ES2764471T3

ES2764471T3 - Receptores de antígeno quimérico y procedimientos de fabricación

Info

Publication number: ES2764471T3
Application number: ES15749056T
Authority: ES
Inventors: Laurence J N Cooper; Ana Beatriz Korngold; Brian A Rabinovich; Harjeet Singh; Simon Olivares
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2020-06-03
Anticipated expiration: 2035-02-16
Also published as: ZA201605655B; MX2016010566A; US20190085079A1; IL272264A; CA3190002A1; RU2016136370A3; US20210324071A1; CN106414748A; DK3105335T3; MX2019009295A; EP3105335A4; RU2753965C2; SG11201606664UA; AU2015218239A1; IL281819A; EP3105335B1; US20170183407A1; EP3656864A1; SG10201811816RA; IL272264B

Abstract

Un polipéptido que comprende un receptor de antígeno quimérico codificado por una secuencia de ADN según el SEQ ID NO: 5.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quimérico y procedimientos de fabricación

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y la medicina. Más particularmente, se refiere a procedimientos para generar receptores de antígeno quimérico (CAR).

Descripción de la técnica relacionada

La transferencia de células T adoptivas es una estrategia terapéutica prometedora que puede usarse para el tratamiento del cáncer. La transferencia de células T adoptivas implica aislar y expandir las células T específicas de antígeno que pueden matar selectivamente las células tumorales. Generalmente, las células T se eliminan de un sujeto y se cultivan in vitro. Se puede introducir un receptor de antígeno quimérico (CAR) en una célula T in vitro para dirigir la célula T, una vez reintroducida en el sujeto, para matar selectivamente las células tumorales en función de la expresión de un antígeno (por ejemplo, Wieczorek y col. 2013; Baya y col. 2013).

Un problema asociado con la transferencia adoptiva de células T es que existe una variabilidad significativa entre las cuales CAR puede funcionar de manera más efectiva en ciertas poblaciones de pacientes, por ejemplo, para tratar un cáncer específico. Debido a la gran cantidad de CAR diferentes posibles que podrían generarse y que podrían exhibir actividad terapéutica contra un cáncer, actualmente es muy difícil para los médicos anticipar qué CAR puede mostrar actividad terapéutica contra un cáncer o subtipo de cáncer dado. Debido al importante potencial terapéutico de la transferencia de células T adoptivas, existe una clara necesidad de procedimientos mejorados para identificar y generar nuevos CAR.

El documento US 2013/0266551 describe un CAR que contiene una señal co-estimuladora mediante la incorporación del dominio de señalización del receptor 4-1BB.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es tal y como se define en las reivindicaciones.

La presente descripción proporciona, en algunos aspectos, procedimientos para la generación de CAR. En algunos aspectos, se proporcionan procedimientos para la generación de un gran número de CAR que se pueden evaluar para detectar actividad contra un cáncer o subtipo de cáncer en particular; de esta manera, se puede generar e identificar CAR que puede exhibir un potencial terapéutico mejorado contra un cáncer o subtipo de cáncer en particular. La presente invención proporciona CAR específicos. El CAR proporcionado en esta invención puede administrarse terapéuticamente a un sujeto o paciente humano, por ejemplo, para tratar un cáncer.

Los datos clínicos demuestran que un diseño particular de receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a las células T a un antígeno asociado a tumor dado (TAA) puede tener un potencial terapéutico variable en diferentes pacientes. Por ejemplo, los CAR específicos de CD19 de segunda generación activados a través de CD28/CD3zeta quimérico o CD137/CD3-zeta pueden exhibir respuestas clínicas superiores cuando se administran células T genéticamente modificadas autólogas a pacientes con leucemia de linaje B aguda, en lugar de crónica. Para abordar este problema, se describen en esta invención procedimientos para generar especies de CAR que pueden exhibir un efecto antitumoral mejorado para un tumor dado.

Por ejemplo, en esta invención se describen procedimientos que pueden usarse para generar y detectar una gran cantidad de CAR para su capacidad para tratar un cáncer de un paciente dado; de esta manera, los procedimientos pueden usarse para personalizar una terapia para un paciente y seleccionar un CAR particular que muestre un potencial terapéutico mejorado para un paciente particular o un subconjunto de pacientes con un cáncer particular. Una estrategia clínica para la terapia génica puede utilizar la transferencia electrónica de plásmidos de ADN del sistema de transposón Sleeping Beauty (SB) (bella durmiente), por ejemplo, para reducir el coste y la complejidad de fabricar diseños de CAR individuales para pequeños subconjuntos de pacientes. Estos procedimientos para personalizar las células T CAR pueden utilizar la generación de una gran cantidad de moléculas CAR que se pueden examinar y evaluar su capacidad para beneficiar a un paciente determinado

En algunos aspectos, se describen procedimientos para el ensamblaje de alto rendimiento de moléculas CAR utilizando un sistema de recombinación específico de sitio triple (también denominado Plataforma “EZ-CAR”). En algunas realizaciones, estos procedimientos pueden permitir la combinación rápida de 3 componentes de un CAR prototípico a partir de (i) el fragmento variable de cadena única (scFv) que define la especificidad, (ii) el andamio/bisagra que agrega el scFv desde la superficie celular, y (iii) uno o más dominios de señalización intracelular. Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos a continuación, se generó un CAR específico de CD19 que se activa a través de CD28/CD3-zeta quimérico utilizando la plataforma EZ CAR en paralelo con células T CD CD19RCD28mZ de grado clínico (CG CAR).

En algunas realizaciones, un CAR proporcionado en esta invención o generado por procedimientos según la presente descripción puede co-expresarse en una célula T con una IL-15 unida a membrana. De esta manera, la célula T puede sobrevivir o existir en un estado inactivo sin proliferación significativa. in vitro o en vivo. En contraste, como se describió anteriormente, las células T que expresan CAR morirán típicamente cuando se retiren las citocinas in vitro y esta muerte celular puede servir como una característica de seguridad en ciertos casos cuando las células T se administran clínicamente. La proliferación de células T se mide típicamente usando un ensayo de células autónomas. Por lo tanto, en contraste con ciertos CAR previamente identificados, donde las células T no pueden persistir in vitro sin estimulación antigénica, se proporcionan en esta invención CAR que pueden inducir citotoxicidad sin crecimiento autónomo in vitro. Dependiendo de la realización particular deseada, un CAR producido por los procedimientos de la presente descripción o proporcionado en esta invención puede expresarse en una célula T con o sin co-expresión en la célula T de una IL-15 unida a membrana.

Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende: (a) una pluralidad de primeros vectores que codifican uno o más dominios de unión a antígeno distintos; (b) una pluralidad de segundos vectores que codifican uno o más dominios de bisagra distintos; y (c) una pluralidad de terceros vectores que codifican uno o más endodominios distintos; donde al menos dos de los primeros, segundos y terceros vectores comprenden una pluralidad de dos o más vectores que codifican dominios de unión a antígeno distintos, dominios de bisagra y/o endodominios, respectivamente, y además donde los vectores comprenden sitios para recombinación homóloga para permitir la generación de un cuarto vector que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR).

En la presente invención, como se usa en referencia a dominios de proteínas y polipéptidos tales como dominios de unión a antígeno, dominios de bisagra, dominios transmembrana y endodominios, el término “distinto” significa dominios que tienen, que comprenden o que consisten en diferentes secuencias de polipéptidos (aminoácidos). Por ejemplo, dos dominios de unión a antígeno “distintos” pueden unirse al mismo antígeno (de hecho, incluso el mismo epítopo en ese antígeno); sin embargo, los dominios de unión a antígeno son “distintos” si sus composiciones de aminoácidos secuenciales difieren entre sí. Asimismo, dos dominios de unión a antígeno “distintos”, que difieren en la composición secuencial de aminoácidos, también pueden unirse específicamente a diferentes antígenos y epítopos. A la inversa, como se usa en esta invención, dos moléculas (polipéptidos) de secuencia de aminoácidos idéntica no son polipéptidos “distintos”.

En algunas realizaciones, la pluralidad de primeros vectores codifica una pluralidad de dominios de unión a antígeno distintos, la pluralidad de segundos vectores codifica un dominio bisagra, y la pluralidad de terceros vectores codifica una pluralidad de endodominios distintos. En algunas realizaciones, la pluralidad de primeros vectores codifica una pluralidad de dominios de unión a antígeno distintos, la pluralidad de segundos vectores codifica una pluralidad de dominios de bisagra distintos, y la pluralidad de terceros vectores codifica una pluralidad de endodominios distintos. En algunas realizaciones, la pluralidad de primeros vectores codifica una pluralidad de dominios de unión a antígeno distintos, la pluralidad de segundos vectores codifica una pluralidad de dominios de bisagra distintos, y la pluralidad de terceros vectores codifica un endodominio. En algunas realizaciones, la pluralidad de primeros vectores codifica un dominio de unión a antígeno, la pluralidad de segundos vectores codifica una pluralidad de dominios de bisagra distintos, y la pluralidad de terceros vectores codifica una pluralidad de endodominios distintos. En algunas realizaciones, los dominios de unión a antígeno comprenden o consisten en scFv. Los terceros vectores pueden codificar un dominio transmembrana. Los segundos vectores pueden codificar un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la composición comprende además una pluralidad de quintos vectores que codifican uno o más dominios transmembrana; donde los primeros vectores, los segundos vectores, los terceros vectores y los quintos vectores comprenden sitios para la recombinación homóloga para generar un cuarto vector que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR). El primer vector puede comprender una primera secuencia y un segundo sitio de recombinación homóloga. El segundo vector puede comprender la segunda secuencia de recombinación homóloga y una tercera secuencia de recombinación homóloga. El tercer vector puede comprender la tercera secuencia de recombinación homóloga y una cuarta secuencia de recombinación homóloga. El tercer vector puede comprender la tercera secuencia de recombinación homóloga y una cuarta secuencia de recombinación homóloga. El cuarto vector comprende la primera secuencia de recombinación homóloga y la cuarta secuencia de recombinación homóloga. El primer vector, el segundo vector y/o el tercer vector pueden codificar una transposasa. La transposasa puede ser una transposasa de tipo salmónide (SB). En algunas realizaciones, 1, 2, 3, 4, o todo el primer vector, el segundo vector, el tercer vector, el cuarto vector y/o el quinto vector es un vector de transposón de Bella Durmiente (SB) o piggyBac. Alternativamente, en algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, el tercer vector, el cuarto vector y/o el quinto vector no es un vector de transposón de Bella Durmiente (SB) o piggyBac; por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede generar un CAR sin usar un vector de Bella Durmiente (SB) o piggyBac y, a continuación, el CAR puede insertarse posteriormente en un vector adecuado para transfectar células T (por ejemplo, insertado en un vector de la Bella Durmiente (SB) como se describe, por ejemplo, en Singh y col. 2015). Sin embargo, en algunas realizaciones, generar un CAR ya presente en un vector que sea adecuado para transfectar células T puede simplemente el proceso o reducir el número de etapas necesarias para generar un CAR y transfectar una célula T. Los distintos dominios de unión a antígeno pueden unirse selectivamente a diferentes antígenos. En algunas realizaciones, los dominios de unión a antígeno distintos se unen selectivamente al mismo antígeno. El dominio de unión a antígeno puede unirse selectivamente a CD19, antígeno universal (ratón), HER-3, GD2, Gp75, proteína CS1, mesotelina, fosfatidilserina, cMyc, CD22, CD4, CD44v6, CD45, CD28, CD3, CD3e, CD123, CD138, CD52, CD56. CD74. CD30, Gp75, CD38, CD33, CD20, fusión Her1/HER3, GD2, un carbohidrato, Aspergilo, ROR1, c-MET, EGFR, Dectin, Ebola, un hongo, GP, HERV-K (HERVK), NY-ESO-1, VEGF-R2, TGF-b2R, IgG4, Biotina u O-AcGD2. Los dominios de unión a antígeno distintos pueden consistir o comprender scFv. La región de bisagra puede consistir o comprender el péptido 12 AA (GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT; SEQ ID NO: 1), péptido t-20 AA, IgG4 Fc A EQ, IgG4 Fc A Q, (t-12AA t-20AA), mKate, phiLov, dsRed, Venus, eGFP, CH3 HA, (CD8 a t-20AA), Double t-20 AA, (t-20AA CD8a), (CD8a Leucine Zipper Basep1), (CD8a Leucine Zipper Acid1), 2D3, CD8 a, o IgG4 Fc. Al menos uno de los endodominios puede comprender CD3Z. Al menos uno de los endodominios puede comprender uno o más dominios ITAM. En algunas realizaciones, al menos uno de los endodominios comprende (CD28 CD3Z), (CD28 CD27 CD3Z), (CD28 OX40 CD3Z), (CD28 4-1BB CD3Z), (CD28 CD27 OX40 CD3Z), (CD28 4-1 BB CD27 CD3Z), (CD28 4-1BB OX40 CD3Z), (4-1BB CD3Z), (4-IBB OX40 CD3Z), (4-1BB CD27 CD3Z), (CD27 CD3Z), (CD27 OX 40 CD3Z), (CD28A CD3Z), (CD28A CD27 CD3Z), (CD28A OX40 CD3Z), (CD28A 4-1 BB CD3Z), (CD28A 4-1BB OX40 CD3Z), (CD28A CD27 OX40 CD3Z), (CD28A 4-1BB CD27 CD3Z), (4-1BB ICOS CD3Z), (CD28 ICOS CD3Z), (ICOS CD3Z), CD3Z o CD28 solamente. En algunas realizaciones, los CAR pueden ser probados para actividad, por ejemplo, utilizando el iQue ™ Screener (IntelliCyt, Albuquerque, NM). En algunas realizaciones, los CAR pueden evaluarse para una o más características (por ejemplo, viabilidad, regulación ascendente de señales de activación, regulación ascendente de CD25, liberación de citocinas y/o destrucción celular) cuando se expresa en células como las células T utilizando una técnica como, por ejemplo, citometría de flujo.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende una colección de vectores que codifican receptores de antígenos quiméricos que codifican una pluralidad de dominios de unión a antígeno, dominios de bisagra y endodominios distintos, siendo aleatorizados los vectores de dicha colección con respecto a dichos dominios.

Otro aspecto más de la presente descripción se refiere a un procedimiento para producir una pluralidad de vectores que codifican cada uno un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende: (i) obtener la composición que comprende una pluralidad de vectores de la presente invención (por ejemplo, como se describió anteriormente); y (ii) someter la composición a condiciones suficientes para permitir que los distintos dominios de unión a antígeno, dominios de bisagra y/o endodominios comprendidos o codificados por dichos vectores se recombinen mediante recombinación homóloga para producir una pluralidad de cuartos vectores, donde cada uno de dichos cuartos vectores codifica un CAR. El procedimiento puede comprender además la expresión del CAR en una célula. El procedimiento puede comprender además probar la actividad del CAR. En algunas realizaciones, uno o más de los primeros vectores codifica una región scFv. En algunas realizaciones, uno o más de los terceros vectores codifica un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, uno o más de los segundos vectores codifica un dominio transmembrana. El procedimiento puede comprender además la incorporación aleatoriamente mediante recombinación de un quinto vector que codifica un dominio transmembrana con dichos primeros vectores, segundos vectores y terceros vectores para formar dicho cuarto vector. En algunas realizaciones, dichos primeros vectores y dicho segundo vector están unidos aleatoriamente a partir de una pluralidad de vectores que codifican una pluralidad de regiones scFv distintas y una pluralidad de regiones de bisagra distintas. En algunas realizaciones, dichos primeros vectores y dichos terceros vectores están unidos aleatoriamente a partir de una pluralidad de vectores que codifican una pluralidad de regiones scFv distintas y una pluralidad de endodominios distintos. En algunas realizaciones, dichos segundos vectores y dichos terceros vectores están unidos aleatoriamente a partir de una pluralidad de vectores que codifican una pluralidad de regiones de bisagra distintas y una pluralidad de endodominios distintos. En algunas realizaciones, dichos primeros vectores, dichos segundos vectores y dichos terceros vectores se unen aleatoriamente a partir de una pluralidad de vectores que codifican una pluralidad de regiones scFv distintas, una pluralidad de regiones de bisagra distintas y una pluralidad de endodominios distintos. El procedimiento puede comprender además la generación de dichos cuartos vectores mediante la unión aleatoria de dichos primeros vectores a partir de una primera biblioteca de vectores que codifican una pluralidad de regiones scFv, la unión aleatoria de dichos segundos vectores a partir de una segunda biblioteca de vectores que codifican una pluralidad de regiones scFv y la unión de dichos terceros vectores de una tercera biblioteca de vectores que codifican una pluralidad de endodominios, para formar dicho cuarto vector que codifica el CAR. Los primeros vectores pueden comprender una primera secuencia y un segundo sitio de recombinación homóloga. Los segundos vectores pueden comprender la segunda secuencia de recombinación homóloga y una tercera secuencia de recombinación homóloga. Los terceros vectores pueden comprender la tercera secuencia de recombinación homóloga y una cuarta secuencia de recombinación homóloga. Los terceros vectores pueden comprender la tercera secuencia de recombinación homóloga y una cuarta secuencia de recombinación homóloga. Los cuartos vectores pueden comprender la primera secuencia de recombinación homóloga y la cuarta secuencia de recombinación homóloga. Los primeros vectores, los segundos vectores y/o los terceros vectores pueden codificar una transposasa. En algunas realizaciones, un sexto vector codifica una transposasa, y donde el procedimiento comprende introducir, electroporar o transfectar uno o más de dichos cuartos vectores y dicho sexto vector en una célula. La transposasa puede ser una transposasa de tipo salmónide (SB). El procedimiento puede comprender además cultivar o proporcionar células transfectadas con el CAR en presencia de células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) que pueden estimular la expansión de las células T que expresan CAR. En algunas realizaciones, cada una de la región scFv, la región bisagra y el endodominio están codificados en un vector de transposón de Bella Durmiente (SB) o piggyBac. En algunas realizaciones, cada uno del primer vector, el segundo vector y/o el tercer vector están unidos aleatoriamente por dicha recombinación a partir de una pluralidad de vectores que codifican múltiples regiones scFv distintas, las regiones de bisagra y los endodominios. En algunas realizaciones, dichos primeros vectores, los segundos vectores y los terceros vectores contienen cada uno un transposón; y donde dicha unión por recombinación homóloga comprende recombinación específica del sitio. En algunas realizaciones, los primeros vectores y los segundos vectores tienen cada uno un primer sitio de recombinación homóloga; y donde los segundos vectores y los terceros vectores tienen cada uno un segundo sitio de recombinación homólogo. En algunas realizaciones, los primeros vectores tienen un tercer sitio de recombinación, y donde los cuartos vectores tienen un cuarto sitio de recombinación, donde el tercer sitio de recombinación y el cuarto sitio de recombinación pueden permitir la recombinación homóloga en una célula. La célula puede ser una célula T tal como, por ejemplo, una célula T alfa beta, una célula T gamma delta, o célula NK, o célula NKT. En algunas realizaciones, la célula es una célula pluripotente tal como, por ejemplo, una célula madre o una célula madre pluripotente inducida. En algunas realizaciones, la célula se deriva de una célula madre, una célula madre pluripotente inducida o una célula madre. La célula puede ser una célula T o una célula NK derivada de una célula madre pluripotente inducida. En algunas realizaciones, dichos dominios de unión a antígeno distintos incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más scFv que reconocen selectivamente diferentes antígenos. En algunas realizaciones, dichos dominios de unión a antígeno distintos incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. o más scFv que reconocen selectivamente (es decir, se unen específicamente) el mismo antígeno. En algunas realizaciones, los dominios de unión a antígeno se unen selectivamente (específicamente) a CD19, antígeno universal (ratón), HER-3, GD2, Gp75, proteína CS1, mesotelina, fosfatidilserina, cMyc, CD22, CD4, CD44v6, CD45, CD28, CD3, CD3e, CD123, CD138, CD52, CD56, CD74, CD30, Gp75, CD38, CD33, CD20, Her1/HER3 fusion, GD2, un carbohidrato, Aspergilo, ROR1, c-MET, EGFR, Dectin, Ebola, un hongo, GP, HERV-K, NY-ESO-1, VEGF-R2, TGF-b2R, IgG4, Biotina u O-AcGD2. En algunas realizaciones, dichos dominios de unión a antígeno comprenden o consisten en scFv. La región bisagra puede codificar el péptido 12 AA (GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT, SEQ ID NO: 1), péptido t-20 AA, IgG4 Fc A EQ, IgG4 Fc A Q, (t-12AA t-20AA), mKate, phiLov, dsRed, Venus, eGFP, CH3 HA, (CD8 a t-20AA), Doble t-20 AA, (t-20AA CD8a), (CD8a Leucina Zipper Basepl), (CD8a Leucina Cremallera Acidl), 2D3, CD8 a o IgG4 Fc. El endodominio puede codificar CD3Z. El endodominio puede codificar uno o más dominios ITAM. En algunas realizaciones, el endodominio codifica (CD28 CD3Z), (CD28 CD27 CD3Z), (CD28 OX40 CD3Z), (CD28 4-1BB CD3Z), (CD28 CD27 OX40 CD3Z), (CD28 4-1BB CD27 CD3Z), (CD28 4-1BB OX40 CD3Z), (4-1BB CD3Z), (4-1BB OX40 CD3Z), (4-1BB CD27 CD3Z), (CD27 CD3Z), (CD27 OX 40 CD3Z), (CD28A CD3Z), (CD28A CD27 CD3Z), (CD28A OX40 CD3Z), (CD28A 4-1BB CD3Z), (CD28A 4-1BB OX40 CD3Z), (CD28A CD27 OX40 CD3Z), (CD28A 4-1BB CD27 CD3Z), (4-1BB ICOS CD3Z), (CD28 ICOS CD3Z), (ICOS CD3Z), CD3Z o CD28 solamente. En algunas realizaciones, los CAR pueden ser probados para actividad, por ejemplo, utilizando el iQue ™ Screener (IntelliCyt, Albuquerque, NM). En algunas realizaciones, los CAR pueden evaluarse para una o más características (por ejemplo, viabilidad, regulación ascendente de señales de activación, regulación ascendente de CD25, liberación de citocinas y/o destrucción celular) cuando se expresa en células como las células T utilizando una técnica como, por ejemplo, citometría de flujo. En algunas realizaciones, dicha actividad comprende la capacidad del CAR para unirse selectivamente a una célula cancerosa, unirse selectivamente a un patógeno, unirse selectivamente a una célula implicada en una enfermedad autoinmune, o promover la activación de una célula T, destrucción de una célula T, diferenciación de una célula T, proliferación de una célula T, desdiferenciación de una célula T, movimiento de una célula T, producción de citocinas por una célula T o destrucción por una célula T.

En algunas realizaciones, la célula cancerosa es un cáncer de ovario, un linfoma, un carcinoma de células renales, un tumor maligno de células B. CLL, B-ALL, ALL, una leucemia, un tumor maligno de células B o linfoma, linfoma de células del manto, un linfoma indolente de células B, linfoma de Hodgkin, AML, cáncer cervical, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, neuroblastoma, cáncer de piel, melanoma, cáncer de pulmón, osteosarcoma, glioma, un tumor derivado del epitelio, cáncer de próstata o cáncer pediátrico. El patógeno puede ser un virus, un hongo o una bacteria. En algunas realizaciones, dicha prueba comprende imágenes de células individuales, genética de células individuales, evaluación de células T individuales o poblaciones de células T; medición de muerte específica o muerte en serie, expresión génica, expresión de proteínas, movimiento hacia o lejos de un objetivo, proliferación, muerte celular inducida por activación, secreción de citocinas o secreción de quimiocinas. El procedimiento puede comprender además seleccionar un CAR único de dicha pluralidad de vectores basándose en una propiedad del CAR único. El procedimiento puede comprender además administrar terapéuticamente el CAR individual a un sujeto. El sujeto puede ser un mamífero tal como, por ejemplo, un humano.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende o que consiste en CAR 213 (SEQ ID NO: 5).

Otro aspecto más de la presente invención se refiere a una célula T transformada que expresa el polipéptido que comprende o que consiste en CAR 213 (SEQ ID NO: 5). La célula puede ser una célula inmortalizada. La célula T puede ser una célula T alfa beta, una célula T gamma delta, célula Nk , célula NKT, célula madre, células derivadas de células madre, incluidas las células del sistema inmunitario.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende la célula T transformada de la presente invención.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende o consiste en CAR 213 (SEQ ID NO: 5). El ácido nucleico puede estar comprendido en una célula T tal como, por ejemplo, una célula T alfa beta, una célula T gamma delta, una célula NK, una célula NKT, una célula madre o una célula T derivada de una célula pluripotente. La célula T puede estar comprendida en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende una biblioteca de diferentes vectores de codificación CAR, los vectores de dicha biblioteca se aleatorizan en términos de dominios de unión a antígeno distintos, dominios de bisagra y/o endodominios. En algunas realizaciones, la biblioteca se aleatorizó en términos de dominios de unión a antígeno distintos, dominios de bisagra y endodominios. En algunas realizaciones, la biblioteca se aleatorizó en términos de dominios y endodominios de unión a antígeno distintos. En algunas realizaciones, la biblioteca se aleatorizó en términos de dominios de unión a antígeno distintos y dominios de bisagra. En algunas formas de realización, la biblioteca se aleatorizó en términos de dominios y endodominios de bisagra de antígeno distintos.

Los ejemplos de dominios de unión a antígeno, regiones de bisagras, dominios transmembrana y endodominios que se usan en los procedimientos de la presente descripción para generar un CAR se muestran a continuación en la tabla 1. Los dominios de unión a antígeno, las regiones de bisagras, los dominios transmembrana y los endodominios se proporcionan simplemente en la tabla 1 como ejemplos no limitantes, y se anticipa que se puede seleccionar prácticamente cualquier dominio de unión a antígeno (porejemplo, dirigido a una célula cancerosa, bacterias, hongos, virus o células infectadas por virus) según se desee para la aplicación clínica particular. En la tabla 1, se proporciona el objetivo del dominio de unión a antígeno (por ejemplo, “CD19” puede referirse a una región scFv que se une selectivamente a CD19). En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende o consiste en un scFv que se une selectivamente al antígeno. Si lo desea, una porción de scFv (por ejemplo, parte de la región variable de scFv) puede ser aleatorizada si se desea. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une selectivamente a una proteína. Alternativamente, el dominio de unión al antígeno puede unirse selectivamente a un carbohidrato expresado en un objetivo tal como, por ejemplo, un hongo, virus, bacteria o célula cancerosa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende o consiste en Dectin-1, que puede unirse selectivamente a p-glucanos y carbohidratos que se encuentran en las paredes celulares fúngicas. En algunas realizaciones, el CAR puede unirse selectivamente a un virus, por ejemplo, el CAR puede unir una proteína viral tal como una proteína de envoltura de hepatitis (por ejemplo, Krebs y col. 2013). En algunas realizaciones, el antígeno es una citocina. El dominio de unión al antígeno puede unirse selectivamente a una proteína, carbohidrato o azúcar. En algunas realizaciones, un CAR se genera a partir de una pluralidad de dominios de unión a antígeno que se unen selectivamente a un solo objetivo, antígeno, o los dominios de unión a antígeno pueden tener antígenos superpuestos. En algunas realizaciones, se genera un CAR a partir de una pluralidad de dominios de unión a antígeno que se unen selectivamente a diferentes objetivos o antígenos. El endodominio en un CAR puede dar como resultado una señal inhibitoria (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, ITIM, SHP-1, LAIR-1, TIGIT, Siglecs) o una señal estimuladora (por ejemplo, CD27, CD28, ICOS, CD134, CD137, LCK, DAP10, ITAM, ZAP-70, LAT, SLP-76, citocinas, así como receptores de citocinas, así como combinaciones y mutaciones) en una célula que expresa el CAR tal como, por ejemplo, una célula T o una célula asesina natural (NK). Cuando la región de unión al antígeno reconoce selectivamente un antígeno, el endodominio puede causar o promover la célula (por ejemplo, Célula T o célula NK) que comprende el CAR para activar la muerte celular, migrar, diferenciar, desdiferenciar o inducir una señal apoptótica en la célula. La señal apoptótica puede comprender o consistir en una señal apoptótica CTLA4 y/o una señal apoptótica PD1 (muerte proteica 1). En algunas realizaciones, se puede expresar más de un CAR distinto en una célula tal como, por ejemplo, una célula T o una célula NK. Por ejemplo, un primer CAR y un segundo CAR pueden expresarse en una célula, donde el primer CAR se une selectivamente a un antígeno en una célula sana e induce una señal inhibidora a través de un primer endodominio (por ejemplo, reduciendo la probabilidad de que la célula T o la célula NK dañen la célula sana) y la segunda CAR se une selectivamente a un antígeno en una célula objetivo (por ejemplo, células cancerosas, hongos, células infectadas por virus, bacterias) e induce una señal estimuladora a través de un segundo endodominio (por ejemplo, promoviendo o causando la muerte celular de la célula objetivo por la célula T o la célula NK). Un CAR generado a través de los procedimientos de la presente invención puede insertarse en una célula objetivo tal como, por ejemplo, una célula T o una célula NK, como ADN integrante (por ejemplo, utilizando electroporación y recombinación homóloga a través de un vector o sistema de transposasa/transposón) o como ADN o ARN no integrante (por ejemplo, entrega viral de un ARNm usando un vector viral tal como, por ejemplo, un lentivirus o retrovirus). En algunas realizaciones, la célula T que codifica un CAR según la presente invención es una célula inmortalizada; tales células inmortalizadas pueden funcionar pueden usarse para evaluar o medir el potencial terapéutico o la toxicidad del CAR. De esta manera, muchos CAR pueden seleccionarse para un perfil farmacológico deseado, toxicidad hacia células enfermas o patógenos, falta de toxicidad en células sanas y/o eficacia terapéutica.

Tabla 1. Moléculas de ADN que pueden combinarse como dominios de unión a antígeno-dominios de señalización de bisagra p

Z - zeta; A- mutante; Nota = 4-1BB también se conoce como CD137; “+” se refiere a la fusión de las diferentes regiones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se pueden usar los siguientes dominios de unión a antígeno, bisagras/andamios, dominios transmembrana y endodominios, como se muestra en la tabla 2. Ejemplos de secuencias incluidas en dominios de señalización, por ejemplo, en la tabla 1 o en la tabla 2, incluyen ^cD27 (SEQ ID NO: 41), CD28 (SEQ ID NO: 42), CD28A (SEQ ID NO: 43), CD134 (OX40) (SEQ ID NO: 44), CD137 (41BB) (SEQ ID NO: 45), ICOS (SEQ ID NO: 46) y CD3 zeta (SEQ ID NO: 47). Los ejemplos de dominios scFv Anti-EGFR como se enumeran en la tabla 2 incluyen Nimotuximab (SEQ ID NO: 48) y Cetuximab (SEQ ID NO: 49). Un ejemplo de una scFv Anti-Fosfatidilserina como se enumera en la tabla 2 es Bavituximab (SEQ ID NO: 50).

Tabla 2: Ejemplo de bibliotecas utilizadas para generar CAR__________________________________

FV

El término “receptores de antígeno quimérico (CAR)” o “CAR”, como se usa en esta invención, incluye receptores de células T artificiales, receptores de células T quiméricas o inmunorreceptores quiméricos. Los CAR son generalmente receptores diseñados que pueden injertar una especificidad artificial en una célula efectora inmune particular. Los CAR pueden emplearse para impartir la especificidad de un anticuerpo monoclonal sobre una célula T, permitiendo así que se genere un gran número de células T específicas, por ejemplo, para uso en terapia celular adoptiva. En realizaciones específicas, los CAR dirigen la especificidad de la célula a un antígeno asociado a tumor, por ejemplo. En realizaciones preferidas, los CAR comprenden un endodominio (que comprende un dominio de activación intracelular), un dominio transmembrana, una región de bisagra o andamio, y un dominio extracelular que comprende un dominio de direccionamiento (por ejemplo, un scFv derivado de un anticuerpo monoclonal). En algunas realizaciones, el dominio de direccionamiento extracelular puede ser un ligando de un receptor (por ejemplo, un péptido que se une selectivamente a un receptor de proteína). En algunas realizaciones, uno puede apuntar a células malignas redirigiendo la especificidad de las células T usando un CAR específico para las células malignas (por ejemplo, mediante el uso de un scFv anti-CD19 para atacar a una célula cancerosa de linaje B).

En la tabla 1 se muestran ejemplos de regiones scFv, regiones de bisagra/andamio, dominios transmembrana y endodominios, y también se proporcionan ejemplos de secuencias relacionadas en esta invención. Tenga en cuenta en la tabla 1 que las regiones scFv pueden referirse a una pluralidad de regiones scFv para un objetivo particular (por ejemplo, “CD19” en la tabla 1 puede referirse a una única secuencia de anticuerpo monoclonal, o en algunas realizaciones preferidas, puede referirse a una pluralidad de regiones scFv derivadas de anticuerpos monoclonales que se dirigen selectivamente a CD19). Se anticipa que los procedimientos de la presente descripción pueden usarse para generar un CAR que comprende, por ejemplo, una fusión de cualquier combinación de una región scFv, bisagra/andamio, dominio transmembrana y endodominio de la tabla 1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el CAR puede comprender una región scFv que se dirige selectivamente a CD19 (por ejemplo, derivado de un ratón, humano o anticuerpo monoclonal humanizado) fusionado a una región de bisagra/andamio IgG4 Fc, un dominio transmembrana CD28 y un endodominio que comprende CD28 y CD3Z. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender una región scFv que se dirige selectivamente a ROR1 fusionado a la región bisagra/andamio Fc de IgG4, un dominio transmembrana CD28 y un endodominio que comprende CD28 y CD3Z. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender una región scFv que se dirige selectivamente a ROR1 fusionado a la región bisagra/andamio Fc de IgG4, un dominio transmembrana CD28 y un endodominio que comprende 4-1BB y CD3Z. En algunas realizaciones, el CAR puede comprender una región scFv que se dirige selectivamente a CD19 (por ejemplo, derivado de un ratón, humano o anticuerpo monoclonal humanizado) fusionado a la región bisagra/andamio Fc de IgG4, un dominio transmembrana CD28 y un endodominio que comprende CD28 y CD3Z.

Como se usa en esta invención, el término “antígeno” es una molécula capaz de unirse a un anticuerpo o receptor de células T. Generalmente se puede usar un antígeno para inducir una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que conduzca a la producción de linfocitos B y/o T.

Como se usa en esta invención, “un” o “uno/a” pueden significar uno o más. Tal como se utilizan en las reivindicaciones, cuando se utilizan junto con la expresión “que comprende”, las palabras “un” o “uno/a” pueden significar uno o más de uno.

El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refieren solo a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción respalda una definición que se refiere solo a alternativas e “y/o”. Tal como se utiliza en esta invención, “otro” puede significar al menos un segundo o más.

Como se usa en esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el procedimiento que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor al referirse a una o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en esta invención. FIG. 1. Los vectores de clonación utilizados para reensamblar CAR utilizando tres plásmidos donantes que expresan (i) scFv específico, (ii) bisagra extracelular y (iii) endodominios. Esta estrategia se adaptará para generar paneles de CAR que difieren en las regiones de bisagra, transmembrana e intracelular. Ingeniería de moléculas CAR a partir de componentes scFv, IgG4 Fc (bisagra grande); o CD8a (bisagra media) o péptido solamente (bisagra pequeña) y combinaciones de CD3^iv con diferentes dominios de señalización utilizando el sistema de sitio de triple recombinación. Una biblioteca de scFv y distintos andamios y dominios de señalización codificados en tres plásmidos donantes (clones de entrada), se recombinan en el vector de ADN de expresión. Esta estrategia generó múltiples especies CAR en el formato de dominio(s) de señalización scFv-B-scaffold-C.

FIGS. 2A-B: (FIG. 2A) Expresión de CAR (Fc) y CD8 en células T después de 66 días tras la electroporación por citometría de flujo. Las células se expandieron en un APC cargado con antígeno CD19 (clon 4) (FIG. 2B) La lisis de CD19 EL-4 se comparó con la lisis de fondo de CD19 neg EL-4 utilizando el ensayo de liberación de cromo de 4 h por células CD19CAR T de grado clínico (CG) Células T CD19CAR por sitios de triple recombinación (EZ CAR) y CAR neg células T. El CAR neg T se expandió con clon # 4 de aAPC derivado de K562 irradiado y anti-CD3 (OKT3) cargado.

FIG. 3: Diseños de CAR. CAR 212 = SEQ ID NO: 4; CAR 213 = SEQ ID NO: 5; CAR 214 = SEQ ID NO: 56; CAR 215 = SEQ ID NO: 57; CAR 216 = SEQ ID NO: 58: CAR 217 = SEQ ID NO: 2; CAR 218 = SEQ ID NO: 59; CAR 193 = SEQ ID NO: 55.

FIG. 4: Plásmidos de seguimiento de Bella Durmiente

FIG. 5: Expresión CAR.

FIG. 6: Cinética de Expresión CAR

FIG. 7: Fenotipo

FIGS. 8A-B: El fenotipo extendido se muestra en la FIG. 8A y la FIG. 8B.

FIG. 9: Análisis de transferencia Western

FIG. 10: Cinética de expansión.

FIG. 11: Expansión de pliegue: Células totales

FIG. 12: Expansión de pliegue: CAR células T.

FIG. 13: Citotoxicidad

FIG. 14: 4-1BB CAR: Citotoxicidad

FIG. 15: Dominio TM: Citotoxicidad

FIG. 16: Espaciador (IgG4 vs CD8): Citotoxicidad

FIG. 17: Producción de IFN-y.

FIG. 18: 4-1BB CAR: Producción de IFN-y

FIG. 19: Dominio TM: Producción de IFN-y

FIG.20: Espaciador (IgG4 vs CD8): Producción de IFN-y.

FIG.21: Seguridad: PCR para transposasa SB11.

FIG.22: Seguridad: Número de copia CAR (qPCR).

FIG. 23: Seguridad: Crecimiento autónomo. Como se muestra en la figura, se observó una falta de crecimiento autónomo.

FIG. 24: Diseño de CAR. Se proporciona un ejemplo de un CAR en el lado derecho de la figura.

FIG.25: CD3-zeta. Consulta = SEQ ID NO: 51; Sujeto - top = SEC ID N.°: 52; Sujeto - medio = SEQ ID NO: 53; Sujeto - inferior = SEQ ID NO: 54.

FIG. 26: Diseños de CAR.

FIG. 27: CAR.

FIG. 28: Expresión CAR.

FIG. 29: Cinética de expansión.

FIG. 30: Cinética de expansión.

FIG. 31: Citotoxicidad

FIG. 32: Citotoxicidad

FIG. 33: Marcadores de memoria. Se muestra el porcentaje de expresión de CD27, CD62L, CD28 y CCR7 en células CAR T (construcciones de expresión que se muestran en la figura 26).

FIG. 34: Producción de IFN-^y.

FIG. 35: Producción de IFN-^y(PMA-Ion)

FIG. 36: Crecimiento autónomo.

FIG. 37: Número de copia de CAR.

FIG. 38: Número de copia de CAR.

FIG. 39: Número de copia de CAR.

FIGS. 40A-E: Se realizó la transfección de células 293-HEK con plásmidos que transportan el ADN de CAR (pSBSO EZ CAR) por lipofectamina. Las células transfectadas se analizaron por citometría de flujo después de teñirlas con anticuerpos anti-Fc o anti-idiotípicos (antiCD19svFv).

FIGS. 41A-B: FIG. 41A, Nalm-6; Células EL-4 CD19 ; células tumorales de pacientes con MCL y CLL (objetivos) y se modificaron previamente para expresar GFP. Las células objetivo 5x10 3 se incubaron con una concentración creciente de células T CD19RIgG4CD28CAR, células T CD19RCD8aCD28 CAR y células CAR neg T (utilizadas como control) durante 4 horas. Después de 4 horas, las células fueron adquiridas por iQue de IntelliCyt y los análisis de datos se realizaron en su software patentado. FIG. 42B. Los gráficos representan el porcentaje de muerte de las células CAR T contra las células tumorales. La relación entre las células efectoras y las células objetivo varió de 0 a 40 células.

FIG. 42: Las células objetivo 5x103 (EL-4 CD19 informador de células B de granzima B) se incubaron con una concentración creciente de células T CD19RIgG4CD28CAR de grado clínico, células CAR T Ez CD19RCD8aCD28 y células CAR neg T (utilizadas como control) durante 4 y 10 horas. Después del tiempo de incubación, las células fueron adquiridas por iQue de IntelliCyt y los análisis de datos se realizaron en su software patentado. Los gráficos representan el porcentaje de muerte de las células CAR T contra las células tumorales. La relación entre las células efectoras y las células objetivo varió de 0 a 20 células.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Se describen en esta invención procedimientos para generar receptores de antígeno quimérico (CAR). El procedimiento utiliza una pluralidad de vectores que codifican cada uno un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, una región scFv), una región bisagra, una región transmembrana y/o un endodominio. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un primer vector codifica el dominio de unión al antígeno, un segundo vector codifica la región bisagra, y una tercera región codifica un endodominio. En algunas realizaciones, la región transmembrana se codifica en el segundo vector, en el tercer vector o en un cuarto vector. En algunas realizaciones preferidas, los vectores pueden recombinarse de forma homóloga para formar un ácido nucleico que codifica un CAR que comprende el dominio de unión al antígeno, la región bisagra, la región transmembrana y el endodominio. De esta manera, muchos CAR pueden generarse y seleccionarse para una actividad deseada tales como, por ejemplo, reconocimiento selectivo y destrucción de una célula cancerosa que expresa un antígeno que se une selectivamente por el CAR. El CAR puede entonces expresarse en una célula como una célula T o una célula asesina natural (NK) como un ácido nucleico integrante (por ejemplo, un ADN integrado en el genoma del huésped usando una transposasa/transposón) o como un ácido nucleico no integrante (por ejemplo, un ARNm entregado a través de un vector viral como un lentivirus o retrovirus). La célula T o la célula NK que expresa el CAR puede administrarse en una preparación farmacéutica o excipiente a un sujeto como un paciente humano para tratar o prevenir una enfermedad (por ejemplo, un cáncer, una infección por hongos, una infección bacteriana o una infección viral).

I. Generación de biblioteca

Las bibliotecas que codifican una pluralidad de regiones scFv, regiones de bisagra/andamio, dominios transmembrana y endodominios (dominios de señalización) pueden generarse mediante procedimientos conocidos por un experto en la materia. En algunas realizaciones, hay múltiples posibilidades disponibles para dos o tres de las regiones scFv, regiones de bisagra/andamio y endodominios (dominios de señalización). En algunas realizaciones, hay múltiples posibilidades disponibles para dos, tres o todas las regiones scFv, regiones de bisagra/andamio, dominios transmembrana y endodominios (dominios de señalización). Se proporcionan ejemplos de regiones scFv, regiones de bisagra/andamio, dominios transmembrana y endodominios (dominios de señalización), por ejemplo, en la tabla 1. En algunas realizaciones, la biblioteca puede codificar una pluralidad de scFv que se dirigen a diferentes antígenos, tales como antígenos múltiples contra el cáncer o dirigidos a tumores; en otras realizaciones, la biblioteca puede codificar una pluralidad de scFv diferentes que se unen selectivamente a un único objetivo (por ejemplo, un solo antígeno anticancerígeno como CD19, etc.). De esta manera, los procedimientos se pueden usar para identificar qué construcción de direccionamiento tumoral puede funcionar de manera más efectiva para una muestra celular dada (por ejemplo, para ser utilizado en una medicina personalizada) o los procedimientos pueden ser utilizados para identificar nuevos CAR que funcionen de manera más eficaz en la orientación de un antígeno dado. La región scFv generalmente comprende una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) derivada de un anticuerpo. En algunas realizaciones, porciones de las regiones VL y VH pueden ser aleatorizadas si se desea. Los procedimientos generales para generar bibliotecas incluyen, por ejemplo, la generación de bibliotecas de levadura, bacterianas, bibliotecas de fagos, células B infiltrantes, hibridomas (incluso de humanos y roedores), o bibliotecas de llamas, camellos, bibliotecas equinas y procedimientos in silico (véase, por ejemplo, Lennard, 2002).

En algunas realizaciones, los diferentes vectores que codifican el scFv, la región de bisagra/andamio, el dominio transmembrana y el endodominio se fusionan para formar un único vector que codifica un CAR. La fusión puede ocurrir mediante recombinación homóloga mediada por transposón.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, los vectores que codifican el scFv, la región de bisagra/andamio, el dominio transmembrana y/o el endodominio pueden ser plásmidos de ADN de Bella Durmiente (SB) o piggyBac. Los plásmidos de ADN de Bella Durmiente (SB) y piggyBac se describen, por ejemplo, en Maiti y col. (2013), Singh y col. (2008) y Huls y col. (2013) En algunas realizaciones, el transposón está mediado por una transposasa (SB) de tipo Tc1 de tipo salmónido. En algunas realizaciones preferidas, el vector que codifica el CAR se transfecta o incorpora a las células T de un sujeto, como un paciente humano con cáncer, a través de los procedimientos descritos en Singh y col. 2014 o Huls y col. Por ejemplo, los vectores de ADN derivados del sistema de Bella Durmiente (SB) se pueden usar para evitar gastos y dificultades de fabricación asociadas con la transducción de células T con vectores virales recombinantes. Después de la electroporación, el transposón/tiansposasa puede mejorar la eficiencia de integración de los plásmidos utilizados para expresar CAR y otros transgenes en las células T. El sistema SB combinado con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) puede propagarse selectivamente y producir células CAR(+) T adecuadas para la aplicación en humanos. En algunas realizaciones, la transferencia electrónica sincrónica de dos plásmidos de ADN, un transposón SB (que codifica un CAR de interés) y una transposasa SB (por ejemplo, SB11) puede ser seguido por la recuperación de integrantes estables mediante adiciones cada 7 días (ciclo de estimulación) de aAPC irradiada con y en presencia de IL-2 e IL-21 humana recombinante soluble. Por ejemplo, se pueden realizar 4 ciclos (28 días de cultivo continuo) para generar números clínicamente atractivos de células T que expresen de manera estable un CAR de interés. El uso de un sistema transposón/transposasa puede utilizarse para la administración de células T que expresan un CAR como se describe, por ejemplo, en Hackett y col.

II. Receptores de antígeno quimérico

Las realizaciones de la presente descripción implican la generación e identificación de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido receptor de antígeno quimérico específico de antígeno (CAR). En algunas realizaciones, el CAR se humaniza para reducir la inmunogenicidad (hCAR).

En algunas realizaciones, el CAR puede reconocer un epítopo compuesto por el espacio compartido entre uno o más antígenos. Los receptores de reconocimiento de patrones, tales como dectina 1, pueden usarse para derivar especificidad a un antígeno de carbohidrato. En ciertas realizaciones, la región de unión puede comprender regiones de determinación complementarias de un anticuerpo monoclonal, regiones variables de un anticuerpo monoclonal y/o fragmentos de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la región de unión es un scFv. En otra realización, un péptido (por ejemplo, una citocina) que se une a un receptor u objetivo celular puede incluirse como una posibilidad o sustituirse por una región scFv en la región de unión de un CAR. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se puede generar un CAR a partir de una pluralidad de vectores que codifican múltiples regiones scFv y/u otras proteínas de direccionamiento. Una región determinante de la complementariedad (CDR) es una secuencia corta de aminoácidos encontrada en los dominios variables de las proteínas receptoras de antígeno (porejemplo, inmunoglobulina y receptor de célula T) que complementa un antígeno y, por lo tanto, proporciona al receptor una especificidad para ese antígeno en particular. Cada cadena polipeptídica de un receptor de antígeno contiene tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Dado que los receptores de antígeno están compuestos típicamente por dos cadenas polipeptídicas, hay seis CDR por cada receptor de antígeno que pueden entrar en contacto con el antígeno; cada cadena pesada y ligera contiene tres CDR. Debido a que la mayoría de las variaciones de secuencia asociadas con las inmunoglobulinas y los receptores de células T se encuentran en las CDR, se hace referencia a veces a estas regiones como dominios hipervariables. Entre estos, CDR3 muestra la mayor variabilidad ya que está codificada por una recombinación de las regiones VJ (VDJ en el caso de la cadena pesada y la cadena ap de TCR).

Un ácido nucleico que codifica CAR generado mediante la presente descripción puede comprender uno o más genes humanos o fragmentos de genes para mejorar la inmunoterapia celular para pacientes humanos. En algunas realizaciones, se puede generar un ADNc de CAR completo o una región de codificación a través de los procedimientos descritos en esta invención. Las regiones o dominio de unión a antígeno pueden comprender un fragmento de las cadenas V^hy V^lde un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal humano particular, tal como los descritos en el documento de patente EE.UU 7,109,304. En algunas realizaciones, el scFv comprende dominios de unión a antígeno de un anticuerpo específico de antígeno humano. En algunas realizaciones, la región scFv es un scFv específico de antígeno codificado por una secuencia que está optimizada para el uso de codones humanos para la expresión en células humanas.

La disposición del dominio de unión a antígeno de un CAR puede ser multimérica, como un diacuerpo o multímeros. Los multímeros se pueden formar mediante el emparejamiento cruzado de las porciones variables de las cadenas ligeras y pesadas en lo que se puede denominar diacuerpo. La porción de bisagra del CAR puede en algunas realizaciones acortarse o excluirse (es decir, generar un CAR que solo incluye un dominio de unión a antígeno, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular). Se puede usar una multiplicidad de bisagras con la presente invención, por ejemplo, como se muestra en la tabla 1. En algunas realizaciones, la región bisagra puede tener la primera cisteína mantenida, o mutada por una prolina o una sustitución de serina, o truncarse hasta la primera cisteína. La porción Fc puede eliminarse del scFv usado como una región de unión a antígeno para generar CAR según la presente invención. En algunas realizaciones, una región de unión a antígeno puede codificar solo uno de los dominios Fc, por ejemplo, ya sea el dominio CH2 o CH3 de la inmunoglobulina humana. También se podría usar la región bisagra, CH2 y CH3, de una inmunoglobulina humana que se ha modificado para mejorar la dimerización. En algunas realizaciones, la porción de bisagra puede comprender o consistir en un péptido de 8 a 14 aminoácidos (por ejemplo, un péptido 12 A^a), una porción de CD8a o el IgG4 Fc. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno puede suspenderse de la superficie celular usando un dominio que promueve la oligomerización, tal como CD8 alfa. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno puede suspenderse de la superficie celular usando un dominio que es reconocido por el clon 2D3 de anticuerpo monoclonal (mAb) (se describe el clon 2D3 de mAb, por ejemplo, en Singh y col. 2008).

El endodominio o dominio de señalización intracelular de un CAR generalmente puede causar o promover la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de una célula inmune que comprende el CAR. Por ejemplo, el endodominio puede promover una función efectora de una célula T tal como, por ejemplo, actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas. La función efectora en una célula T virgen, de memoria o de tipo memoria incluye la proliferación dependiente de antígeno. Los términos “dominio de señalización intracelular” o “endodominio” se refieren a la porción de un CAR que puede transducir la señal de la función efectora y/o dirigir a la célula a realizar una función especializada.

En algunas realizaciones, un endodominio comprende la cadena zeta del receptor de células T o cualquiera de sus homólogos (porejemplo, eta, delta, gamma o épsilon), cadena MB1, B29, Fc RIII, Fc RI y combinaciones de moléculas de señalización, como CD3Z y CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40 y combinaciones de las mismas, así como otras moléculas y fragmentos similares. Se pueden usar porciones de señalización intracelular de otros miembros de las familias de proteínas activadoras, tales como F^cyRⁱII y F^ceRI. Se pueden encontrar ejemplos de estos dominios transmembrana e intracelular alternativos, por ejemplo, Gross y col. (1992), Stancovski y col. (1993), Moritz y col. (1994) Hwu y col. (1995), Weijtens y col. (1996) y Hekele y col. (1996), que se incorporan en esta invención como referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, un endodominio puede comprender el dominio intracelular humano CD3Z.

El dominio extracelular específico de antígeno y el dominio de señalización intracelular están unidos preferiblemente por un dominio transmembrana. Los dominios transmembrana que pueden incluirse en un CAR incluyen, por ejemplo, la bisagra Fc de IgG4 humana y las regiones Fc, el dominio transmembrana CD4 humano, el dominio transmembrana CD28 humano, el dominio CD3Z humano transmembrana o un dominio CD3Z humano mutado por cisteína, o un dominio transmembrana de una proteína de señalización transmembrana humana tal como, por ejemplo, el CD16 y CD8 y el receptor de eritropoyetina. Se proporcionan ejemplos de dominios transmembrana, por ejemplo, en la tabla 1.

En algunas realizaciones, el endodominio comprende una secuencia que codifica receptores coestimuladores tales como, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28 modificado, o un receptor coestimulador de CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 o 4-1BB (CD137). En algunas realizaciones, tanto una señal primaria iniciada por CD3 Z, una señal adicional proporcionada por un receptor coestimulador humano puede incluirse en un CAR para activar más eficazmente las células T transformadas, lo que puede ayudar a mejorar la persistencia en vivo y el éxito terapéutico de la inmunoterapia adoptiva. Como se observa en la tabla 1, el dominio de señalización del receptor endodominio o intracelular puede comprender la cadena zeta de CD3 solo o en combinación con un dominio de señalización coestimuladora Fcy RIII tal como, por ejemplo, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, 4-1BB. En algunas realizaciones, el endodominio comprende parte o la totalidad de uno o más de la cadena zeta TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FceRIy, ICOS/CD278, IL-2Rbeta/CD122, IL-2Ralpha/CD132, DAP10, DAP12. y CD40. En algunas realizaciones, se pueden incluir 1, 2, 3, 4 o más dominios citoplasmáticos en un endodominio. Por ejemplo, en algunos CAR se ha observado que al menos dos o tres dominios de señalización fusionados pueden tener un efecto aditivo o sinérgico.

En algunos aspectos, se puede generar un segmento de ácido nucleico aislado y un casete de expresión que incluye secuencias de ADN que codifican un CAR. Se puede usar una variedad de vectores. En algunas realizaciones preferidas, el vector puede permitir el suministro del ADN que codifica un CAR a inmunitario tal como las células T. La expresión de CAR puede estar bajo el control de un promotor eucariota regulado tal como, por ejemplo, el promotor MNDU3, el promotor CMV, el promotor EF1alpha o el promotor Ubiquitin. Además, los vectores pueden contener un marcador seleccionable, si no por otra razón, para facilitar su manipulación in vitro. En otras realizaciones, el CAR puede expresarse a partir de ARNm transcrito in vitro a partir de un molde de ADN.

Las moléculas de receptor de antígeno quimérico son recombinantes y se distinguen por su capacidad tanto para unir antígeno como transducir señales de activación a través de motivos de activación de inmunorreceptores (ITAM) presentes en sus colas citoplasmáticas. Las construcciones de receptores que utilizan un resto de unión a antígeno (por ejemplo, generado a partir de anticuerpos monocatenarios (scFv)) ofrecen la ventaja adicional de ser “universales” porque se unen al antígeno nativo en la superficie de la célula objetivo de forma independiente de HLA. Por ejemplo, una construcción scFv puede fusionarse con secuencias que codifican la porción intracelular de la cadena zeta del complejo CD3 (Z), la cadena gamma del receptor Fc y la tirosina quinasa sky (Eshhar y col. 1993; Fitzer-Attas y col.

1998). Se han documentado mecanismos efectores de células T redirigidos que incluyen el reconocimiento tumoral y la lisis por CTL en varios sistemas de antígeno-scFv: Z murino y humano (Eshhar y col. 1997; Altenschmidt y col. 1997; Brocker y col. 1998).

La región de unión al antígeno puede, por ejemplo, ser de un scFv humano o no humano. Un posible problema con el uso de regiones de unión a antígeno no humano, como los anticuerpos monoclonales murinos, es la funcionalidad reducida del efector humano y la capacidad reducida de penetrar en las masas tumorales. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña, y por lo tanto, las inyecciones repetidas de dichos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunes que conducen a reacciones de hipersensibilidad dañinas. Para los anticuerpos monoclonales basados en murinos, este efecto se ha denominado respuesta de anticuerpo humano anti-ratón (HAMA). En algunas realizaciones, la inclusión de anticuerpos humanos o secuencias scFv en un CAR puede dar como resultado poca o ninguna respuesta HAMA en comparación con algunos anticuerpos murinos. De manera similar, la inclusión de secuencias humanas en un CAR puede usarse para reducir o evitar el riesgo de reconocimiento o eliminación inmunomediado por las células T endógenas que residen en el receptor y podrían reconocer el antígeno procesado basado en HLA.

En algunas realizaciones, el CAR comprende: a) un dominio de señalización intracelular, b) un dominio transmembrana, c) una región de bisagra, y d) un dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular y el dominio transmembrana están codificados con el endodominio por un único vector que puede fusionarse (por ejemplo, mediante recombinación homóloga dirigida por transposón) con un vector que codifica una región bisagra y un vector que codifica una región de unión a antígeno. En otras realizaciones, la región de señalización intracelular y la región transmembrana pueden estar codificadas por dos vectores separados que están fusionados (por ejemplo, mediante recombinación homóloga dirigida por transposón). La porción específica de antígeno del CAR, también denominada dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno, se dirige selectivamente a CD19. La porción específica de antígeno del CAR es un scFv. En algunas realizaciones, un CAR puede co-expresarse con una citocina unida a la membrana, por ejemplo, para mejorar la persistencia cuando hay una baja cantidad de antígeno asociado a tumor. Por ejemplo, el cAr puede co-expresarse con IL-15 unida a membrana.

En algunas realizaciones, se puede introducir ADN desnudo o un vector adecuado que codifica un CAR en las células T de un sujeto (por ejemplo, células T obtenidas de un paciente humano con cáncer u otra enfermedad). Los procedimientos de transfección estable de células T por electroporación usando ADN desnudo son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento de patente n. ° 6,410,319. ADN no conjugado se refiere generalmente al ADN que codifica un receptor quimérico de la presente invención contenido en un vector de expresión plásmido en una orientación adecuada para la expresión. En algunas realizaciones, el uso de ADN desnudo puede reducir el tiempo requerido para producir células T que expresan un CAR generado a través de los procedimientos de la presente invención.

Alternativamente, puede usarse un vector viral (por ejemplo, un vector retroviral, un vector adenoviral, un vector viral adeno-asociado o un vector lentiviral) para introducir la construcción quimérica en las células T. Generalmente, un vector que codifica un CAR que se usa para transfectar una célula T de un sujeto generalmente no debe replicarse en las células T del sujeto. Se conoce una gran cantidad de vectores que están basados en virus, donde el número de copias del virus mantenido en la célula es lo suficientemente bajo como para mantener la viabilidad de la célula. Los vectores de ejemplo incluyen vectores pFB-neo (STRATAGENE®) así como vectores basados en VIH, SV40, EBC, HSV o BPV.

Una vez que se establece que la célula T transfectada o transducida es capaz de expresar un CAR como una proteína de membrana superficial con la regulación deseada y en un nivel deseado, se puede determinar si el receptor quimérico es funcional en la célula huésped para proporcionar Inducción de señal deseada. Posteriormente, las células T transducidas pueden reintroducirse o administrarse al sujeto para activar respuestas antitumorales en el sujeto. Para facilitar la administración, las células T transducidas pueden transformarse en una composición farmacéutica o en un implante apropiado para la administración en vivo, con vehículos o diluyentes apropiados, que son preferiblemente farmacéuticamente aceptables. Los medios para realizar tal composición o implante se han descrito en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)). Cuando corresponda, los linfocitos T transducidos que expresan un CAR se pueden formular en una preparación en forma líquida o semisólida, tal como una cápsula, solución, inyección, inhalador o aerosol, en las maneras convencionales para su vía de administración respectiva. Los medios conocidos en la técnica se pueden utilizar para evitar o minimizar la liberación y absorción de la composición hasta que alcance el tejido u órgano objetivo, o para asegurar la liberación cronometrada de la composición. Generalmente, se emplea preferiblemente una forma farmacéuticamente aceptable que no afecta a las células que expresan el receptor quimérico. Por lo tanto, de manera conveniente, los linfocitos T transducidos se pueden hacer en una composición farmacéutica que contiene una solución salina balanceada, preferentemente, la solución salina balanceada de Hanks o la solución salina normal.

IV. Células que presentan antígeno artificial

En algunos casos, las aAPC son útiles para preparar composiciones terapéuticas basadas en CAR y productos de terapia celular. Para obtener orientación general sobre la preparación y el uso de sistemas presentadores de antígeno, véanse, por ejemplo, los documentos de patente de EE.^uU. n. ° 6,225,042, 6,355,479, 6,362,001 y 6,790,662; La Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N. ° 2009/0017000 y 2009/0004142; y la Publicación Internacional N. ° W02007/103009)

Las aAPC pueden usarse para expandir las células T que expresan un CAR. Durante el encuentro con el antígeno tumoral, las señales entregadas a las células T por las células presentadoras de antígeno pueden afectar a la programación de las células T y su posterior eficacia terapéutica. Esto ha estimulado los esfuerzos para desarrollar células artificiales presentadoras de antígeno que permitan un control óptimo sobre las señales proporcionadas a las células T (Turtle y col. 2010). Además del anticuerpo o antígeno de interés, los sistemas aAPC también pueden comprender al menos una molécula auxiliar exógena. Se puede emplear cualquier número y combinación adecuados de moléculas auxiliares. La molécula auxiliar se puede seleccionar de moléculas auxiliares tales como moléculas coestimulantes y moléculas de adhesión. Las moléculas co-estimuladoras ejemplares incluyen CD70 y B7.1 (también llamadas B7 o CD80), que pueden unirse a las moléculas CD28 y/o CTLA-4 en la superficie de las células T, afectando así, por ejemplo, a la expansión de células T, diferenciación de Th1, supervivencia a corto plazo de células T y secreción de citocinas como la interleucina (IL) -2 (véase Kim y col. 2004). Las moléculas de adhesión pueden incluir glicoproteínas de unión a carbohidratos tales como selectinas, glicoproteínas de unión a transmembrana tales como integrinas, proteínas dependientes de calcio tales como cadherinas, y proteínas de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig) transmembrana de un solo paso, tales como moléculas de adhesión intercelular (ICAM) que promueven, por ejemplo, el contacto célula con célula o célula con matriz. Las moléculas de adhesión ejemplares incluyen LFA-3 e ICAM tales como ICAM-1. Las técnicas, procedimientos y reactivos útiles para la selección, clonación, preparación y expresión de moléculas auxiliares ejemplares, incluyendo las moléculas co-estimulantes y las moléculas de adhesión, se ejemplifican en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 6.225.042, 6.355.479 y 6.362.001.

Las células seleccionadas para convertirse en aAPC artificiales tienen preferiblemente deficiencias en el procesamiento intracelular de antígenos, el tráfico intracelular de péptidos y/o la carga intracelular de péptidos en moléculas de CMH de clase I o clase II, o son poiquilotérmicas (es decir, menos sensibles a la exposición a temperatura que las líneas celulares de mamíferos), o poseen tanto deficiencias como propiedades poiquilotérmicas. En algunos aspectos, las células seleccionadas para convertirse en aAPC también carecen de la capacidad de expresar al menos una contrapartida endógena (por ejemplo, molécula de CMH de clase I o clase II endógena y/o moléculas auxiliares endógenas como se describe anteriormente) de la molécula de CMH de clase I o clase II exógena y componentes moleculares auxiliares que se introducen en las células. Además, las aAPC artificiales, en algunos casos, retienen las deficiencias y las propiedades poiquilotérmicas que poseían las células antes de su modificación para generar las aAPC. Las aAPC ejemplares constituyen o se derivan de un transportador asociado con una línea celular deficiente en el procesamiento de antígenos (TAP), tal como una línea celular de insecto. Una línea de células de insecto poiquilotérmicas ejemplar es una línea celular de Drosophila, tal como una línea celular Schneider 2 (véase, por ejemplo, Schneider, 1972). Se proporcionan procedimientos ilustrativos para la preparación, el crecimiento y el cultivo de células Schneider 2 en las patentes de e E. UU. N.° 6.225.042, 6.355.479 y 6.362.001.

Los aAPC pueden estar sujetos a un ciclo de congelación-descongelación. Por ejemplo, los aAPC pueden congelarse poniendo en contacto un receptáculo adecuado que contiene los aAPC con una cantidad apropiada de nitrógeno líquido, dióxido de carbono sólido (hielo seco) o material similar a baja temperatura, de modo que la congelación ocurra rápidamente. Se descongelan entonces los aAPC congelados, ya sea retirando los aAPC del material a baja temperatura y exponiéndolos a condiciones de temperatura ambiente, o mediante un proceso de descongelación facilitado en el que se emplea un baño de agua tibia o una mano caliente para facilitar un menor tiempo de descongelación. Además, los aAPC pueden congelarse y almacenarse durante un período prolongado de tiempo antes de la descongelación. Los aAPC congelados también pueden descongelarse y, a continuación, liofilizarse antes de su uso posterior. Preferiblemente, los conservantes que podrían afectar negativamente a los procedimientos de congelación y descongelación, tales como el dimetilsulfóxido (DMSO), los polietilenglicoles (PEG) y otros conservantes, están ausentes en los medios que contienen aAPC que experimentan el ciclo de congelación y descongelación, o se retiran esencialmente, por ejemplo, mediante la transferencia de aAPC a medios que carecen esencialmente de tales conservantes.

En ciertas otras realizaciones, el ácido nucleico xenogénico y el ácido nucleico endógeno de aAPC pueden inactivarse por reticulación, de modo que esencialmente no ocurre crecimiento celular, replicación o expresión de ácido nucleico después de la inactivación. En una realización, los aAPC se inactivan en un punto posterior a la expresión de CMH y moléculas auxiliares exógenos, la presentación de tales moléculas sobre la superficie de los aAPCs y la carga de las moléculas de CMH presentadas con péptido o péptidos seleccionados. Por consiguiente, tales aAPC cargados con péptidos inactivados y seleccionados, aunque se vuelven esencialmente incapaces de proliferar o replicar, retienen la función de presentación del péptido seleccionado. Preferiblemente, la reticulación también procura aAPC que están esencialmente libres de microorganismos contaminantes, tales como bacterias y virus, sin disminuir sustancialmente la función de la célula presentadora de antígeno de los aAPC. Por tanto, la reticulación mantiene las importantes funciones de APC de los aAPC al tiempo que ayuda a aliviar las preocupaciones sobre la seguridad de un producto de terapia celular desarrollado utilizando los aAPC. Para los procedimientos relacionados con reticulación y aAPC, véase por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 20090017000.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por el inventor para funcionar correctamente en la práctica de la invención, y por lo tanto, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Generación de plásmidos de ADN de grado clínico.

El transposón SB, CoOpCD19RCD28^/pSBSO, expresa el codón humano optimizado (CoOp) CoOpCD19RCD28Z CAR de segunda generación bajo el promotor compuesto híbrido EF-1/HTLV (InvivoGen) compuesto por Factor de alargamiento-1a (EF-1a [Kim y col. 1990] y 59 regiones no traducidas del virus de la leucemia de células T humanas (HTLV) [Singh y col. 2011; Davies y col. 2010]. La derivación de este plásmido de ADN se describe en la figura S1. La SB transposasa, SB11, bajo el promotor de citomegalovirus (CMV) se expresa en cis del plásmido de ADN pCMV-SB11 (Singh y col. 2011; Singh y col. 2008). Ambos plásmidos fueron secuenciados en su totalidad y fabricados por el Centro de Biofabricación Clínica de Waisman (Madison, WI) usando kanamicina para la selección de la cepa bacteriana E. Coli DH5a.

Generación de plásmidos de ADN de recombinación específicos de sitio triple - EZ-Build-CARs

Usando la secuencia de ADN del CAR descrita anteriormente (CoOpCD19RCD28z/pSBSO), las partes CD19 ScFv, la bisagra IgG4 Fc y el dominio CD28 transmembrana y la porción citosólica conjugada con el dominio de señalización CD3Z fueron flanqueadas por sitios de recombinación lambda, sintetizados por Geneart (Life Technologies) como productos de PCR. Estas tres partes se insertaron individualmente en los plásmidos pDonors221 (por la enzima BP clonasa (ambas de Invitrogen). Los tres plásmidos se recombinaron con el plásmido de Bella Durmiente de recombinación específica de sitio triple por la enzima LR PLUS clonase (Invitrogen) generando el EZ-Build CD19CD28Z CAR en el formato scFv-B-andamio-C-dominio (s) de señalización (FIG. 1)

Recuento celular

La exclusión de azul de tripano se usó para distinguir células vivas de células muertas y se contó usando Cellometer (Nexecelom Bioscience) (Singh y col. 2011).

Aislamiento de PBMC

Los productos de leucaféresis de dos donantes sanos voluntarios varones se compraron de Key Biologics LLC (Memphis, TN). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante la adaptación del sistema Biosafe Sepax (Eysins, Suiza) para el trabajo de conformidad con cGMP. Brevemente, después de cerrar todas las abrazaderas del kit CS-900, se transfirieron asépticamente 100 ml de Ficoll (GE Healthcare) a través de jeringas de 60 ml a una bolsa de medio con gradiente de densidad (“bolsa de ficoll”) a través del conector Luer-lock y el tubo se selló en caliente con un sellador de mano (Sebra, Modelo # 2380). El kit se conectó a una bolsa de 1.000 ml que contenía tampón CliniMACS (PBS/EDTA, Miltenyi, Cat # 70026) con 20 ml de albúmina de suero humano al 25 % (HSA) (Baxter) (2 % v/v, tampón de lavado) para lavados, una bolsa de producto final [paquete de transferencia de 300 ml con acoplador (Baxter/Fenwal 4R2014)] y una bolsa de reactivo/sangre. Usando el protocolo de separación basado en gradiente de densidad (v126), el pistón de la jeringa se cargó en la cámara de la centrífuga y la cubierta de Sepax aAPC (clon # 4) para propagar selectivamente las células CAR T Las aAPC irradiadas con c se usaron para expandir numéricamente las células T genéticamente modificadas. Los aAPC descongelados de WCB se propagaron en CM durante hasta 60 días en bolsas de cultivo celular VueLife y se cosecharon utilizando el procedimiento de recolección Biosafe Sepax II. Brevemente, el kit CS-490.1 se conectó a una bolsa de salida de 300 ml (paquete de transferencia) a través de la conexión de bloqueo Luer. La cámara de separación se instaló en el pozo y el tubo se insertó en el sensor óptico y las llaves de paso se alinearon en posición T. Después de conectar la línea del sensor de presión, la bolsa del producto y las bolsas de sobrenadante/plasma se colgaron en el soporte. El protocolo modificado PBSCv302 se seleccionó del menú Sepax y el volumen del producto de entrada que se va a procesar (volumen inicial) se ajustó a #840 ml. Después de la validación y prueba del kit, se inició el procedimiento. Una vez finalizado, se retiraron las bolsas, se cerraron las abrazaderas y se retiró el kit. Las células de la bolsa del producto final se eliminaron asépticamente, se lavaron dos veces con medio de lavado (10 % de HSA en Plasmalyte) y se contaron. Se irradiaron aAPC (100 Gy) usando un radiador CIS BIO International (IBL-437 C # 09433) y se crioconservaron para su uso posterior en medios de crioconservación usando un congelador de velocidad controlada (Planer Kryo 750). El clon # 4 aAPC derivado de K562 cargado con anti-CD3 (OKT3) se usó para propagar las células T de control autólogas de control (CARneg) que no habían sufrido modificación genética. Los aAPC, obtenidos del cultivo, se incubaron durante la noche en X-Vivo 15 sin suero (cat # 04-744Q, Lonza) que contenía acetilcisteína al 0,2 % (Acetadote. Cumberland Pharmaceuticals) denominado medio de carga (LM). Al día siguiente, las células se lavaron, se irradiaron (100 Gy) usando un radiador 1000 Elite Cs-137 de célula Gamma (MDS Nordion), resuspendido en LM a una concentración de 106 células/ml junto con 1 mg/106 células de CD3 antihumano purificado de grado funcional (clon-OKT3, 16-0037-85, eBioscience) y se incubaron con agitación suave en un rotador 3-D (Lab-Line) a 4 °C durante 30 minutos. Después de tres lavados con LM, las células se usaron en experimentos o se congelaron en alícuotas en nitrógeno líquido en una capa de vapor para su uso posterior.

Fabricación de células CAR T

Las PBMC descongeladas se resuspendieron en (i) kit de células T humanas (cat # VPA-1002, Lonza; 100 pL para 2x107 células en una cubeta), con (ii) el plásmido de ADN (CoOpCD19RCD28/pSBSO) que codifica para el transposón CD19RCD28 CAR (15 pg de ADN superenrollado por 2x107 PBMC por cubeta), y (iii) el plásmido de ADN (pCMVSB11) que codifica para la transposasa SB11 (5 pg de ADN superenrollado por 2x107 PBMC por cubeta). Esta mezcla se transfirió inmediatamente a una cubeta (Lonza), se sometió a electroporación (definiendo el día de cultivo 0) usando Nucleofector II (Programa U-14, Amaxa/Lonza), reposó en medio completo RPMI al 10 % durante 2 a 3 horas, y después de un cambio de medio-medio, se incubó durante la noche a 37 °C, 5 % de CO ². Al día siguiente, las células se recolectaron, contaron, fenotiparon mediante citometría de flujo y se cultivaron conjuntamente con aAPC irradiado con c en una proporción de 1: 2 (célula CAR T: aAPC), que marcó el día de cultivo 1 y el comienzo de un ciclo de estimulación de 7 días. IL-21 (cat # AF-200-21, PeproTech) y 1L-2 (cat # NDC 65483-116-07, Novartis) se agregaron en un horario de lunes-miércoles-viernes en adelante del día 1 y el día 7 respectivamente. Las células NK pueden prevenir la expansión numérica de las células CAR T, especialmente si su crecimiento excesivo ocurre temprano en el proceso de cultivo de tejidos. Por lo tanto, se realizó un agotamiento de CD56 si las células CD3negCD56 $10 % usando cuentas CD56 (cat # 70206, Miltenyi Biotech, cuentas de 20 ml/107 células) en columnas LS (cat # 130-042 401, Miltenyi Biotech) en tampón CliniMACS que contiene un 25 % de HSA (80 ml/107 células).

Generación de células T de control CAR neg

Como control, las PBMC transfectadas simuladas 5x106 se cultivaron conjuntamente con el clon # 4 de aAPC derivado de K562 irradiado y cargado con anti-CD3 (OKT3) en una proporción de 1: 1 en un ciclo de estimulación de 7 días. Todos los cultivos se complementaron con IL-21 (30 ng/ml) desde el día 1 de cultivo en adelante, e IL-2 (50 U/ml) comenzando 7 días después del inicio del cultivo. Todas las citoquinas se agregaron posteriormente cada dos días Inmunofenotipo de células

Las células se tiñeron usando anticuerpos en 100 ml de tampón FACS (2 % de FBS, 0,1 % de azida de sodio) durante 30 minutos a 4 °C. La adquisición se realizó con FACSCalibur (BD Bioscience) y se analizó con FCS Express 3.00.0612

Ensayo de liberación de cromo

Las células T fueron evaluadas por su citotoxicidad en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas usando 51 células objetivo marcadas con Cr. Las células T se sembraron por triplicado a 1x105, 0,5x105, 0,25x105, 0,125x10 5 placa inferior (Costar). Después de la incubación, se recogieron 50 pL de sobrenadante en LumaPlate (Perkin Elmer), se leyó en TopCount NXT (Perkin Elmer) y se calculó el porcentaje de lisis específica por:

51Cr experimental liberado - 51Cr espontáneo liberado x 100

Máximo de 51Cr liberado - 51Cr espontáneo liberado

La liberación espontánea y máxima se determinó midiendo el cromo en el sobrenadante acondicionado de las células objetivo incubadas con CM o 0,1 % Triton X-100 (Sigma), respectivamente y 0,0625x105 células/pocillo con 5x103 células objetivo en un V de 96 pocillos (Manufacturee Novo Software, Thornhill, Ontario, Canadá).

Ejemplo 2

Generación de CD19 ⁺ CAR

Se generó un CD19 CAR utilizando los procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 1 (denominado procedimiento “EZ”). Estos CD19 CAR (CD19CAR) se compararon con un CD 19CAR de grado clínico (“CG”) generado mediante un procedimiento anterior.

Los datos mostraron que el sistema de recombinación de sitio triple generó un CD19CAR (EZ) similar al grado clínico CD19CAR (CG). Las huellas dejadas por los sitios de recombinación en los plásmidos no interfirieron en la expresión y función del CAR (FIGS. 2A-B).

Ejemplo 3

Generación de dominios transmembrana que contienen CAR (CD8, CD28) y dominios de señalización (CD28, 4-1BB)

Varios CAR probados han mostrado una expansión, citotoxicidad y citotoxicidad Th1 similares. CD19-BB-z ha mostrado una menor producción de citocinas Th2; en vivo, fue eficiente en el control de enfermedades en ratones (Terapia Molecular 17 (8): 1453-1464, 2009). Sin embargo, existe una preocupación debido al hecho de que las células persistieron in vitro sin estimulación antigénica

Los CAR en la clínica se muestran a continuación en la tabla 2. En algunas realizaciones, un CAR de la presente invención no tiene la construcción específica como se muestra en la tabla 2 a continuación. Alternativamente, en algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invención pueden usarse para generar otra variación de un CAR que tenga las características del CAR mencionadas a continuación en la tabla 2 que, sin embargo, es diferente del CAR que se está utilizando actualmente en la clínica.

Tabla 2: CAR en la clínica

Los diseños de construcción CAR específicos se ilustran en la FIG. 3. Como se muestra en la FIG. 3, se generó un esquema de varios CAR usando una combinación de CD19scfv, bisagra CD8a o tallo Fc IgG4, transmembrana CD8 (t M) o CD28 TM o CD137 TM y señalización a través del endodominio CD28 o CD137 junto con el endodominio CD3zeta.

Las construcciones CAR mostradas en la FIG. 3 se clonaron luego en plásmidos de Bella Durmiente que contenían etiquetas SIM y FRA para permitir el seguimiento en estudios de repoblación competitivos, cuando se amplificaron usando un cebador cVseq7 común. Los plásmidos de seguimiento de la Bella Durmiente se muestran en la FIG. 4. Las construcciones CAR mostradas en la FIG. 3 se electroporaron en células T usando Amaxa Nucleofector II y se cultivaron conjuntamente con aAPC durante 28 días en presencia de citocinas (IL2, IL-21). Se muestra la expresión de CAR el día después de la electroporación (día 1) y después de 28 días de co-cultivo con aAPC (día 28). Se muestran diagramas de puntos para CD3 y cAr , donde se usó Ab específico de CD3 y anti-CD 19scfv para distinguir las células T y CAR. Los resultados de expresión de CAR se muestran en la FIG. 5.

Las construcciones CAR mostradas en la FIG. 3 fueron evaluadas para la expresión de CAR a lo largo del tiempo durante 28 días y se muestra. Después de 21 días, la mayoría de los cultivos tenían >80 % de expresión de CAR. La cinética de expresión de CAR se muestra en la FIG. 6.

El porcentaje de expresión de células T CD4 y CD8 en cultivos nucleofeccionados con CAR de la fig. 3 se muestra después de 28 días de co-cultivo con aAPC. Estos resultados de fenotipo se muestran en la FIG. 7.

Después de 28 días de co-cultivo CAR Las células T (que expresan el CAR descrito en la figura 3) se evaluaron para determinar la expresión de marcadores relacionados con la memoria (CD45RA, CCR7, CD27), activación (CD69, HLA-DR), citotóxico (Perforina, Granzima B), agotamiento/senescencia (CD57, KLRG1, PD1) y adhesión (CD39, CD150). Los resultados para este fenotipo extendido se muestran en las FIGS. 8A-B.

Las células CAR T (que expresan el CAR descrito en la FIG. 3) se evaluaron para la expresión de CD3 Z usando transferencia Western. Los lisados celulares se procesaron en condiciones desnaturalizantes, se transfirieron y se midió la expresión de CD3 Z imer quimérico usando un mAb CD3Z antihumano primario de ratón y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP usando el sustrato SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity. Se observan bandas CD3Z quiméricas a 52, 71 y 78 kD en relación con el tamaño de las construcciones CAR. Estos resultados de transferencia western se muestran en la FIG. 9.

Las células T electroporadas con las construcciones CAR (descritas en la FIG. 3) se estimularon con K562 aAPC el día 1 y cada 7 días a partir de entonces durante 28 días. Al final de cada ciclo de estimulación, las células se contaron usando el procedimiento de exclusión de azul tripán y se fenotiparon para la expresión de CD3 y CAR. Los gráficos mostrados en la FIG. 10 representan recuentos de células inferidos para las células, CD3 y CAR T totales a lo largo del tiempo.

Se midió la expansión de las células. Doblar la expansión para las células totales (FIG. 11) y las células CAR (FIG.

12) T se calcularon los días 14, 21 y 28 de co-cultivo comparando los recuentos con el día 1 (después de la electroporación). Los resultados se muestran en la FIG. 11 y la FIG. 12.

La citotoxicidad se midió para las células T que expresan CAR (células CAR T). Las células CAR T (que expresan CAR descritas en la FIG. 3) fueron evaluadas por su citotoxicidad contra CD19 objetivos tumorales (Daudip ²m, NALM-6 y CD19 EL-4) en comparación con CD19 neg EL-4 en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas. Los resultados se muestran en la FIG. 13, la FIG. 14, la FIG. 15 y la FiG. 16.

Producción intracelular de IFN-y. Las células CAR T (que expresan las construcciones descritas en la FIG, 3) se incubaron con las células estimuladoras (CD19 y CD19 neg) en presencia de inhibidor del transporte de proteínas durante 4-6 h, fijadas, permeabilizadas y teñidas con mAb específico de IFN-y. Se usó PMA-Ionomicina como control positivo. Los resultados para la producción intracelular de IFN-y se muestran en la FIG. 17, la FIG. 18, la FIG. 19, y la FIG. 20.

PCR para transposasa SB11. El ADN aislado de las células T CAR (fig. 3) se amplificó usando cebadores específicos SB11 en un termociclador. Se usó GAPDH como gen de mantenimiento, y el plásmido pCMV-SB11 linealizado, el ADN genómico de las células Jurkat que expresan SB11 se usaron como controles positivos. Las células CAR neg se usaron (sin ADN) como controles negativos. Estos resultados de PCR se muestran en la FIG. 21.

El número de copias de CAR se midió usando PCR cuantitativa (qPCR). El número integrado de transgén CAR en células (de las construcciones CAR mostradas en la FIG. 3) se evaluó amplificando el ADN genómico usando cebadores y sondas específicas para el tallo de IgG4 Fc y repeticiones invertidas/directas (IR/DR). El gen RNAse P se usó como control interno, y la línea celular Jurkat que expresa una copia única de CAR se utilizó para generar una curva estándar. Los resultados se muestran en la FIG. 22.

A continuación, se midió la presencia o ausencia de crecimiento autónomo en las células CAR T. El crecimiento aberrante de las células CAR T (que expresa las construcciones CAR que se muestran en la FIG. 3) se controló y midió cultivando células T en ausencia de citocinas y aAPC. Las células se contaron cada 7 días y los porcentajes de células vivas/muertas (desde el día 1) se calcularon y se representaron gráficamente. Como se muestra en la FIG. 23, se observó que más del 80 % de las células T estaban muertas el día 14, lo que demuestra la falta de crecimiento autónomo.

Se podrían expresar varias CAR (> 80 %), expandidas (-1010) y fueron citotóxicas (-60 %, Daudi) en extensión similar. Los dominios de andamiaje (IgG4 o CD8a) se usaron para construir CAR y no afectaron a la expresión ni a la potencia. Los dominios transmembrana (CD8, CD28) no afectaron a la potencia. El dominio transmembrana 4-1BB (216) afectó a la expresión (anti-scFv Ab), pero no a la citotoxicidad y la producción de citocinas. La combinación de dominios de señalización, CD28 y 4-1BB no tuvo un efecto aditivo. Las células CAR T exhibieron memoria/fenotipo efector. Los CAR que contienen solo el dominio 4-1BB (212, 214, 217) tuvieron una mayor expresión de CCR7 en comparación con otros. Las células expresaron marcadores de memoria (CD27hi, CD45RAhi, CCR7lo), activación (CD69med, HLA-DRhi), citólisis (granzymehi, perforinlo) y adhesión (CD39hi, CD150lo), pero cantidades insignificantes de marcadores inhibitorios (CD57, PD1, KLRG1) fueron observados. Todos los CAR, incluidos los que contienen el dominio 4-1BB, carecían de transposasa SB11 y no se auto-proliferaron.

Ejemplo 4

Generación de CAR que contiene CD3-zeta

Los CAR que contienen CD3Z se proporcionan en este ejemplo. Un diagrama general del diseño de CAR se muestra en la FIG. 24) Como se muestra en la FIG. 24, se muestra una comparación del diseño de CAR (FIG. 24, derecha) con una molécula de anticuerpo (FIG. 24, izquierda).

Las secuencias CD3Z se muestran en la FIG. 25) La secuencia de CD3zeta y su isoterma se muestran en la FIG. 25. Los diseños CAR incluyeron CD3 zeta (isoterma 1) que forma uno de los restos de señalización de endodominio y tiene tres ITAM.

Las construcciones CAR específicas se muestran en la FIG. 26 y la FIG. 27) La FIG. 26 muestra un esquema de CAR específico de CD19 que tiene tallos largos (IgG4), medios (bisagra CD8a) y pequeños (IgG 12 aa) que señalizan a través de los endodominios CD28 o CD137. La nomenclatura de las moléculas CAR con diferentes tallos y señalización se muestra en la FIG. 27.

Se midió la expresión de CAR. La expresión de CAR (como se describe en la FIG. 26) se midió el día después de la electroporación (día 1) y después de 28 días de co-cultivo en aAPC (día 28). Los gráficos de puntos de CD3 y CAR (medidos por el mAb específico de CD19scfv) se muestran en la FIG. 28.

La cinética de expansión se midió para el CAR. Las células T electroporadas con construcciones CAR (mostradas en la figura 26) se cultivaron conjuntamente en aAPC en un ciclo de estimulación de 7 días. Las células fueron contadas y evaluadas para la expresión de CD3 y CAR. Los resultados se muestran en la FIG. 29 y la FIG. 30.

Se midió la citotoxicidad de las células CAR T. Al final de 28 días de co-cultivo las células CAR T (que expresan las construcciones mostradas en la FIG. 26) se evaluaron para determinar la citotoxicidad contra objetivos tumorales en un ensayo de liberación de cromo. Como se muestra en la FIG. 31, el porcentaje de citotoxicidad se midió en varias relaciones efector a objetivo para CD 19RCD28 (CAR 194) y CD19RCD137 (C^aR 217) contra los objetivos tumorales CD19 y CD19 neg. Como se muestra en la FIG. 32, se obtuvieron datos para el porcentaje de lisis de CD19 EL-4 por las células CAR T (que expresan construcciones CAR mostradas en la FIG. 26) en una relación E: T de 20: 1. Se midió el porcentaje de expresión de CD27, CD62L, CD28 y CCR7 en las células CAR T (que expresa las construcciones que se muestran en la FIG. 26), y los resultados se muestran en la FIG. 33.

La producción de citocinas intracelulares se midió para las células CAR T. Las células estimuladoras (CD19 y CD19 neg) se incubaron con las células CAR T (que expresan CAR mostrados en la FIG. 26) durante 4 horas en presencia de inhibidor de transporte de proteínas y teñidas con mAb IFN-^ye IL-2. La PMA-Ionomicina sirvió como control positivo y las células T solas sirvieron como control negativo. La FIG. 34 muestra el porcentaje de células productoras de IFN-Y después de la estimulación. La FIG. 35 muestra la descomposición de las células productoras de IFN-^yy/o IL-2 después de la incubación con el cóctel de estimulación celular (PMA-Ionomicina).

Las células CAR T se midieron por la presencia de ausencia de crecimiento autónomo. Las células CAR T (que expresan CAR descritas en la FIG. 26) se evaluaron por su falta de crecimiento aberrante en ausencia de estimulación externa (citocinas y aAPC) durante 18 días. Al final de los 18 días, más del 80 % de las células estaban muertas, mostrando falta de crecimiento no deseado. Como se muestra en la FIG. 36, se observó una falta de crecimiento autónomo.

El número de copia CAR se midió en las células CAR T. El número de copias de la molécula CAR integrada se evaluó usando cebadores/sondas específicas para las regiones IgG4-Fc e IR/DR mediante qPCR. Como se muestra en la FIG. 37, se observó el número de copia CAR integrado (de CAR mostrado en la FIG. 26) usando la sonda IR/DR. Como se muestra en la FIG. 38 y la FIG. 39, se proporciona una compilación de datos del número de copias CAR en forma de tabla y gráfica para construcciones CAR (para ambas construcciones CAR mostradas en la FIG. 3 y construcciones CAR mostradas en la FIG. 26) como se probó en dos experimentos independientes (P491; C714 y GCR357861).

Estos datos muestran que los CAR con varios espaciadores pueden expresarse y crecer in vitro en el sistema de cultivo como se describe en esta invención. Se observó que todos los CAR tenían una expresión CAR similar. La citotoxicidad máxima de CD19 EL-4 se observó en CAR con una región de bisagra CD8. Se observó una expresión similar de CD62L y CD28 en todos los CAR probados. Se observó una alta frecuencia de integración medida por el número de copias CAR en todos los CAR, excepto CAR que contenía el tallo IgG4-Fc. Se observó una falta de crecimiento autónomo y SB11 por PCR. Al contrario de informes anteriores, la inclusión de un separador 12aa en el CAR no confirió una funcionalidad mejorada en estos estudios.

Ejemplo 5

Montaje rápido de CAR de componentes principales

Los inventores generaron un CAR específico de CD19 que se activa a través de CD28/CD3-zeta quimérico utilizando la plataforma EZ CAR en paralelo con células CD19RCD28mZ CAR T de grado clínico (CG CAR). Ambas secuencias de CARD CD28/CD3-Z Clinical y EZ CAR CD19RCD28mZ de grado clínico se insertaron en vectores de transposón de Bella Durmiente y se electroporaron en células T. Después de la electroporación, las células T se cultivaron en presencia de células presentadoras de antígeno artificiales CD19 (también llamadas células activadoras y propagadoras, o AaPC) para la expansión específica de antígeno de las células T. La expresión de los CAR en la superficie de las células T se midió cada semana mediante citometría de flujo (expresión Fc ), que muestra una expresión CAR similar en las células CD19 CAR T de grado clínico y las células EZ CD19 CAR T. También se realizó un ensayo de liberación de cromo (CRA) para evaluar la función de destrucción de las células T CD19 CAR generadas por la plataforma EZ CAR contra las células tumorales. Después de 4 horas de incubación, se observó que el porcentaje de lisis celular específica era del 52 % por las células EZ CAR T y del 49 % por las células CG CAR T. Estos resultados demuestran que las células CAR T funcionales se generaron usando estos procedimientos. Los inventores realizaron a continuación una producción rápida de CAR utilizando los procedimientos descritos anteriormente en combinación con una biblioteca de plásmidos que contienen los siguientes tres componentes de una molécula CAR: bisagras (i) anti-CD 19 scFv (ii) 5 con diferentes tamaños (grande - IgG4a e IgG4AEQ, medio - CD8a, pequeño- t-20AA y t-12AA) y (iii) diferentes combinaciones de 7 dominios de señalización (CD27, CD28, CD28AY 173 ^ F 173, CD134, CD137, CD278) con el dominio CD3Z. La transfección de células HEK 293 con plásmido que contiene el transgen CAR se utilizó para seleccionar 27 construcciones CAR diferentes para asegurar la expresión de la proteína CAR en la superficie celular. La prueba de alto rendimiento de moléculas CAR individuales se llevó a cabo utilizando el iQue ™ Screener (Intellicyt, Albuquerque, NM), un citómetro de flujo de alto rendimiento, donde se realizan ensayos citotóxicos utilizando células objetivo diseñadas que expresan un reportero de granzima B fluorescente o GFP. Los resultados se muestran en las FIGS. 40A-E.

Se realizaron experimentos adicionales para seleccionar las moléculas CAR utilizando IntelliCyt's iQue ™. iQue ™ utiliza citometría de flujo de alto rendimiento, una tecnología complementaria que genera información al estudiar grandes poblaciones utilizando capacidades de multiplexación y análisis de célula por célula. Los inventores adaptaron esta tecnología para informar sobre el potencial terapéutico de las células T modificadas con paneles de CAR. Las células T de los pocillos pueden teñirse para la viabilidad, así como las señales de activación (por ejemplo, sobrerregulación de CD25), liberación de citoquinas y destrucción. Por lo tanto, los inventores adaptaron el iQue Screener y aprovecharon su capacidad para realizar la detección multiplexada de citocinas basadas en cuentas y ensayos basados en células. Los resultados obtenidos indican que esta tecnología puede usarse para probar una gran cantidad de células CAR T diferentes generadas por la plataforma EZ CAR. Los datos se generaron utilizando iQue™ de IntelliCyt, donde se evaluaron 2 poblaciones de células CAR T en cuanto a su capacidad para matar células objetivo. Los resultados se muestran en las FIGS. 41A-B y la FIG. 42. Estos resultados demuestran que las moléculas de CAR estaban activas y que el procedimiento iQue™ puede usarse efectivamente para evaluar la actividad de CAR.

REFERENCIAS

Publicación de EE.UU. N. ° 2009/0017000

Publicación de EE.UU. N. ° 2009/0004142

Patente de EE.UU. N. ° 6.225.042

Patente de EE.UU. N. ° 6.355.479

Patente de EE.UU. N. ° 6.362.001

Patente de EE.UU. N. ° 6.410,319

Patente de EE.UU. N. ° 6.790.662

Patente de EE.UU. N. ° 7.109.304

W02007/103009

Ahmed y Cheung, FEBS Lett. 201421 de enero; 588 (2): 288-97.

Altenschmidt et al., La transferencia adoptiva de linfocitos T activados y dirigidos in vitro da como resultado una regresión total del tumor, J Immunol. 1 de diciembre de 1997; 159 (11): 5509-15.

Audet y col., Sci Rep. 6 de noviembre de 2014; 4: 6881.

Berry y col. Inmunoterapia adoptiva para el cáncer: la próxima generación de células inmunes modificadas genéticamente. Antígenos Tisulares. 2009 Oct; 74(4): 277-89.

Brocker y col. Adv. Immunol., 68: 257, 1998.

Curtin y col., MAbs. 20152 de enero; 7 (1): 265-75.

Czerwinski y col., Drug Metab Dispos. enero de 2015; 43 (1): 42-52.

Davies JK, Singh H, Huís H, Yuk D, Lee DA, y col. (2010) Combinando la redirección y aloanergización de CD19 para generar células T humanas específicas de tumor para la terapia con células alogénicas de tumores malignos de células B. Cancer Res 70: 3915-3924.

de Weers y col., J Immunol. 2011 1 de febrero: 186 (3): 1840-8.

Duong y col., (2013) Ingeniería de la función de las células T utilizando receptores de antígeno quimérico identificados mediante una estrategia de biblioteca de ADN. PLOS ONE 8 (5): e63037.

Eshhar y col., Activación específica y focalización de linfocitos citotóxicos a través de cadenas simples quiméricas que consisten en dominios de unión a anticuerpos y las sub-unidades gamma o zeta de la inmunoglobulina y los receptores de células T. Proc Natl Acad Sci U S A.; 90 (2): 720-4, 1993.

Eshhar, cuerpos T específicos de tumor: hacia la aplicación clínica. Cancer Immunol Immunother. noviembrediciembre de 1997; 45 (3-4): 131-6. 1997

Fitzer-Attas y col., Aprovechar las tirosina quinasas de la familia Syk como dominios de señalización para la cadena quimérica única de los receptores de dominio variable: diseño óptimo para la activación de células T. J Immunol. 1 de enero de 1998; 160 (1): 145-54. 1998

Funakoshi et al., Cancer Treat Rev. dic 2014; 40 (10): 1221-9.

Gerber y col., Clin Cancer Res. 1 de noviembre de 2011; 17 (21): 6888-96.

Goldberg y col., J Clin Oncol. 10 de mayo de 2014; 32 (14): 1445-52.

Gross et al., Expresión de moléculas quiméricas del receptor de célula T de inmunoglobulina como receptores funcionales con especificidad de tipo anticuerpo. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 86: 10024-10028, 1989.

Gross y col. (1992) Dotando a las células T de especificidad de anticuerpos utilizando receptores de células T quiméricas. fAs EB J. dic 1992; 6 (15): 3370-8.

Hackett y col., Un sistema de transposón y transposasa para aplicación humana, Mol Ther. 2010 abr; 18 (4): 674-83). Hekele y col. Retraso del crecimiento de tumores por transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos reprogramados por scFv específico de CD44v6: zeta-quimera. Int. J. Cancer (Pred. 9 de octubre de 1996; 68 (2): 232-8, 1996.

Huls y col., Aplicación clínica de la Bella Durmiente y las células presentadoras de antígeno artificial para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférico. J. Vis. Exp., doi:10.3791/50070, 2013.

Huls y col. “Aplicación clínica de la Bella Durmiente y las células presentadoras de antígeno artificial para modificar genéticamente las células T de la sangre periférica y del cordón umbilical” J Vis Exp. 1 de febrero de 2013; (72): e50070.

Humblet-Baron y Baron, Immunol Cell Biol. 201510 de febrero. Doi: 10.1038/icb.2014.120.

Hwu y col. (1995) Actividad antitumoral in vivo de células T redirigidas con genes quiméricos de anticuerpos/receptores de células T. Cancer Res. 1 de agosto de 1995; 55 (15): 3369-73.

Ikeda y col., Clin Cancer Res. 15 de junio de 2009; 15 (12): 4028-37.

Jabbour y col., Am J Hematol. 18 de noviembre de 2014.

Kaufmann y col., Hum Pathol. Diciembre de 1997; 28 (12): 1373-8.

Kaufman y col., Br J Haematol. Noviembre de 2013; 163 (4): 478-86.

Kim DW, Uetsuki T, Kaziro Y, Yamaguchi N, Sugano S (1990) Uso del promotor alfa del factor de alargamiento humano 1 como un sistema de expresión versátil y eficiente. Gene 91: 217-223.

Kim et al., 2004, Nature, vol. 22 (4), págs. 403-410.

Kim y col., Immunology. Agosto de 2010; 130 (4): 545-55.

Kong y col., Leuk Res. Noviembre de 2014; 38 (11): 1320-6.

Krebs y col., Las células T que expresan un receptor de antígeno quimérico que se une a las proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis B controlan la replicación del virus en ratones. Gastroenterología Agosto de 2013; 145 (2): 456 65.

Le Garff-Tavernier y col., Haematologica. 31 de diciembre de 2014.

Lennard S., Protocolos estándar para la construcción de bibliotecas scFv. Procedimientos Mol Biol. 2002; 178: 59-71. Leung. Base de datos de agentes de contraste e imágenes moleculares (MICAD), Bethesda (MD): Centro Nacional de Información Biotecnológica (EE.UU.); 2004-2013. 25 de marzo de 2010

Leung 2011, anticuerpo monoclonal quimérico IRDye800CW-anti-CD105 TRC105. Base de datos de agente de contraste e imágenes moleculares (MICAD). Bethesda (MD): Centro Nacional de Información Biotecnológica (EE.UU.); 2004-2013. 01 de diciembre de 2011

Maiti y col., Sistema de la Bella Durmiente para redirigir la especificidad de las células T para aplicaciones humanas. J Immunother. 36 (2): 112-23, 2013.

Manero y col., Haematologica. Febrero de 2013; 98 (2): 217-21.

Terapia Molecular 17 (8): 1453-1464, 2009.

Moritz y col. (1994) Linfocitos T citotóxicos con una especificidad de reconocimiento injertada para células tumorales que expresan ERBB2. Proc Natl Acad Sci U S A. 10 de mayo de 1994; 91 (10): 4318-22.

Patel y col., Anticancer Res. 2008 septiembre-octubre; 28 (5A): 2679-86.

Qiu y col., PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6 (3): e1575.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mack, ed. (1980)

Rushworth y col., (2014) “Células que presentan antígenos artificiales universales para propagar selectivamente las células T que expresan el receptor de antígeno quimérico independiente de la especificidad” J Immunother. Mayo; 37 (4): 204-13.

Sarup y col., Mol Cancer Ther. 2008 Oct; 7 (10): 3223-36.

Schneider, J. Embryol. Exp. Morph 1972 Vol. 27, págs. 353-365

Schultz-Thater y col., Br J Cancer. Julio de 2000; 83 (2): 204-8.

Shin y col., Immune Netw. Abril de 2011; 11 (2): 114-22.

Singh et al., Redireccionamiento de la especificidad de las poblaciones de células T para CD19 utilizando el sistema de la Bella Durmiente. Cancer Res., 68: 2961-2971, 2008.

Singh H, Figliola MJ, Dawson MJ, Huls H, Olivares S, y col. (2011) La reprogramación de las células T específicas de CD19 con señalización de IL-21 puede mejorar la inmunoterapia adoptiva de las neoplasias de linaje B. Cancer Res 71: 3516-3527.

Singh y col. “Una nueva estrategia para la terapia génica utilizando la Bella Durmiente para modificar genéticamente las células T de grado clínico para atacar a CD19”. Immunol Rev. enero de 2014; 257 (1): 181-90.

Singh et al., “Fabricación de células T usando el sistema de la Bella Durmiente para forzar la expresión de un receptor de antígeno quimérico específico de CD19”. Cancer Gene Ther. 16 de enero de 2015.

Stancovski y col. (1993)

Stynen y col., pared celular fungular y respuesta inmune, NATO ASI Series Volumen 53, 1991, pp 181-193.

Sun y col., Cell Mol Immunol. junio de 2007; 4 (3): 209-14.

Turtle y col., “Células artificiales presentadoras de antígeno para su uso en inmunoterapia adoptiva” Cancer J. 2010 Jul-Ag; 16 (4): 374-81.

Verel, Int J Cáncer. 20 de mayo de 2002; 99 (3): 396-402.

Vincent and Samuel, Journal of Immunological Methods, Volumen 165, Número 2, 15 de octubre de 1993, páginas 177-182.

Wang y col., Immunology. Febrero de 2015; 144 (2): 254-62.

Weijtens y col. (1996) Los linfocitos T humanos redireccionados por el gen Ig/gamma de cadena sencilla producen citocinas, específicamente lisan las células tumorales y reciclan la capacidad lítica. J Immunol. 15 de julio de 1996; 157 (2): 836-43.

Wieczorek y col., Células T genéticamente modificadas para el tratamiento de enfermedades malignas. Transjus Med Hemother. Diciembre de 2013; 40 (6): 388-402.

Winiarska y col., MAbs. 2014; 6 (5): 1300-13.

Zhuang y col., Cancer Cell Int. 30 de noviembre de 2014; 14 (1): 109.

Zhang y col., Angiogénesis. 2002; 5 (1-2): 35-44.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende un receptor de antígeno quimérico codificado por una secuencia de ADN según el SEQ ID NO: 5.

2. Una célula T transformada que expresa el polipéptido de la reivindicación 1.

3. La célula T transformada de la reivindicación 2, donde la célula es una célula inmortalizada.

4. La célula T transformada de la reivindicación 2, donde la célula T es una célula T alfa beta, una célula T gamma delta o una célula NKT.

5. Una preparación farmacéutica que comprende la célula T transformada de cualquiera de las reivindicaciones 2-4.

6. Un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende una secuencia según el SEQ ID NO: 5.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 6, donde el ácido nucleico está comprendido en una célula T.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 7, donde la célula T es una célula T alfa beta, una célula T gamma delta, una célula NKT o una célula T derivada de una célula pluripotente.

9. Un vector de transposón de la Bella Durmiente que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende una secuencia según el SEQ ID NO: 5.

10. Una célula T que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico codificado por una secuencia según el SEQ ID NO. 5.

11. Una célula T que comprende un vector de transposón de la Bella Durmiente que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 6.

12. La célula T de la reivindicación 10 que comprende además una citocina unida a membrana.

13. La célula T de la reivindicación 12, donde la citocina unida a la membrana es IL-15 unida a la membrana.

14. La célula T según las reivindicaciones 10-13 para uso en el tratamiento del cáncer.

15. La célula T para uso según la reivindicación 14, donde el cáncer es un tumor maligno de células B o linfoma.