ES2772223T3 - Polipeptidos - Google Patents

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ES2772223T3
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Lauge Schäffer
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Abstract

Un polipéptido de acuerdo con la Fórmula (I): Xaa1-Cys-Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa14-Phe-Leu- Xaa17-Xaa18-Ser-Ser- Xaa21- Xaa22- Phe-Gly-Pro-Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser-Xaa35-Thr-Pro; en donde Xaa1 se elimina o se selecciona independientemente de Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser y Lys; Xaa3 se selecciona independientemente de Gly, His, Arg, Ser y Asn; Xaa14 es Glu; Xaa17 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys y Val; Xaa18 se selecciona independientemente de Arg, Lys e His; Xaa21 se selecciona independientemente de Ala, Lys, Gln, Ser y Asn; Xaa22 se selecciona independientemente de Glu, Gln, Ser, Thr y Asn; Xaa26 se selecciona independientemente de Pro, Arg e Ile; Xaa31 se selecciona independientemente de Ser, Glu, Asp y Asn; Xaa35 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys, Asp, Gln y Glu; en donde la numeración de la secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de numeración de aminoácidos de la SEQ ID No: 2; en donde el C-terminal del polipéptido es una amida; en donde el C-terminal puede, opcionalmente, derivarse; y en donde el polipéptido es un agonista del receptor de amilina.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos
Campo de la invención
La invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es un análogo de la SEQ ID NO: 2 (pramlintida), composiciones farmacéuticas que comprenden estos polipéptidos y estos polipéptidos para su uso como medicamentos.
Antecedentes de la invención
Un número grande y creciente de personas sufre de diabetes mellitus y obesidad. La diabetes mellitus es un trastorno metabólico, en el cual la capacidad de utilizar glucosa se pierde parcial o completamente.
Varios regímenes de tratamiento se dirigen al exceso de glucosa en sangre, mientras que otros se centran principalmente en la reducción de peso. Los agentes antidiabéticos más eficientes usados para reducir la glucosa en sangre son la insulina y sus análogos. Se sabe desde hace mucho tiempo que cuando la insulina tradicional se usa para tratar la diabetes, se asocia con un aumento en el peso corporal. La insulina debe inyectarse por vía subcutánea hasta varias veces al día.
La diabetes tipo 2 generalmente se trata en las primeras fases con dieta y ejercicio. A medida que la condición progresa, se añaden varios agentes antidiabéticos orales. Los agentes inyectados tales como los análogos de GLP-1 también se pueden usar en esta etapa. En general, estos agentes son más eficientes en pacientes con células beta funcionales capaces de liberar insulina y amilina.
La amilina humana (SEQ ID No: 1) es un polipéptido de 37 aminoácidos de longitud que tiene propiedades fisicoquímicas que hacen que su uso como un fármaco sea problemático. En particular, tiene una tendencia a la fibrilogénesis, es decir, la formación de fibrillas, in vitro y/o ex vivo y se vuelve ineficaz debido a la precipitación. Además, la amilina es difícil de formular ya que es químicamente inestable y precipita a pH fisiológico. Por lo tanto, se formula en solución ácida.
La amilina humana se une a dos complejos receptores distintos. Estos dos complejos contienen el receptor de calcitonina más una proteína modificadora de la actividad del receptor, RAMP1 o RAMP3. A partir de la estrecha relación entre el receptor de calcitonina y el receptor de amilina, se puede esperar cierta reactividad cruzada con el receptor de calcitonina del agonista del receptor de amilina. Como un ejemplo, la pramlintida tiene cierta afinidad con el receptor de calcitonina pero es 14 veces más potente sobre el receptor de amilina.
El receptor de calcitonina se encuentra en muchos tejidos en todo el cuerpo y se cree que está involucrado en la regulación del metabolismo óseo. La calcitonina de salmón se vende actualmente con el nombre comercial Miacalcic®. El producto se usa contra la hipercalcemia, la osteoporosis (incluida la osteoporosis posmenopáusica y la osteoporosis relacionada con los glucocorticoides), la ostitis deformante (enfermedad de Pagets) y se administra una vez al día mediante inyección o por vía nasal. La calcitonina se une a receptores específicos en la membrana del esqueleto, los riñones y el sistema nervioso central (CNS). La vida media plasmática para la calcitonina de salmón es de aproximadamente 45 minutos.
Los polipéptidos con actividad en el receptor de calcitonina podrían ser útiles en el tratamiento de la hipercalcemia, osteoporosis, enfermedad de Pagets, obesidad o enfermedades relacionadas con la obesidad, así como también en la prevención de enfermedades relacionadas con la obesidad. Un inconveniente del tratamiento con las preparaciones de calcitonina usadas actualmente es que, debido a la corta vida media en plasma de la calcitonina de salmón, el fármaco debe administrarse varias veces al día y debe administrarse inmediatamente antes de una comida.
Los polipéptidos con doble actividad tanto en el receptor de calcitonina como en el receptor de amilina pueden ser ventajosos.
La pramlintida (SEQ ID No: 2) es un producto farmacéutico comercializado por Amylin Pharmaceuticals, como Symlin® para el tratamiento de la diabetes como un complemento de la insulina. La pramlintida es un agonista del receptor de amilina. Es aproximadamente 14 veces menos activo sobre el receptor de calcitonina.
La estructura química de la pramlintida se presenta a continuación y también en la Figura 1.
Figure imgf000002_0001
La pramlintida es químicamente inestable a pH neutro y, por lo tanto, se proporciona en una solución ácida. En comparación con la amilina humana, los aminoácidos en las posiciones 25, 28 y 29 en pramlintida se sustituyen con prolina. Esta modificación reduce la tendencia de la proteína a la fibrilogénesis. La pramlintida tiene una vida media en plasma muy corta y, por lo tanto, debe inyectarse dos o tres veces al día.
Los documentos WO2010046357 y WO2009034119 describen polipéptidos que comprenden análogos de amilina que tienen un residuo de unión a albúmina (llamados derivados de amilina en el mismo). Aunque estos polipéptidos con restos de unión a albúmina muestran propiedades farmacocinéticas (PK) o farmacodinámicas (PD) mejoradas en comparación con la pramlintida, aún pueden mostrar una estabilidad física pobre bajo ciertas condiciones.
El documento WO2011064282 se refiere a un proceso para fabricar polipéptidos en una cepa de levadura genéticamente modificada, que describe específicamente un precursor para crear un compuesto de Pramlintida con una amida C-terminal.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la Fórmula (I):
Xaa1-Cys- Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa14-Phe-Leu- Xaa17-Xaa18-Ser-Ser- Xaa21- Xaa22- Phe-Gly- Pro- Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser- Xaa35-Thr-Pro
en donde
Xaa1 se elimina o se selecciona independientemente de Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser y Lys;
Xaa3 se selecciona independientemente de Gly, His, Arg, Ser y Asn;
Xaa14 se selecciona independientemente de Glu;
Xaa17 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys y Val;
Xaa18 se selecciona independientemente de Arg, Lys e His;
Xaa21 se selecciona independientemente de Ala, Lys, Gln, Ser y Asn;
Xaa22 se selecciona independientemente de Glu, Gln, Ser, Thr y Asn;
Xaa26 se selecciona independientemente de Pro, Arg e Ile;
Xaa31 se selecciona independientemente de Ser, Glu, Asp y Asn;
Xaa35 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys, Asp, Gln y Glu;
en donde el C-terminal del polipéptido es una amida;
y en donde el C-terminal puede, opcionalmente, derivarse;
y en donde el polipéptido es un agonista del receptor de amilina.
Opcionalmente, el polipéptido tiene una EC50 en un ensayo de potencia del receptor de amilina humana, tal como el que se describe en la presente descripción, de aproximadamente 1800 pM o menos. Opcionalmente, el polipéptido tiene una EC50 en un ensayo de potencia del receptor de calcitonina humana, tal como el que se describe en la presente descripción, de aproximadamente 1800 pM o menos. Opcionalmente, el polipéptido tiene una solubilidad a pH 4 de aproximadamente 100 pM o más en un ensayo de solubilidad, tal como el que se describe en la presente descripción. Opcionalmente, el polipéptido tiene una solubilidad a pH 7 de aproximadamente 100 pM o más en un ensayo de solubilidad, tal como el que se describe en la presente descripción. Opcionalmente, el polipéptido tiene una estabilidad física de aproximadamente 25 horas o más en el ensayo de fibrilogénesis (también denominado ensayo de fibrilación), tal como el que se describe en la presente descripción. Opcionalmente, el polipéptido tiene al menos un sustituyente unido a al menos uno de sus residuos de aminoácidos.
Al menos en algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención tienen una solubilidad incrementada.
Al menos en algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención tienen una estabilidad física incrementada.
Al menos en algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención tienen una solubilidad y estabilidad física incrementada.
Al menos en algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención muestran un perfil farmacocinético ventajoso y/o un perfil farmacológico ventajoso. Un ejemplo de un perfil farmacocinético ventajoso es un perfil de acción prolongada.
La presente invención también se refiere a formulaciones farmacéuticas que comprenden los mismos. La presente invención también se refiere a usos farmacéuticos de la misma. La presente invención también se refiere al suministro (tal como la administración) de la misma a pacientes que necesitan del tratamiento de la misma.
En otro aspecto, la invención comprende además una composición farmacéutica que comprende el polipéptido anterior.
En otro aspecto, la invención comprende además un proceso para preparar una composición farmacéutica que comprende el polipéptido anterior.
En otro aspecto, la invención comprende además el polipéptido anterior para uso como un medicamento.
Los polipéptidos de la presente invención son ventajosos ya que poseen una solubilidad y/o estabilidad física mejoradas.
Los ensayos adecuados usados para determinar la potencia en los receptores de amilina y calcitonina, así como también para determinar la solubilidad y la estabilidad física de los polipéptidos, se describen en la presente descripción. Por ejemplo, ver Ensayo (II), (IV) y (III) respectivamente.
La figura 1 presenta una estructura.
La figura 2 presenta una estructura.
La figura 3 presenta una estructura.
La figura 4 presenta una estructura.
Definiciones
El término "amilina humana", como se usa en la presente descripción, se refiere al polipéptido de amilina humana que tiene la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 1. El término incluye, pero no se limita a, una hormona polipeptídica humana de 37 aminoácidos referida como amilina, que en la naturaleza se cosecreta con insulina de las células p del páncreas. La amilina humana tiene la siguiente secuencia primaria de aminoácidos:
Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 1)
La amilina humana tiene un puente disulfuro entre los dos residuos de Cys y un grupo amida C-terminal. Esta estructura se muestra a continuación y también en la Figura 4.
Figure imgf000004_0001
En la presente descripción, SEQ ID No: 1 y amilina humana se pueden usar indistintamente.
El término "pramlintida", como se usa en la presente descripción, se refiere al polipéptido sintético que tiene la secuencia como se representa en la SEQ ID NO 2. La pramlintida tiene la siguiente secuencia primaria de aminoácidos: Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 2)
La pramlintida tiene un puente disulfuro entre los dos residuos de Cys y un grupo amida C-terminal. Esta estructura se muestra a continuación y también en la Figura 1.
Figure imgf000004_0002
En la presente descripción, SEQ ID No: 2 y pramlintida humana se pueden usar indistintamente.
El término "calcitonina" significa calcitonina de salmón o calcitonina humana.
El término "calcitonina de salmón" o "sCT" significa la secuencia de proteína nativa de calcitonina de salmón como se describe en Niall y otros (1969), Biochemistry vol 64, Figura 2. La calcitonina de salmón es un polipéptido que consiste en 32 aminoácidos. Tiene un puente disulfuro entre el primer y el séptimo aminoácido en el extremo amino terminal de la cadena polipeptídica, siendo el puente disulfuro esencial para su actividad biológica y un grupo de prolinamida en el aminoácido carboxilo terminal.
El término "calcitonina humana" significa la secuencia de proteína nativa de calcitonina humana como se describe en Niall y otros (1969), Biochemistry vol 64, Figura 2. La calcitonina humana es un polipéptido que consiste en 32 aminoácidos. Tiene un puente disulfuro entre el primer y el séptimo aminoácido en el extremo amino terminal de la cadena polipeptídica, siendo el puente disulfuro esencial para su actividad biológica y un grupo de prolinamida en el aminoácido carboxilo terminal.
El término "análogo de amilina" o "análogo de amilina", como se usa en la presente descripción, se refiere a una variante de la SEQ ID NO: 1.
El término "análogo de pramlintida" o "análogo de pramlintida", como se usa en la presente descripción, se refiere a una variante de la SEQ ID NO: 2.
Por ejemplo, dichas variantes incluyen, pero no se limitan a, una o más sustituciones y/o una o más deleciones y/o una o más adiciones de cualquiera de los residuos de aminoácidos para cualquier aminoácido natural o no natural, aminoácidos sintéticos o peptidomiméticos y/o la unión de un sustituyente a cualquiera de los aminoácidos naturales o no naturales, aminoácidos sintéticos o peptidomiméticos en cualquier posición disponible.
La variante puede tener el mismo número de residuos de aminoácidos que la pramlintida (es decir, 37). Alternativamente, la variante puede comprender menos residuos de aminoácidos que la pramlintida. Alternativamente, la variante puede comprender más residuos de aminoácidos que la pramlintida. En algunas modalidades, la variante tiene el mismo número de residuos de aminoácidos que la pramlintida (es decir, 37). En algunas modalidades, la variante incluye sustituciones de cualquiera de los residuos de aminoácidos por cualquier aminoácido natural o no natural, aminoácidos sintéticos o peptidomiméticos y/o la unión de un sustituyente a cualquiera de los aminoácidos naturales o no naturales, aminoácidos sintéticos o peptidomiméticos en cualquier posición disponible.
El polipéptido puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos. Por lo tanto, para algunas modalidades, el número de sustituciones de aminoácidos en el análogo de amilina puede ser al menos uno. Preferentemente, el número de sustituciones amino está entre uno y quince, con mayor preferencia entre uno y doce, con mayor preferencia entre uno y diez, con mayor preferencia entre uno y cinco, con mayor preferencia entre uno y tres.
El número de inserciones, adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos puede ser al menos 1, pero hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones, adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos pueden estar. La sustitución o adición puede ser con cualquier aminoácido natural o no natural, aminoácidos sintéticos, peptidomiméticos u otros compuestos químicos. La adición o deleción de residuos de aminoácidos puede tener lugar en el N-terminal del péptido y/o en el C-terminal del péptido.
Cuando se usa en la presente descripción el término "aminoácido natural" es un aminoácido (con los códigos habituales de tres letras & códigos de una letra entre paréntesis) seleccionados del grupo que consiste en: Glicina (Gly & G), prolina (Pro & P), alanina (Ala & A), valina (Val & V), leucina (Leu & L), isoleucina (Ile & I), metionina (Met & M), cisteína (Cys & C), fenilalanina (Phe & F), tirosina (Tyr & Y), triptófano (Trp & W), histidina (His & H), lisina (Lys & K), arginina (Arg & R), glutamina (Gln & Q), asparagina (Asn & N), ácido glutámico (Glu & E), ácido aspártico (Asp & D), serina (Ser & S) y treonina (Thr & T). Si, debido a errores de escritura, hay desviaciones de los códigos de uso común, se aplican los códigos de uso común. Los aminoácidos presentes en los polipéptidos de la presente invención son, preferentemente, aminoácidos que pueden codificarse por un ácido nucleico.
Si el análogo contiene más de 37 residuos de aminoácidos o menos de 37 residuos de aminoácidos, la persona experta aún puede alinear esa secuencia con la secuencia de pramlintida (SEQ ID No. 2) para determinar el número de ubicación del correspondiente respectivo residuo de aminoácido. Un programa de alineamiento adecuado es "needle", que es un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo para el programa de alineamiento se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453.
En la secuencia de numeración de la SEQ ID No: 2, y de acuerdo con la práctica establecida en la técnica, al residuo de aminoácido en el N-terminal (Lys) se le asigna núm. 1 y los residuos de aminoácidos subsecuentes se numeran consecutivamente, terminando en el C-terminal con el núm. de tirosina asignado. 37. Por lo tanto, en general, cualquier referencia en la presente descripción al número de la posición de un residuo de aminoácido proporciona su ubicación en una secuencia de 37 aminoácidos; dicha secuencia de 37 aminoácidos siendo un análogo de pramlintida. Por ejemplo, una referencia a un análogo modificado en la posición 14 puede referirse a un análogo en donde se ha modificado el 14to residuo amino de los 37 aminoácidos en el análogo.
En otras palabras, la numeración de la secuencia de aminoácidos del análogo proporciona la posición de cada análogo con respecto a una secuencia de 37 aminoácidos, en donde la numeración es consecutiva y ascendente en la dirección del N-terminal al C-terminal.
Los análogos pueden describirse por referencia al número del residuo de aminoácido en pramlintida o amilina humana que se modifica, es decir, por su posición, y la naturaleza de la modificación. Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura apropiada de los análogos.
Por ejemplo:
[Pro37]-pramlintida designa un análogo de la SEQ ID No: 2 (pramlintida) en donde el cambio de pramlintida es la sustitución de Tyr en la posición 37 con Pro.
[Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintida designa un análogo de la SEQ ID No: 2 (pramlintida), en el que la Asn en la posición 14 ha sido sustituida con Glu, la Val en la posición 17 ha sido sustituida con Arg, y la Tyr en la posición 37 ha sido sustituida con Pro.
Como un ejemplo adicional, des1 (o Des1) con relación a un análogo de pramlintida se refiere a un análogo en el que se ha eliminado el aminoácido N-terminal, Lisina. Un análogo de pramlintida, donde se ha eliminado el aminoácido N-terminal, también se puede designar des 1 pramlintida.
[Pro25,Pro28,Pro29]-amilina humana designa un análogo de la SEQ ID NO: 1 (amilina humana) en donde las modificaciones de la amilina humana son que la Ala en la posición 25 y las Cys en las posiciones 28 y 29 han sido sustituidos con Pro . Este polipéptido es pramlintida. En consecuencia, se entenderá que la pramlintida es un análogo de la amilina humana. Por lo tanto, 'análogos de pramlintida' y 'análogos de amilina' pueden usarse indistintamente.
Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los residuos de aminoácidos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son completamente equivalentes.
Las expresiones "conforme a", "corresponde a", "una posición equivalente a" o "posición correspondiente", como se usa en la presente descripción, se pueden usar para caracterizar el sitio de modificación en un análogo de pramlintida por referencia a la SEQ ID No: 2. Las posiciones equivalentes o correspondientes se deducen fácilmente, por ejemplo por simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "needle" que se basa en un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa align por Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -0,5.
El polipéptido puede comprender uno o más sustituyentes en uno o más de los residuos de aminoácidos. Tales polipéptidos también pueden denominarse derivados de pramlintida o derivados de amilina.
El término "sustituyente", como se usa en la presente descripción, significa cualquier resto adecuado unido, en particular unido covalentemente, a un residuo de aminoácido, en particular a cualquier posición disponible en un residuo de aminoácido. Típicamente, el resto adecuado es un resto químico.
Para algunas modalidades el sustituyente comprende un enlazador.
Para algunas modalidades, el polipéptido tiene un sustituyente en un residuo de aminoácido, cuyo residuo de aminoácido es el residuo de aminoácido en el residuo N-terminal o el residuo de aminoácido es una Lisina.
Para algunas modalidades, el polipéptido tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo a(alfa)-amino del residuo de aminoácido N-terminal.
Para algunas modalidades, el residuo de aminoácido N-terminal es Lisina y el polipéptido tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo £(épsilon)-amino del residuo amino de lisina.
Para algunas modalidades, el polipéptido se extiende mediante la adición de un residuo de lisina en el N-terminal y el polipéptido tiene un sustituyente en el resto de aminoácido N-terminal unido a través del grupo £-amino del residuo amino de lisina.
Para algunas modalidades, el polipéptido se extiende mediante la adición de un residuo de aminoácido en el N-terminal y el polipéptido tiene un sustituyente en el residuo de aminoácido N-terminal unido a través del grupo aamino del residuo de aminoácido N-terminal.
Como se usa en la presente descripción, el término "hidrocarbilo" se refiere a un grupo que comprende al menos carbono e hidrógeno que puede comprender opcionalmente uno o más sustituyentes adecuados. Los ejemplos de tales sustituyentes pueden incluir un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cíclico. Además de la posibilidad de que los sustituyentes sean un grupo cíclico, una combinación de sustituyentes puede formar un grupo cíclico. Si el grupo hidrocarbilo comprende más de un átomo de carbono, entonces esos átomos de carbono no necesitan estar necesariamente unidos entre sí. Por ejemplo, al menos dos de los átomos de carbono pueden estar unidos mediante un átomo o grupo adecuado. Por lo tanto, el grupo hidrocarbilo puede contener heteroátomos. Los heteroátomos adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, azufre, nitrógeno, oxígeno, fósforo y silicio. En una modalidad, el grupo hidrocarbilo se selecciona del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo heteroarilo o un grupo cicloalquilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos de tales sustituyentes pueden incluir un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
Como se usa en la presente descripción, el término "alquilo" incluye tanto grupos alquilo saturados de cadena lineal como ramificados que pueden estar sustituidos (mono o poli) o no sustituidos. Preferentemente, el grupo alquilo es un grupo alquilo C1-20, con mayor preferencia un C1-15, con mayor preferencia un grupo alquilo C1-10, con mayor preferencia un grupo alquilo C1-8, con mayor preferencia un grupo alquilo C1-6. Los grupos alquilo particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /so-propilo, n-butilo, sec-butilo, /so-butilo, fert-butilo, npentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
Como se usa en la presente descripción, el término "cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico que puede estar sustituido (mono o poli) o no sustituido. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
Como se usa en la presente descripción, el término "alquenilo" se refiere a una cadena de carbono que contiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono, que pueden ser ramificados o no ramificados, y sustituidos (mono o poli) o no sustituidos. Preferentemente el grupo alquenilo es un grupo alquenilo C2-20, con mayor preferencia un grupo alquenilo C2-15, con mayor preferencia un grupo alquenilo C2-10, con mayor preferencia un grupo alquenilo C2-8, o con mayor preferencia un grupo alquenilo C2-6. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
Como se usa en la presente descripción, el término "alquinilo" se refiere a una cadena de carbono que contiene uno o más triples enlaces carbono-carbono, que pueden ser ramificados o no ramificados, y sustituidos (mono o poli) o no sustituidos. Preferentemente el grupo alquinilo es un grupo alquinilo C2-20, con mayor preferencia un grupo alquinilo C2-15, con mayor preferencia un grupo alquinilo C2-10, con mayor preferencia un grupo alquinilo C2-8, o con mayor preferencia un grupo alquinilo C2-6. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
Como se usa en la presente descripción, el término "arilo" se refiere a un grupo aromático C6-10 que puede estar sustituido (mono o poli) o no sustituido. Los ejemplos típicos incluyen fenilo y naftilo, etc. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
Como se usa en la presente descripción, el término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo como se definió anteriormente que contiene uno o más heteroátomos. Los heteroátomos adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, azufre, nitrógeno, oxígeno, fósforo y silicio. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo hidroxi, alquilo, halo, alcoxi, haloalquilo, haloalcoxi, amino, aminoalquilo o cicloalquilo.
El término "enlazador" como se usa en la presente descripción incluye sustituyentes adecuados que pueden unir un resto, tal como un resto químico, al polipéptido, tal como la cadena principal del polipéptido. Por lo tanto, el enlazador y el resto químico se convierten en un sustituyente juntos. El resto unido al enlazador puede ser cualquier resto adecuado. Los ejemplos incluyen un resto de unión a albúmina.
En una modalidad, el resto de unión a albúmina tiene de 6 a 40 átomos de carbono, de 8 a 26 átomos de carbono o de 14 a 22 átomos de carbono, por ejemplo 16, 17, 18, 19, 20 átomos de carbono.
En otra modalidad el resto de unión a albúmina es un grupo acilo seleccionado del grupo que comprende CH3(CH2)rCO-, en donde r es un número entero de 4 a 38, preferentemente un número entero de 4 a 24, con mayor preferencia seleccionado del grupo que comprende CH3(CH2)6CO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)16CO-, CH3(CH2)18CO-, CH3(CH2)20CO- y CH3(CH2)22CO-.
En una modalidad, el resto de unión a albúmina comprende un grupo que puede cargarse negativamente a pH 7,4.
En una modalidad, el resto de unión a albúmina comprende un grupo de ácido carboxílico, tal como HOOC(CH2)sCO-, en donde s es un número entero de 12 a 22. Preferentemente s es 16 o 18.
En una modalidad, el resto unido al enlazador es un resto de unión a albúmina.
Por ejemplo, el enlazador puede comprender uno o dos aminoácidos que en un extremo se unen al resto, tal como un resto de unión a albúmina, y en el otro extremo se unen a cualquier posición disponible en la cadena principal del polipéptido.
En algunas modalidades, el enlazador proporciona un puente o enlace entre un grupo amino en la cadena principal del polipéptido y un grupo acilo en el resto, tal como un resto de unión a albúmina. El enlazador puede estar unido o cerca del residuo de aminoácido N terminal. Preferentemente, el enlazador está unido al aminoácido en la posición 1 del análogo de pramlintida.
Otro ejemplo de un enlazador es una combinación de al menos un aminoácido y una amina.
En una modalidad, preferentemente la amina es el grupo OEG, en donde la fórmula de OEG se muestra a continuación:
Figure imgf000008_0001
Para algunas modalidades, preferentemente el enlazador se selecciona del grupo que consiste en yGlu, yGlu-yGlu, yGluyGlu-yGlu, yGlu-yGlu-yGlu-yGlu, Glu, Glu-Glu, Glu-yGlu, Glu-Arg, Glu-Glu-Arg, His, His-His, His-yGlu, His-His-yGlu, Gly, Gly-yGlu, Ser, Ser-yGlu, D-Arg-D-Arg, Arg, Arg-Arg, Arg-Arg-yGlu, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser-yGlu, Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly and Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-yGlu, yGlu-OEG, yGlu-2xOEG y OEG, preferentemente el enlazador se selecciona de yGlu, yGlu-yGlu, yGlu-OEG, yGlu-2xOEG y OEG, con mayor preferencia el enlazador es yGlu-yGlu.
El enlazador puede contribuir a y/o potenciar el efecto de unión del resto (por ejemplo, el resto de unión a albúmina), por ejemplo, un enlazador que comprende yGlu puede potenciar el efecto de unión a albúmina del polipéptido.
Al usar el término "yGlu "o" gGlu "o gammaGlu o gamma-L-Glu se entiende un aminoácido con la siguiente estructura (también se muestra en la Figura 2):
Figure imgf000008_0002
el grupo a-nitrógeno y el y-carboxi forman los enlaces amida a los dos residuos vecinos
Al usar el término "yGlu-yGlu " se entiende un resto con la siguiente estructura:
Figure imgf000008_0003
Al usar el término "yGlu-OEG " se entiende un resto con la siguiente estructura:
Figure imgf000008_0004
Al usar el término "yGlu-OEG-OEG " se entiende un resto con la siguiente estructura:
Figure imgf000009_0001
El término "grupo épsilon amino" o "grupo £-amino", como se usa en la presente descripción en relación con la lisina, se refiere al grupo amino en la 6ta posición, usando las convenciones de numeración estándar de IUPAC.
El término "grupo alfa amino" o "grupo a-amino" se refiere al grupo amino en la 2da posición, usando las convenciones de numeración estándar de IUPAC. Nos referimos a la siguiente estructura (también se muestra en la Figura 3).
Figure imgf000009_0002
El término "resto de unión a albúmina", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier grupo químico capaz de unirse a la albúmina, es decir, tiene afinidad de unión a la albúmina. En una modalidad, el resto de unión a albúmina es un grupo acilo.
En algunas modalidades, preferentemente el resto de unión a albúmina es un grupo acilo seleccionado de:
(a) CHa(CH2)rCO-, en donde r es un número entero de 4 a 24;
(b) HOOC(CH2)sCO-, en donde s es un número entero de 14 a 20, por ejemplo 16 o 18.
La "afinidad de unión a la albúmina" puede determinarse por varios métodos conocidos en la técnica. En un método, el compuesto a medir se radiomarca con, por ejemplo, 125I o 3H y se incuban con albúmina inmovilizada (Kurtzhals y otros, Biochem.J., 312, 725-731 (1995)). Se calcula la unión del compuesto con relación a un estándar. En otro método, un compuesto relacionado se radiomarca y su unión a la albúmina inmovilizada, por ejemplo, en perlas de SPA, compite con una serie de diluciones del compuesto a medir. El valor EC50 para la competencia es una medida de la afinidad del compuesto. En un tercer método, la afinidad o potencia del receptor de un compuesto se mide a diferentes concentraciones de albúmina, y el cambio en la afinidad o potencia relativa del compuesto en función de la concentración de albúmina refleja su afinidad por la albúmina.
Los polipéptidos de la presente invención exhiben buena potencia. El término "potencia" se usa para describir el efecto de un compuesto dado en ensayos donde se ha establecido una relación sigmoidal entre la concentración logarítmica y el efecto de un compuesto. Además, la respuesta debe ser variable de 0 a 100 %. EC(concentración efectiva)50 puede usarse para describir la concentración de un compuesto dado que produce una respuesta del 50 % en el ensayo, tal como en el ensayo funcional.
Los polipéptidos de la presente invención exhiben buena actividad. El término "actividad" se refiere a la capacidad de reducir el apetito y/o aumentar la saciedad. La actividad se puede medir por la capacidad de reducir el apetito como, por ejemplo, se describe en el Ensayo (I) en la presente descripción.
Los polipéptidos de la presente invención exhiben buena estabilidad física. El término “estabilidad física” de un polipéptido de acuerdo con la invención, o una formulación del mismo se refiere a la tendencia del polipéptido a no formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de exponer a estrés termo-mecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies e interfaces hidrofóbicas. La estabilidad física de las formulaciones de polipéptidos acuosos puede evaluarse por medio de inspección visual, ensayo de fibrilación ThT (a veces denominado ensayo de fibrilogénesis ThT) y/o mediciones de turbidez como se describe en otra parte de la presente descripción. La inspección visual de las formulaciones se realiza en una luz nítida enfocada con un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza por una puntuación visual que clasifica el grado de turbidez, por ejemplo, en una escala de 0 a 3 (una formulación que no muestra turbidez corresponde a una puntuación visual de 0 y una formulación que muestra turbidez visual a la luz del día corresponde a una puntuación visual de 3). Una formulación se clasifica inestable físicamente con respecto a la agregación de proteínas, cuando muestra turbidez visual a la luz del día. Alternativamente, la turbidez de la formulación puede evaluarse mediante mediciones simples de turbidez bien conocidas por los expertos.
Los polipéptidos de la presente invención exhiben buena estabilidad química. El término "estabilidad química" de un polipéptido de acuerdo con la invención o de una formulación del mismo se refiere a la ausencia de cambios covalentes químicos en la estructura del polipéptido, evitando así la formación de productos de degradación química con una potencia potencialmente menor y/o propiedades inmunogénicas potencialmente aumentadas en comparación con la estructura del polipéptido original (nativo). Pueden formarse diversos productos de degradación química en dependencia del tipo y la naturaleza del polipéptido parental y del entorno al que se expone el polipéptido. La eliminación de la degradación química puede probablemente no evitarse completamente y a menudo se observan cantidades aumentadas de productos de degradación química durante el almacenamiento y el uso de las formulaciones polipeptídicas como es bien conocido por el experto en la técnica. La mayoría de los polipéptidos son propensas a la desamidación, un proceso en el que se hidroliza el grupo amida de la cadena lateral en residuos glutaminilo o asparaginilo para formar un ácido carboxílico libre. Otras rutas de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular donde dos o más moléculas de polipéptidos se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de productos de degradación de dímeros, oligómeros y polímeros unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, Nueva York 1992). La oxidación (de, por ejemplo, residuos de metionina) puede mencionarse como otra variante de la degradación química. La estabilidad química de la formulación de polipéptidos puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos momentos después de la exposición a diferentes condiciones ambientales (a menudo la formación de productos de degradación puede acelerarse, por ejemplo, mediante el aumento de la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual a menudo se determina por separación de los productos de degradación en dependencia del tamaño de la molécula y/o la carga mediante el uso de diversas técnicas de cromatografía (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC).
El término "formulación estabilizada" se refiere a una formulación con estabilidad física aumentada, estabilidad química aumentada o estabilidad física y química aumentadas en comparación a una solución acuosa del polipéptido.
Descripción de la invención
La siguiente descripción de la invención incluye la descripción de modalidades y aspectos que no deben interpretarse como una descripción de la invención reivindicada. per se, pero que puede servir como ayuda adicional para comprender la invención reivindicada y sus modificaciones.
Aspectos generales
En la presente descripción se describen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es un análogo de la SEQ ID NO: 2 en donde:
(a) dicho análogo comprende un residuo de prolina en la posición 37;
(b) dicho análogo comprende un residuo de ácido glutámico en la posición 14;
(c) dicho análogo comprende un residuo de histidina o arginina en la posición 17;
en donde la numeración de la secuencia de aminoácidos del análogo corresponde a la secuencia de numeración de aminoácidos de la SEQ ID No: 2; y
opcionalmente, el polipéptido tiene al menos un sustituyente unido a al menos uno de sus residuos de aminoácidos.
La presente invención se refiere a polipéptidos de acuerdo con la Fórmula (I):
Xaa1-Cys-Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa-M-Phe-Leu-Xaa17-Xaa18-Ser-Ser-Xaa21-Xaa22-Phe-Gly-Pro-Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser-Xaa35-Thr-Pro;
Fórmula (I) (SEQ ID No: 3)
en donde
Xaa1 se elimina o se selecciona independientemente de Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser y Lys;
Xaa3 se selecciona independientemente de Gly, His, Arg, Ser y Asn;
Xaa14 se selecciona independientemente de Glu y Asn;
Xaa17 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys y Val;
Xaa18 se selecciona independientemente de Arg, Lys e His;
Xaa21 se selecciona independientemente de Ala, Lys, Gln, Ser y Asn;
Xaa22 se selecciona independientemente de Glu, Gln, Ser, Thr y Asn;
Xaa26 se selecciona independientemente de Pro, Arg e Ile;
Xaa31 se selecciona independientemente de Ser, Glu, Asp y Asn;
Xaa35 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys, Asp, Gln y Glu;
en donde el C-terminal del polipéptido es una amida;
en donde el C-terminal puede derivarse opcionalmente; y
en donde el polipéptido es un agonista del receptor de amilina.
El polipéptido de la invención puede comprender un residuo en la posición 17 que es histidina o arginina, preferentemente arginina.
El polipéptido de la invención puede comprender un residuo en la posición 35 que se selecciona independientemente de cualquiera de histidina, asparagina, glutamina y ácido glutámico; preferentemente histidina, glutamina y asparagina; con mayor preferencia asparagina.
El polipéptido de la invención puede comprender un residuo de aminoácido en la posición 14 que es ácido glutámico y un residuo en la posición 17 que es arginina.
El polipéptido de la invención puede comprender al menos un sustituyente unido a al menos un residuo de aminoácido de dicho polipéptido. Este grupo sustituyente puede seleccionarse de cualquiera de los grupos sustituyentes presentados en la tabla 1. El grupo sustituyente puede estar unido al grupo a-amino del residuo de aminoácido N-terminal o a un residuo de Lys.
Un derivado del polipéptido de la invención puede comprender un enlazador yGIu unido al N-terminal de dicho polipéptido y HOOC(CH2)18CO o HOOC(CH2)16CO- como el residuo de unión a albúmina, y puede tener una secuencia de polipéptidos que comprende:
a. una Glu en la posición 14,
b. una His o una Arg en la posición 17 y
c. una Pro en la posición 37.
El polipéptido de la invención puede ser cualquiera de los polipéptidos presentados en la Tabla 9. El polipéptido puede ser N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14, Arg17, Pro37]-pramlintida. El polipéptido puede ser N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14, His17, Pro37]-pramlintida.
Algunas ventajas
Los polipéptidos de la presente invención pueden exhibir una estabilidad física mejorada.
Los polipéptidos de la presente invención pueden exhibir una solubilidad mejorada.
Los polipéptidos de la presente invención pueden exhibir tanto estabilidad física como solubilidad mejoradas.
Algunos aspectos preferidos
En la presente descripción se presentan ensayos adecuados para medir la unión y la potencia, la solubilidad y la estabilidad física del receptor de amilina humana (por ejemplo, véanse los Ensayos (II), (IV) y (III) respectivamente).
Preferentemente Xaa14 es Glu.
Preferentemente Xaa17 es His o Arg; con mayor preferencia Arg.
Preferentemente Xaa35 es Asn o Gln; con mayor preferencia Asn
Preferentemente Xaa14 es Glu y Xaa17 es Arg.
Preferentemente Xaa14 es Glu y Xaa17 es His.
En una modalidad preferida, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es un análogo de la SEQ ID No: 2 es de la Fórmula (I) en donde:
Xaa1 es Lys;
Xaa3 es Asn;
Xaa14 es Glu
Xaa17 es His o Arg;
Xaa18 es His;
Xaa21 es Asn;
Xaa22 es Asn;
Xaa26 es Ile;
Xaa31 es Asn;
Xaa35 es Asn.
En una modalidad preferida, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es un análogo de la SEQ ID No: 2 es de la Fórmula (I) en donde:
Xaa1 se elimina o se selecciona independientemente de His, Arg y Lys;
Xaa3 se selecciona independientemente de Gly, His y Asn;
Xaa-M se selecciona independientemente de Glu y Asn;
Xaa17 se selecciona independientemente de His, Arg y Val;
Xaa18 se selecciona independientemente de Arg e His;
Xaa21 se selecciona independientemente de Ser y Asn;
Xaa22 es Asn;
Xaa26 es Ile;
Xaa31 se selecciona independientemente de Glu y Asn;
Xaa35 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys, Asp, Gln y Glu.
En una modalidad preferida, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es un análogo de la SEQ ID No: 2 es de la Fórmula (I) en donde:
Xaa1 se elimina o se selecciona independientemente de Gly, His, Arg, Ser y Lys;
Xaa3 se selecciona independientemente de His y Asn;
Xaa14 se selecciona independientemente de Glu y Asn;
Xaa17 se selecciona independientemente de His, Arg y Val;
Xaa18 se selecciona independientemente de Arg e His;
Xaa21 se selecciona independientemente de Gln, Ser y Asn;
Xaa22 es Asn;
Xaa26 se selecciona independientemente de Pro e Ile;
Xaa31 es Asn;
Xaa35 es Asn.
En una modalidad, el C-terminal puede derivarse.
En una modalidad, el C-terminal del polipéptido puede terminarse como un ácido o una amida. En un aspecto, el C-terminal del polipéptido es una amida.
En una modalidad, el C-terminal se deriva con una amida de la Fórmula (II):
(II) C(O)NR1R2
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de H y alquilo. Preferentemente R1 y R2 son ambos H.
En una modalidad, los polipéptidos de la presente invención pueden tener un sustituyente unido a cualquier posición disponible en uno o más de los residuos de aminoácidos. Los ejemplos de sustituyentes incluyen restos químicos directamente unidos a uno o más de los residuos de aminoácidos, o restos químicos indirectamente unidos a uno o más de los residuos de aminoácidos por medio de un enlazador. Los puntos de unión disponibles serán conocidos por la persona experta. Los ejemplos de puntos de unión disponibles incluyen el N-terminal del polipéptido, el C-terminal del polipéptido, un grupo épsilon-amino de un residuo de Lisina, el grupo hidroxilo de un residuo de serina, tirosina o treonina, el grupo amida de un residuo de asparagina o glutamina, el grupo carboxilo de un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico, el grupo tiol de un residuo de cisteína. Preferentemente, el sustituyente se une al extremo N-terminal del polipéptido, o al grupo épsilon amino de un residuo de lisina.
En otra modalidad, el sustituyente se une al grupo amino N-terminal del polipéptido en donde el residuo de aminoácido N-terminal corresponde a la posición 1 del análogo de la SEQ ID No: 2.
En otra modalidad, el sustituyente se une al grupo épsilon amino de un residuo de lisina en la posición 1 del análogo de la SEQ ID No: 2.
En una modalidad, el sustituyente se selecciona de un grupo sustituyente hidrocarbilo, un grupo hidroxilo y un átomo de halógeno. Los ejemplos de átomos de halógeno adecuados incluyen F, Cl, Br e I. Preferentemente, el sustituyente es un grupo sustituyente hidrocarbilo.
En otra modalidad, el grupo sustituyente hidrocarbilo es un grupo alquilo, o un grupo de la Fórmula (III):
(III) Ln-Y
en donde
L es un enlazador;
n = 0 o 1
Y es un resto químico, como un resto de unión a albúmina.
En una modalidad, el enlazador comprende de 1 a 10 aminoácidos. El enlazador puede comprender además aminas.
Los ejemplos de aminas adecuadas incluyen: -C(O)-(CH2)l-O -[C H 2CH2-O]m-(CH 2)p-[NHC(O)-(CH2)l-O -[(C H 2)n-O]m-(CH 2)p]q-N H -en donde l, m, n y p independientemente son 1-7, y q es 0-5.
Por ejemplo, el enlazador puede comprender una amina seleccionada de: -C(O)-CH2-O - CH2- CH2-O -C H 2-CH 2-NH- ; y -C(O)-CH2-O -C H 2-CH2-O -C H 2- CH2-[NHC(O)-CH2-O -C H 2-CH2-O -C H 2-CH 2- ] 1-NH-; y -C(O)-(CH2)2-O -[CH2CH2-O]7-(CH2)2-NH-.
En otra modalidad, el enlazador es una combinación de residuos de aminoácidos y las aminas mencionadas anteriormente, por ejemplo:
yGlu-C(O)-CH2-O -C H 2-C H 2-O -C H 2-C H 2-[NHC(O)-CH2-O -C H 2-C H 2- O - CH2- CHH 1 -NH-; o Arg-Arg-y Glu-C(O)-CH2-O -C H 2-CH 2-O -C H 2- CH2-[NHC(O)-CH2-O -C H 2-C H 2-O - CH2- CH2- ] 1-NH-. En algunas modalidades, n = 1 y L se selecciona del grupo que consiste en yGlu, yGlu-yGlu, yGlu-yGlu-yGlu, yGlu-yGluyGlu-yGlu, Glu, Glu-Glu, Glu-yGlu, Glu-Arg, Glu-Glu-Arg, His, His-His, His-yGlu, His-His-yGlu, Gly, Gly-yGlu, Ser, SeryGlu, D-Arg-D-Arg, Arg, Arg-Arg, Arg-Arg-yGlu, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser-yGlu, Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly y Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-yGlu, yGlu-OEG, yGlu-OEG-OEG y OEG.
En algunas modalidades, n = 1 y L se selecciona de yGlu, yGlu-yGlu, yGlu-OEG, yGlu-OEG-OEG y OEG, con mayor preferencia el enlazador es yGlu-yGlu.
En otra modalidad, n = 0; en consecuencia, no hay enlazador entre los residuos de aminoácidos de la cadena principal del polipéptido y el resto químico, Y es decir, Y se une a una posición disponible en la cadena principal del polipéptido.
En una modalidad, Y es un resto de unión a albúmina.
En una modalidad, el resto de unión a albúmina es un grupo acilo.
Preferentemente, el resto de unión a albúmina es HOOC(CH2)sCO-, en donde s es un número entero de 12 a 22. Con mayor preferencia, s es un número entero de 14 a 20, por ejemplo 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Con mayor preferencia s es de 16 a 18. Con mayor preferencia s es 18.
En una modalidad, el polipéptido comprende un enlazador yGlu unido al terminal N del análogo de amilina y HOOC(CH2)18CO o HOOC(CH2)16CO- como el residuo de unión a albúmina y donde la secuencia del análogo de amilina comprende Glu en la posición 14, His o Arg en la posición 17, His en la posición 35 o Pro en la posición 37 en comparación con la SEQ iD NO: 2.
En otra modalidad, el grupo sustituyente y/o grupo de la fórmula (III) se selecciona de los siguientes grupos presentados en la Tabla 1.
Tabla 1
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Figure imgf000014_0003
Preferentemente, los polipéptidos de la presente invención comprenden un sustituyente.
Preferentemente, los polipéptidos de la presente invención tienen un sustituyente unido al grupo amino N-terminal del polipéptido, en donde el residuo de aminoácido N-terminal corresponde a la posición 1 del análogo de la SEQ ID No: 2.
Preferentemente el sustituyente es:
Figure imgf000014_0001
Preferentemente el sustituyente
Figure imgf000014_0002
se une al grupo amino N-terminal del polipéptido.
Para las modalidades que comprenden un resto de unión a albúmina, los polipéptidos de la presente invención pueden exhibir un perfil farmacocinético prolongado y buenas propiedades farmacodinámicas. Por lo tanto, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención no tienen que inyectarse con tanta frecuencia como los productos de amilina conocidos.
Además, los polipéptidos de la invención proporcionan una reducción en la ingesta de alimentos. La reducción en la ingesta de alimentos es superior a los productos de amilina conocidos.
En una modalidad, el resto de unión a albúmina se une no covalentemente a la albúmina. Preferentemente, el resto de unión a albúmina tiene una afinidad de unión a la albúmina hacia la albúmina sérica humana que está por debajo de aproximadamente 10 pM o por debajo de aproximadamente 1 pM.
La Tabla 2 presenta una lista de compuestos que tienen una solubilidad de más de 100 j M a pH 4.
Tabla 2
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Figure imgf000016_0001
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Como se demostró en la sección de Ejemplos en la presente descripción, los polipéptidos presentados anteriormente tienen una solubilidad mayor o igual a 100 pM (micromolar) a pH 4.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 125 pM (micromolar) a pH 4.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 150 pM (micromolar) a pH 4.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 175 pM (micromolar) a pH 4.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 200 pM (micromolar) a pH 4.
En una modalidad, la solubilidad se mide en un ensayo de solubilidad, como se presenta en la presente descripción. La Tabla 3 presenta una lista de compuestos que tienen una solubilidad de más de 100 pM a pH 7.
Tabla 3
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000018_0001
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Como se demostró en la sección de Ejemplos en la presente descripción, los polipéptidos presentados anteriormente tienen una solubilidad mayor o igual a 100 pM (micromolar) a pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 125 pM (micromolar) a pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 150 pM (micromolar) a pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 175 pM (micromolar) a pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 200 pM (micromolar) a pH 7.
En una modalidad, la solubilidad se mide en un ensayo de solubilidad, como se presenta en la presente descripción. La Tabla 4 presenta una lista de compuestos que tienen una solubilidad de más de 100 pM a pH 4 y pH 7.
Tabla 4
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
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Como se demostró en la sección de Ejemplos en la presente descripción, los polipéptidos presentados anteriormente tienen una solubilidad mayor o igual a 100 pM (micromolar) a pH 4 y pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 125 pM (micromolar) a pH 4 y pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 150 pM (micromolar) a pH 4 y pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 175 pM (micromolar) a pH 4 y pH 7.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una solubilidad mayor o igual a 200 pM (micromolar) a pH 4 y pH 7.
En una modalidad, la solubilidad se mide en un ensayo de solubilidad, como se presenta en la presente descripción. La Tabla 5 presenta una lista de compuestos que tienen una estabilidad física mayor o igual a 25 horas en un ensayo de fibrilogénesis.
Tabla 5
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Como se demuestra en la sección de Ejemplos en la presente descripción, los polipéptidos presentados anteriormente tienen una estabilidad física de más de o igual a 25 horas en un ensayo de fibrilogénesis.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una estabilidad física mayo o igual a 30 horas.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una estabilidad física mayo o igual a 35 horas.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una estabilidad física mayo o igual a 40 horas.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen una estabilidad física mayo o igual a 45 horas.
En una modalidad, la estabilidad física se mide en un ensayo de fibrilogénesis como se presenta en la presente descripción.
La Tabla 6 presenta una lista de compuestos que tienen un valor de EC50 del receptor de amilina humana de 1800 pM (picomolar) o menos.
Tabla 6
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Como se demuestra en la sección de Ejemplos en la presente descripción, los polipéptidos presentados anteriormente tienen un valor de EC50 de amilina humana de 1800 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 1500 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 1200 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 1000 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 800 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 600 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 400 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 200 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 100 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 75 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de amilina humana de 60 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, la EC50 de amilina humana se mide en un ensayo como se presenta en la presente descripción. La Tabla 7 presenta una lista de compuestos que tienen un valor de EC50 del receptor de amilina humana de 1800 pM (picomolar) o menos.
Tabla 7
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Como se demuestra en la sección de Ejemplos en la presente descripción, los polipéptidos presentados anteriormente tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 1800 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 1500 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 1200 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 1000 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 800 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 600 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 400 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 200 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 100 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC50 de calcitonina humana de 80 pM (picomolar) o menos.
En una modalidad, la EC50 de calcitonina humana se mide en un ensayo como se presenta en la presente descripción.
La Tabla 8 presenta una lista de compuestos que tienen un valor de EC50 del receptor de amilina humano de 1800 pM (picomolar) o menos, una solubilidad de 150 pM o más a pH 7 y una estabilidad física de 25 horas o más en un ensayo de fibrilogénesis.
Tabla 8
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En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC.50 de amilina humana de 1800 pM (picomolar) o menos, y una solubilidad de más de 150 pM a pH 7, y una estabilidad física mayor o igual a 25 horas en un ensayo de fibrilogénesis.
En una modalidad, la EC50 de amilina humana, la solubilidad a pH 7 y la estabilidad física se miden en los ensayos que se presentan en la presente descripción.
La Tabla 9 presenta una lista de compuestos que tienen un valor de EC50 del receptor de amilina humano de 1800 pM (picomolar) o menos, una solubilidad de 200 pM o más a pH 7 y una estabilidad física de 45 horas o más en un ensayo de fibrilogénesis.
Tabla 9
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En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente descripción tienen un valor de EC.50 de amilina humana de 1800 pM (picomolar) o menos, y una solubilidad de más de 200 pM a pH 7, y una estabilidad física mayor o igual a 45 horas en un ensayo de fibrilogénesis.
En una modalidad, la EC50 de amilina humana, la solubilidad a pH 7 y la estabilidad física se miden en los ensayos que se presentan en la presente descripción.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito en la presente descripción tiene un perfil farmacocinético prolongado en comparación con la pramlintida medida por el Ensayo (IX) como se describe en la sección Ensayos. Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T1^ en plasma de al menos 30 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T1^ en plasma de al menos 40 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 50 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 60 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 70 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T% en plasma de al menos 75 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 80 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 85 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 90 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T ^ en plasma de al menos 95 horas.
Para algunas modalidades, el polipéptido descrito la presente descripción tiene una T 1^ en plasma de al m enos 100 horas.
Proceso
La producción de polipéptidos tales como amilina o análogos de la misma e s bien conocida en la técnica. Los polipéptidos de la invención pueden a sí producirse mediante síntesis clásica de polipéptidos, por ejemplo, síntesis de polipéptidos en fase sólida mediante el uso de química t-Boc o Fm oc u otras técnicas bien establecidas, v é a s e , por ejemplo, G reen e y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999. Los polipéptidos pueden a d e m á s producirse mediante un método que comprende cultivar una célula huésped que contiene una secu en cia de ADN que codifica los polipéptidos y e s ca p a z de expresar el polipéptido en un medio de nutrientes a d ecu ado bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido. Para los polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos no naturales, la célula recombinante d ebe modificarse de manera que los aminoácidos no naturales s e incorporen al polipéptido, por ejemplo mediante el uso de mutantes de ARNt.
Com posiciones farmacéuticas
En un aspecto, la invención s e refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las com posiciones son a d e cu a d a s para administración parenteral.
En una modalidad, el polipéptido está presente en la formulación a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml. En otro aspecto, el polipéptido está presente en la formulación a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml.
En otra modalidad, la formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. En otra modalidad, la formulación tiene un pH de 2,0 a 7,0. En otra modalidad, la formulación tiene un pH de 2,5 a 4,5. En otra modalidad, la formulación tiene un pH de 3,5 a 4,5.
Las com posiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, com o s e describe en Remington's Pharmaceutical Sc ien ces , 1985 o en Remington: The S c ie n ce and Practice of Pharmacy, 19 ma edición, 1995.
La formulación puede comprender, adem ás, un sistema tampón, conservante(s), agente(s) de isotonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y/o tensioactivos. El uso de tales excipientes en com posiciones farmacéuticas e s bien conocido por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The S c ie n ce and Practice of Pharmacy, 19 ma edición, 1995.
En una modalidad, la formulación farmacéutica e s una formulación acuosa, e s decir, una formulación que comprende agua. Tal formulación e s típicamente una solución o una suspensión. En una modalidad adicional de la invención, la formulación farmacéutica e s una solución acuosa.
El término “formulación a c u o s a ” s e define com o una formulación que comprende al m enos 50 % peso/peso de agua. Igualmente, el término “solución a c u o s a ” s e define como una solución que comprende al m enos 50 % p/p de a gua y el término “suspensión a c u o s a ” s e define com o una suspensión que comprende al m enos 50 % p/p de agua.
En otra modalidad, la formulación farmacéutica e s una formulación liofilizada, en la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes del uso. En otra modalidad, la formulación farmacéutica e s una formulación s e c a (por ejemplo, liofilizada o s e c a d a por atomización) lista para usar sin ninguna disolución previa.
Por el término "forma seca" s e entiende la composición farmacéutica líquida o formulación que s e s e c a ya s e a por s e c a d o por congelación (es decir, liofilización; v é a s e , por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol.
38:48-59), s e c a d o por aspersión (v é a s e Masters (1991) en Spray-Drying Handbook (5ta ed; Longman Scientific and Technical, E ssez , U.K.), pp. 491-676; Broadhead y otros (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; y Mumenthaler y otros (1994) Pharm. Res. 11:12-20), o s e c a d o al aire (Carpenter y Crow e (1988) Cryobiology 25:459-470; y R o ser (1991) Biopharm. 4:47-53).
En una modalidad adicional, el tampón s e selecciona del grupo que consiste en acetato, carbonato, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógeno fosfato, hidrógeno fosfato, fosfato y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, ácido láctico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o su s m ezclas. C a d a uno de estos tam pones específicos constituye una modalidad alternativa. En otra modalidad, la formulación comprende, adem ás, un conservante aceptable farmacéuticamente. En una modalidad adicional, la formulación comprende a d em á s un agen te isotónico, por ejemplo, propilenglicol, manitol o glicerol. En una modalidad adicional, la formulación comprende, adem ás, un agen te quelante.
En otra modalidad, la formulación comprende, adem ás, un estabilizante. El uso de un estabilizante en com posiciones farmacéuticas e s bien conocido por los expertos. Por conveniencia, s e ha ce referencia a Remington: The S c ie n ce and Practice of Pharmacy, 19 ma edición, 1995.
La formación de a g re g a d o s por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversam ente la actividad biológica de e s e polipéptido, lo que resulta en la pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. A dem ás, la formación de a gre g a d o s puede provocar otros problemas tales com o el bloqueo de tubos, membranas, o bom bas cuando la composición farmacéutica que contiene polipéptidos se administra mediante el uso de un sistema de infusión.
Las composiciones de la invención son com posiciones farmacéuticas líquidas estabilizadas cuyos com ponentes con actividad terapéutica incluyen un polipéptido que posiblemente exhibe formación de a g re ga d o s durante el almacenamiento en formulaciones farmacéuticas líquidas.
Por "formación de agregados" s e entiende una interacción física entre las moléculas polipeptídicas que resulta en la formación de oligómeros, que pueden p erm anecer solubles, o grandes a gre g a d o s visibles que precipitan de la solución.
Por "durante el almacenamiento" s e entiende una composición o formulación farmacéutica líquida, que una v e z preparada, no s e administra inmediatamente a un sujeto. Por el contrario, d e sp u é s de la preparación, s e e m p a ca para su almacenamiento, ya s e a en forma líquida, en estado congelado, o en forma s e c a para su posterior reconstitución en una forma líquida u otra forma a d ecu a d a para la administración a un sujeto.
Las com posiciones farmacéuticas pueden comprender, adem ás, una cantidad de una b a se de aminoácido suficiente para disminuir la formación de a g re ga d o s por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición.
Por "base de aminoácido" s e entiende un aminoácido o una combinación de aminoácidos, donde cualquier aminoácido dado está presente en su forma de b a se libre o en su forma de sal. Cu an do s e usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden presentarse en su s formas de b a se libre, todos pueden presentarse en sus formas de sal, o algunos pueden presentarse en su s formas de b a se libre, mientras otros s e presentan en sus formas de sal. En una modalidad, los aminoácidos usado s en la preparación de las com posiciones son aquellos que portan una ca d en a lateral cargada, tales com o arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. Cualquier estereoisóm ero (es decir, L, D o su s m ezclas) de un aminoácido particular (por ejemplo, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina y sus m ezclas) o combinaciones de estos estereoisómeros, puede presentarse en las com posiciones farmacéuticas siempre que el aminoácido particular esté presente en su forma de b a se libre o en su forma de sal. En una modalidad, s e usa el estereoisóm ero L. Las com posiciones también pueden formularse con derivados de esto s aminoácidos. Los derivados de arginina a d ecu ad o s incluyen, por ejemplo, aminoguanidina, ornitina y N-monoetil L-arginina, los derivados de metionina a d ecu ad o s incluyen etionina y butionina y los derivados de cisteína a d e cu a d o s incluyen S-metil-L cisteína. Al igual que con los otros aminoácidos, los derivados de aminoácidos s e incorporan en las com posiciones ya s e a en su forma de b a se libre o en su forma de sal. En otra modalidad, los aminoácidos o su s derivados de aminoácidos se usan en una concentración, que e s suficiente para evitar o retrasar la agregación de la proteína.
En otra modalidad, la formulación comprende, adem ás, un tensioactivo.
Es posible que puedan presentarse otros ingredientes en la formulación farmacéutica del polipéptido. Estos ingredientes adicionales pueden incluir a g en tes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, a g en tes de masa, modificadores de la tonicidad, a gen tes quelantes, iones metálicos, vehícu los oleaginosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina o proteínas) y un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal com o betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). T ales ingredientes adicionales, por supuesto, no deben afectar adversam ente la estabilidad general de la formulación farmacéutica.
Las com posiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento en varios sitios, por ejemplo, en sitios tópicos, por ejemplo, sitios de la piel y las m ucosas, en sitios que eluden la absorción, por ejemplo, administración en una arteria, en una vena, en el corazón y en sitios que implican absorción, por ejemplo, administración en la piel, debajo de la piel, en un músculo o en el abdomen.
La administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede realizarse a través de varias v ía s de administración, por ejemplo, lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estóm ago e intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo, a través de los bronquiolos y alvéolos o su combinación, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo a través de la conjuntiva, uretral, y parenteral a pacientes que necesitan dicho tratamiento.
Las com posiciones de la presente invención pueden administrarse en varias formas de dosificación, por ejemplo, com o soluciones, suspen sion es, emulsiones, microemulsiones, emulsiones múltiples, espum as, pomadas, pastas, yesos, ungüentos, tabletas, tabletas recubiertas, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina blanda, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, atomizadores, polvos, aerosoles, inhalantes, gotas para los ojos, ungüentos oftálmicos, enjuagues oftálmicos, pesarios vaginales, anillos vaginales, ungüentos vaginales, solución para inyección, soluciones transformadoras in situ, por ejemplo, gelificación in situ, colocación in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, solución de infusión, e implantes.
Las composiciones de la invención pueden combinarse adicionalmente, o unirse a, por ejemplo, a través de interacciones covalentes, hidrófobas y electrostáticas, un portador farmacéutico, sistema de administración de fármaco y sistema de administración de fármaco avanzado para mejorar adicionalmente la estabilidad del derivado de un análogo de amilina del mismo, aumentar la biodisponibilidad, aumentar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia bien conocida por los expertos en la técnica, y aumentar la obediencia del paciente o cualquiera de sus combinaciones.
Las composiciones de la presente invención son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvo y soluciones para la administración pulmonar del derivado de un análogo de amilina, mediante el uso de, por ejemplo, un inhalador de dosis fija, un inhalador de polvo seco y un nebulizador, todos ellos dispositivos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las composiciones de la actual invención son útiles en la formulación de sistemas de administración de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y lenta.
La administración parenteral puede realizarse por inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa similar a una lapicera. Alternativamente, la administración parenteral puede realizarse por medio de una bomba de infusión. Otra opción es una composición que puede ser una solución o suspensión para la administración del derivado de un análogo de amilina en la forma de un atomizador nasal o pulmonar. Como aún otra opción, las composiciones farmacéuticas que contienen el polipéptido de la invención también pueden adaptarse a la administración transdérmica, por ejemplo, mediante inyección sin aguja o desde un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o administración transmucosal, por ejemplo, bucal. El polipéptido de la invención pueden administrarse por vía pulmonar en un vehículo, como una solución, suspensión o polvo seco mediante el uso de cualquiera de los tipos conocidos de dispositivos adecuados para la administración pulmonar de fármacos. Los ejemplos de estos comprenden, pero no se limitan a, los tres tipos generales de generación de aerosoles para la administración de fármacos pulmonares, y pueden incluir nebulizadores de chorro o ultrasónicos, inhaladores de dosis fija o inhaladores de polvo seco (consultar Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).
En una modalidad, la formulación farmacéutica que comprende el polipéptido es estable durante más de 6 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento.
En otra modalidad, la formulación farmacéutica que comprende el polipéptido es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento.
En otra modalidad, la formulación farmacéutica que comprende el derivado de un análogo de amilina es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.
En otra modalidad la formulación farmacéutica que comprende el derivado de un análogo de amilina es estable durante más de 2 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.
En un aspecto, un proceso para preparar una composición farmacéutica que comprende el derivado de acuerdo con la invención comprende mezclar un derivado de acuerdo con la invención con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Indicaciones terapéuticas
En un aspecto, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse como un medicamento.
En un aspecto el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse como un medicamento para el tratamiento o prevención de la hiperglucemia, diabetes tipo 2, intolerancia a la glucosa, diabetes tipo 1, obesidad, hipertensión, síndrome X, dislipidemia, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria y otros trastornos cardiovasculares, accidente cerebrovascular, síndrome del intestino irritable, dispepsia y úlceras gástricas. En un aspecto, el polipéptido se usa para retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad en la diabetes tipo 2. En un aspecto, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse como un medicamento para el tratamiento de o la prevención de la obesidad.
En un aspecto, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse como un medicamento para el tratamiento de o la prevención de hipercalcemia, osteoporosis o ostitis deformante. En un aspecto, el polipéptido puede usarse como un medicamento para reducir el peso corporal. En un aspecto, el polipéptido puede usarse como un medicamento para el tratamiento o prevención de la obesidad, o como un medicamento para prevenir el aumento de peso corporal. En un aspecto, el polipéptido modifica la ingesta de alimentos, tal como reduce la ingesta de alimentos.
En un aspecto, el medicamento disminuye la ingesta de alimentos, disminuye la apoptosis de las células p, aumenta la función de las células p y la masa de las células p, y/o restaura la sensibilidad a la glucosa de las células p.
En un aspecto, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse para la preparación de un medicamento.
En un aspecto el polipéptido puede usarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la hiperglucemia, diabetes tipo 2, intolerancia a la glucosa, diabetes tipo 1, obesidad, hipertensión, síndrome X, dislipidemia, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria y otros trastornos cardiovasculares, accidente cerebrovascular, síndrome del intestino irritable, dispepsia y úlceras gástricas.
En un aspecto, el polipéptido puede usarse para la preparación de un medicamento para retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad en la diabetes tipo 2.
En un aspecto, el polipéptido disminuye la ingesta de alimentos, disminuye la apoptosis de las células p, aumenta la función de las células p y la masa de las células p, y/o restaura la sensibilidad a la glucosa de las células p.
El tratamiento con un polipéptido de acuerdo con la presente invención puede combinarse, además, con una segunda o más sustancias activas farmacológicamente, por ejemplo, seleccionadas de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad. Ejemplos de estas sustancias farmacológicamente activas son: Insulina, derivado de insulina, análogos de insulina, GLP-1, derivados de GLP-1, análogos de GLP-1, derivados de oxintomodulina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasa, antagonistas de glucagón, inhibidores de la DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepáticas implicadas en la estimulación de la gluconeogénesis y/o glucogenólisis, moduladores de la captación de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo lipídico tales como agentes antihiperlipidémicos como inhibidores de la HMG CoA (estatinas), compuestos que reducen la ingestión de alimentos, agonistas RXR y agentes que actúan sobre el canal de potasio dependiente de ATP de las p-células; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozilo, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; p-bloqueadores tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de la ACE (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril y ramipril, bloqueadores de los canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamilo y a-bloqueadores tales como doxazosina, urapidilo, prazosina y terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocaína y anfetamina), antagonistas de NPY (neuropéptido Y), agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas del TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas del CRF (factor de liberación de corticotropina), antagonistas del CRF BP (proteína de unión al factor de liberación de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistasp3, agonistas de MSH (hormona estimulante de melanocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistocinina), inhibidores de la recaptación de serotonina, inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, compuestos mixtos de serotonina y noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormona del crecimiento, compuestos de liberación de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (proteínas desacopladoras 2 o 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasa/amilasa, moduladores de RXR (receptor X retinoide), agonistas TRP; antagonistas de histamina H3, gastrina y análogos de gastrina.
Debe entenderse que cualquier combinación adecuada de los polipéptidos de acuerdo con la invención con uno o más de los compuestos mencionados anteriormente y opcionalmente una o más sustancias activas farmacológicamente adicionales se consideran dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención se describirá ahora a modo de ejemplos.
EJEMPLOS
Los polipéptidos preparados se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10
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a potencia in vitro de los polipéptidos frente a los receptores de amilina y los receptores de calcitonina de ratas y umanos (como se describe en el Ensayo (II)) se muestra en la Tabla 11.
Tabla 11
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Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
La solubilidad de los polipéptidos se probó como se describe en el Ensayo (IV) y los resultados se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12
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Los derivados de amilina se probaron para determinar la estabilidad física en el ensayo ThT (Ensayo (III)) y los datos se proporcionan en la Tabla 13.
Tabla 13
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Los derivados de amilina se probaron con respecto a su efecto en el ensayo de ingesta de alimentos (Ensayo (I)) y los resultados se muestran en la Tabla 14
Tabla 14
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La vida media de los derivados de amilina de las invenciones se probó en mini cerdos como se describe en el Ensayo (IX) y los datos se proporcionan en la Tabla 15.
Tabla 15
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Abreviaturas
Algunas de las abreviaturas usadas en los Ejemplos son las siguientes:
Acm: acetamidometilo
HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato)
HBTU: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
Fmoc: 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo
Boc: terc butiloxicarbonilo
Mtt: 4-metiltritilo
DCM: diclorometano
TIPS: triisopropilsilano
TFA: ácido trifluoroacético
NMP: 1-metil-pirrolidin-2-ona
HOAt: 1-Hidroxi-7-azabenzotriazol
DIC: Diisopropilcarbodiimida
Trt: trifenilmetilo
Ensayos
En los siguientes ejemplos, se hace referencia a los siguientes Ensayos:
Ensayo (I) - Protocolo experimental para probar la eficacia sobre el apetito mediante el uso de un modelo de rata alimentada ad libitum
Ensayo (II)a - Ensayo funcional - Ensayo de receptor de calcitonina y amilina humana
Ensayo (II)b - Ensayo funcional Ensayos de receptor de calcitonina de rata y amilina de rata
Ensayo (III) - Ensayos de fibrilación con tht para la evaluación de la estabilidad física de las formulaciones de proteínas
Ensayo (IV) - Determinación de la solubilidad
Ensayo (V) - Determinación de la unión al receptor de amilina humana
Ensayo (VI) - Determinación de la unión al receptor de amilina de rata
Ensayo (VII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina humana
Ensayo (VIII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina de rata
Ensayo (IX) - pk - Determinación de T1^ en minicerdo
Ensayo (X) - pk - Determinación de T1^ en rata
Ensayo (I) - Protocolo experimental para probar la eficacia sobre el apetito mediante el uso de un modelo de rata alimentada ad libitum
Se usan ratas Sprague Dawley (SD) de Taconic Europe, Dinamarca para los experimentos. Las ratas tienen un peso corporal de 200-250 g al comienzo del experimento. Las ratas llegan al menos 10-14 días antes del inicio del experimento para permitir la aclimatación a los entornos experimentales. Durante este período, los animales son manipulados al menos 2 veces. Después de la llegada, las ratas se alojan individualmente durante una semana en una fase de luz/oscuridad invertida (lo que significa que las luces están apagadas durante el día y encendidas durante la noche) durante dos semanas. Dado que las ratas normalmente son activas y comen la mayor parte de su ingesta diaria de alimentos durante el período oscuro, las ratas se dosifican por la mañana justo antes de que se apaguen las luces. Esta configuración resulta en la variación de datos más baja y la sensibilidad de prueba más alta. El experimento se lleva a cabo en las jaulas caseras de las ratas y las ratas tienen acceso libre a alimentos y agua durante todo el período de aclimatación y el período del experimento. Cada dosis de derivado se prueba en un grupo de 5-8 ratas. Se incluye un grupo de vehículo de 6-8 ratas en cada conjunto de pruebas. Las ratas se dosifican una vez de acuerdo con el peso corporal con una solución de 0,01-3 mg/kg administrada por vía intraperitoneal (ip), oral (po) o subcutánea (sc). El tiempo de dosificación se registra para cada grupo. Después de la dosificación, las ratas son devueltas a sus jaulas caseras, donde después tienen acceso a comida y agua. El consumo de alimentos se registra individualmente de manera continua mediante el registro en línea o manualmente cada hora durante 7 horas, y luego después de 24 h y a veces de 48 h. Al final de la sesión experimental, los animales se sacrifican.
Los datos individuales se registran en hojas de Excel de Microsoft. Los valores atípicos se excluyen después de aplicar la prueba de evaluación estadística de Grubbs para valores atípicos, y el resultado se presenta gráficamente mediante el uso del programa GraphPad Prism.
Ensayo (II) - Ensayos funcionales
Ensayo (II)a - Ensayo de receptor de calcitonina y amilina humana
1. Esquema del ensayo de luciferasa
La activación de los receptores de calcitonina y amilina (coexpresión de receptor de calcitonina y proteínas modificadoras de la actividad del receptor (RAMP)) conduce a un aumento de las concentraciones intracelulares de AMPc. En consecuencia, la transcripción se activa por promotores que contienen múltiples copias del elemento de respuesta a AMPc (CRE). Por lo tanto, es posible medir la actividad de amilina mediante el uso de un gen reportero de luciferasa CRE introducido en las células BHK que también expresan receptores de calcitonina o amilina.
2. Construcción de la línea celular CRE-luc/receptor de calcitonina (a) y amilina 3(a).
Una línea celular BHK570 se transfectó de manera estable con el receptor de calcitonina humana y un gen reportero de luciferasa sensible a CRE. La línea celular se transfectó adicionalmente con RAMP-3, mediante el uso de métodos estándar. Esto convierte el receptor de calcitonina en un receptor de amilina 3(a). El metotrexato, la neomicina y la higromicina son marcadores de selección para la luciferasa, el receptor de calcitonina y RAMP-3, respectivamente.
3. Ensayos de luciferasa
Para realizar ensayos de actividad, se sembraron células BHK CRE-luc/receptor de amilina 3(a) o receptor de calcitonina (a) en placas de cultivo blancas de 96 pocillos a una densidad de aproximadamente 20 000 células/pocillo. Las células estaban en 100 pl de medio de crecimiento (DMEM con FBS al 10 %, Pen/Strep al 1 %, Na-piruvato 1 mM, Metotrexato 250 nM, Neomicina 500 pg/ml y Higromicina 400 pg/ml). Después de la incubación durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 %, el medio de crecimiento se reemplazó por 50 pl/pocillo de medio de ensayo (DMEM (sin rojo fenol), Glutamax™, FBS al 10 % y Hepes 10 mM, pH 7,4). Además, se añadieron 50 pl/pocillo de estándar o muestra en tampón de ensayo. Después de 3 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 %, el medio de ensayo con estándar o muestra se eliminó y se reemplazó por 100 pl/pocillo de PBS. Además, se añadió 100 pl/pocillo de LucLite™. Las placas se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, la luminiscencia se midió en un TopCounter (Packard) en modo SPC (conteo de fotones individuales).
Ensayo (II)b - Ensayos de receptor de calcitonina de rata y amilina de rata
esquema del ensayo de AMPc
La activación de los receptores de calcitonina y amilina (coexpresión de receptor de calcitonina y proteínas modificadoras de la actividad del receptor (RAMP)) conduce a un aumento de las concentraciones intracelulares de AMPc. Para cuantificar los niveles de AMPc en las células transfectadas transientemente, se usó el Ensayo de Activación de Adenil Ciclasa FlashPlate® de Perkin Elmer. El principio básico del Ensayo FlashPlate® es una competencia entre AMPc radiactivo y no radiactivo generado por las células para un número fijo de sitios de unión.
Construcción de células con receptor de calcitonina(a) de rata y amilina 3(a) de rata.
Las células BHK tk'ts 13 se transfectaron transitoriamente con receptor de calcitonina (a) o receptor de amilina 3 (a) de rata (receptor de calcitonina(a) de rata RAMP3 de rata) mediante el uso de FuGENE® 6 (Roche), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Ensayo AMPc
24 horas d e sp u é s de la transfección transitoria, s e añadieron las células (células con receptor de calcitonina(a) de rata o amilina 3(a) de rata) (100 000 células/pocillo) a las FlashPlates® de 96 pocillos con muestras o estándar en tampón de estimulación FlashPlate con IBMX y se incubaron durante 30 min. La m ezcla de detección s e creó de acuerdo con el protocolo del fabricante y s e midió el centelleo d e sp u é s de 3 h de incubación en TopCounter™ (Packard).
E n sayo (III) - E n sa yo s de fibrilación con ThT para la evaluación de la estabilidad física de las formulaciones de proteínas
La estabilidad física baja de un polipéptido puede conducir a la formación de fibrillas de amiloide, que s e observa como estructuras macromoleculares similares a hilo en la muestra, bien ordenadas, que eventualmente resultan en la formación de gel. Esto se ha medido tradicionalmente mediante inspección visual de la muestra. Sin embargo, e s e tipo de medición e s muy subjetiva y d epen d e del observador. Por lo tanto, la aplicación de una sonda indicadora de molécula pequeña e s mucho m ás ventajosa. La tioflavina T (ThT) e s una sonda de este tipo y tiene una firma de fluorescencia distinta cuando se une a las fibrillas [Naiki y otros (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 09, 274-284].
El curso temporal para la formación de fibrillas puede describirse mediante una curva sigmoidea con la siguiente expresión [Nielsen y otros (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
F = f . mit f f + mf t
1 e-Kt- to )'A Ec. (1)
Aquí, F e s la fluorescencia de ThT en el tiempo t. La constante t0 e s el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de fluorescencia máxima. Los dos parámetros importantes que describen la formación de la fibrilla son el tiempo de retraso calculado por fe - 2 t y la constante de tasa aparente kapp = 1/.
La formación de un intermediario parcialmente plegado del polipéptido s e sugiere com o un m ecanism o de iniciación general para la fibrilación. Algunos de e s o s intermediarios s e nuclean para formar una plantilla sobre la cual los intermediarios posteriores pueden ensam blarse y se procede a la fibrilación. El tiempo de retraso corresponde al intervalo en el cual s e construye la m asa crítica de núcleos y la constante de tasa aparente e s la tasa con la que se forma la propia fibrilla.
Preparación de la muestra
Las muestras s e prepararon poco antes de cada ensayo. C a d a composición de muestra s e describe en cada ejemplo. El pH de la muestra s e ajustó al valor d e se a d o mediante el uso de las cantidades apropiadas de NaOH y HClO4 o HCl concentrados. La tioflavina T s e añadió a las muestras a partir de una solución madre en H2 O a una concentración final de 1 |iM.
Las alícuotas de muestra de 200 |il se colocaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Packard OptiPlate™-96, poliestireno blanco). Usualmente, se colocaron cuatro u ocho réplicas de cada muestra (que corresponden a una condición de prueba) en una columna de pocillos. La placa s e selló con Scotch Pad (Qiagen).
Incubación y medición de fluorescencia
La incubación a una temperatura dada, la agitación y la medición de la emisión de fluorescencia de ThT s e realizó en un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan A scen t FL o un lector de placas (Thermo Labsystems). La temperatura s e ajustó a 37 °C. La agitación orbital s e ajustó a 960 rpm con una amplitud de 1 mm en todos los datos presentados. La medición de la fluorescencia s e realizó mediante el uso de excitación a través de un filtro de 444 nm y la medición de la emisión a través de un filtro de 485 nm.
C a d a ejecución s e inició mediante la incubación de la placa a la temperatura del e n sa yo durante 10 min. La placa se midió cada 20 minutos por un período de tiempo deseado. Entre cada medición, la placa s e agitó y s e calentó como se describió.
Manejo de los datos
Los puntos de medición s e guardaron en formato de Microsoft Excel para el procesamiento posterior y el dibujo y el ajuste de curvas s e realizó mediante el uso de GraphPad Prism. La emisión de fondo a partir de ThT en ausen cia de fibrillas fue insignificante. Los puntos de datos son típicamente una media de cuatro u ocho muestras y s e muestran con barras de error de la desviación estándar. Solo los datos obtenidos en el mismo experimento (es decir las muestras en la misma placa) s e presentan en el mismo gráfico a segu rando una medida de formación de fibrillas relativa entre los experimentos.
El conjunto de datos puede ajustarse a Eq. (1). Sin embargo, dado que las curvas sigmodiales completas en este caso no siempre se logran durante el tiempo de medición, el grado de fibrilación se expresa como fluorescencia ThT tabulada como la media de las muestras y se muestra con la desviación estándar en varios puntos de tiempo.
Medición de concentraciones iniciales y finales
La concentración del polipéptido en cada una de las formulaciones probadas se midió tanto antes de la aplicación en el ensayo de fibrilación ThT ("Inicial") como después de completar la fibrilación ThT ("Después del ensayo ThT"). Las concentraciones se determinaron por métodos de HPLC inversa mediante el uso de un estándar de pramlintida como referencia. Antes de la medición después de la finalización, se recogieron 150 pl de cada una de las réplicas y se transfirieron a un tubo Eppendorf. Estos se centrifugaron a 30 000 G durante 40 minutos. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm antes de la aplicación en el sistema de HPLC.
Ensayo (IV) - Determinación de la solubilidad
El polipéptido se disolvió en agua a ~ 500 nmol/ml y se mezcló 1:1 con una serie de tampones (glicilglicina 100 mM pH 3,0, glicilglicina 100 mM pH 4,0, glicilglicina 100 mM pH 5,0, bistrispropano 100 mM pH 6,0, bistrispropano 100 mM pH 6,5, bistrispropano 100 mM pH 7,0, bistrispropano 100 mM pH 7,5, bistrispropano 100 mM pH 8,0). Después de 18 horas a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron y la concentración del polipéptido se determinó por UPLC.
Ensayo (V) - Determinación de la unión al receptor de amilina humana
El ensayo de unión se realizó mediante el uso de perlas de ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (RPNQ0001) de PerkinElmer y membranas celulares de las células Amilina 3(a)/CRE-luc (como se describió en el Ensayo (II)). Las membranas se prepararon de la siguiente manera; las células se lavaron con PBS y se incubaron con Verseno durante aproximadamente 5 minutos antes de la cosecha. Las células se lavaron con PBS y la suspensión celular se centrifugó durante 5 minutos a 1000 rpm. Las células se homogeneizaron (ultrathurrax) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 10 mM (pH 7,4) y se centrifugaron a 20 000 rpm durante 15 minutos. El sedimento resultante se resuspendió, se homogeneizó y se centrifugó (20 000 rpm, 15 min) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 0,1 mM (pH 7,4, tampón 2). El sedimento resultante se resuspendió en tampón 2 y se midió la concentración de proteína (ensayo de proteína BCA, Pierce). El homogenado se mantuvo frío durante todo el procedimiento. Las membranas se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. El ensayo se realizó en un Optiplate de 384 pocillos (PerkinElmer) en un volumen total de 40 ul. Las membranas se mezclaron con perlas de SPA. La concentración final de las membranas 35 ng/pL final y las perlas de SPA fue de 0,05 mg/pocillo. Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO y se diluyeron adicionalmente en tampón de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7,4, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, OA al 0,1 % y Tween20 al 0,02 %). El radioligando amilina I125 de rata (NEX448 PerkinElmer) se disolvió en tampón de ensayo y se añadió al Optiplate a una concentración final de 50 pM/pocillo (aproximadamente 20 000 cpm/10 ul). La mezcla final se incubó con agitación a 400 rpm durante 120 minutos a 25 °C antes de la centrifugación (1500 rpm, 10 minutos). Las muestras se analizaron en TopCounter ™ (Packard). El IC50 se calculó mediante el uso de (análisis de competencia de unión a un sitio) GraphPad Prism5 como una medida de afinidad del receptor.
Ensayo (VI) - Determinación de la unión al receptor de amilina de rata
El ensayo se realizó como se describió anteriormente (Ensayo (V) - Determinación de la unión al receptor de amilina humana) con la excepción de que usamos membranas preparadas a partir de células BHK tk'ts 13 que se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata RAMP 3 en una relación equimolar (1:2). Las células BHK tk'ts 13 se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata mediante el uso de FuGENE® 6 (Roche), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se cultivaron en DMEM con FBS al 10 % y Pen/Strep al 1 %. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, se recogieron las células y se prepararon las membranas.
Ensayo (VII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina humana
El ensayo de unión se realizó mediante el uso de perlas de ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (RPNQ0001) de PerkinElmer y membranas celulares preparadas a partir de una línea celular BHK tk'ts 13 que se transfectó de manera estable con el receptor de calcitonina humana y un gen reportero de luciferasa sensible a CRE. Las membranas se prepararon de la siguiente manera; las células se lavaron con PBS y se incubaron con Verseno durante aproximadamente 5 minutos antes de la cosecha. Las células se lavaron con PBS y la suspensión celular se centrifugó durante 5 minutos a 1000 rpm. Las células se homogeneizaron (Ultrathurrax) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 10 mM (pH 7,4) y se centrifugaron a 20 000 rpm durante 15 minutos. El sedimento resultante se resuspendió, se homogeneizó y se centrifugó (20 000 rpm, 15 min) en un tampón que contenía Na-HEPES 20 mM y EDTA 0,1 mM (pH 7,4, tampón 2). El sedimento resultante se resuspendió en tampón 2 y se midió la concentración de proteína (ensayo de proteína BCA, Pierce). El homogenado se mantuvo frío durante todo el procedimiento. Las membranas se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. El ensayo se realizó en un Optiplate de 384 pocilios (PerkinElmer) en un volumen total de 40 ul. Las membranas se mezclaron con perlas de SPA. La concentración final de las membranas 35 ng/pL final y la concentración final de las perlas de SPA fue de 0,05 mg/pocillo. Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO y se diluyeron adicionalmente en tampón de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7,4, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, OA al 0,1 % y Tween20 al 0,02 %). El radioligando calcitonina I125 (NEX422 PerkinElmer) se disolvió en tampón de ensayo y se añadió al Optiplate a una concentración final de 75 pM/pocillo (aproximadamente 30 000 cpm/l0 ul). La mezcla final se incubó durante 120 con agitación a 400 rpm minutos a 25 °C antes de la centrifugación (1500 rpm, 10 minutos). Las muestras se analizaron en TopCounter ™ (Packard). El IC50 se calculó mediante el uso de (análisis de competencia de unión a un sitio) GraphPad Prism5 como una medida de afinidad del receptor.
Ensayo (VIII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina de rata
El ensayo se realizó como se describió anteriormente (Ensayo (VII) - Determinación de la unión al receptor de calcitonina humana) con la excepción de que usamos membranas preparadas a partir de células BHK tk'ts 13 que se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata. Las células BHK tk'ts 13 se transfectaron transitoriamente con el receptor de calcitonina de rata mediante el uso de FuGENE® 6 (Roche), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se cultivaron en DMEM con FBS al 10 % y Pen/Strep al 1 %. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, se recogieron las células y se prepararon las membranas.
Ensayo (IX) - pK - Determinación de T1^ en minicerdo
T1^ es la vida media terminal = ln2/Az de un compuesto en plasma. Az es la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva de concentración plasmática-tiempo y se estima mediante regresión lineal del tiempo frente a la concentración logarítmica.
Los valores de t1^ de los análogos de amilina de la invención se determinan mediante estudios farmacocinéticos en minicerdos Gottingen machos de Ellegaard Gottingen Minipigs ApS y se siguen los principios del cuidado de animales de laboratorio.
Se permitió un período de aclimatación de aproximadamente 6-10 días antes de que los animales ingresaran al estudio. Al comienzo del período de aclimatación, los minicerdos tenían alrededor de 5 a 12 meses de edad y en el intervalo de peso de 7-35 kg. Los minicerdos tenían dos catéteres venosos centrales insertados que se usaron para tomar muestras de sangre.
Los estudios se realizaron en una habitación para el animal que se iluminó para dar un ciclo de aproximadamente 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales fueron alojados individualmente.
Los animales tuvieron acceso libre a agua para beber de calidad doméstica durante el estudio, pero se les sometió típicamente a ayuno desde la noche antes de la dosificación hasta aproximadamente 6-12 horas después de la dosificación. Los animales se pesaron al llegar y en los días de dosificación.
En los presentes estudios, las sustancias de prueba se administraron por vía subcutánea en dosis aproximadas de 2 nmol/kg. Los animales recibieron una única inyección subcutánea. La inyección subcutánea se administró en el lado derecho del cuello, aproximadamente a 5-7 cm de la oreja y a 7-9 cm del centro del cuello. Las inyecciones se administraron con un tapón de goma en la aguja, lo que permitió introducir aproximadamente 0,5 cm de la aguja. Cada sustancia de prueba se administró típicamente a tres, pero en algunos casos a dos o cuatro animales.
Se obtuvo un perfil completo de concentración plasmática-tiempo de cada animal, al emplear 12-16 puntos de muestreo. Por ejemplo, se recolectaron muestras de sangre de acuerdo con el siguiente programa:
Después de la administración subcutánea:
Predosis (0), 0,5, 1,2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168 y 240 horas después de la inyección.
En algunos casos, también se tomaron muestras de sangre adicionales hasta 288 horas después de la inyección.
En cada tiempo de toma de muestra, se extrajeron 0,5 a 2 ml de sangre de cada animal. Las muestras de sangre se tomaron a través del catéter venoso central.
Las muestras de sangre se recogieron en tubos de ensayo EDTA (es decir, Sarstedt Micro tubo 1,3 mL K3E). Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo durante un máximo de 20 minutos antes de la centrifugación. El plasma se separó mediante centrifugación (es decir, a 4 °C, 10 min., 1500G) y se transfirió inmediatamente a tubos Micronic. Se transfirieron aproximadamente 200 pl de plasma a cada tubo Micronic. El plasma se almacenó a -20 °C hasta que se analizó. Las muestras de plasma se evaluaron para determinar el contenido de amilina mediante el uso de un ensayo ELISA.
Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un análisis farmacocinético no compartimental (NCA) mediante el uso de WinNonlin Professional 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE.UU.). NCA se realizó mediante el uso de los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo de cada animal. T1^ es la vida media terminal = ln2/Az y se determinó a partir de Az, la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva, estimada por regresión lineal de tiempo frente a la concentración logarítmica.
Ensayo ELISA de plasma para la cuantificación de amilina
El ELISA de amilina humana es un inmunoensayo tipo sándwich basado en anticuerpos monoclonales para determinar los niveles de amilina en el plasma humano. El anticuerpo de captura reconoce la amilina humana, ácido amilínico (amilina desamidada), un fragmento 1-20 de amilina, pero no amilina reducida. El anticuerpo de detección se une a la amilina humana reducida o no reducida, pero no al ácido amilínico, y forma complejo con estreptavidinafosfatasa alcalina. El sustrato, fosfato de 4-metilumbeliferilo, se aplica al sándwich completo y la señal fluorescente, monitoreada a 355 nm/460 nm, es proporcional a la cantidad de amilina presente en la muestra.
Método MS para la cuantificación de amilina
Se diluyen 40 pl de plasma con 120 pl de EtOH al 66,67 % HCOOH al 1 % y se mezclan. Se centrifuga durante 20 min. a 13 000 rpm, 4 °C. El sobrenadante se analiza mediante un método LC-MS en un Sciex API 3000 y se cuantifica con un estándar compuesto en plasma
Ensayo (X) - pK - Determinación de T1^ en rata
T ^ es la vida media terminal = ln2/Az de un compuesto en plasma. Az es la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva de concentración plasmática-tiempo y se estima mediante regresión lineal del tiempo frente a la concentración logarítmica.
Los valores de T ^ de los análogos de amilina de la invención se determinan mediante estudios farmacocinéticos en ratas macho Sprague Dawley, de Taconic Europe, y se siguen los principios del cuidado de animales de laboratorio.
Se permitió un período de aclimatación de aproximadamente 7 días antes de que los animales ingresaran al estudio. Al comienzo del período de aclimatación, las ratas estaban en el intervalo de peso de 300-400 g. Las ratas tenían catéteres permanentes insertados en a. carotis que se utilizaron para tomar muestras de sangre.
Los estudios se realizaron en una habitación para el animal que se iluminó para dar un ciclo de aproximadamente 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales fueron alojados individualmente debido a los catéteres y tenían comida y agua a voluntad. Los animales se pesaron en los días de dosificación.
En los presentes estudios, las sustancias de prueba se administraron por vía subcutánea en dosis aproximadas de 20 nmol/kg. Los animales recibieron una única inyección subcutánea en el cuello mediante el uso de una aguja 25G con jeringa. Cada sustancia de prueba se administró típicamente a tres, pero en algunos casos a dos o cuatro animales.
Se obtuvo un perfil completo de concentración plasmática-tiempo de cada animal, al emplear 8-10 puntos de muestreo. Por ejemplo, se recolectaron muestras de sangre de acuerdo con el siguiente programa:
Después de la administración subcutánea:
Predosis (0), 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 12, 24, 48 y 72 horas después de la inyección.
En cada tiempo de toma de muestra, se extrajeron 0,08 a 0,10 ml de sangre de cada animal. Las muestras de sangre se tomaron a través del catéter.
Las muestras de sangre se colectaron en tubos de ensayo EDTA. Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo durante un máximo de 20 minutos antes de la centrifugación. El plasma se separó mediante centrifugación (es decir, a 4 °C, 10 min., 1500G) y se transfirió inmediatamente a tubos Micronic placas de PCR. Aproximadamente 40 pl de plasma se transfirieron y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Las muestras de plasma se evaluaron para determinar el contenido de amilina mediante el uso de un ensayo ELISA.
Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un análisis farmacocinético no compartimental (NCA) mediante el uso de WinNonlin Professional 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE.UU.). NCA se realizó mediante el uso de los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo de cada animal. T ^ es la vida media terminal = ln2/Az y se determinó a partir de Az, la constante de velocidad de primer orden asociada con la porción terminal (logarítmica lineal) de la curva, estimada por regresión lineal de tiempo frente a la concentración logarítmica.
Preparaciones
Las secuencias de polipéptidos se prepararon de acuerdo con la síntesis de polipéptidos mencionada a continuación y los compuestos tal como se presentan en las Tablas (por ejemplo, la Tabla 10) se prepararon de acuerdo con la síntesis mencionada a continuación.
Un método de síntesis de polipéptidos fue mediante la química de Fmoc en un sintetizador de polipéptidos Liberty basado en microondas (CEM Corp., Carolina del Norte). La resina era Tentagel S RAM con una carga de aproximadamente 0,25 mmol/g o PAL-ChemMatrix con una carga de aproximadamente 0,43 mmol/g. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt en NMP mediante el uso de soluciones de aminoácidos de 0,3 M en NMP y un exceso molar de 6-8 veces. Las condiciones de acoplamiento fueron de 5 minutos a 70 °C. La desprotección se realizó con piperidina al 5 % en NMP a 70 °C. Los aminoácidos protegidos usados fueron aminoácidos-Fmoc estándar (suministrados, por ejemplo, de Anaspec o Novabiochem) disueltos a 0,3 M en NMP que contiene HOAt 0,3 M.
Otro método de síntesis de polipéptidos fue mediante la química de Fmoc en un sintetizador de polipéptidos Prelude (Protein Technologies, Arizona). La resina era Tentagel S RAM con una carga de aproximadamente 0,25 mmol/g o PAL-ChemMatrix con una carga de aproximadamente 0,43 mmol/g. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt en NMP mediante el uso de soluciones de aminoácidos de 0,3 M en NMP y un exceso molar de 6-8 veces. Las condiciones de acoplamiento fueron acoplamientos simples o dobles durante 1 o 2 horas a temperatura ambiente. La desprotección fue con piperidina al 20 % en NMP. Los aminoácidos protegidos usados fueron aminoácidos-Fmoc estándar (suministrados, por ejemplo, por Anaspec o Novabiochem) disueltos a 0,3 M en NMP que contiene HOAt a 0,3 M.
Otro método de síntesis de polipéptidos fue en un sintetizador de polipéptidos 433 de Applied Biosystems en una escala de 0,25 mmol o 1,0 mmol mediante el uso de los protocolos FastMoc UV suministrados por el fabricante que emplean acoplamientos mediados por HBTU o HATU en NMP, y monitoreo UV de la desprotección del grupo de protección Fmoc. La resina de partida usada para la síntesis de las amidas polipeptídicas fue la resina Rink-Amide. Los derivados de aminoácidos protegidos usados fueron aminoácidos-Fmoc estándar (suministrados de por ejemplo Anaspec, o Novabiochem) suministrado en cartuchos previamente pesados adecuados para el sintetizador ABI433A.
Cuando se deseaba una modificación química de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporó como Lys(Mtt) y el aminoácido N-terminal se incorporó a la secuencia como un aminoácido-Boc o, si el aminoácido N-terminal se incorporó como un aminoácido-Fmoc, el grupo Fmoc se eliminó y el N-terminal se protegió mediante tratamiento con 6 equivalentes de carbonato de Boc y 6 equivalentes de DIPEA en NMP durante 30 minutos. La resina se lavó con NMP y DCM y el grupo Mtt se eliminó mediante la suspensión de la resina en hexafluoroisopropanol puro durante 20 minutos seguido de lavado con DCM y NMP. La modificación química de la lisina se realizó mediante la adición de uno o más de los bloques de construcción enumerados a continuación mediante los mismos métodos usados para la síntesis de polipéptidos, es decir, mediante una o más etapas automatizados en el Liberty o el ABI 433 o mediante una o más etapas manuales de acoplamiento a temperatura ambiente. Después de la síntesis la resina se lavó con DCM y se secó, y el polipéptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2 horas con TFA/TIPS/agua (92,5/5/2,5 o 95/2,5/2,5) seguido por precipitación con 4 volúmenes de dietiléter, lavado adicional con dietiléter y secado. Si el polipéptido contenía cisteínas protegidas con grupos Acm, el polipéptido se redisolvió en agua a 2-5 mg/ml, el pH se ajustó a menos de 4 y el puente disulfuro se formó mediante tratamiento con 4 equivalentes de yodo (2 % p/v en metanol) durante 15 minutos. Alternativamente, el puente disulfuro se formó sobre la resina mediante el uso de Trt como el grupo protector para la cisteína y tratando con 10 equivalentes de yodo en NMP durante 1 hora. En este caso, el polipéptido bruto se purificó directamente después de la escisión y precipitación con éter dietílico.
Purificación: El polipéptido crudo se purificó por HPLC semipreparativa en una columna de 20 mm x 250 mm empacada con sílice C-18 de 5 p o 7 p. Las soluciones de polipéptidos se bombearon sobre la columna de HPLC y los polipéptidos precipitados se disolvieron en 5 ml de ácido acético al 50 % H2 O y diluido a 20 ml con H2 O e inyectado en la columna que luego se eluyó con un gradiente de 40-60 % de CH3 CN en 0,1 % TFA 10 ml/min durante 50 min a 40 oC. Se colectaron las fracciones que contenían el polipéptido. El polipéptido purificado se liofilizó después de la dilución del eluato con agua.
Para el análisis de las fracciones de HPLC y el análisis del producto final de RP-HPLC se realizó mediante el uso de detección UV a 214 nm y, por ejemplo, una columna de sílice Vydac 218TP54 de 4,6 mm x 250 mm 5 p C-18 (The Separations Group, Hesperia, EE.UU.) y se eluyó a, por ejemplo, 1 ml/min a 42 oC. Muy a menudo se usó una de las cuatro condiciones de elución diferentes:
A1: Equilibración de la columna con un tampón que consiste en (NH4)2SO40,1 M, que se ajustó a pH 2,5 con H2 SO4 concentrado y elución mediante un gradiente de 0 % a 60 % de CH3 CN en el mismo tampón durante 50 min.
B1: Equilibración de la columna con TFA/H2 O al 0,1 % y elución mediante un gradiente de 0 % CH3CN/0,1 % de TFA/H2 O a 60 % de CH3CN/0,1 % de TFA/H2 O durante 50 min.
B6: Equilibración de la columna con TFA/H2 O al 0,1 % y elución mediante un gradiente de 0 % CH3CN/0,1 % de

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de acuerdo con la Fórmula (I):
Xaa1-Cys-Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa14-Phe-Leu- Xaa17-Xaa18-Ser-Ser- Xaa21-Xaa22- Phe-Gly-Pro-Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser-Xaa35-Thr-Pro;
en donde
Xaa1 se elimina o se selecciona independientemente de Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser y Lys;
Xaa3 se selecciona independientemente de Gly, His, Arg, Ser y Asn;
Xaa14 es Glu;
Xaa17 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys y Val;
Xaa18 se selecciona independientemente de Arg, Lys e His;
Xaa21 se selecciona independientemente de Ala, Lys, Gln, Ser y Asn;
Xaa22 se selecciona independientemente de Glu, Gln, Ser, Thr y Asn;
Xaa26 se selecciona independientemente de Pro, Arg e Ile;
Xaa31 se selecciona independientemente de Ser, Glu, Asp y Asn;
Xaa35 se selecciona independientemente de His, Arg, Lys, Asp, Gln y Glu;
en donde la numeración de la secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de numeración de aminoácidos de la SEQ ID No: 2;
en donde el C-terminal del polipéptido es una amida;
en donde el C-terminal puede, opcionalmente, derivarse; y
en donde el polipéptido es un agonista del receptor de amilina.
2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un residuo en la posición 17 que es histidina o arginina, preferentemente arginina.
3. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende un residuo en la posición 35 que se selecciona independientemente de cualquiera de histidina, asparagina, glutamina y ácido glutámico; preferentemente histidina, glutamina y asparagina; con mayor preferencia asparagina.
4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende un residuo de aminoácido en la posición 14 que es ácido glutámico y un residuo en la posición 17 que es arginina.
5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde al menos un sustituyente se une a al menos un residuo de aminoácido de dicho polipéptido.
6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el grupo sustituyente se selecciona de cualquiera de los grupos sustituyentes presentados en la tabla a continuación:
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde un sustituyente s e une al grupo a-amino del residuo de aminoácido N-terminal o a un residuo de Lys.
8. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, seleccionado del grupo que consiste en cualquiera de los polipéptidos a continuación:
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Gly-[His1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintida; N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[His1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Gly1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Arg1,Glu14,His17,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Gly-[Arg1,Glu14,His17,Pro37]-pramlintida; N-alfa-[(s)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiri1HGlu14,Arg17,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Gln21,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Lys11,Glu14,His17,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintida; N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[G lu14,Arg18,Ser21,Ser22,Ser28,Ser29,Asp31,Asp35,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Gln21,Gln35,Pro37]-pramlintida; N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Thr21,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Gln35,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Gln35,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Gln31,Gln35,Pro37]-pramlintida;
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Gln22,Gln31,Gln35,Pro37]-pramlintida.
9. Un derivado del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho derivado comprende un enlazador y GIu unido al N-terminal de dicho polipéptido y H O O C (CH 2 )isC O o H O O C (CH 2 )i6 C O - com o el residuo de unión a albúmina, y en donde la secu en cia del polipéptido comprende: a. una Glu en la posición 14,
si. una His o una Arg en la posición 17 y
C. una Pro en la posición 37.
10. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el polipéptido es: N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14, A rg17, Pro37]-pramlintida.
11. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el polipéptido es:
N-alfa-[(S)-4-Carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Pro37]- pramlintida.
12. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar com o un medicamento.
13. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento o prevención de la hiperglucemia, diabetes tipo 2, intolerancia a la glucosa, diabetes tipo 1, obesidad, hipertensión, síndrome X, dislipidemia, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria y otros trastornos cardiovasculares, accidente cerebrovascular, síndrome del intestino irritable, dispepsia y úlceras gástricas, hipercalcemia, osteoporosis y ostitis deformante.
14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
15. Un proceso para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 que comprende mezclar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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