ES2761693T3 - Composiciones y métodos para mejorar las respuestas inmunitarias a Eimeria - Google Patents

Abstract

Una vacuna, que comprende una primera secuencia de polinucleótidos, que codifica un polipéptido TRAP o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el primer polinucleótido codifica un polipéptido TRAP, que se selecciona de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, y un fragmento inmunogénico de la SEQ ID NO:3.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para mejorar las respuestas inmunitarias a Eimeria

INTRODUCCIÓN

La coccidiosis, una enfermedad infecciosa de las aves de corral, porcinos y bovinos causadapor el parásito protozoario apicomplejo Eimeria, presenta problemas en todo el mundo. La coccidiosis se encuentra entre las diez principales enfermedades infecciosas de las aves de corral en términos de su impacto económico en la industria avícola. Otros miembros de la familia de apicomplejos también causan enfermedades, incluyendo Plasmodium, Cryptosporidium y Toxoplasma, que son los agentes causantes del paludismo, la criptosporidiosis y la toxoplasmosis, respectivamente. Las vacunas actualmente disponibles contra Eimeria se basan en dosis bajas controladas de parásitos de Eimeria esencialmente completamente virulentos pero sensibles a los fármacos. La vacunación con las vacunas actuales basadas en Eimeria produce una considerable morbilidad de reacción a la vacuna y pérdidas económicas en los rebaños vacunados. Por lo tanto, se necesita una vacuna eficaz de baja virulencia contra Eimeria. Una vacuna eficaz para Eimeria también puede resultar útil como vacuna contra otros parásitos apicomplejos.

Sumario

Las vacunas según la invención y usos de las mismas según la invención, se definen en las reivindicaciones. Se desvela una vacuna que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido TRAP o un fragmento inmunogénico del mismo. El polipéptido TRAP puede comprender la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO:3 o un fragmento inmunogénico de las mismas. Las vacunas opcionalmente incluyen además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido CD154 capaz de unirse a CD40. Los polipéptidos CD154 incluyen menos de 50 aminoácidos y comprenden los aminoácidos 140-149, o un homólogo de los mismos. Las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden estar comprendidas dentro de un vector, tal como un virus, bacteria o liposoma. En un aspecto, se proporciona una vacuna que comprende una Salmonella enteritidis que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido TRAP.

En otro aspecto más, la invención incluye el uso de vacunas de acuerdo con la invención en métodos para mejorar la respuesta inmunitaria de acuerdo con la reivindicación 14.

También se desvelan en el presente documento métodos para reducir la morbilidad asociada a la infección con un parásito apicomplejo en un sujeto mediante la administración de una vacuna de acuerdo con la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa el esquema para realizar mutaciones dirigidas al sitio en Salmonella enteritidis.

La figura 2 representa el esquema de diseño del método de PCR de extensión superpuesta utilizado para generar las inserciones TRAP y TRAP-CD154 en el bucle 9 del polinucleótido lamB.

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de mortalidad a los cinco días después de la infección con Eimeria maxima después de la inoculación con un vector de Salmonella que expresa la secuencia de TRAP de Eimeria indicada.

Descripción detallada

Las tecnologías de ADN recombinante permiten una manipulación relativamente fácil de muchas especies bacterianas y virales. Algunas bacterias y virus son levemente patogénicos o no patogénicos, pero son capaces de generar una respuesta inmunitaria robusta. Estas bacterias y virus producen vacunas atractivas para provocar una respuesta inmunitaria a los antígenos. Las vacunas bacterianas o virales pueden imitar una infección natural y producir una inmunidad mucosa robusta y duradera. Las vacunas a menudo son relativamente baratas de producir y administrar. Además, tales vectores a menudo pueden transportar más de un antígeno y pueden proporcionar protección contra múltiples agentes infecciosos.

En un aspecto, se proporciona una vacuna que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido TRAP o un fragmento inmunogénico del mismo. El polipéptido TRAP puede comprender la SEQ ID NO: 11 o un fragmento inmunogénico de la SEQ ID NO:11. Una vacuna incluye cualquier composición que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria al polipéptido. En otro aspecto, el uso de vectores, tales como vectores bacterianos, para la vacunación y la generación de respuestas inmunitarias contra Eimeria u otros parásitos apicomplejos, tales como Plasmodium (el agente causante del paludismo), Se desvela Toxoplasma y Cryptosporidium. Las cepas de Salmonella son vectores adecuados porque los genes bacterianos pueden mutarse o atenuarse para crear bacterias con poca o ninguna patogenia para el sujeto infectado o inmunizado, al tiempo que se mantiene la inmunogenicidad.

Se ha demostrado que un antígeno de alta masa molecular en estadio asexual de Eimeria maxima (EmTFP250) es un objetivo para los anticuerpos maternos producidos por gallinas reproductoras infectadas con este parásito protozoario (International Journal for Parasitology; 34 (2004) 861-872). El análisis de la secuencia de aminoácidos del antígeno reveló un miembro nuevo de la familia TRAP (proteína anónima relacionada con la trombospondina), que contiene 16 repeticiones de trombospondina e tipo 1 y 31 dominios de unión a calcio similares al factor de crecimiento epidérmico. EmTFP250 o TRAP también contiene dos regiones hidrofílicas complejas bajas ricas en restos de ácido glutámico y de glicina, y un dominio transmembrana/cola citosólica asociada a la motilidad de deslizamiento del parásito que está altamente conservada dentro de las proteínas micronemas de apicomplejos. Se seleccionaron varios epítopos potenciales y se identifican en las SEQ ID NO: 1-3 y 11. Debido a la naturaleza conservada de este antígeno, la expresión de estos epítopos por un vector puede inducir inmunidad protectora contra múltiples parásitos apicomplejos.

Salmonella puede proporcionar un vector útil porque puede sobrevivir en el tracto gastrointestinal del huésped y dar lugar a una respuesta inmunitaria de la mucosa. Las vacunas orales que usan un vector de Salmonella producen una respuesta inmunitaria de la mucosa robusta y son relativamente fáciles de administrar tanto a animales como a seres humanos. Sin embargo, muchas de las cepas actuales de la vacuna de Salmonella no son tan efectivas para generar una fuerte respuesta inmunitaria protectora en comparación con sus homólogas más virulentas. Las cepas virulentas proporcionan una respuesta inmunitaria robusta, pero también pueden causar una morbilidad significativa al sujeto vacunado. Una cepa de Salmonella que podría usarse para una vacunación eficaz mucosa, por ejemplo oral, proporcionaría un vector que podría usarse para vacunar fácilmente a un sujeto contra uno o más agentes patógenos, tales como parásitos apicomplejos.

Se describe una cepa de Salmonella enteritidis útil como vector, y varios vectores recombinantes hechos usando esta cepa. Específicamente, se proporciona una Salmonella enteritidis 13A (SE13A) capaz de expresar un polipéptido TRAP exógeno. Además, se desvela una vacuna y métodos para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la administración de la vacuna que comprende una secuencia de polinucleótidos TRAP que codifica un polipéptido TRAP y una secuencia de polinucleótidos CD154 que codifica un polipéptido CD154 o un homólogo del mismo que es capaz de unirse a CD40. Las vacunas se pueden usar para mejorar una respuesta inmunitaria contra Eimeria u otro parásito apicomplejo, tales como Plasmodium, Toxoplasma o Cryptosporidium, o puede usarse para reducir la morbilidad asociada a una infección causada por un parásito apicomplejo.

Un aislado de tipo salvaje de Salmonella, Salmonella enteritidis 13A (SE13A) (depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 13 de septiembre de 2006, número de depósito PTA-7871), se seleccionó basándose en su capacidad inusual de causar colonización de la mucosa y translocación submucosa en pollos, lo que permite una presentación robusta de antígenos o epítopos asociados en pollos comerciales. Es importante destacar que este aislado de Salmonella de tipo salvaje no causa enfermedad clínicamente detectable o pérdida de rendimiento en pollos comerciales, indicando poco potencial causante de enfermedad de la Salmonella de tipo salvaje en animales vertebrados.

El aislado de SE13A puede atenuarse más inactivando al menos un gen necesario para la replicación sostenida de la bacteria fuera de las condiciones de laboratorio o de fabricación. A continuación se describen cepas atenuadas o variantes de Salmonella que pueden usarse como vectores. SE13A se utilizó para generar cepas atenuadas de Salmonella para desarrollar vacunas y generar respuestas inmunitarias mejoradas. SE13A es invasivo, no patogénico para las aves de corral y no causa una morbilidad mensurable. Estas características dan como resultado una respuesta inmunitaria mejorada en comparación con los vectores bacterianos no invasivos. La atenuación de SE13A por la mutación de genes que limitan la capacidad de propagación de la bacteria puede aumentar la seguridad de la vacuna. Las cepas SE13A con mutaciones en aroA o htrA conservan la capacidad de generar una respuesta inmunitaria, pero tienen una replicación limitada en el huésped. Por consiguiente, la atenuación aumenta la seguridad del vector sin comprometer la inmunogenicidad.

Las mutaciones pueden realizarse en otros varios genes de Salmonella, incluidos, aunque no de forma limitativa, cya, crp, asd, cdt, phoP, phoQ, ompR, proteínas de la membrana externa, dam, htrA u otros genes relacionados con el estrés, aro, pur y gua. Tal como se muestra en los Ejemplos, se encontró que las mutaciones en aroA y htrA atenúan SE13A. Los genes aro son enzimas involucradas en la ruta de la biosíntesis de shikimato o la ruta de aromatasa y los mutantes aro son auxotróficos para los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina. htrA es un gen de respuesta al estrés que codifica una proteasa periplásmica que degrada las proteínas aberrantes. Los mutantes en htrA también se atenúan y muestran una mayor sensibilidad al peróxido de hidrógeno.

Las mutaciones en aroA y htrA descritas en los Ejemplos son mutaciones de deleción, pero las mutaciones se pueden hacer de varias maneras. Adecuadamente, las mutaciones son mutaciones no reversibles que no pueden repararse en una sola etapa. Las mutaciones adecuadas incluyen deleciones, inversiones, inserciones y sustituciones. Un vector puede incluir más de una mutación, por ejemplo, un vector puede contener mutaciones tanto en aroA como en htrA. Los métodos para hacer tales mutaciones son bien conocidos en la técnica.

Los polinucleótidos que codifican los antígenos del polipéptido TRAP y otros antígenos de cualquier número de organismos patogénicos pueden insertarse en el vector (por ejemplo, SE13A) y expresarse en la bacteria. La expresión de estos polinucleótidos por el vector permitirá la generación de polipéptidos antigénicos después de la inmunización del sujeto. Los polinucleótidos pueden insertarse en el cromosoma de la bacteria o estar codificados en plásmidos u otro ADN extracromosómico. Los expertos en la materia apreciarán que existen numerosas metodologías para obtener la expresión de polinucleótidos en vectores tales como Salmonella. Los polinucleótidos pueden estar operativamente conectados a un promotor (por ejemplo, un promotor constitutivo, un promotor inducible, etc.) por métodos conocidos por los expertos en la materia. Adecuadamente, los polinucleótidos que codifican los antígenos TRAP se insertan en un polinucleótido bacteriano que se expresa. Adecuadamente, el polinucleótido bacteriano codifica una proteína transmembrana y el polinucleótido que codifica el antígeno TRAP se inserta en la secuencia del polinucleótido bacteriano para permitir la expresión del antígeno TRAP en la superficie de la bacteria. Por ejemplo, el polinucleótido que codifica TRAP puede insertarse en marco en el polinucleótido bacteriano en una región que codifica una región de bucle externo de una proteína transmembrana de modo que la secuencia de polinucleótido bacteriano permanezca en marco. Véase el Ejemplo 1.

Como alternativa, el primer polinucleótido que codifica el antígeno TRAP puede insertarse en un polinucleótido que codifica un polipéptido secretado. Los expertos en la materia apreciarán que el polinucleótido que codifica el antígeno TRAP podría insertarse en una amplia variedad de polinucleótidos bacterianos para proporcionar expresión y presentación del antígeno TRAP a las células inmunes de un sujeto tratado con la vacuna. En los ejemplos, se insertó un primer polinucleótido que codifica el polipéptido TRAP en el bucle 9 del gen lamB de SE13A. El polinucleótido que codifica el antígeno TRAP puede incluirse en una sola copia o en más de una copia. También se puede generar un vector bacteriano que contiene múltiples copias del antígeno TRAP insertado en el bucle 9 de lamB. Como alternativa, se pueden insertar múltiples copias de un epítopo en el vector bacteriano en más de una ubicación.

Adecuadamente, el primer polinucleótido codifica una porción del polipéptido TRAP o el polipéptido TRAP completo. El polinucleótido puede insertarse en el vector. En los ejemplos, se incorporaron tres polipéptidos (SEQ ID NO:1-3) en SE13A. Adecuadamente, la porción del polipéptido TRAP insertado en el vector es un fragmento inmunogénico. Un fragmento inmunogénico es un péptido o polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria celular o humoral. Adecuadamente, un fragmento inmunogénico de TRA^p puede tener 6 o más aminoácidos consecutivos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos o 20 o más aminoácidos de la secuencia proteica de longitud completa.

Otros epítopos adecuados para su inclusión en una vacuna que tiene TRAP comprendida dentro de un vector incluyen, aunque sin limitación, polinucleótidos que codifican otros polipéptidos relacionados con Eimeria. Un experto en la materia apreciará que se pueden usar diversas secuencias en combinación con cualquier otro antígeno y también se puede usar junto con polipéptidos que codifican péptidos inmunoestimulantes, tales como un polipéptido de CD154.

Como se describe con mayor detalle a continuación, una vacuna que incluye un vector puede incluir un polipéptido CD154 que es capaz de unirse a CD40 en el sujeto y estimular al sujeto para que responda al vector y su antígeno asociado. La participación de las células dendríticas (CD) es esencial para el inicio de una respuesta inmunitaria potente, ya que poseen la capacidad única de activar los linfocitos T intactos, causando expansión y diferenciación de linfocitos T en células efectoras. Es función de las CD, que es una célula presentadora de antígeno (CPA) que se encuentra en prácticamente todos los tejidos del cuerpo, capturar los antígenos, transportarlos al tejido linfoide asociado y, a continuación, presentarlos a los linfocitos T intactos. Tras la activación por las CD, los linfocitos T se expanden, se diferencian en células efectoras, salen de los órganos inmunitarios secundarios y entran en los tejidos periféricos. Los linfocitos T citotóxicos activados (LTC) pueden destruir las células infectadas por virus, las células tumorales o incluso las CPA infectadas con parásitos intracelulares (por ejemplo, Salmonella) y se ha demostrado que son cruciales en la protección contra la infección viral. CD40 es un miembro de la familia de moléculas del receptor de TNF y se expresa en diversos tipos de células, incluidas las células presentadoras de antígeno (CPA) profesionales, tales como CD y linfocitos B. La interacción de CD40 con su ligando CD154 es extremadamente importante y estimulante para la inmunidad humoral y celular. La estimulación de las CD a través de CD40, expresado en la superficie de las CD, puede ser simulada por los anticuerpos anti-CD40. En el cuerpo, sin embargo, esto se produce por la interacción con el ligando natural para CD40 (es decir, CD154) expresado en la superficie de los linfocitos T activados. Resulta interesante que se han identificado las regiones de unión a CD40 de CD154. La región de unión a CD40 de CD154 puede expresarse en la superficie de un vector, tal como un vector de Salmonella y da como resultado una respuesta inmunitaria mejorada contra una secuencia peptídica presentada conjuntamente.

Tal como se ha descrito anteriormente, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos CD154 pueden insertarse en el cromosoma del vector o mantenerse extracromosómicamente. Un polipéptido CD154 puede ser una porción de la proteína de longitud completa CD154 o la proteína CD154 completa. Adecuadamente, el polipéptido CD154 es capaz de unirse a CD40. Un experto en la materia apreciará que estos polinucleótidos pueden insertarse en marco en diversos polinucleótidos y expresarse en diferentes partes del vector o pueden secretarse. El polinucleótido que codifica un polipéptido CD154 capaz de potenciar la respuesta inmunitaria a TRAP también puede codificar el antígeno TRAP. El polinucleótido que codifica un polipéptido CD154 puede estar unido al polinucleótido que codifica el antígeno TRAP, de forma tal que en el vector, el polipéptido CD154 y el antígeno TRAP están presentes en el mismo polipéptido. En los ejemplos, un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD154 que es capaz de unirse a CD40 también codifica el antígeno TRAP. Véanse las SEQ ID NO: 1,2, 3 y 11 en el listado de secuencias adjunto.

En los ejemplos, los polinucleótidos (SEQ ID NO: 13-15) que codifican el antígeno TRAP y el polinucleótido que codifica el polipéptido CD154 están ambos insertados en el bucle 9 del gen lamB. Los expertos en la materia apreciarán que también se pueden usar polinucleótidos bacterianos que codifican otras proteínas transmembrana y otros bucles del gen lamB.

Como se ha mencionado anteriormente, puede incluirse en la vacuna un polinucleótido CD154 que codifica un polipéptido CD154 que es capaz de mejorar la respuesta inmunitaria al antígeno. Adecuadamente, el polipéptido CD154 tiene menos de 50 aminoácidos de longitud, más adecuadamente menos de 40, menos de 30 o menos de 20 aminoácidos de longitud. El polipéptido puede tener entre 10 y 15 aminoácidos, entre 10 y 20 aminoácidos o entre 10 y 25 aminoácidos de longitud. La secuencia CD154 y la región de unión a CD40 no están altamente conservadas entre las diversas especies. Las secuencias CD154 de pollo y de ser humano se proporcionan en la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO:4, respectivamente.

Se han determinado las regiones de unión a CD40 de CD154 para varias especies, incluyendo seres humanos, pollo, patos, ratón y ganado vacuno, y se muestran en la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:7, la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:9, respectivamente. Aunque existe una variabilidad en las secuencias en la región de unión de CD40 entre especies, el polipéptido CD154 humano fue capaz de mejorar la respuesta inmunitaria en pollos. Por tanto, se puede practicar la invención utilizando polipéptidos CD154 específicos de especie o un polipéptido CD154 heterólogo como se define en las reivindicaciones.

En los ejemplos, se generaron varias bacterias recombinantes SE13A. En cada una de las cepas SE13A que contienen los polinucleótidos TRAP y CD154, el polipéptido TRAP y el polipéptido CD154 se codificaron en el mismo polinucleótido y estaban en marco entre sí y con el polinucleótido de Salmonella lamB en el que se insertaron. En realizaciones alternativas, el polipéptido CD154 y el polipéptido TRAP pueden estar codificados por polinucleótidos distintos. SE13A aroA htrA TRAP contiene una deleción en aroA y htrA y codifica el epítopo TRAP (s Eq ID NO: 1-3) y, opcionalmente, el polipéptido CD154 (SEQ ID NO:4) insertado en el bucle 9 de lamB.

También se proporcionan composiciones que comprenden una cepa atenuada de Salmonella y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es cualquier vehículo adecuado para la administración in vivo. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en la composición incluyen, aunque sin limitación, agua, soluciones tamponadas, soluciones de glucosa o fluidos de cultivo bacteriano. Los componentes adicionales de las composiciones pueden incluir adecuadamente, por ejemplo, excipientes, tales como estabilizantes, conservantes, diluyentes, emulsionantes y lubricantes. Los ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen estabilizantes, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas, tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas, tales como suero bovino o leche desgrasada y tampones (por ejemplo, tampón fosfato). Especialmente, cuando tales estabilizantes se añaden a las composiciones, la composición es adecuada para liofilización o desecación por pulverización.

También se proporcionan métodos para mejorar las respuestas inmunitarias en un sujeto mediante la administración de una vacuna que contiene un polipéptido TRAP y un polipéptido CD154 capaz de unirse a CD40 y activar CD40. La vacuna que comprende el polinucleótido que codifica un polipéptido CD154 capaz de unirse a CD40 se administra a un sujeto en una cantidad efectiva para mejorar la respuesta inmunitaria del sujeto a la vacuna. Adecuadamente, la vacuna contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido que incluye los aminoácidos 140­ 149 del polipéptido CD154 humano (SEQ ID NO: 4) o un homólogo del mismo. Por tanto, un homólogo del aminoácido 140-149 derivado de una especie puede usarse para estimular una respuesta inmunitaria en una especie distinta.

Varios polipéptidos adecuados se identifican en el presente documento. Adecuadamente, el polinucleótido codifica un polipéptido CD154 de la misma especie que el sujeto. Adecuadamente, en sujetos humanos se usa un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:5, en pollos se usa un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 6, en patos se usa un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:7, en ratones se usa un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 8 y en vacas se usa un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:9. En los ejemplos, el polipéptido CD154 humano (SEQ ID NO: 5) se usó en una vacuna de pollo y se demostró que mejora la respuesta inmunitaria a un antígeno extraño. Por lo tanto, otras combinaciones heterólogas de polipéptidos CD154 y sujetos pueden ser útiles en los métodos descritos en el presente documento. El polipéptido CD154 puede usarse para mejorar la respuesta inmunitaria en el sujeto a cualquier antígeno extraño o polipéptido antigénico presente en la vacuna además del polipéptido TRAP. Un experto en la materia apreciará que el polipéptido CD154 podría usarse para mejorar la respuesta inmunitaria a más de un polipéptido antigénico presente en una vacuna.

El polipéptido del CD 154 estimula una respuesta inmunitaria al menos en parte al unirse a su receptor, CD40. Los ejemplos usaron un polipéptido homólogo al polipéptido CD154 que se expresa en las células inmunes del sujeto y que es capaz de unirse al receptor CD40 en los macrófagos y otras células presentadoras de antígeno. La unión de este complejo ligando-receptor estimula a los macrófagos (y las células de linaje de macrófagos, tales como las células dendríticas) para mejorar la fagocitosis y la presentación de antígenos, al tiempo que aumenta las secreciones de citocinas que se sabe que activan otras células inmunes locales (tales como los linfocitos B). Como tales, las moléculas asociadas al péptido CD154 son, preferentemente, las dianas de la respuesta inmunitaria y la producción expandida de anticuerpos.

Los vectores potenciales para su uso en los métodos incluyen, aunque sin limitación, Salmonella (Salmonella enteritidis), Shigella, Escherichia (E. coli), Yersinia, Bordetella, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus, Vibrio (Vibrio cholerae), Listeria, adenovirus, poxvirus, herpesvirus, alfavirus y virus adenoasociados.

Además, se desvelan métodos para mejorar la respuesta inmunitaria contra un parásito apicomplejo y métodos para reducir la morbilidad asociada a la infección posterior con un parásito apicomplejo. Brevemente, los métodos comprenden administrar a un sujeto una vacuna que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido TRAP en una cantidad efectiva. Los polipéptidos TRAP pueden incluir las SEQ ID NO: 1-3 y 11. La inserción de los polipéptidos TRAP en el vector se puede lograr de varias maneras conocidas por los expertos en la materia, incluidos, aunque sin limitación, el sistema de mutación dirigido al sitio sin cicatrices descrito en BMC Biotechnol. 2007 sept, 17: 7(1): 59, Mutagénesis sin cicatrices y dirigida al sitio en el cromosoma de Salmonella enteritidis. El vector también se puede diseñar para expresar los polipéptidos TRAP junto con otros polipéptidos capaces de mejorar la respuesta inmunitaria como se ha tratado anteriormente, tal como en la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO:10. En particular, un polipéptido de CD154 capaz de unirse a CD40 puede ser expresado por el vector para mejorar la respuesta inmunitaria del sujeto al polipéptido TRAP. Opcionalmente, el vector es una bacteria, ta como Salmonella enteritidis.

La dosis útil de la vacuna a administrar variará según la edad, el peso y la especie del sujeto, el modo y la vía de administración y el tipo de patógeno contra el cual se busca una respuesta inmunitaria. La composición puede administrarse en cualquier dosis suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. Para vacunas bacterianas, se prevé que las dosis que varían 103 to 1010 bacteria, de 104 a 109 bacterias o de 105 a 107 bacterias son adecuadas. La composición puede administrarse solo una vez o puede administrarse dos o más veces para aumentar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la composición puede administrarse dos o más veces separadas por una semana, dos semanas o por tres o más semanas. Las bacterias son adecuadamente viables antes de la administración, pero, en algunas realizaciones, las bacterias pueden ser eliminadas antes de la administración. En algunas realizaciones, las bacterias pueden replicarse en el sujeto, mientras que en otras realizaciones, las bacterias pueden no ser capaces de replicarse en el sujeto.

Para la administración a animales o seres humanos, las composiciones pueden administrarse por diversos medios, que incluyen, aunque no de forma limitativa, por vía intranasal, mucosal, por pulverización, intradérmica, parenteral, subcutánea, oral, por aerosol o por vía intramuscular. La administración por medio de gotas oculares o la adición de agua potable o alimentos también son adecuadas. Para pollos, las composiciones pueden administrarse in ovo. Algunas realizaciones de esta divulgación proporcionan métodos para mejorar las respuestas inmunitarias en un sujeto. Los sujetos adecuados pueden incluir, aunque sin limitación, vertebrados, adecuadamente mamíferos, adecuadamente un ser humano, y pájaros, adecuadamente aves de corral, tales como pollos. También se pueden usar otros modelos animales de infección. Mejorar una respuesta inmunitaria incluye, aunque no de forma limitativa, inducir un efecto terapéutico o profiláctico que es mediado por el sistema inmune del sujeto. Específicamente, mejorar una respuesta inmunitaria puede incluir, aunque no de forma limitativa, la producción mejorada de anticuerpos, un cambio de clase mejorado de cadenas pesadas de anticuerpos, la maduración de las células presentadoras de antígeno, la estimulación de linfocitos T auxiliares, la estimulación de linfocitos T citolíticos o la inducción linfocitos T y B de memoria.

Se prevé que varios epítopos o antígenos de los mismos o diferentes patógenos se puedan administrar en combinación en una sola vacuna para generar una respuesta inmunitaria mejorada contra múltiples antígenos. Las vacunas recombinantes pueden codificar antígenos de múltiples microorganismos patogénicos, virus o antígenos asociados a tumores. La administración de una vacuna capaz de expresar múltiples antígenos tiene la ventaja de inducir inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo tiempo. Por ejemplo, las bacterias vivas atenuadas, tales como Salmonella enteritidis 13A, proporcionan un vector adecuado para provocar una respuesta inmunitaria contra múltiples antígenos.

Las vacunas bacterianas pueden construirse usando polinucleótidos exógenos que codifican antígenos que pueden insertarse en el genoma bacteriano en cualquier sitio no esencial o alternativamente pueden transportarse en un plásmido usando métodos bien conocidos en la técnica. Un sitio adecuado para la inserción de polinucleótidos es dentro de porciones externas de proteínas transmembrana o acoplado a secuencias que se dirigen al polinucleótido exógeno para vías secretoras. Un ejemplo de una proteína transmembrana adecuada para la inserción de polinucleótidos es el gen lamB. En los ejemplos, los polinucleótidos TRAP y CD154 se insertaron en el bucle 9 de la secuencia de lamB.

Los polinucleótidos exógenos incluyen, aunque sin limitación, polinucleótidos que codifican antígenos seleccionados de microorganismos o virus patogénicos e incluyen polinucleótidos que se expresan de tal manera que se genera una respuesta inmunitaria efectiva. Dichos polinucleótidos pueden derivarse de virus patogénicos, tales como la gripe (por ejemplo, M2e, hemaglutinina o neuraminidasa), virus herpes (por ejemplo, los genes que codifican las proteínas estructurales de los virus del herpes), retrovirus (por ejemplo, la proteína de la cubierta gp160), adenovirus, paramixovirus, coronavirus y similares. Los polinucleótidos exógenos también se pueden obtener de bacterias patogénicas, por ejemplo, genes que codifican proteínas bacterianas, tales como toxinas y proteínas de la membrana externa. Además, los polinucleótidos exógenos de parásitos, tales como otros parásitos apicomplejos, son candidatos atractivos para el uso de una vacuna vectorial.

Los polinucleótidos que codifican polipéptidos implicados en la activación del sistema inmunológico también pueden incluirse en un vector, tal como una vacuna viva atenuada de Salmonella. Los polinucleótidos pueden codificar moléculas del sistema inmunitario conocidas por sus efectos estimulantes, tales como una interleucina, el factor de necrosis tumoral, un interferón u otro polinucleótido implicado en la regulación inmunitaria. La vacuna también puede incluir polinucleótidos que codifican péptidos que se sabe que estimulan una respuesta inmunitaria, tal como el polipéptido CD154 descrito en el presente documento.

Los siguientes ejemplos pretenden ser solo ilustrativos y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención o de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Construcción de insertos TRAP y TRAP/CD154.

Cepas y condiciones de cultivo

Todos los plásmidos se mantuvieron primero en células E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) a menos que se describa lo contrario. Se usó Salmonella enteritidis 13A para la introducción de mutaciones. La cepa 13A de Salmonella enteritidis era un aislado de campo disponible de USDA/APHIS/NVSL y se depositó en la ATCC como número de depósito PTA-7871. Las bacterias portadoras del plásmido pKD46 se cultivaron a 30 °C. Se cultivaron otras bacterias a 37 °C. El curado del plásmido se realizó a 37 °C.

Los medios de Luria-Bertani (LB) se usaron para el crecimiento de rutina de las células y se usó medio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la expresión fenotípica después de la electroporación. Cuando sea adecuado, se añadieron los siguientes antibióticos al medio: ampicilina (Amp) a 100 jg/ml, kanamicina (Km) a 50 |jg/ml y cloranfenicol (Cm) a 25 jg/ml.

Plásmidos

Los plásmidos pKD46, pKD13 y pBC-I-Scel se han descrito previamente (Datsenko y Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645 y Kang et al., J Bacteriol 2004, 186:4921-4930). El plásmido pKD46 codifica enzimas recombinasas Red que median la recombinación homóloga del ADN lineal entrante con el ADN cromosómico. Este plásmido también contiene el gen de resistencia a la ampicilina y es sensible a la temperatura, por lo que requiere 30 °C para el mantenimiento en la célula. El plásmido pKD13 sirvió como molde para la amplificación del gen de resistencia a Km (Kmr) utilizado en la PCR solapante. El plásmido pBC-I-Scel, que se mantiene en la célula a 37 °C, produce la enzima I-Scel, que fragmenta la siguiente secuencia de reconocimiento rara de 18 pares de bases: 5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3' (SEQ ID NO:16). El plásmido pBC-I-SceI también contiene el gen de resistencia al cloranfenicol (Cmr).

PCR

Todos los cebadores utilizados para la PCR se enumeran en la Tabla 1. Por lo general, la PCR se realizó utilizando aproximadamente 0,1 jg de plásmido genómico purificado o ADN generado por PCR (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), 1x tampón de polimerasa clonado en Pfu, 5U de Pfu polimerasa (Stratagene La Jolla, CA, EE.UU.), dNTP 1 mM (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) y 1,2 jM de cada cebador en un volumen total de 50 jl. El termociclador del motor de ADN (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) Se utilizó con las siguientes condiciones de amplificación: 94 °C durante 2 minutos; 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 58 °C durante 60 segundos, 72 °C durante 90 segundos por 1 kb; y 72 °C durante 10 minutos para la extensión final. Cada producto de PCR se purificó en gel (Qiagen, Valencia, CA, Ee . UU.) y eluyeron en 25 j l de tampón EB para la preparación de moldes utilizados en la PCR de extensión solapante o en 50 j l de tampón EB, precipitaron en etanol y se suspendieron en 5 j l de ^ddH2O para la electroporación en S. enteritidis.

Tabla 1. Secuencias del cebador

continuación

En la Tabla 1, los nucleótidos en cursiva son complementarios a ambos lados del sitio de inserción del bucle 9 del gen lamB, que corresponde al nucleótido 1257 usando S. typhimurium como genoma de referencia anotado. Los nucleótidos en negrita representan el sitio de reconocimiento para I-SceI en el cebador de Km-f.

Electroporación

La transformación de pKD46 en S. enteritidis fue el primer paso llevado a cabo para que las enzimas recombinasas Red pudieran usarse para participar en la recombinación de mutaciones posteriores. El plásmido pKD46 se cosechó de E. coli BW25113 (Datsenko y Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645) utilizando un kit de preparación de plásmidos (Qiagen Valencia, CA, EE.UU.). A continuación, se usaron 0,5 pl de ADN de pKD46 para la transformación en S. enteritidis 13A que se había preparado para la electroporación. (Datsenko y Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645). Brevemente, Las células se inocularon en 10-15 ml de caldo 2X YT y se cultivaron a 37 °C durante la noche. Luego, se volvieron a inocular 100 pl de cultivo durante la noche en 10 ml de caldo 2X YT recién preparado a 37 °C durante 3-4 horas. Las células a transformar con el plásmido pKD46 se calentaron a 50 °C durante 25 minutos para ayudar a inactivar la restricción del huésped. Las células se lavaron cinco veces en agua ddH2O y se resuspendieron en 60 pl de glicerol al 10 %. A continuación, se aplicaron a las células pulsos de 2400-2450 kV durante 1-6 ms, se incubaron en SOC durante 2-3 horas a 30 °C y se sembraron en medio LB con antibióticos apropiados. Los transformantes de S. enteritidis con pKD46 se mantuvieron a 30 °C. Cuando estos transformantes se prepararon para reacciones de electroporación adicionales, todas las etapas fueron iguales, excepto que se añadió arabinosa al 15 % para inducir enzimas recombinasas Red una hora antes del lavado, y las células no se sometieron a la etapa de calentamiento a 50 °C.

Construcción de Bucle 9 arriba-I-SceI/Kmr-Bucle 9 abajo

La introducción del sitio de reconocimiento de la enzima I-Scel junto con el gen de Kmr en el bucle 9 del gen lamB se realizó combinando el sistema de recombinasa Red (Datsenko y Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645) y PCR solapante (Horton et al., BioTechniques 1990, 8:528-535). El sitio de inserción corresponde al nucleótido 1257 del gen lamB usando Salmonella typhimurium LT2 (S. typhimurium) como genoma de referencia anotado. En primer lugar, las regiones aguas arriba y aguas abajo que flanquean inmediatamente el sitio de inserción del bucle 9 (bucle 9 hacia arriba y bucle 9 abajo, respectivamente) se amplificaron por separado. Los cebadores utilizados fueron lamarriba-f y lam-arriba-r para el bucle 9 arriba y lam-abajo-f y lam-abajo-r para el bucle 9 abajo. A continuación, el gen de Kmr del plásmido pKD13 se amplificó usando los cebadores Km-f y Km-r. En este caso, el sitio para la enzima I-SceI se añadió sintéticamente al extremo 5' del cebador Km-f, después se precedió por una región complementaria al cebador bucle-arriba-r. De manera análoga, una región complementaria al cebador bucle-abajo-f se añadió al extremo 5' del cebador Km-r. Las regiones complementarias permiten que los 3 productos de PCR hibriden cuando se usan como moldes en una reacción de PCR. La figura 2a representa este esquema de diseño. Los fragmentos de PCR que consisten en la secuencia del bucle 9 arriba-I-SceI/Kmr-bucle 9 abajo (PCR-A) se electroporaron en células de S. enteritidis, que albergaban pKD46 y se indujeron con arabinosa, y, a continuación, se sembraron en placas con LB con Km. Para verificar la orientación correcta de la secuencia de la mutación, los inventores realizaron PCR de las colonias con los pares de cebadores Kan4F/lam3f y Kan4R/lam3r, donde Kan4F y Kan4R son cebadores específicos del gen Kmr y lam3f y lam3r son cebadores localizados fuera de la región del bucle 9 de lamB. Estos fragmentos de PCR se purificaron en gel (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) y se utilizaron para la secuenciación del ADN.

Construcción de Bucle 9 arriba-TRAP-CD154-Bucle 9 abajo

El fragmento de LA PCR solapante final, PCR-B, contenía el antígeno TRAP añadido en combinación con secuencias CD154 flanqueadas por las regiones arriba y abajo del bucle 9 (Figura 2 b). Las secuencias de combinación consistieron en el polinucleótido TRAP que codifica la SEQ ID NO: 1-3 y CD154 junto con separadores, tales como restos de Serina (Ser).

Para acortar la cantidad de etapas para la construcción del siguiente fragmento, la secuencia TRAP-CD154 se añadió sintéticamente al extremo 5' del cebador lam-abajo-f y fue precedida por la región complementaria al cebador bucle-arriba-r. El producto de PCR utilizado anteriormente para el bucle 9 hacia arriba podría usarse junto con el producto de PCR recién construido en el que se incorporaron los TRAP-CD154 en el extremo 5' del bucle 9 hacia abajo para realizar la reacción de PCR final. Sin embargo, para otras secuencias de inserción, se necesitaba una etapa de PCR adicional, debido a la mayor longitud de las secuencias de inserción, para amplificar el bucle 9 hacia arriba con nucleótidos añadidos específicos para secuencias de inserción conectadas al cebador de bucle-arriba-r. La secuencia de codificación para Gly (GGT) y Serina (TCC), así como todos los demás aminoácidos, se eligieron basándose en datos recopilados de los codones utilizados con más frecuencia en las proteínas de E. coli y Salmonella typhimurium. Véase la Tabla 1 para obtener más detalles sobre el diseño del cebador.

Mutación de inserción en el sitio I-Scel/Kmr

La primera etapa de mutación consistió en diseñar un fragmento de PCR, PCR-A, que serviría como el portador del casete del sitio I-SceI/Kmr para su inserción en el sitio lamB. La PCR-A consistió en el sitio de reconocimiento de la enzima I-SceI adyacente al gen Kmr con aproximadamente 200-300 pb de ADN flanqueante en cada extremo homólogo a las regiones aguas arriba y aguas abajo del sitio de inserción del bucle 9 de lamB (bucle 9 hacia arriba y bucle 9 hacia abajo, respectivamente). El fragmento se introdujo en células de S. enteritidis que expresaban enzimas recombinasas Red y se seleccionaron las colonias Kmr. Tras la selección de unas pocas colonias mediante PCR de las colonias, se secuenciaron los clones positivos para detectar la secuencia del sitio I-SceI/Kmr insertada deseada y se seleccionó el mutante identificado y se designó como SE164.

Sustitución genómica de I-SceI/Kmr con TRAP-CD154

La segunda etapa de mutación requirió construir un fragmento de PCR, denominado PCR-B y mostrado en la Figura 2B, que consiste en la secuencia de inserción final, los TRAP-CD154, flanqueados por fragmentos homólogos de lamB. Los amplicones de PCR-B no tienen marcador de selección y deben ser contraseleccionados después de la sustitución para la mutación anterior sitio I-SceI/Kmr en SE164. El plásmido pBC-I-SceI codifica el gen Cmr y la enzima I-SceI, que cortará el genoma en el sitio I-SceI de SE164. Por tanto, se realizó la electroporación de pBC-I-SceI en SE164 junto con PCR-B. Después de la recombinación de PCR-B para reemplazar PCR-A, los clones positivos se eligieron en función de la capacidad de crecer en Cm pero no en Km. Después de la secuenciación del ADN de los mutantes para confirmar la recombinación exitosa de PCR-B, las cepas se denominaron Secuencia 1, Secuencia 2 y Secuencia 3. Se usaron diez clones aleatorios para cada una de las inserciones de TRAP-CD154 para PCR con lam 3f y lam 3r y luego se digirieron usando sitios únicos de enzimas de restricción para cada secuencia de inserción y el 100 % de los clones analizados mediante digestión fueron positivos para la secuencia de mutación deseada. Los resultados de la secuenciación demostraron que la inserción de TRAP-CD154 fue exactamente en la región del bucle 9 sin la adición de nucleótidos extraños en cada caso. Los insertos de las vacunas TRAP-CD 154 son los siguientes: TRAP-CD154 (SEQ ID NO:33); TRAP-US-CD154 (SEQ ID NO:34); TRAP-DS-CD154 (SEQ ID NO:35).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna, que comprende una primera secuencia de polinucleótidos, que codifica un polipéptido TRAP o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el primer polinucleótido codifica un polipéptido TRAP, que se selecciona de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, y un fragmento inmunogénico de la S^eQ ID NO:3.

2. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende además una segunda secuencia de polinucleótidos, que codifica un polipéptido CD 154 capaz de unirse a CD40, teniendo el polipéptido CD154 menos de 50 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 140-149 de la SEQ ID NO:4, de la S^eQ ID NO:5, de la SEQ ID NO:6, de la ^s E^q ID NO:7, de la SEQ ID NO: 8 o de la SEQ ID NO: 9.

3. La vacuna de la reivindicación 2, en donde la vacuna comprende más de una copia de la primera secuencia de polinucleótidos, más de una copia de la segunda secuencia de polinucleótidos, o más de una copia de la primera secuencia de polinucleótidos y más de una copia de la segunda secuencia de polinucleótidos.

4. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en la que la primera secuencia de polinucleótidos está unida en marco a la segunda secuencia de polinucleótidos.

5. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el primer polinucleótido está comprendido dentro de un vector.

6. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el primer polinucleótido está comprendido dentro de una bacteria, comprendiendo la bacteria el polipéptido TRAP en su superficie.

7. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el primer polinucleótido está comprendido dentro de una bacteria y la bacteria se selecciona del grupo que consiste en especies de Salmonella, especies de Bacillus, especies de Escherichia y especies de Lactobacillus.

8. La vacuna de la reivindicación 7, en la que la bacteria es Salmonella enteritidis, seleccionada de cepas depositadas como ATCC PTA-7871, ATCC PTA-7872 y ATCC PTA-7873.

9. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la primera secuencia de polinucleótidos está insertada en una secuencia de polinucleótidos, que codifica una porción externa de una proteína transmembrana.

10. Uso de una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un medicamento para mejorar la respuesta inmunitaria contra un parásito de Eimeria en un sujeto, comprendiendo la mejora de la respuesta inmunitaria administrar al sujeto la vacuna en una cantidad eficaz para mejorar la respuesta inmunitaria del sujeto al parásito de Eimeria.

11. El uso de la reivindicación 10, en donde la respuesta inmunitaria mejorada comprende una respuesta de anticuerpo mejorada o una respuesta de linfocitos T mejorada.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en donde la vacuna no es capaz de replicarse.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde el parásito de Eimeria es Eimeria maxima. 14. Una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un método para mejorar la respuesta inmunitaria contra un parásito de Eimeria en un ave de corral, comprendiendo el método administrar a las aves de corral la vacuna en una cantidad efectiva para mejorar la respuesta inmunitaria de las aves de corral al parásito de Eimeria.