ES2765501T3

ES2765501T3 - Composiciones y métodos para preparar (s)-norcoclaurina y (s)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas

Info

Publication number: ES2765501T3
Application number: ES15810408T
Authority: ES
Inventors: Peter James Facchini
Original assignee: Willow Biosciences Inc
Current assignee: Atlas Energy Corp
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2035-06-12
Also published as: US20170130250A1; EP3158073B1; CA2952638A1; AU2015278205B2; CA2952638C; US10662453B2; US20190062793A1; US10119155B2; EP3158073B8; AU2015278205A2; AU2015278205A1; WO2015192233A1; WO2015192233A4; EP3158073A4; EP3158073A1

Abstract

Un método de preparación de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar al menos un precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionado entre un derivado de L-tirosina; y (b) poner en contacto el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina con NCS y, opcionalmente, MAO, en condiciones de reacción que permitan la catálisis del precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina para formar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina; y en donde el derivado de L-tirosina tiene la fórmula química (I): **(Ver fórmula)** en donde R1 representa hidrógeno o hidroxilo; en donde R2 representa hidrógeno; y en donde R3 representa un grupo amino -(NH2); y en donde R3' representa un átomo de hidrógeno, a condición de que R1 represente hidroxilo; o en donde R3 y R3' tomados juntos forman un grupo carbonilo; y en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en SEQ. ID. NO: 96; y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone como SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34 y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para preparar (s)-norcoclaurina y (s)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas

Campo de la divulgación

Las composiciones y métodos que se desvelan en el presente documento se refieren a metabolitos secundarios y procesos para fabricar los mismos. Más en particular, la presente divulgación se refiere a (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas y métodos para fabricar (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas.

Antecedentes de la divulgación

Los siguientes párrafos se proporcionan a modo de antecedentes de la presente divulgación. Sin embargo, no son una admisión de que ninguna de las cosas que se analizan en los mismos sea técnica anterior o parte del conocimiento de expertos en la materia.

Las vías bioquímicas de los organismos vivos se clasifican habitualmente como parte del metabolismo primario o parte del metabolismo secundario. Las vías que son parte del metabolismo primario de una célula viva están implicadas en el catabolismo para la producción de energía o en el anabolismo para la producción de componentes básicos para la célula. Por otro lado, los metabolitos secundarios son producidos por las células vivas y pueden carecer de cualquier función anabólica o catabólica obvia. Sin embargo, se ha reconocido desde hace mucho tiempo que muchos metabolitos secundarios son útiles en muchos aspectos, incluyendo, por ejemplo, como agentes terapéuticos.

El metabolito secundario (S)-norcoclaurina es producido por la adormidera (Papaver somniferum) y por otros miembros principalmente de las familias de plantas papaveráceas, ranunculáceas, berberidáceas y menispermáceas. No se ha descubierto (S)-norlaudansolina en la naturaleza, pero es estructuralmente similar a la (S)-norcoclaurina y puede sintetizarse usando el mismo conjunto de enzimas naturales. Puede usarse (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas como materia prima para fabricar compuestos alcaloides que son útiles como compuestos medicinales, así como drogas o estimulantes recreativos. Los ejemplos de dichos compuestos alcaloides incluyen los analgésicos narcóticos codeína y morfina, los agentes antimicrobianos sanguinerina y berberina, los relajantes musculares papaverina y (+)-tubocurarina, y el supresor de la tos y posible fármaco antineoplásico noscapina.

Actualmente, pueden recogerse (S)-norcoclaurina y determinados intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina de fuentes naturales, tales como la adormidera, Como alternativa, estos compuestos pueden prepararse de forma sintética. La (S)-norlaudanosolina puede prepararse de forma sintética. Sin embargo, los métodos de fabricación existentes para la (S)-norcoclaurina, la (S)-norlaudanosolina y los intermedios de síntesis de las mismas tienen rendimientos bajos de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis y/o son caros. Además, los métodos de fabricación sintéticos habitualmente conducen a grandes volúmenes de materiales de desecho, tales como disolventes orgánicos y catalizadores metálicos. Por tanto, existe en la técnica la necesidad de métodos mejorados para la síntesis de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. Sumario de la divulgación

Los siguientes párrafos tienen por objeto presentar al lector la descripción más detallada a continuación y no definir ni limitar la materia objeto reivindicada de la presente divulgación.

La presente divulgación se refiere al metabolito secundario (S)-norcoclaurina, al compuesto no natural (S)-norlauranosolina y a intermedios de síntesis de los mismos, así como a métodos de preparación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. La presente divulgación se refiere adicionalmente a determinadas enzimas capaces de catalizar reacciones que dan como resultado la conversión de determinados intermedios de síntesis para formar (S)-norcoclaurina y/o (S)-norlaudanosolina.

En consecuencia, la presente invención proporciona, en al menos un aspecto, al menos una realización de preparación de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que comprende:

(a) proporcionar al menos un precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionado entre un derivado de L-tirosina; y

(b) poner en contacto el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina con NCS y, opcionalmente, MAO, en condiciones de reacción que permitan la catálisis del precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina para formar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina;

y

en donde el derivado de L-tirosina tiene la fórmula química (I):

(I)

en donde R¹representa hidrógeno o hidroxilo;

en donde R²representa hidrógeno; y

en donde R³representa un grupo amino -(NH²); y

en donde R³' representa un átomo de hidrógeno, a condición de que R¹represente hidroxilo; o

en donde R³y R³' tomados juntos, forman un grupo carbonilo; y

en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en SEQ. ID. NO: 96; y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone como SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34 y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende como componentes unidos operativamente:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica NCS y, opcionalmente, MAO; y

(ii) una o más secuencias de ácido nucleico capaces de controlar la expresión en una célula hospedadora; (b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora para producir NCS y, opcionalmente, MAO, y para producir una o más de (S)-norcoclaurina (S)-norlaudanosolina, o uno de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina;

(c) recuperar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina;

en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en SEQ.ID. NO: 96; y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone como SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34; y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar NCS y, opcionalmente, MAO, que comprende:

(i) una o más secuencias de ácido nucleico que codifican NCS y, opcionalmente, MAO; y

(ii) una o más secuencias de ácido nucleico capaces de controlar la expresión en una célula hospedadora; (b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora para producir NCS y, opcionalmente, MAO;

(c) recuperar NCS y, opcionalmente, MAO, de la célula hospedadora;

en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en SEQ.ID. NO. 96; y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34; y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en: dopamina; 4-hidroxifenilacetaldehído; y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende

(i) una o más secuencias de ácido nucleico complementarias con todo o una porción del ARNm sintetizado mediante la secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en NCS y, opcionalmente, MAO; y

(ii) uno o más elementos capaces de controlar la transcripción de la secuencia de ácido nucleico complementaria, en donde la secuencia quimérica de ácido nucleico es capaz de producir un ARN antisentido complementario con todo o una porción del ARNm de la secuencia de ácido nucleico que codifica NCS y, opcionalmente, MAO;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora;

(c) cultivar la célula hospedadora para producir el ARN antisentido e inhibir la síntesis de NCS y, opcionalmente, MAO, y para producir uno o más de un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, o un precursor de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionado entre el grupo de intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina y precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en: dopamina; y 4-hidroxifenilacetaldehído; y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y

(d) recuperar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o un intermedio de síntesis de (S)-norlaudanosolina que consiste en dopamina; 4-hidroxifenilacetaldehído; y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en ^sE^q.ID. NO: 96; y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone como SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34; y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

En realizaciones preferidas de la invención, el derivado de L-tirosina es dopamina; 4-hidroxifenilacetaldehído; o 3,4-dihidroxifenilacetaldehído.

La presente divulgación proporciona al menos una realización de preparación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina y cada uno de los siguientes intermedios de síntesis: tiramina, dopamina, L-DOPA, 4-hidroxifenilacetaldehído y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído. En consecuencia, la presente divulgación proporciona adicionalmente:

(I) al menos una realización de preparación de (S)-norcoclaurina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas TYR, DODC, TYDC, MAO y NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en (S)-norcoclaurina.

(II) al menos una realización de preparación de dopamina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas TYR y DODC en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en dopamina.

(III) al menos una realización de preparación de 4-hidroxifenilacetaldehído que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con cantidades catalíticas de enzimas TYDC y MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en 4-hidroxifenilacetaldehído; y

(IV) al menos una realización de preparación de L-DOPA que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con cantidades catalíticas de la enzima TYR en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en L-DOPA;

(V) al menos una realización de preparación de tiramina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con cantidades catalíticas de la enzima TYDC en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en tiramina;

(VI) al menos una realización de preparación de (S)-norlaudanosolina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas TYR, DODC, MAO y NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en (S)-norlaudanosolina; y

(VII) al menos una realización de preparación de 3,4-dihidroxi-fenilacetaldehído que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas TYR, DODC y MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en 3,4-dihidroxi-fenilacetaldehído.

En un aspecto adicional más, la presente divulgación proporciona en al menos una realización, las realizaciones mencionadas anteriormente en donde la enzima, o mezclas que comprenden cantidades catalíticas de enzimas, según sea el caso, y los intermedios de síntesis (S)-norcoclaurina y/o (S)-norlaudanosolina se juntan en condiciones de reacción in vitro. En otra realización, la enzima, o mezclas que comprenden cantidades catalíticas de enzimas, según sea el caso, y los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y/o (S)-norlaudanosolina se juntan en condiciones de reacción in vivo.

La presente divulgación proporciona adicionalmente en forma sustancialmente pura (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina y los siguientes intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y/o (S)-norlaudanosolina: L-DOPA; dopamina; tiramina; 4-hidroxifenilacetaldehído y 3,4-hidroxifenilacetaldehído.

Otras características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debería comprenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica implementaciones preferidas de la divulgación, se proporcionan solamente a modo de ilustración.

Breve descripción de los dibujos

Para una mejor comprensión de las diversas realizaciones de ejemplo que se describen en el presente documento y para mostrar más claramente cómo pueden realizarse estas diversas realizaciones, se hará referencia, a modo de ejemplo, a las figuras adjuntas que muestran al menos una realización de ejemplo y las figuras se describirán ahora brevemente. Debe comprenderse que las figuras del presente documento se proporcionan solo con fines ilustrativos y no tienen por objeto limitar la presente divulgación.

La FIG. 1 representa una vía de síntesis para la fabricación de (S)-norcoclaurina e intermedios de síntesis de la misma. Se incluyen las estructuras químicas de los intermedios de síntesis y enzimas capaces de catalizar la conversión química de los intermedios de síntesis.

La FIG. 2 representa una vía de síntesis para la fabricación de (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de la misma. Se incluyen las estructuras químicas de los intermedios de síntesis y enzimas capaces de catalizar la conversión química de los intermedios de síntesis.

La FIG. 3 representa las estructuras químicas para (S)-norcoclaurina (FIG. 3F), (S)-norlaudanosolina (FIG. 3H) y los siguientes intermedios de síntesis de las mismas: L-tirosina (FIG. 3A); tiramina (FIG. 3B); L-DOPA (FIG. 3C); dopamina (FIG. 3E), 4-hidroxifenilacetaldehído (FIG. 3D); y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído (FIG. 3g ), respectivamente.

La FIG. 4 representa fragmentos de secuencia de ácido nucleico obtenidos de diversas especies de plantas que codifican múltiples polipéptidos de NCS. Las regiones que codifican NCS están representadas por cuadros de color negro, PSON = Papaver somniferum; PBR = Papaverbracteatum; CMA = Chelidonium majus; CCH = Chordyalis cheilantifolia; SDI = Stylophorum diphyllum; y ECA = Eschscholzia californica.

La FIG. 5 representa una inmunotransferencia que usa anticuerpos anti-marcadores de His que muestra la expresión de polipéptidos de NCS de diversas especies de plantas en E. coli. Son secuencias polipeptídicas utilizadas: SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); TFLNCS2 (SEQ.ID. NO: 22); SDINSC1 (SEQ.ID. NO: 17); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 53); (PBRNSC3 (SEQ.ID. NO: 11); ECANCS1 (SEQ.ID. NO: 18); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 27); PBRNCS4 (SEQ.ID. NO: 12); CCHNCS5 (SEQ.ID. NO: 31); PBRNCS5 (SEQ.ID NO: 13); XSINCS1 [SEQ.ID. NO: 41); y PSONCS3 (SEQ.ID. NO: 42).

La FIG. 6 representa placas TLPC que muestran la producción de norcoclaurina en E. coli usando diversas secuencias polipeptídicas de NCS intactas (FIG. 6A; FIG. 6B) y secuencias de NCS truncadas FIG. 6C. Son secuencias de NCS intactas utilizadas SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); SDINSC1 (SEQ.ID. NO: 17); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); y PSONCS3 (SEQ.ID. NO: 42), TFLNCS2 (SEQ.ID. NO: 87); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 85); PBRNSC3 (SEQ.ID. NO: 83); ECANCS1 (SEQ.ID. NO: 56); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 65); PBRNCS4 (SEQ.ID. NO: 50); CCHNCS5 (SEQ.ID. NO: 92); XSINCS1 (SEQ.ID. NO: 93). Son secuencias truncadas TFLNCSA19 (SEQ.ID NO: 112); TFLNCS2A25 (SEQ.ID. NO: 109); CMANCS1A25 (SEQ.ID. NO: 105); PBRNCS3A25 (SEQ.ID. NO: 107); ECANCS1A25 (SEQ.ID. NO: 106); CCHIVCS1A25 (SEQ.ID. NO: 103); PBRNCS4A25 (SEQ.ID. NO: 108); CCHNCSSA25 (SEQ.ID. NO: 104); XSINCS1A25 (SEQ.ID. NO: 113).

La FIG. 7 representa una inmunotransferencia que usa anticuerpos anti-marcadores de His que muestra la expresión de polipéptidos de NCS en levadura (FIG. 7A) y placas TLPC que muestran la producción de norcoclaurina en levadura usando diversos polipéptidos de NCS (FIG. 7B). La expresión se muestra usando polipéptidos TFLNCSA19 (SEQ.ID. NO: 112); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); SCANCS1 (SEQ ID. NO: 14); SDINCS1 (SEQ.ID.NO: 89), PSONCS3 (SEQ.ID.NO: 42); TFLNCS2A25 (SEQ.ID. NO: 109); XSINCS1A25 (SEQ.ID. NO: 113) y PSONCS2 (SEQ.ID. NO: 111). PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); y SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14). La producción de norcoclaurina se muestra usando polipéptidos TFLNCSA19 (SEQ.ID. NO: 112); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); SDINCS1 (SEQ.ID.NO: 89), PSONCS3 (SEQ.ID.NO: 42); TFLNCS2A25 (SEQ.ID. NO: 109); XSINCS1A25 (SEQ.ID. NO: 113) y PSONCS2 (SEQ.ID. NO: 111) PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); y SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14). Los controles son levadura transformada con un vector que no comprende un gen de NCS ["vector vacío"); y levadura y E. coli que expresan TFLNCS A19 (SEQ.ID. NO: 112).

Descripción detallada de la divulgación

A continuación se describirán diversas composiciones y métodos para proporcionar un ejemplo de una realización de cada materia objeto reivindicada. Ninguna realización que se describe a continuación limita ninguna materia objeto reivindicada y ninguna materia objeto reivindicada puede abarcar métodos, procesos, composiciones o sistemas que difieran de los que se describen a continuación. La materia objeto reivindicada no se limita a composiciones o métodos que tengan todas las características de una composición, método, sistema o proceso cualesquiera que se describen a continuación o características comunes a múltiples o todas las composiciones, sistemas o métodos que se describen a continuación. Es posible que una composición, sistema, método o proceso que se describe a continuación no sea una realización de ninguna materia objeto reivindicada. Cualquier materia objeto desvelada en una composición, sistema, método o proceso que se describa a continuación que no se reivindique en el presente documento puede ser materia objeto de otro instrumento de protección, por ejemplo, una solicitud de patente continua, y los solicitantes, inventores o propietarios no tienen la intención abandonar, renunciar o dedicar al público ninguna materia objeto por su divulgación en el presente documento.

Definiciones

El término "(S)-norcoclaurina" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3F.

El término "(S)-norlaudanosolina" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3H.

El término "L-tirosina" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3A.

El término "tiramina" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3^b.

Los términos "L-DOPA" y "L-3,4-dihidroxifenilalanina", que pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3C.

El término "dopamina" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3E.

Los términos "4-hidroxifenilacetaldehído" o "4HPAA", que pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3D.

Los términos "3,4-dihidroxifenilacetaldehído" o "3,4DHPAA", que pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a un compuesto químico que tiene la estructura química representada en la FIG. 3G.

Las expresiones "vía de síntesis de (S)-norcoclaurina" y "vía de síntesis de (S)-norlaudanosolina", se refieren a la vía metabólica para la síntesis de "(S)-norcoclaurina" representada en la FIG. 1 y "(S)-norlaudanosolina" representada en la FIG. 2, respectivamente. Cuando se hace referencia a un primer compuesto químico dentro de las vías de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina como "corriente arriba" respecto de un segundo compuesto químico en la vía, se entiende en el presente documento que la síntesis del primer compuesto químico precede a la síntesis del segundo compuesto químico. Por el contrario, cuando se hace referencia a un primer compuesto químico como "corriente abajo" respecto de un segundo compuesto químico en las vías de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, se entiende en el presente documento que la síntesis del segundo compuesto químico precede a la síntesis del primer compuesto químico.

Las expresiones "precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina" y "precursor de la vía de la (S)-norlaudanosolina", como se usan en el presente documento, se refieren a cualquiera de los compuestos químicos en las vías de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que se exponen en la FIG. 3A; la FIG. 3B; la FIG. 3C; la FIG, 3D; la FIG. 3E; y la FIG. 3G; junto con la expresión "intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina", "precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina" se refiere a un compuesto sintetizado corriente arriba de un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina.

Las expresiones "intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina" e "intermedio de síntesis de (S)-norlaudanosolina" como se usan en el presente documento se refieren a cualquiera de los compuestos químicos en las vías de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que se exponen en la FIG. 3B; la FIG. 3C; la FIG. 3D; la FIG. 3E y la FIG. 3G; junto con las expresiones "precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina" o "precursor de la vía de la (S)-norlaudanosolina", "intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina" e "intermedio de síntesis de (S)-norlaudanosolina" se refieren a un compuesto sintetizado corriente abajo de un precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o la (S)-norlaudanosolina.

Las expresiones "tirosina hidroxilasa", "polifenol oxidasa" y "TYR", que pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a todas y cada una de las enzimas que comprenden una secuencia de restos de aminoácidos que (i) es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido de TYR que se expone en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 98 o (ii) está codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente rigurosas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido de TYR que se expone en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones "tirosina descarboxilasa" y "TYDC", como pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a todas y cada una de las enzimas que comprenden una secuencia de restos de aminoácidos que (i) es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido de TYDC que se expone en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 102 o (ii) está codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente rigurosas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido de TYDC que se expone en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones "dihidroxifenilalanina descarboxilasa", "DOPA descarboxilasa" y "DODC", como pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a todas y cada una de las enzimas que comprenden una secuencia de restos de aminoácidos que (i) es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido de DODC que se expone en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 100 o (ii) está codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente rigurosas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido de DODC que se expone en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones "monoamino oxidasa" o "MAO", como pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a todas y cada una de las enzimas que comprenden una secuencia de restos de aminoácidos que (i) es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido de MAO que se expone en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 96 o (ii) está codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente rigurosas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido de MAO que se expone en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones "norcoclaurina sintasa" y "NCS", como pueden usarse indistintamente en el presente documento, se refieren a todas y cada una de las enzimas que comprenden una secuencia de restos de aminoácidos que (i) es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido de NCS que se expone en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 1 a SEQ.ID. NO: 42 o (ii) está codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones al menos moderadamente rigurosas con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier polipéptido de NCS que se expone en el presente documento, pero para el uso de codones sinónimos.

La expresión "secuencia de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de monómeros de nucleósidos o nucleótidos que consiste en bases de origen natural, azúcares y enlaces interazúcar (cadena principal). La expresión también incluye secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros de origen no natural o porciones de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico de la presente divulgación pueden ser secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y pueden incluir bases de origen natural incluyendo adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas. Los ejemplos de dichas bases modificadas incluyen aza y desaza adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo y xantina e hipoxantina.

Las expresiones utilizadas indistintamente en el presente documento "secuencia de ácido nucleico que codifica TYR" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de TYR", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de TYR, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 97. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de TYR incluyen adicionalmente todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias polipeptídicas de TYR que se exponen en el presente documento; o (ii) se hibridan con cualesquier secuencias de ácido nucleico de TYR que se exponen en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente rigurosas o que se hibridarían con las mismas en condiciones al menos moderadamente rigurosas pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones utilizadas indistintamente en el presente documento "secuencia de ácido nucleico que codifica TYDC" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de TYDC", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de TYDC, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 101. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de TYDC incluyen adicionalmente todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias polipeptídicas de TYDC que se exponen en el presente documento; o (ii) se hibridan con cualesquier secuencias de ácido nucleico de TYDC que se exponen en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente rigurosas o que se hibridarían con las mismas en condiciones al menos moderadamente rigurosas pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones utilizadas indistintamente en el presente documento "secuencia de ácido nucleico que codifica MAO" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de MAO", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de MAO, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 95. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de MAO incluyen adicionalmente todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias polipeptídicas de NCS que se exponen en el presente documento; o (ii) se hibridan con cualesquier secuencias de ácido nucleico de MAO que se exponen en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente rigurosas o que se hibridarían con las mismas en condiciones al menos moderadamente rigurosas pero para el uso de codones sinónimos.

Las expresiones utilizadas indistintamente en el presente documento "secuencia de ácido nucleico que codifica NCS" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de NCS", se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de NCS, incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID. NO: 43 a SEQ.ID. NO: 80. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de ⁿC^sincluyen adicionalmente todas y cada una de las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias polipeptídicas de NCS que se exponen en el presente documento; o (ii) se hibridan con cualesquier secuencias de ácido nucleico de NCS que se exponen en el presente documento en condiciones de hibridación al menos moderadamente rigurosas o que se hibridarían con las mismas en condiciones al menos moderadamente rigurosas pero para el uso de codones sinónimos.

Por la expresión "sustancialmente idéntico" se entiende que dos secuencias polipeptídicas son preferentemente al menos un 70 % idénticas y más preferentemente son al menos un 85 % idénticas y mucho más preferentemente al menos un 95 % idénticas, por ejemplo, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idénticas. Con el fin de determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas, las secuencias de aminoácidos de dichas dos secuencias se alinean, usando, por ejemplo, el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2: 482) de manera que se obtenga la coincidencia de orden más alto entre las dos secuencias y se determine el número de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias. Se reconocen generalmente en la técnica métodos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carillo y Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48: 1073) y los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, Nueva York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. En general, para dichos cálculos, se emplearán programas informáticos. Los programas informáticos que pueden usarse en este sentido incluyen, pero sin limitación, GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990: 215: 403). Un método particularmente preferido para determinar el porcentaje de identidad entre dos polipéptidos implica el algoritmo Clustal W (Thompson, J D, Higgines, D G y Gibson T J. 1994, Nucleic Acid Res 22 (22): 4673-4680 junto con la matriz de puntuación BLOSUM 62 (Henikoff S y Henikoff, J G, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 usando una penalización de apertura de hueco de 10 y una penalización de extensión de hueco de 0,1, de manera que la coincidencia de mayor orden se obtiene entre dos secuencias en donde al menos el 50 % de la longitud total de una de las dos secuencias está implicada en la alineación.

Por "condiciones de hibridación al menos moderadamente rigurosas" se quiere decir que se seleccionan condiciones que promueven la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico complementarias en solución. La hibridación puede producirse en toda o una porción de una molécula de secuencia de ácido nucleico. La porción de hibridación tiene normalmente al menos 15 (por ejemplo 20, 25, 30, 40 o 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia reconocerán que la capacidad de un dúplex de ácido nucleico, o híbridos, se determina por la Tf, que en tampones que contienen sodio es función de la concentración del ion sodio y la temperatura (Tf=81,5 °C-16.6 (Log10 [Na+])+0,41(% (G+C)-600/l) o una ecuación similar). En consecuencia, los parámetros en las condiciones de lavado que determinan la estabilidad del híbrido son la concentración de iones de sodio y la temperatura. Con el fin de identificar moléculas que son similares, pero no idénticas, con una molécula de ácido nucleico conocida, puede suponerse que una falta de coincidencia del 1 % produce una disminución de aproximadamente 1 °C de la Tf, por ejemplo, si se buscan moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad >95 %, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5 °C. En base a estas consideraciones, los expertos en la materia podrán seleccionar fácilmente las condiciones de hibridación apropiadas. En realizaciones preferidas, se seleccionan condiciones de hibridación rigurosas. A modo de ejemplo, pueden emplearse las siguientes condiciones para conseguir una hibridación rigurosa: hibridación a cloruro de sodio 5x/citrato de sodio (SSC)/solución de Denhardt 5x/SDS al 1,0 % a Tf (basada en la ecuación anterior) -5 °C, seguido de un lavado de 0,2 x SSC/SDS al 0,1 % a 60 °C. Las condiciones de hibridación moderadamente rigurosas incluyen una etapa de lavado en 3x SSC a 42 °C. Se entiende, sin embargo, que puede conseguirse una rigurosidad equivalente usando tampones, sales y temperaturas alternativas. Pueden encontrarse directrices adicionales con respecto a condiciones de hibridación en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3,1.-6.3.6 y en: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3.

El término "quimérico" como se usa en el presente documento en el contexto de secuencias de ácido nucleico se refiere a al menos dos secuencias de ácido nucleico unidas, que no están unidas de forma natural. Las secuencias de ácido nucleico quimérico incluyen secuencias de ácido nucleico unidas de diferentes orígenes naturales. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que constituye un promotor de levadura unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TYR se considera quimérica. Las secuencias de ácido nucleico quimérico también pueden comprender secuencias de ácido nucleico del mismo origen natural, a condición de que no estén unidas de forma natural. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que constituye un promotor obtenido de un tipo de célula particular puede estar unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido obtenido a partir de ese mismo tipo de célula, pero normalmente no está unida a la secuencia de ácido nucleico que constituye el promotor. Las secuencias de ácido nucleico quimérico también incluyen secuencias de ácido nucleico que comprenden cualquier secuencia de ácido nucleico de origen natural unida a cualquier secuencia de ácido nucleico de origen no natural.

Las expresiones "sustancialmente puro" y "aislado", como pueden usarse indistintamente en el presente documento, describen un compuesto, por ejemplo, un intermedio de síntesis de vía o un polipéptido, que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Normalmente, un compuesto es sustancialmente puro cuando al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 % o un 98 % y mucho más preferentemente al menos un 99 % del material total de interés (en volumen, en peso húmedo o seco o, en porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede medirse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, en el caso de polipéptidos, mediante cromatografía, electroforesis en gel o análisis por HPLC.

La expresión "in vivo" como se usa en el presente documento para describir métodos de preparación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o intermedios de síntesis de las mismas se refiere a poner en contacto un precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o un precursor de la vía de la (S)-norlaudanosolina con una enzima capaz de catalizar la conversión de un precursor de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina dentro de una célula viva, incluyendo, por ejemplo, una célula microbiana o una célula vegetal, para formar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o un intermedio de síntesis de (S)-norlaudanosolina, o para formar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina.

La expresión "in vitro" como se usa en el presente documento para describir métodos de preparación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o intermedios de síntesis de las mismas se refiere a poner en contacto un precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o un precursor de la vía de la (S)-norlaudanosolina con una enzima capaz de catalizar la conversión de un precursor de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina en un entorno exterior a una célula viva, incluyendo, sin limitación, por ejemplo, en una placa de micropocillos, un tubo, un matraz, un vaso de precipitados, un tanque, un reactor y similares, para formar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o intermedio de síntesis de (S)-norlaudanosolina, o para formar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina.

Debe observarse que términos de grado tales como "sustancialmente", "aproximadamente" y "alrededor" como se usan en el presente documento significan una cantidad razonable de desviación del término modificado de manera que el resultado final no cambie significativamente. Estos términos de grado deben interpretarse como que incluyen una desviación del término modificado si esta desviación no negase el significado del término que modifica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "y/o" tiene por objeto representar un inclusive-o. Es decir, "X y/o Y" significa X o Y o ambos, por ejemplo.

Como ejemplo adicional, "X, Y y/o Z" pretende significar X o Y o Z o cualquier combinación de los mismos.

Implementación general

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, la presente divulgación se refiere a los metabolitos secundarios (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas, así como a métodos de preparación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. La divulgación actual se refiere adicionalmente a determinadas enzimas capaces de catalizar reacciones químicas que dan como resultado la conversión de intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina para formar (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina, respectivamente. Los métodos proporcionados en el presente documento representan un medio novedoso y eficiente de fabricación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. Los métodos proporcionados en el presente documento no se basan en la síntesis química y pueden realizarse a escala comercial. Según el conocimiento del inventor, la divulgación actual proporciona por primera vez una metodología para fabricar NCS, (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina usando células de levadura que normalmente no son capaces de sintetizar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina. Dichas células pueden usarse como fuente de donde puede extraerse (S)-norcoclaurina y/o (S)-norlaudanosolina económicamente. La (S)-norcoclaurina y/o la (S)-norlaudanosolina producidas de acuerdo con la presente divulgación son útiles, entre otras cosas, en la fabricación de composiciones farmacéuticas.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona al menos una realización de preparación de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o un intermedio de síntesis de las mismas que comprende:

(a) proporcionar al menos un precursor biosintético de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionado entre L-tirosina o un primer derivado de L-tirosina; y

(b) poner en contacto el precursor biosintético de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina con al menos una de las enzimas seleccionadas entre el grupo de enzimas que consiste en (i) TYR; (ii) TYDC; (iii) DODC; (iv) MAO; y (v) NCS en condiciones de reacción que permitan la catálisis del precursor biosintético de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina para formar (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o un intermedio de síntesis de las mismas, en donde el intermedio de síntesis es un segundo derivado de L-tirosina;

y

en donde el primer y el segundo derivado de L-tirosina tienen la fórmula química (I):

en donde R¹representa hidrógeno o hidroxilo;

en donde R²representa hidrógeno o un grupo amino -(NH²); y

en donde R³representa un grupo carboxilo -(COOH) o un grupo amino -(NH²);

en donde R³' representa un átomo de hidrógeno; o

R³y R³' tomados juntos, forman un grupo carbonilo.

En realizaciones preferidas de la divulgación, el primer y/o el segundo derivado de L-tirosina es L-DOPA; tiramina; dopamina; 4-hidroxifenilacetaldehído o 3,4-dihidroxifenilacetaldehído.

Síntesis de (S)-norcoclaurina

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un método de preparación de (S)-norcoclaurina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYR; (ii) TYDC; (iii) DODC; (iv) MAO; y (v) NCS; en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en (S)-norcoclaurina.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norcoclaurina que comprende:

(a) proporcionar L-DOPA y L-tirosina; y

(b) poner en contacto la L-DOPA y la L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYDC; (ii) DODC; (iv) MAO; y (iv) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA y L-tirosina en (S)-norcoclaurina.

(a) proporcionar dopamina y L-tirosina; y

(b) poner en contacto la dopamina y la L-tirosina con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYDC; (ii) MAO; y (iii) NCS; en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de dopamina y L-tirosina en (S)-norcoclaurina.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norcoclaurina que comprende: (a) proporcionar dopamina y tiramina; y

(b) poner en contacto dopamina y tiramina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) MAO y (ii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de dopamina y tiramina en (S)-norcoclaurina.

(a) proporcionar L-tirosina y tiramina; y

(b) poner en contacto dopamina y tiramina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYR, (ii) DODC; (iii) MAO y (iv) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina y tiramina en (S)-norcoclaurina.

(a) proporcionar L-DOPA y tiramina; y

(b) poner en contacto L-DOPA y tiramina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) DODC: (ii) MAO y (iii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA y tiramina en (S)-norcoclaurina.

(a) proporcionar L-tirosina y 4-hidroxifenilacetaldehído; y

(b) poner en contacto L-tirosina y 4-hidroxifenilacetaldehído con cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYR; (ii) DODC y (iii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina y 4-hidroxifenilacetaldehído en (S)-norcoclaurina.

(a) proporcionar L-DOPA y 4-hidroxifenilacetaldehído; y

(b) poner en contacto L-DOPA y 4-hidroxifenilacetaldehído con cantidades catalíticas de las enzimas (i) DODC y (iii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA y 4-hidroxifenilacetaldehído en (S)-norcoclaurina.

(a) proporcionar dopamina y 4-hidroxifenilacetaldehído; y

(b) poner en contacto la dopamina y el 4-hidroxifenilacetaldehído con cantidades catalíticas de la enzima NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de dopamina y 4-hidroxifenilacetaldehído en (S)-norcoclaurina.

Las realizaciones anteriores de la divulgación para preparar (S)-norcoclaurina se ilustran adicionalmente en la Tabla A.

Las reacciones anteriores pueden realizarse en condiciones in vivo o in vitro como se detalla a continuación en el presente documento.

Síntesis de dopamina

En una realización de la divulgación, se proporciona un método de preparación de dopamina. En consecuencia, se proporciona un método de preparación de dopamina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto la L-tirosina, con una mezcla de enzimas que comprenda cantidades catalíticas de las enzimas (i) DODC; y (ii) TYR en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en dopamina;

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de dopamina que comprende:

(a) proporcionar L-DOPA; y

(b) poner en contacto la L-DOPA con cantidades catalíticas de la enzima DODC en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA en dopamina.

Síntesis de 4-hidroxifenilacetaldehído

En una realización de la divulgación, se proporciona un método de preparación de 4-hidroxifenilacetaldehído. En consecuencia, se proporciona un método de preparación de 4-hidroxifenilacetaldehído que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto la L-tirosina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYDC y (ii) MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en 4-hidroxifenilacetaldehído.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de 4-hidroxifenilacetaldehído que comprende:

(a) proporcionar tiramina; y

(b) poner en contacto la tiramina con cantidades catalíticas de la enzima MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de tiramina en 4-hidroxifenilacetaldehído.

La reacción anterior puede realizarse en condiciones in vivo o in vitro como se detalla a continuación en el presente documento.

Síntesis de L-DOPA

En una realización de la divulgación, se proporciona un método de preparación de L-DOPA. En consecuencia, se proporciona un método de preparación de L-DOPA que comprende:

(a) proporcionar tirosina; y

(b) poner en contacto la L-tirosina con cantidades catalíticas de la enzima TYR en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina para formar L-DOPA.

Síntesis de tiramina

En una realización de la divulgación, se proporciona un método de preparación de tiramina. En consecuencia, se proporciona un método de preparación de tiramina que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto la L-tirosina con cantidades catalíticas de la enzima TYDC en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina para formar tiramina.

Síntesis de (S)-norlaudanosolina

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto la L-tirosina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYR; (ii) DODC; (iii) MAO y (iv) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en (S)-norlaudanosolina.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar L-DOPA; y

(b) poner en contacto la L-DOPA con cantidades catalíticas de las enzimas (i) DODC; (ii) MAO y (iii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA en (S)-norlaudanosolina.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (5)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar dopamina; y

(b) poner en contacto la dopamina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) MAO y (ii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de dopamina en (S)-norlaudanosolina; En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar dopamina y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y

(b) poner en contacto la dopamina y el 3,4-dihidroxifenilacetaldehído con cantidades catalíticas de la enzima NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de dopamina y 4-hidroxifenilacetaldehído en (S)-norlaudanosolina,

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar L-tirosina y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y

(b) poner en contacto la L-tirosina y el 3,4-dihidroxifenilacetaldehído con cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYR; (ii) DODC y (iii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina y 4-hidroxifenilacetaldehído en (S)-norlaudanosolina.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de (S)-norlaudanosolina que comprende: (a) proporcionar L-DOPA y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y

(b) poner en contacto la L-DOPA y el 3,4-dihidroxifenilacetaldehído con cantidades catalíticas de las enzimas (i) DODC y (ii) NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA y 4-hidroxifenilacetaldehído en (S)-norlaudanosolina.

Las realizaciones anteriores de la divulgación para preparar (S)-norlaudanosolina se ilustran adicionalmente en la Tabla B.

Síntesis de 3,4-dihidroxifenilacetaldehído

En una realización de la divulgación, se proporciona un método de preparación de 3,4-dihidroxifenilacetaldehído. En consecuencia, se proporciona un método de preparación de 3,4-dihidroxifenilacetaldehído que comprende:

(a) proporcionar L-tirosina; y

(b) poner en contacto la L-tirosina con cantidades catalíticas de las enzimas (i) TYR; (ii) DODC; y (iii) MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-tirosina en 3,4-dihidroxifenilacetaldehído.

En una realización adicional, se proporciona un método de preparación de 3,4-dihidroxifenilacetaldehído que comprende:

(a) proporcionar L-DOPA; y

(b) poner en contacto la L-DOPA con cantidades catalíticas de las enzimas (i) DODC; y (ii) MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de L-DOPA en 3,4-dihidroxifenilacetaldehído.

(a) proporcionar dopamina; y

(b) poner en contacto la dopamina con cantidades catalíticas de la enzima MAO en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de dopamina en 3,4-dihidroxifenilacetaldehído.

Producción in vitro de (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas

De acuerdo con la presente divulgación, se ponen en contacto precursores de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina y/o intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina con cantidades catalíticas de una o más de las enzimas TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de precursores de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina y/o intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina en condiciones de reacción in vitro. En dichas condiciones de reacción in vitro, los constituyentes de la reacción inicial se proporcionan en forma más o menos pura y se mezclan en condiciones que permitan que las reacciones químicas requeridas, tras la catálisis enzimática, transcurran sustancialmente. Las formas sustancialmente puras de los precursores de síntesis iniciales de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina y/o intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina pueden sintetizarse químicamente o aislarse de fuentes naturales incluyendo Papaver somniferum y otros miembros de las familias de plantas papaveráceas, ranunculáceas, berberidáceas y menispermáceas que comprenden dichos compuestos según se desee. Los miembros adecuados de las papaveráceas incluyen, pero sin limitación, especies que pertenecen al género Papaver; Argenome; Corydalis; Chelidonium; Eschscholzia; Glaucium; Romería; Sanguineria; y Stylophorum. Dichas especies que pueden ser capaces de producir (S)-norcoclaurina, incluyen, pero sin limitación, especies de plantas seleccionadas entre Argemone mexicana; Chelidonium majus; Corydalis bulbosa; Corydalis cava; Chordyalis cheilanthifolia; Corydalis ochotenis; Corydalis ophiocarpa; Corydalis platycarpa; Corydalis saxicola; Corydalis tuberosa; Eschscholzia californica; Glaucium flavum; Papaver armeniacum; Papaver brateatum, Papaver cylindricum; Papaver decaisnei; Papaver fugax; Papaver oreophyllum; Papaver orientale; Papaver paeonifolium; Papaver persicum; Papaver pseudo-orientale; Papaver rhoeas; Papaver rhopalothece; Papaver setigerum; Papaver somniferum; Papaver tauricolum; Papaver triniaefolium; Romeria carica; Sanguineria canadensis; Stylophorum diphylium. Los miembros adecuados de las ranunculáceas incluyen, pero sin limitación, especies que pertenecen al género Thalictrum; Hydrastis; Nigella; Coptis y Xanthoriza. Dichas especies que pueden ser capaces de producir (S)-norcoclaurina, incluyen, pero sin limitación, especies de plantas seleccionadas entre: Thalictrum flavum; Hydrastis canadensis; Nigella sativa; Coptis japonica y Xanthorhiza simplicissima. Los miembros adecuados de las berberidáceas incluyen, pero sin limitación, especies que pertenecen al género Berberis; Mahonia; Jeffersonia y Nandina. Dichas especies que pueden ser capaces de producir (S)-norcoclaurina, incluyen, pero sin limitación, especies de plantas seleccionadas entre Berberis thunbergii; Mahonia aquifolium, Jeffersonia diphylla y Nandina domestica. Los miembros adecuados de las menispermáceas, incluyen, pero sin limitación, especies de plantas seleccionadas entre: Menispermum, Cocculus, Tinospora y Cissempelos. Dichas especies que pueden ser capaces de producir (S)-norcoclaurina, incluyen, pero sin limitación, especies de plantas seleccionadas entre Menispermum canadense; Coccolus trilobus; Tinospora cordifolia y Cissempelos mucronata. Todas las especies de plantas mencionadas anteriormente pueden ser capaces de producir precursores de la vía de síntesis de la norcoclaurina y/o intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina.

De acuerdo con el presente documento, pueden aislarse formas más o menos puras de las enzimas de fuentes naturales, especies microbianas y las especies de plantas mencionadas anteriormente, incluyendo Papaver somniferum o pueden prepararse de forma recombinante. Por tanto, en el presente documento se proporciona un método adicional para preparar una enzima seleccionada entre el grupo de enzimas que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS que comprende:

(i) una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más de los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS; y

(ii) una o más secuencias de ácido nucleico capaces de controlar la expresión en una célula hospedadora;

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora para producir uno o más de los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS; y

(c) recuperar TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS de la célula hospedadora.

En realizaciones preferidas, las enzimas son polipéptidos que tienen una secuencia de polipéptidos representada por SEQ.ID. NO: 98 (TYR); SEQ.ID. NO: 100 (DODC); SEQ.ID. NO: 102 (TYDC); SEQ.ID. NO: 96 (MAO); y SEQ.ID. NO: 1 a SEQ.ID. NO: 42 (NCS).

El crecimiento de las células hospedadoras conduce a la producción de TYR; DODC; TYDC; MAO y/o NCS. Los polipéptidos posteriormente pueden recuperarse, aislarse y separarse de otros componentes de la célula hospedadora mediante una diversidad de diferentes técnicas de purificación de proteínas incluyendo, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, filtración en gel, etc. Pueden encontrarse directrices generales adicionales con respecto a la purificación de proteínas, por ejemplo, en: Cutler, P. Protein Purification Protocols, Humana Press, 2004, segunda ed. Por tanto, pueden obtenerse preparaciones sustancialmente puras de los polipéptidos de TYR; DODC; TYDC; MAO y/o NCS. Pueden prepararse combinaciones y mezclas de los polipéptidos de ^tYR; DODC; TYDC; MAO y NCS y seleccionarse en consecuencia, y todas y se incluye específicamente cada una de las combinaciones de las enzimas que se exponen en el presente documento.

De acuerdo con el presente documento, se ponen en contacto precursores de la vía de síntesis de la norcoclaurina o intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina con cantidades catalíticas de una o más de las enzimas TYR; DODC; TYDC; MAO y/o NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de los precursores de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina y/o intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina. En realizaciones preferidas, los agentes se ponen en contacto entre sí y se mezclan para formar una mezcla. En realizaciones preferidas, la mezcla es una mezcla acuosa que comprende agua y, opcionalmente, más agentes adicionales para facilitar la catálisis enzimática, incluyendo agentes tamponadores, sales, agentes modificadores del pH, así como cofactores, por ejemplo, NAD+ y NADP+. La reacción puede realizarse a un intervalo de temperaturas diferentes. En realizaciones preferidas, la reacción se realiza a una temperatura entre aproximadamente 18 °C y 37 °C. Tras completar la reacción in vitro pueden obtenerse (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o intermedios de síntesis de las mismas en forma más o menos pura. Se observa que en realizaciones de la presente divulgación donde la síntesis de (S)-norlaudanosolina requiere que una porción del sustrato de dopamina disponible se convierta en 3,4-DHPAA y una porción se usa para acoplarse a 3,4-DHPAA con el fin de producir (S)-norlaudanosolina en presencia de NCS, la actividad de MAO puede regularse con el fin de obtener un equilibrio estequiométrico de ambos sustratos de NCS. Dicha regulación puede conseguirse, por ejemplo, a nivel transcripcional o traduccional.

Producción in vivo de (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas

De acuerdo con la presente divulgación los precursores de la vía de síntesis de la (S)-norcoclaurina y/o los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina se ponen en contacto con cantidades catalíticas de una o más de las enzimas TYR; DODC; TYDC; MAO: y/o NCS en condiciones de reacción que permitan una conversión química catalizada por enzimas de los precursores de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina y los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina en condiciones de reacción in vivo. En dichas condiciones de reacción in vivo, las células vivas se modifican de manera que producen (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o intermedios de síntesis de las mismas. En determinadas realizaciones, las células vivas son microorganismos, incluyendo células bacterianas y células fúngicas. En otras realizaciones, las células vivas son organismos multicelulares, incluyendo plantas.

En una realización, las células vivas se seleccionan para que sean células hospedadoras capaces de producir al menos uno de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina de la presente divulgación, pero incapaces de producir (S)-norcoclaurina o una o más de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o intermedios de síntesis de la presente divulgación. Dichas células incluyen, sin limitación, bacterias, levaduras, otras células fúngicas, células vegetales o células animales. Por tanto, a modo de ejemplo solamente, una célula hospedadora puede ser una célula hospedadora de levadura capaz de producir L-tirosina, pero no dopamina, (S)-norcoclaulina o (S)-norlaudanosolina. Con el fin de modular dichas células hospedadoras de manera que produzcan (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o intermedios de síntesis de las mismas, una o más de las enzimas seleccionadas entre el grupo de enzimas que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO y NCS de acuerdo con el presente documento pueden introducirse heterólogamente y expresarse en las células hospedadoras.

En otras realizaciones, las células vivas producen de forma natural uno o más de los precursores de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina, y/o intermedios de síntesis de los mismos, y/o (S)-norcoclaurina, y/o (S)-norlaudanosolina de la presente divulgación, sin embargo, las células vivas se modulan de manera que los niveles de uno o más de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina, o (S)-norcoclaurina y/o (S)-norlaudanosolina producidos en las células se modulen, con respecto a los niveles producidos por las células sin la introducción heteróloga de ninguna de las enzimas mencionadas anteriormente en dichas células vivas.

Con el fin de producir (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, se proporciona en el presente documento un método adicional para preparar (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina y/o uno o más de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionados entre el grupo de intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en: tiramina; L-DOPA; 4-hidroxifenilacetaldehído, 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y dopamina que comprende:

(i) una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más de los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC, MAO; y NCS; y

(b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora para producir el polipéptido seleccionado entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS y para producir una o más de (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o uno de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina; y

(c) recuperar (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina.

En algunas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico pueden aislarse de las especies de plantas mencionadas anteriormente, incluyendo Papaver somniferum, o de especies microbianas. En realizaciones preferidas, las secuencias de ácido nucleico se seleccionan entre las secuencias de ácido nucleico que se exponen en el presente documento como una o más de SEQ.ID. NO: 43 a SEQ. ID. NO.: 80; SEQ. ID. NO: 95; SEQ. ID. NO: 97; S^eQ. ID. NO: 99; o SEQ. ID. NO: 101. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica TYR, DODC, TYDC, MAO o NCS puede contener múltiples secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de TYR, DODC, TYDC, MAO o NCS, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico específicas que codifican múltiples secuencias de NCS que pueden usarse de acuerdo con el presente documento incluyen SEQ. ID. NO: 80; SEQ. ID. NO: 48; SEQ. ID. NO: 51; SEQ. ID. NO: 53; SEQ ID. NO: 54; SEQ. ID. NO: 65; SEQ ID. NO: 66; SEQ. ID. NO: 55; y SEQ ID. NO: 57. Será evidente para los expertos en la materia que una secuencia de ácido nucleico que codifica menos regiones codificantes de NCS (por ejemplo, 1 región codificante, 2 regiones codificantes, 3 regiones codificantes, 4 regiones codificantes, 5 regiones codificantes o 6 regiones codificantes) que las proporcionadas por la región codificante múltiple que contiene secuencias de ácido nucleico puede aislarse de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente. En este sentido, la FIG. 4 identifica las regiones codificantes de NCS de cada una de estas secuencias de ácido nucleico. Además, puede seleccionarse una única región codificante, por ejemplo, una de las regiones codificantes que se muestran en la FIG.

4 y se usa para preparar multímeros (por ejemplo, un homo-dímero, homo-trímero, homo-tetrámero, homopentámero u homo-hexámero). En otras realizaciones, pueden seleccionarse y combinarse dos o más regiones codificantes, del mismo o diferentes organismos, para preparar multímeros (por ejemplo, un hetero-dímero, heterotrímero, hetero-tetrámero, hetero-pentámero o hetero-hexámero). Se observa adicionalmente que puede usarse una secuencia de ácido nucleico que codifica formas de longitud completa o truncadas de TYR, DODC, TYDC, MAO y NSC, por ejemplo, los péptidos señal N-terminales, que representan normalmente no más de hasta 30 aminoácidos, pueden retirarse de los extremos N, como se proporciona en o SEQ. ID. NO: 103 - SEQ. ID. NO: 110. Como se ilustra en el Ejemplo 3, las secuencias truncadas pueden proporcionar niveles más significativos de norcoclaurina que la secuencia intacta y, por tanto, pueden usarse en realizaciones preferidas de la presente divulgación. El polipéptido o polipéptidos mencionados anteriormente en el presente documento se seleccionan de acuerdo con el intermedio o intermedios de síntesis específicos de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, o (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que se desea obtener. Por tanto, a modo de ejemplo no limitante, si se desea preparar (S)-norcoclaurina, puede introducirse en una célula hospedadora capaz de producir L-tirosina, una secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora que codifique los polipéptidos TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS (es decir, una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ.ID. NO: 97 (TYR); SEQ.ID. NO: 99 (DODC); SEQ.ID. NO: 101 (TYDC); SEQ.ID. NO: 95 (MAO); y una de SEQ.ID. NO: 43 - SEQ.ID. NO: 80 (NCS).

Se observa adicionalmente que en determinadas realizaciones de la presente divulgación, la secuencia de ácido nucleico quimérico puede codificar múltiples polipéptidos de TYR, DODC, TYDC; MAO; y/o NCS. Por tanto, en determinadas realizaciones de la presente divulgación, la secuencia de ácido nucleico quimérico puede codificar adicionalmente, un segundo; segundo y tercer; segundo, tercer y cuarto; segundo, tercer, cuarto y quinto; o un segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto polipéptido seleccionado entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO y NCS. En realizaciones donde se proporcionan secuencias de ácido nucleico quimérico que codifican múltiples polipéptidos, cada una de las secuencias de ácido nucleico adicionales y/o los polipéptidos pueden ser idénticos o no idénticos. Son secuencias de ácido nucleico que pueden usarse de acuerdo con estas realizaciones CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 66); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 85); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 65); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 90); y PSo Nc S3 (SEQ.ID. NO: 94) (de los cuales la expresión y la producción de (S)-norcoclaurina se muestran en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3, respectivamente) y PBRNCS2 (S^eQ.ID. NO: 48), SDⁱN^cS1 (SEQ.ID. NO: 89) y CMANSC2 (SEQ.ID. NO: 54).

De acuerdo con el presente documento, la secuencia de ácido nucleico que codifica TYR; DODC; TYDC; MAO; y/o NCS está unida a una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión de TYR; DODC; TYDC; MAO; y/o NCS en una célula hospedadora. En consecuencia, la presente divulgación también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica TYR; DODC; TYDC; MAO; y/o NCS unido a un promotor capaz de controlar la expresión en una célula hospedadora. Las secuencias de ácido nucleico capaces de controlar la expresión en células hospedadoras que pueden usarse en el presente documento incluyen cualquier promotor transcripcional capaz de controlar la expresión de polipéptidos en células hospedadoras. En general, se usan promotores obtenidos de células bacterianas cuando se selecciona un hospedador bacteriano de acuerdo con el presente documento, mientras que se usará un promotor fúngico cuando se selecciona un hospedador fúngico, se usará un promotor vegetal cuando se selecciona una célula vegetal, etc. Los elementos de ácido nucleico adicionales capaces de controlar la expresión en una célula hospedadora incluyen terminadores transcripcionales, potenciadores y similares, todos los cuales pueden incluirse en las secuencias de ácido nucleico quimérico de la presente divulgación.

De acuerdo con la presente divulgación, las secuencias de ácido nucleico quimérico que comprenden un promotor capaz de controlar la expresión en la célula hospedadora unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS, pueden integrarse en un vector de expresión recombinante que garantiza una buena expresión en la célula hospedadora. En consecuencia, la presente divulgación incluye un vector de expresión recombinante que comprende en la dirección 5' a 3' de la transcripción como componentes unidos operativamente:

(i) una secuencia de ácido nucleico capaz de controlar la expresión en una célula hospedadora; y

(ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS,

en donde el vector de expresión es adecuado para la expresión en una célula hospedadora. La expresión "adecuado para la expresión en una célula hospedadora" significa que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de ácido nucleico quimérico de la presente divulgación unida a elementos genéticos necesarios para conseguir la expresión en una célula hospedadora. Los elementos genéticos que pueden incluirse en el vector de expresión a este respecto incluyen una región de terminación transcripcional, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican genes marcadores, uno o más orígenes de replicación y similares. En realizaciones preferidas, el vector de expresión comprende adicionalmente elementos genéticos necesarios para la integración del vector o una porción del mismo en el genoma de la célula hospedadora, por ejemplo, si se usa una célula hospedadora vegetal, las secuencias de los bordes izquierdo y derecho de ADN-T que facilitan la integración en el genoma nuclear de la planta.

De acuerdo con la presente divulgación, el vector de expresión puede contener adicionalmente un gen marcador. Los genes marcadores que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen todos los genes que permiten la distinción de células transformadas de células no transformadas, incluyendo todos los genes marcadores seleccionables y detectables. Un gen marcador puede ser un marcador de resistencia tal como un marcador de resistencia a antibióticos contra, por ejemplo, kanamicina o ampicilina. Los marcadores seleccionables que pueden emplearse para identificar transformantes a través de inspección visual incluyen p-glucuronidasa (GUS) (Patentes de los EE.UU. N.° 5.268.463 y 5.599.670) y proteína verde fluorescente (GFP) (Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep, 14: 403).

Una célula hospedadora que puede usarse de manera particularmente conveniente es Escherichia coli. La preparación de los vectores de E. coli puede realizarse usando técnicas habitualmente conocidas tales como digestión de restricción, ligadura, gelectroforesis, secuenciación de ADN, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras metodologías. Hay disponible una amplia diversidad de vectores de clonación para realizar las etapas necesarias para preparar un vector de expresión recombinante. Entre los vectores con un sistema de replicación funcional en E. coli, se encuentran vectores tales como pBR322, la serie de vectores pUC, la serie de vectores M13 mp, pBluescript etc. Normalmente, estos vectores de clonación contienen un marcador que permite la selección de células transformadas. Pueden introducirse secuencias de ácido nucleico en estos vectores y los vectores pueden introducirse en E. coli preparando células competentes, electroporación o usando otras metodologías bien conocidas para un experto en la materia. Puede cultivarse E. coli en un medio apropiado, tal como medio Luria-Broth, y recogerse. Pueden recuperarse fácilmente vectores de expresión recombinantes de las células tras la recogida y la lisis de las células. Adicionalmente, pueden encontrarse directrices generales con respecto a la preparación de vectores recombinantes y el crecimiento de organismos recombinantes en, por ejemplo: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, Tercera Ed.

Se incluyen adicionalmente en la presente divulgación una célula hospedadora en donde célula hospedadora comprende una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende en la dirección de transcripción 5' a 3' como componentes unidos operativamente una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más de los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS. Como se ha mencionado anteriormente, la célula hospedadora es preferentemente una célula hospedadora capaz de producir al menos uno de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina o precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina de la presente divulgación, pero es incapaz producir (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina o uno o más de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, u otros intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina de la presente divulgación, pero para la introducción de las secuencias de ácido nucleico quimérico de la presente divulgación. Pueden seleccionarse combinaciones de secuencias de ácido nucleico con el fin de producir (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina de acuerdo con el presente documento haciendo referencia a la Tabla A y la Tabla B, todas y cada una de las combinaciones de secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos que se exponen en las Tablas A y B se incluyen específicamente en el presente documento.

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, en otras realizaciones, las células vivas producen de forma natural uno o más de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina, precursores de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina o (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina de la presente divulgación, sin embargo, las células vivas están moduladas de manera que los niveles de uno o más de los intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, o (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina producidos en las células se modulen, sin la introducción heteróloga de ninguna de las enzimas mencionadas anteriormente en dichas células vivas. Dichas modulaciones pueden conseguirse mediante una diversidad de técnicas de modificación, incluyendo, pero sin limitación, la modulación de una o más de las actividades enzimáticas de TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS, por ejemplo, modulando las secuencias de ácido nucleico nativas que codifican TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS, por ejemplo, mediante metodologías de silenciamiento génico, tales como metodologías antisentido: o mediante el uso de técnicas de modificación que dan como resultado la modulación de la actividad de las enzimas usando, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria, silenciamiento génico inducido por virus, la adición de disolventes orgánicos, combinación de genes o una combinación de estas y otras técnicas conocidas por los expertos en la materia, estando cada metodología diseñada para alterar la actividad de las enzimas de TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS, de manera que aumente la acumulación de uno o más de (S)-norcoclaurina o los intermedios de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina en las células vivas. Por tanto, la presente divulgación incluye adicionalmente realizaciones que implican la modulación de células vivas reduciendo la producción de NCS con el fin de producir dopamina y/o 4-hidroxifenilacetaldehído y/o 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; modulando células vivas reduciendo la producción de DODC con el fin de producir L-DOPA; modulando células vivas reduciendo la producción de TYR con el fin de producir L-tirosina; modulando células vivas reduciendo la producción de TYDC con el fin de producir L-tirosina; modulando células vivas reduciendo la producción de MAO con el fin de producir dopamina. Por tanto, quedará claro que de acuerdo con las realizaciones anteriores, pueden producirse intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina y precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina inhibiendo una enzima que convierte el intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina inmediatamente corriente abajo del intermedio de síntesis (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina deseada, o el precursor de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina deseado, y proporcionando el intermedio de (S)-norcoclaurina o ( S )-norlaudanosolina o el precursor de ( S )-norcoclaurina o ( S )-norlaudanosolina inmediatamente corriente arriba (como se representa en la FIG. 1 y la FIG. 2) del intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina, o precursor de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina en condiciones que permitan la producción del intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina deseado o precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina del componente corriente arriba inmediato. Por tanto, estrictamente a modo de ejemplo, uno puede seleccionar una planta que comprenda la vía de síntesis completa representada en la FIG. 1 (Papaver somniferum, por ejemplo) e inhibir NCS en dicha planta, proporcionando de este modo L-DOPA y/o tiramina en condiciones que permitan la producción de dopamina o 4-hidroxifenilacetaldehído, respectivamente; o, y nuevamente, estrictamente a modo de ejemplo, uno puede seleccionar una planta que comprenda la vía de síntesis completa representada en la FIG. 1 (Papaver somniferum, por ejemplo) e inhibir DODC en dicha planta, proporcionando de este modo L-tirosina en condiciones que permitan la producción de L-DOPA.

En el presente documento se proporciona adicionalmente un método para preparar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o ( S)-norlaudanosolina, o un precursor de ( S)-norcoclaurina o ( S)-norlaudanosolina seleccionado entre el grupo de intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina y precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en: L-tirosina; L-DOPA; dopamina; tiramina; 4-hidroxifenilacetaldehído y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende (i) una o más secuencias de ácido nucleico complementarias con todo o una porción del ARNm sintetizado por la secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS; y (ii) uno o más elementos capaces de controlar la transcripción de la secuencia complementaria de ácido nucleico, en donde la secuencia quimérica de ácido nucleico es capaz de producir un ARN antisentido complementario con todo o una porción del ARNm de la secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos seleccionados entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS; (b) introducir la secuencia de ácido nucleico quimérico en una célula hospedadora;

(c) cultivar la célula hospedadora para producir el ARN antisentido e inhibir la síntesis del polipéptido seleccionado entre el grupo de polipéptidos que consiste en TYR; DODC; TYDC; MAO; y NCS y para producir uno o más de un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina o un precursor de la vía de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionado entre el grupo de intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina y precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en L-tirosina; L-DOPA; dopamina; tiramina; 4-hidroxifenilacetaldehído y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y

(d) recuperar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina o un precursor de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina seleccionado entre el grupo de intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina y precursores de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en L-tirosina; L-DOPA; dopamina; tiramina; 4-hidroxifenilacetaldehído y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído.

Composiciones que comprenden intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina y (S)-norlaudanosolina

De acuerdo con la presente divulgación, se proporcionan métodos para preparar diversos intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina. En consecuencia, se incluyen adicionalmente en la presente divulgación formas sustancialmente puras o aisladas de dichos intermedios de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina. En la presente divulgación se incluye tiramina sustancialmente pura o aislada que tiene la fórmula química que se expone en la FIG. 3B; L-DOPA sustancialmente pura o aislada que tiene la fórmula química que se expone en la FIG. 3C; una dopamina sustancialmente pura o aislada que tiene la fórmula química que se expone en la FIG. 3E; 4-hidroxifenilacetaldehído sustancialmente puro o aislado que tiene la fórmula química que se expone en la FIG. 3D; y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído sustancialmente puro o aislado que tiene la fórmula química que se expone en la FIG.

3G; y (S)-norlaudanosolina sustancialmente pura o aislada que tiene la fórmula química que se expone en la FIG.

3H.

Secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos y polipéptidos implicados en (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas

La presente divulgación se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican polinucleótidos implicados en (S)-norcoclaurina, (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. En consecuencia, la presente divulgación proporciona las siguientes secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de NCS: SEQ. ID. NO: 1 a SEQ. ID. NO: 42. Las secuencias de nucleótidos anteriores pueden obtenerse en forma pura o sustancialmente pura y pueden proporcionarse en vectores de expresión. En consecuencia, la presente divulgación comprende adicionalmente un vector de expresión que comprende una cualquiera de SEQ. ID. NO: 1 a SEQ. ID. NO: 41.

La presente divulgación también proporciona los siguientes polipéptidos de NCS: SEQ. ID. NO: 42 a SEQ. ID. NO: 79. Los polipéptidos anteriores de acuerdo con la presente divulgación pueden obtenerse en forma más o menos pura de acuerdo con la presente divulgación.

Uso de (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas

La (S)-norcoclaurina. la (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas obtenidos de acuerdo con la presente divulgación pueden formularse para su uso como material de origen o producto intermedio químico para fabricar un fármaco farmacéutico. una droga recreativa. un estimulante. un agente terapéutico o un agente medicinal. incluyendo los estimulantes cafeína y nicotina. la cocaína estimulante y anestésica local. la quinina fármaco antipalúdico. la morfina analgésica. los antimicrobianos sanguinerina y berberina. el relajante muscular papaverina y el supresor de la tos noscapina. y derivados de cualquiera de los anteriores. Puede usarse otra (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina como fármaco farmacéutico. una droga recreativa. un estimulante. un agente terapéutico o un agente medicinal. Por tanto. la presente divulgación incluye adicionalmente una composición farmacéutica o composición precursora farmacéutica que comprende (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas preparada de acuerdo con los métodos de la presente divulgación. Las preparaciones de fármacos farmacéuticos o precursores farmacéuticos que comprenden (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas de acuerdo con la presente divulgación preferentemente comprenden adicionalmente vehículos. excipientes y sustancias auxiliares. tales como agentes humectantes o emulsionantes. sustancias tamponadoras del pH y similares. Estos vehículos. excipientes y sustancias adyuvantes son generalmente agentes farmacéuticos que pueden administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen. pero sin limitación. líquidos tales como agua. solución salina. polietilenglicol. ácido hialurónico. glicerol y etanol. También pueden incluirse sales farmacéuticamente aceptables en las mismas. por ejemplo. sales de ácidos minerales tales como clorhidratos. fosfatos. sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos. propionatos. benzoatos y similares. También se prefiere. aunque no es necesario. que la preparación contenga un excipiente farmacéuticamente aceptable que sirva como estabilizador. Los ejemplos de vehículos adecuados que también actúan como estabilizadores para péptidos incluyen. sin limitación. grados farmacéuticos de dextrosa. sacarosa. lactosa. sorbitol. inositol. dextrano y similares. Otros vehículos adecuados incluyen. de nuevo sin limitación. almidón. celulosa. fosfatos de sodio o calcio. ácido cítrico. glicina. polietilenglicoles (PEG) y combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica puede formularse para la administración oral e intravenosa y otras vías de administración según se desee. La dosis puede variar.

En realizaciones adicionales. la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un paciente con una composición farmacéutica que comprenda (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas preparados de acuerdo con la presente divulgación. En consecuencia. la presente divulgación proporciona adicionalmente un método para tratar a un paciente con (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas preparados de acuerdo con los métodos de la presente divulgación. comprendiendo dicho método administrar al paciente una composición que comprende (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. en donde (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas se administran en una cantidad suficiente para mejorar una afección médica en el paciente.

La presente divulgación también proporciona un uso de una composición que comprende (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas. para mejorar una afección médica en un paciente. La presente divulgación proporciona adicionalmente (S)-norcoclaurina. (S)-norlaudanosolina e intermedios de síntesis de las mismas para su uso en la mejora de una afección médica en un paciente. Puede usarse (S)-norcoclaurina para mejorar la relajación vascular y como estimulante broncodilatador.

Ejemplos

A continuación en el presente documento se proporcionan ejemplos de realizaciones específicas para realizar los métodos de la presente divulgación. así como realizaciones que representan las composiciones de la presente divulgación. Los ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación de ninguna manera.

Ejemplo 1 - Aislamiento de secuencias de ácido nucleico candidatas que codifican NCS

Los genes candidatos de NCS de longitud completa se identificaron mediante búsquedas BLAST en la web con secuencias de consulta que incluyen PsNSC (véase: SEQ. ID. NO: 7; SEQ. ID. NO: 8). TfNCS (véase: SEQ. ID. NO: 3) y AmNCS (SEQ. ID. NO: 4; ^sE^q. ID. NO: 5). El ADNc de la primera cadena se sintetizó a partir del ARN total de cada una de las 20 especies de plantas usando cebadores de transcriptasa inversa y oligo-dT. y se amplificaron ADNc que codifican genes candidatos de NCS de longitud completa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores directos e inversos enumerados en la Tabla C. Se usaron las siguientes especies de plantas: Argenome mexicana; Chelidonium majus; Chordyalis cheilanthifolia; Eschscholzia califomica; Glaucium flavum; Papaver bracteatum; Sanguineria canadensis; Stylophorum majus; Thalictrum flavum; ydrastis canadensis; Nigella sativa, Xanthorhiza simpficissima; Berberís thunbergii; Mahonia aquifolium; Jeffersonia diphylla; Nandina domestica; Menispermum canadense; Coccolus trilobus; Tinospora cordifolia y Cissempelos mucronata. Se realizaron treinta ciclos de PCR que consistieron en 94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 min. La reacción contenía cada desoxinucleósido trifosfato a una concentración de 0,3 mM, 0,3 mM de cada cebador, 50 ng de molde y 5 x tampón de reacción KAPAhifi y ADN polimerasa KAPA Hifi (Kapa biosystems). Cada producto amplificado se clonó en el vector fácil pGEM-T y se usó como molde para una reacción de PCR adicional. Para obtener la región codificante de los genes candidatos de NCS clonados en un vector de expresión, se diseñaron cebadores para incluir HindIII o BamHI o XhoI en sus secuencias como se proporciona en la Tabla D. Se realizó PCR en las condiciones descritas para estas construcciones, después se clonaron en primer lugar en el vector pGEMT-easy y el plásmido resultante se digirió con HindIII y Xhol o BamHI y XhoI. El fragmento de gen candidato de NCS interno [^sE^q. ID. NO: 80 - SEQ. ID. NO: 93] se subclonó en el vector pET 29b y se ligó a ADN ligasa T4 (Invitrogen) y la mezcla de ligadura se transformó en E. coli BL21 pLysS o ER2566 pLysS. Para obtener versiones truncadas de genes candidatos de NCS que carecieran de 25 restos de aminoácidos de la proteína intacta, se diseñaron cebadores directos, excepto el cebador para la proteína SDINCS1 truncada a la que le faltan los primeros 30 restos de aminoácidos como se proporciona en la Tabla E [SEQ.ID. NO: 103 a SEQ.ID. NO: 110]. Después de la PCR para genes candidatos truncados de NCS, los productos de PCR resultantes se purificaron y se ligaron en el vector pGEM-T easy. El plásmido resultante se subclonó usando sitios de restricción HindIII/XhoI o BamHI/XhoI en el vector pET 29 y BL21 pLys. Se determinaron secuencias de ácido nucleico de 32 fragmentos de secuencia de ácido nucleico que codifica NCS (SEQ. ID. NO: 48 - SEQ. ID. NO: 80) y se obtuvieron las secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ. ID. NO: 10 - SEQ. ID. NO: 42). En determinados casos, el fragmento de nucleótido que codifica el polipéptido NCS comprende múltiples (es decir, 2, 3, 4 o 5) regiones codificantes de NCS. Estos fragmentos y la orientación relativa de múltiples regiones codificantes de NCS se muestran en la FIG. 4.

Ejemplo 2 - Expresión de polipéptidos de NCS en Escherichia coli

Un total de 14 construcciones de proteína de fusión 6 x-His que contenían ADNc candidatos de NCS de longitud completa o truncados se expresaron en E. coli mediante inducción con IPTG 0,5 mM durante 4,5 h a 37 °C. Para la proteína PSONCS3, se aplicó inducción a baja temperatura (4 °C) durante la noche. Se usaron las siguientes secuencias de ácido nucleico: SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 52); TFLNCS2 (SEQ.ID. NO: 87); SDINSC1 (SEQ.ID. NO: 89); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 66); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 72); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 85); (PBRNSC3 (SEQ.ID. NO: 83); ECANCS1 (SEQ.ID. NO: 56); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 65); PBRNCS4 (SEQ.ID. NO: 50); CCHNCS5 (SEQ.ID. NO: 92); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 90); XSINCS1 (SEQ.ID. NO: 93); y PSONCS3 (SEQ.ID. NO: 94). Los cultivos se recogieron mediante centrifugación a 8.000 g durante 10 min y se resuspendieron en Tris 20 mM frío, pH 7,5, KCl 100 mM, glicerol al 10 %. Las células se alteraron rutinariamente mediante ultrasonidos, seguido de separación en proteínas solubles e insolubles mediante centrifugación. La proteína recombinante de cada lisado se separó en SDS-PAGE (geles al 12 %) y se examinaron mediante inmunotransferencia usando anticuerpo anti-Histag. La inmunotransferencia que muestra polipéptidos de NCS 14_expresados (SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); TFLNCS2 (SEQ.ID. NO: 22); SDINSC1 (SEQ.ID. NO: 17); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 53); (PBRNSC3 (SEQ.ID. NO: 11); ECANCS1 (SEQ.ID. NO: 18); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 27); PBRNCS4 (SEQ.ID. NO: 12); CCHNCS5 (SEQ.ID. NO: 31); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); XSINCS1 (SEQ.ID. NO: 41); y PSONCS3 (SEQ.ID. NO: 42)) se muestra en la FIG. 5.

Ejemplo 3 - Producción de norcoclaurina en Escherichia coli recombinante que expresa NCS

La actividad de NCS se midió como se describe por Liscombe, DK, Macleod BP, Loukanina N, Nandi OI y Facchini PJ, Fé de erratas de 2005 a "Evidence for the monophyletic evolution of bensoisoquinoline alkaloid biosynthesis in angiosperms" Phytochemistry 66: 1374-1393. En resumen, se incubaron mezclas de reacción que contienen cada proteína recombinante con dopamina [8-¹⁴C] 1 nmol y 4-HPAA 10 nmol durante 1,5 horas a 37 °C. Las mezclas de reacción se aplicaron puntualmente sobre una CCF de gel de sílice 60 F²⁵⁴y se desarrollaron en n-BuOH:HOAC:H²O (4:1:5, v/v/v). Las placas de CCF se visualizaron y se analizaron usando un Bio-Imaging Analyzer. Los resultados se muestran en la FIG. 6. Se analizó un total de 14 cepas de E. coli, cada una de las cuales expresaba uno de los polipéptidos aislados en el Ejemplo 1. La FIG. 6A muestra los resultados obtenidos usando E. coli que expresaba las 6 secuencias polipeptídicas de NCS intactas: SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); SDINSC1 (SEQ.ID. NO: 17); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); y PSONCS3 (SEQ.ID. NO: 42) y todo ello proporcionó niveles sustanciales de producción de norcoclaurina. La FIG.

6B muestra los resultados obtenidos usando E. coli que expresaba 8 secuencias polipeptídicas intactas: TFLNCS2 (SEQ.ID. NO: 87); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 85); (PBRNSC3 (SEQ.ID. NO: 83); ECANCS1 (SEQ.ID. NO: 56); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 65); PBRNCS4 (SEQ.ID. NO: 50); CCHNCS5 (SEQ.ID. NO: 92); XSINCS1 (SEQ.ID. NO: 93) y todo ello no proporcionó ninguna producción visualmente detectable de norcoclaurina. Se prepararon secuencias de ácido nucleico truncado [véase: SEQ.ID. NO: 103 - SEQ.ID. NO: 110] usando las siguientes secuencias de ácido nucleico que codificaban NCS intactas: TFLNCS2 (SEQ.ID. NO: 87), (generando TFLNCS2A25 (SEQ.ID. NO; 109)); CMANCS1 (SEQ.ID. NO: 85), (generando TMANCS1A25 (SEQ.ID. NO: 105)); (PBRNC53 (SEQ.ID. NO: 83) (generando PBRNCS3A25 (SEQ.ID. NO: 107)); ECANCS1 (SEQ.ID. NO: 56) (generando ECANSC1A25 (SEQ.ID. NO: 106)); CCHNCS1 (SEQ.ID. NO: 65) (generando CCHNCS1A25 (SEQ.ID. NO: 103)); PBRNCS4 (SEQ.ID. NO: 50) (generando PBRNCS4A25 (SEQ.ID. NO: 108)): CCHNCS5 (SEQ.ID. NO: 92) (generando CCHNCS5A25 (SEQ.ID. NO: 104)); y XSINCS1 (SEQ.ID. NO: 93) (generando XSINCSA25 (SEQ.ID. NO: 113)); se usó un gen de NCS de Thalictrum flavum (TFLNCS) como control. Se muestra la producción de norcoclaurina de las secuencias truncadas en la FIG. 6C. Se observa que el truncamiento de dos secuencias (TLFNCS 2 (SEQ.ID. NO: 87) y XSIN (SEQ.ID. NO: 93) dio como resultado una producción más sustancial de norcoclaurina cuando se expresa la forma truncada, con respecto a cuando la forma intacta de estas proteínas se expresa en E. coli.

Ejemplo 4 - Expresión de polipéptidos de NCS en levadura

El gen de SDINCS1 sintético incluía un marcador de His⁶C-terminal y estaba flanqueado por sitios de restricción Notl y SacI para inserción directa en el vector de expresión de levadura pESC-leu2d (Agilent). Los marcadores His⁶C-terminales se fusionaron con otros candidatos de NCS mediante la reamplificación de candidatos del gen de NCS mediante PCR usando cebadores inversos que incluían secuencias que codificaban el marcador de His⁶(Tabla F). Se ligaron amplicones en pESC-leu2d usando Notl y Bglll, Notl y Spel, Spel y PacI o Notl y SacI y se usaron vectores de expresión para transformar la cepa YPH 499 de Saccharomyces cerevisiae (Gietz y Schiestl, 2007). Se usó una única colonia de levadura transformada para inocular 2 ml de medio de Compuesto Sintético (SC) que carecía de leucina, pero que contenía glucosa al 2 % (p/v) y se cultivó durante la noche a 30 °C y 200 rpm. Se inoculó un matraz que contenía 50 ml de medio SC que carecía de leucina, pero que contenía galactosa al 1,8 % (p/v), glucosa al 0,2 % (p/v) y rafinosa al 0,1 % (p/v), con 1 ml del cultivo de una noche y cultivado a 30 °C y 200 rpm durante aproximadamente 55 h. Las células de levadura se recogieron mediante centrifugación y se suspendieron en 3 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 7,3. Las células se lisaron mediante ultrasonidos, se retiraron los restos celulares a 4 °C mediante centrifugación durante 30 min a 20.000xg y el sobrenadante se usó para ensayos enzimáticos. La FIG. 7A muestra los resultados de la expresión usando TFLNCSA19 (SEQ.ID. NO: 112); PB^rN^cS5 (SEQ.ID. NO: 13); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); SDINCS1 (SEQ.ID.NO: 89), PSONCS3 (SEQ.ID.NO: 42); TFLNCS2A25 (SEQ.ID. NO: 109); XSINCS1A25 (SEQ.ID. NO: 113) y PSONCS2 (SEQ.ID. NO: 111).

Ejemplo 5 - Actividad de norcoclaurina sintasa en levaduras recombinantes que expresaban NCS

Se incubaron mezclas de reacción de NCS que contenían proteína recombinante en bruto, dopamina [8-¹⁴C] 1 nmol y 4-HPAA 10 nmol durante 1,5 h a 37 °C. Las mezclas de reacción se aplicaron puntualmente sobre una CCF de gel de sílice 60 ^F254y se desarrollaron en n-BuOH:HOAc:H²O (4:1:5, v/v/v). La placa de CCF se visualizó y se analizó usando un Bio-Imaging Analyzer. La FIG. 7B muestra la producción de norcoclaurina para TFLNCSA19 (SEQ.ID. NO: 112); PBRNCS5 (SEQ.ID. NO: 13); CCHNCS2 (SEQ.ID. NO: 28); NDONCS3 (SEQ.ID. NO: 34); SCANCS1 (SEQ.ID. NO: 14); SDINCS1 (SEQ.ID.NO: 89), PSONCS3 (SEQ.ID.NO: 42); TFLNCS2A25 (SEQ.ID. NO: 109); XSINCS1A25 (SEQ.ID. NO: 113) y PSONCS2 (SEQ.ID. NO: 111). Los controles son levadura transformada con un vector que no comprende un gen de NCS ("vector vacío"); y levadura y E. coli que expresan TFLNCS A19 (SEQ.ID. NO: 112).

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a lo que se consideran los ejemplos preferidos en el presente documento, debe comprenderse que la invención no se limita a los ejemplos desvelados.

TABLA A

continuación

TABLA B

continuación

Tabla C

continuación

continuación

Tabla D

continuación

Tabla E

Tabla F

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que comprende:

(b) poner en contacto el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina con NCS y, opcionalmente, MAO, en condiciones de reacción que permitan la catálisis del precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina para formar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina; y

en donde el derivado de L-tirosina tiene la fórmula química (I):

en donde R¹representa hidrógeno o hidroxilo;

en donde R²representa hidrógeno; y

en donde R³representa un grupo amino -(NH²); y

en donde R³y R³' tomados juntos forman un grupo carbonilo; y

en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en SEQ. ID. NO: 96;

y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone como SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34 y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

2. Un método de preparación de (S)-norcoclaurina de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina es dopamina y 4-hidroxifenilacetaldehído; y el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina no se pone en contacto con MAO.

3. Un método de preparación de (S)-norlaudanosolina de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el precursor de la vía de la (S)-norlaudanosolina es dopamina; y el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina se pone en contacto con NCS y MAO.

4. Un método de preparación de (S)-norlaudanosolina de acuerdo con la reivindicación 1 en donde los precursores de la vía de la (S)-norlaudanosolina son dopamina y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído y el precursor de la vía de la (S)-norcoclaurina no se pone en contacto con MAO.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las condiciones de reacción son condiciones de reacción in vitro.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las condiciones de reacción son condiciones de reacción in vivo.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que las condiciones de reacción in vivo se logran mediante la expresión de NCS y, opcionalmente, MAO, en una célula vegetal, levadura o en E. coli.

8. Un método para preparar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica NCS y, opcionalmente, MAO; y

(c) recuperar (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina;

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula hospedadora es una célula vegetal, una célula de levadura o una célula de E. coli.

10. Un método para preparar NCS y, opcionalmente, MAO, que comprende:

(c) recuperar NCS y, opcionalmente, MAO, de la célula hospedadora;

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula hospedadora es una célula vegetal, una célula de levadura o una célula de E. coli.

12. Un método para preparar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o (S)-norlaudanosolina que consiste en: dopamina; 4-hidroxifenilacetaldehído; y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; y que comprende:

(a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende

(d) recuperar un intermedio de síntesis de (S)-norcoclaurina o un intermedio de síntesis de (S)-norlaudanosolina que consiste en dopamina; 4-hidroxifenilacetaldehído; y 3,4-dihidroxifenilacetaldehído; en donde MAO es un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en s Eq .ID. NO: 96; y en donde NCS es un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo de secuencias que se expone como SEQ. ID. NO: 14; SEQ. ID. NO: 17; SEQ. ID. NO: 28; SEQ. ID. NO: 34; y SEQ. ID. NO: 42; o como se codifica por SEQ. ID. NO: 109 o SEQ. ID. NO: 113.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la célula hospedadora es una célula vegetal, una célula de levadura o una célula de E. coli.