ES2759320T3 - Proteína con actividad dextransacarasa y aplicaciones - Google Patents
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Abstract
Proteína de actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 1, o que comprende al menos un 80 %, preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 90 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente un 98 % de identidad en las posiciones 563 a 1282 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, preferentemente en las posiciones 563 a 1282 y 1316 a 1433 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, aún más preferentemente en las posiciones 563 a 1282, 1316 a 1433 y 174 a 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, aún más preferentemente en las posiciones 563 a 1282, 1316 a 1433 y 42 a 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la actividad dextransacarasa que permite la síntesis de dextranos de masa molar media en peso Mw comprendida entre 2.103 y 40.103 g.mol-1, y un índice de dispersidad Di menor de 1,5, a temperaturas comprendidas de 20 °C a 50 °C y a concentraciones iniciales de sacarosa comprendidas de 50 g.l-1 a 600 g.l-
Description
DESCRIPCIÓN
Proteína con actividad dextransacarasa y aplicaciones
Sector de la técnica
La invención tiene por objeto una proteína con actividad dextransacarasa procedente de la cepa Leuconostoc citreum NRRL B-1299, especialmente, una proteína con actividad dextransacarasa truncada. La invención se refiere también a un procedimiento de síntesis de dextranos mediante una proteína tal con actividad dextransacarasa, así como a los dextranos sintetizados.
Estado de la técnica
A continuación, para mayor claridad, el término "dextransacarasa" se podrá utilizar, a veces, para designar una proteína con actividad dextransacarasa.
Las glucansacarasas de origen bacteriano son a-transglucosilasas que pertenecen a las familias 13 y 70 de las glucosidohidrolasas. A partir de sacarosa, estas enzimas catalizan generalmente la síntesis de a-glucanos de masa molar elevada (106-109 g.mol-1). También pueden sintetizar oligosacáridos o glucoconjugados por reacción de transglucosilación en aceptores exógenos de diversa naturaleza. Las glucansacarasas tienen diferentes especificidades de productos, tanto en los que respecta a la naturaleza de los enlaces osídicos sintetizados (a-1,2; a-1,3; a-1,4 o a-1,6) y su organización, como al tamaño de los productos formados.
De manera general, las dextransacarasa se producen de forma natural por bacterias lácticas, por ejemplo los géneros Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus o Weissela sp.
Entre las glucansacarasas, las dextransacarasas producen dextrano, que generalmente tienen al menos un 50 % de enlaces osídicos a-1,6 en la cadena principal y, opcionalmente, ramificaciones en a-1,2, a-1,3 y/o a-1,4. El índice de ramificación y su disposición espacial varían según la enzima productora.
Los dextranos y derivados de dextrano tienen un número creciente de aplicaciones industriales, a menudo dependientes de sus masas molares.
Salvo que se indique lo contrario, se entiende por "masa molar' o "masa molar promedio", en la presente invención, la masa molar promedio en peso, expresada independientemente en g.mol'1 o Da.
Los dextranos de masa molar baja o media (que generalmente varía de 103 a 7.104 g mol-1) se utilizan principalmente en aplicaciones analíticas, en el campo de la medicina, por ejemplo, como un extensor de plasma sanguíneo gracias a su baja antigenicidad y baja viscosidad en solución salina, para soluciones oftálmicas, transportador de hierro o anticoagulante (después de la funcionalización), en la prevención de complicaciones postoperatorias, en el tratamiento de quemaduras o en la reducción del riesgo de trombosis o embolia, etc.
Estos dextranos de masa molar baja o media se producen de forma general mediante hidrólisis ácida, seguida de fraccionamiento con ayuda de disolventes orgánicos. Sin embargo, estos procedimientos químicos suelen ser costosos, poco rentables y contaminantes.
Por tanto, se han desarrollado procedimientos alternativos para mejorar la producción de dextranos de masa molar baja o media.
De este modo, la patente US 5,229,277 describe un procedimiento de síntesis de dextranos de masa molar baja que lleva a la práctica el uso de Leuconostoc mesenteroides y una cepa mutante de Lipomyces starkeyi ATCC 74054. Este procedimiento, además de requerir el uso de dos microorganismos, necesita condiciones de cultivo específicas y duraciones y temperaturas precisas para que la actividad dextranasa identificada en Lipomyces starkeyi ATCC 74054 reduzca la masa molar de los dextranos sintetizados por Leuconostoc mesenteroides. Los polímeros de dextrano producidos tienen una masa molar comprendida entre 4.104 y 1,5.105 Da.
La solicitud de patente EP2365084 describe un procedimiento de síntesis de dextranos de masa molar controlada. Estos a-glucanos se producen directamente mediante formas truncadas de las glucansacarasas DsrS, procedentes de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F, a partir de sacarosa, con la adición opcional de un aceptor exógeno. Una variante DsrS Core AA es especialmente interesante para la producción de dextrano de masa molar media de 1.104 Da.
Sin embargo, la síntesis debe realizarse a temperaturas bajas (preferentemente a 10 °C) para de maximizar los rendimientos. Además, la enzima no presenta una gran eficacia catalítica, y se necesitan aproximadamente 48 horas de síntesis para alcanzar el consumo total de la sacarosa.
También es posible fomentar la producción de dextranos de masa molar baja aumentando la concentración inicial de sustrato. Sin embargo, se ha demostrado frecuentemente con este método que el dextrano producido frecuentemente está polidisperso, y que la síntesis de polímeros de masa molar elevada no se anula por completo. Sigue existiendo por tanto la necesidad de producir dextranos que tengan una masa molar baja, especialmente de dextranos poco polidispersos.
Objeto de la invención
Un objeto de la invención era también proporcionar dextranos lineales. Dichos dextranos son útiles en muchos campos, en particular para aplicaciones médicas. En efecto, se ha demostrado que los dextranos que tienen un alto contenido en enlaces a-1,6 (y, por tanto, los más lineales) son los que conllevan menores cantidades de reacciones alérgicas (1,2).
Otro objeto de la invención era también proporcionar un procedimiento de producción de dichos dextranos de forma enzimática, y no química, y de manera simple, rápida y precisa, necesitando solamente usar un único microorganismo.
Otro objetivo de la invención era poder controlar la masa molar de un dextrano sintetizado de manera muy precisa, en particular mediante parámetro(s) de reacción fácilmente controlable(s).
Los inventores tienen por tanto el mérito de haber descubierto que una proteína con actividad dextransacarasa procedente de la cepa Leuconostoc citreum NRRL B-1299 permite la síntesis de dextranos de masa molar controlable de manera muy precisa, y esto, sin necesitar de reacciones enzimáticas limitantes, directamente a partir de sacarosa, y sin agregar ningún aceptor exógeno ni otra(s) enzima(s) adicional(es).
Dicha proteína tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 1. La proteína solo posee una identidad máxima del 62 % para el 100 % de su secuencia con la alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides LBAE C11 cuya secuencia está disponible en las bases de datos con el número de registro de Genbank WP_004904957.1. En comparación con otras supuestas secuencias de glucansacarasas que pueden identificarse después de las campañas de secuenciación de genomas bacterianos, este porcentaje de identidad es bastante bajo. La proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, denominada DsrM, de masa molar 229 kDa, está compuesta de 2065 aminoácidos, que posee la triada catalítica DED y los 4 motivos conservados habitualmente descritos en las enzimas de la familia 70 de las glucosidohidrolasas. Los motivos proteicos conservados del núcleo catalítico (I a IV) se han identificado desde la posición 1177 a la posición 1183 para el motivo I, desde la posición 673 a la posición 683 para el motivo II, desde posición 710 a la posición 721 para el motivo III y desde la posición 785 a posición 799 para el motivo IV. En comparación con la secuencia proteica de la glucansacarasa GTF-180, los cinco dominios estructurales tradicionalmente descritos para las glucansacarasas (A, B, C, IV y V) (3) se pueden identificar en la estructura primaria de la proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (figura 1).
Las variantes de función conservadora de la proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 también están incluidas en la presente solicitud.
Se denomina "variante de función conservadora", una variante en la que, en una proteína, un resto (o más) de aminoácido dado se ha modificado o suprimido sin alterar la conformación global ni la actividad enzimática de la proteína con actividad dextransacarasa. La actividad enzimática de una variante de dextransacarasa puede ensayarse según las técnicas conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, mediante el método con ácido dinitrosalicílico (DNS) de Sumner y Howell (4) o mediante análisis de HPLC (siglas del inglés high performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento).
Preferentemente, dicha una variante de función conservadora es una proteína con actividad dextransacarasa cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos un 80 %, preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 90 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente un 98 % de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
De manera ventajosa, la una o varias modificaciones relativas a las partes no sensibles de la enzima, y que por tanto no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 563 y la posición 1282 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, correspondiente a la tríada catalítica y a los dominios A, B, C.
Preferentemente, la una o varias modificaciones no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 563 y la posición 1282 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 así como a las zonas comprendidas entre la posición 1316 y 1433 (parte del dominio V del extremo C) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Aún más preferentemente, la una o varias modificaciones no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 563 y la posición 1282 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, las zonas comprendidas entre la posición 1316 y 1433 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 así como a las zonas comprendidas entre la posición 174 y 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Las secuencias comprendidas entre las posiciones 174 y 421, y también entre 1316 y 1433 incluyen de este modo unidades repetidas (repeticiones YG) generalmente descritas en esta familia con afinidad por el glucano y, por tanto, por tener un papel sobre el tamaño de los productos formados, así como sobre la actividad catalítica de la enzima (3).
Aún más preferentemente, la una o varias modificaciones no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 563 y la posición 1282 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, las zonas comprendidas entre la posición 1316 y 1433 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 así como a las zonas comprendidas entre la posición 42 y 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
De este modo, se ha puesto de manifiesto mediante ensayos de truncamiento de la dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que la supresión de los aminoácidos comprendidos entre las posiciones 1434 y 2065 del dominio V del extremo C, entre ellos la totalidad de los "motivos APY", no alteraría la actividad y la especificidad de la enzima (véase la figura 2, dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY).
Por el contrario, se ha puesto de manifiesto que la supresión de los aminoácidos entre las posiciones 1 y 174 y entre las posiciones 1317 y 2065 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (dominio C del extremo C), producen la pérdida de su actividad como enzima (véase la figura 2, dextransacarasa truncada DsrM A174-1317). El experto en la materia sabrá determinar las variantes conservadoras de función, especialmente en lo que respecta a estos elementos.
De este modo, un objeto de la invención es una proteína con actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 1, o que comprende al menos un 80 %, preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 90 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente un 98 % de identidad en las posiciones 563 a 1282 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, preferentemente en las posiciones 563 a 1282 y 1316 a 1433 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, aún más preferentemente en las posiciones 563 a 1282, 1316 a 1433 y 174 a 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, aún más preferentemente en las posiciones 563 a 1282, 1316 a 1433 y 42 a 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Según una realización particular, una variante conservadora de función consiste en una forma truncada de una proteína con actividad dextransacarasa tal como se ha definido anteriormente que conserva la actividad enzimática dextransacarasa.
Preferentemente, dicha forma truncada comprende menos de 2065 aminoácidos, preferentemente menos de 1600 aminoácidos, aún más preferentemente menos de 1450 aminoácidos. Muy preferentemente, dicha forma truncada comprende 1392 aminoácidos.
Según una realización particular, dicha forma truncada de la proteína con actividad dextransacarasa con secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 2. Esta forma truncada concreta se denomina DsrM APS AC-APY.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 de la posición 42 a la posición 1433, y se ha eliminado de las posiciones 1 a 41 y 1434 a 2065 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Como se ha indicado anteriormente, se ha puesto de manifiesto por tanto que la supresión de estos aminoácidos, entre ellos la totalidad de los "motivos APY", no altera la actividad y la especificidad de la enzima.
Por otro lado, la proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 no supera el 54 % de identidad y el 68 % de similitud, respecto de las secuencias proteicas de DsrS y sus variantes DsrS vardel A3, DsrS vardel Core y DsrS Core AA (véase la solicitud de patente EP2365084).
Las variantes de función conservadora de la proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 también está comprendida en la presente solicitud, y se define de la misma manera que antes.
De este modo, preferentemente, la una o varias modificaciones pueden referirse a las partes no sensibles de la enzima, y que por tanto no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 522 y la posición 1241 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, correspondiente a la tríada catalítica y a los dominios A, B, C.
Preferentemente, la una o varias modificaciones no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 522 y la posición 1241 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 así como a las zonas comprendidas entre la posición 1275 y 1392 (parte del dominio V del extremo C) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
Aún más preferentemente, la una o varias modificaciones no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 522 y la posición 1241 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, las zonas comprendidas entre la posición 1275 y 1392 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 así como a las zonas comprendidas entre la posición 133 y 380 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
Aún más preferentemente, la una o varias modificaciones no se refieren específicamente a la zona comprendida entre la posición 522 y la posición 1241 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, las zonas comprendidas entre la posición 1275 y 1392 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 así como a las zonas comprendidas entre la posición 1 y 380 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
De este modo, un objeto de la invención se refiere a una proteína con actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 2, o que comprende al menos un 80 %, preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 90 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente a un 98 % de identidad en las posiciones 522 a 1241 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, preferentemente en las posiciones 522 a 1241 y 1275 a 1392 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, aún más preferentemente en las posiciones 522 a 1241, 1275 a 1392 y 133 a 380 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, aún más preferentemente en las posiciones 522 a 1241, 1275 a 1392 y 1 a 380 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
A continuación, la expresión "proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2" (o "dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2" se refiere tanto a la proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 como a sus variantes conservadoras de función. Según una realización particular, se trata solamente de la proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
Los inventores han puesto de manifiesto las funciones excepcionales de una dextransacarasa de acuerdo con la invención.
Una proteína con actividad dextransacarasa de acuerdo con la invención es exclusivamente específica de la polimerización a través de enlaces glucosídicos de tipo a-1,6 y, sobre todo, es una excelente polimerasa. En efecto, como se pone de manifiesto en la parte experimental, los análisis cromatográficos realizados después de una síntesis de dextrano a partir de 100 g.l-1 de sacarosa muestran que aproximadamente un 85 % y 81 % de las unidades de glucosilo derivadas de la sacarosa se utilizan en la producción del polímero durante el uso respectivo de una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y de una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Asimismo, una proteína con actividad dextransacarasa de acuerdo con la invención tiene una temperatura óptima de funcionamiento comprendida entre 30 °C y 45 °C, y un pH óptimo comprendido entre 4 y 7, más precisamente entre 4,5 y 5,75 para una proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y entre 5 y 7 para una proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
De esta forma, una dextransacarasa de acuerdo con la invención ofrece una amplia gama de utilización en términos de pH y temperaturas. En concreto, la enzima conserva más del 80% de su actividad en un amplio intervalo de temperaturas, especialmente hasta 45 °C, lo que es muy raro en las enzimas de la familia 70 de las glucosidohidrolasas. Sin embargo, la puesta en práctica de la síntesis de dextranos a temperaturas elevadas, por ejemplo de aproximadamente 45 °C, permite limitar ciertas contaminaciones microbianas. Este amplio intervalo de uso, en consecuencia, convierte la dextransacarasa de acuerdo con la invención en muy atractiva para usos industrial.
Según una realización particular, se puede preparar una proteína con actividad según la invención mediante técnicas conocidas de recombinación genética.
El experto en la materia sabrá cómo utilizar las tecnologías de biología molecular y podrá elegir un sistema de expresión adecuado según las técnicas conocidas. En este caso, se puede hacer referencia a los resultados experimentales posteriores.
La expresión "sistema de expresión" comprende una célula hospedadora y un vector compatible en condiciones apropiadas, es decir, condiciones que permitan la expresión del gen que codifica la proteína de interés, contenido en el vector e introducido en la célula hospedadora. Normalmente, la secuencia de los ácidos nucleicos que codifican
una proteína con actividad dextransacarasa de acuerdo con la invención, puede insertarse en un vector de expresión apropiado que después se introducirá en una célula hospedadora procariota o eucariota adecuada.
Se puede utilizar cualquier vector de expresión adecuado y conocido del experto en la materia de acuerdo con la invención. Un vector de expresión es normalmente un plásmido, un cósmido, un episoma, un cromosoma artificial, un fago o un vector vírico. De manera ventajosa, el vector de expresión utilizado es pET-53-DEST, pET-55-DEST, pET-60-DEST o pBAD- DEST49.
Normalmente, la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención puede realizarse en células hospedadoras procariotas o eucariotas. Como ejemplos no limitantes de cepas de células hospedadoras procariotas, pueden mencionarse cepas tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cepas de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Como ejemplos no limitantes de cepas de células hospedadoras eucariotas, pueden mencionarse cepas tales como las de los parásitos Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia) Leishmania o Trypanosoma, o células de levadura tales como Saccharomyces sp. como Saccharomyces cerevisiae o pombe, Pichia pastoris etc.
Preferentemente, se utilizan células hospedadoras procariotas. Según una realización ventajosa, las células utilizadas para la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención son Escherichia coli y, más preferentemente, las cepas se seleccionan entre TOP10, BL21-AI, BL21 Star DE3, Arctic Express DE3.
Según una realización particular en la que la dextransacarasa de acuerdo con la invención es una dextransacarasa truncada tal como se ha definido anteriormente, la secuencia de los ácidos nucleicos que codifican una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 tal como se ha descrito anteriormente, se inserta en un vector de expresión pET-55-DEST, introducido a continuación en una célula hospedadora procariota de tipo Escherichia coli BL21 Star DE3. Esta realización permite producir la dextransacarasa, y permite obtener aproximadamente 10.000 unidades de actividad enzimática por litro de cultivo.
Una dextransacarasa según la invención puede prepararse cultivando células hospedadoras que contengan una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una dextransacarasa de acuerdo con la invención, en condiciones que permitan la expresión de una dextransacarasa, y por aislamiento de dicha dextransacarasa del medio de cultivo según las técnicas conocidas por el experto en la materia.
Después, dichas dextransacarasas pueden purificarse mediante cualquier técnica de purificación conocida por el experto en la materia, por ejemplo, por precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio hidrófobo, filtración en gel, cromatografía HPLC de fase inversa, etcétera. Según una realización preferida, la dextransacarasa obtenida mediante el cultivo de las células hospedadoras se purifica por cromatografía de afinidad.
De manera ventajosa, una dextransacarasa de acuerdo con la invención también se puede inmovilizar por técnicas conocidas del experto en la materia, por ejemplo, mediante la formación de enlaces iónicos y/o hidrófobos entre el soporte y la proteína (adsorción), formación de enlaces covalente entre el soporte y la proteína, inclusión de la proteína en el soporte o encapsulación de la proteína en el soporte. La inmovilización de una dextransacarasa de acuerdo con la invención supone una realización especialmente ventajosa de acuerdo con la invención, como se apreciará más adelante.
Debido a sus propiedades dextransacarasas notables, las proteínas con actividad dextransacarasa de acuerdo con la invención permiten además la síntesis de dextranos. El experto en la materia sabrá cómo adaptar las condiciones experimentales a aplicar para tener una producción optimizada de dextrano. De manera general, la dextransacarasa debe incubarse en un medio de síntesis que contenga sacarosa.
En consecuencia, un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de dextranos, en el que:
- se suministra sacarosa en un medio de síntesis,
- se pone en contacto una dextransacarasa de acuerdo con la invención con dicha sacarosa de dicho medio de síntesis para formar dextranos,
- opcionalmente, se aíslan los dextranos obtenidos.
De manera ventajosa, el pH utilizado en el procedimiento de síntesis está comprendido entre 4 y 7, preferentemente entre 4,5 y 5,75 para una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y entre 5 y 7 para una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Normalmente, el pH utilizado en el procedimiento de fabricación es de aproximadamente 5,75.
El medio de síntesis puede ser cualquier medio conocido del experto en la materia y adaptado a la síntesis de dextranos de acuerdo con la invención. Preferentemente, el medio de síntesis es un medio líquido que comprende un disolvente. Sin embargo, el experto podrá utilizar cualquier disolvente que permite conseguir el pH deseado para la síntesis. De este modo, dicho disolvente podrá, de forma ilustrativa, seleccionarse entre agua, o una solución
tampón adecuada (por ejemplo, acetato de sodio).
El experto en la materia sabrá adaptar la duración de la síntesis, especialmente en función de la cantidad de proteína con actividad dextransacarasa añadida al medio de síntesis y en función de la temperatura. De este modo, será necesaria una duración de síntesis más larga cuando se utilicen concentraciones elevadas de sacarosa en el medio de síntesis, por ejemplo, de aproximadamente 400 g.l-1 a 600 g.l-1. Normalmente, a una concentración enzimática de 1 U.ml-1, la síntesis se realiza durante un período comprendido entre 4 horas y 24 horas, preferentemente entre 8 horas y 16 horas, preferentemente durante un período de aproximadamente 14 horas. De una manera especialmente ventajosa, se pueden utilizar amplios intervalos de temperatura y concentraciones iniciales de sustrato, permitiendo estas además el control preciso de la masa molar de los dextranos obtenidos. De manera general, la concentración de sacarosa en el medio de síntesis puede estar comprendida entre 50 y 600 g.l-1, preferentemente entre 50 y 400 g.l-1. Normalmente, se utilizarán concentraciones de sacarosa en el medio de síntesis comprendidas entre 50 y 200 g.l-1 para los dextranos de masa molar más elevada, y se utilizarán concentraciones de sacarosa en el medio de síntesis comprendidas entre 200 y 600 g.l-1, preferentemente entre 200 y 400 g.l-1 para los dextranos de masa molar más baja. Efectivamente, ya es sabido que la masa molar promedio en peso del dextrano sintetizado podrá ser más elevada si se utilizan una concentración inicial de sacarosa baja en el medio de síntesis.
Por otro lado, de manera general, la síntesis se puede realizar a una temperatura comprendida entre 20 °C y 50 °C, preferentemente comprendida entre 25 °C y 45 °C. Como se ha indicado anteriormente, el uso de una enzima en una amplia gama de temperaturas, especialmente hasta 45 °C, es muy raro en las enzimas de la familia 70 de las glucosidohidrolasas. Sin embargo, la puesta en práctica de la síntesis de dextranos a temperaturas elevadas, por ejemplo de aproximadamente 45 °C, permite limitar ciertas contaminaciones microbianas.
Por otro lado, se ha comprobado en anteriores trabajos que un aumento de la temperatura permite la obtención de dextranos de masas molares superiores (5,6). Sin embargo, se ha puesto de manifiesto en el presente documento de forma sorprendente que, al contrario, durante la síntesis de dextranos mediante una dextransacarasa de acuerdo con la invención, una disminución de la temperatura induce dextranos de masas molares más altas.
Normalmente, se utilizarán temperaturas comprendidas entre 20 °C y 35 °C, preferentemente entre 25 °C y 35 °C, para los dextranos de masa molar más alta, se utilizarán temperaturas comprendidas entre 35 °C y 50 °C, preferentemente entre 35 °C y 45 °C para los dextranos de masa molar más baja. De esta forma, la temperatura de la reacción tiene gran influencia sobre la masa molar de los productos formados con la enzima de la presente invención.
Por otro lado, se utilizarán preferentemente concentraciones de sacarosa elevadas, especialmente de 200 a 600 g.l-1, preferentemente entre 200 y 400 g.l-1, para reacciones realizadas a temperaturas elevadas, especialmente superiores o iguales a 45 °C.
La masa molar de un dextrano sintetizado se puede controlar de forma muy precisa mediante la elección de la temperatura y la concentración de sacarosa, lo que resulta especialmente ventajoso ya que esto permite proporcionar de manera precisa una amplia gama de dextranos en términos de masa molar.
En efecto, como se pone de manifiesto en la parte experimental, se ha observado aquí de forma sorprendente una variación lineal de la masa molar de los dextranos obtenidos cuando se fija la temperatura de síntesis (o la concentración de sacarosa), y que se hace variar la concentración de sacarosa (o la temperatura de síntesis). Este resultado es muy sorprendente y, según el conocimiento de los inventores, nunca se había observado anteriormente, es una característica especialmente ventajosa de la invención ya que permite obtener, mediante temperaturas comprendidas de 20 °C a 50 °C y a concentraciones iniciales de sacarosa comprendidas de 50 g.l-1 a 600 g.l-1, dextranos con una masa molar comprendida de 2.103 a 40.103 g.mol-1.
Según una realización particular de la invención, en la que se utiliza una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, los dextranos tienen una masa molar comprendida de 7.103 a 25.103 g.mol-1. De este modo, a modo de ejemplo, si se fija la temperatura a 25 °C, el procedimiento de síntesis de dextranos de acuerdo con la invención permite obtener, a partir de una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, un dextrano que tiene una masa molar media 25.103 g.mol-1 a partir de 50 g.l-1 de sacarosa y un dextrano de masa molecular media de 8.103 g.mol-1 a partir de 400 g.l-1 de sacarosa. Análogamente, para una concentración inicial de sacarosa fijada en 200 g.l-1, es posible obtener un dextrano cuya masa molar media es de 17.103 g.mol-1 a 25 °C y un dextrano cuya masa molar media es de 8,5.103 g.mol-1 a 45 °C.
Por tanto, un objeto de la divulgación se refiere a un dextrano que se puede obtener mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Normalmente, un dextrano de acuerdo con la divulgación se caracteriza porque presenta un 100 % de enlaces glucosídicos a-1,6, una masa molar media en peso Mw comprendida entre 2.103 y 40.103 g.mol-1, preferentemente entre 6,5.103 y 32.103 g.mol'1, aún más preferentemente entre 7.103 y 25.103 g.mol'1 y un índice de dispersidad Di menor de 1,5. Una realización particular se refiere a un dextrano tal que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la invención y descrito como antecede.
De este modo, los dextranos según la divulgación son completamente lineales, puesto que no presenten ninguna ramificación, como se puede poner de manifiesto con un método de medición por RMN de protón con el espectrómetro Bruker Avance (500 MHz) (véanse los resultados experimentales). Por otro lado, los dextranos de acuerdo con la divulgación presentan de forma típica una masa molar media baja (2.103 a 40.103 g.mol'1, preferentemente entre 6,5.103 y 32.103 g.mol'1, preferentemente entre 7.103 y 25.103 g.mol'1, determinada por análisis HPSEC, y son poco polidispersos. Este resultado es muy sorprendente, ya que se obtiene mediante una dextransacarasa de acuerdo con la invención, puesto que las glucansacarasas de la familia GH-70 son conocidas por sintetizar generalmente a-glucanos con masas molares muy altas, de 106 a 108 Da (7-11).
Una realización particular de la invención se refiere también a una dextransacarasa que se ha inmovilizado.
Por tanto, un objeto de la invención se refiere a un complejo que comprende un soporte y una proteína con actividad dextransacarasa de acuerdo con la invención, caracterizada porque dicha proteína con actividad dextransacarasa se ha inmovilizado sobre dicho soporte.
A continuación, dicho complejo obtenido se podría denominar, a veces "proteína con actividad dextransacarasa inmovilizada" o "dextransacarasa inmovilizada".
Como se ha indicado anteriormente, una dextransacarasa de acuerdo con la invención se puede inmovilizar sobre el soporte por técnicas conocidas del experto en la materia, por ejemplo, mediante la formación de enlaces iónicos y/o hidrófobos entre el soporte y la proteína (adsorción), formación de enlaces covalente entre el soporte y la proteína, inclusión de la proteína en el soporte o encapsulación de la proteína en el soporte. Una dextransacarasa de acuerdo con la invención que se ha inmovilizado sobre un soporte presentará varias ventajas, entre ellas, aumentar la estabilidad de dicha dextransacarasa inmovilizada con respecto de la temperatura, el pH etc., permitir la reutilización de dicha dextransacarasa durante varias síntesis sucesivas, permitir el desarrollo de procesos semicontinuos y/o continuos, etc.
Preferentemente, se podrá utilizar un método de inmovilización mediante adsorción o formación de enlaces covalente entre el soporte y la proteína.
Una realización particular de la invención se refiere, por tanto, a un complejo tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque dicha dextransacarasa se ha inmovilizado sobre dicho soporte por formación de enlaces covalentes, iónicos y/o hidrófobos entre el soporte y la proteína.
El experto en la materia sabrá determinar el soporte más adecuado según el método de inmovilización empleado, que permita especialmente obtener buenos rendimientos de inmovilización así como una actividad de la enzima inmovilizada elevada.
Por ejemplo, se puede utilizar como soporte para un método de inmovilización por adsorción, un polimetacrilato de alta porosidad que tenga como grupo funcional un grupo amino de separador corto (por ejemplo Sprinbeads AA130® comercializado por Sprin Technologies), polimetacrilato que tenga como grupo funcional un grupo octadecilo (por ejemplo Sprinbeads AO110® comercializado por Sprin Technologies), poliestireno -DVB (DiVinil-Benceno) (por ejemplo Sprinbeads SN110® comercializado por Sprin Technologies) o metacrilato de epoxi que tiene como grupo funcional un grupo epoxi (por ejemplo Purolite ECR8214® comercializado por Purolite).
Por ejemplo, se puede utilizar como soporte para un método de inmovilización mediante enlaces iónicos entre el soporte y la proteína, polimetacrilato que tiene como grupo funcional un grupo de amino cuaternario (por ejemplo Sepabeads ECQ1A® comercializado por Resindion) o de estireno que tiene como grupo funcional un grupo amino cuaternario (por ejemplo Purolite ECR1604® comercializado por Purolite).
Preferentemente, dicha inmovilización se realiza usando el metacrilato de epoxi que tiene como grupo funcional un grupo epoxi, especialmente Purolite ECR8214® comercializado por Purolite.
De una manera especialmente ventajosa, la masa molar de un dextrano sintetizado a partir de una dextransacarasa inmovilizada de acuerdo con la invención puede, análogamente a una dextransacarasa de acuerdo con la invención no inmovilizada, controlarse de forma muy precisa mediante la elección de la temperatura y la concentración de sacarosa. Esto permite suministrar de forma precisa una gama más amplia de dextranos en términos de masa molar, produciendo ventajosamente una dextransacarasa inmovilizada de acuerdo con la invención dextranos de masas más bajas que las producidas mediante una dextransacarasa de acuerdo con la invención no inmovilizada en condiciones idénticas (véanse los resultados experimentales).
De este modo, una realización particular de la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de dextranos, en el que:
- se suministra sacarosa en un medio de síntesis,
- se pone en contacto un complejo de acuerdo con la invención con dicha sacarosa en dicho medio de síntesis para formar dextranos,
- opcionalmente, se aíslan los dextranos obtenidos.
Un objeto de la divulgación también se refiere a un dextrano que se puede obtener mediante dicho procedimiento de síntesis de dextranos.
Preferentemente, un dextrano así obtenido se caracteriza por que presenta un 100 % de enlaces glucosídicos a-1,6, una masa molar media en peso Mw comprendida entre 3.103 y 10.10 3 g.mol-1, preferentemente entre 4,2.103 y 7.3.103 g.mol-1 y un índice de dispersidad Di menor de 1,5.
Normalmente, a una temperatura fijada en 30 °C, una dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 inmovilizada sobre un soporte de Purolite ECR8214® produce un dextrano de masa molar 7,3.103 g.mol'1 a partir de 50 g.l-1 de sacarosa y un dextrano de masa molecular media de 4,2.103 g.mol'1 a partir de 450 g.l-1 de sacarosa.
La invención también se refiere a la síntesis de glucooligosacáridos. Los glucooligosacáridos son oligosacáridos constituidos por una cadena de unidades glucosilo asociadas mediante enlaces osídicos (por ejemplo, en a-1,6, a-1,2, a-1,3 y/o a-1,4). Las reacciónes del aceptor realizadas consisten en una transferencia de restos de glucosilo desde la sacarosa a otras moléculas aceptoras glucídicas agregadas al medio de síntesis.
De esta forma, un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de glucooligosacáridos, en el que: - se suministra sacarosa y al menos un aceptor glucídico a un medio de síntesis,
- se pone en contacto una dextransacarasa o un complejo de acuerdo con la invención con dicha sacarosa y dicho al menos un aceptor glucídico en dicho medio de síntesis para formar glucooligosacáridos,
- opcionalmente, se aíslan los glucooligosacáridos obtenidos.
El experto en la materia sabe qué aceptor glucídico utilizar dependiendo del tipo de glucooligosacáridos que se desea obtener.
Por ejemplo, dicho al menos un aceptor glucídico se selecciona entre glucosa, maltosa, isomaltosa, maltooligosacáridos y glucooligosacáridos y, preferentemente, se selecciona entre glucosa, maltosa y/o isomaltosa. Las mismas condiciones de síntesis que se han descrito anteriormente (medio de síntesis, temperatura, pH, concentraciones iniciales de sacarosa etc.) se aplican al presente procedimiento de síntesis de glucooligosacáridos. Un objeto de la divulgación también se refiere a un glucooligosacáridos que se puede obtener mediante el procedimiento de síntesis de glucooligosacáridos anteriormente descrito.
Según una realización particular de la invención, los glucooligosacáridos obtenidos son isomaltooligosacáridos. Por "isomaltooligosacáridos" se entienden oligómeros de glucosas unidas solamente por enlaces a-1,6. Dichos isomaltooligosacáridos se pueden obtener mediante un procedimiento de síntesis de glucooligosacáridos tal como se ha definido anteriormente, en el que dicho al menos un aceptor glucídico es, por ejemplo, glucosa o isomaltosa, preferentemente glucosa.
Un glucooligosacárido según la divulgación tiene, de forma general, una masa molar comprendida entre 0,4.103 y 5.103 g.mol-1, preferentemente entre 0,7.103 y 3,4.103 g.mol-1.
Normalmente, a una temperatura fijada en 30 °C, el procedimiento de síntesis de glucooligosacáridos de acuerdo con la invención permite obtener, a partir de una proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, un glucooligosacárido de masa molar media de 6,8.102 g.mol-1 a partir de 315 g.l-1 de glucosa y de 60 g.l-1 de sacarosa y un glucooligosacárido de masa molar media de 3,4.103 g.mol-1 a partir de 88 g.l-1 de glucosa y 110 g.l-1 de sacarosa.
Normalmente, a una temperatura fijada en 30 °C, el procedimiento de síntesis de glucooligosacáridos de acuerdo con la invención permite obtener, a partir de una proteína con actividad dextransacarasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 inmovilizada sobre el soporte Purolite ECR8214®, un glucooligosacárido de masa molar media de 7:102 g.mol-1 a partir de 333 g.l-1 de glucosa y de 166 g.l-1 de sacarosa y un glucooligosacárido de masa molar media de 2,4.103 g.mol-1 a partir de 88 g.l-1 de glucosa y 110 g.l-1 de sacarosa.
La invención también se refiere a la síntesis de glucoconjugados. Así, las glucansacarasas se pueden utilizar en la síntesis de glucoconjugados mediante reacción del aceptor, introduciendo además de la sacarosa, una molécula hidroxilada en el medio de síntesis.
La glucosilación de moléculas hidroxiladas puede ser interesante para la síntesis de nuevos compuestos, o para modificar propiedades fisicoquímicas tales como, por ejemplo, la solubilidad.
Por "molécula hidroxilada" se entiende cualquier tipo de molécula no glucídica que contiene al menos un grupo hidroxilo libre. Normalmente, una molécula hidroxilada es un flavonoide, poliol, aminoácido. Por ejemplo, se pueden glicosilar las catequinas, polifenoles o alquilpoliglucósidos.
Por tanto, un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de compuestos glucoconjugados, en el que:
- se suministra sacarosa y al menos una molécula hidroxilada en un medio de síntesis,
- se pone en contacto una dextransacarasa o un complejo de acuerdo con la invención con dicha sacarosa y dicha al menos una molécula hidroxilada en dicho medio de síntesis para formar compuestos glucoconjugados, - opcionalmente, se aíslan los componentes glucoconjugados obtenidos.
Las mismas condiciones de síntesis que se han descrito anteriormente (medio de síntesis, temperatura, pH, concentraciones iniciales de sacarosa etc.) se aplican al presente procedimiento de síntesis de glucoconjugados. Un objeto de la divulgación se refiere a un glucoconjugado que se puede obtener mediante el procedimiento de síntesis de glucoconjugados anteriormente descrito.
Los productos de acuerdo con la divulgación, especialmente los dextranos, los glucooligosacáridos o los glucoconjugados según la divulgación, se podrán utilizar en cualquier tipo de aplicaciones en las que sus características funcionales, especialmente su tamaño y su tipo de enlaces osídicos, sean adecuadas.
Un dextrano, glucooligosacárido o glucoconjugado de acuerdo con la divulgación se puede utilizar en aplicaciones farmacéuticas, cosméticas o alimentarias. Se puede, para las posibles aplicaciones, citar la publicación Vettori et al. (12). De manera ilustrativa, pero no limitativa, un dextrano de acuerdo con la invención se puede utilizar como soporte o base (por ejemplo, en una vacuna o en una composición farmacéutica) (13) como agente nutracéutico (13,14), como agente estabilizante (por ejemplo, estabilizante de un antígeno en una vacuna, o estabilizante de proteínas o de productos liofilizados), como agente inmunoestimulador o prebiótico (15), como agente de prevención de la cristalización de los azúcares, como sustituto de plasma sanguíneo, como transportador de hierro en el tratamiento de anemias importantes (14), como anticoagulante, como extensor del plasma sanguíneo, en la prevención de complicaciones postoperatorias, en el tratamiento de quemaduras y en la reducción del riesgo de trombosis o embolias, como principio activo o excipiente en soluciones oftálmicas, como excipiente en la liofilización como diluyente y/o modificador de la temperatura de colapso, como crioprotector, Como agente de almacenamiento de órganos para trasplantes.
Un objeto de la divulgación se refiere a una composición farmacéutica, cosmética o alimentaria que comprende un dextrano según la divulgación, un glucooligosacárido según la divulgación o un glucoconjugado según la divulgación como principio activo o como excipiente aceptable.
La invención también se refiere finalmente a derivados de los dextranos de la invención. En el presente documento, por "derivado de dextrano", se entiende un dextrano de la invención y que se ha sometido a una o varias etapas de modificaciones químicas conocidas, principalmente seleccionadas entre una eterificación, una esterificación o una reticulación. Por lo tanto, es posible obtener un derivado de dextrano tal como un dextrano reticulado, un éster de dextrano, por ejemplo, un éster inorgánico de dextrano (fosfato de dextrano, sulfato de dextrano) o un éster orgánico de dextrano, un éter de dextrano, por ejemplo, un éter de dextrano no iónico (dextrano alquilado, hidroxialquil éter o hidroxialquil aril éter de dextrina, éter de dextrano poli(etilenglicol) o un éter de dextrano iónico (sulfopropil dextrano, dextrano carboximetilado, dextrano 2-(dimetilamino)etilo). Dichas técnicas de modificación química, así como las aplicaciones para las que son adecuados los dextranos así obtenidos, son muy conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, puede hacerse referencia al documento de Heinze et al (16) y a la tesis de Ndegwa Henry Maina (17).
Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de modificación de un dextrano de conformidad con la invención, en el que el dextrano se somete a una o más etapas de modificación química.
De manera ventajosa, una etapa de modificación química se selecciona entre una eterificación, una esterificación y una reticulación.
Descripción de las figuras
Figura 1: Representación esquemática de la estructura primaria de DsrM (basada en el alineamiento de proteínas con la enzima GFT180 de Lactobacillus reuteri 180). Se diferencian cinco dominios: dominio V en blanco, dominio IV en gris claro, dominio B rayado, dominio A en esferas y dominio C en negro. Los motivos repetidos YG según la definición de Giffard y Jacques se han representado con motivos de tipo mosaico.
Figura 2: Representación esquemática de las estructuras primarias de DsrM, DsrM APS AC-APY y DsrM A174-1317. Se diferencian cinco dominios: dominio V en blanco, dominio IV en gris claro, dominio B rayado, dominio A en esferas y dominio C en negro. Los motivos repetidos YG según la definición de Giffard y Jacques se han representado con motivos de tipo mosaico.
Figura 3: Características de los soportes de inmovilización comerciales y utilizados para la inmovilización de la enzima DsrM APS AC-APY.
Figura 4: Representación gráfica de la actividad enzimática de la dextransacarasa truncada DsrM APS AC- APY en función de la temperatura en condiciones normalizadas, a partir de 100 g.M de sacarosa en acetato de sodio 50 mM, pH 5,75.
Figura 5: Representación gráfica de la actividad enzimática de la dextransacarasa completa DsrM en función de la temperatura en condiciones normalizadas, a partir de 100 g.M de sacarosa en acetato de sodio 50 mM, pH 5,75.
Figura 6: Representación gráfica de la actividad enzimática de la dextransacarasa truncada DsrM APS AC- APY en función del pH en condiciones normalizadas, a partir de 100 g.M de sacarosa, a 30 °C.
Figura 7: Representación gráfica de la actividad enzimática de la dextransacarasa completa DsrM en función del pH en condiciones normalizadas, a partir de 100 g.M de sacarosa, a 30 °C.
Figura 8: Representación de la masa molar de los dextranos sintetizados mediante DsrM a 25 °C, pH 5,75 en función de la concentración inicial de sacarosa.
Figura 9: Perfil HPSEC-RI de los productos sintetizados mediante DsrM (forma completa), tras 24 h de reacción a partir de 100 g.M de sacarosa a 30 °C, pH 5,75.
Figura 10: Gráficas de la derecha: Control de la masa molecular de los dextranos sintetizados mediante la enzima DsrM APS AC-APY a temperatura fija: 25 °C (A), 30 °C (B), 35 °C (C), 40 °C (D), variando la concentración inicial del sustrato (sacarosa).
Gráficas de la izquierda: Perfiles HPSEC-RI de las reacciones enzimáticas a t=24h a partir de 50 g.M , 100 g.M , 200 g.M , 300 g.M y 400 g.M de sacarosa (respectivamente, curvas de abajo hacia arriba) con temperatura fija: 25 °C (A), 30 °C (B), 35 °C (C), 40 °C (D).
Figura 11: Gráficas de la derecha: Control de la masa molecular de los dextranos sintetizados mediante la enzima DsrM APS AC-APY a concentración inicial de sacarosa fija: 50 g.M (A), 100 g.M (B), 200 g.M (C), 300 g.l-1 (D) y 400 g.M (E), haciendo variar la temperatura.
Gráficas de la izquierda: Perfiles HPSEC-Rl de las reacciones enzimáticas a t=24h a 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C y 45 °C (respectivamente, curvas de abajo hacia arriba) con concentración inicial de sacarosa fija: 50 g.M (A), 100 g.M (B), 200 g.M (C), 300 g.M (D) y 400 g.M (E).
Figura 12: Perfil HPSEC-RI de los dextranos sintetizados mediante DsrM APS AC-APY al finalizar la reacción a partir de 100 g.M de sacarosa a 30 °C, pH 5,75, con a: polímero de masa molecular media de 17,5 kDa, b: disacáridos (leucrosa presente en la mezcla de síntesis final) y c: monosacáridos (fructosa y glucosa).
Figura 13: A: Comparación de la masa molar media de los dextranos sintetizados mediante la enzima DsrM APS AC- APY libre (marcador negro) e inmovilizada sobre el soporte Purolite ECR8214® (marcador blanco) a 30 °C y en función de concentraciones iniciales de sacarosa crecientes (50 g.M , 100 g.M , 200 g.M ,300 g.M y 400 g.M ) B: Perfiles HPSEC-RI de las reacciones enzimáticas catalizadas mediante DsrM APS AC-APY inmovilizada a t=24 h a partir de 50 g.M , de 100 g.M , de 200 g.M , de 300 g.M y de 400 g.M de sacarosa (respectivamente, curvas de abajo hacia arriba).
Figura 14: Espectro H1 RMN de los productos sintetizados mediante DsrM tras 24 h de reacción a partir de 100 g.M de sacarosa a 30 °C, pH 5,75 con a) enlaces a-1,6, b) leucrosa.
Figura 15: Espectro H1 RMN de los productos sintetizados mediante DsrM APS AC-APY al finalizar la reacción a partir de 100 g.M de sacarosa a 30 °C, pH 5,75 con a) leucrosa, b) enlaces a-1,6.
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1: Identificación del gen dsrm en el genoma de Leuconostoc citreum NRRL B-1299 y análisis de la estructura primaria de la proteína correspondiente.
El gen dsrm a se ha identificado en el genoma de Leuconostoc citreum NRRL B-1299 por blast nucleotídico contra una base de datos constituida por secuencias nucleotídicas de glucansacarasas clasificadas en la familia 70 de las glucosidohidrolasas según la clasificación CAZY (Carbohydrate Active enZYme database, www.cazy.org/GH70 all.html).
El gen se introdujo en la secuencia proteica mediante el programa informático Transeq de EMBOSS (www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss transeq/).
Una secuencia que codifica un péptido de señalización fue identificada mediante el programa informático SignalP server 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).
Múltiples alineamientos de proteínas (con el programa informático de alineamiento global, ClustalW2, disponible en línea, www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) con otras glucansacarasas caracterizadas, han permitido identificar los motivos conservados del núcleo catalítico de DsrM y cortar la enzima en diferentes dominios proteicos ( A, B, C, IV y V).
Los diferentes porcentajes de identidad y de similitud entre secuencias proteicas, indicados en la ficha preliminar de la invención, se calcularon con la herramienta BlastP (Blast para proteína-proteína) del NCBI, disponible en línea (blast.nc- bi.nlm.n¡h.gov/Blast.cg¡?PROGRAM=blastp&PAGE TYPE=BlastSearch&LINK L OC=blasthome) y utilizando los parámetros predeterminados propuestos por el sitio.
Ejemplo 2: Clonación del gen dsrm
El gen dsrm se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico de Leuconostoc citreum NRRL B-1299 y usando los dos cebadores mostrados en la Tabla 1.
Tabla 1
La adición de las 4 bases "CACC" en la posición 5' del cebador directo (subrayados en la Tabla 1) permitió la inserción correcta del fragmento de PCR en el vector de entrada pENTR/D/TOPO (Life Technologies), para después proceder a la clonación utilizando la tecnología Gateway. Se seleccionó un clon de entrada positivo (vector de entrada que contenía el fragmento de PCR en la dirección deseada) y se recombinó con el vector de destino pET-55-DEST (Novagen) utilizando la mezcla II de enzima clonasa LR (Life technologies). Los clones recombinantes positivos se seleccionaron y analizaron por restricción. La ausencia de mutación dentro de los plásmidos se confirmó por secuenciación (GATC).
Ejemplo 3: Clonación del gen dsrm
Aps ñ c-apy.
El gen dsrm Aps ñc-apy se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pET-55/DsrM anteriormente construido en el Ejemplo 2 y usando los dos cebadores presentados en la Tabla 2.
Tabla 2
La adición de las 4 bases "CACC" en la posición 5' del cebador directo (subrayados en la Tabla 2) permitió la inserción correcta del fragmento de PCR en el vector de entrada pENTR/D/TOPO (Life Technologies), para después proceder a la clonación utilizando la tecnología Gateway. Se seleccionó un clon de entrada positivo (vector de entrada que contenía el fragmento de PCR en la dirección deseada) y se recombinó con el vector de destino pET-55-DEST (Novagen) utilizando la mezcla II de enzima clonasa LR (Life technologies). Los clones recombinantes positivos se seleccionaron y analizaron por restricción. La ausencia de mutación dentro de los plásmidos se confirmó por secuenciación (GATC).
Ejemplo 4: Expresión heteróloga de dsrm y dsrm
Aps Ac-apy
en Escherichia coli
Para la producción de enzimas recombinantes, células d’Escherichia coli BL21 star DE3 se transformaron con los
plásmidos correspondientes (pET-55/dsrm o pET-55/ dsrm Aps Ac-apy) construidos según los ejemplos 2 y 3. Se inocularon 300 |jl de la mezcla de transformación en 30 ml de medio LB (caldo lisogénico), complementado con 100 jg.ml-1 de ampicilina e incubado durante la noche a 37 °C para preparar un precultivo.
Los cultivos de IL en medio ZYM5052 modificado (glicerol al 1 %, glucosa al 0 %, lactosa al 0.1 %, Studier, 2005) se sembraron a una densidad óptica DO600 nm inicial de 0,05 a partir del precultivo del día anterior, y después se incubaron durante 26 horas a 21 °C y a 150 rpm. Al final de la fermentación, los medios de cultivo se centrifugaron (15 min, 6500 rpm, 4 °C) y los sedimentos se concentraron a una DO de 80 en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75.
Para obtener la enzima recombinante (producida por Escherichia coli intracelularmente), las células se degradaron con ultrasonidos según el siguiente protocolo: 5 ciclos de 20 segundos al 30 % de la potencia máxima de la sonda, en frío, separados por 4 minutos de reposo sobre hielo. El sobrenadante de la sonicación (que contiene la enzima recombinante soluble) se recuperó después de 30 minutos de centrifugación (10000 rpm, 10 °C) y se conservó a 4 °C.
Ejemplo 5: Método de determinación de la actividad enzimática según el método del DNS.
Una unidad enzimática de glucansacarasa representa la cantidad de enzima que libera un jmol de fructosa por minuto, a 30 °C, a partir de 100 g.l-1 de sacarosa en acetato de sodio 50 mM, pH 5,75.
La actividad se determina midiendo la velocidad de producción inicial de los azúcares reductores utilizando el método del ácido dinitrosalicílico (DNS). Durante una cinética, se toman 100 j l de medio de reacción y la reacción se detiene añadiendo un volumen equivalente de DNS. Después, las muestras se calientan durante 5 minutos a 95 °C, se enfrían en hielo, se diluyen a la mitad en agua, y la absorbancia se lee a 540 nm. Un intervalo patrón de 0 a 2 g.M de fructosa permite establecer la relación entre el valor de absorbancia y la concentración de azúcares reductores.
Ejemplo 6: Inmovilización de la dextransacarasa truncada APS AC-APY
Se realizó la inmovilización haciendo reaccionar las masas comprendidas entre 0,1 g y 0,6 g de diferentes soportes comerciales con 2,5 ml de sobrenadante de sonicación que contiene la enzima recombinante DsrM APS AC-APY. El pH de esta solución enzimática se controla y debe estar comprendido entre 5,75 y 7,5. La reacción se realiza a 4 °C con agitación suave (100 rpm). La inmovilización se detiene después de 16 horas de reacción mediante filtración y lavado con tres volúmenes sucesivos (10 ml) de tampón acetato de sodio, pH 5,75 a 50 mM. La enzima inmovilizada se conserva a 4 °C antes de su uso.
Las características de los soportes estudiados se proporcionan en la Figura 3.
A continuación, dicha enzima inmovilizada se denomina como "DsrM APS AC-APY inmovilizada".
Los diferentes soportes de inmovilización se analizaron para determinar su capacidad de fijar la enzima DsrM APS AC-APY. La selección consistió en poner en contacto masas de 250 mg de cada soporte con 2,5 ml de sobrenadante de sonicación (actividad libre inicial: 16,5 U/ml).
La actividad fijada después de la reacción y lavado de los diferentes soportes se midió sobre alícuotas obtenidas de cada lote de producto enzimático y de masa controlada. El volumen de reacción también se ha adaptado a la actividad de cada lote, permitiendo lo volúmenes más grandes la medición de las enzimas más activas. Los resultados de la selección se presentan en la Tabla 3 siguiente.
Tabla 3
Soporte Masa de enzima inmovilizada Volumen de Producción de azúcares
durante la reacción (mg) reacción (ml) reductores Actividad (umol/min/reacción) (U/g) Purolite
ECR8214® 39,5 3 1,03 77,94 Sprinbeads
AO110® 35,8 3 0,93 77,77 Sepabeads
ECQ1A® 36,7 3 0,43 35,34 Purolite
ECR1604® 44,4 3 0,46 31,19 Purolite
ECR4204® 56,5 1 1,71 30,27 Sprinbeads
AA130® 54,4 1 1,32 24,26
Sprinbeads
SN110® 
3 0,32 21,88
Los diferentes soportes, según su actividad medida, pueden agruparse en dos categorías:
- los 2 soportes Purolite ECR8214® y Sprinbeads AO110® que presentan las mejores actividades, de aproximadamente 78 U/g;
- 5 soportes que tienen actividades medianas pero buenas, comprendidas entre 22 y 35 U/g;
Solamente el soporte Purolite ECR8214® se utilizó a continuación para optimizar la inmovilización, especialmente mediante optimización de los rendimientos de inmovilización, de las actividades fijadas etc.
La optimización de la inmovilización de DsrM APS AC-APY sobre Purolite ECR8214® consistió en hacer variar la masa de soporte entre 100 mg y 600 mg puesta en contacto con una cantidad de enzima libre fija (2,5 ml de sobrenadante de sonicación con una actividad inicial de 45 U/ml).
El cálculo de tres rendimientos diferentes permite caracterizar la inmovilización:
- el rendimiento de fijación Rfijación, que cuantifica la parte total de la enzima fijada en los soportes Actividad libre inicial
Rfija c ió n (°%) - ( 1 - ■ )x100 Actividad Ubre final
- el rendimiento de inmovilización Rinmovilización, que cuantifica la enzima inmovilizada activa en función de la cantidad total de la enzima utilizada para la inmovilización
Actividad, inmovilizada
Rinm ovilización(°%) = Actividad Ubre introducida^ 00
- eficacia de inmovilización, que cuantifica la cantidad de enzima inmovilizada activa en función de la cantidad total de la enzima inmovilizada eficazmente
Actividad inmovilizadae
Eficacia (%) (Actividad libre ininicial — Actividad libre final) x100 Los resultados de la inmovilización se presentan en la Tabla 4 siguiente.
Tabla 4
masa para Actividad Rendimiento de Rendimiento de
inmovilización (mg) inmovilizada U/g fijación % inmovilización % Eficacia %
105,5 144,3 44 14 31
248,7 147,2 58 33 56
355,6 146,0 80 46 58
456,7 148,2 92 60 66
604,0 132,3 97 71 73
La mejor condición de inmovilización se define como el resultado de un compromiso entre los diferentes rendimientos y la actividad del biocatalizador inmovilizado obtenido.
En primer lugar se observa que el uso de una solución de DsrM APS AC-APY libre de actividad más alta (45 U/ml vs 16U/ml utilizada durante la selección de los soportes) permite aumentar significativamente la actividad fijada sobre el soporte. En efecto, las actividades medidas aumentaron en un factor de 2 (véase la Tabla 4, actividades de aproximadamente 140 U/ml).
Por otro lado, las masas del soporte Purolite ECR8214® comprendidas entre 100 y 450 mg permiten obtener una actividad fijada de aproximadamente 140 U/g. Sin querer quedar vinculado por teoría alguna, los inventores piensan que, en estas condiciones, el soporte está completamente saturado de proteína. Esto se confirma además por los rendimientos de fijación y de inmovilización obtenidos que tienden a aumentar con la masa de soporte utilizada. Más allá de 600 mg puestos en contacto con 2,5 ml de sobrenadante de sonicación, la actividad comienza a disminuir (aproximadamente 132 U/g).
La mejor condición de inmovilización para el soporte Purolite ECR8214® es, por tanto, la puesta en contacto de una cantidad comprendida entre 450 y 600 mg de soporte, típicamente de aproximadamente 500 mg, con 2,5 ml de sobrenadante de sonicación. Estas condiciones permiten obtener la mejor actividad (aproximadamente 140 U/g) limitando a la vez las pérdidas de enzimas (rendimientos elevados).
A continuación, "DsrM APS AC-APY inmovilizada" es una dextransacarasa DsrM APS AC-APY inmovilizada sobre el soporte Purolite ECR8214®.
Ejemplo 7: Determinación de los rendimientos de producción de la dextransacarasa completa DsrM y de la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY
Los rendimientos de producción se determinan por cromatografía de intercambio aniónico (HPAEC-PAD, High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) y mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HPSEC, High Performance Size Exclusion Chromatography).
Análisis HPAEC-PAD
Los azúcares, glucosa, fructosa, leucrosa y sacarosa, se separan en una columna Dionex CarboPac PA-100 mediante un gradiente de acetato de sodio de 6 a 500 mM en 36 minutos, que contiene hidróxido de sodio (sosa) 150 mM. Se realizan intervalos patrón de 5, 10, 15 y 20 mg.kg-1 de estos azúcares y se permite su cuantificación. Los rendimientos de producción, es decir, la parte de glucosa procedente de la sacarosa incorporada a la formación de glucosa libre, de leucrosa y dextrano se calculan de la siguiente forma:
( [ Glucosa]tf — [Glucosa] tü)x342
%G glucosa
([SacarosajtQ — [Sacarosa]tf)x1Qü
( [ Glucosa]tf — [Glucosa]tü)
%G leucrosa
([ Sacarosa]tü — [Sacarosa]tf) x100
Análisis HPSEC
Los azúcares se separaron según su tamaño en dos columnas de permeación en gel puestas en serie (Shodex OH Pack 805 y 802.5) en un horno cuya temperatura se mantiene a 70 °C. El caudal de la fase móvil (NaNO30,45 M, etilenglicol al 1 %) es de 0,3 ml.min-1. Las muestras se diluyeron en el mismo disolvente que el eluyente a 10 g.M máximo de los azúcares totales.
El análisis de los productos de la reacción mediante cromatografía de exclusión molecular permite calcular la parte de unidades de glucosilo derivadas de sacarosa, utilizadas en la producción de dextrano:
Aire
°%G dextrano = dextrano
Airesacarosa X162
342
Dextransacarasa completa DsrM
En el presente documento se ha puesto de manifiesto que DsrM es una polimerasa muy buena. En efecto, los análisis cromatográficos (HPAEC-PAD y HPSEC-RI) realizados después de una síntesis de dextrano a partir de 100 g.M de sacarosa, a 30 °C, pH 5,75, muestran que el 81 % de las unidades de glucosilo derivadas del sustrato se utilizan en la producción de dextrano. Solo se incorpora entre el 4 % y el 15 % de estas unidades a la síntesis de glucosa y leucrosa libres, respectivamente.
Dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY
En el presente se ha puesto de manifiesto que la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY es también una excelente polimerasa. En efecto, los análisis cromatográficos (HPAEC-PAD y HPSEC-RI) realizados después de una síntesis de dextrano a partir de 100 g.M de sacarosa, a 30 °C, pH 5,75, muestran que el 85 % de las unidades de glucosilo derivadas del sustrato se utilizan en la producción del polímero. Solo se pierde el 3 % y el 12 % de estas unidades al incorporarse en la síntesis de glucosa y leucrosa libres, respectivamente.
Ejemplo 8: Método de determinación de la masa molar de los dextranos mediante análisis HPSEC
Una gama de patrón realizada con los dextranos comerciales de 503000, 68400, 34100, 11300 g.mol-1, así como maltopheptosa, sacarosa y fructosa ha permitido determinar la masa molar de los dextranos sintetizados mediante DsrM, DsrM APS AC-APY o DsrM APS Ac -APY inmovilizada.
Ejemplo 9: Determinación de las condiciones óptimas de trabajo de la dextransacarasa completa DsrM y de la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY
Efecto de la temperatura
El valor de la temperatura óptima se determina midiendo la actividad del extracto enzimático sin procesar, a diferentes temperaturas (entre 23 y 50 °C) a partir de 100 g.l-1 de sacarosa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75.
Como se puede observar en las figuras 4 y 5, la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY y la dextransacarasa DsrM mostraron una temperatura óptima comprendida entre 30 y 45 °C, que ofrece la posibilidad de trabajar en intervalos de temperatura amplios, y especialmente a temperaturas elevadas.
Efectos del pH
El efecto del pH sobre la actividad enzimática del extracto sin procesar se mide a 30 °C a partir de 100 g.l-1 de sacarosa, en tampón de citrato fosfato 50 mM, para valores de pH comprendidos entre 3,5 y 8 (intervalo de 0,5). Como se observa en la figura 6, la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY a un pH óptimo comprendido entre 4,5 y 5,5.
Como se observa en la figura 7, la dextransacarasa DsrM a un pH optimal comprendido entre 5 y 7.
Ejemplo 10: Producción de dextranos de distintas masas molares
Las reacciones enzimáticas con DsrM, DsrM APS AC-APY y DsrM APS AC-APY inmovilizada se han aplicado a 1 U/ml, a partir de diferentes concentraciones iniciales de sacarosa (50, 100, 200, 300 y 400 g.l'1) y opcionalmente a diferentes temperaturas (25, 30, 35, 40 y 45 °C), en tampón de acetato de sodio, 50 mM, pH 5,75.
Las tomas de muestra en los momentos iniciales y finales (24 h) se realizaron (la reacción enzimática se detuvo por calentamiento a 95 °C durante 5 minutos) y se conservaron a -20 °C antes de analizarse mediante HPAEC-PAd , como se explica en el ejemplo 7, para controlar los rendimientos de producción, y mediante cromatografía de exclusión molecular (HPSEC), como se explica en el ejemplo 8, para determinar la masa molecular de los dextranos sintetizados.
En lo que respecta a los ensayos realizados sobre DsrM APS AC-APY inmovilizada, los medios de reacción se centrifugan para eliminar los residuos sólidos de enzima inmovilizada.
Dextransacarasa completa DsrM
Se obserba una variación lineal del tamaño de los productos en función de la concentración inicial de sacarosa (fijación de la temperatura).
De esta forma, es posible controlar la masa molar del dextrano sintetizado por la forma completa de DsrM haciendo variar la concentración inicial de sustrato, a temperatura fija.
De este modo, por ejemplo a 25 °C, es posible obtener un panel de dextranos cuya masa molar media está comprendida entre 32.103 y 6,5.103 g.mol-1 para una gama de concentraciones iniciales de sustrato comprendida de 100 a 500 g.l-1 (Figura 8).
La figura 9 pone de manifiesto que un dextrano, sintetizada a partir de 100 g.l-1 de sacarosa sola, a 30 °C y pH 5,75, que presenta una baja masa molar promedio de 27.103 Da, y es poco polidispersa.
Dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY
Como se puede observar en las figuras 10 y 11, se observa una variación lineal del tamaño de los productos en función de la temperatura (fijación de la concentración inicial de sacarosa) o de la concentración inicial de sacarosa (fijación de la temperatura).
De esta forma, es también posible controlar de forma muy precisa la masa molar del dextrano sintetizado por la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY haciendo variar la concentración inicial de sustrato, a temperatura fija
(o a la inversa).
De este modo, a modo de ejemplo, si se fija la temperatura a 25 °C, la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY produce un dextrano de masa molar media de 25.103 g.mol'1 a partir de 50 g.l-1 de sacarosa y un dextrano de masa molecular media de 8.103 g.mol'1 a partir de 400 g.l-1 de sacarosa.
Por otro lado, se resalta que los dextranos sintetizados son poco polidispersos, salvo los polímeros producidos a partir de altas concentraciones de sacarosa (400 g.M).
Igualmente se observa, que es posible explorar un espectro más amplio de productos, en términos de masas masa moleculares, temperaturas bajas o a partir de pequeñas concentraciones de sacarosa.
Análogamente, para una concentración inicial de sacarosa fijada en 50 g.l-1, es posible obtener dextranos cuya masa molar media está comprendida entre 25.103 g.mol'1 y 7.103 g.mol'1 para una gama de temperaturas comprendida de 25 a 45 °C.
Además, los balances de producción varían poco en función de las condiciones experimentales. Los análisis HPAEC-PAD realizados indican que, para todas las reacciones analizadas, más del 81 % de las unidades de glucosilo derivadas del sustrato se utilizan para la producción del polímero durante el uso de la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY.
La figura 12 pone de manifiesto que un dextrano, sintetizada a partir de 100 g.l'1 de sacarosa sola, a 30 °C y pH 5,75, que presenta una baja masa molar promedio de 17,5.103 Da, y es poco polidispersa.
Dextransacarasa DsrM APS AC-APY inmovilizada
Como se observa en la figura 13, la enzima inmovilizada conserva su capacidad de producir dextranos de masas molares diferentes según la concentración inicial de sacarosa. La variación lineal de la masa molar de los dextranos producidos también se conserva.
Por otro lado, la dispersidad de los dextranos es similar entre las dos formas de la enzima (dextransacarasa DsrM APS AC-APY y dextransacarasa DsrM APS AC-APY inmovilizada) (figura 13).
Finalmente, la dextransacarasa DsrM APS AC-APY inmovilizada sobre el soporte Purolite ECR8214® tiene la particularidad de producir dextranos de masas molares más bajas que las producidas mediante la dextransacarasa DsrM APS AC-APY en condiciones idénticas. Por ejemplo, para una concentración inicial de 100 g.l'1 de sacarosa, se obtiene un dextrano de masa molar 9,4.103 g.mol'1 con la dextransacarasa DsrM APS AC-APY no inmovilizada mientras que se obtiene un dextrano de masa molar 4,7.103 g.mol'1 con la dextransacarasa DsrM APS AC-APY inmovilizada (figura 13). La inmovilización de una dextransacarasa de acuerdo con la invención presenta por tanto la ventaja de ampliar la gama de dextranos producidos.
Ejemplo 11: Análisis de la naturaleza de los enlaces de los dextranos producidos mediante la dextransacarasa DsrM y mediante la dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY
Después de la liofilización, 20 mg de medio de reacción en bruto (tras el consumo total de sacarosa) se diluyen en 0,5 ml de agua deuterada y se analizan mediante RMN de protón con el espectrómetro Bruker Avance (500 MHz). Después, los espectros se tratan e interpretan con el programa informático TOPSPIN 3.0.
Dextransacarasa completa DsrM
Se ha puesto de manifiesto mediante análisis RMN que el producto sintetizado mediante DsrM y 100 g.l'1 de sacarosa sola, a 30 °C en acetato de sodio 50 mM, pH 5,75, es un polímero de unidades de glucosilo unidas exclusivamente t (100 %) en a-1,6 (Figura 14).
El producto sintetizado a partir de DsrM es, por tanto, un dextrano perfectamente lineal, y DsrM es una dextransacarasa muy específica de la polimerización mediante enlaces osídicos de tipo a-1,6.
Dextransacarasa truncada DsrM APS AC-APY
Se ha puesto de manifiesto mediante los análisis RMN que, análogamente a la dextransacarasa DsrM, el producto sintetizado a partir de la forma truncada DsrM APS AC-APY y 100 g.l'1 de sacarosa sola, a 30 °C y pH 5,75 es un polímero de unidades de glucosilo unidas exclusivamente (100 %) en a-1,6 (Figura 15).
El producto sintético a partir de la forma truncada DsrM APS AC-APY es por tanto igualmente un dextrano perfectamente lineal, y DsrM APS AC-APY es una dextransacarasa muy específica de la polimerización mediante enlaces osídicos de tipo a-1,6.
Ejemplo 12: Producción de glucooligosacáridos por reacción del aceptor
Las reacciones de aceptor se han puesto de manifiesto usando 1 U.ml-1 de DsrM APS AC-APY y DsrM APS AC-APY inmovilizada, a partir de concentraciones iniciales de sacarosa comprendidas de 60 a 333 g.l-1 y de concentraciones de glucosa (que tiene el papel de aceptor glucídico) comprendido de 83 a 333 g.l-1. Las síntesis se realizaron a una temperatura de 30 °C y en un tampón de acetato de sodio, 50 mM, pH 5,75. Las reacciones enzimáticas se detuvieron mediante calentamiento a 95 °C durante 5 minutos después de 24 horas.
Posteriormente, las diferentes muestras se analizaron mediante HPSEC como se explica en el ejemplo 8 para determinar la masa molar media de los productos sintetizados.
Los resultados obtenidos mediante DsrM APS AC-APY, es decir, la proteína de actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 2, a partir de diferentes concentraciones de sacarosa y glucosa aceptora se presentan en la Tabla 5 siguiente:
Tabla 5
Relación Masa seca total Glucosa Sacarosa (g.l- Masa molar de glucooligosacáridos [Glucosa]/[Sacarosa]a (g.l-1) (g.l-1) 1) (g.mol-1)
1,25 375 167 208 1,9.103
2,31 375 113 262 2,7.103
1,25 198 88 110 3,4.103
0,50 500 333 167 0,8.103
1,25 375 167 208 1,9.103
0,19 375 315 60 0,7.103
1,25 552 245 307 1,1.103
2,00 500 167 333 1,6.103
1,25 375 167 208 1,9.103
0,50 250 167 83 1,6.103
2,00 250 83 167 1,6.103
1,25 375 167 208 1,9.103
aRelación calculada a partir de concentraciones másicas
Los resultados obtenidos mediante DsrM APS AC-APY inmovilizada, es decir, la proteína con actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO:2 inmovilizada sobre el soporte ECR8214® como se describe en el ejemplo 6, a partir de diferentes concentraciones de sacarosa y glucosa aceptora se presentan en la Tabla 6 siguiente:
Tabla 6
Relación .. t t l ( M ) [Glucosa] Masa molar de [Glc]/[Sacarosa1a asa seca oa (g ) (g.l-1)______[Sacarosa] (g.l-1)_____ glucooligosacáridos (g.mol-1)
1,25 375 167 208 1,5.103
2,31 375 113 262 2,0.103
1,25 198 88 110 2,4.103
0,50 500 333 167 0,7.103
1,25 375 167 208 1,6.103
0,19 375 315 60 0,7.103
1,25 552 245 307 1,0.103
2,00 500 167 333 1,4.103
1,25 375 167 208 1,6.103
1,25 375 167 208 1,5.103
0,50 250 167 83 1,5.103
2,00 250 83 167 2,3.103
1,25 375 167 208 1,6.103
aRelación calculada a partir de concentraciones másicas
Por tanto, se ha demostrado en el presente documento que, con las condiciones de síntesis aplicadas, la utilización de las dextransacarasas de acuerdo con la invención permite al menos sintetizar glucooligosacáridos de masa molar media comprendida 0,7.103 a 3,4.103 g.mol-1.
Ejemplo 13:
El dextrano comercial de 11 300 g/mol suministrado por Sigma (ref D-9260 lote 74H0764) se comparó con el dextrano sintetizado según el procedimiento de la invención a partir de sacarosa 300 g/l en tampón de acetato de sodio a pH 5,75 y una temperatura de 30 °C para obtener una masa molar de 11 300 g/mol. Un análisis mediante
Claims (11)
1. Proteína de actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 1, o que comprende al menos un 80 %, preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 90 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente un 98 % de identidad en las posiciones 563 a 1282 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, preferentemente en las posiciones 563 a 1282 y 1316 a 1433 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, aún más preferentemente en las posiciones 563 a 1282, 1316 a 1433 y 174 a 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, aún más preferentemente en las posiciones 563 a 1282, 1316 a 1433 y 42 a 421 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la actividad dextransacarasa que permite la síntesis de dextranos de masa molar media en peso Mw comprendida entre 2.103 y 40.103 g.mol-1, y un índice de dispersidad Di menor de 1,5, a temperaturas comprendidas de 20 °C a 50 °C y a concentraciones iniciales de sacarosa comprendidas de 50 g.l-1 a 600 g.l-1.
2. Proteína de actividad dextransacarasa que tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 2, o que comprende al menos un 80 %, preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 90 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente a un 98 % de identidad en las posiciones 522 a 1241 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, preferentemente en las posiciones 522 a 1241 y 1275 a 1392 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, aún más preferentemente en las posiciones 522 a 1241, 1275 a 1392 y 133 a 380 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, aún más preferentemente en las posiciones 522 a 1241, 1275 a 1392 y 1 a 380 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la actividad dextransacarasa que permite la síntesis de dextranos de masa molar media en peso Mw comprendida entre 2.103 y 40.103 g.mol-1, y un índice de dispersidad Di menor de 1,5, a temperaturas comprendidas de 20 °C a 50 °C y a concentraciones iniciales de sacarosa comprendidas de 50 g.l-1 a 600 g.l-1.
3. Proteína con actividad dextransacarasa según la reivindicación 2, caracterizada porque tiene por secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 2.
4. Complejo que comprende un soporte y una proteína con actividad dextransacarasa tal como se ha definido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha proteína con actividad dextransacarasa se ha inmovilizado sobre dicho soporte.
5. Procedimiento de síntesis de dextranos, en el que:
- se suministra sacarosa en un medio de síntesis,
- se pone en contacto una dextransacarasa tal como se ha definido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con dicha sacarosa de dicho medio de síntesis para formar dextranos, y
- opcionalmente, se aíslan los dextranos obtenidos.
6. Procedimiento de síntesis de dextranos, en el que:
- se suministra sacarosa en un medio de síntesis,
- se pone en contacto un complejo tal como se ha definido según la reivindicación 4 con dicha sacarosa en dicho medio de síntesis para formar dextranos, y
- opcionalmente, se aíslan los dextranos obtenidos.
7. Procedimiento de síntesis según las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque la síntesis se realiza a una temperatura comprendida entre 20 °C y 50 °C, preferentemente comprendida entre 25 °C y 45 °C.
8. Procedimiento de síntesis según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que la concentración de sacarosa en el medio de síntesis estar comprendida entre 50 y 600 g.l'1, preferentemente comprendida entre 50 y 400 g.l-1.
9. Procedimiento de síntesis según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por que el pH de la reacción está comprendido entre 4 y 7, preferentemente de aproximadamente 5,75.
10. Proceso de síntesis de glucooligosacáridos en el que:
- se suministra sacarosa y al menos un aceptor glucídico a un medio de síntesis,
- se pone en contacto una dextransacarasa tal como se ha definido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un complejo tal como se ha definido según la reivindicación 4 con dicha sacarosa y dicho al menos un aceptor glucídico en dicho medio de síntesis para formar glucooligosacáridos, y
- opcionalmente, se aíslan los glucooligosacáridos obtenidos.
11. Procedimiento de síntesis de compuestos glucoconjugados, en el que:
- se suministra sacarosa y al menos una molécula hidroxilada en un medio de síntesis,
- se pone en contacto una dextransacarasa tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un complejo tal como se ha definido según la reivindicación 4 con dicha sacarosa y dicha al menos una molécula hidroxilada en dicho medio de síntesis para formar compuestos glucoconjugados, y
- opcionalmente, se aíslan los componentes glucoconjugados obtenidos.
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