ES2757913T3 - Composiciones y métodos para la producción biológica de lactato a partir de compuestos de C1 mediante el uso de transformantes de deshidrogenasa láctica - Google Patents

Abstract

Una bacteria metanotrófica obligada que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una deshidrogenasa de lactato (LDH), en donde la bacteria metanotrófica es capaz de convertir metano en lactato.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la producción biológica de lactato a partir de compuestos de C1 mediante el uso de transformantes de deshidrogenasa láctica

ANTECEDENTES

[0001] El ácido láctico, que se puede producir químicamente o biológicamente, es un compuesto químico ampliamente usado que varía deñ uso en la industria cosmética para uso en la industria alimentaria para las industrias farmacéutica y química. Dado que el ácido láctico contiene dos grupos funcionales reactivos, un grupo carboxílico y un grupo hidroxilo, puede experimentar una variedad de conversiones químicas en productos químicos potencialmente útiles, como óxido de propileno, acetaldehído, ácido acrílico, ácido propanoico, 2,3-pentanodiona y lactida (Varadarajan y Miller, Biotechnol. Progr. 15: 845, 1999). Recientemente, se ha prestado mayor atención al uso de ácido láctico para producir ácido poliláctico (PLA), que es una materia prima renovable utilizada en el fabricación de bioplásticos que ofrece una alternativa más sostenible a los recursos petroquímicos. El ácido láctico ópticamente puro se puede polimerizar en un PLA de alta masa molecular a través de las reacciones en serie de policondensación, despolimerización y polimerización de apertura de anillo (Sódergárd y Stolt, Prog. Polym. Sci. 27: 1123, 2002). El polímero PLA resultante tiene varios usos en una amplia gama de aplicaciones, que incluyen ropa protectora, empaque de alimentos, película de mantillo, bolsas de basura, recipientes rígidos, envoltura retráctil y bandejas de corta duración (Drumright et al., Adv. Mater. 12: 1841,2000; Vink et al., Polym. Degrad. Stabil. 80: 403, 2003).

[0002] Las materias primas de carbohidratos actualmente utilizadas en la producción biológica de lactato son relativamente caras. Otras materias primas, como el metano, están disponibles a bajo precio en grandes cantidades. La conversión de metano potencialmente representa una ruta para reducir significativamente el costo de producción de ácido láctico. Sin embargo, aún no se ha desarrollado una forma práctica de lograr esto.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0003] La invención proporciona bacterias metanotróficas obligadas que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica una deshidrogenasa de lactato (LDH), en donde las bacterias metanotróficas es capaz de convertir el metano en lactato.

[0004] La invención también proporciona un método de producción de lactato, que comprende cultivar bacterias metanotróficas de la invención en presencia de una materia prima de carbono que comprende metano en condiciones suficientes para la producción de lactato, en donde las bacterias metanotróficas convierten metano a lactato.

BREVE SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

[0005] Se describe aquí bacterias metabolizadoras C¹ de origen no natural que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato (LDH).

[0006] También se describe un microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ es un metanótrofo.

[0007] En este documento se describe un microorganismo metabolizador C¹ que no se produce de forma natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ es capaz de convertir una materia prima de carbono en lactato, y en la que la materia prima de carbono se selecciona del grupo compuesto por metano, dióxido de carbono, monóxido de carbono, gas natural y gas de síntesis.

[0008] También se describe aquí un microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ no es una levadura.091

[0009] Se describe además un microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural es capaz de producir más de lactato en comparación con la del microorganismo metabolizador de referencia correspondiente C¹ cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ en al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0010]

La Figura 1 representa el nivel de producción de lactato para cierto Metilococcus capsulatus (Bath) recombinante que expresa un ácido nucleico de deshidrogenasa de lactato (Idh) heterólogo en comparación con la OD⁶⁰⁰ después de 72 horas de crecimiento.

La Figura 2 representa la distribución 513C de varias fuentes de carbono.

La Figura 3 representa el vector pMS3 que comprende secuencias que codifican una proteína de iniciación de replicación (trfA) y un promotor (Pbla), un origen de replicación (oriV), un origen de transferencia (oriT), sitios de clonación múltiple (MCS), gen de resistencia a la kanamicina (KanR) y promotor (KanR_promoter) y origen de replicación para E. coli (pUC_Ori_rc).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0011] La presente descripción proporciona microorganismos metabolizadores de origen no natural C¹, y composiciones y métodos relacionados para la biosíntesis de lactato a partir de una materia prima de carbono. Típicamente, el material de alimentación de carbono comprende un sustrato C¹. En una realización específica, la descripción proporciona bacterias metabolizadoras de origen no natural C¹ que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato (LDH). También se describe un microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ es un metanótrofo. En una realización específica, la presente descripción proporciona un microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizante C¹ es capaz de convertir una materia prima de carbono en lactato. Típicamente, la materia prima de carbono se selecciona del grupo que consiste en metano, dióxido de carbono, monóxido de carbono, gas de síntesis y gas natural. La presente divulgación proporciona además un microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ no es una levadura. En una realización todavía adicional, la presente descripción proporciona un Microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural es capaz de producir más de lactato en comparación con el de un microorganismo metabolizador C¹ de referencia correspondiente cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ en al menos un conjunto de condiciones de cultivo. En una realización adicional, la presente descripción proporciona un microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ no natural es capaz de producir más lactato en comparación con el de un microorganismo metabolizador C¹ de referencia correspondiente cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ en al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

[0012] Antes de exponer esta descripción con más detalle, puede ser útil para la comprensión del mismo proporcionar definiciones de ciertos términos que se usan en este documento. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de esta descripción.

[0013] En la presente descripción, la descripción de cualquier rango en el presente documento pretende ser una divulgación de cualquier número dentro de la gama, y una divulgación de cualquier intervalo formado por cualquier número dentro del intervalo, incluyendo los puntos finales. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa ⁶ 20% del rango, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. El término "que consiste esencialmente en 'limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados, o a aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. Debe entenderse que los términos "un" y "una" como se usan en el presente documento se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados. El uso de la alternativa "o" debe entenderse como uno, ambos o cualquier combinación de los mismos. Como se usa en el presente documento, los términos "incluir", "tener" y "comprender" no excluyen la presencia de otros elementos no de otra manera específicamente excluidos.

[0014] Cuando se utiliza en conexión con un polipéptido, los términos "deshidrogenasa de lactato" y "LDH" se usan indistintamente en este documento para referirse a un polipéptido que tiene actividad de deshidrogenasa de lactato, es decir, es capaz de catalizar la reducción de piruvato a lactato. En algunas realizaciones, la deshidrogenasa de lactato es una L-deshidrogenasa de lactato, que cataliza la reducción de piruvato a L-lactato (EC 1,1,1. 27) En otras realizaciones, la deshidrogenasa de lactato es una deshidrogenasa de D-lactato, que cataliza la reducción de piruvato a D-lactato (EC 1,1,1,28).

[0015] El término "materia prima de carbono" se refiere aquí a cualquier compuesto de carbono capaz de ser metabolizado por el microorganismos metabolizador C¹ de origen no natural de la presente descripción, tales como, p. ej., un sustrato C¹.016*

[0016] Como se usa en este documento, el término “Sustrato C¹" se refiere a cualquier molécula que contiene carbono que carece de un enlace carbono-carbono. Los sustratos C¹ se pueden encontrar en el gas natural, el gas natural no convencional, el gas de síntesis, e incluyen moléculas como, p. ej., metano, metanol, formaldehído, ácido fórmico (formiato), monóxido de carbono, dióxido de carbono, aminas metiladas (p. ej., metilamina), dimetilamina, trimetilamina, etc.), tioles metilados, halógenos de metilo (p. ej., bromometano, clorometano, yodometano, diclorometano, etc.), cianuro y similares.

[0017] Como se usa en este documento, el término "metano" se refiere al compuesto alcano (Ci) más simple con la fórmula química CH⁴ , que es un gas incoloro y inodoro a temperatura y presión ambiente.

[0018] Como se usa en este documento, el término "gas natural" se refiere a mezclas de origen natural de gas subterráneas que contienen metano. El gas natural puede ser accesible desde depósitos porosos mediante procesos convencionales (p. ej., perforación, inundación de agua). Aunque está compuesto principalmente de metano, el gas natural también puede comprender otros gases alcalinos ligeros (p. ej., etano, propano, butano, pentano), dióxido de carbono, nitrógeno, sulfuro de hidrógeno o similares, o cualquier combinación de los mismos.

[0019] El término, "gas natural no convencional", se refiere aquí a mezclas de gases que ocurren naturalmente creadas en formaciones de baja permeabilidad a las que se debe acceder por métodos convencionales, tales como fracturación hidráulica, perforación horizontal o la perforación direccional. Los depósitos de gas natural no convencionales ejemplares incluyen arenas de gas apretadas formadas en piedra arenisca o carbonato, metano de lecho de carbón formado en depósitos de carbón y adsorbido en partículas de carbón, gas de esquisto formado en roca de esquisto de grano fino y adsorbido en partículas de arcilla o mantenido dentro de poros pequeños o microfracturas, hidratos de metano que son una combinación cristalina de gas natural y agua formada a baja temperatura y alta presión en lugares como debajo de los océanos y el permafrost. El gas natural no convencional tiende a tener una composición más variable, que incluye tener niveles potencialmente más altos de etano, propano, butano, CO² o cualquier combinación de los mismos, en comparación al gas natural convencional.

[0020] Como se usa en este documento, los términos "gas de síntesis" o "syngas" se refiere a una mezcla de gas producido sintéticamente que contiene principalmente monóxido de carbono (CO) e hidrógeno (H2). El gas de síntesis puede producirse, p. ej., mediante reformado con vapor de gas natural o hidrocarburos líquidos, o mediante gasificación de carbón, biomasa o desechos. El gas de síntesis también puede incluir metano, CO² , H²S y otros gases en cantidades más pequeñas en relación con CO y H².

[0021] Como se usa en el presente documento, “microorganismo metabolizador C¹" se refiere a cualquier microorganismo que tiene la capacidad de uso (es decir, a metabolizar) un sustrato C¹ como una fuente de energía, la biomasa, y puede o no puede usar otros sustratos de carbono (tales como azúcares y carbohidratos complejos) para energía y biomasa. Los microorganismos metabolizadores de C¹ incluyen bacterias (como metanotrofos y metilotrofos) y levaduras. En ciertas realizaciones, un microorganismo metabolizador C¹ no incluye un microorganismo fotosintético, como las algas. En ciertas realizaciones, un microorganismo metabolizador C¹ será un " microorganismo metabolizador C¹ obligado”, lo que significa que requiere sustratos de C¹ como fuente de energía. En realizaciones adicionales, se cultivará un microorganismo metabolizador C¹ (p. ej., metanotrofo) en presencia de un sustrato de C¹ (es decir, usando el sustrato de C¹ como fuente de energía).

[0022] Como se usa en este documento, los términos "metanótrofo", "bacteria metanotrófica" o "bacterias metanotróficas" se refieren indistintamente en este documento a bacterias metilotróficas capaces de utilizar metano. Por ejemplo, el metano del gas natural puede usarse como fuente de carbono y energía para el crecimiento. Como se usa en este documento, el término "bacterias metanotróficas" incluye "bacterias metanotróficas obligatorias" que solo pueden utilizar metano (p. ej., a partir de gas natural) para fuentes de carbono y energía y "bacterias metanotróficas facultativas" que son naturalmente capaces de usar sustratos de múltiples carbonos, tales como acetato, piruvato, succinato, malato o etanol, además del metano como fuente de carbono y energía.

[0023] Como se usa en este documento, el término "metilotrofo" o "bacterias metilotróficas" se refiere a cualquier bacteria capaces de utilizar compuestos de un carbono (es decir, compuestos que no contienen enlaces carbonocarbono). En ciertas realizaciones, una bacteria metilotrófica puede ser un metanotrófico. Por ejemplo, "bacteria metanotrófica" se refiere a cualquier bacteria metilotrófica que tenga la capacidad de utilizar metano como fuente primaria de carbono y energía. Las bacterias metanotróficas ejemplares incluyen Metilomonas, Metilobacter, Metilococcus, Metilosinus, Metilocystis, Metilomicrobium o Metanomonas. En ciertas otras realizaciones, la bacteria metilotrófica es una "bacteria metilotrófica obligada", que se refiere a bacterias que están limitadas al uso de sustratos de C¹ para la generación de energía.024*

[0024] Como se usa en este documento, el término "huésped" se refiere a una célula o microorganismo (p. ej., Metanótrofo) que puede ser genéticamente modificado con un ácido nucleico exógeno para producir un polipéptido de interés (p. ej., deshidrogenasa de lactato). En ciertas realizaciones, una célula huésped puede poseer o modificarse opcionalmente para incluir otras modificaciones genéticas que confieren propiedades deseadas que están relacionadas o no relacionadas con la LDH exógena codificada por el ácido nucleico exógeno (p. ej., piruvato descarboxilasa eliminada). Por ejemplo, una célula huésped puede poseer modificaciones genéticas que: minimizan o reducen la utilización del producto de lactato que se produce, minimizan o reducen la producción de inhibidores del crecimiento de la célula huésped, proporcionan un alto crecimiento, proporcionan tolerancia a contaminantes o condiciones de cultivo particulares (p. ej., tolerancia al ácido, resistencia a los biocidas), confieren la capacidad de metabolizar sustratos de carbono adicionales, o confieren la capacidad de sintetizar productos o productos intermedios deseables adicionales.

[0025] Como se usa en este documento, los términos "molécula de ácido nucleico" y "ácido nucleico" se utilizan indistintamente para referirse a un compuesto polimérico que comprende subunidades unidas covalentemente de nucleótidos. La producción sintética de ácidos nucleicos incluye métodos químicos y biológicos de reproducción de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos incluyen ácido polirribonucleico (ARN), ácido polidesoxirribonucleico (ADN), que pueden ser monocatenarios o bicatenarios. El ADN incluye ADNc, ADN genómico, ADN sintético, ADN semisintético o similares. Los términos "ácido nucleico de LDH" y "ácido nucleico que codifica LDH" se usan indistintamente en la presente memoria para un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad LDH.

[0026] Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de aminoácidos.

[0027] Como se usa en este documento, los términos "recombinante" o "no natural" (o "no de origen natural") se refieren indistintamente a un organismo, microorganismo, célula, los ácidos nucleicos, o vector que incluye al menos una alteración genética o ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico exógeno, o se refiere a una célula que ha sido alterada de tal manera que la expresión de un ácido nucleico o gen endógeno puede controlarse, donde tales alteraciones o modificaciones son introducidas o inducidas por ingeniería genética. Las alteraciones genéticas incluyen, p. ej., modificaciones que introducen ácidos nucleicos expresables que codifican proteínas o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones u otras alteraciones funcionales del material genético de una célula o modificaciones logradas mediante la evolución clásica de la cepa o métodos de evolución molecular dirigida que se conocen en el técnica. Dichas modificaciones incluyen, p. ej., modificaciones en regiones codificantes (y fragmentos funcionales de las mismas) y regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón.

[0028] Como se usa en este documento, los términos "transformación" y "transformación" se refiere a la introducción de un ácido nucleico (p. ej., El ácido nucleico exógeno o heterólogo) en una célula huésped. La célula huésped transformada puede transportar el ácido nucleico exógeno o heterólogo extracromosómicamente o integrado en el cromosoma. La integración en un genoma de la célula huésped y los vectores autorreplicantes generalmente dan como resultado una herencia genéticamente estable de la molécula de ácido nucleico transformada. Las células huésped que contienen los ácidos nucleicos transformados se denominan indistintamente como células "recombinantes" o "de origen no natural" o "genéticamente modificadas" o "transformadas" o "transgénicas" (p. ej., bacterias).

[0029] Tal como se utiliza aquí, el término "microorganismo metabolizador C¹ de referencia correspondiente" se refiere al microorganismo metabolizador C¹ correspondiente sin el ácido nucleico exógeno que codifica LDH.

[0030] Cuando se utiliza en conexión con un ácido nucleico, polipéptido, compuesto, o actividad, los términos "endógeno" o "nativo" se usan indistintamente para referirse a un ácido nucleico, polipéptido, compuesto o actividad que está presente en la célula huésped de tipo silvestre. Cuando se usa en conexión con una célula, el término "nativo" se refiere a la célula de tipo salvaje.

[0031] Como se usa en el presente documento, ácido nucleico "heterólogo" o "exógeno", constructo o secuencia se usan de forma intercambiable aquí para referirse a una molécula de ácido nucleico o parte de una molécula de ácido nucleico que no es nativo de una célula huésped. Además, los términos "heterólogo" y "exógeno" pueden referirse a una actividad biológica que es diferente o alterada de la que se encuentra endógena a una célula huésped, o que no es nativa de una célula huésped sino que está codificada por una molécula de ácido nucleico introducida en la célula huésped.

[0032] El "porcentaje de identidad" entre dos o más secuencias de ácido nucleico o dos o más secuencias de amino ácido es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/total de número de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio que debe introducirse para optimizar la alineación de dos o más secuencias. Dos secuencias se alinean de manera óptima cuando se alinean usando parámetros definidos, es decir, una matriz de sustitución de aminoácidos definida, una penalización por existencia de huecos (también denominada penalización por hueco abierto) y penalización por extensión de huecos, para llegar al puntaje de similitud más alto posible para ese par de secuencias.03*

[0033] La "alineación óptima" para la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias se logra usando un algoritmo matemático, tal como el algoritmo BLAST (p. ej., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990; vea también BLASTN en la red mundial ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para secuencias de aminoácidos, la matriz BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89 (22): 10916-10919) se usa como una matriz de sustitución de puntuación predeterminada en algoritmos de alineación de secuencias de aminoácidos, tales como BLASTP. La penalización de existencia de hueco se impone para la introducción de un único hueco de aminoácidos en una de las secuencias alineadas, y la penalización de extensión de hueco se impone para cada posición de residuo en el hueco. La alineación óptima de las secuencias de aminoácidos se lleva a cabo utilizando BLASTP con los siguientes parámetros de alineación: matriz de puntuación BLOSUM62, penalización por existencia de brecha = 11 y penalización por extensión de brecha = 1. Para una alineación óptima de las secuencias de ácido nucleico, BLASTN se utiliza con los siguientes parámetros de alineación: Puntajes de coincidencia/falta de coincidencia = 1/-3, y penalización por existencia de brecha = 5, y penalización de extensión de brecha = 2. El puntaje de similitud se define por las posiciones de aminoácidos o nucleótidos de cada secuencia en la que comienza y termina la alineación (p. ej., la ventana de alineación), y opcionalmente por la inserción de una brecha o brechas múltiples en una o ambas secuencias para llegar con el puntaje de similitud más alto posible.

[0034] Una "sustitución conservadora" se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservadoras ejemplares son bien conocidas en la técnica (véase, p. ej., WO 97/09433, página 10, publicado el 13 de marzo de 1997; Lehninger, Biochemistry, Segunda edición; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), pp,71 -77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY y Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8).

[0035] Como se usa en este documento, "sobreexpresado" cuando se usa en referencia a un ácido nucleico o una proteína se refiere a un aumento en la expresión o actividad del ácido nucleico o proteína. El aumento de la expresión o actividad incluye la expresión o actividad de un ácido nucleico o proteína que se incrementa por encima del nivel de un microorganismo de control o de referencia de tipo salvaje (sin ingeniería genética). Un ácido nucleico o proteína se sobreexpresa si la expresión o actividad se encuentra en un microorganismo donde normalmente no se expresa o no es activo. Un ácido nucleico o proteína se sobreexpresa si la expresión o actividad se extiende o presenta más tiempo en el microorganismo recombinante que en un control de tipo salvaje o un microorganismo de referencia.

[0036] "Inhibir" o "inhibe", como se usa aquí, se refiere a una alteración, reducción, regulación a la baja, abrogación o deleción, directa o indirectamente, en la expresión de un gen diana o en la actividad de una molécula diana en relación con una molécula de control, endógena o de referencia, en la que la alteración, reducción, regulación negativa o abrogación es estadísticamente, biológicamente, industrialmente o clínicamente significativa.

[0037] Tal como se utiliza aquí, el término "derivado" se refiere a una modificación de un compuesto por medios químicos o biológicos (p. ej., con o sin una enzima), cuyo compuesto modificado es estructuralmente similar a un compuesto original y (en realidad o teóricamente) derivable de ese compuesto padre. Un derivado puede tener diferentes propiedades químicas, biológicas o físicas del compuesto original, como ser más hidrófilo o tener una reactividad alterada en comparación con el compuesto original. La derivación (es decir, modificación) puede implicar la sustitución de uno o más restos dentro de la molécula (p. ej., un cambio en el grupo funcional). Por ejemplo, un hidrógeno puede estar sustituido con un halógeno, tal como flúor o cloro, o un grupo hidroxilo (-OH) puede reemplazarse con un resto de ácido carboxílico (-COOH). Otras derivaciones ejemplares incluyen polimerización, glicosilación, alquilación, acilación, acetilación, ubiqutinación, esterificación y amidación.

[0038] El término "derivado" se refiere también a todos los solvatos, p. ej., hidratos o aductos (p. ej., aductos con alcoholes), metabolitos activos, y sales de un compuesto original. El tipo de sal depende de la naturaleza de los restos dentro del compuesto. Por ejemplo, los grupos ácidos, como los grupos de ácido carboxílico, pueden formar sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos (p. ej., sales de sodio, sales de potasio, sales de magnesio, sales de calcio y también sales con iones de amonio cuaternario fisiológicamente tolerables y adición de ácido sales con amoniaco y aminas orgánicas fisiológicamente tolerables como, p. ej., trietilamina, etanolamina o tris-(2-hidroxietilo) amina). Los grupos básicos pueden formar sales de adición de ácido con, p. ej., ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con ácidos orgánicos carboxílicos o ácidos sulfónicos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico o ácido p-toluenosulfónico. Los compuestos que contienen simultáneamente un grupo básico y un grupo ácido, p. ej., un grupo carboxilo además de átomos de nitrógeno básicos, pueden estar presentes como zwitteriones. Las sales se pueden obtener por métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica, p. ej., combinando un compuesto con un ácido o base inorgánica u orgánica en un disolvente o diluyente, o de otras sales por intercambio catiónico o intercambio aniónico.

[0039] Como se usa en este documento, el término "lactato" se refiere a todas las formas de ácido láctico, incluyendo todas las formas de derivados tales como sal de ácido láctico, ion de ácido láctico, éster de ácido láctico, un solvato en ácido láctico, y/o un oligómero de ácido láctico o un éster de ácido láctico.

[0040] El término "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico del ácido al que está operativamente enlazado, tal como, p. ej., un promotor o un potenciador.

[0041] El término "unido operativamente" se refiere aquí a una configuración en la que una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa a la exógeno LDH que codifica ácido nucleico de tal manera que la secuencia de control influye en la expresión de la LDH codificada.042*

[0042] Como se usa en este documento, el término "deshidrogenasa de lactato parental correspondiente" se refiere a una deshidrogenasa de lactato de origen natural o conocido de otro modo de deshidrogenasa de lactato a partir del cual se basa la secuencia de aminoácidos de una secuencia de LDH variante.

Microorganismos metabolizadores de Ci - células huesped

[0043] Los microorganismos metabolizadores Ci de origen no natural, como se describe en el presente documento, se preparan introduciendo el ácido nucleico codificador de LDH exógeno deseado en la célula huesped deseada. El microorganismo metabolizador C¹ que se modificará genéticamente puede ser una cepa natural, adaptada a la cepa (p. ej., realizando la fermentación para seleccionar cepas con utilización reducida de lactato, tasas de crecimiento mejoradas o aumento del rendimiento de biomasa total en comparación con la cepa original), o previamente modificado de forma recombinante para convertir alcanos o alquenos en lactato, para tener una actividad reducida o mínima de descarboxilasa de piruvato, para tener mayores tasas de crecimiento, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones preferidas, los microorganismos metabolizadores de C¹ no son microorganismos fotosintéticos, tales como algas o plantas. A menudo, el microorganismo metabolizador C¹ de la presente descripción no es levadura, y típicamente, no es un hongo. En algunas realizaciones, el microorganismo metabolizador C¹ de la presente descripción no es un microorganismo fotosintético o un hongo.

[0044] El microorganismo metabolizador C¹ de la presente descripción puede ser un procariota o bacterias, que es una célula modificada genéticamente a partir de uno o más de los géneros Metilomonas, Metilobacter, Metilococcus, Metilosinus, Metilocystis, Metilomicrobium, Metanomonas, Metilophilus, Metilobacillus, Metilobacterium, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Bacillus, Paracoccus, Nocardia, Arthrobacter, Rhodopseudomonas o Pseudomonas.

[0045] En realizaciones adicionales de la divulgación, las bacterias metabolizadoras C¹ es una metanótrofo o un metilotrofo. El microorganismo metabolizador C¹ de la presente invención es un metanótrofo que puede ser una célula modificada genéticamente de uno o más de los géneros Metilomonas, Metilobacter, Metilococcus, Metilosinus, Metilocystis, Metilomicrobium, Metanomonas o Metilocella. En otras realizaciones, el microorganismo metabolizador C¹ de la presente descripción es un metilotrofo que es una célula genéticamente modificada de una o más de las especies Metilobacterium extorquens, Metilobacterium radiotolerans, Metilobacterium populi, Metilobacterium clorometanicum o Metilobacterium nodulans.

[0046] En algunas realizaciones preferidas, el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural de la presente invención es una bacteria metanotrófica modificada genéticamente, que tiene la capacidad de usar metano como carbono y energía de origen. Las bacterias metanotróficas se clasifican en tres grupos en función de sus vías de asimilación de carbono y la estructura interna de la membrana: tipo I (proteobacterias gamma), tipo II (proteobacterias alfa y tipo X (proteobacterias gamma). En algunas realizaciones, el microorganismo metabolizante C¹ no natural de la presente invención es un metanotrofo tipo I modificado genéticamente. En ciertas realizaciones específicas, el microorganismo metabolizador C¹ no natural de la presente invención es un metanotrofo tipo II modificado genéticamente. Los metanotrofos de tipo I usan la vía de monofosfato de ribulosa (RuMP) para la asimilación de carbono, mientras que los metanótrofos de tipo II usan la vía de la serina. El microorganismo metabolizador C¹ no natural de la presente invención puede ser un metanotrofo de tipo X modificado genéticamente. Los metanotróficos de tipo X usan la vía de RuMP pero también expresan bajos niveles de enzimas de la serina vía.

[0047] El microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural de la presente invención puede ser un metanotrofo facultativo modificado genéticamente o un metanotrofo obligado modificado genéticamente. Por ejemplo, el microorganismo metabolizador C¹ de la presente invención puede ser un metanotrófico facultativo que es una célula genéticamente modificada de uno o más de los géneros y/o especies: Metilocella, Metilocystis y Metilocapsa (p. ej., Metilocella silvestris, Metilocella palustris, Metilocella tundrae, Metilocystis daltona cepa SB2, Metilocystis bryophila y Metilocapsa aurea KYG), Metilobacterium organophilum (ATCC 27,886), Metilibium petroleiphilum o variantes de alto crecimiento de los mismos. Las bacterias metanotróficas obligatorias ejemplares incluyen Metilococcus capsulatus (Bath), Metilomonas 16a (ATCC PTA 2402), Metilosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11,196), Metilomicrobium buryatense 5G (Taxonomy ID: 675511, Syst. Appl. Microbiol. 24 (2): 24) (2) (Julio de 2001)), Metilosinus sporium (NRRL B-11,197), Metilocystis parvus (NRRL B-11,198), Metilomonas metanica (NRRL B-11,199), Metilomonas albus (NRRL B-11,200), Metilobacter capsulatus (NRRL B-11,201), Metilomonas flagellata sp AJ-3670 (FERM P-2400), Metilacidiphilum infernorum, Metilacidium, metilacroidcumthycumym, metilacromato de metilo alcaliphilum, o variantes de alto crecimiento de los mismos.

[0048] El microorganismo metabolizante C¹ de origen no natural de la presente descripción puede ser una bacteria metabolizadora de gas de síntesis que es una célula modificada genéticamente de uno o más de los géneros: Clostridium, Moorella, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacterium, Carboxydothermus, Acetogenium, Acetobacterium, Acetoanaerobium, Butyribaceterium, o Peptostreptococ. El microorganismo metabolizador C¹ de la presente descripción puede ser un gas de síntesis que metabolizan bacterias de una o más de las especies: Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans, Butyribacterium metilotrophicum, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen, o una combinación de los mismos.049*

[0049] El microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural de la presente descripción puede ser un eucariota tal como una levadura que es una célula modificada genéticamente a partir de uno o más de los géneros: Candida, Yarrowia, Hansenula, Pichia, Torulopsis, o Rhodotorula.

Sistemas de expresión y vectores; Métodos de Transformación.

[0050] Cualquiera de los microorganismos metabolizadores Ci recombinantes descritos en este documento pueden ser transformados para comprender al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato para proporcionar el anfitrión con una nueva deshidrogenasa de lactato o actividad mejorada de deshidrogenasa de lactato o puede ser modificada genéticamente para eliminar o reducir sustancialmente una función genética endógena usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

[0051] Un número de sistemas de expresión y vectores de expresión útiles para la expresión de ácidos nucleicos heterólogos en microorganismos metabolizadores C¹ son conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico exógena que codifica una deshidrogenasa láctica está operativamente unida a una secuencia de control de la expresión, tal como, p. ej., un promotor.

[0052] Los promotores adecuados para su uso en la práctica de la presente invención pueden ser constitutivos, permeables o inducibles, y nativos o no nativos de la célula huésped empleada. Los promotores ejemplares incluyen una descarboxilasa de piruvato (PDC), un promotor, un promotor de la desoxi-xilulosa fosfato sintasa, un promotor de deshidrogenasa de metanol (MDH) (como, p. ej., el promotor en la región intergénica aguas arriba del gen mxaF del Metilococcus capsulatus (Bath) (Acc. No. Mc a 0779) o el promotor MDH de M. extorquens (Ver Springer et al., FEMS Microbiol. Lett. 160: 119 (1998)), un promotor de 6-fosfato sintasa de hexulosa, un promotor de proteína ribosómica S16, un promotor de serina hidroximetilo transferasa, un promotor de serina-glioxilato aminotransferasa, un promotor de fosfoenolpiruvato carboxilasa, un promotor T5, promotor Trc, un promotor para la síntesis de PHA (Foellner et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 284, 1993), un promotor de descarboxilato de piruvasa (Tokuhiro et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 131: 795, 2006), el promotor lac operon Plac (Toyama et al., Microbiol. 143: 595, 1997), un promotor híbrido como Ptrc (Brosius et al.., Gene 27: 161, 1984), promotores identificados a partir de pl nativos asmid en metilotrofos (EP 296484), metanotrofos y similares.

[0053] Además, los promotores homólogos o heterólogos adecuados para la alta expresión de moléculas de ácido nucleico exógeno pueden ser utilizados. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 7,098,005 describe el uso de promotores para alta expresión en la presencia de metano o metanol de un ácido nucleico de codificación heteróloga en bacterias metabolizantes C¹.

[0054] En ciertas realizaciones, la expresión regulada de los ácidos nucleico exógenos que codifica una o más enzimas de biosíntesis de lactato puede ser deseable para optimizar la tasa de crecimiento de las bacterias metanotróficas de origen no natural y puede mejorar el crecimiento bacteriano en una variedad de condiciones de la fuente de carbono. Esto puede lograrse mediante el uso de un sistema promotor inducible.

[0055] En ciertas realizaciones, una codificación de LDH de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor inducible. Los sistemas promotores inducibles empleados en la práctica de la presente invención incluyen los conocidos en la técnica e incluyen el sistema promotor inducible por tetraciclina; sistema promotor inducible por operón IPTG/lac, sistema promotor inducible por choque térmico; sistemas promotores sensibles al metal; sistema promotor inducible por nitrato; sistema promotor inducible por luz; sistema promotor inducible por ecdisona, el sistema inducible/regulable descrito para uso en bacterias metilotróficas y metanotróficas (véase, p. ej., la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° US 2010/0221813), y similares. Por ejemplo, en una realización, el microorganismo metabolizador C¹ no natural (p. ej., metanotrofo, metilotrofo) comprende: (1) un ácido nucleico exógeno que codifica LDH, unido operativamente a un promotor flanqueado por secuencias de operador lacO, y (2) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína represora lacI unida operativamente a un promotor constitutivo (p. ej., promotor de hexulosa-6-fosfato sintasa). La inducción se inicia cuando la proteína represora LacI se une a las secuencias del operador lacO que flanquean al LDH u otro promotor, evitando la transcripción. IPTG se une al represor lacI y lo libera de las secuencias lacO, lo que permite la transcripción. Mediante el uso de un sistema promotor inducible, la síntesis de lactato puede controlarse mediante la adición de un inductor.

[0056] Los sistemas de expresión y vectores de expresión empleados en la práctica de la presente invención opcionalmente contienen elementos genéticos, tales como, p. ej., uno o más sitios para inicio de la traducción y una unión al ribosoma sitio de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción, múltiples sitios de clonación, otros segmentos de codificación, y similares.

[0057] Los sistemas y vectores de expresión empleados en la práctica de la presente invención pueden contener además elementos genéticos que facilitan la integración por recombinación homóloga o no homóloga. Los elementos genéticos que facilitan la integración por recombinación homóloga tienen homología de secuencia con sitios de integración dirigidos en la secuencia genómica de la célula huésped deseada. Los elementos o técnicas genéticas que facilitan la integración por recombinación no homóloga incluyen la integración mediada por enzimas de restricción (REMI) (ver Manivasakam et al., Mol. Cell Biol. (1998) 18 (3): 1736-1745), integración mediada por transposón, y otros elementos y métodos que son bien conocidos en la técnica.058*

[0058] Los procedimientos recombinantes para la expresión de ácidos nucleicos exógenos o heterólogos en organismos microbianos son bien conocidos en la técnica. Tales métodos se pueden encontrar descritos, p. ej., en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).

[0059] En ciertas realizaciones, la fuerza y el momento de la expresión de las deshidrogenasas lácticas pueden ser modulados utilizando métodos conocidos en la técnica para mejorar la producción de lactato. Por ejemplo, se puede usar la fuerza del promotor variable o el número de copias de ácido nucleico para modular los niveles de expresión. En otro ejemplo, el tiempo de expresión puede modularse usando sistemas promotores inducibles u operones policistrónicos. Por ejemplo, la expresión de LDH puede ocurrir durante la fase de crecimiento y la fase estacionaria del cultivo o solo durante la fase estacionaria. En otro ejemplo, LDH puede sufrir una coexpresión ordenada con otros genes de interés.

[0060] La introducción del ácido nucleico codificador de LDH exógeno en la célula huésped se puede lograr de una variedad de formas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, la electroporación de bacterias metabolizadoras C¹ se ha descrito previamente en, p. ej., Toyama et al., FEMS Microbiol. Letón. 166: 1, 1998; Kim y Wood, Appl. Microbiol Biotecnología 48: 105, 1997; Yoshida y col., Biotechnol. Letón. 23: 787, 2001, y la solicitud de patente de EE. Pub. No. 2008/0026005.

[0061] La conjugación bacteriana, que se refiere a un tipo particular de transformación que implica el contacto directo de los donantes y las células receptoras, se utiliza más frecuentemente para la transferencia de ácidos nucleicos en microorganismos metabolizadores C¹. La conjugación bacteriana implica mezclar las células "donante" y "receptor" juntas en estrecho contacto entre sí. La conjugación se produce mediante la formación de conexiones citoplasmáticas entre las bacterias donantes y receptoras, con transferencia unidireccional de moléculas de ácido nucleico donante recién sintetizadas en las células receptoras. Un receptor en una reacción de conjugación es cualquier célula que puede aceptar ácidos nucleicos mediante transferencia horizontal desde una bacteria donante. Un donante en una reacción de conjugación es una bacteria que contiene un plásmido conjugativo, un transposón conjugativo o un plásmido movilizado. La transferencia física del plásmido donante puede ocurrir a través de un plásmido auto transmisible o con la ayuda de un plásmido "auxiliar". Conjugaciones que implican bacterias metabolizadoras C¹ se han descrito previamente en Stolyar et al, Mikrobiologiya. 64: 686, 1995; Motoyama y col., Appl. Micro. Biotecnología 42:67, 1994; Lloyd y col., Arch. Microbiol 171: 364, 1999; Publicación PCT N° WO 02/18617; y Ali y col., Microbiol.

152: 2931,2006.

[0062] La expresión de ácidos nucleicos heterólogos en bacterias metabolizadoras C¹ se conoce en la técnica (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 6,818,424, Patente de EE.UU. Appl Pub N° 2003/0003528). Se ha descrito la transformación basada en transposón Mu de bacterias metilotróficas (Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.

91: 857, 2011). Se ha descrito un sistema de transposón mini-Tn7 para la expresión simple y multicopia de ácidos nucleicos heterólogos sin inactivación por inserción de genes del huésped en Metilobacterium (Patente de EE.UU. Pub. N22008/0026005).

[0063] Otras modificaciones genéticas a la C¹ pueden desearse metabolización microorganismo tal como se describe en el presente documento, que se pueden impartir usando métodos conocidos. Por ejemplo, varios métodos para inactivar, golpeando-out, o eliminación de la función del gen endógeno en C¹ se pueden usar bacterias que metabolizan. El intercambio alélico usando vectores suicidas para construir mutantes de deleción/inserción en bacterias metabolizadoras de C¹ de crecimiento lento también se ha descrito en, p. ej., Toyama y Lidstrom, Microbiol.

144: 183, 1998; Stolyar y col., Microbiol. 145: 1235, 1999; Ali y col., Microbiol. 152: 2931, 2006; Van Dien y col., Microbiol. 149: 601,2003.

Microorganismos metabolizadores Ci - recombinantes

[0064] Como se ha descrito anteriormente en este documento, los microorganismos metabolizadores C¹ de la presente divulgación se modifican de forma recombinante para incluir ácidos nucleicos exógenos que expresan o sobre expresan la deshidrogenasa de lactato(s) de interés, dando como resultado microorganismos recombinantes útiles para producir lactato. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona bacterias metanotróficas de origen no natural que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica una deshidrogenasa de lactato (LDH), en donde las bacterias metanotróficas son capaces de convertir una materia prima de carbono en lactato. Típicamente, la materia prima de carbono es metano. Los ácidos nucleicos exógenos empleados en la práctica de la presente invención pueden codificar una deshidrogenasa de lactato natural o conocida de otro modo, o una variante de secuencia o truncamiento de dicha deshidrogenasa de lactato parental correspondiente. Dichas variantes de deshidrogenasa de lactato codificadas pueden exhibir solubilidad, expresión, estabilidad, actividad catalítica, tasa de renovación o cualquier combinación de las mismas o pueden ser variantes modificadas de forma conservadora de secuencias conocidas de deshidrogenasa de lactato y las secuencias de deshidrogenasa de lactato descritas en el presente documento.06*

[0066] Ácidos nucleicos exógenos que codifican una deshidrogenasa de lactato adecuada para uso en la práctica de la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos de tipo salvaje que codifican genes de LDH, así como variantes de los mismos. El término "variante de ácido nucleico" se refiere aquí a un ácido nucleico que puede contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones, inserciones, o puede ser o comprender fragmentos de un ácido nucleico de referencia. Un ácido nucleico de referencia se refiere a un tipo salvaje seleccionado (ácido nucleico original) que codifica una enzima LDH particular (p. ej., LdhA). Debido a la redundancia en el código genético, las variantes de ácido nucleico pueden o no afectar la secuencia de aminoácidos.

[0067] Típicamente, ácidos nucleicos exógenos que codifican LDH a ser introducidos en un huésped tal como se describe en el presente documento se someten a codón de optimización antes de la introducción en el huésped para asegurar que la expresión de la proteína es eficaz o mejorada. La optimización de codones se refiere a la alteración de codones en ácidos nucleicos o regiones codificantes de ácidos nucleicos antes de la transformación para reflejar el uso típico de codones del huésped sin alterar el polipéptido codificado por la molécula de ADN no natural. Los métodos de optimización de codones para la expresión óptima de ácido nucleico en huéspedes heterólogos se han descrito previamente (ver, p. ej., Welch et al., PLoS One 4: e7002, 2009; Gustafsson et al., Trends Biotechnol. 22: 346, 2004; Wu et al.., Nucl. Acids Res. 35: D76, 2007; Villalobos et al., BMC Bioinformatics 7: 285, 2006; Publicaciones de Patentes de los Estados Unidos Núms. 2011/0111413 y 2008/0292918).

[0068] Una variante de ácido nucleico puede codificar un LDH de secuencia de aminoácidos que comprende una o más sustituciones conservadoras en comparación con una secuencia de aminoácidos de LDH parental correspondiente. Puede producirse una sustitución conservadora de forma natural en el polipéptido (p. ej., variantes genéticas de origen natural) o puede introducirse cuando el polipéptido se produce de forma recombinante.

[0069] Los ácidos nucleicos exógenos adecuados que codifican un LDH que se puede emplear en la práctica de la presente invención incluyen ácidos nucleicos que codifican una LDH de otros organismos (es decir, deshidrogenasa de lactatos y/o ácidos nucleicos que codifican deshidrogenasa de lactato que no son nativos para el microorganismo huésped C¹). Tal ácido nucleico exógeno puede codificar cualquiera de una serie de secuencias de aminoácidos de LDH que se conocen en la técnica. Además, los ácidos nucleicos que codifican LDH correspondientes que se han aislado y clonado de varios de estos organismos, tales como, p. ej., de bacterias, plantas, levaduras, hongos y animales, pueden ser adecuados para su uso en la práctica de presente invención Con la secuencia completa del genoma disponible para cientos de organismos, la identificación de ácidos nucleicos que codifican la deshidrogenasa de lactato en especies relacionadas o distantes, que incluyen, p. ej., registros homogéneos, ortólogos, parálogos, etc., es bien conocida en la técnica. Estos pueden ser codones optimizados para una expresión óptima del microorganismo metabolizador C¹ deseado utilizando métodos conocidos.

[0070] En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una D- o L- LDH de Actinomyces viscosus, Acinonyx jubatus, Archilochus colubris, Bacillus anthracis, Bacillus caldolyticus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus (Q9p4b6) (también conocida como Geobacillus stearothermophilus), Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacteroides pectinophilus, Bifidobacterium longum, Bos taurus, Canis familiaris, Canis lupus, Deinococcus radiodurans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Equusferus, Felis catus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces maxxianus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis sp. torquens, Lactobacillus delbrueckii (incluyendo subsp. bulgaricus), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobaillus plantaum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria monocytogenes, Listeria marthii, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Thermus thermophilus, Mus musculus, Oryctolagus cuniculus, Pediococcus acidilactici, guttata de Taeniopygia, Rattus norvegicus, Rhizopus oryzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus bovis, Streptococcus pasteurianus, pares de Ruminococcus, Staphylococcus simiae, Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus lentus, Macrococcus caseolyticus, Bacillus thuringiensis seovar konkukian str. 97-27, Bacillus thuringiensis serovar chinensis CT-43, Bacillus mycoides y similares.

[0071] En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno codifica una deshidrogenasa D-lactato. Las secuencias de muchas deshidrogenasa de D-lactato son conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos exógenos ilustrativos empleados en la práctica de la presente invención que codifican una deshidrogenasa de D-lactato incluyen aquellos que codifican una D-LDH de Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantaum, Lactobacillus johnsonii, Leuconostoc mesenteroides (ver, p. ej., JP 2002-136263A y US 2007)./0105202 (s Eq ID NO: 2)); y Lactobacillus helveticus (véase, p. ej., WO 2003/102201). Típicamente, el ácido nucleico que codifica LDH exógeno es un codón optimizado para una expresión óptima de la célula huésped específica empleada.072

[0072] En algunos casos, el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una D-LDH que tiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, a al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos de referencia ("LDH parental") seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 64 y 66, o una variante truncada en N o C terminalmente del mismo, en donde la LDH codificada comprende actividad D-LDH, o en donde el microorganismo metabolizador Ci no natural que comprende dicho ácido nucleico exógeno produce D-lactato (como se determina, p. ej., usando el método del Ejemplo 1 y sustituyendo el EnzyFluo™ D-Lactate Assay Kit (Catálogo N° EFDLC- 100, BioAssay Systems, Hayward, CA 94545) por el EnzyFluo™ L -Kit de ensayo de lactato en el método). En algunas realizaciones, la D-LDH codificada retiene al menos el 50% de la actividad de D-LDH en comparación con la LDH parental. Típicamente, el microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica D-LDH es capaz de producir más lactato en comparación con el correspondiente microorganismo metabolizador C¹ de referencia, cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ bajo al menos un conjunto de condiciones de cultivo. El microorganismo metabolizador C¹ no natural puede comprender un ácido nucleico exógeno que codifica una D-LDH que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 65 y 67, o una variante truncada en el extremo N o C del mismo. En realizaciones específicas, el ácido nucleico exógeno codifica una D-LDH que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID N: 64 o SEQ ID NO: 66.

[0073] El microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural puede comprender un ácido nucleico exógeno que codifica una D-LDH, en donde el ácido nucleico exógeno tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 64 y 66, en donde la LDH codificada comprende actividad D-LDH, o en donde - el microorganismo metabolizador C¹ que ocurre naturalmente que comprende dicho ácido nucleico exógeno produce D-lactato (como se determina, p. ej., usando el método del Ejemplo 1 y sustituyendo el Kit de Ensayo de D-Lactato EnzyFluo™ (Catálogo N° e FDl C-100, BioAssay Systems, Hayward, Ca 94545) para el Kit de Ensayo de L-Lactato EnzyFluo™ en el método). En algunas realizaciones, la D-LDH codificada retiene al menos el 50% de la actividad de D-LDH en comparación con la LDH parental. Típicamente, el microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica D-LDH es capaz de producir más lactato en comparación con el correspondiente microorganismo metabolizador C¹ de referencia, cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ bajo al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

[0074] En ciertas realizaciones, el ácido nucleico exógeno tiene una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 66. El microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende dicho ácido nucleico exógeno puede ser capaz de producir más lactato en comparación con el microorganismo C¹ de referencia correspondiente, cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ en al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

[0075] El microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural puede comprender un ácido nucleico exógeno que codifica un L-LDH. Los ejemplos de ácidos nucleicos de L-LDH incluyen los correspondientes a los números de acceso AEEL01000014,1 (región 176996 a 177985) (Streptococcus bovis), NC_010080,1 (región 957682 a 958608) (Lactobacillus helveticusi), BC146210,1 (Bos taurus), AB776697,1 (Pediococcus acidilactici), EF152288,1 (Rhizopus oryzae), NC_013198,1 (región 619708 a 620646) (Lactobacillus rhamnosus), NC_010610,1 (región 417799 a 418740) (Lactobacillus fermentum), NC_008054 (NC_008054 (NC_008054) 100828) (Lactobacillus delbrueckii), NC_002662,1 (región 1369224 a 1370201) (Lactococcus lactis) y NC_004668,1 (región 231275 a 232258) (Enterococcus faecalis). Por ejemplo, los ácidos nucleicos exógenos empleados en la práctica de la presente invención pueden codificar cualquiera de las siguientes secuencias de polipéptidos ejemplares de L-LDH: N° de acceso EFM27433,1 (Streptococcus bovis), YP_001577351,1 (Lactobacillus helveticus), AAI46211. 1 (Bos taurus), BAM76361,1 (Pediococcus acidilactici), ABL84845,1 (Rhizopus oryzae), YP_003170352,1 (Lactobacillus rhamnosus), Y p001843164,1 (Lactobacillus fermentum), YP 618317,1 (Lactobacillus delbrueckii), NP_267487,1 (Lactococcus lactis), NP_814049,1 (Enterococcusfaecalis); SEQ iD NOs: 52 (Staphylococcus simiae CCM 7213), 53 (Staphylococcus vitulinus F1028), 54 (Staphylococcus lentus F1142), 55 (Macrococcus caseolyticus JCSC5402), 56 (Bacillus thuringiensis. Serovar konkukian str 97-27), 57 (Bacillus thuringiensis serovar chinensis CT- 43) y 58 (Bacillus mycoides DSM 2048).

[0076] El microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural puede comprender un ácido nucleico exógeno que codifica una L-LDH que tiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente e l 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, y al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 y una variante truncada en los extremos N y C del mismo, en donde la LDH codificada comprende actividad L-LDH, o en donde el microorganismo metabolizador C¹ que se produce de forma natural que comprende dicho ácido nucleico exógeno produce L-lactato (según se determina, p. ej., usando el método del Ejemplo 1). En algunas realizaciones, la L-LDH codificada retiene al menos el 50% de la actividad de L-LDH en comparación con la LDH parental. Típicamente, el microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica tal L-LDH es capaz de producir más lactato en comparación con el correspondiente microorganismo metabolizador Ci de referencia, cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ bajo al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

[0077] En algunas realizaciones, la referencia de secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 y 48. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de referencia se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34, 16 y 24. Los ácidos nucleicos exógenos ejemplares incluyen aquellos que codifican una L-LDH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (Streptococcus pasteurianus LDH), 4 (Lactobacillus helveticus LDH), 6 (variante Bos taurus LDH), 8 (Ruminococcus torques LDH), 10 (Rhizopus oryzae LDH), 12 (Enterococcus faecalis LDH), 14 (Lactobacillus casei LDH), 16 (Bacillus megaterium LDH), 18 (Taeniopygia guttata LDH), 20 (Lactobacillus plantarum LDH), 22 (Lactobacillus acidophilus LDH), 24 (Staphylococcus aureus LDH), 26 (Bacillus caldolyticus LDH), 28 (Actinomyces viscosus LDH), 30 (Bacillus anthracis LDH), 32 (Bacteroides pectinophilus LDH), 34 (Listeria marthii LDH), 36 (Bacillus subtilis LDH), 38 (Enterococcus faecium Ld H), 40 (Baco thuringiensis LDH), 42 (Geobacillus stearothermophilus LDH), 44 (Deinococcus radiodurans LDH), 46 (Plasmodium ovale LDH variante), 48 (Thermus thermophilus LDH), 53 (Staphylococcus simiae CCM 7213), 54 (Staphylococcus vitulinus F1028), 54 Staphylococcus lentus F1142), 56 (Macrococcus caseolyticus JCSC5402), 57 (Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27), 58 (Bacillus thuringiensis serovar chinensis CT-43), 59 (Bacillus mycoides DSM 2048), y variante N- y N-C terminalmente truncada de los mismos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno codifica una L-LDH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 y 48. En otras realizaciones, el ácido nucleico exógeno codifica una L-LDH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34, 16, y 24.

[0078] el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural puede comprender un ácido nucleico exógeno que codifica un L-LDH, en donde el ácido nucleico exógeno tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a una secuencia de ácido nucleico de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45 y 47, en donde el LDH codificado comprende actividad L-LDH, o en donde el microorganismo metabolizador C¹ de origin natural que comprende dicho ácido nucleico exógeno produce L-lactato (como se determina, p. ej., usando el método del Ejemplo 1). En algunas realizaciones, la L-LDH codificada retiene al menos el 50% de la actividad de L-LDH en comparación con la LDH parental. Típicamente, el microorganismo metabolizador C¹ no natural que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica tal L-LDH es capaz de producir más lactato en comparación con el correspondiente microorganismo metabolizador C¹ de referencia, cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ bajo al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

[0079] En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43 y 47. En otras realizaciones, el ácido nucleico exógeno codifica una secuencia de ácido nucleico de referencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 33, 15 y 23. Ácidos nucleicos exógenos ilustrativos que codifican una L-LDH incluyen aquellos que tienen una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45 y 47. En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno que codifica una L-LDH comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43 y 47. En ciertas realizaciones específicas, el ácido nucleico exógeno que codifica una L-LDH comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 33, 15, y 23.

[0080] En términos generales, las variantes de truncamiento de las LDH codificadas descritas en el presente documento codifican una LDH de referencia correspondiente (es decir, parental o secuencia de las mismas) que ha sido truncada en el extremo N por aproximadamente 1 a aproximadamente 6 residuos de aminoácidos (o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 residuos de aminoácidos), o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 residuos de aminoácidos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 residuos de aminoácidos, o de 1 a aproximadamente 2 residuos de aminoácidos, o que está truncado en el extremo N por 1 residuo de aminoácido), y/o C-terminalmente truncado por de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos (o de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, o aproximadamente 5 residuos de aminoácidos).081*

[0081] En ciertas realizaciones de los microorganismos metabolizadores C¹ de origen no natural descritos en este documento, el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural es capaz de producir al menos aproximadamente 1,5 veces más lactato como en comparación con el de un microorganismo metabolizador C¹ correspondiente de referencia cuando se cultiva en presencia de un sustrato C¹ (p. ej., metano) en al menos un conjunto de condiciones de cultivo. En otras realizaciones, el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural es capaz de producir al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 1000 veces y hasta aproximadamente 15.000 veces o hasta aproximadamente 20.000 veces más lactato en comparación con el correspondiente microorganismo metabolizador Ci de referencia cuando se cultiva en presencia de un sustrato Ci (p. ej., metano) en al menos un conjunto de condiciones de cultivo.

[0082] Los métodos para generar ácidos nucleicos exógenos que codifican variantes de LDH pueden diseñarse usando los métodos basados en filogenética descritos en las referencias mencionadas anteriormente (Patente de Estados Unidos N° 8,005,620; Gustafsson; Welch y col.] Villalobos y col.] Minshull y col.). Cada variante de LDH generada por estos métodos retendrá al menos 50% de actividad (preferiblemente 100% o más de actividad) y tendrá una secuencia de polipéptidos que sea al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, a al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntico o 100% idéntico a una secuencia de polipéptidos de referencia o parental de tipo salvaje. En ciertas realizaciones, las variantes de LDH codificadas incluirán al menos una sustitución de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más o hasta 20, 25 o 30 sustituciones) en una posición predeterminada con respecto a una enzima de referencia o parental de tipo salvaje, siempre que una variante retenga la actividad de deshidrogenasa de lactato (p. ej., actividad de deshidrogenasa de L­ o D- lactato o producción de L- o D- lactato). En este documento se describen ensayos ejemplares para determinar la actividad de deshidrogenasa de D- y L-lactato.

[0083] En algunas realizaciones, el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural de la presente descripción comprende dos o más ácidos nucleicos, cada uno codifica una deshidrogenasa de lactato, en donde las secuencias de los ácidos nucleicos y/o las secuencias de las LDH pueden ser iguales o diferentes. En ciertas realizaciones, se introducen múltiples copias de un ácido nucleico que codifica LDH en una célula huésped, que puede ser dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más copias de la misma LDH o diferente codificación de LDH ácidos nucleicos. Cuando se introducen dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas en un microorganismo metabolizador C¹ del huésped, se entiende que las dos moléculas de ácido nucleico exógenas más se pueden introducir como una molécula de ácido nucleico individual (p. ej., en un solo vector), vectores por separado, integrados en el cromosoma del huésped en un solo sitio o en múltiples sitios, y cada una de estas realizaciones todavía debe considerarse dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas. Por ejemplo, se pueden introducir más de una molécula de ácido nucleico heterólogo o exógeno en una célula huésped, p. ej., como moléculas de ácido nucleico separadas, como una molécula de ácido nucleico policistrónico, como una molécula de ácido nucleico única que codifica una proteína de fusión, o cualquier combinación de las mismas., y aún se considerará como más de un ácido nucleico heterólogo o exógeno.

[0084] En ciertas realizaciones, el ácido nucleico exógeno se introduce en una célula huésped por conjugación, transformación, transfección, electroporación, o similar, en donde la molécula añadida puede integrar en el genoma del huésped o puede existir como material genético extra-cromosómico (p. ej., como un plásmido u otro vector autorreplicante).

[0085] En ciertas realizaciones, los microorganismos metabolizadores C¹ de origen no natural de la presente divulgación comprenden además modificaciones genéticas adicionales. Por ejemplo, una secuencia de control heteróloga (p. ej., promotor, potenciador) puede usarse para regular la expresión de un gen o ácido nucleico nativo de una manera diferente de la forma en que un gen o ácido nucleico nativo se expresa normalmente en la naturaleza o en el cultivo.. Se pueden hacer otras modificaciones genéticas, como, p. ej., para reducir o inhibir la descarboxilasa de piruvato endógena, la metilglioxal sintasa, LDH (p. ej., LDH aeróbica, D-LDH), sintasa de glucógeno, fosfoglucomutasa o cualquier combinación de las mismas para aumentar la producción de lactato, rendimiento de lactato, o ambos. En tales realizaciones, los microorganismos metabolizadores de C¹ no naturales (p. ej., bacterias metanotróficas no naturales) que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica LDH como se describe en el presente documento tendrán un gen de descarboxilasa de piruvato endógeno borrado o mutado de modo que la actividad de descarboxilasa de piruvato sea mínima a indetectable. En ciertas realizaciones, los microorganismos metabolizadores de C¹ no naturales (p. ej., bacterias metanotróficas no naturales) que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica LDH como se describe en el presente documento tendrán un ácido nucleico endógeno borrado o mutado que codifica la metilglioxal sintasa u otra enzima de la vía de derivación de metilglioxal tal que la vía de derivación de metilglioxal tiene una actividad mínima a indetectable para minimizar la acumulación de metilglioxal (un subproducto tóxico).

[0086] En ciertas realizaciones, microorganismos metabolizadores C¹ no naturales (p. ej., Bacterias metanotróficas no naturales) que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica una LDH como se describe en el presente documento tendrá un D-LDH endógeno eliminado o mutado para minimizar o evitar síntesis de una mezcla racémica de D-lactato y L-lactato, en donde el microorganismo metabolizador C¹ no natural produce L-lactato. En ciertas realizaciones, los microorganismos metabolizadores de C¹ no naturales (p. ej., bacterias metanotróficas no naturales) se transforman con dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más copias de una LDH que codifica moléculas de ácido nucleico exógeno. En realizaciones adicionales, los microorganismos metabolizadores de C¹ no naturales (p. ej., bacterias metanotróficas no naturales) que comprenden una molécula de ácido nucleico exógena que codifica LDH como se describe en este documento sobreexpresan LDH a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más veces en comparación con el nivel de expresión normal de LDH endógeno.087*

[0087] Microorganismos metabolizadores C¹ no naturales (p. ej., metanótrofos, metilótrofos) de la presente divulgación también pueden modificarse por ingeniería genética que comprenden la variantes de rutas o enzimas de lactato biosintéticas. La variación en la síntesis de lactato puede ocurrir en uno o más pasos individuales de una ruta o involucrar una ruta completamente nueva. En ciertas realizaciones, las reacciones particulares de la ruta del lactato son catalizadas por enzimas de lactato variantes o alternativas, que pueden estar en combinación con la inhibición o la anulación de la actividad de piruvato descarboxilasa, actividad de alcohol deshidrogenasa, una o más enzimas de la ruta de derivación de metilglioxal, D-LDH, glucógeno sintasa, fosfoglucomutasa, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, se usan rutas híbridas con ácidos nucleicos derivados de dos o más fuentes para mejorar la producción de lactato, el rendimiento, o ambos.

[0088] Se conocen varios métodos para inhibir, inactivar, knocking-out, o eliminar la función del gen endógeno en bacterias metanotróficas en la técnica. Por ejemplo, la disrupción genética dirigida es un método efectivo para la regulación negativa de genes donde un ácido nucleico exógeno se inserta en un gen estructural para interrumpir la transcripción. Los casetes genéticos que comprenden el ADN de inserción exógena (p. ej., un marcador genético) flanqueado por una secuencia que tiene un alto grado de homología de secuencia con una porción del gen huésped diana a ser interrumpido se introducen en las bacterias metanotróficas del huésped. El ADN exógeno altera el gen del huésped diana a través de mecanismos de replicación del ADN nativo. El intercambio alélico para construir mutaciones de deleción/inserción en microorganismos metabolizadores C¹, incluidas las bacterias metanotróficas, se han descrito, p. ej., en Toyama y Lidstrom, Microbiol. 144: 183, 1998; Stolyar y col., Microbiol. 145: 1235, 1999; Ali y col., Microbiol.

152: 2931,2006; Van Dien y col., Microbiol. 149: 601,2003; Martin y Murrell, FEMS Microbiol. Letón. 127: 243, 2006.

Métodos de cultivo

Métodos de producción de lactato

[0089] En el presente documento se describen métodos para producir lactato, que comprenden cultivar un microorganismo metabolizador C¹ no natural. (p. ej., metanotrofo, metilotrofo) que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica la deshidrogenasa de lactato en presencia de una materia prima de carbono en condiciones suficientes para producir lactato. Típicamente, la materia prima de carbono se selecciona del grupo que consiste en metano, metanol, gas de síntesis y gas natural. Más típicamente, la materia prima de carbono se selecciona del grupo que consiste en metano y gas natural. Los métodos para el crecimiento y mantenimiento de cultivos bacterianos metanotróficos son bien conocidos en la técnica. Se pueden usar diversas realizaciones de bacterias metanotróficas no naturales descritas en el presente documento en los métodos de producción de lactato, tales como ácido L-láctico y sus sales y ésteres.

[0090] En ciertas realizaciones, el lactato se produce durante una fase específica del crecimiento celular (p. ej., la fase de retardo, la fase de registro, la fase estacionaria, o fase de muerte). Puede ser deseable que el carbono de la materia prima se convierta en lactato en lugar de en crecimiento y mantenimiento del microorganismo metabolizador C¹. En algunas realizaciones, el microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural (p. ej., metanótrofos, metilótrofos) como se describe en el presente documento se cultivan a una densidad celular baja a media (OD⁶⁰⁰) y luego se inicia la producción de lactato. En algunas realizaciones, se produce lactato mientras que el microorganismo metabolizador C¹ (p. ej., bacterias metanotróficas) ya no se divide o se divide muy lentamente. En algunas realizaciones, el lactato se produce solo durante la fase estacionaria. En algunas realizaciones, el lactato se produce durante la fase logarítmica y la fase estacionaria.

[0091] La composición de fermentador que comprende lactato producido por microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural (p. ej., metanótrofos, metilótrofos) según la invención puede comprender además otros compuestos orgánicos asociados con los procesos de fermentación biológicos. Por ejemplo, los subproductos biológicos de la fermentación pueden incluir uno o más de alcoholes, epóxidos, aldehídos, cetonas, ésteres o una combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, la composición del fermentador puede contener uno o más de los siguientes alcoholes: metanol, etanol, butanol o propanol. Otros compuestos, como H² O, CO, CO² , CON² , H² , O² y materias primas de carbono no utilizadas, como metano, etano, propano y butano, también pueden estar presentes en el gas de escape del fermentador.

[0092] Condiciones suficientes para producir lactato incluyen el cultivo del microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25° a aproximadamente 50°C. En algunas realizaciones, la temperatura de cultivo está en el rango de aproximadamente 37° a aproximadamente 50°C, y puede estar en el rango de aproximadamente 37°C a aproximadamente 45°C. Otras condiciones suficientes para producir lactato incluyen el cultivo del microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural a un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, y a menudo en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.093*

[0093] En ciertas realizaciones, microorganismo metabolizador C¹ de origen no natural (p. ej., metanótrofos, metilótrofos) dado a conocer en el presente documento producen lactato a aproximadamente 0,001 g/l de cultivo a aproximadamente 500 g/l de cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de lactato producido es de aproximadamente 1 g/l de cultivo a aproximadamente 100 g/l de cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de lactato producido es de aproximadamente 0,001 g/L, 0,01 g/L, 0,025 g/L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,15 g/L, 0,2 g/L, 0,25 g/L, 0,3g/L, 0,4g/L, 0,5g/L, 0,6g/L, 0,7g/L, 0,8g/L, 0,9g/L, 1g/L, 2,5g/L, 5g/L, 7,5 g/L, 10g/L, 12,5g/L, 15g/L, 20g/L, 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/L, 60g/L, 70g/L, 80g/L, 90g/L, 100g/L, 125g/L, 150g/L, 175g/L, 200g/L, 225g/L, 250g/L, 275g/L, 300g/L, 325g/L, 350g/L, 375g/L, 400g/L, 425g/L, 450g/L, 475g/L, o 500g/L.

[0094] En ciertas realizaciones, el lactato es un líquido sustancialmente purificado. Los métodos de purificación son conocidos en la técnica y la pureza puede evaluarse mediante métodos tales como cromatografía en columna, HPLC o análisis GC-MS. En ciertas realizaciones, el lactato tiene al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de pureza en peso.

[0095] En ciertas realizaciones, al menos una parte de la fase gas que queda después de una o más etapas de lactato de recuperación se recicla de nuevo en el sistema de fermentación.

[0096] Una variedad de metodologías de cultivo puede usarse para las bacterias metanotróficas recombinantes descritas en la presente memoria. Por ejemplo, las bacterias metanotróficas se pueden cultivar mediante cultivo discontinuo o metodologías de cultivo continuo. En ciertas realizaciones, los cultivos se cultivan en una unidad de cultivo controlada, tal como un fermentador, biorreactor, biorreactor de membrana de fibra hueca, o similares.

[0097] Un método de lote clásico de cultivo es un sistema cerrado donde la composición de los medios de comunicación se establece al comienzo del cultivo y no sujeto a alteraciones externas durante el proceso de cultivo. Por lo tanto, al comienzo del proceso de cultivo, los medios se inoculan con el microorganismo metabolizador C¹ deseado (p. ej., metanotrofo) y se permite que ocurra crecimiento o actividad metabólica sin agregar nada al sistema. Típicamente, sin embargo, un cultivo "discontinuo" es discontinuo con respecto a la adición de una fuente de carbono y a menudo se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En sistemas discontinuos, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que finaliza el cultivo. Dentro de los cultivos discontinuos, las células se moderan a través de una fase de retraso estático a una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente a una fase estacionaria donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se trata, las células en la fase estacionaria eventualmente morirán. Las células en fase de crecimiento logarítmico a menudo son responsables de la producción en masa del producto final en algunos sistemas. La producción de fase estacionaria o post-exponencial se puede obtener en otros sistemas.

[0098] El sistema de alimentación por lotes es una variación en el sistema por lotes estándar. Los procesos de cultivo Fed-Batch comprenden un sistema de lote típico con la modificación de que el sustrato se agrega en incrementos a medida que avanza el cultivo. Los sistemas Fed-Batch son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. La medición de la concentración real de sustrato en los sistemas Fed-Batch es difícil y, por lo tanto, se estima sobre la base de los cambios de factores medibles, como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases residuales como el CO². Los métodos de cultivo Batch y Fed-Batch son comunes y conocidos en la técnica (véase, p. ej., Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2a Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36: 227, 1992).

[0099] Cultivos continuos son sistemas "abiertos", donde se añade un medio de cultivo definidos continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultáneamente durante el procesamiento. Los cultivos continuos generalmente mantienen las células en una densidad de fase líquida alta constante donde las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica. Alternativamente, el cultivo continuo se puede practicar con células inmovilizadas donde se añaden continuamente carbono y nutrientes y se eliminan continuamente productos valiosos, subproductos y productos de desecho de la masa celular. La inmovilización celular puede realizarse usando una amplia gama de soportes sólidos compuestos de materiales naturales y/o sintéticos.

[0100] El cultivo continuo o semi-continuo permite la modulación de un factor o de cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o la concentración de producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitado, como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, a una velocidad fija y permitirá que todos los demás parámetros se modifiquen. En otros sistemas, varios factores que afectan el crecimiento pueden alterarse continuamente mientras la concentración celular, medida por la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento en estado estable y, por lo tanto, la pérdida celular debido a la extracción de los medios debe equilibrarse con la tasa de crecimiento celular en el cultivo. Los métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de cultivo continuo, así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto, son bien conocidos en la técnica, y Brock, supra, detalla una variedad de métodos.

[0101] Biorreactores de fase líquida (p. ej., tanque agitado, lecho de relleno, una fase líquida, fase de dos líquidos, membrana de fibra hueca) son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para el crecimiento de microorganismos y biocatálisis de origen no natural.012*

[0102] Mediante el uso de biorreactores en fase gaseosa, los sustratos para la bioproducción son absorbidos de un gas por microorganismos no naturales, lisados celulares o fracciones libres de células de los mismos, en lugar de un líquido. El uso de biorreactores en fase gaseosa con microorganismos es conocido en la técnica (p. ej., Las patentes de EE.UU. Nos 2,793,096; 4,999,302; 5,585,266; 5,079,168; y 6,143,556; Registro de Invención Estatutaria de EE.UU.

H1430; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2003/0032170; Emerging Technologies in Hazardous Waste Management III, 1993, eds. Tedder y Pohland, pp. 411 -428). Los ejemplos de biorreactores de fase gaseosa incluyen un sistema de paso único, un sistema de bombeo de circuito cerrado y un reactor de lecho fluidizado. Al utilizar biorreactores en fase gaseosa, el metano u otros sustratos gaseosos están fácilmente disponibles para la bioconversión por polipéptidos con, p. ej., actividad monooxigenasa. En ciertas realizaciones, los métodos para convertir un gas en una composición de lactato se realizan en biorreactores en fase gaseosa. En realizaciones adicionales, los métodos para convertir un gas en una composición de lactato se realizan en reactores de lecho fluidizado. En un reactor de lecho fluidizado, un fluido (es decir, gas o líquido) se pasa hacia arriba a través de portadores de lecho de partículas, generalmente arena, carbón activado granular o tierra de diatomeas, en donde los microorganismos pueden unirse y crecer. La velocidad del fluido es tal que los portadores de lecho de partículas y los microorganismos unidos están suspendidos (es decir, la fluidización del lecho). Los microorganismos unidos a los soportes del lecho de partículas circulan libremente en el fluido, lo que permite la transferencia de masa efectiva de sustratos en el fluido a los microorganismos y un mayor crecimiento microbiano. Los ejemplos de reactores de lecho fluidizado incluyen reactores de flujo enchufable y reactores completamente mezclados. Los usos de reactores de lecho fluidizado con biopelículas microbianas son conocidos en la técnica (p. ej., Pfluger et al., Bioresource Technol.

102: 9919, 2011; Fennell et al., Biotechnol, Bioengin. 40: 1218, 1992; Ruggeri et al., Water Sci. Technol. 29: 347, 1994; Patentes de los Estados Unidos Nos 4,032,407; 4,009, 098; 4,009,105; y 3,846,289).

[0103] Las bacterias metanotróficas descritas en la presente descripción pueden cultivarse como un cultivo puro aislado, con un microorganismo o heterólogos no metanotróficos que pueden ayudar con el crecimiento, o con una o más cepas o especies diferentes de bacterias metanotróficas pueden combinarse para generar un cultivo mixto.

[0104] En realizaciones alternativas, los métodos descritos en el presente documento usan microorganismos metabolizadores C¹ recombinantes como se describe en el presente documento o lisados celulares de los mismos inmovilizados en, dentro o detrás de una matriz sólida. En realizaciones adicionales, los microorganismos C¹ que se producen de forma no natural descritos en este documento, los lisados celulares o sus extractos libres de células están en un estado sustancialmente no acuoso (p. ej., liofilizados). Los microorganismos recombinantes, los lisados celulares o sus fracciones libres de células se unen temporal o permanentemente sobre, dentro o detrás de una matriz sólida dentro de un biorreactor. Los nutrientes, sustratos y otros factores requeridos se suministran a las matrices sólidas para que las células puedan catalizar las reacciones deseadas. Los microorganismos recombinantes pueden crecer en la superficie de una matriz sólida (p. ej., como una biopelícula). Los microorganismos recombinantes, los lisados celulares o las fracciones libres de células derivadas de los mismos pueden unirse a la superficie o dentro de una matriz sólida sin crecimiento celular o en un estado no vivo. Los ejemplos de soportes de matriz sólida para microorganismos incluyen anillos de polipropileno, anillos biológicos de cerámica, monturas de cerámica, soportes fibrosos (p. ej., membrana), perlas de vidrio poroso, cuentas de polímero, carbón, carbón activado, gel de sílice seco, alúmina en partículas, arena de Ottawa, arcilla, láminas de soporte de células de poliuretano y portador de partículas de lecho fluidizado (p. ej., arena, carbón activado granular, tierra de diatomeas, perlas de gel de alginato de calcio).

[0105] El lactato producido usando las composiciones y métodos descritos en el presente documento puede procesarse adicionalmente en otros productos de alto valor usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, después de la recuperación o purificación, se puede cambiar o derivatizar el lactato para diversos usos, como la fabricación de bioplásticos.

[0106] También se describen productos útiles, que incluyen lactato y composiciones de los mismos, y los de origen no natural que se producen microorganismos metabolizadores C¹ discutidos en este documento. Las composiciones de la presente descripción pueden estar en forma de un sólido (p. ej., un polvo) o líquido (p. ej., solución, emulsión, suspensión y similares) y pueden comprender lactato en combinación con un componente seleccionado del grupo que consiste en un microorganismo metabolizador C¹ no natural descrito aquí, agua, una sal, un ácido, una base, un tampón y similares.017*

[0107] El lactato y las composiciones del mismo producidas usando los métodos descritos en este documento pueden distinguirse del lactato producido a partir de productos petroquímicos o de lactato biosintetizado a partir de bacterias no metanotróficas mediante huellas dactilares de carbono. A modo de antecedentes, las mediciones isotópicas estables y los enfoques de balance de masa se utilizan ampliamente para evaluar las fuentes globales y los sumideros de metano (véase Whiticar y Faber, Org. Geochem. 10: 759, 1986; Whiticar, Org. Geochem. 16: 531, 1990) Se puede determinar una medida del grado de fraccionamiento isotópico de carbono causado por la oxidación microbiana del metano midiendo el valor de la firma isotópica (es decir, relación de isótopos estables 13C: 12C) del metano residual. Por ejemplo, los metanotrofos aeróbicos pueden metabolizar el metano a través de una enzima específica, la monoxigenasa de metano (MMO). Los metanótrofos convierten el metano en metanol y, posteriormente, el formaldehído. El formaldehído puede oxidarse aún más a CO² para proporcionar energía a la célula en forma de equivalentes reductores (NADH), o incorporarse a la biomasa a través de los ciclos RuMP o serina (Hanson y Hanson, Microbiol. Rev. 60: 439, 1996), que son directamente análogos a las vías de asimilación de carbono en los organismos fotosintéticos. Más específicamente, un metanotrofo Tipo I usa la ruta RuMP para la síntesis de biomasa y genera biomasa completamente a partir de CH⁴ , mientras que un metanotrofo Tipo II usa la ruta de serina que asimila el 50-70% del carbono celular del CH⁴ y el 30-50% de CO² (Hanson y Hanson, 1996). Los métodos para medir las composiciones de isótopos de carbono se proporcionan, p. ej., en Templeton et al. (Geochim. Cosmochim. Acta 70: 1739, 2006). La relación de isótopos de carbono estable de ¹³C/12C de lactato (informada como un valor de 5 13C en partes por mil, %»), varía según la fuente y la pureza del sustrato de C¹ utilizado (véase, p. e j, la Figura 2).

[0108] Por ejemplo, el lactato derivado del petróleo tendrá una distribución 5 13C de aproximadamente -22 a aproximadamente -24 %». El lactato biosintetizado principalmente a partir de glucosa derivada del maíz (5 13C -10,73 %») tiene un 513C de aproximadamente -14,66 a -14,85 %». Se espera que el lactato biosintetizado a partir de fuentes de carbono renovables tenga valores de 5 13C que sean menos negativos que el lactato derivado del petróleo. Sin embargo, la distribución 5 13C del metano del gas natural se diferencia de la mayoría de las fuentes de carbono, con una distribución 513C más negativa que el petróleo crudo. Las bacterias metanotróficas muestran una preferencia por utilizar 12C y reducir su consumo de 13C en condiciones de exceso de metano, lo que resulta en un mayor desplazamiento negativo del valor de 5 ¹³C. El lactato producido por bacterias metanotróficas como se describe en el presente documento tiene una distribución 5 13C más negativa que el lactato de petróleo crudo o fuentes de carbono renovables, que varía de aproximadamente -30 a aproximadamente -70 %».

[0109] En ciertas realizaciones, una composición de lactato (es decir, una composición que comprende un lactato) y el lactato contenido en ella tienen una distribución 5 13C de menos de aproximadamente -30 %», -40 o -50 %». En ciertas realizaciones, la composición de lactato y el lactato que contiene tienen una distribución de 5 13C de aproximadamente -30 a aproximadamente -40 %», o de aproximadamente -40 a aproximadamente -50 %». En realizaciones adicionales, la composición de lactato y el lactato contenido en ella tienen un 513C de menos de -30 %», menos de -31 %», menos de -32 %», menos de -33 %», menos de -34 %», menos de - 35 %», menos de -36 %», menos de -37 %0, menos de -38 %„, menos de -39 %», menos de -40 %», menos de -41 %», menos de -42 %», menos de -43 %„, menos de -44 %», menos de -45 %», menos de -46 %», menos de -47 %», menos de -48 %», menos de -49 %», menos de -50 %», menos de -51 %», menos que -52 %», menos que -53 %», menos que -54 %», menos que -55 %», menos que -56 %», menos que -57 %», menos que -58 %», menos que -59 %», menos que - 60 %», menos de -61 %», menos de -62 %», menos de -63 %», menos de -64 %», menos de -65 %», menos de ^{- 6 6} %», menos de -67 %», menos de ^{- 6 8} %», menos de -69 ^{% 0} o menos de -70 %». En realizaciones específicas, el lactato en tales realizaciones puede ser el ácido libre (es decir, ácido láctico, CH³CH(OH)COOH, en donde dicho ácido libre tiene un 513C como se describió anteriormente. En otras realizaciones, el lactato puede ser un sal, anhídrido, oligómero o éster que contiene uno o más grupos CH³C(OH)C(O)-(como en el caso de una sal o éster) o uno o más grupos CH³C(O-)C(O)-) (como en el caso de ciertos ésteres, oligómeros y anhídridos), en los que los átomos de carbono del grupo lactato tienen un 513C como se describe aquí.01

[0110] Los anteriores y otros aspectos de la invención se pueden entender mejor en relación con los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

MICROORGANISMOS METABOLIZADORES C¹ MODIFICADOS PARA LA PRODUCCIÓN DE LACTATO

I. Metilococcus capsulatus (Bath) diseñado para la producción de lactato.

[0111] Las células huésped (Metilococcus capsulatus (Bath)) fueron diseñadas para poseer una dehidrogenasa de L-lactato exógeno (ldh) de ácido nucleico para permitir la producción de L-lactato de un sustrato C¹ (metano). Las secuencias de ácido nucleico que codifican las deshidrogenasa de lactatos se codificaron para el Metilococcus capsulatus (Bath) y se sintetizaron. Estos ácidos nucleicos optimizados con codones corresponden en secuencia a las siguientes SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43 y 45. Codifican las siguientes LDH, respectivamente, SEQ ID NO: 2 (Streptococcus pasteurianus), 4 (Lactobacillus helveticus), ⁶ (Bos taurus), ⁸ (Pediococcus acidilactici), 10 (Rhizopus oryzae), 12 (Enterococcus faecalis), 14 (Lactobacillus casei), 16 (Bacillus megaterium), 18 (Taeniopygia guttata), 20 (Lactobacillus plantarum), 22 (Lactobaillus acidophilus), 24 (Staphylococcus aureus), 26 (Bacillus caldolyticus), 28 (Actinomyces viscosus), 30 (Bacillus anthracis), 32 (Ruminococcus torques), 34 (Listeria marthii), 36 (Bacillus subtilis), 38 (Enterococcus faecium), 40 (Bacillus thuringiensis), 42 (Geobacillus stearothermophilus), 44 (Deinococcus radiodurans), 46 (Plasmodium ovale (variante)) y 48 (Thermus thermophilus). Los ácidos nucleicos de LDH se clonaron en el plásmido pMS3 (representado en la Figura 3) aguas abajo de un sistema promotor que era el promotor de deshidrogenasa de metanol (MDH) con sitio de unión al ribosoma (SEQ ID NO: 49, promotor putativo de la proteína de deshidrogenasa de metanol de M. capsulatus (Bath), subunidad grande n229 (MCA0779)) (vector pMS3x1) o alternativamente en el mismo vector con uno de los dos sitios de unión ribosomal mutados diferentes (vectores pMS3x2 y pMS3x3) o aguas abajo del promotor MDH en un promotor inducible por sistema de IPTG (LacIq) (con sitio de unión al ribosoma nativo (vector pMS3z1) o alternativamente en el mismo vector con uno de los dos sitios de unión al ribosoma mutados diferentes sitios de unión al ribosoma mutado (vectores pMS3z2 y pMS3z3). pMS3, derivado del plásmido RK2 (ver Schmidhauser, et al. al., J. Bacteriol. 164 (1): 446-55 (1985)) es un plásmido mínimo que contiene secuencias que codifican una proteína de iniciación de replicación (trfA) y un promotor (Pb1a), un origen de replicación (oriV), un origen de transferencia (oriT), y el gen y promotor de resistencia a la kanamicina (promotor KanR). Los vectores se introdujeron en Metilococcus capsulatus (Bath) a través de apareamiento conjugado basado en los métodos informados por Ali y Murrell (Microbiology 155: 761,2009).

[0112] Los vectores se transformaron primero en E. coli S17-1 utilizando métodos de electroporación estándar. La transformación se confirmó mediante la selección de colonias resistentes a la kanamicina en agar LB que contenía 30 pg/ml de kanamicina. La secuencia del plásmido donante se verificó mediante secuenciación. Las colonias transformadas se inocularon en medios LB que contenían 30 pg/ml de kanamicina y se agitaron durante la noche a 37°C. Se usaron alícuotas (p. ej., 100 ml) de cultivos nocturnos para inocular medios LB frescos que contenían 30 pg/ml de kanamicina y luego se cultivaron hasta una densidad óptica (OD600) entre 0,45-0,6 (crecimiento de la fase de registro medio). Alícuotas de este segundo cultivo equivalentes a un OD de 1^{, 6} (p. ej., 3 ml de un cultivo con un OD600 de 0,5) se sedimentaron luego por centrifugación y se lavaron tres veces con MM-W¹ estéril por centrifugación y resuspensión. Luego se recogió una alícuota de 10 ml del cultivo nocturno en un filtro de nitrocelulosa estéril de 47 mm (tamaño de poro de 0,2 mm). Las células donantes de E. coli se lavaron en el filtro con 50 ml de medio NSM estéril para eliminar los medios residuales y el antibiótico.

[0113] En paralelo, se inoculó una muestra de la cepa receptora del M. capsulatus (Bath) (NCIMB 11132) en frascos de suero de 100 ml que contenían 20-50 ml de medio MM-W1. Las botellas se sellaron con septos de caucho de butilo y se rizaron y luego se introdujeron entre 40-60 ml de metano en la botella sellada. Las botellas se agitaron continuamente en una incubadora a 42°C hasta alcanzar un OD600 de aproximadamente 0,3. Aproximadamente 5 ml de cultivo de M. capsulatus (Bath) se sedimentaron por centrifugación y se mezclaron con las células donantes de E. coli. Esta mezcla se colocó en una placa de agar MM-W1 que contenía un 0,5% de extracto de levadura y se incubó durante 48 ha 37°C en presencia de una mezcla 1:1 de metano y aire. Después de 24 h, las células se resuspendieron en 0,5 ml de medio estéril (MM-W1) y se extendieron alícuotas (100 ml) sobre placas de agar MM-W1 que contenían 7,5 pg/ml de kanamicina.

[0114] Las placas se incubaron en cámaras selladas que contienen una mezcla 1:1 de metano y aire y se mantuvieron a 42°C (M. capsulatus (Bath)). La mezcla de gases se reponía aproximadamente cada ² días hasta que se formaron colonias, típicamente después de 5-8 días. Se colonizaron colonias en placas NSM que contenían kanamicina para confirmar la resistencia a la kanamicina, así como para aislar aún más las células transformadas de metanotrofas de las células donantes de E. coli residuales.

[0115] La presencia de expresión Idh o función de LDH se verificó por (1) PCR y secuenciación y/o (2) ensayo para la presencia de lactato. Por ejemplo, para verificar que el material de la colonia de transferencia se hirvió a 98°C y se sometió a PCR usando condiciones estándar (98°C durante 1 min; 30 ciclos de 98°C durante 10 s, 55°C durante 30 s y 72°C durante 1 min; 72°C durante 10 min). Opcionalmente, como control adicional, 1 ml de cada uno de los plásmidos aislados se puede transformar de nuevo en E. coli XL1-Blue MRF'Kan (Stratagene, La Jolla, CA), y los plásmidos se pueden aislar para verificar por digestión de endonucleasa de restricción.

[0116] El M. capsulatus (Bath) recombinante se cultivó a 42°C en placas de 24 pocillos que contenían medio MM-W1 contenido en cámaras selladas. La composición del espacio de cabeza se ajustó a un volumen 1:1 de metano: aire. Las botellas se agitaron a una velocidad de 200-250 rpm. Alternativamente, el cultivo se mantuvo en placas de medio MM-W1 solidificadas con agar al 1,5% p/v cultivado en una cámara hermética a los gases que contenía una mezcla 1:1 (v/v) de metano: aire-gas. Las placas se incubaron invertidas en la cámara a 42°C.

Producción de lactato a partir de un sustrato Ci (CH4)

[0117] M. capsulatus (Bath) transformado con un vector solo (es decir, control negativo sin el ácido nucleico y promotor que codifica LDH exógeno) o vector que contiene el ácido nucleico LDH exógeno y el sistema promotor se usaron para inocular 2,5 ml de medio MM-W1/pocillo de placas de 24 pocillos con 7,5 pg/ml de kanamicina. La composición del medio MM-W1 utilizada fue la siguiente: 0,8 mM MgSO4 * ⁷ H2O, 10 mM NaNO3, 0,14 mM CaCl2, 1,2 mM NaHCO3, 2,35 mM KH2PO4, 3,4 mM K2HPO4, 20,7 pM Na2MoO4 * ² H2O, 1 pM CuSO4 * ⁵ H2O, 10 pM FeIII-Na-EDTA, y 1 ml por litro de solución de metales traza (que contiene, por litro, 500 mg de FeSO4 * ⁷ H2O, 400 mg de ZnSO4 * ⁷ H2O, 20 mg MnCl2 * ⁷ H2O, 50 mg de CoCl2 * ⁶ H2O, 10 mg NiCl2 * ⁶ H2O, 15 mg H3BO3, 250 mg EDTA). Se agregaron fosfato, bicarbonato y FeIII-Na-EDTA después de que el medio se esterilizara en autoclave y se enfriara. Las placas se colocaron en cámaras selladas y el espacio superior se enjuagó con una mezcla ^{1 :1} de aire y metano como fuente de carbono para el M. capsulatus (Bath), las placas se sellaron y luego se agitaron continuamente a una velocidad de 200-250 rpm durante la incubación a 42-45°C durante un precultivo de 24 horas. Luego, se inocularon nuevas placas de 24 pocillos que contenían 2,5 ml de MM-W1 fresco y kanamicina con 0,25 ml del pre-cultivo y se incubaron a 42-45°C durante 72 horas. La cepa de M. capsulatus (Bath) que contiene el promotor MDH en el sistema promotor inducible por IPTG (Laclq) se hizo crecer en presencia de IPTG 0,1-10 mM). Las células se cosecharon por centrifugación y los sobrenadantes se analizaron utilizando el kit de ensayo de enzima de L-lactato EnzyFluo™ según las instrucciones del fabricante (BioAssay Systems, Hayward, CA 94545, número de catálogo EFLLC-100) con la excepción de que los sobrenadantes se incubaron con reactivos del kit durante dos horas antes de medir la fluorescencia. Como el metano era la única fuente de carbono proporcionada a las células, todo el lactato producido debe haber sido derivado del metano.

Resultados

[0118] Los resultados en la Tabla 1 demuestran la producción de lactato usando una variedad de ácidos nucleicos exógenos que codifican la deshidrogenasa de lactato. En ciertos casos en los que el lactato se produjo bajo la expresión constitutiva de la LDH, el M. capsulatus (Bath) recombinante mostró una proporción de OD⁶⁰⁰ de alto lactato (ver Figura 1).

Tabla 1. Producción de ácido láctico por M. capsulatus (Bath) que expresa LDH

[0119] Para cada secuencia en la Tabla 1, el valor detectado más alto se enumera de acuerdo con la siguiente escala: 3 - 100uM, + 100 - 1000uM, ++> 1000uM. El límite inferior para designar células recombinantes como que tienen actividad LDH positiva (3 gM) se estableció en concentraciones 3 veces mayores de lactato que el fondo del ensayo de cepas que no se sabe que portan un ácido nucleico LDH funcional (es decir, las cepas de control negativo). En varios casos, la actividad de LDH (es decir, la producción de lactato) no se detectó por encima de este umbral para los ácidos nucleicos enumerados en la tabla anterior con ciertos promotores, o ácidos nucleicos que codifican LDH de Bos Taurus (SEQ ID NO: 5), L. helveticus (SEQ ID NO: 3), o Plasmodium ovale (SEQ ID NO: 45). En tres casos donde el ácido nucleico de LDH exógeno bajo el control de un promotor constitutivo se conjugó con la cepa huésped (es decir, los ácidos nucleicos que codifican Bacillus anthracis LDH (n: 29), Bacillus thuringensis LDH (SEQ ID NO: 39) y Deinococcus radiodurans LDH (SEQ ID NO: 43)), no se observaron colonias, sin embargo, se formaron colonias cuando los mismos ácidos nucleicos de LDH exógenos se colocaron bajo el control de un promotor inducible que indica un posible efecto tóxico del lactato en las células. Si bien no desea estar sujeto a ninguna teoría, se cree que debido a la alta toxicidad del lactato, la actividad de LDH induce una alta presión selectiva sobre las células que expresan para mutar o inactivar el ácido nucleico de LDH. Por lo tanto, la falta de actividad por encima del umbral puede ser causada por una serie de factores (que se observaron en varios clones identificados por debajo del umbral de detección), incluidas las mutaciones en el ácido nucleico de LDH o la pérdida del plásmido, y no proporciona evidencia concluyente por la presencia o ausencia de la función LDH en ese caso.

II Metilosinus trichsporium OB3b y Metilomicrobium buryatense 5G diseñados para la producción de lactato.

[0120] Las células huésped (Metilosinus trichosporium OB3b y Metilomicrobium buryatense 5G) fueron diseñadas para poseer un ácido nucleico de deshidrogenasa de lactato exógeno (ldh) para permitir la producción de L-lactato a partir de un sustrato C¹ (metano). Las moléculas de ácido nucleico que codifican LDH exógenas de la Parte I anterior se clonaron individualmente en el vector de expresión pMS10 (un plásmido equivalente a PMS3 con gen de resistencia a la kanamicina de una fuente diferente) aguas abajo de un sistema promotor para la conjugación en M. trichosporium OB3b o M.buryatense basado en 5G sobre los métodos reportados por Ali y Murrell (Microbiology 155: 761, 2009). Para la transformación de Metilosinus trichosporium OB3b, el promotor fue el promotor Ob3b sga (serina-glucoxilato transaminasa) (SEQ ID NO: 50). Para la transformación de Mthylomicrobium buryatense 5G, el promotor fue el promotor Metilomonas 16a moxF (deshidrogenasa de metanol) (SEQ ID NO: 51) o el promotor Metilomonas 16a hps (hexulosa-6-fosfato sintetasa) (SEQ ID NO: 52).

[0121] Brevemente, el plásmido movilizable que contiene uno o más ácidos nucleicos de interés (p. ej., LDH) y que codifica resistencia a la kanamicina se transformó primero en E. coli S17-1 utilizando métodos de electroporación estándar. La transformación se confirmó mediante la selección de colonias resistentes a la kanamicina en agar LB que contenía 30 pg/ml de kanamicina. Las colonias transformadas se inocularon en medios LB que contenían 30 pg/ml de kanamicina y se agitaron a 37°C hasta que la OD600 alcanzó 1,0. Luego se recogió una alícuota de 1,0 ml del cultivo en un tubo Eppendorf estéril (tamaño de 1,6 ml). Las células donantes de E. coli se lavaron 2x 1,0 ml de medio MM-W1 estéril (OB3b) o NMS (5G) para eliminar los medios residuales y el antibiótico.

[0122] Paralelamente, se inoculó una muestra de la cepa receptora M. trichosporium OB3b (NCIMB 11131) o M. buryatense 5G (de la Dra. Mary Lidstrom, Universidad de Washington) en frascos de suero de 100 ml que contenían 20-50 ml de medios MM-W1 (OB3b) o NMS (5G). El espacio de cabeza de las botellas se enjuagó con una mezcla 1:1 de oxígeno y metano, y las botellas se sellaron con septos de caucho butílico y se engarzaron. Las botellas se agitaron continuamente en una incubadora a 30°C hasta alcanzar un OD⁶⁰⁰ de aproximadamente 0,5. Las células OB3b o 5G se recogieron luego por centrifugación y se lavaron con 50 ml de medio MM-W1 o NMS estéril. Las células lavadas se resuspendieron en medio MM-W1 o n Ms estéril a una OD⁶⁰⁰ de 1,0 y se mezclaron alícuotas con el donante E. coli en una relación receptor:donante de 2:1. La mezcla celular se sedimentó por centrifugación y el sedimento celular se detectó en una placa de agar MM-W1 o NMS que contenía extracto de levadura al 0,5% y se incubó durante 48 h a 30°C en presencia de una mezcla 1:1 de metano y aire. Después de 48 h, las células se volvieron a suspender en 1,0 ml de medio estéril y se extendieron alícuotas (100 ml) sobre placas de agar MM-W1 o NMS que contenían 4-7,5 pg/ml de kanamicina.

[0123] Las placas se incubaron en cámaras selladas que contienen una mezcla 1:1 de metano y aire y se mantuvieron a 30°C. La mezcla de gas se repone cada 2 días hasta formarse las colonias, típicamente después de 7-14 días. Se colonizaron las colonias en placas MM-W1 o NMS que contenían kanamicina para confirmar la resistencia a la kanamicina, así como para aislar adicionalmente las células metanotróficas transformadas de las células donantes de E. coli residuales.

[0124] La presencia de expresión ldh o función LDH se verificó mediante uno o más de (1) PCR y secuenciación, (2) análisis de transferencia Western, y (3) ensayo para la presencia de lactato. Por ejemplo, para verificar la transferencia, el ADN plasmídico se aisló y se sometió a PCR usando OneTaq 2x Master Mix con tampón estándar (New England BioLabs) usando condiciones estándar (95°C durante 5 min; 25 ciclos de 95°C durante 30 s, 60°C durante 30 s, y 72°C durante 1 min; 72°C durante 10 min) y juegos de cebadores diseñados específicamente para unirse por fuera y por dentro al ácido nucleico ldh. El ADN del plásmido original que contiene el clonado de ldh se usó ácido(s) nucleico(s) como un control positivo para la PCR.

[0125] Los M. trichosporium OB3b o M. buryatense 5G recombinantes se cultivaron a 30°C en frascos de suero que contenían MM-W1 o NMS que contenían 4-7,5 ug/ml de medio de kanamicina. La composición del espacio de cabeza se ajustó a un volumen 1:1 de metano:aire. Las botellas se agitaron a una velocidad de 200-250 rpm. Alternativamente, el cultivo se mantuvo en placas de medio MM-W1 o NMS solidificadas con agar al 1,5% p/v cultivado en una cámara hermética a los gases que contenía una mezcla 1:1 (v/v) de metano: aire-gas. Las placas se incubaron invertidas en la cámara a 30°C.

Producción de lactato a partir de un sustrato C1 (CH4)

[0126] M. trichosporium OB3b o M. buryatense 5G transformada con un vector solo o vector que contiene un ácido nucleico ldh se utilizaron para inocular 2,0 ml de MM-W1 o medios NMS en tubos de Balch (vidrio Bellco) que tienen 5 pg/ml de kanamicina. La composición del medio MM-W1 utilizado fue la siguiente: 0,8 mM MgSO4 * ⁷ H²O, 10 mM NaNO3, 0,14 mM CaCl² , 1,2 mM NaHCO3, 2,35 mM KH² PO4, 3,4 mM K²HPO4, 20,7 pM Na2MoO4 * ² H²O, 1 pM CuSO4 * ⁵ H²O, 10 pM FeIII-NaEDTA y 1 ml por litro de solución de metales traza (que contiene, por litro 500 mg FeSO4 * ⁷ H²O, 400 mg ZnSO4 * ⁷ H²O, 20 mg MnCͲ * ⁷ H²O, 50 mg C⁰ CI² * ⁶ H²O, 10 mg NÍCͲ * ⁶ H²O, 15 mg H³BO3, 250 mg EDTA). Se agregaron fosfato, bicarbonato y Fem-Na-EDTA después de que el medio se esterilizara en autoclave y se enfriara. La composición de los medios NMS utilizados fue la siguiente: 1,00 g/L MgSO4 * ⁷ H²O, 0,02 g/L CaCí² *

⁶ H²O, 1,00 g/LKNO³ , 15 g/L NaCl, 20 ml de tampón fosfato (5,44 g/L KH² PO4, 14,34 g/L Na²HPO4 * 12 H²O), 50 ml de tampón de carbonato (45 ml de NaHCO31 M 5 ml de Na²CO³ 1 M), 2 ml de solución de oligoelemento (0,5 g/L

Na2-EDTA, 1,0 g/L FeSO4 * ⁷ H²O, 0,75 g/L Fe-EDTA, 0,8g/L ZnSO4 * ⁷ H²O, 0,005 g/L MnCl² * ⁴ H²O, 0,03 g/LH3BO3,

0,05 g/L CoCͲ * ⁶ H²O, 0,4 g/L Cu-EDTA, 0,6 g/L CuCͲ * ² H²O, 0,002 g/L N id ² * ⁶ H²O, 0,05 g/L Na²MoO2 * ² H²O) (Ojala, DS, et al., Methods in Enzymology, Vol. 495, pp. 99-118). Se añadieron tampones de fosfato y carbonato estériles después de que la solución se enfriara a temperatura ambiente. El espacio superior de la placa se enjuagó con una mezcla ^{1 :1} de oxígeno y metano como fuente de carbono para las cepas, los tubos se sellaron con septos de caucho butílico, se engarzaron y luego se agitaron continuamente a una velocidad de 200-250 rpm durante la incubación a 30°C.°C durante 72 horas. Las células se cosecharon por centrifugación y los sobrenadantes se analizaron usando el kit de ensayo de enzima L-lactato EnzyFluo™ según las instrucciones del fabricante (BioAssay Systems, Hayward, CA 94545, número de catálogo EFLLC-100) con la excepción de que los sobrenadantes se incubaron con reactivos del kit durante dos horas antes de medir la fluorescencia. Los resultados se normalizaron a valores de OD⁶⁰⁰ para cada cultivo correspondiente. Como el metano era la única fuente de carbono proporcionada a las células, todo el lactato producido debe haber sido derivado del metano.

Resultados

[0127] M. trichosporium OB3b y M. buryatesne 5G se alteraron para producir L-lactato mediante la introducción y expresión de un ácido nucleico L-deshidrogenasa de lactato exógeno. Los diversos ácidos nucleicos de deshidrogenasa de lactato exógena se unieron operativamente a un promotor constitutivo en un vector de expresión que funciona en metanótrofos.

[0128] En todos los casos en los que se produjo lactato, el OD⁶⁰⁰ de los cultivos osciló entre 0,31 y 0,71 y todas las cepas recombinantes produjeron niveles bajos pero detectables (1- 20 pM mayores que concentraciones de lactato 3 veces mayores que las cepas que no se sabe que llevan un ácido nucleico funcional LDH) de lactato.

EJEMPLO 2

DISTRIBUCIÓN DE ISÓTOPOS DE CARBONO ESTABLE EN PRODUCTOS DERIVADOS DE MICROORGANISMOS METABOLIZADORES C¹

[0129] El ácido láctico derivado de metano producido por cepas de M. capsulatus (Bath) modificadas se analizó para determinar el contenido de carbono (% peso seco) y la relación de isótopos estables de carbono (¹³C) a través de un analizador elemental/espectrometría de masas de relación de isótopos de flujo continuo utilizando un analizador elemental CHNOS (vario ISOTOPE cube, Elementar, Hanau, Alemania) junto con un IsoPrime100 IRMS (Isoprime, Cheadle, Reino Unido). Se centrifugaron muestras de biomasa metanotrófica cultivada en fermentadores o botellas de suero, se resuspendieron en agua desionizada y los volúmenes correspondientes a ⁰ ,^{2 - 2} mg de carbono (aproximadamente 0,5-5 mg de peso de células secas) se transfirieron a cápsulas de estaño de 5 x 9 mm (Costech Analytical Technologies, Inc., Valencia, CA) y se secaron a 80°C durante al menos 24 horas. Las muestras de ácido láctico (aprox. 0,3-1 mg) recuperadas de cultivos de M. capsulatus (Bath) que expresan secuencias de ácido nucleico que codifican LDH que codifican diferentes LDH se resuspendieron de manera similar en agua desionizada, se transfirieron a cápsulas de estaño de 5 x 9 mm y se secaron a 80°C durante al menos 24 horas. Los estándares que contenían al menos 0,1 mg de carbono proporcionaron valores confiables de 5¹³C.

[0130] La relación de isótopos se expresa en notación "delta" (%»), en donde la composición isotópica de un material en relación con la de un estándar en una desviación por millón está dada por 513C (o 5¹⁵N) = (RMuestra/R Estándar-1) x 1.000, en donde R es la relación molecular de las formas de isótopos pesados a ligeros. El estándar para el carbono es la Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB) y para el nitrógeno es el aire. El NIST (National Institute of Standards and Technology) propuso SRM (Standard Reference Material) N° 1547, hojas de durazno, se usó como estándar de calibración. Todos los análisis de isótopos se realizaron en el Center for Stable Isotope Biogeochemistry de la Universidad de California, Berkeley. La precisión externa a largo plazo para los análisis de isótopos C y N es 0,10 %<> y 0,15 ,4o, respectivamente.

[0131] Las cepas separadas de M. capsulatus (Bath) construidas para la expresión constitutiva de 4 ácidos nucleicos de LDH diferentes (véase la Tabla 2) se cultivaron en metano en botellas de suero 0,5L que contienen 130 ml de medio definido MMS1,0 modificado con 15 ug/ml de kanamicina. Las cepas se inocularon de cultivos discontinuos de botellas de suero (7% v/v) cultivadas en los mismos medios suministrados con una mezcla 1:1 (v/v) de metano y aire. La composición del medio MMS1,0 fue la siguiente: 0,8 mM MgSO4 * ⁷ H²O, 30 mM NaNO3, 0,14 mM CaCl² , 1,2 mM NaHCO3, 2,35 mM KH² PO4, 3,4 mM K²HPO4, 20,7 pM Na2MoO4 * ² H²O, 6 pM CuSO4 * ⁵ H²O, 10 pM FeIII-Na-EDTA y 1 ml por litro de una solución de metales traza (que contiene, por L: 500 mg de FeSO4 * ⁷ H²O, 400 mg ZnSO4 *

⁷ H²O²⁰ mg MnCl² * ⁷ H²O, 50 mg CoCͲ * ⁶ H²O, 10 mg N id ² * ⁶ H²O, 15 mg H³BO3, 250 mg EDT fosfato, bicarbonato y FeIII-Na-EDTA después de que los medios se esterilizaron en autoclave y se enfriaron. El pH final de los medios fue de 7,0 0,1. Las botellas de suero se inocularon por duplicado, se sellaron con tapones de

goma y se inyectaron con 60 ml de gas metano (99% de pureza; grado 2,0, Praxair suministrado por Alliance Gas, San Carlos, CA) añadido mediante una jeringa a través de un filtro estéril de 0,45 pM y agujas estériles 27G. Los cultivos se incubaron a 42°C con agitación giratoria a 250 rpm y se midió el crecimiento a intervalos de aproximadamente 12 a 24 horas retirando muestras de 1 ml para determinar OD⁶⁰⁰. Las submuestras (0,5 ml) se aclararon por centrifugación y los sobrenadantes libres de células se analizaron para L-lactato como se describió anteriormente. Después del muestreo, las botellas se ventilaron y el espacio de cabeza se reemplazó con 60 ml de metano y 60 a 120 ml de oxígeno concentrado (al menos 85% de pureza). Aproximadamente a las 72 horas, se retiraron las muestras finales y los volúmenes de cultivo restantes se clarificaron por centrifugación (8.000 rpm, 10 minutos), se determinó su pH (pH 6,7 a 6,9) y los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta la recuperación del producto y análisis.

Tabla 2. Descripción de la muestra de cepa

[0132] El ácido láctico se recuperó de cada uno de estos cultivos por extracción líquido-líquido y el material extraído a partir de sobrenadantes acidificados se analizaron posteriormente para el contenido de ácido L-láctico, la composición de ácido láctico relativo y para estable distribución de isótopo de carbono (valores 513C; ver Tabla 3). Los sobrenadantes de cultivos de metano de cepas de M. capsulatus (Bath) modificadas que expresan secuencias de ácido nucleico que codifican LDH que codifican diferentes LDH se clarificaron por centrifugación, se ajustaron a pH 2 usando HCl concentrado y se extrajeron dos veces usando volúmenes iguales de acetato de etilo (Fisher, grado HPLC) Las fracciones de acetato de etilo de cada muestra se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y luego se concentraron a sequedad a presión reducida por evaporación rotatoria a 40°C. Los residuos se disolvieron en acetato de etilo y las submuestras se analizaron para determinar el contenido de ácido L-láctico (kit de ensayo de enzima L-lactato EnzyFluo™, Catálogo N° EFLLC- 100; BioAssay Systems, Hayward, CA 94545) y la composición de ácido láctico por GC-MS.

[0133] La cromatografía de gas-espectrometría de masas se llevó a cabo en un 6890 GC Agilent equipado con un Zebron ZB-5HT (p/n 7HG-G015-11; Phenomenex, Torrance CA) y un detector selectivo de masas. La temperatura inicial de la columna fue de 50°C y se incrementó a una velocidad de 20°C por minuto a 320°C y se mantuvo durante 5 minutos. Las temperaturas de la línea de entrada y transferencia fueron de 250°C y se utilizó helio como gas portador. Las muestras que contenían L-lactato recuperado por extracción líquido-líquido se desvatizaron con BSTFA antes del análisis (inyecciones de 1,0 pl) de la siguiente manera: para secar extractos que contenían lactato (que contenían 0,3 a 1 mg de L-lactato) en viales GC de borosilicato se agregaron 400 pL N,O-bis(trimetilsililo)trifluoroacetamida (BSTFA), 400 pL de acetonitrilo y 100 pL de tolueno. Se preparó una muestra en blanco en un método similar como referencia. Viales de muestra con solventes de derivatización se calentaron durante 1 hora usando un bloque de calor a 50°C. Las muestras finales derivadas se analizaron por GC-MS usando las condiciones descritas anteriormente. Los cromatogramas se integraron y los picos individuales se registraron por tiempo y recuentos de área. Los cromatogramas de muestra se superpusieron con el cromatograma en blanco para determinar los picos comunes tanto en blanco como en muestras para que pudieran eliminarse de la evaluación de cuantificación relativa posterior. Los espectros de masas de cada pico restante en el cromatograma se revisaron contra una base de datos espectrales de masas para la identificación tentativa. La lista final de analitos y áreas de pico se utilizó para determinar las concentraciones relativas de ácido láctico en relación con todos los analitos. Para este paso, se supuso que todos los analitos tenían conteos de abundancia total equivalentes (factor de respuesta esencialmente equivalente). Los resultados indicaron que el contenido relativo del ácido láctico era del 55-80% dependiendo de la muestra individual (ver Tabla 3).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una bacteria metanotrófica obligada que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una deshidrogenasa de lactato (LDH), en donde la bacteria metanotrófica es capaz de convertir metano en lactato.

2. La bacteria metanotrófica de la reivindicación 1, en donde la bacteria metanotrófica se selecciona del grupo que consiste en un metanotrofo Tipo I, un metanotrofo Tipo II y un metanotrofo Tipo X.

3. Las bacterias metanotróficas de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las bacterias metanotróficas se seleccionan de entre el grupo que consiste en un Metilococcus, un Metilomonas, un Metilobacter, un Metilosinus, un Metilomicrobium, un Metanomonas, un Metilacidiphilum y Metiloacida.

4. La bacteria metanotrófica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la bacteria metanotrófica se selecciona del grupo que consiste en Metilococcus capsulatus (Bath), Metilomonas metanica 16a, Metilosinus trichosporium OB3b, Metilosinus sporium, Metilomonas metanica, Metilomonas albus, Metilobathyumulatumumum, Metilobacterumulatum, Metilobacterum, Metilobacterum, Metilobacterium capsula, Metilomonas sp. AJ-3670, Metilacidiphilum infernorum, Metilacidiphilum fumariolicum, Metiloacida kamchatkensis y Metilomicrobium alcaliphilum.

5. La bacteria metanotrófica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde la bacteria metanotrófica se selecciona de Metilococcus capsulatus (Bath) o Metilosinus trichosporium OB3b.

6. La bacteria metanotrófica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el ácido nucleico heterólogo:

(a) codifica una deshidrogenasa de lactato que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 57 y 58;

(b) codifica una deshidrogenasa de lactato que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 57 y 58; o

(c) comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 1921,23, 25, 27, 29, 31,35, 37, 39, 41,43, 45 y 47.

7. Las bacterias metanotróficas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo codifica una LDH de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en Actinomyces viscosus, Acinonyx jubatus, Archilochus colubris, Bacillus anthracis, Bacillus caldolyticus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus (Q9p4b6) (también conocido como Geobacillus stearothermophilus), Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacteroides pectinophilus, Bifidobacterium longum, Bos taurus, Canis familiaris, Canis lupus, Deinococcus radiodurans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Equusferus, Felis catus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces maxxianus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei. torquens, Lactobacillus delbrueckii (incluyendo subsp. bulgaricus), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Listeria monocytogenes, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Thermus thermophilus, Mus musculus, Oryctolagus cuniculus, Pediococcus acidilactici, Taeniopygia guttata, Rattus norvegicus, Rhizopus oryzae, Staphylococcus aureus y Streptococcus bovis.

8. La bacteria metanotrófica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica LDH es un codón optimizado para la expresión en la bacteria metanotrófica.

9. Un método para producir lactato, que comprende el cultivo de bacterias metanotróficas de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 en presencia de una materia prima de carbono que comprende metano en condiciones suficientes para producir lactato, en donde la bacteria metanotrófica convierte metano en lactato.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la materia prima de carbono es gas natural.