ES2764699T3

ES2764699T3 - Molécula de miARN definida por su fuente y sus usos diagnósticos y terapéuticos en enfermedades o afecciones asociadas a la TEM

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Publication number: ES2764699T3
Application number: ES17165861T
Authority: ES
Inventors: Roeland Quirinus Jozef Schaapveld; Gerardus Wilhelmus Christiaan Theodoor Verhaegh; Jacobus Antonius Schalken; Puijenbroek Andreas Alphons Franciscus L Van; Willemijn Maria Gommans; Sanne Weijzen
Original assignee: Interna Technologies BV
Current assignee: Interna Technologies BV
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2020-06-04
Anticipated expiration: 2031-03-04

Abstract

Molécula de miARN-520f o mimético o isomiR de la misma, o fuente de la misma, donde dicha fuente de dicha molécula de miARN o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o composición que comprende dicha molécula de miARN-520f, mimético o isomiR o fuente de la misma, para usar en el tratamiento, la reversión, la curación y/o el retraso de un cáncer asociado a la TEM mediante la inducción de un proceso de TME, donde dicha molécula de miARN-520f comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y/o tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 19, 118 y/o 119 y tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos o más.

Description

DESCRIPCIÓN

Molécula de miARN definida por su fuente y sus usos diagnósticos y terapéuticos en enfermedades o afecciones asociadas a la TEM

Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a los usos terapéuticos de una molécula de miARN definida por su fuente más adelante en un cáncer asociado a la TEM (transición epitelio-mesenquimal). La divulgación se refiere a los usos diagnósticos y terapéuticos de una molécula de miARN definida por su fuente más adelante en enfermedades y afecciones asociadas a la TEM.

Antecedentes de la invención

[0002] La mayoría de los tumores sólidos son de origen epitelial (es decir, carcinomas). Se ha observado una pérdida de marcadores celulares epiteliales (por ejemplo, la E-cadherina) y una ganancia de marcadores celulares mesenquimales (por ejemplo, la N-cadherina y la vimentina) en las muestras de tumores de pacientes, incluidas de cáncer de próstata (1). Las células cancerosas se pueden desdiferenciar a través de esta denominada transición epitelio-mesenquimal (TEM). Durante la TEM, se descomponen las uniones celulares intercelulares, dando así a las células tumorales la capacidad para migrar e invadir el tejido circundante o a través de las paredes de los vasos sanguíneos. Se piensa que tales cambios fenotípicos juegan un papel importante en la diseminación de la enfermedad y en última instancia llevan a la progresión de la enfermedad, que está a menudo asociada a un mal pronóstico para los pacientes (2;3).

[0003] La pérdida de expresión de E-cadherina se considera una marca distintiva molecular de la TEM. La TEM en células tumorales resulta de una reprogramación transcripcional de la célula. En particular se ha demostrado que la represión transcripcional del promotor del gen de la E-cadherina (CDH1) desencadena el fenotipo de la TEM. La proteína E-cadherina es una de las moléculas de cadherina más importante de mediación de contactos célulacélula en células/tejidos epiteliales. El CDH1 se reprime por la unión de los represores transcripcionales, SNAI1, SNAI2, TCF3, TW iSt , ZEB1, ZEB2 o KLF8 (4-7), a tres denominadas cajas E en la región promotora proximal de CDH1 (8-10). La inhibición de la unión de estos represores al promotor del CDH1 puede revertir la TEM, también llamada transición mesenquimal-epitelial (TME), e inhibe la invasión de las células tumorales y la progresión tumoral (11).

[0004] Recientemente, se ha demostrado que la expresión de varios microARN está relacionada con la TEM (12). Mediante la comparación de perfiles de expresión de microARN de células con un fenotipo epitelial y mesenquimal (inducido), miembros de la familia miR-200 (miR-141, miR-200a/b/c y miR-429) y miR-205 se identificaron como miR asociados a la TEM (13-15). Se demostró que los genes diana de los microARN asociados a la TEM de la familia miR-200 son ZEB1 y ZEB2. Todavía no se han encontrado microARN dirigidos contra los otros represores transcripcionales conocidos de CDH1 (es decir, SNAI1, SNAI2, TCF3 y TWIST1). La identificación de estos microARN en un perfil de expresión de células que han experimentado una TEM no significa necesariamente que estos microARN estén implicados durante la TEM.

[0005] Actualmente no hay ningún medicamento conocido eficaz que se pueda usar para prevenir, tratar, revertir y/o retrasar específicamente una enfermedad o afección asociada a la TEM en un sujeto. Los únicos tratamientos estándar comprenden quimioterapia, radioterapia, cirugía. Particularmente, la identificación de pacientes que desarrollarán o ya han desarrollado metástasis y/o el tratamiento temprano de pacientes con tumores que expresan marcadores de TEM, tal como la expresión de cadherina mesenquimal y/o una menor expresión de E-cadherina, podrían contribuir a una mejor supervivencia libre de enfermedad y general. Por lo tanto, hay todavía una necesidad de marcadores diagnósticos para la TEM y de nuevos tratamientos de enfermedades o afecciones asociadas a la TEM.

Descripción de la invención

[0006] En un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de miARN-520f o un mimético o un isomiR de la misma, o una fuente de la misma, donde una fuente de dicha molécula de miARN o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 1,

o una composición que comprende dicha molécula de miARN-520f, mimético o isomiR o fuente de la misma, para usar en el tratamiento, la reversión, la cura y/o el retraso de un cáncer asociado a la TEM mediante la inducción de un proceso de TME,

donde dicha molécula de miARN-520f comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y/o tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 19, 118 y/o 119 y tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos o más. En un aspecto de la divulgación, se proporciona una molécula de miARN o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una composición que comprende dicha molécula de miARN o equivalente de la misma o dicha fuente de la misma para el uso como un medicamento para la prevención, el tratamiento, la reversión, la cura y/o el retraso de una enfermedad o una afección asociada a la TEM.

[0007] Los microARN (miARN) son ARN pequeños de 17-25 nucleótidos, que funcionan como reguladores de la expresión génica en eucariotas. Los miARN se expresan inicialmente en el núcleo como parte de transcritos primarios largos llamados miARN primarios (pri-miARN). Dentro del núcleo, los pri-miARN son digeridos parcialmente por la enzima Drosha, para formar miARN precursores en horquilla (pre-miARN) de 65-120 nucleótidos de largo que se exportan al citoplasma para un procesamiento adicional por Dicer en miARN más cortos maduros, que son las moléculas activas. En los animales, estos ARN cortos comprenden una región "semilla" 5' proximal (nucleótidos 2 a 8) que parece ser el determinante primario de la especificidad de emparejamiento del miARN con la región 3' no traducida (3'-UTR) de un ARNm diana. Una explicación más detallada se da en la parte dedicada a las definiciones generales.

[0008] Cada una de las definiciones dadas a continuación sobre una molécula de miARN, un equivalente de miARN o una fuente de miARN debe usarse para cada uno de los miARN identificados o equivalente de miARN o fuentes de miARN de esta solicitud: miARN-124-1, miARN-206, miARN181a-1, miARN-141, miARN-200a, miARN-200b, miARN-200c, miARN-429, miARN-205, miARN518b, miARN520f, miARN524 y fuentes de las mismas, incluida además una fuente que comprende al menos 80 nucleótidos y que comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1. Las secuencias preferidas maduras (según se identifica en la tabla 3), semilla (según se identifica en la tabla 5), isomiR (según se identifica en la tabla 6) o fuente (según se identifica en las tablas 2 (precursor de ARN) o 4 (ADN codificante de un precursor de ARN)) de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma se identifican, respectivamente, en las tablas correspondientes.

[0009] En todo el texto de la solicitud, a menos que se indique lo contrario, un miARN también se puede llamar una molécula de miARN, un miR o un equivalente del mismo o una fuente o un precursor del mismo. Un equivalente preferido es uno maduro, un isomiR o un mimético. Cada secuencia identificada aquí se puede identificar como la SEQ ID NO usada en el texto de la solicitud o correspondiente a la SEQ ID NO en el listado de secuencias.

[0010] En el contexto de la invención una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma puede ser un miARN sintético o natural o recombinante o maduro o una parte de un miARN maduro o un miARN humano o derivado de un miARN humano como se define posteriormente en la parte dedicada a las definiciones generales. Una molécula de miARN humano es una molécula de miARN que se encuentra en una célula, tejido, órgano o líquidos corporales humanos (es decir, una molécula de miARN humano endógeno). Una molécula de miARN humano también puede ser una molécula de miARN humano derivada de una molécula endógena de miARN humano por sustitución, deleción y/o adición de un nucleótido. Una molécula de miARN o un equivalente o un mimético de la misma puede ser una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria.

[0011] En el contexto de la divulgación, una molécula de miARN preferida o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma es tal que una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende o consiste en al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 se define además preferiblemente de la siguiente manera.

La SEQ ID NO: 1 es la siguiente:

UCAnGCUGUGnCCCUnnAnAGGGAAGCnCUUUCUnUnGUCnnAAnGAAAAnnA

nGnGCUnCCnUUUnGAGnnUUACnGUUUG

[0012] En el motivo representado por la SEQ ID NO: 1, n puede ser cualquier base A, U, C o G.

[0013] En otra forma de realización preferida, se proporciona una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma de modo que una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, la identidad es al menos del 99% o el 100%. En una forma de realización preferida, dicha fuente es un precursor de una molécula de miARN-520f o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma. Las fuentes y los precursores preferidos se definen más adelante aquí. Por lo tanto, la divulgación se refiere a una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma o una fuente de la misma o una composición que comprende dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma, tal y como se define en los párrafos siguientes, donde la molécula de miARN es un miARN-518b, miARN-520f y/o miARN-524 o un equivalente o un mimético o un isomiR de los mismos o una fuente de los mismos. La molécula de miARN, el equivalente, el mimético y el isomiR preferidos se definen más adelante aquí.

[0014] En una forma de realización preferida, un equivalente de un miARN-520f es una molécula de miARN humano. Una molécula de miARN humano es una molécula de miARN que se encuentra en una célula, tejido u órgano humano. Una molécula de miARN humano también puede ser una molécula de miARN humano derivada de una molécula endógena de miARN humano por sustitución, deleción y/o adición de un nucleótido. En este contexto, un "nucleótido" puede significar 1, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos. Un equivalente preferido de un miARN-520f no es una molécula de miARN mml-mir-519a o mml-mir-520c según se identifican en lo sucesivo. Una fuente o precursor preferidos de una molécula de miARN520f no es una fuente o un precursor de una molécula de miARN mml-mir-519a o un mml-mir-520c según se identifican en lo sucesivo. Las secuencias maduras y precursoras de mml-mir-519a negadas preferidas se identifican como SEQ ID NO: 108 y 109. Las secuencias maduras y precursoras de mml-mir-520c preferidas se identifican como SEQ ID NO: 110 y 111.

[0015] En una forma de realización preferida, una molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma (la tabla 5 muestra una secuencia semilla preferida de cada una de las moléculas de miARN identificadas aquí). Preferiblemente en esta forma de realización, una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o isomiR de la misma puede ser de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 a 30 nucleótidos de longitud y comprende más preferiblemente al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma. Aún más preferiblemente, una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o isomiR de la misma tiene de 15 a 28 nucleótidos de longitud y comprende más preferiblemente al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla. Aún más preferiblemente, una molécula de miARN tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos o más y comprende preferiblemente al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla. En cada una de estas formas de realización, una molécula de mirARN o un equivalente o un mimético o isomiR de la misma puede comprender los 7 nucleótidos de la secuencia semilla según se identifica en la tabla 5. Aún más preferiblemente, una molécula de miARN tiene una longitud de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos o más y comprende los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla según se identifica en la tabla 5.

[0016] Por consiguiente, una molécula de miARN-520f preferida o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y más preferiblemente tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos o más.

[0017] Por consiguiente, una molécula de miARN-518b preferida o equivalente o mimético o isomiR de la misma según la divulgación comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 103 y más preferiblemente tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos o más.

[0018] Por consiguiente, una molécula de miARN-524 preferida o equivalente o mimético o isomiR de la misma según la divulgación comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 106 o 107 y más preferiblemente tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos o más.

[0019] En otra forma de realización preferida, una molécula de miARN o un equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en una secuencia semilla dada en relación con miARN-520f según se identifica en la tabla 5 como SEQ ID NO: 87-107 y tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia madura completa (la tabla 3 muestra secuencias maduras preferidas de cada uno de los miARN identificados aquí). Preferiblemente, la identidad es al menos de un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más alta, tal como un 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

[0020] Alternativamente, preferiblemente en esta forma de realización, una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma tiene una longitud de no más de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos, comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en una secuencia semilla dada en relación con miARN-520f según se identifica en la tabla 5 como SEQ ID NO: 87-107 y tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia madura completa según se identifica en la tabla 3 como SEQ ID NO: 2-21. Preferiblemente, la identidad es de al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

[0021] En otra forma de realización preferida, un isomiR de una molécula de miARN tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de isomiR completa (la tabla 6 muestra isomiR preferidos de cada uno de los miARN maduros identificados como SEQ ID NO: 118-162). Preferiblemente, la identidad es de al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más alta, tal como un 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Preferiblemente en esta forma de realización, un isomiR de una molécula de miARN o un equivalente o un mimético de la misma tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos o más.

[0022] La identidad se puede evaluar usando varias vías tal y como se define más adelante aquí. Sin embargo, en una forma de realización preferida, la identidad significa el porcentaje de identidad y se calcula mediante el número de nucleótidos iguales entre la secuencia sujeto y la secuencia problema, dividido entre la longitud total de la secuencia problema y multiplicado por 100.

[0023] Por consiguiente, una molécula de miARN-520f preferida o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y/o tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 945, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 19, 118, 119 y/o 120 y/o tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos o más.

[0024] Por consiguiente, una molécula de miARN-518b preferida o equivalente o mimético o isomiR de la misma según la divulgación comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 103 y/o tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 945, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 18, 121,122 y/o 123 y/o tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos o más. Por consiguiente, una molécula de miARN-524 preferida o equivalente o mimético o isomiR de la misma según la divulgación comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 106 o 107 y/o tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 945, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 20, 21, 124, 125, 126, 127 y/o 128 y/o tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos o más.

[0025] Otra molécula de miARN preferida o equivalente o mimético o un isomiR de la misma tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia semilla relacionada con miARN-520f (según se identifica en la tabla 5) o con una secuencia madura relacionada con miARN-520f (según se identifica en la tabla 3) o con una secuencia precursora relacionada con miARN-520f (según se identifica en la tabla 2) o con un ADN que codifica un precursor de ARN relacionado con miARN-520f (según se identifica en la tabla 4) o con una secuencia de isomiR relacionada con miARN-520f (según se identifica en la tabla 6). La identidad puede ser al menos de un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100%. La identidad se evalúa preferiblemente en toda la SEQ ID NO según se identifica en una tabla dada. Sin embargo, la identidad también se puede evaluar en parte de una SEQ ID NO dada. Parte puede significar al menos un 50% de la longitud de la SEQ ID NO, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o el 100%.

[0026] Un equivalente puede ser un isomiR o un mimético. Una secuencia precursora puede resultar en más de una secuencia de isomiR en función del proceso de maduración (véase, por ejemplo, miARN-520f o miARN-518b o miARN-524 donde, en determinados tejidos, se han identificado múltiples isomiR (tabla 6: SEQ ID NO: 118-128). Un mimético es una molécula que tiene una actividad similar o idéntica a una molécula de miARN. En este contexto, a una actividad similar se le da el mismo sentido que a un nivel aceptable de una actividad.

[0027] Cada una de las moléculas de miARN o equivalentes o miméticos o isomiR de las mismas según se identifica en la presente tiene un nivel aceptable de una actividad de un miARN dado del que derivan. Un nivel aceptable de una actividad significa preferiblemente que dicho miARN o equivalentes o miméticos o isomiR del mismo sigue siendo capaz de mostrar un nivel aceptable de dicha actividad de dicho miARN. Una actividad de un miARN dado o un equivalente del mismo es, por ejemplo, la capacidad para inducir una TME detectable como se define posteriormente aquí. Un nivel aceptable de una actividad es preferiblemente al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de la actividad del miARN del que derivan. Tal actividad puede ser como se mide en una célula de la vejiga de un individuo o in vitro en una célula en comparación con la actividad del miARN del que derivan. La evaluación de la actividad se puede realizar en el nivel de ARNm, usando preferiblemente una RT-qPCR. La evaluación de la actividad se puede realizar en el nivel de proteína, usando preferiblemente un análisis de transferencia Western o, una inmunohistoquímica o un análisis de inmunofluorescencia de secciones transversales.

[0028] La evaluación de la actividad se puede realizar usando células que expresan una construcción de luciferasa de luciérnaga dirigida por un promotor de CDH1 y midiendo la actividad de luciferasa.

[0029] Una actividad preferida de cualquiera de las moléculas de miARN o equivalente de las mismas según se identifica en la presente (es decir, miARN-124-1, miARN-206, miARN181a-1, miARN-141, miARN-200a, miARN-200b, miARN-200c, miARN-429, miARN-205, miARN-518b, miARN-520f, miARN-524) o una actividad preferida de una molécula de miARN o equivalente de la misma identificada por una fuente preferida (es decir, una molécula de miARN o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1) es inducir una TME detectable en un sujeto como se define posteriormente aquí.

[0030] Una fuente de una molécula de miARN o una fuente de un equivalente de una molécula de miARN, mimético, isomiR puede ser cualquier molécula que sea capaz de inducir la producción de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma tal como un mimético o isomiR según se identifica en la presente y que comprende una estructura de tipo horquilla y/o una molécula de ácido nucleico bicatenaria. La presencia de una estructura de tipo horquilla, se puede evaluar usando el programa RNAshapes (Steffen P. et al, (2006), Bioinformatics, 22: 500-503) usando ventanas de deslizamiento de 80, 100 y 120 nt o más. La presencia de una estructura de tipo horquilla está normalmente presente en una fuente natural o endógena de una molécula de miARN, mientras que una molécula de ácido nucleico bicatenaria está normalmente presente en una fuente recombinante o sintética de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma.

[0031] Una fuente de una molécula de miARN o de un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma puede ser un ARN monocatenario, un ARN bicatenario o un ARN parcialmente bicatenario o comprender tres cadenas, un ejemplo de lo cual se describe en la WO2008/10558. Como se utiliza en este caso, parcialmente bicatenario se refiere a estructuras bicatenarias que comprenden también estructuras monocatenarias en el extremo 5' y/o en el 3'. Puede ocurrir cuando cada cadena de una molécula de miARN no tiene la misma longitud. En general, tal molécula de miARN bicatenaria parcial puede tener menos de un 75% de estructura bicatenaria y más de un 25% de estructura monocatenaria, o menos de un 50% de estructura bicatenaria y más de un 50% de estructura monocatenaria, o más preferiblemente menos de un 25%, 20 % o 15% de estructura bicatenaria y más de un 75%, 80%, 85% de estructura monocatenaria. Alternativamente, una fuente de una molécula de miARN o de un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma es una molécula de ADN que codifica un precursor de una molécula de miARN o de un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma. Se identifican moléculas de ADN preferidas en este contexto en la tabla 4 en relación con miARN-520f. La invención abarca el uso de una molécula de ADN que codifica un precursor de una molécula de miARN que tiene al menos un 80% de identidad con dicha secuencia según se identifica en la tabla 4. Preferiblemente, la identidad es al menos de un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Preferiblemente en esta forma de realización, una molécula de ADN tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más y tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de ADN según se identifica en la tabla 4 en relación con miARN-520f. Por consiguiente, una fuente preferida de una molécula de miARN-520f tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 45 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más.

[0032] Por consiguiente, una fuente preferida de una molécula de miARN-518b según la divulgación tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 44 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más.

[0033] Por consiguiente, una fuente preferida de una molécula de miARN-524 según la divulgación tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 46 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más.

[0034] La inducción de la producción de una molécula de miARN dada o de un equivalente de la misma o de un mimético o un isomiR de la misma se obtiene preferiblemente cuando dicha fuente se introduce en una célula usando un ensayo tal y como se define a continuación. Las células abarcadas por la presente invención se definen más adelante.

[0035] Una fuente preferida de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma o de un mimético o un isomiR de la misma es un precursor de la misma, más preferiblemente un ácido nucleico codificante de dicha molécula de miARN o un equivalente de la misma o de un mimético o un isomiR de la misma. Un precursor preferido es un precursor que se produce de forma natural. Un precursor puede ser un precursor sintético o recombinante.

[0036] Un precursor preferido de una molécula de miARN dada se identifica en la tabla 2 como SEQ ID NO: 22-35. La invención abarca el uso de un precursor de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma que tiene al menos un 80% de identidad con dicha secuencia. Preferiblemente, la identidad es de al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Preferiblemente en esta forma de realización, una molécula de ARN tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más y tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia según se identifica en la tabla 2 como SEQ ID NO: 22-35.

[0037] Por consiguiente, una fuente preferida de una molécula de miARN-520f tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 33 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más.

[0038] Por consiguiente, una fuente preferida de una molécula de miARN-518b según la divulgación tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 32 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más.

[0039] Por consiguiente, una fuente preferida de una molécula de miARN-524 según la divulgación tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 34 y/o tiene una longitud de al menos 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos o más.

[0040] Fuentes o precursores preferidos se han definido posteriormente aquí. Una fuente preferida incluye o comprende una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico, es decir, ADN codificante de dicho precursor de dicho miARN, más preferiblemente dicha construcción de expresión es un vector de terapia génica viral seleccionado de vectores de terapia génica basados en un adenovirus, un virus adeno-asociado (AAV), un herpesvirus, un virus de la viruela y un retrovirus. Un vector de terapia génica viral preferido es un vector de AAV o lentiviral. Otros vectores preferidos son los vectores virales oncolíticos. Tales vectores se describen adicionalmente aquí a continuación. Alternativamente, una fuente puede ser una molécula de miARN sintética o un mimético químico como se define adicionalmente en la parte dedicada a las definiciones generales.

[0041] La detección de la presencia de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma tal como un mimético o un isomiR se puede realizar usando cualquier técnica conocida por la persona experta. La evaluación del nivel de expresión o de la presencia de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma se realiza preferiblemente usando técnicas de biología molecular tradicionales tales como la qPCR (en tiempo real), las micromatrices, las matrices de perlas, los análisis de protección de ribonucleasas o análisis Northern o clonación y secuenciación. La persona experta entenderá que, alternativamente o en combinación con la cuantificación de una molécula de miARN o de un equivalente de la misma, la cuantificación de un sustrato de una molécula de miARN correspondiente o de un equivalente de la misma o cualquier compuesto conocido por estar asociado a una función de dicha molécula de miARN o de dicho equivalente de la misma o la cuantificación de una función o actividad de dicha molécula de miARN o de dicho equivalente de la misma usando un ensayo específico se abarca dentro del alcance de la invención.

[0042] Las composiciones y formulaciones preferidas se definen todas más adelante aquí. Una molécula de miARN o un equivalente de la misma o un mimético o un isomiR de la misma se puede usar como tal como una molécula desnuda, con o sin modificaciones químicas, o encapsulada en una partícula o conjugada a una fracción. Una composición preferida comprende una molécula de miARN o un equivalente de la misma o un mimético o un isomiR de la misma encapsulada en una nanopartícula o una estructura liposómica. Una molécula de miARN o equivalente de la misma o un mimético o un isomiR de la misma puede ser un híbrido aptámero-miARN. Una molécula de miARN o equivalente de la misma puede ser un híbrido aptámero-miARN. Un aptámero-miARN se define como un miARN unido a un oligonucleótido de ARN (o ADN), donde el último adopta una conformación que dirige la molécula de híbrido aptámero-miARN a una proteína de la superficie celular (por ejemplo, el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA)). El miARN marcado con un aptámero se puede unir a, por ejemplo, polietilenglicol, lo que aumenta la vida media circulante de la quimera (Dassie, J.P. et al. Nat. Biotechnol. 27: 839-849 (2009)).

[0043] En la divulgación, se puede prevenir, retrasar, curar y/o tratar con una molécula tal y como se define en la presente cualquier enfermedad o afección donde la TEM está implicada o asociada. En la invención, se puede prevenir, retrasar, curar y/o tratar con una molécula tal y como se define en la presente cualquier cáncer donde la TEM está implicada o asociada.

[0044] En el contexto de la invención, la transición epitelio-mesenquimal (TEM) es una serie orquestada de eventos donde se modifican las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular (MEC) para permitir la liberación de células epiteliales del tejido circundante. El citoesqueleto de la célula epitelial se reorganiza para conferir la capacidad de la célula para moverse a través de una MEC tridimensional mediante la reprogramación molecular de la célula. La reprogramación molecular de una célula epitelial es necesaria para conseguir un fenotipo mesenquimal e implica la regulación por disminución o la reducción de la expresión de proteínas epiteliales, tales como la E-cadherina y las proteínas de unión tales como la desmoplaquina, la claudina y la ocludina. Además, la expresión de proteínas mesenquimales está regulada por aumento o aumentada, incluidas, por ejemplo, la expresión de proteínas de la MEC tales como las MMP y la fibronectina y proteínas de la superficie celular tales como la N-cadherina y la integrina avpo. También pueden estar regulados por aumento o aumentados en las células que exhiben un fenotipo mesenquimal factores de transcripción tales como, por ejemplo, SNAI1 (también conocido como SNAIL), TWIST, ZEB1 (también conocido como 6EF1) y ZEB2 (también conocido como SIP1). La referencia a la inducción de la "transición" de una célula epitelial a una célula que exhibe un fenotipo mesenquimal debe entenderse como una referencia la inducción de los cambios genéticos, morfológicos y/o funcionales que se requieren para cambiar una célula epitelial a una célula que exhibe un fenotipo mesenquimal del tipo definido aquí. La referencia a la inducción de la transición mesenquimal-epitelial debe entenderse con el significado inverso.

[0045] Como parte de la divulgación, en una enfermedad o afección de la invención, la TEM puede ser detectable antes del comienzo de la enfermedad o afección, es decir, antes de la aparición de un síntoma de dicha enfermedad o afección. La presente invención abarca además que la TEM es detectable durante el desarrollo de dicha enfermedad o afección, es decir, después de la aparición de un síntoma de dicha enfermedad o afección, donde la enfermedad o afección es un cáncer asociado a la TEM. Además, también abarca que la TEM es detectable antes del comienzo del cáncer y durante el desarrollo de dicho cáncer. En un cáncer de la invención, la TEM puede ser detectable antes del comienzo del cáncer, es decir, antes de la aparición de un síntoma de dicho cáncer. La presente invención abarca además que la TEM es detectable durante el desarrollo de dicho cáncer, es decir, después de la aparición de un síntoma de dicho cáncer. Además, también abarca que la TEM es detectable antes del comienzo del cáncer y durante el desarrollo de dicho cáncer.

[0046] La TEM se puede detectar usando cualquier técnica conocida por la persona experta. Preferiblemente, la TEM se evalúa detectando una reducción de la expresión de E-cadherina epitelial y/o un aumento de la expresión de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal usando inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos dirigidos contra la E-cadherina y/o la vimentina mesenquimal y/o la cadherina mesenquimal respectivamente (2, 3). La N-cadherina (CDH2) y la OB-cadherina (CDH11) son dos ejemplos de cadherinas mesenquimales. La evaluación de la expresión se realiza preferiblemente en una biopsia o sección tumoral en varios puntos temporales para un sujeto dado o en uno o varios puntos temporales para un sujeto dado y un control sano. La evaluación se puede realizar cada semana, cada mes. Por lo tanto, el aumento/la reducción puede evaluarse cada semana, mes. Preferiblemente, una reducción de la expresión de E-cadherina epitelial significa una reducción significativa, preferiblemente una reducción de al menos un 5% de la expresión usando inmunohistoquímica. Más preferiblemente, una reducción significa una reducción de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90% o el 100%. En este caso, no es detectable ninguna expresión. Un aumento de 25 veces de E-cadherina se obtuvo usando una molécula de miARN-520f según se identifica en la presente (un ejemplo representativo se muestra en el ejemplo 2, figura 4B). El efecto de esta molécula de miARN sobre este marcador es más pronunciado de forma cuantitativa (al menos 1,5 veces) que el efecto correspondiente de la molécula de miARN de la familia 200 que ya se sabían que tiene un efecto sobre la E-cadherina como se muestra en el ejemplo 2, figura 4B. Por lo tanto, podemos anticipar que una molécula de miARN-520f según se identifica en la presente se puede considerar una molécula atractiva para un uso según se identifica en la presente.

[0047] Preferiblemente, un aumento de la expresión de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal significa un aumento significativo, preferiblemente un aumento de al menos un 5% de la expresión usando inmunohistoquímica. Más preferiblemente, un aumento significa un aumento de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90%, al menos un 100%, o al menos un 150% o más.

[0048] Como parte de la divulgación, una enfermedad o afección donde está implicada o asociada la TEM es preferiblemente una enfermedad o afección donde ocurre un proceso de desdiferenciación. Como parte de la invención, un cáncer donde está implicada o asociada la TEM es preferiblemente un cáncer donde ocurre un proceso de desdiferenciación. En este proceso de desdiferenciación, una reducción de la expresión de E-cadherina epitelial y/o un aumento de la expresión de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal ocurre preferiblemente y se puede evaluar tal y como se explica aquí. Como un ejemplo, la TEM puede ser mostrada por células cancerosas que experimentan este proceso y se vuelven así metastásicas debido a su capacidad para separarse de las células vecinas y penetrar en y a través de los tejidos circundantes. Por lo tanto, una enfermedad preferida de la invención es un cáncer (por ejemplo, maligno, metastásico) y una enfermedad adicional de la divulgación es una fibrosis. Los cánceres de una forma de realización preferida de la invención incluyen un cáncer de origen epitelial o un carcinoma o un tumor sólido. Las células cancerosas pueden ser de la vejiga, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestino, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, testículo, lengua o útero. Además, el cáncer puede ser específicamente de los siguientes tipos histológicos, aunque no está limitado a estos: neoplasma, maligno; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes y fusiformes; carcinoma de células pequeñas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma de células basales; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células transicionales; carcinoma papilar de células transicionales; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinado; adenocarcinoma trabecular; carcinoma cístico adenoide; adenocarcinoma en pólipos adenomatosos; adenocarcinoma, poliposis familiar del colon; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquioloalveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulosas; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulado; carcinoma suprarrenal cortical; f; carcinoma de los anexos de la piel; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget de la mama; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; tumor estromal ovárico, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli. La enfermedad o afección asociada a la TEM es un cáncer, preferiblemente un cáncer de vejiga o de próstata. La TEM no ocurre en todos los cánceres. En los sarcomas de tejidos suaves y leucemias, el proceso de desdiferenciación de TEM no ocurre. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, un cáncer según se identifica en la presente es un carcinoma y/o no es una leucemia y/o no es un sarcoma de tejido.

[0049] La TEM según la divulgación también puede ocurrir durante la inflamación crónica o las afecciones que promueven la rotura de tejido prolongada que puede estimular la fibrosis, comprometiendo así la integridad del tejido y la función de los órganos. Una fibrosis se conoce también como fibrosis de órganos o degeneración de órganos (revisada en Thierry J.P. et al, 2009, Cell, 139: 871-890). En los tejidos fibróticos, los miofibroblastos se acumulan y segregan una cantidad excesiva de colágeno que se deposita como fibras, comprometiendo así la función de los órganos y conduciendo a su fallo. La fibrosis se origina a partir de la conversión de una porción significativa de células epiteliales en miofibroblastos a través de un proceso de TEM (Iwano et al., 2002 J. Clin. Invest. 110: 341-50). Demostrado inicialmente en células diferenciadas de túbulos y conductos renales, ahora está claro que el epitelio del cristalino, el endotelio, los hepatocitos y los cardiomiocitos pueden experimentar todos la TEM y contribuir significativamente a la fibrosis de tejido. Cada fibrosis donde se supone o se sospecha que ocurre una TEM está abarcada dentro del alcance de la divulgación.

[0050] Una afección o enfermedad asociada a la TEM según la divulgación también puede ser una mala cicatrización de heridas, una nefropatía renal diabética, una disfunción de aloinjertos, las cataratas o los defectos en la formación de las válvulas cardíacas.

[0051] Actualmente no hay ningún medicamento conocido eficaz que se pueda usar específicamente para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cáncer asociado a la TEM en un sujeto. La invención abarca el uso de una molécula de miARN o un equivalente de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una composición que comprende dicha molécula de miARN o equivalente de la misma o una fuente de la misma con este fin. Ya se han definido aquí moléculas de miARN preferidas o equivalentes o mimético o isomiR o fuentes de las mismas.

[0052] Este uso incluye aumentar farmacológicamente una actividad o el nivel de estado estable de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma o de dicha fuente de la misma en un sujeto, en una célula de dicho sujeto, en un tejido de dicho sujeto o en un líquido corporal de dicho sujeto.

[0053] En este uso, se aumenta una actividad o nivel de estado estable de dicho miARN, o equivalente del mismo o fuente del mismo para inducir una TME detectable en un sujeto. Una TME, transición mesenquimal-epitelial, es lo contrario de una TEM. Por lo tanto, la inducción de la TME es idéntica a la reversión de la TEM. Preferiblemente, una TME se evalúa detectando un aumento de la expresión de E-cadherina epitelial y/o una reducción de la expresión de vimentina mesenquimal usando inmunohistoquímica usando un anticuerpo específico dirigido contra la E-cadherina, respectivamente vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal (2, 3). La evaluación de la expresión se realiza preferiblemente en una biopsia o sección tumoral en varios puntos temporales para un sujeto dado o en uno o varios puntos temporales para un sujeto dado y un control sano. La evaluación se puede realizar en intervalos de tiempo regulares, por ejemplo, cada semana, cada mes. Por lo tanto, el aumento/la reducción puede evaluarse regularmente, por ejemplo, cada semana, cada mes. Una TME se ha detectado preferiblemente cuando se ha detectado un aumento de la expresión de E-cadherina epitelial y/o una reducción de la expresión de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal para al menos un punto temporal. Preferiblemente, se ha detectado una TME cuando se ha detectado para al menos dos, tres, cuatro, cinco puntos temporales tal aumento de la expresión de E-cadherina epitelial y/o reducción de la expresión de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal. Preferiblemente, un aumento de la expresión de E-cadherina epitelial significa un aumento significativo, preferiblemente un aumento de al menos un 5% de la expresión usando inmunohistoquímica. Más preferiblemente, un aumento significa un aumento de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90%, al menos un 150% o más.

[0054] Preferiblemente, una reducción de la expresión de vimentina mesenquimal y/o cadherina mesenquimal significa una reducción significativa, preferiblemente una reducción de al menos un 5% de la expresión usando inmunohistoquímica. Más preferiblemente, una reducción significa una reducción de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90% o el 100%. En este caso, no es detectable ninguna expresión.

[0055] Una actividad o nivel de estado estable de dicha molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma, donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1, se puede aumentar en el nivel de la molécula de miARN (o equivalente o mimético o isomiR de la misma) misma, por ejemplo, proporcionando dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma a un sujeto, preferiblemente a una célula de un sujeto, o a un tejido de dicho sujeto, o a un órgano de dicho sujeto o a dicho sujeto donde dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma proviene de una fuente exógena. Para la provisión de una molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma a partir de una fuente exógena, dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma puede convenientemente producirse por expresión de un ácido nucleico que codifica dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o que codifica una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma en una célula huésped adecuada como se describe a continuación o como moléculas completamente sintéticas por síntesis química.

[0056] Preferiblemente, sin embargo, una actividad o nivel de estado estable de una molécula de miARN o equivalente o un mimético o un isomiR de la misma se aumenta regulando el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o que codifica una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma. Preferiblemente, el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos se regula en una célula de dicho sujeto o en un tejido de dicho sujeto o en el sujeto. El nivel de expresión de una molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma se puede aumentar por introducción de una molécula de miARN, o equivalente o mimético o isómero de la misma, o una fuente de la misma, o una construcción (o vector) de expresión en una célula, tejido, órgano o líquido corporal de dicho sujeto, o en el sujeto por la cual un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una molécula de miARN o equivalente o un mimético o un isomiR de la misma o que comprende una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o un mimético o un isomiR de la misma, y por la cual una secuencia de nucleótidos está bajo control de un promotor capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos en dicha célula, tejido, órgano, sujeto. El nivel de expresión de una molécula de miARN o equivalente o un mimético o un isomiR de la misma o fuente de la misma también se puede aumentar por introducción de una construcción de expresión en una célula, tejido, órgano, sujeto, por la cual una construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un factor capaz de la transactivación de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica una molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma.

[0057] Un uso de la invención comprende preferiblemente el paso de administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico para aumentar la actividad o el nivel de estado estable de una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma según se identifica en la presente. Una construcción de ácido nucleico puede ser una construcción de expresión como se especifica adicionalmente aquí. Preferiblemente, una construcción de expresión es un vector de terapia génica viral seleccionado de vectores de terapia génica basados en un adenovirus, un virus adeno-asociado (AAV), un herpesvirus, un virus de viruela, un vector de virus oncolítico y un retrovirus. Un vector de terapia génica viral preferido es un vector AAV o lentiviral. Alternativamente, un uso de la invención comprende preferiblemente el paso de administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma tal y como se define aquí.

[0058] En un uso de la invención, una célula, un tejido, un órgano o líquido corporal es preferiblemente de un sujeto del que se sospecha que tiene un alto riesgo de tener un cáncer asociado a la TEM debido, por ejemplo, a su edad o su contexto genético o a su dieta. Alternativamente, en otra forma de realización preferida, el uso de la invención se aplica en una célula, tejido, órgano o líquido corporal de un sujeto diagnosticado como ya sea que tiene un riesgo predictivo de desarrollar más adelante un cáncer asociado a la TEM. Un método de diagnóstico usado es preferiblemente una de las descripciones como se describe en este caso. Alternativamente, una célula, un tejido o un órgano que se va a tratar se puede seleccionar en función del riesgo de progresión de la enfermedad o afección asociada a la TEM. Tal riesgo de progresión se puede evaluar usando criterios clinicopatológicos tradicionales o un pronóstico basado en biomarcadores conocidos por la persona experta. La divulgación abarca también administrar una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o un precursor de la misma o una composición que comprende dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma en un tejido u órgano de dicho sujeto. Ya se han definido aquí moléculas de miARN preferidas o equivalentes o mimético o isomiR o fuentes de la misma. En la invención, una célula, tejido u órgano preferidos es una célula, tejido u órgano que es o comprende una célula o tejido de la vejiga o la próstata o es o comprende la vejiga o la próstata como órgano.

[0059] Un tratamiento de un cáncer asociado a la TEM puede incluir un tratamiento que evite la TEM en una célula tumoral que aún no ha metastatizado o revertir la TEM (definida como transición mesenquimal-epitelial) en una célula tumoral que ya ha formado metástasis y/o está migrando del tumor primario a sitios distantes en el cuerpo.

[0060] En otro uso, la invención mencionada en la presente se puede combinar con tratamientos estándar de cáncer asociado a la TEM tales como quimioterapia, radioterapia o cirugía. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos se ejemplifican más adelante aquí.

[0061] Aunque la terapia génica es una posibilidad de prevenir, tratar, revertir y/o retrasar una afección o una enfermedad asociada a la TEM, también pueden ser previstos otros posibles tratamientos. Por ejemplo, también se prefiere el tratamiento mediante fármacos de "molécula pequeña" para dirigir determinadas vías moleculares en la dirección deseada. Estas pequeñas moléculas se identifican preferiblemente por el método de cribado de la invención tal y como se define más adelante aquí.

[0062] En el contexto de la divulgación, prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar una enfermedad o afección asociada a la TEM puede significar que:

- se ha mejorado al menos un síntoma de esta enfermedad o afección, y/o

- se ha mejorado al menos un parámetro asociado a esta enfermedad o afección.

[0063] En el contexto de la invención, prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cáncer asociado a la TEM puede significar que:

- se ha mejorado al menos un síntoma de este cáncer, y/o

- se ha mejorado al menos un parámetro asociado a este cáncer.

[0064] Un síntoma puede ser la presencia de metástasis como se explica a continuación. Un parámetro puede ser la evaluación de la TME tal y como se ha explicado anteriormente en la presente. En el contexto de la invención, prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cáncer asociado a la TEM se pueden sustituir por conseguir un efecto antitumoral. A menos que se indique lo contrario, un efecto antitumoral se evalúa o detecta preferiblemente después de al menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más en un sujeto tratado. Un efecto antitumoral se identifica preferiblemente en un sujeto como:

- una inhibición de la proliferación de células tumorales y/o

- un aumento en la capacidad de diferenciación de las células tumorales y/o

- una inducción o inducción aumentada de la muerte de células tumorales y/o

- un retraso en la aparición de metástasis y/o de la migración de las células tumorales y/o

- una inhibición o prevención o retraso del aumento de peso o crecimiento de un tumor y/o

- una prolongación de la supervivencia de los pacientes de al menos un mes, varios meses o más (en comparación con aquellos no tratados o tratados con un control o en comparación con el sujeto en el comienzo del tratamiento).

[0065] En el contexto de la invención, un paciente puede sobrevivir y/o se puede considerar que está libre de enfermedad. Alternativamente, el cáncer se puede haber detenido o retrasado. Una inhibición de la proliferación de células tumorales puede ser al menos de un 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%, o más. La proliferación de células se puede evaluar usando técnicas conocidas.

[0066] Una inducción de la muerte de células tumorales puede ser al menos de un 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, o más. El crecimiento del tumor se puede inhibir al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%, o más. La muerte de células tumorales se puede evaluar usando técnicas conocidas por la persona experta. La muerte de células tumorales se puede evaluar usando IRM (imágenes por resonancia magnética) o TC (tomografía computarizada).

[0067] En determinadas formas de realización, el aumento de peso del tumor o el crecimiento del tumor se puede inhibir al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%, o más. El peso del tumor o el crecimiento del tumor se puede evaluar usando técnicas conocidas por la persona experta.

[0068] La detección del crecimiento del tumor o la detección de la proliferación de células tumorales se pueden evaluar in vivo midiendo cambios en la utilización de glucosa por tomografía de emisión de positrones con el análogo de glucosa 2-[18F]-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (FDG-PET) o [18F]-'3-fluoro-'3-desoxi-L-timidina PET. Una alternativa ex vivo puede ser la tinción de una biopsia tumoral con Ki67.

[0069] Un retraso en la aparición de metástasis y/o de migración de células tumorales puede ser un retraso de al menos una semana, un mes, varios meses, un año o más largo. La presencia de metástasis se puede evaluar usando IRM, TC o ecografía o técnicas que permiten la detección de células tumorales circulantes (CTC). Ejemplos de las últimas pruebas son la prueba CellSearch CTC (Veridex), una selección magnética de CTC de sangre periférica basada en la EpCam. En determinadas formas de realización, el crecimiento del tumor se puede retrasar al menos una semana, un mes, dos meses o más. En una forma de realización determinada, una aparición de metástasis se retrasa al menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. Una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma o una fuente de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 se había descubierto sorprendentemente que retrasa la aparición de metástasis y/o migración de células tumorales de una forma más pronunciada que el efecto correspondiente de la molécula de miARN de la familia 200 que ya se sabía que tienen tal efecto como se muestra en el ejemplo 2, figura 6D. Por lo tanto, podemos anticipar que una molécula de miARN o una fuente de la misma según se identifica en la presente se puede considerar una molécula atractiva para un uso según se identifica en la presente.

[0070] Un aumento en la capacidad de diferenciación de las células tumorales se puede evaluar usando un marcador de diferenciación específico y siguiendo la presencia de tal marcador en las células tratadas. Marcadores o parámetros preferidos ya se han identificado aquí, es decir, marcadores asociados a la TME. Esto se puede hacer usando RT-PCR, transferencia Western o inmunohistoquímica. Un aumento de la capacidad de diferenciación puede ser al menos un aumento detectable después de al menos una semana de tratamiento usando cualquiera de las técnicas identificadas. Preferiblemente, el aumento es de un 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, o más, lo que significa que el número de células diferenciadas dentro de una muestra dada aumentará en consecuencia. En determinadas formas de realización, el crecimiento del tumor se puede retrasar al menos una semana, un mes, dos meses o más. En una forma de realización determinada, una aparición de metástasis se retrasa al menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más.

[0071] En otra forma de realización preferida, se proporciona una composición que comprende además otra molécula de miARN seleccionada de:

a) al menos una de miARN-124-1, miARN-206, miARN-181a-1, miARN-141, miARN-200a, miARN-200b, miARN-200c, miARN-429 y miARN-205 y/o un equivalente o un mimético o un isomiR o una fuente de las mismas.

[0072] Ya que no se espera que cada una de las moléculas de miARN identificadas o equivalentes o isomiR o miméticos de las mismas tengan los mismos genes diana, se supone que el uso de una molécula de miARN o un equivalente o un isomiR o un mimético de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 combinada opcionalmente con al menos una de las moléculas de miARN, o equivalente o isomiR o mimético de las mismas o fuente de las mismas identificadas arriba bajo a) permite un tratamiento más eficaz de un cáncer asociado a la TEM. Como parte de la divulgación, permite un tratamiento más eficaz de una enfermedad o afección asociada a la TEM. Ya se han definido aquí moléculas de miARN o equivalentes o mimético o isomiR o fuentes de las mismas preferidas. Un tumor tratado mediante una composición o un cóctel de al menos una molécula de miARN o un equivalente o un isomiR o un mimético de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 se espera que tenga menos posibilidades de escapar o de resistir dicho tratamiento. En otra forma de realización preferida de la divulgación, se abarca el diagnóstico de la expresión de cada una de las moléculas de miARN o de sus genes diana según se identifica en la presente y en función del resultado para adaptar la identidad de las moléculas de miARN usadas para el tratamiento.

[0073] Cuando la invención se refiere a una composición que comprende más de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma o fuente de la misma, se abarca que cada molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma o fuente de la misma pueda estar presente cada una en una composición separada, donde cada composición se administra consecutiva o simultáneamente a un sujeto. Alternativamente, también se abarca que más de una de las moléculas de miARN o equivalentes o isomiR o miméticos de las mismas o fuentes de las mismas esté presente en una composición tal y como se define aquí.

[0074] En otro aspecto, se proporciona el uso de una molécula de miARN o un equivalente o un isomiR o un mimético de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma o una composición que comprende dicha molécula de miARN, un equivalente o isomiR o mimético o una fuente de la misma para la producción de un medicamento para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar un cáncer asociado a la TEM. En otro aspecto de la divulgación, la molécula de miARN o un equivalente o un isomiR o un mimético de la misma es para prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar una enfermedad o una afección asociada a la TEM. Cada característica de este aspecto adicional ya se ha descrito en la presente.

[0075] En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para prevenir prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar una afección o enfermedad asociada a la TEM administrando una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma o fuente de la misma o composición como se ha definido en la presente anteriormente a un sujeto que necesita la misma. Cada característica de este aspecto adicional ya se ha descrito en la presente.

[0076] En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para diagnosticar la TEM o una enfermedad o afección asociada a la TEM en un sujeto, donde el método comprende los pasos de:

(a) determinar el nivel de expresión de una molécula de miARN o un equivalente o isomiR o mimético de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma en un sujeto y, opcionalmente,

(b) comparar el nivel de expresión de dicha molécula o equivalente de la misma o fuente de la misma tal y como se define en (a) con un valor de referencia para el nivel de expresión de dicha molécula, equivalente, isomiR, mimético o fuente de la misma, donde el valor de referencia es preferiblemente el valor medio para el nivel de expresión de dicha molécula, equivalente, isomiR, mimético o fuente de la misma en un sujeto sano.

[0077] En el contexto de esta divulgación, diagnóstico significa o una evaluación predictiva de riesgos de un sujeto de desarrollar una enfermedad o una afección asociada a la TEM o de desarrollar la TEM misma. En el contexto de la invención, un sujeto puede ser un animal. Preferiblemente, un sujeto es un mamífero. Un mamífero preferido es un ser humano. Preferiblemente, un sujeto es un ser humano.

[0078] Ya que los niveles de expresión de estas secuencias de nucleótidos y/o cantidades de la molécula de miARN correspondiente o equivalente o isomiR o mimético de la misma o fuente de la misma puede ser difícil de medir en un sujeto, se usa preferiblemente una muestra de un sujeto. Según otra forma de realización preferida, el nivel de expresión (de una secuencia de nucleótidos o molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma) se determina ex vivo en una muestra obtenida de un sujeto. La muestra comprende preferiblemente un líquido corporal de un sujeto. Un líquido corporal puede comprender o derivar de sangre, suero, plasma, deposición, orina o una biopsia de tejido o una biopsia tumoral o un tejido canceroso de origen epitelial de un sujeto. Un tejido preferido es de vejiga o de próstata. Concretamente se contempla que la divulgación se pueda usar para evaluar o diagnosticar diferencias entre las fases de la enfermedad o afección asociada a la TEM, tal como entre precáncer y cáncer, o entre un tumor primario y un tumor metastatizado.

[0079] Un aumento o una reducción del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos (o nivel de estado estable de la molécula de miARN codificada o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma) se define preferiblemente como un cambio detectable del nivel de expresión de un nucleótido (o nivel de estado estable de una molécula de miARN codificada o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma o cualquier cambio detectable en una actividad biológica de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma) usando un método tal y como se ha definido anteriormente en comparación con el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente (o nivel de estado estable de una molécula de miARN codificada correspondiente o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma) en un sujeto sano. Una secuencia de nucleótidos preferida es una secuencia que codifica un precursor de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma o una secuencia precursora de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético de la misma. Según una forma de realización preferida, un aumento o una reducción de una actividad de miARN se cuantifica usando un ensayo específico para la actividad de un miARN. Un ensayo preferido es la evaluación de la TME como se ha definido en la presente anteriormente.

[0080] Preferiblemente, una reducción del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos significa una reducción de al menos un 5% del nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos usando matrices. Más preferiblemente, una reducción del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos significa una reducción de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90% o el 100%. En este caso, no hay expresión detectable.

[0081] Preferiblemente, una reducción del nivel de expresión de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma significa una reducción de al menos un 5% del nivel de expresión del miARN usando una qPCR, micromatrices o un análisis de transferencia Northern. Preferiblemente, la qPCR es una qPCR RT en horquilla. Más preferiblemente, una reducción del nivel de expresión de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma significa una reducción de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90% o el 100 %. En este caso, no hay expresión detectable.

[0082] Preferiblemente, una reducción de una actividad de miARN significa una reducción de al menos un 5% de una actividad de miARN usando un ensayo adecuado. Más preferiblemente, una reducción de una actividad de miARN significa una reducción de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90% o el 100%. En este caso, no hay expresión detectable.

[0083] Preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos significa un aumento de al menos un 5% del nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos usando cualquiera de las técnicas mencionadas en la presente. Más preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos significa un aumento de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90%, al menos un 150% o más.

[0084] Preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma significa un aumento de al menos un 5% del nivel de expresión de la molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma usando una RT-qPCR, preferiblemente una RT-qPCR en horquilla. Más preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de una molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma significa un aumento de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90%, al menos un 150% o más.

[0085] Preferiblemente, un aumento de una actividad de miARN significa un aumento de al menos un 5% de una actividad de miARN usando un ensayo adecuado. Más preferiblemente, un aumento de una actividad de miARN significa un aumento de al menos un 10%, aún más preferiblemente al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 90%, al menos un 150% o más.

[0086] Preferiblemente, un nivel de expresión se determina ex vivo en una muestra obtenida de un sujeto. Más preferiblemente, la muestra es como se ha definido en la presente anteriormente y donde posteriormente, una secuencia de nucleótidos dada y/o molécula de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma se extrae y se purifica usando métodos conocidos por la persona experta. Más preferiblemente, la muestra es o comprende o deriva de una biopsia tumoral, sangre u orina.

[0087] En un método de diagnóstico de la divulgación se determinan preferiblemente el nivel de expresión de más de una, más preferiblemente de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 moléculas de miARN o equivalente o isomiR o mimético o fuente de la misma y/o los niveles de estado estable de las moléculas de miARN correspondientes o equivalente o isomiR o mimético o fuente de las mismas.

[0088] Por consiguiente, en un método preferido, en el paso (a) se determina el nivel de expresión de otra molécula de miARN o equivalente o fuente de la misma seleccionada de:

(a) al menos una de miARN-124-1, miARN-206, miARN-181a-1, miARN-141, miARN-200a, miARN-200b, miARN-200c, miARN-429 y miARN-205 y/o un equivalente o una fuente de las mismas.

[0089] En otro método preferido de la divulgación, la TEM o una enfermedad o afección asociada a la TEM se diagnostica cuando la comparación conduce al descubrimiento de una reducción del nivel de expresión de dicha molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma, donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1. Las moléculas de miARN más preferidas o los equivalentes o los miméticos o los isomiR o las fuentes de las mismas se han definido todos anteriormente en la presente.

[0090] En otro método preferido de la divulgación, la TEM o una enfermedad o afección asociada a la TEM se diagnostica cuando la comparación conduce al descubrimiento de una reducción del nivel de expresión de la molécula de miARN o un equivalente de la misma, donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o una fuente de la misma y una reducción del nivel de expresión de al menos uno de otro miARN seleccionado de:

(a) al menos uno de miARN-124-1, miARN-206, miARN-181a-1, miARN-141, miARN-200a, miARN-200b, miARN-200c, miARN-429 y miARN-205 y/o un equivalente o un mimético o un isomiR o una fuente de los mismos.

[0091] En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para la identificación de una sustancia o una molécula capaz de prevenir, tratar, revertir, curar y/o retrasar la TEM o una afección o enfermedad asociada a la TEM en un sujeto, donde el método comprende los pasos de:

(a) proporcionar una población de células de prueba capaz de expresar una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma, donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o fuente de la misma, preferiblemente la población de prueba comprende células de la vejiga o la próstata, y/o la población de células de prueba comprende células cancerosas y/o la población de células de prueba comprende células de mamífero, y/o la población de células de prueba comprende células humanas;

(b) poner en contacto la población de células de prueba con la sustancia;

(c) determinar el nivel de expresión de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma o la actividad o el nivel de estado estable de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma en la población de células de prueba que se ha puesto en contacto con la sustancia;

(d) comparar la expresión, la actividad o el nivel de estado estable determinado en (c) con la expresión, la actividad o el nivel de estado estable de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma en una población de células de prueba que no se ha puesto en contacto con la sustancia; e

(e) identificar una sustancia que produce una diferencia en el nivel de expresión, la actividad o el nivel de estado estable de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma, entre la población de células de prueba que se ha puesto en contacto con la sustancia y la población de células de prueba que no se ha puesto en contacto con la sustancia.

[0092] Preferiblemente, en el paso a), una célula de prueba comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una fuente o un precursor de una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma donde una fuente o un precursor de dicha molécula de miARN o equivalente o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1. Las moléculas de miARN más preferidas o los equivalentes o los miméticos o los isomiR o las fuentes de las mismas se han definido todos anteriormente en la presente. Más preferiblemente, una célula de prueba comprende una construcción de luciferasa de luciérnaga dirigida por un promotor de CDH1. Preferiblemente, en un método se comparan los niveles de expresión, una actividad o los niveles de estado estable de más de una secuencia de nucleótidos o más de una molécula de miARN, equivalente o mimético o isomiR o fuente de la misma. Preferiblemente, en un método, una población de células de prueba comprende células de mamífero, más preferiblemente células humanas. Aún más preferiblemente, una población de células de prueba comprende células de la vejiga o la próstata. Una población de células de prueba preferida no expresa una molécula de miARN o un equivalente o un mimético o un isomiR de la misma donde una fuente de dicha molécula de miARN o equivalente de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con el motivo representado por la SEQ ID NO: 1 o fuente de la misma o tiene una expresión reducida en comparación con un homólogo epitelial normal que expresa CDH1. Más preferiblemente, una población de células de prueba comprende una célula mesenquimal con baja expresión de CDH1, pero es capaz de expresar CDH1. Alternativamente o además de las células mencionadas previamente, en un aspecto, la divulgación se refiere también a una sustancia que se identifica en los métodos anteriormente mencionados.

Definiciones generales y tecnologías generales referidas en la presente

[0093] Las moléculas de microARN ("miARN") tienen generalmente de 21 a 22 nucleótidos de longitud, aunque se han reportado longitudes de 17 y hasta 25 nucleótidos. Por lo tanto, cualquier longitud de 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 está abarcada en la presente invención. Los miARN se procesan cada uno a partir de una molécula de ARN precursora más larga ("miARN precursor"). Los miARN precursores se transcriben a partir de genes que no codifican proteínas. Un precursor puede tener una longitud de al menos 50, 70, 75, 80, 85, 100, 150, 200 nucleótidos o más. Los miARN precursores tienen dos regiones de complementariedad que les permiten formar una estructura en horquilla o replegada, que es escindida por las enzimas llamadas Dicer y Drosha en los animales. Dicer y Drosha son nucleasas de tipo ribonucleasa Ill. El miARN procesado es típicamente una porción del tallo.

[0094] El miARN procesado (también denominado "miARN maduro") se vuelve parte de un complejo grande, conocido como el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), para regular (por disminución) un gen diana particular. Los ejemplos de miARN de animal incluyen aquellos que forman pares de bases de manera perfecta o imperfecta con la diana de ARNm, dando como resultado o la degradación de ARNm o la inhibición de la traducción, respectivamente (Olsen et al, 1999; Seggerson et al, 2002). Las moléculas de ARNip son también procesadas por Dicer, pero a partir de una molécula de ARN larga bicatenaria. Los ARNpi no se hallan naturalmente en las células animales, pero pueden funcionar en tales células en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) para dirigir la escisión específica de secuencia de una diana de ARNm (Denli et al, 2003).

[0095] El estudio de moléculas de miARN endógenas se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 60/575,743. Un miARN está aparentemente activo en la célula cuando el ARN maduro monocatenario está unido por un complejo proteico que regula la traducción de ARNm que hibridan con el miARN. La introducción de moléculas de ARN exógenas que afectan a las células de la misma manera que los miARN expresados endógenamente requieren que una molécula de ARN monocatenaria de la misma secuencia que el miARN endógeno maduro sea captada por el complejo proteico que facilita el control traduccional. Se han evaluado una variedad de diseños de moléculas de ARN. Se han identificado tres diseños generales que maximizan la captación del miARN monocatenario deseado por la vía del miARN. Una molécula de ARN con una secuencia de miARN que tiene al menos uno de los tres diseños puede denominarse un miARN sintético.

[0096] Las moléculas de miARN de la invención pueden reemplazar o complementar la actividad de silenciamiento génico de un miARN endógeno. Un ejemplo de tales moléculas, las características y las modificaciones preferidas de tales moléculas y composiciones que comprenden tales moléculas se describe en WO2009/091982.

[0097] Las moléculas de miARN de la invención o equivalentes o fuente de las mismas comprenden, en algunas formas de realización, dos moléculas de ARN donde un ARN es idéntico a un miARN maduro de origen natural. La molécula de ARN que es idéntica a un miARN maduro se denomina la cadena activa. La segunda molécula de ARN, denominada la cadena complementaria, es al menos parcialmente complementaria a la cadena activa. Las cadenas activa y complementaria se hibridan para crear un ARN bicatenario, que es similar al precursor de miARN de origen natural que está unido por el complejo proteico inmediatamente antes de la activación del miARN en la célula. La maximización de la actividad de dicho miARN requiere maximizar la captación de la cadena activa y minimizar la captación de la cadena complementaria por el complejo proteico de miARN que regula la expresión génica en el nivel de la traducción. Los diseños moleculares que proporcionan una actividad de miARN óptima implican modificaciones de la cadena complementaria.

[0098] Dos diseños incorporan modificaciones químicas de la cadena complementaria.

[0099] La primera modificación implica la creación de un ARN complementario con un grupo distinto de un fosfato o un hidroxilo en su extremo 5'. La presencia de la modificación 5' elimina aparentemente la captación de la cadena complementaria y favorece posteriormente la captación de la cadena activa por el complejo proteico de miARN. La modificación 5' puede ser cualquiera de una variedad de moléculas que incluyen NH2, NHCOCH3, biotina y otras.

[0100] La segunda estrategia de modificación química que reduce significativamente la captación de la cadena complementaria por la vía del miARN es la incorporación de nucleótidos con modificaciones de azúcar en los primeros 2-6 nucleótidos de la cadena complementaria. Debe observarse que las modificaciones de azúcar de acuerdo con la segunda estrategia de diseño se pueden acoplar con las modificaciones 5' terminales de acuerdo con la primera estrategia de diseño para mejorar adicionalmente las actividades de miARN.

[0101] El tercer diseño de miARN implica la incorporación de nucleótidos en el extremo 3' de la cadena complementaria que no son complementarios a la cadena activa.

[0102] Los híbridos de los ARN activos y complementarios resultantes son muy estables en el extremo 3' de la cadena activa pero relativamente inestables en el extremo 5' de la cadena activa. Estudios con ARNpi indican que la estabilidad híbrida 5' es un indicador clave de la captación de ARN por el complejo proteico que soporta la interferencia de ARN, que está al menos relacionada con la vía del miARN en las células. Los inventores han descubierto que el uso juicioso de los desemparejamientos en la cadena de ARN complementaria mejora significativamente la actividad de dicho miARN.

Bibliotecas de miARN

[0103] Según la divulgación, una aplicación clave para los miARN según se identifica en la presente es la evaluación o el diagnóstico de la presencia de uno individual o grupos de miARN en una muestra. Luego pueden evaluarse poblaciones celulares con cada uno de los diferentes miARN para identificar los miARN cuya presencia afecta a un fenotipo celular (es decir, la TEM). El número de miARN diferentes en las bibliotecas es variable. Se contempla que puede haber, haber al menos o haber como mucho 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más, o cualquier rango derivable incluido, moléculas específicas de miARN diferentes en la biblioteca. En formas de realización específicas, las bibliotecas tienen de 1 a 20 moléculas específicas de miARN diferentes o de 5 a 20 moléculas específicas de miARN diferentes. Moléculas específicas de miARN "diferentes" se refiere a ácidos nucleicos que codifican específicamente miARN con secuencias diferentes.

[0104] Se contempla que los miARN están hechos principalmente de ARN, aunque en algunas formas de realización, pueden ser de ARN, análogos de nucleótidos, tales como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos desbloqueados (UNA), ADN o cualquier combinación de ADN, ARN, análogos de nucleótidos y ANP (ácidos nucleicos peptídicos). Por consiguiente, se entiende que la biblioteca contiene uno o más ácidos nucleicos para estos diferentes miARN. En formas de realización específicas, la biblioteca es específica de miARN humanos, aunque se contemplan bibliotecas para múltiples organismos.

[0105] Una molécula de ARN para el uso de la invención tiene o comprende o consiste en una región de miARN. En formas de realización específicas, una molécula de miARN o equivalente de la misma tiene una secuencia que deriva de cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-21 inclusive relacionadas con miARN-520f (tabla 3). Se contempla particularmente que moléculas de ácido nucleico de la invención puedan derivar de cualquiera de las secuencias de miARN maduro en las SEQ ID NOs: 2-21 relacionadas con miARN-520f.

[0106] Una molécula de miARN o equivalente de la misma incluirá una secuencia que se extiende al menos de 1 a 5 nucleótidos de la secuencia codificante aguas arriba y/o abajo de la secuencia de miARN predicha. En algunas formas de realización, las moléculas tienen hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más nucleótidos contiguos, o cualquier rango derivable incluido, que flanquean la secuencia que codifica el miARN procesado predominante en uno o ambos lados (extremo 5' y/o 3').

[0107] Las bibliotecas de la divulgación pueden contener secuencias de miARN de cualquier organismo con miARN, incluidos específicamente, pero no limitados a, mamíferos tales como seres humanos, primates no humanos, ratas y ratones. Específicamente se contemplan bibliotecas que tienen, que tienen al menos o que tienen como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más miARN diferentes (es decir, moléculas específicas de miARN que tienen secuencias diferentes derivadas de diferentes genes de miARN). Específicamente se contemplan tales bibliotecas descritas en la frase precedente respecto a cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-21, particularmente aquellas correspondientes a las secuencias de miARN (secuencia madura).

Ácidos nucleicos

[0108] La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico también llamadas fuentes o precursores de miARN que pueden introducir miARN en células cultivadas o en un sujeto. Los ácidos nucleicos pueden haber sido producidos en células o in vitro por enzimas purificadas, aunque se producen preferentemente por síntesis química. Pueden ser crudas o purificadas. El término "miARN", a menos que se indique lo contrario, se refiere al miARN procesado, después de que se haya escindido de su precursor. La tabla 2 indica qué SEQ ID NO corresponde a una secuencia precursora particular de un miARN (SEQ ID NO: 22-35 y la tabla 3 qué SEQ ID NO corresponde a la secuencia madura de un miARN (SEQ ID NO: 2-21. La tabla 4 identifica las secuencias de ADN clonadas en el vector lentiviral (SEQ ID NO: 36-47, que se usaron en el cribado funcional como se describe en los ejemplos. La tabla 5 identifica la secuencia semilla preferida (como las SEQ ID NO: 87-107) de cada uno de los miARN maduros de la tabla 3. El nombre del miARN a menudo se abrevia y se hace referencia al mismo sin el prefijo y se entenderá como tal, en función del contexto. A menos que se indique lo contrario, los miARN a los que se hace referencia en la solicitud son secuencias humanas identificadas como mir-X o let-X, donde X es un número y/o letra.

[0109] Se entiende que un miARN deriva de secuencias genómicas o un gen no codificante. En este aspecto, el término "gen" se usa por simplicidad para referirse a la secuencia genómica que codifica el precursor de miARN para un miARN dado. Sin embargo, las formas de realización de la invención pueden implicar secuencias genómicas de un miARN que están implicadas en su expresión, tales como un promotor u otras secuencias reguladoras.

[0110] El término "recombinante" se puede usar y este generalmente se refiere a una molécula que se ha manipulado in vitro o que es el producto replicado o expresado de tal molécula.

[0111] El término "ácido nucleico" es bien conocido en la técnica. Un "ácido nucleico" como se utiliza en este caso se referirá generalmente a una molécula (una o más cadenas) de ADN, ARN o un derivado o análogo de las mismas, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o de pirimidina de origen natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o en el ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C). El término "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido", cada uno como un subgénero del término "ácido nucleico".

[0112] El término "miARN" generalmente se refiere a una molécula monocatenaria, pero en formas de realización específicas, las moléculas implementadas en la invención también abarcarán una región o una cadena adicional que es parcialmente (entre un 10 y un 50% complementaria a lo largo de la longitud de la cadena), sustancialmente (más del 50% pero menos del 100% complementaria a lo largo de la longitud de la cadena) o completamente complementaria a otra región de la misma molécula monocatenaria o a otro ácido nucleico. Así, los ácidos nucleicos pueden abarcar una molécula que comprende una o más cadena(s) complementaria(s) o autocomplementaria(s) o "complemento(s)" de una secuencia particular que comprende una molécula. Por ejemplo, un miARN precursor puede tener una región autocomplementaria, que es complementaria hasta el 100%.

[0113] Como se utiliza en este caso, "hibridación", "hibrida" o "capaz/capaces de hibridar" se entiende para significar la formación de una molécula bicatenaria o tricatenaria o una molécula con una naturaleza parcialmente bicatenaria o tricatenaria usando técnicas conocidas por la persona experta tales como procedimientos de transferencia de Southern. El término "aparear" como se utiliza en este caso es sinónimo de "hibridar". El término "hibridación", "hibrida(n)" o "capaz/capaces de hibridar" puede referirse a condiciones de hibridación "baja", "media" o "alta" tal y como se define a continuación.

[0114] Condiciones de astringencia baja a media a alta significa la prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 pg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 25%, 35% o 50% para las astringencias baja a media a alta, respectivamente. Posteriormente, la reacción de hibridación se lava tres veces durante 30 minutos cada una usando SSC 2X, SDS al 0,2% y 55 °C, 65 °C o 75 °C para las astringencias baja a media a alta.

[0115] Los ácidos nucleicos o derivados de los mismos de la invención comprenderán, en algunas formas de realización, la secuencia de miARN de cualquier miARN descrito en las SEQ ID NO: 2-21 o se describen en las SEQ ID NO: 22-35 o en las SEQ ID NO: 36-47. Se contempla que las secuencias de ácidos nucleicos de la invención derivadas de las SEQ ID NO: 2-21 pueden tener, tener al menos o tener como mucho 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, nucleótidos contiguos de las SEQ ID NOs: 2-21 (o cualquier rango derivable incluido). En otras formas de realización, los ácidos nucleicos son, son al menos o son como mucho un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% idénticos a la secuencia de miARN de las SEQ ID NO: 2-21 o a la secuencia precursora de cualquiera de las SEQ ID NO: 22-35 o cualquier combinación o rango derivable incluido.

Nucleobases

[0116] Como se utiliza en este caso, una "nucleobase" se refiere a una base heterocíclica, tal como, por ejemplo, una nucleobase de origen natural (es decir, una A, T, G, C o U) que se encuentra en al menos un ácido nucleico de origen natural (es decir, ADN y ARN), y derivado(s) de origen natural o no natural y análogos de tal nucleobase. Una nucleobase puede formar generalmente uno o más enlaces de hidrógeno ("aparear" o "hibridar") con al menos una nucleobase de origen natural de una manera que puede sustituir el emparejamiento de nucleobases de origen natural (por ejemplo, la unión de hidrógeno entre A y T, G y C, y A y U).

[0117] Las nucleobase(s) de "purina" y/o de "pirimidina" abarcan nucleobases de purina y/o pirimidina de origen natural y también derivado(s) y análogo(s) de las mismas, incluidas, pero no limitadas a, aquellas con una purina o pirimidina sustituida por una o más fracciones de alquilo, carboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, fluoro, cloro, bromo, o yodo), tiol o alquiltiol. Las fracciones alquilo preferidas (por ejemplo, alquilo, carboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, a aproximadamente 6 átomos de carbono. Otros ejemplos no limitativos de una purina o una pirimidina incluyen una deazapurina, una 2,6-diaminopurina, un 5-fluorouracilo, una xantina, una hipoxantina, una 8-bromoguanina, una 8-cloroguanina, una bromotimina, una 8-aminoguanina, una 8-hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2-aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilciosina, un 5-bromouracilo, un 5-etiluracilo, un 5-yodouracilo, un 5-clorouracilo, un 5-propiluracilo, un tiouracilo, una 2-metiladenina, una metiltioadenina, una N,N-dimetiladenina, unas azaadeninas, una 8-bromoadenina, una 8-hidroxiadenina, una 6-hidroxiaminopurina, una 6-tiopurina, una 4-(6-aminohexil/citosina) y similares. Otros ejemplos son conocidos por las personas expertas en la técnica.

[0118] Una nucleobase puede estar comprendida en un nucleósido o un nucleótido, usando cualquier método de síntesis química o natural descrito en la presente o conocido por una persona experta en la materia. Tal nucleobase se puede marcar o puede ser parte de una molécula que se marca y contiene la nucleobase.

Nucleósidos

[0119] Como se utiliza en este caso, un "nucleósido" se refiere a una unidad química individual que comprende una nucleobase unida de manera covalente a una fracción conectora de nucleobase. Un ejemplo no limitativo de una "fracción conectora de nucleobase" es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un "azúcar de 5 carbonos"), incluidas, pero no limitadas a, una desoxirribosa, una ribosa, una arabinosa o un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos. Los ejemplos no limitativos de un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos incluyen un 2'-fluoro-2'-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico donde un carbono se sustituye por un átomo de oxígeno en el anillo del azúcar.

[0120] Diferentes tipos de enlace(s) covalente(s) de una nucleobase a una fracción conectora de nucleobase se conocen en la técnica. A modo de ejemplo no limitativo, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G) o una nucleobase 7-deazapurina une típicamente de manera covalente la posición 9 de una purina o una 7 deazapurina a la posición 1' de un azúcar de 5 carbonos. En otro ejemplo no limitativo, un nucleósido que comprende una nucleobase de pirimidina (es decir, C, T o U) une típicamente de manera covalente una posición 1 de una pirimidina a una posición 1' de un azúcar de 5 carbonos (Kornberg y Baker, 1992).

Nucleótidos

[0121] Como se utiliza en este caso, un "nucleótido" se refiere a un nucleósido que comprende además una "fracción de esqueleto". Una fracción de esqueleto une generalmente de manera covalente un nucleótido a otra molécula que comprende un nucleótido o a otro nucleótido para formar un ácido nucleico. La "fracción de esqueleto" en nucleótidos de origen natural comprende típicamente una fracción de fósforo, que está unida de manera covalente a un azúcar de 5 carbonos. La unión de la fracción de esqueleto ocurre típicamente en la posición 3' o 5' del azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, otros tipos de uniones se conocen en la técnica, particularmente cuando un nucleótido comprende derivados o análogos de una fracción de origen natural de un azúcar de 5 carbonos o fósforo.

Análogos de ácidos nucleicos

[0122] Un ácido nucleico puede comprender, o estar totalmente compuesto de, un derivado o análogo de una nucleobase, una fracción conectora de nucleobase y/o una fracción de esqueleto que puede estar presente en un ácido nucleico de origen natural. Un ARN con análogos de ácidos nucleicos también se puede marcar según métodos de la invención. Como se utiliza en este caso, un "derivado" se refiere a una forma modificada o alterada químicamente de una molécula de origen natural, mientras que los términos "mimético" o "análogo" se refieren a una molécula que puede o puede no parecerse estructuralmente a una molécula o fracción de origen natural, pero posee funciones similares. Como se utiliza en este caso, una "fracción" generalmente se refiere a un componente químico o molecular más pequeño de una estructura química o molecular más grande. Análogos o derivados de nucleobases, nucleósidos y nucleótidos se conocen bien en la técnica y se han descrito (véase, por ejemplo, Scheit,

[0123] Los ejemplos no limitativos adicionales de nucleósidos, nucleótidos o ácidos nucleicos que comprenden derivados o análogos de azúcares de 5 carbonos y/o fracciones de esqueleto, incluyen aquellos en: la patente de EE.UU. n.° 5,681,947, que describe oligonucleótidos que comprenden derivados de purina que forman hélices triples con y/o evitan la expresión de ADNdc; las patentes de EE.UU. 5,652,099 y 5,763,167, que describen ácidos nucleicos que incorporan análogos fluorescentes de nucleósidos encontrados en el ADN o el ARN, particularmente para el uso como sondas fluorescentes de ácidos nucleicos; la patente de EE.UU. 5,614,617, que describe análogos de oligonucleótidos con sustituciones en anillos de pirimidina que poseen una estabilidad a las nucleasas mejorada; las patentes de EE.UU. 5,670,663, 5,872,232 y 5,859,221, que describen análogos de oligonucleótidos con azúcares de 5 carbonos modificados (es decir, fracciones de T-desoxifuranosilo modificadas) usados en la detección de ácidos nucleicos; la patente de EE.UU. 5,446,137, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos una fracción de azúcar de 5 carbonos sustituida en la posición 4' con un sustituyente distinto del hidrógeno que se pueden usar en ensayos de hibridación; la patente de EE.UU. 5,886,165, que describe oligonucleótidos tanto con desoxirribonucleótidos con enlaces internucleotídicos 3'-5' como con ribonucleótidos con enlaces internucleotídicos 2'-5'; la patente de EE.UU. 5,714,606, que describe un enlace internucleotídico modificado donde un oxígeno de la posición 3' del enlace internucleotídico se sustituye por un carbono para mejorar la resistencia a las nucleasas de los ácidos nucleicos; la patente de EE.UU. 5,672,697, que describe oligonucleótidos que contienen uno o más enlaces internucleotídicos de 5' fosfonato de metileno que mejoran la resistencia a las nucleasas; las patentes de EE.UU. 5,466,786 y 5,792,847, que describen el enlace de una fracción sustituyente que puede comprender un fármaco o marcador en el carbono 2' de un oligonucleótido para proporcionar una estabilidad a las nucleasas mejorada y la capacidad para administrar fármacos o fracciones de detección; la patente de EE.UU.

5,223,618, que describe análogos de oligonucleótidos con un enlace de esqueleto de carbono 2' o 3' que une la posición 4' y la posición 3' de la fracción de azúcar de 5 carbonos adyacente para mejorar la captación celular, la resistencia a las nucleasas y la hibridación con el ARN diana; la patente de EE.u U. 5,470,967, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un enlace internucleotídico de sulfamato o sulfamida que son útiles como sonda de hibridación de ácidos nucleicos; las patentes de EE.UU. 5,378,825, 5,777,092, 5,623,070, 5,610,289 y 5,602,240, que describen oligonucleótidos con una fracción conectora de tres o cuatro átomos sustituyendo la fracción de esqueleto fosfodiéster usados para mejorar la resistencia a las nucleasas, la captación celular y regular la expresión de ARN; la patente de EE.UU. 5,858,988, que describe un agente portador hidrofóbico unido a la posición 2'-0 de los oligonucleótidos para mejorar su estabilidad y permeabilidad de membrana; la patente de EE.UU. 5,214,136, que describe oligonucleótidos conjugados a antraquinona en el extremo 5' que poseen una hibridación mejorada con el ADN o el ARN; estabilidad mejorada a las nucleasas; la patente de EE.UU. 5,700,922, que describe quimeras ANP-ADN-ANP donde el ADN comprende 2'-desoxi-eritro-pentofuranosil nucleótidos para mejorar la resistencia a las nucleasas, la afinidad de enlace y la capacidad para activar la ribonucleasa H; y WO98/39352, WO99/14226, WO2003/95467, WO2003/95467 y WO2007/085485, que describen nucleótidos de ARN modificados de los cuales la fracción de ribosa se modifica con un puente extra que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. La ribosa bloqueada aumenta significativamente la especificidad y la afinidad de enlace; y WO2008/147824, que describe nucleótidos de ARN modificados denominados UNA (ácido nucleico desbloqueado). Los UNA son análogos acílicos de ARN en los que se ha escindido el enlace entre los átomos C2' y C3', disminuyendo la afinidad de enlace hacia una cadena complementaria. Los UNA son compatibles con el reconocimiento de la ribonucleasa H y la escisión de ARN y mejora el silenciamiento génico mediado por ARNip; WO2008/036127, que describe análogos de ácidos nucleicos de morfolino, que contienen enlaces entre subunidades tanto sin carga como catiónicos; WO/2007/069092 y EP2075342, que describen ácidos nucleicos zip (ZNA), que contienen derivados de espermina de conjugación como fracciones catiónicas (unidades Z) con un oligonucleótido; la patente de EE.UU. 5,708,154, que describe ARN unido a un ADN para formar un híbrido ADN-ARN; la patente de EE.UU. 5,728,525, que describe el marcaje de análogos de nucleósido con un marcador fluorescente universal.

[0124] Instrucciones adicionales para análogos de nucleósidos y análogos de ácidos nucleicos son la patente de EE.u U. 5,728,525, que describe análogos de nucleósidos que están marcados en el extremo; la patente de EE.UU.

5,637,683, 6,251,666 (sustituciones de L-nucleótidos) y 5,480,980 (nucleótidos 7-desaza- 2'-desoxiguanosina y análogos de ácidos nucleicos de los mismos).

[0125] El uso de otros análogos se contempla específicamente para usar en el contexto de la presente invención. Tales análogos se pueden usar en las moléculas sintéticas de ácido nucleico de la invención, tanto en toda la molécula como en nucleótidos seleccionados. Incluyen, pero de forma no limitativa,

1) modificaciones de ribosa (tales como 2'F, 2' NH2, 2'N3,4'tio o 2' O-CH3) y

2) modificaciones de fosfato (tales como las encontradas en fosforotioatos, metilfosfonatos y fosfoboratos).

[0126] Tales análogos se han creado para conferir estabilidad en los ARN reduciendo o eliminando su capacidad para ser escindidos por ribonucleasas. Cuando estos análogos de nucleótidos están presentes en los ARN, pueden tener efectos profundamente positivos sobre la estabilidad de los ARN en animales. Se contempla que el uso de análogos de nucleótidos se pueda usar solo o conjuntamente con cualquiera de las modificaciones de diseño de un miARN sintético para cualquier ácido nucleico de la invención.

Nucleótidos modificados

[0127] Los miARN de la invención contemplan específicamente el uso de nucleótidos que se modifican para mejorar sus actividades. Tales nucleótidos incluyen aquellos que están en el extremo 5' o 3' del ARN, así como aquellos que son internos en la molécula. Los nucleótidos modificados usados en las cadenas complementarias de dichos miARN o bloquean el 5 'OH o el fosfato del ARN o introducen modificaciones internas de azúcar que mejoran la captación de la cadena activa del miARN. Las modificaciones para los miARN incluyen modificaciones internas de azúcar que mejoran la hibridación, así como estabilizan las moléculas en las células y modificaciones terminales que estabilizan adicionalmente los ácidos nucleicos en las células. Además, se contemplan modificaciones que se pueden detectar por microscopía u otros métodos para identificar células que contienen los miARN sintéticos.

Preparación de ácidos nucleicos

[0128] Un ácido nucleico puede prepararse por cualquier técnica conocida por una persona experta en la materia, tal como, por ejemplo, síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Aunque los miARN según la invención podrían producirse usando métodos recombinantes, se prefiere producir los miARN por síntesis química o producción enzimática. Los miARN se pueden producir por una serie de métodos, incluidos métodos que implican tecnología del ADN recombinante.

[0129] La síntesis de ácido nucleico se realiza según métodos estándar. Véase, por ejemplo, Itakura y Riggs (1980). Adicionalmente, la patente de EE.UU. 4,704,362, la patente de EE.UU. 5,221,619 y la patente de EE.UU. 5,583,013 describen cada una varios métodos de preparación de ácidos nucleicos. Los ejemplos no limitativos de un ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) incluyen un ácido nucleico hecho por síntesis in vitro químicamente usando química de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita y técnicas en fase sólida tal y como se describe en la EP 266,032, o a través de productos intermedios de H-fosfonato de desoxinucleósido como se describe por Froehler et al., 1986 y la patente de EE.UU. con n.° de serie 5,705,629. En los métodos de la presente invención, se pueden usar uno o más oligonucleótidos. Varios mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos se han descrito, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 5,602,244.

[0130] Un ejemplo no limitativo de un ácido nucleico producido enzimáticamente incluye uno producido por enzimas en reacciones de amplificación tales como la PCR(™) (véase por ejemplo, la patente

[0131] de EE.UU. 4,683,202 y la patente de EE.UU. 4,682,195) o la síntesis de un oligonucleótido descrito en la patente de EE.UU. n.° 5,645,897.

[0132] La síntesis de oligonucleótidos es bien conocida por aquellas personas expertas en la técnica. Se han descrito varios mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU.

4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 5,602,244.

[0133] Básicamente, la síntesis química se puede conseguir por el método del diéster, el método del triéster, el método de la fosforilasa de polinucleótidos y por química en fase sólida. Estos métodos se discuten con más detalle a continuación.

Método del diéster

[0134] El método del diéster fue el primero que se desarrolló en un estado utilizable, principalmente por Khorana y los compañeros de trabajo (Khorana, 1979). El paso básico es la unión de dos desoxinucleótidos adecuadamente protegidos para formar un didesoxinucleótido con un enlace de fosfodiéster. El método del diéster está bien establecido y se ha usado para sintetizar moléculas de ADN (Khorana, 1979).

Método del triéster

[0135] La diferencia principal entre los métodos del diéster y del triéster es la presencia en este último de un grupo protector extra en los átomos de fosfato de los reactivos y los productos (Itakura et al., 1975). El grupo protector de fosfato es normalmente un grupo clorofenilo, que hace a los nucleótidos y los productos intermedios de polinucleótidos solubles en solventes orgánicos. Por lo tanto, las purificaciones se hacen en soluciones de cloroformo. Otras mejoras en el método incluyen (i) el acoplamiento de bloque de trímeros y oligómeros más grandes, (ii) el uso extenso de cromatografía en fase líquida de alta resolución para la purificación tanto de productos intermedios como finales y (iii) la síntesis en fase sólida.

Método de la polinucleótido fosforilasa

[0136] Este es un método enzimático de síntesis de ADN que se puede usar para sintetizar muchos oligonucleótidos útiles (Gillam et al., 1978; Gillam et al, 1979). Bajo condiciones controladas, la polinucleótido fosforilasa añade predominantemente un único nucleótido a un oligonucleótido corto.

[0137] La purificación cromatográfica permite que se obtenga el aducto único deseado. Se requiere al menos un trímero para iniciar el procedimiento, y este cebador debe obtenerse por algún otro método. El método de la polinucleótido fosforilasa funciona y tiene la ventaja de que los procedimientos implicados son familiares para la mayoría de bioquímicos.

Métodos en fase sólida

[0138] Basándose en la tecnología desarrollada para la síntesis en fase sólida de polipéptidos, ha sido posible unir el nucleótido inicial con material de soporte sólido y proceder con la adición gradual de nucleótidos. Se simplifican todos los pasos de mezclado y de lavado, y el procedimiento se vuelve susceptible a la automatización. Estas síntesis se realizan ahora rutinariamente usando sintetizadores automáticos de ácidos nucleicos.

[0139] La química de la fosforamidita (Beaucage y Lyer, 1992) se ha convertido por mucho en la química de acoplamiento más ampliamente usada para la síntesis de oligonucleótidos. Como ya conocen bien aquellas personas expertas en la técnica, la síntesis de fosforamidita de los oligonucleótidos implica la activación de precursores monoméricos de fosforamidita de nucleósidos por reacción con un agente de activación para formar productos intermedios activados, seguido de la adición secuencial de los productos intermedios activados a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento (generalmente anclada en un extremo a un soporte sólido adecuado) para formar el producto oligonucleotídico.

Métodos recombinantes

[0140] Los métodos recombinantes para producir ácidos nucleicos en una célula son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Estos incluyen el uso de vectores, plásmidos, cósmidos y otros vehículos para la administración de un ácido nucleico a una célula, que puede ser la célula diana o simplemente una célula huésped (para producir grandes cantidades de la molécula de ARN deseada). Alternativamente, tales vehículos se pueden usar en el contexto de un sistema libre de células siempre y cuando estén presentes los reactivos para generar la molécula de ARN. Tales métodos incluyen aquellos descritos en Sambrook, 2003, Sambrook, 2001 y Sambrook, 1989. En determinadas formas de realización, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que no son sintéticas. En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura química de un ácido nucleico de origen natural y una secuencia de un ácido nucleico de origen natural, como la secuencia exacta y completa de un miARN primario monocatenario (véase Lee 2002), un miARN precursor monocatenario o un miARN maduro monocatenario. Además del uso de tecnología recombinante, tales ácidos nucleicos no sintéticos se pueden generar químicamente, tal como utilizando la tecnología usada para crear oligonucleótidos.

Diseño de miARN

[0141] Los miARN comprenden típicamente dos cadenas, una cadena activa que es idéntica en secuencia al miARN maduro que se está estudiando y una cadena complementaria que es al menos parcialmente complementaria a la cadena activa. La cadena activa es la molécula biológicamente relevante y debería ser captada preferentemente por el complejo en las células que modula la traducción o a través de la degradación de ARNm o del control traduccional. La captación preferencial de la cadena activa tiene dos resultados profundos: (1) la actividad observada de dicho miARN aumenta drásticamente y (2) los efectos no intencionados inducidos por la captación y la activación de la cadena complementaria se eliminan esencialmente. Según la invención, se pueden usar varios diseños de miARN para asegurar la captación preferencial de la cadena activa.

Agente de bloqueo 5'

[0142] La introducción de una fracción estable distinta de fosfato o hidroxilo en el extremo 5' de la cadena complementaria afecta a su actividad en la vía del miARN. Esto asegura que solo se usará la cadena activa del miARN para regular la traducción en la célula. Las modificaciones 5' incluyen, pero de forma no limitativa, NH2, biotina, un grupo amina, un grupo alquilamino inferior, un grupo acetilo, 2' O-Me, DMTO, fluoresceína, un tiol o acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad.

[0143] Otras modificaciones de la cadena sentido. La introducción de modificaciones de nucleótidos como 2'-O Me, 2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metil, 2'-O-metoxietil (2'-0-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-0-AP), 2'-O-dimetilaminoetil (2'-0-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropil (2'-0-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietil (2'-0-DMAEOE), o 2'-O-N-metilacetamido (2'-0-NMA), NH2, biotina, un grupo amina, un grupo alquilamino inferior, un grupo acetilo, DMTO, fluoresceína, un tiol, o acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad en la cadena complementaria del miARN puede eliminar la actividad de la cadena complementaria y mejorar la captación de la cadena activa del miARN.

[0144] Desemparejamientos de bases en la cadena sentido. Como con los ARNpi (Schwarz 2003), la estabilidad relativa de los extremos 5' y 3' de la cadena activa del miARN determina aparentemente la captación y la activación de la activa por la vía del miARN. La desestabilización del extremo 5' de la cadena activa del miARN por la colocación estratégica de los desemparejamientos de bases en el extremo 3' de la cadena complementaria del miARN sintético mejora la actividad de la cadena activa y elimina esencialmente la actividad de la cadena complementaria.

Células huésped y células diana

[0145] Como parte de la divulgación, las células donde se introduce un miARN o una fuente del mismo o donde se evalúa la presencia de un miARN pueden derivar de o estar contenidas en cualquier organismo. Preferiblemente, la célula es una célula de vertebrado. Más preferiblemente, la célula es una célula de mamífero. Aún más preferiblemente, la célula es una célula humana.

[0146] Una célula de mamífero puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o pluripotente, en división o no en división, de epitelio, inmortalizada o transformada, o similar. La célula puede ser una célula indiferenciada, tal como una célula madre, o una célula diferenciada, tal como de una célula de un órgano o tejido. Alternativamente, las células se pueden calificar como células epiteliales, cerebro, mama, cérvix, colon, tracto gastrointestinal, corazón, riñón, intestino grueso, hígado, pulmón, ovario, páncreas, corazón, próstata, vejiga, intestino delgado, estómago, testículos o útero.

[0147] Como se utiliza en este caso, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se pueden usar de forma intercambiable. Todos estos términos incluyen también su progenie, que es cualquier y todas las generaciones posteriores formadas por división celular. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Una célula huésped puede ser "transfectada" o "transformada", que se refiere a un proceso por el que un ácido nucleico exógeno se transfiere o se introduce en la célula huésped. Una célula transformada incluye la célula del sujeto primario y su progenie. Como se utiliza en este caso, los términos células "diseñadas" y "recombinantes" o células huésped se destinan a referirse a una célula en la que se ha introducido una secuencia de ácido nucleico exógena, tal como, por ejemplo, un ARN interferente pequeño o una construcción molde que codifica un gen indicador. Por lo tanto, las células recombinantes son distinguibles de las células de origen natural que no contienen un ácido nucleico introducido de forma recombinante.

[0148] Como parte de la divulgación, un tejido puede comprender una célula huésped o células que se van a transformar o poner en contacto con una composición de administración de ácido nucleico y/o un agente adicional. El tejido puede ser parte o separarse de un organismo. En determinadas formas de realización de la divulgación, un tejido y sus células constituyentes pueden comprender, pero de forma no limitativa, cerebro, células madre, hígado, pulmón, hueso, mama, cérvix, colon, endometrio, epitelial, esófago, células caliciformes, riñón, ovarios, páncreas, próstata, vejiga, piel, intestino delgado, estómago, testículos, corazón, vaso sanguíneo.

[0149] En determinadas formas de realización de la divulgación, la célula huésped o el tejido puede estar comprendido en al menos un organismo. En determinadas formas de realización, el organismo puede ser un mamífero, un ser humano, un primate o murino. Una persona experta en la técnica entendería además las condiciones bajo las que incubar todas las células huésped descritas anteriormente para mantenerlas y para permitir su división para formar progenie.

Métodos de administración

[0150] La presente invención implica en algunas formas de realización administrar un ácido nucleico a una célula. Esto se puede realizar como parte de un método de cribado o se puede relacionar con una aplicación terapéutica o diagnóstica como se describe en la presente.

[0151] Las moléculas de ARN pueden estar codificadas por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término "vector" se utiliza para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para la introducción en una célula donde se puede replicar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es foránea a la célula en la que el vector se está introduciendo o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula, pero en una posición en el ácido nucleico de la célula huésped donde la secuencia no se encuentra ordinariamente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales, lentivirus y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Una persona experta en la técnica estaría bien equipada para construir un vector a través de técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook et al, 1989 y Ausubel et al, 1996. Además de codificar un polipéptido modificado tal como gelonina modificada, un vector puede codificar secuencias polipeptídicas no modificadas tales como una etiqueta o molécula dirigida. Una molécula dirigida es una que dirige el ácido nucleico deseado a un órgano, tejido, célula u otra ubicación particular en el cuerpo de un sujeto.

[0152] El término "vector de expresión" se refiere a un vector con una secuencia de ácido nucleico codificante para al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Además de secuencias de control que dirigen la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que sirven para otras funciones también y se describen

[0153] Hay varias maneras en las que los vectores de expresión pueden introducirse en las células. En determinadas formas de realización de la invención, el vector de expresión comprende un virus o un vector diseñado derivado de un genoma viral. La capacidad de determinados virus para introducirse en las células mediante endocitosis mediada por receptores, para integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar genes virales de forma estable y eficaz los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de genes foráneos en células de mamíferos (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus usados como vectores génicos fueron virus de ADN, incluidos los papovavirus (virus de los simios 40, virus del papiloma bovino y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y los adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986). Estos tienen una capacidad relativamente baja para secuencias de ADN foráneas y tienen un espectro de huéspedes restringido. Además, su potencial oncogénico y sus efectos citopáticos en células permisivas plantean cuestiones de seguridad. Pueden alojar solo hasta 8 kb de material genético foráneo, pero se pueden introducir fácilmente en una variedad de líneas celulares y animales de laboratorio (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986). Los vectores de expresión pueden contener un casete de expresión de ARNi que comprende un promotor y una o más estructuras en horquilla separadas por una o más regiones separadoras (WO2006/084209).

[0154] Se describe otra manera de introducir vectores de expresión en las células, usando proteínas de fusión de avidina, en la US6,287,792.

[0155] Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenarios caracterizados por una capacidad para convertir su ARN a ADN bicatenario en células infectadas; también pueden usarse como vectores. Otros vectores virales pueden emplearse como construcciones de expresión en la presente invención. Se pueden emplear vectores derivados de virus tales como virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al, 1988), virus adeno-asociado (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, 1984), lentivirus (WO2008/071959, WO2004/054512), virus hemaglutinante del Japón (WO2004/035779), Baculovirus (WO2006/048662) y herpesvirus. Ofrecen varias características atractivas para varias células de mamíferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al, 1988; Horwich et al, 1990).

[0156] Se cree que otros métodos adecuados para la administración de ácidos nucleicos para afectar a la expresión de composiciones de la presente invención incluyen prácticamente cualquier método por el que se puede introducir un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, incluidos vectores virales y no virales) en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en este caso o como conocería una persona experta en la materia. Tales métodos incluyen, pero de forma no limitativa, la administración directa de ADN tal como por inyección (patente de EE.UU. Nos. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859), incluida la microinyección (Harlan y Weintraub, 1985; patente de EE.UU. n° 5,789,215); por electroporación (patente de EE.UU. n.° 5,384,253); por precipitación de fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al, 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al, 1987; Wong et al, 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); por internalización fotoquímica (W02008/007073); por bombardeo de microproyectiles (solicitudes PCT Nos. W o 94/09699 y 95/06128; patentes de EE.UU. Nos. 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 y 5,538,880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al, 1990; patentes de EE.UU. Nos. 5,302,523 y 5,464,765); por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de Ee .UU. Nos. 5,591,616 y 5,563,055); o por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993; patentes de EE.UU. Nos. 4,684,611 y 4,952,500); por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985). A través de la aplicación de técnicas tales como estas, se puede(n) transformar de forma estable o transitoria orgánulo(s), célula(s), tejido(s) u organismo(s).

[0157] Una revisión proporciona varias maneras de formular una molécula de ARN para optimizar su internalización en una célula (Kim SS. et al, Trends Mol. Med., 2009, 15: 491-500). Las siguientes otras publicaciones divulgan maneras alternativas de formular una molécula de ARN para mejorar su internalización en una célula: WO 2007/095152, que describe el uso de PTD-DRBD (dominios de transducción de péptidos unidos a un dominio de unión bicatenario) para la administración de oligonucleótidos, WO 2009/086558, que describe el uso de partículas SNALP (partículas lipídicas de ácido nucleico estables), que comprenden una mezcla de lípidos catiónicos y de fusión que permiten la captación celular y la liberación endosómica de la carga útil de ácido nucleico de la partícula, WO 2009/149418, que describe emulsiones de fosfolípido-aceite-ARNi neutras, WO 2007/121947, que describe el uso de un vehículo de administración basado en lipoplejos, WO 2009/132131, que describe el uso de nuevos lípidos y partículas de ácido nucleico-lípido que proporcionan una encapsulación eficiente y una administración eficiente del ácido nucleico encapsulado a las células, WO2004/091578 y WO2004/064805, que describen una tecnología de cocleato de capas alternantes de lípidos que forman espirales alrededor de una molécula de ácido nucleico, WO2003/047494 y WO2003/047493, que describen micelas inversas que incorporan ácidos nucleicos para la administración oral y mucosa, WO 2008/156702, que describe bacterias y una partícula terapéutica bacteriana (BTP), incluidos oligonucleótidos como vehículo de administración a las células. Cada una de las formulaciones a las que se ha hecho referencia o descritas en estas publicaciones está abarcada por la presente invención.

[0158] Se han unido una variedad de compuestos a los extremos de oligonucleótidos para facilitar su transporte a través de membranas celulares. Se ha hallado que los péptidos señal cortos encontrados en TAT de VIH, VP22 de HSV, antennapedia de Drosophila y otras proteínas permiten la transferencia rápida de biomoléculas a través de las membranas (revisado por Schwarze 2000). Estos péptidos señal, denominados dominios de transducción de proteínas (PTD), se han unido a oligonucleótidos para facilitar su administración a células cultivadas (Eguchi A, Dowdy SF, Trends Pharmacol Sci., 2009, 7: 341-5). Se han conjugado colesteroles a oligonucleótidos para mejorar su captación en células en animales (MacKellar 1992). Los grupos de colesterol terminales interactúan aparentemente con receptores o lípidos en las superficies de las células y facilitan la internalización de los oligonucleótidos modificados. Asimismo, la poli-L-lisina se ha conjugado con oligonucleótidos para reducir la carga negativa neta y mejorar la captación en las células (Leonetti 1990).

[0159] Se han desarrollado una variedad de compuestos que forman complejos con ácidos nucleicos, los administran a las superficies de las células y facilitan su captación en y liberación de los endosomas. Entre estos están: (1) una variedad de lípidos tales como DOTAP (u otro lípido catiónico), DDAB, DHDEAB y DOPE y (2) polímeros no a base de lípidos como la polietilenimina, la poliamidoamina y dendrímeros de estos y otros polímeros. En algunas de estas formas de realización, se emplea una combinación de lípidos tal como DOTAP y colesterol o un derivado de colesterol (patente de EE.UU. 6,770,291). Se ha demostrado que varios de estos reactivos facilitan la captación de ácidos nucleicos en animales.

[0160] Los componentes celulares implicados en la vía del miARN se están volviendo conocidos. Las proteínas que estabilizan y/o transportan miARN dentro de las células pueden mejorar la estabilidad y la actividad de los miARN porque deberían proteger y guiar los miARN unidos una vez que están en las células. Las mezclas de las proteínas transportadoras de miARN y los miARN podrían mejorar la eficacia de los tratamientos a base de miARN. Los ARN son moléculas hidrofílicas en virtud de su fosfato aniónico y su esqueleto de azúcar. Aunque las nucleobases son hidrofóbicas, la hidrofilicidad domina debido a la extensa unión de hidrógeno resultante de los residuos de fosfato y azúcar. El carácter hidrofílico y el esqueleto aniónico reducen la permeación celular. Se ha demostrado que la conjugación de grupos lipofílicos como el colesterol (Manoharan, 2002) y los derivados de los ácidos láurico y litocólico con funcionalidad C32 (Lorenz et al, 2004) mejoran la captación celular. Además, la unión de oligonucleótidos conjugados con esteroides a diferentes lipoproteínas del flujo sanguíneo, tal como la LDL, protege su integridad y dirige su biodistribución (Rump et al, 2000). Se ha demostrado también que el colesterol unido a moléculas antisentido (Bijsterbosch et al., 2001) y aptámeros (Rusconi et al., 2004) estabiliza los oligonucleótidos permitiendo la unión a lipoproteínas. Se ha demostrado que el colesterol mejora la captación y la estabilidad en suero de los ARNpi in vitro (Lorenz et al., 2004) e in vivo (Soutschek et al., 2004). Adicionalmente, una serie de moléculas pequeñas como SB-435495 (Blackie et al, (2002)), isradipina (Oravcova et al, 1994), amlodipina (Oravcova et al, 1994) y 2,2',4,4',5,5'-hexaclorobifenilo (Borlakoglu et al, 1990) podrían mejorar la captación celular y mejorar la resistencia a las nucleasas promoviendo la asociación lipoproteica.

Cribado con bibliotecas de miARN

[0161] Como se usa en la solicitud de patente, el cribado es un proceso donde múltiples reactivos específicos de miARN se administran por separado a las poblaciones celulares individuales o animales. En uno o más tiempos designados después de la administración, las poblaciones celulares o los animales se evalúan para uno o más fenotipos. Aquellas células o animales que tienen un fenotipo significativamente diferente a las células o los animales del grupo de control negativo se clasifican como positivos. El miARN que se estaba manipulando en la muestra se define como una coincidencia. Las coincidencias representan dianas para la investigación adicional y el potencial desarrollo terapéutico.

[0162] En algunas formas de realización, hay un proceso de múltiples pasos para el cribado, en determinadas formas de realización, hay cuatro pasos generales:

(1) Desarrollar un ensayo cuantitativo para controlar el proceso celular que se está estudiando.

[0163] Los ensayos que miden la intensidad de un fenotipo celular varían desde ensayos microscópicos que controlan el tamaño celular, el estado del ciclo celular o la tinción con anticuerpos hasta ensayos enzimáticos que valoran la producción de un sustrato específico en un lisado celular hasta mediciones directas de biomoléculas o moléculas pequeñas en lisados, en células o en medio.

[0164] Crítico para el éxito de un cribado es la creación de un ensayo que mida realmente el fenotipo celular y la maximización de la proporción de señal a ruido del ensayo. La maximización de la señal a ruido implica probar variables como el tiempo de ensayo, los componentes de ensayo, el tipo celular y la longitud de tiempo entre la transfección y el ensayo. Cuanto mayor es la diferencia en los resultados del ensayo entre un fenotipo positivo y un fenotipo de control negativo, mayor será la extensión en los resultados del cribado y mejor será la oportunidad para identificar genes interesantes.

(2) Optimizar las condiciones de transfección para las células deseadas.

[0165] El primer paso en este proceso es identificar un reactivo de transfección y las condiciones de siembra que maximizan la captación de los miARN sintéticos mientras se mantiene una alta viabilidad celular. Hallamos útil probar 2-5 reactivos de transfección diferentes cuando se usan líneas celulares o 5-10 condiciones de electroporación cuando se usan células primarias o en suspensión. La transfección se puede optimizar para el reactivo o la condición de electroporación que funcionó mejor entre las condiciones probadas. El cribado de bibliotecas específicas de miARN requiere condiciones para una transfección de alto rendimiento. En este tipo de cribado, se usó una introducción lentiviral en lugar de la transfección. Esto puede requerir técnicas de optimización alternativas.

(3) Cribado

[0166] Una vez que se han desarrollado el ensayo y el proceso de transfección, se puede introducir consecutivamente una biblioteca de miARN sintéticos o miARN expresados por virus en células en una placa de 24 o 96 pocillos. Las transfecciones duplicadas o triplicadas para cada reactivo proporcionan datos suficientes para un análisis estadístico razonable.

(4) Validar coincidencias

[0167] Validar una coincidencia implica demostrar que el fenotipo observado se debe al miARN diana. Las coincidencias se confirman típicamente administrando una serie de dilución del inhibidor de miARN o miARN sintético que se ha registrado como una coincidencia en la célula que se evaluó originalmente. La confirmación es ligeramente diferente a la validación. La confirmación es una repetición del fenotipo inducido por miARN, mientras que la validación puede incluir también la inversión del fenotipo antagonizando el fenotipo mediado por el miARN.

Marcaje y técnicas de marcaje

[0168] En algunas formas de realización de la divulgación, la presente invención se refiere a miARN que se marcan, tal como para ensayos de cribado para evaluar la relevancia terapéutica o diagnóstica de una especie de miARN particular. Se contempla que el miARN puede primero aislarse (o a partir de una célula donde el miARN es endógeno respecto a la célula o a partir de una célula donde el miARN es exógeno respecto a la célula) y/o purificarse antes del marcaje. Esto puede conseguir una reacción que marque de manera más eficaz el miARN, a diferencia de otro ARN en una muestra donde el miARN no se aísla o purifica antes del marcaje. En muchas formas de realización de la invención, el marcador no es radiactivo. Generalmente, los ácidos nucleicos se pueden marcar añadiendo nucleótidos marcados (proceso de un solo paso) o añadiendo nucleótidos y marcando los nucleótidos añadidos (proceso en dos pasos).

[0169] Además, los miARN se pueden marcar como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n.° de serie 60/649,584. Tales nucleótidos incluyen aquellos que se pueden marcar con un colorante, incluido un colorante fluorescente, o con una molécula tal como la biotina. Los nucleótidos marcados están fácilmente disponibles; se pueden adquirir comercialmente o se pueden sintetizar mediante reacciones conocidas por aquellas personas expertas en la técnica.

Nucleótidos para marcar

[0170] Los nucleótidos para marcar no son nucleótidos de origen natural, sino que se refieren a nucleótidos preparados que tienen una fracción reactiva en ellos. Las funcionalidades reactivas específicas de interés incluyen: amino, sulfhidrilo, sulfoxilo, aminosulfhidrilo, azido, epóxido, isotiocianato, isocianato, anhídrido, monoclorotriazina, diclorotriazina, piridina sustituida con mono- o dihalógeno, diazina mono- o disustituida, maleimida, epóxido, aziridina, haluro de sulfonilo, haluro de ácido, haluro de alquilo, haluro de arilo, alquilsulfonato, éster de N-hidroxisuccinimida, éster de imido, hidrazina, azidonitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehído, yodoacetilo, éster de cianometilo, éster de p-nitrofenilo, éster de o-nitrofenilo, éster de hidroxipiridina, carbonilimidazol y los otros grupos químicos de este tipo. En algunas formas de realización, la funcionalidad reactiva se puede unir directamente a un nucleótido o se puede unir al nucleótido a través de un grupo de unión. La fracción funcional y cualquier conector no pueden perjudicar sustancialmente la capacidad del nucleótido que se va a añadir al miARN o que se va a marcar. Los grupos de unión representativos incluyen grupos de unión que contienen carbono, que típicamente varían aproximadamente de 2 a 18, normalmente aproximadamente de 2 a 8 átomos de carbono, donde los grupos de unión que contienen carbono pueden o pueden no incluir uno o más heteroátomos, por ejemplo, S, O, N, etc., y puede o puede no incluir uno o más sitios de insaturación. De interés particular en muchas formas de realización son los grupos de unión de alquilo, típicamente grupos de unión de alquilo inferiores de 1 a 16, normalmente de 1 a 4 átomos de carbono, donde los grupos de unión pueden incluir uno o más sitios de insaturación. Los nucleótidos (o cebadores) funcionalizados usados en los métodos anteriores de generación de dianas funcionalizadas se pueden fabricar usando protocolos conocidos o comprar de vendedores comerciales, por ejemplo, Sigma, Roche, Ambion e IDT. Los grupos funcionales se pueden preparar según maneras conocidas por las personas expertas en la técnica, incluida la información representativa encontrada en las patentes de EE.Uu .

Nos. 4,404,289; 4,405,711; 4,337,063 y 5,268,486, y la patente Br. n.° 1,529,202.

[0171] En varias formas de realización de la invención se usan nucleótidos modificados con amina. El nucleótido modificado con amina es un nucleótido que tiene un grupo de amina reactiva para la unión del marcador. Se contempla que cualquier ribonucleótido (G, A, U o C) o desoxirribonucleótido (G, A, T o C) se puede modificar para el marcaje. Los ejemplos incluyen, pero de forma no limitativa, los siguientes ribo- y desoxirribonucleótidos modificados: 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-ATP; N6-(4-amino)butil-ATP, N6-(6-amino)butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-amino)hexil-ATP; 8-[(6-amino)hexil]-amino-ATP; 5-propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP; 5-(3-aminoalil)-dUTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-dATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-dATP; N-(4-amino)butil-dATP, N6-(6-amino)butil-dATP, N4-[2,2-oxi-to-(etilamino)]-dCTP; N6-(6-amino)hexil-dATP; 8-[(6-amino)hexil]-amino-dATP; 5-propargilamino-dCTP y 5-propargilamino-dUTP. Tales nucleótidos se pueden preparar según métodos conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Además, una persona experta en la materia podría preparar otras entidades de nucleótido con la misma modificación de amina, tal como un 5-(3-aminoalil)-CTP, g Tp , ATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP en lugar de un 5-(3- aminoallil)-UTP.

Técnicas de marcaje

[0172] En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos se marcan añadiendo catalíticamente al ácido nucleico un nucleótido o nucleótidos ya marcado(s). Uno o más nucleótidos marcados se pueden añadir a las moléculas de miARN. Véase la patente de EE.UU. 6,723,509.

[0173] En otras formas de realización, un nucleótido o nucleótidos no marcado(s) se añade catalíticamente a un miARN y el nucleótido no marcado se modifica con una fracción química que permite que se marque posteriormente, en formas de realización de la invención, la fracción química es una amina reactiva de manera que el nucleótido es un nucleótido modificado con amina. Ejemplos de nucleótidos modificados con amina son bien conocidos por las personas expertas en la técnica y muchos están disponibles comercialmente tal como de Ambion, Sigma, Jena Bioscience y TriLink.

[0174] A diferencia del marcaje de ADNc durante su síntesis, la cuestión para marcar los miARN es cómo marcar la molécula ya existente. Con este fin, podemos usar una enzima capaz de usar un ribonucleótido o desoxirribonucleótido de di- o trifosfato como un sustrato para su adición a un miARN, una molécula de ARN pequeña. Además, en formas de realización específicas, esto implica usar un ribonucleótido de di- o trifosfato modificado, que se añade al extremo 3' de un miARN. La fuente de la enzima no es limitante. Ejemplos de fuentes para las enzimas incluyen levadura, bacterias gram-negativas tales como E. coli, Lactococcus lactis y el virus de la viruela ovina.

[0175] Las enzimas capaces de añadir tales nucleótidos incluyen, pero de forma no limitativa, la poli(A) polimerasa, la transferasa terminal y la polinucleótido fosforilasa. En formas de realización específicas de la invención, se contempla que la ligasa NO es la enzima usada para añadir el marcador y, en cambio, se emplea una enzima no ligasa.

[0176] La poli(A) polimerasa se ha clonado a partir de una serie de organismos, desde plantas hasta seres humanos. Se ha demostrado que cataliza la adición de tractos de homopolímero a ARN (Martin et al, RNA, 4(2): 226-30, 1998).

[0177] La transferasa terminal cataliza la adición de nucleótidos al extremo 3' de un ácido nucleico.

[0178] La polinucleótido fosforilasa puede polimerizar nucleótido difosfatos sin la necesidad de un cebador.

Marcadores y etiquetas

[0179] Los miARN o las sondas de miARN se pueden marcar con un marcador o etiqueta de emisión de positrones (incluido radiactivo), enzimático, colorimétrico (incluye el espectro visible y UV, incluido fluorescente), luminiscente o de otro tipo con fines de detección o aislamiento. El marcador se puede detectar directa o indirectamente. Los marcadores radiactivos incluyen 125I, 32P, 33P y 35S. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen la fosfatasa alcalina, la luciferasa, la peroxidasa de rábano y la p-galactosidasa. Los marcadores también pueden ser proteínas con propiedades luminiscentes, por ejemplo, la proteína verde fluorescente y la ficoeritrina.

[0180] Los marcadores colorimétricos y fluorescentes contemplados para el uso como conjugados incluyen, pero de forma no limitativa, AMCA, colorantes Alexa Fluor, colorantes BODIPY, tal como BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIP Y-R6G, BODIPY-TRX; Cascade Blue; Cascade Yellow; cumarina y sus derivados, tales como 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina e hidroxicumarina; colorantes de cianina, tales como Cy3 y Cy5; eosinas y eritrosinas; fluoresceína y sus derivados, tales como isotiocianato de fluoresceína; quelatos macrocíclicos de iones lantánidos, tales como Quantum Dye(™>; Marina Blue; Oregon Green; colorantes de rodamina, tal como rojo de rodamina, tetrametilrodamina y rodamina 6G; Texas Red;

[0181] Ejemplos específicos de colorantes incluyen, pero de forma no limitativa, aquellos identificados anteriormente y los siguientes: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500. Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750; colorantes BODIPY amino-reactivos, tales como BODIPY 493/503, BODEPY 530/550, BODEPY 558/568, BODIPY 564/570, BODDPY 576/589, BODIPY 581/591, BODEPY 630/650, BODIPY 650/655, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODEPY TMR y BODIPY-TR; Cy3, Cy5, 6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, verde de rodamina, rojo de rodamina, renografina, ROX, SYPRO, TAMRA, 2',4',5',7-tetrabromosulfonfluoresceína y TET.

[0182] Ejemplos específicos de ribonucleótidos fluorescentemente marcados están disponibles de Molecular Probes, y estos incluyen Alexa Fluor 488-5-UTP, Fluoresceína-12-UTP, BODEPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, tetrametilrodamina-6-UTP, Alexa Fluor 546-14-UTP, Texas Red-5-UTP y BODIPY TR-14-UTP. Otros ribonucleótidos fluorescentes están disponibles de Amersham Biosciences, tales como Cy3-UTP y Cy5-UTP. Ejemplos de desoxirribonucleótidos fluorescentemente marcados incluyen dinitrofenilo (DNP)-11-dUTP, Cascade Blue-7-dUTP, Alexa Fluor 488-5-dUTP, fluoresceína-12-dUTP, Oregon Green 488-5-dUTP, BODEPY FL-14-dUTP, verde de rodamina-5-dUTP, Alexa Fluor 532-5-dUTP, BODEPY TMR-14-dUTP, tetrametilrodamina-6-dUTP, Alexa Fluor 546-14-dUTP, Alexa Fluor 568-5-dUTP, Texas Red-12-dUTP, Texas Red-5-dUTP, BODEPY TR-14-dUTP, Alexa Fluor 594-5-dUTP, BODEPY 630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP; Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP. Se contempla que los ácidos nucleicos se pueden marcar con dos marcadores diferentes.

[0183] Se contempla que los miARN sintéticos se pueden marcar con más de un marcador o con dos marcadores diferentes. Además, se puede emplear la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en métodos de la invención (por ejemplo, Klostermeier et al., 2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001). Pueden usarse colorantes de transferencia de energía fluorescente, tal como el heterodímero de naranja de tiazol-etidio; y, TOTAB.

[0184] Alternativamente, el marcador puede no ser detectable per se, sino indirectamente detectable o que permite el aislamiento o la separación del ácido nucleico al que se dirige. Por ejemplo, el marcador podría ser biotina, digoxigenina, cationes polivalentes, grupos quelantes y los otros ligandos, incluyen ligandos para un anticuerpo.

Técnicas de visualización

[0185] Un número de técnicas para visualizar o detectar ácidos nucleicos marcados están fácilmente disponibles. La referencia por Stanley T. Crooke, 2000 tiene una discusión de tales técnicas (capítulo 6). Tales técnicas incluyen, microscopía, matrices, fluorometría, dispositivos Light cycler u otras máquinas de PCR(™> en tiempo real, análisis FACS, contadores de centelleo, dispositivos Phosphoimager, contadores Geiger, IRM, TAC, métodos de detección a base de anticuerpos (transferencias Western, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica), técnicas histoquímicas, HPLC (Griffey et al, 1997, espectroscopia, electroforesis capilar en gel (Cummins et ah, 1996), espectroscopia; espectroscopia de masas; técnicas radiológicas; y técnicas de balance de masas. Alternativamente, los ácidos nucleicos se pueden marcar o etiquetar para permitir su aislamiento eficiente. En otras formas de realización de la invención, los ácidos nucleicos se biotinilan.

[0186] Cuando se emplean dos o más marcadores diferencialmente coloreados, se pueden emplear técnicas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para caracterizar el ARNdc. Además, una persona experta en la materia es bien consciente de maneras de visualizar, identificar y caracterizar ácidos nucleicos marcados y, por consiguiente, tales protocolos se pueden usar como parte de la invención. Ejemplos de herramientas que se pueden usar incluyen también la microscopía de fluorescencia, un bioanalizador, un lector de placas, Storm (Molecular Dynamics), escáner de matrices, FACS (clasificador celular activado por fluorescencia) o cualquier instrumento que tenga la capacidad para excitar y detectar una molécula fluorescente.

Preparación de matrices

[0187] La presente invención se puede emplear con matrices de miARN, que son macromatrices o micromatrices ordenadas de moléculas de ácido nucleico (sondas) que son completamente o casi complementarias o idénticas a una pluralidad de moléculas de miARN o moléculas de miARN precursoras y que se posicionan en un material de soporte en una organización separada espacialmente. Las macromatrices son típicamente láminas de nitrocelulosa 0 nilón sobre las que se han localizado las sondas. Las micromatrices sitúan las sondas de ácido nucleico de forma más densa, de manera que pueden caber hasta 10.000 moléculas de ácido nucleico en una región típicamente de 1 a 4 centímetros cuadrados. Las micromatrices se pueden fabricar localizando moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, genes, oligonucleótidos, etc., sobre sustratos o fabricando secuencias de oligonucleótidos in situ sobre un sustrato. Las moléculas de ácido nucleico localizadas o fabricadas se pueden aplicar en un patrón de matriz de alta densidad de hasta aproximadamente 30 moléculas de ácido nucleico no idénticas por centímetro cuadrado o mayores, por ejemplo, hasta aproximadamente 100 o incluso 1000 por centímetro cuadrado. Las micromatrices usan típicamente vidrio recubierto como soporte sólido, a diferencia del material a base de nitrocelulosa de las matrices de filtro. Con una matriz ordenada de muestras de ácido nucleico complementario a miARN, la posición de cada muestra se puede seguir y vincular a la muestra original. Aquellas personas expertas en la técnica conocen una variedad de dispositivos de matrices diferentes donde una pluralidad de sondas de ácido nucleico distintas está asociada de forma estable a la superficie de un soporte sólido. Sustratos útiles para las matrices incluyen nilón, vidrio y silicio. Tales matrices pueden variar en una serie de maneras diferentes, incluidas la longitud media de las sondas, la secuencia o los tipos de sondas, la naturaleza del enlace entre la sonda y la superficie de la matriz, por ejemplo, covalente o no covalente, y similares.

[0188] Métodos y equipos representativos para preparar una micromatriz se han descrito, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos. 5,143,854; 5,202,231; 5,242,974; 5,288,644; 5,324,633; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,432,049; 5,436,327; 5,445,934; 5,468,613; 5,470,710; 5,472,672; 806; 5,525,464; 5 503 ,980; 5 ,270; 5525 464; 5527 681; 5529 756; 5532 128; 5545 531; 5547 ,839; 5 554 5 556 752; 5 561 071; 5571 ,639; 5580 726; 5580 ,732; 5593 839; 5599 695; 5599 672; 5610 ;287; 5624 711; 5631 134; 5 639 ,603; 5654413; 5 658 734; 5661 ,028; 5665 547; 5667 972; 5695 940; 5700 ,637; 5 744 305; 5800 992; 5 807 522; 5830 ,645; 5837 196; 5871 ,928; 5847 219; 5 876 932; 5919 626; 6004 ,755; 6 087 102; 6368 799; 6,383,749; 6,617,112; 6,638,717; 6,720,138, así como WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/21265; WO 95/21944; WO 95/35505; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; WO 99/35505; WO 09923256; WO 09936760; WO0138580; WO 0168255; WO 03020898; WO 03040410; WO 03053586; WO 03087297; WO 03091426; WO03100012; WO 04020085; WO 04027093; EP 373203; EP 785280; EP 799897 y UK 8803000. Se contempla que las matrices pueden ser matrices de alta densidad, de manera que contengan 100 o más sondas diferentes. Se contempla que pueden contener 1000, 16.000, 65.000, 250.000 o 1.000.000 o más sondas diferentes. Las sondas se pueden dirigir a dianas en uno o más organismos diferentes. Las sondas de oligonucleótidos varían de 5 a 50, 5 a 45, 10 a 40 o 15 a 40 nucleótidos de longitud en algunas formas de realización, en formas de realización determinadas, las sondas de oligonucleótidos tienen de 20 a 25 nucleótidos de longitud.

[0189] Por lo general se conocen la ubicación y la secuencia de cada secuencia de sonda diferente en la matriz. Además, el gran número de sondas diferentes pueden ocupar un área relativamente pequeña que proporciona una matriz de alta densidad que tiene una densidad de sonda generalmente mayor de aproximadamente 60, 100, 600, 1000, 5.000, 10.000, 40.000, 100.000 o 400.000 sondas de oligonucleótidos diferentes por cm2 El área de superficie de la matriz puede ser de aproximadamente o menos de aproximadamente 1, 1,6, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cm2.

[0190] Además, una persona experta en la materia podría analizar fácilmente datos generados usando una matriz. Tales protocolos se describen arriba e incluyen información encontrada en WO 9743450; WO 03023058; WO 03022421; WO 03029485; WO03067217; WO 03066906; WO 03076928; WO 03093810; WO 03100448A1.

[0191] Recientemente, se han vuelto disponibles métodos de perfilado alternativos, basados en la hibridación en solución y la posterior inmovilización e identificación, por ejemplo, la plataforma Illumina.

Preparación de la muestra

[0192] Se contempla que el miARN de una amplia variedad de muestras se puede analizar usando los ensayos descritos en la presente. Mientras que se contempla el miARN endógeno para el uso con algunas formas de realización, el miARN recombinante o sintético -incluidos los ácidos nucleicos que son idénticos al miARN endógeno o el miARN precursor- también puede manejarse y analizarse como se describe en este caso. Las muestras pueden ser muestras biológicas, en cuyo caso pueden ser de sangre, LCR, tejido, órganos, tumor, semen, esputo, deposición, orina, saliva, lágrimas, otro líquido corporal, folículos pilosos, piel o cualquier muestra que contenga o constituya células biológicas. Alternativamente, la muestra puede no ser una muestra biológica, sino ser una mezcla química, tal como una mezcla reactiva libre de células (que puede contener una o más enzimas biológicas).

Ensayos celulares para identificar miARN relacionados con una enfermedad

[0193] En la divulgación, las aplicaciones específicamente contempladas incluyen identificar miARN que contribuyen a la TEM que son ellos mismos partes de una enfermedad o afección o podrían de otro modo estar asociados a una enfermedad particular. Las aplicaciones específicamente contempladas para la invención incluyen identificar miARN que contribuyen a la TEM que son ellos mismos partes de un cáncer o podrían de otro modo estar asociados a una enfermedad particular. Adicionalmente, una aplicación contemplada incluye la identificación de miARN que son capaces de revertir la TEM e inducir la TME. Además, se pueden comparar las funciones de miARN entre una muestra que se cree que es susceptible a un cáncer particular asociado a la TEM y una que se cree que es no susceptible o resistente a ese cáncer. Concretamente se contempla que las moléculas de a Rn de la presente invención se pueden usar para tratar cualquiera de las enfermedades o afecciones discutidas en la sección precedente o modular cualquiera de las vías celulares discutidas en la sección precedente. Las aplicaciones específicamente contempladas incluyen identificar miARN que contribuyen a procesos celulares de TEM que son ellos mismos partes de una enfermedad o pueden de otro modo estar asociados a una enfermedad particular. Además, se pueden comparar funciones de miARN entre una muestra que se cree que es susceptible a un cáncer particular asociado a la TEM y uno que se cree que no es susceptible o resistente a ese cáncer.

[0194] La eficacia de diferentes fármacos terapéuticos se puede modificar mediante miARN tal y como se define y se usa según la presente invención. Además, se ha descrito que las células tumorales que han experimentado una TEM pueden volverse resistentes a la quimioterapia y la inmunoterapia (Thiery et al. 2009 Cell 139: 871-90). Por lo tanto, fármacos a base de miARN que inducen la inversión de la TEM pueden mejorar la susceptibilidad a, por ejemplo, la quimioterapia y la inmunoterapia. Tales fármacos terapéuticos incluyen, pero de forma no limitativa, fármacos quimioterapéuticos. Un "agente quimioterapéutico" se utiliza para connotar un compuesto o una composición que se administra en el tratamiento del cáncer. Estos agentes o fármacos se categorizan por su modo de actividad dentro de una célula, por ejemplo, si y en qué fase afectan al ciclo celular. Alternativamente, un agente se puede caracterizar en función de su capacidad para reticular directamente el ADN, para intercalarse en el ADN o para inducir aberraciones cromosómicas y mitóticas afectando a la síntesis de ácidos nucleicos. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos entran en las categorías siguientes: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos y nitrosoureas.

[0195] Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como la tiotepa y la ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como el busulfano, el improsulfano y el piposulfano; aziridinas tales como la benzodopa, la carbocuona, la meturedopa y la uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluidas la altretamina, la trietilenmelamina, la trietilenfosforamida, la trietilentiofosforamida y la trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente la bulatacina y la bulatacinona); una camptotecina (incluido el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos KW-2189 y CBl-TMl); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como el clorambucil, la clornafazina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el hidrocloruro de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembiquina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida, la mostaza de uracilo; nitrosureas tales como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, la caliqueamicina, especialmente la caliqueamicina gamma y la caliqueamicina omega); dinemicina, incluida la dinemicina A; bisfosfonatos, tal como el clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos antiobióticos de la cromoproteína enediína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluidas la morfolino-doxorrubicina, la cianomorfolino-doxorrubicina, la 2-pirrolino-doxorrubicina y la desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como la mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como la denopterina, el metotrexato, la pteropterina, el trimetrexato; análogos de la purina tales como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina, la tioguanina; análogos de la pirimidina tales como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina, la floxuridina; andrógenos tales como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, el mepitiostano, la testolactona; antisuprarrenales tales como la aminoglutetimida, el mitotano, el trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como el ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como la maitansina y las ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, la verracurina A, la roridina A y la anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, el paclitaxel y el doxetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; complejos de coordinación de platino tales como la cisplatina, el oxaliplatino y la carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (por ejemplo, CPT-Il); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como el ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

[0196] También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (MSRE), incluidos, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LYl 17018, onapristona y toremifeno; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestania, fadrozol, vorozol, letrozol y anastrozol; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-a, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia génica y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Se puede encontrar una lista de fármacos oncológicos aprobados por la FDA de EE.UU. con sus indicaciones aprobadas en la red informática mundial en accessdata.fda.gov/scripts/cder/onctools/druglist.cfm. Además, se contempla que también pueden compararse las muestras que presentan diferencias en la actividad de determinadas vías. Tales vías celulares incluyen, pero de forma no limitativa, las siguientes: cualquier vía de adhesión o motilidad, incluidas, pero de forma no limitativa, aquellas que implican AMP cíclico, proteína quinasa A, receptores acoplados a proteínas G, adenilciclasa, L-selectina, E-selectina, PECAM, VCAM-I, a-actinina, paxilina, cadherinas, AKT, integrina-a, integrina-p, RAF-I, ERK, PI-3 quinasa, vinculina, metaloproteinasas de la matriz, Rho GTPasas, p85, factores trefoil, profilina, FAK, MAP quinasa, Ras, caveolina, calpaína-1, calpaína-2, receptor del factor de crecimiento epidérmico, ICAM-1, ICAM-2, cofilina, actina, gelsolina, Rho A, Rac, quinasa de cadena ligera de la miosina, receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas o ezrina; cualquier vía de apoptosis, incluidas, pero de forma no limitativa, aquellas que implican AKT, ligando Fas, NFKB, caspasa-9, PB quinasa, caspasa-3, caspasa-7, ICAD, CAD, EndoG, granzima B, Bad, Bax, Bid, Bak, APAF-I, citocromo C, p53, a Tm , Bcl-2, PARP, Chkl, Chk2, Rho-21, c-Jun, Rho73, Rad51, Mdm2, Rad50, c-Abl, BRCA-I, perforina, caspasa-4, caspasa-8, caspasa-6, caspasa-1, caspasa-2, caspasa-10, Rho, Jun quinasa, Jun quinasa quinasa, Rip2, lamina-A, lamina-Bl, lamin-B2, receptor Fas, H2O2, granzima A, NADPH oxidasa, HMG2, CD4, CD28, CD3, TRADD, IKK, FADD, GADD45, receptor de muerte DR3, receptor de muerte DR4/5, FLIP, APO-3, GRB2, SHC, ERK, MEK, RAF-1, AMP cíclico, proteína quinasa A, E2F, proteína del retinoblastoma, Smac/Diablo, receptor ACH, 14-3-3, FAK, SODD, receptor del TNF, RTP, ciclina-Dl, PCNA, BcI-XL, PIP2, PIP3, PTEN, ATM, Cdc2, proteína quinasa C, calcineurina, IKKa, IKKp, IKKy, SOS-I, c-FOS, Traf-1, Traf-2, kBp o el proteasoma; cualquier vía de activación celular, incluidas, pero de forma no limitativa, aquellas que implican proteína quinasa A, óxido nítrico, caveolina-1, actina, calcio, proteína quinasa C, Cdc2, ciclina B, Cdc25, GRB2, proteína quinasa SRC, factores de ribosilación de ADP (ARF), fosfolipasa D, AKAP95, p68, Aurora B, CDK1, Eg7, histona H3, PKAc, CD80, PI3 quinasa, WASP, Arp2, Arp3, p34, p20, PP2A, angiotensina, enzima de conversión de la angiotensina, receptor activado por proteasa 1, receptor activado por proteasa 4, Ras, RAF-I, PLCp, PLCy, COX-I, receptores acoplados a la proteína G, fosfolipasa A2, IP3, SUMO1, SUMO 2/3, ubiquitina, Ran, Ran-GAP, Ran-GEF, p53, glucocorticoides, receptor de glucocorticoides, componentes del complejo SWI/SNF, RanBPl, RanBP2, importinas, exportinas, RCCl, c D40, ligando CD40, p38, DCKa, IKKp, NFKB, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TRAF6, IL-4, receptor de IL-4, CDK5, factor de transcripción AP-I, CD45, CD4, receptores de células T, MAP quinasa, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, c-Jun, c-Fos, Jun quinasa, GRB2, SOS-I, ERK-I, ERK, JAK2, STAT4, IL-12, receptor de IL-12, sintasa de óxido nítrico, TYK2, IFNy, elastasa, IL-8, epitelinas, IL-2, receptor de IL-2, CD28, SMAd 3, SMAD4, TGFp o receptor de TGFp; cualquier vía de regulación del ciclo celular, señalización o diferenciación, incluidas, pero de forma no limitativa, aquellas que implican TNF, proteína quinasa SRC, Cdc2, ciclina B, Grb2, Sos-1, SHC, p68, quinasas Aurora, proteína quinasa A, proteína quinasa C, Eg7, p53, ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas, factor de crecimiento neural, factor de crecimiento epidérmico, proteína del retinoblastoma, ATF-2, ATM, ATR, AKT, CHK1, CHK2, 14-3-3, WEE1, CDC25 CDC6, proteínas del complejo de reconocimiento del origen, pl5, pl6, p27, p21, ABL, c-ABL, SMAD, ubiquitina, SUMO, proteínas de choque térmico, Wnt, GSK-3, angiotensina, p73 cualquier PPAR, TGFa, TGFp, p300, MDM2, GADD45, Notch, cdc34, BRCA-I, BRCA-2, SKP1, el proteasoma, CULI, E2F, pi 07, hormonas esteroides, receptores de hormonas esteroides, kBa, kBp, Sin3A, proteínas de choque térmico, Ras, Rho, ERK, IKK, PI3 quinasa, Bcl-2, Bax, PCNA, MAP quinasas, dineína, RhoA, PKAc, ciclina AMP, FAK, PIP2, PIP3, integrinas, trombopoyetina, Fas, ligando Fas, PLK3, MEK, JAK, STAT, acetilcolina, calcineurina de paxilina, p38, importinas, exportinas, Ran, Rad50, Rad51, ADN-polimerasa, ARN-polimerasa, Ran-GAP, Ran-GEF, NuMA, Tpx2, RCCl, Sonic Hedgehog, Crml, Patched (Ptc-1), m Pf , quinasas CaM, tubulina, actina, proteínas asociadas al cinetocoro, proteínas de unión al centrómero, telomerasa, TERT, PP2A, c-MYC, insulina, receptores de células T, receptores de células B, CBP, 1KB, NFKB, RACl, RAFl, EPO, diacilglicerol, c-Jun, c-Fos, Jun quinasa, factores inducibles por hipoxia, GATA4, p-catenina, a-catenina, calcio, arrestina, survivina, caspasas, procaspasas, CREB, CREM, cadherinas, PECAM, corticosteroides, factores estimulantes de colonias, calpaínas, adenilciclasa, factores de crecimiento, óxido nítrico, receptores de transmembrana, retinoides, proteínas G, canales iónicos, activadores transcripcionales, coactivadores transcripcionales, represores transcripcionales, interleucinas, vitaminas, interferones, correpresores transcripcionales, el poro nuclear, nitrógeno, toxinas, proteólisis o fosforilación; o cualquier vía metabólica, incluidas pero de forma no limitativa, aquellas que implican la biosíntesis de aminoácidos, la oxidación de ácidos grasos, la biosíntesis de neurotransmisores y otras moléculas de señalización celular, la biosíntesis de poliaminas, la biosíntesis de lípidos y esfingolípidos, el catabolismo de aminoácidos y nutrientes, la síntesis de nucleótidos, eicosanoides, reacciones de transporte electrónico, la degradación asociada a RE, la glucólisis, la fibrinólisis, la formación de cuerpos cetónicos, la formación de fagosomas, el metabolismo del colesterol, la regulación de toma de alimento, la homeostasis de energía, la activación de protrombina, la síntesis de lactosa y otros azúcares, la resistencia a múltiples fármacos, la biosíntesis de fosfatidilcolina, el proteasoma, la proteína precursora amiloide, GTPasas Rab, la síntesis de almidón, la glicosilación, la síntesis de fosfoglicéridos, vitaminas, el ciclo del ácido cítrico, el receptor de IGF-I, el ciclo de la urea, el transporte vesicular o vías de rescate. Se contempla además que las moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación se puedan emplear en métodos de diagnóstico y terapéuticos con respecto a cualquiera de las vías o factores anteriores. Así, en algunas formas de realización de la invención, un miARN inhibe, elimina, activa, induce, aumenta o modula de otro modo una o más de las vías o factores anteriores se contempla como parte de los métodos de la invención. El ácido nucleico se puede usar en la divulgación para diagnosticar una enfermedad o afección en función de la relación de ese miARN con cualquiera de las vías anteriormente descritas.

Otros ensayos

[0197] Además del uso de matrices y micromatrices, se contempla que un número de ensayos de diferencia podrían emplearse para analizar miARN, sus actividades y sus efectos. Tales ensayos incluyen, pero de forma no limitativa, RT-PCR, hibridación in situ, ensayo de protección de la hibridación (HPA) (GenProbe), ensayo de ADN ramificado (bADN) (Collins, M. L. et al. (1997). Nucleic Acids Research 25: 2979-2984), amplificación en círculo rodante (RCA), detección de hibridación de molécula única (US Genomics), ensayo Invader (ThirdWave Technologies) y Bridge Litigation Assay (Qiagen). Se contempla que tales métodos se puedan usar en el contexto de matrices, así como en el contexto de ensayos de diagnóstico.

Aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico

[0198] Los miARN que afectan a rasgos fenotípicos proporcionan puntos de intervención para aplicaciones terapéuticas, así como aplicaciones de diagnóstico (cribando para la presencia o ausencia de un miARN particular). Concretamente se contempla que las moléculas de ARN de la presente invención se puedan usar para tratar cualquiera de las enfermedades o afecciones discutidas en la sección precedente. Además, cualquiera de los métodos anteriormente descritos también puede emplearse con respecto a aspectos terapéuticos de la invención y a aspectos de diagnóstico de la divulgación. Por ejemplo, métodos con respecto a la detección de miARN o su cribado también pueden emplearse en un contexto de diagnóstico. En aplicaciones terapéuticas, una cantidad eficaz de los miARN de la presente invención se administra a una célula, que puede o puede no estar en un animal. En algunas formas de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de los miARN de la presente invención se administra a un individuo para el tratamiento del cáncer asociado a la TEM. En la divulgación, en algunas formas de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de los miARN de la presente invención se administra a un individuo para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a la TEM. El término "cantidad eficaz" como se utiliza en este caso se define como la cantidad de las moléculas de la presente invención que son necesarias para resultar en el cambio fisiológico deseado en la célula o el tejido al que se administra. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se utiliza en este caso se define como la cantidad de las moléculas de la presente invención que consigue un efecto deseado con respecto a un cáncer asociado a la TEM como se ha definido en la presente anteriormente. Una persona experta en la materia reconoce fácilmente que en muchos casos las moléculas pueden no proporcionar una cura, pero pueden proporcionar un beneficio parcial, tal como el alivio o la mejora de al menos un síntoma. En algunas formas de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Así, en algunas formas de realización, una cantidad de moléculas que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".

[0199] En algunas formas de realización, una molécula tiene una secuencia que corresponde a la secuencia de miARN de ese animal particular, a diferencia de otro animal. Así, en algunas formas de realización, una secuencia humana se utiliza como una molécula de ARN de la presente invención. En experimentos in vivo, una secuencia de miARN usada en un animal de prueba puede diferir de una secuencia humana correspondiente. En este caso, un miARN que difiere de la secuencia humana se puede usar para demostrar el efecto terapéutico en el animal. Los resultados obtenidos con esta secuencia evaluada en un animal se pueden extrapolar resultados esperados en humanos con una molécula de miARN correspondiente.

Modos de administración y formulaciones

[0200] Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden administrar a un sujeto solo o en forma de una composición farmacéutica para el tratamiento de una afección o enfermedad. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o productos auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento del miARN en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. Para la administración tópica, los miARN de la invención se pueden formular como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc. tal y como se conocen bien en la técnica. Las formulaciones sistémicas incluyen aquellas diseñadas para la administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como aquellas diseñadas para la administración transdérmica, transmucosa, inhalación, oral o pulmonar. Para inyección, los ácidos nucleicos de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer o un tampón de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico pueden estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes de usar. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a penetrar. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Para la administración oral, los ácidos nucleicos se pueden formular fácilmente combinando las moléculas con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que los ácidos nucleicos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente al que se va a tratar. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen productos de relleno tales como azúcares, por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Si se desea, pueden añadirse agentes de desintegración, como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal derivada tal como el alginato de sodio. Si se desea, formas de dosificación sólidas se pueden recubrir de azúcares o con recubrimiento entérico usando técnicas estándar. Para preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los portadores, los excipientes o los diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Adicionalmente, pueden añadirse agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares. Para la administración bucal, las moléculas pueden tomar la forma de comprimidos, pastillas, etc. formuladas de manera convencional. Para la administración por inhalación, las moléculas para el uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de un aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y los cartuchos de gelatina para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular con una mezcla en polvo de los ácidos nucleicos y una base en polvo adecuada tal como la lactosa o el almidón. Las moléculas de ARN también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como la manteca de cacao u otros glicéridos.

[0201] Además de las formulaciones descritas previamente, las moléculas también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de actuación prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las moléculas se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados difícilmente solubles, por ejemplo, como una sal difícilmente soluble. Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de administración farmacéutica.

[0202] Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de administración que se pueden usar para administrar ácidos nucleicos de la invención.

[0203] Un ácido nucleico de la invención se puede administrar en combinación con un portador o lípido para aumentar la captación celular. Por ejemplo, el oligonucleótido se puede administrar en combinación con un lípido catiónico. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero de forma no limitativa, lipofectina, DOTMA, DOPe y DOTAP. La publicación de WO0071096, describe diferentes formulaciones, tal como una formulación de DOTAP:colesterol o derivados de colesterol que puede usarse eficazmente para la terapia génica. Otras descripciones discuten también diferentes formulaciones lipídicas o liposómicas, incluidas nanopartículas y métodos de administración; estas incluyen, pero de forma no limitativa, la publicación de patente de EE.UU.

20030203865, 20020150626, 20030032615 y 20040048787. También se describen métodos usados para formar partículas en las patentes de EE.UU. Nos. 5,844,107, 5,877,302, 6,008,336, 6,077,835, 5,972,901, 6,200,801 y 5,972,900. Los ácidos nucleicos también se pueden administrar en combinación con una amina catiónica tal como la poli-L-lisina.

[0204] Los ácidos nucleicos también se pueden conjugar con una fracción química, tal como la transferrina y los colesterilos. Además, los oligonucleótidos se pueden dirigir a ciertos órganos o tejidos uniendo grupos químicos específicos al oligonucleótido. Por ejemplo, la unión del oligonucleótido a una matriz adecuada de residuos de manosa dirigirá el oligonucleótido al hígado. Otros ligandos dirigidos se describen en Liu B., Brief Funct. Genomic Proteomic 6: 112-119, 2007. Ejemplos adicionales son azúcares de carbohidratos tales como la galactosa, la N-acetilgalactosamina, la manosa; vitaminas tales como los folatos; moléculas pequeñas, incluidas el naproxeno, el ibuprofeno u otras moléculas conocidas de unión a proteínas, la ciclodextrina, que se dirige al receptor de transferrina, también llamada ciclodextrina modificada de transferencia (Hu-Lieskovan et al., 2005), PEI (PEG-PEI dirigido a RGD, Schiffelers et al. 2004), la anisamida, el péptido RGD o miméticos de RGD, la poliarginina, el fragmento de anticuerpo anti-TfR de cadena sencilla/TfRscFv, la anexina A5 (dirigida a membranas que exponen fosfatidilserina, Garnier B. et al., Bioconjug Chem., 2009, 11: 2114-22), WO 2009/126933, que describe composiciones y métodos para la administración específica de sitio de ácidos nucleicos combinándolos con ligandos dirigidos y componentes endosomolíticos. Ligandos dirigidos que son preferentemente adecuados son las proteínas de la superficie celular asociadas a tumores, más preferiblemente las proteínas de la superficie celular asociadas a tumores de próstata. La dirección de los ácidos nucleicos también se puede realizar usando la tecnología de aptámeros como se describe en WO2005/111238. Además, fracciones lipídicas adicionales, tales como lípidos de PEG, colesterol, lípidos o péptidos auxiliares endosomolíticos (WO2009/046220) o la morfología general de las nanopartículas generadas (caracterizada por la carga y el tamaño de partícula) respecto a los vehículos de administración mencionados anteriormente pueden conferir especificidad de dirección ya sea a células cancerosas y/o a la vasculatura tumoral.

[0205] Adicionalmente, las moléculas se pueden administrar usando un sistema de liberación prolongada, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico. Varios de los materiales de liberación prolongada se han establecido y se conocen bien por aquellas personas expertas en la técnica. Las cápsulas de liberación prolongada pueden, en función de su naturaleza química, liberar las moléculas durante unas semanas hasta más de 100 días. En función de la naturaleza química y la estabilidad biológica de las moléculas quiméricas, pueden emplearse estrategias adicionales para la estabilización de las moléculas.

[0206] Alternativamente, las moléculas se pueden administrar usando un sistema de administración a base de química de coordinación como se describe en WO2007011217.

[0207] Los ácidos nucleicos se pueden incluir en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como ácidos o bases libres o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que retienen sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se prepararan por reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en solventes acuosos y otros solventes próticos de lo que lo son las formas de base libre correspondientes.

[0208] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una o más moléculas de miARN disueltas o dispersadas en un portador farmacéuticamente aceptable. Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptable(s)" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen o producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones desfavorables aceptables cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un humano, según corresponda. Si determinados efectos adversos son aceptables se determina en función de la gravedad de la enfermedad. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido quimérico o una sustancia activa adicional será conocido por las personas de habilidad en la técnica a la luz de la presente descripción, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para la administración en animales (por ejemplo, humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la Oficina de estándares biológicos de la FDA.

[0209] Como se utiliza en este caso, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes de retraso de absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores farmacológicos, geles, ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como sabría una persona experta en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional es incompatible con la sustancia activa, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas o terapéuticas.

[0210] Los miARN pueden comprender diferentes tipos de portadores en función de si se va a administrar en forma sólida, líquida o de aerosol y de si es necesario que sean estériles para tales vías de administración como la inyección. La presente invención se puede administrar por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intraarterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraarticular, por vía intraprostática, por vía intrapleural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravítrea, por vía intravaginal, por vía rectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía subconjuntival, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericárdica, por vía intraumbilical, por vía intraocular, por vía oral, por vía tópica, por vía local, inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando las células diana directamente, a través de un catéter, a través de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro método o cualquier combinación de los anteriores como sabría una persona experta en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. Mack Printing Company, 1990).

[0211] La cantidad de dosificación real de una composición de la presente invención administrada a un animal o a un paciente se puede determinar por factores físicos y fisiológicos tales como el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, las intervenciones terapéuticas precedentes o concurrentes, la idiopatía del paciente y en la vía de administración. El profesional responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración de sustancia(s) activa(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual.

[0212] En determinadas formas de realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1% de un compuesto activo. En otras formas de realización, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente un 2% y aproximadamente un 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25% y aproximadamente un 60%, por ejemplo, o de un 2% a un 75% del peso de la unidad o de un 25% a un 60%, por ejemplo, y cualquier rango derivable incluido. En otros ejemplos no limitativos, una dosis también puede comprender menos de 1 microgramo/kg/peso corporal, o 1 microgramo/kg/peso corporal, a partir de 5 microgramo/kg/peso corporal, 10 microgramo/kg/peso corporal, 50 microgramo/kg/peso corporal, 100 microgramo/kg/peso corporal, 200 microgramo/kg/peso corporal, 350 microgramo/kg/peso corporal, 500 microgramo/kg/peso corporal, 1 miligramo/kg/peso corporal, 5 miligramo/kg/peso corporal, 10 miligramo/kg/peso corporal, 50 miligramo/kg/peso corporal, 100 miligramo/kg/peso corporal, 200 miligramo/kg/peso corporal, 350 miligramo/kg/peso corporal, o 500 miligramo/kg/peso corporal, hasta 1000 miligramo/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier rango derivable incluido. En ejemplos no limitativos de un rango derivable de los números enumerados aquí, se puede administrar un rango de 5 mg/kg/peso corporal a 100 mg/kg/peso corporal, de 5 microgramo/kg/peso corporal a 500 miligramo/kg/peso corporal, etc., basado en los números anteriormente descritos.

[0213] En cualquier caso, la composición puede comprender diferentes antioxidantes para retrasar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, la prevención de la acción de los microorganismos se puede realizar mediante conservantes tales como varios agentes antibacterianos y antifúngicos, incluidos, pero de forma no limitativa, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

[0214] Las moléculas se pueden formular en una composición en forma de base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, aquellas formadas con los grupos amino libres de una composición proteinácea o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como los ácidos acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férricos; o tales bases orgánicas como la isopropilamina, la trimetilamina, la histidina o la procaína.

[0215] En formas de realización donde la composición está en una forma líquida, un portador puede ser un solvente o medio de dispersión que comprende, pero de forma no limitativa, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como la lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido por dispersión en portadores tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante el uso de surfactantes tal como, por ejemplo, la hidroxipropilcelulosa; o combinaciones derivadas de tales métodos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico o combinaciones de los mismos.

[0216] En otras formas de realización, se pueden usar gotas oftálmicas, soluciones o aerosoles nasales, aerosoles o inhalantes en la presente invención. Tales composiciones están diseñadas por lo general para ser compatibles con el tipo de tejido diana. En un ejemplo no limitativo, las soluciones nasales son normalmente soluciones acuosas diseñadas para ser administradas a los conductos nasales en gotas o aerosoles. Las soluciones nasales se preparan de modo que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de modo que se mantiene la acción ciliar normal. Así, en formas de realización preferidas, las soluciones nasales acuosas son normalmente isotónicas o ligeramente tamponadas para mantener un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.

Además, se pueden incluir en la formulación conservantes antimicrobianos, similares a los usados en las preparaciones oftálmicas, fármacos o estabilizadores de fármacos apropiados, si es necesario. Por ejemplo, se conocen varias preparaciones nasales comerciales e incluyen fármacos tales como antibióticos o antihistaminas.

En determinadas formas de realización, las moléculas se preparan para la administración por vías tales como la ingestión oral. En estas formas de realización, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas (por ejemplo, cápsulas con cubierta de gelatina dura o blanda), formulaciones de liberación prolongada, composiciones bucales, pastillas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de los mismos. Las composiciones orales se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Los portadores preferidos para la administración oral comprenden diluyentes inertes, portadores comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral se puede preparar como un jarabe o elixir. Un jarabe o elixir, y puede comprender, por ejemplo, al menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente aromatizante, un colorante, un conservante o combinaciones de los mismos.

[0217] En determinadas formas de realización preferidas, una composición oral puede comprender uno o más ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes aromatizantes y combinaciones de los mismos. En determinadas formas de realización, una composición puede comprender uno o más de los siguientes: un ligante, tal como, por ejemplo, goma tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicálcico, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente de desintegración, tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de las mismas; un agente aromatizante, tal como, por ejemplo, menta, aceite de gaulteria, aromatizante de cereza, aromatizante de naranja, etc. o combinaciones de los anteriormente mencionados. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, portadores tales como un portador líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, las píldoras, o las cápsulas se pueden recubrir con goma laca, azúcar o ambos.

[0218] La composición debe ser estable bajo las condiciones de producción y almacenamiento y conservarse contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación de endotoxinas debe mantenerse mínimamente en un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.

[0219] En formas de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede realizar mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, tales como, por ejemplo, el monoestearato de aluminio, la gelatina o combinaciones de los mismos.

[0220] Cualquier forma de realización mencionada anteriormente con respecto a la administración o el transporte a las células también puede emplearse con respecto a la implementación de la administración de compuestos medicinales discutidos en esta sección.

Dosificaciones eficaces

[0221] Las moléculas de la invención se utilizarán por lo general en una cantidad eficaz para conseguir el fin pretendido. Para el uso para tratar o prevenir una enfermedad, las moléculas de la invención, o las composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los síntomas o prolongar la supervivencia del paciente al que se está tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de aquellas personas expertas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente.

[0222] Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para conseguir un rango de concentración circulante que incluye la CE50 determinada en cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar dosis útiles en seres humanos con más precisión.

[0223] También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que se conocen bien en la técnica. Una persona experta en la materia podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en función de datos animales.

[0224] La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de las moléculas que son suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones habituales del paciente para la administración por inyección varían de 0,01 a 0,1 mg/kg/día o de 0,1 a 5 mg/kg/día, preferiblemente de 0,5 a 1 mg/kg/día o más. Se pueden conseguir niveles séricos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día.

[0225] En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las proteínas puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Una persona experta en la técnica será capaz de optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación indebida.

[0226] La cantidad de moléculas administrada será, por supuesto, dependiente del sujeto al que se está tratando, del peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, la manera de administración y la decisión del médico prescriptor.

[0227] La terapia se puede repetir intermitentemente mientras los síntomas son detectables o incluso cuando no son detectables. La terapia puede proporcionarse sola o en combinación con otros fármacos o tratamiento (incluida la cirugía).

Toxicidad

[0228] Preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas descritas en la presente proporcionará un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad sustancial. La toxicidad de las moléculas descritas en la presente se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) o la DL100 (la dosis letal para el 100% de la población). La proporción de dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren las proteínas que muestran altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un rango de dosificación que no sea tóxico para el uso en humanos. La dosificación de las proteínas descritas en la presente se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluye la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango en función de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación las puede elegir el médico individual en vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al, 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.l, p.l).

Grupos colgantes

[0229] Un "grupo colgante" puede estar unido o conjugado al ácido nucleico. Los grupos colgantes pueden aumentar la captación celular del ácido nucleico. Los grupos colgantes pueden estar unidos a cualquier porción del ácido nucleico, pero están comúnmente unidos al extremo o los extremos de la cadena oligonucleotídica. Los ejemplos de grupos colgantes incluyen, pero de forma no limitativa: derivados de acridina (es decir, 2-metoxi-6-cloro-9-aminoacridina); agentes reticulantes tales como los derivados de psoraleno, azidofenacilo, proflavina y azidoproflavina; endonucleasas artificiales; complejos metálicos tales como EDTA-Fe(II), o-fenantrolina-Cu(I) y porfirina-Fe(II); fracciones alquilantes; nucleasas tales como amino-1-hexanol nucleasa estafilocócica y fosfatasa alcalina; transferasas terminales; abzimas; fracciones de colesterilo; portadores lipofílicos; conjugados peptídicos; alcoholes de cadena larga; ésteres de fosfato; amino; grupos mercapto; marcadores radiactivos; marcadores no radiactivos tales como colorantes; y polilisina u otras poliaminas. En un ejemplo, el ácido nucleico se conjuga con un carbohidrato, carbohidrato sulfatado o glicano.

Identidad de secuencia

[0230] La "identidad de secuencia" se define en la presente como una relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico (nucleótido, polinucleótido, ARN, ADN), según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias de ácido nucleico, según sea el caso, según se determina mediante la coincidencia entre las cadenas de tales secuencias.

[0231] En una forma de realización preferida, la identidad significa también el porcentaje de identidad y se puede calcular mediante el número de nucleótidos iguales entre la secuencia sujeto y la secuencia problema, dividido entre la longitud total de la secuencia problema y multiplicado por 100.

[0232] La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos pero no limitados a aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIa M J. Applied Math., 48: 1073 (1988).

[0233] Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la coincidencia más grande entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, el paquete de programa GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa BLa St X está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol.

215: 403-410 (1990). El bien conocido algoritmo Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

[0234] Los parámetros preferidos para la comparación de ácidos nucleicos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443-453 (1970); Matriz de comparación: coincidencias = 10; discrepancia = 0; penalización por espacio: 50; penalización por longitud del espacio: 3. Disponible como el programa Gap del Genetics Computer Group, situado en Madison, Wis. Arriba se dan los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos.

[0235] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que se incluyen los artículos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los artículos no específicamente mencionados. Además, el verbo "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en" con el significado de que una molécula de miARN, un equivalente o una fuente de la misma o una composición tal y como se define en la presente puede comprender componente(s) adicional(es) a aquellos específicamente identificados, donde dicho(s) componente(s) adicional(es) no alteran la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "una" o "un" no excluye la posibilidad de que más de uno del elemento estéá presente, a menos que el contexto requiera claramente que allí haya uno y solo uno de los elementos. Por lo tanto, el artículo indefinido "una" o "un" significa normalmente "al menos uno/a".

Descripción de las figuras

[0236]

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo de cribado para la inversión de la TEM y visión de conjunto de los resultados obtenidos de una de las placas de la biblioteca de expresión de microARN basada en lentivirus (ITM0081-0160). A , Se añadió stock de lentivirus (1,0 ul; MOI = 3 a 300) a células TSUpr1-pEcad-Luc durante 24 horas. Dos días después de la infección (día 4), se aplicó la selección con puromicina y, seis días después de la infección (día 8), se midió la actividad de luciferasa. B , Las proporciones de luciferasa de luciémaga/Renilla con corrección de fondo se fijaron contra la MOI lentiviral. Los cuatro miR con señales significativamente por encima del fondo (proporción FLuc/RLuc > media 2 x desviación típica) están rodeados. Los cuatro valores de control representan proporciones FLuc/RLuc inducidas por miR-141 y miR-200c, que se suministraron en tubos separados (ambos por duplicado).

Figura 2 : visión de conjunto del vector de expresión pEcad-Luc/Rluc. El promotor del gen CDH1 (GenBank L34545, posición -294 a 44), que contiene las tres cajas E, se obtuvo mediante la amplificación por PCR usando ADN genómico humano como molde. El fragmento del promotor de CDH1 se clonó aguas arriba del gen de la luciferasa de luciérnaga en el vector pGL2-basic (Promega). El casete de luciferasa de Renilla dirigido por un promotor HSV-Tk se obtuvo del vector pRL-TK (Promega) y el casete de resistencia a antibióticos de zeocina dirigido por un promotor de SV40, del vector pVgRXR (Invitrogen). La luciferasa de Renilla y los casetes de ZeocinaR se clonaron en el vector pGL2-basic en las ubicaciones indicadas.

Figura 3 : caracterización de modelos de líneas celulares tumorales. El ARN total se aisló de cultivos de líneas celulares confluentes al 70-80% y se analizó la expresión de CDH1 y vimentina por qPCR. Se representaron los valores de expresión relativos y las células con CDH1 alto/VIM baja y CDH1 bajo/VIM alta se designaron epiteliales y mesenquimales, respectivamente.

Figura 4 : inducción de la TME usando miméticos de miARN sintéticos. A, Células TSUpr1-pEcad-Luc se transfectaron transitoriamente con de 20 a 60 nM de miméticos de miR sintéticos (Ambion o Dharmacon; véase la tabla 7 para los detalles). Cuatro días después de la transfección, se midieron la actividad Luc y RLuc, y las proporciones Luc/RLuc se normalizaron respecto a las células transfectadas con el control negativo (NC). B, Las células se transfectaron y se trataron como se describe en la figura 4A. El ARN total se aisló y se usó para el análisis por qPCR de miARN y genes. Se muestran los niveles de expresión de CDH1 y CDH2, normalizados respecto al gen constitutivo HPRT, como porcentaje de células transfectadas con el NC. C, Diferentes líneas celulares tumorales parentales se transfectaron con miméticos de miR-200c y miR-520f y otros miméticos de miR y se analizó la expresión de CDH1 (como se describe en la fig. 4B).

Figura 5 : creación de sistemas de expresión de miARN inducibles por doxiciclina. A, los precursores de miR-200c y miR-520f se aislaron del provirus integrado en las células TSUpr1 infectadas con pCDH-lentivirus (en los experimentos de cribado de miR) por digestión con enzimas de restricción. Los precursores de miR se clonaron en los sitios NheI/EagI del vector de expresión de miR inducible pmRi-ZsGreen1 (Clontech PT5049-1). Se muestra el mapa del vector de expresión de miR-520f. B, Se transfectaron células PC3 (ATCC# CRL-1435) con el vector pTet-on-advanced (Clontech PT3899-5), y se seleccionaron en medio con G418 (300 ug/ml). Las células se transfectaron transitoriamente con el vector indicador pTRE-Luc, se trataron con 0, 0,1 y 1,0 ug/ml de doxiciclina (DOX, Sigma D9891) durante 2 días y luego se analizó la activación de Luc. C, Las células PC3-Tet-on (clon 8) se transfectaron luego con el vector pmRi-ZsGreen1-miR-200c o miR-520f y se seleccionaron en medio con puromicina (5 ug/ml). Se evaluó la inducción de miARN y la expresión génica en los clones estables de PC3-mRi-ZsGreen-miR-X. Las células se trataron con 0 y 1,0 ug/ml de DOX durante 4 días, se aisló el ARN total y se analizaron por qPCR el miARN y la expresión génica (tabla 8).

Figura 6: influencia de los miARN en la invasión celular tumoral. A, cincuenta mil (PC3) o cuarenta mil (TSUpr1) células se sembraron en cámaras Biocoat Matrigel Invasion, 8 micras (BD 354480), en medio sin suero. La cámara de invasión se colocó en un pocillo de 24 que contenía medio con suero fetal de ternera al 10% como quimioatrayente. Como control, la misma cantidad de células se sembró sobre la superficie de una placa de cultivo de 24 pocillos. Después de 48 horas de incubación, las células en la cámara de invasión se eliminaron por aspiración y limpiando el compartimento interno con un hisopo. La cámara de invasión se puso luego en reactivo de viabilidad celular CellTiter-GLO (CTG, Promega-G7571) y se incubó durante 15 minutos. La actividad CTG se midió en un luminómetro Victor3. B, Se realizaron ensayos de invasión celular con células PC3-mRi-ZsGreen1-miR-X que se pretrataron durante 2 días con 1 ug/ml de DOX. Además, se usaron células PC3 infectadas con los lentivirus de miR-200c y miR-520f (MOI = 30) y seleccionadas en puromicina durante 4 días. El porcentaje de invasión celular se calculó como la actividad CTG en la parte inferior de la membrana dividida por la actividad CTG total (de las células cultivadas en la superficie de una placa de cultivo de 24 pocillos). La inhibición de la invasión celular por un miARN específico se calculó dividiendo el porcentaje de invasión celular contra células no tratadas (-DOX) o de control (virus de vector vacío). C, Los niveles relativos de expresión de microARN en cultivos paralelos se determinaron por RT-qPCR en horquilla. D, Se realizaron ensayos de invasión celular con células TSUpr-pEcad que estaban infectadas con lentivirus (MOI=30) con vector vacío, precursor de miR-124-1, miR-181a-1, miR-200c, miR-206, miR-518b, miR-520f o miR-524, y seleccionadas en puromicina durante 4 días. La invasión celular se calculó como se describe en la figura 6B.

Ejemplos

Ejemplo 1

Material y métodos

Generación de los miARN codificantes de la biblioteca lentiviral

[0237] Los miARN humanos se seleccionaron tanto del repositorio de miARN público (www.mirbase.org) como de datos de secuenciación profunda de ARN pequeño patentado (véase la WO 2007/081204). Las secuencias de miARN se amplificaron a partir de su ubicación genómica con amplicones que contienen la horquilla de pre-miARN en toda su longitud y una secuencia flanqueante en ambos lados de 50-150 pares de bases. Los cebadores para los amplicones se diseñaron usando el software Primer3 (www.geneious.com). Si el programa de diseño de cebadores no podía encontrar cebadores apropiados en las secuencias designadas, los requisitos para las secuencias flanqueantes se ajustaron a 0-200 pares de bases. Los cebadores diseñados se complementaron con un saliente 5' GCGC y un sitio de restricción para la clonación direccional. Por defecto, el cebador aguas arriba del miARN se complementó con un sitio de restricción de BamHI (GGATCC) y el cebador aguas abajo del miARN se complementó con un sitio de restricción EcoRI (GAATTC). Los cebadores de amplicones con sitios de restricción de BamHI o EcoRI internos (es decir, que ocurren en la secuencia genómica) se complementaron con o un sitio de BglII (AGATCT) o un sitio de XbaI (TCTAGA), respectivamente. Los miARN se amplificaron usando los cebadores anteriormente mencionados a partir de ADN genómico humano de un solo individuo en la siguiente reacción de PCR:

constituyente concentración volumen proveedor / n.° cat.

tampón 10X 1 pl Stratagene / 600159

dNTP 10 mM cada uno 0,2 pl GE Healthcare / 27-18(5-8)0-04

cebador dir. 10 uM 0,2 pl IDT (Integrated DNA Technologies) cebador inv. 10 uM 0,2 pl " "

ADNg 100 ng/uL 0,1 pl fuente privada

ADN pol. Pfu 2,5 U/uL 0,1 pl Stratagene / 600159

H2O N/A 8,2 pl N/A

temp (°C) tiempo ciclos

95 2 min

95 15 s 40

59* 15 s 40 * -0,1 °C/ciclo

72 90 s 40

72 15 min

4 co

[0238] Todos los locus de miARN se amplificaron en reacciones de PCR de 10 pl separadas. Los productos se purificaron usando el conjunto de tampón Qiagen PCR Clean-Up y placas de filtro Whatman Unifilter GF/C (n.° cat. 7700-1101). El ADN se eluyó con 17 pl de H²O por pocillo. Los eluatos separados se usaron en la siguiente reacción de restricción:

constituyente concentración volumen proveedor / n.° cat.

tampón E 10X 2 pl Promega / R005A

EcoRI* 12 U/pl 0,1 pl Promega / R6017

BamHI* 10 U/pl 0,1 pl Promega / R6025

eluato N/A 16 pl N/A

H2O N/A 1,8 pl N/A

*Los amplicones con sitios de restricción internos para EcoRI o BamHI se cortaron en su lugar con Xbal o BglII, respectivamente. La reacción EcoRI+BglII se realizó con tampón Promega D. La reacción BamHI+XbaI se realizó con tampón Promega E.

[0239] Restricción durante 2 horas a 37 °C. Las reacciones de restricción separadas de 20 pl se purificaron usando el conjunto de tampón Qiagen PCR Clean-Up y placas de filtro Whatman Unifilter GF/C (n.° cat. 7700-1101). El ADN se eluyó con 20 pl de H²O por pocillo. Los eluatos separados se usaron en la siguiente reacción de ligamiento:

constituyente concentración volumen proveedor / n.° cat.

tampón 10X 2 pl Promega / C1263

ADN-ligasa T4 1-3 U/pl 0,2 pl Promega / M1804

pCDH restringido* 1 ng/pl 7,8 pl System Biosciences / CD510B-1 eluato N/A 10 pl N/A

Ligamiento durante toda la noche a 4 °C.

*Para la clonación direccional, se cortó pCDH tanto con EcoRI como con BamHI. Se preparó una construcción alternativa llamada pCDH- con sitios de restricción de EcoRI y BamHI invertidos de modo que los amplicones con BamHI 5'y EcoRI 3' se clonaron en la dirección apropiada. Los amplicones con un sitio de EcoRI interno se cortaron con XbaI y se ligaron en un vector pCDH que se restringió con XbaI y BamHI.

[0240] Los ligados resultantes se transformaron por separado en bacterias (células competentes Promega Single Step (KRX), n.° cat. L3002). Se diluyeron 50 pl de células competentes con 950 pl de tampón de transformación II (10 mM MOPS, 75 mM CaCl^{2 , 10}mM RbCl, glicerol al 15%, esterilizado por filtro). Por 20 pl de ligado se añadieron 20 pl de células competentes diluidas. La mezcla se incubó durante 15 minutos en hielo, se sometió a choque térmico a 37 °C durante 30 segundos y se volvió a poner en hielo. Después de 2 minutos, las bacterias transformadas se reconstituyeron en 150 pl de caldo de lisogenia (LB). Se dejó que las bacterias se recuperasen durante 20 minutos a 37 °C tras lo cual se sembraron por separado en placas LB-agar que contenían ampicilina (50 ug/ml) y se cultivaron durante toda la noche a 37 °C.

[0241] Colonias individuales de cada placa se escogen y se subcultivan durante toda la noche en 400 pl de LB con ampicilina (50 ug/ml). Se lisa 1 pl de subcultivo en 100 pl de agua para fines de secuenciación. El lisado bacteriano se usa en la siguiente reacción PCR:

constituyente concentración volumen proveedor / n.° cat.

tampón 5X 1 pl fuente privada

dNTP 10 mM cada uno 0,1 pl GE Healthcare / 27-18(5-8)0-04

pCDH-dir 10 uM 0,1 pl IDT (Integrated DNA Technologies)

pCDH-inv 10 uM _{0 , 1}pl " "

lisado 1:100 1 pl N/A

Taq ADN pol desconocida 0,02 pl fuente privada

H²O N/A 2,68 pl N/A

temp (°C) tiempo ciclos

95 2 min

95 15 s 40

59* 15 s 40 * -0,1 °C/ciclo

72 90 s 40

72 15 min

4 ©o

pCDH-dir CACGCT GTTTT GACCTCCAT AGA

pCDH-inv CACTGACGGGCACCGGAG

(SEQ ID NO: 84-85)

[0242] Los productos de la PCR se diluyeron 25X. Se usó 1 pl de producto de la PCR diluido en la siguiente reacción de secuenciación de Sanger:

constituyente concentración volumen proveedor / n.° cat.

tampón N/A 1,9 pl fuente privada

BigDye v3.1 N/A 0,1 pl A B I/4336921

pCDH-seq 10 uM 0,1 pl IDT (Integrated DNA Technologies)

producto de la PCR 1:25 1 pl N/A

H2O N/A 1,9 nl N/A

temp (°C) tiempo ciclos

94 10 s

50 5 s 40

60 2 min 40

10 o

pCDH-seq GACCTCCATAGAAGATTCT AGAGCT AGC

(SEQ ID NO: 86)

[0243] Se añadieron 30 u de mezcla de precipitación (etanol al 80%, 50 mM de acetato sódico pH 5,5) a cada uno de los productos de la reacción de secuenciación. Las mezclas se agitaron en vórtex durante 10 segundos y se centrifugaron a 5000 rcf durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se aspiró y los sedimentos de ADN se lavaron con 30 pl de etanol al 80% helado y se centrifugaron a 5000 rcf durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante se aspiró y el sedimento de ADN se secó en un bloque de calor durante 10 minutos. El sedimento de ADN seco se disolvió en 10 pl de H²O. La solución de ADN resultante se secuenció en un ABI 3730XL DNA Analyzer. Las secuencias se compararon con las secuencias genómicas esperadas. Los clones correctos se añadieron a la biblioteca. Para los clones incorrectos, se escogieron 4 colonias bacterianas adicionales y se analizó la secuencia de inserto.

[0244] Se subcultivaron construcciones de la biblioteca durante toda la noche en 50 ml de LB con ampicilina (100 ug/ml) y se aislaron con el Qiagen QIAfilter Plasmid Midi Kit (n.° cat. 12245) complementado con el Qiagen EndoFree Plasmid Buffer Set (n.° cat. 19048) según las instrucciones del fabricante. El ADN se disolvió en el tampón TE suministrado y se llevó a una concentración final de 500 ng/pl.

[0245] Pedimos construcciones que no fuimos capaces de clonar nosotros mismos como minigenes de Integrated DNA Technologies. En estos casos, la horquilla en toda su longitud más 20 pares de bases flanqueantes de cada sitio se clonaron en nuestro vector como un servicio por IDT.

[0246] El empaquetamiento y la producción de virus se realizó por System Biosciences como se describe en el manual de usuario de CD-500B1-CD523-A1.

Cultivo celular

[0247] La línea celular TSUprl/pEcad-luc/Rluc se generó por transfección estable de la línea celular humana de carcinoma de la vejiga de células transicionales TSUpr1 con el vector de expresión pEcad-Luc/Rluc (figura 2). Un único clon resistente a la zeocina (clon 1.c.4) se usó para todos los experimentos.

[0248] Las células TSUprl/pEcad-luc/Rluc se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, 31870) complementado con suero fetal bovino al 10% (Sigma, F7524), L-glutamina (Invitrogen 25030-024) y 50 pg/ml de zeocina (Invitrogen, R250-01). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37°C y 5% CO². Las células se dividieron una vez a la semana en una proporción 1:20.

Productos químicos

[0249] Se usó polibreno (2 pg/ml; Sigma, H9268) para aumentar la eficiencia de infección con las partículas lentivirales codificantes de miARN. Se usó puromicina (5 pg/ml; Sigma, P8833) para seleccionar células con expresión del miARN de interés. Se usó zeocina (50 pg/ml; Invitrogen, R250-01) para mantener la integración y la expresión del transgén Ecad-luc/Rluc.

Protocolo de cribado de TME:

Día 1: siembra de células

[0250] Se sembraron células TSUprl/pEcad-luc/Rluc a una densidad de 2.500 células por pocillo en placas de 96 pocillos (100 pl de volumen total por pocillo), por duplicado.

Día 2: infección lentiviral

[0251] Las construcciones lentivirales empaquetadas se proporcionaron como partículas virales pseudotipadas VSV-G congeladas y se almacenaron a -80°C. Antes del uso, los contenidos se descongelaron a temperatura ambiente y se pusieron sobre hielo inmediatamente después. Para abrir los tubos se usó un SepraSeal Cap Removal Tool (Fisher Scientific n.° de cat.: 50823908) y los precipitados se resuspendieron pipeteando varias veces. El medio se eliminó usando una pipeta multicanal. Suavemente, se añadió a las células 200 pl de medio fresco (+FBS/glutamina/zeocina) con 2 pg/ml de polibreno (Sigma, H9268). A continuación, 1,0 pl de partículas lentivirales no diluidas se añadió a cada pocillo (por duplicado). En cada placa de 96 pocillos, se añadieron partículas lentivirales codificantes de miR-141 y miR-200c como controles positivos.

Día 3: refrescar el medio

[0252] Veinticuatro horas después de la adición de lentivirus, se eliminó el medio usando una pipeta multicanal. Las células se lavaron una vez con NaCl al 0,9%, 50 pl por pocillo. Posteriormente, se añadió a cada pocillo 100 pl de medio fresco (+FBS/glutamina/zeocina).

Día 4: selección con puromicina

[0253] El medio se eliminó usando una pipeta multicanal. Para seleccionar las células transducidas, se añadió a las células 200 pl de medio fresco con 5 pg/ml de puromicina (Sigma, P8833). Téngase en cuenta que las células no se lavaban entremedias.

Día 8: ensayo indicador de doble-luciferasa (Promega)

[0254] El medio se eliminó usando una pipeta multicanal. A continuación, las células se lavaron suavemente con NaCl al 0,9% (50 pl/pocillo). Para preparar lisados celulares, se añadió el tampón Passive Lysis Buffer 1x (Promega, E1980) a las células (20 pl por pocillo) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos en un agitador de placas. Los lisados celulares se transfirieron a placas de microtitulación blancas de 96 pocillos (Thermo Scientific, 9502887). La actividad de las luciferasas de luciérnaga y de Renilla se midió en un Victor3 Multilabel Counter (PerkinElmer), según las instrucciones del fabricante.

Aislam iento de ARN total

[0255] Se sembraron células TSUprl/pEcad-luc/Rluc a una densidad de 15.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos. La infección lentiviral se realizó como se ha descrito anteriormente. Debido a la cantidad limitada de partículas virales, el virus se añadió con una multiplicidad de infección (MOI) de 30, y cuando fue posible una MOI de 100. El día 8, el ARN total se aisló utilizando el reactivo Trizol (200 pl por pocillo), según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, 15596-018). La concentración y la pureza del a Rn se determinó en un espectrofotómetro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific).

RT-PCR en tiempo real

[0256] Dos microgramos de ARN total se trataron con DNasa-I (Invitrogen, 18068-015) y se sintetizó ADNc usando cebadores hexaméricos aleatorios y la transcriptasa inversa SuperScript II-MMLV (Invitrogen, 18064-014). La reacción RT (30 pl) se diluyó 4 veces en H²O.

[0257] La expresión génica se determinó por qPCR SYBR Green, usando la mezcla de PCR SYBR Green (Roche, 04707516001) y 2 pl de ADNc como un molde. El ARN no sometido a la transcriptasa inversa se usó como control negativo para la amplificación por PCR. Los cebadores específicos de gen son los siguientes:

E-cadherina directo1 5'-GAAAAGAGAGT GGAAGT G-3'

inverso1 5'-GT GAAGGGAGAT GT ATT G-3'

E-cadherina directo2 5'-CAGGTCTCCTCTTGGCTCTG-3'

inverso2 5'-ACTTTGAATCGGGTGTCGAG-3'

N-cadherina directo 5'-GAGGATTAGCCGGAACAACA-3'

inverso 5'-AACAAATTTCCCCCATCTCC-3'

SNAIL directo 5'-AGGATCTCCAGGCTCGAAAG-3'

Inverso 5'-GACATCTGAGTGGGTCTGGA-3'

SLUG directo 5'-TTCGGACCCACACATTACCT-3'

Inverso 5'-TTGGAGCAGTTTTTGCACTG-3'

ZEB1 directo 5'-AT GCGGAAGACAGAAAAT GG-3'

inverso 5'-GTCACGTTCTTCCGCTTCTC-3'

ZEB2 directo 5'-CGCTTGACATCACTGAAGGA-3'

inverso 5'-CTTGCCACACTCTGTGCATT-3'

P2M directo 5'-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3'

inverso 5'-TGCTGCTTACATGTCTCG-3'

(SEQ ID NO: 48-63).

[0258] La q-PCR se realizó en un instrumento LightCycler LC480 (Roche), usando las siguientes condiciones de amplificación: 5 min a 95°C, seguido de 45 ciclos de 10 s a 95°C, 20 s a 60°C, 20 s a 72°C. Para el conjunto de cebadores de E-cadherina 1, se usó una temperatura de hibridación de 49°C (en vez de 60°C). Los valores Cp se determinaron usando el software LightCycler 480 SW 1.5 (Roche). La expresión de beta-2-microglobulina se usó para la normalización. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon según el modelo descrito por Pfaffl (18).

RT-PCR en horquilla

[0259] La expresión de microARN se determinó por RT-PCR en horquilla como se ha descrito (19). Para esto, 100 ng de ARN total se retrotranscribió usando 0,375 pmol de cebadores en horquilla (SL) específicos de miR:

miR-141:

5 ’-G TC G TA TC C A G TG C A G G G TC C G A G G TA TTC G C A C TG G A TA C G A C

CCATCT-y

miR-200c:

5’-G TC G TATC C AG TG C AG G G TC C G AG G TATTC G C AC TG G ATAC G AC

TCCATC-V

miR-181a-1:

5 ’-GT CGT ATCCAGT GC AGGGTCCG AGGT ATTCGC ACT GG A T ACG AC A

CTCAC-3’

miR-124*:

5 ’-GTCGT ATC C AG T GC AGGGT CCG AGGT A TT CGC AC T G G A T ACG AC

G G CATT-3’

miR-518b:

5 GT CGT ATCCAGT GC AGGGTCCG AGGT ATT CGC ACTGG AT ACG ACA

CCTCT-3’

miR-520f:

5 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

AACCCT-3’

miR-524-5p:

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

GAGAAA-3’

miR-524-3p:

5 GTCGTATCCAGTGC AGGGTCCG AGGT ATTCGCACTGG ATACG AC

ACTCCA-3’

(SEQ ID NO: 64-71)

[0260] en tampón RT 1x, con 0,25 mM de dNTP, 3,33 U/>pl de transcriptasa inversa SuperScript II-MMLV (invitrogen) y 0,25 U/pl de HRP-I RNase Inhibitor (Amersham), durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Los productos de la RT en horquilla se diluyeron 2 veces en H²O.

[0261] Se determinó la expresión de microARN por qPCR SYBR Green, usando la mezcla de PCR (0,5 pl de cebador directo (25 pmol/pl), 0,5 pl de cebador inverso (25 pmol/pl), 8 pl de H²O, 10 pl de mezcla de PCR SYBR Green 2x, Roche) y 2pl de producto de RT en horquilla como molde. El ARN no sometido a la RT SL se usó como control negativo para la amplificación por PCR. Los cebadores específicos de miR son los siguientes:

Cebadores directos:

miR-141: 5'-GCCCGCTAACACTGTCTGGTAAAG -3'

miR-200c: 5'-GCCCGCTAATACTGCCGGGTAATG -3'

miR-181a-1: 5'-TGCCAGAACATTCAACGCTGTCG-3'

miR-124*: 5'-TGCCAGTAAGGCACGCGGTGA-3'

miR-518b: 5'-TGCCAGCAAAGCGCTCCCCTTTAG-3'

miR-520f: 5'- GCCCGCAAGTGCTTCCTTTTAGAG-3'

miR-524-5p: 5'- GCCCGCCTACAAAGGGAAGCACT-3'

miR-524-3p: 5'-TGCCAGGAAGGCGCTTCCCTTTG-3'

[0262] Se usó un cebador inverso universal: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (SEQ ID NO: 72-80)

[0263] La q-PCR se realizó en un instrumento LightCycler LC480 (Roche), usando las siguientes condiciones de amplificación: 5 min a 95°C, seguido de 45 ciclos de 10 s a 95°C, 20 s a 60°C, 10 s a 72°C. Los valores Cp se determinaron usando el software LightCycler 480 SW 1.5 (Roche). La expresión del ARNnp U6 (RNA6-1) se usó para la normalización (cebadores U6 (RNU6-1): RT 5'-GTCa Tc CTTGCGCAg G-3' U6 directo 5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3' y U6 inverso 5'-AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3' (SEQ ID NO: 81-83). Los niveles relativos de expresión de miR se calcularon según el modelo descrito por Pfaffl (18).

Análisis de secuencias de ADN

[0264] La secuencia de los miARN clonados en los vectores lentivirales para las coincidencias como se describe en la tabla 1 se verificó de la siguiente manera. Los ácidos nucleicos totales de las células transducidas lentivirales se aislaron usando reactivo Trizol, según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, 15596-018). La concentración y la pureza de los ácidos nucleicos se determinó en un espectrofotómetro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific). El ADN provírico se amplificó por PCR, usando 500 ng de ácidos nucleicos como entrada y cebadores específicos del vector lentiviral pCDH (directo: 5'-CACGCTGTTTTGACCTCCATAGA-3', inverso: 5'-CACTGACGGGCACCGGAG-3', (SEQ ID NO: 84-85)) durante 35 ciclos a una temperatura de hibridación de 65°C. Los productos amplificados se purificaron usando el sistema de purificación de a Dn Wizard PCR preps (Promega). El análisis de secuencia de ADN se realizó usando 2 pl de amplicón purificado, 5 pmoles de cebador específico de pCDH (5'-GACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGC-3', (SEQ ID NO: 86)) y el kit Big Dye Terminator v 1.1 (Applied Biosystems). Los productos se analizaron en un 3730 DNA Analyzers (Applied Biosystems). Los datos se recogieron usando el Collection Software v3.0 y se analizaron usando el programa Sequencing Analysis v5.3.1 (Applied Biosystems). La secuencia para todos los miARN clonados fue correcta y se da en la tabla 4.

Resultados

Cribado de microARN de transición mesenquimal-epitelial (TME)

[0265] La TEM en células tumorales resulta de una reprogramación transcripcional de la célula. En particular se ha demostrado que la represión transcripcional del promotor del gen de la E-cadherina (CDH1) desencadena el fenotipo de TEM. La proteína E-cadherina es una de las moléculas de cadherina más importantes de mediación de contactos célula-célula en células/tejidos epiteliales. El CDH1 se reprime por la unión de los represores transcripcionales, SNAI1, SNAI2, TCF3, TW iSt , ZEB1 o ZEB2 (20-23), a tres denominadas cajas E en la región promotora proximal de CDH1 (24-26). La inhibición de la unión de estos represores al promotor de CDH1 puede revertir la TEM, también llamada transición mesenquimal-epitelial (TME), e inhibe la invasión de células tumorales y la progresión tumoral en modelos animales (27). Hipotetizamos que un conjunto extenso de microARN es capaz de inducir la TME, dirigiéndose a uno de los represores transcripcionales asociados a la TEM. La supresión de los represores transcripcionales asociados a la TEM dará lugar a la reactivación de la expresión génica de CDH1. Esta reactivación de CDH1 se puede controlar fácilmente mediante la activación de la luciferasa de luciérnaga dirigida por el promotor de CDH1. Por lo tanto, clonamos el elemento central del promotor del gen CDH1, que contiene las tres cajas E (24;25), en un vector de expresión para dirigir la expresión de la luciferasa de luciérnaga. Como control interno, un casete de luciferasa de Renilla dirigido por un promotor HSV-Tk se insertó en el mismo vector (pEcad-Luc). Hemos transfectado de forma estable la línea celular de cáncer de vejiga TSUpr1 con esta construcción indicadora. La expresión de ARNm de CDH1 endógena en esta línea celular es indetectable, mientras que se expresan varios marcadores mesenquimales (24;28).

Cribado de TME inducida por microARN: CONFIGURACIÓN

[0266] Las células TSUpr1-pEcad-Luc son susceptibles a la selección con puromicina. Como un primer paso en la configuración del modelo de cribado, determinamos la eficiencia de transducción de las células TSU. Las células TSU se infectaron con un lentivirus que expresa eGFP con diferentes MOI, y las células transducidas se seleccionaron en medio con puromicina. El número de células infectadas, y por lo tanto resistentes a la puromicina, se determinó por un ensayo de supervivencia celular MTT. En dos experimentos independientes, hemos demostrado que, con una MOI de 8, pudo conseguirse una eficiencia de transducción (MTT de célula infectada+puro/MTT de célula infectada-puro x 100%) de al menos un 60%. En función de estos resultados, decidimos realizar los experimentos piloto de infección con una MOI de 3 y 30.

[0267] Recientemente, se ha demostrado que la familia miR-200 y miR-205 regulan la TEM dirigiéndose a ZEB1 y ZEB2 (13-15). Se seleccionaron dos miARN de la familia miR-200, miR-141 y miR-200c, para configurar y optimizar nuestro ensayo de detección de la TME. Las células TSU se infectaron con ambos vectores de miARN (m O i = 30). Dos (día 4) y seis (día 8) días después de la infección, se midió la actividad de la luciferasa de luciérnaga dirigida por un promotor de E-cadherina y se normalizó frente a la actividad de la luciferasa de Renilla controlada por HSV-Tk. El día 8, la proporción FLuc/RLuc fue inducida más de 2 veces por miR-200c, y más de 1,5-veces por miR-141 (figura 1; tabla 1). Para reducir el 'ruido' de las células no infectadas (FLuc- y RLuc+), se aplicó una selección con puromicina. Las proporciones de FLuc/RLuc inducidas por miR-141 y miR-200c fueron comparables a aquellas sin selección.

[0268] Las células TSU se infectaron con 0,2 microlitros de miR-lentivirus no diluido. Dos días después de la infección, se aplicó una selección con puromicina durante 4 días. Seis días después de la infección se midieron las actividades de luciferasa. El resultado del cribado de los primeros 80 microARN se muestra en la figura 1. Las cuatro 'coincidencias' positivas (FLuc/RLuc > media 2 x De ) fueron microARN conocidos por regular la TEM, es decir, miR-141, miR-200c, miR-205 y miR-429. Este experimento piloto indicó la validez del sistema de selección.

Cribado de la TME inducida por microARN

[0269] Varias construcciones lentivirales en la biblioteca de miR tienen títulos muy altos. Por lo tanto, sin dilución de los stocks de virus antes de la infección, en algunos casos se aplicaron altas MOI de virus. La adición de los lentivirus miR-141 y miR-200c con una MOI alta (de 100 a 600) no tuvo una toxicidad significativa, mientras que mejoró ligeramente la inducción de la proporción FLuc/RLuc. Por lo tanto, toda la biblioteca de expresión de microARN basada en lentivirus se cribó usando un microlitro de lentivirus no diluido (todos por duplicado). Después de cribar los 1120 miR (14 placas, cada una con 80 vectores de miR), se encontraron 65 'coincidencias' positivas (FLuc/RLuc > media 2 x De ). Además de estos 65 miR, 59 miR adicionales se seleccionaron basándose en, por ejemplo, una señal Luc aumentada con una señal RLuc aumentada, dejando la proporción por debajo del umbral. Estos 124 miR se volvieron a cribar en el modelo TSUpr1-pEcad-luc, después de lo cual quedaron 30 miR con una proporción FLuc/RLuc positiva reproducible (26 de 30 del grupo de 65 'coincidencias').

Validación prelim inar de microARN de TME

[0270] Para validar y seleccionar adicionalmente miR relevantes para la regulación TEM/TME, estudiamos sus efectos en la expresión génica endógena, es decir, CDH1 (E-cadherina), CDH2 (N-cadherina), SNAI1 (SNAIL), SNAI2 (SLUG), ZEB1 (deltaEF1) y ZEB2 (SIP1). Las células TSUpr1-pEcad-luc se infectaron con los 30 miR identificados por cribado de TME (MOI = 30 y 100). Seis días después de la infección, el ARN total se aisló y se usó para un análisis qPCR de los genes anteriormente mencionados (tabla 1). La regulación por aumento esperada de la expresión de c DH1 (E-cadherina) se observó solo con unos pocos miR (n = 10), como lo fue la regulación por disminución de la expresión de CDH2 (N-cadherina) (n = 8). De esos miR, miR-181a-1, miR-200a, mir-429 y miR-524 resultaron tanto en la regulación por aumento de CDH1 como la regulación por disminución de CDH2. La cinética de expresión de cadherinas por miR asociados a la TEM es dependiente de cadherinas. Esto puede explicar la regulación por aumento y por disminución no consistente de ambas cadherinas, en el punto de tiempo elegido (6 días después de la introducción de un miR). La marca distintiva de la TEM o lo contrario, la TME, es la conmutación de cadherinas. Por lo tanto, la proporción (relativa) de la expresión de CDH1/CDH2 se usó como medida para estudiar el papel de los miR identificados en la regulación de la TEM. Como se muestra en la tabla 1, diez miR (de 12) tienen una proporción de CDH1/CDH2 aumentada (rango: 1,85-17,65). Los otros dos miR indujeron la expresión de CDH1 significativamente (en línea con la inducción de FLuc), pero estos miR también indujeron sustancialmente (> 2 veces) la expresión de CDH2. De los 12 miR que indujeron la expresión endógena de CDH1 o indujeron una conmutación de cadherinas, también todos regularon por disminución al menos un represor transcripcional de CDH1 en el nivel de ARN.

Conclusiones

[0271] En el conjunto de 12 miR seleccionados, están presentes los miR asociados a la TEM conocidos (familia miR-200 y miR-205), lo que confirma la especificidad de nuestro sistema. De los 9 miR restantes, tres miR (miR-518b, miR-520f y miR-524) pertenecen a la familia miR-515 humana. En este estudio, los miembros de la familia miR-200 en general regularon por disminución la expresión de ZEB2, lo que se asoció con una regulación por disminución de la expresión de CDH2 (el día 8). Por otro lado, los miembros de la familia miR-515 en general regularon por disminución la expresión de SNAI2, lo que se asoció con la regulación por aumento de la expresión de CDH1. Estas diferencias destacables pueden subyacer a dos mecanismos diferentes de regulación de la TEM por los miembros de la familia miR-200 y miR-515. La expresión y la función de los 3 miembros de la familia miR-515 no se ha estudiado y reportado en las bases de datos públicamente disponibles y, por lo tanto, proporciona una primera comprensión sobre el papel de estos miR en la t Em .

Ejemplo 2

Materiales y métodos

Cultivo celular

[0272] Las células TSUprl/pEcad-luc/Rluc (también conocidas como TSUpr1 -pEcad) y la línea celular de cáncer de próstata PC-3 (ATCC# CRL-1435) se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, 31870), complementado con un 10% de suero fetal bovino (Sigma, F7524), L-glutamina (Invitrogen 25030-024) y, para las TSUprl/pEcadluc/Rluc, 50 pg/ml de zeocina (Invitrogen, R250-01). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37°C y 5% CO².

Generación de un sistema de expresión de miARN inducible

[0273] Para facilitar la expresión de miARN a largo plazo y controlada, se hizo uso del sistema de expresión de miARN inducible por Tet miR-X (Clontech Inc.). El precursor de miARN se clonó en el 3'UTR de la unidad de transcripción de la proteína fluorescente ZsGreen. La expresión de miARN está dirigida en el vector por el promotor inducible fuertemente regulado Ptight y la actividad del transactivador coexpresado (Tet-on). En presencia de doxiciclina, el promotor Ptight se activará, dando como resultado la coexpresión de altos niveles de miARN y proteína ZsGreen1, con niveles bajos de expresión en células no inducidas.

[0274] Los precursores de miR-200c y miR-520f se amplificaron por PCR, usando ADN provírico de células TSUpr1 infectadas con lentivirus como molde y los cebadores específicos de vector directo e inverso de pCDH universales (SEQ ID NO: 84-85). Los productos de amplificación se digirieron con EcoRI/NheI; estos sitios son del sitio de clonación múltiple del vector lentiviral pCDH. Los fragmentos digeridos se clonaron en los sitios EcoRI/NheI de un vector pEGFP-N3 modificado (Clontech #6080-1), que se obtuvo por escisión con BamHI/NotI del marco de lectura abierto de EGFP del vector y cerrando el vector después del rellenado de los salientes de BamHI y NotI mediado por una ADN polimerasa Klenow. El precursor de miR se escindió de este vector por digestión con EagI/NheI y se clonó en los sitios EagI/NheI del vector pmRi-ZsGreen1 (Clontech PT5049-1; Fig. 5A). La clonación apropiada se confirmó por análisis de la secuencia de ADN. El vector transactivador pTet-on (Clontech PT3899-5) se transfectó en la línea celular de cáncer de próstata PC3 (ATCC# CRL-1435). La actividad de pTet-on apropiada se evaluó en los clones resistentes a G418, en un ensayo pTRE-luciferasa-indicador transitorio.

[0275] A continuación, los vectores pmRi-ZsGreen1-miR-X se transfectaron en las células PC3-Tet-on (clon 8), junto con un marcador de selección con puromicina. Las colonias resistentes a la puromicina se seleccionaron y se cribaron rápidamente para la expresión de ZsGreen1 inducible por DOX (mediante la medición de fluorescencia en placas de 96 pocillos en el multímetro Victor3). Las células positivas para ZsGreen1 se analizaron además para la expresión de miARN inducible por DOX.

Ensayos de invasión celular

[0276] Para los ensayos de invasión celular, las células PC3-mRi-ZsGreen1-miR-X inducibles por DOX se incubaron en presencia de DOX (1 ug/ml) durante 2 días, antes del ensayo de invasión. Las células PC3 y TSUpr1-pEcad se transdujeron con partículas lentivirales que expresan miR (MOI = 30), como se describe en el ejemplo 1. Las células transducidas lentivirales se seleccionaron con puromicina y se pasaron 1 vez antes de usar. Cincuenta mil (PC3) o 40.000 (TSUpr1-pEcad) células se sembraron en cámaras Biocoat Matrigel Invasion (8 micras; BD 354480) en medio sin suero (Fig. 6A). La cámara de invasión se colocó en un pocillo de 24 que contenía medio con suero fetal de ternera al 10% como quimioatrayente. Como control, la misma cantidad de células se sembró en placas de cultivo de 24 pocillos. Después de 48 horas de incubación, las células en la cámara de invasión se eliminaron por aspiración y limpiando el compartimento interno con un hisopo. La cámara de invasión se puso luego en reactivo de viabilidad celular CellTiter-GLO (CTG, Promega-G7571), se incubó durante 15 minutos y luego se analizó en un luminómetro Victor3. La invasión celular se calculó como la actividad CTG en la parte inferior de la membrana dividida por la actividad CTG de las células cultivadas en una placa de 24 pocillos. La inhibición de la invasión celular por un miARN específico se calculó dividiendo el porcentaje de invasión celular de las células tratadas con DOX frente a las células no tratadas, o de invasión de las células transducidas frente a las células transducidas con el vector vacío.

RT-PCR en tiempo real

[0277] El mismo protocolo que se describe bajo el ejemplo 1 se usó para la RT-PCR de los genes siguientes: vimentina y CDH11 y HPRT. Los cebadores siguientes se usaron para los respectivos genes:

HPRT directo 5'- CTCAACTTTAACTGGAAAGAATGTC -3'

inverso 5'-TCCTTTTCACCAGCAAGCT -3'Vimentina directo

5'-GGCTCAGATTCAGGAACAGC-3'

inverso 5'-GCTTCAACGGCAAAGTTCTC -3'

CDH11 directo 5'-GGTCTGGAACCAGTTCTTCG -3'

inverso 5'-GGCATGAATGTTCCCTGATT -3'

(SEQ ID NO: 112-117)

Resultados

Validación de los microARN de inducción de la TME

Validación in vitro usando miméticos de microARN

[0278] Para validar los microARN identificados cribando una biblioteca de expresión de miARN lentiviral, se usaron miméticos de miARN sintéticos. Los miméticos de miR sintéticos usados se suministraron por Ambion o Dharmacon (Thermo Scientific); véase la tabla 7 para los detalles. Los miméticos de miR-200c de ambas compañías se compararon y mostraron la misma eficacia (es decir, inducción de CDH1; datos no mostrados). Las células TSUpr1-pEcad-luc/Rluc se transfectaron transitoriamente con de 20 a 60 nM de miméticos de miR sintéticos. Cuatro días después de la transfección, se midieron la actividad Luc y RLuc y se normalizaron las proporciones Luc/RLuc para las células transfectadas con mimético de control negativo (NC). De todos los miméticos evaluados, miR-124, 181a, 200c, 206 y miR-520f mostraron una inducción de la proporción Luc/RLuc (Fig. 4A). Salvo miR-200c y miR-520f, los otros miméticos de miR regularon por disminución la actividad RLuc y mostraron toxicidad celular (no mostrada). De todos estos miR, miR-200c y miR-520f indujeron fuertemente (~20 veces) la expresión endógena de CDH1, mientras que miR-124* y miR-181a indujeron CDH1 aproximadamente 2,5 veces (Fig. 4B). MiR-200c, miR-518 y miR-524 regularon por disminución la expresión de c DH2 más de un 30% (Fig. 4B). La eficacia de los miméticos de miR se evaluó adicionalmente en varias otras líneas celulares tumorales con un fenotipo de tipo mesenquimático (en función de las proporciones de expresión de ARNm de CDH1 y vimentina; figura 3). Como en las TSUpr1-pEcad-luc/Rluc, miR-200c y miR-520f también indujeron la expresión de CDH1 en las células PC3, PANC-1, M iA-PaCa2, MDA-MB-231 y TSUpr1 de tipo salvaje (Fig. 4C).

Generación de un sistema de expresión de miARN inducible

[0279] La actividad de pTet-on apropiada se evaluó en los clones resistentes a G418, en un ensayo pTRE-luciferasa-indicador transitorio. Tras el tratamiento con doxiciclina (DOX) (0,1 y 1,0 ug/ml), el clon 8 mostró una fuerte inducción de la expresión de luciferasa, mientras que la actividad Luc en las células no inducidas (sin DOX) no excedió los niveles basales (Fig. 5B). Como se muestra en la figura 5C, varios clones transfectados con pmRi-ZsGreen1-miR-X mostraron una expresión de miR-200c o miR-520f inducible por DOX, que era dependiente de la dosis de DOX, alcanzando niveles máximos a alrededor de 1 ug/ml de DOX (no mostrado).

[0280] La expresión génica endógena en las células con expresión inducible de miR-200c y miR-520f se analizó por qPCR. Se observó una regulación por aumento de CDH1, mientras que se observó una regulación por disminución de CDH11 y vimentina reiteradamente para ambos miR (tabla 8). Las células PC3 mostraron también la inducción más débil de CDH1 por miméticos de miR-200c y miR-520f de todas las líneas celulares evaluadas. Además de la regulación por disminución de marcadores mesenquimales, también se regularon por disminución represores transcripcionales, tales como ZEB1, ZEB2 y SNAI2, después de la inducción de miR-200c y miR-520f (tabla 8). Colectivamente, estos datos indican que, en las líneas celulares miR-200c y miR-520f inducibles, los miR correspondientes, así como sus genes diana de TEM directos e indirectos, se pueden regular en el nivel molecular.

Inhibición de la invasión de células tumorales

[0281] Para estudiar si los miR identificados regulan también la TEM en el nivel celular, los ensayos de invasión celular se realizaron usando los clones estables miR-520f y miR-200c inducibles tal y como se generaron anteriormente y lentivirus con expresión de miR-200c y miR-520f como se ha descrito anteriormente. Todos los clones miR-200c y miR-520f evaluados, inhibieron la invasión celular en el rango de 48-68% (Fig. 6B). La inducción de la expresión de miARN se determinó en cultivos paralelos y se halló positiva (Fig. 6C). Los niveles de miR no mostraron una correlación significativa con el porcentaje de invasión. Estos datos indican que miR-520f, identificado en el ensayo de selección de Luc como un miARN inductor de la TME, pudo revertir también uno de los aspectos biológicos celulares clave de la TEM, es decir, la invasión celular.

[0282] Para confirmar el efecto de los otros miembros de la familia miR-515, miR-518b y miR-524, sobre la invasión celular se evaluó en el modelo de cribado TSUprl/pEcad-luc/Rluc. Las células TSUpr1-pEcad se infectaron con lentivirus que contiene precursor de miR. Los tres miR pertenecientes a la misma familia miR-515, miR-518b, miR-520f y miR-524, inhibieron la invasión celular en un 25-53% (Fig. 6D). La expresión de los miARN maduros correspondientes se confirmó por qPCR en horquilla (tal y como se describe en el ejemplo 1; no mostrado).

Conclusiones

[0283] Los tres miembros de la familia miR-515, miR-518b, miR-520f y miR-524, se identificaron en el cribado de TME. Los miméticos para miR-518b y miR-524 regularon por disminución la expresión del marcador mesenquimal CDH2, mientras que los miméticos de miR-520f regularon por aumento fuertemente la expresión del marcador epitelial CDH1 en varios modelos de líneas celulares. La invasión celular de las células PC3 a través de Matrigel se inhibió después de la inducción de la expresión de miR-520f. El efecto anti-invasivo se observó también cuando los tres miARN se expresaron en el modelo de cribado TSUpr1-pEcad. De hecho, miR-200c no redujo la invasión en este modelo. Esto indica la gran potencia de estos tres miembros de miR-515 que tienen actividad anti-invasiva en varios tipos celulares y tumorales a diferencia de miR-200c.

Inhibición de la formación de metástasis en un modelo animal

[0284] El hecho de que estos tres miembros de la familia miR-515 pudieran activar el promotor del gen de la E-cadherina in vitro, en función de la activación del indicador de luciferasa y la inducción endógena de CDH1 (miR-520f) o la reducción de la expresión de CDH2 (miR-518b y miR-524), y pudieran todos inhibir la invasión de células tumorales in vitro indica que estos microARN son herramientas potentes para inhibir la invasión y la metástasis de las células tumorales in vivo. Para confirmar la actividad antimetastásica de miR-520f, miR-518b y miR-524 en un entorno in vivo, se estableció un experimento de metástasis tumoral experimental. Se inyectan ratones (de 6-8 semanas) desnudos BALB/c inmunodeficientes machos con 0,5 x 106 (200 pl de volumen) células PC3-mRi-ZsGreen1 que expresan ya sea miR-520f, miR-518b y miR-524, a través de la vena caudal (lateral) (29). A grupos de 6 ratones se les da agua potable que contiene DOX (0,2 mg/ml) durante todo el experimento, y un grupo de control de ratones inyectados con células PC3-mRi-ZsGreen1 no tratadas con DOX que expresan ya sea miR-520f, miR-518b y miR-524 reciben agua sin DOX. Los ratones se controlan a diario y, si no sufren inconvenientes serios, se sacrifican después de 2 meses. Los pulmones son el sitio primario de metástasis, ya que contienen el primer lecho capilar que encontrarán las células inyectadas después de la inyección (30, 31). Se sugiere que las células que pasan por el lecho capilar pulmonar, también pueden formar metástasis en otros órganos (30). El número y el tamaño de la metástasis se determinan de forma macroscópica (es decir, por examen visual a través de un microscopio de disección) y microscópicamente (es decir, estudiando la expresión de ZsGreen en secciones de pulmón y otros tejidos). Se anticipa, en función de todos los datos disponibles presentados anteriormente, que las células que expresan ya sea miR-520f, miR-518b o miR-524 forman menos (y menores) metástasis en este modelo animal que las células que no expresan dichos miARN. Esta prueba de concepto preparará el camino para pruebas preclínicas adicionales de miR-520f, miR-518b y miR-524 como fármaco para tratar enfermedades asociadas a la TEM.

[0285] Para confirmar adicionalmente el efecto inhibitorio de miR-520f, miR-518b y miR-524 sobre la metástasis in vivo, diferentes líneas celulares tumorales, diseñadas con pmRi-ZsGreen1-miR-520f, 518b o 524, se inyectan ortotópicamente en ratones desnudos (NOD-SCID o BALB/c nu/nu). En diferentes tiempos después de la inyección de células tumorales, los ratones reciben agua con DOX o sin DOX. La invasión local y la metástasis distante a los pulmones y otros órganos se controlan mediante imágenes in vivo de ZsGreen1 o LUC. La sobreexpresión de miR-520f, miR-518b o miR-524 (inducida por DOX en el agua potable) se espera que reduzca el número de metástasis. Además, los ratones inyectados ortotópicamente con células tumorales, donde se activó miR-520f, miR-518b o miR-524, se espera que tengan una tasa de supervivencia media que será significativamente prolongada en comparación con la de ratones que no reciben DOX (es decir, sin activación de miR-520f, miR-518b o miR-524 en las células tumorales). La supervivencia de los animales se definirá por la supervivencia sin complicaciones graves.

Tabla 1: lista de microARN identificados por cribado (de luciferasa) de TME y regulación de genes endógenos asociados a la TEM. Se infectaron células TSUpr1-pEcad-Luc con 30 microARN positivos para luciferasa (véase el texto). El ARN total se retrotranscribió y se usó para un análisis de PCR en tiempo real SYBR Green de los genes CDH1 (Ecad), CDH2 (Ncad), SNAI1, SNAI2, ZEB1 y ZEB2. LUC, inducción de proporción FLuc/RLuc, promedio de 3 experimentos; CDH1, (inducción de la) expresión endógena de CDH1; Cd H2, (inhibición de la) expresión endógena de CDH2; represor, represores transcripcionales de CDH1 que se regularon por disminución al menos 2 veces, o entre 1,3 y 2 veces (subrayados). Solo se muestran los datos para 12 microARN que son de interés para los estudios adicionales; véase el texto para un razonamiento detallado de la selección de estos 12 miR.

miAR LUC CDH1 CDH2 H1/CDH2 Represor miR-124-1 1,76 1,30 2,46 0,53 SNAI2

miR-181a-1 1,59 4,22 0,89 4,74 SNAI2

miR-141 1,95 0,58 0,04 14,45 ZEB2, SNAI1

miR-200a 1,66 2,18 0,67 3,25 ZEB2

miR-200c 2,53 0,71 0,04 17,65 ZEB2, ZEB1

miR-205 1,79 0,39 0,08 4,86 ZEB2

miR-429 1,50 3,39 0,41 8,28 ZEB2

miR-206 1,73 2,24 2,07 1,08 SNAI2

miR-518b 1,62 3,09 1,67 1,85 SNAI2

miR-520f 1,43 12,92 1,16 11,14 SNAI2, ZEB2

miR-524 1,57 1,60 0,45 3,56 ZEB2

miR-200b

2,08

5,17

1,18

4,38

ZEB2

Tabla 2 Secuencias precursoras de miARN identificados en el cribado de TME (véase la tabla 1). Lista de secuencias precursoras de miARN (dirección 5' a 3'). Todas las secuencias se obtuvieron de miRBase (versión 14: sept. 2009; www.mirbase.org).

SEQ ID miARN Secuencia precursora

²² AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUC CAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAAUGGGGCUG

²³ AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAU

UUAAUGUCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGCGGAGC

CUACGGCUGCACUUGAA

²⁴ UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUA UACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGAGGCGCCUCC

²⁵ UGAGUUUUGAGGUUGCUUCAGUGAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

UUGGAAUUAAAAUCAAAACCAUCGACCGUUGAUUGUACCCUAUGGC

UAACCAUCAUCUACUCCA

^{26 miR-141} CGGCCGGCCCUGGGUCCAUCUUCCAGUACAGUGUUGGAUGGUCU

AAUUGUGAAGCUCCUAACACUGUCUGGUAAAGAUGGCUCCCGGGUG

GGUUC

^{27 miR-200a} CCGGGCCCCUGUGAGCAUCUUACCGGACAGUGCUGGAUUUCC CAGCUUGACUCUAACACUGUCUGGUAACGAUGUUCAAAGGUGA CCCGC

²⁸ CCCUCGUCUUACCCAGCAGUGUUUGGGUGCGGUUGGGAGUCUC

UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGAGG

²⁹ AAAGAUCCUCAGACAAUCCAUGUGCUUCUCUUGUCCUUCAUUCC ACCGGAGUCUGUCUCAUACCCAACCAGAUUUCAGUGGAGUGA AGUUCAGGAGGCAUGGAGCUGACA

³⁰ GCGUCUUACCAGACAUGGUUAGACCUGGCCCUCUGUCUAAUAC

UGUCUGGUAAAACCGUCCAUCCGCUGC

³¹ UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCCCAUAUGGAUU ACUUUGCUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG

³² UCAUGCUGUGGCCCUCCAGAGGGAAGCGCUUUCUGUUGUCUGAAAG

AAAACAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGUUUACGGUUUGA

³³ UCUCAGGCUGUGACCCUCUAAAGGGAAGCGCUUUCUGUGGU CAGAAAGAAAAGCAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUUACCGUUU GGGA

³⁴ UCUCAUGCUGUGACCCUACAAAGGGAAGCACUUUCUCUUGUCCAAA

GGAAAAGAAGGCGCUUCCCUUUGGAGUGUUACGGUUUGAGA

^{35 miR-200b} CCAGCUCGGGCAGCCGUGGCCAUCUUACUGGGCAGCAUUGGAUGGA GUCAGGUCUCUAAUACUGCCUGGUAAUGAUÜACGGCGGAGCCCUGC ACG

Tabla 3 secuencias maduras de los miARN identificados en el cribado de TME (véase la tabla 1). Lista de secuencias de miARN maduros (dirección 5' a 3'). Todas las secuencias se obtuvieron de miRBase (versión 14:

sept. 2009; www.mirbase.org). microARN EQ I SEQ del miARN maduro hsa-miR-124- 2 uaaggcacgcggugaaugcc hsa-miR-124- 3 cguguucacagcggaccuugau hsa-miR-124-hsa-miR-181a 4 aacauucaacgcugucggugagu

5 accaucgaccguugauuguacc hsa-miR-141 6 uaacacugucugguaaagaugg

7 caucuuccaguacaguguugga hsa-miR-200a 8 uaacacugucugguaacgaugu

9 caucuuaccggacagugcugga hsa-miR-200b 10 uaauacugccugguaaugauga

11 caucuuacugggcagcauugga hsa-miR-200c 12 uaauacugccggguaaugaugga

13 cgucuuacccagcaguguuugg hsa-miR-205 14 uccuucauuccaccggagucug

15 gauuucaguggagugaaguuc

hsa-miR-429

16

uaauacugucugguaaaaccgu

AGACACCAGCCCAGGACCCGGAGGCCACCCACACCACCGCCGGCCGA TGGGCGTCTTACCAGACATGGTTAGACCTGGCCCTCTGTCTAATACTGT CTGGTAAAACCGTCCATCCGCTGCCTGATCACCGTTAGAGGAGAGAGC

TGCCTGCCCTGCAGCTCATCAGTGCAAAGCC

GCAAGGAGGAAAGATGCTACAAGTGGCCCACTTCTGAGATGCGGGCT GCTTCTGGATGACACTGCTTCCCGAGGCCACATGCTTCTTTATATCCC CAT AT GG ATTACTTTGCT ATGGA AT GT A AGG AAGT GT GT GGTTTCGGC AAGTGCCTCCTCGCTGGCCCCAGGGTACCACCCGGAGCACAGGTTTG GTGACCTTCTTC GCAAACAGGGCAAATAAATGCATCTTTATTTTGT GT CCATTTT AACCT GGTCAAGGAAAATTCCAACAGCAACATCAAAAAACCAGTGTTGGAG CAAGAATATGTCATGCTGTGGCCCTCCAGAGGGAAGCGCTTTCTGTT GT CT GA A AG AA A AC A AAGCGCT CCCCTTT AG AGGTTTACGGTTT G AG TAAAGCAGCGTTGAAGTTGATGCTGATCTTGGTAATACATTTGCAGA GCGT GCTT ATCAT CAG TGTGTCCATTTAAACCTGGTCAAGGAAGATTCCCACAAAAAATCCAC GGTGCTGGAGCAAGAGGATCTCAGGCTGTGACCCTCTAAAGGGAA GCGCTTTCTGTGGTCAGAAAGAAAAGCAAGTGCTTCCTTTTAGAGG GTTACCGTTTGGGAAAAGCAATGTTGAAGTTGATGCTGATCTTGGT AAAATATTTGCAGAGCGTGCTTATCATCAG CAAACAGGGCCAATAAATGCATCCTCATTTTTGTGTCCATTTTAACCT GGGCAAGGAAAATTCCAACAAAAAACCCAGAGTTCTGGAGCAAGAA GATCTCATGCTGTGACCCTACAAAGGGAAGCACTTTCTCTTGTCCAA AGGAAAAGAAGGCGCTTCCCTTTGGAGTGTTACGGTTTGAGAAAAG CAGCGTTGAAGTTGATGCTTATCTCGGTAATACATTTGTAGAGCATG CTTATCATGAGGCTTGGAC CAGCCGGGCGGCCCCCGGACCCAGCTCGGGCAGCCGTGGCCATCTT ACTGGGCAGCATTGGATGGAGTCAüüTCTCTAATACTGCCTGGTAAT

GATGACGGCGGAGCCCTGCACGCAGCGACCGGCCGACCCCGT

Tabla 5 Secuencias semilla de miARN identificados en el cribado de TME (véase la tabla 1). Lista de secuencias semilla de miARN (dirección 5' a 3'). Todas las secuencias se obtuvieron de miRBase (versión 14: sept. 2009; www.mirbase.org). La secuencia semilla se define como los nucleótidos 2-8 (dirección 5' a 3') de la secuencia de miARN maduro. microARN ARN madu EQ I uencia semilla hsa-miR-124-1 miR-124 87 aaggcac hsa-miR-124-2

miR-124* 88 guguuca hsa-miR-124-3

miR-181a 89 acauuca hsa-miR-181a-1

miR-181a* 90 ccaucga hsa-miR-141

miR-141

91

aacacug

miR-141* 92 aucuucc

miR-200a 93 aacacug hsa-miR-200a

miR-200a* 94 aucuuac miR-200b 95 aauacug hsa-miR-200b

miR-200b* 96 aucuuac miR-200c 97 aauacug hsa-miR-200c

miR-200c* 98 gucuuac miR-205 99 ccuucau hsa-miR-205

miR-205* 100 auuucag hsa-miR-429 miR-429 101 aauacug hsa-miR-206 miR-206 102 ggaaugu hsa-miR-518b miR-518b 103 aaagcgc

104 agugcuu hsa-miR-520f miR-520f

105 aagugcu miR-524-5p 106 uacaaag hsa-miR-524

miR-524-3p

107

aaggcgc

Tabla 6 : secuencias de isomiR de miARN identificados en el cribado (véase la tabla 1). Estos isomiR se han detectado después del análisis de 66 muestras de tejido humano usando la secuenciación profunda de alto rendimiento y solo isomiR que representan > 5% del número total de secuencias clonadas se enumeran aquí, a menos que se indique lo contrario.

miARN MiARN maduro Semilla (SEQ ID) Secuencia de isomiR (SEQ ID) hsa-miR-520f AGUGCUU (104) AAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU (118)

AAGUGCU(105) AAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU*1 (120) CAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU (119) hsa-miR-518b AAAGCGC (103) CAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGU (121)

CAAAGCGCUCCCCUUUAGAGG (122) CAAAGCGCUCCCCUUUAGAG (123) hsa-miR-524 AAGGCGC (107) GAAGGCGCUUCCCUUUGGAGUG (124)

GAAGGCGCUUCCCUUUGGAGU (125) UACAAAG (106) CUACAAAGGGAAGCACUUUCU (126)

CUACAAAGGGAAGCACUUUCUC (127) CUACAAAGGGAAGCACUUUC (128) hsa-miR-124- AAGGCAC (87) UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA (129) hsa-miR-124- UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (130) hsa-miR-124- UAAGGCACGCGGUGAAUGC (131)

UAAGGCACGCGGUGAAUGCC*3 (132) hsa-miR-206 GGAAUGU (102) UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG (133)

UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGU (134) UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUG (135) hsa-miR-181a ACAUUCA (89) AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUUU (136) AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU (137) AACAUUCAACGCUGUCGGUGAG (138) AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUU (139) AACAUUCAACGCUGUCGG (140) AACAUUCAACGCUGUCGGU (141) AACAUUCAACGCUGUCGGUG (142)

AACAUUCAACGCUGUCGGUGA (143)

hsa-miR-141 mir-141 AACACUG (91) UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG (144)

UAACACUGUCUGGUAAAGAUG (145) UAACACUGUCUGGUAAAGAUGGC (146) UAACACUGUCUGGUAAAGAU (147)

UAACACUGUCUGGUAAAGA (148)

UAACACUGUCUGGUAAAGAUGGCU (149) hsa-miR-200a AACACUG (93) UAACACUGUCUGGUAACGAUGUU (150

UAACACUGUCUGGUAACGAUGU (151) hsa-miR-200b AAUACUG (95) UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGAC (152)

UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA (153) AUCUUAC (96) CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA (154)

CAUCUUACUGGGCAGCAUUGG (155) hsa-miR-200c AAUACUG (97) UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA (156) UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGG (157) hsa-miR-205 CCUUCAU (99) UCCUUCAUUCCACCGGAGUCU (158)

UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG (159)

UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUGU (160) hsa-miR-429 mir-429 AAUACUG (101) UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU (161)

UAAUACUGUCUGGUAAAACCG (162)

*1 Secuencia anotada en miRBase. No detectada en el análisis de secuenciación profunda

*2 Solo el 0,9% del número total de secuencias clonadas

*3 Solo el 0,7% del número total de secuencias clonadas_____________________________

Tabla 7 : lista de miméticos de microARN usados para la validación de los resultados de cribado de TME. Se muestran los proveedores y los códigos de producto para todos los precursores de miR sintéticos. Todos los miméticos enumerados son bicatenarios y cada cadena tiene un alineamiento 100% complementario entre sí. Una cadena será la secuencia exacta de las secuencias de miARN maduro depositadas en miRBase y enumeradas en la tabla 3. La otra cadena contiene ciertas modificaciones.

Mimético de miARN Proveedor Código del producto Mimic Negative Control #1** Dharmac CN-001000-01-05

hsa-miR-200c miRIDIAN Mimic Dharmac C-300646-05-0005

hsa-miR-520f miRIDIAN Mimic Dharmac C-300779-03-0005

hsa-miR-524-5p miRIDIAN Mimic Dharmac C-300806-03-0005

hsa-miR-518b miRIDIAN Mimic Dharmac C-300798-03-0005 precursor hsa-miR-124 Pre-miR Ambion PM10691

precursor hsa-miR-124* Pre-miR Ambion PM11154

precursor hsa-miR-181a Pre-miR Ambion PM10421

precursor hsa-miR-181a* Pre-miR Ambion PM10381

precursor hsa-miR-200c Pre-miR Ambion PM11714

precursor hsa-miR-206 Pre-miR Ambion

PM10409

*, Dharmacon es ahora parte de Thermo Fisher Scientific.

** Este control negativo está basado en Cel-miR-67 de C. elegans (SEQ ID 163).

Tabla 8 Expresión génica en células PC3 transfectadas con microARN inducibles. Las células PC3-Tet-on (clon 8) se transfectaron de forma estable con plásmidos de expresión pmRi-ZsGreen1-miR-X. Los clones seleccionados (véase la figura 5) se trataron con 1 pg/ml de DOX durante 4 días. Se aisló el ARN total y se estudió la expresión génica por qPCR. *, más de 1,5-veces; =, sin cambio; n.d., no determinado.

Gen PC3-mRi-miR-200c PC3-mRi-miR-520f

Lista de referencias

[0286]

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ABREVIATURAS

[0287]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Molécula de miARN-520f o mimético o isomiR de la misma, o fuente de la misma, donde dicha fuente de dicha molécula de miARN o mimético o isomiR de la misma comprende al menos 80 nucleótidos y comprende un motivo con al menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 1,

o composición que comprende dicha molécula de miARN-520f, mimético o isomiR o fuente de la misma, para usar en el tratamiento, la reversión, la curación y/o el retraso de un cáncer asociado a la TEM mediante la inducción de un proceso de TME,

donde dicha molécula de miARN-520f comprende al menos 6 de los 7 nucleótidos presentes en la secuencia semilla identificada como SEQ ID NO: 104 o 105 y/o tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID NO: 19, 118 y/o 119 y tiene una longitud de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleótidos o más.

2. Molécula de miARN-520f, o mimético o isomiR de la misma, o fuente de la misma, para el uso según la reivindicación 1, o composición para el uso según la reivindicación 1, donde el cáncer asociado a la TEM es un carcinoma.

3. Molécula de miARN-520f, o mimético o isomiR de la misma o fuente de la misma para el uso según la reivindicación 1, o composición para el uso según la reivindicación 1, donde el cáncer asociado a la TEM es un cáncer de vejiga o de próstata.

4. Composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además otra molécula de miARN, mimético o isomiR o fuente de la misma seleccionada de: al menos uno de miARN-518b y/o miARN-524.

5. Composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además otra molécula de miARN, mimético o isomiR o fuente de la misma seleccionada de: al menos uno de miARN-124-1, miARN-206, miARN-181a-1, miARN-141, miARN-200a, miARN-200b, miARN-200c, miARN-429 y miARN-205 y/o una fuente de las mismas.

6. Molécula de miARN-520f, o mimético o isomiR de la misma, o fuente de la misma, para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el uso se combina con tratamientos estándar de cáncer asociado a la TEM.

7. Molécula de miARN-520f, o mimético o isomiR de la misma, o fuente de la misma, para el uso según la reivindicación 6, o composición para el uso según la reivindicación 6, donde el tratamiento estándar es quimioterapia o radioterapia.

8. Molécula de miARN-520f, o mimético o isomiR de la misma, o fuente de la misma, para el uso según la reivindicación 6, o composición para el uso según la reivindicación 6, donde el tratamiento estándar es inmunoterapia.