ES2772032T3 - Alfa-amilasas y polinucleótidos que las codifican - Google Patents

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Abstract

Polipeptido aislado que tiene actividad alfa-amilasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos del polipeptido maduro de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N.o: 2, SEQ ID N.o: 4 o SEQ ID N.o: 6; (b) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N.o: 2, SEQ ID N.o: 4 o SEQ ID N.o: 6; (c) un polipeptido codificado por un polinucleotido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de codificacion de polipeptido maduro de la SEQ ID N.o: 1, SEQ ID N.o: 3 o SEQ ID N.o: 5; y (d) un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones de astringencia media con la secuencia de codificacion de polipeptidos maduros de la SEQ ID N.o: 1, SEQ ID N.o: 3 o SEQ ID N.o: 5.

Description

DESCRIPCIÓN
Alfa-amilasas y polinucleótidos que las codifican
ANTECEDCENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a alfa-amilasas, polinucleótidos que codifican las alfa-amilasas, construcciones de ácido nucleico o vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos, células hospedadoras recombinantes que comprenden los polinucleótidos, métodos para producir las alfa-amilasas y métodos para usar las alfa-amilasas. En formas de realización de la presente descripción, se mejora la actividad de degradación del almidón crudo.
Descripción de la técnica relacionada
[0002] La degradación enzimática del almidón forma parte de muchos procesos industriales que incluyen la elaboración de cerveza, la producción de jarabes con alto contenido de glucosa o fructosa y la producción de etanol para bebidas o como combustible. En su estado natural, el almidón es bastante resistente a la degradación por muchas enzimas y, por lo tanto, la degradación enzimática industrial del almidón se inicia tradicionalmente mediante un paso de calentamiento en el que el almidón se gelatiniza, lo que hace que el almidón sea más sensible a muchas enzimas. Algunas enzimas pueden actuar sobre el almidón no gelatinizado, y comúnmente se las conoce como poseedoras de actividad degradante del almidón crudo. El uso de estas enzimas permite procesos mejorados, que incluyen, por ejemplo, la reducción del paso de calentamiento en el procesamiento del almidón.
[0003] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucano 4 glucanohidrolasas, EC. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que cataliza la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4 glucosídicos lineales y ramificados. Las enzimas alfa-amilasas se han utilizado para una variedad de propósitos industriales diferentes, incluyendo la licuefacción de almidón, la producción de etanol, el desaprestado de textiles, el lavado de textiles, la modificación del almidón en la industria del papel y la pulpa, la elaboración de cerveza y la panadería.
[0004] WO 2010/091221 describe un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa de Aspergillus terreus. La base de datos UniProt XP002576027 revela la secuencia de ácido nucleico del genoma de Q0C881 (Aspergillus terreus) para una alfa-amilasa.
[0005] WO 2008/080093 divulga alfa-amilasas y glucoamilasas y su uso en la fabricación de biocombustible.
[0006] Sigue existiendo una necesidad en la técnica de alfa-amilasas mejoradas, incluidas las alfa-amilasas que tienen actividad degradante del almidón crudo.
Resumen de la invención
[0007] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de alfa-amilasa seleccionados del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°:4, o SEQ ID N.°:6;
(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°:4, o SEQ ID N.°:6;
(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°:3, o SEQ ID N.°:5; y (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°:3, o SEQ ID N.°:5.
[0008] La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención; construcciones de ácido nucleico; vectores de expresión recombinantes; células hospedadoras recombinantes que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir los polipéptidos.
[0009] La presente invención también se refiere a un método para la producción de etanol usando un polipéptido de la presente invención. La presente invención también se refiere a un método para la producción de etanol a partir de almidón no gelatinizado usando un polipéptido de la presente invención.
Definiciones
[0010] Actividad de alfa-amilasa: El término "actividad de alfa-amilasa" se define en este documento como una actividad que cataliza la endohidrólisis de enlaces (1,4)-alfa-D-glucosídicos en polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa unidas por enlaces alfa-(1,4). El término "actividad de alfa-amilasa" corresponde a las enzimas agrupadas en E.C. 3.2.1.1. Para los fines de la presente invención, la actividad de alfa-amilasa se determina de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección "Ejemplo".
[0011] Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede resultar en polimorfismos dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos modificadas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0012] ADNc: el término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm empalmado maduro obtenida de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluido el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
[0013] Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con un codón de inicio como ATG, GTG o TTG y acaba con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de estos.
[0014] Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (de un gen diferente) respecto al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativa o exógena entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectares con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.
[0015] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de un polipéptido incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.
[0016] Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y que está unido operativamente a secuencias de control que permiten su expresión.
[0017] Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido de la presente invención que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo terminal de un dominio o polipéptido maduro, en donde el fragmento tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 497 residuos de aminoácidos, al menos 526 residuos de aminoácidos, o al menos 555 residuos de aminoácidos de las SEQ ID N.°: 2 o 6. En otro aspecto, un fragmento contiene al menos 528 residuos de aminoácidos, al menos 559 residuos de aminoácidos, o al menos 590 residuos de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 4.
[0018] Condiciones de astringencia alta: el término "condiciones de astringencia alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 50%, después de procedimientos estándar de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 65 °C.
[0019] Célula hospedadora: el término "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que es susceptible a la transformación, la transfección, la transducción y similares con una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a las mutaciones que ocurren durante la replicación.
[0020] Aislado: El término "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no se da en la naturaleza. Los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se produce de forma natural, (2) cualquier sustancia incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se extraiga al menos parcialmente de uno o más o todos los constituyentes naturales con los que está asociado/a en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre en relación con esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada al aumentar la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los que está asociada naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención puede usarse en aplicaciones industriales en forma de un producto de caldo de fermentación, es decir, el polipéptido de la presente invención es un componente de un caldo de fermentación usado como producto en aplicaciones industriales (por ejemplo, producción de etanol). El producto de caldo de fermentación, además del polipéptido de la presente invención, comprenderá ingredientes adicionales utilizados en el proceso de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo las células hospedadoras que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utilizan para producir el polipéptido de interés), restos celulares, biomasa, medios de fermentación y/o productos de fermentación. El caldo de fermentación puede someterse de manera opcional a uno o más pasos de purificación (incluyendo filtración) para eliminar o reducir uno o más componentes de un proceso de fermentación. Por consiguiente, un polipéptido "aislado" de la presente invención puede estar presente en dicho producto de caldo de fermentación.
[0021] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como el procesamiento N-terminal, el truncamiento C-terminal, la glicosilación, la fosforilación, etc. Se sabe en la técnica que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido. También se sabe en la técnica que diferentes células hospedadoras procesan los polipéptidos de manera diferente y, por lo tanto, una célula hospedadora que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, con un amino C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación con otra célula hospedadora que expresa el mismo polinucleótido.
[0022] En un aspecto, el polipéptido maduro son los aminoácidos 1 a 585 de la SEQ ID N.°: 2 basado en SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos -1 a -21 de la SEQ ID N.°: 2 son un péptido señal.
[0023] En otro aspecto, el polipéptido maduro son los aminoácidos 1 a 622 de la SEQ ID N.°: 4 basado en SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos -1 a -21 de la SEQ ID N.°: 4 son un péptido señal.
[0024] En otro aspecto, el polipéptido maduro son los aminoácidos 1 a 607 de la SEQ ID N.°: 6 basado en SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos -1 a -21 de la SEQ ID N.°: 6 son un péptido señal.
[0025] Secuencia codificante del polipéptido maduro: El término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de alfa-amilasa.
[0026] Condiciones de astringencia media: el término "condiciones de astringencia media" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 35%, después de procedimientos estándar de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 55 °C.
[0027] Condiciones de astringencia media-alta: el término "condiciones de astringencia media-alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 35%, después de procedimientos estándar de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 60°C.
[0028] Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen natural o que se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otra manera no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.
[0029] Operativamente unido: el término "operativamente unido/a" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.
[0030] Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad de secuencia".
[0031] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)
[0032] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000,supra), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de EMBOSS de n Cb I NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)
[0033] Subsecuencia: el término "subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' terminal de una secuencia codificante de polipéptido maduro; en donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad alfa-amilasa.
[0034] Variante: el término "variante" significa un polipéptido con actividad de alfa-amilasa que comprende una modificación, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa una sustitución de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de uno o más, por ejemplo 1-3, aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.
[0035] Condiciones de astringencia muy alta: el término "condiciones de astringencia muy alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo procedimientos estándar de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS al 0,2% a 70 °C.
Descripción detallada de la invención
Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa
[0036] La presente divulgación se refiere a nuevas secuencias de alfa-amilasa.
[0037] En el primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de alfaamilasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°:4, o SEQ ID N.°:6;
(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°:4, o SEQ ID N.°:6;
(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°:3, o SEQ ID N.°:5; y (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°:3, o SEQ ID N.°:5.
[0038] Las nuevas secuencias de alfa-amilasa incluyen el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2, el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:4 y el polipéptido maduro de la s Eq ID N.°:6. Un polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:2 se muestra también como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 1 (residuos 1-585). Un polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:4 se muestra también como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 3 (residuos 1-622). Un polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:6 se muestra como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 5 (residuos 1-607).
[0039] En una forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 de al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que tienen actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 en no más de 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 aminoácidos.
[0040] En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2. Un polipéptido de la presente invención comprende preferiblemente o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2 o una variante alélica de esta.
[0041] En una forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:4 de al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que tienen actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:4 en no más de 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 aminoácidos.
[0042] En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 4.
[0043] En una forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°:6 de al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que tienen actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°:6 en no más de 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 aminoácidos.
[0044] En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 6.
[0045] La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de alfa-amilasa codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta, o condiciones de astringencia muy alta con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica de la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°:3, o SEQ ID N.°:5, o (ii) el complemento en toda su longitud de la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°:3, o SEQ ID N.°:5.
[0046] En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de alfa-amilasa codificado por un polinucleótido con una identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ iD N.°: 1, SEQ ID N.°:3 o SEQ ID N.°:5 de al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.
[0047] Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, Nueva York. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
[0048] Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos se ven alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.
[0049] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos simples o múltiples se pueden realizar y probar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o barajado, seguidos de un procedimiento de cribado relevante, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden usarse incluyen PCR propensa a error, visualización de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de EE. UU. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0050] Los métodos de mutagénesis/barajado se pueden combinar con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de a Dn mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.
[0051] Las variantes de los polipéptidos pueden construirse sobre la base del polinucleótido presentado como la secuencia codificante del polipéptido maduro, por ejemplo, una subsecuencia de este, y/o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codones del organismo hospedador destinados a la producción de la enzima, o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
[0052] Los aminoácidos esenciales de un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada residuo de la molécula, y se somete a las moléculas mutantes resultantes a una prueba para determinar la actividad de alfa-amilasa para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Véase también Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante el análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos de sitios de contacto putativos. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett.
309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede inferir de una alineación con un polipéptido relacionado.
Polinucleótidos
[0053] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención, como se describe en este caso.
[0054] En una forma de realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido con una identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5, de al menos 90 %, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%.
Construcciones de ácido nucleico
[0055] La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de la presente invención operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0056] Un polinucleótido puede manipularse de varias maneras para lograr la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son ampliamente conocidas en la técnica.
[0057] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedadora para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora, incluyendo los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sean homólogos o heterólogos a la célula hospedadora.
[0058] Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos de gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), del gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), del gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), del gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), del gen de la levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen crylIIA de Bacillus Thuuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón lac de E. coli, el promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), y el gen de beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 21-25) Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al. 1989, supra. Algunos ejemplos de promotores en tándem se describen en WO 99/43835.
[0059] Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus donde el líder no traducido se ha sustituido por un líder no traducido a partir de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; los ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en el que el líder no traducido se ha sustituido por un líder no traducido a partir de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de estos.
[0060] En una levadura hospedadora, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células de levadura hospedadoras están descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0061] La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula hospedadora para terminar la transcripción. El terminador está unido operativamente al extremo 3' terminal del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora puede usarse en la presente invención.
[0062] Los terminadores preferidos para las células hospedadoras bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB).
[0063] Los terminadores preferidos para células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0064] Los terminadores preferidos para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Romanos et al. 1992, supra describen otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura.
[0065] La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm en dirección hacia 5' de un promotor y en dirección hacia 3' de la secuencia de codificación de un gen que aumenta la expresión del gen.
[0066] Se obtienen ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas a partir de un gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y Gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465­ 3471).
[0067] La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula hospedadora. El líder está operativamente unido al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Se puede usar cualquier líder que sea funcional en la célula hospedadora.
[0068] Los líderes preferidos para células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0069] Los líderes adecuados para las células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
[0070] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3' del polinucleótido y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.
[0071] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0072] Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospedadoras de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0073] La secuencia de control también puede ser una región de codificación de péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia de codificación de péptido señal unida de manera natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia de codificación que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una secuencia de codificación de péptido señal que es exógena a la secuencia de codificación. Puede requerirse una secuencia codificante de péptido señal exógena cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una secuencia codificante de péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante de péptido señal exógena puede reemplazar simplemente la secuencia codificante de péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia de codificación de péptido señal que dirija el polipéptido expresado hacia la vía secretora de una célula hospedadora.
[0074] Las secuencias de codificación de péptidos señal eficaces para células hospedadoras bacterianas son las secuencias de codificación de péptidos señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal adicionales son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0075] Las secuencias de codificación de péptidos señal efectivas para células hospedadoras fúngicas filamentosas son las secuencias de codificación de péptidos señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
[0076] Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes de péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[0077] La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido que codifica un propéptido posicionado en el extremo N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido generalmente es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0078] Cuando están presentes las secuencias tanto del péptido señal como del propéptido, la secuencia del propéptido se coloca junto al extremo N-terminal de un polipéptido y la secuencia del péptido señal se coloca junto al extremo N-terminal de la secuencia del propéptido.
[0079] También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que regulen la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula hospedadora. Algunos ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se active o se desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procariotas incluyen los sistemas del operón lac, tac, y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden usar el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría operativamente enlazado con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
[0080] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación se ubica en el vector de modo que la secuencia de codificación se une operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0081] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que el vector se va a introducir. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
[0082] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el/los cromosoma(s) en el/los que se ha integrado. Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que, juntos, contienen el ADN total que se desea introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.
[0083] El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares.
[0084] Los marcadores seleccionables para su uso en una célula hospedadora fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfatodescarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Para el uso en una célula de Aspergillus se prefieren los genes pyrG y amdS de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
[0085] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
[0086] Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación precisa en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 10000 pares de bases, 400 a 10000 pares de bases y 800 a 10000 pares de bases, que tengan un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia de destino correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia de destino en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora por recombinación no homóloga.
[0087] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmidos que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmidos" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
[0088] Algunos ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden realizarse de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883.
[0089] Algunos ejemplos de orígenes de replicación para usar en una célula hospedadora de levadura son el origen de replicación de 2|j, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
[0090] Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para aumentar la producción de un polipéptido. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador amplificable seleccionable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y de este modo, las copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0091] Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son ampliamente conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, supra).
Células hospedadoras
[0092] La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora de modo que la construcción o el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo una procariota (célula bacteriana) o una eucariota (como una célula de mamífero, de insecto, vegetal o fúngica).
[0093] En un aspecto preferido, la célula hospedadora es una célula fúngica. "Hongos", como se usa en el presente documento, incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como los Oomycota y todos los hongos mitospóricos (según lo definido por Hawksworth et al., En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, octava edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido.).
[0094] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura", como se usa en el presente documento, incluye levaduras ascosporógenas (Endomycetales), levaduras basidioesporógenas y levaduras que pertenece a los hongos imperfectos (Blastomicetos). Dado que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore y Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[0095] La célula hospedadora de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.
[0096] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según lo definido por Hawksworth et al. 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo de levaduras como Saccharomyces cerevisiae es por gemación de un tallo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.
[0097] La célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.
[0098] Por ejemplo, la célula hospedadora filamentosa fúngica puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
[0099] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, gen 78: 147-156, y WO 96/00787. Las levaduras se pueden transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. Y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 75: 1920.
Métodos de producción
[0100] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprende:
a) el cultivo de una célula hospedadora que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
(b) la recuperación del polipéptido.
[0101] En un aspecto preferido, la célula es una célula de Aspergillus, como, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus.
[0102] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula hospedadora recombinante de la presente invención en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
[0103] Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraz con agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, discontinuas, discontinuas o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar el polipéptido. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se secreta en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar a partir de lisados celulares.
[0104] El polipéptido puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección incluyen, pero no se limitan a, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
[0105] El polipéptido puede recuperarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
[0106] El polipéptido se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.
[0107] En un aspecto alternativo, el polipéptido no se recupera, sino que una célula hospedadora de la presente invención que expresa el polipéptido se usa como fuente del polipéptido.
Composiciones
[0108] Se describen composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Dichas composiciones con polipéptido pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. El polipéptido para incluir en la composición puede estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
[0109] La composición con polipéptido puede estar en forma de granulado, un microgranulado o un polvo. Los métodos para preparar tales composiciones son ampliamente conocidos en la técnica.
[0110] La composición con polipéptido puede estar en forma de un producto de caldo de fermentación. El producto de caldo de fermentación, además del polipéptido de la presente invención, comprenderá ingredientes adicionales utilizados en el proceso de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo las células hospedadoras que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utilizan para producir el polipéptido de interés), restos celulares, biomasa, medios de fermentación y/o productos de fermentación. El caldo de fermentación se puede someter opcionalmente a uno o más pasos de purificación (incluyendo filtración) para eliminar o reducir uno más componentes de un proceso de fermentación.
[0111] La composición con polipéptido puede comprender además una enzima seleccionada del grupo que comprende otra alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (EC 3.2.1.2), una glucoamilasa (EC3.2.1.3), una pululanasa (EC 3.2.1.41), una fitasa (EC 3.1.2.28) y una proteasa (EC 3.4.), y sus combinaciones (por ejemplo, el polipéptido de la presente invención y una glucoamilasa, o el polipéptido de la presente invención y una glucoamilasa y una proteasa )
[0112] En un aspecto particular, la composición con polipéptido comprende además una glucoamilasa. El polipéptido se puede combinar con glucoamilasa comercial, tal como la preparación de glucoamilasa suministrada por Novozymes A/S como SPIRIZYME FUEL. La glucoamilasa también se puede derivar a partir de una cepa de Aspergillus sp., tal como Aspergillus niger, o a partir de una cepa de Talaromyces sp. y derivarse en particular de Talaromyces leycettanus como la glucoamilasa descrita en la patente de EE. UU. n° Reg. 32,153, Talaromyces duponti y/o Talaromyces thermopiles tal como las glucoamilasas descritas en la patente de EE. UU. n° 4,587,215 y derivarse más preferiblemente de Talaromyces emersonii. En un aspecto, la glucoamilasa se deriva de la cepa de Talaromyces emersonii CBS 793.97 y/o con la secuencia descrita como la SEQ ID N.°: 7 en WO 99/28448. En otro aspecto, la actividad de glucoamilasa se deriva a partir de una cepa del género Trametes, preferiblemente Trametes cingulata. Otras glucoamilasas incluyen la glucoamilasa con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 de WO 2006/069289. Glucoamilasa también puede incluir las glucoamilasas del género Pachykytospora, preferiblemente Pachykytospora papyracea o la cepa de E. Coli depositada en DSMZ con el n° DSM 17105, e incluye la glucoamilasa con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro del polipéptido maduro de la SEQ iD N.°: 5 de WO 2006/069289. Otras glucoamilasas incluyen las que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o incluso al menos 99% de homología con la secuencia de aminoácidos anteriormente mencionada.
[0113] La dosificación de la composición con polipéptido de la invención y otras condiciones en las cuales se usa la composición pueden determinarse en función de métodos conocidos en la técnica.
Usos
[0114] La presente invención también se refiere a métodos para usar los polipéptidos que tienen actividad de alfaamilasa, o composiciones de estos.
[0115] El polipéptido de la presente invención o la composición que comprende un polipéptido de la presente invención se puede usar en la conversión de almidón, la conversión de almidón a azúcar y la producción de etanol, etc., por ejemplo, en la licuefacción y/o sacarificación de un almidón gelatinizado, un almidón granular o un almidón parcialmente gelatinizado. Un almidón parcialmente gelatinizado es un almidón que en cierta medida está gelatinizado, es decir, en el que parte del almidón se ha hinchado y gelatinizado irreversiblemente y parte del almidón todavía está presente en un estado granular.
[0116] El polipéptido de la invención o la composición que comprende un polipéptido de la presente invención puede usarse en un proceso para licuar un almidón gelatinizado, un almidón granular o un sustrato de almidón parcialmente gelatinizado en medio acuoso con el polipéptido de la presente invención.
[0117] Un uso preferido de un polipéptido de la presente invención es en un proceso de fermentación para producir glucosa y/o maltosa adecuada para la conversión en un producto de fermentación por un organismo de fermentación, preferiblemente una levadura. Dichos procesos de fermentación incluyen un proceso para producir etanol como combustible o para bebidas (alcohol potable), un proceso para producir una bebida, un proceso para producir compuestos orgánicos deseados, como ácido cítrico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona o eritorbato de sodio; cetonas; aminoácidos, como el ácido glutámico (monoglutaminato de sodio), pero también compuestos más complejos como antibióticos, como la penicilina, la tetraciclina; enzimas; vitaminas, tales como riboflavina, B12, betacaroteno; hormonas, que son difíciles de producir sintéticamente.
[0118] En una forma de realización preferida, el polipéptido de la presente invención se usa en un proceso que comprende fermentación para producir un producto de fermentación (por ejemplo, etanol), a partir de un almidón gelatinizado. Tal proceso para producir etanol a partir de almidón gelatinizado por fermentación comprende: (i) licuar el almidón gelatinizado con un polipéptido con actividad alfa-amilasa de la presente invención; (ii) sacarificación de la pasta licuada obtenida; (iii) fermentar el material obtenido en el paso (ii) en presencia de un organismo de fermentación. Opcionalmente, el proceso comprende además la recuperación del etanol. La sacarificación y la fermentación pueden llevarse a cabo como un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso SSF).
[0119] En otra forma de realización preferida, el polipéptido de la presente invención se usa en un proceso que comprende fermentación para producir un producto de fermentación, por ejemplo, etanol, a partir de un almidón no gelatinizado ("crudo"). Tal proceso para producir etanol a partir de material que contiene almidón no gelatinizado por fermentación comprende: (i) poner en contacto el almidón no gelatinizado con un polipéptido con actividad alfaamilasa de la presente invención para degradar el almidón no gelatinizado; (ii) sacarificar la pasta obtenida; (iii) fermentar el material obtenido en el paso (ii) en presencia de un organismo de fermentación. Opcionalmente, el proceso comprende además la recuperación del etanol. La sacarificación y la fermentación pueden llevarse a cabo como un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso SSF).
[0120] El material que contiene almidón utilizado en los métodos de la presente invención puede ser cualquier material vegetal que contenga almidón. Los materiales que contienen almidón preferidos se seleccionan del grupo que consiste en: tubérculos, raíces y granos enteros; y cualquier combinación de estos. En una forma de realización, el material que contiene almidón se obtiene a partir de cereales. El material que contiene almidón puede, por ejemplo, seleccionarse de los grupos que consisten en maíz, raquis de maíz, trigo, cebada, yuca, sorgo, centeno, zahína y patata; o cualquier combinación de estos. Cuando el producto de fermentación es etanol, el material que contiene almidón es preferiblemente granos enteros o al menos principalmente granos enteros. La materia prima también puede consistir o comprender un producto secundario del procesamiento de almidón.
[0121] En formas de realización adicionales, el polipéptido de la presente invención también puede ser útil para el desaprestado de textiles, tejidos o prendas mediante el tratamiento de un textil, tejido o prenda con un polipéptido de la presente invención, para la producción de un producto o masa de panadería, mediante el tratamiento de una masa con un polipéptido de la presente invención, y opcionalmente su horneado, como ingrediente en un proceso de producción de detergente y de pulpa y papel mediante el tratamiento de una pulpa de fabricación de papel con un polipéptido de la presente invención.
[0122] La presente invención se describe a continuación mediante los ejemplos siguientes, que no deberían ser interpretados como una limitación del alcance de la invención.
Ejemplos
Ensayos sobre la actividad de alfa-amilasa
1. Ensayo de Phadebas
[0123] La actividad de la alfa-amilasa se determina mediante un método que emplea comprimidos Phadebas® como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (Phadebas® Amylase Test, suministrado por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón de color azul insoluble reticulado, que se ha mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia tampón y se ha transformado en comprimidos.
[0124] Para cada medición individual se suspende un comprimido en un tubo que contiene 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, CaCl 0,1 mM2, pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba se realiza en un baño de agua a la temperatura de interés. La alfa-amilasa que se desea analizar se diluye en x ml de tampón Britton-Robinson 50 mM. Se agrega 1 ml de esta solución de alfa-amilasa a los 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la alfa-amilasa, lo que proporciona fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad alfa-amilasa.
[0125] Es importante que la absorbancia medida de 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en el rango de 0,2 a 2,0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este rango de absorbancia hay linealidad entre actividad y absorbancia (ley de Lambert-Beer). Por lo tanto, la dilución de la enzima debe ajustarse para cumplir este criterio. En un conjunto específico de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones de tampón), 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cierta cantidad de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto de condiciones dadas.
2. Método alternativo
[0126] La actividad de alfa-amilasa se determina mediante un método que emplea el sustrato PNP-G7. PNP-G7, que es una abreviatura de p-nitrofenil-alfa,D-maltoheptaósido, es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en un kit disponible en el mercado digiere el sustrato para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y, por lo tanto, puede medirse por espectofometría visible a A = 405 nm (400-420 nm). Kits que contienen PNP-G7 el sustrato y la alfaglucosidasa están disponibles comercialmente en Roche y en otros.
[0127] Para preparar la solución de reactivo, se añaden 10 ml de solución de sustrato/tampón a 50 ml de solución de enzima/tampón según lo recomendado por el fabricante. El ensayo se realiza transfiriendo muestras de 20 micro I a una placa de microtitulación de 96 pocillos e incubándolas a 25 °C. Se agregan 200 micro l de una solución de reactivo preequilibrada a 25 °C. La solución se mezcla y se incuba previamente 1 minuto y la absorción se mide cada 30 segundos durante 4 minutos a una DO de 405 nm en un lector de ELISA.
[0128] La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto de condiciones dado.
Ejemplo 1
[0129] Se evaluó una alfa-amilasa de la presente invención (SEQ ID N.°: 2) en un ensayo de fermentación de almidón crudo y se comparó tanto con una alfa-amilasa híbrida (descrita en WO 2006/069290 como poseedora del dominio catalítico de Rhizomucorpusillus (SEQ ID N.°: 20), el enlazador de Aspergillus niger (SEQ ID N.°: 72) y el dominio de unión a carbohidratos de Aspergillus niger (SEQ ID N.°: 96)) como con la alfa-amilasa de Aspergillus terreus (se muestra como la SEQ ID N.°: 2 en WO 2010/091221).
Materiales y métodos
[0130] Se agregaron aproximadamente 405 g de maíz amarillo “diente de caballo” (obtenido de Hawkeye Renewables de Shell Rock, Iowa; molido internamente) a 595 g de agua del grifo y se determinó que el nivel de sólidos secos (DS) era de 34,42% de DS. Esta mezcla se complementó con 3 ppm de penicilina y 1000 ppm de urea. La suspensión se ajustó a pH 4,5 con H2SO4 al 40%. Se añadieron aproximadamente 5 g de esta suspensión a tubos de 15 ml. A cada tubo se dosificó DK193 AMG purificada (AMG de Trametes cingulata divulgada en WO 2006/069289 como la SEQ ID N.°: 2) a 0,0801 mg de EP/g de DS y las alfa-amilasas se dosificaron a 0,0225 mg de EP/g de DS. Las dosis enzimáticas reales se basaron en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada tubo de acuerdo con la siguiente fórmula:
Dosis enz. final (m g/g de DS) x Peso de la masa ( g) x Contenido de sólidos secos (% de DS) Dosis enz. (uL) =
Conc. solución madre (m g/mL) x1000
[0131] Se añadió agua a cada tubo para llevar el volumen agregado total (enzima agua) al 2% del peso inicial de la pasta. Esta corrección de volumen lleva todos los tubos del experimento al mismo porcentaje total de sólidos, haciendo que las concentraciones de etanol sean directamente comparables entre los tratamientos. Después de la adición de enzima y agua, se agregaron 200 pL de propagación de levadura (0,024 g de levadura Fermentis Ethanol Red, incubada durante la noche a 32 °C en 50 ml de pasta de maíz licuada filtrada y 5,1 pL de Spirizyme Plus AMG) a cada tubo.
[0132] Los tubos se incubaron en una sala con temperatura controlada a 32 °C y se realizaron seis fermentaciones replicadas de cada tratamiento. Todos los tubos se agitaron a las 24 y 48 horas. Una muestra se sacrificó para el análisis por HPLC a las 24 horas, dos a las 48 horas y tres a las 70 horas. La preparación de HPLC consistió en detener la reacción mediante la adición de 50 pl de 40% de H2SO4, centrifugado durante 10 minutos a 1462xg, y filtrado a través de un filtro de 0,45 pm. Las muestras se almacenaron a 4 °C. Se usó un sistema 1100 HPLC de Agilent™ junto con un refractómetro diferencial para determinar las concentraciones de etanol y oligosacáridos. La columna de separación era una columna de exclusión de iones BioRad™ Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm).
[0133] Los datos se analizaron en JMP (SAS, Cary, NC). Los valores atípicos se eliminaron en función de la prueba F (p <0,05). Los tratamientos se compararon con el control con el test HSD de Tukey-Kramer (p <0,05).
Resultados y discusión
[0134] Como se muestra en la Tabla 1, en estas condiciones experimentales, una alfa-amilasa de la presente invención (SEQ ID N.°: 2) funcionó mejor que la alfa-amilasa híbrida (WO 2006/069290) que mostraba una mejora del 2,2 % en el punto de tiempo de 70 horas en comparación con la alfa-amilasa híbrida (WO 2006/069290) y también mejor que la alfa-amilasa de Aspergillus terreus.
Tabla 1
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Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido aislado que tiene actividad alfa-amilasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N.°: 6;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N.°: 6;
(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de codificación de polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5; y (d) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de astringencia media con la secuencia de codificación de polipéptidos maduros de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5.
2. Polipéptido de la reivindicación 1, que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N.°: 6.
3. Polipéptido de la reivindicación 1, que es un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 95%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5.
4. Polipéptido de la reivindicación 1, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de astringencia media con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1 o SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5.
5. Polipéptido de la reivindicación 1 que comprende o que consiste en los residuos 1-585 de la SEQ ID N°: 2 o el polipéptido maduro codificado por la SEQ ID N°: 1.
6. Polipéptido de la reivindicación 1 que comprende o que consiste en los residuos 1-622 de la SEQ ID N°: 4 o el polipéptido maduro codificado por la SEQ ID N°: 3.
7. Polipéptido de la reivindicación 1 que comprende o que consiste en los residuos 1-607 de la SEQ ID N°: 6 o el polipéptido maduro codificado por la SEQ ID N°: 5.
8. Polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.
10. Célula hospedadora recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido.
11. Célula hospedadora recombinante de la reivindicación 10, en donde la célula hospedadora es una célula fúngica, tal como una levadura o una célula fúngica filamentosa.
12. Célula hospedadora recombinante de la reivindicación 10 u 11, en la que la célula hospedadora es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia Lipolytica.
13. Célula hospedadora recombinante de la reivindicación 10 u 11, en la que la célula hospedadora es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.
14. Método para producir un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa, que comprende:
(a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 10 en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
(b) recuperar el polipéptido.
15. Proceso para producir un producto de fermentación, que comprende:
(a) tratar un material que contiene almidón con el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7; (b) fermentar el material de (a) usando un organismo de fermentación para producir un producto de fermentación.
16. Proceso de la reivindicación 15, en donde (a) comprende (i) licuar el almidón gelatinizado con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y (ii) sacarificar la pasta licuada obtenido usando una glucoamilasa.
17. Proceso de la reivindicación 15, en donde el producto de fermentación se selecciona del grupo que consiste en etanol como combustible, alcohol potable, una bebida o compuestos orgánicos.
18. Proceso de la reivindicación 15, que comprende recuperar el producto de fermentación.
19. Proceso para producir un producto de fermentación que comprende:
(a) tratar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón; y (b) fermentar el material de almidón tratado usando un organismo de fermentación para producir un producto de fermentación.
20. Proceso de la reivindicación 19, en donde los pasos (a) y (b) se llevan a cabo secuencial o simultáneamente.
21. Proceso de la reivindicación 19, en donde el producto de fermentación es etanol como combustible.
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