ES2764110T3 - Conjugado anticuerpo-fármaco y su utilización para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Conjugado anticuerpo-fármaco y su utilización para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

Conjugado anticuerpo-fármaco de la fórmula (I) siguiente: Ab-(L-D)n (I) o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno o un fragmento de unión a [diana] del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo; L es un ligador de la fórmula (III) siguiente: **(Ver fórmula)** en el que L2 es cicloalquilo (C4-C10)-carbonilo, alquilo (C2-C6), alquilo (C2-C6)-carbonilo, W es una unidad de aminoácido; w es un número entero comprendido entre 0 y 5; Y es PAB-carbonilo con PAB siendo **(Ver fórmula)** y es 0 o 1; el asterisco indica el punto de fijación a D; la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab; D es una porción de fármaco de la fórmula (II) siguiente: **(Ver fórmula)** en el que: R1 es H u OH; R2 es un grupo: alquilo (C1-C6), COOH, COO-((alquilo(C1-C6)) o tiazolilo; R3 es H o un grupo alquilo (C1-C6); A es: - un grupo de la fórmula -Het-Alc- en el que Alc es un grupo alcanodiilo (C1-C8) y está ligado a NR3, y Het es un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C1-C6) y que contiene por lo menos un átomo de nitrógeno, estando dicho átomo de nitrógeno ligado a L, o - un grupo de la fórmula -Aa-Ab- en el que Aa está ligado a L y es O o NR9 con R9 siendo H o alquilo (C1-C6) y Ab está ligado a NR3 y es: - un grupo alcanodiilo (C1-C8), - un grupo -(CH2CH2X1)a1(CH2CH2X2)a2(CH2CH2X3)a3(CH2CH2X4)a4CH2CH2- con X1, X2, X3 y X4 cada uno representando independientemente entre sí O o NR8; a1, a2, a3 y a4 cada uno representando independientemente entre sí 0 o 1; y R8 representando H o un grupo alquilo (C1-C6), - un grupo arilo-alcanodiilo (C1-C8), o heterociclo-alcanodiilo (C1-C8), siendo dicho grupo sustituido opcionalmente por un grupo alquilo (C1-C6), estando la porción heterociclilo o arilo ligadas a Aa y la porción alcanodiilo (C1-C8) ligada a NR3; la línea ondulada indica el punto de fijación a L; y n es 1 a 12.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugado anticuerpo-fármaco y su utilización para el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco. A partir de un aspecto, la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo apto para unirse a una diana, estando dicho anticuerpo conjugado a por lo menos un fármaco seleccionado de entre derivados de dolastatina 10 y auristatinas. La invención asimismo comprende dicho conjugado anticuerpo-fármaco para su utilización en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) o conjugado y su utilización para el tratamiento contra el cáncer.
Los ADC combinan la especificidad de unión de un anticuerpo con la potencia de los fármacos como, por ejemplo, agentes citotóxicos. La tecnología asociada con el desarrollo de anticuerpos monoclonales, el uso de medicamentos más eficaces y el diseño de ligadores químicos para enlazar covalentemente estos componentes ha progresado rápidamente en los últimos años.
El uso de los ADC permite la administración local de fármacos que, si se administran como fármacos no conjugados, puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad para las células normales.
Es decir, se busca así una máxima eficacia con mínima toxicidad. Los esfuerzos para diseñar y perfeccionar el ADC se han centrado en la selectividad del anticuerpo así como el mecanismo de acción del fármaco, unión a fármacos, proporción fármaco/anticuerpo (recarga o DAR) y propiedades de liberación del fármaco. Las moléculas del fármaco pueden conferir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen el agrupamiento de tubulina, unión al ADN, proteasoma, anomalía de la función del ribosoma, inhibición de proteosíntesis y/o topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a un anticuerpo de gran tamaño.
Cada anticuerpo se debe caracterizar por separado, con un ligador apropiado que haya sido diseñado, y un agente citotóxico adecuado que haya sido identificado para que mantenga su potencia al momento de su administración a las células tumorales. Se debe considerar la densidad del antígeno en el cáncer diana y si los tejidos normales expresan el antígeno diana. Otras consideraciones incluyen si todo el ADC es internalizado al momento de la unión con la diana; si un fármaco citotóxico o citostático es preferible al considerar la posible exposición del tejido normal y/o el tipo y etapa del cáncer que se somete a tratamiento; y, si el ligador que conecta el anticuerpo a la carga del fármaco es un enlace escindible o no escindible. Además, la proporción de la conjugación del anticuerpo con respecto a la porción de fármaco debe ser suficiente sin comprometer la actividad de unión del anticuerpo y la potencia del fármaco y sin modificar las propiedades fisicoquímicas del ADC resultando en agregación o propiedades perjudiciales con respecto al futuro proceso de desarrollo del compuesto.
Los ADC que comprenden MMAE o MMAF se describen particularmente en: los documentos US 2009/0098115; EP 2589609; WO 2013/185115; Alley et al. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 759-765; Li et al. Mol. Cancer Ther.
2013, 12(7), 1255-1265; Gerber et al. Blood 2009, 113(18), 43524361; Law et al. Clinical Cancer Research 2004, 10, 7842-7851; Poison et al. Blood 2007, 110(2), 616-623; Fransisco et al. Blood 2003, 102(4), 1458-1465; y Doronina et al. Nature Biotechnology 2003, 21(7), 778-784.
Un ADC es una molécula biológica compleja y los desafíos para el desarrollo de un ADC eficaz siguen siendo un importante problema.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco de la siguiente fórmula (I):
Ab-(L-D)n (I)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno o un fragmento de unión a [diana] del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
L es un ligador (III);
Figure imgf000003_0001
en donde
L2 es cicloalquil-carbonilo (C4-C10), alquilo (C2-C6), alquil-carbonilo (C2-C6),
W es una unidad de aminoácido; w es un número entero comprendido entre 0 y 5;
Y es PAB-carbonilo siendo PAB
Figure imgf000003_0002
y es 0 o 1;
el asterisco indica el punto de fijación a D; y
la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.
D es una porción de fármaco de la siguiente fórmula (II):
Figure imgf000003_0003
en donde:
Ri es H u OH;
R2 es un grupo: alquilo de (C1-C 6), COOH, COO-(alquilo(Ci-C6)) o tiazolilo;
R3 es H o un grupo alquilo (C1-C6);
A es:
■ un grupo de la fórmula -Het-Alc -donde Alc es un grupo alcanodiilo (C1-C8) y está ligado a NR3, y Het es un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C1-C6) y que contiene por lo menos un átomo de nitrógeno, el átomo de nitrógeno está ligado a L, o
■ un grupo de la fórmula -Aa-Ab- en donde Aa es ligado a L y es O u NRg con Rg siendo H o alquilo (Ci­ Ca) y Ab está ligado a NR3 y es:
- un grupo alcanodiilo(Ci-C8),
- un grupo -(CH2CH2Xi)ai(CH2CH2X2)a2(CH2CH2Xg)a3(CH2CH2X4)a4CH2CH2- con Xi, X2, X3 y X4 cada uno representando indistintamente entre sí a O u NR8; ai, a2, a3 y a4 cada uno representando indistintamente entre sí a 0 o i; y R8 representando H o un grupo alquilo (Ci-Ca),
- un grupo arilo-alcanodiilo(Ci-C8) o heterociclo-alcanodiilo(Ci-C8), el grupo se sustituye opcionalmente por un grupo alquilo(Ci-Ca), la porción arilo o heterocicli están ligadas a Aa y la porción alcanodiilo (Ci-C8) se liga a NR3;
la línea ondulada indica el punto de unión a L; y
n presenta un valor de i a i2.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco según la invención, en el que se selecciona la [diana] o el antígeno de dicho anticuerpo de [diana] o anticuerpo de antígeno según la invención, o un fragmento de unión a [diana] o a antígeno del mismo, de entre CDi9, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CDi05, CDi38, CDi74, CD205, CD227, CD326, CD340 , GPNMB, PSMA, MUCi6, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina av, Mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4, HERi, HER3, HER2, IGF-iR, Axl y su fragmento de la membrana extracelular (ECD).
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco, en el que la [diana] o el antígeno de dicho anticuerpo de [diana] o anticuerpo de antígeno según la invención, o un fragmento de unión a [diana] o a antígeno del mismo, se selecciona de entre HER2, IGF-iR y la proteína Axl, preferentemente a partir de HER2 de humano, IGF-iR de humano y la proteína humana Axl, y su fragmento de membrana extracelular (ECD).
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en el que Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse al IGF-iR humano seleccionado de entre:
i) los anticuerpos 208F2, 2 i2 A ii, 2i4F8, 2i9D6 y 2 i3Bi0;
ii) los anticuerpos que compiten por la unión a IGF-iR con los anticuerpos de i); y
iii) los anticuerpos que se unen al mismo epítopo de IGF-iR como los anticuerpos de i).
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse al IGF-iR humano seleccionado de entre:
i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° i, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 4, 5 y 6;
ii) un anticuerpo que compite por la unión a IGF-iR con el anticuerpo de i); y
iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de IGF-iR como el anticuerpo de i);
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde Ab es un anticuerpo que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en donde dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos i retromutación seleccionada a partir de los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 6 i, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95; y
b) un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en donde la secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos i retromutación seleccionada a partir de los residuos 22, 53, 55, 65, 7 i, 72, 77 u 87.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a la proteína Axl de humano seleccionada a partir de:
i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 59, 60 y 61 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 56, 57 y 58;
ii) un anticuerpo que compite por la unión a Axl con el anticuerpo de i); y
iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de Axl como el anticuerpo de i);
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse al HER2 humano, que preferentemente consiste en Trastuzumab.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde L2 presenta la siguiente fórmula:
Figure imgf000005_0001
en donde
el asterisco indica el punto de unión a (W)w; y
la línea ondulada indica el punto de fijación al átomo de nitrógeno de la porción maleimida.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde w = 0 o w = 2 y entonces (W)w se selecciona a partir de:
Figure imgf000005_0002
en donde
el asterisco indica el punto de unión a (Y)y; y
la línea ondulada indica el punto de unión a L2.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde L se selecciona a partir de:
Figure imgf000006_0001
en donde el asterisco indica el punto de fijación a D, y la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde A es un grupo de la fórmula -Aa-Ab- en la que Aa es como se define según la reivindicación 1 y Ab es un grupo:
■ fenil-alcanodiilo(Ci-C2), o
■ heterociclo-(Ci-C2)alcanodiilo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo(Ci-Ca) (especialmente no sustituido), el heterociclo es un anillo saturado, insaturado o aromático con 5 o 6 miembros que comprende 1 o 2 átomos de nitrógeno, seleccionados particularmente entre piridina, piperidina e imidazol, y es preferentemente una piridina.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde A es un grupo de la siguiente fórmula:
en donde:
Rg es como se define en la reivindicación 1, y m es un entero comprendido entre 1 y 8 y preferentemente donde Rg = H o Me y m = 1 o 2,
la línea ondulada indica el punto de unión a L; y
El asterisco indica el punto de unión a NR3.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, en donde (L-D) se seleccionan a partir de:
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
en donde la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, que presenta la fórmula seleccionada a partir de:
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
(Ab-F-62)
Figure imgf000013_0001
y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo,
en donde Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno o un fragmento de unión a [diana] del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
En una forma de realización, y según la invención, dicho Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno o un fragmento de unión a [diana] del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicha/o [diana] o antígeno se selecciona a partir de CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340 , GPNMB, PSMA, MUC16, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina av, Mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4, HER1, HER3, HER2, IGF-1R, Axl y su fragmento de la membrana extracelular (ECD).
En una forma de realización, y según la invención, dicho Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno, o un fragmento de unión a [diana] o a antígeno del mismo, en donde el antígeno o la [diana] se seleccionan a partir de HER2, IGF-1R y la proteína Axl, preferentemente a partir de HER2 de humano, IGF-1R de humano y la proteína humana Axl, y su fragmento de membrana extracelular (ECD).
En una forma de realización y según la invención, el Ab es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y se selecciona a partir de:
a) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse al IGF-1R humano seleccionado de entre:
i) los anticuerpos 208F2, 212A11,214F8, 219D6 y 213B10;
ii) los anticuerpos que compiten por la unión a IGF-1R con los anticuerpos de i); y
iii) los anticuerpos que se unen al mismo epítopo de IGF-1R como los anticuerpos de i).
b) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse al IGF-1R humano seleccionado de entre:
i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 1, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 4, 5 y 6;
ii) un anticuerpo que compite por la unión a IGF-1R con el anticuerpo de i); y
iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de IGF-1R como el anticuerpo de i),
c) un Ab que comprende:
i) un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en donde dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada a partir de los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95; y
ii) un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en donde la secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada a partir de los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 u 87,
d) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a la proteína Axl de humano seleccionada a partir de:
i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 59, 60 y 61 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 56, 57 y 58;
ii) un anticuerpo que compite por la unión a Axl con el anticuerpo de i); y
iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de Axl como el anticuerpo de i), y
e) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a HER2 humano, que preferentemente consiste en Trastuzumab o Pertuzumab.
En una forma de realización, y según la invención, n es 2 o n es 4.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la presente invención para su uso como un medicamento.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende por lo menos un conjugado anticuerpo-fármaco según la presente invención.
En una forma de realización, la composición según la presente invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una composición según la presente invención para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa una [diana] o un antígeno, la [diana] o el antígeno se seleccionan preferentemente de CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B , TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina av, Mesothelin, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4, HERI, HER3, HER2, IGF-1R, Axl y su fragmento de membrana extracelular (ECD), más preferentemente de HER2, IGF-1R y la proteína Axl, asimismo más preferentemente de HER2 humano, IGF-lR humano y la proteína Axl humana, y su fragmento de membrana extracelular (ECD).
En una forma de realización, el cáncer que expresa la [diana] o el antígeno es un cáncer seleccionado de entre cáncer de mama, de colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmonar, melanoma, osteosarcoma, ovárico, prostático, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo, uterino, cáncer endometrial, mesotelioma, carcinoma oral escamoso, sarcoma de Kaposi, leucemia aguda, carcinoma colorrectal, melanoma, adenocarcinoma ductal pancreático y cualquier cáncer resistente a los medicamentos.
La presente descripción describe asimismo un método para el tratamiento de un cáncer que expresa una [diana] 0 un antígeno en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz de por lo menos un conjugado anticuerpo-fármaco según la presente invención o de una composición según la presente invención.
Descripción detallada de la invención
1 - El anticuerpo (Ab)
Los términos "anticuerpo", "anticuerpos", "ab", "MAb" o "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos aislados, manipulados mediante ingeniería genética, o recombinantes (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de cadena completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y asimismo fragmentos de anticuerpos de los mismos, siempre que muestren la actividad biológica deseada. En una forma de realización, el anticuerpo de la invención consiste en un anticuerpo recombinante. El término "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que resulta de la expresión de ADN recombinante en células vivas. Un anticuerpo recombinante de la invención se obtiene mediante métodos de laboratorio de recombinación genética, conocidos por el experto en la materia, creando secuencias de ADN que no se encuentran en organismos biológicos.
En otra forma de realización, el anticuerpo de la invención consiste en un anticuerpo químicamente sintetizado.
Más particularmente, dicha molécula consiste en una glucoproteína formada por por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región (o dominio) variable de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2, y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviado en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse aún más en las regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), entremezcladas con las regiones más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden intervenir en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos del hospedador o los factores, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento vía clásica.
Mediante el término "fragmento de unión a antígeno" o "fragmento de unión a diana" de un anticuerpo según la invención, se pretende hacer referencia a que cualquier péptido, polipéptido o proteína conserva la capacidad unirse a la diana (asimismo comúnmente conocido como antígeno) del anticuerpo y que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 40 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 60 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 70 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 200 residuos de aminoácidos contiguos o por lo menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido del anticuerpo.
En una forma de realización, se seleccionan tales "fragmentos de unión al antígeno" en el grupo formado por fragmentos Fv, scFv (sc para indicar que es monocatenario), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos o cualquier fragmento del que hubiera aumentado el tiempo de vida media por modificación química, como la adición de poli(alquilen)glicol como poli(etilen)glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados llamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" para indicar Poli(Etilen)Glicol), o mediante incorporación en un liposoma, donde tales fragmentos presentan por lo menos una de las características CDR del anticuerpo según la invención. Preferentemente, tales "fragmentos de unión al antígeno" se constituirán o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual se deriva, tal secuencia parcial es suficiente para conservar la misma especificidad de unión del anticuerpo del cual se derivan y una afinidad suficiente, preferentemente de por lo menos igual a 1/100, más preferentemente por lo menos de 1/10 , de la afinidad del anticuerpo del cual se derivan, con respecto a la diana.
Mediante el término "unión", "se une" o lo similar, se pretende que el anticuerpo, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, forme un complejo con un antígeno que sea relativamente estable en condiciones fisiológicas. Una unión específica se caracteriza por una constante de disociación en equilibrio de por lo menos 1.10-6 M. Los métodos para la determinación de si dos moléculas se unen son bien conocidos en la técnica y son, por ejemplo, equilibrio dialítico, resonancia plasmónica superficial, ensayos radiomarcados y similares. Para evitar cualquier duda, no significa que dicho anticuerpo no se pudiera unirse o interferir, a un bajo nivel, con otro antígeno. Sin embargo, como una forma de realización preferida, dicho anticuerpo se une sólo a dicho antígeno. Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo de [diana]" debe ser interpretada como similar a "anticuerpo anti-[diana]" y significa un anticuerpo apto para unirse a la [diana].
La expresión "diana" o [diana] podrá ser interpretada como cualquier molécula presente en la superficie de células, las células tumorales preferentemente, más preferentemente células humanas y de mamíferos, y que puede utilizarse para el suministro de medicamentos. Preferentemente, la diana específicamente se expresa o sobreexpresa en la superficie de las células tumorales en comparación con las células normales.
Más particularmente, la diana puede seleccionarse a partir de CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina av, Mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4, HER1, HER3, HER2, IGF-1R o Axl (B.A. Teicher, Current Cancer Drug Targets, 2009, 9, 982-1004).
Como diana preferida, pueden ser mencionados HER2, IGF-1R y Axl, preferentemente HER2, IGF-1R y Axl de humano.
Como ejemplo no limitativo, la expresión “anticuerpo de HER2”, “anticuerpo IGF-1R” o “anticuerpo de Axl” debería interpretarse como similar a “anti-HER2 anticuerpo”, “anticuerpo anti-IGF-1R” o “anticuerpo de anti-Axl” y significa un anticuerpo capaz de la unión a HER2, IGF-1R o Axl, respectivamente.
En la presente solicitud, el epítopo del anticuerpo preferentemente se localiza en el dominio extracelular de la diana.
En una forma de realización particular, el anticuerpo o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, es apto para unirse a la diana con un EC50 comprendido entre 10.10-10 a 1x10-10, y más preferentemente entre 8x10-10 a 2x10"10
El término la mitad de concentración efectiva máxima (EC50) corresponde a la concentración de un fármaco, anticuerpo o compuesto tóxico que induce respuesta a mitad de camino entre el período inicial y máximo después de algún tiempo de exposición especificado. Comúnmente se usa como una medida de la potencia del fármaco. El EC50 de una curva de la respuesta a la dosis clasificada por lo tanto representa la concentración de un compuesto donde el 50% de su efecto máximo se observa. El EC50 de una curva de la respuesta a la dosis cuantal representa la concentración de un compuesto donde el 50% de la población muestra respuesta, después de la duración de exposición especificada. Las medidas de concentración por lo común siguen una curva sigmoidea, aumentando rápidamente sobre un relativamente cambio en la concentración. Esto puede determinarse matemáticamente por la derivación de la línea mejor y adecuada.
Como una forma de realización preferida, el EC50, determinado en la presente invención, caracteriza la potencia de anticuerpo para unirse a ECD diana expuesto en las células tumorales de humano. El parámetro EC50 se determina usando el análisis de FACS. El parámetro EC50 refleja la concentración del anticuerpo para la cual el 50% de la unión máxima en la diana humana expresado en células tumorales se obtiene. Cada valor de EC50 se calculó como el punto mediano de la curva de la respuesta a la dosis usando un programa de prueba de la curva de la regresión de cuatro parámetros (software del Prisma). Este parámetro se ha seleccionado para ser representativo de afecciones patológicas/fisiológicas.
El término "epítopo" es una región de un antígeno que es ligada por un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y presentan aquellos residuos que directamente contribuyen a la afinidad de la interacción. Los epítopos asimismo pueden ser estructurales, es decir compuestos de aminoácidos no lineales. En ciertas formas de realización, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas como aminoácidos, cadenas secundarias de azúcar, grupos fosforilo, o grupos del sulfonilo, y, en ciertas formas de realización, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de la carga específicas.
La competencia para unirse a la diana puede determinarse mediante cualquier método o métodos conocidos por el experto en la materia tal como, entre otras cosas, radiactividad, Biacore, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, citometría de flujo, etc. En cuanto a “que compite por unirse a la diana” se supone una competencia de por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente por lo menos 70%.
La determinación de la unión al mismo epítopo puede determinarse mediante cualquier método o métodos conocidos por el experto en la materia tal como, entre otras cosas en los ejemplos, radiactividad, Biacore, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, citometría de flujo. En cuanto a “que se unen con el mismo epítopo de la diana”, se supone una competencia de por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente por lo menos 70%.
Como se ha mencionado anteriormente, y al contrario del conocimiento general, la presente invención se concentra en anticuerpos específicos que presentan una elevada capacidad para interiorizarse tras su unión a la diana. Como se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo que “se interioriza” o esto “interiorizado” (las dos expresiones son similares) es el que se obtiene por (haciendo referencia a que “entra”) la célula tras la unión a la diana en una célula de mamífero. Un anticuerpo es interesante como parte del ADC, por tanto se encarga al citotóxico unido en células cancerosas dianizadas. Una vez interiorizado el citotóxico activa la muerte de célula neoplásica.
Se piensa que las claves importantes al éxito con el tratamiento ADC son la especificidad de antígeno diana y la incorporación de los complejos del anticuerpo del antígeno en células neoplásicas. Los antígenos obviamente no internalizantes son menos efectivos que los antígenos internalizantes que administran agentes citotóxicos. Los procesos de la incorporación son variables a través de antígenos y dependen de múltiples parámetros que pueden ser bajo la influencia de anticuerpos.
En el ADC, el citotóxico confiere la actividad citotóxica y el anticuerpo usado es responsable de la especificidad contra células neoplásicas, así como un vector para entrar dentro de las células para dirigir correctamente el citotóxico. Así para mejorar el ADC, el anticuerpo debe mostrar la elevada capacidad de interiorizar en células cancerosas diana. La eficacia de la incorporación regulada del anticuerpo se diferencia considerablemente según el epítopo dianizado. La selección de potentes anticuerpos internalizantes requiere diversos datos experimentales que estudian no sólo la regulación a la baja de diana pero asimismo tras la penetración del anticuerpo en las células.
En una forma de realización preferida, la incorporación del anticuerpo según la invención puede ser evaluada por inmunofluorescencia o FACS (Citometría de flujo) (como ejemplificado a continuación en la presente solicitud) o cualquier método o proceso conocido por el experto en la materia específico para el mecanismo de la incorporación. En una forma de realización preferida, el anticuerpo según la invención puede inducir la incorporación después de unirse a la diana por lo menos 30%, preferentemente 50% y más preferentemente 80%.
El complejo diana/anticuerpo se interioriza después de la unión del anticuerpo al ECD de dicha diana y una reducción de la cantidad de diana a la superficie de las células se induce. Esta reducción puede cuantificarse por cualquier método conocido por el experto en la materia (transferencia western, FACS, inmunofluorescencia, etc.). En una forma de realización, esta reducción, así reflejando la incorporación, puede ser preferentemente cuantificada por FACS y expresarse como la diferencia o delta entre la intensidad media de fluorescencia (MFI) cuantificada a 4°C con el m Fi cuantificado a 37°C después de incubación de 4 horas con el anticuerpo.
Como no ejemplo no limitativo, esta delta se determina basado en MFI obtenido con células no tratadas y células sometidas a tratamiento con el anticuerpo usando i) células neoplásicas, tal como por ejemplo MCF, 7 después de un período de incubación de 4 horas con el anticuerpo en la presente memoria descrito y ii) un anticuerpo secundario marcado por Alexa488. Este parámetro se define como calculado con la fórmula siguiente: A (MFU°c-MFI37°c). Otras formas de realización se detallarán en los siguientes ejemplos.
Esta diferencia entre MFI refleja la regulación a la baja de diana ya que MFI son proporcionales a la diana expresada en la superficie celular.
En un aspecto ventajoso, los anticuerpos consisten la provocación de anticuerpos, como un ejemplo, un A (MFI4°c-MFI37°c) en célula neoplásica, como el MCF-7, de por lo menos 280, preferentemente de por lo menos 400.
Con mayor detalle, la delta anteriormente mencionada puede cuantificarse según el siguiente proceso, que debe considerarse como un ejemplo ilustrativo y no limitativo:
a) El tratamiento y la incubación de células tumorales de interés con el anticuerpo de la invención en el frío (4°C) o en caliente (37°C) completan el medio de cultivo;
b) El tratamiento de las células tratadas de la etapa a) y, en paralelo, células no tratadas con un anticuerpo secundario;
c) Medición del MFI (representante de la cantidad de IGF-1R presente en la superficie) para las células tratadas y no tratadas con un anticuerpo marcado secundario capaz de unión al anticuerpo de la invención; y
d) Cálculo de la delta como la sustracción del MFI obtenido con las células tratadas del MFI obtenido con las células no tratadas.
De esta delta MFI, un porcentaje de la incorporación puede determinarse como: 100x (MFU°c-MFI37°c) / MFI 4°c. Los anticuerpos, según la invención, presentan, preferentemente, un porcentaje de la incorporación comprendido entre el 50% y el 99%, el 70% y el 90%, preferentemente entre el 75% y el 87%.
Una ventaja particular de los anticuerpos en la presente memoria descritos se basa en su tasa de la incorporación.
Es conocido generalmente que, para un ADC, se desea que los anticuerpos usados muestren una rápida tasa de la incorporación, preferentemente dentro de 24 horas de la administración del anticuerpo y, más preferentemente dentro de 12 horas y, incluso más preferentemente dentro de 6 horas.
En la presente invención, la tasa de la incorporación, a la que se hace referencia asimismo como la disminución de anticuerpo ligado a la superficie celular o el deterioro del anticuerpo de la superficie celular, se expresa como t1/2 (vida media) y corresponde como el período de tiempo necesario para obtener una disminución del 50% del AMFI (este aspecto claramente se entenderá haciendo referencia a los siguientes ejemplos).
Una ventaja particular consiste en que los anticuerpos de la invención hacen comprender un t1/2 entre 5 y 25 minutos, y preferentemente entre 10 y 20 minutos.
En la siguiente memoria descriptiva, se ejemplificarán dos dianas preferidas.
Para estas dos dianas preferidas, por “anticuerpo según la invención” o “anticuerpo de la invención” debe entenderse: “anticuerpo del ADC según la invención” o “anticuerpo del ADC de la invención” respectivamente. 1.1: anticuerpos IGF-1R
Una forma de realización particular de la invención se refiere a un ADC en donde el anticuerpo Ab comprende tres CDR de la cadena pesada con la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 2 y CDR-H3 de secuencia SeC ID n° 3, y tres CDR de la cadena ligera con CDR-L2 de secuencia SEC ID n° 5.
Una forma de realización particular de la invención se refiere a un ADC en donde el anticuerpo Ab comprende las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6.
Una forma de realización del ADC comprende un anticuerpo que comprende las tres CDR de la cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con s Ec ID n° 1, 2 y 3; y las tres CDR de la cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 4, 5 y 6.
En otra forma de realización, el anticuerpo o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6.
La enumeración exclusiva IMGT se ha definido para comparar los dominios variables cualquiera sea el receptor del antígeno, el tipo de la cadena o las especies [Lefranc, M. P, Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc, M.P, The Immunologist, 7 132-136 (1999) / Lefranc, M.P, Pommié, C., Ruiz, M, Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Touvenin-Contet, V y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la enumeración exclusiva IMGT, los aminoácidos conservados siempre presentan la misma ubicación, por ejemplo cisteína 23 (1er-CYS), triptófano 41 (CONSERVADO-TRP), aminoácido hidrofobo 89, cisteína 104 (2do-CYS), fenilananina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La enumeración exclusiva IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones base (FR1-IMGT: ubicaciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como las separaciones representan ubicaciones deshabitadas, las longitudes de la c DR-IMGT (representadas entre abrazaderas de soporte y separadas por puntos, por ejemplo [8.8.13]) resultan información crucial. La enumeración exclusiva IMGT se usa en representaciones gráficas 2d , designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M. P, Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. y Lefranc, M. P, Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M. P, T cell receptor and MHC structural data Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].
Debe apreciarse que, sin la especificación contradictoria en la presente memoria descriptiva, las regiones determinantes de complementariedad o CDR, significan las hiperregiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas como se ha definido según el sistema de numeración de IMGT
Sin embargo, las CDR asimismo pueden definirse según el sistema numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Department of Health and Human Services, NIH, 1991, y ediciones posteriores). Existen tres CDR de la cadena pesada y tres CDR de la cadena ligera. En la presente memoria, los términos “CDR” y “CDR” se utilizan para indicar, dependiendo del caso, uno o más, o incluso todas, de las regiones que contienen la mayoría de los residuos aminoacídicos responsables de la afinidad de unión del anticuerpo para el antígeno o epítopo que reconoce. A fin de simplificar la lectura de la presente solicitud, las CDR según Kabat no se definen. Sin embargo, sería obvio para el experto en la materia, usando la definición de las CDR según IMGT, definir las CDR según Kabat.
En el contexto de la presente invención, la “identidad” o “la identidad del porcentaje” entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos significan que el porcentaje de nucleótidos idénticos o residuos aminoacídicos entre las dos secuencias se compara, obtenido después de la alineación óptima, siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias distribuidas aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación de dos ácidos nucleicos o secuencias aminoacídicas es tradicionalmente llevada a cabo al comparar las secuencias después de haberlos alineado óptimamente, la comparación siendo capaz de llevarse a cabo por el segmento o al usar una “ventana de alineación”. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de la comparación a mano, por medio del algoritmo de la homología local de Smith y Aguaman (1981) [Ad. App. Matemáticas. 2:482], por medio del algoritmo de la homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por medio del parecido buscan el método de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] o por medio de software usando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por el software BLAST NR o BLAST P de la comparación).
La identidad del porcentaje se calcula al determinar la cantidad de ubicaciones en donde el nucleótido aminoacídico o el residuo son idénticos entre las dos secuencias, preferentemente entre las dos secuencias completas, dividiendo la cantidad de ubicaciones idénticas por la cantidad total de ubicaciones en la ventana de alineación y multiplicando el resultado por 100 para obtener la identidad del porcentaje entre las dos secuencias. Por ejemplo, el programa BLAST, “DESVASTAN 2 secuencias” (Tatusova et al., “Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www .ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede usarse con los parámetros por defecto (particularmente para los parámetros “open gap penalty”: 5, y “extensión gap penalty”: 2; la matriz seleccionada que es por ejemplo la matriz “BLOSUM 62” propuesta por el programa); la identidad del porcentaje entre las dos secuencias para compararse se calcula directamente por el programa.
Para la secuencia aminoacídica que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con una secuencia aminoacídica de referencia, prefirieron que los ejemplos incluyan a los que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, particularmente una eliminación, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, truncamiento o extensión. En caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, las sustituciones se prefieren en que los aminoácidos sustituidos son sustituidos por aminoácidos “equivalentes”. En la presente memoria, la expresión “aminoácidos equivalentes” indica cualquier aminoácido probablemente para sustituirse por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar sin embargo las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de aquellos ejemplos específicos definidos a continuación.
Los aminoácidos equivalentes pueden determinarse en su homología estructural con los aminoácidos para los cuales se sustituyen o en los resultados de pruebas comparativas de la actividad biológica entre diversos anticuerpos probablemente para generarse.
Como un ejemplo no limitativo, la tabla 1 a continuación resume las posibles sustituciones probablemente para llevarse a cabo sin dar como resultado una modificación significativa de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente; las sustituciones inversas son naturalmente posibles en las mismas condiciones.
Tabla 1
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Un aspecto particular de la invención es que el anticuerpo, no se une con el receptor de la insulina (IR). Este aspecto es del interés ya que el anticuerpo en la presente memoria descrito no tendrá impacto negativo en el IR, haciendo referencia al metabolismo de la Insulina.
Todavía otro aspecto ventajoso del anticuerpo del ADC de la invención es que presenta capacidad de unirse no sólo a IGF-1R de humano pero asimismo al IGF-1R de mono, y más particularmente a IGF-1R cinomolgo. Este aspecto asimismo es de interés ya que facilitará la evaluación de toxicidad requerida para ensayos clínicos.
En todavía otra forma de realización, el anticuerpo del ADC de la invención consiste en un anticuerpo monoclonal.
El término "anticuerpo monoclonal" o "Mab" como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales de la población son idénticos excepto posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, siendo dirigidos con especificidad de objetivo contra un epítopo individual. El anticuerpo monoclonal puede producirse por un clon individual de linfocitos B o hibridoma. Los anticuerpos monoclonales asimismo pueden ser el recombinante, es decir producido por la síntesis técnica o química proteínica. Los anticuerpos monoclonales asimismo pueden aislarse de genotecas del anticuerpo del fago. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlónicos que por lo común incluyen diversos anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo contra diversos determinantes o epítopos, cada anticuerpo monoclonal es dirigido con especificidad de objetivo contra un epítopo individual del antígeno. El anticuerpo monoclonal en la presente memoria incluye el murino, el anticuerpo quimérico y humanizado, tal como se describe a continuación.
El anticuerpo preferentemente se deriva de un hibridoma del origen del murino presentado dentro de la French collection for microorganism cultures (CNCM, Instituto Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia), el hibridoma que se obtiene por la fusión de Balb/C inmunizó esplenocitos/linfocitos de ratones y células de la estirpe celular de mieloma Sp 2/O-Ag 14.
En una forma de realización, el anticuerpo IGF-1R del ADC de la invención consiste en un anticuerpo del murino, al que se hace referencia a continuación como m [nombre del anticuerpo].
En una forma de realización, el anticuerpo IGF-1R consiste en un anticuerpo quimérico, al que se hace referencia a continuación como c [nombre del anticuerpo].
En una forma de realización, el anticuerpo IGF-1R consiste en un anticuerpo humanizado, al que se hace referencia a continuación como el Hz [nombre del anticuerpo].
Para la evitación de duda, en adelante, las expresiones “anticuerpo IGF-1R” y “[el nombre del anticuerpo]’’ es similar e incluye (sin la especificación contraria) el murino, el quimérico y las versiones humanizadas del anticuerpo IGF-1R o del “[nombre del anticuerpo]’. Cuando sea necesario, el prefijo m-(murino), c-(quimérico) o Hz -(humanizado) se usa.
Para más claridad, la siguiente tabla 2 ilustra las secuencias de la CDR, definidas según IMGT, para los anticuerpos preferidos.
Tabla 2
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Resulta evidente para el experto en la materia que cualquier combinación de 6 CDR como se ha descrito anteriormente debería considerarse como parte de la presente invención.
Como puede observarse a partir de esta tabla 2, todos los anticuerpos en la presente memoria descritos presentan las mismas secuencias para la CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L2, esta propiedad que es del particular interés como se ha descrito anteriormente.
Un aspecto específico se relaciona con un anticuerpo del murino caracterizado por que el anticuerpo asimismo comprende cadena ligera y regiones constantes de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga con el ratón, particularmente hombre.
Otro aspecto específico se relaciona con un anticuerpo (c) quimérico caracterizado por que el anticuerpo asimismo comprende cadena ligera y regiones constantes de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga con el ratón, particularmente humano.
Un anticuerpo quimérico es el que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivado de un anticuerpo de una especie determinada combinada con regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a las especies determinadas.
Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse al usar los métodos de técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico podría producirse al clonar el ADN recombinante que contiene a un promotor y una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano del ADC de la invención, particularmente murino y una secuencia que codifica la región constante del anticuerpo de especies heterólogas, preferentemente humano. Un anticuerpo quimérico el ADC según la invención codificada por un gen recombinante podría ser, por ejemplo, una quimera de ratón y de humano, la especificidad de este anticuerpo que se determina mediante la región variable derivada del ADN del murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN de humano.
En una forma de realización preferida pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona a partir de:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 13 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 13 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11;
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 14 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 14 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 10, 5 y 11;
c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 15 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 15 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 12;
d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 16 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 16 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11; y
e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 17 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 17 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 12.
Por “cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 13 a 17”, se pretende hacer referencia a las secuencias que muestran las tres CDR de la cadena pesada SEC ID n° 1, 2 y 3 y, además, mostrando por una identidad de lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con la secuencia completa SEC ID n° 13 a 17 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR (es decir SEC ID n° 1,2 y 3).
En otra forma de realización preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona a partir de:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 18 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 18 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3;
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 19 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 19 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3;
c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 20 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 20 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3;
d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 21 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 21 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 8, 2 y 3; y
e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 22 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 22 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3.
Por “cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 18 a 22”, se pretende hacer referencia a las secuencias que muestran las tres CDR de la cadena ligera SEC ID n° 4, 5 y 6 y, además, mostrando una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, con la secuencia completa SEC ID n° 18 a 22 fuera de las secuencias correspondiente a las CDR (es decir SEC ID n° 4, 5 y 6).
Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo seleccionado de entre:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 13 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 13 y un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 18 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 18;
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 14 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 14 y un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 19 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID N° 19;
c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 15 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 15 y un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 20 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 20;
d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 16 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 16 y un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 21 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 21; y
e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 17 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 17 y un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 22 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 22.
Los anticuerpos quiméricos en la presente memoria descritos pueden asimismo ser caracterizados por el dominio constante y, más particularmente, los anticuerpos quiméricos pueden seleccionarse o diseñado tal como, entre otras cosas, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD o IgE. Más preferentemente, en el contexto de la presente invención, los anticuerpos quiméricos son IgG1 o IgG4.
Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo quimérico que comprende dominios variables VH y VL como se ha descrito anteriormente en el formato IgG1. Más preferentemente, el anticuerpo quimérico comprende un dominio constante para el VH de secuencia SEC ID n° 43 y un dominio de Kappa para el VL de secuencia SEC ID n° 45.
Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo quimérico que comprende dominios variables VH y VL como se ha descrito anteriormente en el formato IgG4. Más preferentemente, el anticuerpo quimérico comprende un dominio constante para el VH de secuencia SEC ID n° 44 y un dominio de Kappa para el VL de secuencia SEC ID n° 45.
En otra forma de realización, preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona a partir de:
a) un anticuerpo que comprende o y consiste en una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 23 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 23 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 28 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 28;
b) un anticuerpo que comprende o y consiste en una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 24 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 24 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 29 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 29;
c) un anticuerpo que comprende o y consiste en una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 25 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 25 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 30 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 30;
d) un anticuerpo que comprende o y consiste en una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 26 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 26 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 31or cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 31; y
e) un anticuerpo que comprende o y consiste en una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 27 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 27 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 32 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 32.
Para mayor detalle, la siguiente tabla 3 ilustra las secuencias del VH y VL, respectivamente, para los anticuerpos quiméricos preferidos.
Tabla 3
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Aún otro aspecto específico de la presente invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo humanizado caracterizado por que las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivada del anticuerpo de humano son, respectivamente, lambda o región kappa y la gamma 1, gamma 2 o gamma 4 región.
“Anticuerpos humanizados” se refiere a un anticuerpo que contiene regiones de la CDR derivadas de un anticuerpo del origen no humano, las otras partes de la molécula del anticuerpo que se deriva de una (o varios) anticuerpos de humano. Además, algunos residuos de segmento del esqueleto (llamado FR) pueden modificarse para conservar la afinidad de unión.
Los anticuerpos humanizados o los fragmentos de los mismos pueden prepararse por métodos conocidos por un experto en la materia. Los anticuerpos humanizados se prefieren para su uso en métodos que implican diagnósticos in vitro o tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otros métodos de la humanización, asimismo conocidos por un experto en la materia, tales como, por ejemplo, la técnica “injerto de CDR” descrito por PDL en los patentes documentos EP 0451 216, EP 0682040, Ep 0939 127, EP 0566647 o las patentes US n° 5.530.101, US n° 6.180.370, US n° 5.585.089 y US n° 5.693.761. Las patentes de US n° 5.639.641 o n° 6.054.297, n° 5.886.152 y n° 5.877.293 asimismo pueden citarse.
Como una forma de realización particular de la invención, y que se explicará con mayor detalle en los ejemplos a continuación, en la presente memoria se describe un anticuerpo que consiste en el hz208F2. La humanización asimismo puede aplicarse a la otra parte de anticuerpos de la presente invención.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que presenta:
i) las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3, respectivamente, y
ii) el FR1, FR2 y FR3 derivado de la estirpe germinal de humano IGHV1-46*01 (SEC ID n° 46), y iii) el FR4 derivado de la estirpe germinal de humano IGHJ4*01 (SEC ID n° 48).
En una forma de realización preferida, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que presenta:
i) la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11, respectivamente, y
ii) el FR1, FR2 y FR3 derivado de la estirpe germinal de humano IGKV1-39*01 (SEC ID n° 47), y iii) el FR4 derivado de la estirpe germinal de humano IGKJ4*01 (SEC ID n° 49).
En una forma de realización de la invención preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC comprende: a) una cadena pesada que presenta CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3, respectivamente, y FR1, FR2 y FR3 derivado de la estirpe germinal de humano IGHV1-46*01 (SEC iD n° 46) , y FR4 derivó de la estirpe germinal de humano IGhJ4*01 (SEC ID n° 48); y
b) una cadena ligera que presenta CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11, respectivamente, y FR1, FR2 y FR3 derivado de la estirpe germinal de humano IGKV1-39*01 (SEC ID n° 47) , y FR4 derivó de la estirpe germinal de humano IGKJ4*01 (SEC ID n° 49).
En una forma de realización, el anticuerpo del ADC según la invención comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) de secuencia SEC ID n° 35. El anticuerpo humanizado se llamará en adelante hz208F2 (“1 Variante” o “Var. 1”).
En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en donde la secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95.
Según las expresiones “retromutación” o “mutación inversa” se supone una mutación o el reemplazo del presente del residuo de humano en la estirpe germinal por el residuo correspondiente inicialmente presente en la secuencia del murino.
En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en donde la secuencia SEC ID n° 33 comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 retromutaciones seleccionadas de los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95.
Para más claridad, la siguiente tabla 4 ilustra las retromutaciones preferidas.
Tabla 4
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Figure imgf000025_0001
En una forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en donde la secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 o 87.
En una forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en donde la secuencia SEC ID n° 35 comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 retromutaciones seleccionadas de los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 o 87.
En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada (VH) de secuencia SEC ID n° 33 en donde la secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95; y
b) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de secuencia SEC ID n° 35, en donde la secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 o 87.
Para más claridad, la siguiente tabla 5 ilustra las retromutaciones preferidas.
Tabla 5
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En tal forma de realización, el anticuerpo del ADC según la invención comprende todas las retromutaciones anteriormente mencionadas y corresponde a un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 34 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) de secuencia SEC ID n° 36. El anticuerpo humanizado se llamará en adelante hz208F2 (“3 Variantes” o “Var. 3”).
En otra forma de realización, todas las formas humanizadas comprendidas entre la variante 1 y la variante 3 asimismo son comprendidas en la presente invención. En otras palabras, el anticuerpo del ADC según la invención corresponde a un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia “de consenso” SEC ID n° 41 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) de secuencia “de consenso” SEC ID n° 42. El anticuerpo humanizado, en conjunto, se llamará en adelante hz208F2 (“Variant2” o “Var.2”).
En una forma de realización preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona a partir de:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 33 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 33 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11; o
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 34 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 34 y las tres CDR de la cadena ligera de secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11.
Por “cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 33 o 34”, se pretende hacer referencia a las secuencias que muestran las tres CDR de la cadena pesada SEC ID n° 1, 2 y 3 y, además, mostrando una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, con la secuencia completa SEC ID n° 33 o 34 fuera de las secuencias correspondiente a las CDR (es decir SEC ID n° 1,2 y 3).
En una forma de realización preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona a partir de:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 35 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 35 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3; y
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 36 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 36 y las tres CDR de la cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3.
Por “cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 35 o 36”, se pretende hacer referencia a las secuencias que muestran las tres CDR de la cadena ligera SEC ID n° 4, 5 y 6 y, además, mostrando una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con la secuencia completa SEC ID n° 35 o 36 fuera de las secuencias correspondiente a las CDR (es decir SEC ID n° 4, 5 y 6).
Los anticuerpos humanizados en la presente memoria descritos pueden asimismo ser caracterizados por el dominio constante y, más particularmente, los anticuerpos humanizados pueden seleccionarse o diseñarse tal como, entre otras cosas, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD o IgE. Más preferentemente, en el contexto de la presente invención, los anticuerpos humanizados son IgG1 o IgG4.
Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo humanizado que comprende dominios variables VH y VL como se ha descrito anteriormente en el formato IgG1. Más preferentemente, el anticuerpo humanizado comprende un dominio constante para el VH de secuencia SEC ID n° 43 y un dominio de Kappa para el VL de secuencia SEC ID n° 45.
Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo humanizado que comprende dominios variables VH y VL como se ha descrito anteriormente en el formato IgG4. Más preferentemente, el anticuerpo humanizado comprende un dominio constante para el VH de secuencia SEC ID n° 44 y un dominio de Kappa para el VL de secuencia SEC ID n° 45.
Todavía otra forma de realización de la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo seleccionado de:
a) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 37 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 37 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 39 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 39; y
b) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 38 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 38 y una cadena ligera de secuencia SEC ID n° 40 o cualquier secuencia que muestra identidad de por lo menos el 80% con SEC ID n° 40.
Para mayor claridad, la siguiente tabla 6 ilustra ejemplos no limitativos de secuencias del VH y VL para la variante 1 (Var. 1) y la variante 3 (Var. 3) del anticuerpo humanizado hz208F2. Asimismo comprende la secuencia de consenso para la variante 2 (Var. 2).
Tabla 6
Figure imgf000026_0001
Otro aspecto de la presente invención es un ADC en donde Ab es un anticuerpo seleccionado de i) un anticuerpo producido por el hibridoma I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 o I-4774 depositaron en CNCM, Institut Pasteur Francia el 30 de mayo de 2013, el 26 de junio de 2013, el 26 de junio de 2013, el 24 de abril de 2013 y el 26 de junio de 2013, respectivamente, ii) un anticuerpo que compite por unirse a IGF-1R con el anticuerpo de i); o el Ni) un anticuerpo que se une con el mismo epítopo de IGF-1R que hace el anticuerpo de i).
Se describe en la presente memoria un hibridoma murino seleccionado del hibridoma I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 e I-4774 depositaron en CNCM, Institut Pasteur Francia el 30 de mayo de 2013, el 26 de junio de 2013, el 26 de junio de 2013, el 24 de abril de 2013 y el 26 de junio de 2013, respectivamente.
Asimismo se describió un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno de lo mismo, según la invención.
Los términos “ácido nucleico”, “secuencia nucleica”, “secuencia de ácido nucleico”, “ polinucleótido”, “oligonucleótido”, “secuencia polinucleotídica” y “secuencia nucleotídica”, utilizados de modo indistinto en la presente descripción, significa una secuencia precisa de nucleótidos, modificados o no, definiendo un fragmento o una región de un ácido nucleico, conteniendo nucleótidos no naturales o no, y siendo un ADN de la doble hebra, un ADN de la cadena sencilla o los productos de transcripción de los ADN.
Las secuencias nucleicas de los anticuerpos del ADC de la presente invención se han aislado y/o se han purificado, es decir, fueron muestreados directa o indirectamente, por ejemplo por una copia, su ambiente que se ha por lo menos parcialmente modificado. Los ácidos nucleicos aislados obtenidos por técnicas de recombinación genética, por medios, por ejemplo, de células hospedadoras, u obtenido por la síntesis química asimismo deberían mencionarse en la presente memoria.
Asimismo se describió un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo del ADC de la invención, o un fragmento de unión a antígeno de lo mismo, según la invención.
Se describen particularmente vectores de clonación y/o expresión diana que contienen tal secuencia nucleotídica.
Los vectores preferentemente contienen elementos que permiten la expresión y/o la secreción de secuencias nucleotídicas en una célula hospedadora determinada. El vector así puede contener a un promotor, iniciación de la traducción y señales de la terminación, así como regiones de regulación de transcripción adecuadas. Debe ser capaz de mantenerse en una manera estable en la célula hospedadora y puede tener opcionalmente señales específicas que especifican la secreción de la proteína traducida. Estos diversos elementos se seleccionan y optimizado por un experto en la materia según la célula hospedadora usada. Para este fin, las secuencias nucleotídicas pueden insertarse en autoreplicarse vectores dentro del hospedador seleccionado o ser vectores integrantes del hospedador seleccionado.
Los vectores son, por ejemplo, vectores del origen plásmido o viral. Se utilizan transforman células hospedadoras a fin de clonar o expresar para las secuencias nucleotídicas de la invención.
Los vectores se preparan por métodos por lo común usados por un experto en la materia y los clones resultantes pueden introducirse en un hospedador adecuado por métodos convencionales como lipofección, electroporación, conjugación, choque térmico o métodos químicos.
Son las células hospedadoras aisladas de disclosedalso transformadas por o comprensión de un vector como se ha descrito anteriormente.
La célula hospedadora puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos como células bacterianas, por ejemplo, pero asimismo células de la levadura o células de animal, particularmente células del mamífero (a excepción del humano). El insecto o las células vegetales asimismo pueden usarse.
Asimismo se describió un método para la producción de un anticuerpo según la invención o un fragmento de unión a antígeno de lo mismo, caracterizado por que el método comprende las siguen etapas:
a) el cultivo en un medio con las afecciones del cultivo adecuadas para cellas hospedador describió mayor a;
y
b) la recuperación del anticuerpo así producido del medio de cultivo o de las células cultivadas.
Las células transformadas son del uso en métodos para la preparación de anticuerpos recombinantes. Los métodos para la preparación de anticuerpos en la forma recombinante usando un vector y/o una célula transformada por un vector, asimismo son comprendidos en la presente memoria. Preferentemente, una célula transformada por un vector como se ha descrito anteriormente se cultiva bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo anteriormente mencionado y la recuperación del anticuerpo.
Como se ha mencionado anteriormente, la célula hospedadora puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos. En términos particulares, es posible identificar las secuencias nucleotídicas que facilitan la secreción en un sistema tanto procariótico como eucariótico. Un vector según la invención que transporta tal secuencia puede usarse así ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes para secretarse. En efecto, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés será facilitada por el hecho de que se encuentran en el sobrenadante del cultivo celular células hospedadoras en vez de interiores.
El anticuerpo del ADC de la invención asimismo puede prepararse por la síntesis química. Un método de preparación asimismo es un objetivo de la invención. Un experto en la materia conoce métodos para la síntesis química, como métodos en fase sólida o métodos en fase sólida parciales, por la condensación de fragmentos o por la síntesis convencional en la solución. Los polipéptidos obtenidos por la síntesis química y capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes asimismo son comprendidos en la invención.
Los ADC que comprenden el anticuerpo que pueden obtenerse probablemente por el método anteriormente descrito asimismo son comprendidos en la presente invención.
Según un aspecto particular, la invención se refiere a un ADC en donde Ab es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de lo mismo, como se ha descrito anteriormente para el uso como un vehículo con especificidad de direccionamiento para administrar a un agente citotóxico a un sitio diana de hospedador, el sitio diana de hospedador que consiste en un epítopo localizado en IGF-1R, preferentemente el dominio extracelular IGF-1R, más preferentemente IGF-1R de humano (SEC ID n° 50) y todavía más preferentemente el dominio extracelular IGF-1R de humano (SEC ID n° 51), y todavía más preferentemente al N-terminal del dominio extracelular IGF-1R de humano (SEC ID n° 52), o cualquier secuencia variante natural del mismo.
En una forma de realización preferida, dicho sitio diana de hospedador es un sitio diana de una célula de mamífero, más preferentemente de una célula humana, más preferentemente células que naturalmente o por vía de la recombinación genética, expresan IGF-1R.
1.2: anticuerpos de Axl
Sin cualquier indicación contradictoria, la definición o expresión usada y definida en el párrafo “1.1, anticuerpos IGF-1R” es igual en el presente párrafo y puede aplicarse a todo el ADC de la presente invención.
El anticuerpo de Axl presenta capacidad de la unión a la proteína de humano Axl. Más particularmente, dicha diana es un epítopo ubicado en el dominio extracelular de Axl (al que se hace referencia como Axl ECD para “dominio extracelular Axl”).
El Axl ECD es un 451 fragmento de aminoácidos, correspondiente a aminoácidos 1-451 de la secuencia SEC ID n° 103, representándose dicha secuencia en el listado de secuencias como SEC ID n° 105. Aminoácidos 1-25 correspondientes al péptido de señalización, el ECD de la proteína de humano Axl sin el péptido de señalización corresponde a los aminoácidos 26-451 de la secuencia SEC ID n°104, representado por la secuencia SEC ID n° 106.
El anticuerpo de Axl de ADC de la invención comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 90%, preferentemente del 95% y del 98% con SEC ID n° 56, 57 y 58; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 59, 60 y 61, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 90%, preferentemente del 95% y del 98% con SEC ID n° 59, 60 y 61.
En una forma de realización, el anticuerpo de Axl comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden respectivamente las secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden respectivamente las secuencias SEC ID n° 59, 60 y 61.
En una forma de realización, el anticuerpo de Axl consiste en m1613F12 que comprende i) un dominio variable de la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 62, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, del 95% y del 98% con SeC ID n° 62; y/o ii) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 63, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, del 95% y del 98% con SEC ID n° 63.
Para más claridad, la tabla 7a a continuación resume diversas secuencias de aminoácidos correspondiente al anticuerpo de Axl.
Tabla 7a
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En una forma de realización, el anticuerpo de Axl consiste en c1613F12 que comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, del 95% y del 98% con SEC ID n° 56, 57 y 58; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 59, 60 y 61, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, del 95% y del 98% con SEC ID n° 59, 60 y 61.
En una forma de realización, el c1613F12 comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden respectivamente las secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden respectivamente las secuencias SEC ID n° 59, 60 y 6 l.
En una forma de realización, el anticuerpo de Axl consiste en c1613F12 que comprende i) un dominio variable de la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 62, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, del 95% y del 98% con SEC ID n° 62; y/o ii) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 63, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con sEc ID n° 63.
En una forma de realización, el anticuerpo de Axl consiste en hz1613F12 que comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SeC ID n° 56, 57 y 58; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 59, 60 y 61, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 59, 60 y 61. En una forma de realización, el hz1613F12 comprende las tres CDR de la cadena ligera que comprenden respectivamente las secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58; y las tres CDR de la cadena pesada que comprenden respectivamente las secuencias SEC ID n° 59, 60 y 61.
En una forma de realización, el hz1613F12 comprende un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia SEC ID n° 70, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 70; y las tres CDR de la cadena pesada que consisten en secuencias SEC ID n° 59, 60 y 61.
En otra forma de realización de la invención, el hz1613F12 comprende un dominio variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID n° 71 a 81 o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 71 a 81; y las tres CDR de la cadena pesada que consisten en SEC ID n° 59, 60 y 61.
Para ilustrar el porcentaje de identidad como se ha definido anteriormente, por “cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 70 a 81”, se pretende hacer referencia a las secuencias que muestran las tres CDR de la cadena ligera SEC ID n° 56, 57 y 58 y, además, mostrando una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, con la secuencia completa SEC ID n° 70 a 81 fuera de las secuencias correspondiente a las CDR (es decir SEC ID n° 56, 57 y 58).
Para más claridad, la tabla 7b a continuación resume diversas secuencias aminoacídicas correspondientes a la cadena ligera del anticuerpo de Axl humanizada (VL) del ADC de la invención (con el hz. = humanizado)
Tabla 7b
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000030_0001
En una forma de realización, el hz1613F12 comprende un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia SEC ID n° 82, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 82; y las tres CDR de la cadena ligera que consisten en secuencias SEC ID n° 56, 57 y 58.
En otra forma de realización, el hz1613F12 comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID n° 83 a 102, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con s Ec ID n° 83 a 102; y las tres CDR de la cadena ligera que consisten en SEC ID n° 56, 57 y 58.
A fin de ilustrar el porcentaje de identidad como se ha definido anteriormente, por “cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 82 a 102”, se pretende hacer referencia a las secuencias que muestran las tres CDR de la cadena pesada SEC ID n° 59, 60 y 61 y, además, mostrando una identidad de por lo menos el 80%, preferentemente el 85%, el 90%, el 95% y el 98%, con la secuencia completa SEC ID n° 82 a 102 fuera de las secuencias correspondiente a las CDR (es decir SEC ID n° 59, 60 y 61).
Para más claridad, la tabla 7c a continuación resume diversas secuencias aminoacídicas correspondientes a la cadena pesada de la proteína de unión del antígeno humanizada (VH) de la invención (con el hz. = humanizado)
Tabla 7c
Figure imgf000030_0002
En una forma de realización, el hz1613F12 comprende un dominio variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende de SEC ID n° 70 y cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 70; y un dominio variable de cadena pesada de secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende de SEC ID n° 82 y cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 82.
En una forma de realización, el hz1613F12 comprende un dominio variable de la cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende de SEC ID n° 71 a 81, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SeC ID n° 71 a 81 ; y un dominio variable de cadena pesada de secuencia seleccionada de entre el grupo que comprende de SEC ID n° 83 a 102, o cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% con SEC ID n° 83 a 102.
Otro aspecto de la presente invención es un ADC en donde Ab es un anticuerpo seleccionado de i) un anticuerpo producido por el hibridoma I-4505, depositado en CNCM, Institut Pasteur Francia el 28 de julio de 2011, ii) un anticuerpo que compite por unirse a Axl con el anticuerpo de i); o el iii) un anticuerpo que se une con el mismo epítopo de Axl que hace el anticuerpo de i).
Según otro aspecto, se describe un hibridoma murino seleccionado del hibridoma I-4505.
La tabla 8 a continuación resume las secuencias nucleotídicas respecto a CDR del 1613F12.
Tabla 8
Figure imgf000031_0002
En una forma de realización, las secuencias del ácido nucleico de las CDR pueden seleccionarse a partir de las secuencias SEC ID n° 64 a 69.
En una forma de realización no limitativa se describe en la presente memoria un ácido nucleico aislado o una combinación del mismo que codifica un anticuerpo caracterizado por que el ácido nucleico o su combinación comprenden las 6 secuencias de CDR SEC ID n° 64 a 69.
1.3: anticuerpos de HER2
Los anticuerpos de HER2 puede consistir en cualquier anticuerpo capaz de la unión a HER2 tal como, entre otras cosas, TrasGEX (Glycotope), Trastuzumab, Pertuzumab o cualquier biosimilar del mismo.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo de HER2 es el Trastuzumab (Herceptin®; 4D5; Genentech, San Francisco, CA).
II - El fármaco (D)
La porción del fármaco según la invención presenta la fórmula siguiente (II)
Figure imgf000031_0001
en donde:
R1 es H o OH;
R2 es un grupo: (Ci-Ca) alquilo (por ejemplo metilo), COOH, COO -(Ci-Ca) alquilo) (como COOMe) o tiazolilo (como tiazol-2-il);
R3 es H o un grupo alquilo (Ci-Ca) (como metilo), particularmente un grupo alquilo (Ci-Ca),
A es:
- un grupo de fórmula-Het-Alk-en donde Alk es un grupo alcanodiil(C1-C8) y se une a NR3, y Het es un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) y conteniendo por lo menos un átomo de nitrógeno, el átomo de nitrógeno que se une a L, o
- un grupo de fórmula -Aa-Ab-en donde Aa se une a L y es O o NRg con Rg que es H o alquilo (Ci-Ca) (como metilo) y Ab se une a NR3 y es:
- grupo alcanodiil(C1-C8) (tal como -(CH2) m-con m comprendió entre i y 8),
- un grupo -(CH2CH2Xi)ai(CH2CH2X2)a2(CH2CH2X3)a3(CH2CH2X4)a4CH2CH2. con X-, X2, X3 y X4 cada uno independientemente del otro que representa O o NRa; a i, a2, a3 y a4 cada uno independientemente del otro que representa 0 o i (particularmente con ai a2 a3 a4 = i o 2, particularmente i); y Re que representa H o un grupo alquilo (Ci-Ca) (como metilo),
- un grupo arilo - alcanodiil(Ci-C8) o heterociclo - alcanodiil(Ci-C8), el grupo siendo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca), el arilo o porción de heterociclo que se une a Aa y porción de alcanodiil(Ci-C8) que se une a NR3;
la línea ondulada indica el punto de unión a L.
Los radicales R2, R3 y A pueden ser grupos quirales y pueden tener formas de sus diferentes estereoisómeros y opcionalmente en la forma de una mezcla de estereoisómeros.
Por «estereoisómero», en el significado de la presente invención se supone un isómero geométrico o un isómero óptico.
Los isómeros geométricos resultan a partir de la diferente ubicación de los sustitutos en un doble enlace que puede tener por lo tanto un Z o configuración E.
Los isómeros ópticos resultan particularmente de la diferente ubicación en la separación de los sustitutos en un átomo de carbono que comprende 4 diferentes sustitutos. Este átomo de carbono a continuación forma un centro quiral o asimétrico. Los isómeros ópticos comprenden diastereoisómeros y enantiómeros. Los isómeros ópticos que son imágenes el uno del otro en un espejo, pero que no pueden estar superpuestos se llaman «enantiómeros». Los isómeros ópticos que no son imágenes superejecutables el uno del otro en un espejo se llaman «diastereoisómeros».
Una mezcla que contiene cantidades iguales de dos formas del enantiómero individuales de la quiralidad opuesta se llama una «mezcla racémica».
Por «alquilo» en la presente invención se hace referencia a una cadena del hidrocarburo saturado lineal o ramificada monovalente. Por ejemplo, pueden mencionarse metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, secbutilo, terc-butilo, pentilo o grupos del hexilo.
Por «(Cx-Cy) alquilo» en el significado de la presente invención se hace referencia a una cadena de alquilo tal como se ha definido anteriormente que comprende átomos de carbono x a y. Por lo tanto, un grupo alquilo (Ci­ Ca) es una cadena de alquilo que presenta i a a átomos de carbono. Alquilo (Ci-Ca) es ventajosamente alquilo (Ci-C4), preferentemente alquilo (Ci-C2).
Por «alcanodiil» en la presente invención se supone una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada divalente. Por ejemplo, pueden mencionarse metanodiil, etanodiil, propanodiil, butanodiil, pentanodiil, hexanodiil, y lo similar.
Por «alcanodiil (Cx-Cy)» en el significado de la presente invención se supone una cadena alcanodiil tal como definido comprensión anterior x a átomos de carbono y. Por lo tanto, un grupo alcanodiil (C i-C8) es una cadena alcanodiil que presenta i a 8 átomos de carbono.
Por «arilo» en el significado de presente invención se supone un grupo de hidrocarburo aromático que preferentemente presenta a a i0 átomos de carbono y capaz de comprender un o dos anillos fusionados. Por ejemplo fenilo o naftilo pueden citarse. Ventajosamente es fenilo.
Por «heterociclo» en el significado de presente invención se supone un grupo hidrocarburo saturado, insaturado o aromático que presenta 1 o 2 anillos fusionados y en que uno o más, ventajosamente 1 a 4, más ventajosamente 1 o 2 de los átomos de carbono son cada uno sustituidos por un heteroátomo seleccionado de entre oxígeno, nitrógeno y azufre. Ventajosamente el heterociclo comprende 5 a 10 átomos de carbono y heteroátomos. Por ejemplo, pueden mencionarse furano, pirrol, tiofeno, tiazol, isotiazol, oxadiazol, imidazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirimidina, piperazina, piperidina, quinazolina, quinolino, quinoxalina, benzofurano, benzotiofeno, indolino, indolizina, benzotiazol, benzotiofeno, benzopiran, benzoxazol, benzo[1,3]dioxol, benzoisoxazol, bencimidazol, cromano, cromeno, dihidrobenzofuran, dihidrobenzotiofeno, dihidroisoxazol, isoquinolina, dihidrobenzo[1,4]dioxin, imidazo piridina [1,2-a], furo piridina [2,3-c], 2,3-dihidro-1H-indeno, [1,3] dioxolo piridina [4,5-c], pirrolo pirimidina [1,2-c], pirrolo pirimidina [1,2-a], tetrahidronaphtaleno y benzo[b][1,4]oxazina.
En la presente invención, el heterociclo es más particularmente un anillo saturado, insaturado o aromático con 5 a 6 elementos que comprenden 1 o 2 átomos de nitrógeno. Por ejemplo, pueden mencionarse pirrol, imidazol, piridina, pirimidina, piperazina y anillos de la piperidina. Preferentemente es piridina, una piperidina o imidazol. Entre las porciones del fármaco de la invención, una clase particularmente valorada de porciones del fármaco corresponde a las porciones del fármaco de la fórmula (II) en las cuales R1 es OH y R2 representa un grupo alquilo (C1-C 6), como metilo.
Otra clase particularmente valorada de porciones del fármaco corresponde a las porciones del fármaco de la fórmula (II) en las cuales R1 es hidrógeno y R2 es tiazolilo (particularmente un grupo tiazol-2-il).
Otra clase de porciones del fármaco particularmente valoradas corresponde a las porciones del fármaco de la fórmula (II) en las cuales R1 es hidrógeno y R2 es un COO -(C1-C6) alquilo) el grupo como el COOMe.
Otra clase de compuestos particularmente valorados corresponde a las porciones del fármaco de la fórmula (II) en las cuales R1 es hidrógeno y R2 es un grupo COOH.
Según una forma de realización particular de la presente invención, R2 es metilo, COOH, COOMe o grupo tiazol— 2—il.
Por lo tanto las porciones del fármaco de la invención son ventajosamente porciones del fármaco de la fórmula (II) en donde:
- Ri=OH y R2=Me (metilo), o
- R-f H y R2=COOH, COOMe o tiazol—2—il.
Según una forma de realización preferida, Ri=H y R2=COOH, COOMe o tiazol—2—il, preferentemente R2=COOH o COOMe, y más preferentemente R2=COOH.
R3 particularmente representa H o un grupo de metilo, ventajosamente un grupo de metilo.
En una forma de realización preferida, Ri es H, R2 es COOH y R3 es un grupo de metilo.
En la definición de A:
- el grupo alcanodiil(C1-C8) es ventajosamente grupo (Ci-C6)alcanodiil, preferentemente grupo (Ci-C4)alcanodiil y más preferentemente grupo (Ci-C2)alcanodiil, y particularmente es una cadena lineal que presenta la fórmula —(CH2) m-en donde m es un número entero comprendido entre 1 y 8, ventajosamente entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, más preferentemente m es 1 o 2,
- el grupo arilo es ventajosamente un grupo de fenilo, y
- el heterociclo es ventajosamente un anillo saturado, insaturado o aromático con 5 o 6 elementos que presentan 1 o 2 átomos de nitrógeno; por ejemplo, pirrol, imidazol, piridina, pirimidina, piperazina o anillo de la piperidina; preferentemente piridina, piperidina o imidazol; más preferentemente piridina.
Cuando A es un grupo de fórmula-Het-Alk-, Het es más particularmente un heterociclo seleccionado entre una piperidina e imidazol.
Cuando A es un grupo de fórmula-Aa-Ab-en donde Ab es un grupo heterociclo - alcanodiil(C1-C8) opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C1-C6), el heterociclo es más particularmente piridina.
Según una forma de realización preferida, A es un grupo de fórmula-Aa-Ab-como se ha definido anteriormente. Aa es O o NRg, y preferentemente NRg, con Rg como se ha definido anteriormente, y preferentemente con Rg = H o Me.
Según una forma de realización particular de la invención, Ab representa un grupo:
- (Ci-C6)alcanodiil, particularmente (C2-C 6)alcanodiil (tal como -(CH2) m-con m comprendido entre 1 y 6, preferentemente entre 2 y 6),
- (CH2CH2Xi)ai(CH2CH2X2)a2CH2CH2. con ai a2 representando ventajosamente 1 o 2, particularmente 1, - arilo -(Ci-C6)alcanodiil, o
- heterociclo -(Ci-C6)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido).
Según otra forma de realización particular de la invención, Ab representa un grupo:
- (Ci-C4)alcanodiil, particularmente (C2-C 4)alcanodiil (tal como -(CH2) m-con m comprendido entre i y 4 y siendo preferentemente 2, 3 o 4),
- (CH2CH2XO CH2CH2-o -(CH2CH2Xi) (CH2CH2X2) CH2CH2-,
- arilo -(C i-C 4)alcanodiil, o
- heterociclo -(C i-C 4)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido).
Según otra forma de realización particular de la invención, Ab representa un grupo:
- (Ci-C4)alcanodiil, particularmente (C2-C 4)alcanodiil (tal como -(CH2) m-con m comprendido entre i y 4 y siendo preferentemente 2, 3 o 4),
- (CH2CH2XO CH2CH2-,
- arilo-(Ci-C2)alcanodiil, o
- heterociclo-(Ci-C2)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido).
Según otra forma de realización particular, Ab representa:
un grupo arilo-alcanodiil (Ci-C8); o un grupo heterociclo-alcanodiil (C i-C8) opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido);
particularmente un grupo arilo-(Ci-Ca)alcanodiil; o un grupo heterociclo-(Ci-Ca)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido);
ventajosamente un grupo arilo-(Ci-C4)alcanodiil; o un grupo heterociclo-(Ci-C4)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido);
y preferentemente un grupo arilo-(Ci-C2)alcanodiil; o un grupo heterociclo-(Ci-C2)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ca) (particularmente no sustituido).
Según aún otra forma de realización particular, Ab es un grupo arilo-alcanodiil (Ci-C8); particularmente un grupo arilo-(Ci-Ca)alcanodiil; ventajosamente un grupo arilo-(Ci-C4)alcanodiil; y preferentemente un grupo arilo-(Ci-C2)alcanodiil.
En las formas de realización particulares anteriores para Ab, el grupo arilo es ventajosamente un grupo fenilo. En las formas de realización particulares anteriores para Ab, el heterociclo es ventajosamente un anillo saturado, insaturado o aromático con 5 o a elementos que presentan i o 2 átomos de nitrógeno. Por ejemplo, pueden mencionarse pirrol, imidazol, piridina, pirimidina, piperazina o anillos de la piperidina. Preferentemente es piridina, piperidina o imidazol, y más preferentemente, es piridina.
Ventajosamente, Ab representa un grupo:
- fenilo-(C1-C 2)alcanodiil, o
- heteroddo-(Ci-C2)alcanodiil opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C1-C 6 ) (particularmente no sustituido), el heterociclo que es un saturado, insaturado o anillo aromático con 5 o 6 elementos que comprenden 1 o 2 átomos de nitrógeno, seleccionados particularmente de entre piridina, piperidina e imidazol, y son preferentemente piridina.
En una forma de realización preferida, Ab es un grupo fenilo-(C1-C 2 )alcanodiil.
Según una forma de realización preferida, A presenta la fórmula siguiente:
Figure imgf000035_0001
y preferentemente la fórmula siguiente:
Figure imgf000035_0002
en donde:
R9 y m son como se define previamente, y preferentemente con R9 = H o Me y m = 1 o 2,
la línea ondulada indica el punto de unión a L, y
el asterisco indica el punto de unión a NR3.
Ventajosamente, la porción del fármaco se selecciona de entre las porciones siguientes:
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
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Ċ
Figure imgf000041_0001
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Figure imgf000045_0001
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Preparación del fármaco (de fórmula DH):
El fármaco puede prepararse usando los métodos generales descritos en los siguen esquemas de reacción de síntesis, opcionalmente complementados por cualquier operación convencional cuando sea necesario que es descrita en la literatura o conocida por los expertos en la materia o descritos en los ejemplos en su parte experimental.
Figure imgf000046_0001
Esquema 1
El esquema 1 ilustra el primer método general que poderse usar para preparar el fármaco. En las fórmulas generales anteriores, R1, R2 y R3 son tal como se ha definido anteriormente, R4 representa - AH, y R4a representa un grupo R4 tal como se ha definido anteriormente opcionalmente en la forma protegida y G es un grupo protector.
La primera etapa consiste en la condensación de compuesto (II), protegido en su función de la amina por un grupo protector G, con el compuesto (III). X puede representar un grupo saliente o electroaceptor como cloro. En este caso la primera etapa consiste en la reacción entre un cloruro ácido y una amina. Esta reacción puede llevarse a cabo usando métodos conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente valorado, se hace que las dos entidades reaccionen en la presencia de una base orgánica o inorgánica por ejemplo Et3N, iPr2NEt, piridina, NaH, Cs2CO3, K2CO3 en un solvente como el THF, diclorometano, DMF, DMs O, a una temperatura particularmente entre -20°C y 100°C. X asimismo puede ser un hidroxilo (OH). En este caso, la primera etapa es una reacción de condensación entre el ácido carboxílico (II) y la amina (III). Esta reacción puede llevarse a cabo siguiendo métodos y métodos conocidos por el experto en la materia. En un método particularmente valorado, se hace que estas dos entidades reaccionen en la presencia de un agente de acoplamiento tal como 1-(3-dimetilaminopropil)-3 carbodiimida del etilo (EDC), 3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona, una amina terciaria como la diisopropiletilamina, en un solvente aprótico polar como diclorometano o DMF, a una temperatura particularmente entre -15°C y 40°C. En otro método particularmente valorado, se hace que estas dos entidades reaccionen en la presencia del dietilo fosforociadinato (DEPC), una amina terciaria como la trietilamina, en un solvente aprótico polar como diclorometano o DMF, a una temperatura de entre -15°C y 40°C. Otro método particularmente valorado consiste en hacer a estas dos entidades reaccionar en la presencia de O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametil-uroniumhexafluorofosfato (HATU), una amina terciaria como la diisopropiletilamina, en un solvente aprótico polar como diclorometano o DMF, a una temperatura de entre - 15°C y 100°C.
Después de desprotección del producto intermedio utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia («Protective Groups in Organic Synthesis», T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 y «Protecting Groups», P.J. Kocienski, Tieme Verlag, 1994), el compuesto (IV) puede condensarse con el compuesto (V) siguiendo los métodos y métodos descritos anteriormente para conducir al compuesto (VI) después de una etapa de la desprotección. Este compuesto puede luego, después de la condensación con el producto intermedio (VII) y la desprotección opcional, dar como resultado la formación del fármaco. El compuesto (VI) asimismo puede acoplarse con un compuesto (VII') en donde R'3 es un precursor de R3, particularmente un grupo R3 protegido por un grupo protector. El acoplamiento seguido de la desprotección del grupo R' para dar como resultado a R3 puede llevarse a cabo siguiendo los mismos procedimientos como los descritos previamente.
Figure imgf000047_0001
El esquema 2 ilustra el segundo método general que poderse usar para preparar el fármaco. En las fórmulas generales anteriores, el G es un grupo protector, R1, R2, R3 y R4a son tal como se ha definido anteriormente, y R4b representa - Ac-AaH con Aa como se ha definido previamente y representación del Ac:
■ grupo alcanodiilo (C1-C7),
■ un grupo -(CH2CH2X1)a1(CH2CH2X2)a2(CH2CH2X3)a3(CH2CHX4) a4CH2*- en donde el grupo CH2 marcado con un asterisco se une al grupo CHO de R4bCHO,
■ un grupo arilo o heterociclo,
■ un grupo arilo - alcanodiil(C1-C7) o heterociclo - (CrC7)alcanodiil, el grupo siendo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C1-C6), la porción alcanodiil(C1-C7) uniéndose al grupo CHO de R4bCHO.
En la primera etapa, el compuesto (IX) protegido en su función de la amina por un grupo protector G se condensa con el compuesto (VI). X puede representar un grupo saliente o electroaceptor por ejemplo cloro. En este caso, la primera etapa consiste en la reacción entre un cloruro ácido y una amina. Esta reacción puede llevarse a cabo usando métodos y métodos conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente valorado se hace que las dos entidades reaccionen en la presencia de una base orgánica o inorgánica como el Et3N, iPr2NEt, piridina, NaH, Cs2CO3, K2CO3 en un solvente como el THF, diclorometano, DMF, DMSO a una temperatura particularmente entre -20 ° y 100°C. X asimismo puede representar un hidroxilo. En este caso, la primera etapa es una reacción de condensación entre el ácido carboxílico (IX) y la amina (VI). Esta reacción puede llevarse a cabo siguiendo métodos y métodos conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente valorado, se hace que las dos entidades reaccionen en la presencia de 1-(3-dimetilaminopropil)- 3 carbodiimida del etilo (EDC), 3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4 (3H)- un, una amina terciaria como la diisopropiletilamina, en un solvente aprótico polar como diclorometano o DMF, a una temperatura particularmente entre -15°C y 40°C. En otro método particularmente valorado, se hace que estas dos entidades reaccionen en la presencia del dietilo fosforocianidato (DEPC), una amina terciaria como la trietilamina, en un solvente aprótico polar como diclorometano o DMF, a una temperatura particularmente entre -15°C y 40°C. Después de la desprotección del producto intermedio, usando métodos conocidos por los expertos en la materia, el compuesto obtenido (VIII) puede dar como resultado el fármaco después de la reacción con R4Y En este caso, el Y es un grupo saliente o electroaceptor como Cl, bromo, yo, OSO2CH3, OSO2CF3 u O-tosilo. La reacción se lleva a cabo en la presencia de una base orgánica o inorgánica como el Et3N, iPr2NEt, NaH, Cs2CO3, K2CO3, en un solvente anhidro polar como diclorometano, THF, DMF, DMSO a una temperatura particularmente entre -20 ° y 100°C. En otro método particularmente valorado, se hace que el compuesto (VIII) reaccione con un aldehido de la fórmula R4b-CHO donde R4b corresponde a un precursor de R4. En este caso, la reacción es una aminación reductiva en la presencia de un agente reductor como el NaBH4, NaBH3CN, NaBH (OAc) 3, en un solvente polar tal como de 1,2 dicloroetanos, diclorometano, THF, DMF, MeOH, en la presencia opcional del isopropóxido del titanio (IV), a un pH que puede controlarse mediante la adición de un ácido como el ácido acético a una temperatura particularmente entre - 20°C y 100°C.
En los esquemas de síntesis anteriores, un fármaco puede dar como resultado otro fármaco después de una etapa de reacción adicional tal como saponificación por ejemplo utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia por lo cual un grupo R2 que representa éster (COOMe), se cambia a un grupo R2 que representa un ácido carboxílico (COOH).
Si se desea para aislar un fármaco que contiene por lo menos una función de base en el estado de una sal ácida de adición, esto es posible al tratar la base libre del fármaco (conteniendo por lo menos una función de base) con un ácido adecuado, preferentemente en la cantidad equivalente. El ácido adecuado puede ser particularmente el ácido trifluoroacético.
III - El ligador (L)
"Ligador", "unidad de ligador", “L” o "enlace" hace referencia en la presente invención a una porción química que comprende una cadena de átomos que une covalentemente un anticuerpo con por lo menos un fármaco.
Los ligadores pueden elaborarse usando una variedad de agentes de acoplamiento proteínicos bifuncionales como el n-succinimidil-3-propionato (2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (ESTO), los derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetilo adipimidato HCl), ésteres activos (como el disuccinimidil suberato), aldehidos (como el glutaraldehído), compuestos del bis-azido (tal tan bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), bis-diazonio derivados (tal tan bis - (pdiazoniumbenzoil)- etilendiamina), diisocianatos (como el tolueno de 2,6 diisocianatos), y compuestos de flúor bis activos (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). El ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplificativo para la conjugación de agentes citotóxicos al sistema de direccionamiento. Otros reactivos del agente de reticulación pueden ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MB, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, SULFO-MB, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidilbenzoato (4-vinilsulfona)) que se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Mal., U.S.A).
El ligador puede ser “no escindible” o “escindible”.
En una forma de realización preferida, comprende en un "ligador escindible" que facilita la liberación del fármaco en la célula. Por ejemplo, un ligador ácido lábil, el ligador sensible a la peptidasa, el ligador fotolábil, el ligador del dimetilo o el ligador que contiene el disulfuro se pueden usar. El ligador es, en una forma de realización preferida, escindible en afecciones intracelulares, de manera que la escisión del ligador libera el fármaco del anticuerpo en el ambiente intracelular.
Por ejemplo, en algunas formas de realización, el ligador es escindible por un agente que escinde que se encuentra en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de una lisosoma o endosoma o caveolea). El ligador puede ser, por ejemplo, un ligador del peptidilo que es escindido por una peptidasa intracelular o enzima de la proteasa, incluyendo, entre otros, una proteasa lisosómica o endosómica. Típicamente, el ligador del peptidilo comprende por lo menos dos aminoácidos sucesivos o por lo menos tres aminoácidos sucesivos o es por lo menos dos aminoácidos de longitud o por lo menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes que escinden pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, de los cuales todos son conocidos para hidrolizar derivados del fármaco del dipéptido dando como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Por ejemplo, un ligador del peptidilo que es escindible por catepsina-B de la proteasa dependiente del tiol, que se expresa de manera elevada en el tejido canceroso, puede usarse (por ejemplo, un ligador que comprende o es Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly). En formas de realización específicas, el ligador del peptidilo escindible por una proteasa intracelular comprende o es Val-Cit o Phe-Lys. Una ventaja de usar la liberación proteolítica intracelular del fármaco consiste en que el fármaco típicamente se atenúa cuando se conjuga y la estabilidad sérica de los conjugados es por lo común elevada.
En otras formas de realización, el ligador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores del pH. Por lo común, el ligador sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, un ligador ácido lábil que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida de CEI-aconítico, ortoéster, acetalo, ketal, o lo similar) puede usarse. Los ligadores son relativamente estables en condiciones del pH neutro, como las de la sangre, pero son inestables a por debajo de pH 5.5 o 5.0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas formas de realización, el ligador hidrolizable es un ligador de tioéter (tal como, por ejemplo, tioéter unido al fármaco mediante una unión acilhidrazona).
Incluso en otras formas de realización, el ligador es escindible bajo condiciones de reducción (por ejemplo, un ligador del disulfuro). Una variedad de ligadores del disulfuro se conoce en la técnica, incluso, por ejemplo, los que pueden formarse usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-propionato (2-piridilditio)), SPDB (N-succinimidil-3-butirato (2-piridilditio)) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa - (2 piridilo ditio) tolueno).
El ligador según la presente invención presenta la fórmula general siguiente:
-(T) a-(W) w-(Y) yen donde:
T es una unidad ensanchadora;
a es 1;
W es una unidad de aminoácido;
w es un número entero comprendido entre 0 y 12;
Y es una unidad de separación;
y es 0, 1 o 2.
La unidad ensanchadora (T) une el anticuerpo a una unidad de aminoácido (W) cuando esté presente, o a la unidad de separación cuando esté presente, o directamente al fármaco. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes sobre el anticuerpo, naturalmente o mediante manipulación química, incluyen sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo del hidroxilo anomérico de un carbohidrato y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son sulfhidrilo y amino. Los grupos de sulfhidrilo pueden generarse por la reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares del anticuerpo, si está presente. Alternativamente, los grupos de sulfhidrilo pueden generarse por la reacción de un grupo amino de una porción de la lisina del anticuerpo con reactivos de generación de sulfhidrilo 2-iminotiolano u otros. En formas de realización específicas, el anticuerpo se manipula genéticamente para transportar una o más lisinas. Más preferentemente, el anticuerpo puede manipularse genéticamente para transportar una o más cisteínas (comparar TioMabs).
En ciertas formas de realización específicas, la unidad del ensanchador forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo. El átomo de azufre puede derivarse de sulfhidrilo (-SH) el grupo de un anticuerpo reducido.
En ciertas otras formas de realización específicas, la unidad del ensanchador se une al anticuerpo mediante un enlace disulfuro entre un átomo de azufre del anticuerpo y un átomo de azufre de la unidad del ensanchador. En otras formas de realización específicas, el grupo reactivo del ensanchador contiene un sitio reactivo que puede ser reactivo a un grupo amino del anticuerpo. El grupo amino puede ser el de arginina o una lisina. Los sitios reactivos de la amina adecuados incluyen, entre otras cosas, ésteres activados (como ésteres de succinimida, ésteres 4-nitrofenil, ésteres de pentafluorofenilo), anhídridos, cloruros ácidos, cloruros del sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.
Incluso en otro aspecto, la función reactiva del ensanchador contiene un sitio reactivo que es reactivo a un grupo de carbohidrato modificado que puede estar presente sobre el anticuerpo. En una forma de realización específica, el anticuerpo está glucosilado enzimáticamente para proporcionar una porción de carbohidrato o está naturalmente glucosilado. El carbohidrato puede suavemente oxidarse con un reactivo como el peryodato de sodio y la unidad de carbonilo resultante del carbohidrato oxidado puede condensarse con un ensanchador que contiene una funcionalidad como hidrazida, una oxima, una amina reactiva, hidracina, tiosemicarbazida, un carboxilato de hidracina o arilhidrazida.
Según una forma de realización particular, la unidad del ensanchador presenta la fórmula siguiente:
Figure imgf000050_0001
en donde
L2 es carbonilo de cicloalquilo (C4-C10), (C2-C6) alquilo o alquilcarbonilo (C2-C6) (cicloalquilo o porciones de alquilo que se unen al átomo de nitrógeno de la porción maleimida),
el asterisco indica el punto de unión a la unidad de aminoácido, si está presente, a la unidad de separación, si está presente, o al fármaco D, y
la línea ondulada indica el punto de unión al anticuerpo Ab.
Por “cicloalquilo (C4-C10)” en la presente invención se supone un ciclo de hidrocarburo que presenta 4 a 10 átomos de carbono incluyendo, entre otros, ciclopentilo, ciclohexilo y lo similar.
L2 puede ser ventajosamente alquilcarbonilo (C2-C6) como carbonilo del pentilo de la fórmula siguiente:
Figure imgf000050_0002
en donde
el asterisco indica el punto de unión a la unidad de aminoácido, si está presente, a la unidad de separación, si está presente, o al fármaco D; y
la línea ondulada indica el punto de unión al átomo de nitrógeno de la porción maleimida.
La unidad de aminoácido (W), cuando está presente, une la unidad del ensanchador (T) si está presente, u otra cosa el anticuerpo a la unidad de separación (Y) si la unidad de separación se encuentra, o al fármaco si la unidad de separación está ausente.
Como se ha mencionado anteriormente, (W)w está ausente (w = 0) o puede ser un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o unidad de dodecapéptido, en donde los aminoácidos que forman los péptidos pueden ser diferentes entre sí. Así (W)w puede ser representado por la fórmula siguiente: (W1)w (W2)w2 (W3)w3 (W4)w4 (W5)w5, en donde cada W1 a W5 representa, indistintamente entre sí, una unidad de aminoácido y cada w1 a w5 son 0 o 1.
En algunas formas de realización, la unidad de aminoácido (W)w puede comprender residuos aminoacídicos como los que ocurren naturalmente, así como aminoácidos menores y análogos aminoacídicos que ocurren artificialmente, como citrulina.
Los residuos aminoacídicos de la unidad de aminoácido (W)w incluyen, entre otras cosas, la alanina, la valina, la leucina, isoleucina, la metionina, fenilananina, el triptófano, prolina, lisina protegida o no con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida o no con tosilo o grupos del nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo y citrulina. Los componentes ligadores aminoacídicos ejemplificativos incluyen preferentemente un dipéptido, un tripéptido, tetrapéptido o un pentapéptido, particularmente un dipéptido o un tripéptido.
Los dipéptidos ejemplificativos incluyen: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg.
Los tripéptidos ejemplificativos incluyen: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.
El tetrapéptido ejemplificativo incluye: Gly-Phe-Leu-Gly (SEC ID N° 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEC ID N° 54).
El pentapéptido ejemplificativo incluye: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEC ID N° 55).
Según una forma de realización particular, (W)w puede ser un dipéptido (es decir w = 2) como Val-Cit, o el ligador carece de una unidad de aminoácido (w=0). Cuando el ligador carece de una unidad de aminoácido, preferentemente asimismo carece de una unidad de separación.
Según una forma de realización preferida, el w = 0 (es decir (W)w es un enlace individual) o w = 2 (es decir (W)w es un dipéptido) y (W)w pueden por lo tanto seleccionarse de entre:
Figure imgf000051_0001
y particularmente es Val-Cit,
en donde
el asterisco indica el punto de unión a la unidad de separación si está presente, o al fármaco D; y
la línea ondulada indica el punto de unión a L2.
Los componentes ligadores aminoacídicos pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada por tumor, catepsina B, C y D o una proteasa de la plasmina.
La unidad de aminoácido del ligador puede ser enzimáticamente escindida por una enzima incluyendo, entre otros, una proteasa asociada por tumor para liberar el fármaco.
La unidad de aminoácido puede diseñarse y optimizarse en su selectividad para la escisión enzimática por una proteasa asociada por tumor particular. Las unidades adecuadas son aquellas cuya escisión es catalizada por las proteasas, catepsina B, C y D y plasmina.
La unidad de separación (Y), cuando está presente, une una unidad de aminoácido si está presente o la unidad del ensanchador al fármaco. Las unidades de separación son de dos tipos generales: autodestructivo y no autodestructivo. Una unidad de separación no autodestructiva es aquella en la que la parte o toda la unidad de separación permanecen unidas al fármaco después de la escisión enzimática de una unidad de aminoácido del conjugado anticuerpo-fármaco. Los ejemplos de una unidad de separación no autodestructiva incluyen, entre otras cosas (glicina de glicina) unidad de separación y una unidad de separación de glicina. Para liberar el fármaco, una reacción de la hidrólisis independiente debería ocurrir dentro de la célula diana para escindir la unión de la unidad del fármaco de glicina.
El conjugado anticuerpo-fármaco según la invención contiene una unidad de separación autodestructiva que puede liberar el fármaco sin la necesidad de una etapa de la hidrólisis separada. La unidad espaciadora (Y) según la invención es un residuo de una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) que se une a (W) w mediante el átomo de nitrógeno del grupo PAB, y conectado directamente con el fármaco mediante éster, carbonato, carbamato o grupo del éter.
Otros ejemplos de separadores autodestructivos incluyen compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB como residuos de derivados 2-aminoimidazol-5-metanol y orto o paraaminobenzilacetal. Pueden utilizarse separadores que experimentan una ciclación fácil mediante la hidrólisis de la unión de la amida, como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas, apropiadamente sistemas de anillo biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] sustituidos y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico.
Por lo tanto, la unidad de separación (Y) según la invención es PAB-carbonilo con PAB siendo
Figure imgf000052_0001
(oxígeno de la unidad PAB que se une a carbonilo), e y = 1 o el ligador carece de una unidad de separación (y=0).
El ligador según la invención presenta por lo tanto la fórmula siguiente (III):
Figure imgf000052_0002
en donde
L2 es carbonilo de cicloalquilo (C4-C10), alquilo (C2-C6) o alquilcarbonilo (C2-C6) (el carbonilo de estas porciones, cuando está presente, uniéndose a (W) w),
W representa una unidad de aminoácido, con w representando un número entero comprendido entre 0 y 5, Y es PAB-carbonilo, con PAB siendo
Figure imgf000053_0001
(oxígeno de la unidad PAB que se une a carbonilo), e y es 0 o 1 (preferentemente y es 0 cuando w es 0 e y es 0 o 1 cuando w está comprendido entre 1 y 5),
el asterisco indica el punto de unión al fármaco D, y
la línea ondulada indica el punto de unión al anticuerpo Ab.
Ventajosamente, L2 es alquilcarbonilo (C2-C6) tal como pentil-carbonilo de la fórmula siguiente:
Figure imgf000053_0002
en donde
el asterisco indica el punto de unión a (W) w; y
la línea ondulada indica el punto de unión al átomo de nitrógeno de la porción maleimida.
Según una forma de realización preferida, el ligador L se selecciona a partir de:
Figure imgf000053_0003
y
Figure imgf000054_0001
en donde el asterisco indica el punto de unión al fármaco D, y la línea ondulada indica el punto de unión al anticuerpo Ab.
IV - el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)
En una forma de realización preferida, el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención puede prepararse por cualquier método conocido por el experto en la materia tal como, sin limitación, i) la reacción de un grupo nucleófilo del anticuerpo con un reactivo ligador bivalente seguido de la reacción con un grupo nucleófilo del fármaco o ii) la reacción de un grupo nucleófilo del fármaco con un reactivo ligador bivalente seguido de la reacción con un grupo nucleófilo del anticuerpo.
Los grupos nucleófilos en el anticuerpo incluyen, sin limitación, grupos de la amina N-terminales, grupos de la amina de cadena secundaria (por ejemplo lisina), grupos del tiol de cadena secundaria, e hidroxilo de azúcar o grupos amino cuando el anticuerpo está glucosilado.
Los grupos nucleófilos en el fármaco incluyen, sin limitación, grupos amina, tiol e hidroxilo, y preferentemente grupos amina.
Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrófilos en porciones de ligador y reactivos ligadores incluso, entre otras cosas, ésteres activos como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos, y haluros ácidos; alquilo y haluros de bencilo como haloacetamidas; aldehidos; cetonas; carboxilo; y grupos de maleimida. El anticuerpo puede presentar disulfuros intercatenarios reducibles, es decir puentes de cisteína. El anticuerpo puede elaborarse reactivo para la conjugación con reactivos ligadores por el tratamiento con un agente reductor como el DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos del tiol reactivos. Los grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en el anticuerpo a través de cualquier reacción conocida por el experto en la materia. Como ejemplo no limitativo, los grupos del tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo al introducirse uno o más residuos de la cisteína.
Los conjugados fármaco-anticuerpo asimismo pueden producirse por la modificación del anticuerpo para introducir porciones del electrófilo, que pueden reaccionar con sustitutos nucleófilos en el reactivo ligador. Los azúcares del anticuerpo glucosilado pueden oxidarse para formar aldehído o grupos de la cetona que pueden reaccionar con el grupo de la amina de reactivos ligadores o fármaco. Los grupos de la base de Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable o pueden reducirse para formar enlaces de la amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o con meta-periodato de sodio puede producir carbonilo (aldehído y cetona) grupos en la proteína que puede reaccionar con grupos adecuados en el fármaco. En otra forma de realización, las proteínas que contienen serina N-terminal o residuos de la treonina pueden reaccionar con el meta-periodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehído en vez del primer aminoácido.
En una forma de realización preferida, el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención se prepara por la preparación de la porción ligadora por el fármaco seguida del acoplamiento entre un grupo nucleófilo del anticuerpo (por ejemplo el grupo SH de una porción de la cisteína) y un grupo electrófilo de la porción ligador de fármaco (por ejemplo, una maleimida).
1. Ligador de fármaco
La porción ligador de fármaco puede prepararse acoplando:
- el ligador con el fármaco,
- una parte del ligador con el fármaco antes de completar la síntesis del ligador,
- el ligador con una parte o un precursor del fármaco antes de completar la síntesis del fármaco, o - una parte del ligador con una parte o un precursor del fármaco antes de completar la síntesis del ligador y el fármaco.
Las reacciones de acoplamiento son reacciones bien conocidas por un experto en la materia entre un grupo nucleófilo y un grupo electrófilo.
El grupo nucleófilo puede ser particularmente un grupo amina, tiol o hidroxilo, y particularmente grupo hidroxilo o amina. En una forma de realización preferida es un grupo amina primario o secundario.
El grupo electrófilo puede ser un grupo del ácido carboxílico (COOH) opcionalmente en una forma activada o una porción de éster de carbonato activada.
Por “la forma activada” de un ácido carboxílico se supone un ácido carboxílico en el cual la porción de OH de la función de COOH se ha sustituido con un grupo saliente activado (LG) que permite el acoplamiento del grupo del ácido carboxílico activado con un grupo amino a fin de formar una unión de la amida y liberar el compuesto LG-H. Las formas activadas pueden ser ésteres activados, amidas activadas, anhídridos o haluros del acilo como cloruros del acilo. Los ésteres activados incluyen derivados formados por la reacción del grupo del ácido carboxílico con el N-hidroxibenzotriazol o N-hidroxisuccinimida.
Por “éster de carbonato activado” se supone éster de carbonato que comprende un OC (O) O porción en la cual O representa un buen grupo saliente que permite el acoplamiento del éster de carbonato activado con un grupo amino a fin de formar una porción del carbamato y liberar ROH compuesto. El grupo R de éster de carbonato activado incluye, sin limitación, el p-nitro-fenil, pentafluorofenilo, 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il y grupos bencilo, preferentemente grupos de pentafluorofenilo y el p-nitro-fenil.
Cuando el ligador presenta la fórmula siguiente (III):
Figure imgf000055_0001
la porción ligador de fármaco presenta la fórmula siguiente (IV):
Figure imgf000055_0002
y la última etapa de la síntesis de la porción ligador de fármaco es generalmente la copulación entre un compuesto de la fórmula siguiente (V):
Figure imgf000055_0003
donde L2 es como se define previamente y LG representa un grupo saliente particularmente un haluro como cloruro o un grupo derivado de N-hidroxisuccinimida, y un compuesto de la fórmula siguiente (VI):
H— (W)w-(Y)y- D (V|).
Cuando y = 1 y Y = PAB-carbonilo, el compuesto de la fórmula (VI) puede prepararse mediante el acoplamiento entre el fármaco (DH) y un compuesto de la fórmula siguiente (VII) o una forma protegida del mismo:
h-(W )„ -pab- co- or (VII)
donde W y w son como se define previamente y R es como se define en la definición de “éster de carbonato activado”.
Cuando el compuesto de la fórmula (VII) está en una forma protegida, la etapa final de la desprotección es necesaria.
Cuando y = 0, el compuesto (VI) presenta la fórmula H-(W) w-D, en donde (W)w y D están compuestos por unidades de aminoácidos. Por consiguiente, el compuesto (VI) puede prepararse en este caso por un método de síntesis peptídico convencional conocido por un experto en la materia.
2. Ah -ligador-fármaco
Una forma de realización preferida según la invención consiste en un acoplamiento entre una cisteína presente en el anticuerpo y un grupo electrófilo de la porción ligador de fármaco, preferentemente con una porción maleimida de fármaco presente en la porción de ligador de fármaco.
El acoplamiento de maleimida-cisteína puede llevarse a cabo por métodos conocidos por el experto en la materia.
En términos generales, los anticuerpos no contienen muchos, si alguno, grupos del tiol de la cisteína libres y reactivos que pueden unirse a una porción del fármaco. La mayor parte de residuos del tiol de la cisteína en anticuerpos existen como puentes disulfuro y deben reducirse con un agente reductor como el ditiotreitol (DTT) o TCEP, bajo condiciones de reducción parciales o totales. La carga (proporción del fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de varias diferentes maneras, incluyendo: (i) limitación del exceso molar de producto intermedio ligador por el fármaco (D-L) o reactivo ligador con relación al anticuerpo, (ii) limitación del tiempo de reacción de la conjugación o temperatura, y (iii) condiciones de reducción parciales o limitadas para la modificación del tiol de la cisteína.
La estructura del enlace disulfuro de IgG de humano está bien establecida (revisado en Liu y mayo, mAbs 4 (2012): 17-23). Existe de hecho mucho parecido y algunas diferencias en cuanto a las estructuras del enlace disulfuro de las 4 subclases del IgG de humano, a saber IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Todas las subclases de IgG contienen invariablemente 12 puentes disulfuro intracatenarios y las diferencias residen en sus enlaces disulfuro intercatenarios formados entre cadenas pesadas y ligeras. Cada enlace disulfuro intracatenario se asocia con un dominio de IgG individual, es decir variable (VL y VH) y constante (CL, CH1, CH2 y CH3) dominios. Las 2 cadenas pesadas se unen en su región de bisagra por una cantidad variable de puentes disulfuro: 2 para IgG1 e IgG4, 4 para IgG2 y 11 para IgG3. Las cadenas pesadas y ligeras del IgG1 se conectan por un enlace disulfuro entre el último residuo de la cisteína de la cadena ligera y el quinto residuo de la cadena pesada, mientras que para las otras subclases, IgG2, IgG3 e IgG4, la cadena ligera se une a la cadena pesada por un enlace disulfuro entre el último residuo de la cisteína de la cadena ligera y el tercer residuo de la cisteína de la cadena pesada, que se ubica a la interconexión de VH y dominios CH1. Las estructuras del enlace disulfuro además de estas estructuras clásicas se han descrito para IgG2 e IgG4 (revisado en Liu y mayo, mAbs 4 (2012): 17-23). Los enlaces disulfuro intercatenarios se encuentran muy expuestos al solvente y son por consiguiente mucho más reactivos que los enlaces disulfuro intracatenarios, que se cubren completamente en estructuras de la lámina de la beta antiparalelas dentro de cada dominio y no se exponen al solventes. Por estos motivos, independientemente del isotipo del anticuerpo, el acoplamiento ocurrirá en residuos de la cisteína expuestos intercatenarios después de la reducción leve. Cada puente disulfuro intercatenario puede formar así, teóricamente, dos sitios de la conjugación.
Los grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con el 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos del tiol reactivos asimismo pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) mediante genomanipulación, dos, tres, cuatro, o más residuos de la cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos del mutante que comprenden uno o más residuos aminoacídicos de la cisteína no naturales). La patente US n° 7.521.541 muestra anticuerpos genomanipulados por la introducción de aminoácidos de la cisteína reactivos.
Los aminoácidos de la cisteína pueden manipularse genéticamente en sitios reactivos en un anticuerpo y que no forman enlaces disulfuro intracatenarios o intermoleculares (Junutula, et al., 2008b Naturaleza Biotech., 26 (8):925-932; Dornan y al (2009) Blood 114 (13):2721-2729; patente US n° 7.521.541; patente US n° 7.723.485; documento WO2009/052249). Los tioles de la cisteína manipulados genéticamente pueden reaccionar con reactivos ligadores de la presente invención que presentan el reactivo del tiol, los grupos electrófilos como maleimida o amidas de halo alfa para formar ADC con los anticuerpos genomanipulados de cisteína y las porciones del fármaco. La ubicación de la porción del fármaco puede así diseñarse, controlarse y conocerse. La carga del fármaco puede controlarse ya que los grupos del tiol de la cisteína manipulados genéticamente por lo común reaccionan con reactivos ligadores reactivos a tiol o reactivos ligadores de fármaco en alto rendimiento. La genomanipulación de un anticuerpo IgG para introducir un aminoácido de la cisteína por la sustitución a un sitio individual en la cadena ligera o pesada proporciona dos nuevas cisteínas en el anticuerpo simétrico. Un fármaco que carga aproximadamente 2 puede lograrse con aproximadamente la homogeneidad del producto de la conjugación ADC.
Donde más de un grupo nucleófilo o grupo electrófilo del anticuerpo reaccionan con un producto intermedio ligador de fármaco o reactivo ligador seguido del reactivo de la porción del fármaco, luego el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribución de porciones del fármaco unidas a un anticuerpo, por ejemplo 1, 2, 3, etc. Los métodos de la cromatografía líquida como fase inversa polimérica (PLRP) e interacción hidrófoba (HIC) pueden separar compuestos en la mezcla por el valor de carga del fármaco. Las preparaciones de ADC con un valor de carga del fármaco individual (p) pueden aislarse, sin embargo, este valor de carga individual ADC todavía pueden ser mezclas heterogéneas porque las porciones del fármaco pueden estar fijadas, mediante el ligador, a diferentes sitios en el anticuerpo.
Para algunos conjugados fármaco-anticuerpo, la proporción del fármaco puede ser limitada por la cantidad de sitios de la unión en el anticuerpo. La elevada carga del fármaco, por ejemplo proporción del fármaco> 5, puede causar la agregación, la insolubilidad, la toxicidad o la pérdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados fármaco-anticuerpo. Por lo común, las porciones del fármaco menores que el máximo teórico se conjugan a un anticuerpo durante una reacción de la conjugación.
La carga de fármaco a la que se hace referencia como la proporción de anticuerpo-fármaco (DAR) es el número promedio de fármacos por agente aglutinante celular.
En caso del anticuerpo IgG1 e isotipos IgG4, donde los fármacos se unen con cisteínas después de la reducción del anticuerpo parcial, la carga del fármaco puede comprender desde 1 a 8 fármacos (D) por anticuerpo, es decir donde 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 porciones del fármaco se unen covalentemente al anticuerpo.
En caso de un anticuerpo el isotipo de IgG2, donde los fármacos se unen con cisteínas después de la reducción del anticuerpo parcial, la carga del fármaco puede comprender desde 1 a 12 fármacos (D) por anticuerpo, es decir donde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 porciones del fármaco se unen covalentemente al anticuerpo. Las composiciones de ADC incluyen recolecciones de agentes aglutinantes celulares, por ejemplo anticuerpos, conjugados con un intervalo de fármacos, de 1 a 8 o 1 a 12.
El número promedio de fármacos por anticuerpo en preparaciones de ADC de reacciones de la conjugación puede caracterizarse por medios convencionales como luz ultravioleta, HPLC de fase inversa, HIC, espectrometría de masas, ensayo de ELISA y electroforesis.
Como forma de realización no limitativa, se presenta en la presente memoria la conjugación con el anticuerpo IGF-1R c208F2. En este caso, el fármaco se acopla con por lo menos una cisteína seleccionada de i) para la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 28, el residuo Cys. en ubicación 214 y ii) para la cadena pesada de secuencia SEC ID n° 23, los residuos Cys. en ubicación 223, 229 y 232.
Como forma de realización no limitativa, se presenta en la presente memoria la conjugación con el anticuerpo IGF-1R c208F2. En este caso, el fármaco se acopla a dos, tres o cuatro, cisteínas seleccionadas de i) para la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 28, el residuo Cys. en ubicación 214 y ii) para la cadena pesada de secuencia SEC ID n° 23, los residuos Cys. en ubicación 223, 229 y 232
Como forma de realización no limitativa, se presenta en la presente memoria la conjugación con el anticuerpo IGF-1R hz208F2 (var. 1). En este caso, el fármaco se acopla con por lo menos una cisteína seleccionada de i) para la cadena ligera de secuencia SEC ID n° 39, el residuo Cys. en ubicación 214 y ii) para la cadena pesada de secuencia SEC ID n° 37, los residuos Cys. en ubicación 223, 229 y 232.
Como forma de realización no limitativa, se presenta en la presente memoria la conjugación con el anticuerpo IGF-1R hz208F2 (var. 3). En este caso, el fármaco se acopla a dos, tres o cuatro, cisteínas seleccionadas de i) para la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 40, el residuo Cys. en ubicación 214 y ii) para la cadena pesada de secuencia SEC ID n° 38, los residuos Cys. en ubicación 223, 229 y 232.
El mismo enfoque podría fácilmente adaptarse a otros anticuerpos tal como, por ejemplo, los anticuerpos de Axl. Una alternativa consiste en el acoplamiento de la lisina. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos residuos de la lisina que no reaccionan con el producto intermedio ligador de fármaco (D-L) o reactivo ligador. Sólo la mayor parte de grupos de la lisina reactivos pueden reaccionar con un reactivo ligador reactivo de amina.
Asimismo, sólo la mayor parte de grupos del tiol de la cisteína reactivos pueden reaccionar con un reactivo ligador reactivo de tiol.
Donde los compuestos de la invención se unen con lisinas, la carga del fármaco puede comprender desde 1 a 80 fármacos (D) por anticuerpo celular, aunque un límite superior de 40, 20, 10 o 8 pueda preferirse. Las composiciones de ADC incluyen recolecciones de agentes aglutinantes celulares, por ejemplo anticuerpos, conjugados con un intervalo de fármacos, de 1 a 80, 1 a 40, 1 a 20, 1 a 10 o 1 a 8.
El ADC de la fórmula (I) según la invención puede presentar la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En la presente invención mediante “farmacéuticamente aceptable” se hace referencia a que puede usarse en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente, no tóxica, segura, y ni biológicamente, ni de otra manera indeseable, y que es aceptable para el uso veterinario así como para el uso farmacéutico de humano.
Mediante “sal farmacéuticamente aceptable” de un compuesto se hace referencia a una sal que es farmacéuticamente aceptable como se ha definido en la presente memoria y que presenta la actividad farmacológica deseada del compuesto parental.
Las sales farmacéuticamente aceptables particularmente comprenden:
(1) las sales de adición de un ácido farmacéuticamente aceptable formadas con ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables como ácidos clorhídricos, bromhídricos, fosfóricos, sulfúricos y similares; o formadas con ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tal como ácidos acético, trifluoroacético, propiónico, succínico, fumárico, málico, tartaric, cítricos, ascórbicos, maleicos, glutámicos, benzoicos, salicílicos, toluensulfónicos, metanosulfónicos, esteáricos, lácticos y similares; y
(2) las sales de adición de una base farmacéuticamente aceptable formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto parental es o sustituido por un ión metálico por ejemplo un ion metálico alcalino, un ión de metal alcalinotérreo o un ión de aluminio; o se coordina con una base orgánica farmacéuticamente aceptable como lisina, arginina y similar; o con una base inorgánica farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, potasa, hidróxido de calcio y similar.
Estas sales pueden prepararse a partir de los compuestos de la invención que contienen una función de base o ácida y los ácidos o bases correspondientes que utilizan métodos químicos convencionales.
V - Tratamiento
Finalmente, la invención se refiere a un ADC como se describe anteriormente para el uso como un medicamento, particularmente en el tratamiento contra el cáncer.
Un objeto de la presente invención adicional es un (I) compuesto formal como se ha definido anteriormente para el uso como producto medicinal, particularmente para el tratamiento contra el cáncer.
La presente invención asimismo se refiere al uso de un compuesto de la fórmula (I) tal como se ha definido anteriormente para producir un producto medicinal, particularmente conceptualizado para el tratamiento contra el cáncer.
La presente invención asimismo se refiere a un método para el tratamiento contra el cáncer que comprende la administración a una persona que lo necesita de un soporte efectivo de un compuesto de la fórmula (I) tal como se ha definido anteriormente.
Los cánceres pueden preferentemente seleccionarse a través de cánceres relacionados con diana incluso células tumorales que expresan o obreexpresan toda o parte de la diana en su superficie.
Más particularmente, los cánceres son cáncer de mama, cáncer del colon, carcinoma esofágico, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, glioma, cáncer de pulmón, melanoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer renal, cáncer de la tiroides, cáncer endometrial uterino, schwannoma, neuroblastoma, cáncer escamoso oral, mesotelioma, leiomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, leucemia aguda, carcinoma colorrectal, melanoma, adenocarcinoma ductal pancreático y cualquier fenómeno de la resistencia al fármaco o cánceres.
Para evitar la duda, por cánceres que expresan diana con resistencia al fármaco, deben entenderse no únicamente cánceres resistentes que inicialmente expresan la diana sino asimismo cánceres que inicialmente no expresan o sobreexpresan la diana, pero que expresan la diana una vez que se hayan hecho resistentes a un tratamiento anterior.
Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el ADC como se describe en la memoria.
Más particularmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el ADC de la invención con por lo menos un excipiente y/o un vehículo aceptable farmacéutico.
En la presente descripción, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “ excipiente” pretenden hacer referencia a un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica que no provoca reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del(de los) compuesto(s) activo(s), un aumento de su vida útil y/o de su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en la solución o sea una mejora de su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables y excipientes son conocidos y se adaptarán por el experto en la materia como una función de la naturaleza y del modo de administración del(de los) compuesto(s) activo(s), seleccionado(s).
El principio activo puede administrarse en formas unitarias de administración, en una mezcla con portadores farmacéuticos convencionales, a animales o a seres humanos. Las formas de unitarias adecuadas de la administración comprenden formas de vía oral y formas para la administración vía parenteral (subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa).
Como composiciones sólidas, para la administración oral, pueden utilizarse comprimidos, soluciones viscosas gelificadas, polvos (cápsulas de la gelatina duras o suaves) o gránulos. En estas composiciones, el principio activo de la invención se mezcla con uno o más diluyentes inertes como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, en un flujo de argón. Estas composiciones asimismo pueden comprender sustancias además de diluyentes, por ejemplo uno o más lubricantes como estearato de magnesio o talco, un agente de colorante, un de recubrimiento (comprimidos recubiertos) o un barniz.
Las composiciones estériles para la administración parenteral pueden ser preferentemente soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas. Como solvente o vehículo, pueden utilizarse agua, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, particularmente aceite de oliva, ésteres orgánicos inyectables por ejemplo oleato de etilo u otros solventes orgánicos adecuados. Estas composiciones asimismo pueden contener adyuvantes, particularmente agentes de humectación, isotónicos, emulsionantes, de dispersión y estabilización. La esterilización puede llevarse a cabo de varias maneras, por ejemplo por la filtración de saneamiento, al incorporar la esterilización de agentes en la composición, por la radiación o al calentarse. Asimismo pueden prepararse en la forma de composiciones estériles sólidas que pueden disolverse en el momento del uso en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable.
Preferentemente, estos ADCs se administrarán por la ruta sistémica, particularmente por la ruta intravenosa, por la ruta intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la ruta oral. De una manera más preferida, la composición que comprende el ADCs según la invención se administrará varias veces, en una forma secuencial.
La invención se refiere asimismo a un kit que comprende por lo menos i) un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención y/o una composición farmacéutica según la invención y ii) una jeringa o vial o ampolleta en la cual el conjugado anticuerpo-fármaco y/o la composición farmacéutica se disponen.
Sus modos de administración, dosis y formas farmacéuticas óptimas pueden determinarse según los criterios generalmente considerados en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente tal como, por ejemplo, la edad o peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios observados.
Otras características y ventajas de la invención aparecen en la continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras cuyas leyendas se representan a continuación.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-1C: Unión de anticuerpos a IGF-1R humana de origen natural mediante análisis FACS. La figura 1A representa la curva de titulación, en la estirpe celular MCF-7. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. La figura 1B representa la EC50 de anticuerpos anti-IGF-1R de origen murino y quiméricos en la estirpe celular MCF-7. La figura 1 representa la Bmáx de anticuerpos anti-IGF-1R quiméricos en la estirpe celular MCF-7.
Figuras 2A-2B: Evaluación del reconocimiento de hIGF-1R utilizando células transfectadas vs no transfectadas. La figura 2A) representa las curvas de titulación de un Ab anti-IGF-1R quimérico en estirpe celular IGF-1R+. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. La figura 2B representa la unión de Abs anti-IGF-IR quiméricos en la estirpe celular humana IGF-1R- .
Figuras 3A-3B: Evaluación de la especificidad de los Abs para IGF-1R vs hIR usando células transfectadas. La figura 3A representa la unión de Ab anti-IGF-1R de origen murino en la estirpe de células transfectadas hIR+. La figura 3b representa la unión de Ab anti-IGF-1R quimérico en la estirpe celular IR+. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. Se introdujo GRO5 anti-hIR Mab (Calbiochem) como control positivo. Figura 4: Unión de Ab anti-IGF-1R de origen murino sobre la estirpe celular IM-9. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. Se introdujo GRO5 anti-hIR Mab como control positivo.
Figuras 5A-5C: Evaluación del reconocimiento del IGF-1R de primate. La figura 5A representa las curvas de titulación del Ab anti-IGF-1R quimérico en la estirpe celular COS-7. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. La figura 5B representa la EC50 de anticuerpos anti-IGF-1R tanto de origen murino como quimérico en la estirpe celular COS-7. La figura 5C representa la EC50 de anticuerpos anti-IGF-1R quiméricos tanto en NIH 3T3 como en células transfectadas hIGF1R+ y estirpe celular COS-7.
Figura 6 : Los sensogramas obtenidos mediante Biacore X100 basado en una tecnología SPR usando un sensorchip CM5 activado con más de 11000 RU de anticuerpo de ratón anti-Tag His químicamente injertado a la matriz de carboximetil-dextrán. El experimento se llevó a cabo con una velocidad de flujo de 30 pl/min a 25°C utilizando HBS-EP+ como el amortiguador de dilución circulante y de las muestras. La figura mostró la superposición de 4 sensogramas independientes alineado en el eje X al principio de la primera inyección de los analitos y en el eje Y por el valor inicial de referencia definido justo antes de esta primera inyección. Los sensogramas obtenidos mediante la captura de la secuencia basada en humanos de la IGF1R soluble recombinante están marcados por rombos. Los sensogramas obtenidos mediante la captura de la secuencia basada en mono cinomolgo de la IGF1R soluble recombinante están marcados por triángulos. Los símbolos blancos corresponden a los ciclos en blanco (5 inyecciones del amortiguador circulante) y los símbolos negros corresponden a las inyecciones del creciente intervalo de concentraciones de c208F2 (5, 10, 20, 40 y 80 nM).
Figura 7: Evaluación del efecto intrínseco de anticuerpos anti-hIGF-1R en la fosforilación del receptor en comparación con IGF1.
Figura 8: Inhibición de la fosforilación de IGF-1R en respuesta a IGF-1 por el anti-hIGF-1R de origen murino. Figura 9: Intensidad de señal de superficie celular de anticuerpos anti-IGF-IR se regula por disminución después de la incubación de células a 37°C. Se incubaron las células MCF-7 a 4°C o 37°C durante 4 h con 10 pg/ml de Abs. La figura representa AMFI.
Figuras 10A-10B: Descomposición superficial del anticuerpo. Anticuerpo unido a superficie celular se evaluó después de 10, 20, 30, 60 y 120 min a 37°C. La figura 10A representa el % de restante IGF-1R en comparación con la intensidad de la señal medida a 4°C. La figura 10B representa el cálculo de vida media utilizando Software Prims y usando ajuste exponencial del decaimiento.
Figura 11: Los Abs anti-hIGF-1R se internalizan. Las células se incubaron con 10 pg/ml de Abs murinos de 0, 30 y 60 min a 37°C. las células fueron permeabilizadas o no y se incubaron con IgG-Alexa 488 secundario antirratón. La membrana corresponde a la intensidad de señal sin permeabilización. El total corresponde a la intensidad de señal después de la permeabilización celular y el citoplásmico corresponde al Ab internalizado. El nombre de cada anticuerpo evaluado se muestra en la parte superior de cada gráfico.
Figuras 12A-12B: Formación de imagen de la internalización del Ab. Figura 12A: Células MCF-7 incubadas con m208F2 durante 20 min a 4°C y lavadas antes de su incubación (W) a 37°C durante 15 (X), 30 (Y) y 60 (Z) min. Las células se fijaron y permeabilizaron. El Ab de m208F2 se reveló usando la IgG Alexa488 antirratón y Lamp-1 usando un anticuerpo de conejo anti-Lamp-1 y con una IgG Alexa 555 anti-conejo secundaria. figura 12B: Las células MCF-7 fueron incubadas durante 30 minutos a 37°C con anticuerpos murinos anti-hIGF-1R y se tiñeron como se describió anteriormente. la colocalización se identificó usando el programa informático accesorio del marcador de colocalización del software ImageJ.
Figura 13: Participación de la vía lisosómica en la degradación de anticuerpos.
Figura 14: El pH ácido disminuye la capacidad de unión de los cinco anticuerpos anti-IGF-1R de origen murino.
Figuras 15A-15D: Unión característica de la primera forma humanizada de c208F2 Mab. Propiedades de la unión del hz208F2 VH3/VL3 mAb se evaluaron sobre la estirpe celular humana MCF-7 (A), en la estirpe celular de mono COS-7 (B) y en la estirpe celular transfectada de origen murino que expresan el receptor de insulina humana (C). La unión tanto del 208F2 mAbs murino como el quimérico se evaluó en paralelo. El clon GRO5 del anticuerpo anti-hIR fue utilizado para verificar la expresión de hIR en la estirpe de células transfectadas (D).
Figura 16: desintegración superficial de anticuerpo hz208F2 VH3/VL3.
Figura 17: Superposición de sensogramas obtenidos con un dispositivo Biacore X100 basado en SPR a una temperatura de 25°C con un chip de sensor CM5 activado en ambas celdas de flujo de células con aproximadamente 12.000 RU de anticuerpos monoclonales anti-TagHis de ratón químicamente injertados a la matriz de carboximetildextrano utilizando HBS-EP+ como el amortiguador de corrimiento con una velocidad de flujo de 30 pl/min. Cada uno de los sensogramas (primero de ellos marcado por triángulos y el segundo marcado por rombos) corresponde a un ciclo completo:
1- Inyección durante un minuto de una solución de h-IGF1R recombinante (10 pg/ml) en la segunda celda de flujo.
2- Para el primer sensograma: 5 inyecciones de amortiguador durante 90 segundos cada una.
Para el segundo sensograma: cinco inyecciones en el intervalo de concentraciones cada vez mayor de las soluciones de anticuerpo anti-IGF1R c208F2 durante 90 s cada una.
3- Un retraso de 300 s para la determinación de las tasas de la cinética de disociación.
4- Una regeneración de la superficie mediante una inyección durante 45 s de un amortiguador de 10 mM glicina, HCl a pH 1.5.
Figura 18: El sensograma correspondiente a la resta del sensograma en blanco (5 inyecciones de HBS-EP+) al sensograma obtenido con el intervalo cada vez mayor de concentraciones de soluciones anti-IGF1R c208F2 se presenta en color gris. El sensograma teórico correspondiente al modelo 1:1 con los siguientes parámetros: kon = (1.206 ± 0.036) x 106 M'1.s'1, koff = (7.81 ± 0.18) x 10-5 s-1, Rmáx = 307.6 ± 0.3 RU es presentado por una fina línea negra. Las concentraciones calculadas de c208F2 se presentan en el gráfico: sólo la concentración más alta (24 nM) se considera como una constante).
Figura 19: Las constantes de disociación corresponden a la media de los cuatro experimentos de ejecución para cada anticuerpo y corresponden a la relación: koff/kon x 1012 que va a ser expresada en la unidad pM. Las barras de error corresponden al error estándar (n = 4).
Figura 20: las semividas corresponden a la media de los cuatro experimentos ejecutado para cada anticuerpo y corresponden a la relación: Ln(2)/koff/3600 que va a ser expresada en la unidad h. Las barras de error corresponden al error estándar (n = 4).
Figura 21: Citotoxicidad celular de anti-IGF-1R, junto con tres compuestos diferentes. Cinco anticuerpos quiméricos anti-IGF-1R se acoplaron con E-13, G-13 o F-63. Un de anticuerpo irrelevante c9G4 asimismo se copuló con los mismos compuestos.
Figuras 22A-22C: evaluación en vivo de c208F2-E-13 (Figura 22A), c208F2-G-13 (Figura 22B) y c208F2-F-63 (Figura 22) en el modelo de xenoinjerto de MCF-7.
Figuras 23A-23B: evaluación en vivo de c208F2-E-13 (Figura 23A), c208F2-G-13 (Figura 23B) comparado con el control ADC (c9G4-E13 y c9G4-G-13) en el modelo de xenoinjerto de MCF-7.
Figuras 24A, 24B y 24C: Especificidad de unión de 1613F12 en proteína rhAxl-Fc inmovilizada (24A), rhDtk-Fc (24B) o proteínas rhMer-Fc (24C) por ELISA.
Figura 25: Análisis FACS de 1613F12 uniéndose a células tumorales humanas
Figura 26: Experimentos mediante ELISA que estudian la unión en la proteína rhAxl-Fc de m1613F12 y hz1613F12.
Figuras 27A, 27B y 27C: Microscopia de inmunofluorescencia de células SN12C después de la incubación con 1613F12. Figura 27A- Fotografías de las condiciones control del isotipo mIgG1 tanto para la membrana como la tinción intracelular. Figura 27B- Tinción de la membrana. Figura 27C- Tinción intracelular de ambos receptores de Axl con 1613F12 y del marcador EEA1 del endosoma temprano. A continuación se presentan las superposiciones de imagen y las colocalizaciones visualizadas están indicadas por las flechas.
Figuras 28A y 28B: La figura 28A representa la actividad citotóxica de hz1613F12-E-13 tanto en las estirpes celulares SN12c (Axl+) como MCF-7 (Axl- ). La figura 28B representa la actividad citotóxica de hz1613F12-G-13 tanto en las estirpes celulares SN12c (Axl+) como MCF-7 (Axl- ).
Figuras 29A y B: Actividad in vivo del anticuerpo trastuzumab conjugado ya sea con compuestos E-13 (29A) o G-13 (29B) en el modelo de xenoinjerto Calu-3.
Figuras 30A a 30C: Actividad in vivo del anticuerpo trastuzumab conjugado ya sea con compuestos E-13 (30A) o G-13 (30B) o solas (figura 30C) en el modelo de xenoinjerto JIMT-1.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos murinos contra IGF-1R ECD
Para generar anticuerpos monoclonales murinos (Mabs) contra el dominio extracelular (ECD) de humano del receptor IGF-1 humano (hIGFIR), se inmunizaron 5 ratones BALB/c s.c. 3 veces con 10 |jg de la proteína rhIGF-1R (R&D Systems, Cat N°391-GR). Como alternativa, se realizaron tres inmunizaciones adicionales con 10 jg del dominio extracelular (ECD) murino de IGF-1R (R&D Systems, Cat N° 6630-GR /Fc) en algunos animales. La primera inmunización se realizó en presencia de adyuvante completo de Freund (Sigma, St. Louis, MD, EUA). Se agregó adyuvante incompleto de Freund (Sigma) para las siguientes inmunizaciones. Tres días antes de la fusión, los ratones inmunizados fueron potenciados con 10 jg de proteína rhIGF-1R. Luego los esplenocitos y los linfocitos se prepararon por la perfusión del bazo y troceando los nódulos linfáticos proximales, respectivamente, recogido de 1 de los 5 ratones inmunizados (seleccionado después de la titulación de sueros de todos los ratones) y se fusionaron a SP2/0-Ag14 células de la mieloma (ATCC, Rockville, MD, EE.UU). El protocolo de la fusión se describe por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Las células fusionadas se someten luego a la selección del HAT. En términos generales, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, sobre todo del origen del murino, es posible referirse a métodos que se describen particularmente en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pps 726, 1988). Aproximadamente 10 días después de la fusión, las colonias de células híbridas se detectaron. Para el cribado primario, los sobrenadantes de hibridomas se evaluaron para la secreción de Mabs se aumenta contra la proteína IGF-1R ECD por el análisis FACS usando células tumorales de MCF7 de pecho humano (ATCC) y/o células de COS7 de mono (riñón-SV40 del mono verde africano transformado) que expresan IGF-1R de mono en su superficie celular. Más exactamente, para la selección por la citometría de flujo, 105 células (MCF7 o COS7) se sembraron en placa en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en PBS que contiene BSA del 1% y azida de sodio del 0.01% (amortiguador de FACS) a 4°C. Después de una centrifugación de dos minutos a 2000 revoluciones por minuto, el amortiguador se eliminó y los sobrenadantes del hibridoma para analizarse se agregaron. Después de 20 minutos de la incubación a 4°C, las células se lavaron dos veces y un anticuerpo antirratón de cabra 488 conjugado Alexa 1/500° diluido en el amortiguador de FACS (#A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, EE.UU) se agregó e incubó durante 20 minutos a 4°C. Después de un lavado final con el amortiguador de FACS, las células se analizaron por FACS (Facscalibur, Becton Dickinson) después de la adición del yoduro del propidio a cada tubo a una concentración final de 40 pg/ml. Los pocillos que contienen células solas y células incubadas con Alexa secundaria anticuerpo 488 conjugado se incluyeron como controles negativos. Los controles del isotipo se usaron en cada experimento (Sigma, en cuanto a M90351MG). Por lo menos 5000 células se evaluaron para calcular el valor medio de la intensidad de la fluorescencia (MFI). Además un ensayo de la incorporación se llevó a cabo a fin de sólo seleccionar anticuerpos internalizantes. Para este ensayo, la estirpe de célula tumoral de MCF7 se cultivó en 1640 RMPI sin el fenol rojo con L-glutamina del 1% y el 10% de FACS durante 3 días antes del experimento. Las células se separaron luego usando la tripsina y 100 pl de una suspensión celular a 4.105 célula/ml se siembran en placa en placas multipocillo 96 en RPMI1640 sin el fenol rojo con L-glutamina del 1% y suero fetal de bovino del 5%. Después de una centrifugación de dos minutos a 2000 revoluciones por minuto, las células eran resuspendidas en 50 pl de sobrenadantes del hibridoma o de soluciones de anticuerpo de control (positivo y el isotipo controla a 1 pg/ml). Después de un período de incubación de 2° minutos a 4°C, las células se centrifugaron 2 minutos a 2000 revoluciones por minuto y se suspendieron de nuevo en medio de cultivo completo frío (4°C) o caliente (37°C). Las células se incubaron luego durante 2 horas a 37°C o a 4°C. Luego las células se lavaron tres veces con el amortiguador de FACS. El anticuerpo de Ig de cabra antirratón 488-marcado Alexa se incubó durante 20 minutos y células se lavó tres veces antes del análisis de FACS tras el yoduro del propidio población celular negativa.
Siguiendo el análisis FACS, dos parámetros se determinaron: (i) la diferencia de la señal fluorescente detectada en la superficie de células incubadas a 4°C con los obtenidos con las células incubadas a 37°C con un sobrenadante del hibridoma y (ii) el porcentaje de IGF1R restante en la superficie celular.
El porcentaje de hIGF 1R restante se calcula así: % IGF-1R restante = (MFI Ab 37°c/MFI Ab 4°c) x 100.
Además se realizaron tres ELISA (antes o después de clonarse) para estudiar la unión de anticuerpos en las proteínas humanas (hIGF-1R) y murinas (mIGF-1R) recombinantes y en la proteína de receptor de insulina humana (hIR) recombinante. El hibridoma que secreta anticuerpo muestra unión a rh- y/o rm-IGF-1R y no unión a rhIR se mantuvo. Brevemente, las placas de ELISA de 96 pocillos (Coprotagonista 3690, Salar, NY, EE.UU) se recubrieron 100 pl/pocillo de la proteína rhIGF-1R (R&D Systems, cat. N°. 391-GR) a 0.6 pg/ml o proteína rmIGF 1R (R&D Systems cat N°6630-GR/Fc) a 1 |jg/ml o proteína rhIR (R&D Systems, cat N°1544-IR/CF) a 1 |jg/ml en PBS durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon luego con PBS que contiene gelatina de 0.5% (#22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) durante 2 h a 37°C. Una vez el amortiguador de saturación desechado por sacudir placas, 100 j l de cada dilución del sobrenadante se agregaron a cada pocillo (o sobrenadante del hibridoma no diluido o diluciones en serie de sobrenadante) e incubaron durante 1 h a 37°C. Después de tres lavados, 100 j l de Ig de cabra antirratón policlónica conjugada por la peroxidasa de rábano (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, Pa , EE.Uu .) se agregó a una dilución 1/5000 en PBS que contiene gelatina del 0.1% y Tween 20 del 0.05% (w:w) durante 1 h a 37°C. Luego, las placas de ELISA se lavaron 3 veces y el sustrato de TMB (#UP664782, Uptima, Interchim, Francia) se agrega. Después de un período de incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió utilizando ácido sulfúrico 1 M y se mide la densidad óptica a 450 nm.
El hibridoma secretor de anticuerpo de interés se expandió y se clonó por la dilución de límite. Una vez isotipado, un clon de cada código se expandió y congeló. Cada anticuerpo de interés se produjo en sistemas de producción in vitro denominados CellLine (Integra Biosciences) para la caracterización adicional.
Ensayos adicionales para dirigirse a los análisis de FACS de especificidad de unión se llevaron a cabo en células IM9 (IR de humano que expresan linfoblastos B) así como en células transfectadas de hIGF-1R versus células no transfectadas.
Todos los datos correspondientes a los anticuerpos seleccionados se resumieron en la tabla 9 y se demuestra que los cinco anticuerpos seleccionados fuertemente reconocen IGF-1R de humano de origen natural expresado en células del cáncer de mama MCF-7 o en células transfectadas. Asimismo reconocen IGF-1R de mono en células COS 7. Estos anticuerpos no se reaccionan de manera cruzada con el receptor de la insulina de humano muy expresado en células IM9. Debe apreciarse que estos anticuerpos reconocen de manera escasa la proteína de rhIGF-1R ECD cuando se recubre directamente a placas de ELISA.
Tabla 9
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Ejemplo 2: Unión de anticuerpo a IGF-1R de origen natural de humano por análisis de FACS
Los cinco anticuerpos IGF-1R murinos son quimerizados. Las propiedades de unión tanto del los anticuerpos IGF-1R quiméricos como murinos fueron evaluadas por análisis de FACS tras la estirpe celular del adenocarcinoma de pecho MCF-7 de humano (ATCC#HTB-22) usando concentraciones del anticuerpo cada vez mayores. Con ese objetivo, las células (1x106 células/ml) se incubaron con anticuerpos IGF-1R durante 20 minutos a 4°C en el amortiguador de FAc S (PBS, BSA del 0.1%, NaN3 del 0.01%). Se lavaron luego 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado conectado con Alexa 488 durante 20 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad antes de lavarse 3 veces en el amortiguador de FACS. La unión de anticuerpos anti-IGF-1R inmediatamente se llevó a cabo en células viables que se identificaron usando el yoduro del propidio (que tiñe células muertas). El máximo de la intensidad de la señal obtenida con cada anticuerpo se diseñó como Bmax y se expresa en la media de la intensidad de la fluorescencia (MFI). El EC50 de unión expresado para en la molaridad (M) se calculó usando un análisis de la regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).
La curva de la titulación de cada Ab quimérico o murino demostró que todos los anticuerpos generados presentan capacidad para reconocer la forma de IGF-1R de origen natural con un perfil de saturación común (Figura 1A). A fin de clasificar anticuerpos y comparar las propiedades de unión de los Ab murino y quimérico, la unión EC50 de cada compuesto se determinó usando un análisis de regresión no lineal. La comparación del EC50 de cada Ab murino con su forma quimérica correspondiente mostró que las 2 formas mostraron las mismas propiedades de unión que demuestran que la quimerización de Ab no afectó el reconocimiento IGF-1R (Figura 1B-C). EC50 y los valores de Bmax de anticuerpos quiméricos se resumieron en la tabla 10.
Tabla 10
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Ejemplo 3: Confirmación de la especificidad de anticuerpo utilizando células transfectadas IGF-1R o IR o células IM9 que expresan niveles significativos de IR
A fin de confirmar la especificidad de los anticuerpos generados para IGF-1R versus IR, los transfectantes estables que expresan hIGF-1R o hIR fueron evaluados por análisis de FACS. Brevemente, las concentraciones cada vez mayores de mAb quimérico se incubaron con células durante 20 minutos a 4°C en el amortiguador de FACS (PBS, 0.1%BSA, NaN3 del 0.01%). Las células se lavaron luego 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado conectado con Alexa 488 antes de incubarse durante 20 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad y luego se lavaron 3 veces en el amortiguador de FACS. La unión de anticuerpos anti-IGF-1R inmediatamente se llevó a cabo en células viables que se identificaron usando el yoduro del propidio (que tiñe células muertas). La unión EC50 expresada para en la molaridad (M) se calculó usando un análisis de la regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).
Las curvas de la titulación obtenidas en la estirpe celular transfectada de hIGF-1R (Figura 2A) versus las células no transfectadas (Figura 2B) confirmaron la especificidad de unión de Abs quiméricos para IGF-1R de humano. EC50 y los valores de Bmax se resumieron en la tabla 11.
Tabla 11
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A fin de verificar la ausencia de unión tanto de anticuerpos quiméricos como murinos en hIR, una estirpe celular estable que expresa IR de humano (hIR) se usó. El reconocimiento de la superficie celular humana hIR tanto por por Ab murino como quimérico se llevó a cabo por análisis de FACS. La concentración cada vez mayor de mAb murino o quimérico se incubó en la estirpe celular transfectada hIR durante 20 minutos a 4°C en el amortiguador de FACS (PBS, 0.1%BSA, NaN3 del 0.01%). Las células se lavaron luego 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado conectado con Alexa 488 antes de incubarse durante 20 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad y luego se lavaron 3 veces en el amortiguador de FACS. La unión de anticuerpos anti-IGF-1R inmediatamente se llevó a cabo en células viables que se identificaron usando el yoduro del propidio (que tiñe células muertas). La unión EC50 expresada en la molaridad (M) se calculó usando un análisis de la regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0). El anticuerpo anti-hIR se clona GRO5 se usó como controles positivos. Los anticuerpos 9G4 murinos y quiméricos se introdujeron como anticuerpos irrelevantes. El alto nivel de expresión de hIR en la superficie celular de las células transfectadas se confirmó usando el anticuerpo anti-hIR comercial GRO5 (Figura 3A y 3B). Incluso usando elevadas concentraciones de hIGF-1R Ab murino (Figura 3A) o quimérico (Figura 3B), no se observó unión sobre la superficie celular de células transfectadas hIR . Estos resultados demostraron que ni el Ab Ab anti-hIGF-1R murino ni quimérico reconocieron hIR.
Esta especificidad del reconocimiento de hIGF-1R versus IR asimismo se ha demostrado, por análisis de FACS, usando células de IM9, una estirpe celular del B-linfoma que expresa hIR (Figura 4). Para este análisis FACS, el protocolo era igual que el descrito anteriormente y anticuerpos murinos se usaron a fin de evitar la reactividad reticulada de Ab no humano secundario (las células de IM9 expresan Ig humana en su superficie celular). Los resultados presentados en la figura 4 demostraron otra vez que la señal prevista se observó utilizando el anticuerpo GRO5 anti-hIR mientras ninguno del anticuerpo murino evaluado mostró cualquier señal de unión significativa en esta estirpe celular.
Ejemplo 4: Unión del anticuerpo a IGF-1R natural de mono por análisis de Biacore y FACS
Uno del primer requisito previo para estudios de la toxicología reguladores es descubrir una especie de animal relevante a fin de evaluar el compuesto seleccionado. Como la serie de anticuerpos descritos en la presente memoria no es capaz de reconocer el IGF-1R murino, la especie más probable para la evaluación toxicológica es el primate no humano (NHP).
A fin de evaluar la unión de anticuerpos anti-IGF-1R en el IGF-1R de mono, la unión tanto de anticuerpos antihIGF-1R quiméricos como murinos fue evaluada primero por los análisis de FACS en la estirpe celular COS-7 que aumenta concentraciones del anticuerpo. Las células (1x106 células/ml) se incubaron con anticuerpos anti-IGF-1R durante 20 minutos a 4°C en el amortiguador de FACS (PBS, el 0.1%, BSA, NaN3 del 0.01%). Luego, las células se lavaron 3 veces e incubaron con el anticuerpo secundario adecuado conectado con Alexa 488 antes de incubarse durante 20 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad y finalmente se lavaron 3 veces en el amortiguador de FACS. La unión de anticuerpos anti-IGF-1R inmediatamente se evaluó en células viables identificadas usando el yoduro del propidio (que tiñe células muertas). La unión EC50 expresada en la molaridad (M) se calculó usando un análisis de la regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).
Las curvas de la titulación obtuvieron en la estirpe celular COS-7 del mono mostraron que, todos los Ab antihIGF-1R reconocieron específicamente el IGF-1R expresado para en la superficie de la estirpe celular del mono (Figura 5A). La determinación del, EC50 para cada Ab murino y quimérico mostró que las 2 formas se compararon bien en cuanto a con sus propiedades de unión en el IGF-1R de mono (Figura 5B). Aquellos resultados mostraron que todo anti-hIGF-1R generado reconoció el IGF-1R de mono.
Una comparación de EC50 de unión en células COS-7 versus células IGF-1R transfectadas se llevó a cabo a fin de verificar la magnitud del reconocimiento del anticuerpo quimérico en el humano versus IGF-1R de mono. Los resultados mostrados en la figura 5C demostraron un reconocimiento similar de humano y IGF-1R de monos por todos los anticuerpos.
A fin de confirmar el reconocimiento sobre otro tipo del mono, las células se transfectaron con la forma de IGF-1R mono Cynomolgus para producir IGF-1R ECD de mono soluble y los experimentos de Biacore se llevaron a cabo con uno de los anticuerpos quiméricos (c208F2) a fin de comparar sus propiedades de unión el hIGF-1R o IGF-1R de Cynomolgus.
Los experimentos de reconocimiento se ejecutaron en un dispositivo Biacore X100 usando un circuito integrado del sensor CM5 activado por anticuerpo anti-Tag His (su catálogo de la GE Healthcare del kit de captura número 28-9950-56). Más de 11000 RU de anticuerpos químicamente se injertan en la matriz de carboximetildextano usando la química del kit de la amina. Los experimentos se llevaron a cabo a 25°C con velocidad de flujo de 30 pl/min utilizando el amortiguador de HBS-EP (GE Healthcare) como el amortiguador de la dilución de la muestra y puesta en funcionamiento. El esquema cinético de ciclo único se utilizó para definir los parámetros cinéticos de la unión de la forma quimérica del 208F2 anticuerpo (c208F2) en hIGF-1R comparado con Macaca IGF-1R Una solución de una versión recombinante soluble de heterotetrámero IGF1R compuesto de cadenas 2a y los dominios extracelulares de cadenas 2p expresadas con un C-terminal 10-His tag, sobre la base de cualquiera en la secuencia de humano (R&D Systems catalogue número 305-GR-50) o de la que del cinomolgo (producido en la casa) se inyectó 1 minuto en la segunda celda de flujo a una dilución definida para captura aproximadamente 160 RU del antígeno. Después de la fase de captura, cualquiera de la solución amortiguadora de corrimiento se inyectó 5 veces (90 s cada inyección) o un intervalo creciente de 5 concentraciones de c208F2 se inyectaron (los años 90 cada inyección) en ambas celdas de flujo. Al final de la quinta inyección la solución amortiguadora de corrimiento se hizo pasar a fin de definir la tasa de la disolución.
La superficie se regeneró luego con una inyección de glicina de 10 mm, HCl pH 1.5 amortiguador durante 30 s. La señal calculada corresponde a la diferencia entre respuesta de la celda de flujo 2 (con IGF-1R capturado) y respuesta de la celda de flujo 1 (sin cualquier molécula IGF-1R) (Figura 6).
Para cada molécula IGF1R (humana o cyno), la señal debido a las inyecciones del intervalo creciente de concentraciones de c208F2 se corrigió por la sustracción de la señal obtenida con las 5 inyecciones del amortiguador (doble referencia). Los sensogramas resultantes se analizaron usando el software Biaevaluation con un 1:1 modelo. Las tasas cinéticas se evalúan independientemente (2 tasas de la cinética de la unión de c208F2 en cada IGF-1R) o comúnmente (las mismas tasas cinéticas de la unión de c208F2 en el IGF1R de humano o de cynomolgus). La calidad de la prueba se evaluó por una proporción Chi2/Rmax inferior a 0.05 RU. Las tasas de la cinética de la unión (ver la tabla 12) definidas por separado para cada IGF-1R son cercanas y un ajuste de ambos sensogramas con las mismas tasas cinéticas es de la buena calidad.
El anticuerpo c208F2 reconoce asimismo IGF-1Rs de humano y cinomolgo recombinante con una constante de disociación (KD) aproximadamente 0.2 nM. Las afinidades definidas en el estudio tis corresponden a las afinidades funcionales (la avidez) de los anticuerpos para un nivel de IGF-1R de humano y cinomolgo capturado de aproximadamente 160 RU.
Tabla 12
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Ejemplo 5: efecto intrínseco de anticuerpos generados en fosforilación de IGF-1R
Es conocido que los anticuerpos podrían inducir un efecto agonista cuando se unen con receptores de la tirosina cinasa. Como no nos gustaría seleccionar tales anticuerpos del agonista, la evaluación de fosforilación hIGF-1R se estudió usando los anticuerpos quiméricos.
Con ese objetivo, las células de MCF-7 se incubaron en el medio sin sueros durante la noche. Luego, cualquiera IGF-1 (100 nM) o Abs que debe analizarse se agregó (10 pg/ml) durante 10 minutos a 37°C. El medio se desechó y las células se decaparon en un amortiguador de la lisis (pH 7.5) conteniendo 10 mM Tris amortiguador de HCl (pH 7.5), NaCl del 15% (1 M), mezcla detergente del 10% (10 mM Tris-HCl, amortiguador de la lisis de Igepal del 10%) (Sigma Chemical Co.), sodio del 5% desoxicolato (Sigma Chemical Co.) 1 cóctel del inhibidor de la proteasa completa el comprimido de la TM (Roche), conjunto del cóctel del inhibidor de la fosfatasa del 1% II (Calbiochem), durante 90 minutos a 4°C. Los productos de la lisis fueron depurados por la centrifugación a 4°C, se calentaron durante 5 minutos a 100°C y mantuvieron a-20°C o directamente cargaron en geles del SDS-PAGE del 4-12%. La incubación del anticuerpo primario se llevó a cabo para el de 2 hr a temperatura ambiente y luego la incubación con anticuerpos secundarios HRP-unidos se llevó a cabo durante 1 hr a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron en TBST antes de la visualización de proteínas con ECL. Las manchas se cuantificaron usando el software Image J. Los valores de la proteína de Fospho-se normalizaron con GAPDH. Fosforilación de hIGF-1R en respuesta a IGF-1 se consideró como el 100% del estímulo. El efecto de Ab anti-hIGF-1R en fosforilación de hIGF-1R se determinó como el % de fosforilación inducida por IGF-1.
Los resultados descritos en la figura 7 representan la media del % de pIGF-1R en respuesta a los Abes anti-IGF-1Res quiméricos de 3 experimentos independientes /-S.D. comparado con IGF-1. Como se se muestra no se detecta ninguna fosforilación significativa o menor (<10%) de hIGF-1R se detectó cuando las células MCF-7 se incubaron con 10 pg de Abes anti-IGF-1Res.
Ejemplo 6: Inhibición de fosforilación de IGF-1R en respuesta a IGF-1 por anticuerpos IGF-1R murinos A fin de caracterizar los anticuerpos seleccionados, su capacidad de inhibir la fosforilación IGF1-inducida se estudió. Con ese objetivo, las células de MCF-7 se incubaron en el medio sin sueros durante la noche. Luego, las células se incubaron durante 5 minutos con el Ab anti-hIGF-1R murino antes de la adición de IGF-1 durante 2 minutos a 37°C. El medio se desechó y las células se decaparon en un amortiguador de la lisis (pH 7.5) conteniendo 10 mM Tris amortiguador de HCl (pH 7.5), NaCl del 15% (1 M), mezcla detergente del 10% (10 mM Tris-HCl, amortiguador de la lisis de Igepal del 10%) (Sigma Chemical Co.), sodio del 5% desoxicolato (Sigma Chemical Co.) 1 cóctel del inhibidor de la proteasa completa el comprimido de la TM (Roche), conjunto del cóctel del inhibidor de la fosfatasa del 1% II (Calbiochem), durante 90 minutos a 4°C. Los productos de la lisis fueron depurados por la centrifugación a 4°C, se calentaron durante 5 minutos a 100°C y mantuvieron a-20°C o directamente cargaron en geles del SDS-PAGE del 4-12%. La incubación del anticuerpo primario se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente y luego la incubación con anticuerpos secundarios HRP-unidos se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron en TBST antes de la visualización de proteínas con ECL. Las manchas se cuantificaron usando el software Image J. Los valores de la proteína de fosfosa normalizaron con GAPDH. Fosforilación de hIGF-1R en respuesta a IGF-1 se consideró como el 100% del estímulo. El efecto de Ab anti-hIGF-1R en fosforilación de hIGF-1R se determinó como el % de fosforilación inducida por IGF-1.
Todos los Ab anti-IGF-1R inhibieron fuertemente fosforilación de hIGF-1R en respuesta a IGF-1 (disminuya> el 80%) (Figura 8). Los mejores inhibidores de fosforilación IGF1-inducida de hIGF-1R son el m208F2, m212A11 y Mabs m214F8.
Ejemplo 7: Estudio de incorporación IGF-1R después de unir de los anticuerpos IGF-1R generados por análisis de FACS
Las células de MCF-7 se incubaron con 10pg/ml de anticuerpos quiméricos a 4°C durante 20 minutos. Luego, las células se lavaron e incubaron a 4°C o 37°C durante 4 h. La cantidad del anticuerpo ligado de la superficie celular se determinó usando un anticuerpo secundario. El AMFI definido como la diferencia entre MFI cuantificado a 4°C y MFI cuantificado a 37°C después de un período de incubación de 4 horas correspondió a la cantidad de Ab interiorizado. El AMFI se presentó en la figura 9 y la tabla 11. El porcentaje de la incorporación a 10 |jg/ml de Ab se calculó como seguido 100* (MFI a 4°C -MFI a 37°C)/MFI a 4°C y presentado en la tabla 13.
Tabla 13
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A fin de determinar si los anticuerpos que asimismo reconocieron el IGF-1R de mono eran capaces de interiorizar este receptor, el mismo experimento de la incorporación se llevó a cabo. Los resultados resumidos en la tabla 14 demostraron que todos los anticuerpos analizados eran capaces de regular la internalización de IGF-1R de mono.
Tabla 14
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La cinética de la disminución del anticuerpo ligada de la superficie celular se evaluó adicionalmente. Con ese objetivo, las células de MCF-7 se sembraron en placas de 96 pocillos e incubaron con 10 jg/ml del murino durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron luego para eliminar el anticuerpo no unido y en medios a 37°C durante 10, 20, 30, 60 o 120 minutos. En cada momento, las células se centrifugaron y a continación marcadas en superficie en hielo por IgG-Alexa488 antirratón secundario para determinar la cantidad de anticuerpo que permanece en la superficie celular. La intensidad de la fluorescencia para cada murino Ab y para cada punto de tiempo fue normalizado por la señal a 4°C (% que permanece IGF-1R) y se ajustó a un decaimiento exponencial para determinar la vida media (t1/2). El t1/2 se consideró ya que el período de tiempo tenía que obtener una disminución del 50% de la señal. Como se muestra en la figura 10, el nivel de superficie de todo el Ab murino disminuyó rápidamente durante los 30 primeros minutos y la disminución era casi máxima después de 60 minutos de la incubación (Figura 10A). La vida media calculada se comprendió entre 10 a 18 minutos según el Ab murino (Figura 10B).
A fin de validar esto la disminución de la señal de la superficie celular era debido a la incorporación de Ab y no debido a la liberación del receptor, las células se incubaron con el Ab murino durante 0, 30 y 60 minutos a 37°C (Figura 11). Las células se fijaron luego y se permeabilizaron o no a fin de determinar que la superficie celular se unió al anticuerpo (w/o permeabilización) y la señal del anticuerpo total correspondiente a la superficie celular ligada interiorizó Ab (con la permeabilización). La cantidad de Ab interiorizado (citoplásmico) se determinó como siga: MFI después permabilization - MFI sin permeabilización. Este experimento mostró que la disminución de superficie celular ligada Ab era debido a un aumento de Abs citoplásmico que demuestra que Abs se interiorizaron (Figura 11). Además, la degradación de Abs comenzó después de 1 h de la incubación como indicado por la disminución de la señal después de la permeabilización (Total).
Ejemplo 8: Estudio de incorporación IGF-1R después de unir de los anticuerpos IGF-1R generados por análisis confocales
Para confirmar adicionalmente la incorporación de anticuerpos, la microscopía confocal se llevó a cabo para evaluar la distribución subcelular de anticuerpos siguiendo el tráfico celular. Las células se incubaron con Ab antihIGF-1R 37°C, fijado y permeabilizado. Por lo tanto, las células se tiñeron usando un anticuerpo secundario Alexa-488 y con anticuerpo de conejo anti-Lamp-1 que se reveló usando una IgG anticonejo secundaria Alexa 555. Antes de la incubación a 37°C, el 208F2 Ab murino se localizó en la membrana de células MCF-7 (Figura 12A). No se observó ninguna colocalización con el marcador del lisosoma, la lámpara 1 usando la conexión de selección de colocalización del software Image J. El anticuerpo unido a la superficie celular disminuyó particularmente después de 15 minutos de la incubación a 37°C. Concomitantemente a la disminución del anticuerpo unido a la superficie celular, el anticuerpo intracelular se detectó en vesículas. Una colocalización rara con la lámpara 1 podría observarse. Después de 30 minutos de la incubación, el anticuerpo ligado de la superficie celular apenas se detectó. Sin embargo, la colocalización de Ab en el lisosoma aumentó. Después de 1 h de la incubación, la tinción de Ab intracelular disminuyó así como la cantidad de colocalización con la lámpara 1. Esta cinética del anticuerpo unido a la superficie celular y su acumulación intracelular correlaciona con la cinética de la medida del decaimiento de la superficie del anticuerpo por FACS. Además, como ya descrito con estudios de FACS, la degradación de Ab murinos comenzó después de 1 h de la incubación por la microscopía confocal.
La internalización de todos otros anticuerpos de hIGF-1R murinos y su colocalización con la Lámpara 1 asimismo era evaluada (Figura 12B). Después de 30 minutos de la incubación a 37°C, el anticuerpo intracelular se detectó y la colocalización con la lámpara 1 podría observarse indicando que todos los anticuerpos anti-IGF-1R seleccionados con eficacia se interiorizaron en lisosomas.
Ejemplo 9: Inhibición de degradación de Abs usando inhibidor del lisosoma, bafilomicina A1
A fin de confirmar que los anticuerpos alcanzaron el lisosoma cuando se degradan, las células se sometieron a tratamiento o no con bafilomicina A1, un potente inhibidor de funciones del lisosoma. Las células se incubaron luego con 10 pg/ml de Ab para analizarse a 4°C, se lavaron e incubaron durante 2 h a 37°C. Ab interiorizado se detectó después de la permeabilización celular usando Ab IgG-Alexa antirratón secundario 488. La adición de bafilomicina A1 evitó la degradación de Ab intracelular (Figura 13) indicando que Abs se interiorizaron y se degradaron efectivamente en lisosomas.
Ejemplo 10: Efecto de pH en unión de anticuerpo-IGF-1R
Como los anticuerpos se seleccionaron por su potencial internalizante y mostraron anteriormente colocalizar con endosomas tempranos antes de ingresar en el compartimento lisosómico, un enfoque interesante comprendió en seleccionar anticuerpos para los cuales la estabilidad de la unión Ab/hIGF-1R se moduló en cuanto a ambiente del pH y preferentemente anticuerpos que se disociaron preferentemente de IGF-1R cuando el ambiente del pH devino ácido. En efecto, la diferencia primaria entre endosomas tempranos y lisosomas es su pH luminal: en el compartimento del endosoma el pH es aproximadamente 6 mientras en el compartimento lisosómico el pH es de aproximadamente 4.5.
Es conocido que una vez interiorizado después de la unión al ligando (IGF1), el hIGF-1R regresa nuevamente a la superficie celular a través de una vía de reciclaje.
Sin limitarse a una teoría, una hipótesis en la presente memoria descrita es que los anticuerpos más propensos para liberarse de su diana temprana al pH ácido favorecerán probablemente el reciclaje de diana a la membrana y por consiguiente podrían considerarse como mejores candidatos por enfoques de ADC. A fin de investigar si algunos de estos anticuerpos muestran tal propiedad y correlacionan esta propiedad con la actividad citotóxica, la unión del Mab murino anti-hIGF-1R en la estirpe celular MCF-7 se llevó a cabo en amortiguadores a diferente pH. Las concentraciones cada vez mayores del mAb murino se incubaron en la estirpe celular MCF-7 durante 20 minutos a 4°C en un diferente pH que comprende desde 5 a 8. Las células se lavaron luego 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado conectado con Alexa 488 en el amortiguador de FACS. Las células se incubaron durante 20 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad y luego se lavaron 3 veces en el amortiguador de FACS. La unión de anticuerpos anti-hIGF-1R inmediatamente se llevó a cabo en células viables que se identificaron usando el yoduro del propidio que tiñó células muertas. La unión EC50 expresada en la molaridad (M) se calculó usando un análisis de la regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0). Todos los anticuerpos anti-IGF-1R murinos seleccionados mostraron a una capacidad de unión inferior el pH a ácido como ilustrado en la figura 14.
Ejemplo 11: Evaluación de una forma humanizada del 208F2 Mab
La unión de la primera forma humanizada de c208F2 mAb se evaluó en las estirpes celulares MCF-7, COS-7 y NIH 3T3 IR+. Las concentraciones cada vez mayores de m208F2, c208F2 o hz208F2 VH3VL3 se agregaron en cada estirpe celular durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron luego y la unión de mAb analizada se reveló usando el anticuerpo secundario correspondiente. A fin de validar la expresión de IR de humano en la estirpe celular transfectada, el clon del anticuerpo anti-hIR comercial GRO5 se usó y su perfil de reconocimiento ejemplificado (Figura 15D).
La comparación de la forma humanizada con el murino o con quimérico en las células MCF-7 (Figura 15A) o COS-7 de mono (Figura 15B) mostraron perfiles cercanos para las 3 formas analizadas. El proceso de la humanización no modificó la especificidad de reconocimiento del anticuerpo que es absolutamente comparable al murino y formas quiméricas en cuanto a la ausencia de la reactividad reticulada en el receptor de la insulina de humano (Figura 15C).
EC50 calculado de la primera forma humanizada de 208F2 en la estirpe de la célula humana MCF-7 y la estirpe celular de mono COS-7 eran similares al que se determina con la forma quimérica o murina de mAb 208F2. La capacidad de mAb hz208F2 VH3/VL3 para interiorizarse se evaluó por la citometría de flujo. Las células de MCF-7 se incubaron con 10 pg/ml de anticuerpos a 4°C durante 20 minutos. Luego, las células se lavaron e incubaron a 4°C o 37°C durante 4 h. La cantidad del anticuerpo ligado de la superficie celular se determinó usando un anticuerpo secundario. El AMFI definido como la diferencia entre MFI cuantificado a 4°C y MFI cuantificado a 37°C después de un período de incubación de 4 horas correspondió a la cantidad de Ab interiorizado. El AMFI se presentó en la figura 16 y la tabla 13. El porcentaje de la incorporación a 10 pg/ml de Ab se calculó como sigue 100* (MFI a 4°C -MFI a 37°C)/MFI a 4°C y presentado en la tabla 15. Por lo tanto, hz208F2 VH3/VL3 humanizado tenía unión similar y propiedades de la incorporación como la medida con los anticuerpos 208F2 murinos y quiméricos.
Tabla 15
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Ejemplo 12: Definición de la constante de disociación (KD) de la unión de cinco anticuerpos anti-IGFIR quiméricos (c208F2, c213B10, c212A11, c214F8 y c219D6) y una versión (VH3/VL3) humanizada del anticuerpo 208F2 en IGF1R de humano recombinante soluble
Las constantes de disociación (Kd) de la unión de los anticuerpos en un humano-IGF1R soluble recombinante se definieron por la proporción entre la tasa de la disolución (koff) y la tasa de la asociación (kon). Los experimentos cinéticos se ejecutaron en un dispositivo Biacore X100 usando un circuito integrado del sensor CM5 activado por anticuerpo monoclonal anti-Tag his de ratón. Aproximadamente 12000 RU de anticuerpos químicamente se injertan en la matriz de carboximetildextano usando la química del kit de la amina.
Los experimentos se llevaron a cabo a 25°C con velocidad de flujo de 30 pl/min utilización de1HBS-EP+ amortiguador (GE Healthcare) como el amortiguador de la dilución de la muestra y la marcha.
El esquema cinético de ciclo único se utilizó para definir los parámetros cinéticos de la unión de los anticuerpos anti-lGF1R en IGF1R de humano recombinante soluble capturado por su dos 10 etiqueta de histidina C-terminal.
1- Una solución de una versión recombinante soluble de heterotetrámero IGF1R de humano: 2a cadenas y los dominios extracelulares de 2p cadenas expresadas con unos 10 C-terminales adicionales - Su etiqueta (R&D Systems número de catálogo 305-GR-50) se inyectaron durante un minuto en la segunda celda de flujo a una concentración de 10pg/ml. Una media de 587 RU (con una desviación estándar 24 RU) del receptor soluble se capturó a cada uno de los 24 ciclos realizados para este estudio.
2- Después de la fase de captura, cualquier solución amortiguadora de corrimiento se inyectó 5 veces (90 s cada inyección) o un intervalo creciente de 5 concentraciones de uno de los seis anticuerpos se inyectó (los años 90 cada inyección) en ambas celdas de flujo. Al final de la quinta inyección la solución amortiguadora de corrimiento se hizo pasar durante 5 minutos a fin de definir la tasa de la disolución. 3- La superficie se generó luego con una inyección de Glicina de 10 mm, pH de HCl 1.5 amortiguador durante 45 s.
La señal calculada corresponde a la diferencia entre respuesta de la celda de flujo 2 (con IGF1R capturado) y respuesta de la celda de flujo 1 (sin cualquier molécula IGF1R).
Para cada IGF1R la señal debida a las inyecciones el intervalo creciente de concentraciones de un anticuerpo se corrigió por la sustracción de la señal obtenida con las 5 inyecciones del amortiguador (doble referencia) ver la figura 17.
Los sensogramas resultantes fueron analizados por el software Biaevaluation con un 1:1 modelo.
Cuatro experimentos se ejecutaron para cada anticuerpo usando dos diferentes intervalos de concentraciones: 40, 20, 10, 5 y 2.5 nM para los dos primeros experimentos y: 24, 12, 6, 3 y 1.5 nM para los dos últimos experimentos ejecutados para cada anticuerpo.
Para los 6 anticuerpos analizados en este experimento los datos experimentales se ajustaron bien con un 1:1 modelo con valores de koff significativos cuando la concentración más elevada se definió como una constante y las otras cuatro concentraciones se calculan (ver a la figura 18).
Las constantes de disociación (Kd) contaron como la proporción: el koff/kon y los medio en vivo de los complejos contaron como la proporción: Ln(2)/koff se representa en las figuras 19 y 20. Corresponden a la media de los cuatro experimentos independientes separados por electroforésis para cada uno anticuerpos. Las barras de error corresponden a los errores estándar (n=4) de los valores.
Las constantes de disociación están en el intervalo de 10 a 100 p.m. El anticuerpo c208F2 presenta la afinidad más débil (valor de la constante de disociación más elevado) para el h-IGF1R (con un Kd aproximadamente 75 p.m.) y su versión humanizada es por lo menos tan adecuada como la versión quimérica (con un Kd aproximadamente 60 p.m.). Los otros cuatro anticuerpos quiméricos anti-IGF1R presentan una afinidad completamente similar para el hIGF1-R (con un Kd aproximadamente 30 p.m.). La diferencia de las afinidades principalmente se une a la tasa de la disolución o la vida media consiguiente de los complejos. Con 208F2 la semivida del complejo está entre 2 y de 3 horas con el quimérico y las versiones (VH3/VL3) humanizadas. Para los otros cuatro anticuerpos quiméricos las vidas medias de medios están entre 7.0 y 9.4 h.
Esta cinética de disosiación muy lenta está claramente ligada a la estructura bivalente de los anticuerpos que son capaces de unir simultáneamente a ambos de sus brazos de Fab a dos moléculas h-IGF1R contiguas. En este caso el nivel de moléculas IGF1R capturadas puede tener efecto indeseable a la tasa de la disolución. Las afinidades definidas en este estudio corresponden a las afinidades funcionales (o avidez) de los anticuerpos para un nivel de h-IGF1R capturado aproximadamente 600 RU. La diferencia de 3 veces de KD observado entre datos mostrados anteriormente (la tabla 10) y valores presentados en el ejemplo 13 se une a un cambio del nivel de la captura de hIGF-1R (600RU con respecto 160 RU en el ejemplo 4).
Ejemplo 13: generación de 1613F12.
Para generar anticuerpos monoclonales murinos (Mabs) contra el dominio extracelular humano (ECD) del receptor de Axl, 5 ratones BALB/c se inmunizaron 5 períodos de tiempo s.c. con 15-20.106 células CHO-Ax1 y dos veces con 20 |jg de Axl rh ECD. La primera inmunización se llevó a cabo en la presencia del Adyuvante Freund Completo (Sigma, San Louis, MD, EE.UU). El adyuvante Freund incompleto (Sigma) se agregó para las siguientes inmunizaciones.
Tres días antes de la fusión, los ratones inmunizados se incrementaron tanto con 20.106 células CHO-Axl como con 20 jg de rhAxl ECD con IFA.
Para generar hibridomas, los esplenocitos y los linfocitos se prepararon por la perfusión del bazo y troceando los nódulos linfáticos proximales, respectivamente, recolectado de 1 de los 5 ratones inmunizados (seleccionado después de la titulación de sueros) y fusionaron a SP2/0-Ag14 células de la mieloma (ATCC, Rockville, MD, EE.UU). El protocolo de la fusión se describe por Kohler y Milstein (Naturaleza, 256:495-497, 1975). Las células fusionadas se someten luego a la selección del HAT. En términos generales, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, sobre todo del origen murino, es posible referirse a métodos que se describen particularmente en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pps 726, 1988).
Aproximadamente 10 días después de la fusión, las colonias de células híbridas se cribaron. Para el cribado primario, los sobrenadantes de hibridomas se evaluaron para la secreción de Mabs aumentada contra proteína Axl de ECD utilizando un ELISA. En paralelo, un análisis FACS se llevó a cabo para seleccionar Mabs aptos para unirse con la forma celular de Axl presente en la superficie celular utilizando tanto el peso CHO como Axl que expresa células CHO.
Cuanto antes, los hibridomas seleccionados fueron clonados por la dilución de límite y posteriormente cribados para su reactividad contra proteína Axl de ECD. Los Mabs clonados era luego isotipados utilizando un kit de isotipado (cat #5300.05, Southern Biotech, Birmingham, AL, EE.UU). Un clon obtenido de cada hibridoma se seleccionó y se amplió.
Ensayos de ELISA se llevan a cabo como se sigue utilizando sobrenadante del hibridoma puro o, cuando el contenido de IgG en sobrenadantes se determinó, la titulación se implementó el comienzo a 5jg/ml. Luego una A dilución en serie se llevó a cabo en las siguientes 11 hileras. Brevemente, las placas de ELISA de 96 pocillos (Coprotagonista 3690, Salar, NY, EE.UU) se recubrieron 50 jl/pocillo de la proteína de Axl-Fc rh (R y Sistemas D, cat n° 154-AL) o rhAxl ECD a 2 jg/ml en PBS durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon luego con PBS que contiene gelatina del 0.5% (#22151, Serva electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) durante 2 h a 37°C. Una vez el amortiguador de saturación desechado por chasquear placas, 50 j l de sobrenadantes de la célula del hibridoma puros o 50 j l de una 5 solución jg/ml se agregaron a las placas de ELISA e incubaron durante 1 h a 37°C. Después de tres lavados, 50 |jl Ig de cabra antirratón policlónica conjugada por la peroxidasa de rábano (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc. Grove del Oeste, PA, EE.UU) se agregó a una dilución 1/5000 en PBS que contiene gelatina del 0.1% y Tween 20 del 0.05% (w:w) para 1 h a 37°C. Luego, las placas de ELISA se lavaron 3 períodos de tiempo y el sustrato de TMB (#UP664782, Uptima, Interchim, Francia) se agregó. Después de un 10 período de incubación de un minuto a temperatura ambiente, la reacción se interrumpe utilizando sulfúrico de 1 m y se mide la densidad óptica a 450 nm.
Para la selección por la citometría de flujo, 105 células (peso de CHO o CHO-Axl) se sembraron en placa en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en PBS que contiene BSA del 1% y azida de sodio del 0.01% (amortiguador de FACS) a 4°C. Después de una centrifugación de dos minutos a 2000 revoluciones por minuto, el amortiguador se eliminó y sobrenadantes del hibridoma o Mabs purificados (1 jg/ml) que deben analizarse se agregaron. Después de 20 minutos de la incubación a 4°C, las células se lavaron dos veces y anticuerpo antiratón de cabra 488 conjugado Alexa 1/500° diluido en el amortiguador de FACS (#A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, EE.UU) se agregó e incubó durante 20 minutos a 4°C. Después de un lavado final con el amortiguador de FACS, las células se analizaron por FACS (Facscalibur, Becton Dickinson) después de la adición del yoduro del propidio a cada tubo a una concentración final de 40 jg/ml. Los pocillos que contienen células solas y células incubadas con anticuerpo 488 conjugado de Alexa secundario se incluyeron como controles negativos. Los controles del isotipo se usaron en cada experimento (Sigma, en cuanto a M90351MG). Por lo menos 5000 células se evaluaron para calcular el valor medio de la intensidad de la fluorescencia (MFI).
El hibridoma que produce el 1613F12 se seleccionó como un candidato.
Ejemplo 14: humanización de 1613F12
El uso de anticuerpos de ratón (Mabs) para solicitudes terapéuticas en humanos generalmente da como resultado una reacción adversa principal, los pacientes sensibilizan la respuesta del anticuerpo antirratón de humano (HAMA), reduciendo así la eficacia del tratamiento y prevención de la administración continuada. Un enfoque para superar este problema debe humanizar el Mabs de ratón al sustituir secuencias de ratón por su ejemplar de humano, pero sin modificar la actividad vinculante del antígeno. Esto puede lograrse de dos modos principales: (i) por la construcción de anticuerpos quiméricos de ratón/de humano donde las regiones variables de ratón se unen a regiones constantes de humano (Boulianne et al., 1984) y (ii) al injertar las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones variables de ratón en regiones variables de humano cuidadosamente seleccionadas y luego al unir a estas "" regiones variables de humano reformadas a regiones constantes de humano (Riechmann et al., 1988).
14.1 Humanización del dominio variable de la cadena ligera VL
Como una etapa preliminar, la secuencia nucleotídica de 1613F12 VL se comparó con la parte de secuencias del gen de la estirpe germinal del murino de la base de datos IMGT (http://www .imgt.org). Los genes de la estirpe germinal IGKJ5*01 y IGKV16-104*01 de murino se identificaron. A fin de identificar al mejor candidato de humano para el injerto de CDR, el gen de la estirpe germinal de humano que presenta la mejor identidad con la secuencia murina de 1613F12 VL se consigue. Con la ayuda de la herramienta de análisis de la base de datos IMGT, unas posibles regiones de humano aceptor V para el 1613F12 CDR de VL murino se identificaron: IGKV1-27*01 e IGKJ4*02. A fin de llevar a cabo la humanización al dominio variable de la cadena ligera a cada residuo que es diferente entre las secuencias de humano y de ratón se les proporcionó un orden de rango de prioridad. Estas prioridades (1-4) se utilizaron para crear 11 diferentes variantes humanizadas de la región variable de la cadena ligera con hasta 14 retromutaciones.
FR1-IMGT CDR1-IMGT FR2-IMGT CD
1613F12VL DVQITQSPSYLATSPGETITINORAS KSI......SKY LAWYQEKPGKTNKLLIY SG Homsap IGKV1-27*01 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORAS QGI......SNY LAWYQQKPGKVPKLLIY AA V I Y AT P ETI N E TN
Prioridad 11 3 34 4 433 2 3 33
hzl613F12 (VL1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORAS KSI. .....SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL1I2V) DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITORAS KSI. .....SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL1M4I) DIQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI. .....SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.1) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI......SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.1V49T) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI. .....SKY LAWYQQKPGKTPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.1P50N) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI......SKY LAWYQQKPGKVNKLLIY SG hzl613F12 (VL2.2) DVQITQSPSSLSASVGDRVTINCRAS KSI. .....SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.2V49T) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI. .....SKY LAWYQQKPGKTPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.2P50N) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI ......SKY LAWYQQKPGKVNKLLIY SG hzl613F12 (VL2.3) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI......SKY LAWYQEKPGKTNKLLIY SG hzl613F12 (VL3) DVQITQSPSYLAASVGDTITITCRAS KSI......SKY LAWYQEKPGKTNKLLIY SG
R2-IMGT FR3-IMGT
1613F12VL .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLEPEDFAMYFC
Homsap IGKV1-27*01 .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC
E F M F
Prioridad 4 4 4 2
hzl613F12 (VL1) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL1I2V) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL1M4I) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 <VL2.1) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 {VL2.1V49T) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL2.1P50N) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL2.2) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC hzl613F12 (VL2.2V49T) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC hzl613F12 <VL2.2P50N) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC hzl613F12 (VL2.3) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC hzl613F12 (VL3) .S TLQSGVP.SRFSGSG..SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC
CDR3-IMGT FR4-IMGT
1613F12VL QQHHEYPLT FGAGTELELK
Homsap IGKJ4*02 LT FGGGTKVEIK
A EL L
Prioridad 3 33 4
hzl613F12 (VLl) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL1I2V) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL1M4I) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 <VL2.1) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL2.1V49T) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL2.1P50N) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 <VL2.2) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL2.2V49T) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 {VL2.2P50N) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL2.3) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK
hzl613F12 (VL3) QQHHEYPLT FGAGTELEIK
14.2 Humanización del dominio variable de cadena pesada VH
A fin de identificar al mejor candidato de humano para el injerto de CDR, los genes de la estirpe germinal de ratón y de humano que muestran la mejor identidad con 1613F12 VH se buscaron. La secuencia nucleotídica de 1613F12 VH se alineó tanto con secuencias del gen de la estirpe germinal de ratón como con de humano al usar el software “IMGT/V-QUEST” de alineación de la secuencia que es la parte de la base de datos IMGT Las alineaciones de secuencias aminoacídicas asimismo eran llevadas a cabo para verificar los resultados de la alineación de la secuencia nucleotídica usando el software “Align X” del envase de VectorNTI. La alineación con genes de la estirpe germinal de ratón mostró que la estirpe germinal de ratón V-gene IGHV14-3*02 y J-gene IGHJ2*01 es la mayor parte de genes de la estirpe germinal del ratón del homólogo. Al usar la base de datos IMGT la estirpe germinal de D-gene de ratón IGHD11*01 se identificó como la secuencia homóloga. A fin de seleccionar una estirpe germinal de humano adecuada para el injerto de CDR, el gen de la estirpe germinal de humano con la homología más elevada a 1613F12 la secuencia del murino de VH se identificó. Con la ayuda de bases de datos IMGT y herramienta, el gen de estirpe germinal de humano IGHV1-2*02 y el gen de la estirpe germinal de humano iGhJ5*01 J se seleccionaron como secuencias del aceptador de humano para el murino 1613F12 CDR de VH. A fin de llevar a cabo la humanización al dominio variable de cadena pesada a cada residuo que es diferente entre las secuencias de humano y de ratón se les proporcionó un orden (1-4) de la fila de prioridad. Estas prioridades se utilizaron para crear 20 diferentes variantes humanizadas de la región variable de la cadena pesada con hasta 18 retromutaciones.
FR1-IMGT CDR1-IMGT FR2-IMGT CD (1-26) (27-38) (39-55) (
1613F12 EVIILQQSGA.ELVKPGASVKLSCTAS GFNI. .RDTY IIIWVKQRPEQGLEWIGR LD Homsap IGHVl-2*02 QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GYTF. .TGYY MHWVRQAPGQGLEWMGW IN E H Q LV L T I K R E IR
Prioridad 32 3 33 33 1 3 44 3 2 hzl613F12 (VH1) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH1M39I) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH1W55RN66K) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGR LD hzl613F12 (VII1I84S) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH1S85N) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH1I84NS85N) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.1) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.1Q3H) QVHLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hz!613F12 (VH2.1W55R) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hzl613F12 (VH2.1N66K) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 {VH2.1W55RN66K) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hzl613F12 (VH2.1R80S) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 {VH2.1N66KR80S) QVQLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.2) QVHLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.2M89L) QVHLVQSGA.EVKKPGASVKVSCKAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.3) QVQLQQSGA.EVKKPGASVKLSCTAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.3W55R) QVQLQQSGA.EVKKPGASVKLSCTAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hzl613F12 (VH2.3Q3HW55R) QVHLQQSCA.EVKKPGASVKLSCTAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hzl613F12 (VH2.4) QVQLQQSGA.EVKKPGASVKLSCTAS GFNI. .RDTY IHWVRQAPGQGLEWIGR LD hz!613F12 (VH3) EVHLQQSGA.ELVKPGASVKLSCTAS GFNI. .RDTY IHWVKQAPGQGLEWIGR LD
R2-IMGT FR3-IMGT
56-65) (66-104)
1613F12 PA..NGIIT KYGPNFQ.GRATMTSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYC Homsap IGHVl-2*02 PN..SGGT NYAQKFQ.GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC
K GPN A S SN LQ S T E
Prioridad 2 344 4 2 11 33 444
NYAQKFQ.GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.CRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTRDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTRDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTRDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC NYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYLELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC KYAQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYLELSRLRSDDTAVYYC
Figure imgf000074_0001
KYGQKFQ.GRVTMTSDTSSNTAYLQLSRLRSDDTAVYYC
CDR3-IMGT FR4-IMGT
1613F12VH ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTTLSVSS
Homsap IGHJ5*01 WGQGTLVTVSS
TLS
Prioridad 444
hzl613F12 (VH1) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH1M39I) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH1W55RN66K) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH1I84S) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH1S85N) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH1I84NS85N) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.1) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.1Q3H) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.1W55R) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hz!613F12 (VH2.1N66K) ARGAYYYGSSCLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.1W55RN66K) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.1R80S) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl€13F12 (VH2.1N66KR80S) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.2) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.2 M89L) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.3) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.3W55R) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.3Q3HW55R) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH2.4) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
hzl613F12 (VH3) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS
Ejemplo 15: especificidad de unión cd axl
En este ejemplo, la unión de 1613F12 se estudió primero en la proteína rhAxI-Fc. Luego, su unión en los otros dos elementos de la familia TAM, rhDtk-Fc y rhMer-Fc, se estudió.
Brevemente, las proteínas Axl-Fc (R y sistemas D, cat n° 154AL/CF), rhDtk (R y Sistemas D, cat n° 859-DK) o rhMer-Fc (R y Sistemas D, cat n° de 891 SR.) de humano recombinantes se recubrieron durante la noche a 4°C a placas de 96 pocillos de Immulon II y, después de 1 h la etapa obstructora con una solución de la gelatina del 0.5%, 1613F12 se agregó durante 1 h adicional a 37°C concentración a inicial de 5 pg/ml (3.3310-8M). Luego A diluciones en serie se llevaron a cabo sobre 12 columnas. Las placas se lavaron y (Jackson) IgG-HRP específico antirratón de cabra se agregó durante 1 h a 37°C. El desarrollo de reacción se llevó a cabo usando la solución del sustrato TMB. El anticuerpo de control del isotipo mIgG1 y anti-Axl Mab comercial 154 anticuerpo se usó asimismo en paralelo. Los controles de recubrimiento se llevaron a cabo en la presencia de suero policlonal de IgG Fc antihumano de cabra marcado con HRP (Jackson, ref. 109-035-098) y/o en la presencia de un anticuerpo de la antihistidina HRP-acoplado (R and D Systems, ref: MAB050H).
Los resultados se representan en figuras 24A, 24B y 24C, respectivamente.
Este ejemplo muestra que 1613F12 sólo se une con la proteína rhAxl-Fc y no se une a los otros dos elementos de la familia TAM, rhDtk o rhMer. Ninguna especificidad reticulada de la unión de 1613F12 se observa entre elementos TAM. No se observa ninguna unión específica en la ausencia del anticuerpo primario (diluyente). Ninguna unión se observó en la presencia del anticuerpo de control del isotipo.
Ejemplo 16: 1613F12 reconoció la forma celular de Axl que se expresa en células tumorales de humano.
El nivel de expresión de Axl de superficie celular en células tumorales de humano se estableció primero usando un anticuerpo de Axl comercial (R and D Systems, ref: MAB154) en paralelo de la calibración las perlas para permiten la cuantificación del nivel de expresión de Axl. En segundo lugar, la unión de la superficie celular Axl se estudió usando 1613F12.
Para estudios de unión de la superficie celular, dos diluciones en serie veces de 10 pg/ml (6.6610'8 M) solución de anticuerpo primaria (1613F12, MAB154 o control del isotipo mIgG1 9G4 Mab) se preparan y se aplican en 2.105 células durante 20 minutos a 4°C. Después de 3 lavados en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) complementada con BSA del 1% y NaN3 del 0.01%, las células se incubaron con anticuerpo secundario antirratón de cabra Alexa 488 (dilución de 1/500°) durante 20 minutos a 4°C. Después de 3 lavados adicionales en PBS complementado con BSA del 1% y NaN3 del 0.1%, las células se analizaron por FACS (Facscalibur, Becton Dickinson). Por lo menos 5000 células se evaluaron para calcular el valor medio de la intensidad de la fluorescencia.
Para la determinación de ABC cuantitativa usando MAB154, las perlas de calibración de QIFIKIT® se usan. Luego, las células se incuban, en paralelo con las perlas de QIFIKiT®, con inmunoglobulinas antirratón de cabra policlonal/FITC, cabra F (ab')2, en la concentración de saturación. La cantidad de sitios antigénicos en las células del espécimen es determinada luego por la interpolación de la curva de calibración (la intensidad de la fluorescencia de las poblaciones de la perla individuales contra la cantidad de moléculas de Mab en las perlas.
16.1. Cuantificación de superficie celular nivel de expresión de Axl
El nivel de expresión de Axl en la superficie de células tumorales de humano se determinó mediante la citometría de flujo utilizando un ensayo de inmunofluorescencia indirecto (método de QIFIKIT® (Dako, Dinamarca), un kit de la citometría de flujo cuantitativo para evaluar antígenos de la superficie celular. Una comparación de la intensidad de la fluorescencia media (MFI) de los niveles del antígeno conocidos de las perlas mediante un gráfico de calibración permite la determinación de la capacidad de la unión del anticuerpo (ABC) de las estirpes celulares.
La tabla 16 presenta el nivel de expresión de Axl detectado en la superficie de diversas estirpes de célula tumoral de humano (SN12C, Calu-1, MDA-MB435S, MDA-MB231, NCI-H125, MCF7, Panc1) como se determina utilizando QIFIKIT® usando el MAB154 (R and D Systems). Los valores son proporcionados como el complejo de unión de antígeno (ABC).
Tabla 16
Figure imgf000075_0001
Los resultados obtenidos con MAB154 mostraron que el receptor de Axl se expresa a diversos niveles que dependen de célula tumoral de humano considerada.
16.2. Detección de Axl por 1613F12 en células tumorales de humano
Más específicamente, se estudia la unión de Axl utilizando 1613F12.
Se prepararon las curvas de respuesta de dosis de 1613F12. La utilización obtenida de MFIs de diversas células tumorales de humano se analizó luego con el software Prism. Los datos se presentan en la figura 25.
Los datos indican que 1613F12 se une específicamente al receptor de Axl de membrana como avalan los perfiles de la curva de saturación. Sin embargo las diferentes intensidades del marcado se observaron, los niveles variables reveladores del receptor de Axl de superficie celular en células tumorales de humano. Ninguna unión del receptor de Axl se observó utilizando la estirpe de célula tumoral de pecho de humano de MCF7.
Ejemplo 17: Validación de hz1613F12 con respecto m1613F12
A fin de establecer si hz1613F12 era comparable a su forma murina, los experimentos de unión se llevaron a cabo por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas usando ensayos de la proteína de rhAxl-Fc.
En este ensayo, las placas de 96 pocillos (Immulon II, Thermo Fisher) se recubrieron con 5 pg/ml de 1613F12 solución en 1x PBS, durante la noche a 4°C. Después de una etapa de saturación, un intervalo de proteína de Axl-Fc rh (R and D Systems, ref: 154-AL) se incuba durante 1 hora a 37°C en las placas recubiertas. Para la etapa de revelación, un anticuerpo biotinilado-Axl (en el producto de la casa) se agregó a 0.85pg/ml durante 1 hora a 37°C. Este anticuerpo de Axl pertenece a un grupo epitópico distinto. Luego una solución de la peroxidasa de rábano de la avidina a 1/2000 ° en el amortiguador diluyente se agrega a los pocillos. Luego la solución del sustrato TMB se agrega durante 5 minutos. Después de la adición de la solución de finalización de la peroxidasa, la absorbancia a 405 nm se cuantificó con un lector de la microplaca.
La figura 26 muestra que tanto las versiones humanizadas como murinas de 1613F12 se unen de manera similar a la proteína rhAxl-Fc.
Ejemplo 18: 1613F12 estudio de la incorporación usando marcado de inmunocitoquímica fluorescente. Los resultados de la incorporación complementarios se obtienen por la microscopía confocal usando el método de marcado fluorescente indirecto.
Brevemente, la estirpe de célula tumoral de SN12C se cultivó en RMPI1640 con L-glutamina al 1% y 10% de FCS durante 3 días antes del experimento. Las células se separaron luego usando la tripsina y se sembraron en placa en la placa multipocillos 6 que contiene cubreobjetos en RPMI1640 con L-glutamina del 1% y FCS del 5%. Al día siguiente, 1613F12 se agregó a 10 pg/ml. Las células sometidas a tratamiento con un anticuerpo irrelevante asimismo eran incluidas. Las células se incubaron luego durante 1 h y 2 h a 37°C, CO2 del 5%. Para T 0 h, las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C para determinar la unión del anticuerpo en la superficie celular. Las células se lavaron con PBS y fijaron con paraformaldehído durante 15 minutos. Las células se enjuagaron y se incubaron con anticuerpo Alexa 488 de IgG antirratón de cabra durante 60 minutos a 4°C para identificar el anticuerpo restante en la superficie celular. Para seguir la penetración del anticuerpo en las células, las células se fijaron y permeabilizado con la saponina. Ig de cabra antirratón Alexa 488 (Invitrogen) se utilizó teñida tanto la membrana como el anticuerpo intracelular. Los endosomas tempranos se identificaron usando un conejo el anticuerpo dirigido con especificidad de objetivo en contra policlónico de EEA1 reveló con un anticuerpo de cabra antirratón IgG-Alexa 555 (Invitrogen). Las células se lavaron tres veces y los núcleos se tiñeron usando Draq5. Después de la tinción, las células se montaron en Prolongan el medio de montaje de Oro (Invitrogen) y analizado al usar Zeiss LSM 510 microscopio confocal.
Las fotografías se presentan en figuras 2727-4C.
Las imágenes se obtuvieron por la microscopía confocal. En la presencia del control del isotipo mIgG1 (9G4), ni la tinción de la membrana ni el marcado intracelular se observan (Figura 27A). Una pérdida progresiva de la membrana anti-Axl que marca se observa tan pronto como después de 1 incubación h de las células SN12C con 1613F12 (Figura 27B). La acumulación intracelular de anticuerpo 1613F12 claramente se observa a 1 h y 2 h (Figura 27C). El anticuerpo intracelular colocaliza con EEA1, un marcador del endosoma temprano. Estas fotografías confirman la incorporación de 1613F12 en células SN12C.
Ejemplo 19: Síntesis de los fármacos de la invención
Las siguen abreviaturas se usan en los siguientes ejemplos:
aq acuoso
ee exceso enantiomérico
equiv equivalente
ESI Ionización de electropulverización
LC/MSCromatografía líquida / Espectrometría de masas
HLPC Cromatografía líquida de alta eficiencia
RMN resonancia magnética nuclear
Sat. saturado
UV luz ultravioleta
Compuesto 1
(S)-2-(S)-2-(de 3 aminopropilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo) amino)propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N, 3-dimetilbutanamida, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000077_0001
Compuesto 1A: (4R, 5S)-4-metil-5-fenil-3-propanoil-1,3-oxazolidin-2-ona
Figure imgf000077_0002
(4R, 5S)-4-metil-5-fenil-1,3-oxazolidin-2-ona (5.8 g, 32.7 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en tetrahidrofurano (THF, 120 ml) en una atmósfera inerte. La mezcla se enfrió a -78°C y el n-butilitio (14.4 ml) se agregó gota a gota. Después de agitación durante 30 minutos a -78°C, propanoil cloruro (5.7 ml) se agregó. La agitación continuó durante 30 minutos a -78°C luego durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró luego disuelta de nuevo en 200 ml del agua. El pH de la solución se ajustó a 7 con solución acuosa saturada del bicarbonato sódico. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de acetato etílico (EtOAc). Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 6.8 g (89%) del compuesto 1A en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1B: terc-butilo (2S)-2- [(1R, 2R)-1-hidroxi-2-metil-3- [(4R, 5S)-4-metil-2-oxo-5-fenil-1,3-oxazolidin-3-il] - 3-oxopropil] pirrolidin-1-carboxilato
Figure imgf000077_0003
El compuesto 1A (17.6 g, 75.45 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en diclorometano (DCM, 286 ml) en una atmósfera inerte. Esta solución se enfrió con un baño helado. La trietilamina (TEA, 12.1 ml, 1.15 equiv) y Bu2BOTf (78.3 ml, 1.04 equiv) se agregó gota a gota al mantener la temperatura de la mezcla de reacción a continuación 2°C. La agitación se continuó a 0°C durante 45 minutos, después de los cuales la reacción se enfrió a -78°C. Una solución de terc-butilo (2S)-2-formilpirrolidin-1-carboxilato (8.5 g, 42.66 mmol, 0.57 equiv) en DCM (42 ml) se agregó gota a gota. La agitación se continuó durante 2 horas a -78°C, luego durante 1 hora a 0°C y finalmente 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 72 ml del amortiguador de fosfato (pH = 7.2 - 7.4) y 214 metanol ml y se enfrió a 0°C. Una solución de peróxido de hidrógeno del 30% en metanol (257 ml) se agregó gota a gota al mantener la temperatura menor a 10°C. La agitación se continuó durante 1 hora a 0°C. La reacción se neutralizó con 142 ml del agua, luego se concentró a presión reducida. La solución acuosa resultante se extrajo 3 veces con 200 ml EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y éter de petróleo (EtOAc:PE = 1:8) para producir 13.16 g (40%) del compuesto 1B en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 1C: ácido (2R, 3R)-3-[(2S)-1-[(terc-butoxilo)carbonilo]pirrolidin-2-il] -3-hidroxi-2-metilpropanoico
Figure imgf000078_0001
El compuesto 1B (13.16 g, 30.43 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en THF (460 ml) en la presencia de peróxido de hidrógeno (30% en agua, 15.7 ml), luego enfriado con un baño helado. La solución acuosa de hidróxido de litio (0.4 mol/L, 152.1 ml) se agregó gota a gota al mantener la temperatura de reacción a continuación 4°C. La mezcla de reacción se agitó 2.5 horas a 0°C. La solución acuosa de Na2SO3 (1 mol/L, 167.3 ml) se agregó gota a gota mientras se mantiene la temperatura a 0°C. La mezcla de reacción se agitó 14 horas a temperatura ambiente, luego se neutralizó con 150 ml de la solución saturada del bicarbonato sódico fría y se lavó 3 veces con 50 ml de DCM. El pH de solución acuosa se ajustó a 2-3 con un 1M solución acuosa de KHSO4. Esta solución acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con la solución de NaCl saturada, secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 7.31 g (88%) del compuesto 1C en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 1D: ácido (2R, 3R)-3-[(2S)-1-[(terc-butoxilo)carbonilo]pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico
Figure imgf000078_0002
El compuesto 1C (7.31 g, 26.74 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (135 ml) en la presencia de yodometano (25.3 ml). El medio de reacción se enfrió con un baño helado después del cual NaH (60% en aceite, 4.28 g) se agregó en porciones. La reacción se dejó bajo agitación 3 días a 0°C y luego con 100 ml del bicarbonato sódico neutralizado solución acuosa saturada y se lavó 3 veces con 50 éter ml. El pH de solución acuosa se ajustó a 3 con 1M solución KHSO4 acuosa. Esta solución acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 100 ml de Na2S2O3 (5% en agua), una vez con la NaCl-solución-saturada, luego secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 5.5 g (72%) del compuesto 1D en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 1E: N-metoxi-N-metil-2-fenilacetamida
Figure imgf000078_0003
El ácido 2-fenilacético (16.2 g, 118.99 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en la dimetilformamida (DMF, 130 ml) luego enfriado a -10°C. El dietilo fosforocianidato (DEPC, 19.2 ml), metoxilo (metilo) clorhidrato de la amina (12.92 g, 133.20 mmol, 1.12 equiv) y trietilamina (33.6 ml) se agregó. La mezcla de reacción se agitó 30 minutos a -10°C luego 2.5 horas a temperatura ambiente. Se extrajo luego dos veces con 1 litro de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con 500 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 400 ml del agua, luego secó sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con EtOAc y mezcla PE (1:100 a 1:3) para producir 20.2 g (95%) del compuesto 1E en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1F: 2—fenil—1 —(1,3—tiazol—2—il)etan—1 —ona
Figure imgf000079_0001
La tetrametiletilendiamina (TMEDA, 27.2 ml) se disolvió en THF 300 ml) en una atmósfera inerte, luego enfriada a -78°C antes de la adición gota a gota de n-BuLi (67.6 ml, 2.5 M). El 2-bromo-1,3-tiazol (15.2 ml) se agregó gota a gota y agitación se continuó 30 minutos a -78°C. El compuesto 1E (25 g, 139.50 mmol, 1.00 equiv) disuelto en THF (100 ml) se agregó gota a gota. La agitación se continuó durante 30 minutos a -78°C luego 2 horas a -10°C. La reacción se neutralizó con 500 ml de KHSO4 (sat.), luego se extrajo 3 veces con 1 litro de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con 400 agua ml y dos veces con 700 ml de NaCl (sat.), luego secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 25 g (88%) del compuesto 1F en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1G: (1R)—2—fenil—1—(1,3—tiazol—2—il)etan—1—ol
Figure imgf000079_0002
En una atmósfera inerte, una solución de compuesto 1F (15 g, 73.8 mmol, 1.00 equiv.) en el éter (300 ml) se agregó gota a gota a (+)-B-clorodiisopinocanfeilborano ((+)-Ipc2BCl, 110.8 ml). La mezcla de reacción se agitó 24 horas a 0°C, luego se neutralizó con 300 ml de (un 1:1) mezcla de NaOH (10% en agua) y H2O2 (30% en agua), y finalmente extrajo tres veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con 300 ml de K2CO3 (sat.) y una vez con 500 ml de NaCl (sat.), luego secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:20 a 1:2) para producir 6.3 g (42%) del compuesto 1G en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 1H: 2 -[(1S)—1 -azido—2—feniletil]- 1,3-tiazol
Figure imgf000079_0003
Compuesto 1G (6 g, 29.23 mmol, 1.00 equiv.) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (150 ml) en la presencia de la trifenilfosfina (13 g, 49.56 mmol, 1.70 equiv.), luego enfriado a 0°C. Dietilazodicarboxilato (DEAD, 7.6 ml) se agregó gota a gota, seguido de difenilfosforilazida (DPPA, 11 ml), el baño frío se eliminó luego y la solución se dejó bajo agitación 48 horas a temperatura ambiente. El medio se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:30) para producir 8 g del compuesto en parte purificado 1H en la forma de aceite amarillo. El compuesto 1H se usó como tal en la siguiente etapa.
Compuesto 1I: terc-butilo N - [(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il) etilo]carbamato.
Figure imgf000079_0004
El compuesto 1H (6.5 g, 28.2 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (100 ml) en la presencia de la trifenilfosfina (6.5 g, 33.9 mmol, 1.20 equiv.) Y calentado a 50°C durante 2 horas. El amoníaco (70 ml) se agregó posteriormente y el calentamiento se continuó durante 3 horas. La reacción se enfrió, neutralizada con 500 agua ml, luego extrajo 3 veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron y extrajeron dos veces con 500 ml de 1N HCl. Las fases acuosas se combinaron, puestas a pH 8-9 agregando una solución de hidróxido de sodio (10% en agua), luego se extrajeron 3 veces con 500 ml de DCM. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 4.8 g (83%) de (1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etan-1-amina en la forma de aceite amarillo. Este compuesto se protegió luego con un grupo de Boc ((terc-butoxilo)carbonilo) de modo que pudiera purificarse. Se disolvió en una atmósfera inerte en 1,4 dioxano (40 ml), luego enfriado a 0°C. (Boc)2O (10.26 g, 47.01 mmol, 2.00 equiv) diluido en 20 ml de 1,4 dioxano se agregó gota a gota. El baño frío se eliminó y la solución mantenida bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente antes de neutralizarse con 300 ml del agua y extrajo dos veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:20, ee = el 93%). Se recristalizó luego en una mezcla de hexano/acetona (~ 5-10 / 1, 1g / 10 ml) para producir 6 g (84%) del compuesto 1I en la forma de un sólido color blanco (ee> el 99%).
Compuesto 1J: terc-butilo (2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamoil]etil]pirrolidina- 1 -carboxilato
Figure imgf000080_0001
El compuesto 1I (3 g, 9.86 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 10 ml DCM. El ácido trifluoroacético (TFA, 10 ml) se agregó y la solución mantenida bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego concentrada a presión reducida para producir 2.0 g (64%) de (1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il) etan-1-amina; ácido trifluoroacético en la forma de aceite amarillo. Este producto intermedio se disolvió de nuevo en 20 ml de DCM después del cual el compuesto 1D (1.8 g, 6.26 mmol, 1.05 equiv), DEPC (1.1 g, 6.75 mmol, 1.13 equiv) y diisopropiletilamina (DIEA, 1.64 g, 12.71 mmol, 2.13 equiv) se agregó. La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego concentrada a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:3) para producir 2.3 g (81%) del compuesto 1J en la forma de un sólido color amarillo pálido.
Compuesto 1K: (2R, 3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il) etilo]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il] propanamida; ácido trifluoroacético
Figure imgf000080_0002
El compuesto 1J (2.25 g, 4.75 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 10 ml de DCM. TFA (10 ml) se agregó y la solución mantenida bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego concentrada a presión reducida para producir 2.18 g (94%) del compuesto 1K en la forma de aceite amarillo. Compuesto 1L: ácido (2S, 3S)-2-(benzilamino)-3-metilpentanoico
Figure imgf000080_0003
Ácido (2S, 3S)-2-amino-3-metilpentanoico (98.4 g, 750 mmol, 1.00 equiv) se agregó a temperatura ambiente y en porciones a una solución de hidróxido de sodio 2N (375 ml). Benzaldehído (79.7 g, 751.02 mmol, 1.00 equiv) rápidamente se adicionó y la solución resultante se agitó 30 minutos. El borohidruro de sodio (10.9 g, 288.17 mmol, 0.38 equiv) se agregó en pequeñas porciones, al mantener la temperatura a entre 5 y 15°C. La agitación se continuó durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con 200 ml del agua, luego lavada dos veces con 200 ml de EtOAc. El pH de solución acuosa se ajustó a 7 con un 2N solución de ácido clorhídrico. El precipitado conformado se recolectó al filtrar y proporcionó 149.2 g (90%) del compuesto 1L en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 1M: ácido (2S, 3S)-2-[bencilo (metilo)amino]-3-metilpentanoico
Figure imgf000081_0001
El compuesto 1L (25 g, 112.97 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en el ácido fórmico (31.2 g) en la presencia de formaldehído (36.5% en agua, 22.3 g). La solución se agitó 3 horas a 90°C luego concentrado a presión reducida. El residuo se trituró en 250 ml de acetona, luego se concentró. Esta operación de la trituración/evaporación se repitió dos veces con 500 ml de acetona para producir 21.6 g (81%) del compuesto 1M en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 1N: (2S, 3S)-2-[bencilo (metilo) amino]-3-metilpentan-1-ol
Figure imgf000081_0002
LiAlH4 (0.36 g) se suspendió en 10 ml de THF en una atmósfera inerte a 0°C. El compuesto 1M (1.5 g, 6.37 mmol, 1.00 equiv) se agregó en pequeñas porciones al mantener la temperatura a entre 0 y 10oC. La mezcla de reacción se agitó 2 horas a 65°C, luego nuevamente enfriado a 0°C antes de neutralizarse con adiciones sucesivas de 360 pL del agua, 1 ml de hidróxido de sodio del 15% y 360 pL del agua. Las sales de aluminio que precipitaron se eliminaron al filtrar. El filtrado se secó sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:50) para producir 820 mg (58%) del compuesto 1N en la forma de aceite amarillo pálido.
Compuesto 1O: (2S, 3S)-2-[bencilo(metilo) amino]-3-metilpentanal
Figure imgf000081_0003
Cloruro del oxalilo (0.4 ml) se disolvió en DCM (15 ml) en una atmósfera inerte. La solución se enfrió a -70°C y una solución del dimetilsulfóxido (DMSO (0.5 ml) en DCM (10 ml) se agregó gota a gota durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó 30 minutos después de que una solución del compuesto 1N (820 mg, 3.70 mmol, 1.00 equiv) en DCM (10 ml) se agregó gota a gota durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó unos 30 minutos adicionales a baja temperatura, luego la trietilamina (2.5 ml) se agregó lentamente. La mezcla de reacción se agitó 1 hora a -50°C, el baño frío se eliminó luego y la reacción se neutraliza con 25 ml del agua al permitir la temperatura regresarse a normal. La solución se lavó una vez con 30 ml de solución acuosa NaClsaturada, luego secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:200) para producir 0.42 g (52%) del compuesto 1O en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1P: (2S, 3S)-N-benzil-1,1-dimetoxi-N,3-dimetilpentan-2-amina
Figure imgf000082_0001
El compuesto 1O (4.7 g, 21.43 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 20 ml de metanol a 0°C. Ácido sulfúrico concentrado (4.3 ml) se agregó gota a gota y agitación se continuó durante 30 minutos a 0°C. El trimetilo ortoformato (21.4 ml) se agregó, el baño frío eliminado y el medio de reacción mantenido bajo agitación durante 3 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se diluyó con 200 ml de EtOAc, sucesivamente lavado con 100 ml de Na2CO3 del 10% y 200 ml de NaCl saturado, luego secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 3.4 g (60%) del compuesto 1P en la forma de aceite amarillo pálido.
Compuesto 1Q: [[1-(terc-butoxilo)etenilo]oxi](terc-butilo)dimetilsilano
Figure imgf000082_0002
Diisopropilamina (20 g, 186.71 m mol, 1.08 equiv) se disolvió en 170 ml de THF en una atmósfera inerte y se enfrió a -78°C. nBuLi (2.4 M, 78.8 ml) se agregó gota a gota y la solución agitó 30 minutos a baja temperatura (diisopropilamida para proporcionar LDA-de-litio) antes de adicionar acetato de terc-butilo (20 g, 172.18 mmol, 1.00 equiv). La mezcla de reacción se agitó 20 minutos a -78°C antes de adicionar la hexametilfosforamida (HMPA, 25.8 ml) y una solución de tertbutildimetilclorosilano (TBDMSCl, 28 g, 185.80 mmol, 1.08 equiv) en 35 ml de THF. La agitación se continuó durante 20 minutos adicionales a baja temperatura, y el baño frío se eliminó luego. La solución se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió de nuevo en 100 ml del agua y extrajo 3 veces con 100 ml de PE. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 500 ml de solución acuosa NaCl-saturada, secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó por la destilación para producir 16.6 g (83%) del compuesto 1Q en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 1R: terc-butilo (3R, 4S, 5S)-4-[bencilo(metilo) amino]-3-metoxi-5-metil heptanoato
Figure imgf000082_0003
El compuesto 1P (2.0 g, 7.54 mmol, 1.00 equiv) y el compuesto 1Q (2.6 g, 11.28 mmol, 1.50 equiv) se disolvieron en 33 ml de DCM en una atmósfera inerte. La solución se enfrió a 0°C. DMF (1.2 g) se agregó gota a gota junto con una solución de BF3-Et2O (2.1 g) en 7.5 ml de DCM. La agitación se continuó durante 24 horas a 0°C. El medio de reacción se lavó una vez con 30 ml de carbonato de sodio (10%) y dos veces con 50 ml de solución acuosa NaCl-saturada, luego secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100) para producir 1.82 g (91%) del compuesto 1R en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1S: clorhidrato de (3R, 4S, 5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamino)heptanoato
Figure imgf000082_0004
El compuesto 1R (2.4 g, 6.87 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 35 ml de etanol en la presencia de Pd/C (0.12 g) y concentró ácido clorhídrico (0.63 ml). La atmósfera de nitrógeno fue sustituida por una atmósfera de hidrógeno y el medio de reacción se dejó bajo agitación 18 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se trituró en 50 ml de hexano y el sobrenadante eliminado que, después secado a presión reducida, proporcionó a 1.66 g (82%) del compuesto 1S en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 1T: terc-butilo (3R, 4S, 5S)-4-[(2S)-2-[[(benciloxilo)carbonilo]amino]-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoato
Figure imgf000083_0001
Ácido (2S)-2-[[(benciloxilo)carbonilo]amino]-3-metilbutanoico (15 g, 0.40 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 300 ml de DCM en la presencia de DIEA (38.3 ml) y hexafluorofosfato bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP, 32.3g). La solución se agitó 30 minutos a temperatura ambiente antes de adicionar el compuesto 1S (15.99g, 0.42 mmol, 1.07 equiv). El medio de reacción se agitó 2 horas y luego se concentró. El residuo se purificó en la fase (C18) inversa con una mezcla de acetonitrilo (ACN) y agua (30:70 a 100:0 en 40 minutos) para producir 17 g (58%) del compuesto 1T en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 1U: terc-butilo (3R, 4S, 5S)-4-[(2S)-2-amino-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoato
El compuesto 1T (76 mg, 0.15 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 10 ml de etanol en la presencia de Pd/C (0.05 g). La atmósfera de nitrógeno fue sustituida por una atmósfera de hidrógeno y la reacción se agitó 2 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 64 mg del compuesto 1U en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 1V: (3R, 4S, 5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo]amino]-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoato
Figure imgf000083_0002
El compuesto 1U (18.19 g, 50.74 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 400 ml de un 1,4-dioxano/agua mezcla (1:1) en la presencia del bicarbonato sódico (12.78 g, 152 mmol, 3.00 equiv) y 9H-fluoren-9-ilmetil cloroformato (Fmoc-Cl, 19.69 g, 76 mmol, 1.50 equiv), luego se agitó 2 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se diluyó luego con 500 ml del agua y extrajo 3 veces con 200 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 200 ml de solución acuosa NaCl-saturada, secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 40 g del compuesto en parte purificado 1V en la forma de aceite amarillo pálido. Compuesto 1W: ácido (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino]-N,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoico
Figure imgf000083_0003
El compuesto 1V (40 g, 68.88 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera neutra en 600 ml de DCM. TFA (300 ml) se agregó. La solución se agitó 2 horas a temperatura ambiente, luego se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de metanol y DCM (1:10) para producir 23.6 g (65%) del compuesto 1W en la forma oleosa incolora.
Compuesto 1X: 9H-fluoren-9-ilmetil N-[(1S)-1-[[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etilo]carbamoil]etilo]pirroNdin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metilo)carbamoil]-2-metilpropil]carbamato
Figure imgf000084_0001
El compuesto 1W (2.53 g, 4.82 mmol, 1.08 equiv) se disolvió en 20 ml de DCM en la presencia del compuesto 1K (2.18 g, 4.47 mmol, 1.00 equiv), DEPC (875 mg, 5.37 mmol, 1.20 equiv) y DIEA (1.25 g, 9.67 mmol, 2.16 equiv). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego sucesivamente lavada con 50 ml de KHSO4 saturado y 100 ml del agua, secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de metanol y DCM (1:200 a 1:40) para producir 2.8 g (71%) del compuesto 1X en la forma de un sólido color amarillo pálido.
Compuesto 1Y: (2S)-2-amino-N-[(3R, 5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1—(1,3—tiazol—2—il)etilo]carbamoil]etilo]pirrolidin—1 —il]—5—metil—1 —oxoheptan—4—il] -N, 3-dimetilbutanamida
Figure imgf000084_0002
El compuesto 1X (2.8 g, 3.18 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en acetonitrilo (ACN, 12 ml) en la presencia de la piperidina (3 ml) y mantuvo bajo agitación 18 horas a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 50 ml del agua, luego extrajo dos veces con 100 ml de DCM. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de metanol y DCM (1:100 a 1:40) para producir 1.2 g (57%) del compuesto 1Y en la forma de un sólido color amarillo.
Compuesto 1ZA: ácido (2S)-2-[[(terc-butoxilo)carbonilo](metilo)amino]-3-metil butanoico
Figure imgf000084_0003
Ácido (2S)-2-[[(terc-butoxilo)carbonilo]amino]-3-metilbutanoico (63 g, 289.97 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (1000 ml) en la presencia de yodometano (181 ml). La solución se enfrió a 0°C antes de adicionar el hidruro de sodio (116 g, 4.83 mol, 16.67 equiv) en pequeñas porciones. La mezcla de reacción se agitó durante 1.5 horas a 0oC, el baño frío se eliminó luego y agitación se continúa durante 18 horas. La reacción se neutralizó con 200 ml del agua y luego se concentró a presión reducida. La fase acuosa residual se diluyó con 4 litros del agua, lavado una vez con 200 ml de EtOAc y su pH ajustado a entre 3 y 4 con un 1N solución de ácido clorhídrico. La mezcla obtenida se extrajo 3 veces con 1.2 L de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 60 g (89%) del compuesto 1ZA en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1ZB: bencilo (2S)-2-[[(terc-butoxilo) carbonilo] (metilo) amino]-3-metilbutanoato
Figure imgf000084_0004
El compuesto 1ZA (47 g, 203.21 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en DMF (600 ml) en la presencia de LÍ2CO3 (15.8 g, 213.83 mmol, 1.05 equiv). La solución se enfrió a 0°C luego el bromuro de bencilo (BnBr 57.9 g, 338.53 mmol, 1.67 equiv) se agregó gota a gota. La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche antes de neutralizarse con 400 ml del agua y filtró. La solución obtenida se extrajo dos veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:20) para producir 22.5 g (34%) del compuesto 1ZB en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 1ZC: clorhidrato de bencilo (2S)-3-metil-2-(metilamino)butanoato
Figure imgf000085_0001
El compuesto 1ZB (22.5 g, 70.00 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 150 ml de DCM. Ácido clorhídrico gaseoso se burbujeó. La reacción se agitó 1 hora a temperatura ambiente y luego se concentró a presión reducida para producir 17 g (94%) del compuesto 1ZC en la forma de un sólido color amarillo.
Compuesto 1ZD: terc-butilo N-carbamato (3,3—dietoxipropil)
Figure imgf000085_0002
La 3,3-dietoxipropan-1-amina (6 g, 40.76 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 1,4-dioxano (30 ml) en la presencia de TEA (4.45 g, 43.98 mmol, 1.08 equiv), luego enfriado a 0°C. (Boc) 2O (9.6 g, 43.99 mmol, 1.08 equiv) diluido en 20 ml de 1,4-dioxano se agregó gota a gota. La solución se agitó 2 horas a 0°C luego durante la noche a temperatura ambiente antes de neutralizarse con 10 ml del agua. El pH se ajustó a 5 con e1HCl (1%). La solución se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 8.21 g (81%) del compuesto 1ZD en la forma de aceite amarillo pálido. Compuesto 1ZE: terc-butilo N-(3-oxopropil) carbamato
Figure imgf000085_0003
El compuesto 1ZD (8.20 g, 33.15 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 18.75 ml de ácido acético y se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente. El medio de reacción se extrajo luego 3 veces con 30 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas 3 veces con 30 ml de solución de NaCl saturada, secada sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 5 g (87%) del compuesto 1ZE en la forma de un aceite color rojo oscuro.
Compuesto 1ZF: ácido (2S)-2-[(3-[[(terc-butoxilo)carbonilo]amino]propilo)(metilo)amino]-3-metilbutanoico
Figure imgf000085_0004
El compuesto 1ZE (2.4 g, 13.86 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 50 ml de THF en la presencia del compuesto 1ZC (3.56 g, 13.81 mmol, 1.00 equiv) y DIEA (9.16 ml, 4.00 equiv). La mezcla de reacción se agitó 30 minutos a temperatura ambiente antes de adicionar el sodio triacetoxiborohidruro (5.87 g, 27.70 mmol, 2.00 equiv). La agitación se continuó durante la noche, luego la reacción se neutralizó con 100 ml del agua y extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo en parte se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:4). El producto sin refinar obtenido se disolvió de nuevo en 20 ml de metanol en la presencia de Pd/C (1.2 g) y se hidrogenó durante 20 minutos temperatura a normal y presión. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 200 mg (5%) del compuesto 1ZF en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 1ZG: terc-butilo N-('3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2- [(1R,2R)-1-metoxi-2-metil—2—[[(1S)—2—fnil—1—(1,3—tiazol—2—il)etilo]carbamoil]til]pirrolidin—1—il]—5—metil—1—oxoheptan— 4il](metilo)carbamoil]-2-metilpropil]carbamoil]-2-metilpropil](metilo) amino]propilo) carbamato
Figure imgf000086_0001
El compuesto 1Y (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 2 ml de DMF en la presencia del compuesto 1ZF (26.2 mg, 0.09 mmol, 1.20 equiv), DIEA (37.7 ml) y O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N, N, N, N ’-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU, 43.3 mg, 0.11 mmol, 1.50 equiv). La reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego diluida con 10 ml del agua y extrajo 3 veces con 5 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 100 mg del compuesto 1ZG en la forma de aceite incoloro en parte purificado.
El compuesto 1ZG (90 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera neutra en 2 ml de DCM y la solución se enfrió con un baño helado. TFA (1 ml) se agregó y la reacción agitada durante 2 horas a temperatura ambiente, luego concentrada a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: el agua / ACN amortiguado con el 0.05% de TFA; gradiente de 18% a 31% de ACN en 7 minutos luego el 31% a 100% de ACN en 2 minutos; detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 1 se obtuvo con una producción del 25% (23 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Atlantis columna de T3, 3 pm, 4.6 x 100 mm; 35°C; 1 ml / minuto, el 30% a 60% de ACN en agua (acetato de amonio de 20 mm en 6 minutos); ESI (C44H73N7O6S, masa 827.53 exacto) m/z: 829 (MH+), 5.84 minutos (93.7%, 254 nm).1
1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 5to), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.22 - 4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.74 (m, 58H).
Compuesto 2
(S)-2-(S)-2-(((2-aminopiridin-4-il)metilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-1-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético
Figure imgf000086_0002
Compuesto 2A: terc-butilo (S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il) amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato
Figure imgf000087_0001
El compuesto 1D (2.5 g, 8.70 mmol, 1.00 equiv) y (1S, 2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol (1.315 g, 8.70 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DMF (35 ml). La solución se enfrió a 0°C luego DEPC (1.39 ml) y TEA (1.82 ml) se agregaron gota a gota. La mezcla de reacción se agitó 2 horas a 0 °C luego 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con 200 ml del agua y extrajo tres veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 50 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 50 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 50 ml de NaCl (sat.), luego se seca sobre sulfato de sodio, se seca y se concentra a presión reducida para producir 3.6 g (98%) de compuesto 2A en la forma de un sólido color amarillo. Compuesto 2B: (2R, 3R)-N-((1S, 2R)—1 —hidroxi—1 —fenilpropan—2—il)—3—metoxi—2—metil—3—(S)—pirrolidin—2—il) propanamida-2 ,2 ,2-trifluoroacetato
Figure imgf000087_0003
El compuesto 2A (2.7 g, 6.42 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DCM (40 ml) luego enfriado a 0 °C. TFA (25 ml) se agregó y la solución se agita durante 2 horas a 0 °C. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para producir 4.4 g del compuesto 2B en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 2C: (9H-fluoren-9-il)metilo ((S)-1-(((3R, 4S, 5S)-1-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)—1—hidroxi—1 — fenilpropan-2-il) amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metilo)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) carbamato
Figure imgf000087_0002
Los compuestos 2B (4.4 g, 10.13 mmol, 1.00 equiv) y 1W (5.31 g, 10.12 mmol, 1.00 equiv) se disolvieron en una atmósfera inerte en DCM (45 ml). La solución se enfrió a 0°C luego DEPC (1.62 ml) y DIEA (8.4 ml) se agregaron gota a gota. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 0°C luego a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml del agua y extrajo tres veces con 50 ml de DCM. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 50 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 50 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 50 ml de NaCl (sat.), luego se seca sobre sulfato de sodio, filtrado y se concentra a presión para producir 3.3 g (39%) de compuesto 2C en la forma de un sólido color amarillo.
Compuesto 2D: (S)-2-amino-N-((3R, 4S, 5S)-1-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N, 3-dimetilbutanamida
Figure imgf000088_0001
El compuesto 2C (300 mg, 0.36 mmol, 1.00 eq.) se disolvió en una atmósfera inerte en ACN (2 ml) y piperidina (0.5 ml). La solución se dejó bajo agitación a temperatura ambiente durante la noche luego evaporada hasta secarse a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de DCM y MeOH (1:100) para producir 150 mg (68%) del compuesto 2D en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 2E: metil 2-(terc-butoxicarbonilo)amino)isonicotinato
Figure imgf000088_0002
Metil 2-aminopiridina-4-carboxilato (2 g, 13.14 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en el terc-butanol (20 ml) después de añadir di-terc-butilo dicarbonato (4.02 g, 18.42 mmol, 1.40 equiv). La mezcla de reacción se agitó a 60°C durante la noche luego la reacción se detuvo a través de la adición de una solución de 1M NaHCO3 acuosa (50 ml). El sólido se recuperó mediante filtración, se lavó con 50 ml de EtOH luego secado en vacío para producir 2.5 g (75%) del compuesto 2E en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 2F: terc-butilo (4-(hidroximetilo) piridin-2-il)carbamato
Figure imgf000088_0003
El compuesto 2E (2.5 g, 9.91 mmol, 1.00 equiv) y CaCh (1.65 g) se disolvió en EtOH (30 ml). La solución se enfrió a 0°C luego NaBH4 (1.13 g, 29.87 mmol, 3.01 equiv) gradualmente se adicionó. La solución se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente luego la reacción se detuvo con la adición del agua (50 ml). La mezcla se extrajo tres veces con 20 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con 20 ml de NaCl (sat.) luego secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión reducida para producir 2.0 g (90%) de compuesto 2F en la forma de un sólido incoloro.
Compuesto 2G: terc-butilo (4-formilpiridin-2-il)carbamato
Figure imgf000088_0004
El compuesto 2F (2.5 g, 11.15 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en DCE (25 ml) luego 19.4 g (223.14 mmol, 20.02 equiv) de MnO2 se agregaron. La mezcla se dejó bajo agitación durante la noche a 70 °C luego los sólidos se eliminaron al filtrar. El filtrado se evaporó hasta secarse para producir 1.4 g (57%) del compuesto 2G en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 2H: bencilo (S)-2-(((2-(terc-butoxicarbonilo)amino)piridin-4-il)metil) (metil) amino)-3-metilbutanoato
Figure imgf000089_0003
El compuesto 2G (2.3 g, 10.35 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 25 ml de THF en la presencia del compuesto 1ZC (2.93 g, 11.37 mmol, 1.10 equiv), DIEA (5.39 g, 41.71 mmol, 4.03 equiv) y NaBH (OAc)a (4.39 g, 20.71 mmol, 2.00 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas a temperatura ambiente luego neutralizada con 60 ml de NaHCO3 (sat.) y se extrajo 3 veces con 20 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con 20 ml de NaCl (sat.), secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:15) para producir 2.7 g (61%) del compuesto 2H en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 2I: ácido (S)-2-(((2-(terc-butoxicarbonil)amino)piridin-4-il)metil)(metil)amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000089_0001
El compuesto 2H (500 mg, 1.17 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 10 ml de AcOEt y 2 ml de metanol en la presencia del Pd/C (250 mg), y se hidrogenó durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 254 mg (64%) del compuesto 2I en la forma de un sólido incoloro
Compuesto 2J: terc-butilo (4-((3S, 6S, 9S, 10R)-9-(S)- sec-butilo)-10-(2-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-3,6-diisopropil-2,8-dimetil-4,7-dioxo-11-oxa-2,5,8-triazadodecil)piridin-2-il)carbamato
Figure imgf000089_0002
El compuesto 2J se preparó de manera similar al compuesto 1ZG de la amina 2D (85.2 mg, 0.14 mmol, 1.50 equiv), el ácido 2I (31.7 mg, 0.09 mmol, 1.00 equiv), hAt U (42.9 mg, 0.11 mmol, 1.20 equiv) y DIEA (36.7 mg, 0.28 mmol, 3.02 equiv) en DMF (3 ml). Después de la evaporación hasta secarse, 100 mg del producto sin refinar se obtuvieron en la forma de un sólido color blanco.
El compuesto 2J (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv) se disolvieron en 2 ml de DCM y 1 ml de TFA. La reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se concentró a presión reducida. El residuo (80 mg) se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm;eFase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 2 se obtuvo con una producción del 6% (6.3 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.8 ml/min, del 10% a 95% de ACN en agua (TFAdel 0.05%) en 6 minutos); ESI (C45H73N7O7, 823.56 de masa exacta) m/z: 824.5 (MH ) y 412.9 (M 2H /2, el 100%), 3.21 minutos (99.2%, 210 nm) 1
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.81 - 7.79 (m, 1H); 7.39 - 7.29 (m, 5to); 6.61 -6.59 (m, 2H); 4.84 - 4.52 (m, 1H); 4.32 - 4.02 (m, 1H); 3.90 - 2.98 (m, 10H); 2.90 - 2.78 (m, 1H); 2.55 - 0.81 (m, 39H).
Compuesto 3 de referencia
metilo ((S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(piridin-4ilmetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético
Figure imgf000090_0001
Compuesto 3A: terc-butilo (S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-3-(((S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il) amino)-2-metil-3-oxopropil)pirrolidina-1-carboxilato
Figure imgf000090_0002
El compuesto 1D (3 g, 10.44 mmol, 1.00 equiv) y metilo (S)-2-amino-3-fenilpropanoato (2.25 g, 12.55 mmol, 1.20 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DMF (40 ml). La solución se enfrió a 0°C luego DEPC (1.67 ml, 1.05 equiv) y TEA (3.64 ml, 2.50 equiv) se agregaron gota a gota. La mezcla de reacción se agitó 2 horas a 0 °C luego a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml del agua y extrajo tres veces con 50 ml EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 100 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 100 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 100 ml de NaCl (sat.), luego secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión para producir 4 g (85%) de compuesto 3A en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 3B: 2,2,2 trifluoroacetato de metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-metoxi-2-metil-3-(S)-pirrolidin-2-il)propanamido)-3-fenilpropanoato
Figure imgf000090_0003
El compuesto 3A (5 g, 11.15 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DCM (40 ml). TFA (25 ml) se agregó y la solución agitada durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para producir 8 g del compuesto 3B en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 3C: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-((((9H-fluoren-9-il) metoxilo)carbonilo)amino)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato
Figure imgf000091_0001
Los compuestos 3B (8.03 g, 17.36 mmol, 1.00 equiv) y 1W (9.1 g, 17.34 mmol, 1.00 equiv) se disolvieron en una atmósfera inerte en DCM (80 ml). La solución se enfrió a 0 °C luego DEPC (2.8 ml) y DIEA (12 ml) se agregaron gota a gota. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 0°C luego a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con 200 ml del agua y extrajo tres veces con 50 ml de DCM. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 50 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 50 ml de NaHCÜ3 (sat.), una vez con 50 ml de NaCl (sat.), luego secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión reducida para producir 5 g (34%) de compuesto 3C en la forma de un sólido color amarillo.
El compuesto 3D: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-amino-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato
Figure imgf000091_0002
El compuesto 3C (5.5 g, 6.43 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en una solución del fluoruro del tetrabutilamonio (TBAF, 2.61 g, 9.98 mmol, 1.55 quiv) en DMF (100 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas luego diluidas con 100 ml del agua y extrajo tres veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron luego secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión reducida para producir 3.3 g (81%) del compuesto 3D en la forma de un sólido color amarillo.
Compuesto 3E: bencilo (S)-3-metil-2-(metilo (piridin-4-ilmetil) amino) butanoato
Figure imgf000091_0003
Piridin-4-carbaldehído (1 g, 9.34 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 10 ml del de 1,2 dicloroetanos (DCE) en la presencia del compuesto 1ZC (2.9 g, 11.25 mmol, 1.21 equiv) e isopropóxido del titanio (IV) (4.19 ml, 1.40 equiv). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos luego 2.77 g de NaBH (OAc)3 (13.07 mmol, 1.40 equiv) se agregaron. El medio de reacción se dejó bajo agitación durante la noche luego neutralizada con 100 ml del agua y la mezcla se extrajo 3 veces con 50 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron y evaporaron hasta secarse. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:20) para producir 1.3 g (45%) del compuesto 3E en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 3F: (S)-3-metil-2-(metilo (piridin-4-ilmetil) amino) ácido butanoico
Figure imgf000091_0004
El compuesto 3E (800 mg, 2.56 mmol, 1.00 equiv) se disolvieron en 30 ml de AcOEt en la presencia del Pd/C (300 mg) e hidrogenaron durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de DCM y MeOH (100:1 a 5:1) para producir 100 mg (18%) del compuesto 3F en la forma de un sólido color blanco.
El compuesto 3D (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv) y 3F (26.34 mg, 0.12 mmol, 1.50 equiv) se disolvió en 3 ml de DCM. La solución se enfrió a 0°C luego 0.018 ml de DEPC y 0.0392 ml de DIEA se agregaron. La reacción se agitó a 0°C durante 2 horas luego a temperatura ambiente durante la noche. El medio de reacción se concentró a presión reducida y el residuo (70 mg) se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: el agua / ACN amortiguado con el 0.05% de TFA; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 3 se obtuvo con una producción del 27% (20 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, el 10% a 95% de ACN en agua (t Fa del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C46H72N6O8, 836.5 de masa exacto) m/z: 837.5 (MH+) y 419.4 (M 2H+/2 (100%)), 7.04 minutos (90.0%, 210 nm)
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.76 - 8.74 (m, 2H); 8.53 - 8.48 (m, 0.4H, NHCO intercambio incompleto); 8.29 - 8.15 (m, 0.8H, NHCO intercambio incompleto); 8.01 (s, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 4.88 - 4.68 (m, 3H); 4.31 - 4.07 (m, 2H); 3.94 - 2.90 (m, 18H); 2.55 - 0.86 (m, 38H).
Compuesto 4 de referencia
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-N, 3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético
Figure imgf000092_0001
El compuesto 3 (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una mezcla del agua (5 ml), ACN (5 ml) y piperidina (2.5 ml). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche luego concentrada a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / Ac N amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 20 mg (20%) de compuesto 4 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, el 10% a 95% de ACN en agua (t Fa del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C45H70N6O8, 822.5 de masa exacta) m/z: 823.5 (MH+) y 412.4 (M 2H+/2, el 100%), 6.84 minutos (89.1%, 210 nm).
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.79 - 8.78 (m, 2H); 8.09 (m, 2H); 7.30 - 7.21 (m, 5H); 4.80 - 4.80 (m, 1H), 4.36 - 0.87 (m, 58H).
Compuesto 6
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(3-am inopropil) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolid in-2-il)-3-m etoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000093_0001
Compuesto 6A: metilo (2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R, 4S, 5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(terc-butoxilo) carbonilo] amino] propilo) (metilo) amino]-3-metil butanamido] -N,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il](metoxilo)metilo]propanamido] -3-fenilpropanoato
Figure imgf000093_0002
El compuesto 3D (157.5 mg, 0.25 mmol, 1.00 equiv) se disolvió a 0°C en una atmósfera inerte en 3 ml de DCM en la presencia del ácido carboxílico 1ZF (78.7 mg, 0.27 mmol, 1.10 equiv), DEPC (46 jl) y DIEA (124 jl). La mezcla de reacción se agitó 2 horas a baja temperatura y el baño frío se eliminó luego y la agitación se continúa durante 4 horas. Se concentró luego a presión reducida para producir 200 mg del compuesto 6A en la forma de aceite amarillo crudo. Se usó como tal en la siguiente etapa.
El compuesto 6A (200 mg, 0.22 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte a 0°C en 2 ml de DCM. TFA (1 ml) se agregó gota a gota y el baño frío eliminado. La mezcla de reacción se agitó 1 hora a temperatura ambiente luego concentrada a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jim, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm), para producir 60 mg (26%, producción en 2 etapas) de 6 compuestos en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Zorbax Eclipse Plus C8, 3.5 jm, 4.6 x 150 mm; 1 ml/min, 40°C, metanol del 30 a 80% en agua (H3PO4 del 0.1%) en 18 minutos); ESI (C43H74N6O8, 802.56 de masa exacta) m/z: 804 (MH ); 11.50 minutos (91.5%, 210 nm).
1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.52 (d, 0.3H, NHCO intercambio incompleto); 8.25 (d, 0.5H, NHCO intercambio incompleto); 7.30-7.22 (m, 5to); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 61H).
Compuesto 7
(S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(de 3 aminopropilos) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)- ácido 3-fenilpropanoico, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000093_0003
El compuesto 6 (70 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una mezcla del agua (5 ml), ACN (2.5 ml) y piperidina (5 ml). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego concentrada a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 |jm, 19 x l50 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Agua de la luz ultravioleta 2489 Detector de luz ultravioleta a 254 nm y 220 nm), para producir 14.6 mg (21%) de 7 compuestos en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Ascenti Express C18, 2.7 jm, 4.6 x 100 mm; 1.5 ml/min, 40°C, 0 a 80% de metanol en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C42H72N6O8, 788.54 de masa exacta) m/z: 790 (MH ), 5.71 minutos (96.83%, 210 nm).
1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.42 (d, 0.3H, NHCO intercambio incompleto); 8.15 (d, 0.2H, NHCO intercambio incompleto); 7.31-7.21 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.25-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 59H).
Compuesto 8
(S)-2-(S)-2-(((2-aminopiridin-4-il) metilo) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(s )-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il) etilo) amino) propilo) pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético
Figure imgf000094_0001
Compuesto 8A: terc-butilo (4-((3S, 6S, 9S, 10R)-9-(S)- sec-butilo)-3,6-diisopropil-10-(2-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il) etilo) amino) propilo) pirrolidin-1-il)- 2-oxoetil)-2,8-dimetil-4,7-dioxo-11-oxa-2,5,8-triazadodecil) piridin-2-il) carbamato
Figure imgf000094_0002
El compuesto 8A se sintetizó de la misma manera que el compuesto 2J de la amina 1Y (39 mg, 0.06 mmol, 1.00 equiv), el ácido 2I (20 mg, 0.06 mmol, 1.00 equiv), HATU (27 mg, 0.07 mmol, 1.20 equiv) y DIEA (23.2 mg, 0.18 mmol, 3.01 equiv) en DCM (3 ml). El producto sin refinar no se purificó.
Compuesto 8: El compuesto 8 se sintetizó de manera similar al compuesto 2 del producto intermedio 8A (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar (100 mg) se purificó por HPLc preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm , 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / a Cn amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente del 18% a 31% de a Cn en 7 minutos luego el 31% a 100% de ACN en 2 minutos; Detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). Del compuesto 8 se obtuvo una producción del 8% (8 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Atlantis columna de T3, 3 jm, 4.6 x 100 mm; 35°C; 1.8 ml / minuto, el 25% a 80% de ACN en agua (TFA del 0.05%) en 7 minutos); ESI (C47H72N8O6S, 876.5 de masa exacta) m/z: 877.5 (MH+) y 439.5 (M 2H+/2, el 100%), 4.87 minutos (95.1%, 254 nm).1
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.83 - 7.78 (m, 2H); 7.56 - 7.52 (m, 1H); 7.34 - 7.17 (m, 5H); 6.64 - 6.62 (m, 2H); 5.77 - 5.61 (m, 1H); 4.86 - 4.68 (m, 2H); 4.25 - 4.05 (m, 1H); 3.87 - 2.83 (m, 17H); 2.56 -0.84 (m, 37H).
Compuesto 9
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(((2-aminopiridin-4-il) metilo) (metilo) amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético
Figure imgf000095_0001
Compuesto 9A: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(((2-(tercbutoxicarbonilo)amino)piridin-4-il)metilo)(metilo)amino)—3-metil butanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato
Figure imgf000095_0002
El compuesto 9A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (170 mg, 0.27 mmol, 1.00 equiv), el ácido 2I (99.7 mg, 0.30 mmol, 1.10 equiv), DEPC (0.049 ml, 1.05 equiv) y DlEA (0.133 ml, 3.00 equiv) en DCM (5 ml). El producto sin refinar se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:1) para producir 200 mg (78%) del compuesto 9A en la forma de un sólido color amarillo pálido.
Compuesto 9: El compuesto 9 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 9A (200 mg, 0.21 mmol, 1.00 equiv) en DCM (4 ml) y TFA(2 ml). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 9 se obtuvo con una producción del 10% (20 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (t Fa del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C46H73N7O8, 851.6 de masa exacta) m/z: 852.5 (MH+) y 426.9 (M 2H+/2, el 100%), 6.92 minutos (92.7%, 254 nm).
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.51 - 8.45 (m, 0.5H, NH intercambio incompleto); 8.30 - 8.24 (m, 0.3H, NH intercambio incompleto); 8.17 - 8.07 (m, 0.8H, NH intercambio incompleto); 7.79 - 7.77 (m, 1H); 7.36 - 7.18 (m, 5H); 7.21 - 7.16 (m, 1H); 6.94 - 6.89 (m, 1H); 4.85 - 4.65 (m, 3H); 4.20 - 3.10 (m, 20H); 3.00 - 2.85 (m, 2H); 2.55 - 0.80 (m, 36H).
Compuesto 10
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(((2-am inopirid in-4-il) metilo) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin—2—il)—3—metoxi—2— metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético
Figure imgf000096_0001
Compuesto 10: El compuesto 9 (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una mezcla del agua (5 ml), ACN (5 ml) y piperidina (2.5 ml). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente y luego se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 32.2 mg (33%) de compuesto 10 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (t Fa del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C45H71N7O6, 837.5 de masa exacta) m/z: 838.5 (MH+) y 419.9 (M 2H+/2, el 100%), 6.81 minutos (97.7%, 220 nm).
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.41 - 8.32 (m, 0.3H, NH intercambio incompleto); 8.20 - 8.07 (m, 0.8H, NH intercambio incompleto); 7.82 - 7.75 (m, 1H); 7.36 - 7.158 (m, 5H); 7.12 - 7.03 (m, 1H); 6.94 - 6.88 (m, 1H); 4.85 -4.66 (m, 3H); 4.20 -3.10 (m, 16H); 3.00 -2.85 (m, 2H); 2.57 -0.80 (m, 37H).
Compuesto 11
(S)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il) etilo) amino) propilo) pirrolidin—1—il)—5—metil—1—oxoheptan—4—il)—N, 3-dimetil-2-(S)-3-metil-2-(metilo (4-fenetilo (metilamino)) amino) butanamido) butanamida, ácido trifluoroacético
Figure imgf000096_0002
Compuesto 11A: terc-butilo N - [4-(2-hidroxietil)fenil]carbamato
Figure imgf000096_0003
Di-terc-butilo dicarbonato (16.7 g, 77 mmol, 1.05 eq.) se agregó a una solución de 2-etanol (4-aminofenil) (10 g, 72.9 mmol, 1 eq.) en THF (200 ml), y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con EtOAc (200 ml), se lavó con agua (200 ml), luego HCl 1M (100 ml), luego solución NaHCO3 acuosa saturada (100 ml) luego salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4 luego evaporada hasta secarse a presión reducida. El producto sin refinar se trituró dos veces con heptano (150 ml) y secó en vacío para proporcionar el compuesto 11A como un sólido color blanco (14.7 g, el 84%).
Compuesto 11B: terc-butilo N - [4- fenilo (2-oxoetil)] carbamato
Figure imgf000097_0001
El compuesto 11A (2.5 g, 10.5 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 25 ml de DCM luego enfriado a -78°C. Una solución de Dess-Martin Periodinane (DMP, 6.71 g, 15.8 mmol, 1.5 equiv) en DCM (10 ml) se agregó gota a gota. El baño frío se eliminó y agitación continuó durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 60 ml de una mezcla 50/50 de solución acuosa saturada-bicarbonato sódico y solución acuosa Na2S2O3-saturada. La solución resultante se extrajo 3 veces con 30 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con solución acuosa NaCl-saturada, secadas sobre sulfato de sodio anhidro, filtradas y concentradas a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE 1/15) para producir 1.0 g (40%) del compuesto 11B en la forma de un sólido color amarillo pálido.
Compuesto 11C: bencilo (2S)-2-[[2-(4-[[(terc-butoxilo) carbonilo] amino] fenilo) etilo] (metilo) amino] - 3-metilbutanoato.
Figure imgf000097_0002
El compuesto 1ZC (3.5 g, 13.6 mmol, 1.1 equiv) se disolvió en THF (30 ml) en la presencia de DIEA (6.4 g, 49.7 mmol, 4.0 equiv), aldehido 11B (2.9 g, 12.3 mmol, 1.0 equiv) y sodio triacetoxiborohidruro (5.23 g, 49.7 mmol, 2.0 equiv). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego neutralizada con 60 ml de la solución saturada del bicarbonato sódico. La solución resultante se extrajo 3 veces con 30 ml EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con solución acuosa NaCl-saturada, secadas sobre sulfato de sodio anhidro, filtradas y concentradas a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE 1:20) para producir 3.7 g (68%) del compuesto 11C en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 11D: ácido (2S)-2- [[2-(4- [[(terc-butoxilo) carbonilo] amino] fenilo) etilo] (metilo) amino]-3-metilbutanoico
Figure imgf000097_0003
El compuesto 11C (2 g, 4.5 mmol, 1 equiv) se disolvió en 10 ml de metanol en la presencia de Pd/C (2 g) e hidrogenó durante 2 horas a temperatura y presión normales. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 1.2 g (75%) del compuesto 11D en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 11E: ácido (2S)-2-[[2-(4-[[(terc-butoxilo)carbonilo] (metilo) amino] fenilo) etilo] (metilo) amino]-3-metilbutanoico
Figure imgf000097_0004
El compuesto 11D (1.2 g, 3.4 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (20 ml). El medio de reacción se enfrió con un baño helado después del cual NaH (60% en aceite, 549 mg, 13.7 mmol, 4.0 equiv) se agregó en porciones, seguido de yodometano (4.9 g, 34 mmol, 10 equiv). La reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiental, luego neutralizada con agua y se lavó con 100 ml de EtOAc. El pH de solución acuosa se ajustó a 6-7 con 1N HCl. Esta solución acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 800 mg (64%) del compuesto 11E en la forma de un sólido color amarillo.
Compuesto 11F: terc-butilo N - [4-(2-[[(1S)—1— [[(1S)—1— [[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etilo]carbamoil]etilo] pirrolidin—1 —il]—5—metil—1—oxoheptan— 4il](metilo)carbamoil]-2-metilpropil]carbamoil]-2-metilpropil] (metilo)amino]etilo)fenilo]-N-metilcarbamato
Figure imgf000098_0001
El compuesto 11F se preparó en la manera similar del compuesto 6A de la amina 1Y (150 mg, 0.22 mmol, 1.2 equiv) y el ácido 11E (70 mg, 0.19 mmol, 1.0 equiv). Después de la purificación en gel de sílice (EtOAc/PE 1:1) 100 mg (52%) del producto deseado se obtuvieron en la forma de un sólido color amarillo pálido.
El compuesto 11 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 1 del producto intermedio 11F (100 mg, 0.1 mmol). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 |jm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 11 se obtuvo con una producción del 39% (39.7 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Eclipse Plus C8, 3.5 jm, 4.6 x 150 mm; 1 ml/min, 40°C, metanol del 50 a 95% en agua (TFA del 0.05%) en 18 minutos); ESI (C50H77N7O6S, 903.57 de masa exacta) m/z: 904.5 (MH ), 7.53 minutos (93.68%, 254 nm).
1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.84 (d, 0.5H, NHCO intercambio incompleto); 8.7­ 8.5 (m, 0.9H, NHCO intercambio incompleto); 7.76-7.73 (m, 1H); 7.55 - 7.4 (m, 1H); 7.28-7.22 (m, 7H); 7.08­ 7.05 (m, 2H); 5.51-5.72 (m, 1H); 4.9-4.80 (m, 2H); 4.3-0.7 (m, 60H).
Compuesto 12
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético
Figure imgf000098_0002
De la misma manera en cuanto a las fases finales en la síntesis de compuesto 1, se prepara el compuesto 12 en dos etapas a partir de amina 3D (118 mg, 0.19 mmol) y el ácido 11E (82 mg, 0.22 mmol). El residuo final se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm , 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 12 se obtuvo con una producción del 7% (13.7 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Eclipse Plus C8, 3.5 jm, 4.6 x 150 mm; 1 ml/min, 40°C, metanol del 40 a 95% en agua (TFA del 0.05%) en 18 minutos); ESI (C49H78N6O8, 878.59 de masa exacta) m/z: 879.7 (MH+), 10.07 minutos (90.6%, 254 nm).1
1H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.40 (se, 2H); 7.38-7.22 (m, 7mo); 4.95-4.7 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 62H).
Compuesto 13
Acido (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-N,3-dimetil-2-(S)-3-metil-2-(metilo(4-fenetilo(metilamino))amino) butanamido) butanamido)-3-metoxi-5-metil heptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético
Figure imgf000099_0001
El compuesto 13 se preparó de la misma manera para el compuesto 7 del compuesto 12 (100 mg, 0.10 mmol). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 Ob D, 5 |jm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 13 se obtuvo con una producción del 20% (20 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Ascenti Express C18, 2.7 jm, 4.6 x 100 mm; 1.5 ml/min, 40°C, metanol del 10 a 95% en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C48H76N6O8, 864.57 de masa exacta) m/z: 865.6 (MH ), 6.05 minutos (90.9%, 210 nm).
H RMN: (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.32-7.19 (m, 9H); 4.9-4.65 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 59H).
Compuesto 14
(S)-2-(S)-2-(3-aminobenzil)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético
Figure imgf000099_0002
Compuesto 14A: terc-butilo (3-(hidroximetilo)fenilo)carbamato
Figure imgf000099_0003
Se disuelve (3-aminofenil) metanol (3 g, 24.36 mmol, 1.00 equiv) en THF (60 ml) después de que di-terc-butil dicarbonato (6.38 g, 29.23 mmol, 1.20 equiv) se añade posteriormente. La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente y la reacción se diluyó luego agregando 200 ml del agua. El producto se extrajo 3 veces con 100 ml de AcOEt y las fases orgánicas se recombinaron luego, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir el producto sin refinar (13.85 g del compuesto 14A) en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 14B: te rc -b u tilo (3-formilfenil)carbamato
Boc
Figure imgf000100_0001
El compuesto 14A (13.8 g, 61.81 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en DCE (400 ml) y MnO2 (54 g, 621.14 mmol, 10.05 equiv) se agregó posteriormente. La mezcla se dejó bajo agitación a temperatura ambiente durante 3 días después de los cuales los sólidos se eliminaron al filtrar. El filtrado se evaporó hasta secarse y el residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:30) para producir 3 g (22%) del compuesto 14B en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 14C: bencilo (S)-2-((3-(terc-butoxicarbonilo)amino)bencilo)(metilo)amino)-3-metilbutanoato
Figure imgf000100_0002
El compuesto 14B (1 g, 4.52 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 20 ml de THF en la presencia del compuesto 1ZC (1.16 g, 4.50 mmol, 1.00 equiv), DIEA (3 ml) y NaBH (OAc)3 (1.92 g, 9.06 mmol, 2.01 equiv). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente y luego neutralizó con 100 ml del agua y extrajo 3 veces con 50 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:50) para producir 1.9 g (99%) del compuesto 14C en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 14D: ácido (S)-2-((3-(terc-butoxicarbonilo) amino) bencilo) (metilo) amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000100_0003
El compuesto 14C (1 g, 2.34 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 30 ml de AcOEt y 4 ml de metanol en la presencia del Pd/C (400 mg) e hidrogenó durante 1 hora a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 680 mg (86%) del compuesto 14D en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 14E: terc-butilo (3-((3S, 6S, 9S, 10R)-9-(S)- sec-butilo)-3,6-diisopropil-10-(2-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-2,8-dimetil-4,7-dioxo-11-oxa-2,5,8-triazadodecil)fenilo) carbamato
Figure imgf000100_0004
El compuesto 14E se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (100 mg, 0.15 mmol, 1.00 equiv), el ácido 14D (102.27 mg, 0.30 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.053 ml) y DIEA (0.046 ml) en DCM (3 ml). El producto sin refinar (80 mg) se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:1) para producir 100 mg (67%) del compuesto 14E en la forma de un sólido color amarillo pálido.
El compuesto 14 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 14E (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar (80 mg) se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; detector de luz ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 14 se obtuvo con una producción del 10% (10 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Eclipse Plus columna C8, 3.5 pm, 4.6 x 150 mm; 40°C; 1.0 ml / minuto, 40% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 18 minutos); ESI (C48H73N7O6S, 875.5 de masa exacta) m/z: 876.5 (MH+) y 438.9 (M 2H+/2, el 100%), 11.35 minutos (95.6%, 210 nm).
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.92 - 8.86 (m, 0.4H, NH intercambio incompleto); 8.70 - 8.54 (m, 0.6H, NH intercambio incompleto); 7.88 - 7.78 (m, 1H); 7.60 - 7.50 (m, 1H); 7.45 - 6.97 (m, 9H); 5.80 - 5.65 (m, 1H); 4.85 - 4.70 (m, 1H); 4.40 - 0.80 (m, 56H).
Compuesto 15
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(3-aminobenzil) (metilo) amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético
Figure imgf000101_0001
Compuesto 15A: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-((3-(tercbutoxicarbonilo)amino)bencilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato
Figure imgf000101_0002
El compuesto 15A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (200 mg, 0.32 mmol, 1.00 equiv), el ácido 14D (212.6 mg, 0.63 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.1103 ml) y DIEA (0.157 ml, 3.00 equiv) en DCM (5 ml). El producto sin refinar se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:1) para producir 200 mg (67%) del compuesto 15A en la forma de un sólido color amarillo.
El compuesto 15 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 15A (200 mg, 0.21 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / a Cn amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos;
Detector de luz ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 15 obtuvo una producción del 19% (38.6 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (t Fa del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C47H74N6O8, 850.5 de masa exacta) m/z: 851.5 (MH+) y 426.4 (M 2H+/2, el 100%), 6.61 minutos (91.1%, 210 nm).1
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.53 - 7.42 (m, 1H); 7.35 - 7.18 (m, 8H); 4.88 4.79 (m, 2H); 4.42 - 4.00 (m, 3H); 3.93 - 2.71 (m, 22H); 2.61 - 0.81 (m, 33H).
Compuestos 16 a 20
Figure imgf000102_0001
Los compuestos 16 a 20 se prepararon de la misma manera en cuanto al compuesto 1, de las aminas 1Y y 1ZC y aldehídos correspondientes.
Terc-butilo (4-oxobutil)carbamato, implicado en la preparación del compuesto 16, se preparó en cuanto al compuesto 1ZE en 2 etapas de 4,4-dietoxibutan-1-amina.
El terc-butil-N-metil-N-(2-oxoetil) carbamato implicado en la preparación del compuesto 17 era comercial. El 2-(2-(terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)acetaldehído, implicado en la preparación del compuesto 18, se preparó en 2 etapas como se expone a continuación:
2 -(2-Hidroxietoxi)etan-1-ol (7 g, 66 mmol, 9.9 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en piridina (10 ml) en la presencia de 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 80 mg, 0.65 mmol, 0.1 equiv). La solución se enfrió a 0°C luego TBDMSCl (1 g, 6.6 mmol, 1.0 equiv) se agregó en porciones. La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, diluida con 100 ml de EtOAc y sucesivamente se lavó dos veces con 100 ml de 1N HCl y dos veces con solución acuosa NaCl-saturada. La fase orgánica se secó sobre el sulfato de sodio anhidro, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 1.3 g (88%) de 2 - [2-[(tercbutildimetilsilil)oxi]etoxilo]etan-1-o l en la forma de aceite incoloro.
Cloruro del oxalilo (760 mg, 6 mmol, 1.3 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DCM (40 ml) y se enfrió a -78°C. El dimetilsulfóxido (DMSO, 1.07 g, 13.7 mmol, 3 equiv) diluido en DCM (5 ml) se agregó gota a gota. Después de un período de tiempo de agitación de 30 minutos a baja temperatura, 2 -[2- [(tert-butildimetil sililo) oxi] etoxilo] etan-1-ol (1 g, 4.5 mmol, 1.0 equiv) disuelto en 5 ml de DCM se agregó. La agitación se continuó durante 1 hora a baja temperatura antes de adicionar el TEA (2.78 g, 27 mmol, 6 equiv). La mezcla de reacción se agitó 15 minutos a -78°C y durante la noche a temperatura ambiente antes de neutralizarse con 100 ml del agua. Se extrajo luego 3 veces con 100 ml de DCM. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio anhidro, filtrado y concentrado a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE 1 :20) y produjo 0.8 g (80%) de 2-[2-[(tert-butildimetilsilil)oxi]etoxilo]acetaldehído en la forma de aceite incoloro. El Terc-butil 4-formilfenil carbonato implicado en la preparación del compuesto 19 se preparó en una etapa individual así: 4-hidroxibenzaldehído (2.5 g, 20.5 mmol, 1.0 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en t Hf (20 ml) en la presencia de 18 corona 6 (0.25 g) y carbonato del potasio (5 g). La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y di-terc-butilo dicarbonato (5.8 g, 26.58 mmol, 1.30 equiv) se agregó posteriormente. La agitación se continuó durante 1 hora a baja temperatura después de la cual la reacción se neutralizó con 30 ml del agua. La solución resultante se extrajo tres veces con 200 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio anhidro filtrado y concentrado a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE 1:10) y produjo 4.2 g (92%) de terc-butilo 4-formilfenil carbonato en la forma de un sólido color amarillo pálido.
El 4-nitrobenzaldehído implicado en la preparación del compuesto 20 era comercial.
La síntesis de compuesto 18 fue completada por la desprotección del alcohol sililado. Esto se llevó a cabo así: (S)-N-(S)-1-(((3R, 4S, 5S)-1-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-11-isopropil-2,2,3,3,10-pentametil-4,7-dioxa-10-aza-3-siladodecan-12-amida (40 mg, 0.04 mmol, 1.0 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (10 ml) en la presencia de TBAF (2 mg, 0.09 mmol, 2 equiv) y se agitó 4 horas a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 50 ml del agua luego extrajo tres veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio anhidro, filtrado y concentrado a presión reducida para producir el compuesto18 en el estado crudo.
La síntesis del compuesto 20 se completó al reducir el grupo nitro. Esto se llevó a cabo así: (2S)-N- [(3R, 4S, 5S)-1- [(2S)-2- [(1R, 2R)-2- [[(1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il] carbamoil] -1-metoxi-2-metiletil] pirrolidin-1-il] -3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N,3-dimetil-2-[(2S)-3-metil-2- [metilo [metilo(4-nitrofenil)]amino] butanamido]butanamida (40 mg, 0.05 mmol, 1.0 equiv) se disolvió en 15 ml de etanol. Cloruro de estaño dihidratado (II) (317 mg, 1.4 mmol, 30 equiv) se agregó y la solución mantenida bajo agitación durante 3 días a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 50 ml del agua, luego se extrajo tres veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio anhidro, filtrado y concentrado a presión reducida para producir el compuesto 20 en el estado crudo.
Figure imgf000103_0001
Caracterización de los productos finales: Compuesto 16 LC/MS/UV (Eclipse Plus C8, 3.5 pm, 4.6 x 150 mm; 1 ml/min, 40°C, metanol del 5 a 95% en agua (TFAdel 0.05%) en 18 minutos); ESI: (C45H75N7O6S, 841.55 de masa exacta) m/z 842.5 (MH+), 421.9 (100%, (M 2H+)/2); luz ultravioleta: 14.02 minutos (94.9%, 210 nm). 1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 5 (Presencia de rotámeros) 8.55-8.2 (m, 0.8H, NHCO intercambio incompleto); 8.0 (0.55H, NHCO intercambio incompleto); 7.70 (d, 1H); 7.44 (d, 1H); 7.21-7.15 (m, 5H); 5.65-5.45 (m, 1H); 4.8-4.5 (m, 2H); 4.15-3.9 (m, 2H); 3.8-0.6 (m, 59H). Compuesto 17 LC/MS/UV ESI: (C44H73N7O6S, 827.53 de masa exacta) m/z 828 (MH+), 415 [el 100%, (M 2H+)/2]; luz ultravioleta: temperatura ambiente = 6.72 minutos (99.6%, 254 nm) 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 5 (Presencia de rotámeros) 7.82-7.80 (m, 1H); 7.56-7.54 (m, 1H); 7.35-7.20 (m, 5to); 5.8-5.55 (m, 1H); 4.85-4.6 (m, 1H); 4.25-4.05 (m, 1H); 3.95-0.8 (m, 60H). Compuesto 18 LC/MS/UV (Atlantis T3, 3 pm, 4.6 x 100 mm; 1.2 ml/min, 40°C, metanol del 5 a 95% en agua (t Fa del 0.05%) en 7 minutos) yo; ESI: (C45H74N6O8S, 858.53 de masa exacta) m/z 859 (MH ), 881 (MNa ), 430 (100%, (M 2H+)/2); luz ultravioleta: 4.85 minutos (96.8%, 220 nm). 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 5 (Presencia de rotámeros) 8.75-8.55 (m, 0.5H, NHCO intercambio incompleto); 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.40-7.15 (m, 5H); 5.8­ 5.6 (m, 1H); 4.8-4.55 (m, 2H); 4.15-4.0 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 60H). Compuesto 19 LC/MS/UV ESI: (C48H72N6O7S, 876.52 de masa exacta) m/z 877 (MH+), 439 [el 100%, (M 2H+)/2]; luz ultravioleta: temperatura ambiente = 1.76 minutos (93.2%, 220 nm). Compuesto 20 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 5 (Presencia de rotámeros) 7.85­ 7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.15 (m, 5to); 7.1-7.05 (m, 2H); 6.73-6.70 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 5.0-4.7 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H). LC/MS/UV ESI: (C48H73N7O7S, 875.53 de masa exacta) m/z 876 (MH+), 439 [el 75%, (M 2H+)/2]; luz ultravioleta: temperatura ambiente = 4.83 minutos (96.8%, 254 nm). 1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 6 (Presencia de rotámeros) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.1 (m, 7H); 6.76­ 6.72 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 4.9-4.65 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H).
Compuestos 21 a 24
Figure imgf000104_0001
Los compuestos 21 a 24 se prepararon de la misma manera en cuanto a los compuestos 17 a 20, sustituyendo la amina 1Y por la amina 2D.
Figure imgf000104_0002
Caracterización de los productos finales: Compuesto 21 LC/MS/UV (ESI) (C42H74N6O7, 774.56 de masa exacta) m/z 775 (MH+), 797 (MNa+), 388 (100%, (M 2H )/2); luz ultravioleta: 3.14 minutos (97.6%, 215 nm). 1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 6 (Presencia de rotámeros) 8.05-7.7 (m, 0.8H, NHCO intercambio incompleto); 7.45-7.15 (m, 5H); 4.9-4.45 (m, 2H); 4.35-4.00 (m, 2H); 3.95-0.8 (m, 61H). Compuesto 22 LC/MS/UV (ESI) (C43H75N5O9, 805.56 de masa exacta) m/z 806 (MH+), 828 (MNa+), 404 (100%, (M 2H )/2); luz ultravioleta: 4.47 minutos (95.6%, 215 nm). 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 6 (Presencia de rotámeros) 8.1-7.7 (m, 0.4H, NHCO intercambio incompleto); 7.45-7.15 (m, 5H); 4.9-4.5 (m, 3H); 4.4-4.05 (m, 2H); 4.05-0.8 (m, 61H). Compuesto 23 LC/MS/UV (ESI) (C46H73N5O8, 823.55 de masa exacta) m/z 824 (MH+), 846 (MNa+), 413 (100%, (M 2H+)/2); luz ultravioleta: 4.76 minutos (98.5%, 215 nm). 1H RMN (400MHz, CDCh, ppm): 6 (Presencia de rotámeros) 7.5-7.2 (m, 5H); 7.9-7.75 (m, 2H); 5.5-5.3 (m, 1H); 4.9-4.6 (m, 2H); 4.55-4.15 (m, 4to); 4.0-0.8 (m, 55H). Compuesto 24 LC/MS/UV (ESI) (C46H74N6O7, 822.56 de masa exacta) m/z 823 (MH ), 845 (MNa ), 861 (MK ); luz ultravioleta: 3.68 minutos (99.15%, 254 nm). 1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 6 (Presencia de rotámeros) 8.0-7.7 (m, 0.5H, NHCO intercambio incompleto); 7.5-7.0 (m, 7H); 6.75-6.65 (m, 2H); 4.85-4.5 (m, 2H); 4.4-4.05 (m, 2H); 4.0-0.8 (m, 56H).
Compuesto 26
(S)-2-(S)-2-(2-aminoetilo) (metilo)amino)- 3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000105_0001
Compuesto 26A: bencilo (S)-2-((2-(terc-butoxicarbonilo)amino)etilo)(metilo)amino)-3-metilbutanoato
Figure imgf000105_0002
El compuesto 26A se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 2H de la amina 1ZC (1.3 g, 5.04 mmol, 1.00 equiv), terc-butilo (2-oxoetil) carbamato (800 mg, 5.03 mmol, 1.00 equiv), DIEA (3.52 g, 27.24 mmol, 5.42 equiv) y NaBH (OAc)3 (2.25 g, 10.62 mmol, 2.11 equiv) en THF (25 ml). La mezcla se dejó bajo agitación durante la noche y neutralizó con 50 ml del agua. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (10:1) para producir 0.6 g (33%) del compuesto 26A en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 26B: ácido (S)-2-((2-(terc-butoxicarbonilo)amino)etilo)(metilo)amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000105_0003
El compuesto 26A (600 mg, 1.65 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 40 ml de THF en la presencia del Pd/C (300 mg) y se hidrogenó durante 1 hora a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y MeOH para producir 0.4 g (89%) del compuesto 26b en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 26C: terc-butilo ((3R, 4S, 7S, los AÑOS 10)-4-(S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il) carbamato
Figure imgf000106_0001
, ,
El compuesto 26C se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (70 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv), el ácido 26B (58.4 mg, 0.21 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.032 ml) y DIEA (0.053 ml) en DCM (3 ml). Después de la evaporación hasta secarse, el compuesto 26C se obtuvo en la forma de aceite amarillo (100 mg). Compuestos 26: El compuesto 26 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 26C (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv) en DCM (3 ml) y TFA (1.5 ml). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMa Dz U, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 45% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 26 se obtuvo con una producción del 38% (38.1 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.0 ml/min, 5% a 95% de MeOH en agua (TFAdel 0.05%) durante 18 minutos); ESI (C43H71N7O6S, 813.52 de masa exacta) m/z: 814.5 (MH+) y 407.9 (M.2H+/2, el 100%), 15.78 minutos (91.2%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.90 - 8.82 (m, 0.5 H, NH intercambio incompleto); 8.71 - 8.65 (m, 0.3H, NH intercambio incompleto); (7.85 - 7.77 (m, 1H); 7.60 - 7.49 (m, 1H); 7.37 - 7.15 (m, 5H); 5.78 -5.55 (m, 1H); 4.82 -4.62 (m, 1.6H); 4.32 -3.83 (m, 3.6H); 3.75 - 3.35 (m, 7.4H); 3.30 -2.60 (m, 13H); 2.58 -0.80 (m, 42H).
Compuesto 27
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(4-hidroxifenetil) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin—2—il)—3—metoxi—2— metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético
Figure imgf000106_0002
Compuesto 27: El compuesto 27 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (70 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv), el ácido 49C (55.5 mg, 0.22 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.034 ml, 2.00 equiv) y DIEA (0.055 ml, 3.00 equiv) en DCM (3 ml). El producto sin refinar se purificó por HPlC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 45% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 27 se obtuvo con una producción del 3% (2.9 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Eclipse Plus columna C8, 3.5 pm, 4.6 x 150 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C48H75N5O9, 866.56 de masa exacta) m/z: 866.5 (MH ) y 433.9 (M 2H /2, el 100%), 6.61 minutos (89.1%, 210 nm).1
1H RMN (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.70 - 8.49 (m, 0.9 H, NH/OH intercambio incompleto); 8.30 - 8.22 (m, 0.3H, NH intercambio incompleto); 7.36 - 7.02 (m, 7H); 6.86 - 6.62 (m, 2H); 4.82 -4.69 (m, 2H); 4.20 -4.03 (m, 1H); 3.91 -3.33 (m, 12H); 3.30 -2.90 (m, 17H); 2.55 - 0.80 (m, 35H).
Compuesto 28
(S)-2-(S)-2-(3-aminobenzil) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-1-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l)-A/,3-d¡metilbutanam¡da, ácido trifluoroacético
Figure imgf000107_0001
Compuesto 28A: terc-butilo (3-((3S, 6S, 9S, 10R)-9-(S)- sec-butilo)-10-(2-(S)-2-((1R, 2R)-3-(((1S, 2R)-1-h¡drox¡-1-fen¡lpropan-2-¡l) am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l) pirrolidin-1-il)- 2-oxoet¡l)-3,6-d¡¡soprop¡l-2,8-d¡met¡l-4,7-d¡oxo-11-oxa-2,5,8-tr¡azadodec¡l) fen¡lo) carbamato
Figure imgf000107_0002
El compuesto 28A se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la am¡na 2D (100 mg, 0.17 mmol, 1.00 equ¡v), el ác¡do 14D (111.25 mg, 0.33 mmol, 2.00 equ¡v), d EpC (0.058 ml) y DIEA (0.05 ml) en DCM (3 ml). El res¡duo se pur¡f¡có en una columna de síl¡ce con una mezcla de EtOAc y hexano (1:1) para produc¡r 100 mg (66%) del compuesto 28A en la forma de un sól¡do color blanco.
Compuesto 28: El compuesto 28 se s¡ntet¡zó de la m¡sma manera en cuanto al compuesto 2 del producto ¡ntermed¡o 28A (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equ¡v). El producto s¡n ref¡nar (80 mg) se pur¡f¡có por HPLC preparat¡va (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunf¡re Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de eluc¡ón: agua / Ac N amort¡guado con TFA del 0.05%; Grad¡ente de 20% a 40% ACN en 10 m¡nutos a cont¡nuac¡ón 40% a 100% ACN en 2 m¡nutos; Detector ultrav¡oleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 28 se obtuvo con una producc¡ón del 20% (20 mg) en la forma de un sól¡do color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascent¡s Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/m¡n, 10% a 95% de MeOH en agua (TFAdel 0.05%) en 8 m¡nutos); ESI (C46H74N6O7, 822.56 de masa exacta) m/z: 823.5 (MH+) y 412.4 (M 2H+/2, el 100%), 12.45 m¡nutos (87.2%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presenc¡a de rotámeros) 7.47 - 7.20 (m, 5H); 7.10 - 7.01 (m, 1H); 6.80 -6.56 (m, 3H); 4.82 - 4.52 (m, 3H); 4.33 - 4.03 (m, 2H); 3.91 - 3.82 (m, 0.5H); 3.75 - 3.35 (m, 9.5H); 3.28 - 3.10 (m, 2H); 2.79 - 2.90 (m, 1H); 2.60 - 2.40 (m, 2H); 2.30 - 0.80 (m, 40H).
Compuesto 29
Ác¡do (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(3-am¡nobenz¡l)(met¡lo)am¡no)- 3-met¡lbutanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropano¡co, ác¡do tr¡fluoroacét¡co
Figure imgf000108_0001
El compuesto 15 (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una mezcla del agua (5 ml), ACN (5 ml) y piperidina (2.5 ml). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente y luego se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 20 mg (20%) del compuesto 29 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Eclipse Plus columna C8, 3.5 pm, 4.6 x 150 mm; 40°C; 1.0 ml/min, 40% 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 18 minutos); ESI (C46H72N6O8, 836.54 de masa exacta) m/z: 837.5 (MH+) y 419.4 (M 2H+/2, el 100%), 10.61 minutos (92.5%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.38 - 7.15 (m, 6H); 7.00 - 6.99 (m, 3H); 4.85 -4.68 (m, 2H); 4.37 -3.38 (m, 11H); 3.31 -2.70 (m, 8H); 2.60 -0.82 (m, 35H).
Compuesto 30
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(4-aminobutil) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000108_0002
El compuesto 30 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 16, de amina 3D y el ácido carboxílico correspondiente.
LC/MS/UV (Ascenti Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 1.5 ml/min, 40°C, metanol del 10 a 95% en agua (TFA del 0.05%) en 15 minutos); ESI (C44H76N6O8, 816.57 de masa exacta) m/z: 817.6 (MH ), 409.4 (M 2H+/2); 12.0 minutos (90%, 210 nm).1
1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.7-8.2 (m, 1H, NHCO, intercambio incompleto); 7.4-7.1 (m, 5H); 4.95-4.7 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.8 (m, 63H).
Compuesto 31
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(4-aminobutil)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000109_0001
El compuesto 31 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 4, a partir del éster de metilo 30. LC/MS/UV (Ascenti Express C18, 2.7 |jm, 4.6 x 100 mm; 1.5 ml/min, 40°C, metanol del 10 a 95% en agua (TFA del 0.05%) en 18 minutos); ESI (C43H74N6O8, 802.56 de masa exacta) m/z: 803.6 (MH ), 402.4 (M 2H /2); 13.68 minutos (98.9%, 210 nm).
1H RMN (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.4-7.1 (m, 5H); 4.95-4.7 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.8 (m, 61H).
Compuesto 32
(S)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino)propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-(S)-3-metil-2-(metilo (3-propilo(metilamino))amino)butanamido)butanamida, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000109_0002
Compuesto 32A: terc-butilo (3,3-dietoxipropil) (metilo) carbamato
Figure imgf000109_0003
El compuesto 1ZD (247 mg, 1 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 30 ml de un 1:1 mezcla de THF y DMF El medio de reacción se enfrió sobre un baño helado después del cual NaH (60% en aceite, 60 mg, 1.5 equiv) se agregó en porciones, seguidas de Mel (0.28 ml) gota a gota. La reacción se dejó bajo agitación durante 2 días a temperatura ambiente, luego neutralizada con 5 ml de solución acuosa NH4Cl-saturada y se extrajo dos veces con 15 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 200 mg (77%) del compuesto 32A en la forma de un sólido color amarillo.
Compuesto 32B: Ácido (S)-2-((3-(terc-butoxicarbonilo)(metilo)amino)propilo)(metilo)amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000110_0001
El compuesto 32B se preparó siguiendo el mismo protocolo descrito para la preparación de compuesto 1ZF, sustituyendo el compuesto 1ZD por el compuesto 32A.
El compuesto 32: El compuesto 32 se preparó en dos etapas, siguiendo el mismo protocolo descrito para la preparación del compuesto 1, de la amina 1Y y el ácido carboxílico 32B.
LC/MS/UV (Zorbax SB-Aq, 1.8 |jm, 4.6 x 100 mm, 40°C, metanol del 10 a 95% en agua (TFAdel 0.05%) en 13 minutos); ESI (C45H75N7O6S, 842.19 de masa exacta) m/z: 843 (MH ), 421.9 (M 2H /2); 11.91 minutos (88%, 210 nm).
1H RMN: (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.5 - 9.0 (m, 0.5H, NHCO de intercambio incompleto), 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.60 - 7.50 (m, 1H), 7.35 - 7.15 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.30 -4.00 (m, 1H), 3.95 - 0.80 (m, 61H).
Compuestos 33 y 34
Figure imgf000110_0002
Los compuestos 33 y 34 se prepararon de la misma manera en cuanto a los compuestos 6 y 7, sustituyendo el ácido carboxílico 1ZF por el compuesto 32B.
Figure imgf000110_0003
Caracterización de los productos finales: Compuesto 33 LC/MS/UV (ESI) (C44H76N6O8, 816.57 de masa exacta) m/z 817.6 (MH+), 409.4 (M 2H /2); luz ultravioleta: 5.94 minutos (95%, 210 nm). 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 5 (Presencia de rotámeros) 58.6 - 8.2 (m, 0.8H, NHCO intercambio incompleto) 7.30 - 7.22 (m, 5H), 4.80 (m, 2H), 4.23 - 0.86 (m, 66H). Compuesto 34 LC/MS/UV (ESI) (C43H74N6O8, 802.56 de masa exacta) m/z 803.6 (MH+), 402.4 (M 2H+/2); luz ultravioleta: 5.94 minutos (97.5%, 210 nm). 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 5 (Presencia de rotámeros) 57.30 - 7.20 (m, 5H), 4.80 (m, 2H), 4.25 - 0.86 (m, 63H).
Compuesto 35
(S)-2-(S)-2-((2- etilo (2-aminoetoxi)) (metilo) amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo) amino)propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000111_0001
Compuesto 35A: terc-butilo (2- etilo (2-hidroxietoxi)) carbamato
Figure imgf000111_0002
2 - etanol (2-aminoetoxi) (5 g, 47.56 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en THF (100 ml) a 0°C e hidróxido de sodio (2 g, 50.00 mmol, 1.05 equiv) se agregó posteriormente (solución en 25 ml del agua). Una solución de di-terc-butilo dicarbonato (10.38 g, 47.56 mmol, 1.00 equiv) en THF (20 ml) se agregó gota a gota y la reacción se mantuvo luego bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó agregando 50 ml del agua y el producto se extrajo con 3 veces 75 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas una vez con 100 ml de NaCl (sat.), luego secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión reducida para producir 9 g (92%) de compuesto 35A en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 35B: terc-butilo (2- etilo (2-oxoetoxi)) carbamato
Figure imgf000111_0003
Una solución de DMSO (3.46 ml, 5.00 equiv) en DCM (20 ml) se agregó gota a gota a una solución de cloruro del oxalilo (1.9 ml, 2.30 equiv) en DCM (20 ml) a -78 °C bajo nitrógeno. Después de la adición (30 minutos), la solución se agitó durante 30 minutos y una solución del compuesto 35A (2 g, 9.74 mmol, 1.00 equiv) en 20 ml DCM se agregó posteriormente. Después de la adición del TEA (12.2 ml), la reacción se agitó a -78 °C durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó agregando 100 ml del agua y el producto se extrajo 3 veces con 50 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 1.9 g del compuesto 35B en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 35C: bencilo (S)-12-isopropil-2,2,11-trimetil-4-oxo-3,8-dioxa-5,11-diazatridecan-13-oato
Figure imgf000112_0001
El compuesto 35C se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 14C de la amina 1ZC (2.4 g, 9.31 mmol, 1.00 equiv), el aldehído 35B (1.9 g, 9.35 mmol, 1.00 equiv), NaBH (OAc) 3 (3.96 g, 18.68 mmol, 2.00 equiv) y DIEA (6.2 ml) en THF (40 ml). La mezcla de reacción se neutralizó con 200 ml del agua y extrajo 3 veces con 100 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado para producir 2.3 g del compuesto 35C en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 35D: ácido (S)-12-isopropil-2,2,11-trimetil-4-oxo-3,8-dioxa-5,11-diazatridecan-13-oico
Figure imgf000112_0002
El compuesto 35C (200 mg, 0.49 mmol, 1.00 equiv) se disolvieron en 10 ml de EtOH en la presencia del Pd/C (200 mg) e hidrogenaron durante la noche. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 150 mg (96%) del compuesto 35D en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 35E: terc-butilo ((3R, 4S, 7S, 10S)-4-((S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il) etilo) amino) propilo) pirrolidin-1-il)- 2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2,14-dioxa-5,8,11-triazahexadecan-16-il) carbamato
Figure imgf000112_0003
El compuesto 35E se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (70 mg, 0.11 mmol, 1.00equiv), el ácido 35D (40.6 mg, 0.13 mmol, 1.20 equiv), DEPC (0.0324 ml) y DIEA (0.0527 ml) en DCM (3 ml). El producto sin refinar (100 mg, el 98%) se aisló en la forma de aceite amarillo y posteriormente se usó como tal. Compuesto 35: los 35 compuestos se sintetizaron de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 35E (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-010), Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / Ac N amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). Los 35 compuestos se obtuvieron con una producción del 23% (22.9 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (t Fa del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C45H75N7O7S, 857.54 de masa exacta) m/z: 858.5 (MH+) y 429.9 (M.2H+/2, el 100%), 5.89 minutos (89.7%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8 8.9 - 8.5 (m, 0.5H, NHCO intercambio incompleto), 7.8 - 7.7 (m, 1H), 7.55 - 7.45 (m, 1H), 7.35 - 7.1 (m, 5H), 5.45 - 5.5 (m, 1H), 4.9 -4.6 (m, 1H), 4.3 -0.75 (m, 62H).
Compuesto 36
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((7S, 10S, 13, 14R)-1-amino-13-((S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-14-metoxi-6,12-dimetil-8,11-dioxo-3-oxa-6,9,12-triazahexadecan-16-oil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000113_0001
Compuesto 36A: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((12S, 15S, 18S, 19R)-18-((S)- sec-butilo)-12,15-diisopropil-19-metoxi-2,2,11,17-tetrametil-4,13,16-trioxo-3,8-dioxa-5,11,14,17-tetraazahenicosan-21-oil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato
Figure imgf000113_0002
El compuesto 36A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv), el ácido 35D (25 mg, 0.11 mmol, 1.48 equiv), DEPC (0.0337 ml) y DIEA (0.0548 ml) en DCM (3 ml). El producto sin refinar (100 mg) se aisló en la forma de aceite amarillo y posteriormente se usó como tal.
Compuesto 36: los 36 compuestos se sintetizaron de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 36A (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep c 18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFAdel 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). Los 36 compuestos se obtuvieron con una producción del 13% (12.7 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Agilent ZORBAX SB-Aq columna, 1.8 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, MeOH del 2% en agua (TFA del 0.05%) durante 1 minuto luego 2% a 95% de MeOH en agua en 13 minutos, A continuación MeOH de 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C44H76N6O9, 832.57 de masa exacta) m/z: 833.5 (MH+) y 417.4 (M.2H+/2, el 100%), 11.58 minutos (98.5%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.1 - 8.5 (m, 0.8H, NHCO intercambio incompleto), 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 64H).
Compuesto 37
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((7S, 10S, 13S, 14R)-1-amino-13-(S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-14-metoxi-6,12-dimetil-8,11-dioxo-3-oxa-6,9,12-triazahexadecan-16-oil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000113_0003
Los 37 compuestos se prepararon de la misma manera en cuanto al compuesto 4, de 36 compuestos (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna Atlantis prep OBD T3, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 18.4 mg (19%) de 37 compuestos en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 |jm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C43H74N6O9, 818.6 de masa exacta) m/z: 819.6 (MH+) y 410.4 (M.2H+/2, el 100%), 5.48 minutos (96.7%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.35 - 7.2 (m, 5H), 5.0 - 4.65 (m, 3H), 4.3 - 0.8 (m, 61er).
Compuesto 38
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((2-aminoetilo)(metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin—2—il)—3—metoxi—2— metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000114_0001
Compuesto 38A: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((9S, 12S, 15S, 16R)-15-(S)- sec-butilo)-9,12-diisopropil-16-metoxi-2,2,8,14-tetrametil-4,10,13-trioxo-3-oxa-5,8,11,14-tetraazaoctadecan-18-oil) pirrolidin—2—il)—3— metoxi-2-metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato
Figure imgf000114_0002
El compuesto 38A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (70 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv), el ácido 26B (60.7 mg, 0.22 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.0337 ml) y DIEA (0.0548 ml) en DCM (3 ml). El producto sin refinar (100 mg) se aisló en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 38: los 38 compuestos se sintetizaron de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 38A (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLCPre-HPLC-001 preparativo SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). Los 38 compuestos se obtuvieron con una producción del 10% (10.3 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Agilent ZORBAX SB-Aq columna, 1.8 jm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, MeOH del 2% en agua (TFA del 0.05%) durante 1 minuto luego 2% a 95% de MeOH en agua en 13 minutos A continuación MeOH de 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C42H72N6O8, 788.5 de masa exacta) m/z: 789.5 (MH+) y 395.4 (M.2H+/2, el 100%), 12.97 minutos (91.0%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 60H).
Compuesto 39
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-(S)-2-(2-aminoetilo) (metilo) amino)- 3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000115_0001
Los 39 compuestos se prepararon de la misma manera en cuanto al compuesto 4, de 38 compuestos (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMa Dz U, Columna de Sunfire Prep C18 Ob D, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 8.2 mg (8%) de 39 compuestos en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Eclipse Plus columna C18, 3.5 pm, 4.6 x 150 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C41H70N6O8, 774.5 de masa exacta) m/z: 775.5 (MH+) y 388.4 (M.2H+/2, el 100%), 6.47 minutos (93.6%, 210 nm).
H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.35 - 7.15 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 57H).
Compuesto 40
(S)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il) etilo) amino) propilo) pirrolidin—1—il)—5—metil—1—oxoheptan—4—il)—N, 3-dimetil-2-(S)-3-metil-2-(metilo (4- butilo (metilamino)) amino) butanamido) butanamida, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000115_0002
Compuesto 40A: terc-butilo (4,4-dietoxibutil) (metilo) carbamato
Figure imgf000115_0003
El compuesto 40A se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 11E, de terc-butilo (4,4-dietoxibutil) (metilo) carbamato (5.5 g, 19.97 mmol, 1.00 equiv), NaH (60% en aceite, 3.2 g, 80.00 mmol, 4.01 equiv) y yodometano (14 ml) en el THF/DMF (40/20 ml). La reacción se neutralizó con 50 ml de NH4Cl (aq). El compuesto 40A se aisló en la forma de aceite amarillo, 5.5 g (95%).
Compuesto 40B: metilo de terc-butilo (4-oxobutil) carbamato
Figure imgf000115_0004
El compuesto 40A (3 g, 10.89 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una mezcla de AcOH y agua (15/4 ml) y la solución se dejó bajo agitación durante la noche. El pH se puso a 7-8 con solución acuosa NaHCO3-saturada y luego se extrajo dos veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas dos veces con 50 ml de solución acuosa NaCl-saturada, secada sobre sulfato de sodio anhidro, filtrado y concentrado a presión reducida. El compuesto 40B se aisló en la forma de aceite amarillo, 2.1 g (96%).
Compuesto 40C: bencilo (S)-2-((4-(terc-butoxicarbonilo)(metilo)amino)butilo)(metilo) amino)-3-metilbutanoato
Figure imgf000116_0003
El compuesto 40C se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 14C de la amina 1ZC (2.45 g, 9.53 mmol, 0.80 equiv), el aldehido 40B (2.4 g, 11.92 mmol, 1.00 equiv), NaBH(OAc)3 (5.06 g, 23.87 mmol, 2.00 equiv) y DIEA (6.16 g, 47.66 mmol, 4.00 equiv) en THF (15 ml). La mezcla de reacción se neutralizó con 100 ml del agua y se extrajo dos veces con 100 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (1:100-1:20)) para producir 1.2 g (25%) del compuesto 40C en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 40D: ácido (S)-2-((4-(terc-butoxicarbonilo)(metilo)amino)butilo)(metilo) amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000116_0001
El compuesto 40C (500 mg, 1.23 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 20 ml de EtOH en la presencia del Pd/C (550 mg) y se hidrogenó durante 1 hora a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 350 mg (90%) del compuesto 40D en la forma de aceite incoloro. Compuesto 40E: terc-butilo ((3R, 4S, 7S, 10S)-4-((S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-5,11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazapentadecan-15-il)(metilo)carbamato
Figure imgf000116_0002
DIEA.DEPC.DCM
El compuesto 40E se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (60 mg, 0.09 mmol, 1.00 equiv), el ácido 40D (57.8 mg, 0.18 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.0278 ml) y DIEA (0.0452 ml) en DCM (3 ml). El producto sin refinar (100 mg) se usó posteriormente como tal.
Compuesto 40: el compuesto 40 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 40E (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, fase de elución de 19 x 100 mm: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 40 se obtuvo con una producción del 24% (24.6 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C46H77N7O6S, 855.6 de masa exacta) m/z: 856.6 (MH+) y 428.8 (M.2H+/2, el 100%), 5.89 minutos (97.0%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.9 - 8.5 (0.7H, NHCO intercambio incompleto), 7.8 -7.7 (m, 1H), 7.55 -4.45 (m, 1H), 7.35 -7.1 (m, 5H), 5.5 -5.75 (m, 1H), 4.9 -4.6 (m, 2H), 4.2 -0.8 (m, 64H). Compuesto 41
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((8S, 11S, 14S, 15R)-14-((S)- sec-butilo)-8,11-diisopropil-15-metoxi-7,13-dimetil-9,12-dioxo-2,7,10,13-tetraazaheptadecan-17-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000117_0001
Compuesto 41A: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((11S, 14S, 17S, 18R)-17-((S)- sec-butilo)-11,14-diisopropil-18-metoxi-2,2,5,10,16-pentametil-4,12,15-trioxo-3-oxa-5,10,13,16-tetraazaicosan-20-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato
Figure imgf000117_0002
El compuesto 41A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (170 mg, 0.27 mmol, 1.00 equiv), el ácido 40D (170 mg, 0.54 mmol, 2.09 equiv), DEPC (0.0819 ml) y DIEA (0.133 ml) en DCM (5 ml). El producto sin refinar (200 mg) se usó posteriormente como tal.
Compuesto 41: el compuesto 41 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 41A (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep c 18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 41 se obtuvo con una producción del 25% (25 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Agilent Zorbax SB-Aq columna, 1.8 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, MeOH del 2% en agua (TFA del 0.05%) durante 1 minuto luego 2% a 95% de MeOH en agua en 13 minutos, a continuación MeOH de 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C45H78N6O8, 830.6 de masa exacta) m/z: 831.6 (MH+) y 416.4 (M.2H+/2, el 100%), 11.58 minutos (97.2%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.55 - 8.15 (0.75H, NHCO intercambio incompleto), 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 67H).
Compuestos 42
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-(S)-1-((8S, 11S, 14S, 15R)-14-(S)-sec-butilo)-8,11-diisopropil-15-metoxi-7,13-dimetil-9,12-dioxo-2,7,10,13-tetraazaheptadecan-17-oil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-fenilpropanoico, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000118_0001
El compuesto 42 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 4, de 41 compuestos (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, columna Atlantis prep OBD T3, 5 |jm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 30.6 mg (31%) del compuesto 42 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 jm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 0% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C44H76N6O8, 816.6 de masa exacta) m/z: 817.6 (MH+) y 409.4 (M.2H+/2, el 100%), 5.75 minutos (100%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.5 - 8.1 (0.3H, NHCO intercambio incompleto), 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 64H).
Compuesto 43
(S)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino)propilo)pirrolidin—1 —il)—5—metil—1 —oxoheptan—4—il)—N,3—dimetil—2—((R)—3—metil—2—(metilo (2-(2-etoxilo(metilamino))etilo)amino)butanamido) butanamida, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000118_0002
Compuesto 43A: terc-butilo (2-(2-(tertbutildimetilsilil)oxi)etoxilo)etilo)carbamato
Boc
Figure imgf000118_0003
TBDMSCI, DCM
El compuesto 35A (terc-butilo ((2- etilo (2-hidroxietoxi))carbamato) (8.21 g, 40.00 mmol, 1.00 equiv) e imidazol (6 g, 88.14 mmol, 2.20 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DCM (200 ml). Cloruro de tercbutildimetilsilano (TBDMSCl, 6.62 g, 43.92 mmol, 1.10 equiv) se agregó gota a gota y el medio de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml de DCM luego lavado dos veces con 200 ml de HCl de 0.5 m, dos veces con 200 ml de NaHCO3 (sat.), luego 300 ml de NaCl (permanecieron). La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (1:3) para producir 10 g (78%) del compuesto 43A en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 43B: terc-butilo (2-(2-(terc-butildimetilsilil) oxi) etoxilo) etilo) (metilo) carbamato
Figure imgf000118_0004
Boc
El compuesto 43B se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 11E, del compuesto 43A (10 g, 31.30 mmol, 1.00 equiv), NaH (60% en aceite, 5 g, 208.33 mmol, 4.00 equiv) y yodometano (22 g, 5.00 equiv) en DMF (200 ml). El medio de reacción se neutralizó con 200 ml del agua y lavó 3 veces con 100 ml de AcOEt luego 300 ml de NaCl (sat.). La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 10 g (96%) del compuesto 43B en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 43C: terc-butilo (2- etilo (2-hidroxietoxi)) (metilo) carbamato
Figure imgf000119_0001
El compuesto 43B (10 g, 29.89 mmol, 1.00 equiv) y TBAF.3H2O (20.8 g, 65.93 mmol, 2.20 equiv) se disolvió en THF (200 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas luego extrajo 3 veces con 100 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se recombinaron, se lavaron dos veces con 300 ml del agua, luego dos veces con 300 ml de NaCl (sat.), secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (1:3 - 1:1) para producir 6.6 g del compuesto 43C en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 43D: metilo de terc-butilo (2- etilo (2-oxoetoxi)) carbamato
Figure imgf000119_0002
El compuesto 43D se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 35B, del compuesto 43C (2 g, 9.12 mmol, 1.00 equiv), cloruro del oxalilo (1.9 ml), TEA (11.3 ml) y DMSO (3.3 ml). El compuesto 43D (2 g) se aisló en la forma de aceite amarillo.
Compuesto 43E: bencilo (S)-12-isopropil-2,2,5,11-tetrametil-4-oxo-3,8-dioxa-5,11-diazatridecan-13-oato
Figure imgf000119_0003
NaBH(OAc)3 DIEA,THF
El compuesto 43E se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 14C de la amina 1ZC (2.4 g, 9.31 mmol, 1.00 equiv), el aldehido 43D (2 g, 9.16 mmol, 1.00 equiv), NaBH(OAc)3 (4 g, 18.87 mmol, 2.06 equiv) y DIEA (6 ml) en THF (100 ml). La mezcla de reacción se neutralizó con 100 ml del agua y extrajo 3 veces con 100 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (4:1) para producir 1 g (37%) del compuesto 43E en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 43F: ácido (S)-12-isopropil-2,2,5,11-tetrametil-4-oxo-3,8-dioxa-5,11-diazatridecan-13-oico
Figure imgf000119_0004
El compuesto 43E (1 g, 2.37 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 40 ml de MeOH en la presencia de Pd/C (1 g) e hidrogenó durante 1 hora a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 600 mg (76%) del compuesto 43F en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 43G: terc-butilo ((3R, 4S, 7S, 10R)-4-( (S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2,14-dioxa-5,8,11-triazahexadecan-16-il) (metilo) carbamato
Figure imgf000120_0001
El compuesto 43G se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv), el ácido 43F (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv), DEPC (24.79 mg, 0.15 mmol, 2.00 equiv) y DIEA (29.46 mg, 0.23 mmol, 3.00 equiv) en DCM (1 ml). El producto sin refinar (59 mg) se usó posteriormente como tal.
Compuesto 43: el compuesto 43 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 43G (81 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 43 se obtuvo con una producción del 64% (52.6 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeCN en agua (TFA del 0.05%) durante 8 minutos MeCN luego del 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C48H77N7O7S, 871.6 de masa exacta) m/z: 872.5 (MH+) y 436.9 (M.2H+/2, el 100%), 3.90 minutos (100%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.8 - 7.7 (m, 1H), 7.55 - 4.45 (m, 1H), 7.35 - 7.1 (m, 5H), 5.5 - 5.75 (m, 1H), 4.9 - 4.6 (m, 2H), 4.2 - 0.8 (m, 64H).
Compuesto 44
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((9S, 12S, 15S, 16R)-15-((S)- sec-butilo)-9,12-diisopropil-16-metoxi-8,14-dimetil-10,13-dioxo-5-oxa-2,8,11,14-tetraazaoctadecan-18-oil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido bis trifluoroacético
Figure imgf000120_0002
Compuesto 44A: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((12S, 15S, 18S, 19R)-18-((S)- sec-butilo)-12,15-diisopropil-19-metoxi-2,2,5,11,17-pentametil-4,13,16-trioxo-3,8-dioxa-5,11,14,17-tetraazahenicosan-21-oil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato
El compuesto 44A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (60 mg, 0.09 mmol, 1.00 equiv), el ácido 43F (47 mg, 0.14 mmol, 1.50 equiv), DEPC (31 mg, 0.19 mmol, 2.00 equiv) y DIEA (37 mg, 0.28 mmol, 3.00 equiv) en DCM (1.5 ml). El producto sin refinar (58 mg) se usó posteriormente como tal.
Compuesto 44: el compuesto 44 se sintetiza de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 44A (58 mg, 0.06 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre— HPLC-001 SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 44 se obtuvo con una producción del 40% (23.7 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeCN en agua (TFA del 0.05%) durante 8 minutos MeCN luego del 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C45H78N6O9, 846.6 de masa exacta) m/z: 847.6 (MH+) y 424.4 (M.2H+/2, el 100%), 3.20 minutos (100%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.3 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 67H).
Compuesto 45
(S)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)—1—metoxi—2—metil—3—oxo—3—(((S)—2—fenil—1—(tiazol—2—il) etilo) amino) propilo) pirrolidin-1-il)—5—metil—1 -oxoheptan—4-il)-N, 3-dimetil-2-(S)-3-metil-2-(metilo (2- etilo (piperazin-1-il))amino)butanamido)butanamida, tris ácido trifluoroacético
Figure imgf000121_0001
Compuesto 45A: terc-butilo 4-(2-hidroxietilo)piperazina—1—carboxilato
Figure imgf000121_0002
2—(piperazin—1—il) etan—1—ol (5 g, 38.41 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en DCM (100 ml), y una solución de diterc-butilo dicarbonato (8.38 g, 38.40 mmol, 1.00 equiv) en DCM (20 ml) se agregó gota a gota. La reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se evaporó hasta secarse y el residuo se disuelve en 200 ml de AcOEt, lavado 5 veces con NaCl (permanecido), secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 8.5 g (96%) de compuesto 45A en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 45B: terc-butilo 4—(2—oxoetil)piperazina—1—carboxilato
Figure imgf000121_0003
Et3N, DCM
El compuesto 45B se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 35B, del compuesto 45A (1 g, 4.34 mmol, 1.00 equiv), cloruro del oxalilo (610 mg, 4.80 mmol, 1.12 equiv), TEA (2.13 g, 21.09 mmol, 4.90 equiv) y DMSO (0.82 g, 2.40 equiv). El compuesto 45B (0.8 g, el 81%) se aisló en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 45C: terc-butilo ((S)- 4—(2—((1—(benciloxilo)—3—metil—1—oxobutan—2—il)(metilo) amino)etilo)piperazina-1-carboxilato
Figure imgf000122_0001
El compuesto 45C se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 14C de la amina 1ZC (720 mg, 2.79 mmol, 0.80 equiv), el aldehído 45B (800 mg, 3.50 mmol, 1.00 equiv), NaBH(OAc)3 (1.6 g, 7.55 mmol, 2.15 equiv) y DIEA (2.5 ml) en THF (50 ml). La mezcla de reacción se neutralizó con 5 ml del agua y extrajo 3 veces con 5 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (3:1) para producir 400 mg (33%) del compuesto 45C en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 45D: ácido (S)-2-((2-(4-(terc-butoxicarbonilo)piperazin-1-il)etilo) (metilo) amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000122_0002
El compuesto 45C (400 mg, 0.92 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 30 ml de MeOH en la presencia del Pd/C (400 mg) e hidrogenó durante 1 hora a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 300 mg (95%) del compuesto 45D en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 45E: terc-butilo 4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-((S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino) propilo)pirrolidin-1-il)- 2-oxoetil)—5,11 —dimetil— 6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il) piperazina-1-carboxilato
Figure imgf000122_0003
El compuesto 45E se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (60 mg, 0.09 mmol, 1.00 equiv), el ácido 45D (62.7 mg, 0.18 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.0278 ml) y DIEA (0.0452 ml) en DCM (3 ml). El producto sin refinar (100 mg) se usó posteriormente como tal.
Compuesto 45: el compuesto 45 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 45E (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep c 18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; gradiente del 20% a 40% Ac N en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). Los 45 compuestos se obtuvieron con una producción del 19% (19.4 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Agilent ZORBAX SB-Aq columna, 1.8 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.0 ml/min, MeOH del 2% en agua (TFA del 0.05%) durante 1 minuto luego 2% a 95% de MeOH en agua en 13 minutos a continuación MeOH de 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C47H78N8O6S, 882.6 de masa exacta) m/z: 883.5 (MH+) y 442.4 (M.2H+/2, el 100%), 10.95 minutos (98.8%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros), 7.80 - 7.70 (m, 1H), 7.52 - 7.43 (m, 1H), 7.31 -7.09 (m, 5H), 5.70 - 5.51 (m, 1H), 4.80 - 4.60 (m, 1H), 4.20 - 0.75 (m, 66H).
Compuesto 46
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-N, 3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(2-(piperazin-1-il)etil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, tris ácido trifluoroacético
Figure imgf000123_0001
Compuesto 46A: terc-butilo 4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-(S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-3-(((S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il) amino)-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il) piperazina-1-carboxilato
Figure imgf000123_0002
El compuesto 46A se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de amina 3D (170 mg, 0.27 mmol, 1.00 equiv) el ácido 45D (184.6 mg, 0.54 mmol, 2.00 equiv), DEPC (0.0819 ml) y DIEA (0.133 ml) en DCM (5 ml). El producto sin refinar (200 mg) se usó posteriormente como tal.
Compuesto 46: el compuesto 46 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 2 del producto intermedio 46A (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHlMADZU, Columna de Sunfire Prep c 18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; Gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El compuesto 46 se obtuvo con una producción del 19% (19.1 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeCN en agua (TFA del 0.05%) durante 8 minutos MeCN luego del 95% en agua durante 2 minutos); ESI (C46H79N7O8, 857.6 de masa exacta) m/z: 858.6 (MH+) unos 429.9 (M.2H+/2, el 100%), 5.93 minutos (100%, 210 nm).1 1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.58 - 8.50 (m, 0.5 H, NHCO, intercambio incompleto), 8.29 - 8.22 (m, 0.4 H, NHCO, intercambio incompleto), 7.35 - 7.15 (m, 5H), 4.87 - 4.69 (m, 3H), 4.22 - 0.82 (m, 68H).
Compuesto 47
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-N, 3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(2-(piperazin-1-il)etil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, tris ácido trifluoroacético
Figure imgf000123_0003
El compuesto 47 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 4, de 46 compuestos (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMa Dz U, Columna Atlantis prep OBD T3, 5 |jm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 32.6 mg (33%) del compuesto 47 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 jm , 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C46H77N7O8, 843.6 de masa exacta) m/z: 844.6 (MH+) y 422.9 (M.2H+/2, el 100%), 5.73 minutos (100%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.66 - 8.57 (m, 0.3 H, NHCO, intercambio incompleto), 8.41 - 8.32 (m, 0.3 H, NhCo , intercambio incompleto), 8.13 - 8.06 (m, 0.2 H, NHCO, intercambio incompleto), 7.30 - 7.10 (m, 5H), 4.80 - 4.61 (m, 3H), 4.19 - 0.78 (m, 65H).
Compuesto 48
(S)-2-(S)-2-(((1H-imidazol-2-il)metilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il) etilo)amino)propilo)pirrolidin—1—il)—5—metil—1 — oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético
Figure imgf000124_0001
El compuesto 48 se preparó de la misma manera en cuanto al compuesto 1, de las aminas 1Y y 1ZC y 1H-imidazol-2-carbaldehído. El producto final se purificó por HPLC preparativa en las siguientes condiciones: Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19x150 mm, fases móviles almacenadas en un amortiguador con TFA del 0.05%, gradiente de 15.0 a 30% de ACN en agua en 10 minutos luego ACN de hasta el 95.0% en 2 minutos, Detección de UV UV 220 nm.
LC/MS/UV (Zorbax Eclipse Plus C8, 1.8 jm, 4.6 x 100 mm; 1 ml/min, 40°C, metanol del 2% en agua (fase de elucións almacenadas en un amortiguador con TFA del 0.05%) durante 1 minuto, luego el 2% a 95% de metanol durante 12 minutos; ESI (C45H70N8O6S, 850.51 de masa exacta) m/z: 851.2 (MH+), 873.5 (MNa+), 426.3 (M.2H+/2); 12.75 minutos (90.5%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.83 - 7.81 (m, 1H), 7.80 - 7.53 (m, 3H), 7.53 -7.22 (m, 5H), 5.6 - 5.8 (m, 1H), 5.0 - 4.6 (m, 2H); 4.6 - 0.85 (m, 55H).
Compuesto 49
(S)-2-((S)-2- amino(metil)((4-hidroxifenetil))- 3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo) amino)propilo)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético
Figure imgf000124_0002
Compuesto 49A: 2-(4-hidroxifenil)acetaldehído
Figure imgf000125_0001
4-(2-hidroxietil)fenol (4 g, 28.95 mmol, 1.00 quiv) se disolvió en DMSO (32 ml) y el TEA (8.8 ml, 2.20 equiv) se agregó posteriormente gota a gota. Una solución de SO3. Py (10 g, 2.20 equiv) en DMSO (36 ml) se agregó y la mezcla se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se neutralizó con 250 ml del agua y extrajo 3 veces con 100 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, lavadas 5 veces con agua (100 ml) luego dos veces con 150 ml de NaCl (sat.), secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (1:10) para producir 1 g (25%) del compuesto 49A en la forma de aceite incoloro.
Compuesto 49B: bencilo (S)-2-((4-hidroxifenetil) (metilo) amino)-3-metilbutanoato
Figure imgf000125_0002
El compuesto 49B se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 14C de la amina 1ZC (1.5 g, 5.82 mmol, 0.99 equiv), el aldehido 49A (800 mg, 5.88 mmol, 1.00 equiv), NaBH(OAc)3 (2.7 g, 12.74 mmol, 2.17 equiv) y DIEA (4.23 ml) en THF (25 ml). La mezcla de reacción se neutralizó con 50 ml del agua y extrajo 3 veces con 50 ml de AcOEt. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en gel de sílice (EtOAc/PE (1:10) para producir 600 mg (37%) del compuesto 49B en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 49C: ácido (S)-2-(4-hidroxifenetil) (metilo) amino)-3-metilbutanoico
Figure imgf000125_0003
El compuesto 49B (0.5 g, 1.46 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 40 ml de MeOH en la presencia del Pd/C (250 mg) e hidrogenó durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 0.4 g del compuesto 49C en la forma de un sólido color blanco. Compuesto 49: el compuesto 49 se sintetizó de la misma manera en cuanto al compuesto 3 de la amina 1Y (53.4 mg, 0.08 mmol, 2.00 equiv), el ácido 49C (70 mg, 0.28 mmol, 1.00 equiv), DEPC (0.032 ml, 2.00 equiv) y DIEA (0.053 ml, 3.00 equiv) en DCM (3 ml). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 Sh IMADZU, columna Atlantis prep OBD T3, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFAdel 0.05%; gradiente de 20% a 45% ACN en 10 minutos luego el 45% a 100% de ACN en 2 minutos; Detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 3 mg (1%) del compuesto 49 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 pm, 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFAdel 0.05%) en 8 minutos); ESI (C49H74N6O7S, 890.5 de masa exacta) m/z: 891.5 (MH+) y 446.4 (M.2H+/2, el 100%), 6.69 minutos (100%, 210 nm).1
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.92 - 8.87 (m, 0.5 H, NHCO, intercambio incompleto), 8.70 - 8.63 (m, 0.4 H, Nh c O, intercambio incompleto), 8.85 - 8.77 (m, 1 H), 7.59 - 7.51 (m, 1 H), 7.35 - 7.03 (m, 7H), 6.82 -6.71 (m, 2H), 5.77 - 5.58 (m, 1H), 5,81 -5.70 (m, 1H), 4.21 - 0.80 (m, 58H).
Compuesto 50
Ácido (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-(4-hidroxifenetil)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético
Figure imgf000126_0001
El compuesto 50 se prepara de la misma manera en cuanto al compuesto 4, de 27 compuestos (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-001 SHIMa Dz U, Columna Atlantis prep OBD T3, 5 |jm, 19 x 150 mm; Fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; gradiente de 20% a 40% ACN en 10 minutos a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; detector ultravioleta Waters 2545 a 254 nm y 220 nm), para producir 10.7 mg (11%) del compuesto 50 en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Columna de Ascentis Express C18, 2.7 jm , 4.6 x 100 mm; 40°C; 1.5 ml/min, 10% a 95% de MeOH en agua (TFA del 0.05%) en 8 minutos); ESI (C47H73N5O9, 851.5 de masa exacta) m/z: 852.5 (MH+) y 426.8 (M.2H+/2, el 100%), 6.46 minutos (91.7%, 210 nm).
1H RMN: (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 7.34 - 7.15 (m, 5H); 7.15 - 7.04 (se, 2H), 6.82 -6.83 (m, 2H), 4.83 - 4.70 (m, 1H), 4.21 - 4.00 (m, 1H), 3.90 - 3.80 (m, 1H), 3.74 - 3.62 (m, 1H), 3.57 - 2.86 (m, 20H), 2.56 -0.80 (m, 36H).
Compuesto 51
metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-(4-hidroxibenzil) (metilo) amino)- 3­ metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin—2—il)—3—metoxi—2— metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético
Figure imgf000126_0002
Compuesto 51A: terc-butilo (4-formilfenil)carbonato
Figure imgf000126_0003
4-hidroxibenzalddehído (3.0 g, 24 mmol) se disolvió en 30 ml de DCM en la presencia del 4-DMAP (300 mg, 2.46 mmol, 0.1 equiv.) y di-terc-butilo dicarbonato (5.35 g, 24 mmol, 1.0 equiv.) y agitado 1 hora a temperatura ambiente. La solución se diluyó luego con 200 ml del agua y extrajo 3 veces con 100 ml de DCM. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 5 g (92%) del compuesto 51A en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 51B: bencilo (S)-2-((4-(terc-butoxicarbonilo)oxi)bencilo)(metilo)amino)-3-metilbutanoato
Figure imgf000127_0001
NaBH(OAc)3 DIEA.THF
El compuesto 51A (220 mg, 0.99 mmol) se disolvió en 5 ml de THF en la presencia del compuesto 1ZC (255 mg, 0.99 mmol, 1.0 equiv.), NaBH(OAc)3 (420 mg, 2 mmol, 2.0 equiv.) y DIeA (654 pl) y agitado durante la noche a temperatura ambiente. La solución se diluyó luego con 100 ml del agua y extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100) para producir 200 mg (47%) del compuesto 51B en la forma de un sólido color blanco.
Compuesto 51C: ácido (S)-2-((4-(terc-butoxicarbonilo)oxi)bencilo)(metilo)amino)-3-metil butanoico
Figure imgf000127_0003
El compuesto 51C se preparó por la hidrogenación del compuesto 51B (200 mg), siguiendo el protocolo usado para la preparación de compuesto 3F.
Compuesto 51D: metilo (S)-2-((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(tercbutoxicarbonilo)oxi)bencilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)- 3-fenilpropanoato
Figure imgf000127_0002
El compuesto 51D se preparó acoplando el compuesto 51C con la amina 3D, siguiendo el protocolo usado para la preparación de compuesto 3 para obtener el producto deseado en la forma de aceite amarillo con una producción del 60%.
Compuesto 51: el Compuesto 51D (80 mg, 0.08 mmol) se disolvió en 1 ml de DCM en la presencia de 0.5 ml TFA, se agita 2 horas a temperatura ambiente y luego se concentra a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Pre-HPLC-010, columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua / ACN amortiguado con TFA del 0.05%; gradiente del 23% a 40% de ACN en 10 minutos a continuación 40% a 95% de ACN en 2 minutos; Detector de luz ultravioleta Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). Los 51 compuestos se obtuvieron con una producción del 24% (20 mg) en la forma de un sólido color blanco.
LC/MS/UV (Zorbax SB-Aq, 1.8 pm, 4.6 x 100 mm; MeOH del 2% en agua (TFA del 0.05%) durante 1 minuto luego 2% a 95% de MeOH en 13 minutos); ESI (C47H73N5O9, 851.54 de masa exacta) m/z: 874.5 (MNa+), 426.9 (M.2H+/2); 12.48 minutos (96%, 210 nm).1
1H RMN: (300MHz, CD3OD, ppm): 8 (Presencia de rotámeros) 8.1 - 8.6 (m, 0.9H, NHCO intercambio incompleto); 7.29 - 7.27 (m, 2H), 7.25 - 6.86 (m, 5H), 6.84 - 6.83 (m, 2H), 4.83 - 4.72 (m, 3H), 4.26 - 0.82 (m, 58H).
Compuesto 61
(S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metilo)amino)- 3-metilbutanamido)-N-((3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-(S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino)propilo) pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N, 3-dimetilbutanamida
Figure imgf000128_0001
Compuesto 61A: diclorhidrato de W-(4-am¡nofenet¡l)-W-metil-L-val¡na
Figure imgf000128_0002
El compuesto 11D (962 mg, 2.75 mmol) se disolvió en 10 ml de una solución comercialmente disponible de HCl en propan-2-ol (5 - 6 M) y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. El análisis de la cromatografía en capa fina indicó el consumo completo del material de partida. El solvente se evaporó a presión reducida, y el sólido color amarillo resultante triturado con Et2O (2 x 10 ml). El producto se secó en vacío para proporcionar el compuesto 61A como un sólido color amarillo (322 mg, el 47%).
Compuesto 61: Ácido carboxílico 61A (73 mg, 0.23 mmol, 1 eq.) y amina 1Y (150 mg, 0.23 mmol, 1 eq.) se disolvieron en DMF seco (2 ml). DIEA (158 pl, 0.90 mmol, 4 eq.) y DEc P (51 pl, 0.34 mmol, 1.5 eq.) se agregaron y la reacción agitada durante 4 horas a temperatura ambiente. El análisis por el LC-MS mostró el consumo completo del material de partida. El solvente se evaporó a presión reducida, y el residuo purificó mediante cromatografía rápida en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto 61 como un sólido color amarillo ligero (83 mg, el 40%).
1H RMN: (500MHz, DMSO-d6 , ppm): 8 (Presencia de rotámeros), 8.86 (d, 0.5H, NHCO); 8.65 (d, 0.5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0.5H, tiazol), 7.78 (d, 0.5H, tiazol), 7.65 (d, 0.5H, tiazol), 7.63 (d, 0.5H, tiazol), 7.32 - 7.12 (m, 5H), 6.83 (d, Hz de J=8.3, 2H), 6.45 (d, Hz de J=8.3, 2H), 5.56 - 5.49 (m, 0.5 H), 5.42 - 5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.46 (m, 2H), 4.01 - 0.66 (m, 57H).
HPLC (Xbridge Shield C18, 3.5 pm, 4.6 x 50 mm; 3.5 ml/min, 40°C, 0 a 95% de MeCN en agua (TFA del 0.1%) en 2.25 minutos MeCN luego del 95% durante 0.5 minutos, Tr = 1.31 minutos (96.5%, 220 nm).
m/z (Q-TOF ESI+) 890.5558 (2%, MH+, C49H76N7O6S requiere 890.5572), 445.7834 (100%, (MH2P , C49H77N7O6S requiere 445.7823).
Compuesto 62
Metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-am¡nofenet¡l)(met¡lo)am¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N, 3-dimetilbutanamido^-metoxi^-metilheptanoil) pirroNdin^-il^-metoxi^-metilpropanoi^-L-fenilalamnato
Figure imgf000128_0003
El compuesto 62 se preparó de la misma manera respecto al compuesto 61, usando el ácido carboxílico 61A (69 mg, 0.21 mmol, 1 eq.), amina 3D (135 mg, 0.21 mmol, 1 eq.), DIEA (75 pl, 0.43 mmol, 2 eq.) y DECP (49 pl, 0.32 mmol, 1.5 eq.). El producto sin refinar se purificó por cromatografía rápida en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto 62 como un sólido amarillento (82 mg, el 45%).
1H RMN: (500MHz, DMSO-d6 , ppm): 8 (Presencia de rotámeros), 8.50 (d, J=8.3, 0.5H, NHCO); 8.27 (d, J=8.0, 0.5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.44 (m, 3H), 4.01 - 3.72 (m, 1.5H), 3.66 (s, 1.5H, CO2Me), 3.63 (s, 1.5H, CO2Me), 3.57 - 0.65 (m, 55.5H).
HPLC (Xbridge Shield C18, 3.5 pm, 4.6 x 50 mm; 3.5 ml/min, 40°C, 0 a 95% de MeCN en agua (TFA del 0.1%) en 2.25 minutos MeCN luego del 95% durante 0.5 minutos, Tr = 1.29 minutos (95.3%, 220 nm).
m/z (Q-TOF ESI+) 865.5800 (2%, MH+, C48H77N6O8 requiere 865.5797), 433.2937 (100%, (MH2P , C48H78N6O8 requiere 433.2935).
Compuesto 63
((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)- L-fenilananina 2,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000129_0001
El compuesto 62 (23 mg, 0.03 mmol) se disolvió en una mezcla del agua (1 ml) y acetonitrilo (1 ml). La piperidina (0.75 ml) se agregó y la mezcla agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. El análisis de la cromatografía en capa fina indicó el consumo completo del material de partida. El solvente se evaporó a presión reducida, y el residuo purificó mediante HPLC preparativa (SunFire la columna C18 Preparatoria OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; Fase móvil: agua/MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente del 20% a 40% de MeCN en 10 minutos, luego del 40% a 100% de MeCN en 2 minutos; detector UV Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). Los 63 compuestos se obtuvieron como un sólido color blanco (14 mg, el 66%).
1H RMN: (500MHz, DMSO-d6, ppm): 8 (Presencia de rotámeros), 12.7 (s (br), 1H, CO2H), 9.58 (m (de br), 1H); 9.04 - 8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0.6H, NHCO), 8.15 (d, 0.4H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 7.13 - 6.99 (m (de br), 2H), 6.90 - 6.64 (s (br), 2H), 4.77 - 3.40 (m, 10H), 3.34 - 2.75 (m, 20H), 2.34 - 1.94 (m, 4H), 1.90 - 0.7 (m, 25H). HPLC (Xbridge Shield C18, 3.5 pm, 4.6 x 50 mm; 3.5 ml/min, 40°C, 0 a 95% de MeCN en agua (TFA del 0.1%) en 2.25 minutos MeCN luego del 95% durante 0.5 minutos, Tr = 1.24 minutos (100%, 220 nm).
m/z (Q-TOF ESI+) 851.5641 (6%, MH+, C47H75N6O8 requiere 851.5641), 426.2854 (100%, (MH2)2+, C47H76N6O8 requiere 426.2857).
Ejemplo 20: actividad antiproliferativa de los fármacos
Método:
Cultivo celular. A549 (carcinoma broncopulmonar no microcítico - ATCC CCL-185) y MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama - ATCC HTB-26) células se cultivaron en medio Eagle esencial mínimo (MEM) con el suero fetal de ternera (FCS) del 5% y medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con FCS del 10% respectivamente. Unas células de MCF7 (carcinoma ductal de mama - ATCC HTB-22) y SN-12C (carcinoma renal - ATCC) se mantuvieron en el medio RPMI1640 (sin el fenol rojo para células MCF7) conteniendo FCS del 10%. Todos los medios se complementaron con fungizona (1.25 pg/ml) y estreptomicina de la penicilina (100 U / 100 pg/ml). Las células se cultivaron en condiciones convencionales en una incubadora a 37°C, CO2 del 5% y humedad atmosférica del 95%.
Actividad antiproliferativa de 4 estirpes de célula tumoral. Los fármacos seleccionados se investigaron para su actividad antiproliferativa usando ensayo de proliferación ATPlite (Perkin Elmer, Villebon sur Yvette, Francia) en un panel completo de 4 estirpes celulares. Las células se sembraron en placas de 96 pocilios (103 células/pocillo para A549, 2.103 para MCF7, MDA-MB-231 y SN12C) al día 0 a una concentración para asegurar que las células permanecieran en la fase de crecimiento celular logarítmica durante todo el 72 período de tratamiento medicamentoso h. Después de un 24H período de incubación, todas las células se sometieron a tratamiento con diluciones en serie de los compuestos analizados (11 |j L de un 10X solución en DMSO del 1% - 6 pocillos / condición). Para evitar el cumplimiento de los compuestos en las puntas, las puntas se cambiaron entre dos diluciones consecutivas. Las células se colocaron luego en 37°C, incubadora de CO2 del 5%. Durante el día 4, la viabilidad celular se evaluó al dosificar el ATP liberado por células viables. La cantidad de células viables se analizó en comparación con la cantidad de las células tratadas del solvente. Los valores de EC50 se determinaron con el análisis de prueba de la curva (no modelo de la regresión lineal con una respuesta a la dosis sigmoideo, coeficiente de la cuesta de la colina variable), llevado a cabo con el algoritmo proporcionado por el software de GraphPad (GraphPad Software Inc., CA, USA).
Resultados:
Diversos fármacos:
Diversos fármacos se analizaron para determinar su actividad antiproliferativa de la estirpe celular MDA-MB-231 siguiendo el método anteriormente descrito. Las actividades cuantificadas proporcionaron valores de EC50 <0.1j M.
Los pocos siguientes ejemplos seleccionados de entre los fármacos ejemplificados anteriores ilustran sus propiedades antiproliferativas completamente notables:
Ejemplo 12 : EC50 = 5.80x10'1° m; ejemplo 13: EC50 = 7.95x10'8 m; ejemplo 15: EC50 = 1.70x10'1° m; ejemplo 27: EC50 = 1.20x10-10 m.
Diversas estirpes celulares:
Los 15 compuestos se analizaron en diferentes estirpes celulares (A549, MDA-MB-231, MCF-7, SN12C) siguiendo el método anteriormente descrito. Las actividades cuantificadas proporcionaron valores de EC50 <0.1j M en todas las estirpes celulares analizadas.
Figure imgf000130_0002
Ejemplos comparativos:
La sustitución en el anillo de fenilo (amino/hidroxilo v. carboxilo) se estudió en los siguientes ejemplos comparativos mostrando la actividad antiproliferativa mejorada de los fármacos según la invención que comprende sustituto del hidroxilo o amino.
Figure imgf000130_0001
Figure imgf000131_0003
Ejemplo 21: Síntesis de la porción ligador-fármaco
Compuesto E-11
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo(4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-((S)-sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino)propilo)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenilo)(metilo)carbamato 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000131_0001
Compuesto E-11-1: metilo (S)-2-amino-5-ureidopentanoato clorhidrato
Figure imgf000131_0002
Cloruro de acetilo (10 ml) se agregó gota a gota a MeOH (120 ml) a 0°C con agitación. Después de 20 minutos, L-citrulina (10 g, 57 mmol, 1.00 eq.) se agregó y la mezcla se calienta a reflujo durante la noche. El solvente se evaporó a presión reducida para producir 15 g (116%) de E-11-1 compuesto como un sólido color blanco. El producto se usó en la siguiente etapa sin el secado adicional.
Compuesto E-11-2: metilo (S)-2-(S)-2-(terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanoato
Figure imgf000132_0001
El compuesto E-11-1 (13 g, 57.6 mmol, 1.1 eq.) se disolvió en DMF (140 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. DIEA (30 ml, 173 mmol, 3.0 eq.), hidroxibenzotriazol (HOBt - 10.59 g, 69.1 mmol, 1.2 eq.) y Boc-L-valina hidroxisuccinimida éster (Boc-Val-OSu - 18.1 g, 57.6 mmol, 1.0 eq.) se agregaron. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, luego el solvente se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (100 ml) y extrajo dos veces con DCM (150 ml). Las fases orgánicas se combinaron, secadas sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó en gel de sílice (DCM/MeOH) para producir 18.8 g (84%) de E-11-2 compuesto como un sólido color blanco.
Compuesto E-11-3: ácido (S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metil butanamido)-5-ureidopentanoico
Figure imgf000132_0002
El compuesto E-11-2 (18.8 g, 48.4 mmol, 1 eq.) se disolvió en MeOH (200 ml) a 0°C. Una solución de NaOH 1M (72 ml, 72 mmol, 1.5 eq.) se agregó y la mezcla agitada durante 2 horas a temperatura ambiente. MeOH se eliminó a presión reducida y la solución acuosa restante acidificada con HCl 1M. La fase acuosa se evaporó hasta secarse y el residuo se purifica en gel de sílice (DCM/MeOH) para producir 18 g (99%) del compuesto E-11-3 como un sólido color blanco.
Compuesto E-11-4: terc-butilo ((S)-1-(((S)-1-((4-(hidroximetilo)fenilo)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato
Figure imgf000132_0003
El compuesto E-11-3 (5g, 13.4 mmol, 1 eq.) se disolvió en una mezcla de DCM seco (65 ml) y MeOH seco (35 ml). (4-aminofenil)metanol (1.81 g, 14.7 mmol, 1.1 eq.) y W-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ -6.60 g, 26.7 mmol, 2 eq.) se agregaron y la mezcla agitada en la oscuridad durante la noche. Los solventes se evaporaron a presión reducida, y el residuo purificado en gel de sílice (DCM/MeOH) para producir 5.2 g (73%) de E-11-4 compuesto como un sólido grisáceo.
Compuesto E-11-5: terc-butilo ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato
Figure imgf000133_0001
El compuesto E-11-4 (1.1 g, 2.29 mmol, 1 eq.) se disolvió en DMF seco (5 ml) a temperatura ambiente bajo una atmósfera inerte. Carbonato bis (4-nitrofenil) (1.40 g, 4.59 mmol, 2 eq.) se agregó, seguido de DIEA(600 pl, 3.44 mmol, 1.5 eq.), y la solución amarilla resultante agitó durante la noche. DMF se evaporó a presión reducida, y el residuo purificado en gel de sílice (DCM/MeOH) para producir 1.27 g (84%) del compuesto E-11-5 como un sólido grisáceo.
Compuesto E-11-6: 4-((S)-2-((S)-2-(terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-((S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etilo)amino)propilo)pirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-5,11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11 -triazatridecan-13-il) enilo)(metilo)carbamato 2 ,2 ,2-trifluoroacetato
Figure imgf000133_0002
Carbonato E-11-5 (114 mg, 0.177 mmol, 1.2 eq.) y anilina 11F (150 mg, 0.147 mmol, 1 eq.) se disolvieron en DMF seco (4 ml). HOBt (38 mg, 0.295 mmol, 2 eq.) y DIEA (54 pL, 0.295 mmol, 2 eq.) se agregaron y la mezcla agitada durante el fin de semana a temperatura ambiente. DMF se evaporó a presión reducida y el residuo purificó mediante cromatografía rápida en sílice, que eluye con DCM. El producto fue purificado de nuevo por HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector de UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto E-11-6 como un sólido color blanco (89 mg, el 39%).
Compuesto E-11:
Figure imgf000134_0001
El compuesto E-11-6 (21 mg, 0.014 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en DCM (0.25 ml) y TFA (40 j L) se agregó. La solución se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, después de las cuales, análisis de LC-MS indicó el consumo completo del material de partida. La mezcla brevemente se enfrió (baño de nitrógeno líquido) al añadir simultáneamente DMF (0.5 ml) luego DIEA (100 j L) a fin de neutralizar el TFA. El baño refrigerante se eliminó luego y 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (4 mg, 0.012 mmol, 1 eq.) se agregó. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y el producto purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto E-11 como un sólido color blanco (11 mg, el 54%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1524.8282 (2%, MNa+, CygH-mN^NaO-MS requiere 1524.8299), 751.9283 (100%, (MH2)2+, C79H117N13O14S requiere 751.9276).
compuesto E-12
metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2, 5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil) amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000134_0002
Compuesto: E-12-1: terc-butilo ((S)-3-metil-1-oxo-1-(((S)-1-oxo-1-((4-((((perfluorofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-5-ureidopentan-2-il)amino)butan-2-il)carbamato
Figure imgf000135_0001
El compuesto E-11-4 (670 mg, 1.26 mmol, 1 eq.) se disolvió en DMF seco (6 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. Bis (perfluorofenil) carbonato (991 mg, 2.51 mmol, 2 eq.) se agregó, seguido de DIEA (329 pl, 1.89 mmol, 1.5 eq.), y la solución incolora resultante se agitó durante 3o minutos a temperatura ambiente. DMF se evaporó a presión reducida, y el residuo purificado en gel de sílice (DCM/MeOH) para producir 836 mg (96%) del compuesto E-12-1 como un sólido grisáceo.
Compuesto E-12-2: metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000135_0002
Anilina 12 (165 mg, 0.189 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en DMF (5 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. Carbonato E-12-1 (194 mg, 0.282 mmol, 1.5 eq.), HoBt (51 mg, 0.375 mmol, 2 eq.) y DIEA (66 pL, 0.375 mmol, 2 eq.) se agregaron y la mezcla agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. El solvente se evaporó a presión reducida y el residuo purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFAdel 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto E12-7 como un sólido color blanco (247 mg, el 77%).
Compuesto E-12-3: metilo ((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-(S)-2-(S)-2-amino-3-metilbutanamido)- 5-ureidopentanamido)bencilo)oxi)carbonilo)(metilo)amino) fenetilo)(metilo)amino)-3 metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato bis (2,2,2 trifluoroacetato)
Figure imgf000136_0001
El compuesto E-12-2 (5.6 mg, 4.04 |jmol, 1.0 eq.) se disolvió TFA(100 jL). Después de 5 minutos, 2 ml del agua se agregaron y la mezcla liofilizada durante la noche para producir el compuesto E-12-3 como un sólido grisáceo (5.6 mg, el 98%).
Compuesto E-12:
Figure imgf000136_0002
El compuesto E-12-3 (5.6 mg, 4 jmol, 1.0 eq.) se disolvió en acetonitrilo (0.5 ml), y DIEA (5 jL, 7 eq.) se agregó, seguido de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-hexanoato (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) (2.5 mg, 8 jmol, 2 eq.). La mezcla se agitó durante 6 horas a temperatura ambiente. Después de controlar la reacción por el LC-MS, 200 pL del agua se agregaron, y la solución resultante se purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto E-12 como un sólido color blanco (4.6 mg, el 70%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 739.4389 (100%, (MH2)2+, C78H118N12O16 requiere 739.4389).
Compuesto E-13
((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-(S)-2-((4-((((4-(S)-2-(S)-2-(6-(2,5-dioxo-2, 5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)- L-fenilananina de 2,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000137_0001
Compuesto E-13-1: ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)- L-fenilananina
Figure imgf000137_0002
El compuesto E-12-2 (185 mg, 0.123 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en una mezcla del agua (5 ml) y acetonitrilo (5 ml) a temperatura ambiente. Piperidina (3.67 ml, 300 eq.) se agregó y la mezcla se agitó durante 6 horas a temperatura ambiente. Los solventes se evaporaron hasta secarse a presión reducida, y el residuo triturado con Et2Ü (60 ml). El sólido se enjuagó con dos veces Et2O (20 ml) y secó en vacío para producir el compuesto E-13-1 como un sólido grisáceo (175 mg, el 95%).
Compuesto E-13-2: ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5SM-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)- L-fenilananina bis (2 ,2,2 trifluoroacetato)
Figure imgf000138_0001
Compuesto E-13-1 (175 mg, 0.128 mmol, 1.0 eq.) se disolvió TFA (200 pL). Después de 5 minutos, el agua (1 ml) y acetonitrilo (1 ml) se agregaron y la solución fue liofilizada durante la noche para producir el compuesto E-13-2 como un sólido grisáceo (180 mg, el 87%).
Compuesto E-13: ((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-(S)-2-(S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)- L-fenilananina, 2,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000139_0001
El compuesto E-13-2 (80 mg, 0.058 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en una mezcla de acetonitrilo (1.5 ml) y DMF (0.4 ml). DIEA (50 |jL, 0.289 mmol, 5 eq.) se agregó, seguido de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-hexanoato (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) (36 mg, 0.116 mmol, 2 eq.). La mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Después de controlar la reacción por LC-MS, el solvente se evaporó a presión reducida y el residuo purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA de 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto E-13 como un sólido color blanco (32 mg, el 35%).
m/z (MS de Q-TOF ESI-) 1461.8336 (100%, (M-H)- C77H113N12O16 requiere 1461.8403). m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1463.8565 (2%, MH+, C77H115N12O16 requiere 1463.8549), 732.4317 (100%, (MH2)2+, C77H116N12O16 requiere 732.4311).
Compuesto E-15
metilo ((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-(S)-2-(S)-2-(6-(2,5-dioxo-2, 5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2 ,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000139_0002
Compuesto E-15-1: metilo ((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)oxi)carbonil)amino)benzil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2 ,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000140_0001
Compuesto E-15-1se preparó según el mismo método respecto al compuesto E-11-6, usando carbonato E-11-5 (28 mg, 0.044 mmol, 1 eq.), anilina 15 (42 mg, 0.044 mmol, 1 eq.), HOBt (3 mg, 0.022 mmol, 0.5 eq.), y DIEA (15 |jL, 0.087 mmol, 2 eq.) en DMF (2 ml). El compuesto E-15-1 se aisló como un sólido color blanco (8.2 mg, el 13%).
Compuesto E-15-2: metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)- 5-ureidopentanamido)bencilo)oxi)carbonilo)amino)bencilo) (metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato bis (2 ,2,2 trifluoroacetato)
Figure imgf000140_0002
El compuesto E-15-1 (8.2 mg, 5.58 jmol, 1.0 eq.) se disolvió en TFA(200 j L). Después de 5 minutos, el agua (1 ml) se agregó y la solución fue liofilizada durante la noche para producir el compuesto E-15-8 como un sólido color blanco (7.6 mg, el 99%).
Compuesto E-15:
Figure imgf000141_0001
El compuesto E-15 se preparó según el mismo método respecto al compuesto E-12, usando la amina E-15-2 (7.6 mg, 5.55 |jmol, 1 eq.), 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-hexanoato (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) (2 mg, 6.65 |jmol, 1.2 eq.) y DIEA (5 jL, 0.028 mmol, 5 eq.) en acetonitrilo (0.5 ml). El compuesto E-15 se aisló como un sólido color blanco (4.2 mg, el 48%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1471.8169 (2%, MNa+, CyaH-mN^NaO-ia requiere 1471.8211), 725.4223 (100%, (MH2)2+, C76H114N12O16 requiere 725.4232), 483.9482 (10%, (MHa)3+, C76H115N12O16 requiere 483.9513).
Compuesto F-13
((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-(S)-2-(S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2, 5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilananina 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000141_0002
Compuesto F-13-1: bencilo A/-(4-(terc-butoxicarbonilo)(metilo)amino)fenetilo)-N-metil-L-valinato
Figure imgf000141_0003
Compuesto 11C (250 mg, 0.567 mmol, 1 eq.) se disolvió en THF (10 ml) seguido mediante la adición de NaH (suspensión del 60% en el aceite mineral, 68 mg, 1.702 mmol, 3 eq.). La mezcla se agitó durante 5 minutos antes de añadir yodometano (106 j L, 1.702 mmol, 3 eq.). La reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente antes de inactivar con agua y separar entre EtOAc (100 ml) y agua (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y evaporó hasta secarse para producir el compuesto F-13-1 como aceite amarillo (250 mg, el 97%), que se usó sin purificación adicional.
Compuesto F-13-2: bencilo N-met//-N-(4-fenetilo (metilamino))-L-valinato
Figure imgf000142_0001
La anilina Boc-protegida F-13-1 (250 mg, 0.550 mmol, 1 eq) se disolvió en MeOH (5 ml) seguido mediante la adición de 1 ml de una solución comercialmente disponible de HCl en iPrOH (5 - 6 M). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas antes de evaporar hasta secarse a presión reducida. El aceite amarillo resultante se trituró con Et2O para producir el compuesto F-13-2 como un sólido color amarillo (202 mg, el 94%). Compuesto F-13-3: bencilo N-(4-('('SJ-2-('('S/)-2-(Yterc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)-N-metil-L-valinato
Figure imgf000142_0002
E-11-3 ácido (190 mg, 0.508 mmol, 1.5 eq.) se disolvió en DMF seco (1 ml), seguido mediante la adición de DIEA (118 j L, 0.677 mmol, 2 eq.), benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP - 264 mg, 0.508 mmol, 1.5 eq.) y anilina F-13-2 (120 mg, 0.339 mmol, 1 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y los solventes evaporados a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto F-13-3 como un sólido color blanco (140 mg, el 45%).
Compuesto F-13-4: N-(4-((S)-2-((S)-2-(terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetilo)-N-metil-L-valina
Figure imgf000142_0003
El compuesto F-13-3 (116 mg, 0.163 mmol, 1 eq.) se disolvió en MeOH (5 ml) en la presencia del 10% Pd/C (30 mg) e hidrogenó durante 2 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida para producir 110 mg (99%) del compuesto F-13-4 como un sólido beis.
Compuesto F-13-5: metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido) N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000143_0001
Amina 3D (89 mg, 0.140 mmol, 1 eq.) y ácido F-13-4 (145 mg, 0.210 mmol, 1.5 eq.) se disolvieron en DMF seco (4 ml), y PyBOP (109 mg, 0.210 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (73 jL, 0.420 mmol, 3 eq.) se agregaron. La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y el solvente evaporado. El residuo se separó entre EtOAc y agua y la fase orgánica secada sobre MgSO4, filtrado y evaporado a presión reducida. El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto F-13-5 como un sólido color blanco (140 mg, el 73%).
Compuesto F-13-6: ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetilo)(metilo) amino)-3-metilbutanamido)-N, 3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)- L-fenilananina 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000144_0001
El compuesto F-13-5 (140 mg, 0.104 mmol, 1 eq.) se disolvió en una mezcla del agua (4 ml), acetonitrilo (4 ml) y piperidina (2 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El solvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto F-13-6 como un sólido color blanco (115 mg, el 83%).
Compuesto F-13:
Figure imgf000144_0002
El compuesto F-13 se preparó según el mismo método respecto al compuesto E- 11, usando la amina Boc protegida F-13-6 (55 mg, 0.041 mmol, 1.0 eq.) en DCM (0.5 ml) y TFA (100 j L, 30 eq.), seguido de dilución con DMF (1 ml), inactivando con (DIEA (320 j L, 45 eq) luego reacción con 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-hexanoato (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) (15 mg, 0.049 mmol, 1.2 eq.). Después de la purificación por HPLC preparativa y liofilización, el compuesto F-13 se obtuvo como un sólido color blanco (14 mg, el 24%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1314.8067 (2%, MH+, C69H108N11O14 requiere 1314.8072), 657.9067 (100%, (MH2)2+, C69H109N11O14 requiere 657.9072).
Compuesto F-61
N-(S)-1-(((S)-1-((4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-(S)- sec-butilo)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etilo)amino)propilo)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenilo)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanamida 2,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000145_0001
Compuesto F-61-1: bencilo N-diclorhidrato-N-metil-L-valinato (4-aminofenetil)
Figure imgf000145_0002
El compuesto 11C (1.0 g, 2.27 mmol, 1 eq.) se disolvió en 8 ml de una solución comercialmente disponible de HCl en iPrOH (5 - 6 M). La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente antes de evaporar hasta secarse a presión reducida. El residuo se trituró dos veces con Et2O (30 ml) y secó en vacío para producir el compuesto F-61-1 como un sólido color blanco (916 mg, el 98%).
Compuesto F-61-2: bencilo N-(4-((S)-2-((S)-2-(terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metilbutanamido)- 5-ureidopentanamido) fenetilo)-N-metil-L-valinato
Figure imgf000145_0003
E-11-3 ácido (769 mg, 2.05 mmol, 1.5 eq.) se disolvió en DMF seco (2.5 ml) seguido mediante la adición de DIEA (957 j L, 5.48 mmol, 4 eq.) y PyBOP (1.07 g, 2.05 mmol, 1.5 eq.). Anilina F-61-1 (566 mg, 1.369 mmol, 1 eq.) se agregó y la mezcla agitada a temperatura ambiente durante la noche. Los solventes se evaporaron a presión reducida, y el residuo purificado en gel de sílice (DCM/MeOH) para producir 969 mg (102%) del compuesto F-61-2 como un sólido color blanco.
Compuesto F-61-3: A/-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonilo) amino)- 3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetilo)-N-metil-L-valina
Figure imgf000146_0001
El compuesto F-61-2 (969 mg, 1.28 mmol, 1 eq.) se disolvió en MeOH (20 ml) en la presencia de 10% de Pd/C (270 mg) e hidrogenó durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtró y se concentró a presión reducida, y el residuo purificado en gel de sílice (DCM/MeOH/AcOH) para producir 520 mg (67%) del compuesto F-61-3 como un sólido color blanco.
Compuesto F-61-4: terc-butilo ((S)-1-(((S)-1-((4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-((S)-sec-butilo)-7,10-d M sopropil-3-(2-(S)-2-((1R, 2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-fen¡l-1-(t¡azol-2-¡l)et¡lo) am¡no)prop¡lo)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)-5,11-d¡met¡l-6,9-d¡oxo-2-oxa-5,8,11-tr¡azatr¡decan-13-¡l)fen¡lo)am¡no)-1-oxo-5-ure¡dopentan-2-¡l) amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) carbamato 2 ,2,2 trifluoroacetato
Figure imgf000146_0002
F-61-3 ácido (67.5 mg, 0.111 mmol, 1.5 eq.) se disolvió en DMF seco (2 ml) y DECP (17 j L, 0.111 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (39 j L, 0.223 mmol, 3 eq.) se agregaron. Después de agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente, amina 1Y (50 mg, 0.074 mmol, 1 eq.) se agregó y la solución fue agitada durante la noche. El solvente se evaporó a presión reducida, y el residuo purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto F61-4 como un sólido color blanco (28 mg, el 28%).
Compuesto F-61-5: (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-((3R, 4S, 7S, 10S)-4-(S)- sec-butilo)-7,10-d¡¡soprop¡l-3-(2-(S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-fen¡i-1-(t¡azol-2-¡l)et¡lo)am¡no)prop¡lo)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)-5,11-d¡met¡l-6,9-d¡oxo-2-oxa-5,8,11-tr¡azatr¡decan-13-¡l) fenilo)- 5-ureidopentanamida bis (2,2,2-trifluoroacetato)
Figure imgf000147_0001
El compuesto F-61-4 (28 mg, 0.021 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en TFA(200 j L). Después de 5 minutos, el agua (2 ml) y acetonitrilo (0.5 ml) se agregaron y la solución fue liofilizada durante la noche para producir el compuesto F-61-5 como aceite incoloro (38 mg, el 134%).
Compuesto F-61:
Figure imgf000147_0002
El compuesto F-61-5 (28.3 mg, 0.020 mmol, 1 eq.) se disolvió en acetonitrilo (0.5 ml), seguido de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (9 mg, 0.029 |jmol, 1.4 eq.) y DIEA (25 jL, 0.143 mmol, 7 eq.). La mezcla se agitó durante 4.5 horas, después de las cuales el análisis de HPLC mostró la presencia del material de partida, pero el consumo completo de succinimida. 2,5-dioxopirrolidin-1-il-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato suplementario por lo tanto se añadió (3 mg, 0.01 jmol, 0.5 eq.) y la reacción se agitó durante 1.5 horas. El análisis de HPLC mostró el consumo completo del material de partida. El solvente se evaporó hasta secarse y el residuo se tritura dos veces con una mezcla de EtOAc/Et2O (80/20) para producir el compuesto F-61 como un sólido grisáceo (19.4 mg, 70%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1361.7725 (2%, MNa+, C70H106N12NaO12S requiere 1361.7666), 670.3961 (100%, (MH2)2+, C70H108N12O12S requiere 670.3960).
Compuesto F-62:
Metil((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R,4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetilo)(metilo)amino)- 3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000148_0001
Compuesto F-62-1: metilo ((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2-trifluoroacetato
El compuesto F-62-1 se preparó de manera similar al compuesto F-61-4 de amina 3D (100 mg, 0.158 mmol, 0.9 eq.), F-61-3 ácido (108 mg, 0.178 mmol, 1 eq.), DECP (41 j L, 0.267 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (93 j L, 0.534 mmol, 3 eq.) en DMF (2 ml). Después de la purificación por HPLC preparativa, el compuesto F-62-1 se obtuvo como un sólido color blanco (93 mg, el 39%).
Compuesto F-62-2: metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato bis (2,2,2 trifluoroacetato)
Figure imgf000149_0001
El compuesto F-62-1 (35 mg, 0.026 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en TFA (200 j L). Después de 10 minutos, el agua (2 ml) y acetonitrilo (0.5 ml) se agregaron y la solución fue liofilizada durante la noche para producir el compuesto F-62-2 como un sólido color blanco (34 mg, el 105%).
Compuesto F-62:
Figure imgf000150_0001
Amina F-62-2 (34 mg, 5.55 |jmol, 1 eq.) se disolvió en acetonitrilo (3 ml). DIEA (5 jL, 0.028 mmol, 5 eq.) y 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-hexanoato (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) (2 mg, 6.65 jmol, 1.2 eq.) se agregaron. El análisis de HPLC mostró el consumo completo del material de partida. El solvente se evaporó hasta secarse y el residuo se tritura con una mezcla de EtOAc/Et2O (80/20). El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jim, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto F-62 como un sólido color blanco (5.5 mg, el 13%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1336.7859 (2%, MNa+, C69H107NnNaO14 requiere 1336.7891), 657.9073 (100%, (MH2)2+, C69H109N11O14 requiere 657.9072).
Compuesto F-63:
((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R, 4S, 5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)- 5-ureidopentanamido)fenetilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilananina 2,2,2­ trifluoroacetato
Figure imgf000151_0001
Compuesto F-63-1: ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5SM-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilananina
Figure imgf000151_0002
El compuesto F-62-1 (157 mg, 0.118 mmol, 1 eq.) se disolvió en una mezcla del agua (4.5 ml), acetonitrilo (4.5 ml) y piperidina (3.5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El solvente se evaporó a presión reducida y el residuo Et2O triturado (60 ml). El sólido se recolectó mediante filtración y enjuagó dos veces con Et2O (10 ml) para producir el compuesto F-63-1 como un sólido grisáceo (153 mg, el 100%).
Compuesto F-63-2: ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilananina bis 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000152_0001
El compuesto F-63-1 (153 mg, 0.127 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en TFA (200 j L). Después de 10 minutos, el agua (2 ml) y acetonitrilo (0.5 ml) se agregaron y la solución fue liofilizada durante la noche para producir el compuesto F-63-2 como un sólido color blanco (34 mg, el 105%).
Compuesto F-63:
Figure imgf000153_0001
Amina F-63-2 (100 mg, 0.082 mmol, 1 eq.) se disolvió en una mezcla de acetonitrilo (2 ml) y DMF (0.5 ml), y 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (45 mg, 0.147 mmol, 1.8 eq.) y DIEA (71 pL, 0.409 mmol, 5 eq.) se agregaron. Después de agitar a temperatura ambiente durante 4.5 horas, el solvente se evaporó a presión reducida. El producto sin refinar se purificó por HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto F-63 como un sólido color blanco después (42 mg, el 36%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1300.7901 (2%, MH+, C68H106N11O14 requiere 1300.7915), 650.8990 (100%, (MH2P , C68H107N11O14 requiere 650.8994).
Compuesto G-12
metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-metilhexanamido)fenetilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2-trifluoroacetato
Figure imgf000153_0002
Compuesto G-12-1: diclorhidrato de bencilo A/-(4-aminofenetil)-W-metil-L-valinato
Figure imgf000154_0001
En cloruro del oxalilo (3 ml) se disolvió ácido 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoico (200 mg, 0.947 mmol, 1 eq.). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas antes de evaporar hasta secarse a presión reducida. El compuesto G-12-1 se obtuvo como un sólido beis (217 mg, el 100%) y usó en la siguiente etapa sin la purificación.
Compuesto G-12:
Figure imgf000154_0002
Anilina 12 (40 mg, 0.045 mmol, 1 eq.) se disolvió en DCM seco (1 ml) a 0°C y DIEA (8 jL, 0.045 mmol, 1 eq.) se agregó. Después de agitar durante 30 minutos, una solución de compuesto G-12-1 (10 mg, 0.45 mmol, 1 eq.) en DCM seco (1 ml) se introdujo y la reacción fue agitada durante 1 hora a 0°C. La mezcla se diluyó con DCM (25 ml) y se lavó dos veces con agua (20 ml), una vez con la salmuera (10 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, filtrado y evaporado a presión reducida para producir el producto sin refinar como un sólido marrón ligero (54 mg). Esto se purificó por cromatografía rápida en gel de sílice (DCM/MeOH) seguido de HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). El producto aislado era liofilizado para producir un sólido color blanco (23 mg), que fue purificado de nuevo por HPLC preparativa y las fracciones seleccionadas combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto G-12 como un sólido color blanco (9 mg, el 16%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1094.6543 (20%, MNa+, CagHagNyNaOn requiere 1094.6512), 1072.6722 (16%, MH+, C59H90N7O11 requiere 1072.6693), 536.8358 (100%, (MH2)2+, C59H91N7O11 requiere 536.8383).
Compuesto G-13
((2R, 3R)-3-(S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-metilhexanamido)fenetilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilananina 2,2,2- trifluoroacetato
Figure imgf000155_0001
Compuesto G-13:
Figure imgf000155_0002
Anilina 13 (15 mg, 0.015 mmol, 1 eq.) se disolvió en DCM seco (1.5 ml) a 0°C y DIEA (8 jL, 0.046 mmol, 3 eq.) se agregó. Una solución de compuesto G-12-1 (3.5 mg, 0.046 mmol, 1 eq.) en DCM seco (0.5 ml) se introdujo y la reacción fue agitada durante 1.5 horas a 0°C. El solvente se evaporó a presión reducida y el producto sin refinar se purificó mediante HPLC preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 Ob D, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto G-13 como un sólido color blanco (11.4 mg, el 62%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1058.6510 (30%, MH+, CsaHaeNyOn requiere 1058.6536), 529.8285 (100%, (MH2)2+, C58H89N7O11 requiere 529.8305).
Compuesto G-15
metilo ((2R, 3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)bencilo)(metilo)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato 2,2,2- trifluoroacetato
Compuesto G-15:
Figure imgf000156_0001
Anilina 15 (40 mg, 0.047 mmol, 1 eq.) se disolvió en DCM seco (2 ml) a 0°C y DIEA (10 jL, 0.056 mmol, 1.2 eq.) se agregó. Una solución de compuesto G-12-1 (108 mg, 0.47 mmol, 10 eq.) en DCM seco (1 ml) se introdujo y la reacción fue agitada durante 1.5 horas a 0°C. La mezcla se diluyó con DCM (10 ml) y se lavó dos veces con agua (5 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, filtrado y evaporado a presión reducida para producir el producto sin refinar como un sólido beis. Esto se purificó por HPLc preparativa (Waters 600E, Columna de Sunfire Prep C18 OBD, 5 jm, 19 x 100 mm; Fase de elución: agua / MeCN almacenado en un amortiguador con TFA del 0.1%; Gradiente 5% a 100% de MeCN en 15 minutos; Detector UV Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar el compuesto G15 como un sólido color blanco (27 mg, el 50%).
m/z (MS de Q-TOF ESI+) 1066.6517 (2%, MNa+, CsyHssNyNaOn requiere 1066.6199), 522.8224 (100%, (MH2)2+, C57H87N7O11 requiere 522.8226).
Ejemplo 22: síntesis de ADC, purificación y caracterización
El procedimiento descrito a continuación se aplica a las formas de IgG1 quiméricas y humanizadas. Debe apreciarse que para cualquier otra forma, como IgG2, IgG4, etc., el experto en la materia podría adaptar este procedimiento usando el conocimiento general.
Los anticuerpos (1-5 mg/ml) parcialmente se redujeron con Tris clorhidrato del fosfino (2-carboxietil) (TCEP) en el pH del amortiguador de borato de 10 mm 8.4 conteniendo NaCl de 150 mm y EDTA de 2 mm durante 2 h a 37°C. Típicamente, 2.5-3 equivalentes molares de TCEP se utilizaron para dianizar las relaciones fármaco-a-anticuerpo (DAR) de aproximadamente 4, respectivamente. La reducción del anticuerpo parcial se confirmó mediante el análisis del SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción. Antes del acoplamiento ligador-fármaco a los residuos de la cisteína intercatenarios liberados, la mezcla de reducción se dejó enfriar a temperatura ambiente. La concentración del anticuerpo se ajustó luego a 1 mg/ml con el pH del amortiguador de borato de 10 mm 8.4 conteniendo NaCl de 150 mm y EDTA de 2 mm, y un exceso molar de 5 del fármaco al anticuerpo se agregó de una solución de 10 mm en dimetil sulfóxido (DMSO). La concentración DMSO final se ajustó al 10% donde se mantienen la solubilidad del fármaco en el medio acuoso durante el acoplamiento. La reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente. El exceso del fármaco fue inactivado por la adición de 1.5 moles de N-acetilcisteína por mol de fármaco e incubación durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la diálisis contra amortiguador de His 25 mM de pH 6.5 conteniendo NaCl de 150 mm durante la noche a 4°C, los conjugados fármaco-anticuerpo se purificaron utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia basados en columnas de cromatografía comerciales y unidades de la ultrafiltración. En primer lugar, el fármaco no acoplado y los agregados de ADC fueron eliminados por la cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) en columna S200 (GE Life Sciences) o TSK G3000 SW (Tosoh). Los monómeros ADC purificados fueron concentrados luego a 2-3 mg/ml por la ultrafiltración en 30 o 50 unidades de la filtración kDa MWCO o por la cromatografía de afinidad en la Proteína A. ADCs purificados se almacenaron a 4°C después de la filtración estéril en un filtro de 0.2 jm.
Fueron analizados adicionalmente por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reducción para confirmar la conjugación del fármaco y por SEC en columnas S200 analíticas o TSK G3000 SWXL para determinar el contenido de monómeros y formas agregadas. Las concentraciones proteicas se determinaron mediante la utilización del ensayo de ácido bicinconínico (BCA) con IgG como patrón. El DAR se estimó para cada ADC purificado por HIC y LC-MS. Típicamente, el contenido de formas de agregados era inferior a 5% y DAR estaba comprendido entre 3.5 y 5.
Ejemplo 23: la evaluación de la citotoxicidad de anticuerpos IGF-1R acoplados con diferentes fármacos Los cinco anticuerpos IGF-1R mostraron ser internalizados rápidamente en lisosomas y tener una capacidad de unión inferior en ambientes ácidos. En este sentido, esos Abs tenían todas las propiedades para utilizarse como ADCs. Así, los cinco anticuerpos anti-IGF-1R quiméricos se acoplaron con tres diferentes compuestos (G-13; E-13 y F-63). La proporción del anticuerpo fármaco de aquellos ADCs fue de aproximadamente 4. A fin de evaluar la citotoxicidad no específica, un anticuerpo quimérico irrelevante c9G4 asimismo era acoplado con aquellos compuestos en el mismo DAR. Las células de MCF-7 se incubaron con concentraciones cada vez mayores de cada ADCs a 37°C durante 6 días en el medio de cultivo completo. La viabilidad celular se evaluó usando un ensayo de viabilidad celular luminiscente (CellTiterc-Glo, Promega). La señal luminiscente se leyó usando el lector de la placa de Mithras (Bertold Technologies). El anticuerpo quimérico irrelevante c9G4 acoplado con E-13, G-13 o con F-63 mostró una actividad citotóxica modesta o nula de células MCF-7 (Figura 21). Al contrario, la adición de todos los otros ADCs obtenidos después del acoplamiento de anticuerpos anti-IGF-IR con E-13, G-13 o con F-63 disminuyó particularmente la viabilidad de la célula de MCF-7.
Ejemplo 24: la actividad in vivo del anticuerpo c208F2 conjugado a los compuestos E-13, G-13 o a F-63 en el modelo del xenoinjerto MCF-7.
A fin de confirmar que la eficacia in vitro del c208F2 acoplado a los compuestos G-13, E-13 o F-63 podría traducirse in vivo, se han analizado en el modelo del xenoinjerto MCF-7.
Todos los procedimientos de animales se llevaron a cabo según las normas de la Directiva 2010/63/UE de la protección de animales usados con objetivos científicos. El protocolo fue aprobado por el Animal Ethical Committee del Pierre Fabre Institute. Cinco millones de células MCF-7 se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos/Swiss de siete semanas. Antes de la inyección celular, se implantaron gránulos de estrógeno (Innovative Research of America) en el costado izquierdo de ratones a fin de liberar estrógenos necesarios para la proliferación in vivo de tumores MCF-7.
Veinte días después del implante de células MCF-7, cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 120­ 150 mm3, los animales se dividieron en grupos de 5 ratones según tamaño tumoral y aspecto. Los diferentes tratamientos fueron inoculados por inyecciones intraperitoneales. El estado de salud de animales se monitorizó diariamente. El volumen tumoral se cuantificó dos veces a la semana con un calibrador electrónico hasta el fin del estudio. El volumen tumoral se calcula con la fórmula siguiente: n/6 x longitud x anchura x altura. La toxicidad se evaluó siguiendo el peso de los animales tres veces por semana. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en cada medida usando una prueba de Mann-Whitney. Todos los compuestos se inyectaron intraperitonealmente (i.p). En este ejemplo, la actividad antitumoral de c208F2 mAb acoplado con E-13, F-13 o F-63 a aproximadamente DAR 4 se evaluó después de 2 inyecciones de una dosis de 7 mg/kg a D20 y D27 (Figura 22A, 22B y 22C). En paralelo las porciones del fármaco rematado E-13, F-13 y F-63 se inyectaron a la dosis equivalente de la correspondiente a 7mg/kg de DAR de c208F2-E-13, c208F2-F-13 y c208F2-F-63 aproximadamente 4.
La inyección de c208-E-13 (Figura 22A), c208F2-G-13 (Figura 22B) o c208F2-F-63 (Figura 22C) inhibió de manera significativa e incluso indujo una regresión de proliferación tumoral completa (p <0.05 contra el fármaco rematado correspondiente). Ninguna diferencia de actividad estadística entre c208-E-13, c208F2-G-13 y c208F2-F-63 podría observarse. Los fármacos rematados no tenían efecto en la proliferación tumoral de MCF-7 (p> 0.05 vs el grupo control)
Un segundo conjunto de experimentos se llevó a cabo con c208F2 acoplado con E-13 o con G-13 y con el anticuerpo irrelevante c9G4 acoplado con E-13 o G-13 en modelos del xenoinjerto MCF-7 como se describe previamente. Los ratones se inyectaron i.p. con 7 mg/kg de cada ADCs a D20 y D27 (Figuras 23A y 23B).
La inyección tanto de c9G4-E-13 como de c9G4-F-13 afectó moderadamente y transitoriamente el crecimiento de tumores del xenoinjerto MCF-7. Sin embargo, este segundo experimento confirmó que las inyecciones de c208-E-13 o de c208F2-G-13 indujeron la regresión tumoral completa ya que D43 muestra la elevada actividad antitumoral de esos ADCs.
Ejemplo 25: la potente citotoxicidad in vitro de ADC de Axl acoplados con diferentes fármacos
La actividad citotóxica de ADC para la inhibición del crecimiento de las células tumorales se analizó en ensayo de proliferación celular usando SN12C (carcinoma de la célula renal de humano Axl+) y MCF-7 (adenocarcinoma de pecho de humano Axl'). Brevemente, las células se sembraron en placas multipocillo de 96 pocillos el día antes del tratamiento medicamentoso a 2500 células por pocillo. ADC y los controles se diluyeron en serie y luego se añadieron a las placas mw-96. Las células se incubaron luego durante 6 días a 37°C y C02 del 5%. La viabilidad celular se cuantificó al cuantificar el nivel de ATP en los pocillos usando CellTiterc-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega catalog #G7571). El porcentaje de la viabilidad celular se calculó considerando las células no tratadas como el 100%. Usando un análisis de la regresión no lineal (GraphPad Prism 4.0), el IC50, la concentración del compuesto necesaria para producir un 50% de reducción en la viabilidad comparado con células no tratadas (control = el 100%), se determinó y expresó en la molaridad (Figura 28).
Los datos mostraron en figuras 28A y 28B que hz1613F12 conjugado a E-13 o a G-13 proporcionan valores de IC50 de 1.048 10'1° M, 1.413 10'1° M, respectivamente. Así E-13 y G-13 pueden activar una citotoxicidad potente cuando se acoplan a un anticuerpo de Axl tal como 1613F12. No se observa citotoxicidad en las células MCF7 (Axl-).
Ejemplo 26: la actividad in vivo del anticuerpo de trastuzumab conjugado a los compuestos E-13 o a G-13 en el modelo del xenoinjerto Calu-3.
A fin de confirmar la eficacia in vivo de anticuerpos acoplados a los compuestos G-13 o E-13, se han acoplado al Trastuzumab y han analizado en el modelo Calu-3 del xenoinjerto sensible HER2 conocido por su amplificación HER2 y (3+) expresión. El anticuerpo Tratuzumab se adquirió de Euromedex, 24 Rue des Tuileries 67460 SOUFFEL-WEYERSHEIM / Francia.
Todos los procedimientos de animales se llevaron a cabo según las normas de la Directiva 2010/63/UE de la protección de animales usados con objetivos científicos. El protocolo fue aprobado por el Animal Ethical Committee del Pierre Fabre Institute. Siete millones de células Calu-3 se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID de 7 semanas.
Seis días después del implante de células de Calu-3, cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 250-260 mm3, los animales se dividieron en grupos de 6 ratones según tamaño tumoral y aspecto. Los diferentes tratamientos fueron inoculados por inyecciones intraperitoneales. El estado de salud de animales se monitorizó diariamente. El volumen tumoral se cuantificó dos veces a la semana con un calibrador electrónico hasta la finalización del estudio. El volumen tumoral se calcula con la fórmula siguiente: (longitud x anchura2)/2. La toxicidad se evaluó siguiendo el peso de animales tres veces por semana. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en cada medida usando una prueba de Mann-Whitney. Todos los compuestos se inyectaron intraperitonealmente (i.p). En este ejemplo, la actividad antitumoral de Tratuzumab mAb acoplado con E-13 o con G-13 a aproximadamente DAR 4 se evaluó después de 1 inyección de una dosis de 3 mg/kg a D6. En paralelo el Trastuzumab se inyectó solo a la dosis equivalente de la correspondiente a 3mg/kg del anticuerpo desnudo. La inyección de Trastuzumab-E-13 (Figura 29A) o Trastuzumab-G-13 (Figura 29B) inhibió considerablemente la proliferación tumoral e incluso indujo una regresión del crecimiento tumoral completa en todos los ratones tratados (p <0.05 vs anticuerpo desnudo correspondiente). Ninguna diferencia de actividad estadística se observó entre los grupos Trastuzumab-E-13 y Trastuzumab-G-13. Comparado con los datos publicados (Cretella et al. Molecular Cancer 2014, 13:143) en este modelo de Calu-3, TDM-1 no indujo la regresión completa incluso si su dosificación fuera más elevada (15 mg/kg cada 6 días vs 3 mg/kg, una inyección respectivamente) que la usada para Trastuzumab-E-13 o para Trastuzumab-G-13.
Ejemplo 27: Actividad in vivo del anticuerpo de trastuzumab conjugado con compuestos E-13 o G-13 en el modelo de xenoinjerto JIMT-1.
Para saber si los conjugados de anticuerpos de Trastuzumab asimismo muestran una actividad en un modelo conocido de resistencia al Trastuzumab, se evaluó el modelo de xenoinjerto de JIMT-1 que expresa altamente HER2 pero que era resistente a la terapia con Trastuzumab. Todos los procedimientos con animales fueron realizados según las normas de la Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. El protocolo fue aprobado por el Animal Ethical Committee del Pierre Fabre Institute. Siete millones de células JIMT-1 fueron inyectadas subcutáneamente en ratones SCID de 7 semanas de edad.
Catorce días después de la implantación de células JIMT-1, cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 220-230 mm3, los animales fueron divididos en grupos de 5 ratones según el tamaño del tumor y su aspecto. Los diferentes tratamientos fueron inoculados por inyección intraperitoneal. El estado de salud de los animales fue supervisado diariamente. Se cuantificó el volumen tumoral dos veces a la semana con una pinza calibradora electrónica hasta el final del estudio. El volumen tumoral se calcula con la siguiente fórmula: (longitud x anchura2)/2. La toxicidad se evaluó siguiendo el peso de los animales tres veces por semana. Se realizaron análisis estadísticos en cada cuantificación mediante una prueba de Mann-Whitney. Todos los compuestos fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.). En este ejemplo, se evaluó la actividad antitumoral de mAb de Trastuzumab ya sea acoplado con E-13 o G-13 en aproximadamente DAR 4 tras 1 inyección de una dosis de 3 mg/kg en D6 (Figuras 30A y 30B). En un primer experimento, se demuestra que el Trastuzumab solo no tuvo ningún efecto antitumoral (Figura 30). Este resultado concuerda con los datos publicados.
Una inyección ya sea con Trastuzumab-E-13 (Figura 30A) o Trastuzumab-G-13 (Figura 30B) inhibió significativamente el crecimiento tumoral traducido respectivamente en un 73% y 70% de inhibición del crecimiento en el día 34. No pudo observarse ninguna diferencia de actividad estadística entre Trastuzumab-E-13 y Trastuzumab-G-13. Como ya se había observado en el modelo Calu-3 y en comparación con datos publicados (Barok et al. (Barok et al. Breast Cancer Research 2011,13:R46) en este modelo JIMT-1, TDM-1 parece ser menos potente incluso cuando su dosis (15 mg/kg cada 6 días vs 3 mg/kg, una inyección respectivamente) fue superior a la usada para Trastuzumab-E-13 o Trastuzumab-G-13.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Conjugado anticuerpo-fármaco de la fórmula (I) siguiente:
    Ab-(L-D)n (I)
    o sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
    en el que
    Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno o un fragmento de unión a [diana] del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
    L es un ligador de la fórmula (III) siguiente:
    Figure imgf000253_0001
    en el que
    L2 es cicloalquilo (C4-C1ü)-carbonilo, alquilo (C2-C6), alquilo (C2-C6)-carbonilo,
    W es una unidad de aminoácido; w es un número entero comprendido entre 0 y 5;
    Y es PAB-carbonilo con PAB siendo
    Figure imgf000253_0002
    y es 0 o 1;
    el asterisco indica el punto de fijación a D;
    la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab;
    D es una porción de fármaco de la fórmula (II) siguiente:
    Figure imgf000253_0003
    en el que:
    Ri es H u OH;
    R2 es un grupo: alquilo (C i- Ce), COOH, COO-((alquilo(Ci-C6)) o tiazolilo;
    R3 es H o un grupo alquilo (Ci-Ce);
    A es:
    ■ un grupo de la fórmula -Het-Alc- en el que Alc es un grupo alcanodiilo (C1-C8) y está ligado a NR3, y Het es un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (Ci-Ce) y que contiene por lo menos un átomo de nitrógeno, estando dicho átomo de nitrógeno ligado a L, o
    - un grupo de la fórmula -Aa-Ab- en el que Aa está ligado a L y es O o NRg con Rg siendo H o alquilo (Ci-Ce) y Ab está ligado a NR3 y es:
    ■ un grupo alcanodiilo (Ci-C8),
    ■ un grupo -(CH2CH2Xi)ai(CH2CH2X2)a2(CH2CH2X3)a3(CH2CH2X4)a4CH2CH2- con Xi, X2, X3 y X4 cada uno representando independientemente entre sí O o NR8; a i, a2, a3 y a4 cada uno representando independientemente entre sí 0 o i; y R8 representando H o un grupo alquilo (Ci-Ce),
    ■ un grupo arilo-alcanodiilo (Ci-C8), o heterociclo-alcanodiilo (Ci-C8), siendo dicho grupo sustituido opcionalmente por un grupo alquilo (Ci-Ce), estando la porción heterociclilo o arilo ligadas a Aa y la porción alcanodiilo (Ci-C8) ligada a NR3;
    la línea ondulada indica el punto de fijación a L; y
    n es i a i2.
    2. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación i, en el que la [diana] o el antígeno de dicho anticuerpo de [diana] o anticuerpo de antígeno según la invención, o un fragmento de unión a [diana] o a antígeno del mismo, se seleccionan de entre CDi9, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, c D56, CD64, CD70, CD74, CD79, CDi05, CDi38, CDi74, CD205, CD227, CD326, CD340, MUCie, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina av, Mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4, HERi, HER3, HER2, IGF-iR, Axl y su fragmento de membrana extracelular (ECD).
    3. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación i, en el que dicha/o [diana] o antígeno de dicho anticuerpo de [diana] o anticuerpo de antígeno según la invención, o un fragmento de unión a [diana] o a antígeno del mismo, se seleccionan de entre HER2, IGF-iR y proteína Axl, preferentemente HER2 humano, IGF-iR humano y proteína Axl humana, y su fragmento de membrana extracelular (ECD).
    4. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación i, en el que Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al IGF-iR humano seleccionado de entre:
    i) los anticuerpos 208F2, 2 i2 A ii, 2i4F8, 219D6 y 2 i3Bi0;
    ii) los anticuerpos que compiten por unirse a IGF-iR con los anticuerpos de i); e
    iii) los anticuerpos que se unen al mismo epítopo de IGF-iR que los anticuerpos de i).
    5. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación i, en el que:
    dicho Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al IGF-iR humano seleccionado de entre:
    i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° i, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 4, 5 y e;
    ii) un anticuerpo que compite por unirse a IGF-iR con el anticuerpo de i); e
    iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de IGF-iR que el anticuerpo de i); o
    dicho Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse a la proteína Axl humana seleccionado de entre:
    i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 59, 60 y 61 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 56, 57 y 58;
    ii) un anticuerpo que compite por unirse a Axl con el anticuerpo de i); e
    iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de Axl que el anticuerpo de i).
    6. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que Ab comprende:
    a) un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en el que dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95; y
    b) un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en el que dicha secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 u 87.
    7. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que dicho Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al HER2 humano que consiste en Trastuzumab.
    8. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que L2 es de la fórmula siguiente:
    Figure imgf000255_0001
    en el que
    el asterisco indica el punto de fijación a (W)w; y
    la línea ondulada indica el punto de fijación al átomo de nitrógeno de la porción maleimida.
    9. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que w = 0; o w = 2 y (W)w se selecciona de entre:
    Figure imgf000255_0002
    en el que
    el asterisco indica el punto de fijación a (Y)y; y
    la línea ondulada indica el punto de fijación a L2.
    10. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que L se selecciona de entre:
    Figure imgf000256_0001
    en el que el asterisco indica el punto de fijación a D, y la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.
    11. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que A es un grupo de la fórmula -Aa-Ab- en la que Aa es como se define según la reivindicación 1 y Ab es un grupo:
    ■ fenil-alcanodiilo (C1-C 2), o
    ■ heterociclo-alcanodiilo (C1-C 2) opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C-i-Ca) (particularmente no sustituido), siendo el heterociclo un anillo saturado, insaturado o aromático con 5 o 6 miembros que comprende 1 o 2 átomos de nitrógeno, seleccionado particularmente de entre piridina, piperidina e imidazol, y siendo preferentemente una piridina.
    12. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que L es un grupo de la fórmula siguiente:
    Figure imgf000257_0001
    en el que:
    Rg es como se define en la reivindicación 1 y m es un número entero comprendido entre 1 y 8 y preferentemente en el que R9 = H o Me y m = 1 o 2,
    la línea ondulada indica el punto de fijación a L, y
    el asterisco indica el punto de fijación a NR3.
    13. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que (L-D) se selecciona de entre:
    Figure imgf000257_0002
    Figure imgf000258_0001
    Figure imgf000259_0001
    en el que la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.
    14. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1 o 2 que presenta la fórmula seleccionada de entre:
    Figure imgf000260_0001
    (Ab-G-12)
    Figure imgf000261_0001
    (Ab-G-13)
    Figure imgf000262_0001
    Figure imgf000263_0001
    (Ab-F-63) y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo,
    en el que Ab es un anticuerpo de [diana] o un anticuerpo de antígeno o un fragmento de unión a [diana] del mismo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
    15. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 14, en el que la [diana] de dicho anticuerpo de [diana] o el antígeno de dicho anticuerpo de antígeno se selecciona de entre HER2, IGF-1R y proteína Axl, preferentemente HER2 humano, IGF-1R humano y proteína Axl humana.
    16. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 14, en el que dicho Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y es seleccionado de entre:
    a) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al IGF-1R humano seleccionado de entre:
    i) los anticuerpos 208F2, 212A11,214F8, 219D6 y 213B10;
    ii) los anticuerpos que compiten por unirse a IGF-1R con los anticuerpos de i); e
    iii) los anticuerpos que se unen al mismo epítopo de IGF-1R que los anticuerpos de i),
    b) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al IGF-1R humano seleccionado de entre:
    i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 1, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 4, 5 y 6;
    ii) un anticuerpo que compite por unirse a IGF-1R con el anticuerpo de i); e
    Ni) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de IGF-1R que el anticuerpo de i),
    c) un Ab que comprende:
    i) un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en el que dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 o 95; e
    ii) un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en el que dicha secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 u 87,
    d) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse a la proteína Axl humana seleccionado de entre:
    i) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 59, 60 y 61 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 56, 57 y 58;
    ii) un anticuerpo que compite por unirse a Axl con el anticuerpo de i); e
    iii) un anticuerpo que se une al mismo epítopo de Axl que el anticuerpo de i), y
    e) un Ab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse a1HER2 humano que consiste en Trastuzumab o Pertuzumab.
    17. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que n es 2 o 4.
    18. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su utilización como un medicamento.
    19. Composición que comprende por lo menos un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
    20. Composición según la reivindicación 19 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
    21. Composición según la reivindicación 19 o 20, para la utilización en el tratamiento de un cáncer que expresa una [diana] o un antígeno, siendo dicha/o [diana] o antígeno seleccionada/o preferentemente de entre CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina av, mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX, 5T4, HER2, IGF-1R, Axl y su fragmento de membrana extracelular (ECD).
    22. Composición según la reivindicación 19 o 20, para la utilización en el tratamiento de un cáncer que expresa HER2, IGF-1R o Axl.
    23. Composición según una de las reivindicaciones 19 a 21, en la que dicho cáncer que expresa una [diana] o un antígeno es un cáncer seleccionado de entre cáncer de mama, de colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmón, melanoma, osteosarcoma, ovárico, próstata, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo, uterino, cáncer endometrial uterino, mesotelioma, carcinoma oral escamoso, sarcoma de Kaposi, leucemia aguda, carcinoma colorrectal, melanoma, adenocarcinoma ductal pancreático y cualquier cáncer resistente a fármacos.
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