ES2755101T3

ES2755101T3 - Nuevos compuestos y conjugados de criptoficina, su preparación y su uso terapéutico

Info

Publication number: ES2755101T3
Application number: ES16791017T
Authority: ES
Inventors: Antony Bigot; Hervé Bouchard; Marie-Priscille Brun; François Clerc; Jidong Zhang
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2036-11-03
Also published as: SG11201803181SA; CL2018001210A1; TWI714661B; ECSP18034035A; RS59498B1; US10941139B2; CA3003085A1; WO2017076998A1; JP2018535255A; MY189448A; AU2016347724A1; PH12018500852B1; DK3371179T3; IL259067B; EA201890898A1; MX374535B; AR106604A1; CR20180256A; TW201730164A; JP6929292B2

Abstract

Compuesto de criptoficina de fórmula (I):**Fórmula** en donde: - R1 representa un grupo alquilo(C1-C6); - R2 y R3 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6); o alternativamente R2 y R3 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o hetercicloalquilo(C3-C6); - R4 y R5 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-NH(R12) o un grupo alquilo(C1-C6)-OH o un grupo alquilo(C1-C6)-SH o un grupo alquilo(C1-C6)-CO2H; o alternativamente R4 y R5 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o hetercicloalquilo(C3-C6); - R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6); - R7 y R8 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-CO2H o un grupo alquilo(C1-C6)-Nalquilo(C1-C6)2; o alternativamente R7 y R8 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o un grupo hetercicloalquilo(C3-C6); - R9 representa uno o más sustituyentes del núcleo de fenilo elegidos, independientemente entre sí, de: un átomo de hidrógeno, -OH, alcoxi(C1-C4), un átomo de halógeno, -NH2, -NHalquilo(C1-C6) o -Nalquilo(C1-C6)2 o - NHcicloalquilo(C1-C6) o heterocicloalquilo(C3-C6); - R10 representa al menos un sustituyente del núcleo de fenilo elegido de un átomo de hidrógeno y alquilo(C1-C4); - W representa - alquilo(C1-C6)-NH(R11), - alquilo(C1-C6)-OH, - alquilo(C1-C6)-SH, - CO2H o C(=O)NH2; - alquilo(C1-C6)-CO2H o alquilo(C1-C6)-C(=O)NH2; o - alquilo(C1-C6)-N3. - R11 y R12 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6).

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos compuestos y conjugados de criptoficina, su preparación y su uso terapéutico

La presente invención se refiere a nuevos compuestos de criptoficina, a nuevas cargas eficaces de criptoficina, a nuevos conjugados de criptoficina, a composiciones que los contienen y a su uso terapéutico, especialmente como agentes anticancerosos. La invención también se refiere al proceso para preparar estos conjugados.

Las criptoficinas son metabolitos secundarios que pertenecen a la clase de macrociclos de depsipéptido producidos por cianobacterias del género Nostoc. El primer representante de esta clase de moléculas, criptoficina-1 (C-1), se aisló en 1990 a partir de la cianobacteria Nostoc sp (ATCC 53789; véase EiRler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747 3789). A principios de los años 90, se halló que las criptoficinas C-1 y C-52, que se caracterizan por una función epóxido, tienen actividad antitumoral in vitro e in vivo. Las clorohidrinas de estas, C-8 y C-55, eran marcadamente más activas, pero no se pudieron formular como disoluciones estables (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33). Su actividad más alta se correlacionó con su capacidad putativa para generar los epóxidos correspondientes en células. Sin un método adecuado para estabilizar las clorohidrinas en aquel momento, la criptoficina C-52 (LY355703) pasó a ensayos clínicos, produjo actividad antitumoral marginal en dos ensayos de fase II en cáncer de pulmón con 30-40 % de enfermedad estable y, por lo tanto, se suspendió (Edelman M.J., et al., Lung Cancer 2003, 39, 197-99 y Sessa C., et al., Eur J. Cancer 2002, 38, 2388-96).

Al tomar en consideración su elevada potencia y mecanismo de acción común con maitansinoides y auristatinas, las dos moléculas citotóxicas se validaron en la clínica para conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés), esta serie se consideró como posible agente de unión a tubulina para el ADC. Por lo tanto, se desarrollaron conjugados en la serie de criptoficina partiendo de la derivación en la posición para-bencílica del macrociclo (Al-Awar R.S., et al., J Med Chem 2003, 46, 2985-3007).

El documento WO2011/001052 describe conjugados anticuerpo-fármaco de criptoficina en los cuales el resto citotóxico se enlaza con el anticuerpo a través de la posición para-bencílica mediante el uso de diversos tipos de enlazadores. Podrían ser escindibles, sensibles a disulfuro o proteasa o no escindibles.

La optimización adicional de los conjugados anticuerpo-fármaco de criptoficina descrita en el documento WO2011/001052 condujo a potentes conjugados de criptoficina que exhibieron actividad antitumoral alentadora, pero se halló que eran inestables en el plasma de ratones, mientras que eran estables en el plasma de especies no roedoras. Por lo tanto, existía la necesidad de conjugados de criptoficina que exhibieran propiedades de estabilidad mejoradas.

El objetivo de la presente invención es el de proponer nuevos macrociclos de criptoficina que, tras conjugarse con un anticuerpo, son estables en el plasma de ratones y nuevos conjugados de criptoficina compuestos por dichos macrociclos estables.

Compendio de la invención

En este sentido, la invención se refiere a compuestos de criptoficina de fórmula (I):

■ Ri representa un grupo alquilo(C1-C6);

■ R2 y R3 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(Ci-C6); o alternativamente R2 y R3 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o hetercicloalquilo(C3-C6);

■ R4 y R5 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-NH(R12) o un grupo alquilo(C1-C6)-OH o un grupo alquilo(C1-C6)-SH o un grupo alquilo(C1-C6)-CO2H; o alternativamente R4 y R5 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o hetercicloalquilo(C3-C6);

■ R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6);

■ R7 y Rs representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-CO2H o un grupo alquilo(C1-C6)-Nalquilo(C1-C6)2;

o alternativamente R7 y Rs forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o un grupo hetercicloalquilo(C3-C6);

■ R9 representa uno o más sustituyentes del núcleo de fenilo elegidos, independientemente entre sí, de: un átomo de hidrógeno, -OH, alcoxi(C1-C4), un átomo de halógeno, -NH2, -NHalquilo(C1-C6),-Nalquilo(C1-C6)2, -NHcicloalquilo(C1-C6) o heterocicloalquilo(C3-C6);

■ R10 representa al menos un sustituyente del núcleo de fenilo elegido de un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo(C1-C4);

■ W representa

• alquilo(C1-C6)-NH(Rn), más particularmente (CH2)nNHRn;

• alquilo(C1-C6)-OH, más particularmente (CH2)nOH;

• alquilo(C1-C6)-SH, más particularmente (CH2)nSH;

• CO2H o C(=O)NH2;

• alquilo(C1-C6)-CO2H o alquilo(C1-C6)-C(=O)NH2; o

• alquilo(C1-C6)-N3.

W está ubicado en una posición ortho (o), meta (m) o para (p) del núcleo de fenilo;

■ R11 y R12 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un alquilo(C1-C6), más particularmente un grupo metilo;

■ n representa un número entero entre 1 y 6.

La invención se refiere, además, a cargas eficaces de criptoficina de fórmula (II):

■ R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9 y R10 son según se definieron en la fórmula (I);

■ Y representa alquilo(C1-C6)-NRn o alquilo(C1-C6)-O o alquilo(C1-C6)-S;

o alternativamente Y representa C(=O)O, C(=O)NH, alquilo(C1-C6)-C(=O)O o alquilo(C1-C6)-C(=O)NH; o alternativamente Y representa alquilo(C1-C6)-triazol- como

Y está ubicado en una posición ortho (o), meta (m) o para (p) del núcleo de fenilo;

■ R11 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6);

■ L representa un enlazador;

■ RCG1 representa un grupo químico reactivo presente en el extremo del enlazador, RCG1 es

reactivo a un grupo químico reactivo presente en un anticuerpo.

La invención también se refiere a conjugados de

fórmula (III):

■ Y y L son según se definieron en la fórmula (II);

■ G representa el producto de reacción entre RCG1, un grupo químico reactivo presente en el extremo del enlazador y RCG2, un grupo químico reactivo ortogonal presente en el anticuerpo (Ab);

■ Ab representa un anticuerpo.

Cada sustituyente R1 a R11 también puede adoptar una de las configuraciones espaciales (p. ej., R o S o alternativamente Z o E), según se describe en los ejemplos.

Los compuestos de fórmula (I), (II) y (III) pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricos. Por lo tanto, pueden existir en forma de enantiómeros o de diastereoisómeros. Estos enantiómeros y diastereoisómeros, y además mezclas de estos, incluidas mezclas racémicas, forman parte de la invención.

Los compuestos de fórmula (I), incluidos los que se ilustran, pueden existir en forma de bases o de sales de adición de ácido, especialmente de ácidos farmacéuticamente aceptables.

Definiciones

En el contexto de la presente invención, ciertos términos tienen las siguientes definiciones:

□ grupo alquenilo: un grupo hidrocarburo obtenido al retirar un átomo de hidrógeno de un alqueno. El grupo alquenilo puede ser lineal o ramificado. Los ejemplos que se pueden mencionar incluyen etenilo (-CH=CH2, también denominado vinilo) y propenilo (-CH2-CH=CH2, también denominado alilo).

□ grupo alcoxi: un grupo -O-alquilo, en el que el grupo alquilo es según se define a continuación;

□ grupo alquilo: un grupo lineal o ramificado saturado alifático basado en hidrocarburo obtenido al retirar un átomo de hidrógeno de un alcano. Los ejemplos que se pueden mencionar incluyen grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, tere-butilo, pentilo, neopentilo, 2,2-dimetilpropilo y hexilo;

□ grupo alquileno: un grupo divalente saturado de fórmula empírica -CnH2n-, obtenido al retirar dos átomos de hidrógeno de un alcano. El grupo alquileno puede ser lineal o ramificado. Los ejemplos que se pueden mencionar incluyen grupos metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-), butileno (-CH2CH2CH2CH2-) y hexileno (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) o los siguientes grupos

ramificados ¡ preferiblemente, el grupo alquileno es de fórmula -(CH₂)n-, n representa un número entero; en los intervalos de valores, los límites están incluidos (p. ej., un intervalo del tipo "n que varía de 1 a 6" o "entre 1 y 6" incluye los límites 1 y 6);

□ anticuerpo: un anticuerpo con afinidad por una diana biológica, más particularmente, un anticuerpo monoclonal. La función del anticuerpo es dirigir el compuesto biológicamente activo como un compuesto citotóxico hacia la diana biológica. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o multiespecífico; también puede ser un fragmento de anticuerpo; también puede ser un anticuerpo murino, quimérico, humanizado o humano. Un "anticuerpo" puede ser un anticuerpo natural o convencional en el que dos cadenas pesadas están enlazadas entre sí mediante uniones disulfuro y cada cadena pesada está enlazada a una cadena ligera mediante una unión disulfuro (también denominado "anticuerpo de longitud completa"). Los términos "anticuerpo convencional (o de longitud completa)" se refieren a un anticuerpo que comprende el péptido señal (o propéptido, si lo hay), y a la forma madura obtenida después de la secreción y el procesamiento proteolítico de la(s) cadena(s). Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios o regiones, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados colectivamente CH). Las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento de unión y la especificidad por el antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas tales como asociación a cadena de anticuerpo, secreción, movilidad transplacentaria, unión a complemento y unión a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte del extremo N del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación del anticuerpo están compuestos por residuos que pertenecen principalmente a las regiones hipervariables o de determinación de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés). Ocasionalmente, los residuos de regiones no hipervariables o de marco (FR, por sus siglas en inglés) influyen sobre la estructura del dominio global y, por consiguiente, el sitio de combinación. Las regiones de determinación de la complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que definen juntas la afinidad de unión y especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión a inmunoglobulina natural. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, designadas CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L y CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo convencional, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera.

Según se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" denota anticuerpos convencionales (longitud completa) y fragmentos de estos, así como anticuerpos de dominio simple y fragmentos de estos, en particular, cadena pesada variable de anticuerpos de dominio simple. Los fragmentos de anticuerpos (convencionales) típicamente comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en particular, la región de unión a antígeno o región variable del anticuerpo intacto, y conservan la función biológica del anticuerpo convencional. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

La función del anticuerpo es dirigir el compuesto biológicamente activo como un compuesto citotóxico hacia la diana biológica.

• grupo arilo: un grupo cíclico aromático que contiene entre 5 y 10 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, tolilo, xililo, naftilo;

• diana biológica: un antígeno (o grupo de antígenos) preferiblemente ubicado en la superficie de células cancerosas o células estromales asociadas con este tumor; estos antígenos pueden ser, por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento, un producto de oncogén o un producto génico "supresor tumoral" mutado, una molécula relacionada con la angiogénesis o una molécula de adhesión;

• conjugado: un conjugado anticuerpo-fármaco o ADC, es decir, un anticuerpo al cual se acopla covalentemente a través de un enlazador al menos una molécula de un compuesto citotóxico;

• grupo cicloalquilo: un grupo alquilo cíclico que comprende entre 3 y 6 átomos de carbono unidos en la estructura cíclica. Los ejemplos que se pueden mencionar incluyen grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo;

• DAR (relación entre fármaco y anticuerpo): una cantidad promedio de moléculas citotóxicos acopladas a través de un enlazador a un anticuerpo;

• halógeno: cualquiera de los cuatro elementos flúor, cloro, bromo y yodo;

• grupo heteroarilo: un grupo arilo que contiene entre 2 y 10 átomos de carbono y entre 1 y 5 heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno o azufre unidos en el anillo y conectados con los átomos de carbono que forman el anillo. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, pirimidilo, tienilo, imidazolilo, triazolilo, indolilo, imidazo-piridilo, pirazolilo;

• grupo heterocicloalquilo: un grupo cicloalquilo que contiene entre 2 y 8 átomos de carbono y entre 1 y 3 heteroátomos, tales como nitrógeno, oxígeno o azufre unidos en el anillo y conectados con los átomos de carbono que forman el anillo. Los ejemplos incluyen aziridinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofu ran i lo, tetrahidropiranilo, azetidinilo, oxetanilo y piranilo;

• enlazador: un grupo de átomos o una unión simple que puede acoplar covalentemente un compuesto citotóxico a un anticuerpo para formar un conjugado;

• fragmento: moléculas más simples que permiten la síntesis total de compuestos de criptoficina;

• carga eficaz: un compuesto citotóxico al cual está unido covalentemente un enlazador;

• grupo químico reactivo: grupo de átomos que pueden promover o sufrir una reacción química.

Abreviaturas

ADC: conjugado anticuerpo-fármaco; AcOH: ácido acético; AIBN: azobisisobutironitrilo; ALK: grupo alquileno(C1-C12), más particularmente alquileno(C1-C6), más particularmente, de la forma -(CH2)n-, n es un número entero de 1 a 12 y preferiblemente de 1 a 6; ac.: acuoso/a; Ar: argón; AUC: área debajo de la curva; BEMP: 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilperhidro-1 ,3,2-diazafosforina; BF3: trifluoruro de boro; Boc2O: di-terc-butil-dicarbonato; BuLi: butil litio; CAN: nitrato de amonio cérico; Cbz: carboxibencilo; CHCta: cloroformo; CH3CN: acetonitrilo; CH3I: yoduro de metilo; CO2: dióxido de carbono; CL: aclaramiento; m-CPBA: ácido m-cloroperbenzoico; CR: respuesta completa; cripto denota la unidad de fórmula

criptoficina D1-D19 descritos más adelante o un compuesto de criptoficina de un ejemplo; D1 se refiere a un ADC con una DAR de 1, D2 a un ADC con una DAR de 2, etc.; d: día; DAR: relación entre fármaco y anticuerpo; DBU: 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; DCC: N,N'-diciclohexilcarbodiimida; DCE: dicloroetano; DCM: diclorometano; DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona; DIC: N,N'-diisopropilcarbodiimida; DIAD: diisopropilazodicarboxilato; DIEA: N,N-diisopropiletilamina; DMA: dimetilacetamida; DMAP: 4-(dimetilamino)piridina; DME: dimetoxietano; DMEM: Medio de Eagle modificado de Dulbecco; DMEM/F12: Medio de Eagle modificado de Dulbecco mezcla de nutrientes F-12; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DPBS: disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; DPPA: difenilfosforazida (PhO)2P(=O)N3; DSC: carbonato de N,N'-disuccinimidilo; EDA: etilenodiamina; EDC: 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; EDTA: ácido etilenodiaminatetraacético; EEDQ: N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina; ELSD: detector de difusión de luz con evaporación; eq.: equivalente; ES: electropulverización; EtOAc: acetato de etilo; Et2O: éter dietílico; EtOH: etanol; Ex.: ejemplo; FCS: suero bovino fetal; Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo; FmocOSu: N-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi) succinimida; GI: grupo electroinductivo; Grubbs I: bencilideno-bis(triciclohexilfosfina)diclororutenio; Grubbs II: (1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidinilideno)dicloro(fenilmetileno)(triciclohexilfosfina)rutenio; h: hora; H2O: agua; Hal: halógeno; HATU: hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido; HCl: ácido clorhídrico; HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico; HIC: cromatografía de interacción hidrófoba; HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol; HOBt: 1-hidroxi-benzotriazol; HPLC: cromatografía líquida de alto rendimiento; HRMS: espectrometría de masas de alta resolución; IC50: mediana de concentración inhibitoria; i.e.: id est que significa es decir; IEC: cromatografía de intercambio iónico; iPrOH: 2-propanol; iPr2O: éter diisopropílico; i.v.: intravenoso/a; K2CO3: carbonato potásico; LDA: diisopropilamida de litio; LiOH: hidróxido de litio; marg.: marginalmente; MeOH: metanol; MeTHF: 2-metil-tetrahidrofurano; MgSO4: sulfato de magnesio; min: minuto; MNBA : anhídrido 2-metil-6-nitrobenzoico; MTBE: metil terc-butil éter; MTD: dosis máxima tolerada; NaH: hidruro de sodio; NaHSO4: bisulfato de sodio; Na2S2O3: tiosulfato de sodio; NaCl: cloruro de sodio; NaHCO3: hidrógeno carbonato de sodio; NaHSO3: bisulfito de sodio; NaHSO4: hidrógeno sulfato de sodio; NaOH: hidróxido de sodio; NH4Cl: cloruro de amonio; NHS: N-hidroxisuccinimida; NMP: 1 -metil-2-pirrolidona; NMR: resonancia magnética nuclear; P2-Et: 1 -etil-2,2,4,4,4-pentakis(dimetilamino)-2A5,4A5-catenadi(fosfaceno); PBS: disolución salina tamponada con fosfato; PEG: polietilenglicol; PK: farmacocinética; PMB: para-metoxibencilo; PNGase F: Péptido-N-Glicosidasa F; PPh3: trifenilfosfina; ppm: partes por millón; PR: respuesta parcial; QS: quantum satis que significa la cantidad necesaria; Q-Tof: cuadrupolo tiempo de vuelo; cuant.: rendimiento cuantitativo; RCG: grupo químico reactivo; RT: temperatura ambiente; sat.: saturado/a; s.c.: subcutáneamente; SCID: inmunodeficiencia combinada grave; SEC: cromatografía

de exclusión por tamaño; TBAF: fluoruro de tetrabutilamonio; tBuOK: ferc-butóxido de potasio; TCEP: clorhidrato de

tris(2-carboxietil)fosfina; TEA: trietilamina; TEMPO: (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)oxilo; TFA: ácido trifluoroacético;

TFS: superviviente sin tumor; THF: tetrahidrofurano; THP: tetrahidropirano; TLC: cromatografía de capa delgada; t1/2:

semivida; tR: tiempo de retención; p-TsOH: ácido para-toluenosulfónico; UPLC: cromatografía líquida de

ultrarrendimiento; UV: ultravioleta; Vss: volumen aparente de distribución en situación de equilibrio.

Figuras

Figura 1: Espectro de masa de alta resolución del Ej. 3

Figura 2: Espectro de masa de alta resolución del Ej. 7

Figura 3: Espectro de masa de alta resolución del Ej. 10

Figura 4: Espectro de masa de alta resolución del Ej. 14

Figura 5: Espectro de masa de alta resolución del Ej. 20

Figura 6: Espectro de masa de alta resolución del Ej. 23

Figura 7: Eficacia in vivo del Ej. 3 contra xenoinjerto de MDA-MB-231 en ratones SCID

Figura 8: Eficacia in vivo del Ej. 7 contra xenoinjerto de MDA-MB-231 en ratones SCID

Figura 9: Eficacia in vivo del Ej. 10 contra xenoinjerto de MDA-MB-231 en ratones SCID

Figura 10: Eficacia in vivo del Ej. 14 contra xenoinjerto de MDA-MB-231 en ratones SCID

Figura 11: Eficacia in vivo del Ej. 20 contra xenoinjerto de MDA-MB-231 en ratones SCID

Figura 12: Eficacia in vivo del Ej. 23 contra xenoinjerto de MDA-MB-231 en ratones SCID

Figura 13: Perfil PK in vivo de ADC1 después de una única administración i.v. en ratones SCID

Figura 14: Perfil PK in vivo de ADC1 después de una única administración i.v. en especie no roedora

Figura 15: Perfil PK in vivo del Ej. 3 después de una única administración i.v. en ratones SCID

Figura 16: Perfil PK in vivo del Ej. 7 después de una única administración i.v. en ratones SCID

Figura 17: Espectro de HRMS de ADC1 desglicosilado 96 h después de una única administración i.v. en ratones

SCID

Figura 18: Espectro de HRMS de cadena ligera de ADC296 h después de una única administración i.v. en ratones

SCID

Figura 19: Espectro de HRMS de ADC1 desglicosilado 6 d después de una única administración i.v. en especie no

roedora

Figura 20: Espectro de HRMS del Ej. 396 h después de una única administración i.v. en ratones SCID

Figura 21: Espectro de HRMS del Ej. 796 h después de una única administración i.v. en ratones SCID

Figura 22: Espectro de HRMS del

Ej.1096 h después de una única administración i.v. en ratones SCID Figura 23: Espectro de HRMS del

Ej.1496 h después de una única administración i.v. en ratones SCID Figura 24: Espectro de HRMS del Ej.2096 h después de una única administración i.v. en ratones SCID Figura 25: Espectro de HRMS del Ej.2396 h después de una única administración i.v. en ratones SCID Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a compuestos de criptoficina de fórmula (I):

■ Ri representa un grupo alquilo(Ci-C6);

■ R2 y R3 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6); o alternativamente R2 y R3 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6) o hetercicloalquilo(C3-C6);

■ R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6);

■ R9 representa uno o más sustituyentes del núcleo de fenilo elegidos, independientemente entre sí, de: un átomo de hidrógeno, -OH, alcoxi(C1-C4), un átomo de halógeno, -NH2, -NHalquilo(C1-C6) o -Nalquilo(C1-C6)2 o -NHcicloalquilo(C1-C6) o un grupo heterocicloalquilo(C3-C6);

■ W representa

• alquilo(C1-C6)-NH(Rn), más particularmente (CH2)nNHRn;

• alquilo(C1-C6)-OH, más particularmente (CH2)nOH;

• alquilo(C1-C6)-SH, más particularmente (CH2)nSH;

• CO2H o C(=O)NH2;

• alquilo(C1-C6)-CO2H o alquilo(C1-C6)-C(=O)NH2; o

• alquilo(C1-C6)-N3.

■ R11 y R12 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6), más particularmente un grupo metilo;

■ n representa un número entero entre 1 y 6.

El compuesto de criptoficina puede ser uno de los siguientes D1-D19:

■ W y R12 son según se definieron en la fórmula (I);

O el compuesto de criptoficina puede ser una unidad equivalente descrita en uno de los ejemplos.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un primer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Ri representa un alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un segundo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que cada uno de R2 y R3 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un tercer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que uno de R2 y R3 representa un alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo, y el otro representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un cuarto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R2 y R3 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6), en particular, un grupo ciclopropilo.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un quinto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que cada uno de R4 y R5 representa un alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un sexto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R6 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un séptimo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R7 y Rs representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6).

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un octavo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro. Más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo. Preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un noveno grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Río representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un décimo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que W está ubicado en la posición para del núcleo de fenilo.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimoprimer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que W se selecciona de alquilo(C1-C6)-NHRn , en particular, alquilo(C1-C3)-NHR11, particularmente, un grupo CH2-NH2, alquilo(C1-C6)-OH, en particular alquilo(C1-C3)-OH, particularmente, un grupo CH2-OH, alquilo(C1-C6)-SH, en particular alquilo(C1-C3)-SH y alquilo(C1-C6)-CO2H, en particular, alquilo(C1-C3)-CO2H.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimosegundo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Rí representa un alquilo(C1-C6), en particular un grupo metilo, cada uno de R2 y R3 representa un átomo de hidrógeno, R6 representa un átomo de hidrógeno, R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro, más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo, preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi y Río representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimotercer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Rí representa un alquilo(C1-C6), en particular un grupo metilo, R2 y R3 representa un alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo, y el otro representa un átomo de hidrógeno, R6 representa un átomo de hidrógeno, R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro, más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo, preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi y Río representa un átomo de hidrógeno.

Alternativamente, W se selecciona de (CH2)nNHRn , (CH2)nSH de (CH2)nOH, en donde n representa un número entero entre 1 y 6.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimocuarto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos de la siguiente estructura (configuración epóxido beta):

Todos estos subgrupos tomados solos o en combinación son parte de la invención.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son el objeto de la invención, se pueden mencionar en particular los siguientes compuestos:

en donde:

■ Ri , R2, R3, R4, R5, R6, R7, R7, R9 y R10 son según se definieron en la fórmula (I);

■ Y representa alquilo(Cr C6)-NRn o alquilo(Cr C6)-O o alquilo(Cr C6)-S;

Y está ubicado en una posición ortho (o), meta (m) o para (p) del núcleo de fenilo;

■ R11 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6);

■ L representa un enlazador;

■ RCG1 representa un grupo químico reactivo presente en el extremo del enlazador, RCG1 es reactivo a un grupo químico reactivo presente en un anticuerpo.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un primer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R1 representa un alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un segundo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que cada uno de R2 y R3 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un tercer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que uno de R2 y R3 representa un grupo alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo, y el otro representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un cuarto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R2 y R3 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6), en particular, un grupo ciclopropilo.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un quinto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que cada uno de R4 y R5 representa un grupo alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un sexto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R6 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un séptimo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R7 y Rs representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6).

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un octavo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro. Más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo. Preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un noveno grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R10 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un décimo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Y está ubicado en la posición para del núcleo de fenilo.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un decimoprimer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Y representa alquilo(C1-C6)-NRn , en particular alquilo(C1-C3)-NRn , más particularmente CH2-NH.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimosegundo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Ri representa un alquilo(C1-C6), en particular un grupo metilo, cada uno de R2 y R3 representa un átomo de hidrógeno, R6 representa un átomo de hidrógeno, R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro, más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo, preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi y R10 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimotercer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Ri representa un alquilo(C1-C6), en particular un grupo metilo, R2 y R3 representa un alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo, y el otro representa un átomo de hidrógeno, R6 representa un átomo de hidrógeno, R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro, más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo, preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi y R10 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son objeto de la invención, un decimocuarto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos de la siguiente estructura (configuración epóxido beta):

Entre los compuestos de la fórmula (II) que son el objeto de la invención, se pueden mencionar en particular los siguientes compuestos:

■ R i, R2, R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9 y Río son según se definieron en la fórmula (I);

■ Y y L son según se definieron en la fórmula (II);

■ Ab representa un anticuerpo.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un primer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Ri representa un alquilo(CrC6), en particular, un grupo metilo.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un segundo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que cada uno de R2 y R3 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un tercer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que uno de R2 y R3 representa un grupo alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo, y el otro representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un cuarto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R2 y R3 forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C3-C6), en particular, un grupo ciclopropilo.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un quinto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que cada uno de R4 y R5 representa un grupo alquilo(C1-C6), en particular, un grupo metilo.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un sexto grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R6 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un séptimo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R7 y Rs representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6).

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un octavo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R9 representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro. Más particularmente, el núcleo de fenilo comprende dos sustituyentes en las posiciones 3 y 4 en el núcleo de fenilo. Preferiblemente, es 3-Cl y 4-metoxi.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un noveno grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que R10 representa un átomo de hidrógeno.

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son objeto de la invención, un decimoprimer grupo de compuestos está compuesto por los compuestos en los que Y representa alquilo(C1-C6)-NRn, en particular alquilo(C1-C3)-NRn, más particularmente CH2-NH.

Entre los compuestos de la fórmula (I) que son objeto de la invención, un decimosegundo grupo de compuestos está compuesto por los compuestos de la siguiente estructura (configuración epóxido beta):

Entre los compuestos de la fórmula (III) que son el objeto de la invención, se pueden mencionar en particular los siguientes compuestos:

El acoplamiento entre la carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) y el anticuerpo, para obtener el conjugado de fórmula (III), se produce por medio de un grupo químico reactivo RCG1 presente en la carga eficaz que es reactivo a un grupo reactivo RCG2 presente en el anticuerpo. La reacción entre RCG1 y RCG2 asegura el acoplamiento del compuesto de fórmula (II) al anticuerpo mediante la formación de una unión covalente. En el conjugado de fórmula (III), partes de RCG1 y rCG2 pueden permanecer formando el acoplamiento entre el enlazador y el anticuerpo.

Los ejemplos de RCG1 que se pueden mencionar incluyen:

(i) el grupo reactivo -C(=O)-ZaRa en el que Za representa una unión simple, O o NH, más particularmente O, y Ra representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6), cicloalquilo(C3-C7), alquenilo, arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo(C3-C7). El grupo arilo puede sustituirse por 1 a 5 grupos elegidos de grupos halógeno, en particular F, alquilo, alcoxi, nitro y ciano;

(ii) uno de los siguientes grupos reactivos: el grupo maleimido O ; el grupo haloacetamido con Ri3 que representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C6), más particularmente Me; -

SH; -NH2; -C=CH o un C=C activado tal como un resto ciclooctino como

una O-alquil

hidroxilamina o un sustrato de reacción de Pictet-Spengler tal como

descrito en Agarwal P., et al., Bioconjugate Chem 2013, 24, 846-851.

Más particularmente, -ZaRa puede representar -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2,

o

donde el catión representa, por ejemplo, sodio, potasio o cesio o

o el grupo

Gl representa al menos un grupo electroinductivo tal como -NO2 o -Hal, especialmente -F.

Pueden ser, por ejemplo, los siguientes grupos:

Otro tipo de grupo

C(=O)ZaRa es el siguiente:

■ Más particularmente, RCG1 se puede elegir de uno de los descritos en los ejemplos.

Los ejemplos de RCG2 que se pueden mencionar incluyen (Garnett M.C., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001,53, 171-216):

(i) grupos £-amino de lisinas cargados por las cadenas laterales de los residuos lisina que están presentes en la superficie de un anticuerpo;

(ii) grupos a-amino de aminoácidos del extremo N de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo;

(iii) los grupos sacárido de la región bisagra;

(iv) los tioles de cisteínas generadas al reducir uniones disulfuro intracatenarias o los tioles de cisteínas genomanipuladas;

(v) grupos amida cargados por las cadenas laterales de algunos residuos glutamina que están presentes en la superficie del anticuerpo;

(vi) grupos aldehído introducidos mediante el uso de la enzima generadora de formilglicina.

Más recientemente, se han considerado otras estrategias de conjugación, por ejemplo, la introducción de cisteínas mediante mutación (Junutula J.R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932), la introducción de aminoácidos no naturales que permiten otros tipos de química (Axup J.Y., et al., PNAS 2012, 109, 40, 16101-16106) o la conjugación en glicanos del anticuerpo (Zhou Q., et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 510-520). Otra estrategia para las modificaciones de anticuerpos específicas para un sitio se basa en el etiquetado enzimático mediante el uso de, por ejemplo, transglutaminasa bacteriana (Jeger S., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997; Strop P., et al., Chem. Biol. 2013, 20, 161-167) o enzima generadora de formilglicina (Hudak J.E., et al., Angew. Chem. Int. Ed.

2012, 51, 4161-4165). Para acceder a un análisis de estrategias de conjugación específicas para un sitio, ver Agarwal P. and Bertozzi C.R., Bioconjugate Chem 2015, 26, 176-192. Estas tecnologías de conjugación también se pueden aplicar a las cargas eficaces de criptoficina descritas en la presente invención.

También se puede modificar el anticuerpo químicamente para introducir nuevos grupos químicos reactivos RCG2. Por lo tanto, los expertos en la técnica saben cómo modificar un anticuerpo con la ayuda de un agente de modificación que introduce, por ejemplo, grupos disulfuro, tiol, maleimido o haloacetamido activados (ver especialmente WO2005/077090 página 14 y WO2011/001052). La modificación posibilita mejorar la reacción de conjugación y usar una variedad más amplia de grupos RCG1.

Más particularmente, en el caso donde RCG1 es del tipo (ii) indicado anteriormente, se puede modificar el anticuerpo químicamente mediante el uso de un agente de modificación adecuado o introducir uno o más aminoácidos no naturales para introducir las funciones adecuadas RCG2. Por ejemplo:

- cuando RCG1 representa un éster de N-hidroxisuccinimidilo, RCG2 representa un grupo -NH2;

- cuando RCG1 representa una función maleimido o haloacetamido o un grupo -Cl, RCG2 puede ser un grupo -SH; - cuando RCG1 representa un grupo -N3, RCG2 puede ser un grupo -C=CH o un C=C activado tal como un resto ciclooctino;

- cuando RCG1 representa un grupo -OH o -NH2, RCG2 puede ser una función ácido carboxílico o amida;

- cuando RCG1 representa un grupo -SH, RCG2 puede ser una función maleimido o haloacetamido;

- cuando RCG1 representa una función -C=CH o un C=C activado, RCG2 puede ser un grupo -N3;

- cuando RCG1 representa una función -O-alquil hidroxilamina o un sustrato de reacción de Pictet-Spengler, RCG2 puede ser una función aldehído o cetona.

Los ejemplos de G que se pueden mencionar incluyen:

La invención se refiere a cargas eficaces de criptoficina de fórmula (II) y a conjugados de fórmula (III):

en la que:

■ L1 representa

■ una unión simple o un grupo NRi6(hetero)aril-CRi5Ri4-O-C(=O) si Y = alquilo(Ci-C6)-N(Rii);

■ un grupo NRi8-alquilo(C2-C6)-NRi7-C(=O) o un grupo NRi6(hetero)aril-CRi5Ri4-O-C(=O)NRi8-alquilo(C2-C6)-NRi7-C(=O) si Y = alquilo(Ci-C6)- O- o alquilo(Ci-C6)-S;

■ un grupo NRi6(hetero)aril-CRi5Ri4 si Y = C(=O)O, C(=O)NH, alquilo(Ci-C6)-C(=O)O o alquilo(Ci-C6)-C(=O)NH; ■ R11, R14, R15, Ri 6, R17 y Ris representan, independientemente entre sí, H o un grupo alquilo(Ci-C6);

■ (AA)w representa una secuencia de w aminoácidos AA conectados entre sí a través de uniones peptídicas;

■ w representa un número entero que varía de 1 a 12, preferiblemente, de 1 a 6 y más particularmente 2 o 3;

■ L2 representa una unión simple o un grupo alquilo(Ci-C6) o un grupo alquilo(Ci-C6)-(OCH2CH2)i o un grupo alquilo(Ci-C6)-(OCH2CH2)i-Oalquilo(Ci-C6) o un grupo (CH2CH2O)ialquilo(Ci-C6) o un grupo CH(SO3H)-alquilo(Ci-C6) o un grupo alquilo(Ci-C6)-CH(SO3H) o un grupo alquilo(Ci-C6)-ciclohexilo o un grupo NRi9-alquilo(Ci-C6) o un grupo NR20-(CH2CH2O)ialquilo(Ci-C6) o un grupo NR2i-arilo o un grupo NR2i-heteroarilo o un grupo alquilo(Ci-C6)-NR22C(=O)-alquilo(Ci-C6) o un grupo alquilo(Ci-C6)-NR22C(=O)-alquilo(Ci-C6)-(OCH2CH2)i. Más particularmente, L2 representa un grupo alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-(OCH2CH2)i o un grupo CH(SO3H)-alquilo(C1-C6);

■ R19, R20, R21 y R22 representan, independientemente entre sí, H o un grupo alquilo(Ci-C6);

■ i representa un número entero entre 1 y 50 y preferiblemente entre 1 y 10 (i puede tomar todos los valores entre 1 y 50).

AA denota un aminoácido natural o no natural, de configuración D o L, más particularmente elegido de: alanina (Ala), p-alanina, ácido Y-aminobutírico, ácido 2-amino-2-ciclohexilacético, ácido 2-amino-2-fenilacético, arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), citrulina (Cit), cisteína (Cys), ácido a,a-dimetil-Y-aminobutírico, ácido p,pdimetil-Y-aminobutírico, glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), £-acetil-lisina (AcLys), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr), valina (Val). Más particularmente, AA se elige de alanina (Ala), citrulina (Cit), glutamina (Gln), glicina (Gly), £-acetilo-lisina (AcLys), valina (Val).

La secuencia (AA)w tiene la fórmula:

2 i

la que R23 representa la cadena lateral de uno de los aminoácidos descritos anteriormente. Los

ejemplos de secuencias son los siguientes: Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-AcLys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Ala, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu.

Para Y = alquilo(C1-C6)-N(Rn ) y, más particularmente, CH2NH, RCG1-L puede ser uno de los siguientes (IV1-17):

en la que:

■ (AA)w representa una secuencia de w aminoácidos AA conectados entre sí a través de uniones peptídicas según se describieron anteriormente;

■ i representa un número entero entre 1 y 50 y preferiblemente entre 1 y 10 (i puede tomar todos los valores entre 1 y 50);

■ Mi , M2, M3 y M4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ R19, R20, R21, R22 y R24 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6), más particularmente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.

Para Y = alquilo(CrC6)-O o alquilo(CrC6)-S y, más particularmente, CH2O o CH2S, RCG1-L puede ser uno de los siguientes (IV18-34):

en la que:

■ Mi , M2, M3 y M4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ R17, Ris, R19, R20, R21, R22 y R24 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6), más particularmente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.

Para Y = alquilo(C1-C6)-N(Rn) y, más particularmente, CH2NH, RCG1-L también puede ser uno de los siguientes (IV35-51):

en la que:

■ J i , J2, J3 y J4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ Mi , M2, M3 y M4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ R14, R15, Ri6, R19, R20, R21, R22 y R24 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(Ci-C6), más particularmente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.

Para Y = alquilo(C1-C6)-O o alquilo(C1-C6)-S y, más particularmente, CH2O o CH2S, RCG1-L también puede ser uno de los siguientes (IV52-68):

en la que:

■ J i , J2, J3 y J4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ Mi , M2, M3 y M4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ Ri4, R15, Ri6, R17, Ris, R19, R20, R21, R22 y R24 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6), más particularmente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.

Para Y = C(=O)O, C(=O)NH, alquilo(C1-C6)-C(=O) o alquilo(C1-C6)-C(=O)NH y más particularmente C(=O)O o CH2-C(=O)O, RCG1-L puede ser uno de los siguientes (IV69-85):

en la que:

■ J i , J2, J3 y J4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ Mi , M2, M3 y M4 se eligen, independientemente entre sí, de CR24 y N;

■ R14, R15, Ri6, R19, R20, R21, R22 y R24 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C1-C6), más particularmente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.

Para Y = C(=O) o alquilo(C1-C6)-C(=O), la invención también se refiere a cargas eficaces de criptoficina de fórmula (II) y a conjugados de fórmula (III):

en la que:

■ (AA)'w representa una secuencia de w aminoácidos AA conectados entre sí a través de uniones peptídicas;

■ R²⁵representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶);

■ L3 representa un grupo alquilo(C¹-C⁶) o un grupo (CH²CH²O)i-alquilo(C¹-C⁶) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-(OCH²CH²)i o un grupo CH(SO3H)-alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-(OCH²CH²)i-Oalquilo(C¹-C⁶) o un grupo NR¹⁹-alquilo(C¹-C⁶) o un grupo NR²⁰-(CH²CH²O)iCH²CH²o un grupo alquilo(C1-C6)-ciclohexilo-C(=O)NR19-alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-ciclohexilo-C(=O)NR²⁰-(CH²CH²O)i-CH²CH²o un grupo NR21-aril-C(=O)NR19-alquilo(C1-C6) o un grupo NR21-heteroaril-C(=O)NR19-alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-NR²²C(=O)(CH²CH²O)i-alquilo(C¹-C⁶); ■ R¹⁹, R²⁰, R^{2 1}, R²²y R²⁵representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶);

■ RCG1 representa un grupo químico reactivo que es reactivo a un grupo químico reactivo presente en un anticuerpo, según se definió anteriormente;

■ Ri, R², R³, R⁴, R⁵, R6, R⁷, Rs, R⁹y R¹⁰son según se definieron anteriormente.

AA denota un aminoácido natural o no natural, de configuración D o L, más particularmente elegido de: alanina (Ala), p-alanina, ácido Y-aminobutírico, ácido 2-amino-2-ciclohexilacético, ácido 2-amino-2-fenilacético, arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), citrulina (Cit), cisteína (Cys), ácido a,a-dimetil-Y-aminobutírico, ácido p,pdimetil-Y-aminobutírico, glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), £-acetil-lisina (AcLys), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr), valina (Val). Más particularmente, AA se elige de alanina (Ala), citrulina (Cit), glutamina (Gln), glicina (Gly), £-acetil-lisina (AcLys), valina (Val).

La secuencia (AA)'w tiene la fórmula:

O

" 'V D ^k-^nv.

en la que R²⁶representa la cadena lateral de uno de los aminoácidos descritos anteriormente. Los ejemplos de secuencias son los siguientes: Gly-Gly, Lys-Phe, Lys-Val, AcLys-Val, Cit-Val, Lys-Phe-Phe, Lys-Phe-DPhe, Lys-Phe-Gly, Lys-Ala, Ala-Val, Cit-Phe, Cit-Leu, Cit-Ile, Cit-Trp, Ala-Phe, Phe-Ala, Gly-Gly-Gly, Phe-Ala-Gly, Cit-Val-Gly, Cit-Leu-Phe-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly, Leu-Ala-Leu-Ala.

Para Y = C(=O) o alquilo(C¹-C⁶)-C(=O) y más particularmente C(=O) o CH²-C(=O), RCG1-L puede ser uno de los siguientes (V86-101):

en la que:

■ (AA)'w representa una secuencia de w aminoácidos AA conectados entre sí a través de uniones peptídicas, según se describieron anteriormente;

■ w representa un número entero que varía de 1 a 12, preferiblemente, de 1 a ⁶y más particularmente 2 o 3;

■ Mi, M², M³y M⁴se eligen, independientemente entre sí, de CR²⁴y N;

■ R¹⁹, R^{2 0}, R²¹, R²², R²⁴y R²⁵representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶), más particularmente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.

El enlazador L también se puede elegir entre los compuestos ilustrados.

Según la invención, los compuestos de la fórmula general (I), (II) y (III) se pueden preparar mediante los siguientes procesos.

Proceso para preparar los compuestos de criptoficina

Vía general A para la preparación de los compuestos de fórmula (I) en el caso donde W=CH2N3 o CH²NH²

Los fragmentos A, B, C y D permiten la preparación de los compuestos de criptoficina Pi a P³con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre los fragmentos AD1 y BC en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOAt y HATU;

Etapa (ii): desprotección en condiciones ácidas mediante el uso de, por ejemplo, TFA y macrociclización en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOAt y HATU;

Etapa (iii): oxidación de la olefina para formar el epóxido mediante el uso de, por ejemplo, m-CPBA;

Etapa (v): reducción del grupo azido mediante el uso de, por ejemplo, TCEP.

Los fragmentos A y B se prepararon según la síntesis descrita más adelante. Los fragmentos C protegidos como ésteres de metilo están disponibles comercialmente para R4=H, Rs=Me (R), R2=R3=H (número CAS [92535-26-7]); R4=H, Rs=Me (S), R2=R3=H (número CAS [118138-56-0]); R4=Rs=Me, R2=R3=H (número CAS [25307-82-8]); R²=H, R3=Me (R), R4=H, R5=Me (R) (número CAS [86544-92-5]); R²=H, R3=Me (S), R4=H, Rs=Me (R) (número CAS [86544-93-6]); R²=H, R3=Me (R), R4=Rs=Me (número CAS [1315052-25-5]); R²=H, R3=Me (S), R4=Rs=Me (número CAS [1315050-96-4]); R²=H, R3=iPr (R), R4=Rs=Me (número CAS [1314999-06-8]); R²=H, R3=iPr (S), R4=Rs=Me (número CAS [1315054-33-1]); R2=R3=R4=Rs=Me (número CAS [90886-53-6]); R⁴y R⁵forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo ciclopropilo (número CAS [914226-26-9]). También se pueden preparar según se describe en los ejemplos. Los fragmentos C no disponibles comercialmente se prepararon según se describe en los ejemplos. Todos los fragmentos D están disponibles comercialmente: L-Fmoc-Ala-OH (número CAS [35661-39-3]); L-Fmoc-Val-OH (número CAS [68858-20-8]); L-Fmoc-terc-Leu-OH (número CAS [132684-60-7]); L-Fmoc-Leu-OH (número CAS [35661-60-0]); L-Fmoc-NMe-Leu-OH (número CAS [103478-62-2]); L-Fmoc-3-dimetilamino-Ala-OH (número CAS [587880-86-2]); L-Fmoc-(Oalil)Asp-OH (número CAS [146982-24-3]); L-Fmoc-4-metil-Leu-OH (número CAS [139551-74-9]). Los componentes básicos AD1 y BC se prepararon según la síntesis descrita más adelante.

Vía general B para la preparación de los compuestos de fórmula (I) en el caso donde W=CH²OH o CH²N³o CH²NH²

Los fragmentos A, B, C y D permiten la preparación de los compuestos de criptoficina P²a P⁴con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (ii): desprotección en condiciones ácidas mediante el uso de, por ejemplo, TFA, macrociclización en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOAt y HATU e hidrólisis de acetato a pH 6-7 mediante el uso de, por ejemplo, NaOH en una mezcla de agua y AcOEt;

Etapa (iii): protección de alcohol bencílico como un éter de sililo mediante el uso de, por ejemplo, clorotriisopropilsilana en presencia de una base tal como, por ejemplo, imidazol; oxidación de la olefina para formar el epóxido mediante el uso de, por ejemplo, m-CPBA; desprotección del éter de sililo mediante el uso de, por ejemplo, una disolución de TBAF.

Etapa (iv): azidación en presencia de DPPA y una base tal como, por ejemplo, DBU;

Etapa (v): reducción del grupo azido mediante el uso de, por ejemplo, TCEP.

Los fragmentos A y B se prepararon según la síntesis descrita más adelante. Los fragmentos C estaban disponibles comercialmente según se indicó en la sección anterior o se prepararon según se describe en los ejemplos. Todos los fragmentos D están disponibles comercialmente según se indicó en la sección anterior. Los componentes básicos AD2 y BC se prepararon según la síntesis descrita más adelante.

Vía general C para la preparación de los compuestos de fórmula (I) en el caso donde W=CH²OH o CH²N³o CH²NH²

El alcohol de Sakurai y los fragmentos B, C y D permiten la preparación de los compuestos de criptoficina P²a P⁴con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre los fragmentos AD3 y BC alternativo en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOAt y HATU;

Etapa (ii): macrociclización mediante metatesis con cierre de anillo en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, catalizador Grubbs I;

Etapa (iii): desprotección del éter de p-metoxibencilo en condiciones ácidas tal como, por ejemplo, TFA al 10 %; Etapa (iv): oxidación del alcohol mediante el uso de un agente oxidante tal como, por ejemplo, TEMPO en presencia de hipoclorito de sodio;

Etapa (v): introducción del epóxido mediante reacción de Corey-Chaykovsky asimétrica con el uso de sulfonio quiral derivado de isotiocineol sustituido adecuadamente en presencia de una base tal como, por ejemplo, base fosfaceno P2-Et;

Etapa (vi): reducción del grupo azido mediante el uso de, por ejemplo, TCEP.

El alcohol de Sakurai y el fragmento B se prepararon según la síntesis descrita más adelante. Los fragmentos C estaban disponibles comercialmente según se indicó en la sección anterior o se prepararon según se describe en los ejemplos. Todos los fragmentos D están disponibles comercialmente según se indicó en la sección anterior. Los componentes básicos AD3 y BC alternativo se prepararon según la síntesis descrita más adelante.

Preparación de los compuestos de fórmula (I) en el caso donde W=CH²SH

P⁴permite la preparación de otros compuestos de criptoficina P⁵y P6 con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): introducción del grupo cloro mediante el uso de cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ii): funcionalización mediante el uso de trimetilsililtiolato de tetrabutilamonio preparado in situ a partir de TBAF y hexametildisilatiano según Hu J., et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 4959-496: en el transcurso de esta reacción, normalmente se forma el dímero intermediario representado en el Esquema 3;

Etapa (iii): reducción del dímero mediante el uso de una fosfina tal como, por ejemplo, TCEP.

Los Esquemas 1, 2, 3 y 4 describen los casos n=1, pero también pueden aplicarse para la preparación de compuestos de fórmula (I) en el caso donde n>1 partiendo de P², P³o P⁴con la ayuda de las etapas detalladas a continuación y descritas en el Esquema 2 del documento WO2011 /001052:

Etapa (i): abertura del anillo de epóxido en medio ácido para obtener la función diol; se puede usar ácido perclórico concentrado, por ejemplo;

Etapa (ii): escisión oxidativa del diol mediante el uso de, por ejemplo, periodato de sodio;

Etapa (iii): Reacción de Wittig mediante el uso de un haluro de fosfonio adecuado, por ejemplo, un bromuro, y una base fuerte, por ejemplo, BuLi;

Etapa (iv): oxidación de la olefina para formar el epóxido mediante el uso de, por ejemplo, m-CPBA;

Etapa (v): desprotección del éter de sililo mediante el uso de, por ejemplo, una disolución de TBAF.

Preparación de los compuestos de fórmula (I) en el caso donde W=CO²H

P⁴permite la preparación de otros compuestos de criptoficina P⁷y P⁸con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): oxidación mediante el uso del reactivo de Dess-Martin;

Etapa (ii): oxidación de tipo Pinnick en presencia de 2 metil-2-buteno (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981, 37, 2091 2096).

El Esquema 6 describe el caso n=0, pero también pueden aplicarse para la preparación de compuestos de fórmula (I) en el caso donde W=(CH²)nCO²H partiendo de un análogo de P⁴que lleva un grupo (CH²)n+1OH. Los Esquemas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se proporcionan para un enlazador en la posición para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D^{1 9}.

Proceso para preparar las cargas eficaces de criptoficina

Los compuestos de fórmula (II) podrían prepararse según el Esquema 7 partiendo de un compuesto de criptoficina de fórmula (I) y un precursor de enlazador (LP):

• alquilo(C¹-C⁶)-NH(Rn), más particularmente (CH²)nNHRn;

• alquilo(C¹-C⁶)-OH, más particularmente (CH²)nOH;

• alquilo(C¹-C⁶)-SH, más particularmente (CH²)nSH;

• CO²H;

• alquilo(C¹-C⁶)-CO²H, más particularmente (CH²)nCO²H; o

• alquilo(C¹-C⁶)-N³.

en el que R¹¹representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶), más particularmente un grupo metilo.

El precursor del enlazador LP tiene la función de introducir un precursor del enlazador L en el compuesto de criptoficina después de la reacción entre el grupo W y una función química presente en el LP.

En el Esquema 7, varias etapas y/o reacciones pueden ser necesarias para preparar la carga eficaz de criptoficina (II) partiendo del compuesto de criptoficina (I). Por ejemplo, en el caso donde ZaRa =-O-NHS, un enlazador L en el cual ZaRa = -O-alilo puede introducirse mediante el uso del precursor de enlazador correspondiente con la posterior desprotección de la función éster y la introducción de -O-NHS. La desprotección se puede llevar a cabo mediante el tratamiento con un catalizador de paladio, por ejemplo, Pd(PPh3)4 en presencia de una amina depuradora, por ejemplo, morfolina; la activación se puede llevar a cabo con DSC en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA o con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC. Esta conversión de un grupo ZaRa en otro grupo ZaRa (p. ej. -O-alilo ^ -O-NHS) puede aplicarse para obtener otros grupos ZaRa, especialmente los descritos anteriormente.

El Esquema 7' ilustra de manera similar la preparación de un compuesto de criptoficina que comprende un enlazador que lleva respectivamente, un grupo maleimido, un haloacetamido, un amino o un azido (L* representa un fragmento de un enlazador de manera que L= -L*-maleimido o L= -L*-haloacetamido o L= -L*-NH²- o L=-L*-N3).

ypto

Esquema 7

Estos compuestos se obtienen mediante reacción entre un compuesto de criptoficina que comprende un enlazador L' que comprende un grupo amino y un agente modificador para introducir, respectivamente, un grupo maleimido, un haloacetamido, un amino o un azido.

Los compuestos de fórmula (II) podrían prepararse alternativamente según el Esquema 8 partiendo del mismo compuesto de criptoficina de fórmula (I) y otro precursor de enlazador (LP'):

En el Esquema 8, varias etapas y/o reacciones pueden ser necesarias para llegar a la carga eficaz de criptoficina (II) partiendo del compuesto de criptoficina (I). Por ejemplo, en el caso donde ZaRa =-O-NHS, se puede introducir un precursor de enlazador protegido L' y posteriormente proceder a la desprotección y acoplamiento con un precursor de enlazador L” para introducir la función ácido carboxílico que se puede activar directamente en ZaRa = -O-NHS o primero desprotegerse y posteriormente activarse (L' y L” representan fragmentos de enlazador de manera que L=L'-L” ). La desprotección se puede llevar a cabo mediante tratamiento con una base, por ejemplo, piperidina; el acoplamiento con un enlazador L” puede proceder a través de la abertura de un anhídrido cíclico, por ejemplo, anhídrido glutárico; la activación se puede llevar a cabo con DSC en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA o con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC.

Un ejemplo de reacción entre el grupo W y una función química presente en LP es una amidación entre un precursor de enlazador LP que lleva una función ácido carboxílico y W=(CH²)nNH²o entre un precursor de enlazador LP que lleva una función amina y W=CO²H o (CH²)nCO²H: esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDCI o HOBt. También se puede hacer reaccionar un precursor de enlazador LP que lleva una función amina y W'=(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrofenil) obtenido a partir de W=(CH²)nOH y cloroformiato de p-nitrofenilo (activación del alcohol en forma de carbonato) según el esquema más adelante (R¹⁷= H o alquilo(C¹-C6)):

-NHR¹⁷+ cripto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrofenil) ^ cripto-(CH2)nO-C(=O)-NR17-

El mismo tipo de reacción también se puede llevar a cabo entre un precursor de enlazador LP que lleva una función alcohol activada como un carbonato y W=(CH²)nNH². Otro ejemplo de reacción es una esterificación entre un precursor de enlazador que lleva una función alcohol y W=CO²H o (CH²)nCO²H: esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, MNBA. Otro ejemplo de reacción es una cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre entre un precursor de enlazador que lleva una función alquino y W=(CH2)N3: esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de sulfato de cobre y ascorbato de sodio.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nNH²y L=(IV1) con n=1, Ri5=H y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 7

Etapa (i): acoplamiento peptídico en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, EDC y HOBt, y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ii): desprotección del éster de alilo en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, tetrakis-(trifenilfosfina)paladio;

Etapa (iii): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS mediante tratamiento con DSC en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nNH²y L=(IV1) con n=1, Rn=H y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 8

Etapa (ii): desprotección de la amina Fmoc en presencia de una base tal como, por ejemplo, piperidina;

Etapa (i¡¡): acoplamiento a anhídrido glutárico;

Etapa (iv): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS mediante tratamiento con DSC en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA.

Los Esquemas 9 y 10 describen el caso L(IV1) con n=1, Rn=H y ALK=(CH2)3, pero también pueden aplicarse a otros enlazadores L con RCG1=C(=O)ONHS, concretamente el caso L(IV1) con n^1 y/o Rii^H y/o ALK^(CH2)3 y los casos L(IV2) y L(IV3). Se proporcionan para un enlazador en la posición para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nNH²con n=1, Rn=H y RCG1 =maleimido, haloacetamido, NH², N³o ciclooctino concretamente los enlazadores L(IV4) a L(IV17)

Etapa (ii): desprotección de la amina Fmoc en presencia de una base tal como, por ejemplo, piperidina.

El Esquema 11 describe los casos L(IV4) con n=1, Rn=H y ALK=(CH²)s, L(IV8) con n=1 y Rn=H, L(IV12) con n=1, Rn=H y ALK=(CH2)4, L(IV14) con n=1, Rn=H y ALK=(CH2)3 y L(IV16) con n=1, Rn=H, ALK=(CH2)3 y ALK'=(CH²)², pero también se puede aplicar a otros enlazadores L(IV4) a L(IV17) con RCG1=maleimido, yodoacetamido, NH², N³o ciclooctino. Se representa para un grupo reactivo yodoacetamido, pero se puede aplicar de manera idéntica para un grupo reactivo bromoacetamido. Se proporciona para un enlazador en la posición para, pero se puede aplicar de manera idéntica para las posiciones ortho o meta. De manera similar, se proporciona para un compuesto de criptoficina, pero también puede aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nX con X=O o S y L=(IV18) con n=1, R¹⁷y R¹⁸=H y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 7

Etapa (i): activación del alcohol bencílico o tiol bencílico como un p-nitrofenil-(tio)carbonato mediante tratamiento con p-nitrofenil-cloroformiato en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ii): formación del (tio)carbamato mediante reacción con una amina en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (iii): desprotección del éster de alilo en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, tetrakis-(trifenilfosfina)paladio;

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nX con X=O o S y L=(IV18) con n=1, R¹⁷y Ri8=H y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 8

Etapa (i): formación del (tio)carbamato mediante reacción con una amina en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (iii): acoplamiento a anhídrido glutárico;

Los Esquemas 12 y 13 describen el caso L(IV18) con n=1, R¹⁷y R¹⁸=H y ALK=(CH2)3, pero también pueden aplicarse a otros enlazadores L con RCG1=C(=O)ONHS, concretamente el caso L(IV18) con n£1 y/o R¹⁷, R ^ H y/o ALK*(CH2)3 y los casos L(IV19) y L(IV20). para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nX con X=O o S y RCG1=maleimido, haloacetamido, NH², N³o ciclooctino concretamente los enlazadores L(IV21) a (IV34)

El Esquema 14 describe el caso L(IV21) con n=1, R¹⁷y R¹⁸=H y ALK=(CH2)5, el caso L(IV25) con n=1 y R¹⁷y R¹⁸=H, el caso L(IV29) con n=1, R¹⁷y R¹⁸=H y ALK=(CH2)4, el caso L(lV31) con n=1, R¹⁷y R¹⁸=H y ALK=(c H2)3 y el caso L(IV33) con n=1, R¹⁷, R¹⁸y R²²=H, ALK=(CH2)3 y ALK'=(CH²)², pero también se puede aplicar a otros enlazadores L(IV21 a 34) con RCG1=maleimido, yodoacetamido, NH², N³o ciclooctino. Se representa para un grupo reactivo yodoacetamido, pero se puede aplicar de manera idéntica para un grupo reactivo bromoacetamido. Se proporciona para un enlazador en la posición para, pero se puede aplicar de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporciona para un compuesto de criptoficina, pero también puede aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nNH²y L=(IV35) con n=1, Rn=Ru-R15-R16-H, J1=J2=J3=J4=CH y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 7

Etapa (i): formación del carbamato, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nNH²y L=(IV35) con n=1, Rii=Ri4-Ri5-Ri6-H, J i =J2=J3=J4=CH y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 8

Etapa (i): formación del carbamato, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA en presencia de un reactivo p-nitrofenilcarbonato adecuado;

Etapa (i¡¡): acoplamiento a anhídrido glutárico;

Los Esquemas 15 y 16 describen el caso L(IV35) con n=1, Rii=Ri4-Ri5-Ri6-H, J i =J2=J3=J4=CH, un alcohol para bencílico y ALK=(CH2)3, pero también pueden aplicarse a otros enlazadores L con RCGi=C(=O)ONHS, concretamente el caso L(IV35) con n^i y/o R ii, Ri4, Ri5, Ri6^H y/o Ji, J², J³, J4^CH y/o un alcohol orto-bencílico y/o ALK^(CH2)3 y los casos L(IV36) y L(IV37). Se proporcionan para un enlazador en la posición para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente Di-Dig.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nNH²con n=1, Ri i =Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji =J2=J3=J4=CH y RCG1=maleimido, haloacetamido, NH², N³o ciclooctino concretamente los enlazadores L(IV38) a L(IVi5i)

Esquem a 17

El Esquema 17 describe los casos L(IV38) con n=1, Ri i =Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji =J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)5, L(IV42) con n=1, Ri i =Ri4=Ri5=Ri6=H y Ji =J2=J3=J4=CH y un alcohol para-bencílico, ^l(|V46) con n=1, Ri i =Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji =J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)4, L(IV48) con n=1, Ri i =Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji =J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y Al K=(CH2)3 y L(lV50) con n=1,

5 i

Rii=Ri4=Ri5=Ri6=R22=H, J i =J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico, ALK=(CH2)3 y ALK'=(CH²)², pero también puede aplicarse a otros enlazadores L(IV38) a L(IV51) con RCG1=maleimido, yodoacetamido, NH², N³o ciclooctino. Se proporciona con un alcohol para-bencílico, pero también se puede aplicar a un alcohol orto-bencílico. Se representa para un grupo reactivo yodoacetamido, pero se puede aplicar de manera idéntica para un grupo reactivo bromoacetamido. Se proporciona para un enlazador en la posición para, pero se puede aplicar de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporciona para un compuesto de criptoficina, pero también puede aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nX con X=O o S y L=(IV52) con n=1, R14=R15=R16=R17=R18=H, J1=J2=J3=J4=CH y Al K=(CH2)3 en base al Esquema 7

Esquem a 18

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nX con X=O o S y L=(IV52) con n=1, R14=R15=R16=R17=R18=H, J1=J2=J3=J4=CH y Al K=(CH2)3 en base al Esquema 8

Etapa (i¡¡): acoplamiento a anhídrido glutárico;

Los Esquemas 18 y 19 describen el caso L(IV52) con n=1, Ri4=Ri5=Ri6=Ri7=Ri8=H, Ji =J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)3, pero también pueden aplicarse a otros enlazadores L con RCGi=C(=O)ONHS, concretamente el caso L(IV52) con n^i y/o Ri4, Ri5, Ri6, Ri7, Ri8^H y/o Ji, J², J³, J4^CH y/o un alcohol ortobencílico y/o ALK^(CH2)3 y los casos L(IV53) y L(IV54). Se proporcionan para un enlazador en la posición para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente Di-Dig.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=(CH²)nX con X=O o S y RCGi=maleimido, haloacetamido, NH², N³o ciclooctino concretamente los enlazadores L(IV55) a (IV68)

El Esquema 20 describe el caso L(IV55) con n=1, Ru=R15=R16=R17=R18=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para bencílico y ALK=(CH²)²y ALK'=(CH2)5, el caso L(IV59) con n=1, Ru=R15=R16=R17=R18=H, J1=J2=J3=J4=c H, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH²)², el caso L(IV63) con n=1, Ru=R15=R16=R17=R18=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico, ALK=(Ch ²)²y ALK'=(CH2)4, el caso L(IV65) con n=1, R14=R15=R16=R17=R18=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico, ALK=(CH²)²y Al K'=(CH2)3 y el caso L(IV67) con n=1, R14=R15=R16=R17=R18=R22=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico, Al K=(CH²)², ALK'=(CH2)5 y ALK"=(CH²)², pero también se puede aplicar a otros enlazadores L(IV55 a 68) con RCG1=maleimido, yodoacetamido, NH², N³o ciclooctino. Se representa para un grupo reactivo yodoacetamido, pero se puede aplicar de manera idéntica para un grupo reactivo bromoacetamido. Se proporciona para un enlazador en la posición para, pero se puede aplicar de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporciona para un compuesto de criptoficina, pero también puede aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=C(=O)O y L=(IV69) con Ru=R15=R16=H, J1=J2=J3=J4=CH y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 7

Etapa (i): esterificación en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como, por ejemplo, MNBA, y una base tal como, por ejemplo, DMAP y DIEA;

Etapa (i¡¡): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS mediante tratamiento con DSC en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=C(=O)O y L=(IV69) con Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji=J2=Js=J4=CH y ALK=(CH2)3 en base al Esquema 8

Etapa (i¡¡): acoplamiento a anhídrido glutárico;

Los Esquemas 21 y 22 describen el caso L(IV69) con Ri4=Ri5=Ri6=H, J i =J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)3, pero también pueden aplicarse a otros enlazadores L con RCG1=C(=O)ONHS, concretamente el caso L(IV69) con R¹⁴, R¹⁵, Ri6^H y/o Ji, J², J³, J4^CH y/o un alcohol o/ío-bencílico y/o ALK^(CH2)3 y los casos L(IV70) y L(IV71). Se proporcionan para un enlazador en la posición para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente Di-Di9.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=C(=O)O con Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji =J2=J3=J4=CH y RCGi =maleimido, haloacetamido, NH², N³o ciclooctino concretamente los enlazadores L(IV72) a L(IV85)

El Esquema 23 describe los casos L(IV72) con n=1, Ru=R15=R16=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)5, L(IV76) con n=1, Ru=R15=R16=H y J1=J2=J3=J4=CH y un alcohol para-bencílico, L(IV80) con n=1, R14=R15=R16=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)4, L(IV82) con n=1, R14=R15=R16=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico y ALK=(CH2)3 y L(IV84) con n=1, R14=R15=R16=R22=H, J1=J2=J3=J4=CH, un alcohol para-bencílico, ALK=(CH2)3 y ALK'=(CH²)², pero también se puede aplicar a otros enlazadores L(IV72) a L(IV85) con RCG1=maleimido, yodoacetamido, NH², N³o ciclooctino. Se proporciona con un alcohol para-bencílico, pero también se puede aplicar a un alcohol o/?o-bencílico. Se representa para un grupo reactivo yodoacetamido, pero se puede aplicar de manera idéntica para un grupo reactivo bromoacetamido. Se proporciona para un enlazador en la posición para, pero se puede aplicar de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporciona para un compuesto de criptoficina, pero también puede aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=C(=O)O y L=(V86) con R25=H y ALK=(CH2)7

Etapa (i): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS mediante tratamiento con DSC en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ii): acoplamiento peptídico en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

El Esquema 24 describen el caso L(V86) con R25=H y ALK=(CH2)7, pero también pueden aplicarse a otros enlazadores L con RCG1=C(=O)ONHS, concretamente el caso L(V86) con R25^H y/o ALK^(CH2)7 y los casos L(V87) y L(V88). Se proporcionan para un enlazador en la posición para, pero pueden aplicarse de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporcionan para un compuesto de criptoficina, pero también pueden aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Preparación de los compuestos de fórmula (II) en el caso donde W=C(=O)O con R30=H y RCG1=maleimido, haloacetamido, NH², N³o ciclooctino concretamente los enlazadores L(V89) a L(V101)

Etapa (i): acoplamiento peptídico en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ii): reducción del azido mediante tratamiento con un agente reductor tal como, por ejemplo, TCEP.

El Esquema 25 describe los casos L(V89) con R25=H y ALK=(CH2)5, L(V93) con R25=H y ALK=(CH2)3, L(V96) con R25=H y ALK=(CH2)4, L(V98) con R25=H y ALK=(CH2)3 y L(V100) con R22=R25=H, ALK=(CH2)3 y ALK'=(CH²)², pero también se puede aplicar a otros enlazadores L(V89) a L(V101) con RCG1=maleimido, yodoacetamido, NH², N³o ciclooctino. Se representa para un grupo reactivo yodoacetamido, pero se puede aplicar de manera idéntica para un grupo reactivo bromoacetamido. Se proporciona para un enlazador en la posición para, pero se puede aplicar de manera idéntica para las posiciones orto o meta. De manera similar, se proporciona para un compuesto de criptoficina, pero también puede aplicarse para la preparación de otros compuestos de fórmula (I), especialmente D¹-D¹⁹.

Proceso para preparar los conjugados de criptoficina

Los compuestos de fórmula (III) se podrían preparar según el Esquema 26 partiendo de una carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) y un anticuerpo (Ab):

en la que:

■ Y representa alquilo(Ci-C6)-NRii o alquilo(Ci-C6)-O o alquilo(Ci-C6)-S;

o alternativamente Y representa C(=O)O o alquilo(Ci-C6)-C(=O)O; o alternativamente Y representa alquilo(Ci-C6)-triazol- como alquilo(Ci-C6)

Y está ubicado en una posición orto (o), meta (m) o para (p) del núcleo de fenilo;

■ R¹¹representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(Ci-C6);

■ L representa un enlazador ubicado en una posición orto (o), meta (m) o para (p) del núcleo de fenilo, según se definió anteriormente;

■ Ab representa un anticuerpo.

Proceso para preparar los componentes básicos para la síntesis de compuestos de criptoficina de fórmula (I) Síntesis general del fragmento A

Esquema 27

El fragmento A se puede preparar en 12 etapas partiendo de ásteres de hidroxi adecuados con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): protección del alcohol como un éter de p-metoxibencilo mediante el uso de alcohol p-metoxibencílico activado como un tricloroacetimidato en presencia de una cantidad catalítica de ácido tal como, por ejemplo, p-TsOH; Etapa (ii): reducción del áster mediante el uso de un agente reductor tal como, por ejemplo, borohidruro de litio; Etapa (iii): oxidación del alcohol mediante el uso de un agente oxidante tal como, por ejemplo, TEMPO en presencia de hipoclorito de sodio;

Etapa (iv): alilación diastereoselectiva mediante el uso de aliltributilestaño en presencia de tetracloruro de estaño; Etapa (v): metatesis cruzada mediante el uso de terc-butilacrilato en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, catalizador Grubbs II;

Etapa (vi): desprotección del éter de p-metoxibencilo mediante el uso de CAN y tratamiento posterior con etanoditiol en presencia de una cantidad catalítica de ácido tal como, por ejemplo, p-TsOH;

Etapa (vii): protección de los alcoholes como éteres de sililo mediante el uso clorotrietilsilano en presencia de una base tal como, por ejemplo, imidazol;

Etapa (viii): oxidación de Swern mediante el uso de DMSO y cloruro de oxalilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ix): Reacción de Wittig mediante el uso de un haluro de fosfonio adecuado, por ejemplo, un bromuro, y una base fuerte tal como, por ejemplo, BuLi;

Etapa (x): desprotección del éter de sililo mediante el uso de, por ejemplo, una disolución de TBAF.

Etapa (xi): oxidación del alcohol bencílico mediante el uso de un agente oxidante tal como, por ejemplo, óxido de manganeso;

Etapa (xii): isomerización de la unión doble mediante el uso de AIBN en presencia de bencenotiol. Los ésteres de hidroxi están disponibles comercialmente para Ri=Me (número CAS [72657-23-9]), Et (número CAS [72604-81-0]) y iPr (número CAS [72604-82-1]). La preparación de haluros de fosfonio se describe en el documento WO2011/001052.

Síntesis general del fragmento B

El fragmento B se puede preparar en 2 etapas partiendo de aminoácidos adecuados con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): protección de la amina mediante tratamiento con Boc²O en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (ii): saponificación del éster de metilo mediante el uso de una base tal como, por ejemplo, LiOH.

Los aminoácidos protegidos como ésteres de metilo están disponibles comercialmente para R9=3-Cl, 4-OMe (número CAS [704870-54-2]); 3-Cl, 4-OEt (número CAS [1256963-00-9]); 3-Cl, 4-OPr (número CAS [1259709-59-9]); 3-Cl, 4-OMe, 5-F (número CAS [1213670-98-4]); 3-Cl, 4-OMe, 5-Cl (número CAS [1259701-42-2]); 3-Cl, 4-OMe, 5-OMe (número CAS [1212820-34-2]); 3-Cl, 4-OH, 5-OMe (número CAS [1213426-93-7]); 3-Cl, ⁴-NH²(número CAS [1213672-64-0]); 2-Cl, 3-Cl, ⁴-NH²(número CAS [1213607-49-8]); 3-Cl, ⁴-NH², 5-F (número CAS [1213400-66-8]); 3-Cl, ⁴-NH², 5-Cl (número CAS [1213480-30-8]).

Síntesis general del componente básico AD1

Esquema 29

Los fragmentos A y D permiten la preparación del componente básico AD1 con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): esterificación del fragmento D con el fragmento A en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como, por ejemplo, MNBA, y una base tal como, por ejemplo, DMAP y DIEA;

Etapa (ii): reducción del aldehído en un alcohol mediante el uso de un agente reductor tal como, por ejemplo, trimetoxiborohidruro de sodio;

Etapa (i¡¡): activación del alcohol como un mesilato mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA; sustitución del mesilato por un grupo azido mediante tratamiento con azida de sodio;

Etapa (iv): desprotección de la amina mediante tratamiento con una base tal como, por ejemplo, piperidina.

Síntesis general del componente básico AD2

Esquema 30

Los fragmentos A y D permiten la preparación del componente básico AD2 con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (iii): desprotección de la amina mediante tratamiento con una base tal como, por ejemplo, piperidina.

Síntesis general del componente básico AD3

Etapa (i): esterificación del fragmento D con alcohol de Sakurai en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como, por ejemplo, MNBA, y una base tal como, por ejemplo, DMAP y DIEA;

Etapa (ii): desprotección de la amina mediante tratamiento con una base tal como, por ejemplo, piperidina.

Síntesis general del componente básico BC

Los fragmentos B y C permiten la preparación del componente básico BC con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico del fragmento B con el fragmento C en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOBt y EDC, y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Síntesis general de un componente básico alternativo BC

Los fragmentos B y C permiten la preparación de un componente básico alternativo BC con la ayuda de las etapas detalladas a continuación:

Etapa (ii): desprotección del grupo Boc en condiciones ácidas mediante el uso de, por ejemplo, TFA;

Etapa (iii): formación de la acrilamida mediante tratamiento con cloruro de acriloil en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (iv): saponificación del éster de metilo mediante el uso de una base tal como, por ejemplo, tBuOK.

Preparación de precursores de enlazador LP

El LP puede ser uno de los siguientes; LPi a LP¹⁰¹se describen mediante el uso de aminoácidos L, pero también se puede aplicar a aminoácidos D. Se proporcionan para w=2, pero se aplican de manera similar a w>2 al repetir tantas veces como sea necesaria la etapa de acoplamiento peptídico.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre Fmoc-L-aminoácido-ONHS y L-aminoácido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DME/THF/H²O en presencia de una base tal como, por ejemplo, bicarbonato de sodio;

Etapa (ii): desprotección de la amina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de una base tal como, por ejemplo, piperidina;

Etapa (iii): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDC;

Etapa (iv): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo a RT en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los diácidos monoprotegidos como ésteres de alilo están disponibles comercialmente para n=2 (succinato de monoalilo) o se pueden preparar mediante transesterificación de los monoésteres de metilo o terc-butilo, que están disponibles comercialmente para n=2 a 6.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC soportado;

Etapa (iv): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los diácidos de PEG monoprotegidos como ésteres de alilo se pueden preparar según el esquema a continuación:

cuando ALK=CH?CH?

Etapa (i): alargamiento de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF o DMF mediante tratamiento de un ácido protegido insaturado con el alcóxido generado por la acción del sodio en cantidad catalítica;

Etapa (ii): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético. En el último caso, se puede formar trifluoroacetato de la función alcohol presente en la estructura. Este trifluoroacetato se escinde durante la siguiente etapa (iii);

Etapa (iii): protección del ácido carboxílico como un éster de metilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como MeOH, mediante tratamiento con trimetilsilildiazometano;

Etapa (iv): saponificación del éster de metilo; la reacción se lleva a cabo en una mezcla de disolventes polares tal como una mezcla THF/H²O en presencia de LiOH;

Etapa (v): protección del ácido carboxílico como un éster de alilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM en presencia de alcohol alílico, un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDC y una base tal como, por ejemplo, DMAP;

Etapa (vi): alargamiento de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF o DMF mediante tratamiento de un éster halogenado con el alcóxido del diol de PEG monoprotegido como un éter de THP. La preparación de este tipo de diol de PEG monoprotegido se describe bien en la literatura: ver, por ejemplo, Richard A., et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 o Sakellariou E.G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Los dioles de PEG de partida están disponibles comercialmente para i=3 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DMF/H²O mediante tratamiento con carbonato de N,N'-disuccinimidilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los diácidos sulfo monoprotegidos como éster de alilo se pueden preparar según el esquema a continuación:

Etapa (i): protección del ácido carboxílico como un éster de alilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM en presencia de alcohol alílico, un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDC y una base tal como, por ejemplo, DMAP;

Etapa (ii): a-sulfonación del ácido carboxílico; la reacción se lleva a cabo a 75 °C en un disolvente aprótico polar tal como DCE mediante tratamiento con ácido clorosulfónico en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA. Etapa (iii): formación del resto ácido carboxílico; la reacción se lleva a cabo mediante tratamiento con hidróxido de sodio;

Etapa (iv): sustitución del bromuro por un tioacetilo; la reacción se lleva a cabo a -20 °C en un disolvente aprótico polar tal como THF mediante el uso de ácido tioacético en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; Etapa (v): formación del resto ácido sulfónico; la reacción se lleva a cabo a RT mediante tratamiento con peróxido de hidrógeno y ácido acético.

Los ácidos ciano carboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos maleimido carboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (mí) : activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC soportado;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos maleimido están disponibles comercialmente para ALK=ALK'=CH²CH²y i=1 a 7 y se pueden preparar de cualquier otra manera según el esquema a continuación:

cuando ALK=ALK'=CH2CH2 e i>7

cuando ALK=CH2CH2 y ALK'¿CH2CH2

Etapa (ii): Reacción de Mitsunobu en maleimida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como THF mediante tratamiento de maleimida por el ácido PEG hidroxi en presencia de PPh3 y DIAD;

Etapa (i¡¡): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético;

Etapa (iv): alargamiento de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF o DMF mediante tratamiento de un éster halogenado con el alcóxido del diol de PEG monoprotegido como un éter de THP. La preparación de este tipo de diol de PEG monoprotegido se describe bien en la literatura: ver, por ejemplo, Richard A., et al., Chem. Eur. J. 2005, 11,7315-7321 o Sakellariou E.G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090;

Etapa (v): protección selectiva del éter de THP; la reacción se lleva a cabo en un disolvente prótico polar tal como MeOH, mediante el uso de una cantidad catalítica de cloruro de acetilo;

Etapa (vi): activación del alcohol como un mesilato; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (vii): sustitución nucleófila; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DMF en presencia de una base tal como, por ejemplo, hidruro de sodio;

Etapa (viii): protección del alcohol como un éter de bencilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como THF mediante tratamiento con bromuro de bencilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, hidruro de sodio;

Etapa (ix): desprotección del alcohol mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano);

Etapa (x): desprotección del alcohol mediante hidrogenólisis en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, paladio sobre carbono.

Los dioles de PEG de partida están disponibles comercialmente para i=3 a 12. Los dioles de ALK de partida están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos maleimido ciclohexanocarboxílicos están disponibles comercialmente para ALK=CH²y se pueden preparar de cualquier otra manera según el esquema a continuación:

Cuando n=2 a 4

Etapa (i): hidrogenación; la reacción se lleva a cabo a 60 °C en ácido acético en presencia de un catalizador tal como óxido de platino a presión de hidrógeno, por ejemplo, 60 psi;

Etapa (ii): protección de la amina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente prótico polar tal como una mezcla dioxano/H²O mediante tratamiento con bencilcloroformiato en presencia de una base tal como, por ejemplo, NaOH; Etapa (iii): protección del ácido carboxílico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con terc-butanol en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como, por ejemplo, EDC y una base tal como, por ejemplo, DMAP;

Etapa (iv): desprotección de la amina; la reacción se lleva a cabo mediante hidrogenólisis en un disolvente prótico polar tal como MeOH en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, paladio;

Etapa (v): introducción del resto maleimido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DMF mediante tratamiento con anhídrido maleico en presencia de NHS y un reactivo de acoplamiento tal como, por ejemplo, EDC;

Etapa (vi): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético;

Etapa (vii): acoplamiento catalizado por paladio; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como THF mediante tratamiento con el derivado de bromo-ALK-ciano en presencia de cloruro de litio, zinc y trimetilclorosilano y un catalizador tal como, por ejemplo, tetrakis(trifenilfosfina)paladio.

Los derivados de bromo-ALK-ciano adecuados están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

Etapa (iii): a-sulfonación del ácido carboxílico; la reacción se lleva a cabo a 75 °C en un disolvente aprótico polar tal como DCE mediante tratamiento con ácido clorosulfónico en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; Etapa (iv): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo a RT en un disolvente polar tal como una mezcla DMF/H²O mediante tratamiento con carbonato de N,N'-disuccinimidilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (v): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo a RT en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos maleimido están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

Etapa (iii): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los bromo y yodoacetatos de N-succinimidilo están disponibles comercialmente.

Etapa (mí) : acoplamiento y activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; el acoplamiento del bromo y yodoacetato de N-succinimidilo con el ácido aminocarboxílico se lleva a cabo a RT en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/DMF con la adición posterior de carbonato de N,N'-disuccinimidilo y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los bromo y yodoacetatos de N-succinimidilo están disponibles comercialmente, los ácidos aminocarboxílicos también para n=1 a 12 y los ácidos aminocarboxílicos N-metilados para n=1 a 7.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): acoplamiento y activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; el acoplamiento del bromo y yodoacetato de N-succinimidilo con el ácido aminocarboxílico se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/DMF con la adición posterior de carbonato de N,N'-disuccinimidilo y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los bromo y yodoacetato de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; en el caso donde ALK=CH²CH²y R²⁰=H, los ácidos amino PEG carboxílicos están disponibles comercialmente para i=1 a 6 y se pueden preparar de cualquier otra manera a partir de acrilato de ferc-butilo y el correspondiente amino-PEG-alcohol; en el caso donde ALK^CH²CH²se pueden preparar según los esquemas a continuación:

en el caso donde ALK= CH²CH²y R?q^ H

en el caso donde ALK^CH?CH?

en el caso donde R²q=H

Etapa (i): protección de la amina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM al tratar la amina con dicarbonato de di-ferc-butilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (ii): protección del ácido carboxílico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con ferc-butanol en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como, por ejemplo, EDC y una base tal como, por ejemplo, DMAP;

Etapa (iii): alquilación del átomo de nitrógeno; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF mediante tratamiento con una base tal como, por ejemplo, hidruro de sodio en presencia de un reactivo que lleva un grupo saliente tal como un haluro;

Etapa (iv): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético;

Etapa (v): alargamiento de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF o DMF mediante tratamiento de un éster halogenado con el alcóxido de un benzofenona-imina-PEG-alcohol generado a través de la acción del hidruro de sodio o naftalénido de potasio según se describe en el documento WO2007/127440;

Etapa (vi): saponificación del éster; la reacción se lleva a cabo al hacer reaccionar el éster con LiOH en presencia de H²O.

Los amino-PEG-alcoholes están disponibles comercialmente, por ejemplo, para i=3, 4, 7, 8 o se pueden preparar a partir de dioles de PEG, que están disponibles comercialmente para i=3 a 12, según el procedimiento descrito en US7230101. La protección de la función amina con benzofenona se puede llevar a cabo mediante deshidratación azeotrópica en presencia de un ácido de Lewis tal como BF³eterato.

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre Fmoc-L-aminoácido-NHS y L-aminoácido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DME/THF/H²O en presencia de una base tal como, por ejemplo, bicarbonato de sodio;

Etapa (ii): desprotección de la amina Fmoc; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de una base tal como, por ejemplo, piperidina;

Etapa (iii): acoplamiento y activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; el acoplamiento del bromo y yodoacetato de N-succinimidilo con el ácido aminocarboxílico se lleva a cabo a RT en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/DMF con la adición posterior de carbonato de N,N'-disuccinimidilo y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los bromo y yodoacetato de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; los ácidos amino-(hetero)aril-carboxílicos están disponibles comercialmente como, por ejemplo, ácido 4-amino-2-benzoico, ácido 6-amino-3-piridina carboxílico, ácido 5-amino-2-pirazina carboxílico, ácido 2-amino-5-pirimidina carboxílico o ácido 6-amino-1,2,4,5-tetrazina carboxílico.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos aminocarboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 11.

preparado según el esquema a continuación:

El éster de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; en el caso donde ALK=CH²CH², los ácidos amino PEG carboxílicos protegidos por Fmoc están disponibles comercialmente para i=1 a 6 y se pueden preparar de cualquier otra manera a partir de acrilato de terc-butilo y el correspondiente amino-PEG-alcohol; en el caso donde ALK#CH²CH²se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁰. La protección de la función amina con un grupo Fmoc se puede realizar mediante tratamiento con FmocOSu (número CAS [82911-69-1]) en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): introducción del grupo azido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla acetona/H²O mediante tratamiento con azida de sodio;

Etapa (iv): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDC;

Etapa (v): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos bromo carboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 11.

LP15

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i¡¡): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC soportado;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ácidos azido PEG se pueden preparar según los esquemas a continuación:

cuando ALK=CH2CH2

Etapa (ii): activación de la función alcohol; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como DCM mediante el uso de cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (iii): sustitución del mesilato por un grupo azido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla acetona/H²O mediante tratamiento con azida de sodio;

Etapa (iv): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano); Etapa (v): alargamiento de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF o DMF mediante tratamiento de un éster halogenado con el alcóxido del diol de PEG monoprotegido como un éter de THP, alcóxido generado, por ejemplo, con hidruro de sodio. La preparación de este tipo de diol de PEG monoprotegido se describe bien en la literatura: ver, por ejemplo, Richard A., et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 o Sakellariou E.G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090;

Etapa (vi): saponificación del éster de metilo; la reacción se lleva a cabo a RT en una mezcla de disolventes polares tal como una mezcla THF/H²O en presencia de LiOH;

Los dioles de PEG de partida están disponibles comercialmente para i=3 a 12; los ésteres de bromo metilo están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

Etapa (iii): acoplamiento de ciclooctino; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como DCM;

Etapa (v): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ciclooctinos están disponibles comercialmente para n'=1, 2, 3 y 5; los diácidos monoactivados como éster de NHS están disponibles comercialmente para n=1 a 3 y para n=4 a 10 se pueden preparar mediante la activación de diácidos disponibles comercialmente con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC y una base tal como, por ejemplo, DMAP.

Etapa (iv): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano); Etapa (v): activación del ácido ciclooctino-PEG carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDC;

Etapa (vi): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ciclooctinos están disponibles comercialmente para n'=1,2 , 3 y 5; los diácidos de PeG monoactivados como éster de NHS se preparan según el esquema a continuación:

cuando ALK=CH?CH?

Etapa (ii): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético;

Etapa (iii): monoactivación de un ácido como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como THF mediante el uso de NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC y una base tal como, por ejemplo, DMAP;

Etapa (iv): alargamiento de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar anhidro tal como THF o DMF mediante tratamiento de un éster halogenado con el alcóxido del diol de PEG monoprotegido como un éter de THP. La preparación de este tipo de diol de PEG monoprotegido se describe bien en la literatura: ver, por ejemplo, Richard A., et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 o Sakellariou E.G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090;

Etapa (v): protección del ácido carboxílico como un éster de metilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como MeOH, mediante tratamiento con trimetilsilildiazometano;

Etapa (vi): saponificación del éster de metilo; la reacción se lleva a cabo en una mezcla de disolventes polares tal como una mezcla THF/H²O en presencia de LiOH;

Etapa (vii): activación del ácido como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como THF mediante el uso de NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DCC y una base tal como, por ejemplo, DMAP.

Los dioles de PEG de partida están disponibles comercialmente para i=3 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DME/THF/H²O en presencia de una base tal como bicarbonato de sodio o en un disolvente polar tal como DCM en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como anhídrido propilfosfónico y una base tal como, por ejemplo, TEA; Etapa (ii): desprotección de la amina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de una base tal como, por ejemplo, piperidina;

Etapa (iv): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN;

Etapa (v): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí. Los diácidos monoprotegidos como ésteres de alilo están disponibles comercialmente para n=2 (succinato de monoalilo) o se pueden preparar mediante transesterificación de los monoésteres de metilo o terc-butilo, que están disponibles comercialmente para n'=2 a 6.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los diácidos de PEG monoprotegidos como ésteres de alilo se preparan según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP2.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los sulfo diácidos monoprotegidos como éster de alilo se preparan según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP³.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DME/THF/H²O en presencia de una base tal como bicarbonato de sodio o en un disolvente polar tal como DCM en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como anhídrido propilfosfónico y una base tal como, por ejemplo, TEA. Etapa (ii): desprotección de la amina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de una base tal como, por ejemplo, piperidina;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos maleimido carboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos de maleimido PEG están disponibles comercialmente para ALK=ALK'=CH²CH²e i=1 a 7 y se pueden preparar de cualquier otra manera según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP⁵.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; el ácido maleimido ciclohexanocarboxílico está disponible comercialmente para ALK=CH²y se puede preparar de cualquier otra manera según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP6.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): a-sulfonación del ácido carboxílico; la reacción se lleva a cabo a 75 °C en un disolvente aprótico polar tal como DCE mediante tratamiento con ácido clorosulfónico en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; Etapa (iv): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como DCM mediante tratamiento con NHS en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EDC;

Etapa (v): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN;

Etapa (vi): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos maleimido están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): acoplamiento peptídico entre el dipéptido y el éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN;

Etapa (iv): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los bromo y yodoacetatos de N-succinimidilo están disponibles comercialmente.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los bromo y yodoacetatos de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; los ácidos aminocarboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 12 y los ácidos aminocarboxílicos N-metilados para n=1 a 7.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (iii): acoplamiento y activación del ácido carboxílico como éster de NHS; el acoplamiento del bromo y yodoacetato de N-succinimidilo con el ácido aminocarboxílico se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/DMF con la adición posterior de carbonato de N,N'-disuccinimidilo y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; el bromo y yodoacetato de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; en el caso donde ALK=CH²CH²y R²⁰=H, los ácidos amino PEG carboxílicos están disponibles comercialmente para i=1 a 6 y se pueden preparar de cualquier otra manera a partir de acrilato de ¿ere-butilo y el correspondiente amino-PEG-alcohol; en el caso donde ALK^CH²CH²se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁰.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DME/THF/H²O en presencia de una base tal como bicarbonato de sodio o en un disolvente polar tal como DCM en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como anhídrido propilfosfónico y una base tal como, por ejemplo, TEA;

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; el bromo y yodoacetato de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; los ácidos amino-(hetero)aril-carboxílicos están disponibles comercialmente, como por ejemplo ácido 4-amino-2-benzoico, ácido 6-amino-3-piridina carboxílico, ácido 5-amino-2-pirazina carboxílico, ácido 2-amino-5-pirimidina carboxílico o ácido 6-amino-1,2,4,5-tetrazina carboxílico.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos aminocarboxílicos están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos amino PEG carboxílicos protegidos con Fmoc están disponibles comercialmente para i=1 a 6 y se pueden preparar de cualquier otra manera a partir de acrilato de terc-butilo y el correspondiente amino-PEG-alcohol; en el caso donde ALK#CH²CH²se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁰. La protección de la función amina con un grupo Fmoc se puede realizar mediante tratamiento con FmocOSu (número CAS [82911 69-1]) en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos azido carboxílicos se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁴.

preparado según el esquema a continuación:

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los ácidos azido PEG carboxílicos se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁵.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los enlazadores de ciclooctino activados como ésteres de NHS se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁶.

Los ésteres de NHS de Fmoc-L-aminoácidos están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y R¹⁷y R¹⁸= H o Me independientemente entre sí; los enlazadores de ciclooctino activados como ésteres de NHS se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁷.

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (ii): activación del alcohol bencílico como un p-nitrofenil-carbonato mediante tratamiento con p-nitrofenilcloroformiato en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA.

Existen muchos derivados de anilina disponibles comercialmente tales como, por ejemplo, 4-(hidroximetil)-anilina (número CAS [623-04-1]), 4-(1-hidroxietil)-anilina (racémico (número CAS [14572-89-5]) o enantiopuro (R) (número Ca s [210754-25-9]) o (S) (número CAS [500229-84-5])), 4-amino-a,a-dimetil-benceno-metanol (número CAS [23243-04-1]), 4-amino-a-metoxi-a-metil-bencenometanol (número CAS [1379318-81-6]), 4-amino-a-metil-atrifluorometil-bencenometanol (número CAS [851652-56-7]), 2-amino-bencenometanol (número CAS [5344-90-1]), 2-amino-a-metil-bencenometanol (racémico (número CAS [10517-50-7]) o enantiopuro (R) (número CAS [3205-21-8]) o (S) (número CAS [3205-21-8])), 6-amino-3-piridinametanol (número CAS [113293-71-3]), 6-amino-a-metil-3-piridinametanol (número CAS [1335054-83-5]), 6-amino-a-etil-3-piridinametanol (número Ca S [1355225-85-2]), 6-amino-a,a-dimetil-3-piridinametanol (número CAS [843646-03-8]), 5-amino-3-piridinametanol (número CAS [873651 92-4]), 2-amino-3-piridinametanol (número CAS [23612-57-9]), 2-amino-a-metil-3-piridinametanol (racémico (número CAS [869567-91-9]) o enantiopuro (R) (número Ca s [936718-01-3]) o (S) (número CAS [936718-00-2])), 2-amino-aetil-3-piridinametanol (número CAS [914223-90-8]), 2-amino-a,a-dimetil-3-piridinametanol (número Ca S [213666-96 7]), 3-amino-4-piridinametanol (número CAS [152398-05-5]), 3-amino-a-metil-4-piridinametanol (número CAS [1242470-88-7]), 3-amino-a,a-metil-4-piridinametanol (número CAS [13357-81-8]), 4-amino-3-piridinametanol (número CAS [138116-34-4]), 4-amino-a-metil-3-piridinametanol (número CAS [741223-49-4]), 4-amino-a,a-metil-3-piridinametanol (número CAS [1339013-26-1]), 3-amino-2-piridinametanol (número CAS [52378-63-9]), 3-amino-ametil-2-piridinametanol (número CAS [954240-54-1]), 3-amino-a,a-metil-2-piridinametanol (número CAS [899438-57 4]).

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP²y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Existen muchos derivados de anilina disponibles comercialmente tales como, por ejemplo, los indicados para LP³⁵.

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP³y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP⁴y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP⁵y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP6 y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP⁷y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LPs y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LPg y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹⁰y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹¹y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹²y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹³y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹⁴y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹⁵y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹⁶y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre el precursor de enlazador LP¹⁷y un derivado de anilina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/MeOH en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, EEDQ;

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP³⁵y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP³⁶y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP³⁷y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP³⁸y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP³⁹y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁰y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴¹y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴²y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴³y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁴y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁵y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁶y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁷y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁸y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁴⁹y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Etapa (i): formación del carbamato entre el precursor de enlazador LP⁵⁰y una diamina monoprotegida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

Etapa (i): formación del carbamato; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP³⁵.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP³⁶.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP³⁷.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP³⁸.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP³⁹.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁰.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴¹.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴².

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴³.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁴.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁵.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁶.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁷.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁸.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁴⁹.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁵⁰.

preparado según la 1a etapa descrita para el precursor de enlazador LP⁵¹.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento del ácido sobre resina de Wang mediante esterificación; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como DCM en presencia de un agente acoplador tal como, por ejemplo, DIC y una base tal como, por ejemplo, DMAP;

Etapa (ii): desprotección del grupo Fmoc; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como DMF mediante tratamiento con una base tal como, por ejemplo, piperidina;

Etapa (iii): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como DMF en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOBt y HATU y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (iv): escisión de la resina; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DCM/H²O en presencia de un ácido tal como, por ejemplo, TFA.

Los alquil-aminoácidos protegidos con Fmoc están disponibles comercialmente para n=1 a 9; los L-aminoácidos con Fmoc están disponibles comercialmente.

preparado según el esquema a continuación:

Los ácidos amino PEG carboxílicos protegidos con Fmoc están disponibles comercialmente para i=1 a 6 y se pueden preparar de cualquier otra manera a partir de acrilato de terc-butilo y el correspondiente amino-PEG-alcohol; en el caso donde ALK#CH²C H se pueden preparar según los esquemas descritos para el precursor de enlazador LP¹⁰. La protección de la función amina con un grupo Fmoc se puede realizar mediante tratamiento con FmocOSu (número CAS [82911-69-1]) en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; los L-aminoácidos con Fmoc están disponibles comercialmente.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (i): acoplamiento peptídico entre Boc-L-aminoácido-ONHS y L-aminoácido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DME/THF/H²O en presencia de una base tal como, por ejemplo, bicarbonato de sodio;

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con sulfo aminoácidos; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (iii): desprotección del grupo Boc mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano);

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; los sulfo aminoácidos están disponibles comercialmente para n=1 y 2 o se pueden preparar de cualquier otra manera según el esquema a continuación:

Etapa (i): sustitución del bromuro por un tioacetilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, THF mediante el uso de ácido tioacético en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA; Etapa (ii): formación del resto ácido sulfónico; la reacción se lleva a cabo mediante tratamiento con peróxido de hidrógeno y ácido acético;

Etapa (iii): sustitución del bromuro por un azido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como, por ejemplo, DMA mediante tratamiento con azida de sodio;

Etapa (iv): desprotección de éster de metilo; la reacción se lleva a cabo en condiciones ácidas tales como, por ejemplo, una mezcla de HCl y AcOH;

Etapa (v): reducción del azido; la reacción se lleva a cabo mediante hidrogenólisis en un disolvente polar tal como H²O en presencia de un catalizador tal como paladio sobre carbono;

Los derivados de dibromo están disponibles comercialmente para n=3, 4 y 9.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con maleimido aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; las maleimido aminas están disponibles comercialmente para n=2 a 6.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con maleimido PEG aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; las maleimido PEG aminas están disponibles comercialmente para ALK=ALK'=CH²CH²e i=0 y 1 o se pueden preparar de cualquier otra manera según el esquema a continuación: cuando ALK=ALK'=CH?CH? e i>1

cuando ALK#CH?CH? y ALK'=CH?CH?

Etapa (i): Reacción de Mitsunobu en maleimida; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, THF mediante tratamiento de malemida por el ácido PEG hidroxi en presencia de PPh3 y DIAD;

Etapa (iii): activación del alcohol como un tosilato; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, DCM mediante tratamiento con cloruro de tosilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (iv): sustitución del grupo tosilo; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, THF en presencia de una base tal como, por ejemplo, hidruro de sodio.

Etapa (v): desprotección del grupo bencilo; la reacción se lleva a cabo mediante hidrogenólisis en un disolvente prótico polar tal como, por ejemplo, MeOH en presencia de una cantidad catalítica de catalizador tal como, por ejemplo, paladio sobre carbono;

Etapa (vi): activación del alcohol como un mesilato; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, DCM mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (vii): sustitución nucleófila; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, DMF en presencia de una base tal como, por ejemplo, hidruro de sodio;

Los alcoholes PEG amino protegidos con Boc de partida están disponibles comercialmente para i=2 a 4 o se pueden preparar al tratar alcoholes PEG amino disponibles comercialmente con Boc²O para i=5 a 8; los alcoholes ALK amino de partida están disponibles comercialmente para n=1 y 3 a 10; los dioles de PEG monoprotegidos con un grupo bencilo están disponibles comercialmente para i=1 a 9; los dioles ALK' de partida están disponibles comercialmente para n=1 a 12.

preparado según el esquema a continuación:

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; los maleimido aminas se pueden preparar según el esquema a continuación:

Etapa (i): activación del ácido carboxílico como un éster de NHS; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla DMF/H²O mediante tratamiento con carbonato de N,N'-disuccinimidilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Etapa (ii): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CH³CN;

El ácido maleimido ciclohexanocarboxílico está disponible comercialmente para ALK=CH²o se puede preparar de cualquier otra manera según los esquemas descritos para LP6; las diaminas monoprotegidas con un grupo Boc están disponibles comercialmente para n=1 a 10.

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; los maleimido PEG aminas se pueden preparar según el esquema a continuación:

El ácido maleimido ciclohexanocarboxílico está disponible comercialmente para ALK=CH²o se puede preparar de cualquier otra manera según los esquemas descritos para LP6; las PEG diaminas monoprotegidas con un grupo Boc están disponibles comercialmente para n=1 a 9.

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con halogenoacetamido PEG aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; las halogenoacetamido aminas están disponibles comercialmente para n=2 a 4 y 8 o se pueden preparar según el esquema a continuación:

Los bromo y yodoacetatos de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; las diaminas monoprotegidas con un grupo Boc están disponibles comercialmente para n=1 a 10.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (ii): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como una mezcla DCM/CHsCN;

Los bromo y yodoacetatos de N-succinimidilo están disponibles comercialmente; las PEG diaminas monoprotegidas con un grupo Boc están disponibles comercialmente para i=1 a 9.

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con halogenoacetamido aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ésteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; las halogenoacetamido aminas se pueden preparar según el esquema a continuación:

Los ásteres de NHS de halogenoacetamidas se pueden preparar según se describe para el precursor de enlazador LP¹¹; las diaminas monoprotegidas con un grupo Boc están disponibles comercialmente para n=1 a 10.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con azido aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ásteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; las azido aminas están disponibles comercialmente para n=2 a 8 y 10.

preparado según el esquema a continuación:

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con azido PEG aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Los L-aminoácidos están disponibles comercialmente; los ásteres de NHS de L-aminoácidos protegidos con Boc están disponibles comercialmente; para ALK=CH²CH², las azido PEG aminas están disponibles comercialmente para i=1 a 8 y 10, para ALK#CH²CH², las azido PEG aminas se pueden preparar según el esquema a continuación:

Etapa (i): activación del alcohol como un mesilato; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, DCM mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (ii): sustitución del mesilato por un grupo azido; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como una mezcla acetona/H²O mediante tratamiento con azida de sodio;

Los alcoholes PEG amino de partida se pueden preparar según se describe para el precursor de enlazador LP⁹⁰.

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con ciclooctino aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Las ciclooctino aminas están disponibles comercialmente para n=1,2, 3 y 5.

Etapa (ii): acoplamiento peptídico con ciclooctino PEG aminas; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como CH³CN en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, DCC y HOBt y una base tal como, por ejemplo, DIEA;

Las ciclooctino PEG aminas se pueden preparar según el esquema a continuación:

Etapa (ii): sustitución nucleófila; la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico polar tal como, por ejemplo, DMF en presencia de una base tal como, por ejemplo, hidruro de sodio;

Etapa (iii): desprotección mediante el uso de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético;

Etapa (iv): protección de la amina con un grupo Boc; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como, por ejemplo, DCM mediante tratamiento con Boc²O en presencia de una base tal como, por ejemplo, TEA;

Etapa (v): acoplamiento peptídico; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar tal como, por ejemplo, DCM en presencia de reactivos de acoplamiento tales como, por ejemplo, HOBt y EDC. Los alcoholes ALK amino de partida están disponibles comercialmente para n=1 a 10; los ciclooctinos están disponibles comercialmente para n=1, 2, 3 y 5.

Proceso para preparar los conjugados de fórmula (III)

Los conjugados de la presente invención se pueden obtener a través del proceso que comprende las etapas que consisten en:

(i) poner en contacto y dejar que hagan reacción una disolución acuosa opcionalmente tamponada de un anticuerpo, opcionalmente primero modificada por medio de un agente modificador, y una disolución de la carga eficaz de criptoficina de fórmula (II), el grupo químico RCG1 del compuesto de fórmula (II) es reactivo a los grupos químicos RCG2 presentes en el anticuerpo, especialmente a los grupos amino presentes en los anticuerpos, los dichos grupos químicos RCG2 se introdujeron, según corresponda, mediante el agente modificador, para acoplar el compuesto de fórmula (II) con el anticuerpo mediante la formación de una unión covalente;

(ii) y después en opcionalmente separar el conjugado formado en la etapa (i) de la carga eficaz de criptoficina y/o del anticuerpo que no hizo reacción y/o de cualesquiera aglomerados que se puedan haber formado.

Según una variante y más particularmente, en la etapa (ii) el conjugado de la etapa (i) se separa solo de la carga eficaz de criptoficina que no hizo reacción y de cualesquiera aglomerados formados, y todo anticuerpo que no hizo reacción se deja en la disolución.

La función de la puesta en contacto es hacer reaccionar los grupos químicos RCG1 y RCG2 para garantizar el acoplamiento de la carga eficaz de criptoficina con el anticuerpo mediante la formación de una unión covalente; preferiblemente,

■ cuando RCG1 representa -C(=O)-ZaRa, la reacción preferiblemente se lleva a cabo en las funciones amino del anticuerpo, especialmente los grupos £-amino llevados por las cadenas laterales de los residuos lisina (Lys) del anticuerpo y los grupos a-amino de aminoácidos del extremo N de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Un conjugado de la siguiente fórmula se obtiene en este caso: mAb-[NH-C(=O)-L*-Crypto]d con L* = fragmento de un enlazador L que comprende RCG1=-C(=O)- ZaRa y de manera que L= -L*C(=O)- ZaRa y d representa la relación entre fármaco y anticuerpo o DAR;

■ cuando RCG1 representa -Cl o un grupo maleimido o haloacetamido, el anticuerpo puede comprender grupos químicos tiol;

■ cuando RCG1 representa un grupo azido, el anticuerpo puede comprender un resto -Ce CH o una triple unión activada tal como un ciclooctino;

■ cuando RCG1 representa -NH², la reacción se puede llevar a cabo en la función amida del anticuerpo mediante el uso de catálisis enzimática, especialmente los grupos amida llevados por las cadenas laterales de residuos glutamina (Gln) de un anticuerpo. Un conjugado de la siguiente fórmula se obtiene en este caso: mAb-[C(=O)-NH-L*-Crypto]d con L* = fragmento de un enlazador L que comprende RCG1=-NH2 y de manera que L= -L*NH²y d representa la relación entre fármaco y anticuerpo o DAR;

■ cuando RCG1 representa -Ce CH o un Ce C activado tal como un resto ciclooctino, el anticuerpo puede comprender grupos azido.

El término "aglomerados" significa asociaciones que se pueden formar entre dos o más anticuerpos, los anticuerpos posiblemente se han modificado mediante conjugación. Los aglomerados tienden a formarse por la influencia de una amplia variedad de parámetros, tales como una alta concentración de anticuerpo en la disolución, el pH de la disolución, fuerzas de cizallamiento altas, la cantidad de fármacos injertados y su carácter hidrófobo, la temperatura (ver las referencias mencionadas en la introducción de J. Membrane Sci. 2008, 318, 311-316), sin embargo, la influencia de algunos de estos todavía no se ha dilucidado claramente. En el caso de proteínas o anticuerpos, se puede hacer referencia al AAPS Journal, "Protein Aggregation and Bioprocessing" 2006, 8(3), E572-E579. El contenido de aglomerados se puede determinar a través de técnicas conocidas tales como SEC (ver en este sentido Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480).

La disolución acuosa del anticuerpo se puede tamponar con tampones tales como, por ejemplo, fosfato potásico o HEPES o una mezcla de tampones tales como el tampón A descrito más adelante. El tampón depende de la naturaleza del anticuerpo. La carga eficaz de criptoficina se disuelve en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, DMSO o DMA.

La reacción se lleva a cabo a una temperatura generalmente de entre 20 °C y 40 °C. El tiempo de reacción puede variar entre 1 y 24 horas. La reacción entre el anticuerpo y la carga eficaz de criptoficina se puede monitorear mediante SEG con un detector refractométrico y/o ultravioleta y/o HRMS para determinar su grado de progreso. Si el grado de sustitución es insuficiente, la reacción se puede dejar por más tiempo y/o se puede agregar compuesto de criptoficina. Se puede hacer referencia a la sección de ejemplos para obtener más detalles en relación con las condiciones particulares. Se describen realizaciones particulares en los Ejemplos 3, 7, 10, 14, 20 y 23.

Un experto en la técnica cuenta con diversas técnicas cromatográficas para la separación de la etapa (ii): el conjugado se puede purificar, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión estérica (SEG), mediante cromatografía de absorción (por ejemplo, intercambio iónico, IEC), mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), mediante cromatografía de afinidad, mediante cromatografía sobre soportes mixtos tales como cerámica hidroxiapatita, o mediante HPLC. También se puede usar purificación mediante diálisis o diafiltración.

Después de la etapa (i) o (ii), la disolución del conjugado se puede someter a una etapa de ultrafiltración y/o diafiltración (iii). Después de estas etapas, se obtiene de esta manera el conjugado en disolución acuosa.

Anticuerpo

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo murino, quimérico, humanizado y humano.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico, es decir, un anticuerpo que se une específicamente a una única diana. Alternativamente, puede ser un anticuerpo multiespecífico [RCP1].

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG, por ejemplo, un anticuerpo de IgG¹, de IgG², de IgG³o de IgG⁴.

El anticuerpo según la invención se une específicamente a una diana y de esta manera dirige el compuesto biológicamente activo como un compuesto citotóxico hacia dicha diana. Según se usa en la presente memoria, "se une específicamente" o "se une específicamente a" o "se une a" o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se puede caracterizar por una constante de disociación en equilibrio (Kd) de al menos aproximadamente 1x10-8 M o menos (p. ej., una Kd menor indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmones superficiales y similares. Según se describe en la presente memoria, los anticuerpos se han caracterizado, por ejemplo, por su unión específica a la diana y/o antígeno diana mediante el uso de resonancia de plasmones superficiales, p. ej., BIACORE™.

La diana típicamente corresponde a una proteína expresada en la superficie celular, p. ej., una proteína expresada en la superficie de células tumorales.

En una realización, la diana es el receptor EphA2. [El receptor EphA2 es un receptor de efrina y también se denomina "EPH receptor A2" o "proteína de receptor de célula epitelial-tirosina cinasa" (ver, p. ej., la anotación de OMIM *176946, disponible en el sitio web omim.org/entry/176946, versión actualizada el 21 de julio de 2016)][RCP2]. El anticuerpo que se une específicamente al receptor EphA2 podría corresponder, por ejemplo, a uno de los anticuerpos descritos en el documento WO2008/010101 o el documento WO2011/039724.

En otra realización, la diana es CD19. CD19 es una molécula de superficie celular expresada específicamente por linfocitos B y células dendríticas foliculares del sistema hematopoyético, y también se denomina "antígeno de linfocito B CD19" (ver, p. ej., la anotación de OMIM *107265, disponibles en el sitio web omim.org/entry/107265, versión actualizada por última vez el 11 de mayo de 2015). El anticuerpo que se une específicamente a CD19 podría corresponder, por ejemplo, a Coltuximab, es decir, la parte de anticuerpo (resto) de Coltuximab Ravtansin.

El anticuerpo se puede modificar opcionalmente con un agente modificador para promover el acoplamiento de las cargas eficaces de criptoficina descritas anteriormente. El anticuerpo puede ser especialmente monoclonal, policlonal o multiespecífico. Puede ser también un fragmento de anticuerpo. Puede ser también un anticuerpo murino, humano, humanizado o quimérico. El anticuerpo usado en los ejemplos de la presente invención es hu2H11_R3574, un anticuerpo antagonista contra el receptor EphA2. La secuencia de hu2H11_R3574 se describe en el documento WO2011/039724 (SEQ ID NO: 18 para la cadena pesada y SEQ ID NO: 16 para la cadena ligera).

Conjugado

Un conjugado generalmente comprende de aproximadamente 1 a 10 compuestos de criptoficina acoplados covalentemente con el anticuerpo (este es el grado de inserción o la "relación entre fármaco y anticuerpo" o "DAR"). Esta cantidad varía como una función de la naturaleza del anticuerpo y del compuesto de criptoficina, y también de las condiciones de funcionamiento usadas en el proceso de conjugación (por ejemplo, la cantidad de equivalentes de compuesto de criptoficina con respecto al anticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y de cualquier codisolvente). La puesta en contacto del anticuerpo y el compuesto de criptoficina conduce a una mezcla que comprende varios conjugados que están individualmente diferenciados entre sí por las diferentes DAR; opcionalmente el anticuerpo que no hizo reacción; opcionalmente aglomerados. La DAR que se determinar en la disolución final corresponde, por lo tanto, a una DAR promedio. La DAR se puede calcular a partir de la desconvolución del espectro de SEC-HRMS del conjugado. La DAR (HRMS) es preferiblemente mayor que 0,5, más particularmente, entre 1 y 10 e incluso más particularmente entre 2 y 7.

El conjugado se puede usar como un agente anticanceroso. Debido a la presencia del anticuerpo, el conjugado es altamente selectivo para células tumorales en lugar de células sanas. Esto posibilita dirigir el compuesto de criptoficina en un entorno similar a este o directamente a este; (en este sentido, ver las siguientes publicaciones que describen el uso de conjugados de anticuerpo monoclonal en el tratamiento del cáncer: "Antibody-drug conjugates for cancer therapy" Carter P.J., et al., Cancer J. 2008, 14, 154-169; "Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs" Chari R., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98-107). Se pueden tratar cánceres sólidos o líquidos. El conjugado se puede usar solo o en combinación con al menos un otro agente anticanceroso.

El conjugado se formula en forma de una disolución acuosa tamponada en una concentración generalmente de entre 1 y 10 mg/mL. Esta disolución se puede inyectar en forma de perfusión per se o se puede rediluir para formar una disolución de perfusión.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen la preparación de ciertos compuestos según la invención. Estos ejemplos no son limitantes y meramente ilustran la presente invención.

Métodos analíticos usados

Cromatografía líquida de presión elevada - Espectrometría de masas (LCMS)

Método A1

Se obtuvieron espectros en un sistema Waters UPLC-SQD en modo de electropulverización positivo y/o negativo (ES+/-) mediante el uso de detección ELSD y UV (210-400 nm). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes:

columna: ACQUITY BEH C18 - 1,7 pm - 2,1 x 50 mm; disolventes: A: H²O (ácido fórmico al 0,1 %), B: CH³CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 50 °C; velocidad de flujo: 0,8 mL/min; gradiente (2,5 min): de 5 a 100 % de B en 1,8 min; 2,4 min: 100 % de B; 2,45 min: de 100 a 5 % de B en 0,05 min.

Método A2

Se obtuvieron espectros en un sistema Waters XeVo-QTof en modo de electropulverización positivo (ES+) mediante el uso de detección ELSD y UV (210-400 nm). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes:

columna: ACQUITY BEH C18 - 1,7 pm - 2,1 x 100 mm; disolventes: A: H²O (ácido fórmico al 0,1 %), B: CH³CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 70 °C; velocidad de flujo: 0,55 mL/min; gradiente (11 min): de 5 a 97 % de B en 8,3 min; 8,6 min: 97 % de B; 9 min: de 97 a 5 % de B en 0,7 min y 5 % de B durante 2 min.

Método A3

Se obtuvieron espectros en un sistema Waters XeVo-QTof en modo de electropulverización positivo (ES+). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes:

columna: ACQUITY BEH C18 - 1,7 pm - 2,1 x 100 mm; disolventes: A: H²O (ácido fórmico al 0,1 %), B: CH³CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 45 °C; velocidad de flujo: 0,6 mL/min, gradiente (5,3 min): 5 % de B durante 0,3 min; de 5 a 100 % de B en 3,7 min; 4,6 min: 100 % de B; 5,3 min 5 % de B.

Método A4

columna: ACQUITY BEH C18 - 1,7 pm - 2,1 x 50 mm; disolventes: A: H²O (ácido fórmico al 0,1 %), B: CH³CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 45 °C; velocidad de flujo: 0,8 mL/min; gradiente (10 min): de 5 a 100 % de B en 8,6 min; 9,6 min: 100 % de B; 9,8 min: 5 % de B.

Método A5

columna: ACQUITY CSH C18 - 1,7 pm - 2,1 x 50 mm; disolventes: A: H²O (ácido fórmico al 0,1 %), B: CH³CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 40 °C; velocidad de flujo: 0,85 mL/min; gradiente (2,5 min): de 5 a 100 % de B en 1,8 min; 2,4 min: 100 % de B; 2,45 min: de 100 a 5 % de B en 0,05 min.

Resonancia magnética nuclear de 1H (NMR)

Los espectros de 1H NMR se adquirieron en un espectrómetro Bruker Avance de cualquiera de los modelos DRX-300, DRX-400 o DRX-500. Los desplazamientos químicos (5) se proporcionan en ppm.

Cromatografía de exclusión por tamaño - espectrometría de masas de alta resolución (SEC-HRMS)

El análisis cromatográfico se llevó a cabo en una máquina Agilent HP1100 y una columna Waters BEH SEC 200 1,7 pm (2,1 x 150 mm) a 30 °C con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min y una elución isocrática de (A) 25 mM formiato de amonio ácido fórmico al 1 %/(B) CH³CN ácido fórmico al 0,1 % 70/30 durante 15 minutos. La espectrometría de masas se llevó a cabo en una máquina Waters QTOF-II con ionización por electropulverización en modo positivo (ES+). Los espectros de masas se desconvoluyeron con el programa informático Waters MaxEnt1.

Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (SEC)

El análisis se llevó a cabo en un sistema Waters Alliance HPLC o un sistema Hitachi Lachrom equipado con un detector de matriz de fotodiodos y una columna Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5 pm (7,8 x 300 mm) con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min y una elución isocrática de 30 minutos con un tampón de pH 7 que contiene 0,2 M de KCI, 0,052 M de KH²PO⁴, 0,107 M de K²HPO⁴y 20 % en volumen de isopropanol.

Tampones

• Tampón A (pH 6,5): NaCl (50 mM), fosfato potásico (50 mM), EDTA (2 mM)

• Tampón B (pH 6,5): NaCl (140 mM), fosfato potásico y sódico (9,6 mM)

• PBS (pH 7,4): KH²PO⁴(1,06 mM), NaCl (155,17 mM), Na2HPO4-7H2O (2,97 mM)

• DPBS: KCI (2,67 mM), KH²PO⁴(1,47 mM), NaCl (136,9 mM), Na2HPO4 (8,10 mM) ajustado a pH 6,5 con 5N HCl (1 mL por 1000 mL de tampón)

Método general usado para la preparación del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)

Se trató una disolución de anticuerpo en un tampón acuoso compuesto por una mezcla 96:4 de tampón A y 1 N HEPES con un exceso de una disolución a aproximadamente 10 mM de carga eficaz de criptoficina en DMA de manera que la concentración final de anticuerpo es 3 mg/mL y el porcentaje de DMA en el tampón acuoso es 20 %. Después de agitar durante 2 horas, la mezcla se analizó mediante SEC-HRMS para determinar la DAR en la población de anticuerpos monoméricos. Si se halló una DAR insuficiente, la mezcla se trató con un exceso adicional (1 a 5 equivalentes) de disolución de criptoficina en DMA durante 2 horas adicionales a RT con agitación. La mezcla se purificó por filtración en gel mediante el uso de una matriz Superdex 200 pg (columna de desalado HiLoad 16/60 o 26/60, GEHealthcare) preequilibrada en tampón acuoso pH 6,5 (tampón B o DPBS) que contenía 10 a 20 % de NMP. Las fracciones que contenían el anticuerpo conjugado monomérico se combinaron y concentraron en Amicon Ultra-15 (membrana de 10k o 50k Ultracel, Millipore) hasta una concentración de entre 2 y 5 mg/mL. A continuación, se llevó a cabo un cambio de tampón o una dilución en el tampón adecuado para formular el conjugado en el tampón final. En el caso de un cambio de tampón, se llevó a cabo mediante filtración en gel usando una matriz Sephadex™ G25 (columnas de desalinización NAP-5, NAP-10, NAP-25/PD-10 o Hiprep 26/10, GEHealthcare) preequilibrado con el tampón acuoso final cuya composición y pH son adecuados para cada conjugado. El conjugado se filtró finalmente a través de una unidad de filtro Steriflip® (membrana de PVDF de 0,22 pm Durapore®, Millipore). El conjugado final se sometió a ensayo mediante espectrometría de UV o SEC-HPLC para medir la concentración del conjugado, mediante SEC-HPLC para determinar la pureza monomérica y mediante SEC-HRMS para determinar la DAR a partir de la desconvolución del espectro de masas del conjugado.

Síntesis del fragmento A: (2E,5S,6R,7E)-ferc-butil 8-(4-formilfenil)-5-hidroxi-6-metilocta-2,7-dienoato

Compuesto 1: (2E,5S,6R)-tere-butil 5-hidroxi-7-((4-metoxibencil)oxi)-6-metilhept-2-enoato

En argón, a una disolución de (2R,3S)-1-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-metil-5-hexen-3-ol o alcohol de Sakurai (número CAS [203926-55-0], 100 g, 399,5 mmol) en DCM (350 mL) se agregaron acrilato de tere-butilo (354,7 mL, 2,435 mol) y catalizador de Grubbs (4,849 g, 2,435 mol). Después de agitar durante 17 h a RT, la mezcla de reacción se filtró sobre 230 g de sílice y se eluyó con una mezcla de heptano/AcOEt (50/50, 6 x 300 mL). Después de la concentración, el residuo se purificó mediante cromatografía rápida sobre 1,2 kg de gel de sílice (gradiente de elución heptano/EtOAc) para proporcionar 140,8 g de un aceite marrón. El aceite se disolvió en DCM anhidro (550 mL), se agregaron 10 g de resina quadraPure™ TU para retirar el exceso de catalizador. La mezcla se agitó durante 3 h a 35 °C. La resina se filtró y lavó con DCM, el filtrado se concentró y se secó al vacío para proporcionar 135,75 g del compuesto 1 como un aceite marrón (97 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,42 (s, 9 H); 1,72 (m, 1 H); 2,18 (m, 1 H); 2,30 (m, 1 H); 3,24 (dd, J = 7,0 y 9,3 Hz, 1 H); 3,46 (dd, J = 7,7 y 9,3 Hz, 1 H); 3,49 (m, 1 H); 3,73 (s, 3 H); 4,35 (s, 2 H); 4,65 (d, J = 5,8 Hz, 1 H); 5,76 (td, J = 1,5 y 15,6 Hz, 1 H); 6,83 (td, J = 7,4 y 15,6 Hz, 1 H); 6,90 (d, J = 8,8 Hz, 2 H); 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2 H).

Compuesto 2: (2E,5S,6R)-tere-butil 5,7-dihidroxi-6-metilhept-2-enoato

A una disolución de compuesto 1 en CH³CN (910 mL), se agregó H²O (90 mL) y la mezcla se enfrió a 12 °C antes de agregar en 25 min una disolución de CAN (196,7 g, 358,9 mmol) en H²O (300 mL). La agitación se continuó durante 1 h a RT. Se disolvió CAN adicional (18,83 g, 34,36 mmol) en una mezcla de CH³CN (70 mL) y se agregó H²O (30 mL) y se agitó durante 1 h a RT para completar la reacción. La mezcla se aplacó con NaCl hasta la saturación de la capa ac., después se agregó MTBE (400 mL). Después de la decantación, la capa ac. se extrajo con MTBE (2 x 80 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una mezcla 3:1 de NaHCO3/H2O al 5 %(3 x 200 mL), salmuera sat. (2 x 130 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. La capa ac. se acidificó con HCl 2N hasta pH 4, después se saturó con NaCl y se extrajo con MTBE (2 x 150 mL). Esta segunda capa orgánica se lavó con NaHCO3 al 5 %(60 mL), salmuera sat. (60 mL), se secó sobre MgSO4, se concentró y se combinó con la primera capa orgánica para proporcionar un aceite marrón anaranjado.

La mezcla se disolvió en MeTHF (300 mL), después se agregaron 1,2-etanoditiol (22 mL, 0,260 mol) y p-TsOH (1,651 g, 8,590 mmol). Después de agitar a 60 °C durante 5 h, se agregó MTBE (200 mL) a la mezcla de reacción y se lavó con NaHCO3 al 5 % (2 x 120 mL), salmuera sat. (120 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 520 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MTBE) para proporcionar 29,48 g de compuesto 2 como un aceite amarillo (75 %).

Compuesto 3: (2E,5S,6R)-tere-butil 6-metil-5,7-bis((trietilsilil)oxi)hept-2-enoato

En argón a una disolución de compuesto 2 (39,38 g, 0,171 mol) en DCM anhidro (500 mL) se agregó imidazol (51,540 g, 0,749 mol). La mezcla amarilla se enfrió a 0 °C, después se agregó trietilclorosilano (63,99 mL, 0,374 mol) y se dejó que la disolución se calentara hasta RT durante toda la noche. La mezcla de reacción se aplacó con NH4Cl sat. (400 mL), MTBE (300 mL) y hielo. El pH se ajustó en 4 con NaHSO42M, las capas se separaron después con agitación vigorosa. La capa ac. se extrajo con MTBE (200 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NH⁴CI medio sat. (2 x 250 mL), tampón de fosfato pH 7 (150 mL), salmuera sat. (150 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 490 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/Et²O) para proporcionar 74,52 g de compuesto 3 como un aceite amarillo pálido (95 %).

Compuesto 4: (2E,5S,6S)-ferc-butil 6-metil-7-oxo-5-((trietilsilil)oxi)hept-2-enoato

En argón, a una disolución de DMSO (102,400 mL, 1,427 mol) en DCM (300 mL) se agregó por goteo a -75 °C cloruro de oxalilo (63 mL, 0,719 mol) en 1 h y se continuó con la agitación durante 15 min antes de agregar, a -75 °C, una disolución de compuesto 3 en DCM (150 mL) mientras se mantenía la temperatura por debajo de -70 °C. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara hasta -40 °C y se continuó con la agitación durante 2 h. La mezcla de reacción se enfrió nuevamente a -75°C, después se agregó DIEA (425 mL, 2,432 mol) en 75 minutos mientras se mantenía la temperatura por debajo de -65 °C. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara hasta RT y después se aplacó con MTBE (500 mL, hielo, NH4Cl sat. (200 mL) y NaHSO4 2M hasta alcanzar pH 4. Las capas se separaron después con agitación vigorosa. La capa ac. se extrajo con MTBE (200 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NH4Cl (3 x 300 mL), tampón de fosfato pH 7 (300 mL), salmuera sat. (300 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 1,25 kg de gel de sílice (gradiente de elución heptano/Et²O) para proporcionar 51,74 g de compuesto 4 como un aceite anaranjado (93 %).

Compuesto 5: (2E,5S,6R,7E)-ferc-butil 5-hidroxi-8-(4-(hidroximetil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, a una suspensión de bromuro de fosfonio (síntesis descrita en el documento WO2011/001052, 147 g, 0,237 mol) en THF anhidro (1,5 L) se agregó a -50 °C una disolución 2,5 M de n-BuLi en hexano (90 mL, 0,225 mol). Se dejó que la temperatura se calentara hasta -40 °C y se continuó con la agitación durante 15 min. Después de calentarla hasta RT, la mezcla roja se agitó durante 1 h. El medio de reacción se enfrió a -70 °C antes de agregar una disolución del compuesto 4 (51,63 g, 126,6 mmol) en THF (200 mL) mientras se mantuvo la temperatura por debajo de -65 °C. Cuando se completó la adición, se dejó que la mezcla de reacción se calentara hasta RT y se continuó con la agitación durante toda la noche. La mezcla de reacción se filtró para retirar la fracción insoluble que se lavó con MTBE (500 mL). El filtrado se concentró parcialmente a 42 °C (1/3), después se aplacó con hielo, NH4Cl (500 mL), MTBE (500 mL) y NaHSO42M hasta alcanzar pH 4. Las capas se separaron y la capa ac. se extrajo con MTBE (200 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NH4Cl medio sat. (250 mL), tampón de fosfato pH 7 (250 mL), salmuera sat. (250 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron hasta la mitad al vacío hasta 250 mbar. La suspensión se diluyó con 50:50 heptano/MTBE (600 mL) enfriado con un baño de hielo, se retiró por filtración y se lavó con 50:50 heptano/MTBE. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar 100,05 g como un aceite marrón.

El compuesto bruto se disolvió en THF anhidro (320 mL), después se lavó con TBAF trihidratado (90 g, 282,40 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h. Después de la concentración al vacío, el compuesto bruto se diluyó con 10:1 MTBE/THF (770 mL), se lavó con un NH4Cl medio sat. (3 x 200 mL), NaHSO4 1M (200 mL), tampón de fosfato pH 7 (200 mL), salmuera sat. (200 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. La capa ac. se extrajo con MTBE. Después de la decantación, la capa orgánica se lavó con tampón de fosfato pH 7 (30 mL), salmuera sat. (30 mL), se secó sobre MgSO⁴y se filtró. Después de la concentración, las capas orgánicas combinadas se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 1,25 kg de gel de sílice (gradiente de elución heptano/Et²O) para proporcionar 36,91 g del compuesto 5 como un aceite marrón-rojo (88 %).

Fragmento A: (2E,5S,6R,7E)-ferc-butil 8-(4-formilfenil)-5-hidroxi-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, a una disolución de compuesto 5 (30,3 g, 91,7 mmol) en DCM anhidro (600 mL) se agregó, a 10 °C, óxido de manganeso (175 g, 3,013 mol) y la mezcla de reacción se agitó durante 4 h a 35 °C. El oxidante se filtró a través de un tapón de celite y se lavó con acetona tibia. El filtrado se concentró para proporcionar 30,43 g de un aceite rojo-anaranjado.

En argón, el aceite se diluyó con benceno (800 mL) y se sometió a reflujo en presencia de AIBN (880 mg, 4,58 mmol) y tiofenol (2,81 mL, 27,51 mmol) durante 1 h. Se agregaron AIBN (530 mg, 0,03 eq) y tiofenol (1,03 mL, 10,087 mmol) adicionales y se continuó con el reflujo durante 1 h adicional. Se agregaron AIBN (530 mg, 0,03 eq) y tiofenol (1,03 mL, 10,087 mmol) adicionales y se continuó con el reflujo durante 3 h. Se agregaron AIBN (353 mg, 1,834 mmol) y tiofenol (468 pL, 4,58 mmol) adicionales y se continuó con el reflujo durante 1 h. La conversión E/Z fue 92/8, se agregaron 352,6 mg de AIBN y se continuó con el reflujo durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta RT y se concentró al vacío para proporcionar 28,03 g del fragmento A como un aceite anaranjado (92 %) con una relación E/Z mayor que 98/2.

Síntesis del fragmento B: ácido (R)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanoico

A una disolución de (R)-2-((íerc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifil)-propanoato de metilo (número CAS [162465-44-3], 30 g, 87,26 mmol) en THF (225 mL), se agregaron H²O (30 mL) y LiOH monohidratado (4,4 g, 104,85 mmol). El medio de reacción se agitó 2 h a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se diluyó con H²O (200 mL), después se acidificó a pH 2 con HCl 5N (20 mL) y se extrajo mediante EtOAc (2 x 250 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (500 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío, se diluyeron con Et²O y se concentraron al vacío para proporcionar 26,9 g de fragmento B como un sólido blanco (94 %).

1H RMN (300 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,21 a 1,37 (m, 9 H); 2,74 (dd, J = 11,0 y 14,3 Hz, 1 H); 2,96 (dd, J = 5,0 y 14,3 Hz, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 4,04 (m, 1 H); 6,99 a 7,09 (m, 2 H); 7,18 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1 H); 7,29 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 12,60 (ancho m, 1 H).

Síntesis del fragmento C1: clorhidrato de 3-amino-2,2-dimetilpropanoato de metilo

Compuesto 6: 3-((íerc-butoxicarbonil)amino)-2,2-dimetilpropanoato de metilo

En argón, a una disolución de ácido 3-([(íerc-butoxi)carbonil]amino)-2,2-dimetilpropanoico (número CAS [180181-02 6], 250 mg, 1,09 mmol) en DCM (6 mL) y MeOH (2 mL) se agregó por goteo a 0 °C, (trimetilsilil)diazometano (819,86 pL, 1,64 mmol) hasta un color amarillo persistente. Después se agregó AcOH hasta una decoloración completa. La mezcla de reacción se concentró al vacío, después se diluyó con H²O y se extrajo con DCM dos veces. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío para proporcionar 260 mg de compuesto 6 como un aceite incoloro (cuant.).

Fragmento C1: clorhidrato de 3-amino-2,2-dimetilpropanoato de metilo

A una disolución de compuesto 6 (260 mg, 1,12 mmol) en 1,4-dioxano (10 mL) se agregó HCl 4N en 1,4-dioxano (2,81 mL, 11,24 mmol). La mezcla de reacción se agitó a RT durante toda la noche, después se concentró al vacío para proporcionar 200 mg de fragmento C1 (cuant.).

Síntesis del fragmento C2: clorhidrato de 3-amino-2,2-dimetilbutanoato de metilo

A una disolución de ácido DL-3-aminobutírico (número CAS [541-48-02], 18,72 g, 176,09 mmol) en H²O (96 mL) se agregaron dicarbonato de di-terc-butilo (39,62 g, 176,09 mmol) y NaOH (8,03 g, 200,74 mmol) en H²O (76 mL) después alcohol terc-butílico (132 mL). La mezcla de reacción se agitó a RT durante toda la noche. Después de este tiempo, el medio de reacción se concentró al vacío, después se diluyó con EtOAc (200 mL) y se acidificó a pH 3 con HCl diluido. Después de asentarse, la fase ac. se extrajo con EtOAc (200 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 34,5 g de compuesto 7 como un aceite incoloro (82 %).

1H RMN (300 MHz, 5 en ppm, COCh-d1): 1,25 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,45 (s, 9 H); 2,55 (m, 2 H); 4,04 (m, 1 H); 4,93 (ancho m, 1 H); 8,41 (ancho m, 1 H).

Compuesto 8: 3-((te/-c-butoxicarbonil)amino)butanoato de metilo

En argón, se agitó una disolución de compuesto 7 (10 g, 49,20 mmol) en tolueno (350 mL) y MeOH (100 mL) a 5 °C. Entre 5 °C y 10 °C, se agregó (trimetilsilil)diazometano (73,81 mL, 147,61 mmol) por goteo. La mezcla de reacción se agitó 3 h, después se evaporó al vacío para proporcionar 10,8 g de compuesto 8 como un aceite amarillo pálido (cuant.).

1H RMN (300 MHz, 5 en ppm, CO Cb-d): 1,20 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,45 (s, 9 H); 2,50 (m, 2 H); 3,69 (s, 3 H); 4,03 (m, 1 H); 4,90 (ancho m, 1 h ).

Compuesto 9: 3-((íerc-butoxicarbonil)amino)-2-metilbutanoato de metilo

En argón, a una disolución de LDA (2M en THF, 25,32 mL, 50,63 mmol) en THF (48 mL) a -70 °C se agregó por goteo una disolución de compuesto 8 (5 g, 23,01 mmol) en THF (62 mL). La mezcla de reacción se agitó 1 h a -75 °C después se agregó yodometano (5,79 mL, 92,05 mmol) por goteo a -70 °C. La mezcla de reacción se agitó 3 h a -75 °C, después a RT durante toda la noche. Después de este tiempo, se agregó una disolución ac. de NH4Cl al 20 % (100 mL) y Et²O (125 mL). Después de asentarse, la fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (80 mL) después NaCl sat. (80 mL). Las fases ac. combinadas se extrajeron con Et²O (125 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 5,49 g de aceite bruto. La cristalización con pentano (15 mL) proporcionó 2,65 g de compuesto 9 después del secado al vacío. La disolución de pentano se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/Et²O) para proporcionar 1,98 g de compuesto 9. Los dos lotes se agruparon (87 %) se usaron como tal en la siguiente etapa.

Compuesto 10: 3-((íerc-butoxicarbonil)amino)-2-,2-dimetilbutanoato de metilo

En argón, se enfrió THF (46 mL) a -72 °C después se agregaron LDA (2M en THF, 22 mL, 44,0 mmol) y por goteo a -72 °C (+/-2 °C) una disolución del compuesto 9 (4,60 g, 19,89 mmol) en THF (64 mL). La mezcla de reacción se agitó 1 h15 a -75 °C después se agregó yodometano (5 mL, 79,55 mmol) por goteo a -72 °C (+/- 2 °C). El medio de reacción se agitó 3 h a -75 °C después durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, se agregó una disolución ac. de NH4Cl al 20 % (50 mL) y Et²O (80 mL). Después de asentarse, la fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (50 mL) y salmuera sat. (50 mL). Las fases ac. combinadas se extrajeron con Et²O (80 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 6,5 g de aceite bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 200 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/iPr²O) para proporcionar 1,9 g de compuesto 10 como un aceite incoloro (39 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,92 (d, J = 7,1 Hz, 3 H); 1,02 (s, 3 H); 1,04 (s, 3 H); 1,48 (s, 9 H); 3,58 (s, 3 H); 3,88 (m, 1 H); 6,62 (ancho d, J = 10,5 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 146, m/z = 246 [M+H]+; RT = 1,2 min. Fragmento C2: clorhidrato de 3-amino-2,2-dimetilbutanoato de metilo

En un matraz de fondo redondo, con agitación magnética, se introdujo el compuesto 10 (0,3 g, 1,22 mmol), posteriormente 1,4-dioxano (5 mL) y HCl 4N en 1,4-dioxano (5 mL). La mezcla de reacción se agitó a RT durante toda la noche, después se concentró al vacío. El sólido bruto obtenido se precipitó en iPr²O (15 mL), se filtró y se secó para proporcionar 210 mg de fragmento C2 como un sólido blanco (95 %).

LCMS (A1): ES m/z = 146 [M+H]+; RT = 0,8 min.

Síntesis del fragmento C3: 2-(1-aminociclopropil)-2,2-dimetilpropanoato de etilo

En argón, a una disolución de 2-ciano-2-metilpropionato de etilo (número CAS [1572-98-1], 2 g, 13,88 mmol) en Et²O (48 mL) se agregó isopropóxido de titanio (IV) (4,63 g, 15,97 mmol). La mezcla de reacción se agitó 10 min a RT, después se enfrió a -5 °C. Una disolución de bromuro de etilmagnesio 3M en Et²O (9,72 mL, 29,16 mmol) se agregó por goteo a -5 °C-0 °C en 25 min, después la mezcla de reacción se agitó 40 min sin el baño de enfriamiento. En este momento, un TLC mostró que la reacción se había completado. El medio de reacción se enfrió a 0 °C y se agregó boro trifluoruro dietil eterato (3M en Et²O, 3,6 mL, 29,16 mmol) por goteo a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó 30 min sin el baño de enfriamiento. Después de este tiempo, se agregó HCl 1N a 0 °C hasta pH 1-2 (8 mL), después NaOH 2N hasta pH 8 (28 mL), la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (3 x 150 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 2,4 g de aceite amarillo bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 70 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 915 mg de fragmento C3 como un aceite amarillo pálido (39 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, COCb-cTÍ): 0,52 (m, 2 H); 0,70 (m, 2 H); 1,11 (s, 6 H); 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,64 (ancho s, 2 H); 4,18 (c, J = 7,2 Hz, 2 H).

Síntesis del fragmento C4: clorhidrato de 3-amino-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato de metilo

A una disolución de ácido DL-3-aminoisobutírico (número CAS [10569-72-9], 5 g, 47,52 mmol) en NaOH 2N (24,7 mL) se agregó por goteo una disolución de Boc²O (11,73 g, 53,22 mmol) en THF (75 mL) mientras el medio de reacción se mantenía a una temperatura por debajo de 30 °C con un baño de agua fría. El medio de reacción se agitó a RT durante 18 h, después se concentró al vacío, se diluyó en H²O (75 mL) y se lavó con MTBE (3 x 150 mL). La fase acuosa se acidificó hasta pH 3 mediante la adición de ácido cítrico a 100 g/L (150 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 150 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (3 x 45 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 9,4 g de compuesto 11 como un aceite incoloro (97 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,01 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,38 (s, 9H); 2,48 (m, 1H); 2,91 (dt, J = 6,1,6,5 y 13,5 Hz, 1H); 3,15 (ddd, J = 6,1,7,4 y 13,5 Hz, 1H); 6,80 (t, J = 6,1 Hz, 1H); 12,15 (ancho s, 1H).

Compuesto 12: 3-((íe/'c-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato de metilo

A una disolución de compuesto 11 (9,4 g, 46,25 mmol) en acetona (300 mL) se agregaron K²CO³(16,14 g, 115,63 mmol) y CH3l (13,26 g, 92,5 mmol). El medio de reacción, una suspensión amarilla, se agitó a RT durante 20 h, después se filtró sobre Clarcel. La torta obtenida de este modo se lavó con acetona, el filtrado se concentró al vacío, se diluyó con DCM (100 mL), se filtró sobre Clarcel, la torta obtenida de este modo se lavó con DCM y el filtrado se concentró al vacío para proporcionar 9,4 g de compuesto 12 como un líquido amarillo (93 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,01 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,37 (s, 9H); 2,54 (m, 1H); 2,91 (dt, J = 6,2 y 13,5 Hz, 1H); 3,15 (ddd, J = 6,2, 6,9 y 13,5 Hz, 1H); 3,59 (s, 3H); 6,90 (t, J = 6,2 Hz, 1H).

Compuesto 13: 3-((íerc-butoxicarbonil)amino)-2-(((4-metoxibencil)oxi)metil)-2-metilpropanoato de metilo

A una disolución de DIEA (3,2 mL, 22,45 mmol) en THF (10 mL) enfriada a -75 °C se agregó por goteo una disolución de n-BuLi 1,6 M en THF (14 mL, 22,4 mmol). El medio de reacción se agitó a -75 °C durante 20 min; después se agregó por goteo a -75 °C una disolución del compuesto 12 (2 g, 9,21 mmol) en THF (16 mL) y la mezcla de reacción se agitó a -75 °C durante 10 min. Una disolución de 1-((clorometoxi)metil)-4-metoxibenceno (1,72 g, 9,21 mmol) en THF (16 mL) se agregó después rápidamente a la mezcla de reacción y se continuó con la agitación a -25 °C durante 4 h. El medio de reacción se diluyó con DCM (100 mL) antes de la adición de una disolución de ácido cítrico a 100 g/L (50 mL) mientras la temperatura se mantuvo por debajo de 5 °C. El medio de reacción se agitó a RT durante 15 min. La fase orgánica se lavó con una disolución de ácido cítrico a 100 g/L (2 x 50 mL), H²O (3 x 50 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 4,08 g de un aceite amarillo-anaranjado que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 150 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/EtOAc) para proporcionar 2,05 g de compuesto 13 como un aceite incoloro (60 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,03 (s, 3H); 1,37 (s, 9H); 3,14 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 3,31 (d, J = 9,1 Hz, 1H); 3,48 (d, J = 9,1 Hz, 1H); 3,58 (s, 3H); 3,73 (s, 3H); 4,38 (s, 2H); 6,76 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 6,90 (d, J = 8,9 Hz, 2H); 7,20 (m, 2H).

Fragmento C4: clorhidrato de 3-amino-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato de metilo

El Compuesto 13 (1,5 g, 4,08 mmol) se trató con una disolución de HCl 4 M en dioxano (24 mL) a R.T. durante 1 h. El medio de reacción después se concentró al vacío y se coevaporó en presencia de tolueno para proporcionar 794 mg de fragmento C4 como un aceite viscoso (cuant.).

Síntesis de AD1: (2E,5S,6R,7E)-te/e-butil 5-(((S)-2-amino-4-metilpentanoil)oxi)-8-(4-(azidometil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

Compuesto 14: (2E,5S,6R,7E)-terc-butil 5-(((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-metilpentanoil)oxi)-8-(4-formilfenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, en un matraz de fondo redondo con agitación magnética, se introdujo Fmoc-Leu-OH (4,9 g, 13,86 mmol), posteriormente el fragmento A (3,5 g, 10,59 mmol) en DCM (100 mL) y DIEA (6,6 mL, 38,13 mmol). A continuación, se agregaron MNBA (5 g, 14,52 mmol) y DMAP (620 mg, 5,07 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se lavó con H²O (100 mL) y salmuera sat. (100 mL). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 9,1 g de aceite anaranjado bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 400 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 5 g de compuesto 14 como un aceite amarillo pálido (71 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,77 (d, J = 6,8 Hz, 6 H); 1,05 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,33 a 1,64 (m, 4 H); 1,38 (s, 9 H); 2,39 a 2,63 (m parcialmente enmascarado, 2 H); 4,01 (m, 1 H); 4,13 a 4,31 (m, 3 H); 4,95 (m, 1 h ); 5,81 (d, J = 15,9 Hz, 1 H); 6,37 (dd, J = 8,8 y 16,2 Hz, 1 H); 6,52 (d, J = 16,2 Hz, 1 H); 6,70 (td, J = 7,3 y 15,9 Hz, 1 H); 7,29 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,40 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,67 (dd, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,74 a 7,82 (m, 3 H); 7,87 (d, J = 7,9 Hz, 2 H); 9,93 (s, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 666 [M+H]+, m/z = 689 [M+Na]+; RT = 1,92 min.

Compuesto 15: (2E,5S,6R,7E)-terc-butil 5-(((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-metilpentanoil)oxi)-8-(4-(hidroximetil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, a una disolución de compuesto 14 (5 g, 7,51 mmol) en MeTHF (60 mL), se agregó trimetoxiborohidruro de sodio (1,2 g, 8,91 mmol) en porciones. El medio de reacción se agitó 5 h a RT. Después de este tiempo, se agregaron NH4Cl sat. (100 mL) y acetona (20 mL). El medio de reacción se agitó 1 h a RT. Después de asentarse, la fase orgánica se lavó con H²O, después con salmuera sat. (50 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 5,3 g de aceite amarillo anaranjado bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 300 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 3.15 g de compuesto 15 como un semisólido blanco (63 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (m, 6 H); 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,35 a 1,66 (m, 4 H); 1,38 (s, 9 H); 2,35 a 2,56 (m parcialmente enmascarado, 2 h); 4,02 (m, 1 H); 4,15 a 4,32 (m, 3 H); 4,43 (d, J = 5,5 Hz, 2 H); 4,92 (m, 1 H); 5,12 (t, J = 5,5 Hz, 1 H); 5,80 (d, J = 15,9 Hz, 1 H); 6,10 (dd, J = 8,8 y 16,2 Hz, 1 H); 6,39 (d, J = 16,2 Hz, 1 H); 6,69 (m, 1 H); 7,20 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,28 a 7,33 (m, 4 H); 7,41 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,69 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,80 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 7,88 (d, J = 7,9 Hz, 2 H). LCMS (A1): ES m/z = 668 [M+H]+; m/z = 690 [M+Na]+; m/z = 712 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,84 min.

Compuesto 16: (2E,5S,6R,7E)-terc-butil 5-(((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil) amino)-4-metilpentanoil)oxi)-8-(4-(azidometil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, se introdujeron el compuesto 15 (3,15 g, 4,72 mmol) y DCM (50 mL) en un matraz de fondo redondo. A 0 °C, se agregó TEA (987 pL, 7,08 mmol) y posteriormente cloruro de metanosulfonilo (438 pL, 5,66 mmol), el medio de reacción se agitó 1 h a 0 °C y 13 h a RT. Después de este tiempo, se agregaron DCM (50 mL) y agua (50 mL). Después de asentarse, la fase orgánica se lavó con salmuera sat. (3 x 25 mL), se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío. En argón, el producto bruto obtenido de este modo se disolvió en DMF (50 mL) y se agregó azida de sodio (644 mg, 9,91 mmol). El medio de reacción se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, el DMF se concentró al vacío y se agregó AcOEt. La mezcla obtenida se lavó con HCl 0,1 N (25 mL), con NaHCÜ3 sat. (25 mL) y salmuera sat. (25 mL), se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 3,3 g de producto bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 200 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,8 g de compuesto 16 como una goma incolora (55 %) y 740 mg de compuesto AD1 (33 %).

LCMS (A2): ES m/z = 715 [M+Na]+; RT = 8,95 min.

Compuesto AD1: (2E,5S,6R,7E)-terc-butil 5-(((S)-2-amino-4-metilpentanoil)oxi)-8-(4-(azidometil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, en un matraz de fondo redondo con agitación magnética, se introdujeron el compuesto 16 (1,8 g, 2,6 mmol) y DCM (50 mL), y posteriormente piperidina (1,6 mL, 16,2 mmol). El medio de reacción se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, se lavó con HCl 1N, después con NaHCÜ3 sat., salmuera sat., se secó sobre MgSO⁴, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 2 g de producto bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 130 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,48 g de compuesto AD1 como un aceite amarillo pálido (cuant.).

LCMS (A3): ES m/z = 471 [M+H]+; RT = 2,65 min.

Síntesis de AD2: clorhidrato de (2E,5S,6R,7E)-te/r-butil 5-(((S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoil)oxi)-8-(4-(hidroximetil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

Compuesto 17: (2E,5S,6R,7E)-terc-butil 5-(((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4,4-dimetilpentanoil)oxi)-8-(4-formilfenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, en un matraz de fondo redondo a una disolución de compuesto A (1,633 g, 4,94 mmol) en DCM (60 mL) se agregaron L-Fmoc-te/"c-Leu-OH (1,82 g, 4,94 mmol), DIEA (2,57 mL, 14,83 mmol), MNBA (1,70 g, 4,94 mmol) y DMAP (241,51 mg, 1,98 mmol). Después de agitar durante 2 h a RT, el medio de reacción se diluyó con H²O (50 mL) y se extrajo dos veces con DCM. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con ácido cítrico (2 x 50 mL), NaHCO3 sat. (50 mL) y salmuera sat. (50 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 3,24 g de compuesto 17 bruto que se usó directamente en la siguiente reducción (96 %).

Compuesto 18: (2E,5S,6R,7E)-terc-butil 5-(((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4,4-dimetilpentanoil)oxi)-8-(4-(hidroximetil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, en un matraz de fondo redondo a una disolución de compuesto 17 (3,24 g, 4,77 mmol) en MeTHF (60 mL), se agregó trimetoxiborohidruro de sodio (670,56 mg, 5,24 mmol) a 0 °C. Después de agitar durante 1 h a RT, se agregó trimetoxiborohidruro de sodio adicional (304 mg, 2,38 mmol) y se agitó durante 2 h. Después el medio de reacción se enfrió a 0 °C, se diluyó con acetona (18 mL) y NH4Cl sat. (36 mL) y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 2,61 g de compuesto 18 como sólido amorfo incoloro (80 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (s, 9 H); 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,35 a 1,60 (m, 4 H); 1,38 (s, 9 H); 2,37 a 2,58 (m parcialmente enmascarado, 2 H); 4,04 (m, 1 H); 4,16 a 4,33 (m, 3 H); 4,45 (d, J = 5,7 Hz, 2 H); 4,91 (m, 1 H); 5,12 (t, J = 5,7 Hz, 1 H); 5,80 (d, J = 16,0 Hz, 1 H); 6,10 (dd, J = 8,8 y 16,2 Hz, 1 H); 6,39 (d, J = 16,2 Hz, 1 H); 6,69 (m, 1 H); 7,21 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,25 a 7,33 (m, 4 H); 7,40 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,68 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,78 (d, J = 8,3 Hz, 1 H); 7,88 (d, J = 7,9 Hz, 2 H). LCMS (A1): ES m/z = 608; m/z = 682 [M+H]+; m/z = 726 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,85 min.

Compuesto AD2: clorhidrato de (2E,5S,6R,7E)-te/r-butil 5-(((S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoil)oxi)-8-(4-(hidroximetil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoato

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 18 (2,61 g, 3,83 mmol) en DCM (40 mL) se agregó piperidina (7,60 mL, 76,56 mmol) y el medio de reacción se agitó durante 1 h a RT. Después se concentró y se extrajo con AcOEt. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con HCl 1N, H²O y salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se diluyó con iPr²O (50 mL) y se agitó durante 40 h a RT. El producto bruto se filtró, se lavó con iPr²O y se secó al vacío 3 h a 40 °C para proporcionar 1,706 g de compuesto AD2 como un sólido amorfo incoloro (90 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,88 (s, 9 H); 1,10 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,39 a 1,49 (m, 1 H); 1,42 (s, 9 H); 1,75 (dd, J = 6,1 y 15,1 Hz, 1 H); 2,47 a 2,64 (m parcialmente enmascarado, 2 H); 3,92 (t, J = 5,5 Hz, 1 H); 4,47 (d, J = 5,7 Hz, 2 H); 5,02 (m, 1 H); 5,15 (t, J = 5,7 Hz, 1 H); 5,90 (d, J = 15,9 Hz, 1 H); 6,15 (dd, J = 8,3 y 16,1 Hz, 1 H); 6,44 (d, J = 16,1 Hz, 1 H); 6,77 (td, J = 7,3 y 15,9 Hz, 1 H); 7,26 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,34 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 8,10 (ancho m, 3 H). LCMS (A1): ES m/z = 460 [M+H]+; RT = 0,95 min.

Síntesis de AD3: (2R,3S)-1 -((4-metoxibencil)oxi)-2-metilhex-5-en-3-il(S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato

Compuesto 19: (2R,3S)-1 -((4-metoxibencil)oxi)-2-metilhex-5-en-3-il (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4.4- dimetilpentanoato

A una disolución de alcohol de Sakurai (1,02 g, 4,08 mmol) y ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4.4- dimetilpentanoico (1,5 g, 4,08 mmol) en THF (15 mL) se agregaron cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo (1,02 g, 4,08 mmol), TEA por goteo (1,14 mL, 8,16 mmol) y DMAP (126,0 mg, 1,02 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 5 h, después se enfrió mediante el uso de un baño de hielo antes de la adición de HCl 1N (60 mL) mientras se mantuvo la temperatura por debajo de 10 °C. El medio resultante se agitó a RT durante 15 min y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO3 sat. (15 mL), salmuera sat. (3 x 15 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante tres cromatografías rápidas sucesivas sobre gel de sílice (150 g, gradiente de elución heptano/EtOAc; 150 g y 20 g, gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 1,78 g de compuesto 19 como un aceite incoloro (72 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 0,89 (s, 9H); 1,51 (dd, J = 2,8 y 14,3 Hz, 1H); 1,61 (dd, J = 9,0 y 14,3 Hz, 1H); 1,95 (m, 1H); 2,21 (m, 1 H); 2,31 (m, 1 H); 3,20 (dd, J = 6,5 y 9,6 Hz, 1H); 3,35 (m, 1 H); 3,73 (s, 3H); 4,04 (m, 1H); 4,18 a 4,34 (m, 5H); 4,83 (m, 1H); 5,00 (dq, J = 2,1 y 10,3 Hz, 1H); 5,05 (dq, J = 2,1 y 7,3 Hz, 1H); 5,70 (m, 1H); 6,87 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,17 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,30 (m, 2H); 7,41 (t, J = 7,8 Hz, 2H); 7,70 (d, J = 7,8 Hz, 2H); 7,75 (d, J = 8,3 Hz, 1 H); 7,90 (d, J = 7,8 Hz, 2H). LCMS (A5): ES m/z = 600 [M+H]+; m/z = 617 [M+H+NH³]+; m/z = 644 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,86 min.

Compuesto AD3: (2R,3S)-1 -((4-metoxibencil)oxi)-2-metilhex-5-en-3-il (S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato

A una disolución de compuesto 19 (1,78 g, 2,98 mmol) en DCM (63 mL) se agregó por goteo piperidina (1,77 mL, 17,9 mmol). El medio de reacción se agitó a R.T. durante 4 h, se diluyó con DCM (150 mL), se lavó con HCl 1N (2 x 20 mL), NaHCO3 sat. (20 mL), salmuera sat. (3 x 20 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 50 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/EtOAc) para proporcionar 644 mg de compuesto AD3 como un aceite incoloro (57 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,88 (s, 9H); 0,89 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,21 (dd, J = 6. 9 y 13,9 Hz, 1H); 1,56 (dd, J = 5,0 y 13,9 Hz, 1H); 1,66 (ancho s, 2H); 2,00 (m, 1H); 2,24 (m, 1 H); 2,33 (m, 1 H); 3,26 (m, 2H); 3,38 (dd, J = 5,5 y 9,4Hz, 1H); 3,74 (s, 3H); 4,36 (s, 2H); 4,84 (m, 1H); 5,00 a 5,10 (m, 2H); 5,72 (m, 1H); 6,89 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 7,22 (d, J = 8,8 Hz, 2H). LCMS (A5): ES m/z = 378 [M+H]+; RT = 0,88 min.

Síntesis de BC1: ácido 3-((R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilpropanoico

Compuesto 20: 3-((R)-2-((íerc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilpropanoato de metilo

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujo el fragmento C1 (981,45 mg, 4,00 mmol) y DCM (50 mL), posteriormente DIEA (1,84 mL, 10,92 mmol), el fragmento B (1,2 g, 3,64 mmol), HOBt (563,40 mg, 4,00 mmol) y EDC (1,45 mL, 8,01 mmol). El medio de reacción se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se diluyó con H²O (30 mL) y se extrajo dos veces con DCM. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 2,5 g de aceite bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 110 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,06 g de compuesto 20 como un merengue blanco (66 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,06 (s, 3 H); 1,07 (s, 3 H); 1,30 (s, 9 H); 2,65 (dd, J = 11,6 y 13,9 Hz, 1 H); 2,82 (dd, J = 4,0 y 13,9 Hz, 1 H); 3,18 (dd, J = 6,1 y 13,4 Hz, 1 H); 3,29 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,60 (s, 3 H); 3,81 (s, 3 H); 4,11 (m, 1 H); 6,90 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,04 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,19 (dd, J = 2,3 y 8,6 Hz, 1 H); 7,33 (ancho s, 1 H); 7,75 (ancho t, J = 6,1 Hz, 1 H).

Compuesto BC1: ácido 3-((R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilpropanoico

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto 20 (1,06 g, 2,39 mmol) y THF (25 mL), posteriormente LiOH (70,18 mg, 2,87 mmol) y H²O (1 mL). El medio de reacción se agitó durante unas pocas horas antes de agregar 70 mg de LiOH y se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, se agregó resina Amberlit hasta pH 4, se filtró, después se lavó con THF y se concentró al vacío para proporcionar 1 g de compuesto BC1 como un sólido blanco (97 %).

Síntesis de BC2: ácido 3-((R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanoico

Compuesto 21: 3-((R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanoato de metilo

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujo el fragmento B (1,02 g, 2,78 mmol) y DCM (25 mL), posteriormente EDC (592 mg, 3,03 mmol) y HOBt (478 mg, 3,03 mmol). El medio de reacción se agitó 15 min, después se agregaron el fragmento C2 (0,5 g, 2,75 mmol) y DIEA (1,7 mL, 9,73 mmol). El medio de reacción se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se concentró al vacío, después se diluyó con AcOEt. La capa orgánica se lavó con salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 1,45 g de aceite bruto que se purificó mediante cromatografía rápida sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 845 mg de compuesto 21 como una espuma blanca (67 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): mezcla diastereoisomérica 50:50; 0,87 (d, J = 6,8 Hz, 1,5 H); 0,97 (d, J = 6.8 Hz, 1,5 H); 1,01 (s, 1,5 H); 1,03 (s, 1,5 H); 1,07 (s, 3 H); 1,31 (s, 9 H); 2,58 a 2,87 (m, 2 H); 3,59 (s, 1,5 H); 3,60 (s, 1,5 H); 3,81 (s, 3 H); 3,99 a 4,20 (m, 2 H); 6,90 (d, J = 9,0 Hz, 0,5 H); 6,97 (d, J = 9,0 Hz, 0,5 H); 7,05 (ancho d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,19 (dd dividido, J = 2,4 y 8,6 Hz, 1 H); 7,32 (d, J = 2,4 Hz, 0,5 H); 7,34 (d, J = 2,4 Hz, 0,5 H); 7,54 (d, J = 10,1 Hz, 0,5 H); 7,62 (d, J = 10,1 Hz, 0,5 H). LCm S (A3): mezcla diastereoisomérica 50:50; ES m/z = 457 [M+H]+; m/z = 479 [M+Na]+; RT = 3,19-3,2 min.

Compuesto 21 estereómeros 1 y 2: 3-((R)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanoato de metilo estereómeros 1 y 2

En argón, en un matraz de fondo redondo a una disolución de fragmento B (1,17 g, 3,55 mmol) en DCM (30 mL) se agregaron EDC (741,75 mg, 3,87 mmol), HOBt (592,57 mg, 3,87 mmol). Después de agitar durante 15 min a RT, se agregaron el fragmento C2 (639 mg, 3,52 mmol) y DIEA (2,17 mL, 12,31 mmol). El medio de reacción se agitó durante 4 h, después se concentró y diluyó con AcOEt (100 mL). Las capas orgánicas se lavaron con H²O (2 x 10 mL) y salmuera sat. (2 x 10 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía rápida sobre 50 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,306 g de mezcla de diastereoisómeros (81 %) que se separaron mediante dos cromatografías rápidas sucesivas, la primera sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 376 mg de compuesto 21 estereómero 1 (23 %), la segunda sobre 70 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 181 mg de compuesto 21 estereómero 1 (11 %), 279 mg de compuesto 21 estereómero 2 (17 %) y 476 mg de mezcla de diasteroisómeros.

Compuesto 21 estereómero 1

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (d, J = 6,8 Hz, 3 H); 1,07 (s, 6 H); 1,31 (s, 9 H); 2,57 (m, 1H); 2,80 (dd, J = 5,2 y 13,8 Hz, 1 H); 3,60 (s, 3 H); 3,81 (s, 3 H); 4,05 (m, 1 H); 4,16 (m, 1 H); 6,99 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,0 y 8,6 Hz, 1 H); 7,34 (d, J=2,0 Hz, 1 H); 7,57 (d, J=10,1 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 381; m/z = 401; m/z = 455 [M-H]-; m/z = 457 [M+H]+; RT = 1,29 min.

Compuesto 21 estereómero 2

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,95 (d, J = 6,8 Hz, 3 H); 1,00 (s, 3 H); 1,03 (s, 3 H); 1,31 (s, 9 H); 2,55 (m, 1H); 2,80 (dd, J = 5,0 y 14,3 Hz, 1 H); 3,59 (s, 3 H); 3,81 (s, 3 H); 4,09 a 4,22 (m, 2 H); 6,92 (d, J = 8,8 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,0 y 8,6 Hz, 1 H); 7,34 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,64 (d, J = 10,1 Hz, 1 H). LCMS (A1): eS m/z = 381; m/z = 401; m/z = 455 [M-H]-; m/z = 457 [M+h ]+; RT = 1,29 min.

Compuesto BC2: ácido 3-((R)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanoico

El compuesto 21 (0,845 g, 1,85 mmol) y MeOH (20 mL) se introdujeron en un matraz de fondo redondo y a continuación 1,8 mL de NaOH 10M. La disolución se agitó y se calentó a 50 °C durante toda la noche. El medio de reacción se evaporó al vacío y después se diluyó con H²O (20 mL) y se neutralizó con HCl 5N. La disolución se extrajo dos veces con AcOEt. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat., se secaron con MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 800 mg de compuesto BC2 como una espuma blanca (97 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): mezcla diastereoisomérica 50:50; 0,91 (d, J = 6,8 Hz, 1,5 H); 0,97 (d, J = 6.8 Hz, 1,5 H); 1,00 (s, 3 H); 1,03 (s, 1,5 H); 1,07 (s, 1,5 H); 1,31 (s, 9 H); 2,57 (m, 1 H); 2,83 (m, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 4,01 a 4,16 (m, 2 H); 6,90 (d, J = 9,0 Hz, 0,5 H); 6,95 (d, J = 9,0 Hz, 0,5 H); 7,03 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,20 (ancho, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,31 (ancho s, 1 H); 7,49 (d, J = 10,1 Hz, 0,5 H); 7,54 (d, J = 10,1 Hz, 0,5 H); 11,94 (ancho m, 1 H). LCMS (A1): mezcla diastereoisomérica 50:50; ES m/z = 387; m/z = 443 [M+H]+; Rt = 1,20-1,21 min.

Compuesto BC2 estereómero 1: ácido 3-((R)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxi fenil)propanamido)-2.2- dimetilbutanoico estereómero 1

El compuesto 21 estereómero 1 (0,325 g, 1,85 mmol) y MeOH (8 mL) se introdujeron en un matraz de fondo redondo y a continuación 0,692 mL de NaOH 10M. La disolución amarilla se agitó y se calentó a 50 °C durante toda la noche. El medio de reacción se evaporó al vacío y después se diluyó con H²O (20 mL) y se extrajo con AcOEt (3 x 5 mL). Las capas ac. se acidificaron con HCl 5N y se extrajeron con AcOEt (3 x 30 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (5 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 303 mg de compuesto BC2 estereómero 1 como una espuma blanca (96 %) usada directamente en la siguiente reacción.

Compuesto BC2 estereómero 2: ácido 3-((R)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxi fenil)propanamido)-2.2- dimetilbutanoico estereómero 2

El compuesto 21 estereómero 2 (1,094 g, 2,39 mmol), THF (5 mL) y H²O (5 mL) se introdujeron en un matraz de fondo redondo y a continuación LiOH (301 mg, 7,18 mmol). La disolución se agitó durante 44 h a RT. La reacción no se había completado, se agregó LiOH (301 mg). La mezcla se agitó durante 48 h, después se agregaron 301 mg de LiOH en THF (10 mL) y H²O (5 mL) y el medio de reacción se agitó 40 h a 60 °C. El medio de reacción se evaporó al vacío. Se agregó ácido cítrico 1M hasta pH 2 y la mezcla se extrajo con AcOEt (2 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H²O, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 1,096 g de compuesto BC2 estereómero 2 como un sólido amorfo blanco (cuant.) usado directamente en la siguiente reacción.

Síntesis de BC3: ácido 2-((R)-1-(2-((te/-c-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)ciclopropil)-2-metilpropanoico de etilo

Compuesto 22: 2-((R)-1-(2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)ciclopropil)-2-metilpropanoato de etilo

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujo el fragmento C3 (1,2 g, 7,01 mmol) y THF (16,5 mL), posteriormente el fragmento B (2,54 g, 7,71 mmol), HOBt (1,77 g, 8,76 mmol), EDC (1,23 g, 8,06 mmol) y DIEA (1,35 mL, 7,71 mmol). El medio de reacción se agitó durante 2 h a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se diluyó con H²O (25 mL) y se extrajo con AcOEt (250 mL). Las capas orgánicas se lavaron con H²O (2 x 25 mL), salmuera sat. (2 x 25 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía rápida, la primera sobre 200 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 2,16 g de compuesto 22 como una espuma incolora (64 %) and 343 mg de mezcla que contenía el compuesto esperado que se purificó adicionalmente sobre 30 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 160 mg de compuesto 22 como una espuma incolora (4,7 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,62 (m, 1 H); 0,74 a 0,99 (m, 3 H); 1,03 (s, 3 H); 1,10 (s, 3 H); 1,24 (t, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,42 (s, 9 H); 2,90 (m, 2 H); 3,88 (s, 3 H); 4,08 (m, 1 H); 4,10 (c, J = 7,2 Hz, 2 H); 4,96 (m, 1 H); 6,33 (ancho s, 1 H); 6,85 (d, J = 8,5 Hz, 1 H); 7,03 (dd, J = 2,4 y 8,5 Hz, 1 H); 7,17 (d, J = 2,4 Hz, 1 H).

Compuesto BC3: ácido 2-((R)-1 -(2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)ciclopropil)-2-metilpropanoico

El compuesto 22 (2,09 g, 4,33 mmol), THF (10 mL) y H²O (8 mL) se introdujeron en un matraz de fondo redondo y a continuación LiOH (726,33 mg, 17,31 mmol). La disolución se agitó y se calentó a 65 °C. Después de 16 h, la reacción no se había completado, se agregaron 726,33 mg de LiOH en 10 mL de H²O. La mezcla se agitó durante 48 h a 65 °C. Después del enfriamiento, el medio de reacción se diluyó con H²O (20 mL) y se extrajo con AcOEt (3 x 40 mL). Las capas orgánicas se lavaron con H²O (2 x 10 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 1,29 g de mezcla éster/ácido. La capa ac. se acidificó con HCl 5N hasta pH 3, después se extrajo con AcOEt (3 x 50 mL). Las capas orgánicas se lavaron con H²O (2 x 10 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 787 mg de compuesto BC3 como una espuma beis (40 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,50 a 0,90 (m, 4 H); 1,03 (s, 6 H); 1,30 (s, 9 H); 2,60 (dd, J = 10,5 y 14,1 Hz, 1 H); 2,78 (dd, J = 5,0 y 14,1 Hz, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 3,97 (m, 1 H); 6,80 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 8,5 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,0 y 8,5 Hz, 1 H); 7,31 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,86 (s, 1 H); 12,11 (ancho m, 1 H).

Síntesis de BC4: ácido (S)-3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2,2-dimetilbutanoico

Compuesto 23: (S)-3-((R)-2-((íe/'c-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanoato de metilo

A una disolución de fragmento B (2 g, 6,06 mmol) en DCM (60 mL) se agregaron EDC (1,13 mL, 7,06 mmol) y HOBt (948 mg, 6,67 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 15 min, después se agregaron (S)-3-amino-2,2-dimeilbutanoato de metilo (881 mg, 6,06 mmol) y DIEA (1,53 mL, 9,10 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 4 h, se concentró al vacío y se diluyó con EtOAc (100 mL) y H²O (20 mL). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (20 mL); las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (2 x 20 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 150 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/EtOAc) para proporcionar 2,21 g de compuesto 23 como una laca incolora (79 %). 1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,88 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,08 (s, 6H); 1,32 (s, 9H); 2,67 (dd, J = 9,9 y 13,6 Hz, 1H); 2,82 (dd, J = 5,2 y 13,6 Hz, 1 H); 3,62 (s, 3H); 3,83 (s, 3H); 4,06 (m, 1H); 4,77 (m, 1 H) 6,97 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,4 y 8,6 Hz, 1H); 7,33 (d, J = 2,4 Hz, 1 H); 7,55 (d, J = 9,8 Hz, 1H).

Compuesto 24: (S)-3-((R)-2-amino-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2,2-dimetilbutanoato 2,2,2-trifluoroacetato de metilo

A una disolución de compuesto 23 (2,2 g, 4,81 mmol) en DCM (25 mL) se agregó TFA (3,6 mL, 48,1 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche, se concentró al vacío y se coevaporó en presencia de tolueno para proporcionar 2,0 g de compuesto 24 como una mezcla de diastereoisómeros (88 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,04 (s, 3H); 1,10 (s, 3H); 2,95 (d, J = 7,0 Hz, 2H); 3,62 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 4,00 (m, 1H); 4,15 (m, 1H); 7,10 a 7,30 (m, 3H); 8,00 (d, J = 9,5 Hz, 1H); 8,22 (ancho s, 3H).

Compuesto 25: (S)-3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2,2-dimetilbutanoato de metilo A una disolución de compuesto 24 (2,0 g, 4,25 mmol) en DCM (20 mL) se agregó cloruro de acriloilo (536 pL, 6,37 mmol) y DIEA (2,5 mL, 12,74 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 2 h, después se diluyó con H²O (20 mL). La fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 20 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (2 x 20 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/EtOAc) para proporcionar 850 mg de compuesto 25 como una mezcla de diastereoisómeros 85:15 (68 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,03 (s, 3H); 1,04 (s, 3H); 2,72 (dd, J = 9,7 y 13,9 Hz, 1 H); 2,86 (dd, J = 5,8 y 13,9 Hz, 1 H); 3,58 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,15 (m, 1H); 4,56 (m, 1 H); 5,56 (dd, J = 2,3 y 10,2 Hz, 1H); 6,03 (dd, J = 2,3 y 17,2 Hz, 1H); 6,28 (dd, J = 10,2 y 17,2 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 7,17 (dd, J = 2,2 y 8,5 Hz, 1 H); 7,31 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,72 (d, J = 9,8 Hz, 1 H); 8,36 (d, J = 8,6 Hz, 1H).

Compuesto BC4: ácido (S)-3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2,2-dimetilbutanoico

A una disolución de tBuOK (1,11 g, 9,86 mmol) en THF (4 mL) enfriada a 0 °C se agregaron H²O (47 gL) y compuesto 25 (450 mg, 1,10 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 3 h, después se acidificó con HCl 1N (5 mL). La fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 20 mL); las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (30 mL), salmuera sat. (20 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío. Los dos diastereoisómeros se separaron mediante cromatografía de fluido supercrítico en una columna Chiralpak AS 10 gm (elución isocrática a 85/15 CO²/[MeOH TEA al 0,1 %] para proporcionar 385 mg de compuesto BC4 como un sólido amorfo (89 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,88 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 0,99 (s, 3H); 1,00 (s, 3H); 2,71 (dd, J = 9,4 y 13,7 Hz, 1H); 2,88 (dd, J = 5,3 y 13,7 Hz, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,10 (m, 1H); 4,54 (m, 1H); 5,55 (dd, J = 2,3 y 10,2 Hz, 1H); 6,01 (dd, J = 2,3 y 17,1 Hz, 1H); 6,28 (dd, J = 10,2 y 17,1 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,17 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1H); 7,32 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 7,80 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,39 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 12,00 (ancho s, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 395 [M-H]-; m/z = 397 [M+H]+; RT = 0,92 min.

Síntesis de BC5: ácido (S)-3-((R)-2-((fe/'c-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanoico

El Compuesto BC5 se preparó a partir de (3S)-3-amino-2,2-dimetilbutanoato de metilo (MFCD09256689) y siguiendo la síntesis general del componente básico BC representada en el Esquema 32 y descrita para los compuestos BC1 y BC2.

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,89 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,02 (s, 3H); 1,04 (s, 3H); 1,30 (s, 9H); 2,68 (dd, J = 13,6 y 10,2 Hz, 1H); 2,82 (dd, J = 5,2 y 13,6 Hz, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,05 (m, 1H); 4,12 (m, 1H); 7,00 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1 H); 7,32 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,52 (d, J = 9,9 Hz, 1 H); 12,35 (ancho s, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 441 [M-H]-; m/z = 443 [M+H]+; m/z = 883 [2M-H]-; RT = 1,16 min.

Síntesis de BC6: ácido 3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2 (hidroximetil)-2-metilpropanoico

Compuesto 26: 3-((R)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato de metilo

A una disolución de fragmento C4 (1,059 g, 5,77 mmol) en THF (60 mL) se agregaron DIEA (2,06 mL, 11,76 mmol), fragmento B (1,90 g, 5,77 mmol), HOBt (935 mg, 6,92 mmol) y EDC (1,23 mL, 6,92 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 48 h, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 200 g de gel de sílice (elución isocrática heptano/EtOAc) para proporcionar 1,05 g de compuesto 26 como un aceite incoloro (39 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,98 (s, 3H); 1,30 (s, 9H); 2,63 (m, 1H); 2,83 (m, 1H); 3,18 a 3,48 (m, 4H); 3,60 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,10 (m, 1H); 4,81 (m, 1H); 6,98 (d, J = 8,9 Hz, 1H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,1 y 8,7 Hz, 1H); 7,35 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 7,83 (m, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 457 [M-H]-; m/z = 459 [M+H]+; m/z = 503 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,1 min.

Compuesto 27: clorhidrato de 3-((R)-2-amino-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato de metilo

El Compuesto 26 (1,05 g, 2,29 mmol) se trató con HCl 4 M en dioxano (16 mL, 64 mmol) durante 1 h a RT. El medio de reacción se concentró al vacío y se coevaporó dos veces en presencia de tolueno. El producto bruto se trituró con iPr²O (10 mL), se filtró y se lavó dos veces con iPr²O (5 mL). A continuación, la torta se disolvió en DCM, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 809 mg de compuesto 27 como una espuma blanca (90 %) que se usó sin purificación adicional.

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,92 (s, 1,5H); 0,97 (s, 1,5H); 2,88 (m, 1H); 3,00 (m, 1H); 3,19 a 3,47 (m, 4H); 3,60 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 4,05 (m, 1H); 4,89 (m, 1H); 7,11 (d dividido, J = 8,6 Hz, 1H); 7,19 (dd dividido, J = 2,0 y 8,6 Hz, 1H); 7,38 (d dividido, J = 2,0 Hz, 1H); 8,15 (ancho s, ³H); 8,39 (m, 1H).

Compuesto 28: 3-((R)-2-amino-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2-metil-2-(((trietilsilil)oxi)metil)propanoato de metilo

A una disolución de compuesto 27 (809 mg, 2,05 mmol) en DCM (4 mL) enfriada con un baño de hielo se agregaron TEA (1,43 mL, 10,23 mmol) y clorotrietilsilano (1,37 mL, 8,19 mmol) mientras se mantenía la temperatura por debajo de 4 °C. Se continuó con la agitación a 4 °C durante 10 min, después el medio de reacción se agitó a RT durante 20 h. Se agregaron salmuera sat. (20 mL) y DCM al medio que se agitó durante 10 min. La fase orgánica se lavó con salmuera sat. (3 x 10 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 70 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 706 mg de compuesto 28 como un aceite amarillo pálido (73 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,52 (c, J = 8,0 Hz, 6H); 0,89 (t, J = 8,0 Hz, 9H); 0,98 (s, 3H); 1,70 (ancho s, 2H); 2,54 (m, 1H); 2,82 (m, 1H); 3,18 a 3,45 (m, 3H); 3,58 (m, 2H); 3,60 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,14 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1H); 7,28 (d dividido, J = 2,3 Hz, 1H); 7,78 (m, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 471 [M-H]-; m/z = 473 [M+H]+; m/z = 517 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,97 min.

Compuesto 29: 3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2-metil-2-(((trietilsilil)oxi)metil)propanoato de metilo

A una disolución de compuesto 28 (704 mg, 1,49 mmol) en DCM (19 mL) enfriada con un baño de hielo/acetona se agregaron DIEA (780 pL, 4,46 mmol) y cloruro de acriloilo por goteo (181 pL, 2,23 mmol). El medio de reacción se agitó a 0-5 °C durante 1 h, después se agregó EtOAc (38 mL) y el medio se lavó con HCl 1N (5 mL), NaHCO3 sat. (5 mL), salmuera sat. (3 x 15 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 30 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 742 mg de compuesto 29 como un aceite incoloro (94 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,52 (c dividido, J = 8,0 Hz, 6H); 0,89 (t dividido, J = 8,0 Hz, 9H); 0,99 (s, 1,5H); 1,01 (s, 1,5H); 2,69 (m, 1H); 2,87 (m, 1H); 3,20 (m, 1H); 3,28 (m, 1H); 3,50 (dd, J = 3,1 y 9,9 Hz, 1H); 3,58 (s, 3H); 3,68 (d, J = 9,9 Hz, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,59 (m, 1H); 5,55 (d, J = 10,3 Hz, 1H); 6,00 (d, J = 17,3 Hz, 1H); 6,25 (dd dividido, J = 10,3 y 17,3 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 7,18 (dd dividido, J = 2,0 y 8,5 Hz, 1H); 7,31 (d dividido, J = 2,0 Hz, 1H); 7,96 (m, 1H); 8,39 (d, J = 8,9 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 525 [M-H]-; m/z = 527 [M+H]+; m/z = 571 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,54 min.

Compuesto BC6: ácido 3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoico

A una suspensión de tBuOK (1,42 g, 12,65 mmol) en THF (7 mL) enfriada con un baño de hielo/acetona se agregó H²O (50 pL), el medio se agitó durante 10 min antes de la adición de una disolución de compuesto 29 (741 mg, 1,41 mmol) in THF (7 mL). Se continuó con la agitación a 0 °C durante 10 min, después a RT durante 1 h. El medio de reacción se enfrió con un baño de hielo antes de la adición de HCl 1N (16,9 mL). Después de 15 min de agitación, el medio de reacción se extrajo con DCM (3 x 25 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (2 x 15 mL), H²O (15 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 656 mg de compuesto BC6 como una espuma amarilla (cuant.).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,91 (s, 3H); 2,69 (m, 1H); 2,90 (dd, J = 4,8 y 13,6 Hz, 1H); 3,18 a 3,42 (m, 4H); 3,80 (s, 3H); 4,59 (m, 1H); 4,73 (ancho, 1H); 5,55 (d, J = 2,3 y 10,3 Hz, 1H); 6,00 (dd, J = 2,3 y 17,2 Hz, 1H); 6,24 (dd, J = 10,3 y 17,2 Hz, 1H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,19 (dd, J = 2,0 y 8,7 Hz, 1H); 7,35 (d, J = 2,0 Hz, 1H); 8,00 (m, 1H); 8,39 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 12,30 (ancho s, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 397 [M-H]-; m/z = 399 [M+H]+; RT = 0,77 min.

Síntesis de los Ejemplos 1 a 3: amina bencílica de aza-C52, éster de NHS de amina glutaril-Val-Ala-aza-C52 bencílica y el ADC correspondiente

Compuesto 30: (6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(azidometil)fenil)-8-(terc-butoxi)-3-metil-8-oxoocta-1,6-dien-4-il 6-(3-cloro-4-metoxibencil)-13-isobutil-2,2,10,10-tetrametil-4,7,11-trioxo-3-oxa-5,8,12-triazatetradecan-14-oato

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto BC1 (899,55 mg, 2,10 mmol) en DMF (25 mL), HATU (861 mg, 2,20 mmol) y HOAt (302 mg, 2,20 mmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a Rt . Después de eso, se agregaron el compuesto AD1 (940 mg, 2 mmol) y DIEA (1,05 mL, 5,99 mmol). El medio de reacción se agitó durante 4 h a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se diluyó con H²O (50 mL) y se extrajo con AcOEt (2 x 40 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera sat. (25 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 80 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,011 g de compuesto 30 como un semisólido amarillo (57 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,76 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,78 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,07 (s, 6 H); 1,39 (s, 9 H); 1,37 a 1,63 (m, 3 H); 1,41 (s, 9 H); 2,36 a 2,60 (m parcialmente enmascarado, 3 H); 2,64 (dd, J = 9,5 y 14,1 Hz, 1 H); 2,86 (dd, J = 5,6 y 14,1 Hz, 1 H); 3,18 (dd, J = 6,1 y 13,5 Hz, 1 H); 3,25 (dd, J = 6,9 y 13,5 Hz, 1 H); 3,79 (s, 3 H); 4,09 (m, 1 H); 4,26 (m, 1 H); 4,40 (s, 2 H); 4,92 (m, 1 H); 5,81 (d, J = 15,9 Hz, 1 H); 6.17 (dd, J = 8,4 y 16,1 Hz, 1 H); 6,44 (d, J = 15,9 Hz, 1 H); 6,70 (m, 1 H); 6,94 (d, J = 8,9 Hz, 1 H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,3 y 8,9 Hz, 1 H); 7,31 (m, 3 H); 7,42 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,59 (t, J = 6,3 Hz, 1 H); 7,77 (d, J = 7,9 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 879 [M-H]-; m/z = 881 [M+H]+; m/z = 925 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,89 min.

Compuesto 31: (3S,10R, 16S,E)-16-((R, E)-4-(4-(azidometil)fenil)but-3-en-2-il)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6-dimetil-1-oxa-4,8,11-triazacidohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Compuesto 31 se preparó en dos etapas.

Etapa 1: en un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto 30 (1,011 g, 1,15 mmol) en DCM (10 mL). Después del enfriamiento hasta 0 °C, se agregaron TFA (1,72 mL, 22,94 mmol) y 100 pL de H²O. El medio de reacción se agitó durante 72 h a RT. Después de que se completó, se agregó tolueno al medio y se concentró al vacío para proporcionar 900 mg de intermediario amino/ácido (cuant.).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d⁶): 0,76 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,78 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,07 (s, 3 H); 1,08 (s, 3 H); 1,38 a 1,62 (m, 3 H); 2,35 a 2,58 (m parcialmente enmascarado, 3 H); 2,79 (dd, J = 11.0 y 13,8 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 4,1 y 13,8 Hz, 1 H); 3,16 (dd, J = 5,9 y 13,5 Hz, 1 H); 3,28 a 3,39 (m enmascarado, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 4,03 (m, 1 H); 4,26 (m, 1 H); 4,40 (s, 2 H); 4,92 (m, 1 H); 5,82 (d, J = 16,1 Hz, 1 H); 6,16 (dd, J = ^{8 , 8}y 16,4 Hz, 1 H); 6,42 (d, J = 16,4 Hz, 1 H); 6,73 (m, 1 H); 7,09 (d, J = ^{8 , 6}Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,0 y ^{8 , 6}Hz, 1 H); 7.32 (d, J = ^{8 , 6}Hz, 2 H); 7,37 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,41 (d, J = ^{8 , 6}Hz, 2 H); 7,84 (d, J = 7,9 Hz, 1 H); 8,01 (ancho s, 3 H); 8,10 (t, J = 6,4 Hz, 1 H); 12,2 (ancho s, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 723 [M-H]-; m/z = 725 [M+H]+; RT = 1,09 min.

Etapa 2: en un matraz de fondo redondo, a una disolución del intermediario amino/ácido (840 mg, 1,16 mmol) en 200 mL de CH³CN se agregaron DIEA (1,95 mL, 11,58 mmol), HOAt (159,23 mg, 1,16 mmol) y HATU (499,40 mg, 1,27 mmol). El medio de reacción se agitó durante 3 h a RT. Después de la concentración al vacío, el producto bruto se diluyó con AcOEt (200 mL), se neutralizó con ácido cítrico 0,5 M (12 mL) y HCl 1N ^{( 6}mL). La capa orgánica se separó, se lavó con NaHSO³sat., NaHCO³sat., salmuera sat., se secó sobre MgSO⁴, se filtró, se concentró y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 40 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 558 mg de compuesto 31 como un sólido blanco ^{( 6 8}%).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d⁶): 0,60 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,61 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,07 (s, 3 H); 1,09 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,15 (m, 1 H); 1,33 a 1,48 (m, 2 H); 2,24 (m, 1 H); 2,53 a 2,70 (m, 2 H); 2,88 (ancho d, J = 13,6 Hz, 1 H); 3,01 (dd, J = 3,5 y 14,5 Hz, 1 H); 3,23 a 3,32 (m enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 4,18 (m, 1 H); 4,35 (m, 1 H); 4,40 (s, 2 H); 4,95 (m, 1 H); 5,86 (dd, J = 1,7 y 15,8 Hz, 1 H); 6,13 (dd, J = ^{8 , 8}y 16,1 Hz, 1 H); 6,40 (m, 1 H); 6,47 (d, J = 16,1 Hz, 1 H); 7,04 (d, J = ^{8 , 6}Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,0 y ^{8 , 6}Hz, 1 H); 7,29 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7.32 (d, J = ^{8 , 6}Hz, 2 H); 7,41 (ancho d, J = ^{8 , 6}Hz, 3 H); 7,89 (d, J = 8,9 Hz, 1 H); 8,1 (d, J = 8,2 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 705 [M-H]-; m/z = 707 [M+H]+; RT = 1,58 min.

Compuesto 32: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(azidometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6-dimetil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 31 (410 mg, 0,579 mmol) en DCM (50 mL), se agregó, a 0 °C, m-CPBA (259 mg, 1,16 mmol). Después de agitar durante 16 h a RT, se agregó m-CPBA (130 mg) dos veces en 24 h. Después de que se completó la reacción, la mezcla bruta se agitó durante ¹h con NaHCO³sat. (15 mL) y Na²S²O³sat. (15 mL), después se extrajo con DCM (3 x 15 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera sat. (15 mL), se secaron sobre MgSO⁴, se filtraron y se concentraron para proporcionar 440 mg de una mezcla de epóxidos alfa y beta como un semisólido amarillo. Los epóxidos alfa y beta se separaron mediante cromatografía líquida quiral que se llevó a cabo en una columna 76 x 350 mm cargada con 1,1 kg de 10 pm Chiralpak AD (amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato recubierta sobre un soporte de gel de sílice, Chiral Technologies Europe) mediante el uso de elución isocrática con 80:20 heptano/EtOH. Después de la concentración, se obtuvieron 185 mg de compuesto 32 como un sólido blanco (44 %) y se obtuvieron 118 mg de epóxido alfa como un sólido blanco (28 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d⁶): 0,72 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,74 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,96 (s, 3 H); 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,08 (s, 3 H); 1,11 (m, 1 H); 1,40 a 1,55 (m, 2 H); 1,79 (m, 1 H); 2,26 (m, 1 H); 2,64 (m, 2 H); 2,85 (ancho d, J = 13,2 Hz, 1 H); 3,00 (m, 2 H); 3,25 (dd, J = 10,2 y 13,2 Hz, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,90 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 4.17 (m, 1 H); 4,35 (m, 1 H); 4,46 (s, 2 H); 5,12 (m, 1 H); 5,80 (dd, J = 1,7 y 16,0 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,8, 11,6 y 16.0 Hz, 1 H); 7,04 (d, J = ^{8 , 6}Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,0 y ^{8 , 6}Hz, 1 H); 7,29 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,31 a 7,40 (m, 5 H); 7,94 (d, J = 9,1 Hz, 1 H); 8,40 (d, J = 8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 723 [M+H]+; RT = 1,48 min.

Ejemplo 1: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6-dimetil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 32 (185 mg, 255,79 pmol) en DCM ^{( 6}mL), MeOH ^{( 6}mL) y H²O (0,8 mL), se agregó TCEP (81,47 mg, ^{2 8 1 , 3 7}pmol). La disolución se agitó durante 16 h a RT. Después de que se completó la reacción, la mezcla bruta se diluyó con NaHCO³sat. (15 mL) y se extrajo con DCM (2 x 30 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante dos cromatografías rápidas sucesivas sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 90 mg de ejemplo 1 como un sólido blanco (51 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,72 (d, J = 6,6 Hz, 3 H); 0,75 (d, J = 6,6 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,1 Hz, 3 H); 1,07 (s, 3 H); 1,14 (m, 1 H); 1,42 a 1,57 (m, 2 H); 1,77 (m, 1 H); 1,92 (ancho m, 2 H); 2,26 (m, 1 H); 2,64 (m, 2 H); 2,86 (ancho d, J = 13,0 Hz, 1 H); 2,94 (dd, J = 2,0 y 8,0 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,6 y 14,4 Hz, 1 H); 3,27 (dd, J = 10,2 y 13,0 Hz, 1 H); 3,70 (s, 2 H); 3,80 (s, 3 H); 3,84 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 4,18 (m, 1 H); 4,34 (m, 1 H); 5,11 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,7 y 15,6 Hz, 1 H); 6,38 (ddd, J = 4,1, 11,6 y 15,6 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,0 y 8,6 Hz, 1 H); 7,22 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,28 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,31 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,35 (d, J = 10,2 Hz, 1 H); 7,91 (d, J = 9,0 Hz, 1 H); 8,38 (d, J = 8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 695 [M-H]-; m/z = 697 [M+H]+; RT = 0,83 min.

Compuesto 33: (S)-2-amino-N-((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6.6- dimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida

En argón, en un matraz de fondo redondo a una disolución de ejemplo 1 (90 mg, 129,01 pmol) en DCM (20 mL) se agregaron ácido (S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3-metilbutan-amido)propanoico o FmocValAla (número CAS [150114-97-9], 79,47 mg, 193,61 pmol), EDC (34,27 pL, 193,61 pmol) y HOBt (20,93 mg, 154,9 pmol). El medio de reacción se agitó durante toda la noche a RT. Después de este tiempo, se agregó piperidina (129 pL, 1,29 mmol) y se agitó durante 2 h. El disolvente se retiró y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía rápida sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 50 mg de compuesto 33 (45 %) como un sólido blanco.

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,75 (m, 9 H); 0,88 (d, J = 7,1 Hz, 3 H); 0,96 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,1 Hz, 3 H); 1,08 (s, 3 H); 1,18 (m, 1 H); 1,23 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,42 a 1,57 (m, 2 H); 1,70 (ancho m, 2 H); 1,79 (m, 1 H); 1,92 (m, 1 H); 2,26 (m, 1 H); 2,63 (m, 2 H); 2,86 (ancho d, J = 13,0 Hz, 1 H); 2,99 (m, 3 H); 3,22 a 3,33 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 h ); 3,86 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 4,18 (m, 1 H); 4,28 (d, J = 6,3 Hz, 2 H); 4,33 (m, 2 H); 5,11 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,7 y 15,6 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 4,1, 11,6 y 15,6 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,0 y 8,6 Hz, 1 H); 7,24 (s, 4 H); 7,28 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,37 (d, J = 10,2 Hz, 1 H); 7,92 (d, J = 9.1 Hz, 1 H); 8,07 (ancho d, J = 8,3 Hz, 1 H); 8,38 (d, J = 8,1 Hz, 1 H); 8,42 (t, J = 6,3 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 434 [M+2H]2+; m/z = 865 [M-H]-; m/z = 867 [M+H]+; m/z = 911 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,88 min.

Compuesto 34: ácido 5-(((S)-1 -(((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6.6- dimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoico

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 33 (54 mg, 57,64 pmol) en DMF (5 mL) se agregó anhídrido glutárico (8 mg, 69,17 pmol). El medio de reacción se agitó durante 3,5 h a RT. Después de este tiempo, el disolvente se retiró y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía rápida sobre 1,8 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 51 mg de compuesto 34 como un sólido blanco (90 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,73 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,76 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,81 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,05 (s, 3 H); 1,15 (m, 1 H); 1,22 (d, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,43 a 1,52 (m, 2 H); 1,70 (m, 2 H); 1,77 (m, 1 H); 1,97 (m, 1 H); 2,17 (m, 2 H); 2,24 (m, 1 H); 2,55 a 2,68 (m, 2 H); 2,85 (ancho d, J = 12,7 Hz, 1 H); 2,96 (dd, J = 1,8 y 7,7 Hz, 1 H); 2,99 (dd, J = 3,0 y 14,6 Hz, 1 H); 3,23 a 3,40 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,85 (d, J = 1,8 Hz, 1 H); 4,22 a 4,38 (m, 4 H); 5,11 (m, 1 H); 5,79 (d, J = 14,9 Hz, 1 H); 6,37 (ddd, J = 4,1, 11,3 y 14,9 Hz, 1 H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,15 (dd, J = 2,0 y 8,7 Hz, 1 H); 7,23 (ancho s, 4 H); 7,28 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 7,37 (ancho d, J = 10,7 Hz, 1 H); 7,87 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,93 (d, J = 9.2 Hz, 1 H); 8,06 (ancho m, 1 H); 8,37 (ancho m, 1 H); 8,41 (ancho m, 1 H); 12,03 (ancho m, 1 H). lCm S (a 1): ES m/z = 979 [M-H]-; m/z = 981 [M+H]+; RT = 1,17 min.

Ejemplo 2: 2,5-dioxopirrolidin-1-il5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3- isobutil-6,6-dimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoato

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 34 (30 mg, 30,56 pmol) en THF (5 mL) se agregaron DIEA (5,34 pL, 30,56 pmol) y DSC (16,31 mg, 61,13 pmol). El medio de reacción se agitó durante 2 h a RT. Después de este tiempo, el disolvente se retiró y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía rápida sobre 1,3 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 9 mg de ejemplo 2 como un sólido blanco. Un segundo lote que contenía el compuesto esperado, así como también una impureza se diluyó con MeTHF, se lavó dos veces con H²O, salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró para proporcionar 15 mg de ejemplo 2 como un sólido blanco (rendimiento global de 73 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,73 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,77 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,96 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,07 (s, 3 H); 1,15 (m, 1 H); 1,23 (d, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,43 a 1,56 (m, 2 H); 1,78 (m, 1 H); 1,81 (m, 1 H); 1,97 (m, 1 H); 2,20 a 2,33 (m, 3 H); 2,58 a 2,69 (m, 4 H); 2,80 (s, 4 H); 2,85 (ancho d, J = 12,7 Hz, 1 H); 2,98 (dd, J = 2,1 y 7,9 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,2 y 14,7 Hz, 1 H); 3,22 a 3,34 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,85 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 4,15 (m, 2 H); 4,22 a 4,38 (m, 4 H); 5,11 (m, 1 H); 5,79 (d, J = 15,1 Hz, 1 H); 6,38 (ddd, J = 3,9, 11,2 y 15,1 Hz, 1 H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,15 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1 H); 7,22 (ancho s, 4 H); 7,29 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,36 (ancho d, J = 10,3 Hz, 1 H); 7,89 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,92 (d, J = 8,9 Hz, 1 H); 8,04 (d, J = 7,4 Hz, 1 H); 8,32 (t, J = 6,1 Hz, 1 H); 8,39 (d, J = 8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 540; m/z = 1076 [M-H]-; m/z = 1078 [M+H]+; m/z = 1122 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,23 min.

Ejemplo 3: mAb-Ej. 2

El método general descrito anteriormente se usó para la preparación del ejemplo 3. Se hicieron reaccionar 60 mg de hu2H11_R35-74 con 161 ^L de una disolución 9,96 mM de ejemplo 2 en DMA (1,733 mg, 4 eq.) durante 2 h. Después de este tiempo, se agregaron 121 ^L de la disolución del ejemplo 2 (3 eq.) y el medio se agitó durante 2 h. En este momento, se agregaron 121 ^L de la disolución del ejemplo 2 (3 eq.) y se agitó durante 2 h. Después de purificación en Superdex 200 pg en DPBS pH 6,5 NMP al 20 %, concentración sobre Amicon Ultra-15, cambio de tampón en PD-10 en tampón B pH 6,5 NMP al 5 % y filtración en Steriflip, se obtuvieron 39,9 mg del ejemplo 3 como una disolución límpida incolora a una concentración de 2,28 mg/mL con una DAR de 4,6 (HRMS), una pureza monomérica de 99 % y un rendimiento global de 66 %.

SEC-HRMS: espectro para ADC intacto en la Figura 1; m/z = 150346 (D1); m/z = 151307 (D2); m/z = 152274 (D3); m/z = 153240 (D4); m/z = 154200 (D5); m/z = 155165 (D6); m/z = 156133 (D7); m/z = 157095 (D8).

Síntesis de los Ejemplos 4 a 7: amina bencílica de (S)-3-neopentyle-aza-C52, éster de NHS de amina glutaril-Val-Ala-(S)-3-neopentil-aza-C52 bencílica y el ADC correspondiente

Ejemplo 5

Compuesto 35: (6R,13S)-(1 E,3R,4S,6E)-8-(terc-butoxi)-1-(4-(hidroximetil)fenil)-3-metil-8-oxoocta-1,6-dien-4-il 6-(3-cloro-4-metoxibencil)-2,2,10,10-tetrametil-13-neopentil-4,7,11-trioxo-3-oxa-5,8,12-triazatetradecan-14-oato

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de fragmento BC1 (1,32 g, 3,08 mmol) en DCM (60 mL) se agregaron DIEA (1,53 mL, 9,25 mmol), HOAt (503,75 mg, 3,70 mmol) y HATU (1,41 g, 3,70 mmol). La suspensión amarilla se agitó durante 30 min a RT, después se agregó el fragmento AD2 (1,7 g, 3,08 mmol). El medio de reacción se agitó durante 2 h a RT. Después de este tiempo, se agregaron 1,53 mL de DIEA y se agitaron durante 1 h. La mezcla se neutralizó con ácido cítrico 1M (50 mL) y se extrajo con AcOEt (2 x 80 mL). Las capas orgánicas se lavaron con NaHSO4 1M, H²O, se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,475 g de compuesto 35 como un sólido incoloro (57 %).

Compuesto 36: ácido (2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-(3-((R)-2-amino-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilpropanamido)-4,4-dimetilpentanoil)oxi)-8-(4-(hidroximetil)-fenil)-6-metilocta-2,7-dienoico

En un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 35 (1,475 g, 1,69 mmol) en DCM (20 mL) se agregaron TFA (8 mL, 52,27 mmol) y H²O (2 mL). El medio de reacción se agitó durante 5 h a RT. El disolvente se retiró. El residuo se diluyó con H²O (20 mL) y AcOEt (20 mL) y se trató con NaOH 2M (2 mL) durante 2 h a RT. La capa orgánica se separó y la capa ac. se extrajo con AcOEt (2 x 10 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró para proporcionar 1,24 g de un sólido incoloro. El sólido se disolvió en AcOEt (10 mL) y H²O (10 mL) y se trató con NaOH 2M (400 pL) durante 2 h a RT. La capa orgánica se separó, las capas ac. se extrajeron con AcOEt (2 x 10 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 990 mg de compuesto 36 como un sólido blanco (82 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (s, 9 H); 0,99 (s, 3 H); 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,05 (s, 3 H); 1,52 (dd, J = 2,0 y 14,8 Hz, 1 H); 1,69 (dd, J = 9,9 y 14,8 Hz, 1 H); 2,36 a 2,61 (m parcialmente enmascarado, 4 H); 2,84 (dd, J = 5,0 y 13,9 Hz, 1 H); 3,18 (d, J = 7,5 Hz, 2 H); 3,40 (dd, J = 5,1 y 8,1 Hz, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 4,29 (m, 1 H);

4,45 (s, 2 H); 4,90 (m, 1 H); 5,12 (ancho m, 1 H); 5,81 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,10 (dd, J = 8,4 y 15,9 Hz, 1 H); 6,40 (d, J = 15,9 Hz, 1 H); 6,70 (td, J = 7,5 y 15,5 Hz, 1 H); 7,01 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,11 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1 H); 7,25 (m, 3 H); 7,32 (d, J = 8,2 Hz, 2 H); 7,72 (t, J = 6,5 Hz, 1 H); 7,79 (d, J = 7,8 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 712 [M-H]-; m/z = 714 [M+H]+; Rt = 0,94 min.

Compuesto 37: (3S,10R, 16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((R,E)-4-(4-(hidroximetil)-fenil)but-3-en-2-il)-6,6-dimetil-3-neopentil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En argón, en un matraz de fondo redondo, se introdujeron el compuesto 36 (990 mg, 1,39 mmol) y CH³CN (150 mL), se calentaron con un balo de agua a 50 °C hasta que la solubilización completa y se agitaron durante 10 min.

Después de eso, se agregaron DIEA (687,20 pL, 4,16 mmol), HOAt (207,51 mg, 1,52 mmol) y HATU (579,7 mg, 1,52 mmol) y se agitaron durante 30 min a RT. El medio de reacción se neutralizó con ácido cítrico 1M (30 mL). El disolvente se retiró y la capa ac. se extrajo con AcOEt (2 x 40 mL). Las capas orgánicas se lavaron con NaHSO41M, H²O, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El sólido bruto se diluyó con H²O (200 mL) y se agitó durante 1 h. El sólido se filtró, después se diluyó con AcOEt, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró para proporcionar una mezcla de compuesto 37 y HATU. El sólido se agitó con MeTHF (50 mL) y H²O (50 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con H²O (4 x 20 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 10 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 680 mg de compuesto 37 como un sólido incoloro (70 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,68 (s, 9 H); 0,98 (s, 3 H); 1,03 (s, 3 H); 1,09 (d, J = 6,9 Hz, 3 H); 1,19 (ancho d, J = 14,5 Hz, 1 H); 1,58 (dd, J = 10,3 y 14,5 Hz, 1 H); 2,23 (m, 1 H); 2,52 a 2,70 (m, 3 H); 2,86 (ancho d, J = 12,7 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,3 y 14,8 Hz, 1 H); 3,22 a 3,33 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 4,18 (m, 1 H); 4,42 (m, 1 H); 4,46 (d, J = 6,0 Hz, 2 H); 4,91 (m, 1 H); 5,13 (t, J = 6,0 Hz, 1 H); 5,85 (ancho d, J = 15,0 Hz, 1 H); 6,05 (dd, J = 8,4 y 15,9 Hz, 1 H); 6,40 (m, 2 H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1 H); 7,25 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,29 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 7,31 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,42 (d, J = 10,6 Hz, 1 H); 7,94 (d, J = 9,1 Hz, 1 H); 8,41 (d, J = 8,2 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 694 [M-H]-; m/z = 696 [M+H]+; RT = 1,36 min.

Compuesto 38: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-16-((R,E)-4-(4-(((triisopropilsilil)oxi)metil)fenil)but-3-en-2-il)-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En argón, a 0 °C, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 37 (680 mg, 0,976 mmol) en CHCl3 (10 mL), se agregaron 1H-imidazol (305,84 mg, 4,49 mmol) y clorotriisopropilsilano (480,13 pl, 2,25 mmol). El medio de reacción se agitó durante 5 h a RT, después se diluyó con NH4Cl sat. y MTBE (30 mL). La capa orgánica se lavó con NaHSO4 1M, NaHCO3 sat., salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró para proporcionar 970 mg de compuesto 38 como un sólido amorfo anaranjado (cuant.).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,63 (s, 9 H); 0,87 a 1,17 (m, 31 H); 1,53 (dd, J = 10,9 y 14,3 Hz, 1 H);

2,22 (m, 1 H); 2,51 a 2,70 (m, 3 H); 2,86 (ancho d, J = 13,0 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,2 y 14,9 Hz, 1 H); 3,24 a 3,35 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 4,18 (m, 1 H); 4,41 (m, 1 H); 4,76 (s, 2 H); 4,91 (m, 1 H); 5,87 (ancho d, J = 15,4 Hz, 1 H); 6,06 (dd, J = 8,9 y 15,9 Hz, 1 H); 6,40 (m, 2 H); 7,03 (d, J = 8,5 Hz, 1 H); 7,18 (ancho d, J = 8,5 Hz, 1 H); 7,25 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); 7,28 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); 7,30 (ancho s, 1 H); 7,42 (d, J = 10,5 Hz, 1 H); 7,93 (d, J = 9,2 Hz, 1 H); 8,42 (d, J = 8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 850 [M-H]-; m/z = 852 [M+H]+; m/z = 896 [M-H+HCO²H]-; RT = 2,15 min.

Ejemplo 4: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(hidroximetil)fenil)oxiran-2-il)etil)-6,6-dimetil-3-neopentil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 4 se preparó en 2 etapas.

Etapa 1: en argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 38 (832 mg, 0,976 mmol) en DCM (10 mL) se agregó, en tres veces, m-CPBA (339,15 mg, 1,51 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 50 h a RT, después se diluyó con DCM (10 mL) y se agitó durante 15 min con NaHCO3 sat. (30 mL) y Na2S2O3 (30 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró para proporcionar 1,1 g de una mezcla de epóxidos alfa y beta como una espuma incolora (cuant.).

Etapa 2: la mezcla de epóxidos alfa y beta se diluyó en THF (30 mL) y se agregó TBAF 1M (952,32 pL). Después de agitar durante 2 h, se agregaron 952 pL de TBAF. Después de agitar durante 1 h, la mezcla se diluyó con H²O (50 mL) y se extrajo con AcOEt (3 x 50 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar 770 mg de una mezcla de epóxidos alfa y beta como un sólido amarillo (cuant.). Los epóxidos alfa y beta se separaron mediante cromatografía líquida quiral que se llevó a cabo en una columna 76 x 350 mm cargada con 1,1 kg de 10 pm Chiralpak AD (amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato recubierta sobre un soporte de gel de sílice, Chiral Technologies Europe) mediante el uso de elución isocrática con 75:25 heptano/EtOH. Después de la concentración, se obtuvieron 190 mg de ejemplo 4 como un sólido blanco (31 %) y se obtuvieron 125 mg de epóxido alfa como un sólido blanco (20 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,81 (s, 9 H); 0,98 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,05 (s, 3 H); 1,26 (m, 1 H); 1,71 (dd, J = 10,4 y 14,5 Hz, 1 H); 1,82 (m, 1 H); 2,26 (m, 1 H); 2,52 (m, 2 H); 2,84 (d, J = 12,8 Hz, 1 H); 2,92 (dd, J = 2,1 y 7,8 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,1 y 14,5 Hz, 1 H); 3,24 a 3,36 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 3,90 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 4,17 (ddd, J = 3,4, 8,0 y 11,7 Hz, 1 H); 4,42 (m, 1 H); 4,50 (d, J = 6,0 Hz, 2 H); 5,10 (m, 1 H); 5,20 (t, J = 6,0 Hz, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,8 y 15,4 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,8, 11,5 y 15,4 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8.6 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,1 y 8,6 Hz, 1 H); 7,26 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); 7,29 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 7,32 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); 7,41 (d, J = 10,3 Hz, 1 H); 8,02 (d, J = 9,2 Hz, 1 H); 8,38 (d, J = 8,2 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m/z = 710 [M-H]-; m/z = 712 [M+H]+; RT = 1,28 min.

Compuesto 39: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(azidometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8, 11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de ejemplo 4 (100 mg, 140 pmol) en THF (5 mL) se agregaron DPPA (156,82 pL, 701,98 pmol) y DBU (110,22 pl, 701,98 pmol). La disolución se agitó durante 6 h a RT, después se diluyó con H²O y se extrajo con AcOEt (3 x 30 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró y se purificó sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 100 mg de compuesto 39 como un sólido blanco (40 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (s, 9 H); 0,97 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,04 (s, 3 H); 1,28 (d, J = 14,5 Hz, 1 H); 1,69 (dd, J = 10,7 y 14,5 Hz, 1 H); 1,84 (m, 1 H); 2,28 (m, 1 H); 2,62 (m, 2 H); 2,84 (d, J = 12,8 Hz, 1 H); 2,93 a 3,03 (m, 2 H); 3,22 a 3,34 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,92 (ancho s, 1 H); 4,17 (m, 1 H); 4,40 a 4,49 (m, 3 H); 5,10 (m, 1 H); 5,80 (d, J = 15,8 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,8, 11,7 y 15,8 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1 H); 7,28 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 7,32 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); 7,39 (d, J = 8,3 Hz, 2 H); 7,41 (m, 1 H); 8,00 (d, J = 9,1 Hz, 1 H); 8,36 (d, J = 8,2 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 735 [M-H]-; m/z = 737 [M+H]+; RT = 1,54 min.

Ejemplo 5: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 39 (100 mg, 122,07 pmol) en DCM (2,5 mL) y MeOH (2,5 mL) se agregó por goteo una disolución de TCEp (38,88 mg, 134,28 pmol) en H²O (500 pL). El medio de reacción se agitó durante 24 h a RT. La mezcla de reacción se diluyó con H²O y NaHCO3 sat., se extrajo con DCM (3 x 10 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró para proporcionar 73 mg del ejemplo 5 como un sólido blanco (84 %) usado sin purificación adicional en la siguiente etapa.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,82 (s, 9 H); 0,97 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,04 (s, 3 H); 1,29 (d, J = 14,4 Hz, 1 H); 1,70 (dd, J = 10,2 y 14,4 Hz, 1 H); 1,80 (m, 1 H); 2,02 (ancho m, 2 H); 2,25 (m, 1 H); 2,62 (m, 2 H);

2,83 (d, J = 13,0 Hz, 1 H); 2,93 (dd, J = 2,2 y 7,8 Hz, 1 H); 2,99 (dd, J = 3,4 y 14,5 Hz, 1 H); 3,23 a 3,35 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,71 (s, 2 H); 3,80 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 4,17 (ddd, J = 3,5, 8,5 y 11,5 Hz, 1 H); 4,41 (m, 1 H); 5,09 (m, 1 H); 5,79 (d, J = 15,7 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,7, 11,4 y 15,7 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8.7 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1 H); 7,22 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,28 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 7,34 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,40 (d, J = 10,3, 1 H); 8,02 (d, J = 8,9 Hz, 1 H); 8,38 (d, J = 8,2 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m/z = 709 [M-H]-; m/z = 711 [M+H]+; RT = 0,86 min.

Compuesto 40: (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1 -(((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el ejemplo 5 (73 mg, 82,10 pmol) y DMF (1 mL), posteriormente FmocValAla (50,55 mg, 123,16 pmol), HOBt (17,75 pL, 131,37 pmol), DCM (10 mL) y EDC (14,53 pl, 82,10 pmol). La disolución se agitó durante 4 h a RT, después se diluyó con H²O (10 mL) y se extrajo con DCM (3 x 20 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con H²O, se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró y se purificó sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 90 mg de compuesto 40 como un sólido incoloro (99 %).

,5 y = 1,9 y

, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,7, 11,6 y 15,7 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,15 (dd, J = 2,5 y 8,6 Hz, 1 H); 7,21 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,24 (d, J = 8,5 Hz, 2 H); 7,28 (d, J = 2,5 Hz, 1 H); 7,32 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7.38 to 7.47 (m, 4 H); 7,73 (t, J = 7,9 Hz, 2 H); 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 2 H); 8,03 (d, J = 9,1 Hz, 1 H); 8,05 (d, J = 7,9 Hz, 1 H); 8,39 (m, 2 H). LCMS (A1): ES m/z = 1103 [M+H]+; m/z = 1147 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,71 min.

Compuesto 41: (S)-2-amino-N-((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto 40 (104 mg, 76,65 pmol) en DCM (5 mL), posteriormente piperidina (138,87 pl, 1,40 mmol). La disolución se agitó durante 5 h a RT, después se concentró y se purificó sobre 10 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH/H²O) para proporcionar 50 mg de compuesto 41 como un sólido incoloro (60 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,76 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,81 (s, 9 H); 0,88 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,02 (d, J = 7,1 Hz, 3 H); 1,04 (s, 3 H); 1,22 (d, J = 7,3 Hz, 3 H); 1,29 (d, J = 14,6 Hz, 1 H); 1,66 (ancho m, 2 H); 1,70 (dd, J = 10,6 y 14,6 Hz, 1 H); 1,81 (m, 1 H); 1,92 (m, 1 H); 2,25 (m, 1 H); 2,60 (m, 2 H); 2,83 (d, J = 13,0 Hz, 1 H); 2,93 (dd, J = 1,9 y 7,4 Hz, 1 H); 2,99 (m, 2 H); 3,28 (dd, J = 10,4 y 13,0 Hz, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,89 (d, J = 1,9 Hz, 1 H); 4,16 (ddd, J = 3,2 y 8,2 y 11,8 Hz, 1 H); 4,29 (d, J = 6,0 Hz, 2 H); 4,34 (m, 1 H); 4,41 (m, 1 H); 5,09 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,7 y 15,5 Hz, 1 H); 6,38 (ddd, J = 3,8, 11,3 y 15,5 Hz, 1 H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,2 y 8.7 Hz, 1 H); 7,25 (m, 4 H); 7,29 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,40 (d, J = 10,4 Hz, 1 H); 8,02 (d, J = 9,1 Hz, 1 H); 8,08 (ancho d, J = 7,7 Hz, 1 H); 8,39 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 8,45 (t, J = 6,0 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 441 [M+2H]2+; m/z = 879 [M-H]-; m/z = 881 [M+H]+; m/z = 925 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,99 min.

Compuesto 42: ácido 5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoico

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto 41 (50 mg, 51,05 pmol) en DCM (10 mL), posteriormente anhídrido glutárico (10,48 mg, 91,89 pmol). El medio de reacción se agitó durante 2 h a RT, se concentró y se purificó sobre 10 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH/H²O) para proporcionar 42 mg de compuesto 42 como un sólido incoloro (82 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (s, 9 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,04 (s, 3 H); 1,23 (d, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,29 (d, J = 14,2 Hz, 1 H); 1,70 (m, 3 H); 1,81 (m, 1 H); 1,96 (m, 1 H); 2,18 a 2,25 (m, 5 H); 2,61 (m, 2 H); 2,83 (d, J = 13,0 Hz, 1 H); 2,93 (dd, J = 2,0 y 7,4 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,1 y 14,5 Hz, 1 H); 3,29 (dd, J = 10,4 y 13,0 Hz, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,89 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 4,16 (m, 2 H); 4,25 a 4,31 (m, 3 H); 4,42 (m, 1 H); 5,09 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,9 y 15,5 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,8, 11,6 y 15.5 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,15 (dd, J = 2,1 y 8,7 Hz, 1 H); 7,23 (m, 4 H); 7,28 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 7,40 (d, J = 10,4 Hz, 1 H); 7,83 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 8,02 (m, 2 H); 8,35 (t, J = 6,1 Hz, 1 H); 8,39 (d, J = 8,0 Hz, 1 H); 12,04 (ancho m, 1 H). Lc Ms (A1): ES m/z = 498 [M+2H]2+; m/z = 993 [M-H]-; m/z = 995 [M+H]+; RT = 1,27 min.

Ejemplo 6: 2,5-dioxopirrolidin-1-il5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6-dimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoato

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto 42 (23 mg, 23,10 pmol) en DCM (5 mL), posteriormente DSC (8,29 mg, 32,34 pmol) y DIEA (5,63 pL, 32,34 pmol). El medio de reacción se agitó durante 2 h a RT. Después de este tiempo, se agregaron 2 mg de DSC, 1 pL de DIEA y DCM (2 mL) y se agitaron durante 1 h a RT. El disolvente se retiró y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía rápida sobre 10 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 20 mg del ejemplo 6 como un sólido incoloro (79 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 (s, 9 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,04 (s, 3 H); 1,23 (d, J = 7,2 Hz, 3 H); 1,30 (d, J = 14,2 Hz, 1 H); 1,70 (dd, J = 10,7 y 14.7 Hz, 1 H); 1,81 (m, 3 H); 1,97 (m, 1 H); 2,21 a 2,32 (m, 3 H); 2,61 (m, 2 H); 2,68 (t, J = 7,8 Hz, 2 H); 2,80 (ancho s, 4 H); 2,83 (d, J = 13,0 Hz, 1 H); 2,94 (dd, J = 2,0 y 7,6 Hz, 1 H); 3,00 (dd, J = 3,4 y 14,9 Hz, 1 H); 3,28 (dd, J = 10.5 y 13,0 Hz, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 4,16 (m, 2 H); 4,23 a 4,31 (m, 3 H); 4,42 (m, 1 H); 5,10 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,9 y 15,3 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 3,8, 11,4 y 15,3 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,8 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,2 y 8,8 Hz, 1 H); 7,23 (m, 4 H); 7,28 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,40 (d, J = 10,5 Hz, 1 H); 7,89 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 8,02 (d, J = 9,1 Hz, 1 H); 8,06 (d, J = 7,5 Hz, 1 H); 8,34 (t, J = 6,1 Hz, 1 H); 8,39 (d, J = 8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 546,5 [M+2H]2+; m/z = 1090 [M-H]-; m/z = 1092 [M+H]+; m/z = 1136 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,34 min.

Ejemplo 7: mAb-Ej. 6

El método general descrito anteriormente se usó para la preparación del ejemplo 7. Se hicieron reaccionar 60 mg de hu2H11_R35-74 con 233 pL de una disolución 10,6 mM de ejemplo 6 en DMA (5 eq.) durante 2 h. Después de purificación en Superdex 200 pg en DPBS pH 6,5 NMP al 20 %, concentración sobre Amicon Ultra-15, cambio de tampón en NAP-25 en tampón B pH 6,5 NMP al 5 % y filtración en Steriflip, se obtuvieron 39 mg del ejemplo 7 como una disolución límpida incolora a una concentración de 1,98 mg/mL con una DAR de 4,1 (HRMS), una pureza monomérica de 100 % y un rendimiento global de 66 %. SEC-HRMS: espectro para el ADC intacto en la Figura 2; m/z = 149370 (mAb no marcado); m/z = 150357 (D1); m/z = 151330 (D2); m/z = 152307 (D3); m/z = 153285 (D4); m/z = 154262 (D5); m/z = 155238 (D6); m/z = 156222 (D7).

Síntesis de los Ejemplos 8 a 10: amina bencílica de 7-Me-aza-C52 estereómero 1, éster de NHS de amina glutaril-Val-Ala-7-Me-aza-C52 bencílica estereómero 1 y el ADC correspondiente

Compuesto 43: (6R,13S)-(1 E,3R,4S,6E)-1 -(4-(azidomet¡l)fen¡l)-8-(ferc-butox¡)-3-metil-8-oxoocta-1,6-dien-4-il 6-(3-cloro-4-metoxibencil)-13-isobutil-2,2,9,10,10-pentametil-4,7,11 -trioxo-3-oxa-5,8,12-triazatetradecan-14-oato

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el fragmento BC2 (1,10 g, 2,48 mmol) en DMF (5 mL), posteriormente HATU (950 mg, 2,5 mmol) y HOAt (340 mg, 2,5 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min a RT, después se agregaron el fragmento AD1 (1,24 g, 2,18 mmol) y DIEA (1,2 mL, 6,87 mmol). La disolución amarilla se agitó durante 16 h a RT, se aplacó con H²O y se extrajo con AcOEt (3 x 30 mL). Las capas orgánicas se lavaron con H²O, salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron sobre 200 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/AcOEt) para proporcionar 1,55 g de compuesto 43 como un merengue blanco (77 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 55/45 mezcla diastereoisomérica; 0,82 a 0,89 (m, 6 H); 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 1,65 H); 0,91 (d, J = 7,0 Hz, 1,35 H); 0,99 a 1,09 (m, 9 H); 1,30 (s, 9 H); 1,40 (s, 10 H); 1,50 a 1,70 (m, 2 H); 2,38 a 2,59 (m parcialmente enmascarado, 3 H); 2,68 (m, 1 H); 2,84 (m, 1 H); 3,79 (s, 1,35 H); 3,81 (s, 1,65 H); 4,00 a 4,18 (m, 2 H); 4,30 (m, 1 H); 4,40 (ancho s, 2 H); 4,92 (m, 1 H); 5,81 (d, J = 15,7 Hz, 1 H); 6,18 (dd, J = 8,3 y 16,1 Hz, 1 H); 6,45 (d, J = 16,1 Hz, 1 H); 6,71 (td, J = 7,3 y 15,7 Hz, 1 H); 6,94 (d, J = 8,1 Hz, 0,45 H); 6,96 (d, J = 8,1 Hz, 0,55 h ); 7,04 (d dividido, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,19 (ancho d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,30 (d, J = 7,8 Hz, 2 H); 7,32 (ancho s, 1 H); 7,41 (d, J = 8,7 Hz, 2 H); 7,52 (d, J = 10,1 Hz, 0,45 H); 7,59 (d, J = 10,1 Hz, 0,55 H); 7,74 (m, 1 H). LCMS (A1): 55/45 mezcla diastereoisomérica; ES m/z = 895 [M+h ]+; m/z = 917 [M+Na]+; RT = 6,94-6,98 min.

Compuestos 44 y 45: (3S,10R,16S,E)-16-((R,E)-4-(4-(az¡domet¡l)fen¡l)but-3-en-2-¡l)-10-(3-cloro-4-metox¡benc¡l)-3-isobutil^^J-trim etiM -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

Los compuestos 44 y 45 se obtuvieron en dos etapas.

Etapa 1: a 0 °C, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 43 (1,50 g, 1,67 mmol) en 11 mL de DCM se agregaron TFA (2,6 mL, 34,65 mmol) y 100 pL de H²O. La mezcla se agitó durante 15 min a 0 °C y a RT durante 6,5 h. El medio de reacción después se evaporó al vacío y se coevaporó en presencia de tolueno para proporcionar 1,7 g de intermediario desprotegido como un sólido anaranjado.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 55/45 mezcla diastereoisomérica; 0,70 a 0,80 (m, 7,65 H); 0,90 (s, 1,35 H); 0,95 (m, 3 H); 1,01 a 1,09 (m, 6 H); 1,38 a 1,68 (m, 3 H); 2,40 a 2,60 (m parcialmente enmascarado, 3 H); 2,80 a 3,02 (m, 2 H); 3,81 (s, 1,35 H); 3,82 (s, 1,65 H); 3,96 a 4,08 (m, 1 H); 4,18 (m, 1 H); 4,28 (m, 1 H); 4,41 (s, 2 H); 4,91 (m, 1 H); 5,83 (d, J = 15,7 Hz, 0,45 H); 5,85 (d, J = 15,7 Hz, 0,55 H); 6,18 (m, 1 H); 6,43 (d, J = 16,1 Hz, 0,45 H); 6,46 (d, J = 16,1 Hz, 0,55 H); 6,74 (m, 1 H); 7,08 a 7,20 (m, 2 H); 7,30 (m enmascarado, 0,45 H); 7,32 (d, J = 7,8 Hz, 2 H); 7,37 (d, J = 2,0 Hz, 0,55 H); 7,42 (m, 2 H); 7,76 (d, J = 8,00 Hz, 0,45 H); 7,79 (d, J = 8,00 Hz, 0,55 H); 7,86 (d, J = 10,1 Hz, 0,55 H); 8,00 (d, J = 10,1 Hz, 0,45 H); 8,11 (ancho m, 3 H); 12,22 (ancho m, 1 H). LCMS (A1): 55/45 mezcla diastereoisomérica; ES m/z = 737 [M-H]-; m/z = 739 [M+H]+; RT = 1,07-1,09 min.

Etapa 2: en un matraz de fondo redondo, a una disolución del intermediario desprotegido (1,43 g, 1,68 mmol) en 25 mL de CH³CN se agregaron DIEA (3 mL, 16,23 mmol), HOAt (250,91 mg, 1,84 mmol) y Ha TU (700,91 mg, 1,84 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h a RT. Después se retiró el disolvente, el medio se diluyó con AcOEt (200 mL), se neutralizó con ácido cítrico 0,5M y HCl. La capa orgánica se separó, se lavó con NaHSO3 sat., NaHCO3 sat., salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró y se purificó sobre 100 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 640 mg de los compuestos 44 y 45 como un sólido amarillo (53 %).

Los diastereoisómeros en C7 se separaron mediante cromatografía líquida quiral que se llevó a cabo en una columna 76,5 x 350 mm cargada con 1,1 kg de 10 pm Whelk 01 SS (4-(3,5-dinitrobenzamido) tetrahidrofenantreno, Regis Technologies) mediante el uso de elución isocrática con 50:50 heptano/EtOH. Después de la concentración, se obtuvieron 210 mg de compuesto 44 (estereómero 1) como un sólido blanco (17 %) y se obtuvieron 236 mg de compuesto 45 (estereómero 2) como un sólido blanco (19 %).

Compuesto 44 (estereómero 1):

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,60 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,62 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,98 (s, 3 H); 1,05 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,10 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,14 (s, 3 H); 1,18 (m, 1 H); 1,40 a 1,54 (m, 2 H); 2,24 (m, 1 H); 2,48 a 2,61 (m parcialmente enmascarado, 2 H); 2,65 (dd, J = 11,8 y 14,5 Hz, 1 H); 3,04 (dd, J = 3,2 y 14,5 Hz, 1 H); 3,55 (m, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 4,19 (m, 2 H); 4,40 (s, 2 H); 4,96 (m, 1 H); 5,91 (dd, J = 1,4 y 15,5 Hz, 1 H); 6,13 (dd, J = 8,9 y 16,1 Hz, 1 H); 6,40 (ddd, J = 3,9, 11,3 y 15,5 Hz, 1 H); 6,46 (d, J = 16,1 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,19 (dd, J = 2,1 y 8,7 Hz, 1 H); 7,30 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 7,32 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,41 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,87 (d, J = 8,9 Hz, 1 H); 8,36 (d, J = 9,9 Hz, 1 H); 8,40 (d, J = 8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 719 [M-H]-; m/z = 721 [M+H]+; RT = 1,61 min

Compuesto 45 (estereómero 2):

1H RMN (5 en ppm, DMSO-d6): 0,59 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,67 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,88 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 1,03 (s, 3 H); 1,10 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,19 (s, 3 H); 1,21 (m, 1 H); 1,49 a 1,60 (m, 2 H); 2,23 (m, 1 H); 2,46 a 2,61 (m parcialmente enmascarado, 2 H); 2,71 (dd, J = 11,3 y 14,5 Hz, 1 H); 2,98 (dd, J = 3,7 y 14,5 Hz, 1 H); 3,48 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 4,05 (m, 1 H); 4,11 (ddd, J = 3,7, 7,6 y 11,3 Hz, 1 H); 4,40 (s, 2 H); 4,90 (m, 1 H); 5,93 (d, J = 15,7 Hz, 1 H); 6,14 (dd, J = 8,7 y 16,1 Hz, 1 H); 6,47 (d, J = 16,1 Hz, 1 H); 6,51 (ddd, J = 5,2, 10,3 y 15,5 Hz, 1 H); 7,02 (d, J = 8.7 Hz, 1 H); 7,21 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1 H); 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,37 (d, J = 2,4 Hz, 2 H); 7,41 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,87 (d, J = 6,9 Hz, 1 H); 7,89 (d, J = 9,0 Hz, 1 H); 8,51 (d, J = 7,6 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 719 [M-H]-; m/z = 721 [M+H]+; RT = 1,61 min.

Compuesto 46: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(azidometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6.6.7- trimetil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A 0 °C, en argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 44 (154 mg, 213,51 pmol) en DCM (10 mL), se agregó m-CPBA (80 mg, 324,51 pmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 5 d. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (15 mL) y se agitó durante 15 min con NaHCÜ3 sat. (6 mL) y Na2S2Ü3 (6 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera sat. (2 x 3 mL), se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró para proporcionar 150 mg de compuesto 46 como un sólido blanco (cuant.).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,75 (d, J = 6,8 Hz, 1,8 H); 0,79 (d, J = 6.8 Hz, 3 H); 0,85 (d, J = 6,8 Hz, 1,2 H); 0,95 a 0,99 (m, 4,2 H); 1,02 a 1,09 (m, 4,8 H); 1,15 (s, 1,8 H); 1,18 (s, 1,2 H); 1,20 (m, 0,6 H); 1,38 (m, 0,4 H); 1,59 a 1,62 (m, 2 H); 1,80 (m, 0,6 H); 1,89 (m, 0,4 H); 2,25 (m, 0,6 H); 2,40 a 2,71 (m parcialmente enmascarado, 2,4 H); 2,96 a 3,08 (m, 2 H); 3,54 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,82 (d, J = 1,9 Hz, 0,4 H); 3,92 (d, J = 1,9 Hz, 0,6 H); 4,14 a 4,29 (m, 2 H); 4,40 a 4,50 (m, 2 H); 5,11 (m, 1 H); 5,85 (dd, J = 2,0 y 15,5 Hz, 0,6 H); 5,95 (dd, J = 2,0 y 15,5 Hz, 0,4 H); 6,38 (m, 1 H); 7,04 (d dividido, J = 8,8 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,2 y 8,8 Hz, 0,6 H); 7,19 (dd, J = 2,2 y 8,8 Hz, 0,4 H); 7,28 (d, J = 2,2 Hz, 0,6 H); 7,30 (d, J = 2,2 Hz, 0,4 H); 7,30 a 7,40 (m, 4 H); 7,89 (d, J = 8,1 Hz, 0,6 H); 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 0,4 H); 8,29 (d, J = 10,0 Hz, 0,6 H); 8,32 (d, J = 8,1 Hz, 0,6 H); 8,35 (d, J = 10,0 Hz, 0,4 H); 8,40 (d, J = 8,1 Hz, 0,4 H). LCMS (A1): ES m/z = 735 [M-H]-; m/z = 737 [M+H]+; RT = 1,52 min.

Ejemplo 8: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1 -(3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6.6.7- trimetil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A 0 °C, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 46 (60 mg, 81,38 pmol) en DCM (3 mL) y MeOH (3 mL) se agregó por goteo una disolución de TCEP (38,9 mg, 134,3 pmol) en 1 mL de H²O. La mezcla de reacción se agitó a RT durante 35 h, después se diluyó con DCM (15 mL) y NaHCO3 sat. Después de agitar durante 10 min, la capa orgánica se separó, se lavó con salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 23 mg de ejemplo 8 como un sólido blanco (40 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,77 (d, J = 7,0 Hz, 1,8 H); 0,81 (d dividido, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,88 (d, J = 7,0 Hz, 1,4 H); 0,95 (d, J = 7,0 Hz, 1,2 H); 0,98 (s, 1,8 H); 1,00 (s, 1,2 H); 1,02 a 1,09 (m, 4,8 H); 1,17 (s, 1,8 H); 1,19 (s, 1,2 H); 1,22 (m, 0,6 H); 1,40 (m, 0,4 H); 1,51 a 1,64 (m, 2 H); 1,78 (m, 0,6 H); 1,89 (m, 0,4 H); 2,28 (m, 0,6 H); 2,40 a 2,71 (m parcialmente enmascarado, 2,4 H); 2,96 (dd, J = 2,2 y 7,5 Hz, 0,6 H); 2,99 (dd, J = 2,2 y 7,5 Hz, 0,4 H); 3,03 (m, 1 H); 3,55 (m, 1 H); 3,70 (s, 1,2 H); 3,72 (s, 1,8 H); 3,78 (d, J = 2,2 Hz, 0,4 H); 3,81 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,2 Hz, 0,6 H); 4,12 a 4,30 (m, 2 H); 5,12 (m, 1 H); 5,84 (dd, J = 1,8 y 15,6 Hz, 0,6 H); 5,96 (dd, J = 1,8 y 15,6 Hz, 0,4 H); 6,39 (m, 1 H); 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,16 a 7,38 (m, 6 H); 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 0,6 H); 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 0,4 H); 8,28 (d, J = 10,0 Hz, 0,6 H); 8,32 (d, J = 8,1 Hz, 0,6 H); 8,37 (d, J = 10,0 Hz, 0,4 H); 8,41 (d, J = 8,1 Hz, 0,4 H). LCMS (A1): ES m/z = 709 [M-H]-; m/z = 711 [M+H]+; RT = 0,86 min.

Compuesto 47: (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1 -(((S)-1 -((4-(3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6,7-trimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el ejemplo 8 (110 mg, 154,65 pmol) y DMF (2 mL), posteriormente FmocValAla (90 mg, 219 pmol), HOBt (30 mg, 222 pmol), d Cm (10 mL) y EDC (35 pl, 197,52 pmol). La disolución se agitó a RT durante 3h30, después se aplacó con H²O (10 mL) y se extrajo mediante DCM (3 x 10 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con NaHCO3 sat., salmuera sat., se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró en presencia de tolueno y se purificó sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 49 mg de compuesto 47 como un sólido blanco (46 %).1

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,76 (d, J = 7,0 Hz, 1,8 H); 0,80 (m, 3 H); 0,82 a 0,89 (m, 6,4 H); 0,95 (d, J = 7,0 Hz, 1,2 H); 0,98 (s, 1,8 H); 1,00 (s, 1,2 H); 1,02 a 1,09 (m, 4,8 H); 1,17 (s, 1.8 H); 1,19 (s, 1,2 H); 1,20 a 1,32 (m, 3,6 H); 1,40 (m, 0,4 H); 1,51 a 1,63 (m, 2 H); 1,78 (m, 0,6 H); 1,85 (m, 0,4 H); 2,00 (m, 1 h ); 2,27 (m, 0,6 H); 2,40 a 2,72 (m parcialmente enmascarado, 2,4 H); 2,96 (m, 1 H); 3,04 (m, 1 H); 3,55 (m, 1 H); 3,77 (d, J = 2,2 Hz, 0,4 H); 3,81 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,2 Hz, 0,6 H); 3,90 (m, 1 H); 4,15 a 4,38 (m, 6 H); 5,12 (m, 1 H); 5,85 (dd, J = 1,8 y 15,6 Hz, 0,6 H); 5,95 (dd, J = 1,8 y 15,6 Hz, 0,4 H); 6,39 (m, 1 H); 7,05 (d dividido, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,15 a 7,48 (m, 19 H); 7,73 (t, J = 8,1 Hz, 2 H); 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 2,6 H); 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 0,4 H); 8,05 (d, J = 8,1 Hz, 1 H); 8,25 a 8,45 (m, 3 H). LCMS (A1): ES m/z = 552 [M+2H]2+; m/z = 1103 [M+H]+; m/z = 1147 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,55-1,57 min.

Compuesto 48: (2S)-2-amino-N-((2S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((1 S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6,7-trimetil-2,5,9,l2-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida

En un matraz de fondo redondo, se agregó piperidina (60 pL, 600,6 pmol) a una disolución de compuesto 47 (50 mg, 45,30 pmol) en DCM (5 mL). La mezcla resultante se agitó durante 24 h a RT, se concentró al vacío y se purificó sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 70 mg de epóxidos alfa y beta.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,75 (d, J = 7,0 Hz, 1,8 H); 0,80 (m, 3 H); 0,82 a 0,92 (m, 6,4 H); 0,96 (d, J = 7,0 Hz, 1,2 H); 0,98 (s, 1,8 H); 1,00 (s, 1,2 H); 1,02 a 1,09 (m, 4,8 H); 1,15 (s, 1,8 H); 1,19 (s, 1,2 H); 1,20 a 1,42 (m, 4 H); 1,50 a 1,70 (m enmascarado, 2 H); 1,78 (m, 0,6 H); 1,85 (m, 0,4 H); 2,00 (m, 1 H); 2,25 (m, 0,6 H); 2,40 a 2,72 (m parcialmente enmascarado, 2,4 H); 2,92 a 3,08 (m, 3 H); 3,54 (m, 1 h ); 3,79 (d, J = 2,1 Hz, 0,4 H); 3,81 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,1 Hz, 0,6 H); 4,13 a 4,41 (m, 6 H); 5,12 (m, 1 H); 5,85 (d, J = 15,4 Hz, 0,6 H); 5,93 (d, J = 15,4 Hz, 0,4 H); 6,38 (m, 1 H); 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,15 a 7,32 (m, 6 H); 7,90 (d, J = 8,3 Hz, 0,6 H); 7,93 (d, J = 8,3 Hz, 0,4 H); 8,10 a 8,55 (m, 7 H). LCMS (A1): ES m/z = 441 [M+2H]2+; m/z = 879 [M-H]-; m/z = 881 [M+H]+; m/z = 925 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,92 min. Los epóxidos alfa y beta se separaron mediante cromatografía líquida quiral que se llevó a cabo en una columna 76 x 350 mm cargada con 1,1 kg de 10 pm Chiralpak AD (amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato recubierta sobre un soporte de gel de sílice, Chiral Technologies Europe) mediante el uso de elución isocrática con 70:30 heptano/EtOH. Después de la concentración, se obtuvieron 28 mg de compuesto 48 como un sólido blanco (70 %) y se obtuvieron 19 mg de epóxido alfa como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,75 (d, J = 7,0 Hz, 6 H); 0,80 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,88 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,98 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 6 H); 1,17 (s, 3 H); 1,23 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,35 (m, 1 H); 1,50 a 1,68 (m, 2 H); 1,78 (m, 1 H); 1,91 (m, 1 H); 2,26 (m, 1 H); 2,58 a 2,70 (m, 2 H); 2,96 (dd, J = 1,9 y 7,7 Hz, 1 H); 2,99 (d, J = 4,8 Hz, 1 H); 3,02 (dd, J = 3,3 y 14,8 Hz, 1 H); 3,53 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,89 (d, J = 1,9 Hz, 1 H); 4,10 a 4,23 (m, 3 H); 4,28 (d, J = 6,1 Hz, 2 H); 4,35 (m, 1 H); 5,11 (m, 1 H); 5,83 (dd, J = 1,9 y 15,2 Hz, 1 H); 6,37 (ddd, J = 4,0, 11,2 y 15,2 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 8,8 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J = 2,4 y 8,8 Hz, 1 H); 7,26 (s, 4 H); 7,29 (d, J = 2,4 Hz, 1 H); 7,90 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 8,08 (ancho d, J = 7,7 Hz, 1 H); 8,29 (d, J = 10,1 Hz, 1 H); 8,33 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 8,46 (t, J = 6,7 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 441 [M+2H]12+; m/z = 879 [M-H]-; m/z = 881 [M+H]+; m/z = 925 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,92 min.

Compuesto 49: ácido 5-(((S)-1 -(((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6,7-trimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoico

En argón, en un matraz de fondo redondo, una disolución de anhídrido glutárico (3,78 mg, 32,44 pmol) en DCM (4 mL) se agregó a una disolución de compuesto 48 (26 mg, 29,5 pmol) en DCM (9 mL). La mezcla resultante se agitó durante 2 h a RT, se concentró al vacío y se purificó sobre 2,5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH/H²O) para proporcionar 18 mg de compuesto 49 como un sólido blanco (61 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,78 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,80 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,97 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 6 H); 1,15 (s, 3 H); 1,23 (ancho d, J = 7,0 Hz, 4 H); 1,49 a 1,61 (m, 2 H); 1,70 (m, 2 H); 1,78 (m, 1 H); 1,97 (m, 1 H); 2,20 (m, 4 H); 2,25 (m, 1 H); 2,62 (m, 2 H); 2,95 (m, 1 H); 3,02 (m, 1 H); 3,53 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,88 (s, 1 H); 4,10 a 4,22 (m, 3 H); 4,24 a 4,31 (m, 3 H); 5,11 (m, 1 H); 5,83 (d, J = 15,7 Hz, 1 H); 6,36 (m, 1 H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,19 (ancho d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,23 (m, 4 H); 7.29 (ancho s, 1 H); 7,87 (d, J = 8,9 Hz, 1 H); 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 1 H); 8,06 (ancho d, J = 7,3 Hz, 1 H); 8,29 (d, J = 10,1 Hz, 1 H); 8,37 (m, 2 H); 12,0 (ancho m, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 993 [M-H]-; m/z = 995 [M+H]+; RT = 1,21 min.

Ejemplo 9: 2.5-dioxopirrolidin-1-il 5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6,7-trimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoato

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 49 (15 mg, 15,07 pmol) en DCM (5 mL) se agregaron DSC (5,63 mg, 21,09 pmol) y DIEA (3,56 pL, 21,09 pmol). La mezcla resultante se agitó durante 1 h a RT, se concentró al vacío y se purificó sobre 2,5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 7,7 mg de ejemplo 9 como un sólido blanco (47 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,78 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,80 (d, J = 6,7 Hz, 3 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,99 (s, 3 H); 1,04 (d, J = 7,2 Hz, 6 H); 1,18 (s, 3 H); 1,26 (m, 4 H); 1,57 (m, 2 H); 1,79 (m, 1 H); 1,83 (m, 2 H); 1,99 (m, 1 H); 2,22 a 2,33 (m, 3 H); 2,60 a 2,71 (m, 4 H); 2,82 (s, 4 H); 2,97 (dd, J = 2,1 y 7,7 Hz, 1 H); 3,04 (dd, J = 3,4 y 14,7 Hz, 1 H); 3,55 (m, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 3,89 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 4,19 (m, 3 H); 4,26 a 4,34 (m, 3 H); 5,12 (m, 1 H); 5,86 (dd, J = 2,0 y 15,7 Hz, 1 H); 6,38 (ddd, J = 3,8, 11,2 y 15,7 Hz, 1 H); 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,19 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1 H); 7,26 (m, 4 H); 7,29 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,91 (m, 2 H); 8,09 (m, 1 H); 8.29 (d, J = 9,9 Hz, 1 H); 8,35 (m, 2 H). LCMS (A1): ES m/z = 1092 [M+H]+; m/z = 1136 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,26 min.

Ejemplo 10: mAb-Ej. 9

El método general descrito anteriormente se usó para la preparación del ejemplo 10. Se hicieron reaccionar 60 mg de hu2H11_R35-74 con 198 pL de una disolución 10,78 mM de ejemplo 9 en DMA (5 eq.) durante 2 h. Después de este tiempo, se agregaron 120 pL de la disolución del ejemplo 9 (3 eq.) y el medio se agitó durante 2 h. Después de purificación en Superdex 200 pg en DPBS pH 6,5 n Mp al 20 %, concentración sobre Amicon Ultra-15, cambio de tampón en PD-10 en tampón B pH 6,5 NMP al 5 % y filtración en Steriflip, se obtuvieron 46 mg del ejemplo 10 como una disolución límpida incolora a una concentración de 2,23 mg/mL con una DAR de 4,7 (HRMS), una pureza monomérica de 99,2 % y un rendimiento global de 78 %. SEC-HRMS: espectro para ADC intacto en la Figura 3; m/z = 150345 (D1); m/z = 151319 (D2); m/z = 152297 (D3); m/z = 153274 (D4); m/z = 154251 (D5); m/z = 155222 (D6); m/z = 156202 (D7); m/z = 157183 (D8).

Síntesis de los Ejemplos 11 a 14: amina bencílica de 3-(S)-neopentil-7-Me-aza-C52 estereómero 1, éster de NHS de amina glutaril-Val-Ala-3-(S)-neopentil-7-Me-aza-C52 bencílica estereómero 1 y el ADC correspondiente

Compuesto 50: (6R,13S)-(1 E,3R,4S,6E)-8-(ferc-butoxi)-1 -(4-(hidroximetil)fenil)-3-metil-8-oxoocta-1,6-dien-4-il 6-(3-cloro-4-metoxibencil)-2,2,9,l0,10-pentametil-13-neopentil-4,7,11 -trioxo-3-oxa-5,8,12-triazatetradecan-14-oato

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de fragmento BC2 (742 mg, 1,68 mmol) en DMF (20 mL), se agregaron HATU (716 mg, 1,83 mmol) y HOAt (251 mg, 1,83 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min a RT. A continuación, se agregó una disolución del fragmento AD1 (730 mg, 1,59 mmol) en DMF (10 mL) y DIEA (981 pL, 5,56 mmol). El medio de reacción se agitó durante 24 h a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se diluyó con hielo (200 g), se extrajo con AcOEt (4 x 200 mL). Las capas orgánicas se lavaron con H²O (80 mL), salmuera sat. (2 x 80 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante dos cromatografías rápidas sucesivas, la primera sobre 300 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) y la segunda sobre 70 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 428 mg de compuesto 50 como una espuma incolora (30 %).

Compuesto 51: ácido (2E,5S,6R,7E)-5-(((2S)-2-(3-((R)-2-amino-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-propanamido)-2,2-dimetilbutanamido)-4,4-dimetilpentanoil)oxi)-8-(4-(hidroximetil)fenil)-6-metilocta-2,7-dienoico

En un matraz de fondo redondo se introdujeron el compuesto 50 (428 mg, 483,87 pmol) y DCM (27 mL). La disolución se enfrió a 0 °C, después se agregó TFA (8 mL, 106,62 mmol). La mezcla se agitó durante 1,5 h a RT. El disolvente se retiró y coevaporó a presión reducida con tolueno (3 x 100 mL). El aceite bruto se diluyó con 1:1 AcOEt/H²O (75 mL) y se neutralizó con NaOH 2M (250 pL) hasta pH 6-7. La mezcla se agitó durante 6 h a RT. Las capas se separaron. La capa ac. se extrajo con AcOEt (3 x 50 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera sat. (2 x 15 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar 374 mg de compuesto 51 como una espuma incolora (cuant.).

Compuesto 52: (3S,10R, 16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((R,E)-4-(4-(hidroximetil)-fenil)but-3-en-2-il)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 51 (352 mg, 483,31 pmol) en CH³CN (60 mL) se agregaron HATU (208 mg, 531,64 mmol), HOAt (73,09 mg, 531,64 pmol) y DIEA (244,52 pL, 1,45 mmol). El medio de reacción se agitó durante 45 min a RT. Después de este tiempo, el medio de reacción se neutralizó con ácido cítrico 0,5 N hasta pH 4, se concentró parcialmente al vacío y se extrajo con AcOEt (150 mL). La capa orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (10 mL), salmuera sat. (3 x 10 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 188 mg de compuesto 52 como una espuma incolora (54 %).

Compuesto 53: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-16-((R,E)-4-(4-(((triisopropilsilil)oxi)metil)fenil)but-3-en-2-il)-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A 0 °C, en argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 52 (188 mg, 264,68 pmol) en DCM (7 mL), se agregaron 1H-imidazol (83,72 mg, 1,2 mmol) y clorotriisopropilsilano 1M (134,15 pl). El medio de reacción se agitó durante 5 h a RT, después se aplacó con NH4Cl sat. y se agitó durante 15 min. Las capas se separaron. La capa ac. se extrajo con DCM (3 x 25 mL). Las capas orgánicas se lavaron con NaHSO4 1M (10 mL), NaHCO3 sat. (10 mL), salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 10 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 137 mg de compuesto 53 como una espuma incolora (59 %).

Ejemplo 11: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(hidroximetil)fenil)oxiran-2-il)etil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 11 se preparó en dos etapas.

Etapa 1: a 0 °C en argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 53 (137 mg, 158,08 pmol) en DCM (5,5 mL) se agregó una disolución de m-CPBA (50,66 mg, 205,51 pmol) en DCM (2 mL) y el medio de reacción se agitó durante 2 h. Después, se agregaron de 39 mg de m-CPBA dos veces después de 2 h de agitación. Después de 16 h de agitación, la mezcla se aplacó con NaHCO3 sat. (30 mL) y Na2S2O3 (30 mL), se agitó durante 15 min y se diluyó con DCM (40 mL). Las capas se separaron. La capa ac. se extrajo con DCM (2 x 20 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera sat. (2 x 8 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar 160 mg de los epóxidos alfa y beta como un sólido incoloro (cuant.).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,80 a 0,91 (m, 12 H); 0,97 a 1,09 (m, 24 H); 1,12 a 1,21 (m, 6 H); 1,32 (d, J = 14,7 Hz, 0,6 H); 1,40 (d, J = 14,7 Hz, 0,4 H); 1,70 a 1,87 (m, 1 H); 1,90 (dd, J = 10,1 y 14,7 Hz, 0,4 H); 1,97 (dd, J = 10,1 y 14,7 Hz, 0,6 H); 2,28 (m, 0,6 H); 2,40 (m, 0,4 H); 2,55 a 2,79 (m, 2 H); 2,90 a 3,00 (m, 2 H); 3,44 (m, 1 H); 3,79 (d, J = 2,1 Hz, 0,4 H); 3,80 (s, 3 H); 3,90 (d, J = 2,1 Hz, 0,6 H); 4,03 a 4,22 (m, 2 H); 4,78 (s, 0,8 H); 4,80 (s, 1,2 H); 5,03 (m, 1 H); 5,90 (dd, J = 1,5 y 15,5 Hz, 0,6 H); 5,99 (dd, J = 1,5 y 15,5 Hz, 0,4 H); 6,40 a 6,55 (m, 1 H); 7,02 a 7,07 (m, 1 H); 7,13 a 7,38 (m, 6 H); 7,85 a 7,93 (m, 2 H); 8,40 (d, J = 7,3 Hz, 0,6 H); 8,51 (d, J = 7,3 Hz, 0,4 H). LCMS (A1): ES m/z = 880 [M-H]-; m/z = 882 [M+H]+; m/z = 926 [M-H+HCO²H]-; RT = 2,05-2,06 min.

Etapa 2 : a 0 °C, en argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de los epóxidos alfa y beta (177 mg, 200,53 gmol) en THF (7,5 mL)se agregó por goteo TBAF 1M (221 gL, 221 gmol). Después de agitar durante 2 h a RT, se agregaron 50 gL de TBAF y se agitaron durante 3,5 h. El medio de reacción se diluyó con H²O (9 mL), se agitó durante 10 min y extrajo con DCM (3 x 25 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (3 x 8 mL), se secaron sobre MgSO⁴, se filtraron y se concentraron para proporcionar 210 mg de los epóxidos alfa y beta como un sólido incoloro (cuant.).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,82 a 1,25 (m, 21 H); 1,32 (d, J = 14,5 Hz, 0,6 H); 1,42 (d, J = 14,5 Hz, 0,4 H); 1,80 (m, 1 H); 1,91 (dd, J = 10,0 y 14,5 Hz, 0,4 H); 1,98 (dd, J = 10,0 y 14,5 Hz, 0,6 H); 2,22 a 2,48 (m, 1 H); 2,55 a 2,78 (m, 2 H); 2,89 a 3,03 (m, 2 H); 3,44 (m, 1 H); 3,79 (d, J = 2,2 Hz, 0,4 H); 3,80 (s, 3 H); 3,90 (d, J = 2,2 Hz, 0,6 H); 4,04 a 4,22 (m, 2 H); 4,48 (d, J = 5,8 Hz, 0,8 H); 4,50 (d, J = 5,8 Hz, 1,2 H); 5,03 (m, 1 H); 5,16 (t, J = 5,8 Hz, 0,4 H); 5,19 (t, J = 5,8 Hz, 0,6 H); 5,89 (dd, J = 1,9 y 15,6 Hz, 0,6 H); 5,99 (dd, J = 1,9 y 15,6 Hz, 0,4 H); 6,40 a 6,52 (m, 1 H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 0,6 H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 0,4 H); 7,16 a 7,37 (m, 6 H); 7,83 a 7,94 (m, 2 H); 8,39 (d, J = 7,4 Hz, 0,6 H); 8,50 (d, J = 7,4 Hz, 0,4 H). LCMS (A1): ES m/z = 724 [M-H]-; m/z = 726 [M+H]+; RT = 1,29 min.

Los epóxidos alfa y beta se separaron mediante cromatografía líquida quiral que se llevó a cabo en una columna 76 x 350 mm cargada con 1,1 kg de 10 gm Chiralpak AD (amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato recubierta sobre un soporte de gel de sílice, Chiral Technologies Europe) mediante el uso de elución isocrática con 75:25 heptano/EtOH. Después de la concentración, se obtuvieron 66 mg del ejemplo 11 como un sólido blanco (45 %) y se obtuvieron 45 mg de epóxido alfa como un sólido blanco (31 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,82 a 0,89 (m, 12 H); 0,99 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 6,9 Hz, 3 H); 1,19 (s, 3 H); I , 34 (d, J = 14,6 Hz, 1 H); 1,80 (m, 1 H); 1,98 (dd, J = 10,1 y 14,6 Hz, 1 H); 2,26 (m, 1 H); 2,61 (m, 1 H); 2,69 (dd, J = I I , 1 y 14,6 Hz, 1 H); 2,91 (dd, J = 2,1 y 7,8 Hz, 1 H); 2,94 (dd, J = 3,7 y 14,6 Hz, 1 H); 3,42 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3.91 (d, J = 2,1 Hz, 1 H); 4,03 a 4,14 (m, 2 H); 4,50 (d, J = 5,8 Hz, 2 H); 5,03 (m, 1 H); 5,19 (t, J = 5,8 Hz, 1 H) ; 5,89 (dd, J = 2,1 y 15,5 Hz, 1 H); 6,43 (ddd, J = 4,7, 10,9 y 15,5 Hz, 1 H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1 H); 7,23 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,30 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 7,33 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,86 (d, J = 8,4 Hz, 1 H); 7,92 (d, J = 7,1 Hz, 1 H); 8,39 (d, J = 9,1 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 724 [M-H]-; m/z = 726 [M+H]+; RT = 1,29 min.

Compuesto 54: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(azidometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6.6.7- trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución del ejemplo 11 (66 mg, 90,87 gmol) en THF (5 mL) se agregaron, a 0 °C, DPPA (100,23 gL, 454,36 gmol) y DBU (69,27 gl, 454,36 gmol). La disolución se agitó durante 5 h a RT, después se diluyó con H²O y se extrajo con AcOEt (2 x 15 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera sat. (2 x 5 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró y se purificó sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 64 mg de compuesto 54 como un sólido incoloro (94 %).

Ejemplo 12: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6.6.7- trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

En un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 54 (64 mg, 85,18 gmol) en DCM (3 mL), MeOH (3 mL) y H²O (400 gL) se agregó TCEP (26,86 mg, 93,70 gmol). El medio de reacción se agitó durante 24 h a RT. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (15 mL) y NaHCO3 sat., se agitó durante 10 min y extrajo con DCM (3 x 15 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 4,5 g de gel de sílice modificado con aminopropilo (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 42 mg de ejemplo 12 como un sólido blanco (68 %).

Compuesto 55: (9H-fluoren-9-il)metil ((2S)-1 -(((2S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((1 S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 - triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato

En argón, en un matraz de fondo redondo se introdujeron el ejemplo 12 (42 mg, 57,91 gmol) y DMF (1 mL), posteriormente FmocValAla (34,44 mg, 86,86 gmol), HOBt (13,20 mg, 93,81 gmol), DCM (10 mL) y EDC (10,36 gl, 57.91 gmol). El medio de reacción se agitó durante 3 h a RT y después se diluyó con H²O (15 mL), se agitó durante 10 min a RT y se extrajo con DCM (3 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar 83 mg de compuesto 55 como un sólido blanco (cuant.).

Compuesto 56: (2S)-2-amino-N-((2S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((1 S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida

En un matraz de fondo redondo, se agregó piperidina (57,8 gL, 579,10 gmol) a una disolución de compuesto 55 (64,73 mg, 57,91 gmol) en DCM (10 mL). Después de agitar durante 5 h, se agregaron 57,8 gL de piperidina y el medio se agitó durante toda la noche a RT. El medio de reacción se concentró al vacío y se purificó sobre 15 g de gel de sílice (gradiente DCM/MeOH/H²O) para proporcionar 30 mg de compuesto 56 como un sólido incoloro (58 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,86 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,82 a 0,90 (m, 15 H); 1,00 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,19 (s, 3 H) ; 1,24 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,34 (d, J = 14,6 Hz, 1 H); 1,66 (ancho m, 2 H); 1,80 (m, 1 H); 1.91 (m, 1 H); 1,98 (dd, J = 10,2 y 14,6 Hz, 1 H); 2,27 (m, 1 H); 2,60 (m, 1 H); 2,69 (dd, J = 11,1 y 14,6 Hz, 1 H); 2,91 (dd, J = 2,0 y 7,7 Hz, 1 H); 2,94 (dd, J = 3,7 y 14,6 Hz, 1 H); 2,99 (d, J = 4,9 Hz, 1 H); 3,43 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3.91 (d, J = 2,0 Hz, 1 H); 4,03 a 4,12 (m, 2 H); 4,29 (d, J = 6,2 Hz, 2 H); 4,34 (m, 1 H); 5,03 (m, 1 H); 5,89 (dd, J = 1,8 y 15,6 Hz, 1 H); 6,43 (ddd, J = 4,8, 10,9 y 15,6 Hz, 1 H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,2 y 8,6 Hz, 1 H); 7,22 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,26 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,32 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,86 (d, J = 8,4 Hz, 1 H); 7,92 (d, J = 7,2 Hz, 1 H); 8,07 (ancho d, J = 7,9 Hz, 1 H); 8,40 (d, J = 7,3 Hz, 1 H); 8,45 (t, J = 6,2 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 448 [M+2H]2+; m/z = 893 [M-H]-; m/z = 895 [M+H]+; m/z = 939 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,29 min.

Compuesto 57: ácido 5-(((2S)-1 -(((2S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((1 S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoico

En argón, en un matraz de fondo redondo, una disolución de anhídrido glutárico (4,29 mg, 36,85 pmol) en DCM (2 mL) se agregó a una disolución de compuesto 56 (30 mg, 33,5 pmol) en DCM (6 mL). El medio de reacción se agitó durante 2 h a RT, se concentró parcialmente al vacío y se purificó sobre 2,5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH/H²O) para proporcionar 34 mg de compuesto 57 como una laca incolora (cuant.).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 a 0,89 (m, 18 H); 0,99 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,19 (s, 3 H); 1.24 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,34 (d, J = 14,6 Hz, 1 H); 1,70 (m, 2 H); 1,80 (m, 1 H); 1,97 (m, 2 H); 2,19 (m, 4 H); 2,26 (m, 1 H); 2,60 (m, 1 H); 2,70 (dd, J = 11,2 y 14,6 Hz, 1 H); 2,90 (dd, J = 2,2 y 7,8 Hz, 1 H); 2,95 (dd, J = 3,7 y 14,6 Hz, 1 H); 3,43 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,91 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 4,03 a 4,18 (m, 3 H); 4,22 a 4,33 (m, 3 H); 5,03 (m, 1 H); 5,90 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,43 (ddd, J = 4,9, 11,0 y 15,5 Hz, 1 H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,19 a 7,28 (m, 5 H); 7,32 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 7,85 (ancho d, J = 8,9 Hz, 2 H); 7,91 (d, J = 7,2 Hz, 1 H); 8,06 (ancho d, J = 7,5 Hz, 1 H); 8,36 (ancho t, J = 6,6 Hz, 1 H); 8,42 (d, J = 7,8 Hz, 1 H); 12,10 (ancho m, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 1007 [M-H]-; m/z = 1009 [M+H]+; RT = 1,21 min.

Ejemplo 13: 2,5-dioxopirrolidin-1 -il 5-(((2S)-1 -(((2S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((1 S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoato

En argón, en un matraz de fondo redondo, a una disolución de compuesto 57 (33 mg, 32,69 pmol) en DCM (8 mL) se agregaron DSC (11,72 mg, 45,76 pmol) y DIEA (7,7 pL, 45,76 pmol). El medio de reacción se agitó durante 1 h a RT, se concentró al vacío y se purificó mediante dos cromatografías rápidas sucesivas sobre 2,5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 17,9 mg de ejemplo 13 como un sólido incoloro (49 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,80 a 0,90 (m, 18 H); 1,00 (s, 3 H); 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,19 (s, 3 H); 1.24 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,34 (d, J = 14,6 Hz, 1 H); 1,80 (m, 1 H); 1,83 (m, 2 H); 1,98 (m, 2 H); 2,26 (m, 1 H); 2,29 (m, 2 H); 2,60 (m, 1 H); 2,68 (t, J = 7,5 Hz, 2 H); 2,70 (dd, J = 11,2 y 14,6 Hz, 1 H); 2,80 (s, 4 H); 2,91 (dd, J = 2,2 y 7,6 Hz, 1 H); 2,95 (dd, J = 3,7 y 14,6 Hz, 1 H); 3,43 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,90 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 4,06 a 4,15 (m, 2 H); 4,18 (dd, J = 6,9 y 8,7 Hz, 1 H); 4,21 a 4,33 (m, 3 H); 5,03 (m, 1 H); 5,89 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,43 (ddd, J=4,9, 10,9 y 15,5 Hz, 1 H); 7,02 (d, J=8,7 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1 H); 7,23 (d, J = 8,4 Hz, 2 H); 7,25 (d, J = 8.4 Hz, 2 H); 7,31 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 7,84 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 7,89 (m, 2 H); 8,04 (d, J = 7,5 Hz, 1 H); 8,33 (t, J = 6.5 Hz, 1 H); 8,39 (d, J = 7,6 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 796; m/z = 1104 [M-H]-; m/z = 1106 [M+H]+; m/z = 1150 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,26 min.

Ejemplo 14: mAb-Ej. 13

El método general descrito anteriormente se usó para la preparación del ejemplo 14. Se hicieron reaccionar 60 mg de hu2H11_R35-74 con 200 pL de una disolución 10,05 mM de ejemplo 13 en DMA (5 eq.) durante 2 h. Después de este tiempo, se agregaron 180 pL de la disolución del ejemplo l3 (4,5 eq.) y el medio se agitó durante 2 h. Después de purificación en Superdex 200 pg en tampón B pH 6,5 NMP al 10 %, concentración sobre Amicon Ultra-15, cambio de tampón en PD-10 en tampón B pH 6,5 NMP al 5 % y filtración en Steriflip, se obtuvieron 46 mg del ejemplo 14 como una disolución límpida incolora a una concentración de 2 mg/mL con una DAR de 3,5 (HRMS), una pureza monomérica de 99,7 % y un rendimiento global de 77 %.

SEC-HRMS: espectro para el ADC intacto en la Figura 4; m/z = 149336 (mAb no marcado); m/z = 150328 (D1); m/z = 151319 (D2); m/z = 152311 (D3); m/z = 153302 (D4); m/z = 154295 (D5); m/z = 155290 (D6); m/z = 156282 (D7).

Ejemplo 15: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((S)-1-(3-(4-(hidroximetil)fenil)oxiran-2-il)etil)-3,6,6-trimetil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 15 se preparó siguiendo la vía general B representada en el Esquema 2 y descrita para los ejemplos 4 y 11.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 65/35 mezcla diastereoisomérica; 0,93 a 1,26 (m, 12 H); 1,75 (m, 0,65 H); 1,83 (m, 0,35 H); 2,22 (m, 0,65 H); 2,41 (m, 0,35 H); 2,55 a 2,70 (m, 2 H); 2,81 (d, J = 13,7 Hz, 0,65 H); 2,88 (d, J = 13,7 Hz, 0,35 H); 2,93 (dd, J = 2,1 y 8,2 Hz, 0,65 H); 3,00 (m, 1,35 H); 3,22 a 3,35 (m parcialmente enmascarado, 1 H); 3,77 (d, J = 2,1 Hz, 0,35 H); 3,81 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,1 Hz, 0,65 H); 4,25 a 4,39 (m, 1,65 H); 4,34 (m, 0,35 H); 4,48 (d, J = 6,0 Hz, 0,7 H); 4,50 (d, J = 6,0 Hz, 1,3 H); 5,08 (m, 1 H); 5,17 (t, J = 6,0 Hz, 0,35 H); 5,20 (t, J = 6,0 Hz, 0,65 H); 5,78 (dd, J = 1,9 y 15,5 Hz, 0,65 H); 5,89 (dd, J = 1,9 y 15,5 Hz, 0,35 H); 6,40 (m, 1 H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,16 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 0,65 H); 7,19 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 0,35 H); 7,20 a 7,34 (m, 5 H); 7,58 (ancho d, J = 10,2 Hz, 0,65 H); 7,64 (ancho d, J = 10,2 Hz, 0,35 H); 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 0,65 H); 8,07 (d, J = 8,4 Hz, 0,35 H); 8,35 (d, J = 8,3 Hz, 0,65 H); 8,44 (d, J = 8,3 Hz, 0,35 H). LCMS (A1): ES m/z = 654 [M-H]-; m/z = 656 [M+H]+; RT = 1,06 min.

Ejemplo 16: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((S)-1-(3-(4-(hidroximetil)fenil)oxiran-2-il)etil)-6,6-dimetil-3-isopropyl-1-oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 16 se preparó siguiendo la vía general B representada en el Esquema 2 y descrita para los ejemplos 4 y 11.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 60/40 mezcla diastereoisomérica; 0,72 (d, J = 7,0 Hz, 1,8 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 1,2 H); 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 1,8 H); 0,87 (d, J = 7,0 Hz, 1,2 H); 0,98 (s, 1,8 H); 0,99 (d, J = 7,0 Hz, 1,8 H); 1,01 (s, 1,2 H); 1,05 (d, J = 7,0 Hz, 1,2 H); 1,09 (s, 1,8 H); 1,11 (s, 1,2 H); 1,82 (m, 1 H); 1,91 (m, 0,6 H); 2,01 (m, 0,4 H); 2,30 (m, 1 H); 2,52 a 2,72 (m, 2 H); 2,88 a 3,04 (m, 3 H); 3,25 a 3,35 (m enmascarado, 1 H); 3,79 (d, J = 2,2 Hz, 0,4 H); 3,80 (s, 3 H); 3,88 (d, J = 2,2 Hz, 0,6 H); 4,09 a 4,21 (m, 2 H); 4,48 (d, J = 5,8 Hz, 0,8 H); 4,50 (d, J = 5,8 Hz, 1,2 H); 5,14 a 5,29 (m, 2 H); 5,79 (dd, J = 1,7 y 15,4 Hz, 0,6 H); 5,90 (dd, J = 1,7 y 15,4 Hz, 0,4 H); 6,40 a 6,52 (m, 1 H); 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,10 (dd, J = 2,0 y 10,2 Hz, 1 H); 7,17 (m, 1 H); 7,21 a 7,35 (m, 5 H); 7,70 (d, J = 9,3 Hz, 0,6 H); 7,80 (d, J = 9,3 Hz, 0,4 H); 8,39 (d, J = 8,0 Hz, 0,6 H); 8,44 (d, J = 8,0 Hz, 0,4 H). LCMS (A1): ES m/z = 682 [M-H]-; m/z = 684 [M+H]+; RT = 1,16 min.

Ejemplo 17: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((S)-1-(3-(4-(hidroximetil)fenil)oxiran-2-il)etil)-3-íerc-butil-6,6-dimetil-1-oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 17 se preparó siguiendo la vía general B representada en el Esquema 2 y descrita para los ejemplos 4 y 11.1

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 50/50 mezcla diastereoisomérica; 0,90 (s, 4,5 H); 0,91 (s, 4,5 H); 1,00 (d, J = 7,0 Hz, 1,5 H); 1,03 (s, 1,5 H); 1,05 (s, 1,5 H); 1,06 (d, J = 7,0 Hz, 1,5 H); 1,10 (s, 1,5 H); 1,12 (s, 1,5 H); 1,85 (m, 1H); 2,32 (m, 1 h); 2,55 a 2,72 (m, 2 H); 2,90 a 3,03 (m, 3 H); 3,25 a 3,35 (m enmascarado, 1 H); 3,81 (s, 3 H); 3,90 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 4,15 (m, 1 H); 4,36 (d, J = 10,0 Hz, 0,5 H); 4,43 (d, J = 10,0 Hz, 0,5 H); 4,49 (d, J = 5,9 Hz, 1 H); 4,51 (d, J = 5,9 Hz, 1 H); 5,15 (t, J = 5,9 Hz, 0,5 H); 5,18 (t, J = 5,9 Hz, 0,5 H); 5,29 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 2,0 y 15,4 Hz, 0,5 H); 5,90 (d, J = 15,4 Hz, 0,5 H); 6,39 (m, 1 H); 6,91 (dd, J = 2,5 y 10,4 Hz, 0,5 H); 6,98 (dd, J = 2,5 y 10,4 Hz, 0,5 H); 7,05 (d dividido, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,15 (dd dividido, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1 H); 7,20 a 7,39 (m, 6 H); 8,32 (d, J = 7,9 Hz, 0,5 H); 8,40 (d, J = 7,9 Hz, 0,5 H). LCMS (A4): ES m/z = 696 [M-H]-; m/z = 698 [M+H]+; RT = 4,13-4,16 min.

Ejemplo 18: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6,7-trimetil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 18 se preparó siguiendo la vía general A representada en el Esquema 1 y descrita para el ejemplo 8.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,78 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,87 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,00 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,19 (s, 3 H); 1,30 (m, 1 H); 1,50 a 1,90 (m, 5 H); 2,28 (m, 1 H); 2,55 a 2,76 (m, 2 H); 2,90 a 3,00 (m, 2 H); 3,48 (m, 1 H); 3,70 (s, 2 H); 3,80 (s, 3 H); 3,89 (s, 1 H); 4,02 a 4,15 (m, 2 H); 5,06 (m, 1 H); 5,88 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,47 (m, 1 H); 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,20 (m, 3 H); 7,31 (m, 3 H); 7,80 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,89 (d, J = 7,3 Hz, 1 H); 8,41 (d, J = 8,2 Hz, 1 H).

Ejemplo 19: 2,5-dioxopirrolidin-1 -il 5-(((S)-1 -(((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-3-isobutil-6,6,7-trimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoato

El Ejemplo 19 se preparó según se representa en el Esquema 3 y se describe para los ejemplos 2, 6, 9 y 13. 1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,79 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,81 a 0,89 (m, 18 H); 1,01 (s, 3 H); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,20 (s, 3 H); 1,24 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,31 (m, 1 H); 1,60 a 1,74 (m, 2 H); 1,78 a 1,86 (m, 3 H); 1,96 (m, 1 H); 2,21 a 2,31 (m, 3 H); 2,55 a 2,72 (m, 4 H); 2,80 (s, 4 H); 2,96 (m, 2 H); 3,47 (m, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,89 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 4,03 a 4,14 (m, 2 H); 4,17 (dd, J = 6,8 y 8,6 Hz, 1 H); 4,21 a 4,33 (m, 3 H); 5,06 (m, 1 H); 5,89 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,47 (ddd, J = 5,2, 10,5 y 15,5 Hz, 1 H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,20 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1 H); 7,23 (m, 4 H); 7,32 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 7,80 (d, J = 8,3 Hz, 1 H); 7,89 (m, 2 H); 8,04 (d, J = 7,6 Hz, 1 H); 8,32 (t, J = 6,3 Hz, 1 H); 8,42 (d, J = 7,6 Hz, 1 H). LCMS (A1): ES m/z = 1092 [M+H]+; m/z = 1136 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,23 min.

Ejemplo 20: mAb-Ej. 19

El Ejemplo 20 se preparó de manera similar a los ejemplos 3, 7, 10 y 14. Se obtuvieron 45 mg del ejemplo 20 como una disolución límpida incolora a una concentración de 2,55 mg/mL con una DAR de 4,4 (HRMS), una pureza monomérica de 99,1 % y un rendimiento global de 78 %.

SEC-HRMS: espectro para el ADC intacto en la Figura 5; m/z = 150368 (D1); m/z = 151350 (D2); m/z = 152327 (D3); m/z = 153304 (D4); m/z = 154281 (D5); m/z = 155255 (D6); m/z = 156237(D7); m/z = 157217 (D8).

Ejemplo 21: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1 -(3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-7-ciclopropil-3-isobutil-6,6-dimetil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 21 se preparó siguiendo la vía general A representada en el Esquema 1 y descrita para los ejemplos 1 y 8.

Ejemplo 22: 2,5-dioxopirrolidin-1-il 5-(((S)-1 -(((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-7-ciclopropil-3-isobutil-6,6-dimetil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-5-oxopentanoato

El Ejemplo 22 se preparó según se representa en el Esquema 3 y se describe para los ejemplos 2, 6, 9 y 13. 1H RMN (500 MHz, ó en ppm, DMSO-d6): 0,34 (m, 1 H); 0,66 (m, 1 H); 0,74 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,76 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,78 (s, 3 H); 0,80 (m, 1 H); 0,82 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,08 (s, 3 H); 1,11 (m, 1 H); 1,20 (m, 1 H); 1,23 (d, J = 7,0 Hz, 3 H); 1,43 a 1,54 (m, 2 H); 1,78 (m, 1 H); 1,82 (m, 2 H); 1,98 (m, 1 H); 2,22 (m, 1 H); 2,28 (m, 2 H); 2,65 (m, 3 H); 2,79 (m, 1 H); 2,81 (s, 4 H); 2,97 (dd, J = 2,2 y 7,9 Hz, 1 H); 3,80 (s, 3 H); 3,89 (d, J = 2,2 Hz, 1 H); 4,02 (m, 1 H); 4,17 (dd, J = 6,7 y 8,7 Hz, 1 H); 4,27 (d, J = 6,3 Hz, 2 H); 4,30 (m, 1 H); 4,37 (m, 1 H); 5,10 (m, 1 H); 5,79 (dd, J = 1,8 y 15,5 Hz, 1 H); 6,39 (ddd, J = 4,0, 11,6 y 15,5 Hz, 1 H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1 H); 7,11 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1 H); 7,20 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 7,22 (m, 4 H); 7,46 (s, 1 H); 7,77 (d, J = 9,0 Hz, 1 H); 7,89 (d, J = 8,6 Hz, 1 H); 8,05 (d, J = 7,5 Hz, 1 H); 8,29 (d, J = 7,6 Hz, 1 H); 8,32 (t, J = 6,3 Hz, 1 H).

Ejemplo 23: mAb-Ej. 22

El Ejemplo 23 se preparó de manera similar a los ejemplos 3, 7, 10 y 14. Se obtuvieron 45 mg del ejemplo 23 como una disolución límpida incolora a una concentración de 2,14 mg/mL con una DAR de 3,6 (HRMS), una pureza monomérica de 100 % y un rendimiento global de 75 %.

SEC-HRMS: espectro para ADC intacto en la Figura 6; m/z = 150341 (D1); m/z = 151329 (D2); m/z = 152317 (D3); m/z = 153308 (D4); m/z = 154296 (D5); m/z = 155287 (D6); m/z = 156279 (D7); m/z = 157267 (D8).

Ejemplo 24: (3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(azidometil)fenil)oxiran-2-il)-etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 24 se preparó siguiendo la vía general C representada en el Esquema 3 y descrita para el ejemplo 32.

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,83 (s, 9H); 0,88 (d, J = 6,8 Hz, 3H); 1,00 (s, 3H); 1,03 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,19 (s, 3H); 1,33 (d, J = 14,5 Hz, 1H); 1,84 (m, 1H); 1,97 (dd, J = 9,8 y 14,5 Hz, 1H); 2,27 (dd, J = 11,1 y 14,5 Hz, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 11,1 y 14,2 Hz, 1H); 2,92 (dd, J = 2,1 y 7,7 Hz, 1H); 2,96 (dd, J = 3,6 y 14,2 Hz, 1H); 3,43 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,96 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 4,08 (ddd, J = 3,6, 7,1 y 11,1 Hz, 1H); 4,12 (m, 1H); 4,46 (s, 2H); 5,05 (ddd, J = 1,3, 3,9 y 11,3 Hz, 1H); 5,90 (dd, J = 1,3 y 15,3 Hz, 1H); 6,45 (ddd, J = 4,7, 10,7 y 15,3 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1H); 7,32 (m, 3H); 7,40 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,92 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 8,40 (d, J = 7,4 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 749 [M-H]-; m/z = 751 [M+H]+; m/z = 795 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,52 min.

Ejemplo 25: (3S,7S, 10R, 16S,E)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Ejemplo 25 se preparó según se describe para los ejemplos 1,5, 8 y 11.

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,86 (s, 9H); 0,88 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 0,98 (s, 3H); 1,02 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,18 (s, 3H); 1,34 (d, J = 14,5 Hz, 1H); 1,80 (m, 1H); 1,98 (dd, J = 9,8 y 14,5 Hz, 1H); 2,27 (dd, J = 11,1 y 14,5 Hz, 1H); 2,40 (ancho m, 2H); 2,62 (m, 1H); 2,68 (dd, J = 11,1 y 14,2 Hz, 1H); 2,90 (dd, J = 2,1 y 7,7 Hz, 1H); 2,96 (dd, J = 3,6 y 14,2 Hz, 1H); 3,43 (m, 1H); 3,76 (s, 2H); 3,80 (s, 3H); 3,91 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 4,02 a 4,15 (m, 2H); 5,04 (ddd, J = 1,3, 3,9 y 11,3 Hz, 1H); 5,88 (dd, J = 1,3 y 15,4 Hz, 1H); 6,45 (ddd, J = 4,7, 10,7 y 15,3 Hz, 1H); 7,03 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,2 y 8,5 Hz, 1H); 7,23 (d, J = 8,3 Hz, 2H); 7,32 (d, J = 2,2 Hz, 2H); 7,36 (d, J = 8,3 Hz, 2H); 7,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,93 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 8,40 (d, J = 7,1 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 723 [M-H]-; m/z = 725 [M+H]+; m/z = 769 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,87 min.

Síntesis de los ejemplos 26 a 28: alcohol 3-(S)-neopentil-7-(S)-Me-aza-C52 bencílico. Éster de NHS de alcohol glutaril-Val-Ala-EDA-3-(S)-neopentil-7-(S)-Me-aza-C52 bencílico y ADC correspondiente

Ejem plo 26

Compuesto 58: (2R,3S)-1 -((4-metoxibencil)oxi)-2-metilhex-5-en-3-il (S)-2-((S)-3-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-2,2-dimetilbutanamido)-4,4-dimetilpentanoato

A una disolución de compuesto BC4 (365 mg, 919,7 pmol) en DMF (12 mL) se agregaron HATU (402 mg, 1,06 mmol) y HOAt (144 mg, 1,06 mmol), el medio de reacción se agitó a RT durante 30 min, después se agregaron una disolución de compuesto AD3 ^{( 3 6 5}mg, 965,7 pmol) en DMF (5 mL) y DIEA (562 pL, 3,22 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 4 h, después se diluyó con H²O (50 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (15 mL), salmuera sat. (3 x 15 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante dos cromatografías rápidas sucesivas sobre 30 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH y heptano/EtOAc) para proporcionar 564 mg de compuesto 58 como una espuma incolora (81 %). 1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,83 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 0,85 (s, 9H); 0,87 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,00 (s, 3H); 1,03 (s, 3H); 1,55 (dd, J = 2,4 y 14,5 Hz, 1H); 1,78 (dd, J = 9,5 y 14,5 Hz, 1H); 1,96 (m, 1H); 2,20 (m, 1H); 2,30 (m, 1H); 2,72 (dd, J = 9,6 y 13,9 Hz, 1H); 2,87 (dd, J = 5,3 y 13,9 Hz, 1H); 3,20 (dd, J = 6,5 y 9,5 Hz, 1H); 3,37 (dd, J = 5,4 y 9,5 Hz, 1H); 3,76 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,19 (m, 1H); 4,28 (m, 1H); 4,34 (s, 2H); 4,55 (m, 1H); 4,82 (m, 1H); 5,00 (d, J = 10,2 Hz, 1H); 5,07 (d, J = 17,4 Hz, 1H); 5,55 (dd, J = 2,3 y 10,2 Hz, 1H); 5,71 (m, 1H); 6,01 (dd, J = 2,3 y 17,1 Hz, 1H); 6,28 (dd, J = 10,2 y 17,1 Hz, 1H); 6,90 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,17 (dd, J = 2,3 y 8,6 Hz, 1H); 7,22 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,32 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,65 (d, J = 9,5 Hz, 1H); 7,70 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 8,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 754 [M-H]-; m/z = 756 [M+H]+; m/z = 800 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,62 min.

Compuesto 59: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((R)-1-((4-metoxibencil)oxi)propan-2-il)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de compuesto 58 (560 mg, 740,4 pmol) en DCM (56 mL), se agregó en Ar el catalizador de Grubbs I (31,0 mg, 37,02 pmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 1 h 30 antes de la adición de 31,0 mg de catalizador. Se continuó con la agitación a RT durante 1 h 30 antes de la adición de 31,0 mg de catalizador. Se continuó con la agitación a RT durante 1 h 30 antes de la adición de 31,0 mg de catalizador y el medio de reacción se agitó a RT durante 1 h 30. Se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 25 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 330 mg de compuesto 59 (61%) y 220 mg que se purificaron adicionalmente mediante cromatografía rápida sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 204 mg de compuesto 59 (37 %) como una mezcla con óxido de triciclohexilfosfina.

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (s, 9H); 0,88 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 0,91 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,04 (s, 3H); 1.20 (s, 3H); 1,29 (d, J = 14,5 Hz, 1H); 1,95 (dd, J = 9,8 y 14,5 Hz, 1H); 1,99 (m, 1H); 2,26 (m, 1H); 2,43 (m, 1H); 2,72 (dd, J = 10,1 y 14,3 Hz, 1H); 2,97 (dd, J = 3,6 y 14,3 Hz, 1H); 3,27 (dd, J = 6,1 y 9,3 Hz, 1H); 3,40 (dd, J = 5,8 y 9,3 Hz, 1H); 3,46 (m, 1H) ; 3,72 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,10 (m, 1H); 4,13 (m, 1H); 4,38 (s, 2H); 4,97 (m, 1H); 5,93 (d, J = 15,4 Hz, 1H); 6,43 (ddd, J = 4,8, 10,7 y 15,4 Hz, 1H); 6,90 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,17 (d, J = 8,6 Hz, 3H); 7,36 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,88 (m, 2H); 8,48 (d, J = 7,5 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 726 [M-H]-; m/z = 728 [M+H]+; m/z = 772 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,54 min.

Compuesto 60: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((R)-1 -hidroxipropan-2-il)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

El Compuesto 59 (532 mg, 730,4 pmol) se trató con una disolución de TFA (3,93 mL) en DCM (36 mL) a RT durante 30 min. El medio de reacción se vertió sobre 9 % de NaHCO³ac. (130 mL) con agitación magnética. Se continuó con la agitación durante 30 min, después la fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 70 mL).Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (3 x 20 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 30 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 299 mg de compuesto 60 como una espuma blanca (67 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,88 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 0,89 (s, 9H); 0,90 (d, J = 7,0 Hz, 3H) 1,03 (s, 3H); 1.20 (s, 3H); 1,36 (dd, J = 1,8 y 14,5 Hz, 1H); 1,80 (m, 1H); 1,96 (dd, J = 9. 6 y 14,5 Hz, 1H); 2,25 (m, 1H); 2,43 (m, 1H); 2,72 (dd, J = 11,1 y 14,3 Hz, 1H); 2,97 (dd, J = 3,8 y 14,3 Hz, 1H); 3,25 (m, 1H); 3,45 (m, 2H); 3,80 (s, 3H); 4,10 (m, 1H); 4,16 (m, 1H); 4,57 (t, J = 5,3 Hz, 1H); 4,98 (m, 1H); 5,93 (dd, J = 1,3 y 15,3 Hz, 1H); 6,45 (ddd, J = 4,9, 10,7 y 15,3 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,22 (dd, J = 2,3 y 8,6 Hz, 1H); 7,36 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,89 (m, 2H); 8,48 (d, J = 7,3 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 606 [M-H]-; m/z = 608 [M+H]+; RT = 1,2 min.

Compuesto 61: (S)-2-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9, 12-tetraoxo-1-oxa-4,8, 11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)propanal

A una disolución de compuesto 60 (297 mg, 488,4 pmol) en DCM (6 mL) enfriada con un baño de hielo/acetona se agregaron a 0 °C una disolución de KBr (58,11 mg, 488,4 pmol) en H²O (1,18 mL), TEMPO (1,57 mg, 9,8 pmol) y por goteo una disolución acuosa de hipoclorito de sodio 1,56 M de pH 9,5 (467,6 pL, 732,52 pmol). Se continuó con la agitación a 0 °C durante 15 min, después se agregó a 0 °C Na²S²O³sat. (3,56 mL), el baño de hiel se retiró y el medio de reacción se agitó durante 10 min. A continuación, se extrajo con DCM (3 x 25 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (2 x 10 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 139 mg de compuesto 61 como una laca blanca (47 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (s, 9H); 0,90 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,03 (s, 3H) ; 1,04 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,20 (s, 3H); 1,26 (d, J = 15,3 Hz, 1H); 1,95 (m, 1H); 2,44 (m, 1H); 2,57 (m, 1H); 2,72 (dd, J = 11,2 y 14,4 Hz, 1H); 2,80 (m, 1H); 2,98 (dd, J = 3,1 y 14,4 Hz, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,10 (m, 3H); 5,22 (m, 1H); 5,98 (d, J = 15,3 Hz, 1H); 6,47 (ddd, J = 4,9, 10,8 y 15,3 Hz, 1H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,22 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1H); 7,37 (s, 1H); 7,90 (m, 1H); 7,92 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 8,53 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 9,68 (s, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 604 [M-H]-; m/z = 606 [M+H]+; m/z = 650 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,28 min.

Compuesto 62: (4-(((triisopropilsilil)oxi)metil)fenil)metanol

A una disolución de 1,4-bencenodimetanol (2 g, 14,33 mmol) en THF (100 mL) se agregó imidazol (1,13 g, 16,48 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 15 min, después se agregó cloruro de triisopropilsililo (3,14 mL, 14,33 mmol) y se continuó con la agitación a RT durante toda la noche. Se agregó Et²O (50 mL) a la mezcla de reacción y la fase orgánica se lavó dos veces con salmuera sat. (100 mL), se filtró sobre MgSO4, se concentró al vacío, se disolvió en DCM, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 200 g de gel de sílice (elución isocrática 8:2 heptano/EtOAc) para proporcionar 1,9 g de compuesto 62 como un aceite incoloro (45 %).1

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,04 (d, J = 6,7 Hz, 18H); 1,15 (m, 3H); 4,48 (d, J = 5,7 Hz, 2H); 4,78 (s, 2H); 5,13 (t, J = 5,7 Hz, 1H); 7,29 (s, 4H).

Compuesto 63: ((4-(bromometil)bencil)oxi)triisopropilsilano

A una suspensión de N-bromosuccinimida (1,29 g, 7,16 mmol) en DCM (65 mL) enfriada a 0 °C se agregó por goteo sulfuro de dimetilo (953 pL, 12,9 mmol). Se continuó con la agitación a 0 °C durante 10 min, después el medio de reacción se enfrió a -20 °C y se agitó a -20 °C durante 10 min. A continuación, se agregó por goteo una disolución de compuesto 62 (1,9 g, 6,45 mmol) en DCM (30 mL) enfriada a -20 °C. Se continuó con la agitación a -20 °C durante 15 min, después a 0 °C durante 15 min y a RT durante toda la noche. El medio de reacción se lavó dos veces con salmuera sat. (100 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante dos cromatografías rápidas sucesivas sobre 40 g de gel de sílice (gradiente de elución heptano/EtOAc). Las fracciones que contenían el compuesto esperado se combinaron, se concentraron al vacío y se disolvieron en heptano (8 mL). La suspensión se filtró, el filtrado se concentró al vacío, se disolvió en Et²O (5 mL), se enfrió a -20 °C, se filtró, se concentró al vacío para proporcionar 1,18 g de compuesto 63 como un aceite amarillo pálido (51 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,04 (d, J = 6,8 Hz, 18H); 1,15 (m, 3H); 4,70 (s, 2H); 4,81 (s, 2H); 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,41 (d, J = 8,4 Hz, 2H). LCMS (A5): ES m/z = 104; m/z = 356 [M]+; RT = 1,99 min.

Compuesto 64: (1 R,4S,5R,6S)-4,7,7-trimetil-6-(4-(((triisopropilsilil)oxi)metil)bencil)-6-tiabiciclo[3.2.1]octan-6-io trifluorometanosulfonato

Se agregó a (1R,4R,5R)-4,7,7-trimetil-6-tiabiciclo[3.2.1]octano (número CAS [5718-75-2], 562,3 mg, 3,3 mmol) una disolución de compuesto 63 (1,18 g, 3,3 mmol) en DCM (3,4 mL). A continuación, se agregó una disolución de trifluorometanosulfonato de litio (2,63 g, 16,51 mmol) en H²O (3 mL) por goteo y el medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche. Después se agregaron H²O (15 mL) y DCM (15 mL) al medio de reacción y se continuó con la agitación a RT durante 10 min. La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 20 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (3 x 8 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El aceite amarillo pálido se trituró en iPr²O (5 mL), el sólido obtenido de este modo se filtró, se lavó con iPr²O (2 x 5 mL) y se secó al vacío para proporcionar 1,125 g de compuesto 64 como un sólido blanco (57 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,04 (m, 21H); 1,15 (m, 3H); 1,45 (m, 1H); 1,60 (m, 2H); 1,68 (s, 3H); 1,71 (m, 1H); 1,74 (s, 3H); 1,98 (m, 1H); 2,40 (d, J = 14,6 Hz, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,58 (ancho d, J = 14,6 Hz, 1H); 3,85 (m, 1H); 4,56 (d, J = 12,6 Hz, 1H); 4,83 (s, 2H); 4,90 (d, J = 12,6 Hz, 1H); 7,44 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 2H).

Compuesto 65: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(((triisopropilsilil)oxi)metil)fenil)oxiran-2-il)etil)-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de los compuestos 61 (138 mg, 227,7 pmol) y 64 (149,5 mg, 250,4 pmol) en DCM (4 mL) enfriada a -70 °C se agregó por goteo BEMP (número c As [98015-45-3], 90,2 pL, 296,0 pmol). La mezcla de reacción se agitó a -70 °C durante 2 h, se agregó salmuera sat. (7 mL) a la mezcla de reacción, el baño se retiró y se continuó con la agitación vigorosamente hasta RT. La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 20 mL), las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 10 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 163 mg de compuesto 65 como un aceite incoloro (30 %) y 60 mg de compuesto 61 (43 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,84 (s, 9H); 0,88 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,00 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,1 Hz, 3H); I , 05 (d, J = 7,3 Hz, 18H); 1,15 (m, 3H); 1,19 (s, 3H); 1,32 (d, J = 14,8 Hz, 1H); 1,82 (m, 1H); 1,97 (dd, J = 9,9 y 14,8 Hz, 1H); 2,28 (dt, J = 11,1 y 14,9 Hz, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 11,2 y 14,3 Hz, 1H); 2,91 (dd, J = 2,2 y 7,6 Hz, 1H); 2,95 (dd, J = 3,8 y 14,3 Hz, 1H); 3,43 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,91 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 4,08 (ddd, J = 3,8, 7,4 y I I , 2 Hz, 1H); 4,12 (m, 1H); 4,81 (s, 2H); 5,04 (ddd, J = 1,5, 4,5 y 11,1 Hz, 1H); 5,89 (dd, J = 1,5 y 15,2 Hz, 1H); 6,44 (ddd, J = 4,5, 10,6 y 15,2 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,91 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 8,39 (d, J = 7,4 Hz, 1H). LCMS (A4): ES m/z = 120; m/z = 882 [M+H]+; RT = 7,65 min.

Ejemplo 26: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(hidroximetil)fenil)oxiran-2-il)etil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de compuesto 65 en THF enfriada a 0 °C se agregó TBAF. El medio de reacción se agitó a 0 °C durante 1 h 30, después se agregó H²O (5 mL) y se continuó con la agitación durante 20 min. El medio de reacción se extrajo con DCM (3 x 20 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (3 x 5 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución EtOAc/MeOH/H²O) para proporcionar 69 mg del ejemplo 26 como una laca blanca (91 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (s, 9H); 0,89 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,00 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,19 (s, 3H); 1,35 (d, J = 14,8 Hz, 1H); 1,80 (m, 1H); 1,99 (dd, J = 9,9 y 14,8 Hz, 1H); 2,27 (dt, J = 11,1 y 14,9 Hz, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 11,2 y 14,3 Hz, 1H); 2,90 (dd, J = 2,2 y 7,6 Hz, 1H); 2,95 (dd, J = 3,8 y 14,3 Hz, 1H); 3,43 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,91 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 4,06 a 4,15 (m, 2H); 4,50 (d, J = 5,9 Hz, 2H); 5,03 (dd, J = 1,5, 3,7 y 11,5 Hz, 1H); 5,20 (t, J = 5,9 Hz, 1H); 5,89 (dd, J = 1,5 y 15,3 Hz, 1H); 6,43 (ddd, J = 4,6, 10,7 y 15,3 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,2 y 8,6 Hz, 1H); 7,23 (d, J = 8,3 Hz, 2H); 7,32 (m, 3H); 7,87 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,92 (d, J = 7,0 Hz, 1H); 8,40 (d, J = 7,4 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 724 [M-H]-; m/z = 726 [M+H]+; m/z = 770 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,29 min.

Compuesto 66: 4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxi ran-2-il)bencil (4-nitrofenil) carbonato

A una disolución del ejemplo 26 (68 mg, 93,6 pmol) en DCM (5 mL) se agregaron bis (4-nitrofenil)carbonato (118,7 mg, 374,5 pmol) y por goteo DIEA (49 pL, 281,0 pmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 6 d, después se agregó salmuera sat. y se extrajo con DCM (3 x 10 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSCU, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 79 mg de compuesto 66 como una laca blanca (94 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (s, 9H); 0,89 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,00 (s, 3H); 1,05 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,19 (s, 3H); 1,34 (d, J = 14,6 Hz, 1H); 1,83 (m, 1H); 1,97 (dd, J = 9,9 y 14,6 Hz, 1H); 2,28 (dt, J = 11,1 y 14,9 Hz, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 11,2 y 14,3 Hz, 1H); 2,93 (m, 2H); 3,42 (m, 1H); 3,79 (s, 3H); 3,99 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 4,09 (m, 2H); 5,05 (dd, J = 1,3, 4,0 y 11,1 Hz, 1H); 5,31 (s, 2H); 5,89 (dd, J = 1,3 y 15,3 Hz, 1H); 6,47 (ddd, J = 4,8, 10.8 y 15,3 Hz, 1H); 7,01 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,21 (dd, J = 2,2 y 8,6 Hz, 1H); 7,31 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,36 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,50 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,59 (d, J = 9,3 Hz, 2H); 7,87 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,92 (d, J = 7,0 Hz, 1H); 8,32 (d, J = 9,3 Hz, 2H); 8,39 (d, J = 7,4 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 889 [M-H]-; m/z = 891 [M+H]+; m/z = 935 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,55 min.

Compuesto 67: clorhidrato de (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((2-NBoc-aminoetil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato

A una suspensión de Fmoc-Val-Ala-OH (3,5 g, 8,53 mmol) en DCM (100 mL) se agregaron TEA (3,6 mL, 25,58 mL) que conduce a la disolución completa del material de partida, N-Boc-EDA (1,62 mL, 10,23 mmol) y una disolución de anhídrido propilfosfónico (6,51 g, 10.23 mmol) al 50 % en DCM. El medio de reacción se agitó a RT durante 3 h, después se agregó NaCH 1N (50 mL) y la suspensión se filtró, se lavó con H²O y DCM. La fase orgánica del filtrado se lavó con H²O. La torta y la fase orgánica se combinaron, se concentraron parcialmente al vacío, se filtraron, se lavaron con DCM y se secaron para proporcionar 3,952 g de compuesto 67 como un polvo blanco (84 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,84 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,19 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,37 (s, 9H); 1,99 (m, 1H); 2,92 a 3,14 (m, 4H); 3,88 (dd, J = 6,9 y 9,1 Hz, 1H); 4,19 a 4,35 (m, 4H); 6,71 (m, 1H); 7,32 (m, 2H); 7,38 (m, 1H); 7,42 (m, 2H); 7,73 (m, 2H); 7,84 (t, J = 6,8 Hz, 1H); 7,89 (d, J = 7,8 Hz, 2H); 7,92 (d, J = 7.8 Hz, 1H).

Compuesto 68: clorhidrato de (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((2-aminoetil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1 -oxobutan-2-il)carbamato

A una suspensión de compuesto 67 (100 mg, 159,5 pmol) en dioxano (3 mL) se agregó HCl 4N en dioxano (905 pL, 3,62 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 20 h, después se concentró al vacío. El producto bruto se resuspendió en iPr²O (3 mL), se sumergió en un baño ultrasónico y se filtró. La torta obtenida de este modo se lavó con iPr²O (2 x 3 mL) y se secó al vacío para proporcionar 78 mg de compuesto 68 como un sólido blanco (88 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,85 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 0,87 (d, J = 6,9 Hz, 3H); 1,23 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,99 (m, 1H); 2,83 (m, 2H); 3,29 (m, 2H); 3,89 (dd, J = 6,9 y 8,9 Hz, 1H); 4,19 a 4,38 (m, 4H); 7,33 (m, 2H); 7,42 (m, 3H); 7,75 (m, 2H); 7,88 (ancho s, 3H); 7,90 (d, J = 7,6 Hz, 2H); 8,08 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 8,14 (d, J = 5,9 Hz, 1H).

Compuesto 69: 4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16il)etil)oxiran 2-yil)bencil (2-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)etil)carbamato

A una suspensión de los compuestos 66 (78 mg, 87,5 pmol) y 68 (51,4 mg, 105,0 pmol) en DCM se agregó DIEA (44,0 pL, 262,5 pmol). El medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche, después se agregó el compuesto 68 (24 mg, 49 pmol) y DIEA (15 pL) y se continuó con la agitación a RT durante 1 d. Se agregó piperidina (87,0 pL, 875,0 pmol) y se continuó con la agitación a RT durante toda la noche. El medio de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante dos cromatografías rápidas sucesivas sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución EtOAc/MeOH/H2O) para proporcionar 57 mg de compuesto 69 como una laca blanca (66 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,75 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,85 (s, 9H); 0,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,87 (d, J = 6,7 Hz, 3H); 0,99 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,18 (m, 6H); 1,33 (d, J = 14,5 Hz, 1H); 1,75 (ancho s, 2H); 1,81 (m, 1H); 1,92 (m, 1H); 1,98 (dd, J = 10,0 y 14,5 Hz, 1H); 2,28 (m, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 11,3 y 14,7 Hz, 1H); 2,90 (dd, J = 2,0 y 7,5 Hz, 1H); 2,96 (m, 1H); 2,98 (d, J = 4,7 Hz, 1H); 3,05 (m, 2H); 3,12 (m, 2H); 3,43 (m, 1H); 3,81 (s, 3H); 3,93 (d, J = 2,0 Hz, 1H); 4,09 (m, 2H); 4,26 (m, 1H); 5,01 (s, 2H); 5,04 (m, 1H); 5,89 (dd, J = 1,5 y 15,2 Hz, 1H); 6,45 (ddd, J = 4,5, 10,4 y 15,2 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,4 y 8,8 Hz, 1H); 7,26 (t, J = 6,0 Hz, 1H); 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,32 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 7,37 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,93 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 8,00 (t, J = 6,0 Hz, 1H); 8,03 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 8,41 (d, J = 7,2 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 492 [M+2H]2+; m/z = 980 [M-H]-; m/z = 982 [M+H]+; m/z = 1026 [M-H+HCO²H]-; RT = 0,91 min.

Compuesto 70: ácido (9S,12S)-1 -(4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)fenil)-12-isopropil-9-metil-3,8,11,14-tetraoxo-2-oxa-4,7,10,13-tetraazaoctadecan-18-oico

A una disolución de compuesto 69 (56,0 mg, 56,8 gL) en DCM (8 mL) se agregó una disolución de anhídrido glutárico (7,27 mg, 62,5 gmol) en DCM (4 mL). El medio de reacción se agitó a RT durante 2 h, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH/hbO) para proporcionar 35,5 mg de compuesto 70 como una laca blanca (56 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,81 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,83 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,85 (s, 9H); 0,87 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 0,99 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,19 (m, 6H); 1,32 (d, J = 14,3 Hz, 1H); 1,70 (m, 2H); 1,81 (m, 1H); 1,92 (m, 1H); 1,98 (m, 2H); 2,15 (m, 2H); 2,19 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 2,27 (m, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 11,1 y 14,1 Hz, 1H); 2,91 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 2,95 (m, 1H); 3,04 (m, 2H); 3,10 (m, 2H); 3,41 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,93 (s, 1H); 4,03 a 4,16 (m, 3H); 4,19 (m, 1H); 5,01 (s, 2H); 5,04 (m, 1H); 5,89 (d, J = 15,6 Hz, 1H); 6,43 (ddd, J = 5,3, 11,0 y 15,6 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1H); 7,28 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,30 (m, 1H); 7,32 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,88 (m, 2H); 7,93 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,98 (ancho s, 1H); 8,06 (ancho s, 1H); 8,42 (d, J = 7,4 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 549 [M+2H]2+; m/z = 1094 [M-H]-; m/z = 1096 [M+H]+; RT = 1,21 min.

Ejemplo 27: 2,5-dioxopirrolidin-1-il (9S,12S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)fenil)-12-isopropil-9-metil-3,8,11,14-tetraoxo-2-oxa-4,7,10,13-tetraazaoctadecan-18-oato

A una disolución de compuesto 70 (14,6 mg, 13,3 gmol) en DCM (5 mL) en Ar se agregaron DSC (4,3 mg, 16,0 gmol) y DIEA (2,8 gL, 16,0 gmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 3 h, después se agregó DSC (1,5 mg, 5.6 gmol) y DIEA (1 gL, 5,7 gmol) y se continuó con la agitación a RT durante 1 h. El medio de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 16,4 g de gel de sílice modificado con diol (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 11,4 mg de ejemplo 27 como una laca blanca (72 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,81 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,83 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,85 (s, 9H); 0,88 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,99 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,19 (m, 6H); 1,34 (d, J = 14,4 Hz, 1H); 1,83 (m, 3H); 1,98 (m, 2H); 2,26 (m, 1H); 2,29 (m, 2H); 2,60 (m, 1H); 2,68 (t, J = 7,6 Hz, 2H); 2,70 (dd, J = 11,2 y 14,3 Hz, 1H); 2,80 (s, 4H); 2,91 (dd, J = 2,3 y 7,6 Hz, 1H); 2,95 (dd, J = 3,7 y 14,3 Hz, 1H); 2,99 a 3,20 (m, 4H); 3,43 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,93 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 4,05 a 4,25 (m, 4H); 5,01 (m, 2H); 5,03 (m, 1H); 5,89 (dd, J = 1,6 y 15,4 Hz, 1H); 6,44 (ddd, J = 4,6, 10,9 y 15,4 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 7,20 (m, 2H); 7,28 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,31 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,37 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,86 (m, 3H); 7,91 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 7,95 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 8,39 (d, J = 7,3 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 311; m/z = 1191 [M-H]-; m/z = 1193 [M+H]+; m/z = 1237 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,26 min.

Ejemplo 28: mAb-Ej. 27

El Ejemplo 28 se preparó de manera similar a los ejemplos 3, 7, 10 y 14. Se obtuvieron 1,56 mg del ejemplo 28 como una disolución límpida incolora a una concentración de 0,78 mg/mL con una DAR de 4 (HRMS), una pureza monomérica de 100 % y un rendimiento global de 13 %.

SEC-HRMS: m/z = 149405 (mAb no marcado); m/z = 150486 (D1); m/z = 151568 (D2); m/z = 152645 (D3); m/z = 153725 (D4); m/z = 154802 (D5); m/z = 155882 (D6); m/z = 156961 (D7); m/z = 158039 (D8).

Síntesis del ejemplo 29: amina maleimido-mc-vc-PABA-3-(S)-neopentil-7-(S)-Me-aza-C52 bencílica

Compuesto 71: 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil (4-nitrofenil)

El Compuesto 72 se preparó según se describe mediante Verma V.A., et al., en Bioorg Med Chem Lett 2015, 25, 864-868.

1H RMN (400 MHz, 6 en ppm, DMSO-d6): 0,83 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,87 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,18 (m, 2H); 1,31 a 1,75 (m, 8H); 1,96 (m, 1H); 2,10 (m, 1H); 2,18 (m, 1H); 2,96 (m, 1H); 3,01 (m, 1H); 3,37 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 4,19 (dd, J = 7,0 y 8,6 Hz, 1H); 4,38 (m, 1H); 5,24 (s, 2H); 5,42 (s, 2H); 5,98 (t, J = 6,0 Hz, 1H); 7,00 (s, 2H); 7,40 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,57 (d, J = 9,2 Hz, 2H); 7,66 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,81 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 8,12 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 8,31 (d, J = 9,2 Hz, 2H); 10,08 (s, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 738 [M+H]+; m/z = 782 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,1 min.

Ejemplo 29: 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil (4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)carbamato

Al compuesto 71 (16,0 mg, 21,7 pmol) se agregaron una disolución del ejemplo 25 (14,3 mg, 19,7 pmol)en DCM (2,5 mL) y DIEA (3,4 pL, 19,7 pmol). El medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche, después se agregó DMF (1 mL) y se continuó con la agitación a RT durante 1 d. Se agregó H²O (8 mL) al medio de reacción, se continuó con la agitación durante 15 min, después la fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 10 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío, se coevaporaron dos veces con tolueno y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 15,8 mg del ejemplo 29 como un sólido blanco (60 %).

1H RMN (400 MHz, 6 en ppm, DMSO-d6): 0,81 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 0,86 (s, 9H); 0,89 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 0,99 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,18 (s, 3H); 1,19 (m, 2H); 1,31 a 1,75 (m, 9H); 1,80 (m, 1H); 1,96 (m, 2H) 2,10 (m, 1H); 2,18 (m, 1H); 2,27 (m, 1H); 2,61 (m, 1H); 2,69 (dd, J = 10,8 y 14,3 Hz, 1H); 2,90 (dd, J = 2,1 y 7,6 Hz, 1H); 2,96 (m, 2H); 3,01 (m, 1H); 3,37 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 3,42 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,90 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 4.08 (m, 1H); 4,11 (m, 1H); 4,20 (m, 3H); 4,39 (m, 1H); 4,97 (s, 2H); 5,04 (m, 1H); 5,40 (s, 2H); 5,89 (dd, J = 1,7 y 15,5 Hz, 1H); 5,97 (t, J = 6,2 Hz, 1H); 6,45 (ddd, J = 4,8, 10,7 y 15,5 Hz, 1H); 6,99 (s, 2H); 7,01 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1H); 7,21 a 7,30 (m, 6H); 7,31 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,78 (m, 2H); 7,85 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 7,90 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 8,07 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 8,39 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 9,97 (s, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 662 [M+2H]2+; m/z = 1322 [M-H]-; m/z = 1324 [M+H]+; m/z = 1368 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,3 min.

Síntesis de los ejemplos 30 y 31: Éster de NHS de triazol-3-(S)-neopentil-7-(S)-Me-aza-C52 no escindible y ADC correspondiente

Compuesto 72: 3-(prop-2-in-1-iloxi)propanoato de tere-butilo

A una disolución de alcohol propargílico (1,362 mL, 23,4 mmol) en THF (23 mL) se agregó sodio (20,08 mg, 0,874 mmol), el medio de reacción se calentó a 60 °C hasta la solubilización completa del sodio, después se enfrió hasta RT antes de la adición de acrilato de tere-butilo (2,286 mL, 15,6 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche, después se agregó H²O (25 mL) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 25 mL). La fase orgánica combinada se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 2 g de compuesto 72 como un aceite incoloro (70 %).

Compuesto 73: ácido 3-(prop-2-in-1-iloxi)propanoico

A una disolución de compuesto 72 (2,0 g, 10,86 mmol) en DCM (50 mL) se agregó TFA (8,065 mL, 108,6 mmol). El medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche, se concentró al vacío, se coevaporó con tolueno y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 80 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 1,1 g de compuesto 73 como un aceite (80 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 2,46 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 3,43 (t, J = 2,4 Hz, 1H); 3,63 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 4,11 (d,J = 2,4 Hz, 2H); 12,20 (ancho, 1H).

Compuesto 74: ácido 3-((1 -(4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)-1 H-1 ,2,3-triazol-4-il)metoxi)propanoico

A una disolución del ejemplo 24 (50 mg, 66,6 gmol) en THF (0,5 mL) se agregaron el compuesto 73 (17,05 mg, 113,1 gmol), sulfato de cobre (II) ac. 0,1 M (266 gL, 26,6 gmol) y ascorbato de sodio ac. 0,2 M (266 gL, 53,2 gmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 1 d, después se agregó H²O (1 mL) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 1 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat., se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante filtración sobre Sephadex LH20 (elución de DCM) para proporcionar 40 mg de un aceite que se purificó adicionalmente mediante cromatografía rápida sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 20 mg de compuesto 74 (35 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,82 (s, 9H); 0,88 (d, J = 6,7 Hz, 3H); 1,00 (s, 3H); 1,04 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,18 (s, 3H); 1,31 (d, J = 14,6 Hz, 1H); 1,80 (m, 1H); 1,97 (dd, J = 10,0 y 14,6 Hz, 1H); 2,25 (m, 1H); 2,42 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 2,60 (m, 1H); 2,70 (dd, J = 10,9 y 14,4 Hz, 1H); 2,90 (dd, J = 2,2 y 7,6 Hz, 1H); 2,95 (dd, J = 3,6 y 14,4 Hz, 1H); 3,44 (m, 1H); 3,62 (t, J = 6,62H); 3,80 (s, 3H); 3,94 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 4,08 (m, 2H); 4,49 (s, 2H); 5,03 (m, 1H); 5,59 (s, 2H); 5,89 (dd, J = 1,7 y 15,3 Hz, 1H); 6,43 (ddd, J = 4,8, 10,8 y 15,3 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1H); 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,32 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,90 (d, J = 7,0 Hz, 1H); 8,13 (s, 1H); 8,46 (m, 1H); 12,20 (ancho, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 440 [M+2H]2+; m/z = 877 [M-H]-; m/z = 879 [M+H]+; RT = 1,24 min.

Ejemplo 30: 2,5-dioxopirrolidin-1 -il 3-((1 -(4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6,6,7-trimetil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)etil)oxiran-2-il)bencil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metoxi)propanoato

A una disolución de compuesto 74 (20 mg, 22,7 gmol) en DCM (5 mL) se agregaron DIEA (5,0 gL, 28,5 gmol) y DSC (6,34 mg, 23,8 gmol). El medio de reacción se agitó RT durante 3 h, después se agregó DSC (3 mg, 11,3 gmol) y DIEA (5 gL, 28,5 gmol) y se continuó con la agitación a RT durante 2 h. El medio de reacción después se concentró al vacío y se purificó mediante dos cromatografías rápidas sucesivas sobre 1,5 g de gel de sílice modificado con diol (gradiente de elución DCM/iPrOH) para proporcionar 11,5 mg del ejemplo 30 (50 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,83 (s, 9H); 0,87 (d, J = 6,6 Hz, 3H); 0,99 (s, 3H); 1,03 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1.04 (d, J = 6,6 Hz, 3H); 1,19 (s, 3H); 1,32 (d, J = 14,5 Hz, 1H); 1,81 (m, 1H); 1,96 (dd, J = 10,2 y 14,5 Hz, 1H); 2,25 (m, 1H); 2,60 (m, 1H); 2,70 (dd, J = 11,2 y 14,5 Hz, 1H); 2,80 (s, 4H); 2,90 (dd, J = 2,0 y 7,4 Hz, 1H); 2,94 (t, J = 6,1 Hz, 2H); 2,97 (dd, J = 3,6 y 14,1 Hz, 1H); 3,42 (m, 1H); 3,74 (t, J = 6,1 Hz, 2H); 3,80 (s, 3H); 3,92 (d, J = 2,0 Hz, 1H); 4,09 (m, 2H); 4,55 (s, 2H); 5,03 (m, 1H); 5,59 (s, 2H); 5,89 (dd, J = 1,6 y 15,2 Hz, 1H); 6,44 (ddd, J = 4,7, 10,6 y 15,2 Hz, 1H); 7,02 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,20 (dd, J = 2,4 y 8,6 Hz, 1H); 7,29 (d, J = 8,3 Hz, 2H); 7,32 (m, 3H); 7,86 (d, J = 8.4 Hz, 1H); 7,90 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 8,14 (s, 1H); 8,39 (d, J = 7,5 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 120; m/z = 974 [M-H]-; m/z = 976 [M+H]+; m/z = 1020 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,29 min.

Ejemplo 31: mAb-Ej. 30

El Ejemplo 31 se preparó de manera similar a los ejemplos 3, 7, 10 y 14. Se obtuvieron 5,4 mg del ejemplo 31 como una disolución límpida incolora a una concentración de 1,8 mg/mL con una DAR de 4 (HRMS), una pureza monomérica de 98,1 % y un rendimiento global de 45 %.

SEC-HRMS: m/z = 149399 (mAb no marcado); m/z = 150245 (D1); m/z = 151101 (D2); m/z = 151965 (D3); m/z = 152831 (D4); m/z = 153679 (D5); m/z = 154546 (D6); m/z = 155408 (D7); m/z = 156273 (D8); m/z = 157284(D9).

Síntesis del ejemplo 32: amina 3-(S)-neopentil-6-Me-6-CH2OH-aza-C52 bencílica

Compuesto 75: (2R,3S)-1 -((4-metoxibencil)oxi)-2-metilhex-5-en-3-il (2S)-2-((4-((R)-2-acrilamido-3-(3-cloro-4-metoxifenil)propanamido)-3-(hidroximetil)-3-metil-2-oxobutil)amino)-4,4-dimetilpentanoato

A una disolución de compuesto BC6 (385,6 mg, 773,5 pmol) en DMF (12 mL) se agregaron HATU (348,7 mg, 889,5 pmol) y HOAt (122,3 mg, 889,5 pmol). El medio de reacción se agitó a RT durante 30 min, después se agregaron una disolución de compuesto AD3 (292 mg, 773,5 pmol) en DMF (5 mL) y DIEA (475,2 pL, 2,71 mmol) y se continuó con la agitación a RT durante 4 h. Se agregó H²O (50 mL) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (15 mL), salmuera sat. (3 x 15 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 30 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 383 mg de compuesto 75 como un aceite amarillo (65 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 55/45 mezcla diastereoisomérica; 0,85 a 0,88 (m, 12H); 0,91 (s, 1,65H);

0,92 (s, 1,35H); 1,56 (m, 1H); 1,60 (m, 1H); 1,98 (m, 1H); 2,21 (m, 1H); 2,30 (m, 1H); 2,71 (m, 1H); 2,92 (m, 1H);

3,19 a 3,45 (m, 6H); 3,73 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,29 (m, 1H); 4,33 (m, 2H); 4,58 (m, 1H); 4,82 (m, 1H); 4,95 a 5,09 (m, 3H); 5,55 (dd, J = 2,2 y 10,2 Hz, 1H); 5,71 (m, 1H); 6,01 (dd, J = 2,2 y 17,2 Hz, 1H); 6,23 (dd, J = 10,2 y 17,2 Hz, 1H);

6,89 (m, 2H); 7,01 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,17 (dd, J = 2,2 y 8,6 Hz, 1H); 7,21 (m, 2H); 7,34 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,82 (d, J = 8,0 Hz, 0,45H); 7,84 (d, J = 8,0 Hz, 0,55H); 7,98 (t, J = 6,5 Hz, 0,45H); 8,00 (t, J = 6,5 Hz, 0,55H); 8,39 (d, J = 8,6 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 756 [M-H]-; m/z = 758 [M+H]+; m/z = 802 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,54-1,56 min.

Compuesto 76: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6-(hidroximetil)-16-((R)-1-((4-metoxibencil)oxi)propan-2-il)-6-metil-3-neopentil-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de compuesto 75 (380 mg, 501,1 pmol) en DCM (38 mL) en Ar se agregó el catalizador de Grubbs I (20,97 mg, 25,05 pmol). El medio de reacción se agitó en Ar a RT durante 4 h, después se agregó el catalizador de Grubbs I (20,97 mg, 25,05 pmol). Se continuó con la agitación a RT durante 3 h, después se agregó el catalizador de Grubbs I (20,97 mg, 25,05 pmol) y se continuó con la agitación a RT. Después de 24 h de reacción, se agregó el catalizador de Grubbs I (20,97 mg, 25,05 pmol) y se continuó con la agitación durante 4 h. El medio de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía rápida sobre 20 g de gel de sílice (elución isocrática heptano/EtOAc) para proporcionar 170 mg de compuesto 76 estereómero 1 (56 %) y 138 mg de compuesto 76 estereómero 2 (37 %).

Compuesto 76 estereómero 1

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,83 (s, 9H); 0,91 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,02 (s, 3H); 1,30 (dd, J = 2,4 y 14,6 Hz, 1H); 1,53 (dd, J = 9,9 y 14,6 Hz, 1H); 1,99 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,67 (m, 1H); 2,91 (dd, J = 3,0 y 13,7 Hz, 1H); 2,97 (dd, J = 4,0 y 14,5 Hz, 1H); 3,17 a 3,49 (m, 5H); 3,72 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,18 (m, 1H); 4,37 (m, 2H); 4,50 (td, J = 2,4 y 9,6 Hz, 1H); 5,00 (m, 3H); 5,82 (dd, J = 1,9 y 15,4 Hz, 1H); 6,39 (ddd, J = 4,2, 11,6 y 15,4 Hz, 1H); 6,90 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,04 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,12 (m, 1H); 7,15 (dd, J = 2,3 y 8,6 Hz, 1H); 7,21 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,28 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 8,09 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,38 (d, J = 8,0 Hz, 1H). LCMS (A4): ES m/z = 728 [M-H]-; m/z = 730 [M+H]+; m/z = 774; rT = 5,15 min.

Compuesto 76 estereómero 2

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,83 (s, 9H); 0,88 (s, 3H); 0,91 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,28 (dd, J = 2,4 y 14,6 Hz, 1H); 1,67 (dd, J = 9,9 y 14,6 Hz, 1H); 1,99 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,67 (m, 1H); 3,02 (dd, J = 3,3 y 14,2 Hz, 1H); 3,08 (dd, J = 1,9 y 13,5 Hz, 1H); 3,25 a 3,42 (m, 4H); 3,55 (dd, J = 5,1 y 11,0 Hz, 1H); 3,73 (s, 3H); 3,81 (s, 3H); 4,17 (m, 1H); 4,37 (m, 2H); 4,44 (td, J = 2,1 y 9,3 Hz, 1H); 4,80 (t, J = 5,1 Hz, 1H); 5,00 (m, 2H); 5,86 (dd, J = 1,6 y 15,1 Hz, 1H); 6,38 (ddd, J = 4,0, 11,4 y 15,3 Hz, 1H); 6,90 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,19 (dd, J = 2,2 y 8,7 Hz, 1H); 7,22 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 7,30 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,42 (d, J = 10,4 Hz, 1H); 7,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H); 8,45 (d, J = 8,0 Hz, 1H). LCMS (A4): ES m/z = 728 [M-H]-; m/z = 730 [M+H]+; m/z = 774; RT = 4,79 min.

Compuesto 77: (3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((R)-1 -((4-metoxibencil)oxi)propan-2-il)-6-metil-3-neopentil-6-(((trietilsilil)oxi)metil)-1-oxa-4,8,11-triaza-ciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de compuesto 76 estereómero 1 (170 mg, 232,8 pmol) en DCM (3 mL) enfriada con un baño de hielo se agregaron a 4 °C clorotrietilsilano (159,3 pL, 931,1 pmol) TEA por goteo (131,1 pL, 931,1 pmol). El medio de reacción se agitó a 4 °C durante 30 min, después a RT durante 20 h. El medio de reacción se diluyó con DCM (50 mL) y salmuera (10 mL) y se continuó con la agitación durante 10 min. La fase orgánica se lavó con salmuera sat. (2 x 10 mL), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío. El otro diastereoisómero del compuesto 76 (138 mg, 189,0 pmol) se protegió de manera similar, ambos lotes se agruparon y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 20 g de gel de sílice (elución isocrática heptano/EtOAc) para proporcionar 139 mg de compuesto 77 estereómero 1 como una espuma incolora (39 %) y 107 mg de compuesto 77 estereómero 2 como una espuma incolora (30 %).

Compuesto 77 estereómero 1

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,62 (c, J = 8,1 Hz, 6H); 0,83 (s, 9H); 0,91 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 0,96 (t, J = 8.1 Hz, 9H); 1,04 (s, 3H); 1,66 (dd, J = 3,4 y 14,4 Hz, 1H); 1,43 (dd, J = 9,3 y 14,4 Hz, 1H); 1,99 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 2,47 (m, 1H); 2,68 (m, 1H); 2,92 (dd, J = 3,0 y 13,5 Hz, 1H); 2,99 (dd, J = 4,0 y 14,8 Hz, 1H); 3,21 a 3,40 (m, 3H); 3,48 (m, 1H); 3,63 (d, J = 10,3 Hz, 1H); 3,73 (s, 3H); 3,81 (s, 3H); 4,17 (m, 1H); 4,36 (m, 2H); 4,51 (td, J = 2,9 y 9,4 Hz, 1H); 5,02 (m, 1H); 5,82 (dd, J = 1,8 y 15,4 Hz, 1H); 6,39 (ddd, J = 4,3, 11,6 y 15,4 Hz, 1H); 6,89 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,02 (m, 1H); 7,04 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,15 (dd, J = 2,3 y 8,7 Hz, 1H); 7,21 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 7,29 (d, J = 2.3 Hz, 1H); 7,96 (d, J = 9,4 Hz, 1H); 8,31 (d, J = 8,0 Hz, 1H). LCMS (A4): ES m/z = 842 [M-H]-; m/z = 844 [M+H]+; m/z = 888 [M-H+HCO²H]-; RT = 7,08 min.

Compuesto 77 estereómero 2

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,52 (c, J = 8,1 Hz, 6H) 0,84 (s, 9H); 0,88 a 0,93 (m, 15H); 1,29 (dd, J = 2,6 y 14,5 Hz, 1H); 1,68 (dd, J = 10,1 y 14,5 Hz, 1H); 1,99 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 2,47 (m, 1H); 2,68 (m, 1H); 3,01 (dd, J = 3,4 y 14,5 Hz, 1H); 3,15 (d, J = 12,8 Hz, 1H); 3,33 (m, 1H); 3,48 (d, J = 10,4 Hz, 1H); 3,73 (s, 3H); 3,81 (s, 3H); 3,83 (d, J = 10,4 Hz, 1H); 4,17 (m, 1H); 4,36 (m, 2H); 4,45 (td, J = 2,4 y 9,2 Hz, 1H); 5,01 (m, 1H); 5,84 (dd, J = 1,8 y 15.3 Hz, 1H); 6,39 (ddd, J = 3,9, 11,4 y 15,3 Hz, 1H); 6,90 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,19 (dd, J = 2.2 y 8,6 Hz, 1H); 7,22 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 7,30 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,47 (d, J = 10,4 Hz, 1H); 8,01 (d, J = 9,2 Hz, 1H); 8,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H). LCMS (A4): ES m/z = 842 [M-H]-; m/z = 844 [M+H]+; m/z = 888 [M-H+HCO²H]-; RT = 6,88 min.

Compuesto 78: 3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-16-((R)-1 -hidroxipropan-2-il)-6-metil-3-neopentil-6-(((trietilsilil)oxi)metil)-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de ambos diastereoisómeros del compuesto 77 (245 mg, 290,1 pmol) en DCM (10 mL) y H²O (2,5 mL) enfriada con un baño de hielo/acetona se agregaron DDQ (339,4 mg, 1,45 mmol) y 2,6-di-ferc-butilpiridina (171,7 mg, 870,3 pmol). El medio de reacción se agitó a 0 °C durante 2 h, después se diluyó con NaHCO3 ac. (10 mL) y DCM (10 mL) y se continuó la agitación durante 10 min. La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 20 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (3 x 5 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 20 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 155 mg de compuesto 78 como una espuma blanca (74 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,49 a 0,65 (m, 6H); 0,80 a 1,07 (m, 24H); 1,35 a 1,71 (m, 2H); 1,83 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 2,47 (m, 1H ; 2,68 (m, 1H); 2,90 a 3,50 (m, 5,96H); 3,65 (d, J = 10,6 Hz, 0,52H); 3,80 (s, 3H); 3,82 (d, J = 10,6 Hz, 0,52H); 4,18 (m, 1H); 4,29 a 4,70 (m, 2H); 5,02 (m, 1H); 5,80 a 5,89 (m, 1H); 6,05 (m, 0,11H); 6,39 (m, 0,89H); 6,98 a 7,31 (m, 3,48H); 7,47 (d, J = 10,6 Hz, 0,52H); 7,87 (d, J = 9,4 Hz, 0,11H); 7,96 (d, J = 9,4 Hz, 0,52H); 8,00 (d, J = 9,4 Hz, 0,37H); 8,31 (d, J = 8,0 Hz, 0,63H); 8,42 (d, J = 8,4 Hz, 0,37H). LCMS (A4): ES m/z = 722 [M-H]-; m/z = 724 [M+H]+; m/z = 768 [M-H+HCO²H]-; RT = 5,68-5,78 min.

Compuesto 79: 2S)-2-((3S,10R,16S,E)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6-metil-3-neopentil-2,5,9,12-tetraoxo-6-(((trietilsilil)oxi)metil)-1 -oxa-4,8,11 -triazaciclohexadec-13-en-16-il)propanal

A una disolución de compuesto 78 (154 mg, 212,6 pmol) en DCM (1,5 mL) enfriada con un baño de hielo/acetona se agregaron a 0 °C una disolución de KBr (25,6 mg, 212,6 pmol) en H²O (612 pL), una disolución de TEMPO a 5 mg/mL en DCM (137 pL, 4,25 pmol) y por goteo una disolución acuosa de hipoclorito de sodio 1,56 M de pH 9,5 (204 pL, 318,9 pmol). Se continuó con la agitación a 0 °C durante 15 min, después se agregó a 0 °C Na2S2O3 (1,9 mL), se retiró el baño de hiel y el medio de reacción se agitó durante 10 min. A continuación, se extrajo con DCM (3 x 20 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con H²O (2 x 10 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 15 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 36 mg de compuesto 61 (23 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 72/28 mezcla diastereoisomérica: 0,49 a 0,65 (m, 6H); 0,80 a 1,08 (m, 24H); 1,32 a 1,69 (m, 2H); 2,40 (m, 1H); 2,68 (m, 2H); 2,79 (m, 1H); 2,89 a 3,70 (m, 5H); 3,80 (s, 3H); 4,10 a 4,53 (m, 2H); 5,02 (m, 0,28H); 5,28 (m, 0,72H); 5,78 a 5,91 (m, 1H); 6,07 (m, 0,28H); 6,40 (m, 0,72H); 7,00 a 7,51 (m, 4H); 7,90 (d, J = 9,4 Hz, 0,28H); 7,98 (d, J = 9,4 Hz, 0,72H); 8,34 (m, 1H); 9,59 (d, J = 2,5 Hz, 0,28H); 9,63 (d, J = 1,8 Hz, 0,72H). LCMS (A5): m/z = 722 [M+H]+; RT = 1,71 min.

Compuesto 80: 1-(azidometil)-4-(bromometil)benceno

A una disolución de dibromuro de p-xileno (2,0 g, 7,2 mmol) en DMF (20 mL) se agregó en 20 min una disolución de azida de sodio (584,9 mg, 8,64 mmol) en DMF (20 mL). El medio de reacción se agitó a RT durante 20 h, después se vertió sobre hielo (100 g) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (3 x 15 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío, se coevaporaron con tolueno y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 70 g de gel de sílice (elución Et²O) para proporcionar 773 mg de compuesto 80 como un aceite incoloro (47 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 4,45 (s, 2H); 4,71 (s, 2H); 7,35 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,47 (d, J = 8,5 Hz, 2H).

Compuesto 81: (1 R,4S,5R,6S)-6-(4-(azidometil)bencil)-4,7,7-trimetil-6-tiabiciclo[3.2.1] octan-6-io trifluorometanosulfonato

Se agregó a (1R,4R,5R)-4,7,7-trimetil-6-tiabiciclo[3.2.1]octano (número CAS [5718-75-2], 580,1 mg, 3,41 mmol) una disolución de compuesto 80 (770 mg, 3,41 mmol) en DCM (2,2 mL). A continuación, se agregó una disolución de trifluorometanosulfonato de litio (2,71 g, 17,03 mmol) en H²O (2 mL) por goteo y el medio de reacción se agitó a RT durante 2 d. Después se agregaron H²O (15 mL) y DCM (15 mL) al medio de reacción y se continuó con la agitación a RT durante 10 min. La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 15 mL), las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera sat. (3 x 8 mL), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El aceite amarillo pálido se trituró en iPr²O (5 mL), el sólido obtenido de este modo se filtró, se lavó con iPr²O (2 x 5 mL) y se secó al vacío para proporcionar 1,266 g de compuesto 81 como un sólido blanco (79 %).

1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 1,08 (d, J = 7,2 Hz, 3H); 1,45 (m, 1H); 1,55 a 1,80 (m, 3H); 1,69 (s, 3H); 1,75 (s, 3H); 1,99 (m, 1H); 2,40 (d, J = 13,8 Hz, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,59 (dm, J = 13,8 Hz, 1H); 3,88 (t, J = 4,6 Hz, 1H); 4,52 (s, 2H); 4,60 (d, J = 12,8 Hz, 1H); 4,90 (d, J = 12,8 Hz, 1H); 7,47 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 7,61 (d, J = 8,5 Hz, 2H).

Compuesto 82: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(azidometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6-metil-3-neopentil-6-(((trietilsilil)oxi)metil)-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de los compuestos 79 (35 mg, 48,5 pmol) y 81 (24,8 mg, 53,3 pmol) en DCM (1,5 mL) enfriada a -70 °C se agregó por goteo BEMP (número CAS [98015-45-3], 18,6 pL, 63,0 pmol). La mezcla de reacción se agitó a -70 °C durante 2 h 30, se agregó salmuera sat. (1,5 mL) a la mezcla de reacción, el baño se retiró y se continuó con la agitación vigorosamente hasta RT. La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 10 mL), las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO⁴, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH) para proporcionar 10,2 mg de compuesto 82 como una laca incolora (24 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,61 (c, J = 8,1 Hz, 6H); 0,80 (s, 9H); 0,98 (t, J = 8,1 Hz, 9H); 1,02 (s, 3H);

I , 03 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,34 (dd, J = 2,5 y 14,4 Hz, 1H); 1,44 (dd, J = 10,0 y 14,4 Hz, 1H); 1,85 (m, 1H); 2,27 (m, 1H); 2,62 (m, 2H); 2,88 (dd, J = 2,6 y 13,5 Hz, 1H); 2,97 (dd, J = 3,7 y 14,2 Hz, 1H); 3,00 (dd, J = 2,3 y 7,3 Hz, 1H);

3,35 (m, 1H); 3,48 (dd, J = 9,5 y 14,2 Hz, 1H); 3,61 (d, J = 10,3 Hz, 1H); 3,81 (s, 3H); 3,92 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 4,15 (m, 1 H); 4,46 (s, 2H); 4,48 (td, J = 2,5 y 9,7 Hz, 1H); 5,10 (m, 1 H); 5,78 (dd, J = 2,2 y 15,3 Hz, 1H); 6,40 (ddd, J = 4,3, I I , 6 y 15,3 Hz, 1H); 7,04 (m, 2H); 7,14 (dd, J = 2,3 y 8,6 Hz, 1H); 7,28 (d, J = 2,3 Hz, 1 H); 7,33 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,39 (d, J = 8,4 Hz, 2H); 7,96 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,28 (d, J = 8,0 Hz, 1H). LCMS (A5): ES m/z = 120; m/z = 865 [M-H]-; m/z = 867 [M+H]+; m/z = 911 [M-H+HCO²H]-; RT = 1,87 min.

Ejemplo 32: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(aminometil)fenil)oxiran-2-il)etil)-10-(3-cloro-4-metoxibencil)-6-metil-3-neopentil-6-(((trietilsilil)oxi)metil)-1-oxa-4,8,11-triazaciclohexadec-13-eno-2,5,9,12-tetraona

A una disolución de compuesto 82 (9,4 mg, 10,84 gmol) en DCM (1,3 mL) y MeOH (0,7 mL) se agregó una disolución de TCEP (3,45 mg, 11,9 gmol) en H²O (0,7 mL). El medio de reacción se agitó a RT durante toda la noche, después se agregó NaHCO3 ac. (2,5 mL) y se continuó la agitación durante 10 min. La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 10 mL), las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se purificaron mediante cromatografía rápida sobre 5 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM/MeOH/H²O) para proporcionar 4,55 mg del ejemplo 32 como una laca blanca (57 %).

1H RMN (500 MHz, 5 en ppm, DMSO-d6): 0,82 (s, 9H); 1,01 (s, 3H); 1,03 (d, J = 7,1 Hz, 3H); 1,33 (dd, J = 2,3 y 14,5 Hz, 1 H); 1,56 (dd, J = 10,1 y 14,5 Hz, 1H); 1,82 (m, 1H); 2,27 (m, 1H); 2,64 (m, 2H); 2,88 (dd, J = 2,6 y 13,5 Hz, 1H);

2,92 (dd, J = 2,2 y 7,3 Hz, 1H); 2,96 (dd, J = 4,0 y 11,2 Hz, 1 H); 3,19 (dd, J = 4,3 y 10,9 Hz, 1H); 3,41 (m, 2H); 3,74 (s, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,88 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 4,18 (m, 1H); 4,47 (td, J = 2,1 y 9,4 Hz, 1H); 4,91 (dd, J = 4,2 y 6,2 Hz, 1H); 5,08 (m, 1H); 5,76 (dd, J = 2,3 y 15,5 Hz, 1H); 6,40 (ddd, J = 3,7, 11,5 y 15,5 Hz, 1H); 7,05 (d, J = 8,8 Hz, 1H);

7,11 (m, 1 H); 7,14 (dd, J = 2,4 y 8,8 Hz, 1 H); 7,22 (d, J = 8,3 Hz, 2H); 7,25 (d, J = 2,4 Hz, 1 H); 7,35 (d, J = 8,3 Hz, 2H); 8,08 (d, J = 9,4 Hz, 1H); 8,31 (d, J = 8,0 Hz, 1 H). LCMS (A5): ES m/z = 725 [M-H]-; m/z = 727 [M+H]+; RT = 0,79 min.

Resultados farmacológicos

Los compuestos de la invención se sometieron a pruebas farmacológicas para determinar su efecto antitumoral. Los ADC de fórmula (III) también se evaluaron en relación con la estabilidad plasmática. A efectos ilustrativos, dos conjugados, ADC1 y ADC2 representados más adelante, derivados del documento WO2011/001052 también se sometieron a prueba.

Evaluación de la inhibición de la proliferación de las líneas celulares HCT116 y MDA-MB-231 mediante los compuestos de criptoficina de fórmula (I)

Las células HCT116 y MDA-MB-231 en su fase exponencial de crecimiento se tripsinizaron y resuspendieron en su respectivo medio de cultivo (DMEM/F12 Gibco n.° 21331, FCS al 10 % Gibco n.° 10500-056, 2nM de glutamina Gibco n.° 25030 para las células MDA-MB-231; DMEM Gibco n.° 11960, FCS al 10 % Gibco n.° 10500-056, 2mM de glutamina Gibco n.° 25030 para las células HCT116). La suspensión celular se sembró en placas de cultivo de 96 pocilios Cytostar (GE Healthcare Europe, n.° RPNQ0163) en medios de cultivo enteros que contenían suero a una densidad de 5000 células/pocillo. Después de la incubación durante 4 h, se agregaron diluciones sucesivas de compuestos de criptoficina a los pocillos a concentraciones decrecientes de 10-7 a 10-12 M (por triplicado para cada concentración). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera que contenía CO²al 5 % en presencia de los compuestos de criptoficina durante 3 d. En el 4° día, se agregaron 10 gl de una disolución de 14C-timidina (0,1 gCi/pocillo, Perkin Elmer n.° NEC56825000) a cada pocillo. La incorporación de 14C-timidina se midió 96 horas después del inicio del experimento con un contador radioactivo en microbeta (Perkin Elmer). Los datos se expresaron en forma de un porcentaje de supervivencia al determinar la relación entre el recuento reducido obtenido con las células tratadas con el compuesto de criptoficina y el recuento obtenido con las células de los pocillos testigo (tratadas solo con el medio de cultivo).

La actividad inhibidora se proporciona por la concentración que inhibe el 50 % de la actividad.

Tabla II

Se halló que los compuestos de criptoficina de fórmula (I) inhiben la proliferación de las líneas celulares HCT116 y MDA-MB-231 con una CI⁵⁰que varía de 50 pM a 2,815 nM.

Evaluación de la inhibición de la proliferación de la línea celular MDA-MB-231 mediante el ADC de fórmula (III)

Las células MDA-MB-231 en su fase exponencial de crecimiento se tripsinizaron y resuspendieron en su medio de cultivo (DMEM/F12 Gibco n.° 21331, fCs al 10 % Gibco n.° 10500-056, 2nM de glutamina Gibco n.° 25030). La suspensión celular se sembró en placas de cultivo de 96 pocillos Cytostar (GE Healthcare Europe, n.° RPNQ0163) en medios de cultivo enteros que contenían suero a una densidad de 5000 células/pocillo. Después de la incubación durante 4 h, se agregaron diluciones sucesivas del ADC a los pocillos a concentraciones decrecientes de 10-7 a 10-12 M (por triplicado para cada concentración). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera que contenía CO²al 5 % en presencia del ADC durante 3 d. En el 4° día, se agregaron 10 gl de una disolución de 14C-timidina (0,1 gCi/pocillo, Perkin Elmer n.° NEC56825000) a cada pocillo. La incorporación de 14C-timidina se midió 96 horas después del inicio del experimento con un contador radioactivo en microbeta (Perkin Elmer). Los datos se expresaron en forma de un porcentaje de supervivencia al determinar la relación entre el recuento reducido obtenido con las células tratadas con el ADC y el recuento obtenido con las células de los pocillos testigo (tratadas solo con el medio de cultivo). En ciertos experimentos, se agregó el anticuerpo no marcado a los pocilios a una concentración de 1 pM en el inicio del experimento y se midió la inhibición de la proliferación como se describió anteriormente.

Tabla III

Se halló que el ADC de criptoficina de fórmula (III), así como ADC1 y ADC2, inhiben la proliferación de la línea celular MDA-MB-231 con una CI⁵⁰que varía de 20 pM a 130 pM y la relación de selectividad de ADC solo con respecto a ADC anticuerpo no marcado entre 185 y 500.

Determinación de la MTD del ADC de fórmula (III) después de una única administración i.v. en ratones SCID

La MTD se determinó como la máxima dosis que no induce 15 % de pérdida de peso corporal durante 3 días consecutivos para un ratón individual o 20 % de pérdida de peso corporal durante 1 día o la mortandad. Se evaluó después de una única inyección de bolo intravenoso (i.v.) en 3 ratones SCID hembra y durante un período de 28 días después del tratamiento.

Tabla IV

El ADC de criptoficina de fórmula (III) exhibió una MTD en ratones SCID que varía de 20 mg/kg a >50 mg/kg.

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del ADC de fórmula (III) contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

La actividad antitumoral in vivo se evaluó a 3 niveles de dosis contra xenoinjertos de mama MDA-MB-231 medibles implantados s.c. en ratones SCID hembra. Los grupos testigo no se trataron. Los conjugados se administraron mediante una única inyección de bolo i.v., el día del tratamiento se indicó en cada gráfico mediante una flecha (▼).

Para la evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados, los animales se pesaron dos veces por semana y los tumores se midieron dos veces por semana mediante calibre. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos tumorales. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula masa (mm3) = [longitud (mm) x ancho (mm)2]/2. Los criterios de valoración de la eficacia primaria fueron AT/AC, porcentaje de mediana de regresión, regresiones parciales y completas (PR y CR, por sus siglas en inglés). Los cambios en el volumen tumoral de cada tumor para cada tratado (T) y testigo (C) se calcularon al restar el volumen tumoral en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen tumoral en el día de la observación especificado. La mediana AT se calculó para el grupo tratado y la mediana AC se calculó para el grupo testigo. A continuación, se calculó la relación AT/AC y se expresó como un porcentaje: AT/AC = (delta T/delta C)x100.

El porcentaje de regresión tumoral se definió como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado (t) en comparación con su volumen en el primer día del primer tratamiento (t0). En un punto de tiempo específico y para cada animal, se calculó el % de regresión. A continuación, se calculó la mediana del % de regresión para el grupo. % de regresión (en t) = ((Volumentü - Volument)/Volumetü)x100. Las regresiones se definieron como parciales (PR) si el volumen tumoral disminuyó hasta el 50 % del volumen tumoral en el inicio del tratamiento y como completas (CR) cuando el volumen tumoral no se pudo medir (0 mm3). Superviviente sin tumor (TFS) se definió como los animales con tumores indetectables al finalizar el estudio (>100 días después del último tratamiento).

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del Ej. 3 contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

Tabla V

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del Ej. 7 contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

Tabla V

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del Ej. 10 contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

Tabla VI

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del Ej. 14 contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

Tabla VII

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del Ej. 20 contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

Tabla VIII

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo del Ej. 23 contra MDA-MB-231 en ratones SCID después de una única administración i.v.

Tabla VIII

Estos resultados mostraron que todos los ejemplos sometidos a prueba de la invención, así como ADC2, exhibieron actividad antitumoral con dosis que varían de 0,625 mg/kg a 5 mg/kg.

Determinación de los parámetros PK del Ej. 3 y el Ej. 7 después de una única administración i.v. en ratones SCID (5 mg/kg)

La farmacocinética in vivo del ADC y el anticuerpo total se evaluaron en ratones SCID hembra después de la administración del conjugado mediante una única inyección de bolo i.v. Se alojaron ratones SCID hembra (5-6 semanas, peso promedio de 20-25 g) en una habitación estéril, en condiciones asépticas en una campana laminar y se alimentaron ad libitum. El ADC se administró (diseño no serial, n=3 / tiempo de muestreo) como un bolo i.v. en un nivel de dosis (10 mL/kg). Para cada animal y en cada punto de tiempo seleccionado (es decir, 0,083, 0,25, 24, 72, 96, 168, 240, 336 h), se recogieron 600 pL de sangre a través de punción cardíaca y las muestras de sangre después se centrifugaron (15 min a 4 °C y 3500 tr/min). La cuantificación del ADC y el anticuerpo total en las muestras de plasma se llevó a cabo usando inmunoensayos. Los perfiles de concentración en plasma con respecto al tiempo y los parámetros PK del conjugado y el anticuerpo total en ratón se caracterizaron usando análisis no compartimental (Phoenix, WinNonLin versión 6.3) y se representaron en las Figuras 15 y 16. El área debajo de la curva de concentración-tiempo, AUC (pg.día/mL) se estimó mediante la regla del trapecio. La concentración a t=0 C⁰(pg/mL), Aclaramiento CL (L/(día.kg) y semivida de eliminación terminal t1/2 (día) se derivaron y calcularon a partir de la curva.

Tabla IX

Evaluación mediante HRMS de la estabilidad plasmática del ADC de criptoficina de fórmula (III) después de una única administración i.v. en ratones SCID a 5 mg/kg

Las muestras de plasma del estudio PK también se analizaron mediante LC-HRMS. El análisis cromatográfico se llevó a cabo en un Waters Acquity I Class y una columna Waters Mass Prep Micro Desalting 20 pm (2,1 x 5 mm) a 80 °C con un gradiente de elución de (A) agua ácido fórmico al 0,1 %/(B) CH³CN ácido fórmico al 0,1 % descrito más adelante.

La espectrometría de masas se llevó a cabo en una máquina Waters QTOF Synapt G2-S con ionización por electropulverización en modo positivo (ES+). Los espectros de masas se desconvoluyeron con el programa informático Waters Biopharmalynx. Los espectros de HRMS se obtuvieron para todos los ejemplos evaluados y se representaron en las Figuras 20 a 25.

Estos resultados mostraron que todos los ejemplos evaluados de la invención no exhibieron la metabolización observada con referencia a a Dc , ADC1 y ADC2.

Por lo tanto, es evidente que los compuestos de la invención tienen una actividad antineoplásica y que los conjugados de la invención exhiben una estabilidad mejorada en el plasma de ratones.

Por consiguiente, en otro de sus aspectos, la invención también se refiere al uso de compuestos de criptoficina de fórmula (I) o de los conjugados de fórmula (III) como agentes anticancerosos.

La presente invención, según otro de sus aspectos, también proporciona medicamentos que comprenden un conjugado de fórmula (III).

Estos medicamentos se emplean terapéuticamente, especialmente en el tratamiento del cáncer.

Según otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo un conjugado de fórmula (III) según la invención. Estas composiciones farmacéuticas comprenden una dosis eficaz de al menos un conjugado de fórmula (III) según la invención, y además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los dichos excipientes se seleccionan, según la forma farmacéutica y el método de administración deseado, entre los excipientes habituales, que son conocidos para el experto en la técnica.

La presente descripción, según otro de sus aspectos, también proporciona un método para tratar las patologías indicadas anteriormente, que comprende administrar a un paciente una dosis eficaz de un conjugado de fórmula (III) según la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de criptoficina de fórmula (I):

■ Ri representa un grupo alquilo(C¹-C⁶);

■ R²y R³representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶);

o alternativamente R²y R³forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C³-C⁶) o hetercicloalquilo(C³-C⁶);

■ R⁴y R⁵representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-NH(R¹²) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-OH o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-SH o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-CO²H; o alternativamente R⁴y R⁵forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C³-C⁶) o hetercicloalquilo(C³-C⁶);

■ R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶);

■ R⁷y Rs representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-CO²H o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-Nalquilo(C¹-C⁶)²;

o alternativamente R⁷y Rs forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo cicloalquilo(C³-C⁶) o un grupo hetercicloalquilo(C³-C⁶);

■ R⁹representa uno o más sustituyentes del núcleo de fenilo elegidos, independientemente entre sí, de: un átomo de hidrógeno, -OH, alcoxi(C1-C4), un átomo de halógeno, -NH², -NHalquilo(CrC6) o -Nalquilo(CrC ^{6 ) 2}o -NHcicloalquilo(C¹-C⁶) o heterocicloalquilo(C3-C6);

■ R¹⁰representa al menos un sustituyente del núcleo de fenilo elegido de un átomo de hidrógeno y alquilo(C1-C4); ■ W representa

• alquilo(C¹-C⁶)-NH(Rn),

• alquilo(C¹-C⁶)-OH,

• alquilo(C¹-C⁶)-SH,

• CO²H o C(=O)NH²;

• alquilo(C¹-C⁶)-CO²H o alquilo(C¹-C⁶)-C(=O)NH²; o

• alquilo(C1-C6)-N3.

■ R¹¹y R¹²representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶).

2. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura:

3. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque Ri representa un grupo metilo.

4. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque:

- cada uno de R²y R³representa un átomo de hidrógeno, o

- uno de R²y R³representa un grupo metilo y el otro representa un átomo de hidrógeno, o

- R²y R³forman junto con el átomo de carbono al que están acoplados un grupo ciclopropilo.

5. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque cada uno de R⁴y R⁵representa un grupo metilo.

6. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque R6 representa un átomo de hidrógeno.

7. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque R⁷y Rs representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶).

⁸. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque R⁹representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro.

9. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque R¹⁰representa un átomo de hidrógeno.

10. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque:

■ R¹representa un alquilo(C1-C6);

■ cada uno de R²y R³representa un átomo de hidrógeno;

■ R6 representa un átomo de hidrógeno;

■ R⁹representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro; y R¹⁰representa un átomo de hidrógeno.

11. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque:

■ R¹representa un alquilo(C¹-C⁶);

■ R²y R³representa un alquilo(C1-C6), y el otro representa un átomo de hidrógeno;

■ R6 representa un átomo de hidrógeno;

■ R⁹representa dos sustituyentes seleccionados de un grupo metoxi y un átomo de cloro; y

■ R¹⁰representa un átomo de hidrógeno.

12. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque W se selecciona de alquilo(C¹-C⁶)-NHRn, alquilo(C¹-C⁶)-OH, alquilo(C¹-C⁶)-SH y alquilo(C¹-C⁶)-CO²H, preferiblemente W representa un grupo CH²-NH²o un CH²-OH.

13. Compuestos de criptoficina de fórmula (I) según la reivindicación 1 que se seleccionan de la siguiente lista:

Ri, R², R³, R⁴, R⁵, R6, R⁷, Rs, R⁹y R¹⁰son según se definieron en la reivindicación 1 a 11, y

■ Y se selecciona de un grupo alquilo(C¹-C⁶)-NRn, alquilo(C¹-C⁶)-O, alquilo(C¹-C⁶)-S, C(=O)O, C(=O)NH, alquilo(C¹-C6)-C(=O)O, alquilo(C¹-C⁶)-C(=O)NH o alquilo(C¹-C⁶)-triazol;

■ R¹¹representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶);

■ L representa un enlazador;

■ RCG1 representa un grupo químico reactivo presente en el extremo del enlazador,

L es de fórmula (IV):

en la que:

■ L1 representa

■ una unión simple o un grupo NR16(hetero)aril-CR15R14O-C(=O) si Y = alquilo(C¹-C⁶)-N(Rn);

■ un grupo NR18-alquilo(C2-C6)-NR17-C(=O) o un grupo NR16(hetero)aril-CR15R14-O-C(=O)NR18-alquilo(C2-C6)-NR17-C(=O) si Y = alquilo(C¹-C⁶)- O- o alquilo(C¹-C⁶)-S;

■ un grupo NR16(hetero)aril-CR15R14- si Y = C(=O)O, C(=O)NH, alquilo(C¹-C⁶)-C(=O)O o alquilo(C¹-C⁶)-C(=O)NH; ■ R¹¹, R¹⁴, R¹⁵, Ri6, R¹⁷y Ris representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(Ci-C6);

■ (AA)w representa una secuencia de w aminoácidos AA conectados entre sí a través de uniones peptídicas;

■ w representa un número entero que varía de 1 a 12;

■ L2 representa una unión simple o un grupo alquilo(C¹-C⁶) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-(OCH²CH²)i o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-(OCH²CH²)i-Oalquilo(C¹-C⁶) o un grupo (CH²CH²O)ialquilo(C¹-C⁶) o un grupo CH(SO3H)-alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-CH(SO3H) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-ciclohexilo o un grupo NR19-alquilo(C1-C6) o un grupo NR²⁰-(CH²CH²O)ialquilo(C¹-C⁶) o un grupo NR²¹-arilo o un grupo NR²¹-heteroarilo o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-NR²²C(=O)-alquilo(C¹-C⁶) o un grupo alquilo(C¹-C⁶)-NR²²C(=O)-alquilo(C¹-C⁶)-(OCH²CH²)i;

R¹⁹, R²⁰, R²¹y R²²representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(C¹-C⁶); ■ i representa un número entero entre 1 y 50;

AA denota un aminoácido natural o no natural, de configuración D o L, elegido de: alanina (Ala), p -alanina, ácido y -aminobutírico, ácido 2-amino-2-ciclohexilacético, ácido 2-amino-2-fenilacético, arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), citrulina (Cit), cisteína (Cys), ácido a ,a -dimetil-Y-aminobutírico, ácido p ,p -dimetil-Y-aminobutírico, glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), £-acetil-lisina (AcLys), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr), valina (Val).

15. Carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según la reivindicación 14, que tiene la siguiente estructura:

16. Carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según una cualquiera de la reivindicación 14 o 15, caracterizada porque Y representa alquilo(C¹-C⁶)-NRn, preferiblemente Y representa CH²-NH.

17. Carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según la reivindicación 14, caracterizada porque la secuencia (AA)w tiene la fórmula:

en la que R23 representa la cadena lateral de AA.

18. Carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según una cualquiera de la reivindicación 14 o 17, caracterizada porque la secuencia AA representa alanina (Ala), citrulina (Cit), glutamina (Gln), glicina (Gly), £-acetil-lisina (AcLys), valina (Val).

19. Carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque RCG1 se elige de:

- grupo -C(=O)-ZaRa en el que

■ Za representa una unión simple, O o NH, y

■ Ra representa H o un grupo alquilo(C¹-C⁶), cicloalquilo(C3-C7), arilo(C5-C10), heteroarilo(C5-C10) o heterocicloalquilo(C3-C7) o un grupo succinimidilo;

- uno de los siguientes grupos reactivos: el grupo maleimido

el grupo haloacetamido

con R¹³que representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo(Ci-C6); -Cl; -N³; - OH; -SH; -NH²;

-C=CH, un grupo

o un grupo O-alquilo(C¹-C⁶) hidroxilamina.

20. Carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque L2 representa un grupo alquilo(C1-C6) o un grupo alquilo(C1-C6)-(OCH2CH2)i o un grupo CH(SO3H)-alquilo(C1-C6)

21. Cargas eficaces de criptoficina de fórmula (II) según la reivindicación 14, que se seleccionan de la siguiente lista:

■ Ri , R2, R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9 y Río son según se definieron en la reivindicación 1 a 11;

■ Y y L son según se definieron en las reivindicaciones 14 a 18;

■ G representa el producto de reacción entre RCG1, un grupo reactivo presente en el extremo del enlazador y RCG2, un grupo reactivo ortogonal presente en el Ab;

■ Ab representa un anticuerpo.

23. Conjugado de fórmula (III) según la reivindicación 22, que tiene la siguiente estructura:

24. Conjugado de fórmula (III) según una cualquiera de la reivindicación 22 o 23, caracterizada porque RCG2 se selecciona de:

• grupos s-amino de lisinas cargados por las cadenas laterales de los residuos lisina que están presentes en la superficie de un anticuerpo;

• grupos a-amino de aminoácidos del extremo N de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo;

• grupos sacárido de la región bisagra;

• tioles de cisteínas generadas al reducir uniones disulfuro intracatenarias o los tioles de cisteínas genomanipuladas;

• grupos amida cargados por las cadenas laterales de algunos residuos glutamina que están presentes en la superficie del anticuerpo;

• grupos aldehído introducidos mediante el uso de la enzima generadora de formilglicina.

25. Conjugado de fórmula (III) según una cualquiera de la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque:

• cuando RCG1 representa un éster de N-hidroxisuccinimidilo, RCG2 representa un grupo -NH²;

• cuando RCG1 representa una función maleimido o haloacetamido o un grupo -Cl, RCG2 representa un grupo -SH;

• cuando RCG1 representa un grupo -N³, RCG2 representa un grupo -C=CH o un C=C activado;

• cuando RCG1 representa un grupo -OH o -NH², RCG2 representa una función ácido carboxílico o amida;

• cuando RCG1 representa un grupo -SH, RCG2 representa una función maleimido o haloacetamido;

• cuando RCG1 representa una función -C=CH o un C=C activado, RCG2 representa un grupo -N³;

• cuando RCG1 representa una función O-alquil hidroxilamina o un sustrato de reacción de Pictet-Spengler, RCG2 representa una función aldehído o cetona.

26. Conjugado de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado porque G se selecciona de:

27. Proceso para preparar el compuesto de criptoficina de fórmula (I) que comprende la etapa:

- La etapa (i) es un acoplamiento peptídico entre los fragmentos AD3 y BC alternativo en presencia de reactivos de acoplamiento;

- La etapa (ii) es una macrociclización mediante metatesis con cierre de anillo en presencia de un catalizador;

- La etapa (iii) es una desprotección del éter de p-metoxibencilo en condiciones ácidas;

- La etapa (iv) es una oxidación del alcohol mediante el uso de un agente oxidante;

- La etapa (v) es una introducción del epóxido mediante reacción de Corey-Chaykovsky asimétrica con el uso de sulfonio quiral derivado de isotiocineol sustituido adecuadamente en presencia de una base;

- La etapa (vi) es una reducción del grupo azido.

28. Proceso para preparar un conjugado de fórmula (III) que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto y dejar que hagan reacción:

- una disolución acuosa opcionalmente tamponada de un anticuerpo, opcionalmente modificada por medio de un agente modificador,

y

- una disolución de una carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) según se define en una de las reivindicaciones 14 a 21,

el grupo químico RCG1 de la carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) es reactivo a los grupos químicos RCG2 presentes en el anticuerpo, especialmente a los grupos amino presentes en los anticuerpos, los dichos grupos químicos RCG2 se introdujeron, según corresponda, mediante el agente modificador,

para acoplar la carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) al anticuerpo mediante la formación de una unión covalente;

(ii) y después opcionalmente para separar el conjugado formado en la etapa (i) de la carga eficaz de criptoficina de fórmula (II) y/o del anticuerpo que no hizo reacción y/o de cualesquiera aglomerados que se puedan haber formado.

29. Medicamento caracterizado porque comprende un conjugado de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.

30. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un conjugado de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, y además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

31. Compuesto de criptoficina de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en el tratamiento del cáncer.

32. Conjugado de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 para su uso en el tratamiento del cáncer.