 atacgtgccg gcgaccattt gtgatcaaat gaccggcatc cttgctacag aagtcacgcc 1081 ggaggatgca cagaagctgt tggtggggct gaaccagaga atagtggtta acggcagaac 1141 gcaacggaat acgaacacca tgaaaaatta tctgcttccc gtggtcgccc aagccttcag 1201 taagtgggca aaggagtgcc ggaaagacat ggaagatgaa aaactcctgg gggtcagaga 1261 aagaacactg acctgctgct gtctatgggc attcaagaag cagaaaacac acacggtcta 1321 caagagacct gatacccagt caattcagaa ggttcaggcc gagtttgaca gctttgtggt 1381 accgagtctg tggtcgtccg ggttgtcaat ccctttgagg actagaatca aatggttgtt 1441 aagcaaggtg ccaaaaaccg acctgatccc atacagcgga gacgcccgag aagcccggga 1501 cgcagaaaaa gaagcagagg aagaacgaga agcagaactg actcgcgaag ccctaccacc 1561 tctacaggca gcacaggaag atgttcaggt cgaaatcgac gtggaacagc ttgaggacag 1621 agcgggcgca ggaataatag agactccgag aggagctatc aaagttactg cccaaccaac 1681 agaccacgtc gtgggagagt acctggtact ctccccgcag accgtactac gtagccagaa 1741 gctcagtctg attcacgctt tggcggagca agtgaagacg tgcacgcaca acggacgagc 1801 agggaggtat gcggtcgaag cgtacgacgg ccgagtccta gtgccctcag gctatgcaat 1861 ctcgcctgaa gacttccaga gtctaagcga aagcgcaacg atggtgtata acgaaagaga 1921 gttcgtaaac agaaagctac accatattgc gatgcacgga ccagccctga acaccgacga 1981 agagtcgtat gagctggtga gggcagagag gacagaacac gagtacgtct acgacgtgga 2041 tcagagaaga tgctgtaaga aggaagaagc cgcaggactg gtactggtgg gcgacttgac 2101 taatccgccc taccacgaat tcgcatatga agggctaaaa atccgccctg cctgcccata 2161 caaaattgca gtcataggag tcttcggagt accgggatct ggcaagtcag ctattatcaa 2221 gaacctagtt accaggcagg acctggtgac tagcggaaag aaagaaaact gccaagaaat 2281 caccaccgac gtgatgagac agagaggtct agagatatct gcacgtacgg ttgactcgct 2341 gctcttgaat ggatgcaaca gaccagtcga cgtgttgtac gtagacgagg cgtttgcgtg 2401 ccactctgga acgctacttg ctttgatcgc cttggtgaga ccaaggcaga aagttgtact 2461 ttgtggtgac ccgaagcagt gcggcttctt caatatgatg cagatgaaag tcaactataa 2521 tcacaacatc tgcacccaag tgtaccacaa aagtatctcc aggcggtgta cactgcctgt 2581 gaccgccatt gtgtcatcgt tgcattacga aggcaaaatg cgcactacga atgagtacaa 2641 caagccgatt gtagtggaca ctacaggctc aacaaaacct gaccctggag acctcgtgtt 2701 aacgtgcttc agagggtggg ttaaacaact gcaaattgac tatcgtggat acgaggtcat 2761 gacagcagcc gcatcccaag ggttaaccag aaaaggagtt tacgcagtta gacaaaaagt 2821 taatgaaaac ccgctctatg catcaacgtc agagcacgtc aacgtactcc taacgcgtac 2881 ggaaggtaaa ctggtatgga agacactttc cggcgacccg tggataaaga cgctgcagaa 2941 cccaccgaaa ggaaacttca aagcaactat taaggagtgg gaggtggagc atgcatcaat 3001 aatggcgggc atctgcagtc accaaatgac cttcgataca ttccaaaata aagccaacgt 3061 ttgttgggct aagagcttgg tccctatcct cgaaacagcg gggataaaac taaatgatag 3121 gcagtggtct cagataattc aagccttcaa agaagacaaa gcatactcac ctgaagtagc 3181 cctgaatgaa atatgtacgc gcatgtatgg ggtggatcta gacagcgggc tattttctaa 3241 accgttggtg tctgtgtatt acgcggataa ccactgggat aataggcctg gagggaaaat 3301 gttcggattt aaccccgagg cagcatccat tctagaaaga aagtatccat tcacaaaagg 3361 gaagtggaac atcaacaagc agatctgcgt gactaccagg aggatagaag actttaaccc 3421 taccaccaac atcataccgg ccaacaggag actaccacac tcattagtgg ccgaacaccg 3481 cccagtaaaa ggggaaagaa tggaatggct ggttaacaag ataaacggcc accacgtgct 3541 cctggtcagt ggctataacc ttgcactgcc tactaagaga gtcacttggg tagcgccgtt 3601 aggtgtccgc ggagcggact acacatacaa cctagagttg ggtctgccag caacgcttgg 3661 taggtatgac ctagtggtca taaacatcca cacacctttt cgcatacacc attaccaaca 3721 gtgcgtcgac cacgcaatga aactgcaaat gctcgggggt gactcattga gactgctcaa 3781 accgggcggc tctctattga tcagagcata tggttacgca gatagaacca gtgaacgagt 3841 catctgcgta ttgggacgca agtttagatc gtctagagcg ttgaaaccac catgtgtcac 3901 cagcaacact gagatgtttt tcctattcag caactttgac aatggcagaa ggaatttcac 3961 aactcatgtc atgaacaatc aactgaatgc agccttcgta ggacaggtca cccgagcagg 4021 atgtgcaccg tcgtaccggg taaaacgcat ggacatcgcg aagaacgatg aagagtgcgt 4081 agtcaacgcc gctaaccctc gcgggttacc gggtgacggt gtttgcaagg cagtatacaa 4141 aaaatggccg gagtccttta agaacagtgc aacaccagtg ggaaccgcaa aaacagttat 4201 gtgcggtacg tatccagtaa tccacgctgt tggaccaaac ttctctaatt attcggagtc 4261 tgaaggggac cgggaattgg cagctgccta tcgagaagtc gcaaaggaag taactaggct 4321 gggagtaaat agtgtagcta tacctctcct ctccacaggt gtatactcag gagggaaaga 4381 caggctgacc cagtcactga accacctctt tacagccatg gactcgacgg atgcagacgt 4441 ggtcatctac tgccgcgaca aagaatggga gaagaaaata tctgaggcca tacagatgcg
4501 gacccaagta gagctgctgg atgagcacat ctccatagac tgcgatattg ttcgcgtgca 4561 ccctgacagc agcttggcag gcagaaaagg atacagcacc acggaaggcg cactgtactc 4621 atatctagaa gggacccgtt ttcatcagac ggctgtggat atggcggaga tacatactat 4681 gtggccaaag caaacagagg ccaatgagca agtctgccta tatgccctgg gggaaagtat 4741 tgaatcgatc aggcagaaat gcccggtgga tgatgcagac gcatcatctc cccccaaaac 4801 tgtcccgtgc ctttgccgtt acgctatgac tccagaacgc gtcacccggc ttcgcatgaa 4861 ccacgtcaca agcataattg tgtgttcttc gtttcccctc ccaaagtaca aaatagaagg 4921 agtgcaaaaa gtcaaatgct ctaaggtaat gctatttgac cacaacgtgc catcgcgcgt 4981 aagtccaagg gaatatagat cttcccagga gtctgcacag gaggcgagta caatcacgtc 5041 actgacgcat agtcaattcg acctaagcgt tgatggcgag atactgcccg tcccgtcaga 5101 cctggatgct gacgccccag ccctagaacc agcactagac gacggggcga cacacacgct 5161 gccatccaca accggaaacc ttgcggccgt gtctgattgg gtaatgagca ccgtacctgt 5221 cgcgccgccc agaagaaggc gagggagaaa cctgactgtg acatgtgacg agagagaagg 5281 gaatataaca cccatggcta gcgtccgatt ctttagggca gagctgtgtc cggtcgtaca 5341 agaaacagcg gagacgcgtg acacagcaat gtctcttcag gcaccaccga gtaccgccac 5401 ggaaccgaat catccgccga tctccttcgg agcatcaagc gagacgttcc ccattacatt 5461 tggggacttc aacgaaggag aaatcgaaag cttgtcttct gagctactaa ctttcggaga 5521 cttcttacca ggagaagtgg atgacttgac agacagcgac tggtccacgt gctcagacac 5581 ggacgacgag ttatgactag acagggcagg tgggtatata ttctcgtcgg acaccggtcc 5641 aggtcattta caacagaagt cagtacgcca gtcagtgctg ccggtgaaca ccctggagga 5701 agtccacgag gagaagtgtt acccacctaa gctggatgaa gcaaaggagc aactattact 5761 taagaaactc caggagagtg catccatggc caacagaagc aggtatcagt cgcgcaaagt 5821 agaaaacatg aaagcagcaa tcatccagag actaaagaga ggctgtagac tatacttaat 5881 gtcagagacc ccaaaagtcc ctacttaccg gactacatat ccggcgcctg tgtactcgcc 5941 tccgatcaac gtccgattgt ccaatcccga gtccgcagtg gcagcatgca atgagttctt 6001 agctagaaac tatccaactg tctcatcata ccaaattacc gacgagtatg atgcatatct 6061 agacatggtg gacgggtcgg agagttgcct ggaccgagcg acattcaatc cgtcaaaact 6121 caggagctac ccgaaacagc acgcttacca cgcgccctcc atcagaagcg ctgtaccgtc 6181 cccattccag aacacactac agaatgtact ggcagcagcc acgaaaagaa actgcaacgt 6241 cacacagatg agggaattac ccactttgga ctcagcagta ttcaacgtgg agtgtttcaa 6301 aaaattcgca tgcaaccaag aatactggga agaatttgct gccagcccta ttaggataac 6361 aactgagaat ttagcaacct atgttactaa actaaaaggg ccaaaagcag cagcgctatt 6421 cgcaaaaacc cataatctac tgccactaca ggaagtacca atggataggt tcacagtaga 6481 tatgaaaagg gacgtaaagg tgactcctgg tacaaagcat acagaggaaa gacctaaggt 6541 gcaggttata caggcggctg aacccttggc gacagcatac ctatgtggga ttcacagaga 6601 gctggttagg aggctgaacg ccgtcctcct acccaatgta catacactat ttgacatgtc 6661 tgccgaggat ttcgatgcca tcatagccgc acactttaag ccaggagaca ctgttttgga 6721 aacggacata gcctcctttg ataagagcca agatgattca cttgcgctta ctgctttgat 6781 gctgttagag gatttagggg tggatcactc cctgctggac ttgatagagg ctgctttcgg 6841 agagatttcc agctgtcacc taccgacagg tacgcgcttc aagttcggcg ccatgatgaa 6901 atcaggtatg ttcctaactc tgttcgtcaa cacattgtta aacatcacca tcgccagccg 6961 agtgctggaa gatcgtctga caaaatccgc gtgcgcggcc ttcatcggcg acgacaacat 7021 aatacatgga gtcgtctccg atgaattgat ggcagccaga tgtgccactt ggatgaacat 7081 ggaagtgaag atcatagatg cagttgtatc cttgaaagcc ccttactttt gtggagggtt 7141 tatactgcac gatactgtga caggaacagc ttgcagagtg gcagacccgc taaaaaggct 7201 ttttaaactg ggcaaaccgc tagcggcagg tgacgaacaa gatgaagata gaagacgagc 7261 gctggctgac gaagtgatca gatggcaacg aacagggcta attgatgagc tggagaaagc 7321 ggtatactct aggtacgaag tgcagggtat atcagttgtg gtaatgtcca tggccacctt 7381 tgcaagctcc agatccaact tcgagaagct cagaggaccc gtcataactt tgtacggcgg 7441 tcctaaatag gtacgcacta cagctaccta ttttgcagaa gccgacagca agtatctaaa 7501 cactaatcag ctacaatgga gttcatccca acccaaactt tttacaatag gaggtaccag 7561 cctcgaccct ggactccgcg ccctactatc caagtcatca ggcccagacc gcgccctcag 7621 aggcaagctg ggcaacttgc ccagctgatc tcagcagtta ataaactgac aatgcgcgcg 7681 gtaccccaac agaagccacg caggaatcgg aagaataaga agcaaaagca aaaacaacag 7741 gcgccacaaa acaacacaaa tcaaaagaag cagccaccta aaaagaaacc ggctcaaaag 7801 aaaaagaagc cgggccgcag agagaggatg tgcatgaaaa tcgaaaatga ttgtattttc 7861 gaagtcaagc acgaaggtaa ggtaacaggt tacgcgtgcc tggtggggga caaagtaatg 7921 aaaccagcac acgtaaaggg gaccatcgat aacgcggacc tggccaaact ggcctttaag 7981 cggtcatcta agtatgacct tgaatgcgcg cagatacccg tgcacatgaa gtccgacgct 8041 tcgaagttca cccatgagaa accggagggg tactacaact ggcaccacgg agcagtacag 8101 tactcaggag gccggttcac catccctaca ggtgctggca aaccagggga cagcggcaga
8161 ccgatcttcg acaacaaggg acgcgtggtg gccatagtct taggaggagc taatgaagga 8221 gcccgtacag ccctctcggt ggtgacctgg aataaagaca ttgtcactaa aatcaccccc 8281 gagggggccg aagagtggag tcttgccatc ccagttatgt gcctgttggc aaacaccacg 8341 ttcccctgct cccagccccc ttgcacgccc tgctgctacg aaaaggaacc ggaggaaacc 8401 ctacgcatgc ttgaggacaa cgtcatgaga cctgggtact atcagctgct acaagcatcc 8461 ttaacatgtt ctccccaccg ccagcgacgc agcaccaagg acaacttcaa tgtctataaa 8521 gccacaagac catacttagc tcactgtccc gactgtggag aagggcactc gtgccatagt 8581 cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa gcgacagacg ggacgctgaa aatccaggtc 8641 tccttgcaaa tcggaataaa gacggatgac agccacgatt ggaccaagct gcgttatatg 8701 gacaaccaca tgccagcaga cgcagagagg gcggggctat ttgtaagaac atcagcaccg 8761 tgtacgatta ctggaacaat gggacacttc atcctggccc gatgtccaaa aggggaaact 8821 ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag attagtcact catgtacgca cccatttcac 8881 cacgaccctc ctgtgatagg tcgggaaaaa ttccattccc gaccgcagca cggtaaagag 8941 ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc gccgcaacta ccgaggagat agaggtacac 9001 atgcccccag acacccctga tcgcacatta atgtcacaac agtccggcaa cgtaaagatc 9061 acagtcaatg gccagacggt gcggtacaag tgtaattgcg gtggctcaaa tgaaggacta 9121 acaactacag acaaagtgat taataactgc aaggttgatc aatgtcatgc cgcggtcacc 9181 aatcacaaaa agtggcagta taactcccct ctggtcccgc gtaatgctga acttggggac 9241 cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg ctggcaaatg taacatgcag ggtgcctaaa 9301 gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa aaccaagtca tcatgctact gtatcctgac 9361 cacccaacac tcctgtccta ccggaatatg ggagaagaac caaactatca agaagagtgg 9421 gtgatgcata agaaggaagt cgtgctaacc gtgccgactg aagggctcga ggtcacgtgg 9481 ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg cagttatcta caaacggtac agcccatggc 9541 cacccgcacg agataattct gtattattat gagctgtacc ccactatgac tgtagtagtt 9601 gtgtcagtgg ccacgttcat actcctgtcg atggtgggta tggcagcggg gatgtgcatg 9661 tgtgcacgac gcagatgcat cacaccgtat gaactgacac caggagctac cgtccctttc 9721 ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca gctaaagcgg ccacatacca agaggctgcg 9781 atatacctgt ggaacgagca gcaacctttg ttttggctac aagcccttat tccgctggca 9841 gccctgattg ttctatgcaa ctgtctgaga ctcttaccat gctgctgtaa aacgttggct 9901 tttttagccg taatgagcgt cggtgcccac actgtgagcg cgtacgaaca cgtaacagtg 9961 atcccgaaca cggtgggagt accgtataag actctagtca atagacctgg ctacagcccc 10021 atggtattgg agatggaact actgtcagtc actttggagc caacactatc gcttgattac 10081 atcacgtgcg agtacaaaac cgtcatcccg tctccgtacg tgaagtgctg cggtacagca 10141 gagtgcaagg acaaaaacct acctgactac agctgtaagg tcttcaccgg cgtctaccca 10201 tttatgtggg gcggcgccta ctgcttctgc gacgctgaaa acacgcagtt gagcgaagca 10261 cacgtggaga agtccgaatc atgcaaaaca gaatttgcat cagcatacag ggctcatacc 10321 gcatctgcat cagctaagct ccgcgtcctt taccaaggaa ataacatcac tgtaactgcc 10381 tatgcaaacg gcgaccatgc cgtcacagtt aaggacgcca aattcattgt ggggccaatg 10441 tcttcagcct ggacaccttt cgacaacaaa attgtggtgt acaaaggtga cgtctataac 10501 atggactacc cgccctttgg cgcaggaaga ccaggacaat ttggcgatat ccaaagtcgc 10561 acacctgaga gtaaagacgt ctatgctaat acacaactgg tactgcagag accggctgtg 10621 ggtacggtac acgtgccata ctctcaggca ccatctggct ttaagtattg gctaaaagaa 10681 cgcggggcgt cgctgcagca cacagcacca tttggctgcc aaatagcaac aaacccggta 10741 agagcggtga actgcgccgt agggaacatg cccatctcca tcgacatacc ggaagcggcc 10801 ttcactaggg tcgtcgacgc gccctcttta acggacatgt cgtgcgaggt accagcctgc 10861 acccattcct cagactttgg gggcgtcgcc attattaaat atgcagccag caagaaaggc 10921 aagtgtgcgg tgcattcgat gactaacgcc gtcactattc gggaagctga gatagaagtt 10981 gaagggaatt ctcagctgca aatctctttc tcgacggcct tagccagcgc cgaattccgc 11041 gtacaagtct gttctacaca agtacactgt gcagccgagt gccacccccc gaaggaccac 11101 atagtcaact acccggcgtc acataccacc ctcggggtcc aggacatctc cgctacggcg 11161 atgtcatggg tgcagaagat cacgggaggt gtgggactgg ttgttgctgt tgccgcactg 11221 attctaatcg tggtgctatg cgtgtcgttc agcaggcact aacttgacaa ttaagtatga 11281 aggtatatgt gtcccctaag agacacactg tacatagcaa ataatctata gatcaaaggg 11341 ctacgcaacc cctgaatagt aacaaaatat aaaatcacta aaaattataa aaacagaaaa 11401 atacataaat aggtatacgt gtcccctaag agacacattg tatgtaggtg ataagtatag 11461 atcaaagggc cgaataaccc ctgaatagta acaaaatatg aaaatcaata aaaatcataa 11521 aatagaaaaa ccataaacag aagtagttca aagggctata aaacccctga atagtaacaa 11581 aacataaaat taataaaaat c
(SEQ ID NO: 103)
El fragmento 7516-11262 de la SEQ ID NO: 103 es la CDS que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1.
El fragmento 8491-11262 de la SEQ ID NO: 103 codifica las glucoproteínas E1, 6K y E2.
El fragmento 8491-9759 de la SEQ ID NO: 103 es la CDS que codifica la glucoproteína E2.
El fragmento 9943-11262 de la SEQ ID NO: 103 es la CDS que codifica la glucoproteína E1.
El fragmento 7516-11262 de la SEQ ID NO: 103 (SEQ ID NO: 104) es la versión de tipo silvestre de la secuencia de SEQ ID NO: 101 y 102.
La SEQ ID NO: 104 es:
7516 atgga gttcatccca acccaaactt tttacaatag gaggtaccag 7561 cctcgaccct ggactccgcg ccctactatc caagtcatca ggcccagacc gcgccctcag 7621 aggcaagctg ggcaacttgc ccagctgatc tcagcagtta ataaactgac aatgcgcgcg 7681 gtaccccaac agaagccacg caggaatcgg aagaataaga agcaaaagca aaaacaacag 7741 gcgccacaaa acaacacaaa tcaaaagaag cagccaccta aaaagaaacc ggctcaaaag 7801 aaaaagaagc cgggccgcag agagaggatg tgcatgaaaa tcgaaaatga ttgtattttc 7861 gaagtcaagc acgaaggtaa ggtaacaggt tacgcgtgcc tggtggggga caaagtaatg 7921 aaaccagcac acgtaaaggg gaccatcgat aacgcggacc tggccaaact ggcctttaag 7981 cggtcatcta agtatgacct tgaatgcgcg cagatacccg tgcacatgaa gtccgacgct 8041 tcgaagttca cccatgagaa accggagggg tactacaact ggcaccacgg agcagtacag 8101 tactcaggag gccggttcac catccctaca ggtgctggca aaccagggga cagcggcaga 8161 ccgatcttcg acaacaaggg acgcgtggtg gccatagtct taggaggagc taatgaagga 8221 gcccgtacag ccctctcggt ggtgacctgg aataaagaca ttgtcactaa aatcaccccc 8281 gagggggccg aagagtggag tcttgccatc ccagttatgt gcctgttggc aaacaccacg 8341 ttcccctgct cccagccccc ttgcacgccc tgctgctacg aaaaggaacc ggaggaaacc 8401 ctacgcatgc ttgaggacaa cgtcatgaga cctgggtact atcagctgct acaagcatcc 8461 ttaacatgtt ctccccaccg ccagcgacgc agcaccaagg acaacttcaa tgtctataaa 8521 gccacaagac catacttagc tcactgtccc gactgtggag aagggcactc gtgccatagt 8581 cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa gcgacagacg ggacgctgaa aatccaggtc 8641 t C C t t y C a d a t C y y d a t a d a . y a C y y a t y a C a y C C a C y a t t y y a C C d a y C t y C y t t a . t a . t C f 8701 gacaaccaca tgccagcaga cgcagagagg gcggggctat ttgtaagaac atcagcaccg 8761 tgtacgatta ctggaacaat gggacacttc atcctggccc gatgtccaaa aggggaaact 8821 ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag attagtcact catgtacgca cccatttcac 8881 cacgaccctc ctgtgatagg tcgggaaaaa ttccattccc gaccgcagca cggtaaagag 8941 ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc gccgcaacta ccgaggagat agaggtacac 9001 atgcccccag acacccctga tcgcacatta atgtcacaac agtccggcaa cgtaaagatc 9061 acagtcaatg gccagacggt gcggtacaag tgtaattgcg gtggctcaaa tgaaggacta 9121 acaactacag acaaagtgat taataactgc aaggttgatc aatgtcatgc cgcggtcacc 9181 aatcacaaaa agtggcagta taactcccct ctggtcccgc gtaatgctga acttggggac 9241 cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg ctggcaaatg taacatgcag ggtgcctaaa 9301 gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa aaccaagtca tcatgctact gtatcctgac 9361 cacccaacac tcctgtccta ccggaatatg ggagaagaac caaactatca agaagagtgg 9421 gtgatgcata agaaggaagt cgtgctaacc gtgccgactg aagggctcga ggtcacgtgg 9481 ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg cagttatcta caaacggtac agcccatggc 9541 cacccgcacg agataattct gtattattat gagctgtacc ccactatgac tgtagtagtt 9601 gtgtcagtgg ccacgttcat actcctgtcg atggtgggta tggcagcggg gatgtgcatg 9661 tgtgcacgac gcagatgcat cacaccgtat gaactgacac caggagctac cgtccctttc 9721 ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca gctaaagcgg ccacatacca agaggctgcg 9781 atatacctgt ggaacgagca gcaacctttg ttttggctac aagcccttat tccgctggca
Claims (26)
1. Un proceso de producción de un virus de ARN atenuado o de un clon de ADNc atenuado del mismo, mediante la atenuación de un virus de ARN infeccioso o de un clon de ADNc infeccioso del mismo, en donde dicho virus de ARN infeccioso o clon de ADNc infeccioso del mismo comprende una ARN polimerasa dependiente de ARN, en donde dicho proceso comprende
proporcionar un virus de ARN infeccioso o un clon de ADNc infeccioso del mismo, en donde dicho clon de ADNc infeccioso comprende la secuencia de ADNc, que es la retrotranscripción de la CDS del genoma de dicho virus de ARN,
que modifica el genoma de ARN de dicho virus de ARN infeccioso o la secuencia de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc, respectivamente,
en donde dicha modificación comprende reemplazar al menos un codón, que codifica Leu, Ser, Arg o Gly en dicho virus de ARN infeccioso o clon de ADNc infeccioso, por un codón diferente pero sinónimo,
en donde dicho codón diferente pero sinónimo es un codón, que difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA.
2. El proceso de la reivindicación 1, en donde
- dicho al menos un codón, que codifica Leu en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo, se selecciona entre CUU, CUC, CUA y CUG en dicho virus de ARN infeccioso o entre CTT, CTC, CTA y CTG en dicho clon de ADNc infeccioso y en donde el codón de Leu diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, se selecciona entre UUA o UUG para la atenuación de dicho virus de ARN o entre TTA y TTG para la atenuación de dicho clon de ADNc, respectivamente; y/o
- dicho al menos un codón, que codifica Ser en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo, se selecciona entre AGU, AGC, UCU y UCC en dicho virus de ARN infeccioso o entre AGT, AGC, TCT y TCC en dicho clon de ADNc infeccioso y en donde el codón de Ser diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, se selecciona entre UCA o UCG para la atenuación de dicho virus de ARN o entre TCA y TCG para la atenuación de dicho clon de ADNc, respectivamente; y/o
- dicho al menos un codón, que codifica Arg en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo, se selecciona entre AGA, AGG, CGU, CGC o CGG en dicho virus de ARN infeccioso o entre AGA, AGG, CGT, CGC o CGG en dicho clon de ADNc infeccioso y en donde el codón de Arg diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, es CGA para la atenuación de dicho virus de ARN o para la atenuación de dicho clon de ADNc, respectivamente; y/o
- dicho al menos un codón, que codifica Gly en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo, se selecciona entre GGG, GGU o GGC en dicho virus de ARN infeccioso o entre GGG, GGT o GGC en dicho clon de ADNc infeccioso y en donde el codón de Gly diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, es GGA para la atenuación de dicho virus de ARN o para la atenuación de dicho clon de ADNc, respectivamente.
3. El proceso de la reivindicación 1 o 2, en donde
- dicho al menos un codón, que codifica Ser en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo, se selecciona entre AGU y AGC en dicho virus de ARN infeccioso o entre AGT y AGC en dicho clon de ADNc infeccioso y en donde el codón de Ser diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, se selecciona entre UCA o UCG para la atenuación de dicho virus de ARN o entre TCA y TCG para la atenuación de dicho clon de ADNc, respectivamente; y/o
- dicho al menos un codón, que codifica Arg en dicho virus de ARN infeccioso o dicho clon de ADNc infeccioso y que se reemplaza por un codón diferente pero sinónimo, se selecciona entre AGA y AGG en dicho virus de ARN infeccioso o en dicho clon de ADNc infeccioso y en donde el codón de Arg diferente pero sinónimo, que lo reemplaza, es CGA para la atenuación de dicho virus de ARN o para la atenuación de dicho clon de ADNc, respectivamente.
4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha modificación comprende reemplazar al menos un codón que codifica Leu y al menos un codón que codifica Ser como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o comprende el reemplazo de al menos un codón que codifica Leu, al menos un codón que codifica Ser, al menos un codón que codifica Arg y al menos un codón que codifica Gly como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha modificación comprende además seleccionar al menos un codón, que codifica Thr o Ala en dicho virus de ARN infeccioso o clon de ADNc infeccioso y que difiere en tan solo un nucleótido de un codón, que codifica Ser reemplazar dicho al menos un codón de Thr o Ala por un codón diferente y no sinónimo, en donde dicho codón diferente y no sinónimo codifica Ser y difiere en tan solo un nucleótido de un codón de PARADA.
6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha modificación comprende reemplazar varios codones como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 1-4 y 5 o 5 y en donde el número de
codones que se reemplazan de este modo es del 2-30 % del número total de codones del genoma de dicho virus de ARN infeccioso o del número total de codones de la secuencia de la CDS de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc, respectivamente.
7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia codificante del genoma de dicho virus de ARN infeccioso o la secuencia de la CDS de ADNc retrotranscrita de dicho clon de ADNc consiste en 2.000 30.000 nucleótidos.
8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha modificación comprende el reemplazo de varios codones como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 1-4 y 5 o 5 y en donde el número de codones que se reemplaza de este modo es de más de 100.
9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho virus de ARN es un virus de ARN monocatenario.
10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho virus de ARN es un virus de Coxsackie o un virus de la gripe o un virus Chikunguña o un virus O'Nyong-Nyong.
11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha modificación comprende el reemplazo de varios codones como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 1-4 y 5 o 5 y en donde
- dicho virus de ARN infeccioso es un virus de Coxsackie y dichos varios codones son codones de la secuencia codificante de P1 de dicho virus de Coxsackie o
- dicho virus de ARN es un virus de la gripe y dichos varios codones son codones de las secuencias codificantes de PA y/o HA de dicho virus de la gripe o
- dicho virus de ARN es un virus Chikunguña y dichos varios codones son codones de la secuencia codificante de C-E3-E2-6K-E1 de dicho virus Chikunguña.
12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el sesgo de pares de codones de dicho virus modificado o clon de ADNc modificado no es diferente del sesgo de pares de codones de dicho virus de ARN infeccioso o clon de ADNc infeccioso; y/o en donde el sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA de dicho virus modificado no es diferente del sesgo de dinucleótidos de CpG y UpA de dicho virus de ARN infeccioso y en donde el sesgo de dinucleótidos de CpG y TpA de dicho clon de ADNc modificado no es diferente del sesgo de dinucleótidos de CpG y TpA de dicho clon de ADNc infeccioso.
13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dichas modificaciones comprenden además reemplazar la ARN polimerasa dependiente de ARN de dicho virus de ARN infeccioso por una ARN polimerasa dependiente de ARN, que tiene una menor fidelidad de copia.
14. Un virus vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del virus, que puede obtenerse mediante el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y
que es un virus de Coxsackie vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Leu en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo se seleccionan todos entre UUA y UUG para dicho virus vivo y atenuado o entre TTA y TTG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado y en donde los codones que codifican Ser en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo se seleccionan entre UCA y u Cg para dicho virus vivo y atenuado o entre TCA y TCG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado o que es un virus de la gripe vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Leu en las proteínas PA y/o HA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo se seleccionan todos entre UUA y UUG para dicho virus vivo y atenuado o entre TTA y TTG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado y en donde los codones que codifican Ser en las proteínas PA y/o HA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo se seleccionan entre UCA y UCG para dicho virus vivo y atenuado o entre TCA y TCG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado o
que es un virus Chikunguña vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Leu en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo se seleccionan todos entre UUA y UUG para dicho virus vivo y atenuado o entre TTA y TTG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado y en donde los codones que codifican Ser en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo se seleccionan entre UCA y UCG para dicho virus vivo y atenuado o entre TCA y TCG para dicho clon de ADNc vivo y atenuado.
15. El virus vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado del virus de la reivindicación 14,
que es un virus de Coxsackie vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de la Se Q ID NO: 14 o la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 14, respectivamente; o
que es un virus de la gripe vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia que codifica la proteína PA de la gripe comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 54 o 56 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 54 o 56, respectivamente; o
que es un virus de la gripe vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia codificante para la proteína HA de la gripe comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87, respectivamente; o
que es un virus de la gripe vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia que codifica la proteína PA de la gripe comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 54 o 56 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 54 o 56, respectivamente y en donde la secuencia que codifica la proteína HA de la gripe comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 87, respectivamente; o
que es un virus Chikunguña vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, y en donde la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID No : 101 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 101, respectivamente.
16. El virus vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado de la reivindicación 14, que es un virus de Coxsackie vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Arg en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o el clon de ADNc del mismo son todos CGA y en donde los codones que codifican Gly en la proteína P1 de dicho virus de Coxsackie vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos GGA; o
que es un virus de la gripe vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Arg en las proteínas Pa y/o HA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos CGA y en donde los codones que codifican Gly en las proteínas Pa y/o HA de dicho virus de la gripe vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos GGA; o
que es un virus Chikunguña vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde los codones que codifican Arg en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos CGA y en donde los codones que codifican Gly en las proteínas E1 y/o E2 de dicho virus Chikunguña vivo y atenuado o clon de ADNc del mismo son todos GGA.
17. El virus vivo y atenuado o el clon de ADNc vivo y atenuado de la reivindicación 16, que es un virus de Coxsackie vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, en donde la secuencia que codifica la proteína P1 del virus de Coxsackie comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 85 o la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 85, respectivamente; o
que es un virus Chikunguña vivo y atenuado o un clon de ADNc vivo y atenuado del mismo, y en donde la secuencia que codifica la poliproteína C-E3-E2-6K-E1 del virus Chikunguña comprende el transcrito de ARN de la secuencia de ADNc de SEQ ID No : 102 o la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 102, respectivamente.
18. Una composición inmunogénica, que comprende el virus vivo y atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17 o el clon de ADNc vivo y atenuado del virus de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17.
19. El virus vivo y atenuado o el clon de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17 para su uso en un método para tratar o proteger contra una infección por un virus de ARN en un hospedador mamífero.
20. La composición de acuerdo con la reivindicación 19 para su uso en la prevención y/o tratamiento y/o paliación de una infección por un virus de ARN o de una enfermedad o trastorno inducido por un virus de ARN.
21. Un método para producir la composición de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende producir el virus vivo y atenuado o el clon de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en un medio de cultivo, opcionalmente recoger las partículas víricas o viriones producidas por dicho virus o clon y formular dicho virus o clon cultivado o dichas partículas víricas recogidas en una composición adecuada para su administración a un animal.
22. Un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, 54, 56, 85, 87, 101 y 102.
23. Un vector de ácido nucleico, que comprende al menos uno de los ácidos nucleicos como se definen en la reivindicación 22.
24. Un medio de cultivo, que comprende al menos uno de los virus vivos y atenuados o el clon de ADNc vivo y atenuado del virus de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17.
25. Un producto de programa informático para su almacenamiento en una memoria de una unidad de procesamiento o en un soporte de memoria extraíble para la cooperación con un lector de dicha unidad de procesamiento, en donde dicho producto de programa informático comprende instrucciones para llevar a cabo el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
26. Un dispositivo informático, que comprende una unidad de procesamiento en cuya memoria se almacena un producto de programa informático de la reivindicación 25.
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