ES2765073T3 - Vacunas de H5 de influenza - Google Patents
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Abstract
Combinación de: una proteína H5 de células completas en bruto de H5N1 de clado 1 expresada en células de insecto mediante un sistema de expresión basado en baculovirus y un virus de enfermedad de Newcastle inactivado para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de clado 2, y en el que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica de SEC ID nº 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona en SEC ID nº 2, y en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se inserta una segunda lisina (K+).
Description
DESCRIPCIÓN
Vacunas de H5 de influenza
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente exposición se refiere al campo de la medicina, preferentemente al campo de las enfermedades infecciosas. En particular, la presente exposición se refiere a las proteínas y vacunas de influenza. Más particularmente, la presente exposición se refiere a la utilización de cualquiera de dichas proteínas o vacunas para el tratamiento y la prevención de infecciones por influenza, adicionalmente para la prevención de la transmisión intraespecífica e interespecífica del virus influenza.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La infección por influenza sigue siendo una importante infección en animales y seres humanos. Influenza está causada por virus que experimentan cambios/modificaciones antigénicas continuas y que poseen un reservorio animal. De esta manera, en el futuro pueden producirse nuevas epidemias y pandemias y la erradicación de la enfermedad resultará difícil de conseguir. Los virus influenza son bien conocidos de la técnica y se describen en mayor detalle en, por ejemplo, P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, n° 12, páginas S 82 a S 86, de diciembre de 2004, con referencias adicionales. Brevemente, el genoma del virus influenza A consiste en ocho segmentos de cadena sencilla y las partículas víricas presentan dos glucoproteínas principales sobre su superficie: hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Con por lo menos 16 subtipos diferentes de hemaglutinina (H1 a H16) y 9 de neuraminidasa (N1 a N9), existe considerable variación antigénica entre virus influenza.
El virus influenza de tipo H5N1 virus de la peste aviar se ha demostrado que infecta aves, cerdos y el ser humano. Los virus también pueden transmitirse directamente de especies de aves a seres humanos (Claas et al., Lancet 351: 472, 1998; Suárez et al., J. Virol. 72. 6678, 1998; Subbarao et al., Science 279: 393, 1998; Shortridge, Vaccine 17 (supl. 1): S26-S29, 1999). La mortalidad en casos clínicos humanos conocidos se acerca a aproximadamente 50%.
Durante el último siglo, los cerdos han sido un vector importante para las pandemias de influenza. Cerdos, camellos y focas, preferentemente cerdos, pueden ser 'cámaras de mezcla' para los virus de influenza aviar y, por lo tanto, representan un riesgo potencial de superación de los obstáculos específicos en la transmisión de aves, el reservorio natural de los virus influenza, a mamíferos. Lo anterior normalmente ocurre por dobles infecciones de los animales susceptibles, p.ej., cerdo, con ambos: un virus de mamífero (porcino) establecido, además de un virus influenza aviar. Dicha doble infección puede crear nuevos virus recombinantes que pueden ser la causa de pandemias humanas o porcinas. Sin embargo, evidencia reciente indica que una recombinación de cepas H5 aviares actuales con virus influenza de mamífero no resultará en recombinantes altamente virulentas. Por otra parte, el virus influenza aviar puede infectar cerdos y, mediante mutaciones espontáneas, adaptarse a los cerdos. El obstáculo crítico se supera en cuanto el virus puede causar infecciones horizontales dentro de una población porcina (o población de otro mamífero).
Sin embargo, una parte importante de los cerdos del sudeste asiático han resultado infectados por cepas de virus influenza aviar (H5) originadas en centros vecinos de producción avícola. Debido a que dichas infecciones hasta el momento han sido subclínicas, sólo pueden diagnosticarse mediante métodos de laboratorio y, de esta manera, con frecuencia se pasan por alto. Existe un riesgo elevado de que los cerdos infectados subclínicamente sirvan de oportunidad a los virus para adaptarse al sistema de los mamíferos, extenderse dentro de la población porcina y también infectar a seres humanos.
Entre las vacunas de influenza actuales se incluyen una vacuna de subunidad (Babai et al., Vaccine 17(9-10):1223-1238, 1999; Crawford et al., Vaccine 17(18):2265-2274, 1999; Johansson et al., Vaccine 17(15-16):2073-2080, 1999) vacuna atenuada (Horimoto et al., Vaccine 22(17-18):2244-2247, 2004), vacuna de ADN (Watabe et al., Vaccine 19(31):4434-4444, 2001) y vacuna de influenza inactivada (Cao et al., Vaccine 10(4):238-242, 1992), siendo esta última la más ampliamente utilizada a escala comercial (Lipatov et al., J. Virol. 78(17):8951-8959, 2004).
Las vacunas de subunidad, hemaglutinina y neuraminidasa recombinantes (Babai et al., Vaccine 17(9-10):1223-1238, 1999; Crawford et al., Vaccine 17(18):2265-2274, 1999; Johansson et al., Vaccine 17(15-16):2073-2080, 1999) pueden ser una alternativa atractiva a la vacuna inactivada, aunque ninguna se utiliza actualmente como vacuna comercial. La preparación de dichas vacunas evidentemente resulta más segura que la preparación de vacunas inactivadas. Además, las vacunas de subunidad no generan respuestas de anticuerpos a proteíans internas del virus influenza y, de esta manera, permiten distinguir entre animales vacunados e infectados (Crawford et al., Vaccine 17(18):2265-2274, 1999).
La proteína hemaglutinina es la glucoproteína de unión a receptor y fusión a membranas del virus influenza y la diana de anticuerpos neutralizantes de infectividad. La proteína hemaglutinina (HA) entera de H5N1 está compuesta de 568 aminoácidos, con un peso molecular de 56 kDa. La molécula de HA consiste en las subunidades HA1 y HA2; la subunidad HA1 actúa de mediador en el contacto inicial con la membrana celular y HA2 es responsable de la fusión membranal (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 63(1-2):129-136, 2004).
Los sistemas de baculovirus/célula de insecto han sido utilizados para expresar genes de hemaglutinina aislados a partir de subtipos de influenza aviar (Babai et al., Vaccine 17(9-10):1223-1238, 1999; Crawford et al., Vaccine 17(18):2265-2274, 1999; Johansson et al., Vaccine 17(15-16):2073-2080, 1999J; Nwe et al., BMC Mircobiology 6(16):doi:10.1186/1471-2180-6-16, 2006). Sin embargo, dichas proteínas recombinantes aparentemente no resultan protectoras en cualquier caso, o sólo menos eficaces por lo menos para algunas especies (Treanor et al., Vaccine 19: 1732-1737, 2001).
El documento Lin et al., J. Vet. Med. Sci. 70(11):1147-52, 2008, dan a conocer la utilización de un sistema de baculovirus/célula de insecto para la producción de proteína H5 del virus H5N1 clado 2 A/duck/China/E319-2/03, que puede utilizarse para una vacunación de sensibilización-refuerzo para la prevención de una infección por el virus de clado 2 A/duck/China/E319-2/03.
Terregino et al. (Avain Pathology; 39 (3), 215-222, 2010) describen una vacuna de influenza H5N2 muerta completa junto con una vacuna de VEN (virus de la enfermedad de Newcastle) muerta completa y cierta protección cruzada después del reto con una cepa diferente de influenza. Sin embargo, Terregino et al., 2010, no dan a conocer una proteína H5 (vacuna de subunidad) de H5N1 de clado 1 junto con VEN que proporciona protección cruzada frente a un virus H5N1 de clado 2.
El documento n° WO 2008/052173 A2 describe una proteína HA H5, aunque no describe la protección cruzada frente a diferentes virus H5N1.
Bright et al. (PLoS One. 30;3(1):E1501, 2008) describen la utilización de un sistema de baculovirus/célula de insecto para la generación de partículas de tipo vírico (PTV) que incluye neuraminidasa, hemaglutinina y proteína matriz 1 procedentes del virus H5N1 de clado 2 para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora frente a diferentes clados contra un reto el virus H5N1 de clado 1 A/VN/1203/2004 en ratones. Sin embargo, la producción de VLP es problemática, ya que, para generar una PTV funcional que imite eficazmente un virus real, se requieren múltiples proteínas estructurales víricas que a continuación deben ensamblarse correctamente en una partícula que reproduzca la conformación de la cubierta externa (cápside) del virus infeccioso. Además, el estudio revela además que el ensamblaje in vitro de PTV compite con la agregación (Ding et al., Biotechnology and Bioengineering 107 (3): 550 560).
De esta manera, existe una necesidad de incrementar la disponibilidad de vacunas mejoradas y nuevos enfoques de vacunación para proporcionar mejores enfoques en el control de las infecciones de influenza y para presentar un impacto positivo sobre la carga de enfermedad. En particular, existe una fuerte necesidad de un sistema simple, eficaz y fácil de manipular que induzca, preferentemente mediante vacunación de una sola inyección, una respuesta inmunitaria protectora frente a múltiples clados de virus influenza con HA H5N1.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Antes de las realizaciones de la presente invención debe indicarse que, tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo la referencia a “una preparación” incluye una pluralidad de dichas preparaciones; la referencia al “portador” es una referencia a uno o más portadores, y equivalentes de los mismos conocidos por el experto en la materia, y de esta manera sucesivamente. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Todos los intervalos y valores dados pueden variar entre 1% y 5%, a menos que se indique lo contrario o el experto en la materia conozca lo contrario; por lo tanto, el 'termino “aproximadamente” ha sido omitido de la descripción. Aunque pueden utilizarse cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes o los indicados en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos, dispositivos y materiales preferentes. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria con el propósito de describir y dar a conocer las sustancias, excipientes, portadores y metodologías tal como se informan en las publicaciones podrían utilizarse en relación a la invención. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la invención no posee el derecho de anteceder a dicha exposición en virtud de invención anterior.
La solución al problema técnico anteriormente indicado se consigue mediante la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Las proteínas de influenza y moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las mismas.
La presente invención proporciona una combinación de una proteína H5 de células completas en bruto de H5N1 de clado 1 expresada en células de insecto mediante un sistema de expresión basado en baculovirus y virus de enfermedad de Newcastle inactivado para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de clado 2, y en el que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica de
SEC ID n° 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de ciado 1 presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 de H5N1 de ciado 1 se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona en SEC ID n° 2, y en la que la modificación 328K se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se inserta una segunda lisina (K+).
Además, la presente invención proporciona una vacuna para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 de clado 2, que comprende:
a. una combinación de:
una proteína H5 de H5N1 de clado 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica de s Ec ID n° 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona en SEC ID n° 2, y en la que la modificación 328K se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se inserta una segunda lisina (K+), y
un virus de enfermedad de Newcastle inactivado, y
b. un adyuvante.
Además, la presente invención proporciona un kit de partes para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 de clado 2, que comprende:
a. la combinación de vacuna tal como se ha indicado anteriormente., y
b. un impreso en el paquete que indica la utilización de dicha combinación o vacuna de a) para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por virus H5N1 de clado 2.
La presente exposición se basa en el inesperado resultado de que la proteína H5 de H5N1 de clado 1 induce, en particular mediante una vacunación de una sola inyección, una respuesta inmunitaria cruzada entre clados frente a virus influenza con HA de H5N1. Como característica, la proteína H5 del virus H5N1 de clado 1, que por razones de claridad también se denomina “proteína H5 (1)” en la presente memoria, comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica indicada en s Ec ID n° 1.
Una “vacunación de una sola inyección” se refiere a una composición inmunogénica que resulta eficaz para reducir la incidencia o la severidad de la infección tras una sola dosis de dicha composición, sin necesidad de un refuerzo.
Preferentemente, la exposición se refiere, de esta manera, a una proteína H5 (1) del virus h5N1 de clado 1 para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de un clado diferente, es decir, de un clado diferente al clado 1 o de cualquier clado excepto el clado 1, respectivamente, en el que dicha proteína H5 (1) comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica de SEC ID n° 1.
El término “clado” o “clados” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al clado o clados del sistema de nomenclatura de la OMS para el virus influenza aviar altamente patogénico (H5N1), que se resume en el sitio web de OMS, URL: who.int/csr/disease/avianjnfluenza/guidelines/nomenclature/en/ (12.08.2011).
Se definen 10 clados iniciales diferentes de virus (numerados 0 a 9) (WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group, 2008), los cuales se denominan clados de primer orden. Los clados están estrictamente definidos al nivel de los nucleótidos, satisfaciendo los tres criterios de definición de clado específicos siguientes desarrollados por WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group:
• Compartir un nodo común (definitorio de clado),
• agrupamiento monofilético con un valor de 'bootstrap' >60 en el nodo definitorio de clado (tras 1000 réplicas de 'bootstrap' de unión al vecino más próximo), y
• distancias en porcentaje medio entre pares de nucleótidos entre y dentro de clados >1,5% y <1,5%, respectivamente.
A medida que los virus dentro de dichos 10 clados continúan evolucionando, surgen nuevos sublinajes (potenciales clados de H5N1) periódicamente. Una vez estos sublinajes cumplen los mismos tres criterios de definición de clado específicos que los 10 clados iniciales (numerados de 0 a 9), se designan como clados separados (WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008). Estos nuevos clados se definen como clados de segundo (o tercer, etc.) orden y se les asigna una 'dirección' numérica que les une a su clado original utilizando un sistema jerárquico de numeración decimal. Por ejemplo, dentro del clado antigénicamente diferente 2.3, los clados de tercer
oden que cumplen la definición de ciado se denominan ciados 2.3.1 y 2.3.2, y de esta manera sucesivamente. Este sistema lógico de numeración jerárquica se relaciona objetivamente con la filogenia de la HA.
Los criterios utilizados para la denominación de los clados según el sistema de nomenclatura de la OMS para H5N1 son:
1. Mantener el número de clado previamente designado en caso posible (es decir, el clado 2.2 sigue siendo 2.2 y el clado 1 sigue siendo 1),
2. Las denominaciones de los nuevos clados basados en la topología del árbol filogenético derivadas de todas las secuencias disponibles (el árbol grande) progenitores de H5N1 (más próximos a Gs/Guangdong/1/96) redenominados como clado 0;
los clados siguientes se numeran partiendo del clado 3 (es decir, los clados 3 a 9)
los clados denominados por la presencia de un nodo común diferente compartido por como mínimo 4 aislados (en un grupo monofilético);
ramas adicionales denominadas con un solo clado evolucionan para convertirse en más de un linaje diferente (es decir, clado 2.2 o clado 2.3.1, basado en la compartición de un nodo común y el agrupamiento monofilético)
3. Distancias entre pares en porcentaje medio entre y dentro de clados (utilizando Kimura de 2 parámetros); los clados diferentes deben presentar >1,5% distancias medias entre otros clados;
los clados diferentes deben presentar <1,5% distancias medias dentro de clado (pueden ser ligeramente más elevadas en clados con valores atípicos altamente evolucionados, es decir, Ck/Shanxi/2/2006 en el clado 7)
4. Bootstrap (basado en 1.000 réplicas de 'bootstrap' de unión de vecino más próximo) >60% del valor de 'bootstrap' en el nodo definitorio de clado (obtenido de la Tabla 1, de: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008).
La cepa prototipo para cada clado se lista en la tabla a continuación:
Clado Cepa prototipo
0 Gs/Guangdong/1/96
3 Ck/Hong Kong/YU562/2001
4 Gs/Guiyang/337/2006
5 Gs/Guangxi/914/2004
6 Ck/Hunan/01/2004
7 Ck/Shanxi/2/2006
8 Ck/Hong Kong/YU777/2002
9 Dk/Guangxi/2775/2005
1 Vietnam/1203/2004
2.1.1 Ck/Indonesia/BL/2003
2.1.2 Indonesia/538H/2006
2.1.3 Indonesia/5/2005
2,2 BHGs/Qinghai/1A/2005
2.3.1 Dk/Hunan/303/2004
2.3.2 Ck/Guangxi/2461/2004
2.3.3 Ck/Guiyang/3055/2005
2.3.4 Dk/Fujian/1734/2005
2,4 Ck/Yunnan/115/2004
2,5 Ck/Korea/ES/2003
2,5 Ck/Korea/ES/2003
(extraídos de la Tabla 2 de: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008).
La publicación WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7, 2008, se encuentra en el sitio web de CDC, url: cdc.gov/EID/content/14/7/e1.htm (12.08.2011.
Se proporciona una vista general de la clasificación de clados de los virus H5N1 conocidos mediante el árbol filogenético en el sitio web de la OMS url: who.int/csr/disease/avian_influenza/H5CompleteTree.pdf (15.08.2011).
Para determinar el clado de una proteína H5 de H5N1, por ejemplo puede utilizarse la herramienta web “Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 HA clade prediction”, que ha sido decrita por Lu, Davis, Rowley y Donis: "A Web-based tool for the clade designation of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses" in Options for the Control of Influenza VI. J.M. Katz, N. Cox y A.W. Hampson (editores), London: Blackwell, 2007 y que se encuentra en el sitio web de URL: h5n1.flugenome.org/grouping.php (12.08.2011).
Por ejemplo, una proteína H% del virus H5N1 de clado 1 (de esta manera, la proteína H5 (1) es una HA con una
secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de un ciado 1 según el sistema anteriormente indicado de nomenclatura de la OMS para H5N1.
Por ejemplo, un virus H5N de clado 2.3.1 es, por lo tanto, un H5N1 que cumple los criterios de un clado 2.3.1 según el sistema de nomenclatura de la OMS anteriormente indicado para H5N1.
Preferentemente, la proteína H5 (1) según la exposición, es decir, la proteína H5 del virus H5N1 de clado 1 tal como se indica en la presente memoria, comprende o conste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98,1%, preferentemente de por lo menos 98,2%, más preferentemente de por lo menos 98,3%, y lo más preferentemente de por lo menos 98,4% respecto a la secuencia polipeptídica de SEC ID n° 1.
La identidad de secuencia en el contexto de la invención se entiende que se basa en una determinada similitud por pares entre secuencias de proteína. La determinación del porcentaje de similitud entre dos secuencias preferentemente se lleva a cabo utilizando un algoritmo computacional, en particular, la bien conocida herramienta de búsqueda de alineaciones locales básicas (Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ: Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990). Para los fines de la presente invención, se determina el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos utilizando el algoritmo de búsqueda de homologías blastp de b La ST utilizando los parámetros siguientes: un umbral esperado de 10, tamaño de término de 3, matriz BLOSUM62, penalización por apertura de hueco de 11, una penalización por extensión de hueco de 1 y un ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional. La base de datos en la que se busca es el conjunto de secuencias de proteína no redundantes (nr). El algoritmo de búsqueda de homologías BLAST se describe en Altschul S.F., J. Mol. Biol.
215(3):403-410, 1990.
Una variante puede, por ejemplo, diferir de la molécula de número de acceso de referencia BAE07201 sin péptido de señal (los 16 residuos aminoácidos N-terminales no se muestran en la SEC ID n° 1) en tan solo 1 a 15 residuos aminoácidos, en tan solo 1 a 10 residuos aminoácidos, tal como 6 a 10, en tan solo 5, en tan solo 4, 3, 2 o incluso 1 residuo aminoácido.
Preferentemente, la proteína H5 (1) según la exposición, es decir, la proteína H5 (1) del virus H5N1 de clado 1 para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de un clado diferente, es preferentemente una proteína H5 del virus influenza, en la que la proteína H5 que presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+). Dicha proteína H5 (1) preferente en lo sucesivo también se denomina Mut k+ o mutK+. Preferentemente, dicha proteína H5 y cualquier proteína H5 adicional según la exposición es una proteína H5 aislada.
La expresión “proteína H5 (1) de H5N1 de clado 1”, tal como se utiliza en la presente memoria, preferentemente se refiere a “proteína H5 (1) como antígeno individual del virus H5N1 de clado 1” o, en particular, “proteína H5 (1) como antígeno individual”.
Las expresiones “hemaglutinina 5 (H5)” o “H5 de virus influenza aviar” o “proteína H5”, tal como se utilizan en la presente memoria, son equivalentes y se refieren, aunque sin limitación, a cualquier proteína H5 natural y a cualesquiera formas modificadas de proteína H5, incluyendo cualquier mutación por deleción, sustitución y/o inserción de proteína H5.
La numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 (1) Mut k+ tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona ejemplarmente en la SEC ID n° 2. La SEC ID n° 2 representa la secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina de la cepa duck/China/E319-2/03 pero que no presenta el péptido de señal aminoterminal. En otras palabras, en el caso de que se haga referencia al aminoácido en la posición 223 (aminoácido 223), se hace referencia al residuo aminoácido que corresponde al aminoácido 223 de la s Ec ID n° 2. Sin embargo, lo anterior no significa que la proteína H5 Mut k según la exposición presente una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID n° 2. Únicamente afirma que los aminoácidos correspondientes de las proteínas H5 según la exposición codifican para los residuos aminoácidos tal como se mencionan explícitamente. En el presente caso, el aminoácido 223 sería serina (S). Los términos “223N” o “155N” se refieren ejemplarmente a que el aminoácido en las posiciones 223 y 155, respectivamente (numeración según las posiciones aminoácidas de la SEC ID n° 2) codifican para el aminoácido asparagina (N). En otras palabras, en el caso de que se haga referencia a “proteína H5 (1) que presenta el aminoácido 223N”, una molécula de aminoácido de H5 que normalmente codifica para serina en la posición aminoácida 223 (numeración según la posición aminoácida de la SEC ID n° 2) será sustituida por una asparagina (N). El término “328K+” o “modificación 328K+” se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5 (numeración según la posición aminoácida de la SEC ID n° 2), se inserta una segunda lisina (K+). En los casos en que las secuencias aminoácidas en las posiciones 328 y 329 codifiquen naturalment lisina-lisina, no se insertará ninguna lisina (K) adicional. Sin embargo, la mayoría de las secuencias conocidas de H5 codifican en las posiciones aminoácidas 328 y 329 para lisina-arginina. En cualquiera de dichos casos, la expresión modificación 328K+ se refiere a que debe insertarse una segunda lisina (K) entre la lisina en la posición 328 y la arginina en la posición 329. La secuencia modificada en este caso se leería como lisina-lisina-arginina (KKR).
Con respecto al presente ejemplo, la hemaglutinina de la cepa duck/China/E329-2/03 se cambia por na proteína H5 (1) de H5N1 de clado 1, ya que es similar a la secuencia de H5 del virus H5N1 de clado 1 A/HongKong/213/2003, el año/localización/huésped de dicho aislado de HK, y muestra reactividad con los anticuerpos específicos para el clado 1. Por lo tanto, la secuencia Mut K+ se clasifica como una secuencia de H5 de H5N1 de clado 1. Dentro del contexto de la exposición, la secuencia Mut K+ diseñada, de esta manera, se entiende y se define que es una proteína H5 de virus H5N1 de clado 1.
De esta manera, en particular también cualquier proteína H5 diseñada se entiende y se define que es una proteína H5 de virus H5N1 de clado 1 según la exposición en el caso de que esté codificada por una secuencia de nucleótidos que satisfaga los criterios de una secuencia de nucleótidos de clado 1 según el sistema anteriormente mencionado de nomenclatura de la OMS para H5N1.
Se da a conocer una proteína H5 y cualesquiera formas modificadas de proteína H5, incluyendo cualquier deleción, sustitución y/o según la exposición, es decir, la proteína H5 (1) del virus H5N1 de clado 1 para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de un clado diferente, es preferentemente una proteína H5 del virus influenza, en la que la proteína H5 que presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+). Resulta evidente que cualquiera de las proteínas H5 proporcionada en la presente memoria es antigénica lo que significa que muestran propiedades antigénicas en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina para los virus influenza.
La presente exposición se refiere además a cualquier parte de la proteína H5 (1), lo que significa que cualquier fragmento peptídico que muestre propiedades antigénicas en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinna, que presenta en un aspecto por lo menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+).
Una proteína H5 (1) muestra propiedades antigénicas en el caso de que inhiba la hemaglutinación en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina, por ejemplo tal como se indica en el Ejemplo 2. Normalmente, dicha parte antigénica de la proteína H5 (1) comprende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 o, más preferentemente, 105 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que codifica para la proteína H5 tal como se ha indicado anteriormente, modificados o no modificados, que muestra propiedades antigénicas en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina tal como se indica en el Ejemplo 2. También se describe un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina en Stephenson et al., Virus Research 103:91-95, 2004, con referencias adicionales. Sin embargo, el ensayo de IH tal como se indica en el Ejemplo 2 se entiende que es un ensayo de referencia rlevante en relación a todos los aspectos de la exposición tal como se indica en la presente memoria.
Brevemente, se llevó a cabo un ensayo de IH para detectar la presencia de anticuerpos específicos de HA. Se utilizó un virus H5N2 heterólogo, A/chicken/Mexico/232/94, a una concentración de cuatro unidades de hemaglutinina [4 unidades de HA] en el ensayo de IH. En placas de microtitulación de fondo en U, se mezclaron a continuación diluciones en serie de dos veces de suero en PBS con volúmenes iguales (25 j l ) que contenían 4 unidades de HA y se incubaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante 30 min. Se añadieron glóbulos rojos de pollo a una concentración de 0,5% en PBS a los pocillos que contenían suero-virus y se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente. Se determinaron los títulos de IH como recíprocos de las diluciones de suero más elevadas en las que se observaba inhibición de la hemaglutinación.
Cabe destacar que Haesebrouck y Pensaert (1986) encontraron que “podría existir una correlación entre los títulos de IH contra el virus de reto y la protección frente al reto”. Haesebrouck y Pensaert (1986) determinaron además que cerdos con títulos de IH >40 eran "completamente resistentes al reto y no se producía replicación del virus en el tracto respiratorio con el reto". De esta manera, el desarrollo de títulos de IH >40 en los cerdos vacunados se correlacionaría con protección. (F. Haesebrouck y M.B. Pensaert, 1986). Effect of intratracheal challenge of fattening pigs previously immunized with an inactivated influenza H1N1 vaccine (Veterinary Microbiology, 11:239--249, 1986. Debe asumirse que títulos equivalentes o por lo menos prácticamente equivalentes de IH de H5 también resultarán en una protección inmunitaria completa de los cerdos frente al virus influenza aviar. Los títulos más bajos resultan por lo menos en una seroconversión de los animales vacunados y resultan en una protección inmunitaria parcial de dichos animales, lo que también puede reducir drásticamente el riesgo de una pandemia.
Además, una parte antigénica de la proteína H5 (1) según la exposición incluye, aunque sin limitación, mutantes por deleción de la proteína H5, que comprende:
i. por lo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o, más preferentemente, 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que circunda e incluye el aminoácido 223N, y
ii. por lo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o, más preferentemente, 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que circunda e incluye el aminoácido 328K+, y
iii. en la que cualquiera parte de dicha parte antigénica de la proteína H5 muestra inhibición de la hemaglutinina en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina tal como se indica en el Ejemplo 2.
Preferentemente, dichos aminoácidos circundantes de aminoácido 223N y/o 328K+ están codificados por la SEC ID n° 2 o la SEC ID n° 5.
Son proteínas H5 adicionalmente preferentes (1) según la exposición:
i. cualquiera de las indicadas anteriormente que presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, ii. cualquiera de las indicadas anteriormente que presenta el aminoácido 94N/223N y la modificación 328K+, iii. cualquier proteína H5 de origen aviar que presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
iv. cualquier proteína H5 de origen aviar que presenta los aminoácidos 94N/223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
v. cualquier proteína H5 de origen aviar que presenta los aminoácidos 155N/223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
vi. cualquier proteína H5 de origen aviar que presenta el aminoácido 120N/155N/223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
vii. cualquier proteína H5 que presenta las modificaciones 94N/223N y la modificación 328K+, o
viii. cualquier proteína H5 que presenta las modificaciones 94N/155N/223N y la modificación 328K+, o ix. cualquier proteína H5 que presenta las modificaciones 94N/120N/155N/223N y la modificación 328K+, o x. cualquier proteína H5 que presenta la modificación 223N, la modificación 328K+ y una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: BGU
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL, o
xi. cualquier proteína H5 que presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+ y una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS, o
xii. cualquier proteína H5 que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5.
Además, entre las proteínas H5 preferentes (1) tal como se dan a conocer en la presente memoria se incluyen las proteínas H5 tal como se indican en Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n° 36, páginas 12915 a 12920, de 6 de septiembre, 2005, en la que las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones anteriormente indicadas, por lo menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2 y en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+).
Además, entre las proteínas H5 adicionalmente preferentes (1) se incluyen proteínas H5 que comprenden un péptido que comprende el aminoácido 223N y la modificación 328K, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la s Ec ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+), y
i. la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6 o SEC ID n° 7, o ii. Cualquier péptido que presente una homología de secuencia de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 97%, aún todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 98%, y aún todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 99%, respecto al polipéptido de i) que comprende inhibición de hemaglutinina en una inhibición estándar de hemaglutinina tal como se ha indicado anteriormente, o
iii. cualquier parte antigénica de los polipéptidos de i) o ii) que comprende por lo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o más preferentemente 8 aminoácidos contiguos de cualquiera de los péptidos de i) o ii).
iv. Cualesquiera péptidos de i), ii) o iii) que presenta los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83d , 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, 223N, o 120N/155N.
v. Cualquier péptido de i), ii), iii) o iv) que presenta una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: BGU
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL, o
vi. cualquier péptido de i), ii), iii) o iv) que presenta una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS.
“Homología de secuencia”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un método para determinar el grado de relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, se alinean óptimamente dos o más secuencias, y se introducen huecos en caso necesario. En contraste con la identidad de secuencia, se cuentan las sustituciones de aminoácidos conservadoras como una correspondencia al determinar la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido con una homología de secuencia de 95% respecto a una secuencia de referencia, 85%, preferentemente 90%, todavía más preferentemente 95% de los residuos aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de referencia deben ser correspondientes o comprender una sustitución conservadora por otro aminoácido o nucleótido, o pueden insertarse en la secuencia de referencia, varios aminoácidos o nucleótidos, hasta 15%, preferentemente hasta 10%, todavía más preferentemente hasta 5%, de los residuos aminoácidos o nucleótidos totales, no incluyendo sustituciones conservadoras. Preferentemente, la secuencia homóloga comprende por lo menos un tramo de 50, todavía más preferentemente de 100, todavía más preferentemente de 250, todavía más preferentemente de 500 nucleótidos. Después de dicha alineación, se determina la homología de secuencia posición a posición, p.ej. Las secuencias son “homólogas” en una posición particular en el caso de que en dicha posición, los nucleótidos o residuo aminoácidos sean idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide a continuación por el número total de nucleótidos o residuos aminoácidos en la secuencia de referencia, proporcionando el % de homología de secuencia. La homología de secuencia puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, aunque sin limitación, los indicados en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., editores, Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., editores, M. Stockton Press, New York, 1991, y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988. Se diseñan métodos preferentes para determinar la homología de secuencia, proporcionando la correspondencia máxima entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la homología de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Entre los ejemplos de dichos programas se incluyen, aunque sin limitación, el paquete informático de GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387, 1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215, 403-410, 1990). El programa BLASTX se encuentra disponible públicamente del NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410, 1990). Estos programas alinean óptimamente secuencias utilizando pesos de hueco por defecto a fin de producir el nivel máximo de homología de secuencia entre la secuencia dada y la secuencia de referencia.
Además, entre las proteínas H5 (1) preferentes se incluyen proteínas H5 que comprenden la modificación 328K+, tal como se ha indicado anteriormente, y la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Tabla 1, o cualquier parte inmunogénica de la misma:
Tabla 1. Antígenos H5
Además, la presente exposición se refiere además a proteínas H5 (1) que presentan por lo menos el aminoácido 223N
y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la
posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a
que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+), y comprende:
i. un péptido que presenta las secuencias de NCBI n° de acceso AAT65209, CAJ32556, ABC47656, CAF21874, CAF21870, AAC58998, AAC58997, AAC58996, AAC58994, AAC58993, AAC58992, AAC58991, AAC58990,
AAC58995, AAS45134, AAN17270, AAN17269, AAN17268, AAN17267, AAN17266, AAN17265, AAN 17264, AAN
17263, AAN 17262, AAN17261, AAN 17260, AAN 17259, AAN 17257, AAN 17256, AAN 17255, AAN 17254,
AAA43083, AAA43082, AAB19079, BAE48696, BAE48693, BAE48696, BAE48695, BAE48694, BAE48692, BAE48691, BAE48690, BAE48689, BAE48688, BAE48687, BAE48686, BAE48685, BAE48684, BAE48683, AAC58999 ABC72082, AAV91149, AAP71993, AAP71992, AAP71991, AAP71990, AAP71989, AAP72011, AAP72010, AAP72009, AAP72008, AAP72007, AAP72006, AAP72005, AAP72004, AAP72003, AAP72002, AAP72001, AAP72000, AAP71999, AAP71998, AAP71997, AAP71996, AAP71995, AAP71994, AAF99718, ABF58847, AAG38534, AAC32102, AAC32099, AAL75847, AAC32101, AAC32098, AAC32088, AAC32078, AAR99628 AAC32100, AAM49555, AAL75843, AAL75839, AAD13573, AAD13568, AAF04720, AAF04719, AAC34263 AAR16155, AAD13574, AAD13570, AAD13575, AAD13572, AAD13569, AAD13567, AAD13566, AAK57506, AAG01225, AAG01215, AAG01205, AAG01195 o ABD83813 modificadas de la manera indicada anteriormente, lo que significa que dichas secuencias incluyen las modificaciones 223N y 328 K+ anteriormente indicadas, las cuales no son parte de las secuencias de tipo salvaje, o
ii. cualquier péptido que presente una homología de secuencia de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 97%, aún todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 98%, y aún todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 99%, respecto al polipéptido de i) que comprende inhibición de hemaglutinina en una inhibición estándar de hemaglutinina tal como se ha indicado anteriormente,
iii. cualesquiera péptidos de i), ii) o iii) que presenta los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T o 120N/155N, o
iv. cualquiera de dichos péptidos de i), ii) o iii) que presenta una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125 SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: BGU
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL, o
v. cualquier péptido de i), ii), iii) o iv) que presenta una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: BGU.
Preferentemente, la proteína H5 (1) para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de un clado diferente se expresa y/o produce recombinantemente mediante un sistema de expresión baculovírico, preferentemente en células de insecto en cultivo.
La expresión “proteína H5 (1)” tal como se indica en la presente memoria es, de esta manera en particular, equivalente a la expresión “proteína H5 recombinante” utilizada en la presente memoria.
Con respecto al virus H5N1 de un clado diferente, tal como se indica en la presente memoria, dicho virus H5N1 de un clado diferente se selecciona preferentemente del grupo que consiste en virus H5N1 de clado 0, virus H5N1 de clado 2, virus H5N1 de clado 3, virus H5N1 de clado 4, virus H5N1 de clado 5, virus H5N1 de clado 6, virus H5N1 de clado 7, virus H5N1 de clado 8 y virus H5N1 de clado 9.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado diferente es virus H5N1 de clado 2.2 o un virus H5N1 de clado 2.3.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado diferente es virus H5N1 de clado 2.2.1 o un virus H5N1 de clado 2.3.2.
En aras de la claridad, la proteína H5 del virus H5N1 de un clado diferente se denomina “proteína H5 (2)” en lo sucesivo en la presente memoria. Por lo tanto, la proteína H5 (2) tal como se indica en la presente memoria es en particular una proteína H5 codificada por el genoma de un H5N1 de cualquier clado con la excepción del clado 1.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado diferente es un virus H5N1 de origen norteafricano o vietnamita, en el que dicho virus H5N1 de origen norteafricano es preferentemente un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) de virus influenza, en el que dicha proteína H% (2) presenta:
(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, en los que la modificación 145(-) se refiere a que la posición aminoácida 145 de H5 ha sido delecionada, o
(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 145L, 172T y 254V,
y en el que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 (2) se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona ejemplarmente en la SEC ID n° 8,
o en el que dicha proteína H5 (2) consiste o comprende uan secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95%, preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, todavía más preferentemente por lo menos 98%, todavía más preferentemente por lo menos 99% o particularmente preferentemente 100% homóloga respecto a cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 9 a 46.
Preferentemente, dicha proteína H5 (2) según (a) es una proteína de subclado A, y dicha proteína H5 según (b) o (c) es una proteína de subclado B.
Dentro del contexto de la invención, se entiende que el término “aminoácido” en particular se refiere a un residuo aminoácido o, respectivamente, a un aminoácido que se ha unido covalentemente mediante enlaces peptídicos a dos aminoácidos adicionales o, en el caso de que el aminoácido se encuentre localizado N- o C-terminalmente en la secuencia peptídica, a un aminoácido adicional.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado diferente comprende proteína H5 (2) que presenta:
(a) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, o
(b) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o (c) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H y 254V,
y/o
en el que dicha proteína H5 (2) comprende un péptido que comprende:
i. cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 9 a n° 46,
ii. cualquier péptido que presente una homología de secuencia de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos 95%, todavía más preferentemente de por lo menos 96%, todavía más preferentemente de por lo menos 97%, aún todavía más preferentemente de por lo menos 98%, todavía más preferentemente de por lo menos 99%, lo más preferentemente de 100%, respecto al polipéptido de i) que comprende inhibición de hemaglutinina en una inhibición estándar de hemaglutinina, o
iii. cualquier parte de los polipéptidos de i) o ii) que comprende por lo menos 334 aminoácidos contiguos de cualquiera de dichos péptidos de i) o ii) y en el que cualquiera de dichos péptidos comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina,
y/o
en el que dicha proteína H5 (2) consiste o comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95%, todavía más preferentemente de por lo menos 96%, todavía más preferentemente de por lo menos 97%, todavía más preferentemente de por lo menos 98%, todavía más preferentemente de por lo menos 99%, lo más preferentemente de 100%, respecto a cualquiera de las secuencias indicadas en las Se C ID n° 9 a n° 46.
Más en particular, el virus H5N1 de un clado diferente preferentemente comprende proteína H5 (2) que consiste o comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95%, preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, todavía más preferentemente por lo menos 98%, todavía más preferentemente por lo menos 99% o particularmente preferentemente 100% homóloga respecto a cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 15 o n° 20, y en el que dicha proteína H5 (2) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 20 resulta en particular más preferente.
En particular, la presente exposición se refiere a la proteína H5 (1) indicada en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones
(A) por virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano, es decir, una infección por un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) que presenta los aminoácidos según (a) indicados anteriormente o que comprende una proteína H5 tal como se ha indicado anteriormente,.relacionada con cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 9 a n° 19, o n° 42 o n° 43,
o
(B) por virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano, es decir, una infección por un virus H5N1 que comprende una proteína H5 que presenta los aminoácidos según (b) o (c) indicados anteriormente o que comprende una proteína H5 tal como se ha indicado anteriormente,.relacionada con cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 20 a n° 41, o n° 44 o n° 46.
Preferentemente, la presente exposición se refiere además a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican para cualquiera de las proteínas H5 (1), tal como se ha indicado anteriormente, para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 de un clado diferente. Preferentemente, dichas moléculas de ácidos nucleicos son moléculas de ARN, ADN o de copia de ADN (c). De esta manera, la presente exposición se refiere a un molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADNc codificante de una proteína H5 o
cualesquiera formas modificadas de proteína H5, incluyendo cualquier mutante por deleción, sustitución y/o inserción de proteína H5, en la que aquellas proteínas H5 que presentan el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+).
Preferentemente, la presente exposición se refiere además a una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADNc codificante de cualquier parte de la proteína H5 (1), lo que significa que cualquier fragmento peptídico que muestre propiedades antigénicas en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina tal como se ha indicado anteriormente, y que presenta por lo menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2, en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+). Normalmente, dichas moléculas de ácidos nucleicos, las cuales codifican para una parte antigénica de la proteína H5, comprenden 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 o, más preferentemente, 315 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína H5 tal como se ha indicado anteriormente, modificados o no modificados, que muestra propiedades antigénicas en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina tal como se indica en la presente memoria.
Anteriormente se han indicado partes antigénicas adicionales de la proteína H5 (1). Es conocimiento común del experto en la materia la construcción de cualquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos, preferentemente moléculas de ADNc que codifican para la parte antigénica de la proteína H5 tal como se ha indicado anteriormente. Lo anterior incluye, además, aunque sin limitación, la construcción de moléculas de ácidos nucleicos, preferentemente de moléculas de ADNc, que codifican para las partes antigénicas de la proteína H5 tal como se ha indicado anteriormente, incluyendo mutantes por deleción de la proteína H5, que comprende:
i. por lo menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 o, más preferentemente, 24 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que circunda e incluye la secuencia codificante que codifica para el aminoácido 223N, y ii. por lo menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 o, más preferentemente, 24 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótiods que circunda e incluye la secuencia codificante que codifica para el aminoácido 328K+, y iii. en la que cualquiera parte de dichas partes antigénicas de la proteína H5 muestra inhibición de la hemaglutinina en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina tal como se indica en el Ejemplo 2.
Preferentemente, dichos nucleótidos circundantes de los nucleótidos, que codifican para los aminoácidos 223N y/o 328K+, codifican para la SEC ID n° 2 o la SEC ID n° 5.
Son moléculas de ácidos nucleicos adicionalmente preferentes que codifican para la proteína H5 (1) según la exposición:
i. cualquiera de las indicadas anteriormente codificantes para el aminoácido 223N y la modificación 328K+, ii. cualquiera de las indicadas anteriormente codificantes para el aminoácido 94N/223N y la modificación 328K+, iii. Cualesquiera moléculas de ácidos nucleicos de origen aviar codificantes para el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
iv. cualesquiera moléculas de ácidos nucleicos de origen aviar codificantes para los aminoácidos 94N/223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
v. cualesquiera moléculas de ácidos nucleicos de origen aviar codificantes para los aminoácidos 155N/223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o
vi. cualquier molécula de ácidos nucleicos codificante para la proteína H5 de origen aviar que presenta el aminoácido 120N/155N/223N y la modificación 328K+, en la que origen aviar se refiere a que la secuencia de H5 se deriva de un aislado vírico que se aisló originalmente de un ave infectada por virus influenza aviar de tipo 5, o vii. cualquier molécula de ácido nucleico codificante para la proteína H5 que presenta las modificaciones 94N/223N y la modificación 328K+, o
viii. cualquier molécula de ácido nucleico codificante para la proteína H5 que presenta las modificaciones 94N/155N/223N y la modificación 328K+, o
ix. cualquier molécula de ácido nucleico codificante para la proteína H5 que presenta las modificaciones 94N/120N/155N/223N y la modificación 328K+, o
x. cualquier molécula de ácido nucleico codificante para la proteína H5 que presenta la modificación 223N, la modificación 328K+ y una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: BGU
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL, o
xi. cualquier molécula de ácido nucleico codificante para la proteína H5 que presenta el aminoácido 223N, la modificación 328K+ y una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS, o
xii. cualquier molécula de ácido nucleico codificante para la proteína H5 que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5.
Entre las proteínas H5 adicionalmente preferentes (1) tal como se dan a conocer en la presente memoria se incluyen las proteínas H5 tal como se indican en Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n° 36, páginas 12915 a 12920, de 6 de septiembre de 2005, en la que las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones anteriormente indicadas, por lo menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2 y en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+). Preferentemente, la presente exposición se refiere además a cualquier molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADNc codificante para cualquiera de dichas proteínas indicadas en Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n° 36, páginas 12915 a 12920, de 6 de septiembre, 2005, en la que las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones anteriormente indicadas, por lo menos el aminoácido 223N y la modificación 328k , en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida proporcionada ejemplarmente en la SEC ID n° 2 y en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+).
Los métodos, o cómo introducir cualquiera de las modificaciones anteriormente indicadas en la secuencia de nucleótidos, incluyendo la secuencia codificante de la proteína H5 de un virus influenza, son bien conocidos de la técnica. La secuencia genómica del virus influenza entero puede modificarse según la exposición, por ejemplo según los métodos indicados en la patente US n° 6.951.754, con referencias adicionales.
Además, pueden utilizarse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante comprendidas en los conocimientos de la técnica para modificar una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un antígeno tal como se indica en la presente memoria. Dichas técnicas se explican por completo en la literatura. Ver, p.ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994).
Preferentemente, la presente exposición se refiere además a un vector que comprende cualquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos tal como se ha indicado anteriormente. En otras palabras, la presente exposición se refiere a un vector que incluye la secuencia codificante de cualquiera de dicha proteína H5 (1) o parte de la misma tal como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión, que permite la expresión de cualquiera de dichas proteínas H5 (1) o parte de las mismas tal como se ha indicado anteriormente. Los vectores según la exposición son aquellos que resultan adecuados para la transfección o infección de células bacterianas, de levadura o animales, in vitro o in vivo.
Los vectores y métodos para preparar y/o utilizar vectores (o recombinantes) para la expresión pueden ser iguales o análogos a los métodos dados a conocer en: patente US n° 4.603.112, n° 4.769.330, n° 5.174.993, n° 5.505.941, n° 5.338.683,n° 5.494.807, n° 4.722.848, n° 5.942.235, n° 5.364.773, n° 5.762.938, n° 5.770.212, n° 5.942.235, n° 382.425, publicaciones de patente PCT n° WO 94/16716, n° WO 96/39491y n° WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, octubre de 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety", PNAS USA 93: 11341-11348, octubre de 1996, Smith et al., patente US n° 4.745.051, (baculovirus recombinante), Richardson, C.D. (editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995), Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, vol. 3, n° 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, vol. 4, n° 3, páginas 399 a 406; EPA0 370 573, solicitud de patente US n° 920.197, presentada el 16 de octubre,1986, publicación de patente EP n° 265785, patente US n° 4.769.331 (virus herpes recombinante), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996,
Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 93: 11313-11318, octubre de 1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, octubre de 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, octubre de 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068 3075,1991; patentes US n° 5.591.439, n° 5.552.143, documento n°WO 98/00166, allowed solicitudes autorizadas de patente US n° de serie 08/675,556 y n° 08/675,566, ambas presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante), Grunhaus et al., "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (vol. 3) p. 237-52, 1992, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, páginas 3861-65,Graham, Tibtech 8,85-87, abril, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol.
70,42434, documento n° PCT WO 91/11525, Felgner et al., J. Biol. Chem. 269,2550-2561, 1994; Science, 259: 1745 49, 1993 t McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414 11420, octubre de 1996 y patentes US n° 5.591.639, n° 5.589.466 y n° 5.580.859, así como el documento n° WO 90/11092, n° WO93/19183, n° WO94/21797, n° WO95/11307 y n° WO95/20660, Tang et al., Nature y Furth et al. Analytical Biochemistry, referentes a vectores de expresión de ADN, entre otros. Ver también el documento n° wo 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expresión lentivírico); Sanford et al., patente US n° 4.945.050; Fischbachet al. (Intracel), documento n° WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, páginas 271 a 283, 1997, (sistemas de vector de ADN); Szoka et al., patente US n° (método de inserción de ADN en células vivas); McCormick et al., patente US n° 5.677.178 (utilización de virus citopáticos), y patente US n° 5.928.913 (vectores para el transporte génico), así como otros documentos citados en la presente memoria.
Un vector vírico, por ejemplo seleccionado de virus herpes porcinos, tales como el virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, poxvirus, especialmente virus Vaccinia, virus de viruela aviar, virus de la viruela del canario y virus de la viruela porcina, así como vectores de ADN (plásmidos de ADN), se utiliza ventajosamente en la práctica de la exposición.
Métodos de producir las proteínas H5 (1) según la presente invención.
La presente exposición proporciona métodos para producir y/o recuperar cantidades elevadas de proteína H5 recombinante, i) al permitir la infección de células susceptibles en cultivo por un vector vírico recombinante que contiene secuencias codificantes de ADN de H5, en las que la proteína H5 es expresada por el vector vírico recombinante, y ii) posteriormente recuperar la proteína H5 a partir del cultivo celular. Cantidades elevadas de proteína H5 se refiere a, aunque sin limitación, más de aproximadamente 20 pg/ml de cultivo celular, preferentemente más de aproximadamente 25 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 30 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 40 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 50 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 60 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 80 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 100 pg/ml, todavía más preferentemente más de aproximadamente 150 pg/ml, lo más preferentemente más de aproximadamente 190 pg/ml.
Preferentemente, la proteína H5 (1) se recupera mediante recolección de las células SF+ enteras (es decir, intactas) que expresan la proteína H5.
Las células preferentes son aquellas susceptibles de infección por un vector vírico recombinante apropiado, que contiene un ADN de H5 y que expresa la proteína H5 (1). Preferentemente, las células son células de insecto, y más preferentemente, incluyen las células de insecto comercializadas bajo la marca comercial células de insecto SF+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Los cultivos celulares preferentes presentan un recuento celular de entre aproximadamente 0,3 y 2,0 x 106 células/ml, más preferentemente entre aproximadamente 0,35 y 1,9 x 106 células/ml, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,4 y 1,8 x 106 células/ml, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,45 y 1,7 x 106 células/ml, y lo más preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 1,5 x 106 células/ml.
Entre los vectores víricos preferentes se incluyen baculovirus, tales como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), en particular con la condición de que las células de producción sean células de insecto. Aunque resulta preferente el sistema de expresión baculovirus, el experto en la materia entenderá que otros sistemas de expresión funcionarán para los fines de la presente exposición, es decir, la expresión de H5 en el sobrenadante de un cultivo celular. Dichos otros sistemas de expresión pueden requerir la utilización de una secuencia de señal para causar la expresión de H5 hacia el medio.
El medio de crecimiento apropiado también será determinable por el experto en la materia, siendo un medio de crecimiento preferente, medio de células de insecto libre de suero, tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) y similares.
El vector vírico recombinante que contiene las secuencias de ADN de H5 presenta una multiplicidad de infección (MDI) preferente de entre aproximadamente 0,03 y 1,5, más preferentemente de entre aproximadamente 0,05 y 1,3, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,09 y 1,1, y lo más preferentemente de entre aproximadamente 0,1 y 1,0, al utilizarlo para la infección de las células susceptibles. Preferentemente, las MDI mencionadas anteriormente se refieren a un ml de líquido de cultivo celular. Preferentemente, el método indicado en la presente memoria
comprende la infección de 0,35 a 1,9 x 106 células/ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,4 y 1,8 x 106 células/ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,45 y 1,7 x 106 células/ml, y lo más preferentemente de entre aproximadamente 0,5 y 1,5 x 106 células/ml con un vector vírico recombinante que contiene un ADN de H5 y que expresa la proteína H5 que presenta una MDI (multiplicidad de infección) de entre aproximadamente 0,03 y 1,5, más preferentemente de entre aproximadamente 0,05 y 1,3, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,09 y 1,1, y lo más preferentemente de entre aproximadamente 0,1 y 1,0.
A continuación, se incuban las células infectadas durante un periodo de hasta diez días, más preferentemente de entre aproximadamente dos días y aproximadamente diez días, todavía más preferentemente de entre aproximadamente cuatro días y aproximadamente nueve días, y lo más preferentemente de entre aproximadamente cinco días y aproximadamente ocho días. Entre las condiciones de incubación preferentes se incluyen una temperatura de entre aproximadamente 22°C y 32°C, más preferentemente de entre aproximadamente 24°C y 30°C, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 25°C y 29°C, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 26°C y 28°C, y lo más preferentemente de aproximadamente 27°C. Preferentemente, las células SF+ se observan tras la inoculación para cambios inducidos por baculovirus característicos. Dicha observación puede incluir la monitorización de las tendencias de densidad celular y la reducción de la viabilidad durante el periodo post-infección. Se encontró que el título vírico máximo se observaba 3 a 5 días después de la infección y el pico de expresión de la proteína H5 en las células se obtenía entre los días 5 y 8, y/o al reducir la viabilidad celular a menos de 10%.
De esta manera, un aspecto de la presente exposición proporciona un método para producir y/o recuperar proteína H5 recombinante, preferentemente en cantidades indicadas anteriormente, al i) permitir la infección de un número de células susceptibles (ver anteriormente) en cultivo por un vector vírico recombinante con una MDI definida anteriormente, ii) expresar la proteína H5 con el vector vírico recombinante, y iii) recuperar después la proteína H5 a partir de las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o la viabilidad celular se reduce a menos de 10%. Preferentemente, el vector vírico recombinante es un baculovirus recombinante que contiene secuencias de ADN de H5 y las células son células SF+. Adicionalmente, resulta preferente que el cultivo se examine periódicamente para evidencia macroscópica y microscópica de contaminación o de cambios atípicos de la morfología celular durante el periodo posterior a la infección. Cualquier cultivo que muestre cualquier contaminación debe desecharse.
Para la recuperación de proteína H5 (1) que se utilizará en una composición inmunogénica o inmunitaria, tal como una vacuna, la inclusión de una etapa de inactivación resulta preferente para inactivar el vector vírico.
Una “composición inmunogénica o inmunitaria” se refiere a una composición de materia que comprende por lo menos un antígeno que induce una respuesta inmunitaria en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos frente a la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una “respuesta inmunitaria” incluye, aunque sin limitación, uno o más de los efectos siguientes: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras y/o células T citotóxicas, y/o células T gamma-delta, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunitaria terapéutica o protectora de manera que la resistencia a una nueva infección se incrementará y/o se reducirá la severidad clínica de la enfermedad. Dicha protección se manifestará en una reducción o falta de los síntomas normalmente manifestados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título vírico reducido en el huésped infectado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “vacuna” se refiere al término utilizado por el experto en la materia. Más particularmente, “vacuna” se refiere a una composición inmunogénica que, administrada en un animal que la necesita, resulta en una reducción de la incidencia o severidad de los signos clínicos de la infección de influenza hasta e incluyendo la prevención completa de tales signos clínicos. Preferentemente, la reducción de incidencia o severidad es de por lo menos 10%, más preferentemente de por lo menos 20%, todavía más preferentemente de por lo menos 30%, todavía más preferentemente de por lo menos 40%, más preferentemente de por lo menos 50%, todavía más preferentemente de por lo menos 60%, todavía más preferentemente de por lo menos 70%, más preferentemente de por lo menos 80%, todavía más preferentemente de por lo menos 90%, todavía más preferentemente de por lo menos 95%, y lo más preferentemente de 100%, en comparación con un animal o grupo de animales que no han recibido la composición de la presente exposición, pero que han sido expuestos a niveles infecciosos de virus influenza que normalmente resultarían en la infección de influenza, resultando en la manifestación de signos clínicos.
De esta manera, la presente exposición se refiere además a un método para producir y/o recuperar proteína H5 recombinante, preferentemente en cantidades indicadas anteriormente, al i) permitir la infección de un número de células susceptibles (ver anteriormente) en cultivo por un vector vírico recombinante con una MDI definida anteriormente, ii) expresar la proteína H5 con el vector vírico recombinante, y iii) recuperar la proteína H5 expresada en las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o la viabilidad celular se reduce a menos de 10%, y iv) inactivar el vector vírico recombinante.
Preferentemente, dicha inactivación se lleva a cabo inmediatamente antes o inmediatamente después de la etapa de filtración, siendo después de la etapa de filtración el tiempo preferente para la inactivación. Puede utilizarse cualquier método convencional de inactivación para los fines de la presente invención. De esta manera, la inactivación puede
llevarse a cabo mediante tratamientos químicos y/o físicos. En formas preferentes, se determina el volumen de líquidos recolectados y la temperatura se lleva a un valor entre aproximadamente 32°C y 42°C, más preferentemente entre aproximadamente 34°C y 40°C, y lo más preferentemente entre aproximadamente 35°C y 39°C. Entre los métodos de inactivación preferentes se incluyen la adición de etilenimina binaria (EIB) ciclizada, preferentemente en una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mM, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7 mM, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la inactivación incluye la adición de una solución de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina, preferentemente de aproximadamente 0,4 M, que se ha ciclizado a etilenimina binaria (EIB) 0,2 M en NaOH 0,3 N, a los líquidos para proporcionar una concentración final de aproximadamente 5 mM de EIB. Preferentemente, a continuación, se agitan los líquidos continuamente durante 72 a 96 horas y los líquidos recolectados inactivados pueden almacenarse congelados a -40°C o menos o entre aproximadamente 1°C y 7°C. T ras completar la inactivación, se añade una solución de tiosulfato sódico, preferentemente 1,0 M, para neutralizar cualquier EIB residual. Preferentemente, el tiosulfato sódico se añade en cantidad equivalente al EIB añadido anteriormente para la inactivación. Por ejemplo, en el caso de que se añada EIB hasta una concentración final de 5 mM, se añade una solución 1,0 M de tiosulfato sódico para proporcionar una concentración mínima final de 5 mM para neutralizar cualquier EIB residual.
De esta manera, un aspecto adicional de la presente exposición se refiere a un método para producir proteína H5 recombinante, preferentemente en cantidades indicadas anteriormente, al i) permitir la infección de un número de células susceptibles (ver anteriormente) en cultivo por un vector vírico recombinante con una MDI definida anteriormente, ii) expresar la proteína H5 con el vector vírico recombinante, y iii) recuperar la proteína H5 expresada en las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o la viabilidad celular se reduce a menos de 10%, y iv) inactivar el vector vírico recombinante. Preferentemente, el vector vírico recombinante es un baculovirus que contiene secuencias de ADN de H5 y las células son células SF+. Las etapas de inactivación preferentes son las indicadas anteriormente. Preferentemente, la inactivación se lleva a cabo entre aproximadamente 35°C y 39°C y en presencia de EIB 2 a 8 mM, todavía más preferentemente en presencia de EIB aproximadamente 5 mM.
Según un aspecto adicional de la presente exposición, el método descrito anteriormente incluye además una etapa de neutralización después de la etapa iv). Dicha etapa v) comprende añadir una cantidad equivalente de un agente que neutralice el agente de inactivación dentro de la solución. Preferentemente, en el caso de que el agente de inactivación sea EIB, resulta preferente la adición de tiosulfato sódico hasta una cantidad equivalente. De esta manera, según un aspecto adicional, la etapa v) comprende añadir una solución de tiosulfato sódico hasta una concentración final de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mM, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7 mM, lo más preferentemente de aproximadamente 5 mM, en el caso de que el agente de inactivación sea EIB.
En formas preferentes y especialmente en formas que utilizan la proteína H5 recombinante en una composición inmunogénica, tal como una vacuna, cada lote de proteína H5 recolectada se somete a ensayo para la inactivación mediante pase por células de insecto susceptibles de baculovirus dependientes de anclaje, tales como células Sf9. En una forma preferente de estos ensayos, se inoculan 150 cm2 de una monocapa apropiada de cultivo celular con 1,0 ml de líquidos de H5 inactivados y se mantienen a 25°C a 29°C durante 14 días con por lo menos dos pases. Al final del periodo de mantenimiento, se examinan las monocapas celulares para el efecto citopatogénico (ECP) típico del baculovirus de H5. Preferentemente, también se utilizan controles víricos positivos. Dichos controles consisten en un cultivo de células Sf9 inoculadas con un baculovirus de H5 de referencia no inactivado y un matraz de células Sf9 que se mantienen no inoculadas. Tras la incubación y pase, la ausencia de células infectadas por virus en los líquidos víricos tratados con EIB constituiría una prueba satisfactoria de inactivación. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían mostrar un ECP típico de baculovirus de H5 y el matraz no inoculado no debería mostrar ninguna prueba de ECP de baculovirus de H5. Alternativamente, al final del periodo de mantenimiento, podrían recogerse las muestras de sobrenadante e inocularse sobre una placa de 96 pocillos de Sf9, que ha sido cargada con células Sf9, y después mantenerse a 25°C a 29°C durante 5 a 6 días. A continuación, se fija la placa y se tiñe con un anticuerpo anti-H5 conjugado con FITC o cualquier anticuerpo marcado dirigido contra proteínas específicas de baculovirus (es decir, gp64). La ausencia de ECP, expresión de H5 o expresión de proteínas específicas de baculovirus (es decir, gp64) en los líquidos víricos tratados con EIB constituye una prueba de inactivación satisfactoria. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían mostrar un ECP y actividad de IFA típicos y el matraz no inoculado no debería mostrar ninguna prueba de CP de baculovirus de H5 ni actividad de IFA.
De esta manera, un aspecto adicional indicado en la presente memoria, se refiere a una prueba de inactivación para determinar la efectividad de la inactivación del vector vírico recombinante que expresa la proteína H5 (1), que comprende las etapas: i) poner en contacto por lo menos una parte del líquido de cultivo que contiene el vector vírico recombinante con un agente inactivador, preferentemente tal como se ha indicado anteriormente, ii) añadir un agente de neutralización para neutralizar el agente de inactivación, preferentemente tal como se ha indicado anteriormente, y iii) determinar la infectividad residual mediante los ensayos indicados anteriormente.
Tras la inactivación, la cantidad relativa de proteína H5 recombinante en una muestra puede determinarse de varias
maneras. Entre los métodos preferentes de cuantificación se incluyen densitometría en SDS-PAGE, ELISA y estudios de vacunación animal que se correlacionan con cantidades conocidas de vacuna con resultados clínicos (serología, etc.). Al utilizar SDS-PAGE para la cuantificación, el material de muestra que contiene una cantidad desconocida de proteína H5 recombinante se hace migrar en un gel, junto con muestras que contienen diferentes cantidades conocidas de proteína H5 recombinante. A continuación, puede producirse una curva estándar basándose en las muestras conocidas y puede determinarse la cantidad de H5 recombinante en la muestra desconocida mediante comparación con dicha curva patrón. Debido a que los ELISA se reconocen generalmente como el estándar de la industria para la cuantificación de antígenos, resultan preferentes para la cuantificación.
Vacunas que comprenden proteínas H5 (1) o moléculas de ácidos nucleicos o vectores codificantes de los mismos
Se da a conocer una combinación de:
(a) la proteína H5 (1) indicada en la presente memoria
y
(b) un virus inactivado de la enfermedad de Newcastle para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 de un clado diferente, en particular para la utilización en cualquier método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria.
Dicha combinación también se denomina “la combinación indicada en la presente memoria” a continuación en la presente memoria.
Según la exposición se entiende que la combinación indicada en la presente memoria se encuentra preferentemente incluida en una vacuna de combinación multivalente o la combinación indicada en la presente memoria en particular se refiere a una vacunación combinada, más particularmente a la administración de la proteína H5 (1) indicada en la presente memoria y del virus inactivado de enfermedad de Newcastle en un máximo de 24 horas en un animal, en particular aves, por seres humanos que lo necesitan.
Preferentemente, el virus inactivado de enfermedad de Newcastle es un virión completo inactivado de enfermedad de Newcastle.
Preferentemente, el virus inactivado de enfermedad de Newcastle es un virus inactivado de enfermedad de Newcastle obtenido mediante inactivación de un virus de enfermedad de Newcastle que comprende un polinucleótido de ARN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 90%, todavía más preferentemente por lo menos 95% o en particular 100% con una copia de ARN del polinucleótido indicado en la SEC ID n° 51 (secuencia de ADNc del virus de cepa LaSota), que ha sido inactivado.
En particular, el virus inactivado de enfermedad de Newcastle es un virus inactivado de cepa LaSota de enfermedad de Newcastle.
Preferentemente, el virus inactivado de enfermedad de Newcastle es un virus de enfermedad de Newcastle que ha sido inactivado con un reactivo seleccionado del grupo que consiste en formaldehído etilenimina binaria (EIB), betapropio-lactona (BPL) y combinaciones de los mismos.
La cantidad de virus inactivado de enfermedad de Newcastle en la combinación indicada en la presente memoria es preferentemente de 10i.2 *a 1010 equivalentes de dosis infecciosas de huevo (EID50), preferentemente de entre 106 y 109 EID50, en particular preferentemente de entre 107 y 109 EID50. La cantidad de proteína H5 (1) en la combinación indicada en la presente memoria es preferentemente la misma que la mencionada posteriormente en la presente memoria.
La cantidad de proteína H5 (1) según la exposición es preferentemente de entre 10 y 1000 unidades de hemaglutinación (UHA) por dosis, más preferentemente de entre 50 y 950 UHA por dosis, todavía más preferentemente de entre 100 y 900 UHA por dosis, todavía más preferentemente de entre 200 y 800 UHA por dosis, todavía más preferentemente de entre 300 y 700 UHA pro dosis, todavía más preferentemente de entre 300 y 500 UHA por dosis.
Según un aspecto adicional, la presente exposición se refiere a vacunas o composiciones farmacéuticas en general, que comprende:
i. una o más de las proteínas H5 (1) indicadas en la presente memoria o la combinación indicada en la presente memoria,
ii. una o más de las moléculas de ácidos nucleicos indicadas en la presente memoria, codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1), y/o
iii. uno o más de los vectores indicados en la presente memoria, incluyendo cualquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos y codificante de cualquiera de dichas proteínas H5 (1) tal como se indica en la presente memoria, y
iv. Un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La expresión “composición farmacéutica”, “composición farmacéutica/de vacuna” tal como se indica en la presente memoria, incluye, aunque sin limitación, vacunas para la reducción o prevención de una infección o a una composición de materia para el tratamiento y reducción de una infección.
La preparación de vacunas a base de ácidos nucleicos, preferentemente vacunas de ADNc, codificantes para hemaglutinina de influenza, se describe en, por ejemplo, Deck et al, Vaccine 1997; 15(1):71-78; Ulmer et al., Science 1993; 259:1745-1749; Ulmer et al., Vaccine 1994;12(16):1541-1544. Cualquiera de dichos métodos puede utilizarse para la producción de vacunas a base de ácidos nucleicos, preferentemente vacunas de ADNc, codificantes de una proteína H5 de influenza tal como se indica en la presente memoria.
Además, puede producirse una vacuna, que comprende proteína H5 (1) o partes de la misma tal como se indica en la presente memoria, mediante enfoques convencionales, p.ej., mediante técnicas de expresión recombinante o mediante purificación bioquímica y técnicas de separación. Las técnicas de expresión recombinante, incluyendo la expresión en células de insecto, son bien conocidas de la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994). Son ejemplos adicionales de sistemas de expresión recombinante bien establecidos, sistemas de expresión bacteriana tales como E. coli o B. subtilis, sistemas de expresión basados en levaduras, tales como S. cerevisiae o S. pombe, o sistemas de expresión de células de mamífero, tales como los sistemas de expresión basados en BHK, CHO y/o NS0. Dichos sistemas son bien conocidos de la técnica y se encuentran generalmente disponibles de, p.ej., Clontech Laboratories Inc., 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, EE.UU. Se describen estrategias de expresión adicionales en, por ejemplo, Lüschow et al., Vaccine, n° 19, páginas 4249 a 4259, 2001, o Veit et al., PNAS vol. 103, páginas 8197 a 8202, 2006. Además, los sistemas de virus adenoasociado recombinante están bien establecidos y se describen en, por ejemplo, la patente US n° 5.436.146 o documento n° WO200203872 con referencias adicionales. Además, los sistemas de expresión basados en virus vaccinia (viruela), por ejemplo tal como se indican en la patente US n° 6.265.183, con referencias adicionales, también se encuentran bien establecidos y resultan adecuados para producir uno o más antígenos recombinantes, una o más composiciones antígenos, utilizadas según la exposición. Los sistemas de expresión adecuados adicionales utilizan virus popova recombinantes, tales como SV40, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus.
Las composiciones farmacéuticas/de vacuna relevantes tal como se indican en la presente memoria, pueden comprender además virus inactivado que comprenden proteína H5 (1) tal como se indica en la presente memoria, una versión apatogénica de un virus vivo que comprende proteína H5 (1) tal como se indica en la presente memoria, preparación y/o fragmentos de un virus, en el que dicha preparación y/o fragmento comprende la proteína H5 (1) tal como se indica en la presente memoria.
El experto en la materia conoce componentes adicionales que pueden estar comprendidos en dichas composiciones/vacunas junto con antígeno (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publ., Easton, 1990). El experto puede utilizar soluciones estériles fisiológicamente aceptables inyectables conocidas. Para la preparación de una solución lista para utilizar, se encuentran fácilmente disponibles una solución lista para utilizar, soluciones isotónicas acuosas, tales como, p.ej., solución salina o soluciones de proteínas plasmásticas correspondientes. La composición/vacuna farmacéutica puede encontrarse presentes en forma de liofilizados o preparaciones secas, que pueden reconstituirse con una solución inyectable conocida directamente antes de la utilización bajo condiciones estériles, p.ej., en forma de un kit de partes.
Además, las composiciones farmacéuticas/de vacuna de la presente exposición pueden incluir uno o más portadores veterinariamente aceptables. Tal como se utiliza en la presente memoria, un “portador veterinariamente aceptable” incluye, aunque sin limitarse a ninguno en particular ni a ninguno en general, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes de retardo de la adsorción y similares.
Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Entre los agentes isotónicos pueden incluirse cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Entre los estabilizantes se incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiamintetraacéitoc, entre otros.
Un conservante tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un agente activo antimicrobiológico, tal como, por ejemplo, gentamicina, mertiolato y similares. En particular, la adición de un conservante resulta más preferente para la preparación de una composición multidosis. Se añaden dichos agentes activos antimicrobiológicos en
concentraciones eficaces para evitar en la composición de interés cualquier contaminación microbiológica o para la inhibición de cualquiera crecimiento microbiológico en la composición de interés.
“Adyuvantes”, tal como se utiliza en la presente memoria, puede incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, p.ej., Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua-en-aceite-en-agua.
La emulsión puede estar basada en particular en aceite de parafina líquida ligera (de tipo Farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tal como escualano o escualeno; aceite que resulta de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol, ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes preferentemente son surfactantes no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de manida (p.ej., oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, los cuales están opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, páginas 51 a 94, 1995 y Todd et al., Vaccine 15:564-570, 1997. Son ejemplos de emulsiones de aceite-en-agua adecuadas, adyuvantes a base de Emulsigen, tales como EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, EE.UU.). Inesperadamente se ha encontrado que las composiciones farmacéuticas/de vacuna que comprenden proteína H5, preferentemente proteína H5 recombinante tal como se indica en la presente memoria, se ha añadido adyuvante eficazmente con emulsiones de aceite-en-agua, preferentemente con dichos adyuvantes a base de Emulsigen, más preferentemente con EMULSIGEN® y EMULSIGEN-D®.
Además, resulta posible utilizar la emulsión SPT indicada en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59, indicada en la página 183 de la misma obra.
Un caso adicional de adyuvante es un compuesto seleccionado de los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo. Son compuestos adyuvantes ventajosos, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están entrecruzados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, n° 2, junio de 1996). El experto en la materia también puede referirse a la patente US n° 2.909.462, que describe dichos polímeros acrílicos entrecruzados con un compuesto polihidroxilado que presenta por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, sustituyendo los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que presentan por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferentes son los que contienen entre 2 y 4 átomos de carbono, p.ej., vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden ellos mismos contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) resultan particularmente apropiados. Se encuentran entrecruzados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos, pueden mencionarse Carbopol 974P, 934P y 971P. Resulta más preferente la utilización de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de dichos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente a pH fisiológico, con el fin de proporcionar la solución adyuvante en la que se incorporará la composición inmunogénica, inmunitaria o vacuna misma.
Entre los adyuvantes adecuados adicionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímero en bloque (CytRx, Atlanta, GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), monofosforil-lípido A, adyuvante Avridina lípido-amina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o de otro tipo), toxina del cólera o dipéptido muramilo, entre muchos otros.
Preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de entre aproximadamente 100 |jg y aproximadamente 100 mg por dosis. Todavía más preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de entre aproximadamente 100 jg y aproximadamente 10 mg por dosis. Todavía más preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de entre aproximadamente 500 jg y aproximadamente 5 mg por dosis. Todavía más preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de entre aproximadamente 750 jg y aproximadamente 2,5 mg por dosis. Más preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.
Las composiciones farmacéuticas/de vacuna pueden incluir además uno o más agentes inmunomoduladores, tales como, p.ej., interleuquinas, interferones u otras citoquinas. Las composiciones farmacéuticas/de vacuna pueden incluir además gentamicina y mertiolato. Aunque las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser fácilmente determinados por el experto en la materia, la presente exposición contempla composiciones que comprenden entre aproximadamente 50 jg y aproximadamente 2000 jg de adyuvante y preferentemente aproximadamente 250 jg/1 ml de dosis de la composición de vacuna. Preferentemente, la presente exposición contempla composiciones de vacuna que comprenden entre aproximadamente 1 jg/m l y
aproximadamente 60 |jg/ml de antibióticos, y más preferentemente menos de aproximadamente 30 |jg/ml de antibióticos.
La presente exposición se refiere además a una composición farmacéutica/de vacuna que comprende:
i una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las proteínas H5 de virus influenza tal como se indica en la presente memoria, en la que la proteína H5 que presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona ejemplarmente en la SEC ID n° 2 y en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5, se inserta una segunda lisina (K+), y
ii. adyuvantes farmacéuticamente aceptables tal como se ha indicado anteriormente.
Preferentemente, el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en:
a) EMULSIGEN®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w, por sus siglas en inglés);
b) EMULSIGEN-D®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), c) un Polygen, un copolímero,
d) EMULSIGEN-P®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con un inmunoestimulante propietario,
e) Carbigen es un polímero entrecruzado,
f) EMULSIGEN-75®, un doble adyuvante que comprende una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con un polímero entrecruzado,
g) ISA 70 es una emulsión de agua-en-aceite (w/o).
Lo más preferentemente, los adyuvantes son una emulsión de aceite-en-agua, tal como un adyuvante a base de Emulsigen seleccionado del grupo que consiste en EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75®, EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P®. Lo más preferentemente, se utiliza EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P® en la formulación de la presente exposición.
Según un aspecto adicional, las composiciones farmacéuticas/de vacuna tal como se dan a conocer en la presente memoria comprenden uno o más antígenos. Preferentemente, dicho antígeno adicional es un antígeno de un patógeno aviar o de mamífero. Preferentemente, dicho antígeno adicional es un antígeno de influenza adicional, tal como hemaglutinina H5, H7, H9 o cualquier otra hemaglutinina de virus influenza, en la que H5 es preferentemente una proteína H5 de un virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en particular de un virus H5N1 de origen norteafricano, tal como la proteína H5 (2) indicada en la presente memoria. El antígeno o antígenos adicionales pueden añadirse en una forma purificada, como parte de una preparación antigénica, en la forma de un microorganismo muerto o en la forma de un microorganismo vivo modificado.
El término “antígeno” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere, aunque sin limitación, a péptidos, polipéptidos, glucopéptidos o polisacáridos que son capaces de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor de antígeno de células T con el fin de inducir, activar o estimular una respuesta inmunitaria dirigida contra dicho antígeno en un huésped en el que se administra dicho antígeno. El término “antígeno” se refiere además a moléculas de ácidos nucleicos, preferentemente moléculas de ADN o ARN, cada una de las cuales codifica para y expresa un péptido, polipéptido o glucopéptido que es capaz de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor de antígeno de células T con el fin de inducir, activar o estimular una respuesta inmunitaria contra el antígeno que está codificado por la molécla de ácido nucleico. El antígeno utilizado para la preparación de la composición farmacéutica que se utiliza según la exposición es un microorganismo o una parte antigénica y/o preparación de dicho microorganismo. En este aspecto, el término “inmunización”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a, aunque sin limitación, cualquier causa o potenciación de una respuesta inmunitaria. La expresión “respuesta inmunitaria” ya se ha descrito anteriormente.
Las estrategias de administración de las vacunas de influenza son bien conocidas de la técnica. Las estrategias de vacunación mucosal para vacunas de virus inactivados y de virus atenuados se encuentran contempladas. Aunque las mucosas pueden ser la diana para la administración local de una vacuna, se han utilizado diversas estrategias para administrar proteínas inmunogénicas en las mucosas.
Preferentemente, la vacuna puede administrarse en una mezcla con, o como conjugado o proteína de fusión quimérica con, toxina del cólera, tal como toxina B del cólera o una quimera de toxina A/B del cólera (Hajishengallis , J Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling and Holmes, Infect. Immun., 60:4915-24, 1992). Las vacunas mucosales basadas en la utilización de la subunidad B de la toxina del cólera han sido descritas (Lebens y Holmgren, Dev. Biol. Stand. 82:215-27, 1994). Preferentemente, puede prepararse una mezcla con enterotoxina termolábil (TL) para la vacunación mucosal.
Entre otras estrategias de inmunización mucosal se incluyen el encapsulado del virus en microcápsulas (patentes US n° 5.075.109, n° 5.820.883 y n° 5.853.763) y la utilización de un portador membranoso inmunopotenciador (documento
n° WO 98/0558). La inmunogenicidad de los inmunógenos administrados por vía oral puede potenciarse mediante la utilización de glóbulos rojos (rbc) o fantasmas de rbc (patente US n° 5.643.577) o mediante la utilización de antígeno de lengua azul (patente Us n° 5.690.938).
Según otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica/de vacuna tal como se ha indicado anteriormente, preferentemente un método para producir una vacuna que comprende una proteína H5 expresada por baculovirus recombinante tal como se ha indicado anteriormente. Generalmente, dicho método incluye las etapas de transfectar un constructo en un virus, en el que el constructo comprende: i) ADNc de H5 recombinante tal como se indica en la presente memoria, ii) infectar células en medio de cultivo con el virus transfectado, iii) causar que el virus exprese la proteína H5 recombinante tal como se indica en la presente memoria, iv) recuperar la proteína H5 expresada a partir del cultivo, v) y preparar la composición mediante la mezcla de la proteína H5 expresada con un adyuvante adecuado y/o otro portador farmacéuticamente aceptable.
Los adyuvantes preferentes son los indicados anteriormente. De esta manera, según un aspecto adicional, el método de preparación de una composición antigénica, tal como, por ejemplo, una vacuna, para inducir una respuesta inmunitaria contra infecciones de influenza comprende: i) preparar y recuperar proteína H5, y ii) mezclar lo anterior con adyuvantes adecuados.
Además, la composición de vacuna de la presente exposición puede incluir además diluyentes, agentes isotónicos, estabilizadores y/o conservantes. Entre los diluyentes pueden incluirse agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Entre los agentes isotónicos pueden incluirse sales inorgánicas u orgánicas, p.ej., cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, sacáridos, trehalosa, manitol y sacarosa, entre otros. Entre los estabilizantes se incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiamin-tetraacético, entre otros. Los adyuvantes adecuados son los indicados anteriormente.
Utilización medicinal de cualquiera de dichas proteínas H5 (1), moléculas de ácidos nucleicos, vectores, vacunas y combinaciones indicadas en la presente memoria.
Las proteínas H5 (1) tal como se dan a conocer en la presente memoria, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1), los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1) tal como se indican en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/de vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5 (1), moléculas de ácidos nucleicos o vectores o la combinación indicada en la presente memoria pueden utilizarse como una medicina, preferentemente para el tratamiento y profilaxis de infecciones causadas por virus influenza, lo más preferentemente por virus influenza A. Las proteínas H5 (1) tal como se dan a conocer en la presente memoria, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1) tal como se indican en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/de vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5 (1), moléculas de ácidos nucleicos o vectores, tal como se indican en la presente memoria, o la combinación indicada en la presente memoria pueden utilizarse para el tratamiento o la profilaxis de seres humanos, así como en medicina veterinaria. Al utilizarse en medicina veterinaria, el tratamiento de aves, preferentemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como mamíferos, preferentemente cerdos, vacas, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámsters, ratones y similares, resulta preferente.
En términos de la presente invención, “profilaxis” se refiere a la reducción de la incidencia o severidad de los signos clínicos de la infección por influenza hasta e incluyendo la prevención completa de dichos signos clínicos. Preferentemente, la reducción de incidencia o severidad es de por lo menos 10%, más preferentemente de por lo menos 20%, todavía más preferentemente de por lo menos 30%, todavía más preferentemente de por lo menos 40%, más preferentemente de por lo menos 50%, todavía más preferentemente de por lo menos 60%, todavía más preferentemente de por lo menos 70%, más preferentemente de por lo menos 80%, todavía más preferentemente de por lo menos 90%, todavía más preferentemente de por lo menos 95%, y lo más preferentemente de 100%, en comparación con un animal o grupo de animales que no ha recibido las composiciones de la presente exposición, pero que han sido expuestos a niveles infecciosos de virus influenza que normalmente resultarían en la infección de influenza, resultando en la manifestación de signos clínicos.
De esta manera, según otro aspecto, la presente exposición se refiere a la utilización de proteínas H5 (1) tal como se dan a conocer en la presente memoria, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1), comprendiendo los vectores cualquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1) tal como se indican en la presente memoria, y cualesquiera composiciones farmacéuticas/de vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5 (1), moléculas de ácidos nucleicos o vectores, tal como se indican en la presente memoria, o la combinación indicada en la presente memoria, pueden utilizarse como una medicina, preferentemente como una medicina para seres humanos y/o como una medicina veterinaria, preferentemente para aves, en particular para pollos.
Además, las proteínas H5 (1) tal como se dan a conocer en la presente memoria, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1), los vectores que comprenden dichas moléculas de ácidos
nucleicos codificantes de cualquiera de dichas proteínas H5 (1), tal como se indica en la presente memoria, o la combinación indicada en la presente memoria, pueden utilizarse para la preparación de una composición farmacéutica, tal como se indica en la presente memoria, preferentemente de una vacunación de una sola inyección o una vacuna de una dosis, para la profilaxis o el tratamiento de infecciones causadas por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria. Tal como se ha indicado anteriormente, dichas composiciones farmacéuticas/composiciones de vacuna pueden utilizarse para el tratamiento y/o la profilaxis de seres humanos, así como para el tratamiento y/o la profilaxis de animales, tales como aves, preferentemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como mamíferos, preferentemente cerdos, vacas, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámsters, ratones y similares.
Según un aspecto adicional, la presente exposición se refiere además a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus influenza causadas por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en las que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína H5 (1) tal como se indica en la presente memoria o de la combinación indicada en la presente memoria, en un sujeto que requiere de dicho tratamiento. Además, la presente exposición se refiere además a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus influenza causadas por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en las que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier molécula de ácidos nucleicos o vector de H5 tal como se indica en la presente memoria, que codifica cualquier proteína H5 (1) tal como se indica en la presente memoria, en un sujeto que requiere de dicho tratamiento. Además, la presente exposición se refiere además a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus influenza causadas por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en las que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5 (1), moléculas de ácidos nucleicos o vectores, tal como se indica en la presente memoria, en un sujeto que requiere de dicho tratamiento. El sujeto que lo requiere puede ser un ser humano, así como un animal, preferentemente un ave, todavía más preferentemente pájaro, pollo, pato, pavo o un mamífero, preferentemente cerdo, vaca, caballo, foca, camello, perro, gato, hámster, ratón y similares.
Preferentemente, la administración, tal como se indica en la presente memoria, es una administración de una sola inyección, o una administración de una dosis.
Preferentemente, en el caso de que se vacunen pollos, la proteína H5 tal como se indica en la presente memoria puede utilizarse para la vacunación el día 1 de edad o posteriormente, p.ej., el día 10, o en los días 1 a 10, o en el día 10 o posteriomente.
Preferentemente, la infección de influenza puede tratarse mediante la administración de cualquier proteína H5 (1), la molécula de ácidos nucleicos o vector codificante de cualquiera de dichas proteínas H5, o cualquier composición farmacéutica/de vacuna tal como se indica en la presente memoria, está causada por un virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria y, en su caso, también en combinación con otro virus influenza aviar, porcino o humano, o cualquier combinación o híbrido del mismo.
Una ventaja adicional de la presente exposición es que beneficia a un concepto “DIVA” (por sus siglas en inglés, diferenciación de animales infectados y vacunados) con kits ELISA específicos para diferenciar entre seres humanos o animales vacunados y seres humanos o animales infectados por virus H5N1.
Según otro aspecto, la presente exposición se refiere a un kit de partes, que comprende: i) cualquiera de dichas proteínas H5 (1) tal como se indica en la presente memoria, la molécula de ácidos nucleicos o vector codificante de cualquiera de dichas proteínas H5, o cualquier composición farmacéutica/ de vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácidos nucleicos o vectores tal como se indica en la presente memoria, y ii) un impreso en el paquete que indica la utilización de dichas proteínas H5, moléculas de ácidos nucleicos, vector o vacuna para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria. En el caso de que se vacunen pollos, la proteína H5 (1) tal como se indica en la presente memoria puede utilizarse para la vacunación el día 1 de edad o posteriormente.
De esta manera, se entiende que el kit de partes tal como se menciona en la presente memoria es para la utilización o se utiliza, respectivamente, para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria.
Preferentemente, dicho kit en partes comprende por lo menos un antígeno adicional de un patógeno aviar o de
mamífero y la indicación informativa de la utilización medicinal, humana o veterinaria, de dicho antígeno adicional, en particular el antígeno adicional tal como se menciona anteriormente.
Se da a conocer un método para reducir la excreción vírica en un sujeto, que comprende administrar la proteína H5 (1) indicada en la presente memoria o la combinación tal como se indica en la presente memoria en un sujeto infectado o en riesgo de una infección vírica por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria.
La exposición se refiere además a la proteína H5 (1) indicada en la presente memoria o la combinación tal como se indica en la presente memoria para la utilización en un método para reducir la excreción vírica en un sujeto, en el que dicha proteína H5 (1) o dicha combinación se administra en un sujeto infectado o en riesgo de una infección vírica por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria.
Se da a conocer la utilización de la proteína H5 (1) indicada en la presente memoria o de la combinación tal como se indica en la presente memoria para la preparación de un medicamento para reducir la excreción vírica en un sujeto infectado o en riesgo de una infección vírica por el virus H5N1 de un clado diferente del clado 1, en el que dicho virus H5N1 de un clado diferente del clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado diferente tal como se indica en la presente memoria.
Preferentemente, la proteína H5 (1) según la exposición, la combinación indicada en la presente memoria, la vacuna tal como se indica en la presente memoria o el kit mencionado en la presente memoria, es para la utilización como una vacuna de una sola inyección o en una vacunación de una dosis.
Ejemplos
Los ejemplos a continuación proporcionan los materiales y procedimientos preferentes según la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que los presentes ejemplos se proporcionan únicamente a título ilustrativo, y nada en ellos debe considerarse como limitativos del alcance global de la invención.
EJEMPLO 1
Construcción de un baculovirus recombinante codificante y que expresa antígenos HA de H5
El baculovirus recombinante que contiene el antígeno HA de H5 se generó de la manera siguiente: las secuencias codificantes de la HA de H5 (SEC ID n° 3) se sintetizaron químicamente y se subclonaron en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Se generó Ha de H5 MutK+ (SEC ID n° 5) mediante la utilización de cebadores oligonucleótidos y el kit de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) y se subclonó en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Los plásmidos pVL1392 que contienen los genes codificantes del antígeno HA de H5 (SEC ID n° 3) y HA de H5 MutK+ (SEC ID n° 5) a continuación se cotransfectaron con ADN del baculovirus DiamondBac® (Sigma) en células de insecto Sf9 (BD Biosciences Pharmingen) para generar baculovirus recombinante que contenía los genes HA H5 codificante de SEC ID n° 3 y HA H5 mutK+ codificante de SEC ID n° 5. Los baculovirus recombinantes que contenían los genes codificantes de Ha H5 (SEC ID n° 3) y HA H5 MutK+ (SEC ID n° 5) se aislaron en cultivo y las cepas víricas de trabajo (MSV, por sus siglas en inglés) se propagaron en la línea celular SF+, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70°C. Las células de insecto infectadas por baculovirus de HA H5 tal como se han indicado anteriormente para generar el MSV o virus de trabajo expresaban los antígenos HA de H5 (SEC ID n° 3) y HA de H5 MutK+ (SEC ID n° 5) según detección con anticuerpos séricos policlonales o monoclonales en un ensayo indirecto de anticuerpos fluorescentes o transferencia western.
Tras sembrarlos con las cantidades apropiadas de baculovirus recombinantes (HA H5 y HA H5 MutK+, respectivamente), los matraces de centrifuga que contenían las células SF+ (Protein Sciences, Inc., Meriden, CT) se incubaron a continuación a 27± 2°C durante 7 días y bajo agitación a 100 rpm durante ese tiempo. Los matraces utilizaban tapones ventilados para permitir el flujo de aire. Se recolectó el cultivo de células completas en bruto que contenía las células SF+ infectadas por baculovirus y los sobrenadantes de cultivo celular de cada cultivo.
EJEMPLO 2
Preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comrpenden antígenos HA de H5
Se recolectó la proteína HA H5 de células completas en bruto y la proteína HA H5 Mutk+ expresada en células de insecto mediante un sistema de expresión basado en baculovirus. Los baculovirus fueron inactivados en presencia de etilenimina binaria (EIB) ciclizada 5 mM (concentración final) entre aproxiamdamente 32°C y 39°C durante 72 a 96 horas. Tras completar la inactivación, se añadió una solución de tiosulfato sódico 0,3 M hasta una concentración final
de 5 mM para neutralizar cualquier EIB residual. Tras la neutralización, se añadieron diversos adyuvantes y se generaron las composiciones de vacuna/farmacéuticas siguientes.
VACUNAS
EJEMPLO 3
Vacunación de pollos contra la influenza aviar
Se evaluó en ensayos con animales una vacuna de combinación que comprendía HA H5 MutK'(Fracción 1) y virus inactivado de enfermedad de Newcastle (Fracción 2), denominada "BACULO AI ND KV”. La vacuna se formuló con la hemaglutinina H5 producida en el sistema de expresión baculovirus basado en el constructo MutK+ (Ejemplos 1 y 2). El origen de la fracción vírica de enfermedad de Newcastle (EN) era el virus completo.
Fracción 1:
Hemaglutinina de H5 (HA H5) expresada en baculovirus, recombinante, de virus H5N1 de influenza aviar Fracción de influenza aviar (IA).
Todas las fracciones se inactivaron con etilenimina binaria (EIB). No se permitió infectividad residual procedente del vector baculovirus.
Fracción 2:
Virión completo, virus de la enfermedad de Newcastle (EN), cepa LaSota. Fracción de enfermedad de Newcastle. La fracción EN se inactivó con formaldehído, EIB o betapropiolactona (BPL). No se permitió infectividad residual procedente del virus EN.
Composición de la fórmula:
El material recolectado inactivado de proteína HA H5 y EN se mezcló en una emulsión de agua/aceite. La mezcla incluía aceite mineral como adyuvante.
Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, se consideraron tres parámetros clínicos: 1) morbilidad/mortalidad. 2) Niveles de anticuerpos. 3) Excreción vírica.
En todos los estudios, se vacunaron pollos SPF; la administración de la vacuna fue por la vía subcutánea, en la parte posterior del cuello. Se administró una dosis de 0,5 ml, a menos que se indique lo contrario.
Los pollos se mantuvieron dentro de unidades de aislamiento durante la duración completa de los estudios. Los estudios cumplían con las directrices internacionales de la OIE para la evaluación de las vacunas de influenza aviar.
Se llevó a cabo el resto para evaluar la fracción antigénica de la influenza aviar (IA). Se inocularon pollos 3 semanas después de la vacunación, por vía intranasal (50 j l ) y oral (50 jl), administrando un total de 100 j l de líquido alantoico que contenía 106 EID50 del virus de reto.
Con el fin de evaluar la protección frente al reto contra H5N1 HPAI, se llevaron a cabo dos estudios.
1) Estudio de protectotipos, utilizando una única vacunación o una doble vacunación (que evaluaba el efecto de refuerzo), edades de los pollos de 1 día o 10 días (que evaluaba el efecto de la edad) y dosis de 0,5 o 0,2 ml (que evaluaba el efecto de la dosis).
Se utilizaron dos cepas de reto diferentes para el presente estudio: a) subclado A cepa vietnamita 2.3.2 (aislado en 2006) que recientemente ha estado causando enfermedad en la producción avícola del sudeste asiático (China, Vietnam), b) una cepa egipcia de grupo B1 subclado 2.2.1 (aislada en 2010), que recientemente ha estado causado enfermedad en la producción avícola egipcia. Las cepas de reto no son genéticamente próximas al constructo de baculovirus de vacuna (MutK+). Los resultados se interpretan en el contexto de protectotipos que amplían la protección proporcionada por dos inmunizaciones con vacunas similares o diferentes.
Conclusiones:
1) Se observó una protección de entre 80% y 100% según la edad o dosis. Se observó una protección de 100% al administrar una dosis de 0,5 ml a los 10 días de edad de la formulación bivalente.
2) Al administrar en forma de una sola inmunización de 0,5 ml de IA BACULO KV (por sus siglas en inglés, virus muerto) EN a los 10 días de edad, se observó la misma protección que administrando dos inyecciones de la vacuna inactivada producida tradicionalmente comercial Volvac AI KV.
3) Al administrar en forma de una sola inmunización de 0,5 ml de IA BACULO KV EN a los 10 días de edad, se detectó un nivel similar de anticuerpos específicos de H5 en comparación con la administración de dos inyecciones de la vacuna inactivada producida tradicionalmente comercial IA Volvac KV.
4) Se observaron niveles bajos de excreción vírica hasta 3 días después del reto, cuando se administró la vacuna en forma de una sola inmunización de 0,5 ml de IA BACULO KV EN a los 10 días de edad.
2) Estudio de eficacia BACULO, utilizando una sola vacunación única a los 10 días de edad.
Se utilizaron tres cepas de reto diferentes para este estudio: a) una cepa egipcia subclado 2.2.1 (aislado en 2008), b) una cepa egipcia grupo A1 subclado 2.2.1 (aislada en 2010), c) una cepa egipcia grupo B1 subclado 2.2.1 (aislada en 2010). Las dos últimas han estado causando recientemente enfermedad en la producción avícola egipcia.
Conclusiones:
1) Se observó entre 90% y 100% de protección.
2) La vacuna BACULO AI KV EN mostró un rendimiento que cumplía con las directrices de la Agencia europea del medicamento (AEM) para vacunas contra el virus HPAI en aves.
3) Ésta es el primer informe disponible que demuestra eficaz con la administración de una sola inyección para una vacuna basada en baculovirus que incluye una hemaglutinina genéticamente distante de la de los virus utilizados para el reto.
EJEMPLO 4
1. Diseño experimental.
El presente experimento se diseñó y llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 3 anteriormente indicado: para la evaluación de la eficacia de la vacuna, se consideraron tres parámetros clínicos: 1) morbilidad/mortalidad. 2) Niveles de anticuerpos. 3) Excreción vírica.
En todos los estudios, se vacunaron pollos SPF; la administración de la vacuna fue por la vía subcutánea, en la parte posterior del cuello. Se utilizó un prototipo de vacuna que contenía una proteína H5 de clado 1 (denominada Mut K+) formulada en forma de un producto bivalente con una segunda fracción antigénica de EN (virus de la enfermedad de Newcastle).
Se administró una dosis de 0,5 ml, a menos que se indique lo contrario. Los animales fueron vacunados a los 10 días de edad.
Los pollos se mantuvieron dentro de unidades de aislamiento durante la duración completa de los estudios. Los estudios cumplían con las directrices internacionales de la OIE para la evaluación de las vacunas de influenza aviar.
Se llevó a cabo el reto para evaluar la fracción antigénica de la influenza aviar (IA). Se inocularon pollos 3 semanas después de la vacunación, por vía intranasal (50 j l ) y oral (50 jl), administrando un total de 100 j l de líquido alantoico que contenía 106 EID50 del virus de reto.
Lo anterior también se resume en la tabla (Tabla A), posteriormente (la vacunación se llevó a cabo a los 10 días de edad, columna 1 (DI de grupos experimentales según la vacuna aplicada), columna 2 (dosis de vacuna) y columna 3 (edad de reto)).
El virus de reto era A/Chicken/Egypt/1063/2010, que se clasificó como subtipo H5N1 subclado 2.2.1.1 VIA HP. Ésta es la cepa de reto oficial utilizada en Egipto para la evaluación de lotes de vacuna. La dosis de reto era 106 EID50.
2. Resultados y análisis de los datos.
Los resultados y análisis de los datos se resumen en la tabla, posteriormente (Tabla A): Columna 4 (TMG (título medio geométrico) altamente patogénico (AP) 3 semanas después de la vacunación, pre-reto); columna 5 (porcentaje de supervivencia, 2 semanas después del reto) y columna 6 (detección de excreción vírica, muestras positivas en RT-PCR).
Tabla A: resumen del diseño experimental y de los resultados y análisis de los datos del Ejemplo 4.
3. Conclusiones
• El grupo vacunado sobrevivió al reto. El prototipo de vacuna indujo una respuesta inmunitaria eficiente, medida como titulación de HI utilizando el antígeno homólogo.
• El prototipo de vacuna Mut K+ proporciono una buena protección vírica, medida como capacidad de reducir la excreción vírica. Los valores de Ct de RT-PCR eran excesivamente bajos para representar virus infeccioso, sino sólo material genético residual.
En el listado de secuencias (SEC ID n° 1 a n° 51):
SEC ID n° 1 corresponde a H5 de A/Hong Kong/213/2003(H5N1) sin péptido de señal,
SEC ID n° 2 a n° 7 corresponde a las SEC ID n° 1 a n° 6 de la solicitud de patente internacional (PCT) número PCT/US2007/082699,
SEC ID n° 8 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1709-6",
SEC ID n° 9 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-1/A1",
SEC ID n° 10 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-15/A1",
SEC ID n° 11 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "2095-50/A1",
SEC ID n° 12 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-2/A1",
SEC ID n° 13 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-5/A1",
SEC ID n° 14 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-7/A1",
SEC ID n° 15 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-8/A1",
SEC ID n° 16 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-9/A1",
Claims (13)
1. Combinación de:
una proteína H5 de células completas en bruto de H5N1 de ciado 1 expresada en células de insecto mediante un sistema de expresión basado en baculovirus y un virus de enfermedad de Newcastle inactivado para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por el virus H5N1 de clado 2, y en el que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica de SEC ID n° 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona en SEC ID n° 2, y en la que la modificación 328K+ se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se inserta una segunda lisina (K+).
2. Vacuna para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 clado 2, que comprende:
a. una combinación de:
una proteína H5 de H5N1 de clado 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 98% respecto a la secuencia polipeptídica de SEC ID n° 1, en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 1 presenta el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se refiere a la posición aminoácida tal como se proporciona en SEC ID n° 2, y en la que la modificación 328K se refiere a que en la posición aminoácida 328 de la proteína H5 de H5N1 de clado 1 se inserta una segunda lisina (K+), y un virus de enfermedad de Newcastle inactivado, y
b. un adyuvante.
3. Vacuna para la utilización según la reivindicación 2, en la que el adyuvante es un adyuvante basado en Emulsigen.
4. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína H5 de H5N1 de clado 1 presenta uno o más de los aminoácidos siguientes:
a. el aminoácido 94N
b. el aminoácido 120N
c. el aminoácido 155N
5. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína H5 de H5N1 de clado 1 comprende un péptido que comprende:
i. las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 5, SEC ID n° 6 o SEC ID n° 7, o
ii. cualquier péptido que presenta una homología de secuencia de por lo menos 85% respecto al polipéptido de i) y que comprende inhibición de hemaglutinina en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina, o
iii. cualquier parte de los polipéptidos de i) o ii) que comprende por lo menos 8 aminoácidos contiguos de cualquiera de dichos péptidos de i) o ii) y en el que cualquiera de dichos péptidos comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina, o
iv. cualesquiera péptidos de i), ii) o iii) que presenta los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120S, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A o 263T, o
v. cualquier péptido de i), ii), iii) o iv) que presenta una o más de los agregados de aminoácidos siguientes seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: BGU
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL.
6. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho virus H5N1 de clado 2 es virus H5N1 de clado 22 o un virus H5N1 de clado 2.3 y/o en el que dicho virus H5N1 de clado 2 es un virus H5N1 de clado 2.2.1 o un virus H5N1 de clado 2.3.2.
7. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho virus H5N1 de clado 2 es de origen norteafricano o vietnamita, en el que dicho virus H5N1 de origen norteafricano es un virus H5N1 que comprende una proteína H5 de virus influenza H5N1 de clado 2, en el que dicha proteína H5 de clado 2 presenta:
(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, en los que la modificación 145(-) se refiere a que la posición aminoácida 145 de H5 ha sido delecionada, o
(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 145L, 172T y 254V,
y en el que la numeración de las posiciones aminoácidas de la proteína H5 de clado 2 de H5N1 se refiere a la posición aminoácido tal como se proporciona en SEC ID n° 8, o en la que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 2 consiste o comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% homóloga respecto a cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 9 a n° 46.
8. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho virus H5N1 de clado 2 que comprende proteína H5 que presenta:
(a) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, o
(b) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 2061, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H y 254V,
y/o
en el que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 2 comprende un péptido que comprende:
i. cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 9 a n° 46,
ii. cualquier péptido que presente una homología de secuencia de por lo menos 85%, de por lo menos 95%, de por lo menos 96%, de por lo menos 97%, de por lo menos 98%, de por lo menos 99%, de 100% respecto al polipéptido de i) y que comprende inhibición de hemaglutinina en una inhibición estándar de hemaglutinina, o
iii. cualquier parte de los polipéptidos de i) o ii) que comprende por lo menos 334 aminoácidos contiguos de cualquiera de dichos péptidos de i) o ii) y en el que cualquiera de dichos péptidos comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinina,
y/o
en el que dicha proteína H5 de H5N1 de clado 2 consiste o comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95%, de por lo menos 96%, de por lo menos 97%, de por lo menos 98%, de por lo menos 99%, de 100%, respecto a cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 9 a n° 46.
9. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones:
(A) por virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano, es decir, una infección por un virus H5N1 que comprende una proteína H5 de clado 2 que presenta los aminoácidos según (a) de reivindicación 7 o 8 o que comprende una proteína H5 según la reivindicación 7 o 8 relacionada con cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 9 a n° 19, o n° 42 o n° 43, o
(B) por virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano, es decir, una infección por un virus H5N1 que comprende una proteína H5 que presenta los aminoácidos según (b) o (c) de la reivindicación 7 o 8 o que comprende una proteína H5 según la reivindicación 7 o 8 relacionada con cualquiera de las secuencias indicadas en las SEC ID n° 20 a n° 41, o n° 44 o n° 46.
10. Combinación o vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el virus inactivado de enfermedad de Newcastle es un virus inactivado de enfermedad de Newcastle obtenido mediante inactivación de un virus de enfermedad de Newcastle que comprende un polinucleótido de ARN que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70%, de por lo menos 80%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95% o de 100% respecto a una copia de ARN del polinucleótido indicado en la SEC ID n° 51, que ha sido inactivada.
11. Kit de partes para la utilización en un método de tratamiento o prevención de infecciones por virus H5N1 clado 2, que comprende:
a. la combinación o vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y
b. un impreso en el paquete que indica la utilización de dicha combinación o vacuna de a) para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por virus H5N1 de clado 2.
12. Combinación o vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el kit según la reivindicación 11 para la utilización como una vacuna de una sola inyección o en una vacunación de una dosis.
13. Combinación o vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la utilización en un método para reducir la excreción vírica en un sujeto, en la que dicha combinación debe administrarse en un sujeto infectado o en riesgo de una infección vírica por virus H5N1 de clado 2.
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| DE69233158T2 (de) | 1991-03-07 | 2004-05-13 | Connaught Technology Corp., Greenville | Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe |
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| US5807722A (en) | 1992-10-30 | 1998-09-15 | Bioengineering Resources, Inc. | Biological production of acetic acid from waste gases with Clostridium ljungdahlii |
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| EP0620277A1 (en) | 1993-03-18 | 1994-10-19 | Merck & Co. Inc. | Nucleic acid pharmaceuticals |
| FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
| ATE475668T1 (de) | 1994-01-27 | 2010-08-15 | Univ Massachusetts Medical | Immunisierung durch impfung von dns transkriptionseinheit |
| ATE298370T1 (de) | 1994-04-29 | 2005-07-15 | Baxter Healthcare Sa | Rekombinante poxviren mit fremdenpolynukleotiden in wichtigen regionen |
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| WO2002003872A2 (en) | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Johns Hopkins University | Application of photochemotherapy for the treatment of cardiac arrhythmias |
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