ES2762193T3 - Agonistas de proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene dominio de homología Src-2 y métodos de tratamiento usando la misma - Google Patents

Agonistas de proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene dominio de homología Src-2 y métodos de tratamiento usando la misma Download PDF

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Abstract

Un compuesto que está representado por la fórmula I**Fórmula** en donde R1 y R3 son independientemente hidrógeno; y R2 es**Fórmula** ; o en donde R1 es independientemente hidrógeno; R3 es metilo; y R2 es**Fórmula** o**Fórmula** ; o en donde R2 y R3 son independientemente hidrógeno; y R1 es**Fórmula**

Description

DESCRIPCIÓN
Agonistas de proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene dominio de homología Src-2 y métodos de tratamiento usando la misma
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos compuestos que tienen actividad agonista de proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene homología Src-2 (SHP-1).
Antecedentes de la invención
SHP-1, una proteína tirosina fosfatasa con dos dominios de homología Src 2 (SH2), es un regulador de varias moléculas de señalización intracelulares, tal como el transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3), KIT, CD22, CD5, CD72, SHPS-1, TIMP (metaloproteinasas), CDK2, p27, SRC, ZAP70, IL-10, NF-kB, Lck, 3BP2, Lyn y ciclina D1.
STAT3 es un factor de transcripción que regula el crecimiento y la supervivencia celulares al modular la expresión de genes diana. Actúa como un oncogén que está constitutivamente activo en muchos cánceres incluyendo de hígado, pulmón, cabeza y cuello, próstata y mama, así como mieloma y leucemia. Un regulador clave de la actividad de STAT3 es SHP-1. Desde una perspectiva mecanicista, SHP-1 muestra actividad proteína fosfatasa que reduce el nivel de fosfo-STAT3 (P-STAT3) y posteriormente bloquea la dimerización de P-SAT3. Por tanto, la expresión de genes diana, tales como ciclina D y survivina transcritos por STAT3, se reduce significativamente. Además, estudios de proteína SHP-1 y ARNm de SHP-1 mostraron que el nivel de expresión de SHP-1 era bajo en la mayoría de las células cancerosas; y el aumento genético en SHP-1 en células cancerosas produjo la supresión del crecimiento celular, lo que sugiere que el gen SHP-1 actúa como un supresor tumoral. Desde el punto de vista de descubrimiento de fármacos, el desarrollo de una molécula pequeña que pueda reducir P-STAT3 y aumentar el nivel de SHP-1 es una dirección prometedora para terapia de cáncer. SHP-1 también desempeña un papel importante en la remodelación ósea, un proceso de osteoclastos que forman hueso y osteoblastos que reabsorben hueso. La pérdida de función de SHP-1 produce osteoclastos y con el tiempo lleva a osteoporosis. Por tanto, el aumento de la actividad SHP-1 podría ser una dirección para el paciente de osteoporosis. Además, el aumento de SHP-1 es un beneficio para los macrófagos de pacientes de esclerosis múltiple.
Kuen-Feng et al., European Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 46, 2845, divulga que derivados de Sorafenib inducen apoptosis mediante la inhibición de SAT3 independiente de Raf.
Wei-Tien et al., Journal of Hepatology, 2011, 55, 1041 divulga que el transductor de señales y activador de la transcripción 3 es una diana principal independiente de quinasa de Sorafenib en carcinoma hepatocelular.
El documento WO 2005/102997 A1 divulga maleimidas 3,4-disustituidas para uso como agentes de daño vascular.
El documento US 2006/189638 A1 divulga compuestos de 4-piperidin-1 -il-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina.
Breve compendio de la invención
Los problemas del estado de técnica descritos anteriormente se resuelven según el objeto de las reivindicaciones independientes. Las formas de realización preferidas resultan de las subreivindicaciones.
La presente invención se basa en el inesperado hallazgo de que compuestos recientemente diseñados actúan como agonistas de SHP-1 y tienen la capacidad de reducir P-STAT3, y son útiles para tratar ciertas enfermedades, tal como cáncer. Específicamente, los compuestos de la invención no bloquean la actividad de quinasas, tal como Raf-1 y VEGFR2.
En particular, en un aspecto, la invención proporciona un compuesto que está representado por la fórmula I
Figure imgf000002_0001
en donde R1 y R3 son independientemente hidrógeno; y
Figure imgf000003_0001
en donde R1 es independientemente hidrógeno; R3 es metilo;
Figure imgf000003_0002
en donde R2 y R3 son independientemente hidrógeno; y R1 es
Figure imgf000003_0003
También se describe en el presente documento un compuesto de fórmula II, que incluye un compuesto de fórmula II(a), un compuesto de fórmula II(b), o un compuesto de fórmula II(c),
Figure imgf000003_0004
en donde R4, R5 y R6 son independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido, -(C)mNHC(X)NH(C)nRa-, -(C)pNHC(X)Rb-, -(C)qNHS(O)2Rc-, -(C)r(X)NHR<r o -(C)s NH(C)tRe ;
en donde Ra , Rb, Rc , Rd y Re son independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido;
X = O o S; y
m, n, p, q, r, s, t = 0, 1 o 2.
En el presente documento se describe además un compuesto de fórmula III
Figure imgf000003_0005
en donde R7 es hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido, -(C)mNHC(X)NH(C)nRa-, -(C)pNHC(X)Rb-, -(C)qNHS(O)2Rc-, -(C)r(X)NHR<r o -(C)s NH(C)tRe ;
en donde Ra , Rb, Rc , Rd y Re son independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido;
X = O o S; y
m, n, p, q, r, s, t = 0, 1 o 2.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los compuestos inventivos para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada por proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene homología Src-2 disminuida en donde la enfermedad es cáncer (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello), y osteoporosis. También se proporciona un método para aumentar los niveles de expresión o actividad biológica de SHP-1 en una célula in vitro, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento.
Las varias formas de realización de la presente invención se describen en detalle posteriormente. Otras características de la presente invención se presentarán claramente mediante las siguientes descripciones detalladas y dibujos sobre las varias formas de realización y reivindicaciones.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
En los dibujos:
La figura 1 muestra la estructura química de sorafenib y el compuesto SC-1 (no según la invención).
La figura 2 muestra el procedimiento sintético general para las fórmulas I, II y III.
La figura 3 muestra la actividad de Raf-1 en células tratadas con sorafenib y compuesto 1, respectivamente. Las células Huh-7 se expusieron a sorafenib o compuesto 1 a 10 pM durante 24 horas y los lisados celulares se analizaron para actividad raf-1. Columnas, media; barras, DE (n = 3). *P < 0,05.
La figura 4 muestra los resultados del análisis por ELISA para los efectos inhibidores de los compuestos 1-25 frente a sorafenib, cada uno a 10 pM, en el P-STAT estimulado por IL-6 en células PLC5 después de 24 h de tratamiento. Columnas, media; barras, DE (N = 3).
La figura 5 muestra los resultados de análisis por inmunotransferencia para el efecto de los compuestos 1 y 12, cada uno a 5 pM y 10 pM en la fosforilación de P-STAT3, STAT3, ciclina D y survivina en células PLC5 en medio que contiene SBF después de 24 h de tratamiento.
La figura 6 muestra (A) los resultados del análisis por ELISA para muerte celular inducida por el compuesto 1 y 12, a 5 y 10 pM, después de 24 h de tratamiento en células PLC5; y (B) muestra los resultados de análisis por citometría de flujo de muerte celular inducida por el compuesto 1 y 12, a 5 y 10 pM, después de 24 h de tratamiento en células PLC5.
La figura 7 muestra (A) los efectos de sorafenib y SC-1 en fosfo-VEGFR2 en células HUVEC, en donde las células se expusieron a sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h; (B) los efectos de sorafenib y SC-1 sobre la actividad de Raf-1, en donde las células se expusieron a sorafenib o SC-1 10 pM durante 24 h. Puntos, media; barras, DE (n = 6).
La figura 8 muestra (A) los efectos de aumento de la dosis de sorafenib y SC-1 sobre la viabilidad celular en cuatro líneas celulares de HCC, en donde las células se expusieron a sorafenib o SC-1 a las dosis indicadas durante 72 h y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT; y los efectos de aumento de la dosis de sorafenib y SC-1 sobre apoptosis en cuatro líneas celulares de HCC en donde las células se expusieron a sorafenib o SC-1 a las dosis indicadas durante 24 h, y los lisados celulares se analizaron por citometría de flujo (B), o ELISA de muerte celular (C). Puntos, media; barras, De (n = 6).
La figura 9 muestra (A) los efectos de sorafenib o SC-1 en proteínas relacionadas con STAT3, en donde las células se trataron con sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h; (B) los efectos de aumento de la dosis de sorafenib o SC-1 en fosfo-STAT3 en células PLC5, en donde las células se trataron con los fármacos a las concentraciones indicadas durante 24 h; (C) los efectos de sorafenib y SC-1 sobre la actividad de STAT3 (izquierda, ELISA de fosfo-STAT3; derecha, ensayo de indicador luciferasa de STAT3), en donde las células se trataron con sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h y se midió el ELISA de fosfo-STAT3 o actividad luciferasa; (D) los efectos protectores de STAT3 sobre apoptosis inducida por sorafenib en células PLC5, en donde las células (de tipo salvaje o con expresión ectópica de STAT3) se expusieron a sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h, y las células apoptóticas se analizaron por citometría de flujo. Columnas, media; barras, DE (n = 3). *P < 0,05.
La figura 10 muestra que la inhibición de SHP-1 revierte los efectos de sorafenib y SC-1 sobre fosfo-STAT3 y apoptosis. A, izquierda, vanadato, un inhibidor de fosfatasa no específico. Derecha, inhibidor específico de SHP-1. Columnas, media; barras, DE (n = 3). *P < 0,05. B, izquierda, silenciar SHP-1 por ARNip reduce los efectos de sorafenib o SC-1 en p-STAT3 en células de HCC. Se transfectaron células PLC5 con ARNip control o ARNip de SHP-1 durante 24 h y después se trataron con sorafenib o SC-1 durante otras 24 h. Medio, la actividad de SHP-1 en células PLC5. Columnas, media; barras, DE (n = 3). *P < 0,05. Derecha, efectos de sorafenib o SC-1 sobre interacciones de proteínas entre SHP-1 y STAT3. Las células PLC5 se trataron con sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 horas. C, la atenuación de SHP-2 no afecta los efectos de sorafenib o SC-1 sobre p-STAT3 y apoptosis. D, la atenuación de PTP-1B no afecta los efectos de sorafenib sobre p-STAT3 y apoptosis. Se transfectaron células PLC5 con ARNip control o ARNip de SHP-1 o ARNip de PTP-1B durante 24 h y después se trataron con sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h.
La figura 11 muestra que SC-1 disminuye p-STAT3 e induce apoptosis en células HUVEC. A, efectos de sorafenib o SC-1 sobre p-STAT3 (izquierda) y apoptosis (derecha) en células HUVEC. Las células se expusieron a sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h. Las células apoptóticas se ensayaron por citometría de flujo (sub-G1). B, efectos de SC-1 sobre sensibilización de TRAIL en Hc C. Las células PLC5 se trataron con SC-1 (10 pM) y/o TRAIL (100 ng/ml) durante 24 h. C, el silenciamiento de Raf-1 no afecta los efectos de los fármacos sobre p-STAT3. Las células PLC5 se transfectaron con ARNip control o ARNip de Raf-1 durante 24 h después se trataron con sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h. D, efecto de sorafenib y SC-1 sobre la actividad de JAK2. Las células PLC5 se expusieron a sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h. Puntos, media; barras, DE (n = 6). E, efectos de sorafenib y s C-1 sobre SOCS-1 y SOCS-3. Las células Sk-Hep1 se pretrataron con IL-6 durante 24 h después se trataron con sorafenib o SC-1 a las dosis indicadas durante otras 24 h en presencia de IL-6. F, efectos de STAT-C sobre apoptosis inducidos por SC-1 en células PLC5. Las células (de tipo salvaje o con expresión ectópica de STAT3-C) se expusieron a sorafenib o SC-1 a 10 pM durante 24 h. G, efectos de sorafenib y SC-1 sobre SHP-1. Columnas, media; barras, DE (n = 3). *P < 0,05.
La figura 12 muestra el efecto in vivo de sorafenib y SC-1 sobre ratones desnudos con xenoinjerto de Huh-7. A, sorafenib muestra efecto antitumoral en tumores Huh-7. Izquierda, puntos, media (n = 6); barras, EE. *, P < 0,05; **, P > 0,01. Derecha superior, análisis por inmunotransferencia de p-STAT3 y STAT3 en tumores Huh-7. Derecha inferior, la actividad de SHP-1 en tumores Huh-7. B, SC-1 muestra un efecto antitumoral significativo en tumores Huh-7. Izquierda, puntos, media (n = 6); barras, EE. Derecha superior, análisis por inmunotransferencia de p-STAT3 y STAT3 en tumores Huh-7. Derecha inferior, la actividad de SHP-1 en tumores Huh-7.
La figura 13 muestra los efectos antiproliferación de SC-1 y SC-43 en varias líneas celulares cancerosas, incluyendo las líneas de cáncer de mama (A) MDAMB231, (B) MDAMB468 y (C) MCF-7, y líneas celulares cancerosas de leucemia (D) HL-60, (E) KG-1, y (F) ML-1.
La figura 14 muestra que derivados de sorafenib inducen apoptosis significativa de una manera dependiente de la dosis, donde (A), (B), (C), (D) y (E) se refieren a SC-43 para células PLC5, HepG2, Hep3B, HA59T y SK-Hep1, respectivamente; y (F), (G), (H), (I) y (J) se refieren a SC-40 para células PLC5, HepG2, Hep3B, HA59T y SK-Hep1, respectivamente. Puntos, media; barras, DE (n = 6).
La figura 15 muestra que SC-43 disminuye la ruta de señalización relacionada con fosfo-STAT3 en células de HCC, incluyendo células PlC5, HepG2, Hep3B, HA59T y SK-Hep1.
La figura 16 muestra que SC-40 disminuye la ruta de señalización relacionada con fosfo-STAT3 en células de HCC, incluyendo células PlC5, HepG2, Hep3B, HA59T y SK-Hep1.
La figura 17 muestra que SC-43 muestra mejor inhibición de la ruta de señalización relacionada con p-STAT3 que sorafenib en células de HCC, (A) PLC5 y (B) Hep 3B.
La figura 18 muestra que tanto SC-43 como SC-40 inducen una fuerte inhibición de la actividad de p-STAT3 (A) y (B) ELISA de p-STAT3 para SC-43 y SC-40, respectivamente, y (C) y (D) ensayo de indicador de St At 3 para s C-43 y SC-40, respectivamente.
La figura 19 muestra que los derivados SC aumentan la actividad fosfatasa de SHP-1 in vitro, (A) SC-43, (B) SC-40 y (C) SC-49.
La figura 20 muestra que los derivados SC aumentan la actividad fosfatasa de SHP-1 in vitro, (A) SC-43, y (B) SC-40.
La figura 21 muestra que (A) el efecto antitumoral de SC-40 en tumores PLC5; (B) análisis por inmunotransferencia de p-STAT3 y STAT3 en tumores PLC5; (C) el peso corporal de los animales; y (D) el peso del tumor y (E) la actividad de SHP-1 en tumores PLC5. Puntos, media (n = 6); barras, EE.
La figura 22 muestra que SC-43 muestra efecto antitumoral in vitro e in vivo, (A) la citotoxicidad de SC-43 en células de HCC, (B) el efecto antitumoral de SC-43 en ratones que portan HCC, (C) la actividad de SHP-1 inducida por SC-43 y (D) análisis por inmunotransferencia de p-STAT3 y STAT3 en células de HCC tratadas con SC-43 (10 pM y 20 pM).
La figura 23 muestra (A) la imagen obtenida por el sistema de imagenología in vivo no invasiva de los ratones tratados, (B) muestra el peso corporal de los ratones, y (C) muestra la curva de supervivencia entre ratones control y tratados.
Descripción detallada de la invención
Como se usan en el presente documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una muestra” incluye una pluralidad de tales muestras y equivalentes de la misma que conocen los expertos en la materia.
Sorafenib (BAY43-9006, Nexavar) se ha usado clínicamente para carcinoma renal y carcinoma hepatocelular (HCC). Es conocido como un inhibidor de quinasas múltiple que reprime la actividad de Raf-1 y otras tirosinas quinasas tal como VEGFR2, VEGFR3, Flt-3, PDGFR y FGFR-1.
Se estudió la relación entre la estructura de sorafenib y su bioactividad y se modificó la estructura de sorafenib. Según esto, se desarrolló un número de derivados de sorafenib sin la capacidad para bloquear la actividad quinasa e, inesperadamente se encontró que estos compuestos muestran buenos efectos terapéuticos en ciertas enfermedades, tal como cáncer, al menos comparables con los de sorafenib. Los compuestos recientemente diseñados de la invención actúan como agonistas de SHP-1 y son útiles para tratar una enfermedad o afección caracterizada por niveles de expresión o actividad biológica disminuidos de SHP-1, tal como cáncer (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, esclerosis y osteoporosis). Los compuestos de la invención también proporcionan una nueva opción terapéutica para pacientes con resistencia a inhibidores de quinasas. Estos tumores generan mutación en quinasa después del tratamiento y constitutivamente en la forma activa fosforilada, incluso en presencia de un inhibidor de quinasas. Por tanto, el aumento de un supresor tumoral, especialmente SHP-1, para reprimir la forma con mutación activa de las quinasas es una dirección prometedora para pacientes quimiorresistentes. En otras palabras, los compuestos de la invención, actuando a través de un nuevo mecanismo de direccionamiento (independiente de quinasa), proporcionan opciones terapéuticas alternativas que pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer con resistencia a agentes terapéuticos médicos convencionales.
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que está representado por la fórmula I
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en donde R1 y R3 son independientemente hidrógeno; y
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en donde R1 es independientemente hidrógeno; R3 es metilo;
Figure imgf000006_0003
en donde R2 y R3 son independientemente hidrógeno; y R1 es
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Los compuestos inventivos son SC-49, SC-43, SC-59 y SC-60. Los compuestos adicionales enumerados en las tablas y mostrados en la presente solicitud son para fines comparativos solo.
Tabla 1
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También se describe en el presente documento un compuesto de fórmula II, que incluye un compuesto de fórmula II(a), un compuesto de fórmula II(b), o un compuesto de fórmula II(c),
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en donde R4, R5 y R6 son independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido, -(C)mNHC(X)NH(C)nRa-, -(C)pNHC(X)Rb-, -(C)qNHS(O)2Rc-, -(C)r(X)NHR<r o -(C)s NH(C)tRe ;
en donde Ra , Rb, Rc , Rd y Re son independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido;
X = O o S; y
m, n, p, q, r, s, t = 0, 1 o 2.
En una forma de realización, el compuesto de fórmula II incluye esos en los que R4, R5 y R6 son independientemente hidrógeno, alquilo inferior opcionalmente sustituido, -(C)mNHC(X)NH(C)nRa-, -(C)pNHC(X)Rb-, -(C)qNHS(O)2Rc-, o -(C)s NH(C)tRe.
En otra forma de realización, el compuesto de fórmula II incluye esos en los que Ra , Rb, Rc, Rd y Re son independientemente fenilo o naftilo, opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos seleccionados del grupo que consiste en halo, alquilo inferior opcionalmente sustituido (tal como alquilo inferior sustituido con halo, por ejemplo trifluorometilo), alcoxilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, tal como alcoxilo inferior sustituido con halo, por ejemplo, trifluorometilo) y ariloxi opcionalmente sustituido (por ejemplo fenoxi sustituido con ciano).
En ciertos ejemplos, el compuesto de fórmula II es uno de los compuestos SC-31, SC-32, SC-33, SC-34 y SC-35, como se enumeran en la tabla 2.
Tabla 2
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En el presente documento se describe además un compuesto de fórmula III
Figure imgf000009_0002
en donde R7 es hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido, -(C)mNHC(X)NH(C)nRa-, -(C)pNHC(X)Rb-, -(C)qNHS(O)2Rc-, -(C)r(X)NHRd- o -(C)s NH(C)tRe ;
en donde Ra , Rb, Rc , Rd y Re son independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alcoxilo opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroaralquilo opcionalmente sustituido;
X = O o S; y
m, n, p, q, r, s, t = 0, 1 o 2.
En una forma de realización, el compuesto de fórmula III incluye esos en los que R7 es independientemente hidrógeno, alquilo inferior opcionalmente sustituido, -(C)mNHC(X)NH(C)nRa-, -(C)pNHC(X)Rb-, -(C)qNHS(O)2Rc-, o -(C)s NH(C)tRe . En otra forma de realización, el compuesto de fórmula III incluye esos en los que Ra , Rb, Rc , Rd y Re son independientemente fenilo o naftilo, opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos seleccionados del grupo que consiste en halo, alquilo inferior opcionalmente sustituido (tal como alquilo inferior sustituido con halo, por ejemplo trifluorometilo), alcoxilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, tal como alcoxilo inferior sustituido con halo, por ejemplo, trifluorometilo) y ariloxi opcionalmente sustituido (por ejemplo fenoxi sustituido con ciano).
En ciertos ejemplos, el compuesto de fórmula III es uno de los compuestos SC-36, SC-37, y SC-38, como se enumeran en la tabla 3.
Tabla 3
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El término “halo” o “halógeno” solo o en combinación significa todos los halógenos, tal como flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br) o yodo (I).
El término “hidroxilo” se refiere al grupo -OH.
Los términos “tio” y “mercapto” se usan de forma intercambiable y se refieren al grupo -SH.
El término “alquilo” solo o en combinación se refiere a un radical derivado de alcano que contiene, a menos que se indique otra cosa, 1-20 átomos de carbono (C1-C20), preferiblemente 1-15 átomos de carbono (C1-C15), preferiblemente 1-10 átomos de carbono (C1-C10). Es un alquilo de cadena lineal, alquilo ramificado o cicloalquilo, preferiblemente grupos alquilo lineales o ramificados que contienen de 1-15, más preferiblemente de 1 a 8, incluso más preferiblemente 1-6, aún más preferiblemente 1-4 y lo más preferiblemente 1-2 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, y butilo, t-butilo. El término “alquilo inferior” se usa en el presente documento para describir los grupos alquilo de cadena lineal como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, los grupos cicloalquilo son sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos de 3-8, más preferiblemente 3-6 miembros de anillo por anillo, tal como ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo y adamantilo. Alquilo también incluye un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado que contiene o está interrumpido por una porción cicloalquilo. El grupo alquilo de cadena lineal o ramificado está unido en cualquier punto disponible para producir un compuesto estable. Los ejemplos de esto incluyen, pero no están limitados a, 4-(isopropil)-ciclohexileno o 2-metil-ciclopropilpentilo. Uno sustituido con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxilo, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsilfinilo, aciloxi, ariloxi, heteroariloxi, amino opcionalmente mono o di-sustituido con grupo alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfinilo opcionalmente N-mono o N,N-di-sustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino o heteroarilcarbonilamino.
El término “alquenilo” solo o en combinación significa un hidrocarburo lineal, ramificado o cíclico que contiene 2-20, preferiblemente 2-17, más preferiblemente 2-10, incluso más preferiblemente 2-8, lo más preferiblemente 2-4 átomos de carbono y al menos uno, preferiblemente 1-3, más preferiblemente 1-2, lo más preferiblemente un doble enlace carbono a carbono. En el caso de un grupo cicloalquenilo, la conjugación de más de un doble enlace de carbono a carbono no es tal que confiera aromaticidad al anillo. Los dobles enlaces de carbono a carbono pueden o bien estar contenidos en una porción cicloalquilo, con la excepción de ciclopropilo, o en una porción de cadena lineal o ramificada. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, ciclohexenilo, y ciclohexenilalquilo. Un alquenilo sustituido es los grupos de alquenilo de cadena lineal, alquenilo ramificado o cicloalquenilo definidos previamente, sustituidos independientemente con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxilo, ariloxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, sustituido independientemente con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfonilo opcionalmente N-mono o N,N-di-sustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, ariloxicarbonilamino o heteroariloxicarbonilo unido en cualquier punto disponible para producir un compuesto estable.
El término “alquinilo” solo o en combinación significa un hidrocarburo lineal, ramificado o cíclico que contiene 2-20, preferiblemente 2-17, más preferiblemente 2-10, incluso más preferiblemente 2-8, lo más preferiblemente 2-4 átomos de carbono y al menos uno, preferiblemente 1-3, más preferiblemente 1-2, lo más preferiblemente un triple enlace carbono a carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo, propinilo, isopropinilo, y butinilo. Un alquinilo sustituido es los grupos de alquinilo de cadena lineal, alquinilo ramificado definidos previamente, sustituidos independientemente con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxilo, ariloxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, sustituido independientemente con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfonilo opcionalmente N-mono o N,N-disustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, ariloxicarbonilamino o heteroariloxicarbonilo unido en cualquier punto disponible para producir un compuesto estable.
El término “alquil alquenilo” se refiere a un grupo -R-CR'=CR” R'” , en donde R es alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, R', R'' y R''' puede ser independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, o heteroarilo sustituido como se definen posteriormente.
El término “alquil alquinilo” se refiere a un grupo -R-CCR', donde R es un alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, R' es hidrógeno, halógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, o heteroarilo sustituido como se define posteriormente.
El término “alcoxi” indica el grupo -OR, donde R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, heteroalquilo, heteroarilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, o ciloheteroalquilo sustituido como se define.
El término “alquiltio” o “tioalcoxi” indica el grupo -SR, S(O)n=1-2-R, donde R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo, o aralquilo sustituido como se define en el presente documento.
El término “acilo” indica grupos -C(O)R, donde R es hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, y arilo sustituido como se define en el presente documento.
El término “ariloxi” indica grupos -OAr, donde Ar es un grupo arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido como se define en el presente documento.
El término “amido” indica el grupo -C(O)NRR', donde R y R' pueden ser independientemente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo y arilo sustituido como se define en el presente documento.
El término “carboxilo” indica el grupo -C(O)OR, donde R es hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo y arilo sustituido como se define en el presente documento
El término “arilo” solo o en combinación significa fenilo o naftilo opcionalmente carbocíclico fusionado con un cicloalquilo de preferiblemente 5-7, más preferiblemente 5-6, miembros de anillo y/o opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxilo, ariloxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, independientemente sustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfonilo opcionalmente N-mono o N,N-di-sustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, ariloxicarbonilo, o heteroariloxicarbonilo.
El término “heterociclo” se refiere a un grupo carbocíclico saturado, insaturado o aromático que tiene un único anillo (por ejemplo, morfolino, piridilo o furilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, naftpiridilo, quinoxarilo, quinolinilo, indolizinilo o benzo[b]tienilo) y que tiene al menos un heteroátomo, tal como N, O o S, en el anillo, que puede opcionalmente estar sin sustituir o sustituido con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltiol, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol, y sulfamino.
El término “heteroarilo” solo o en combinación significa una estructura de anillo aromático monocíclico que contiene 5 o 6 átomos de anillo, o un grupo aromático bicíclico que tiene de 8 a 10 átomos, que contiene uno o más, preferiblemente 1-4, más preferiblemente 1-3, incluso más preferiblemente 1-2, heteroátomos independientemente seleccionados del grupo de O, S y N, y opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxilo, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsilfinilo, aciloxi, ariloxi, heteroariloxi, amino opcionalmente mono o disustiuido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfinilo opcionalmente N-mono o N,N-di-sustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, o heteroariloxicarbonilo. También se pretende que heteroarilo incluya S o N oxidados, tal como sulfinilo, sulfonilo y N-óxido de un nitrógeno de anillo terciario. Un átomo de carbono o nitrógeno es el punto de unión de la estructura del anillo heteroarilo de modo que se retiene un anillo aromático estable. Los ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo, piridazinilo, pirazinilo, quinazolinilo, purinilo, indonilo, quinolinilo, pirimidinilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, tienilo, isoxazolilo, oxatiadiazolilo, isotiazolilo, tetrazolilo, imidazolilo, triazinilo, furanilo, benzofurilo, e indolilo. Un heteroarilo sustituido contiene un sustituyente unido a un carbono o nitrógeno disponible para producir un compuesto estable.
El término “heterociclilo” solo o en combinación significa un grupo cicloalquilo no aromático que tiene de 5 a 10 átomos en el que de 1 a 3 átomos de carbono en el anillo están sustituidos por heteroátomos de O, S, N y están opcionalmente fusionados a benzo o fusionados a heteroarilo de 5-6 miembros de anillo y/o están opcionalmente sustituidos como en el caso de cicloalquilo. También se pretende que heterociclilo incluya S o N oxidados, tal como sulfinilo, sulfonilo y N-óxido de un nitrógeno de anillo terciario. El punto de unión es en un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos de grupo heterociclilo son tetrahidrofuranilo, dihidropiridinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, piperazinilo, dihidrobenzofurilo, y dihidroindolilo. Un heterociclilo sustituido contiene un nitrógeno sustituyente unido a un carbono o nitrógeno disponible para producir un compuesto estable.
El término “heteroarilo sustituido” se refiere a un heterociclo opcionalmente mono o polisustituido con uno o más grupos funcionales, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “aralquilo” se refiere al grupo -R-Ar donde Ar es un grupo arilo y R es un alquilo inferior o grupo alquilo inferior sustituido. Los grupos arilo pueden opcionalmente estar sin sustituir o sustituidos con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “heteroalquilo” se refiere a un grupo -R-Het donde Het es un grupo heterociclo y R es un grupo alquilo inferior. Los grupos heteroalquilo puede estar opcionalmente sin sustituir o sustituidos con halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “heteroarilalquilo” se refiere al grupo -R-Het AR donde HetAr es un grupo heteroarilo y R es un grupo alquilo inferior. Los grupos heteroarilalquilo pueden estar opcionalmente sin sustituir o sustituidos con halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “cicloalquilo” se refiere a un grupo alquilo cíclico o policíclico divalente que contiene de 3 a 15 átomos de carbono.
El término “cicloalquilo sustituido” se refiere a un grupo cicloalquilo que comprende uno o más sustituyentes con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “cicloheteroalquilo” se refiere a un cicloalquilo en donde uno o más de los átomos de carbono del anillo está sustituido con un heteroátomo (por ejemplo, N, O, S o P).
El término “cicloheteroalquilo sustituido” se refiere a un grupo cicloheteroalquilo como se ha definido en el presente documento que contiene uno o más sustituyentes tal como halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “alquil cicloalquilo” indica el grupo R'-cicloalquilo donde cicloalquilo es un grupo cicloalquilo y R es un alquilo inferior o alquilo inferior sustituido. Los grupos cicloalquilo pueden opcionalmente estar sin sustituir o sustituidos con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
El término “alquil cicloheteroalquilo” indica el grupo -R'-cicloheteroalquilo donde R es un alquilo inferior o alquilo inferior sustituido. Los grupos cicloheteroalquilo pueden opcionalmente estar sin sustituir o sustituidos con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, tiol y sulfamido.
Los compuestos de la invención se pueden preparar por procedimientos químicos convencionales tal como los descritos en avances de química orgánica escritos por Francis Carey y Richard Sundberg y publicación de revisiones “Account of Chemical research”.
En particular, el procedimiento mostrado en el esquema general como a continuación ejemplifica la síntesis de ciertos compuestos de la invención y de compuestos comparativos.
Fórmula I
Figure imgf000013_0001
Formula II
Figure imgf000013_0002
Formula III
Figure imgf000013_0003
Procedimiento sintético general para formula I, II, III; a, K2CO3, DMF; b, piridina, THF; c, Et3N, dioxano
Los compuestos de la invención así sintetizados se pueden purificar adicionalmente por cromatografía o cristalización o cualquier otro método apropiado conocido en la técnica.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los compuestos inventivos y un soporte farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica de la invención se puede usar para aumentar los niveles de expresión o actividad biológica de SHP-1 en una célula, o tratar una enfermedad o afección caracterizada por niveles de expresión o actividad biológica disminuidos de SHP-1. En el presente documento se describe el uso de cualquiera de los compuestos anteriormente descritos para aumentar los niveles de expresión o actividad biológica de SHP-1 en una célula, o tratar una enfermedad o afección caracterizada por niveles de expresión o actividad biológica disminuidos de SHP-1 como se describe en el presente documento y para la fabricación de un medicamento para tratar la misma.
La presente invención también proporciona un método para aumentar la expresión de la proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene homología Src-2 (SHP-1) en una célula in vitro, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto o una composición farmacéutica como se ha descrito en el presente documento. El término “tratar” o “tratamiento” incluye profilaxis del trastorno o afección específicos, o alivio de los síntomas asociados con un trastorno o afección específicos y/o prevenir o eliminar dichos síntomas.
Los compuestos de la presente invención se pueden usar para el tratamiento de enfermedades o afecciones caracterizadas por niveles de expresión o actividad biológica disminuidos de SHP-1. Un compuesto de la invención se puede administrar a un paciente humano por si mismo o en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con soportes o excipientes adecuados a las dosis para tratar o aliviar varias afecciones caracterizadas por disminución de los niveles de expresión o actividad biológica de SHP-1. Los niveles de expresión o actividad biológica aumentados o disminuidos de un factor (por ejemplo, SHP-1) se pueden detectar fácilmente mediante el producto génico del factor tal como una proteína o un ARN, en una muestra de un sujeto (por ejemplo, de sangre o tejido de biopsia) y evaluar in vitro los niveles de ARN, estructura y/o actividad de las proteínas expresadas usando métodos de detección conocidos en técnica, tal como eznimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunotransferencia y transferencia tipo Northern. Los ejemplos particulares de estas enfermedades o afecciones caracterizadas por la disminución de los niveles de expresión o actividad biológica de SHP-1 incluyen, pero no están limitados a, cáncer (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer renal y osteoporosis.
Un “sujeto” es en particular un mamífero, tal como un ser humano, pero también puede ser un animal de compañía (por ejemplo, perros y gatos), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, y caballos) o animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, y cobayas) en necesidad del tratamiento como se describe en el presente documento.
Una “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de un principio activo requerida para conferir efectos terapéuticos en un sujeto, ya sea solo o en combinación con u o más otros agentes activos. Las cantidades eficaces varían, como reconocen los expertos en la materia, dependiendo de la vía de administración, el uso de excipiente, y co-uso de otros principios activos.
Las vías de administración adecuadas pueden, por ejemplo, incluir administración oral, rectal, transmucosa, o intestinal; administración parenteral incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares, y opcionalmente en un depósito o formulación de liberación sostenida.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una manera conocida en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas para uso según la presente invención se pueden formular, por tanto, de manera convencional usando uno o más soportes fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Como se usa en el presente documento, “aceptable” significa que el soporte debe ser compatible con el principio activo de la composición (y preferiblemente, capaz de estabilizar el principio activo) y no perjudicial para el sujeto que se va a tratar. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
En particular, para inyección, los compuestos de la invención se pueden formular en, por ejemplo, tampones fisiológicamente compatibles, tal como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración oral, los compuestos de la invención se pueden formular combinando los compuestos activos con soportes farmacéuticamente aceptables conocidos en esta técnica, tal como lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, fécula de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP), para permitir que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grajeas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, papillas y suspensiones. Para la administración por inhalación, los compuestos de la invención se pueden formular en forma de una presentación de espray en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado.
Ejemplo 1: Síntesis química
1.1. Materiales
Los espectros de resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN) se registraron en instrumentos Brucker DPX300 (400 MHz). Los desplazamientos químicos se describen como valores □□ (ppm) campo abajo a partir de cloroformo deuterado interno de la solución orgánica indicada. Las multiplicidades de pico se expresan como sigue: s, singulete; d, doblete; t, triplete; q, cuartete; dd, doblete de doblete; ddd doblete de doblete de dobletes; dt, doblete de triplete; brs singulete amplio; m, multiplete. Las constantes de acoplamiento (valores J) se dan en hercios (Hz), El progreso de la reacción se determinó por análisis de cromatografía en capa fina (TLC) en placa de gel de sílice 60 F254 (Merck). La purificación cromatográfica se llevó a cabo en columnas de gel de sílice 60 (0,063-0,200 mm o 0,040­ 0,063 mm, Merck), gel de sílice básica. Se usaron reactivos y solventes comerciales sin purificación adicional. Las abreviaturas se usan como sigue: CDCh, cloroformo deuterado; DMSO-d6, dimetilsulfóxido-d6; EtOAc, acetato de etilo; DMF, N,N-dimetilformamida; MeOH, metanol; THF, tetrahidrofurano; EtOH, etanol; DMSO, dimetilsulfóxido; NMP, N-metilpirrolidona. Los espectros de masa de alta resolución se registraron en un espectrómetro de masas FINNIGAN MAT 95S.
1.2. Métodos
El diseño estructural de los compuestos de la invención se describe a continuación. Primero, para abordar la relación entre represión de la quinasa Raf y disminución de P-STAT3 por sorafenib, se usó un enfoque químico para reducir la interacción por puentes de hidrógeno entre el grupo amida de sorafenib con Raf sustituyendo el grupo amido por un grupo fenilciano (compuesto 1, Fig. 1). También se modificó SC-1 en base a grupos funcionales que contienen diferente tamaño, donante de hidrógeno, aceptor de hidrógeno, capacidad hidrofóbica e hidrofílica para generar una serie de compuestos SC-48, SC-49, SC-54, SC-55, SC-56, SC-58, SC-43, SC-44, SC-45, SC-50, SC-51, SC-52, SC-59, SC-60 y SC-40. Además, se sustituyó el grupo funcional urea en el esqueleto de sorafenib con varios compuestos que dan amida y sulfonamida 2-11. Además, se sustituyó el anillo de piridina con quinolina y se usó como una plataforma para llevar a cabo la modificación estructural, generando una serie de compuestos 12-19 y 20-25. Estos derivados de SC-1 se sintetizaron según un procedimiento general descrito en la fórmula II en la figura 2. Además, se extendió la longitud del compuesto añadiendo un anillo fenilo para explorar la relación entre estructura y actividad con grupo funcional diferente 36-38.
1.2.1 Procedimientos de síntesis para el compuesto 1 (fórmula I)
A una solución de trifosgeno en THF (0,30 g, 1,0 mmol) de 50 ml, se añadieron 4-cloro-3-(trifluorometil)anilina (0,21 g, 1.1 mmol) y 2 equivalentes de trietilamina. La mezcla se calentó a 50°C durante 30 min. Después de que la temperatura volviera a temperatura ambiente, se añadió 4-(4-aminofenoxi)benzonitrilo en la solución de THF de 10 ml a la mezcla y se calentó a 50°C durante otros 30 min. La mezcla se evaporó, se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. El extracto se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, y se concentró a presión reducida para dar 1 (0,34 g, 80%).
1.2.1.1.
1-(4-Cloro-3-(trifluormetil)fenil)-3-4-(4-cianofenoxi)fenil)urea (1) (no según la invención)
Figure imgf000015_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 58,00 (s, 1H), 7,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,65-7,54 (m, 3H), 7,26 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,08 (s, 1H), 7,05-6,97 (m, 1H), 6,94-6,86 (m, 3H), 6,84 (t, J = 2,0 Hz, 1H), 6,81 (dd, J = 8,4 Hz, 2,0 Hz, 1H); HRMS calculada para C20H12N2O3F3S [M-H]- 417,0521. Determinada: 417,0518.
1.2.1.4,
4-(3-(3-(trifluorometoxi)bencilamino)fenoxi)benzonitrilo (45) no según la invención)
Figure imgf000016_0001
1H RMN (400 MHz, MeOD): 57,66 (d, J= 9,2 Hz, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,41-7,34 (m, 2H), 7,22 (q, J = 8,0 Hz, 1H), 7,18 (dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,10-7,02 (m, 3H), 6,71 (dd, J= 8,8 Hz, 2,4 Hz, 2H); HRMS calculada para C20H13N3O2 [M-H]-: 346,0992. Determinada: 346,0999.
1.2.1.8.
N-(3-(4-cionofenoxi)fenil)benzamida (51) (no según la invención)
Figure imgf000017_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 87,49 (d, J= 9,2 Hz, 2H), 7,17 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 7,10 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,00-6,92 (m, 3H1), 6,88 (d, J= 9,2 Hz, 2H), 6,84 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 6,17-6,05 (m, 2H), 4,10 (m, 4H); HRMS calculada para C23H19N3O3F3 [M+H]+: 442,1379. Determinada: 442,1381.
1.2.1.12.
(R)-1-(4-(4-cianofenoxi)fenil)-3-(1-(naftalen-1-il)etil)urea (56) (no según la invención)
Figure imgf000018_0001
1H RMN (400 MHz, DMSO): 58,77 (s, 2H), 7,80 (d, J= 8,0 Hz, 4H), 7,29 (s, 2H), 7,24 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,13 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,98 (d, J = 8,4 Hz, 4H), 2,02 (s, 6H); HRMS calculada para C29H21N4O3 [M-H]-: 473,1614. Determinada: 473,1619.
1.2.2 Procedimientos generales para los compuestos 2-25
En un matraz redondeado de dos cuellos de 25 ml, se colocaron derivados de anilina (1 mmol) y una cantidad catalítica de piridina en THF anhidro (10 ml) a temperatura ambiente. Se añadieron compuestos de cloruro de acilo o cloruro de sulfonilo a la mezcla y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. El solvente se eliminó al vacío y el residuo crudo se purificó por cromatografía en una columna de gel de sílice usando EtOAc/hexano como eluyente (de 1/10 a 1/2). Este procedimiento dio el producto de acoplamiento esperado como un sólido blanco con rendimiento del 70% al 95%.
1.2.2.1.
N-Metil-4-(4-(fenilsulfonamido)fenoxi)picolinamida (2)
Figure imgf000019_0001
1H RMN (400 MHz, CDCls): 88,37 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,00 (brs, 1H), 7,77-7,43 (m, 2H), 7,57 (s, 1H), 7,17-7,09 (m, 4H), 6,99-6,93 (m, 4H), 3,00 (d, 3H, J = 4,8 Hz); 13C RMN (100 MHz, CDCls): 8 166,5, 165,9, 164,6, 163,9, 152,1, 151,2, 149,7, 135,0, 134,0, 130,0, 129,9, 124,1, 121,7, 116,4, 116,2, 114,5, 109,8, 26,19; HRMS calculada para C19H16FNsO4S (M+H): 401,0846. Determinada: 401,0849.
4-(4-(4-tert-butilfenilsulfonamido)fenoxi)-N-metilpicolinamida (5)
Figure imgf000020_0001
1H RMN (400 MHz, CDCh): 58,35 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,15 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,79 (brs, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,67 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,57 (s, 1H), 7,18 (d, 2H, J = 9,2 Hz), 6,95 (d, 2H, J = 9,2 Hz), 6,90-6,88 (m, 1H), 2,98 (d, 3H, J = 5,2 Hz); 13C RMN (100 MHz, CDCh): 5165,7, 164,5, 152,2, 151,6, 149,8, 141,5, 136,1, 135,8, 135,5, 135,2, 132,7, 132,2 (m), 124,9 (m), 124,1, 123,5, 121,7, 120,8, 120,4,114,5, 110,0, 26,1; HRMS calculada para C20H-i5BrF3N3O4S (M+H): 528,9919. Determinada: 528,9917.
1.2.2.7.
N-metil-4-(4-(2-nitrofenilsulfonamido)fenoxi)picolinamida (8)
Figure imgf000021_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 58,37 (d, 1H, J= 6,0 Hz), 7,98 (brs, 1H), 7,86-7,83 (m, 2H), 7,72-7,68 (m, 2H), 7,55 (s, 1H), 7,24 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,98 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,94-6,92 (m, 1H), 2,98 (d, 3H, J = 4,8 Hz); HRMS calculada para C19H16N4O6S (M+H): 428,0791. Determinada: 428,0796.
1.2.2.8.
4-(4-(3,5-bis(trifluorometil)benzamido)fenoxi)-N-metilpicolinamida (9)
Figure imgf000021_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 59,92 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,33 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,10 (q, 1H, J = 5,2 Hz), 7,90 (s, 1H), 7,71 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,40 (d, 1H, J = 2,8 Hz), 6,99-6,97 (m, 1H), 6,93 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 2,91 (d, 3H, J = 4,8 Hz); 13C RMN (100 MHz, m etano l^): 5167,8, 166,8, 165,1, 153,4, 151,8, 151,6, 138,6, 137,6, 133,6, 133,3, 133,0, 132,6, 129,4 (d), 126,2 (m), 126,0, 124,2, 123,2, 122,4, 115,2, 110,7, 26,4; HRMS calculada para C22H15F6N3O3 (M+H): 483,1018. Determinada: 483,1017.
1.2.2.9.
4-(4-(5-fluoro-2-(trifluorometil)benzamido)fenoxi)-N-metilpicolinamida (10)
Figure imgf000021_0003
1H RMN (400 MHz, CDCh): 58,66 (d, 1H, J = 12,4 Hz), 8,31-8,26 (m, 2H), 7,93 (s, 1H), 7,70-7,65 (m, 3H), 7,56 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 7,24-7,19 (m, 1H), 7,02 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 6,89-6,87 (m, 1H), 2,90 (d, 3H, J = 3,2 Hz); 13C RMN (100 MHz, metanol-d4): 5166,2, 164,5, 162,9, 160,4, 160,0, 159,9, 152,2, 150,4, 149,7, 135,0, 130,6 (m), 129,8 (m), 128,3, 128,1, 127,7, 127,4, 124,5, 122,5, 122,4, 122,3, 121,8, 121,5, 117,2, 117,0, 114,1, 110,1, 26,1; HRMS calculada para C21H-i5F4N3O3 (M+H): 433,1050. Determinada: 433,0152.
1.2.2.10.
N-Metil-4-(4-(4-(trifluorometil)benzamido)fenoxi)picolinamida (11)
Figure imgf000022_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 59,45 (s, 1H), 8,31 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,15 (s, 1H), 8,08 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,71-7,65 (m, 3H), 7,50 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,47 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 6,96-6,91 (m, 3H), 2,92 (d, 3H, J = 5,2 Hz); 13C RMN, (100 MHz, CDCh): 5 166,4, 164,8, 164,7, 151,8, 149,9,149,8, 138,8, 135,5, 131,4, 131,1, 130,8, 130,7, 130,5, 129,1, 128,1, 125,0, 124,3 (m), 122,6, 122,3, 121,2, 114,4, 109,5, 26,1; HRMS calculada para C21H16F3N3O3 (M+H): 415,1144. Determinada: 415.1146.
1.2.2.11.
2-Nitro-N-(4-(quinolin-4-iloxi)fenil)-4-(trifluorometil)bencenosulfonamida (12)
Figure imgf000022_0002
1H RMN (400 MHz, CDCh): 58,78 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 8,51 (d, 1H, J= 8,8 Hz), 8,19 (s, 1H), 8,12-8,02 (m, 3H), 7,89 (t, 1H, J = 9,6 Hz), 7,62 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,34 (d, 2H, J = 9,6 Hz), 7,15 (d, 2H, J = 9,6 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,59 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 6,55 (d, 1H, J = 6,8 Hz); HRMS calculada para C22H13F3N4O7S (M+H): 534,0457. Determinada: 534,0423.
1.2.2.13
2-Bromo-N-(4-(quinolin-4-iloxi)fenil)-4-(trifluorometil)bencenosulfonamida (14)
Figure imgf000023_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 58,65 (d, 1H, J= 5,2 Hz), 8,25 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 8,18 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 8,07 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 7,98 (s, 1H), 7,73 (t, 1H, J= 7,6 Hz), 7,67 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,54 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,24 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7.05 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,43 (d, 1H, J = 5,2 Hz); 13C RMN (100 MHz, CDCI3): 5 161,3, 152,6, 150,9, 149,7, 141,4, 135,9, 135,6, 135,3, 132,7, 132,4, 132,2 (m), 130,3, 129,1, 126,3, 124,9 (m), 124,4, 123,5, 122,1, 122,0, 121,9, 121,6, 121,3, 120,8, 120,4, 116,3, 104,4; HRMS calculada para C22H-i4BrF3N2O3S (M+H): 521,9861. Determinada: 521,9858.
1.2.2.14
2-Bromo-N-(4-(8-nitroquinolin-4-iloxi)fenil)-4-(trifluorometil)bencenosulfonamida (15)
Figure imgf000023_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 58,76 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 8,49 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,18 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 8,04 (d, 1H, J= 7,6 Hz), 7,99 (s, 1H), 7,68 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 7,60 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,25 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,07 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,53 (d, 1H, J = 5,2 Hz); HRMS calculada para C22H13BrF3N3O5S (M+H): 566,9711. Determinada: 566,9706.
1.2.2.15
N-4-(quinolin-4-iloxi)fenil)-3,5-bis(trifluorometil)benzamida (16)
Figure imgf000023_0003
1H RMN (400 MHz, CDCl3): 510,02 (s, 1H), 8,59 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,37 (s, 2H), 8,34 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 7,99 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 7,92 (s, 1H), 7,80 (d, 2H, J= 9,2 Hz), 7,70 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 6,56 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,14 (d, 2H, J = 9,2 Hz), 6,52 (d, 1H, J = 5,2 Hz); 13C RMN (100 MHz, DMSO-d6): 5162,6, 161,0, 151,5, 150,0, 149,2, 137,0, 136,1, 131,0, 130,7, 130,4, 130,3, 130,0, 128,8, 128,5 (m), 126,4, 125,2 (m), 124,5, 122,5, 121,7, 121,5, 1213, 120,6, 104,3; HRMS calculada para C24H14F6N2O2 (M+H): 476,0959. Determinada: 476,0958.
1.2.2.16
N-4-(8-nitroquinolin-4-iloxi)fenil)-3,5-bis(trifluorometil)benzamida (17)
Figure imgf000024_0001
1H RMN (400 MHz, CDCh): 58,81 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 8,59 (d,1H, J = 8,8 Hz), 8,53-8,47 (m, 2H), 8,06 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,83-7,77 (m, 3H), 7,64 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,37-7,32 (m, 1H), 7,23-7,20 (m, 2H), 6,68 (d, 1H, J = 5,2 Hz); HRMS calculada parar C23H13F4N3O4 (M+H): 471,0842. Determinada: 471,0850.
1.2.2.19
N-(3-metil-4-(8-nitroquinolin-4-iloxi)fenil)-3,5-bis(trifluorometil)benzamida (20)
Figure imgf000025_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 59,86 (s, 1H), 8,45 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 8,38 (s, 2H), 8,31 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,92 (s, 1H), 7,89 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 7,69-7,63 (m, 2H), 7,53 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,33 (s, 1H), 7,28 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,33 (d, 1H, J = 5,2 Hz); HRMS calculada parar C25H15F6N3O4 (M+H): 535,0967 Determinada: 535,0956.
1.2.2.20.
N-(4-(8-aminoquinolin-4-iloxi)-3-metilfenil)-3,5-bis(trifluorometil)benzamida (21)
Figure imgf000025_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 58,49 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 8,27 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,65 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,48-7,45 (m, 2H), 7,37-7,32 (m, 2H), 6,96 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 4,95 (s, 2H), 2,16 (s, 3H); HRMS calculada para C25H17F6N3O2 (M+H): 505,1225. Determinada: 505,1216.
1.2.2.21.
N-(4-(8-acetamidoquinolin-4-iloxi)-3-metilfenil)-3,5-bis(trifluorometil)benzamida (22)
Figure imgf000025_0003
1H RMN (400 MHz, CDCh): 59,77 (s, 1H), 9,36 (s, 1H), 8,65 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 8,46 (s, 2H), 8,44 (d, 1H, J= 5,2 Hz), 7,97 (s, 1H), 7,87 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,72 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,50 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,37 (t, 1H, J= 8,0 Hz), 7,28 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,41 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 2,26 (s, 3H), 2,10 (s, 3H); 13C RMN (100 MHz, CDCh): 5169,2, 163,0, 161,2, 152,0, 148,8, 139,5, 137,2, 136,7, 133,8, 132,6, 132,3, 132,2, 132,0, 131,6, 127,8, 127,1, 126,3, 125,2 (m), 124,2, 121,5, 120,4, 118,8, 118,3, 116,7, 115,7, 113,8, 25,0, 15,4; HRMS calculada para C27H19F6N3O3 (M+H): 547,1331. Determinada: 547,1325.
1.2.2.22.
N-(3-(8-nitroquinolin-4-iloxi)fenil)-3,5-bis(trifluorometil)benzamida (23)
Figure imgf000026_0002
1H RMN (400 MHz, CDCh): 59,77 (s, 1H), 8,74 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 8,54 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 8,48 (s, 1H), 8,39 (s, 2H), 8,04 (s, 1H), 7,87 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,67-7,60 (m, 2H), 7,50-7,43 (m, 2H), 7,37 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 7,00 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 6,65 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 2,30 (s, 3H); 13C RMN (100 MHz, CDCh): 5 169,3, 163,1, 161,7, 154,6, 148,7, 139,6, 136,6, 133,8, 132,7, 132,4, 132,1, 131,7, 130,8, 127,8 (d), 126,9, 126,5, 125,3 (m), 124,2, 121,5, 120,8, 117,7, 117,3, 116,8, 115,7, 113,2, 104,9, 25,0; HRMS calculada para C26H17F6N3O3 (M+H): 533,1174. Determinada: 533,1167.
1.2.2.25
N-(3-(trifluorometil)benceno-sulfonil)-3-(3-amino-4-nitrofenoxi)bencenamina (SC-40)
Figure imgf000026_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 58,06 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,81 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,61 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 7,27 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 6,91- 6,80 (m, 3H), 6,19 (dd, J= 9,6 Hz, 2,4 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,10 (brs, 2H); 13C RMN (100 MHz, CDCh ): 5163,1, 155,5, 146,7, 140,0, 137,6, 132,0, 131,6, 130,9, 130,3, 130,0, 129,9(m), 128,8, 128,0, 124,4, 124,3, 124,2, 124,2, 124,0, 121,6, 117,8, 117,6, 113,6, 107,6, 104,3; LC-MS (ESI): M/Z 452 [M-H]-; HRMS calculada para C19H13N3O5F3S [M-H]- 452,0528. Determinada: 452,0529.
1.2.3 Compuestos 36-38
1.2.3.1
3-(2-fenilH-imidazo[1,2-a]piridin-7-iloxi)-N-(3-(trifluorometoxi)bencil)bencenamina (36)
Figure imgf000027_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 57,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,89 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,71 (s, 1H), 7,40 (t, J-= 7,2 Hz, 2H), 7,35- 7,24 (m, 3H), 7,18 (s, 1H), 7,14 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 7,09 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,60 (dd, J = 7.2 Hz, 2,4 Hz, 1H), 6,46- 6,40 (m, 2H), 6,32 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 4,31 (s, 1H), 4,20 (s, 1H); HRMS calculada para C27H21N3O2F3 [M+H]+: 476,1586. Determinada: 476,1592.
1.2.3.2
N-3-(2-fenilimidazo[1,2-a]piridin-7-iloxi)-3-(trifluorometoxi)bencil)bencenosulfonamida (37)
Figure imgf000027_0002
1H RMN (400 MHz, CDCh): 58,03 (d, J= 6,8 Hz, 2H), 7,92 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,87 (d, J= 6,8 Hz, 2H), 7,76 (d,1= 6,0 Hz, 2H), 7,60 (t, 7,6 Hz, 1H), 7,39 (t, J= 8,0 Hz, 2H), 7,30 (t, J= 6,4 Hz, 1H), 7,21 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 6,96- 6,90 (m, 2H), 6,83 (dd, J= 13,6 Hz, 2,4 Hz, 1H), 6,82 (t, J= 2,0 Hz, 2H), 6,60 (dd, J= 7,2 Hz, 2,4 Hz, 1H); HRMS calculada para C26H19N3O3F3S [M+H]+: 510,1099. Determinada: 510,1100.
1.2.3.3
N-3-(2-fenilimidazo[1,2-a]piridin-7-iloxi)fenil)bencil)bencenosulfonamida (38)
Figure imgf000027_0003
(m, 3H), 7,43 (t, J= 7,6 Hz, 2H), 7,33- 7,26 (m, 2H), 6,92 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 6,84- 6,76 (m, 3H), 6,64 (dd, J= 7,6 Hz, 2,4 Hz, 1H); HRMS calculada para C25H20N3O3S [M+H]+: 442,1225. Determinada: 442,1216.
Ejemplo 2: Bioensayo
2.1 Materiales y métodos
2.1.1. Reactivos y anticuerpos
Sorafenib (Nevaxar®) fue amablemente proporcionado por Bayer Pharmaceuticals (West Haven, CT). Se compraron vanadato de sodio e inhibidor de Sh P-1 de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Los anticuerpos para inmunotransferencia tal como Raf-1, ciclina D1 y PARP se compraron de Santa Cruz Biotecnology (San Diego, CA).
Otros anticuerpos tal como anti-pVEGFR2 (Y1175), VEGFR2, survivina, fosfo-STAT3 (Tyr705) y STAT3 fueron de Cell Signaling (Danvers, MA).
2.1.2. Cultivo celular
La línea celular de HCC Huh-7 se obtuvo del Banco de Recursos para Investigación en Ciencias de la Salud (Osaka, Japón; JCRB0403). Las líneas celulares PLC/PRF/5 (PLC5), Sk-Hep-1 y Hep3B se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con SBF al 10%, penicilina G 100 unidades/ml, sulfato de estreptomicina 100 pg/ml y anfotericina B 25 pg/ml en un incubador humidificado a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% en aire. Otras líneas celulares, incluyendo células de cáncer de mama, por ejemplo, MDAMB231, MDAMB468, MCF-7, y células cancerosas de leucemia, por ejemplo, HL-60, KG-1 y ML-1 también se proporcionan para ensayos como se describe posteriormente.
2.1.3. ELISA de detección de muerte celular
El efecto de los compuestos de la invención sobre la viabilidad celular se evaluó mediante ensayo ELISA de muerte celular (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Las células se trataron con un compuesto de prueba a 5 y 10 pM, por ejemplo. Las células se recogieron y se aplicaron al protocolo estándar proporcionado por el fabricante. 2.1.4. Análisis de apoptosis
Las células apoptóticas se midieron por citometría de flujo (sub-G1). Después del tratamiento con varios compuestos, las células se tripsinizaron, se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en PBS. Después de la centrifugación, las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en solución de tinción de yoduro de potasio (PI). Las muestras se incubaron en la oscuridad durante 30 min a 37°C y después se analizaron con un citómetro de flujo EPICS Profile II (Coulter Corp., Hialeah, FL). Todos los experimentos se realizaron en triplicado.
2.1.5. Nivel de fosfo-STAT3
Se usó un kit de ELISA sándwich PathScan Phospho-Stat3 (Tyr705) para la detección de fosfo-STAT3 (Cell Signaling, Danvers, MA). Las células se pretrataron con IL-6 1 ng/ml y después se expusieron con varios compuestos a 10 pM durante 24 h. Después de incubación con lisados celulares, las proteínas Stat3 tanto no fosforilada como fosfo-Stat3 se capturaron por el anticuerpo recubierto. La expresión de fosfo-STAT3 se midió a 450 nm de absorbancia.
2.1.6. Inmunotransferencia
Las células se trataron con varios compuestos a 5 y 10 pM durante 24 h. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia.
2.1.7. Atenuación génica usando ARNip
Se compraron ARNip Smart-pool, incluyendo control (D-001810-10), Raf-1, SHP-1, SHP-2 y PTP-1B de Dharmacon Inc. (Chicago, IL). El procedimiento se ha descrito previamente (Chen KF et al. J Biol Chem 2009; 284:11121-11133).
2.1.8. PLC5 con expresión ectópica de STAT3
El ADNc de STAT3 (KIAA1524) y STAT3-C se compraron del repositorio de plásmidos Addgene (http://www.addgene.org/). Brevemente, después de la transfección, las células se incubaron en presencia de G418 (0,78 mg/ml). Después de 8 semanas de selección, las colonias supervivientes, es decir, las que surgen de células transfectadas establemente, se seleccionaron y amplificaron individualmente.
2.1.9. Actividad fosfatasa y quinasa
Se usó el kit de ensayo de tirosina fosfatasa RediPlate 96 EnzChek® (R-22067) para el ensayo de actividad de SHP-1 (Molecular Probes, Carlsbad, CA), Se usó el kit de ensayo de la cascada de la quinasa Raf-1 (Upstate-Millipore, Billerica, MA) para examinar la actividad de la quinasa Raf-1. Se compró el kit de actividad de la quinasa JAK2 de Reaction Biology Corp. (Malvern, PA).
2.1.10. Ensayo indicador de STAT3
Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se pretrataron con IL-6 a la dosis de 10 ng/pl durante 30 min. El kit indicador de STAT3 se compró de SABiosciences (Frederock, MD).
2.1.11. Crecimiento tumoral de xenoinjertos
Se obtuvieron ratones desnudos atímicos NCr macho (5-7 semanas de edad) de Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipéi, Taiwán). Todos los procedimientos experimentales que usan estos ratones se realizaron según protocolos aprobados por la Universidad Nacional de Taiwán. Cuando tumores Huh-7 alcanzaron 100-200 mm3, los ratones recibieron tosilato de sorafenib (100 mg/kg), v.o. (oral) una vez al día, o SC-1 (10 mg/kg), v.o. (oral) una vez al día. Los controles recibieron vehículo (Chen KF et al. Cáncer Res. 2008; 68:6698-6707).
2.1.12. Análisis estadístico
Las comparaciones de los valores medios se realizaron usando la prueba de la t para muestras independientes en software SPSS para Windows 11.5 (SPSS, Inc., Chicago, IL) (Chen KF et al. Cáncer Res. 2008; 68:6698-6707). 2.2. Resultados
2.2.1. El compuesto 1 no afecta la actividad de la quinasa Raf
Como se ha descrito anteriormente, se sintetizaron derivados de sorafenib sin proporcionar capacidad donante de hidrógeno al sustituir el anillo de piridina y el grupo funcional amida con cianuro de fenilo. Después, se ensayó la capacidad del compuesto 1 para inhibir la actividad de la quinasa Raf en células PLC5, comparado con la de sorafenib. Como se muestra en la figura 3, sorafenib fue capaz de inhibir el 50% de la actividad de la quinasa Raf-1 de las células sin tratar en las células PLC5 a 5 pM; sin embargo, las células tratadas con el compuesto 1 mostraron la misma actividad de Raf-1 que el control con vehículo. La pérdida de inhibición de Raf-1 se puede atribuir presumiblemente a la pérdida de la capacidad de formar uniones de hidrógeno, como resultado de la sustitución del anillo de piridina y el grupo funcional amida con cianuro de fenilo.
2.2.2. Relación entre estructura y actividad de la sustitución del grupo urea y el anillo de piridina en muerte celular Como se ha descrito anteriormente, se sustituyó el enlace del grupo funcional urea de sorafenib con varias amidas y sulfonamidas generando los compuestos 2-11. Estos compuestos se analizaron mediante ensayo MTT para inhibición de crecimiento celular en células PLC5. La tabla 4 muestra los resultados.
Tabla 4
Figure imgf000030_0001
Los resultados muestran que ninguno de estos derivados en el grupo de donantes de electrones o captadores de electrones mostró mayor toxicidad celular que sorafenib y el compuesto 1.
A continuación, se cambió la piridina a un anillo de quinolina y el enlazador amida para generar los compuestos 12­ 25. Estos compuestos también se analizaron mediante el ensayo MTT para inhibición del crecimiento celular en células PLC5. La tabla 5 muestra los resultados.
Tabla 5
Ċ
Figure imgf000031_0001
Tabla 6
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
El enlazador amida mostró diferente conformación del enlazador sulfonilo, mostrando mejor actividad que los compuestos con enlazador sulfonilo. Por ejemplo, el compuesto 16 mostró una mejor toxicidad celular que el compuesto 12. El compuesto 25 mostró citotoxicidad comparable a sorafenib y 1. Se concluyó que los enlazadores urea y amida mostraron la toxicidad celular más potente en células PLC5.
2.2.3. Validación mecanicista del modo de acción de los derivados de sorafenib
Para comprobar la desfosforilación de STAT3 por derivados de sorafenib, se evaluó el estado de P-STAT3 en células PLC5 expuestas a 10 pM de cada compuesto durante 24 h por ELISA. Como se muestra en la figura 4, los compuestos con enlazador sulfonilo no mostraron cambio apreciable en P-STAT3; sin embargo, el compuesto 1 y algunos de los compuestos con enlazador amida mostraron un alto grado de desfosforilación de STAT3. El nivel disminuido de P-STAT3 inducido por estos derivados se correlacionaba con la toxicidad celular. En otras palabras, estos derivados indujeron muerte celular en parte a través de la inhibición de STAT3.
Además, se ensayó la ruta de señales posterior después de la inhibición de P-STAT3. Los niveles de expresión de ciclina D1 y survivina, genes diana posteriores de STAT3, se evaluaron usando los compuestos 1 y 12. Como se muestra en la figura 5, el compuesto 1 con actividad inhibidora de STAT3, fue capaz de reducir el nivel de ciclina D1 y survivina, pero el compuesto 12 no tuvo efecto en ninguna proteína. Además, se realizaron análisis de fragmentación de ADN y citometría de flujo de células PLC5 tratadas en el compuesto 1, y los resultados muestran que la muerte celular se atribuía a la inhibición de STAT3 y además inducía la señal apoptótica (Fig. 6).
Nuestra suposición de que la inhibición de Raf y STAT3 por sorafenib podría estar estructuralmente disociada fue confirmada por el compuesto 1, que, carente de actividad Raf, mostró el mismo nivel de disminución de P-STAT3 que sorafenib. Sugerimos que el grupo cianuro del compuesto 1 reduce su interacción con Raf. Modificaciones posteriores de sorafenib al cambiar el enlazador y el anillo de piridina a amida y quinolina (compuestos 1, 16 y 25, respectivamente) produjeron una disminución en la potencia de represión de STAT3.
2.2.4. SC-1, un derivado de sorafenib, que carece de la función inhibidora de Raf-1 mostró efecto de muerte celular similar a sorafenib en líneas celulares de HCC
En este experimento, de nuevo se examinaron los efectos de sorafenib y SC-1 sobre la actividad de Raf-1. Raf-1 inmunoprecipitada de extractos celulares de PLC5 o Hep3B se incubó con proteína recombinante MEK y el estado de fosfo-MEK se ensayó en las células tratadas con sorafenib o SC-1. Se observó una reducción del 20-40% en la actividad quinasa de Raf-1 en presencia de sorafenib; sin embargo, SC-1 no inhibió la actividad de Raf-1, lo que sugiere que SC-1 no es un inhibidor de Raf-1 (Fig. 7A). Además, se ensayó la fosforilación de VEGFR2, una diana clave de sorafenib en el tratamiento de cáncer. La expresión de p-VEGFR2 (Tyr1175) estaba disminuida en células PLC5 tratadas con sorafenib mientras que SC-1 no tuvo efecto significativo (Fig. 7B). Estos datos sugieren que SC-1 derivado de sorafenib no afecta la inhibición de quinasas.
A continuación, se examinaron los efectos antiproliferativos de sorafenib y SC-1. Tanto SC-1 como sorafenib disminuyeron la viabilidad de varias células de HCC incluyendo PLC5, SK-Hep1, Huh-7 y Hep3B de una manera dependiente de la dosis (Fig. 8A). Además, las células de HCC tratadas con SC-1 o sorafenib mostraron un aumento significativo en población en fase sub-G1 después de 24 h de exposición (Fig. 8B). Ambos fármacos indujeron muerte celular apoptótica significativa detectada por la inducción de fragmentación de ADN en células de HCC tratadas con SC-1 o sorafenib (Fig. 8C). Estos datos indican que SC-1 tiene un efecto significativo sobre apoptosis y es tan potente como sorafenib en inhibir el crecimiento celular de HCC incluso aunque SC-1 no tiene la capacidad de bloquear la actividad quinasa, lo que sugiere que el mecanismo por el que sorafenib induce apoptosis en HCC puede no estar relacionado con su actividad inhibidora de quinasas.
2.2.5. STAT3 es vital para el efecto sensibilizador de sorafenib y SC-1 en líneas celulares de HCC
Para verificar si la disminución de p-STAT3 es dependiente de la inhibición de quinasa de sorafenib, se ensayó además la ruta de señalización relacionada con STAT3 en células de HCC tratadas con SC-1. Dado el hecho de que STAT3 disminuía por sorafenib y producía la inducción de muerte celular, se examinaron moléculas relacionadas con apoptosis incluyendo Mcl-1, ciclina D1 y survivina. Se encontró que la supresión de p-STAT3 desempeña un papel en mediar la muerte celular inducida por SC-1 o inducida por sorafenib. SC-1 redujo la expresión de proteínas relacionadas con STAT3 en células de HCC. La fosforilación de STAT3 en la tirosina 705 es crítica para para la transactivación de STAT3. SC-1, así como sorafenib disminuyeron p-STAT3 en el residuo Y705 y suprimieron Mcl-1 y ciclina D1 en todas las líneas celulares de HCC probadas incluyendo PLC5, Huh7, y Sk-Hep1 (Fig. 9A). De forma notable, la proteína STAT3 total no estaba afectada por sorafenib y SC-1 (Fig. 9A). Además, SC-1 y sorafenib disminuyeron p-STAT3 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (Fig. 9B). Estos datos sugieren además que sorafenib inhibía STAT3 por un mecanismo independiente de quinasa.
También se ensayó el estado de activación de p-STAT3 por ELISA de STAT3. Veinticuatro horas antes de la exposición a sorafenib o SC-1, se pretrataron células Sk-Hep1 con IL-6 recombinante para mimetizar alto nivel de expresión de STAT3 y después se trataron con SC-1 o sorafenib durante otras 24 horas en presencia de IL-6. Los extractos de células tratadas con SC-1 o sorafenib se incubaron con anticuerpo contra STAT3 fosforilada en Y705. Los resultados de ELISA mostraron que sorafenib, así como SC-1 disminuyeron la actividad de p-STAT3 significativamente (Fig. 9C, izquierda). Para evaluar la actividad transcripcional, la región de unión a STAT3 se clonó en un indicador Luc. Se encontró que la actividad de transcripción de STAT3 estaba significativamente disminuida en presencia de sorafenib o SC-1 (Fig. 9C, derecha). La actividad de luciferasa de luciérnaga se evaluó y normalizó mediante luciferasa de Renilla. Estos resultados mostraron que tanto sorafenib como SC-1 reducían potentemente el nivel de fosforilación de STAT3 mediante la supresión de la transcripción. Después se establecieron clones estables que sobreexpresaban STAT3 de células de HCC para validar el efecto de sorafenib en HCC. Como se muestra en la figura 9D, tanto la apoptosis inducida por sorafenib como la inducida por SC-1 estaban suprimidas en células de HCC que sobreexpresaban STAT3 como se evidencia por el análisis sub-G1, lo que sugiere que STAT3 es un mediador principal de apoptosis inducida por sorafenib o SC-1.
2.2.6. La fosfatasa SHP-1 desempeña un papel en el efecto de sorafenib y SC-1 sobre fosfo-STAT3 y apoptosis
Para estudiar adicionalmente cómo sorafenib inhibe STAT3 en HCC, se examinaron varias proteínas fosfatasas que pueden estar implicadas en regular p-STAT3. Nuestros resultados mostraron que vanadato de sodio, un inhibidor general de fosfatasas, disminuyó la apoptosis y aumento p-STAT3 (Fig. 10A, izquierda). Estos datos sugieren que sorafenib y SC-1 pueden afectar p-STAT3 al dirigirse a proteínas fosfatasas relacionadas con STAT3. Además, encontramos que un inhibidor específico de la fosfatasa s HP-1 revertía la muerte celular y la inhibición de p-STAT3 inducida por sorafenib (Fig. 10A, derecha). Para verificar adicionalmente el papel de SHP-1 en la inhibición de p-STAT3 inducida por SC-1 y sorafenib, se aplicó ARNip específico para SHP-1 para examinar la influencia de sorafenib y SC-1. Encontramos que el silenciamiento de SHP-1 revertía a apoptosis e inhibición de p-STAT3 inducida por sorafenib o SC-1 (Fig. 10B, izquierda). Además, tanto sorafenib como SC-1 aumentaron la actividad SHP-1 hasta 3 veces en comparación con células control (P < 0,05) (Fig. 10B, medio). Las células PLC5 tratadas con sorafenib o SC-1 se inmunoprecipitaron por anticuerpo específico de SHP-1, y después el complejo que contenía SHP-1 se sometió a ensayo de grupo fosfo basado en fluorescencia. De forma notable, ni sorafenib ni SC-1 afectaron la interacción de STAT3 y SHP-1 como se evidencia por inmunoprecipitación de SHP-1 (Fig. 10B, derecha). Estos datos sugieren que sorafenib inducía muerte celular a través de inactivación de STAT3 dependiente de SHP-1.
Además de SHP-1, se ha descrito que otras fosfatasas tal como SHP-2 y PTP-1B regulan p-STAT3. Como se muestra en la figura 10C, los efectos de sorafenib sobre apoptosis y p-STAT3 no se revertían por silenciamiento de SHP-2 o PTP-1B, lo que sugiere que ni SHP-2 ni PTP-1B desempeñaban un papel en mediar los efectos de sorafenib o SC-1 sobre p-STAT3.
2.2.7. SC-1 disminuye p-STAT3 e induce apoptosis en células HUVEC
Para clarificar el efecto de sorafenib sobre p-VEGFR2, una diana clave de sorafenib en el tratamiento de cáncer, se examinó el efecto de sorafenib y SC-1 en células HUVEC. Como se muestra en la figura 11A, izquierda, tanto sorafenib como SC-1 disminuyeron p-STAT3 en células HUVEC e indujeron muerte celular apoptótica significativa en HCC (P < 0,05). De forma notable, sorafenib, pero no SC-1 disminuyó la fosforilación de v Eg FR en células HUVEC (Fig. 7A, medio). Estos resultados indican que ni Raf-1 ni VEGFR median el efecto de sorafenib sobre apoptosis y p-STAT3.
Un estudio previo también ha sugerido que Mcl-1 es crucial en mediar el efecto de sorafenib en la sensibilización de TRAIL. De forma interesante, nuestros datos sugieren que SC-1 también mostraba aumento similar de apoptosis inducida por TRAIL en HCC mediante la disminución de p-STAT3 (Fig. 11B). Para investigar adicionalmente si la inhibición de p-STAT3 por sorafenib está asociada con Raf-1, se atenuó Raf-1 usando ARN interferente pequeño. Silenciar Raf-1 no afectó los efectos de sorafenib o SC-1 en p-STAT3 (Fig. 11C), lo que indica que Raf-1 no media el efecto de sorafenib sobre p-STAT3. De forma notable, ni sorafenib ni SC-1 alteraron la actividad quinasa de JAK2 (Fig. 11D), lo que sugiere que JAK2 no media los efectos de ambos compuestos sobre p-STAT3. Además, nuestros datos mostraron que sorafenib y SC-1 no afectaban los niveles de proteína de SOCS-1 y SOCS-3 (Fig. 11E). De forma interesante, las células de HCC con STAT-3 constitutivamente activa (STAT3-C) no eran completamente resistentes a SC-1 (Fig. 11F). Como SC-1 aumentaba la actividad de SHP-1 (Fig. 11B, medio), nuestros datos sugieren que además de STAT-3, otras moléculas relacionadas con SHP-1 también pueden desempeñar un papel en mediar el efecto de SC-1. Para examinar si sorafenib o SC-1 se dirigen a SHP-1 directamente, se inmunoprecipitaron células PLC5 con anticuerpo anti-SHP-1 después se incubaron con sorafenib o SC-1 durante 6 horas. Como se muestra en la figura 11G, sorafenib y SC-1 aumentan la actividad de SHP-1 en estos lisados, lo que sugiere que sorafenib y SC-1 se dirigen a SHP-1 directamente.
2.2.8. Evaluación terapéutica del efecto de SC-1 y sorafenib en ratones que portan Huh7
Para verificar el efecto terapéutico de SC-1, se aplicó además SC-1 a xenoinjerto de HCC para evaluar su significancia in vivo. Primero, ratones portadores de Huh7 recibieron tratamiento diario con vehículo o sorafenib a la dosis de 10 mg/kg/día por vía oral. El tratamiento con sorafenib inhibió significativamente el crecimiento tumoral de xenoinjertos de Huh7 y los animales tratados con sorafenib tuvieron un tamaño de tumor de menos de la mitad que el de los ratones control (Fig. 12A, izquierda). No hubo diferencia aparente en el peso corporal o citotoxicidad en ningún ratón (datos no mostrados). Además, extractos tumorales de ratones tratados con vehículo y sorafenib se sometieron a inmunotransferencia para p-STAT3. p-STAT3 estaba disminuida en tumor tratado con sorafenib (Fig. 12A, derecha). Se observó p-STAT3/STAT3 en los homogenizados de tres tumores Huh7 representativos. Además, se examinó la actividad s HP-1 en xenoinjerto Huh7 tratado con sorafenib. El tumor tratado con sorafenib mostró inducción significativa de actividad SHP-1 in vivo (Fig. 12A, derecha). En conjunto, estos resultados confirmaron que sorafenib podría aumentar la actividad de SHP-1 para reprimir p-STAT3 implicada en inhibición tumoral en el modelo de xenoinjerto de HCC.
Además, el tratamiento con SC-1 tuvo un fuerte efecto inhibidor (P < 0,05) y el tamaño de tumor en este grupo era solo el 25% de el de los ratones tratados con vehículo al final del tratamiento. (Fig. 12B, izquierda). También se realizaron inmunotransferencia para p-STAT3 y el ensayo de actividad de SHP-1 en una muestra de tumor de animales tratados con SC-1. De forma interesante, SC-1 indujo subida significativa de la actividad SHP-1 y disminuyó p-STAT3 (Fig. 12B, derecha). Estos datos indican que SC-1, un agonista de SHP-1 y un inhibidor de p-STAT3, muestra efectos terapéuticos en inhibir crecimiento tumoral.
2.2.9. Inhibición de crecimiento de células cancerosas
También se examinaron los efectos de SC-1 y SC-43 en otras líneas celulares cancerosas, incluyendo líneas celulares de cáncer de mama, por ejemplo, MDAMB231, MDAMB468, MCF-7, y líneas celulares cancerosas de leucemia, por ejemplo, HL.60, KG-1, y ML-1. La figura 13 muestra los resultados. Estos datos muestran que los compuestos de la invención son eficaces en inhibir el crecimiento de células cancerosas.
2.2.10. Efectos anticancerosos en células de HCC
Las células de HCC se trataron con derivados de sorafenib (SC-43 o SC-40) a la dosis indicada durante 24 h. Las células recogidas se fijaron en etanol al 75% y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) 20 ug/ml. Se realizó análisis sub-G1 por citometría de flujo. La figura 14 muestra que SC-43 y SC-40, derivados de sorafenib, muestran efectos anticancerosos significativos en células de HCC (A), (B), (C), (D) y (E) se refiere a SC-43 para células PLC5, HepG2, Hep3B, HA59T y SK-Hep1, respectivamente; y (F), (G), (H), (I), y (J) se refiere a SC-40 para células PLC5, HepG2, Hep3B, HA59T y SK-Hep1, respectivamente. Puntos, media; barras, DE (n = 6).
2.2.11. Efectos de sorafenib o SC-43 sobre proteínas relacionadas con STAT3
Las células de HCC tratadas con SC-43 (10 pM durante 24 h) se recogieron con tampón de lisis RIPA. Los anticuerpos para inmunotransferencia tal como ciclina D1 se compraron de Santa Cruz Biotechnology. Otros anticuerpos tal como survivina, fosfo-STAT3 (Tyr705), STAT3, Mcl-1, So Cs 1, y SOCS3 eran de Cell Signaling. La figura 15 muestra que SC-43 disminuye la ruta de señalización relacionada con fosfo-STAT3 en HCC.
2.2.12. Efectos de sorafenib o SC-40 sobre proteínas relacionadas con STAT3
Las células de HCC tratadas con SC-40 (10 pM durante 24 h) se recogieron con tampón de lisis RIPA. Los anticuerpos para inmunotransferencia tal como ciclina D1 se compraron de Santa Cruz Biotechnology. Otros anticuerpos tal como survivina, fosfo-STAT3 (Tyr705), STAT3, Mcl-1, So Cs 1, y SOCS3 eran de Cell Signaling. La figura 16 muestra que SC-40 disminuye la ruta de señalización relacionada con fosfo-STAT3 en HCC
2.2.13. Efectos de sorafenib o SC-43 sobre proteínas relacionadas con STAT3
Las células de HCC tratadas con SC-43 (10 pM durante 24 h) se recogieron con tampón de lisis RIPA. Los anticuerpos para inmunotransferencia tal como ciclina D1 se compraron de Santa Cruz Biotechnology. Otros anticuerpos tal como survivina, fosfo-STAT3 (Tyr705), STAT3, Mcl-1, So Cs 1, y SOCS3 eran de Cell Signaling. La figura 17 muestra que SC-43 muestra una mejor inhibición de la ruta de señalización relacionada con p-STAT3 que sorafenib en HCC, (A) PLC5 y (B) Hep3B. SC-43 muestra inhibición significativa de proteínas relacionadas con p-STAT3 a tratamiento de baja dosis que sorafenib.
2.2.14. Efectos de SC-43 y SC-40 sobre la actividad de STAT3
Actividad de p-STAT3: Las células PLC5 tratadas con derivados SC se recogieron en tampón RIPA y se analizaron en el kit de ELISA de p-STAT3. El protocolo de ensayo sigue el fabricante.
Ensayo indicador de STAT3: Se sembraron células PLC5 en una placa de 96 pocillos. Las células se pretransfectaron con construcción indicadora de STAT3 durante 24 h y se trataron con los derivados durante otras 24 h. El kit indicador de STAT3 se compró de SABiosciences.
Las células se trataron con SC-43 o SC-40 a 10 pM durante 24 h y se midió el ELISA de fiosfo-STAT3 o la actividad luciferasa. La figura 18 muestra que tanto SC-43 como SC-40 inducen fuerte inhibición de la actividad de p-STAT3, (A) y (B) ELISA de p-STAT3 para SC-43 y SC-40, respectivamente; y (C) y (D) ensayo indicador de STAT3 para SC-43 y SC-40, respectivamente.
2.2.15. Efectos de SC-43/40 sobre la actividad fosfatasa
Se incubó extracto de proteínas de PLC5 con anticuerpo anti-SHP-1 en tampón de inmunoprecipitación durante la noche. Se añadió proteína G Sepharosa 4 Fast Flow (GE Healthcare Bio-Science) a cada muestra, seguido por incubación durante 3 horas a 4°C con rotación. Este extracto de proteína que contenía SHP-1 se incubó adicionalmente con compuestos SC (10 o 100 mmol/l) durante 30 min a 4°C. Se usó el kit de ensayo de tirosina fosfatasa RediPlate 96 EnzCheck (R-22067) para el ensayo de actividad fosfatasa de SHP-1 (molecular Probes). La figura 19 muestra que los derivados SC aumentan la actividad fosfatasa de SHP-1 in vitro, (A) Sc -43, (B) SC-40, y (C) SC-49.
2.2.16. Efectos de derivados SC sobre la actividad fosfatasa en SHP-1 recombinante
Se usó el kit de ensayo de tirosina fosfatasa RediPlate 96 EnzCheck (R-22067) para el ensayo de actividad fosfatasa de SHP-1 (Molecular Probes). La proteína SHP-1 recombinante (25 ng) se incubó o bien con SC-43 o SC-40 a la dosis indicada durante 30 minutos y después se analizó por actividad fosfatasa SHP-1. La figura 20 muestra que los derivados SC aumentan la actividad fosfatasa de SHP-1 in vitro, (A) SC-43 y (B) SC-40.
2.2.17. Efecto in vivo de SC-40 en xenoinjerto que porta PLC5
Se obtuvieron ratones desnudos atímicos NCr machos (5-7 semanas de edad) del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipéi, Taiwán). Todos los procedimientos experimentales que usan estos ratones se hicieron según los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional de Taiwán. Cada ratón se inoculó s.c. en el flanco dorsal con 1 * 106 células PLC5 suspendidas en 0,1 ml de medio sin suero que contenía Matrigel al 50% (BD Biosciences). Cuando los tumores alcanzaron de 100 a 200 mm3, los ratones recibieron tosilato de SC-40 (10 o 20 mg/kg) por vía oral una vez al día. Los tumores se midieron semanalmente usando calibrador, y sus volúmenes se calcularon usando la siguiente fórmula estándar: anchura * longitud * altura * 0,52.
La figura 21 muestra que (A) el efecto antitumoral de SC-40 en tumores PLC5; puntos, media (n = 6); barras, EE; (B) análisis por inmunotransferencia de p-STAT3 y STAT3 en tumores PLC5; (C) el peso corporal de los animales; y (D) el peso tumoral y (E) la actividad de SHP-1 en tumores PLC5. Los resultados muestran que SC-40 tiene efecto antitumoral significativo en tumores PLC5, pero no afecta el peso corporal de los animales. El peso corporal no tiene diferencias significativas entre animales control y tratados con SC-40.
2.2.18. Efecto antitumoral de SC-43
En este ejemplo, mostramos que SC-43 muestra efecto antitumoral in vitro e in vivo. SC-43 muestra una citotoxicidad significativa en células de HCC (CI50 ~0,5 pM). Además, SC-43 produce significativamente inhibición de crecimiento tumoral en ratones portadores de HCC. La ruta de señalización relacionada con SHP-1/STAT3 actúa como una diana vital para el efecto antitumoral de SC-43. Véase la figura 22 (A) la citotoxicidad de SC-43 en células de HCC, (B) el efecto antitumoral de SC-43 en ratones portadores de HCC, (C) la actividad de SHP-1 inducida por SC-43, y (D) análisis por inmunotransferencia de p-STAT3 y STAT3 en células de HCC tratadas con SC-43 (10 pM y 20 pM).
2.2.19. Efecto in vivo de SC-43 en el modelo ortotópico PLC5/luc
Se obtuvieron ratones desnudos atímicos NCr machos (5-7 semanas de edad) del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipéi, Taiwán). Todos los procedimientos experimentales que usan estos ratones se hicieron según los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional de Taiwán. Cada ratón se inoculó en el hígado en el flanco dorsal con 1 * 104 células PLC5/luc suspendidas en 0,1 ml de medio sin suero que contenía Matrigel al 50% (BD Biosciences). Cuando los tumores se formaron, los ratones recibieron sorafenib o tosilato de SC-43 (10 mg/kg) por vía oral una vez al día. El crecimiento tumoral se siguió por un sistema de imagen de sistema de imagenología in vivo no invasiva (IVIS) dos veces a la semana.
SC-40 muestra un efecto antitumoral significativo en ratones ortotópicos que portan PLC5. El crecimiento del tumor se siguió en el tiempo indicado por el sistema de imagen IVIS. Los ratones se trataron o bien con vehículo, sorafenib (10 mg/kg) o SC-43 (10 mg/kg). La figura 23 muestra (A) las imágenes de los ratones tratados, (B) muestra el peso corporal de los ratones, y (C) muestra la curva de supervivencia entre ratones control y tratados. Los resultados muestran que SC-40 muestra un efecto antitumoral significativo en ratones ortotópicos portadores de PLC5. El peso corporal no tiene diferencias significativas entre los ratones control y tratados con SC-43.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que está representado por la fórmula I
Figure imgf000038_0001
en donde R1 y R3 son independientemente hidrógeno; y
Figure imgf000038_0002
en donde R1 es independientemente hidrógeno; R3 es metilo;
Figure imgf000038_0003
en donde R2 y R3 son independientemente hidrógeno; y R1 es
Figure imgf000038_0004
2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se ha definido en la reivindicación 1 y un soporte farmacológico aceptable.
3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se ha definido en la reivindicación 1 y un soporte farmacológico aceptable para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada por la disminución de la proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene homología de Src-2 (SHP-1), en donde la enfermedad o afección caracterizada por expresión disminuida de SHP-1 es cáncer y osteoporosis.
4. Un método para aumentar la expresión de la proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene homología de Src-2 (SHP-1) in vitro, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto como se ha definido en la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 2.
5. Un compuesto como se ha definido en la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada por expresión disminuida de la proteína tirosina fosfatasa 1 que contiene homología de Src-2 (SHP-1), en donde la enfermedad o afección caracterizada por expresión disminuida de SHP-1 es cáncer y osteoporosis.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde el cáncer es carcinoma hepatocelular, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello.
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