ES2763184T3 - Dosificación terapéutica de una neurregulina en el tratamiento o profilaxis de la insuficiencia cardíaca - Google Patents

Abstract

Un peptido que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidermico (similar a EGF), en donde el peptido es neurregulina, para su uso en la reduccion de los efectos secundarios debido a los niveles suprafisiologicos del peptido tras la administracion mientras se trata o previene la insuficiencia cardiaca en un mamifero sobre un tiempo prolongado en donde una cantidad terapeuticamente efectiva de dicho peptido se administra a un mamifero en un intervalo de al menos 96 horas, en donde dicha cantidad terapeuticamente efectiva es efectiva para tratar o prevenir la insuficiencia cardiaca en dicho mamifero.

Description

DESCRIPCIÓN

Dosificación terapéutica de una neurregulina en el tratamiento o profilaxis de la insuficiencia cardíaca

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere al tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Más específicamente, la invención se dirige a un régimen de dosificación mejorado mediante el cual los beneficios terapéuticos de la administración de una neurregulina, como el factor de crecimiento glial 2 (GGF2) o un fragmento del mismo, se mantienen y/o mejoran, mientras se minimizan los posibles efectos secundarios.

Antecedentes de la invención

Un desafío fundamental asociado con la administración de fármacos a pacientes que lo necesitan es la relación entre tolerabilidad y eficacia. El índice terapéutico es el rango dentro del cual se puede administrar una dosis eficaz de una sustancia a un paciente y una dosis a la que se observan efectos secundarios no deseados en el paciente. Generalmente, cuanto mayor es la diferencia entre la dosis eficaz y la dosis a la que se inician los efectos secundarios, más benigna es la sustancia y es más probable que el paciente la tolere.

La insuficiencia cardíaca, particularmente la insuficiencia cardíaca congestiva (ICC), una de las principales causas de muerte en los países industrializados. Los factores que subyacen a la insuficiencia cardíaca congestiva incluyen presión arterial alta, cardiopatía isquémica, exposición a compuestos cardiotóxicos como los antibióticos de antraciclina, exposición a la radiación, trauma físico y defectos genéticos asociados con un mayor riesgo de insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, la ICC a menudo resulta de una mayor carga de trabajo en el corazón debido a la hipertensión, daño al miocardio por isquemia crónica, infarto de miocardio, enfermedad viral, toxicidad química, radiación y otras enfermedades como la esclerodermia. Estas condiciones resultan en una disminución progresiva en la capacidad de bombeo del corazón. Inicialmente, el aumento de la carga de trabajo que resulta de la presión arterial alta o la pérdida de tejido contráctil induce hipertrofia compensatoria de cardiomiocitos y engrosamiento de la pared ventricular izquierda, lo que mejora la contractilidad y mantiene la función cardíaca. Con el tiempo, sin embargo, la cámara ventricular izquierda se dilata, la función de la bomba sistólica se deteriora, los cardiomiocitos sufren muerte celular apoptótica y la función miocárdica se deteriora progresivamente.

Las neurregulinas (NRG) y los receptores de NRG comprenden un sistema de tirosina quinasa receptor de factor de crecimiento para la señalización célula-célula que está implicado en la organogénesis y el desarrollo celular en nervios, músculos, epitelios y otros tejidos (Lemke, Mol. Cell. Neurosci 7: 247-262, 1996 and Burden et al., Neuron 18: 847­ 855, 1997). La familia NRG consta de cuatro genes que codifican numerosos ligandos que contienen el factor del crecimiento epidérmico (EGF), inmunoglobulina (Ig) y otros dominios reconocibles. Numerosas isoformas secretadas y unidas a la membrana funcionan como ligandos en este sistema de señalización. Los receptores para los ligandos NRG son todos miembros de la familia de receptores EGF (EGFR) e incluyen EGFR (o ErbB1), ErbB2, ErbB3 y ErbB4, también conocidos como HER1 a HER4, respectivamente, en humanos (Meyer et al., Development 124: 3575-3586, 1997; Orr-Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1867-71, 1993; Marchionni et al., Nature 362: 312-8, 1993; Chen et al., J. Comp. Neurol. 349: 389-400, 1994; Corfas et al., Neuron 14: 103-115, 1995; Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1064-1068, 1994 y Pinkas-Kramarski et al., Oncogene 15: 2803-2815, 1997).

Los cuatro genes NRG, NRG-1, NRG-2, NRG-3 y NRG-4, se mapean en loci cromosómicos distintos (Pinkas-Kramarski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9387-91, 1994; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; Chang et al., Nature 387: 509-511, 1997; y Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9562-9567, 1997), y codifican colectivamente una gran variedad de proteínas NRG. Los productos génicos de NRG-1, por ejemplo, comprenden un grupo de aproximadamente 15 isoformas distintas relacionadas estructuralmente (Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7: 247­ 262, 1996 and Peles and Yarden, BioEssays 15: 815-824, 1993). Las primeras isoformas identificadas de NRG-1 incluyeron el factor de diferenciación Neu (Nd F; Peles et al., Cell 69, 205-216, 1992 y Wen et al., Cell 69, 559-572, 1992), herregulina (HRG; Holmes et al., Science 256: 1205-1210, 1992), actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA; Falls et al., Cell 72: 801-815, 1993), y los factores de crecimiento glial GGF1, GGF2 y GGf3 (Marchionni et al. al. Nature 362: 312-8, 1993).

El gen NRG-2 se identificó por clonación por homología (Chang et al., Nature 387: 509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; y Higashiyama et al., J. Biochem. 122: 675-680, 1997) y a través de enfoques genómicos (Busfield et al., Mol. Cell. Biol. 17: 4007-4014, 1997). Los ADNc NRG-2 también se conocen como activadores derivados neurológicos y de timo de las quinasas ErbB (NTAK; número de acceso de Genbank AB005060), divergente de neurregulina (Don-1) y factor de crecimiento derivado del cerebelo (CDGF; solicitud PCT WO 97/09425). La evidencia experimental muestra que es probable que las células que expresan ErbB4 o la combinación ErbB2/ErbB4 muestren una respuesta particularmente sólida a NRG-2 (Pinkas-Kramarski et al., Mol. Cell. Biol. 18: 6090-6101, 1998). También se sabe que el producto del gen NRG-3 (Zhang et al., supra) se une y activa los receptores ErbB4 (Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998).

Un dominio similar a EGF está presente en el núcleo de todas las formas de NRG, y es necesario para la unión y activación de los receptores ErbB. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los dominios similares a EGF codificados en los tres genes son aproximadamente 30-40% idénticas (comparaciones por pares). Además, parece haber al menos dos subformas de dominios similares a EGF en NRG-1 y NRG-2, que pueden conferir diferentes bioactividades y potencias específicas de tejido.

Las respuestas celulares a NRG están mediadas a través de los receptores de tirosina quinasas NRG EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico. La unión de alta afinidad de todos los NRG está mediada principalmente a través de ErbB3 o ErbB4. La unión de ligandos NRG conduce a la dimerización con otras subunidades ErbB y a la transactivación por fosforilación en residuos de tirosina específicos. En ciertos entornos experimentales, casi todas las combinaciones de receptores ErbB parecen ser capaces de formar dímeros en respuesta a la unión de las isoformas NRG-1. Sin embargo, parece que ErbB2 es un compañero de dimerización preferido que puede desempeñar un papel importante en la estabilización del complejo ligando-receptor. ErbB2 no se une al ligando por sí solo, sino que debe combinarse heterólogamente con uno de los otros subtipos de receptores. ErbB3 posee actividad de tirosina quinasa, pero es un objetivo para la fosforilación de los otros receptores. Se sabe que la expresión de NRG-1, ErbB2 y ErbB4 es necesaria para la trabeculación del miocardio ventricular durante el desarrollo del ratón.

Las neurregulinas estimulan el crecimiento hipertrófico compensatorio e inhiben la apoptosis de los miocardiocitos sometidos a estrés fisiológico. De acuerdo con estas observaciones, la administración de una neurregulina es útil para prevenir, minimizar o revertir la enfermedad cardíaca congestiva resultante de factores subyacentes como hipertensión, enfermedad cardíaca isquémica y cardiotoxicidad. Véase, por ejemplo, el Número de Patente de los Estados Unidos (USPN) 6,635,249.

En vista de la alta prevalencia de insuficiencia cardíaca en la población general, sigue habiendo una necesidad insatisfecha de prevenir o minimizar la progresión de esta enfermedad, por ejemplo inhibiendo la pérdida de la función cardíaca o mejorando la función cardíaca.

Resumen de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente divulgación que comprende la invención comprende la reducción de los efectos secundarios causados por el nivel suprafisiológico de neurregulina tras la administración durante un tiempo prolongado mientras se trata o previene la insuficiencia cardíaca en un mamífero.

La invención se basa en la sorprendente observación de que los beneficios terapéuticos de un péptido que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (similar al EGF) se pueden lograr mediante regímenes de dosificación para la administración de neurregulina que no mantienen un estado estable tal como administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido a un mamífero a intervalos de administración de 48, 72, 96 o más horas o más. En consecuencia, el presente tratamiento requiere la administración intermitente o discontinua (cada 48 a 96 horas, o incluso intervalos más largos) de un péptido que contiene un dominio similar a EGF para el mamífero, en donde el dominio similar a EGF está codificado por un gen de neurregulina, y en donde la administración del péptido es en una cantidad efectiva para tratar o prevenir la insuficiencia cardíaca en el mamífero. Los regímenes de dosificación para la administración de neurregulina que no mantienen concentraciones en estado estacionario son tan efectivos como los regímenes de dosificación más frecuentes, pero sin los inconvenientes, costos o efectos secundarios que pueden resultar de una administración más frecuente. Como se usa en el presente documento, el término administración intermitente o discontinua incluye un régimen de dosificación en intervalos de al menos 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, o cualquier combinación o incremento de los mismos, siempre que el intervalo/régimen sea al menos 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses. Como se usa en el presente documento, el término administración intermitente o discontinua incluye un régimen de dosificación en intervalos de no menos de 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, o cualquier combinación o incremento de los mismos, siempre que el intervalo/régimen no sea menos de 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses.

De acuerdo con la presente invención, la administración al mamífero intermitente o discontinua de un péptido que contiene un dominio similar a EGF, en donde el dominio similar a EGF está codificado por un gen de neurregulina, se dirige a lograr un régimen de dosificación en donde no se mantienen concentraciones estrechas en estado estacionario del péptido administrado, lo que reduce la probabilidad de que el mamífero experimente efectos secundarios adversos que pueden resultar del mantenimiento de niveles suprafisiológicos del péptido administrado durante un período prolongado. Por ejemplo, los efectos secundarios asociados con los niveles suprafisiológicos de NRG administrado de manera exógena incluyen hiperplasia de la vaina nerviosa, hiperplasia mamaria, nefropatía renal, hipoespermia, elevación de enzimas hepáticas, cambios en las válvulas cardíacas y cambios en la piel en el sitio de inyección.

En una realización preferida, la presente invención se dirige a un régimen de dosificación intermitente que provoca o permite fluctuaciones en los niveles séricos del péptido que comprende un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina y, por lo tanto, reduce el potencial de efectos secundarios adversos asociado con la administración más frecuente del péptido. El régimen de dosificación intermitente de la presente invención confiere así ventaja terapéutica al mamífero, pero no mantiene niveles terapéuticos en estado estacionario del péptido que comprende un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina. Como aprecian los expertos en la materia, existen diversas realizaciones de la invención para obtener la dosificación intermitente; los beneficios de estas realizaciones pueden establecerse de varias maneras, por ejemplo, dicha administración no mantiene niveles terapéuticos de estado estable de dicho péptido, la administración reduce el potencial de efectos secundarios adversos asociados con la administración del péptido NRG con mayor frecuencia, y similares.

En realizaciones particulares de la invención, la neurregulina puede ser el gen, producto génico o subsecuencia respectiva o fragmento de la misma que comprende, que consiste esencialmente o que consiste en: NRG-1, NRG-2, NRG-3 o NRG-4. En una realización preferida, una subsecuencia NRG o fragmento de la invención comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (similar al EGF) o un homólogo del mismo. Como aprecian las personas con conocimientos ordinarios en la técnica, un péptido homólogo a un péptido de dominio similar a EGF se determina encontrando homología estructural o mediante el péptido homólogo que se desempeña como un péptido similar a EGF en ensayos funcionales tales como mediante unión y activación Receptores ErbB. Preferiblemente, el fragmento es al menos 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 aminoácidos de longitud. Un péptido de neurregulina de la invención puede, a su vez, ser codificado por cualquiera de estos genes de neurregulina (o subsecuencia del mismo). En una realización más particular, el péptido usado en el método es GGF2 humano recombinante o un fragmento o subsecuencia del mismo. Véanse las Figuras 8A-8D para las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de GGF2 humano de longitud completa.

En un aspecto de la invención, los mamíferos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, perros, monos o cerdos. En una realización de la invención, el mamífero es un humano.

En otras realizaciones de la invención, la insuficiencia cardíaca puede resultar de hipertensión, cardiopatía isquémica, exposición a un compuesto cardiotóxico (por ejemplo, cocaína, alcohol, un anticuerpo anti-ErbB2 o anticuerpo anti-HER, tal como HERCEPTIN®, o un antibiótico de antraciclina, como doxorrubicina o daunomicina), miocarditis, enfermedad tiroidea, infección viral, gingivitis, abuso de drogas, abuso de alcohol, pericarditis, aterosclerosis, enfermedad vascular, miocardiopatía hipertrófica, infarto agudo de miocardio o infarto de miocardio previo, disfunción sistólica ventricular izquierda, cirugía de derivación coronaria, inanición, exposición a la radiación, un trastorno alimentario o un defecto genético.

En otra realización de la invención, se administra un anticuerpo anti-ErbB2 o anti-HER2, tal como HERCEPTIN®, al mamífero antes, durante o después de la administración de antraciclina.

En otras realizaciones de la invención, el péptido se administra antes de la exposición a un compuesto cardiotóxico, durante la exposición a dicho compuesto cardiotóxico, o después de la exposición a dicho compuesto cardiotóxico; el péptido se administra antes o después del diagnóstico de insuficiencia cardíaca congestiva en dicho mamífero. Un método de la invención puede tener lugar después de que el mamífero sujeto se haya sometido a hipertrofia cardíaca compensatoria; un método de la invención comprende que el resultado del método es mantener la hipertrofia ventricular izquierda o prevenir la progresión del adelgazamiento del miocardio o inhibir la apoptosis de los cardiomiocitos. En un método de la invención, el péptido puede comprender, que consiste esencialmente en, o que consiste en un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina. Un péptido de la invención se administra antes, durante o después de la exposición a un compuesto cardiotóxico. En otra realización, el péptido que contiene el dominio similar a EGF se administra durante dos, o los tres, de estos períodos. De acuerdo con la presente invención, el péptido que contiene un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina se administra a intervalos de cada 48 a 96 horas. En una realización de la presente invención, el péptido que contiene un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina es' GGF2. En otras realizaciones más de la invención, el péptido se administra antes o después del diagnóstico de insuficiencia cardíaca congestiva en el mamífero. En otra realización más de la invención, el péptido se administra a un mamífero que se ha sometido a hipertrofia cardíaca compensatoria. En otras realizaciones particulares de la invención, la administración del péptido mantiene la hipertrofia ventricular izquierda, evita la progresión del adelgazamiento del miocardio y/o inhibe la apoptosis de los cardiomiocitos.

Las realizaciones de la invención incluyen lo siguiente: un método para tratar la insuficiencia cardíaca en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar un péptido exógeno que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (similar al EGF) a dicho mamífero, en donde dicha administración a dichos intervalos reduce los efectos secundarios adversos asociados con la administración de dicho péptido exógeno en dicho mamífero. Un método para tratar la insuficiencia cardíaca en un mamífero, dicho método comprende administrar un péptido exógeno que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (similar al EGF) a dicho mamífero, en donde dicho dominio similar al EGF está codificado por la neurregulina (NRG)-1 gen, y dicho péptido exógeno se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva para tratar la insuficiencia cardíaca en dicho mamífero a intervalos de al menos 48 horas, en donde dicha administración a dichos intervalos no mantiene niveles estables de dicho péptido exógeno en dicho mamífero. Un método para tratar la insuficiencia cardíaca en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar un péptido exógeno que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (similar al EGF) u homólogo del mismo a dicho mamífero, y dicho péptido exógeno se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva para tratar insuficiencia cardíaca en dicho mamífero a intervalos de al menos o no menos de 48 horas, en donde dicha administración a dichos intervalos permite la fluctuación intradosis de las concentraciones séricas de dicho péptido exógeno a los niveles de referencia o preadministración en dicho mamífero.

Como se usa en el presente documento, el término efecto secundario adverso o perjudicial se refiere a una consecuencia no deseada e indeseable de un tratamiento médico. Con respecto a la presente invención, un efecto secundario adverso o perjudicial resultante de la administración de un péptido exógeno puede incluir uno o más de los siguientes: hiperplasia de la vaina nerviosa, hiperplasia mamaria, nefropatía renal y cambios en la piel en el sitio de inyección.

Como se usa en el presente documento, el término "fluctuación intradosis de las concentraciones séricas de dicho péptido exógeno a niveles de preadministración en dicho mamífero" se refiere a la diferencia entre los niveles de concentración sérica antes de la administración de una dosis de un péptido exógeno.

Como se usa en este documento, el término "niveles de estado estacionario" se refiere a un nivel de un agente exógeno (por ejemplo, un péptido) que es suficiente para lograr el equilibrio (dentro de un rango de fluctuación entre las dosis sucesivas) entre la administración y eliminación. "Mantener niveles terapéuticos en estado estacionario" se refiere a mantener la concentración de un agente exógeno en un nivel suficiente para conferir un beneficio terapéutico a un sujeto o paciente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un histograma que representa la función cardíaca como se ejemplifica por los cambios en la fracción de eyección y el acortamiento fraccional. Como se indicó, las ratas se trataron con GGF2 a 0.625 mg/kg o una cantidad equimolar de un fragmento similar a EGF (fragmento; EGF-id) por vía intravenosa (iv) cada día (q día).

La figura 2 muestra un gráfico lineal que representa la función cardíaca según lo revelado por los cambios en la fracción de eyección y el acortamiento fraccional. Como se indicó, las ratas se trataron con GGF2 a 0.625 mg/kg o 3.25 mg/kg iv cada día.

La Figura 3 muestra un gráfico lineal que representa la función cardíaca según lo revela una mejora significativa en el volumen sistólico final durante el período de tratamiento. Como se indicó, las ratas se trataron con GGF2 a 0.625 mg/kg o 3.25 mg/kg iv cada día.

La figura 4 muestra un gráfico lineal que representa la función cardíaca según lo revelado por los cambios en la fracción de eyección y el acortamiento fraccional. Como se indicó, las ratas se trataron con GGF2 3.25 mg/kg por vía intravenosa (iv) cada 24, 48 o 96 horas.

La Figura 5 muestra un gráfico lineal que representa la función cardíaca según lo revelado por los cambios en la fracción de eyección ecocardiográfica. Como se indicó, las ratas se trataron con vehículo o GGF2 3.25 mg/kg por vía intravenosa (iv), con o sin BSA.

La Figura 6 muestra un gráfico lineal que representa la vida media del GGF2 humano recombinante (rhGGF2) después de la administración iv.

La Figura 7 muestra un gráfico lineal que representa la vida media de GGF2 humano recombinante (rhGGF2) después de la administración subcutánea.

Las Figuras 8A-D muestran las secuencias nucleicas y de aminoácidos de GGF2 de longitud completa. La secuencia de ácido nucleico se designa SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos se designa como SEQ ID NO: 2.

La Figura 9 muestra las secuencias de aminoácidos y nucleicas del dominio 1 similar al factor de crecimiento epidérmico (EGFL). La secuencia de ácidos nucleicos del dominio 1 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos del dominio EGFL I se designa aquí SEQ ID NO: 4.

La Figura 10 muestra las secuencias de aminoácidos y nucleicas del dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 2. La secuencia de ácidos nucleicos del dominio 2 de EGFL se designa aquí en la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos del dominio 2 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 6.

La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos y nucleicas del dominio 3 similar al factor de crecimiento epidérmico (EGFL). La secuencia de ácidos nucleicos del dominio 3 de EGFL se designa en este documento SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del dominio 3 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 8.

La Figura 12 muestra las secuencias de aminoácidos y nucleicas del dominio 4 similar al factor de crecimiento epidérmico (EGFL). La secuencia de ácidos nucleicos del dominio 4 de EGFL se designa en este documento SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos del dominio 4 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 10.

La Figura 13 muestra las secuencias de aminoácidos y nucleicas del dominio 5 similar al factor de crecimiento epidérmico (EGFL). La secuencia de ácidos nucleicos del dominio 5 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos del dominio 5 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 12.

La Figura 14 muestra las secuencias de aminoácidos y nucleicas del dominio 6 similar al factor de crecimiento epidérmico (EGFL). La secuencia de ácidos nucleicos del dominio 6 de EGFL se designa aquí SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos del dominio 6 de EGFL se designa en la SEQ ID NO: 14.

La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (EGFL), que se designa aquí SEQ ID NO: 21.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores hicieron el sorprendente descubrimiento de que la administración discontinua o intermitente de una neurregulina a intervalos de tiempo apropiadamente espaciados entrega una cantidad terapéuticamente efectiva de la neurregulina a un paciente que la necesita y tal régimen de tratamiento es útil para prevenir, hacer profilaxis, mejorar, minimizar, tratar o revertir enfermedades del corazón, como la insuficiencia cardíaca congestiva.

A pesar de la sabiduría convencional y la práctica de desarrollo relacionadas con el diseño de regímenes de dosificación para mantener las concentraciones de estado estacionario de rango más estrecho, los presentes inventores demuestran aquí que los regímenes de dosificación para la administración de neurregulina que no mantienen concentraciones estrechas de estado estacionario son tan efectivos como más regímenes de dosificación frecuente. De hecho, los presentes inventores han demostrado que el tratamiento con neurregulina de la insuficiencia cardíaca con intervalos de dosificación de al menos 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, o cualquier combinación o incremento de los mismos siempre que el intervalo/régimen es de al menos 48 horas es tan eficaz como la dosificación diaria.

Para evaluar la farmacocinética de NRG exógeno, los presentes inventores han demostrado que la vida media de la neurregulina cuando se administra por vía intravenosa es de 4 a 8 horas y cuando se administra por vía subcutánea es de 11-15 horas. Véase, por ejemplo, las Tablas 1 y 2 y las Figuras 6 y 7. La dosificación en regímenes tan infrecuentes como cada cuatro días, por lo tanto, no mantendría ningún nivel detectable durante al menos tres días entre dosis. Con base en estos hallazgos, antes de la presente invención, no se habría predicho que tales relaciones pico/valle se correlacionarían con un beneficio terapéutico constante. Es de destacar que los compuestos con una vida media de este orden generalmente se administran de acuerdo con un régimen de dosificación frecuente (por ejemplo, dosis diarias o dosis diarias múltiples). De hecho, según los datos farmacocinéticos disponibles para g GF2, el desarrollo tradicional predeciría que el tratamiento óptimo implicaría la administración subcutánea diaria.

De acuerdo con la práctica convencional de conocimiento y desarrollo, otros tratamientos médicos para CHF se administran típicamente al menos diariamente. Se cree que la periodicidad de dicho régimen es necesaria porque la ICC es una afección crónica, comúnmente causada por una alteración de la contracción y/o relajación del corazón, en lugar de una afección aguda. En las personas con un corazón débil que conduce a una relajación alterada y CHF, los tratamientos médicos incluyen fármacos que bloquean la formación o la acción de neurohormonas específicas (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de la ECA), antagonistas del receptor de angiotensina (BRA), antagonistas de la aldosterona y bloqueadores de los receptores beta-adrenérgicos). Estos y otros fármacos ahora son estándar de atención en la iCc crónica, ya que se ha demostrado que mejoran los síntomas, la esperanza de vida y/o una reducción en las hospitalizaciones. En caso de exacerbación aguda o síntomas crónicos, los pacientes a menudo son tratados con inotrópicos (por ejemplo, dobutamina, digoxina) para mejorar la contractilidad cardíaca, junto con vasodilatadores (por ejemplo, nitratos, nesiritide) y/o diuréticos (por ejemplo, furosemida) para reducir la congestión. Los pacientes con hipertensión e insuficiencia cardíaca congestiva se tratan con uno o más agentes antihipertensivos, como betabloqueantes, inhibidores de la ECA y BRA, nitratos (dinitrato de isosorbida), hidralazina y bloqueadores de los canales de calcio.

Por lo tanto, a pesar de la práctica típica con respecto al tratamiento de CHF, los presentes inventores han demostrado que un nuevo régimen de dosificación da como resultado un tratamiento eficaz de CHF, evitando a la vez efectos secundarios indeseables. Aunque no desea limitarse a la teoría, es probable que dicho tratamiento con neurregulina fortalezca la capacidad de bombeo del corazón al estimular la hipertrofia de los cardiomiocitos e inhiba parcial o completamente el deterioro del corazón al suprimir la apoptosis de los cardiomiocitos.

A modo de antecedentes adicionales, el principio básico de dosificación es determinar una concentración circulante efectiva y diseñar un régimen de dosificación para mantener esos niveles. Los estudios farmacocinéticos (PK) y farmacodinámicos (PD) se combinan para predecir un régimen de dosificación que mantendrá un nivel de estado estacionario de un fármaco en particular. El plan típico es minimizar la diferencia entre la Cmax y la Cmin y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los fármacos se describen por su "índice terapéutico" que es una relación de la dosis tóxica o los niveles circulantes dividida por la dosis efectiva o las concentraciones circulantes. Cuando el índice terapéutico es grande, existe un amplio rango de seguridad donde se puede administrar una dosis efectiva sin acercarse a los niveles tóxicos. Cuando los efectos adversos resultan en concentraciones demasiado cercanas a las concentraciones efectivas, el índice terapéutico se describe como estrecho y el fármaco es difícil de administrar de manera segura.

Mientras se desarrollan los regímenes de dosificación, se combinan los datos de PK/PD con el conocimiento del índice terapéutico para diseñar una dosis y frecuencia de administración de manera que el compuesto se mantener a una concentración en un paciente (por ejemplo, un humano) de modo que sea por encima de la concentración efectiva y por debajo de la concentración tóxica. Si no se puede mantener una concentración efectiva del fármaco sin inducir efectos inseguros, el fármaco fallará durante el desarrollo. Se pueden encontrar comentarios adicionales relacionados con el desarrollo de fármacos en una variedad de referencias, que incluyen: Pharmacokinetics in Drug Development: Clinical Study Design and Analysis (2004, Peter Bonate and Danny Howard, eds.).

Las neurregulinas son factores de crecimiento relacionados con factores de crecimiento epidérmico que se unen a los receptores erbB. Se ha demostrado que mejoran la función cardíaca en múltiples modelos de insuficiencia cardíaca, cardiotoxicidad e isquemia. También se ha demostrado que protegen el sistema nervioso en modelos de accidente cerebrovascular, lesión de la médula espinal, exposición a agentes nerviosos, daño a los nervios periféricos y quimiotoxicidad.

Sin embargo, se ha demostrado que mantener niveles supranormales de neurregulinas suministradas exógenamente tiene efectos adversos que incluyen hiperplasia de la vaina nerviosa, hiperplasia mamaria y nefropatía renal. Estos efectos se observaron después de la administración subcutánea diaria de neurregulina. Véase, por ejemplo, la Tabla 10.

Como se expone en el presente documento, se exploró la administración subcutánea debido a la vida media prolongada en comparación con la administración intravenosa y la creencia inicial de que mantener niveles constantes de ligando sería ventajoso. El desarrollo de regímenes de dosificación para reducir estos efectos mejoraría significativamente la capacidad de las neurregulinas para ser utilizadas como agentes terapéuticos y es hacia este fin que se dirige la presente invención. Demostrar que la dosificación menos frecuente que no mantiene niveles constantes también es efectiva permite este desarrollo.

Neurregulinas: Como se indicó anteriormente, los péptidos codificados por los genes NRG-1, NRG-2, NRG-3 y NRG-4 poseen dominios similares a EGF que les permiten unirse y activar los receptores ErbB. Holmes et al. (Science 256: 1205-1210, 1992) han demostrado que el dominio de tipo EGF solo es suficiente para unirse y activar el receptor p185erbB2. En consecuencia, cualquier producto peptídico codificado por el gen NRG-1, NRG-2 o NRG-3, o cualquier péptido similar a neurregulina, por ejemplo, un péptido que tiene un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina o ADNc (por ejemplo, puede usar un dominio similar a EGF que contiene los subdominios peptídicos NRG-1 C-C/D o C-C/D', como se describe en USPN 5,530,109, USPN 5,716,930 y USPN 7,037,888; o un dominio similar a EGF como se describe en el documento WO 97/09425) en los métodos de la invención para prevenir o tratar la insuficiencia cardíaca congestiva. El contenido de cada una de las USPN 5,530,109; USPN 5,716,930; USPN 7,037,888; y WO 97/09425.

Factores de riesgo: Los factores de riesgo que aumentan la probabilidad de que un individuo desarrolle insuficiencia cardíaca congestiva son bien conocidos. Estos incluyen, entre otros, fumar, obesidad, presión arterial alta, cardiopatía isquémica, enfermedad vascular, cirugía de derivación coronaria, infarto de miocardio, disfunción sistólica del ventrículo izquierdo, exposición a compuestos cardiotóxicos (alcohol, drogas como la cocaína y antraciclina). antibióticos como doxorrubicina y daunorrubicina), infección viral, pericarditis, miocarditis, gingivitis, enfermedad de la tiroides, exposición a la radiación, defectos genéticos conocidos por aumentar el riesgo de insuficiencia cardíaca (como los descritos en Bachinski and Roberts, Cardiol. Clin. 16: 603-610, 1998; Siu et al., Circulation 8: 1022-1026, 1999; y Arbustini et al., Heart 80: 548-558, 1998), inanición, trastornos alimentarios como la anorexia y la bulimia, antecedentes familiares de insuficiencia cardíaca e hipertrofia miocárdica.

De acuerdo con la presente invención, las neurregulinas pueden administrarse intermitentemente para lograr la profilaxis, tal como previniendo o disminuyendo la tasa de progresión de la enfermedad cardíaca congestiva en aquellos identificados como en riesgo. Por ejemplo, la administración de neurregulina a un paciente en hipertrofia compensatoria temprana permite el mantenimiento del estado hipertrófico y evita la progresión a insuficiencia cardíaca. Además, aquellos identificados por estar en riesgo pueden recibir tratamiento cardioprotector de neurregulina antes del desarrollo de hipertrofia compensatoria. La administración de neurregulina a pacientes con cáncer antes y durante la quimioterapia con antraciclina o la terapia combinada de antraciclina/anti-ErbB2 (anti-HER2) (por ejemplo, HERCEPTIN®) puede evitar que los cardiomiocitos de un paciente sufran apoptosis, preservando así la función cardíaca. Los pacientes que ya han sufrido pérdida de cardiomiocitos también obtienen beneficios del tratamiento con neurregulina, porque el tejido miocárdico restante responde a la exposición a la neurregulina al mostrar un crecimiento hipertrófico y una mayor contractilidad.

Terapia: Las neurregulinas y péptidos que contienen dominios similares a EGF codificados por genes de neurregulina pueden administrarse a pacientes o animales experimentales con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la invención se pueden proporcionar en forma de dosificación unitaria.

La práctica farmacéutica convencional se emplea para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas, y para administrar tales composiciones a pacientes o animales experimentales. Aunque se prefiere la administración intravenosa, se puede emplear cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, parenteral, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intracardíaca, intraperitoneal, intranasal, en aerosol, oral o tópica (por ejemplo, aplicando un parche adhesivo que lleva una formulación capaz de cruzar la dermis y entrar en el torrente sanguíneo).

Las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para la administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de tabletas o cápsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Se encuentran métodos bien conocidos en la técnica para hacer formulaciones, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences". Las formulaciones para administración parenteral pueden, por ejemplo, contener excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para administrar moléculas de la invención incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como gel.

Como otro aspecto de la invención, se proporcionan los presentes compuestos para su uso como un producto farmacéutico especialmente en el tratamiento o prevención de las afecciones y enfermedades mencionadas anteriormente. También se proporciona en el presente documento el uso de los presentes compuestos en la fabricación de un fármaco para el tratamiento o prevención de una de las afecciones y enfermedades mencionadas anteriormente.

Con respecto a las inyecciones intravenosas, los niveles de dosis varían de aproximadamente 0.001 mg/kg, 0.01 mg/kg a al menos 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de al menos aproximadamente cada 24, 36, 48 horas a aproximadamente cada 96 horas y especialmente cada 48, 72 o 96 horas o más como se establece en este documento. En una realización particular, los niveles de dosis de inyección intravenosa varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas y especialmente cada 48, 72 o 96 horas o más como se establece en este documento. En otra realización particular, los niveles de dosis de inyección intravenosa varían de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas y especialmente cada 48, 72 o 96 horas o más como se establece en este documento. En otra realización particular más, los niveles de dosis de inyección intravenosa varían de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas y especialmente cada 48, 72 o 96 horas o más como se establece aquí. En otra realización particular más, los niveles de dosis de inyección intravenosa varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas y especialmente cada 48, 72 o 96 horas o más como se establece en este documento.

Con respecto a las inyecciones subcutáneas, los niveles de dosis varían de aproximadamente 0.01 mg/kg a al menos 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas y especialmente cada 48, 72 o 96 horas o más como se establece en este documento. En una realización particular, los niveles de dosis de inyección varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se establece en este documento, y especialmente cada 48, 72 o 96 horas. En otra realización particular, los niveles de dosis de inyección varían de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se establece aquí, y especialmente cada 48, 72 o 96 horas.

En otra realización particular más, los niveles de dosis de inyección varían de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se establece en este documento, y especialmente cada 48, 72 o 96 horas. En otra realización particular más, los niveles de dosis de inyección varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se establece en el presente documento, y especialmente cada 48, 72 o 96 horas.

Las dosis transdérmicas se seleccionan generalmente para proporcionar niveles en sangre similares o más bajos que los que se alcanzan usando dosis de inyección.

Los compuestos de la invención pueden administrarse como el único agente activo o pueden administrarse en combinación con otros agentes, incluidos otros compuestos que demuestran la misma actividad terapéutica o una actividad terapéutica similar y que se determina que son seguros y eficaces para tal administración combinada Otros compuestos de este tipo utilizados para el tratamiento de la ICC incluyen péptido natriurético cerebral (BNP), fármacos que bloquean la formación o la acción de neurohormonas específicas (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de la ECA), antagonistas del receptor de angiotensina (BRA), antagonistas de la aldosterona y beta-bloqueadores de los receptores adrenérgicos), inotrópicos (por ejemplo, dobutamina, digoxina) para mejorar la contractilidad cardíaca, vasodilatadores (por ejemplo, nitratos, nesiritide) y/o diuréticos (por ejemplo, furosemida) para reducir la congestión, y uno o más agentes antihipertensivos como los betabloqueantes, ACE-inhibidores y BRA, nitratos (dinitrato de isosorbida), hidralazina y bloqueadores de los canales de calcio.

Como se indicó anteriormente, la intervención médica que implica el tratamiento farmacológico requiere la selección de un fármaco apropiado y su administración a un régimen de dosificación adecuado. Un régimen de dosificación adecuado implica una dosis, ruta, frecuencia y duración del tratamiento suficientes. El objetivo final de la terapia farmacológica es la adquisición de concentraciones óptimas de fármacos en el sitio de acción para permitir al paciente tratado superar el proceso patológico para el que se necesita tratamiento. En términos generales, el conocimiento básico de los principios de disposición de drogas facilita la selección de regímenes de dosificación apropiados. Sin embargo, la monitorización terapéutica de fármacos (TDM) se puede utilizar en este contexto como una herramienta complementaria para ayudar al médico tratante a determinar regímenes de dosificación eficaces y seguros de fármacos seleccionados para la terapia médica de pacientes individuales.

Concentración objetivo y ventana terapéutica: La definición de la concentración óptima del fármaco varía dependiendo de las características farmacodinámicas del fármaco particular. La terapia óptima para antibióticos dependientes del tiempo como la penicilina, por ejemplo, se relaciona con lograr una concentración máxima a relaciones MIC (concentración inhibitoria mínima) de 2-4 y un tiempo por encima de la MIC igual al 75% del intervalo de dosis. Para los antibióticos dependientes de la concentración, como la gentamicina, por ejemplo, la eficacia está relacionada con la obtención de las concentraciones máximas respecto a las relaciones MIC de aproximadamente 8-10. Independientemente de los matices asociados con la administración de un fármaco en particular, la terapia con fármacos tiene como objetivo alcanzar las concentraciones plasmáticas objetivo (que a menudo reflejan las concentraciones en el sitio de acción) dentro de los límites de una "ventana terapéutica", que se ha determinado previamente en función de la perfiles farmacocinéticos, farmacodinámicos y de toxicidad del fármaco en las especies objetivo. El ancho de esta ventana varía para diferentes drogas y especies. Cuando la diferencia entre la concentración mínima eficaz y la concentración mínima tóxica es pequeña (2 a 4 veces), la ventana terapéutica se denomina estrecha. En contraste, cuando hay una gran diferencia entre la concentración efectiva y tóxica, se considera que el fármaco tiene una amplia ventana terapéutica. Un ejemplo de un fármaco con una ventana terapéutica estrecha es la digoxina, en la cual la diferencia entre las concentraciones efectivas y tóxicas promedio es de 2 o 3 veces. La amoxicilina, por otro lado, tiene un amplio rango terapéutico y la sobredosis de un paciente generalmente no se asocia con problemas de toxicidad.

Variabilidad en la capacidad de respuesta a los fármacos: la variabilidad pronunciada entre sujetos sanos de la misma especie con respecto a la capacidad de respuesta a los fármacos es común. Además, los estados de enfermedad tienen el potencial de afectar los sistemas y las funciones de los órganos (por ejemplo, el contenido de agua en riñones, hígado) que a su vez pueden afectar la capacidad de respuesta a los fármacos. Esto, a su vez, contribuye a aumentar las diferencias en la capacidad de respuesta a los fármacos en individuos enfermos a quienes se administra el fármaco. Otro tema relevante se relaciona con la administración de más de un fármaco a la vez, lo que resulta en interacciones farmacocinéticas que pueden conducir a alteraciones en la capacidad de respuesta a uno o ambos fármacos. En resumen, los factores fisiológicos (por ejemplo, edad), patológicos (por ejemplo, efectos de la enfermedad) y farmacológicos (por ejemplo, interacción farmacológica) pueden alterar la disposición de los fármacos en los animales. El aumento de la variabilidad entre los individuos resultante de esto puede dar lugar a fallas terapéuticas o toxicidad en fármacos con un índice terapéutico estrecho.

La población de pacientes que se beneficiaría de un régimen de tratamiento de la presente invención es bastante diversa, por ejemplo, los pacientes con insuficiencia renal son buenos candidatos porque los niveles continuos de proteínas terapéuticas a menudo se asocian con depósitos glomerulares renales. La utilidad de un régimen terapéutico que no mantiene niveles plasmáticos constantes como se describe en esta invención sería, por lo tanto, muy beneficioso para pacientes con función renal comprometida en la que cualquier disminución de la función existente podría ser perjudicial. De manera similar, la exposición breve e intermitente a un agente terapéutico como GGF2, como se describe en el presente documento, puede ser beneficiosa para pacientes con tipos de tumor que responden a la estimulación crónica y continua con un factor de crecimiento. Otros pacientes que pueden beneficiarse específicamente de la terapia intermitente como se describe aquí son pacientes con schwannomas y otras neuropatías periféricas. Es una ventaja de la presente invención que la dosificación intermitente puede tener ventajas significativas al no mantener la estimulación continúa relacionada con los efectos secundarios de varios tejidos.

El momento adecuado del muestreo de sangre con el fin de determinar el nivel de fármaco en suero, así como la interpretación del nivel informado requieren la consideración de las propiedades farmacocinéticas del fármaco que se está midiendo. Algunos términos utilizados en la discusión de estas propiedades se definen en los siguientes párrafos.

Vida media: El tiempo requerido para que la concentración sérica presente al comienzo de un intervalo disminuya en un 50%. Conocer una vida media aproximada es esencial para el clínico, ya que determina el horario de dosificación óptimo con agentes orales, la fluctuación intradosis de la concentración sérica y el tiempo requerido para alcanzar el estado estacionario.

En resumen, se han realizado múltiples estudios farmacocinéticos para GGF2. Las semividas típicas para GGF2 son entre 4 y 8 horas para la vía intravenosa (iv), mientras que la semivida de GGF2 administrado por vía subcutánea (sc) es entre 11 y 15 horas. Cmax, AUC, Tmax y T1/2 se muestran en las Tablas 1 y 2 a continuación. Cuando la vida media era demasiado larga para ser determinada con precisión por estos métodos, se presenta un guion en lugar de un momento.

Tabla 1 y Tabla 2

Apéndice 7

Farmacocinética media de la radioactividad derivada de 1251-rhGGF2 en plasma de ratas Sprague-Dawley machos después de una dosis intravenosa o subcutánea única de 1125I-rhGGF2

Grupo 1 (n=2) Grupo 2 (n=1)

Parámetros Total TCAPrecip Total TCAPrecip Cmax (ug eq/g) 0.3289 0.2953 0.0157 0.01

AUC 0-t (ug eq-h/g) 1.27 0.01 0.27 0.17

AUC inf (ug eq-h/g) 1.37 0.96 0.39 0.26

Tmax(h) 0.08 0.08 6.0 6.0

Vida media 6.37 6.11 1320 14.66

Grupo 1 - i.v. Grupo 2-s.c.

Farmacocinética media de la radioactividad derivada de 1251-rhGGF2 en plasma de ratas Sprague-Dawley machos que siguen una dosis intravenosa o subcutánea única de 125I-rhGGF2

Apéndice 9

Grupo 1 (n=2) Grupo 2 (n=1)

Parámetros Total Total

Cmáx (ug eq/g) 0.2611 02291 0.0197 0.0034

AUC 0-t (ug eq-h/g) 1.488 0.567 0.335 0.064

AUC inf (ug eq-h/g) 1.667 0.62 - -Tmáx(h) 0.08 0.08 12.0 12.0

Vida media 7.75 7.96 - -Grupo 1 - i.v. Grupo 2 - s.c.

Las concentraciones plasmáticas después de la administración se muestran en las Figuras 6 y 7 para la administración iv y sc, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 6 y 7, Cmax, se refiere a la concentración máxima en plasma (la concentración máxima que se mide en el plasma en cualquier momento después de la administración); AUCinf, se refiere al área bajo la curva de concentración versus tiempo hasta tiempo infinito (qué método se usa para anticipar que el ensayo tiene límites de detección); AUC0-t, se refiere al área bajo la concentración plasmática (curva de tiempo desde el tiempo cero hasta la última concentración medible); AUC por cualquier método se refiere a una estimación de la exposición total al animal; y Tmax, se refiere a la mediana del tiempo de concentración plasmática máxima. Como es evidente a partir de las tablas y figuras, no es posible mantener niveles terapéuticos en estado estacionario por vía de dosificación cada cuatro días, cada dos días o cada día de dosificación. Los niveles no se pueden medir después de un día e incluso mucho antes de eso, como lo reflejan los datos establecidos en la Tabla 11.

Estado estable: Las concentraciones séricas en estado estable son aquellos valores que se repiten con cada dosis y representan un estado de equilibrio entre la cantidad de fármaco administrado y la cantidad que se elimina en un intervalo de tiempo dado. Durante la dosificación a largo plazo con cualquier fármaco, los dos determinantes principales de su concentración sérica media en estado estacionario son la velocidad a la que se administra el fármaco y el aclaramiento total del fármaco en ese paciente en particular.

Concentración sérica máxima: El punto de concentración máxima en la curva de concentración sérica versus tiempo. El tiempo exacto de la concentración sérica máxima es difícil de predecir ya que representa relaciones complejas entre las tasas de entrada y salida.

Concentración sérica mínima: La concentración sérica mínima encontrada durante un intervalo de dosificación. Las concentraciones mínimas están teóricamente presentes en el período inmediatamente anterior a la administración de la dosis siguiente.

Absorción: El proceso por el cual una droga ingresa al cuerpo. Los fármacos administrados por vía intravascular se absorben totalmente, pero la administración extravascular produce diversos grados y tasas de absorción. La relación entre la tasa de absorción y la tasa de eliminación es el principal determinante de la concentración del fármaco en el torrente sanguíneo.

Distribución: La dispersión del fármaco disponible sistémicamente desde el espacio intravascular en fluidos y tejidos extravasculares y, por lo tanto, a los sitios receptores objetivo.

Rango terapéutico: Ese rango de concentraciones de fármaco en suero asociado con un alto grado de eficacia y un bajo riesgo de toxicidad relacionada con la dosis. El rango terapéutico es un concepto estadístico: es el rango de concentración asociado con la respuesta terapéutica en la mayoría de los pacientes. Como consecuencia, algunos pacientes exhiben una respuesta terapéutica a niveles séricos por debajo del límite inferior del rango, mientras que otros requieren niveles séricos que exceden el límite superior para obtener un beneficio terapéutico.

El momento correcto de la recogida de muestras es importante, ya que la terapia farmacológica a menudo se revisa en función de las determinaciones de concentración sérica. Las fases de absorción y distribución deben completarse y alcanzarse una concentración en estado estacionario antes de extraer la muestra. Los niveles obtenidos antes de que exista una concentración en estado estacionario pueden ser erróneamente bajos; aumentar la dosis en función de dicho resultado podría producir concentraciones tóxicas. Además, cuando se realizan mediciones comparativas, es importante que el tiempo de muestreo sea consistente.

El momento de las muestras de sangre en relación con la dosificación es crítico para la interpretación correcta del resultado de la concentración sérica. La selección del tiempo de extracción de la muestra en relación con la administración del fármaco debe basarse en las propiedades farmacocinéticas del fármaco, su forma de dosificación y la razón clínica para analizar la muestra (por ejemplo, evaluación de la eficacia o aclaración de una posible toxicidad inducida por fármacos). Para la monitorización rutinaria del nivel sérico de fármacos con vidas medias cortas, se puede obtener una muestra máxima y mínima en estado estable para caracterizar el perfil de concentración sérica; para fármacos con una vida media prolongada, las muestras pasantes en estado estable por sí solas generalmente son suficientes.

Por "insuficiencia cardíaca congestiva" se entiende una función cardíaca deteriorada que hace que el corazón sea incapaz de mantener el gasto sanguíneo normal en reposo o con ejercicio, o de mantener un gasto cardíaco normal en el contexto de la presión de llenado cardíaco normal. Una fracción de eyección ventricular izquierda de aproximadamente 40% o menos es indicativa de insuficiencia cardíaca congestiva (a modo de comparación, una fracción de eyección de aproximadamente 60% es normal). Los pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva muestran síntomas y signos clínicos bien conocidos, como taquipnea, derrames pleurales, fatiga en reposo o con ejercicio, disfunción contráctil y edema. La insuficiencia cardíaca congestiva se diagnostica fácilmente mediante métodos bien conocidos (véase, por ejemplo, "Consensus recommendations for the management of chronic heart failure". Am. J. Cardiol., 83(2A): 1A-38-A, 1999).

La gravedad relativa y la progresión de la enfermedad se evalúan usando métodos bien conocidos, tales como examen físico, ecocardiografía, formación de imágenes de radionúclidos, monitorización hemodinámica invasiva, angiografía por resonancia magnética y pruebas de ejercicio en cinta de correr junto con estudios de absorción de oxígeno.

Por "cardiopatía isquémica" se entiende cualquier trastorno resultante de un desequilibrio entre la necesidad miocárdica de oxígeno y la adecuación del suministro de oxígeno. La mayoría de los casos de cardiopatía isquémica resultan del estrechamiento de las arterias coronarias, como ocurre en la aterosclerosis u otros trastornos vasculares.

Por "infarto de miocardio" se entiende un proceso por el cual la enfermedad isquémica da como resultado que una región del miocardio sea reemplazada por tejido cicatricial.

Por "cardiotóxico" se entiende un compuesto que disminuye la función cardíaca al dañar o matar directa o indirectamente a los cardiomiocitos.

Por "hipertensión" se entiende la presión arterial que un profesional médico (por ejemplo, un médico o una enfermera) considera que es más alta de lo normal y conlleva un mayor riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca congestiva.

Por "tratar" se entiende que la administración de una neurregulina o un péptido similar a la neurregulina ralentiza o inhibe la progresión de la insuficiencia cardíaca congestiva durante el tratamiento, en relación con la progresión de la enfermedad que ocurriría en ausencia de tratamiento, en una manera estadísticamente significativa. Se pueden usar indicios bien conocidos, como la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, el rendimiento del ejercicio y otras pruebas clínicas enumeradas anteriormente, así como las tasas de supervivencia y hospitalización para evaluar la progresión de la enfermedad. Se puede determinar si un tratamiento ralentiza o inhibe la progresión de la enfermedad de una manera estadísticamente significativa mediante métodos que son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med. 327: 685-691, 1992 y Cohn et al., N. Engl. J Med. 339: 1810-1816, 1998).

Por "prevención" se entiende minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de insuficiencia cardíaca congestiva en un mamífero en riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca congestiva (como se define en las "Consensus recommendations for the management of chronic heart failure". Am. J Cardiol., 83(2A): 1A-38-A, 1999). La determinación de si la insuficiencia cardíaca congestiva se minimiza o previene mediante la administración de una neurregulina o un péptido similar a la neurregulina se realiza mediante métodos conocidos, tales como los descritos en SOLVD Investigators, supra, y Cohn et al., supra.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica o médica de un tejido, un sistema, un animal o un ser humano que está buscando un investigador, veterinario, médico u otro clínico. Un cambio terapéutico es un cambio en una característica bioquímica medida en una dirección que se espera que alivie la enfermedad o afección que se está abordando. Más particularmente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para disminuir los síntomas asociados con una afección o enfermedad médica, para normalizar las funciones corporales en enfermedades o trastornos que resultan en el deterioro de funciones corporales específicas, o para proporcionar una mejora en una o más de los parámetros medidos clínicamente de una enfermedad.

El término "cantidad profilácticamente efectiva" significa la cantidad de un fármaco farmacéutico que evitará o reducirá el riesgo de ocurrencia del evento biológico o médico que se busca prevenir en un tejido, un sistema, un animal o humano por un investigador, veterinario, médico u otro clínico.

El término "ventana terapéutica" significa el rango de dosis entre la cantidad mínima para lograr cualquier cambio terapéutico y la cantidad máxima que da como resultado una respuesta que es la respuesta inmediatamente antes de la toxicidad para el paciente.

Por "en riesgo de insuficiencia cardíaca congestiva" se entiende una persona que fuma, es obesa (es decir, 20% o más por encima de su peso ideal), ha estado o estará expuesta a un compuesto cardiotóxico (tal como un antibiótico de antraciclina), o tiene (o ha tenido) presión arterial alta, cardiopatía isquémica, infarto de miocardio, un defecto genético que se sabe que aumenta el riesgo de insuficiencia cardíaca, antecedentes familiares de insuficiencia cardíaca, hipertrofia miocárdica, miocardiopatía hipertrófica, disfunción sistólica del ventrículo izquierdo, cirugía de derivación coronaria, enfermedad vascular, aterosclerosis, alcoholismo, pericarditis, una infección viral, gingivitis o un trastorno alimentario (por ejemplo, anorexia nerviosa o bulimia), o es un adicto al alcohol o la cocaína.

Por "disminución de la progresión del adelgazamiento del miocardio" se entiende mantener la hipertrofia de los cardiomiocitos ventriculares de modo que se mantener o aumente el grosor de la pared ventricular.

Por "inhibe la apoptosis miocárdica" se entiende que el tratamiento con neurregulina inhibe la muerte de cardiomiocitos en al menos un 10%, más preferiblemente en al menos un 15%, aún más preferiblemente en al menos un 25%, incluso más preferiblemente en al menos un 50%, aún más preferiblemente en al menos un 75%, y lo más preferiblemente en al menos un 90%, en comparación con los cardiomiocitos no tratados.

Por "neurregulina" o "NRG" se entiende un péptido que está codificado por un gen o ácido nucleico NRG-1, NRG-2 o NRG-3 (por ejemplo, un ADNc), y se une y activa ErbB2, ErbB3, o receptores ErbB4, o combinaciones de los mismos.

Por "neurregulina-1", "NRG-1", "herregulina", "GGF2" o "ligando p185erbB2" se entiende un péptido que se une al receptor ErbB2 cuando se combina con otro receptor (ErbB1, ErbB3 o ErbB4) y está codificado por el gen del ligando p185erbB2 descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,530,109; Patente de los Estados Unidos No. 5,716,930; y la Patente de los Estados Unidos No. 7,037,888.

Por "péptido similar a neurregulina" se entiende un péptido que posee un dominio similar a EGF codificado por un gen de neurregulina, y se une y activa ErbB2, ErbB3, ErbB4, o una combinación de los mismos.

Por "dominio similar al factor de crecimiento epidérmico" o "dominio similar al EGF" se entiende un motivo peptídico codificado por el gen NRG-1, NRG-2 o NRG-3 que se une y activa ErbB2, ErbB3, ErbB4, o combinaciones de los mismos, y tiene una similitud estructural con el dominio de unión al receptor de EGF como se describe en Holmes et al., Science 256: 1205-1210, 1992; Pat. No. 5,530,109; Pat. No. 5,716,930; Pat. No. 7,037,888; Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998; Chang et al., Nature 387: 509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; Higashiyama et al., J Biochem. 122: 675-680, 1997; y WO 97/09425). Véanse las Figuras 9-14 para las secuencias de aminoácidos y nucleicos correspondientes a los dominios EGFL 1-6 codificados por el gen NRG-1.

Por "anticuerpo anti-ErbB2" o "anticuerpo anti-HER2" se entiende un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular del receptor ErbB2 (también conocido como HER2 en humanos) y evita la señal dependiente de ErbB2 (HER2) transducción iniciada por la unión de neurregulina.

Por "célula transformada" se entiende una célula (o un descendiente de una célula) en la que se ha introducido una molécula de ADN que codifica una neurregulina o péptido que tiene un dominio similar a la neurregulina EGF, mediante técnicas de ADN recombinante o gen conocido técnicas de terapia.

Por "promotor" se entiende una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También se incluyen en la invención aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer que la expresión génica dependiente del promotor sea controlable en función del tipo de célula o estado fisiológico (por ejemplo, condiciones hipóxicas versus condiciones normóxicas), o inducible por señales o agentes externos; dichos elementos pueden estar ubicados en las regiones 5' o 3' o internas del gen nativo.

Por "unido operativamente" se entiende que un ácido nucleico que codifica un péptido (por ejemplo, un ADNc) y una o más secuencias reguladoras están conectadas de tal manera que permiten la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) están vinculados a las secuencias reguladoras.

Por "vector de expresión" se entiende un plásmido o virus genéticamente modificado, derivado, por ejemplo, de un bacteriófago, adenovirus, retrovirus, poxvirus, herpesvirus o cromosoma artificial, que se utiliza para transferir un péptido (por ejemplo, una neurregulina) secuencia codificante, operativamente unida a un promotor, en una célula huésped, de modo que el péptido o péptido codificado se exprese dentro de la célula huésped.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención.

La discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos y similares se incluye en esta especificación únicamente con el fin de proporcionar un contexto para la presente invención. No se sugiere ni se representa que alguno o todos estos asuntos formaran parte de la base de la técnica anterior o constituyeran conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Otras realizaciones

Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que es capaz de realizar modificaciones adicionales y esta solicitud está destinada a cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención que sigue, en general, principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la presente divulgación dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y se puede aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente en este documento, y sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Los siguientes ejemplos ayudarán a los expertos en la materia a comprender mejor la invención y sus principios y ventajas. Se pretende que estos ejemplos sean ilustrativos de la invención y no limiten el alcance de la misma.

Ejemplos

Como se indicó anteriormente en este documento, las neurregulinas son una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados con el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y son esenciales para el desarrollo normal del corazón. La evidencia sugiere que las neurregulinas son un potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades del corazón, incluyendo insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, toxicidad quimioterapéutica y miocarditis viral.

Los estudios descritos en el presente documento sirvieron para definir la dosificación en el modelo de ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) de insuficiencia cardíaca congestiva en la rata. Se clonaron y produjeron múltiples variantes de empalme de neurregulina. Se comparó un fragmento de neurregulina que consiste en el dominio similar a EGF (EGF-Id) de informes anteriores (Liu et al., 2006) con una neurregulina de longitud completa conocida como factor de crecimiento glial 2 (GGF2) y el dominio similar a EGF con el dominio Ig (EGF-Ig). Ratas Sprague-Dawley macho y hembra se sometieron a ligadura de arterias LAD. A los 7 días después de la ligadura, las ratas se trataron intravenosamente (iv) con neurregulina diariamente. La función cardíaca se monitorizó mediante ecocardiografía.

El primer estudio comparó 10 días de dosificación con cantidades equimolares de EGF-Id o GGF2 (para GGF2 esto se calcula a 0.0625 y 0.325 mg/kg). El tratamiento con GGF2 dio como resultado una mejora significativamente (p<0.05) mayor en la Fracción de Eyección (EF) y el Acortamiento Fraccional (FS) que el EGF-Id al final del período de dosificación. El segundo estudio comparó 20 días de GGF2 con EGF-Id y EGF-Ig a concentraciones equimolares. El tratamiento con GGF2 dio como resultado una mejora significativa de EF, FS y LVESD (p<0.01). Las mejoras en la fisiología cardíaca no se mantuvieron durante este período con EGF-Id o EGF-Ig. El tercer estudio comparó la dosis diaria (q 24 horas), cada dos días (q 48 horas) y cada cuatro días (q 96 horas) durante 20 días con GGF2 (3.25 mg/kg). Los tres regímenes de tratamiento con GGF2 dieron como resultado mejoras significativas en la fisiología cardíaca, incluidos EF, ESV y EDV, y los efectos se mantuvieron durante 10 días después de la finalización de la dosificación. Los estudios presentados aquí confirman que GGF2 es el compuesto principal de neurregulina y establecen regímenes de dosificación óptimos para administrarlo.

Como se muestra en el presente documento, los presentes estudios establecen la eficacia relativa de GGF2 en comparación con los fragmentos de neurregulina publicados (Liu et al., 2006), inician estudios de rango de dosis y frecuencia de dosis, y determinan si se requiere excipiente de BSA como se informó previamente.

Métodos y materiales

Clonación, expresión y purificación del dominio IgEGF (Ig154Y) del ADN GGF2 (EGF-Ig): el dominio IgEGF se amplificó a partir de un ADNc de GGF2 existente y se clonó en el vector pet 15b (Novagen cat # 69661-3) usando Nde1 y sitios de restricción BamH1. La proteína resultante es una etiqueta His de 21.89 kda ~3kDa (= ~25 kDa).

Secuencia de ADN del clon IgEgf pet 15: Las secuencias subrayadas son los cebadores utilizados para la amplificación. Las secuencias en negrita son los sitios de clonación utilizados para insertar la secuencia en el vector pet (Nde1 y BamH1).

CATATGttgcctccccaattqaaagagatqaaaagccagqaatcggctgcaqgttccaaa

L P P Q L K E M K S Q E S A A G S K

ctagtccttcggtgtgaaaccagttctgaatactcctctctcagattcaagtggttcaag

aatgggaatgaattgaatcgaaaaaacaaaccacaaaatatcaagatacaaaaaaagcca

N G N E L N R K N K P Q N I K I Q K K P

gggaagtcagaacttcgcattaacaaagcatcactggctgattctggagagtatatgtgc

G K S E L R I N K A S L A D S G E Y M C

aaagtgatcagcaaattaggaaatgacagtgcctctgccaatatcaccatcgtggaatca

K V I S K L G N D S A S A N I T I V E S

aacgctacatctacatccaccactgggacaagccatcttgtaaaatgtgcggagaaggag

aaaactttctgtgtgaatggaggggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcg

K T F C V N G G E C F M V K D L S N P S

aqatacttqtqcaaqtgcccaaatqaqtttactggtgatcgctgccaaaactacqtaatq

qccaqcttctacGGATCC (SEQ ID NO: 15)

A S F Y (SEQ ID NO: 16)

La proteína traducida final del vector pet15b se muestra a continuación. La porción del vector está subrayada. M G G S H H H H H H G M A S M T G G T A N G V G D L Y D D D D K V P G S L P P Q L K E M K S _Q E S A A G S K L V L R C E T S S E Y S S L R F K W F K N G N E L N R K N K P Q N I K I Q K K P G K S E L R I N K A S L A D S G E Y M C K V I S K L E N D S A S A N I T I V E S N A T S T s

T T G T S H L V K C A E K E K T F C V N G G E C F M V K D L S N P S R Y L C K C P N E F T G D R C Q N Y V M A S F Y (SEQ ID NO: 17)

Expresión de proteínas: El clon se transformó en células B121 para la expresión de proteínas usando el Sistema de Autoinducción Express Overnight (Novagen) en medio LB a 25°C durante 24 horas.

Replegamiento de proteínas: Adaptado del kit de replegamiento de proteínas Novagen, 70123-3.

Purificación de proteínas: Sus columnas TRAP - según las instrucciones del fabricante.

Inmunotransferencia Western: La expresión de proteínas se evaluó mediante inmunotransferencia Western. La banda resultante con la etiqueta His corre a unos 25 kD.

Se usó un gel de criterio 4-20% (Biorad) para la resolución de la proteína seguido de transferencia sobre papel de nitrocelulosa Protran (tamaño de poro de 0.1 |jm de Schliecher and Schull). La mancha se bloquea en leche al 5% en TBS-T (0.1%). Anticuerpo primario (Anti EGF Human NRG 1-alpha/HRG1-alpha Affinity Purified Polyclonal Ab Cat # AF-296-NA de R&D systems) Dilución 1:1000 en leche al 5% en TBS-T- 1 hora a temperatura ambiente (también funciona a 4°C durante la noche). Se usó anticuerpo secundario de conejo HRP anti cabra a una dilución 1:10.000 en leche al 5% en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. Todos los lavados se realizaron en TBS-T.

Protocolo de purificación para Ig154Y: Los cultivos se hacen crecer a 25°C en el sistema de autoinducción expreso nocturno 1 de Novagen (cat # 71300-4). El cultivo se centrifuga y los gránulos se extraen, se solubilizan y se vuelven a plegar para adquirir la Ig154Y antes de que pueda tener lugar la purificación.

Materiales para extracción, solubilización y replegamiento:

Regulador de lavado 10X: Tris-HCl 200 mM, pH 7.5, EDTA 100 mM, Triton X-100 al 10%

Regulador de solubilización 10X: 500 mM CAPS, pH 11.0

Regulador de diálisis 50X: Tris-HCl 1 M, pH 8.5

30% de N-laurilsarcosina - agregar como polvo (Sigma 61739-5G) 1M DTT

Glutatión reducido (Novagen 3541)

Glutatión oxidado (Novagen 3542)

A. Lisis celular y preparación de cuerpos de inclusión

• Los sedimentos celulares se descongelaron y se volvieron a suspender en 30 ml de regulador de lavado 1X.

• Se añadieron a la suspensión inhibidores de proteasa (25 ul de 10X por 50 ml), DNasa (200 ul de 1 mg/ml por 50 ml) y MgCl² (500 ul de 1 M por 50 ml).

• Las células se sometieron a lisis por sonicación con enfriamiento en hielo.

• Tras la sonicación, los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a 10000 x g durante 12 minutos. • Se retiró el sobrenadante y se volvió a suspender completamente el sedimento en 30 ml de regulador de lavado 1X.

• Se repitió el paso 4.

• El sedimento se resuspendió completamente en 30 ml de regulador de lavado 1X.

• Los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos.

B. Solubilización y replegamiento.

• A partir del peso húmedo de los cuerpos de inclusión a procesar, se calcula la cantidad de regulador de solubilización 1X necesaria para resuspender los cuerpos de inclusión a una concentración de 10-15 mg/ml. Si el volumen calculado es superior a 250 ml, use 250 ml.

• A temperatura ambiente, preparar el volumen calculado de regulador de solubilización 1X suplementado con 0.3% de N-laurilsarcosina (se puede usar hasta 2% si es necesario para una mayor optimización) (300 mg/100 ml de regulador) y 1 mM de DTT.

• Agregar la cantidad calculada de regulador de solubilización 1X del paso 2 a los cuerpos de inclusión y mezclar suavemente. Los desechos grandes se pueden romper por pipeteo repetido.

• Incubar en el agitador del refrigerador a 25°C, 50-100 rpm durante 4-5 horas (o más si es necesario para una mayor optimización).

• Aclarar por centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

• Transferir el sobrenadante que contiene la proteína soluble a un tubo limpio.

C. Protocolo de diálisis para el replegamiento de proteínas

• Preparar el volumen requerido de regulador para la diálisis de proteínas solubilizadas. La diálisis debe realizarse con al menos 2 cambios de regulador de más de 50 veces el volumen de la muestra. Diluir el regulador de diálisis 50X a 1X en el volumen deseado y complemente con DTT 0.1 mM.

• Dializar durante al menos 4 horas a 4°C. Cambiar el regulador y continuar. Dializar por 4 o más horas adicionales.

• Preparar un regulador de diálisis adicional como se determina en el paso 1, pero omita la TDT.

• Continuar la diálisis a través de dos cambios adicionales (minutos 4 horas cada uno), con el regulador de diálisis sin DTT.

D. Regulador de replegamiento rédox para promover la formación de enlaces disulfuro

• Preparar un regulador de diálisis que contenga glutatión reducido 1 mM (1.2 g/4L) y glutatión oxidado 0.2 mM (0.48 g/4L) en regulador de diálisis 1X. El volumen debe ser 25 veces mayor que el volumen de la muestra de proteína solubilizada. Enfriar a 4°C.

• Dializar la proteína replegada del paso 1 durante la noche a 4°C.

Materiales para purificación

Todos los procedimientos se realizan a 4°C.

Productos químicos:

Clorhidrato de Trizma (Sigma T5941-500G)

Solución de cloruro de sodio 5M (Sigma S6546-4L)

Hidróxido de sodio 10N (JT Baker 5674-02)

Imidazol (JT Baker N811-06)

A. Purificación en la columna HISPrep FF 16/10 - 20 ml (GE Healthcare)

Regulador A: Tris-HCL 20 mM NaCl 500 mM pH 7.5

Regulador B: Regulador A 500 mM Imidazol pH 7.5

Equilibrio de columna: Regulador A-5CV, Regulador B-5CV, Regulador A-10CV Cargar 20 ml de muestra por análisis en una columna de 20 ml a 0.5 ml/min.

Lavar la columna con 5CV de regulador A

Eluir columna con 5CV de imidazol 280mM.

Limpiar con 10CV de 100% de regulador B.

Equilibrar con 15CV de regulador A

Analizar fracciones con una mancha de plata en SDS-page

Reunir fracciones con Ig154Y

B. Eliminación de His-Tag

La eliminación de la etiqueta His se realiza con un kit de captura de escisión de trombina de Novagen (Cat# 69022-3). Según las pruebas anteriores, las mejores condiciones son la temperatura ambiente durante 4 horas con trombina a 0.005U de enzima por |jl por cada 10 |jg de proteína Ig154Y. Después de cuatro horas de incubación, agregar 16 |jl de suspensión de estreptavidina agarosa por unidad de enzima trombina. Muestra de roca durante 30 minutos a temperatura ambiente. Recuperar la Ig154Y mediante filtración por rotación o filtrado estéril (dependiendo del volumen).

La escisión total se determina mediante EGF y inmunotransferencia Western anti-His.

C. Concentración de I g 154Y

Ajuste a la concentración deseada con el concentrador Millipore Centriprep 3000 MWCO 15 ml (Ultracel YM-3, 4320) D. Almacenamiento en el regulador final

Se almacena en Tris 20 mM NaCl 500 mM pH 7.5 y 1 X PBS BSA al 0.2%.

Clonación, expresión y purificación de 156Q (EGF-Id) [NRGlb2 EGF dominio (156Q)]

ADN: El dominio NRG1 b2 egf se clonó a partir de ADNc de cerebro humano y se clonó en el vector pet15b (Novagen cat # 69661-3) usando sitios de restricción Nde1 y BamH1. La proteína resultante es una etiqueta His de 6.92 kda ~3kDa (= 9.35 kDa).

Secuencia de ADN de NRG1 b2 egf pet 15 clon

Las secuencias subrayadas son los sitios de clonación (Nde1 y BamH1)

CATATGAGCCA TCTTGTAAAA TGTGCGGAGA AGGAGAAAAC TTTCTGTGTG

AATGGAGGGG AGTGCTTCAT GGTGAAAGAC CTTTCAAACC CCTCGAGATA CTTGTGCAAG TGCCCAAATG AGTTTACTGG TGATCGCTGC CAAAACTACG TAATGGCCAG CTTCTACAAG GCGGAGGAGC TGTACCAGTA AGGATCC (SEQ ID NO:

18)

La proteína traducida final del vector pet15b se muestra a continuación. El dominio egf se resalta en verde.

10 20 30

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSHLVKCAEK EKTFCVNGGE CFMVKDLSNP

60 70 80

SRYLCKCPNE FTGDRCQNYV MASFYKAEEL YQ (SEQ ID NO: 19)

pl/Mw calculado: 7.69/9349.58

Expresión de proteínas

El clon se transformó en células B121 para la expresión de proteínas usando el Overnight Express Autoinduction System (Novagen) en medios LB a 25°C durante 24 horas. La expresión es principalmente en cuerpos de inclusión insolubles.

Replegamiento de proteínas: Adaptado del kit de replegamiento de proteínas Novagen, 70123-3.

Purificación de proteínas: La proteína se carga en una columna de intercambio aniónico DEAE a 2.5 ml/min. El fragmento EGF-Id permanece en el flujo, mientras que los contaminantes se unen y eluyen en una sal más alta. El regulador de carga y lavado es Tris 50 mM pH 7.9 y el regulador de elución es Tris 50 mM pH 7.9 con NaCl 1 M. El flujo a través se agrupa y se concentra con Centriprep YM-3 de Millipore.

Inmunotransferencia Western: La expresión de proteínas se evalúa mediante inmunotransferencia Western. La banda resultante funciona a alrededor de 10 kD.

Se usó un gel de criterio 4-20% (Biorad) para la resolución de la proteína seguido de transferencia sobre papel de nitrocelulosa Protran (tamaño de poro de 0.1 |jm de Schliecher AND Schull). La mancha se bloquea en leche al 5% en TBS-T (0.1%). Anticuerpo primario (Anti e Gf Human NRG1-alpha/HRG1-alpha Affinity Purified Polyclonal Ab Cat • AF-296-Na de R&D systems) Dilución 1:1000 en leche al 5% en TBS-T- 1 hora a temperatura ambiente (también funciona a 4°C durante la noche). Se usó anticuerpo secundario de conejo HRP anti cabra a una dilución 1:10.000 en leche al 5% en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. Todos los lavados se realizaron en TBS-T Protocolo de purificación para NRG-156Q

Los cultivos se hacen crecer a 25°C en Overnight Express Autoinduction System 1 de Novagen (cat# 71300-4). Hay muy poco NRG-156Q soluble (EGF-Id) presente. El cultivo se centrifuga y los gránulos se extraen, solubilizan y vuelven a plegar para adquirir el NRG-156Q antes de que pueda tener lugar la purificación.

Materiales para extracción, solubilización y replegamiento:

Regulador de lavado 10X: Tris-HCl 200 mM, pH 7.5, EDTA 100 mM, Triton X-100 al 10%

Regulador de solubilización 10X: 500 mM CAPS, pH 11.0

Regulador de diálisis 50X: Tris-HCl 1 M, pH 8.5

30% de N-laurilsarcosina - agregar como polvo (Sigma 61739-5G) 1M DTT

Glutatión reducido (Novagen 3541)

Glutatión oxidado (Novagen 3542)

A. Lisis celular y preparación de cuerpos de inclusión

• Descongelar y volver a suspender el sedimento celular en 30 ml de regulador de lavado 1X. Mezclar según sea necesario para la resuspensión completa.

• Agregar inhibidores de proteasa (25 ul de 10X por 50 ml), DNasa (200 ul de 1 mg/ml por 50 ml) y MgCh (500 ul de 1 M por 50 ml) a la suspensión.

• Someter a lisis las células por sonicación.

a. Enfriar las células en hielo durante este paso.

b. Usando la punta cuadrada, someter a sonicación durante 30 segundos en el nivel 6, 10 veces hasta que la suspensión se volver menos viscosa. Dejar que la suspensión se enfríe en hielo durante 60 segundos entre cada sonicación. Mantener un volumen no superior a 40 ml en un tubo cónico de 50 ml al someter a sonicación.

• Cuando esté completo, transferir cada suspensión a botellas de centrífuga de cuello angulado de 250 ml para usar con el rotor F-16/250.

• Recoger los cuerpos de inclusión por centrifugación a 10.000 x g durante 12 minutos.

• Retirar el sobrenadante (guardar una muestra para el análisis de la proteína soluble) y volver a suspender completamente el sedimento en 30 ml de regulador de lavado 1X.

• Repetir la centrifugación como en el paso 4 y guardar el sedimento.

• Nuevamente, volver a suspender completamente el sedimento en 30 ml de regulador de lavado 1X.

• Recoger los cuerpos de inclusión por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y eliminar los últimos restos de líquido golpeando el tubo invertido sobre una toalla de papel.

B. Solubilización y replegamiento.

• A partir del peso húmedo de los cuerpos de inclusión a procesar, calcular la cantidad de regulador de solubilización 1X necesaria para resuspender los cuerpos de inclusión a una concentración de 10-15 mg/ml. Si el volumen calculado es superior a 250 ml, usar 250 ml.

• A temperatura ambiente, preparar el volumen calculado de regulador de solubilización 1X suplementado con 0.3% de N-laurilsarcosina (se puede usar hasta 2% si es necesario para una mayor optimización) (300 mg/100 ml de regulador) y 1 mM de Dt T.

• Agregar la cantidad calculada de regulador de solubilización 1X del paso 2 a los cuerpos de inclusión y mezclar suavemente. Los desechos grandes se pueden romper por pipeteo repetido.

• Incubar con agitador en refrigeración a 25°C, 50-100 rpm durante 4-5 horas.

• Aclarar por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

C. Protocolo de diálisis para el replegamiento de proteínas

• Preparar el volumen requerido de regulador para la diálisis de proteínas solubilizadas. La diálisis debe realizarse con al menos 2 cambios de regulador de más de 50 veces el volumen de la muestra.

• Diluir el regulador de diálisis 50X a 1X en el volumen deseado y complementar con DTT 0.1 mM.

• Dializar durante al menos 4 horas a 4°C. Cambia el regulador y continúa. Dializar por 4 o más horas adicionales.

• Preparar un regulador de diálisis adicional como se determina en el paso 1, pero omita la DTT.

• Continuar la diálisis a través de dos cambios adicionales (minutos 4 horas cada uno), con el regulador de diálisis sin DTT.

D. Regulador de redoblamiento rédox para promover Formación de enlace disulfuro B

• Preparar un regulador de diálisis que contenga glutatión reducido 1 mM (1.2 g/4L) y glutatión oxidado 0.2 mM (0.48 g/4l) en regulador de diálisis 1X. El volumen debe ser 25 veces mayor que el volumen de la muestra de proteína solubilizada. Enfriar a 4°C.

• Dializar la proteína replegada del paso 1 durante la noche a 4°C.

Materiales para purificación

Todos los procedimientos se realizan a 4°C.

Productos químicos:

Clorhidrato de Trizma (Sigma T5941-500G)

Solución de cloruro de sodio 5M (Sigma S6546-4L)

Hidróxido de sodio 10 N (JT Baker 5674-02)

E. Purificación en la columna aniónica DEAE HiPrep 16/10-20 ml (GE Healthcare)

Regulador A: 50 mM Tris-HCL pH 8.0

Regulador B: Tris-HCL 50 mM con NaCl 1M pH 8.0

Equilibrio de columna: Regulador A- 5CV, Regulador B- 5CV, Regulador A- 10CV

• Cargar 50 ml de muestra por análisis en una columna de 20 ml a 2.0 ml/min (NRG-156 (EGF-Id) está en el flujo).

• Lavar la columna de 20 ml con 5CV de regulador A

Columna de 20 ml con gradiente al 100% de B con 5CV. Esto es para eluir contaminantes.

• Limpiar con 10CV de 100% de regulador B.

• Equilibrar con 15CV de regulador A

• Analizar fracciones con una mancha plateada SDS-page

• Reunir fracciones con NRG-156Q (10kDa)

F. Concentración de NRG-156 (EGF-Id)

• Concentrado con concentrador Millipore Centriprep 3000 MWCO 15 ml (Ultracel YM-3, 4320)

• Utilizar el ensayo modificado de proteínas Lowry para determinar la concentración.

G. Eliminación de His-Tag

La eliminación de la etiqueta His se realiza con un kit de captura de escisión de trombina de Novagen (Cat# 69022-3). Según las pruebas anteriores, las mejores condiciones son temperatura ambiente durante 4 horas con trombina a 0.005 U de enzima por |jl por cada 10 |jg de proteína NRG-156Q (EGF-Id). Después de cuatro horas de incubación, agregar 16 j l de suspensión de estreptavidina agarosa por unidad de enzima trombina. Agitar la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Recuperar el NRG-156Q mediante filtración por rotación o filtración estéril (según el volumen). La escisión completa se determina con un EGF y Anti-His Western.

H. Almacenamiento en el regulador final

Almacenado en 1 X PBS con 0.2% de BSA a 4°C.

Expresión y purificación de GGF2

Para la información de clonación y antecedentes para GGF2, véase USPN 5,530,109. La línea celular se describe en USPN 6,051,401. El contenido completo de cada una de las USPN 5,530,109 y USPN 6,051,401.

Línea celular CHO-(Alpha2HSG)-GGF: Esta línea celular fue diseñada para producir cantidades suficientes de fetuina (alpha2HSG humano) para soportar altas tasas de producción de rhGGF2 en condiciones libres de suero.

Las células Cho (dhfr-) se transfectaron con el vector de expresión que se muestra a continuación (pSV-AHSG). Se cultivaron células estables bajo selección con ampicilina. Se designó la línea celular (dhfr-/a2HSGP). Las células dhfr-/a2HSGP se transfectaron luego con el vector pCMGGF2 que se muestra a continuación que contiene la secuencia de codificación para GGF2 humano usando el reactivo lípido catiónico DMRIE-C (Life Technologies #10459-014).

Se obtuvieron líneas celulares estables y de alta producción bajo protocolos estándar usando metotrexato (100 nM, 200 nM, 400 nM, 1 |j M) a intervalos de 4-6 semanas. Las células se independizaron gradualmente de los medios que contenían suero. Los clones se aislaron mediante metodologías estándar de dilución limitante. Los detalles de los requisitos de los medios se encuentran en los informes mencionados anteriormente.

Para mejorar la transcripción, la secuencia de codificación de GGF2 se colocó después de la secuencia intermedia de EBV BMLF-1 (MIS). Véanse diagramas a continuación.

Secuencia MIS (SEQ ID NO: 20)

CGATfAACTACCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG

(flTAAGAAGCTACACCGGCCAGTGGCCGGGGCC

CGATAACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG(GTAAGAAGCTACACCGGCC

AGTGGCCGGGGCC

GTGGAGCCGGGGCCATCCGGTGCCTGAGACAGAGGTGCTCAAGGCAGTCTCCACCTTTT

GTCTCCCCTCTGCAG) AGAGCCACATTCTGGAA] GTT

Secuencia de codificación GGF2 (SEQ ID NO: 1)

atgagatgg cgacgcgccc cgcgccgctc cgggcgtccc

301 ggcccccggg cccagcgccc cggctccgcc gcccgctcgt cgccgccgct gccgctgctg

361 ccactactgc tgctgctggg gaccgcggcc ctggcgccgg gggcggcggc cggcaacgag

421 gcggctcccg cgggggcctc ggtgtgctac tcgtccccgc ccagcgtggg atcggtgcag

481 gagctagctc agcgcgccgc ggtggtgatc gagggaaagg tgcacccgca gcggcggcag

541 cagggggcac tcgacaggaa ggcggcggcg gcggcgggcg aggcaggggc gtggggcggc

601 gatcgcgagc cgccagccgc gggcccacgg gcgctggggc cgcccgccga ggagccgctg

661 ctcgccgcca acgggaccgt gccctcttgg cccaccgccc cggtgcccag cgccggcgag

721 cccggggagg aggcgcccta tctggtgaag gtgcaccagg tgtgggcggt gaaagccggg

781 ggcttgaaga aggactcgct gctcaccgtg cgcctgggga cctggggcca ccccgccttc

841 ccctcctgcg ggaggctcaa ggaggacagc aggtacatct tcttcatgga gcccgacgcc

901 aacagcacca gccgcgcgcc ggccgccttc cgagcctctt tcccccctct ggagacgggc

961 cggaacctca agaaggaggt cagccgggtg ctgtgcaagc ggtgcgcctt gcctccccaa 1021 ttgaaagaga tgaaaagcca ggaatcggct gcaggttcca aactagtcct tcggtgtgaa 1081 accagttctg aatactcctc tctcagattc aagtggttca agaatgggaa tgaattgaat 1141 cgaaaaaaca aacc.acaaaa tatcaagata caaaaaaagc cagggaagtc agaacttcgc 1201 attaacaaag catcactggc tgattctgga gagtatatgt gcaaagtgat cagcaaatta 1261 ggaaatgaca gtgcctctgc caatatcacc atcgtggaat caaacgctac atctacatcc 1321 accactggga caagccatct tgtaaaatgt gcggagaagg agaaaacttt ctgtgtgaat 1381 ggaggggagt gcttcatggt gaaagacctt tcaaacccct cgagatactt gtgcaagtgc 1441 ccaaatgagt ttactggtga tcgctgccaa aactacgtaa tggccagctt ctacagtacg 1501 tccactccct ttctgtctct gcctgaatag

Secuencia de proteínas GGF2 (SEQ ID NO: 2) -MRWRRAPRRSGRPGPRAQRPGSAARSSPPLPLLPLLLLLGTAAL APGAAAGNEAAPAGASVCYSSPPSVGSVQELAQRAAVVIEGKVHPQRRQQGALDRKAA AAAGEAGAWGGDREPPAAGPRALGPPAEEPLLAANGTVPSWPTAPVPSAGEPGEEAPY LVKVHQVWAVKAGGLKKDSLLTVRLGTWGHPAFPSCGRLKEDSRYIFFMEPDANSTSR APAAFRASFPPLETGRNLKKEVSRVLCKRCALPPQLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSS EYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLG NDSASANITIVESNATSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCK CPNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPE

Producción de GGF2: Se descongeló un vial de GGF2 a 2.2 x 106 células/ml en 100 ml de Medio 1 de Acorda (véase la Tabla 3) y se expandió hasta alcanzar cantidades suficientes para los recipientes de producción de semillas. Las células se inocularon en los medios de producción Acorda Medium 2 (véase la Tabla 4) a 1.0 x 105 células/ml en botellas para rodillos ventilados de dos litros. Las botellas para rodillo se mantienen a 37°C durante 5 días y luego se reducen a 27°C durante 26 días. Las botellas para rodillos se controlan en cuanto a recuento celular y la apariencia general, pero no reciben alimento. Una vez que la viabilidad es inferior al 10%, las células se extienden y los medios acondicionados se recogen y se filtran en esterilidad.

Tabla 3: Medio 1

Tabla 4: Medio 2

Protocolo de purificación para GGF2

Todos los procedimientos se realizan a 4°C.

Productos químicos:

Acetato de sodio

Ácido acético glacial (para ajuste de pH)

NaOH 10N (para ajuste de pH)

NaCl

Sulfato de sodio

L-Arginina (JT Baker cat #: 2066-06)

Manitol (JT Baker cat #: 2553-01)

Material de partida: Sobrenadante de medio acondicionado. Ajustar el pH a 6.5.Paso 1:

Captura- Cromatografía de intercambio catiónico

HiPrep SP 16/10 (Amersham Biosciences)

Equilibrio de columna: Regulador A - 5CV, regulador B - 5CV, regulador 15% B - 5CV

Regulador A: Acetato de Na 20 mM, pH 6.0

Regulador B: Acetato de Na 20 mM, pH 6.0, 1M NaCl

Cargar la muestra a 2 ml/min con una carga continua durante la noche si es posible. La unión es mejor con carga continua.

Capacidad máxima para una muestra inicial: 5 mg de GGF2/ml de medio

Velocidad de flujo: 3 ml/min

Primer lavado: 15% B, 10CV

Segundo lavado: 35% B, 10CV

Elución de GGF2: 60% B, 8CV

Lavado de columna: 100% B, 8CV

Paso 2:

Refinamiento - Cromatografía de filtración en gel

Sephacryl S200 26/60

Regulador de elución:

Acetato de Na 20 mM, Sulfato de sodio 100 mM, manitol al 1%.

L-Arginina 10 mM, pH 6.5

Regulador de conductividad:

Muestra: Conjunto de elución SP GGF2 concentrado hasta ~ AU280 1.0

Velocidad de flujo: 1.3 ml/min.

Pico de elución: a ~ 0.36CV desde el inicio de la inyección

Paso 3: Eliminación de ADN y endotoxinas: filtración a través de la membrana Intercept Q.

Regulador de preequilibrio:

Acetato de Na 20 mM, Sulfato de sodio 100 mM, manitol al 1%,

L-Arginina 10 mM, pH 6.5

Recoge el flujo a través

Paso 4: Formulación final y preparación de la muestra

Agregar L-Arginina 90 mM adicional a la muestra

Concentrado

Filtración estéril

El artículo de vehículo/control utilizado en este documento es 0.2% de albúmina de suero bovino (BSA), fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.6.

Se usan cepas de ratas CD®IGS [Crl:CD®(SD)/MYOINFARCT] y Naive Sprague Dawley en el presente documento. Estas cepas fueron adquiridas de Charles River Laboratories. Los animales de prueba tienen aproximadamente 6-7 semanas de edad al llegar y pesan aproximadamente 160-200 g, en el momento del procedimiento quirúrgico. El rango real puede variar y está documentado en los datos.

Todos los animales ingenuos Sprague Dawley recibidos fueron puestos en estudio y asignados al Grupo 1. Los animales considerados adecuados para el estudio fueron pesados antes del tratamiento.

Todos los animales CD®IGS [Crl: CD®(SD)/MYOINFARCT] recibidos se aleatorizaron en grupos de tratamiento (Grupos 2-5) usando un procedimiento de aleatorización simple basado en la Fracción de Eyección calculada de los exámenes ecocardiográficos realizados el día 7 después de la cirugía procedimiento realizado en Charles River Laboratories. Se realizó una aleatorización simple para dar como resultado que cada grupo de tratamiento (Grupos 2­ 5) constara de un número aplicable de animales que resultara en una Fracción de Eyección media del grupo aproximadamente igual (± 3%) en el Grupo 2-5.

Todos los animales en el Grupo 2-6 se aclimataron en Charles River Laboratories de acuerdo con los Procedimientos Operativos Estándar de ese laboratorio. Los animales fueron aleatorizados posteriormente en grupos de tratamiento. Todos los animales ingenuos en el Grupo 1 se aclimataron durante aproximadamente 24 horas después de la recepción antes de sus exámenes ecocardiográficos primarios.

Los animales se alojaron individualmente en jaulas suspendidas de acero inoxidable, tipo malla de alambre, en general no se usaron jaulas de fondo sólido porque los roedores son coprofágicos y la ingestión de heces que contienen artículos de prueba excretados y productos metabólicos o la ingestión del lecho en sí mismo podría confundir la interpretación de los resultados en este estudio de toxicidad.

Se proporcionó iluminación fluorescente a través de un temporizador automático durante aproximadamente 12 horas por día. En ocasiones, el ciclo oscuro se interrumpió de manera intermitente debido a actividades relacionadas con el estudio. La temperatura y la humedad se monitorearon y registraron diariamente y se mantuvieron en la máxima medida posible entre 64 a 79°F y 30 a 70%, respectivamente.

La dieta basal era la dieta de roedores con certificación Lab Diet® Block #5002, PMI Nutrition International, Inc. Esta dieta estaba disponible ad libitum a menos que se indique lo contrario. Cada número de lote utilizado se identificó en los registros del estudio. Se suministró agua del grifo ad libitum a todos los animales mediante un sistema de agua automático a menos que se indique lo contrario.

Diseños de estudio

Tabla 5: Fragmento GGF2 versus EGF-Id (Liu et al., 2006) Dosificado durante 10 días a partir del día 7 después de

LAD

Tabla 6: Dosis más altas de GGF2 en comparación con EGF-Id y EGF-Ig dosificadas durante 20 días a partir del día 7 después de LAD. Lavado de 10 días.

Tabla 7: Frecuencia de dosis de GGF2

Tabla 8: GGF2 con y sin BSA

Prueba y administración de artículos de control

Ruta de administración

Los artículos de prueba y control se administraron por inyección intravenosa. Los animales asignados al Grupo 1 no fueron tratados con vehículo o artículos de prueba; estos animales sirvieron como controles de la misma edad sin tratamiento. La frecuencia, la duración y la dosis de administración fueron como se describe en las Tablas 5-8. El volumen de la dosis fue de aproximadamente 1 ml por kg.

Prueba de administración de artículos

Los artículos de prueba y control se administraron a través de la vena de la cola. Las dosis individuales se basaron en los pesos corporales más recientes. La dosis se administró mediante inyección en bolo, a menos que el Patrocinador indique lo contrario.

Preparación del sistema de prueba

Procedimiento quirúrgico: Ligadura de la arteria descendente anterior izquierda

Los procedimientos quirúrgicos se realizaron en Charles River Laboratories como se describe en Charles River Laboratories Surgical Capabilities Reference Paper, vol. 13, No.1, 2005. En resumen, se hace una incisión craneocaudal en el pecho, ligeramente a la izquierda del esternón, a través de la piel y los músculos pectorales. Las costillas tercera y cuarta son transectadas, y los músculos intercostales son disecados romos. La cavidad torácica es penetrada rápidamente y el pericardio se abre por completo. El corazón se exterioriza a través de la incisión. Se identifican el cono pulmonar y la aurícula izquierda. Se usa una pequeña aguja curva para pasar una pieza de sutura de seda 5-0 debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. La ligadura es atada y el corazón se reubica en el tórax. El aire en la cavidad torácica se expulsa suavemente mientras se cierra la pared torácica y la incisión en la piel. El animal se resucita usando ventilación con presión positiva y se coloca en un ambiente rico en oxígeno. Recuperación postoperatoria

Charles River Laboratories realizó la monitorización postoperatoria a corto plazo y la administración de analgésicos apropiados tal como se describe en Charles River Laboratories Surgical Capabilities Reference Paper, vol. 13, No. 1, 2005.

Se realizó un seguimiento postoperatorio a largo plazo para evaluar a los animales en busca de signos de dolor o infección. Las observaciones diarias del sitio de la incisión continuaron durante 7 días después de la recepción de los animales. Se administraron tratamiento complementario del dolor y terapia antimicrobiana según fuera necesario.

Evaluaciones de estudio antemortem

Observaciones en jaula

Se observó a todos los animales al menos dos veces al día en busca de morbilidad, mortalidad, lesiones y disponibilidad de alimentos y agua. Se identificó cualquier animal con mala salud para monitorización adicional y posible eutanasia.

Pesos corporales

Se midieron y registraron los pesos corporales al menos una vez antes de la aleatorización y semanalmente durante el estudio.

Consumo de alimento

No se midió el consumo de alimento, pero se documentó la inapetencia.

Exámenes ecocardiográficos

Se realizaron exámenes ecocardiográficos en todos los animales asignados al Grupo 1 el día 1, 12, 22 y el día 32 después de la recepción (día 0). Los exámenes ecocardiográficos se realizaron en todos los animales asignados al Grupo 2-5 los días 7, 18, 28 y el día 38 después del procedimiento quirúrgico realizado en Charles River Laboratories (Día 0).

Para el examen ecocardiográfico, cada animal se anestesió de acuerdo con la Tabla 5 y se afeitó el pelo del tórax. Se aplicó gel de acoplamiento al transductor ecocardiográfico y se obtuvo una imagen para medir la función cardíaca a múltiples niveles. Se obtuvieron imágenes para cada animal en visión de eje corto (a nivel papilar medio u otro, según la ubicación del área de infarto observada por ecocardiografía).

Parámetros ecocardiográficos

Se tomaron imágenes de ECHO a nivel del músculo papilar medio, u otro dependiendo de la ubicación del área de infarto observada por ecocardiografía, del ventrículo izquierdo. Las imágenes en modo M y 2D fueron grabadas y almacenadas en CD y/o MOD. Los parámetros de medición obtenidos con ECHO incluyen: grosor de la pared septal intraventricular (diástole); unidades = cm; Espesor de la pared septal intraventricular (sístole); unidades = cm; Dimensión interna ventricular izquierda (diástole); unidades = cm; Dimensión interna ventricular izquierda (sístole); unidades = cm; Grosor de la pared papilar ventricular izquierda (diástole); unidades = cm; Grosor de la pared papilar ventricular izquierda (sístole); unidades = cm; Fin del volumen diastólico; unidades = ml; Fin del volumen sistólico; unidades = ml; Fracción de eyección; reportado como un porcentaje; Volumen sistólico; unidades = ml; y porcentaje de acortamiento fraccional; reportado como un porcentaje.

Eutanasia

Morbilidad

Cualquier animal moribundo, tal como se define mediante un Testing Facility Standard Operating Procedure, se sacrificó por razones humanitarias. Todos los animales sacrificados in extremis o encontrados muertos fueron sometidos a una necropsia de rutina.

Método de eutanasia

La eutanasia se realizó mediante inyección saturada de cloruro de potasio en la vena cava seguida de un método aprobado para asegurar la muerte, por ejemplo, desangrado.

Disposición final

Todos los animales supervivientes puestos en estudio fueron sacrificados en su necropsia programada o, si es necesario, sacrificados in extremis.

Resultados

Estudio 1 - El tratamiento de ratas con GGF2 a 0.625 mg/kg iv al día resultó en una mejora significativa de la función cardíaca como se muestra aquí por los cambios en la fracción de eyección y el acortamiento fraccional. El fragmento EGF-1d no dio como resultado el mismo grado de mejora. Véase tabla 5.

Estudio 2: El tratamiento de ratas con GGF2 a 0.625 y 3.25 mg/kg iv al día resultó en una mejora significativa de la función cardíaca como se muestra aquí por los cambios en la fracción de eyección y el acortamiento fraccional. También se observaron mejoras significativas en los volúmenes sistólicos y diastólicos finales durante el período de tratamiento. Véase tabla 6.

Resultados del estudio 3: El tratamiento de ratas con GGF2 3.25 mg/kg iv cada 24, 48 o 96 horas resultó en una mejora significativa de la función cardíaca como se muestra aquí por los cambios en la fracción de eyección y el acortamiento fraccional. También se observaron mejoras significativas en los volúmenes sistólicos y diastólicos finales durante el período de tratamiento. Véase tabla 7.

Informes anteriores (Liu et al) han demostrado que se requiere una proteína transportadora tal como BSA para una estabilidad y actividad óptimas de neurregulina. GGF2 ha demostrado estabilidad sin portadores como BSA. Este experimento fue diseñado para probar si GGF2 es estable y activa en un régimen terapéutico sin BSA. Después de 10 días de tratamiento, tanto las formulaciones de GGF2 que contienen BSA como las que no contienen BSA dieron como resultado mejoras en la fracción de eyección en comparación con los controles del vehículo similares a los observados en estudios anteriores. Por lo tanto, es evidente a partir de este estudio que no se requiere BSA u otra proteína transportadora en las formulaciones de GGF2 para el tratamiento de la CHF. Véase tabla.

Tabla 10: Hallazgos de patología

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que comprende un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (similar a EGF), en donde el péptido es neurregulina, para su uso en la reducción de los efectos secundarios debido a los niveles suprafisiológicos del péptido tras la administración mientras se trata o previene la insuficiencia cardíaca en un mamífero sobre un tiempo prolongado en donde una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho péptido se administra a un mamífero en un intervalo de al menos 96 horas, en donde dicha cantidad terapéuticamente efectiva es efectiva para tratar o prevenir la insuficiencia cardíaca en dicho mamífero.

2. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde dicha administración se realiza cada 96 horas.

3. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde dicha administración se realiza en un régimen seleccionado del grupo que consiste en cada: cuatro días, semana, 10 días, 14 días, mes, dos meses, tres meses o cuatro meses.

4. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde dicho mamífero es un humano.

5. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde dicho péptido es el factor de crecimiento glial humano recombinante 2 (GGF2).

6. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido es:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEE

l y q .

7. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido es:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEE LY.

8. El péptido para uso de la reivindicación 1, en donde dicho péptido es codificado por el gen neurregulina (NRG)-1, el gen neurregulina (NRG)-2, el gen neurregulina (NRG)-3 o el gen neurregulina (NRG)- 4.