ES2773961T3

ES2773961T3 - Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos

Info

Publication number: ES2773961T3
Application number: ES14855074T
Authority: ES
Inventors: Ernest S Smith; Maurice Zauderer; William J Bowers; Alan Jonason
Original assignee: Vaccinex Inc
Current assignee: Vaccinex Inc
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2020-07-15
Anticipated expiration: 2034-10-21
Also published as: DK3060252T3; MX2016005050A; ES3063301T3; WO2015061330A1; US9249227B2; IL295045B2; IL275720B; CN116966293A; SG11201603167YA; US20150353641A1; CN106029093B; ZA201602686B; BR112016009047A2; JP6461944B2; MX374708B; JP2017502920A; EP3060252A1; MX2020009260A; AU2021202095B9; EP3060252B1

Abstract

Una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a un antígeno del mismo que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene la enfermedad de Huntington, en la que el anticuerpo aislado o fragmento del mismo inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos

Antecedentes de la divulgación

La semaforina-4D (SEMA4D), también conocida como CD100, es una proteína transmembrana (p. ej., SEQ ID NO: 1 (humana); SEQ ID NO: 2 (murina)) que pertenece a la familia del gen de la semaforina. SEMA4D se expresa sobre la superficie celular como un homodímero, pero tras la activación celular, SEMA4D puede ser liberada de la superficie celular mediante escisión proteolítica para generar SEMA4Ds, una forma soluble de la proteína, que también es biológicamente activa. Véase Suzuki y col., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003); Kikutani y col., Nature Immunol.

9:17-23 (2008).

SEMA4D se expresa a altos niveles en órganos linfoides, que incluyen el bazo, timo y ganglios linfáticos, y en órganos no linfoides, tales como el cerebro, corazón y riñón. En órganos linfoides, SEMA4D se expresa abundantemente en linfocitos T en reposo, pero solo se expresa débilmente en linfocitos B en reposo y células presentadoras de antígenos (CPA), tales como células dendríticas (CD). Su expresión, sin embargo, está regulada positivamente en estas células tras la activación por diversos estímulos inmunológicos. La liberación de SEMA4D soluble de células inmunitarias también es aumentada por la activación celular.

SEMA4D se ha implicado en el desarrollo de trastornos neurodegenerativos, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades desmielinizantes, y ciertos cánceres.

Por ejemplo, El documento WO 2013/055922 A1 se refiere a procedimientos de disminución de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en un sujeto con trastorno neuroinflamatorio al administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D.

Sin embargo, queda por establecerse el efecto que consiste en bloquear la señalización de SEMA4D en la organización y función del sistema nervioso central (SNC), incluyendo el cerebro y la médula espinal, y en los comportamientos controlados por el SNC. Esto es importante debido a que los cambios en el SNC tienen una profunda influencia en el comportamiento y la calidad de vida de un sujeto. En particular, tales cambios pueden tener un impacto en el comportamiento neuropsiquiátrico de un sujeto, comportamiento cognitivo y habilidades motoras. Sigue existiendo, por lo tanto, una necesidad de tratamientos para trastornos neuroinflamatorios que alivien los síntomas asociados con el trastorno.

Breve resumen de la divulgación

La presente invención proporciona una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene la enfermedad de Huntington, en la que el anticuerpo aislado o fragmento del mismo inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor.

En una realización, el receptor es seleccionado entre el grupo que consiste en plexina-B1, plexina-B2 y CD72.

En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la transducción de la señal de plexina-B1 mediada por SEMA4D.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente al mismo epítopo de SEMA4D como un anticuerpo monoclonal de referencia que comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno inhibe competitivamente un anticuerpo monoclonal de referencia que comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo monoclonal que comprende una VH que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una VL que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal que comprende una VH y una VL que comprenden, respectivamente, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 18.

En una realización, el sujeto es un ser humano.

Los procedimientos de uso de moléculas de unión a semaforina-4D para aliviar los síntomas en un sujeto que tiene trastornos neurodegenerativos también se desvelan en el presente documento. Según aspectos de la divulgación ilustrados en el presente documento, se proporciona un procedimiento de mejora de los síntomas en un sujeto con un trastorno neurodegenerativo que incluye la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) e inhibe, suprime, previene, invierte o ralentiza el efecto de SEMA4D.

Según aspectos ilustrados en el presente documento, también se desvela un procedimiento de tratamiento a un sujeto con un trastorno neurodegenerativo que incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D), en el que la unión a SEMA4D actúa para mejorar los síntomas asociados con el trastorno.

También se desvela un procedimiento de alivio de los síntomas en un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo que comprende administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D). En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor o una porción de su receptor. En algunas realizaciones de los procedimientos, el receptor es seleccionado entre el grupo que consiste en plexina-Bl y plexina-B2. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión inhibe la transducción de la señal de plexina-Bl mediada por SEMA4D. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión aislada que se une específicamente al mismo epítopo de SEMA4D como un anticuerpo monoclonal de referencia seleccionado entre el grupo que consiste en VX15/2503 o 67. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión aislada inhibe competitivamente que un anticuerpo monoclonal de referencia seleccionado entre el grupo que consiste en VX15/2503 o 67 se una específicamente a SEMA4D. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión aislada comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones de los procedimientos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es el anticuerpo monoclonal VX15/2503 o 67. En algunas realizaciones de los procedimientos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena pesada variable VH que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente. En algunas realizaciones de los procedimientos, la VH y VL comprenden, respectivamente, s Eq ID NO: 9 y SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones de cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH, lupus del SNC, deterioro cognitivo leve, o una combinación de los mismos. En ciertas realizaciones de cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington. En ciertas realizaciones de una cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, los síntomas son seleccionados entre un grupo que consiste en síntomas neuropsiquiátricos, síntomas cognitivos, disfunción motora, y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones de cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, los síntomas neuropsiquiátricos son seleccionados entre un grupo que consiste en reducir el comportamiento similar a la ansiedad, mejorar la memoria espacial, aumentar la locomoción, y cualquier combinación de los mismos.

También se desvelan procedimientos de alivio de los síntomas en un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo, que comprenden administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión inhibe competitivamente que un anticuerpo monoclonal de referencia seleccionado entre el grupo que consiste en VX15/2503 o 67 se una específicamente a SEMA4D. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor o una porción de su receptor. En algunas realizaciones de los procedimientos, el receptor es seleccionado entre el grupo que consiste en plexina-B1 y plexina-B2. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión inhibe la transducción de la señal de plexina-B1 mediada por SEMA4D. En algunas realizaciones de los procedimientos, la molécula de unión aislada comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones de los procedimientos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es el anticuerpo monoclonal VX15/2503 o 67. En algunas realizaciones de los procedimientos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena pesada variable VH que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente. En algunas realizaciones de los procedimientos, la VH y VL comprenden, respectivamente, SEQ ID n O: 9 y SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 10 y SeQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones de cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH, lupus del SNC, deterioro cognitivo leve, o una combinación de los mismos. En ciertas realizaciones de cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington. En ciertas realizaciones de una cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, los síntomas son seleccionados entre un grupo que consiste en síntomas neuropsiquiátricos, síntomas cognitivos, disfunción motora, y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones de cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, los síntomas neuropsiquiátricos son seleccionados entre un grupo que consiste en reducir el comportamiento similar a la ansiedad, mejorar la memoria espacial, aumentar la locomoción, y cualquier combinación de los mismos.

Procedimientos adicionales de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio, o de logro de un resultado deseable en un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo o neuroinflamatorio, también se desvelan en el presente documento. También se desvelan procedimientos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D), en los que la unión a SEMA4D actúa para aliviar los síntomas asociados con el trastorno. Se desvelan procedimientos de promoción de la mielinización en un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo, que comprenden administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión modula la actividad mediada por astrocitos de la función oligodendrocitaria de la mielina. Se desvelan procedimientos de prevención de la muerte de células neurales en un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo, que comprenden administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión modula la actividad sináptica mediada por astrocitos. Se desvelan procedimientos de prevención de la lesión de la barrera hematoencefálica en un sujeto que tiene un trastorno neuroinflamatorio o neurodegenerativo, que comprenden administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión modula el mantenimiento mediado por astrocitos de la integridad de la barrera hematoencefálica. Se desvelan procedimientos de prevención de la activación de los astrocitos en un sujeto que tiene, que se ha determinado que tiene o se sospecha que tiene un trastorno neuroinflamatorio o neurodegenerativo, que comprenden administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión modula el mantenimiento mediado por astrocitos de la integridad de la barrera hematoencefálica. Se desvelan procedimientos de mantenimiento o restauración del soporte trófico mediado por astrocitos de las células precursoras de oligodendrocitos (CPO) en un sujeto que tiene, que se ha determinado que tiene o se sospecha que tiene un trastorno neuroinflamatorio o neurodegenerativo, que comprenden administrar a ese sujeto una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión previene la retracción de los procesos astrocitarios y el movimiento quimiotáctico de las CPO hacia las regiones de daño. Se desvelan procedimientos de protección de neuronas inhibidoras contra la degeneración en la enfermedad de Alzheimer temprana que comprenden administrar a un sujeto que tiene, se ha determinado que tiene, o se sospecha que tiene una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a SEMA4D, en los que la molécula de unión restaura el número de neuronas positivas para somatostatina, neuronas positivas para NYP, o ambas en el sujeto. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, la molécula de unión inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor o una porción de su receptor. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, el receptor es seleccionado entre el grupo que consiste en plexina-Bl y plexina-B2. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, la molécula de unión inhibe la transducción de la señal de plexina-Bl mediada por SEMA4D. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, la molécula de unión aislada se une específicamente al mismo epítopo de SEMA4D como un anticuerpo monoclonal de referencia seleccionado entre el grupo que consiste en VX15/2503 o 67. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, la molécula de unión aislada inhibe competitivamente que un anticuerpo monoclonal de referencia seleccionado entre el grupo que consiste en VX15/2503 o 67 se una específicamente a SEMA4D. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, la molécula de unión aislada comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es el anticuerpo monoclonal VX15/2503 o 67. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena pesada variable VH que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, la VH y VL comprenden, respectivamente, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH, lupus del SNC, deterioro cognitivo leve, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, los síntomas del sujeto que se alivian con los procedimientos se seleccionan entre un grupo que consiste en síntomas neuropsiquiátricos, síntomas cognitivos, disfunción motora, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, los síntomas neuropsiquiátricos del sujeto que se alivian con los procedimientos se seleccionan entre un grupo que consiste en reducir el comportamiento similar a la ansiedad, mejorar la memoria espacial, aumentar la locomoción, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, se determina que el sujeto tiene el trastorno neurodegenerativo al procesar una muestra o imagen del sujeto.

Breve descripción de los dibujos/figuras

FIGURA 1: Esquema del protocolo experimental descrito en los Ejemplos.

FIGURAS 2: Modelo de CVN in vivo que mide el comportamiento similar a la ansiedad en ratones CVN tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") o con un isotipo de control ("AM 2B8"). Locomoción total (FIG. 2A) y locomoción en el centro del campo abierto (FIG. 2B).

FIGURA 3: Modelo de CVN in vivo que mide la memoria espacial en un laberinto de agua de brazo radial (FIG. 3A) en ratones CVN tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") o con un isotipo de control (FIG. 3B).

FIGURA 4: Modelo de NVC in vivo que mide la densidad de las sinapsas GABAérgicas y la concentración del transportador vesicular GABA (TVGA) en ratones CVN tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") o con isotipo de control. Vesículas positivas para TVGA (FIG. 4A) y nivel de intensidad de tinción de TVGA por vesícula (FIG. 4B).

FIGURA 5: Modelo YAC128 in vivo que mide el comportamiento similar a la ansiedad en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") y con isotipo de control. Entradas en (FIG. 5A) y tiempo de permanencia en el centro del campo (FIG. 5B).

FIGURA 6: Modelo YAC128 in vivo que mide la memoria espacial en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ^{("AM 67") y con isotipo de control. Panel A = Ensayo 1}(FiG.^{6A), y Panel B = Ensayo 2 (FIG. 6B).}

FIGURA 7: Modelo YAC128 in vivo que mide el volumen cortical (FiG. 7A) y el cuerpo calloso (FIG. 7B) en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") o con isotipo de control.

FIGURA 8: Modelo YAC128 in vivo que mide la degeneración testicular en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") o con isotipo de control.

FIGURE 9A-P: Análisis inmunohistoquímico de los tipos de células que expresan SEMA4D, plexina-BI, y CD72 en la médula espinal de una rata normal. Nkx2.2 (panel B) es un marcador celular precursor de oligodendrocitos, proteína del ácido fibrilar glial (PAFG) (panel G) es un marcador celular astrocítico, e Ibal (panel N) es un marcador celular microglial. Los paneles A, E, I, y M muestran imágenes fusionadas, y los paneles D, H, L y P, muestran las mismas secciones teñidas con DAPI para visualizar los núcleos celulares. FIGURA 10: Análisis inmunohistoquímico con DAB de la patología amiloide y activación glial en ratones normales (tres paneles superiores) y CVN (tres paneles inferiores). Se tiñeron las secciones del subículo para la beta-amiloide 1-42 (paneles de la izquierda), el marcador de células microgliales Iba1 (paneles centrales) y el marcador de células astrocíticas PAFG.

FIGURAS 11A-11B: Caracterización y patrones de expresión de los receptores de plexina-BI y plexina-B2 en el modelo de ratón CVN de la enfermedad de Alzheimer. La FIG. 11A muestra el análisis inmunohistoquímico de la expresión de plexina-BI en ratones normales (paneles superiores) y CVN (paneles inferiores). Las secciones del cerebro fueron teñidas para plexina-BI, y PAFG, así como DAPI para visualizar los núcleos celulares. La FIG. 11B muestra los niveles de expresión de plexina-BI (gráfica izquierda) y de plexina-B2 (gráfica derecha) tras la inhibición de la señalización de SEMA4D.

FIGURA 12: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de plexina-B2 en ratones normales (paneles superiores) y YAC128 (paneles inferiores). Las secciones del cerebro fueron teñidas para plexina-B2, y PAFG, así como DAPI para visualizar los núcleos celulares. FIGURA 13: Representación esquemática de los papeles que la señalización de SEMA4D puede desempeñar en la regulación de la función de los astrocitos en la salud y la enfermedad. Paneles de la izquierda: los procesos astrocíticos con plexina+ (región sombreada de la superficie exterior del astrocito) se interdigitan entre SEMA4D+ NIKX2.2+ células precursoras de oligodendrocitos (CPO) y proporcionan soporte trófico (SEMA4D+ mostrada como región sombreada de la superficie exterior de CPO). En la enfermedad del SNC, los astrocitos activados regulan positivamente la expresión de plexina y los procesos de retracción mediante la señalización de SEMA4D. Localmente, esto da como resultado la disminución del soporte trófico y el aumento del movimiento de CPO estimulado por quimiotaxis hacia las regiones de daño, mientras que la falta de soporte astrocítico en el lugar de la lesión impide la remielinización. Panel del centro: En la enfermedad del SNC, la activación astrocítica conlleva a una regulación positiva de la expresión de plexina (región sombreada de la superficie exterior del astrocito), aumento de la señalización de SEMA4D y procedimiento de retracción, lo que resulta en una pérdida de la guía de los axones neuronales, disminución del soporte trófico, y/o alteración de la regulación de la captación/liberación de glutamato. En última instancia, dependiendo de la gravedad del estímulo de la enfermedad, se puede producir la pérdida de sinapsis y la subsiguiente muerte de neuronas excitotóxicas. Panel de la derecha: La activación de los astrocitos inducida por la enfermedad del SNC aumenta la señalización de SEMA4D a través de plexina (región sombreada de la superficie exterior del astrocito), que conlleva a una retracción de los procesos del pie astrocítico como se evidencia en la redistribución de la acuaporina-4. Esto da como resultado una alteración de la regulación y permeabilidad de la BHE, facilitando así la inflamación endotelial ^{y la subsiguiente entrada de leucocitos en el}sNc.

FIGURA 14: Análisis inmunohistoquímico que muestra las CPO que expresan SEMA4D orientadas en estrecha asociación con los procesos astrocíticos PAFG+ en ratas normales. Se tiñeron secciones del cerebro para SEMA4D (CPO), y PAFG (astrocitos), así como DAPI para visualizar los núcleos celulares.

FIGURA 15 A, B, C, D: Modelo CVN in vivo que mide la señalización positiva para somatostatina (panel A), neuropéptido-Y (NPY) (panel B), receptor NPY 1 (NPY1R) (panel C), o receptor NPY 2 (NPY2R) (panel D) en el subículo o circunvolución dentada, respectivamente, en ratones CVM tratados con anticuerpo anti-SEMA4D ("AM 67") o con isotipo de control. Las barras de error indican un error estándar. "*"=p<0,05 y "***"=p<0,005 por ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.

FIGURA 16: Análisis inmunohistoquímico de los patrones de expresión de la acuaporina-4 en ratones normales y CVN.

FIGURA 17: Modelo DIV-BBB in vitro que mide la integridad de la barrera hematoencefálica tras la adición del anticuerpo monoclonal anti-SEMA4D VX15/2503.

FIGURAS 18A-18B: Análisis inmunocitoquímico que muestra la activación de astrocitos en los astrocitos de ratas. La FIG. 18A muestra el análisis inmunocitoquímico de la activación de los astrocitos como se refleja en el aumento relativo del área positiva para PAFG en los astrocitos cultivados de rata tratados con SEMA4D de forma aislada o después del pretratamiento con tioacetamida (TAA). La FIG. 18B muestra el análisis inmunocitoquímico de la activación de los astrocitos que se refleja en la relación F-actina y G-actina en los astrocitos cultivados de rata tratados con SEMA4D de forma aislada o en combinación con prostaglandina D2. Las barras de error representan la desviación típica. "*"=p<0,05 por ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.

Descripción detallada de la divulgación

I. Definiciones

Debe observarse que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un anticuerpo anti-SEMA4D" representa uno o más anticuerpos anti-SEMA4D. Como tales, los términos "un"(o "una"), "uno o más", y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.

Además, "y/o" cuando se usa en el presente documento debe considerarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por consiguiente, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A y/o B" en el presente documento tiene por objeto incluir "A y B", "A o B", "A" (solo), y "B" (solo). De manera análoga, el término "y/o" como se usa en una expresión tal como "A", B, y/o C" tiene por objeto abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la materia a la que la divulgación se refiere entiende habitualmente. Por ejemplo, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto en la materia un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente divulgación.

Unidades, prefijos y símbolos se denotan en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen a los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi. Los encabezados que se proporcionan en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o aspectos de la divulgación, que se pueden tener por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. En consecuencia, los términos que se definen inmediatamente a continuación se definen con mayor detalle por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Como se usa en el presente documento, La expresión sustancia, composición, entidad de "origen no natural", y/o cualquier combinación de sustancias, composiciones, o entidades, o cualquier variante gramatical de las mismas, es un término condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye, esas formas de la sustancia, composición, entidad de "origen no natural", y/o cualquier combinación de sustancias, composiciones, o entidades que son bien entendidas por expertos en la materia por ser de "origen natural", o que son, o podrían serlo en cualquier momento, determinadas o interpretadas por un evaluador o un órgano administrativo o judicial para que sea de, "origen natural".

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno neurodegenerativo" o "enfermedad neurodegenerativa" se refiere a un trastorno del sistema nervioso central (SNC) que se caracteriza por la muerte de neuronas en una o más regiones del sistema nervioso y el subsiguiente deterioro funcional de las partes afectadas. Ejemplos de trastornos neurodegenerativos incluyen, sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH (HAND, trastorno neurocognitivo) asociado con el VIH), lupus del SNC y deterioro cognitivo leve. Las enfermedades neurodegenerativas tienen un enorme impacto en las vidas de los individuos afectados y sus familias, así como en la sociedad en su conjunto.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad de Alzheimer" se refiere a una enfermedad progresiva que se manifiesta inicialmente con amnesia parcial, y posteriormente con inquietud, desorientación, afasia, agnosia o apraxia (disminución cognitiva), demencia y en ocasiones euforia o depresiones. La enfermedad suele comenzar entre los 40 y 90 años de edad y afecta predominantemente a las mujeres. En cuanto a su prevalencia, se estima que alrededor del 13 % de la población es mayor de 65 años.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad de Huntington" se refiere a una enfermedad neurodegenerativa, que se debe a la expansión de un tracto de poliglutamina en el extremo N-terminal de la proteína huntingtina (expresada por el gen HTT), en la que la expansión puede ser de más de 35-40 repeticiones del aminoácido glutamina en la proteína mutada (HTTm). La enfermedad se presenta con muerte neuronal progresiva en diferentes áreas del cerebro, incluyendo toxicidad en las neuronas espinosas de tamaño medio del estriado que determina la aparición de la clásica incoordinación motora y los movimientos tales como "corea". El mecanismo de acción de la HTTm se ha descrito tanto como ganancia como pérdida de función en comparación con la proteína de tipo silvestre e implica la adquisición o pérdida de competencia para interactuar con diversas proteínas en diferentes compartimentos celulares.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un anticuerpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgánica pequeña, u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de un trastorno neurodegenerativo, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede aliviar los síntomas del trastorno; disminuir, reducir, retardar o detener la incidencia de los síntomas; disminuir, reducir, retardar la gravedad de los síntomas; inhibir, p. ej., suprimir, retardar, prevenir, detener o revertir la manifestación de los síntomas; aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno; reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; una combinación de tales efectos.

El término "síntomas" al que se hace referencia en el presente documento se refiere, p. ej., a 1) síntomas neuropsiquiátricos, 2) síntomas cognitivos, y 3) disfunción motora. Ejemplos de síntomas neuropsiquiátricos incluyen, por ejemplo, un comportamiento similar a la ansiedad. Ejemplos de síntomas cognitivos incluyen, por ejemplo, déficits de aprendizaje y de memoria. Ejemplos de disfunción motora incluyen, por ejemplo, locomoción.

Términos tales como "tratar" o "tratamiento" o "para tratar" o "aliviar" o "para aliviar" o "mejorar" o "para mejorar" se refieren a tanto 1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas de, invierten y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado y 2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico diana. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos en los que el trastorno va a prevenirse. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, alivio de síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la afección o trastorno, además de aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que la afección o trastorno va a prevenirse.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se indica cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja, y animales de zoológico, para deportes, o mascotas, tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado vacuno, vacas, osos,, etc.

Como se usa en el presente documento, expresiones tales como "un sujeto que se beneficiaría de la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D" y "un animal en necesidad de tratamiento" incluyen sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D u otra molécula de unión a SEMA4D usada, p. ej., para la detección de un polipéptido SEMA4D (p. ej., para un procedimiento de diagnóstico) y/o de tratamiento, es decir, paliación o prevención de una enfermedad, con un anticuerpo anti-SEMA4D u otra molécula de unión a SEMA4D.

Una "molécula de unión" o "molécula de unión al antígeno" de la presente divulgación se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. En una realización, la molécula de unión se une específicamente a SEMA4D, p. ej., a un polipéptido SEMA4D transmembrana de aproximadamente 150 kDa o un polipéptido SEMA4D soluble de aproximadamente 120 kDa (comúnmente denominado SEMA4Ds). En otra realización, una molécula de unión de la divulgación es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En otra realización, una molécula de unión de la divulgación comprende al menos una RDC de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión de la divulgación comprende al menos dos RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión de la divulgación comprende al menos tres RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión de la divulgación comprende al menos cuatro RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión de la divulgación comprende al menos cinco RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión de la divulgación comprende al menos seis RDC de una o más moléculas de anticuerpo.

La presente divulgación está dirigida a un procedimiento de alivio de los síntomas en un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo, que comprende administrar al sujeto una molécula de unión anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. A menos que se haga específicamente referencia a anticuerpos de tamaño completo tales como los anticuerpos de origen natural, la expresión "anticuerpo anti-SEMA4D" abarca anticuerpos de tamaño completo, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes, análogos, o derivados de tales anticuerpos, p. ej., anticuerpo de origen natural o moléculas de inmunoglobulina o moléculas de anticuerpo genomanipuladas o fragmentos que se unen al antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe más adelante y, por ejemplo, en la patente de e E.UU. n.° 5.939.598 de Kucherlapati y col. Anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" también incluyen anticuerpos que comprenden al menos el dominio variable de una cadena pesada, o al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera, en el que el (los) dominio(s) variable(s) tienen la secuencia de aminoácidos del (los) dominio(s) variable(s) de inmunoglobulinas humanas.

Anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" también incluyen anticuerpos "humanos" o "completamente humanos", como se ha descrito anteriormente, que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpo (p. ej., las regiones VH y/o regiones VL) descritas en el presente documento, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido SEMA4D o fragmento o variante del mismo. Pueden usarse técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-SEMA4D humano, incluyendo, entre otros, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que produce sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la región VH de referencia, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, región VL, VLCDR1, VLCDR2, o VLCDR3.

En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas, discutidas adicionalmente a continuación. Como alternativa, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden identificarse selectivamente para actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad (p. ej., la capacidad de unirse a un polipéptido SEMA4D, p. ej., humana, murina, o tanto humana como murina SEMA4D). Tales variantes (o derivados de los mismos) de anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" también pueden denominarse anticuerpos humanos o completamente humanos que son "optimizados" u "optimizados para unión al antígeno" e incluyen anticuerpos que tienen afinidad mejorada hacia el antígeno.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en los sistemas de vertebrado son relativamente bien entendidas. Véase, p. ej., Harlow y col. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Aquellos expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, m, ^{a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (p. ej.,}Y1-y4). ^{Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG, o IgE,}respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente perceptibles para el experto en la materia en vista de la presente divulgación y, por consiguiente, están dentro del ámbito de la presente divulgación. Todas las clases de inmunoglobulina están claramente dentro del ámbito de la presente divulgación, la siguiente discusión generalmente se dirigirá a la clase de IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina convencional comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos con peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos con peso molecular de 53.000-70.000. Las cuatro cadenas normalmente se unen por enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras unen las cadenas pesadas empezando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras se clasifican o bien como kappa o bien como lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con cualquiera de una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan o bien por hibridomas, linfocitos B o bien por células huésped genomanipuladas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van de un extremo N-terminal en los extremos ahorquillados de la configuración en Y al extremo C-terminal en el final de cada cadena.

Las cadenas ligeras y pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. En este sentido, se apreciará que los dominios variables de tanto las porciones de cadena ligera (VL o VK) como pesada (VH) determinan el reconocimiento del antígeno y la especificidad. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (normalmente CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor de Fc, unión al complemento, y similares. Convencionalmente, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales desde el sitio de unión al antígeno o extremo amino-terminal del anticuerpo. La porción del extremo N-terminal es una región variable y en la porción del extremo C-terminal está una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden normalmente el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se ha indicado anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos sobre antígenos. Es decir, se combinan el dominio VL y el dominio VH, o el subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) dentro de estos dominios variables, de un anticuerpo para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión al antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno se define por tres RDC sobre cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos, p. ej., ciertas moléculas de inmunoglobulina derivadas de especies de camélido o genomanipuladas basándose en inmunoglobulinas de camélido, una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir en cadenas pesadas solo, sin cadenas ligeras. Véase, p. ej., Hamers-Casterman y col., Nature 363:446-448 (1993).

En anticuerpos que de origen natural, las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "RDC" presentes en cada dominio de unión al antígeno son secuencias no contiguas cortas de aminoácidos que están específicamente situadas para formar el dominio de unión al antígeno a medida que el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión al antígeno, denominados regiones "marco conservadas", muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco conservadas adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las RDC forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. De este modo, las regiones marco conservadas actúan formando un armazón que proporciona el posicionamiento de las RDC en orientación correcta por interacciones intercatenarias, no covalentes. El dominio de unión al antígeno formado por las RDC colocadas define una superficie complementaria al epítopo sobre el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo cognado. Los aminoácidos que comprenden las RDC y las regiones marco conservadas, respectivamente, pueden ser fácilmente identificadas para cualquier dominio variable de la cadena pesada o ligera dado por un experto en la materia, ya que han sido definidas con precisión (véase más adelante).

En el caso en el que haya dos o más definiciones de un término que se usa y/o está aceptado dentro de la materia, la definición del término como se usa en el presente documento tiene por objeto incluir todos los significados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de la complementariedad" ("RDC") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de tanto polipéptidos de cadena pesada como ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat y col. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" y por Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que se incorporan en el presente documento por referencia, en el que las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de restos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquier definición para referirse a una RDC de un anticuerpo o variantes del mismo tiene por objeto estar dentro del ámbito del término que se define y se usa en el presente documento. Los restos de aminoácidos apropiados que abarcan las RDC como se define por cada una de las referencias anteriormente citadas se exponen a continuación en la Tabla 1 como una comparación. Los números exactos de restos que abarcan una RDC particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la RDC. Los expertos en la materia pueden determinar rutinariamente qué restos comprenden una RDC particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1. Definiciones de RDC1

Kabat y col. también definieron un sistema de numeración para secuencias del dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia del dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat y col. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest". A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de las posiciones de restos aminoácidos específicos en un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, de la presente divulgación son según el sistema de numeración de Kabat.

Anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados del mismo de la divulgación incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos y biespecíficos en los que al menos un brazo es específico para SEMA4D, anticuerpos humanos, humanizados, primatizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de unión al epítopo, p. ej., Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fv monocatenarios (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden ya sea un dominio VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, p. ej., anticuerpos anti-Id para los anticuerpos anti-SEMA4D desvelados en el presente documento). Las moléculas de scFv son conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. n.° 5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo de la divulgación pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2, etc.), o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de la inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, un polipéptido que comprende una ^{porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio VH, un dominio}Ch1, ^{un dominio bisagra (p. ej.,}región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido de unión para su uso en la divulgación puede comprender una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH2; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH3, o una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la divulgación comprende una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para su uso en la divulgación puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (p. ej., la totalidad o parte de un dominio CH2). Como se ha expuesto anteriormente, un experto en la materia entenderá que estos dominios (p. ej., las porciones de cadena pesada) pueden modificarse de forma que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural.

En ciertos anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos desvelados en el presente documento, las porciones de cadena pesada de una cadena de polipéptidos de un multímero son idénticas a aquellas en una segunda cadena de polipéptidos del multímero. Como alternativa, los monómeros que contienen una porción de cadena pesada de la divulgación no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión diana diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico.

Las porciones de cadena pesada de una molécula de unión para su uso en los procedimientos desvelados en el presente documento pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena ^{pesada de un polipéptido puede comprender un dominio}C^{h1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra}derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de la inmunoglobulina, p. ej., una cadena ligera kappa o lambda. En algunos aspectos, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio VL o CL.

Anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos desvelados en el presente documento pueden describirse o especificarse en términos del (de los) epítopo(s) o porción(es) de un antígeno, p. ej., un polipéptido diana desvelado en el presente documento (p. ej., SEMA4D) que reconocen o al que se unen específicamente. La porción de un polipéptido diana que interacciona específicamente con el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo es un "epítopo", o un "determinante antigénico". Un polipéptido diana puede comprender un único epítopo, pero normalmente comprende al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos, dependiendo del tamaño, conformación y tipo de antígeno. Además, debe observarse que un "epítopo" sobre un polipéptido diana puede ser o puede incluir elementos no polipeptídicos, p. ej., un epítopo puede incluir una cadena lateral de carbohidrato.

Se cree que el tamaño mínimo de un epítopo de péptido o polipéptido para un anticuerpo tiene aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptido o polipéptido pueden contener, p. ej., al menos siete, al menos nueve o entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Ya que una RDC puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos, y en algunos casos, pueden estar sobre las mismas cadenas de péptido separadas. Un epítopo de péptido o polipéptido reconocido por los anticuerpos anti-SEMA4D de la presente divulgación puede contener una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de SEMA4D.

Por "se une específicamente a" significa generalmente que un anticuerpo se une a un epítopo mediante su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica una determinada complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, mediante su dominio de unión al antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo no relacionado aleatorio. El término "especificidad" se usa en el presente documento para limitar la afinidad relativa por la que un cierto anticuerpo se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo "A" tiene una especificidad más alta para un epítopo dado que el anticuerpo "B", o puede decirse que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad más alta que la que tiene para el epítopo "D" relacionado.

Por "se une preferentemente", significa que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo, o análogo. De este modo, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado se uniría más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, incluso cuando tal anticuerpo puede reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.

A modo de ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una constante de disociación (Kd) que es inferior a la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior a la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior a la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo.

En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una constante de disociación (k(dis)) que es inferior a la (k(dis)) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior a la (k(dis)) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior a la (k(dis)) del anticuerpo para el segundo epítopo. Puede decirse que anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado desvelado en el presente documento se une a un polipéptido diana desvelado en el presente documento (p. ej., SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D) o un fragmento o variante del mismo con una constante de disociación (k(dis)) inferior o igual a 5 X 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 X 10-3 s-1 o 10-3 s-1. En ciertos aspectos, puede decirse que un anticuerpo de la divulgación se une a un polipéptido diana desvelado en el presente documento (p. ej., SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D) o un fragmento o variante del mismo con una constante de disociación (k(dis)) inferior o igual a 5 X 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 X 10-5 s-1, o 10-5 s-1, 5 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 o 10-7 s-1.

Puede decirse que anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado desvelado en el presente documento se une a un polipéptido diana desvelado en el presente documento (p. ej., SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D) o un fragmento o variante del mismo con una constante de asociación (k(as)) superior o igual a 103 M-1 s-1, 5 X 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 o 5 X 104 M-1 s-1. En algunas realizaciones, puede decirse que un anticuerpo de la divulgación se une a un polipéptido diana desvelado en el presente documento (p. ej., SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D) o un fragmento o variante del mismo con una constante de asociación (k(as)) superior o igual a 105 M-1 s-1, 5 X 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, o 5 X 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1.

Se dice que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferencialmente a ese epítopo hasta el punto que bloquee, en cierta medida, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competición. Puede decirse que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos 90 %, al menos 80 %, al menos 70 %, al menos 60 % o al menos 50 %.

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a una medida de la resistencia de la unión de un epítopo individual con la RDC de una molécula de inmunoglobulina. Véase, p. ej., Harlow y col. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.) páginas 27-28. Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la estabilidad total del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la resistencia de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulinas con el antígeno. Véase, p. ej., Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos, como también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería una de alta avidez.

Los anticuerpos anti-SEMA4D o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la divulgación también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en el presente documento, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, para reaccionar con un segundo antígeno; una medida de conexión entre dos sustancias antigénicas diferentes. De este modo, un anticuerpo es reactivo de forma cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo reactivo de forma cruzada contiene generalmente muchas de las mismas características estructurales complementarias al igual que el epítopo inductor, y en algunos casos, puede en realidad adaptarse mejor que el original.

Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen un determinado grado de reactividad cruzada, porque se unen a epítopos relacionados, pero no idénticos, p. ej., epítopos con al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 %, y al menos 50 % de identidad (como se calcula usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos de 95 %, menos de 9o %, menos de 85 %, menos de 80 %, menos de 75 %, menos de 70 %, menos de 65 %, menos de 60 %, menos de 55 %, y menos de 50 % de identidad (como se calcula usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede ser considerado "altamente específico" para un cierto epítopo, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo, u homólogo de ese epítopo.

Las moléculas de unión anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, de la divulgación también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la divulgación, p. ej., SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D. En ciertos aspectos, las afinidades de unión incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 * 10-3 M, 10-3 M, 5 * 10-4 M, 10-4 M, 5 * 10-5 M, 10-5M, 5 * 10-6 M, 10-6 M, 5 * 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 * 10-9 M, 10-9 M, 5 * 10-10 M, 10-10 M, 5 * 10-11 M, 10-11 M, 5 * 10-12 M, 10-12 M, 5 * 10-13 M, 10-13 M, 5 * 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, o 10-15 M. En ciertas realizaciones, la molécula de unión anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, de la divulgación se une a SEMA4D humana con una Kd de aproximadamente 5 x 10-9 a aproximadamente 6 x 10-9. En otra realización, la molécula de unión anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, de la divulgación se une a SEMA4D murina con una Kd de aproximadamente 1 x 10-9 a aproximadamente 2 x 10-9.

Como se usa en el presente documento, se mantendrá que el término "anticuerpo quimérico" significa cualquier anticuerpo en el que la región inmunorreactiva o sitio se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, parcial o modificada según la presente divulgación) se obtiene de una segunda especie. En ciertas realizaciones, la región de unión diana o sitio será de una fuente no humana (p. ej., ratón o primate) y la región constante es humana.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo genomanipulado" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en cualquiera de la cadena pesada o ligera o ambas está alterado por un reemplazo al menos parcial de una o más RDC de un anticuerpo de especificidad conocida y, si es necesario, por reemplazo de la región marco conservada parcial y cambio de secuencia. Aunque las RDC pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco conservadas, se prevé que las RDC se deriven de un anticuerpo de clase diferente y de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo genomanipulado en el que una o más RDC "donantes" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injertan en una región marco conservada de la cadena pesada o ligera humana se denomina en el presente documento "anticuerpo humanizado". No siempre es necesario reemplazar todas las RDC con las RDC completas del dominio variable del donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, se puede transferir simplemente aquellos restos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión diana.

Se reconoce además que las regiones marco conservadas dentro del dominio variable en una cadena pesada o ligera, o ambas, de un anticuerpo humanizado pueden comprender únicamente restos de origen humano, en cuyo caso estas regiones marco conservadas del anticuerpo humanizado se denominan "regiones marco conservadas completamente humanas" (por ejemplo, AM 1515/2503 o 67, desvelado en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2010/0285036 A1 como AM 2503). Como alternativa, uno o más restos de la(s) región(es) marco conservada(s) del dominio variable del donante pueden genomanipularse en la posición correspondiente de la(s) región(es) marco conservada(s) de un dominio variable en una cadena pesada o ligera, o ambas, de un anticuerpo humanizado si fuera necesario para mantener la unión apropiada o para mejorar la unión al antígeno SEMA4D. Una región marco conservada humana que ha sido genomanipulada de esta manera comprendería por tanto una mezcla de restos de la región marco conservada humanos y de donante, y se denomina en el presente documento "región marco conservada parcialmente humana".

Por ejemplo, la humanización de un anticuerpo anti-SEMA4D puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo RDC de roedor o de roedor mutante o secuencias de RDC con las secuencias correspondientes de un anticuerpo anti-SEMA4D humano. Véanse también las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. El anticuerpo anti-SEMA4D humanizado resultante comprendería al menos una RDC de roedor o de roedor mutante dentro de las regiones marco conservadas completamente humanas del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo humanizado. En algunos casos, restos dentro de las regiones marco conservadas de uno o más dominios variables del anticuerpo anti-SEMA4D humanizado están sustituidos con restos no humanos correspondientes (por ejemplo, de roedor) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370), en cuyo caso el anticuerpo anti-SEMA4D humanizado resultante comprendería regiones marco conservadas parcialmente humanas dentro del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo (p. ej., para obtener afinidad deseada). En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las RDC se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones marco conservadas son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones y col., Nature 331:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" pueden incluir anticuerpos en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de RDC y posiblemente algunos restos de la región marco conservada están sustituidos con restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Véanse también la patente de EE. UU. n.° 6.180.370 y la publicación internacional n.° WO 01/27160, en la se desvelan anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados que tienen afinidad mejorada para un antígeno predeterminado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "proveedor de asistencia sanitaria" se refiere a individuos o instituciones que interactúan y administran directamente a sujetos vivos, p. ej., pacientes humanos. Ejemplos no limitativos de proveedores de asistencia sanitaria incluyen doctores, enfermeros, técnicos, terapeutas, farmacéuticos, consejeros, médicos de medicina alternativa, instalaciones médicas, consultorios médicos, hospitales, urgencias, clínicas, centros de atención de urgencias, clínicas/instalaciones de medicina alternativa, y cualquier otra entidad que proporcione tratamiento general y/o especializado, evaluación, mantenimiento, terapia, medicación, y/o consejos relacionados con todo, o cualquier parte del, estado de salud de un paciente, incluyendo, entre otros, medicina general, medicina especializada, cirugía, y/o cualquier otro tipo de tratamiento, evaluación, mantenimiento, terapia, medicación y/o consejos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "proveedor de prestaciones de asistencia sanitaria" abarca partes individuales, organizaciones, o grupos que proporcionan, presentan, ofrecen, pagan en su totalidad o en parte, o están asociados de alguna otra manera a dar a un paciente acceso a una o más prestaciones de asistencia sanitaria, planes de prestaciones, seguro médico, y/o programas de cuentas de gastos sanitarios.

Como se usa en el presente documento, la expresión "laboratorio clínico" se refiere a una instalación para el examen o procesamiento de materiales o imágenes derivadas de un sujeto vivo, p. ej., un ser humano. Los ejemplos no limitativos de procesamiento incluyen biológicos, bioquímicos, serológicos, químicos, inmunohematológicos, hematológicos, biofísicos, citológicos, patológicos, genéticos, basados en imágenes, u otro examen de materiales derivados del cuerpo humano o de cualquiera o todo el cuerpo humano con el fin de proporcionar información, p. ej., para el diagnóstico, prevención, o tratamiento de cualquier enfermedad o deficiencia, o la evaluación de la salud de los sujetos vivos, p. ej., seres humanos. Estos exámenes también pueden incluir procedimientos de recogida o de lo contrario obtención de una imagen, una muestra, para preparar, determinar, medir, o describir de otra manera la presencia o ausencia de diversas sustancias en el cuerpo de un sujeto vivo, p. ej., un ser humano, o una muestra obtenida del cuerpo de un sujeto vivo, p. ej., un ser humano.

II. Descripción de polipéptidos diana

Como se usa en el presente documento, los términos "semaforina-4D", "SEMA4D" y "polipéptido SEMA4D"se usan indistintamente, como son "SEMA4D" y "Sema4D". En ciertas realizaciones, SEMA4D es expresada sobre la superficie de o es secretada por una célula. En otra realización, SEMA4D está unida a una membrana. En otras realizaciones, SEMA4D es soluble, p. ej., SEMA4Ds. En otras realizaciones, SEMA4D puede incluir una SEMA4D de tamaño completo o un fragmento del mismo, o un polipéptido de variante SEMA4D, en el que el fragmento de SEMA4D o polipéptido de variante SEMA4D retiene alguna o todas las propiedades funcionales de SEMA4D de tamaño completo.

La proteína humana SEMA4D de tamaño completo es una proteína transmembrana homodimérica que consiste en dos cadenas de polipéptidos de 150 kDa. SEMA4D pertenece a la familia de la semaforina de los receptores de la superficie celular y también se denomina CD100. Tanto SEMA4D/Sema4D humana como de ratón son escindidas proteolíticamente de su forma transmembrana para generar formas solubles de 120 kDa, lo que indica la existencia de dos isoformas de Sema4D (Kumanogoh y col., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). Las semaforinas consisten en proteínas solubles y unidas a membrana que fueron originalmente definidas como factores de guía axonal que desempeñan un papel importante en el establecimiento de conexiones precisas entre neuronas y su diana apropiada. Estructuralmente considerada una semaforina de clase IV, la SEMA4D consiste en una secuencia señal del extremo amino-terminal seguida de un dominio "Sema" característico, que contiene 17 restos de cisteína conservados, un dominio similar a Ig, un tramo rico en lisina, una región transmembrana hidrófoba, y una cola citoplásmica.

Una cadena de polipéptidos de SEMA4D puede incluir una secuencia señal de aproximadamente 13 aminoácidos e incluye además un dominio de semaforina de aproximadamente 512 aminoácidos, un dominio similar a inmunoglobulina (similar a Ig) de aproximadamente 65 aminoácidos, un tramo rico en lisina de 104 aminoácidos, una región transmembrana hidrófoba de aproximadamente 19 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 110 aminoácidos. Un sitio consenso para la fosforilación de tirosina en la cola citoplásmica soporta la asociación prevista de SEMA4D con una tirosina quinasa (Schlossman, y col., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).

Se sabe que SEMA4D tiene al menos tres receptores funcionales, plexina-B1, plexina-B2 y CD72. Uno de los receptores, plexina-BI, se expresa en tejidos no linfoides y se ha mostrado que es un receptor de alta afinidad (1 nM) para SEMA4D (Tamagnone y col., Cell 99:71-80 (1999)). Se ha mostrado que la estimulación por SEMA4D de la señalización de plexina-BI induce el colapso del cono de crecimiento de neuronas, e induce el colapso de la extensión del proceso y la apoptosis de oligodendrocitos (Giraudon y col., J. Immunol. 172:1246-1255 (2004); Giraudon y col., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)). Después de la unión a SEMA4D, la señalización de plexina-BI media en la inactivación de R-Ras, dando lugar a una disminución en la fijación mediada por integrina a la matriz extracelular, así como a la activación de RhoA, dando lugar a la reorganización del citoesqueleto y migración celular. Véase Kruger y col., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64 (2005)). La plexina-B2, por otra parte, tiene una afinidad intermedia con SEMA4D e informes recientes indican que la plexina-B2 regula la migración de las neuronas corticales y la proliferación y migración de los neuroblastos en la zona subventricular adulta (Azzarelli y col., Nat Commun, 27 de febrero de 2014, 5:3405, DOI: 10.1038/ncomms4405; y Saha y col., J. Neuroscience, 21 de noviembre de 2012, 32(47):16892-16905).

En tejidos linfoides se usa CD72 como un receptor de baja afinidad (300 nM) de SEMA4D (Kumanogoh y col., Immunity 13:621-631 (2000)). Los linfocitos B y las CPA expresan CD72, y los anticuerpos anti-CD72 tienen muchos de los mismos efectos que SEMA4Ds, tales como el potenciamiento de las respuestas de linfocitos B inducidas por CD40 y la liberación de linfocitos B de CD23. Se cree que CD72 actúa como regulador negativo de las respuestas de linfocitos B reclutando la tirosina fosfatasa SHP-1, que puede asociarse con muchos receptores inhibidores. La interacción de SEMA4D con CD72 da como resultado la disociación de SHP-1, y la pérdida de esta señal de activación negativa. Se ha notificado que SEMA4D promueve la estimulación de linfocitos T y la agregación de linfocitos B y la supervivencia in vitro. La adición de células que expresan SEMA4D o SEMA4Ds potencia la proliferación de linfocitos B inducida por CD40 y la producción de inmunoglobulina in vitro, y acelera las respuestas de anticuerpos in vivo (Ishida y col., Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003); Kumanogoh y H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). La SEMA4Ds potencia la maduración inducida por CD40 de células dendríticas (CD), que incluye la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y el aumento de la secreción de IL-12. Además, SEMA4Ds puede inhibir la migración de células inmunitarias, que puede invertirse mediante la adición de anticuerpos de bloqueo anti-SEMA4D (Elhabazi y col., J. Immunol. 166:4341-4347 (2001); Delaire y col., J. Immunol. 166:4348-4354 (2001)).

Sema4D se expresa a altos niveles en órganos linfoides, que incluyen el bazo, timo y ganglios linfáticos, y en órganos no linfoides, tales como el cerebro, corazón y riñón. En órganos linfoides, Sema4D se expresa abundantemente en linfocitos T en reposo, pero solo se expresa débilmente en linfocitos B en reposo y células presentadoras de antígenos (CPA), tales como CD. La activación celular aumenta la expresión superficial de SEMA4D, así como la generación de SEMA4D soluble (SEMA4Ds).

El patrón de expresión de SEMA4D sugiere que desempeña un papel fisiológico importante, así como patológico en el sistema inmunitario. Se ha mostrado que SEMA4D promueve la activación, agregación y supervivencia de linfocitos B; potencia la proliferación inducida por CD40 y la producción de anticuerpos; potencia la respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; aumenta la proliferación de linfocitos T; potencia la maduración de células dendríticas y la capacidad para estimular linfocitos T; y está directamente implicada en la desmielinización y degeneración axonal (Shi y col., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh y col., J Immunol 169:1175-1181 (2002); y Watanabe y col., J Immunol 167:4321-4328 (2001)).

Los ratones nuligénicos SEMA4D (SEMA4D-/-) han proporcionado evidencia adicional de que SEMA4D desempeña un papel importante tanto en las respuestas inmunitarias humorales como celulares. No se conocen anomalías importantes de tejidos no linfoides en ratones SEMA4D-/-. Las CD de los ratones SEMA4D-/- tienen una capacidad aloestimulante deficiente y muestran defectos en la expresión de moléculas coestimuladoras, que pueden ser rescatadas mediante la adición de SEMA4Ds. Los ratones deficientes en SEMA4D (SEMA4D-/-) dejan de desarrollar encefalitis autoinmunitaria experimental inducida por el péptido de glicoproteína de oligodendrocito de mielina, puesto que los linfocitos T específicos de la glicoproteína de oligodendrocito de mielina son deficientemente generados en ausencia de SEMA4D (Kumanogoh y col., J Immunol 169:1175-1181 (2002)). También se detecta una cantidad significativa de SEMA4D soluble en los sueros de ratones MRL/lpr propensos a la autoinmunidad (modelo de enfermedades autoinmunitarias sistémicas tales como LES), pero no en ratones normales. Además, los niveles de SEMA4Ds se correlacionan con niveles de auto-anticuerpos y aumentan con la edad (Wang y col., Blood 97:3498-3504 (2001)). También se ha mostrado que SEMA4D soluble se acumula en el líquido cefalorraquídeo y los sueros de pacientes con enfermedad desmielinizante, y SEMA4Ds induce la apoptosis de precursores neurales pluripotentes humanos (células de Dev), e inhibe tanto la extensión del proceso como induce la apoptosis de oligodendrocitos de rata in vitro (Giraudon y col., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)). Esta apoptosis fue bloqueada por un AM anti-SEMA4D.

III. Anticuerpos anti-SEMA4D

Se han descrito en la materia anticuerpos que se unen a SEMA4D. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.496.938, las publicaciones estadounidenses n.° 2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1, y US 2006/0233793 A1, las solicitudes de patente internacional WO 93/14125, WO 2008/100995, y WO 2010/129917, y Herold y col., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995).

La divulgación generalmente se refiere a un procedimiento de alivio de los síntomas en un sujeto que tiene un trastorno neuroinflamatorio o neurodegenerativo, p. ej., un paciente humano, que comprende la administración de un anticuerpo que se une específicamente a SEMA4D, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo bloquea la interacción de SEMA4D con uno o más de sus receptores, p. ej., plexina-BI. Los anticuerpos anti-SEMA4D que tienen estas propiedades pueden usarse en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los anticuerpos que pueden usarse incluyen, entre otros, AM VX15/2503, 67, y 76 y fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos que se describen completamente en el documento US 2010/0285036 A1. Anticuerpos adicionales que pueden usarse en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen los anticuerpos BD16 y BB18 descritos en el documento US 2006/0233793 A1, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos; o cualquiera de AM 301, AM 1893, AM 657, AM 1807, AM 1656, AM 1808, AM 59, AM 2191, AM 2274, AM 2275, AM 2276, AM 2277, AM 2278, AM 2279, AM 2280, AM 2281, AM 2282, AM 2283, AM 2284, y AM 2285, así como cualquier fragmento, variante o derivado de los mismos como se describen en el documento US 2008/0219971 A1. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento se une a antincuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D. También son útiles anticuerpos que se unen al mismo epítopo como cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente y/o anticuerpos que inhiben competitivamente cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 89 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, o aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos para una molécula de anticuerpo anti-SEMA4D de referencia, por ejemplo aquellos descritos anteriormente. En una realización adicional, la molécula de unión comparte al menos aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o 100 % de identidad de secuencia con un anticuerpo de referencia.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (dominio VH), en la que al menos una de las RDC del dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a c Dr 1, CDR2 o CDR3 de SEQ ID NO: 9 o 10.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (dominio VH), en la que al menos una de las RDC del dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (dominio VH), en la que al menos una de las RDC del dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto para 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservadas, con SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, en la que el anticuerpo anti-SEMA4D que comprende el dominio VH codificado se une específicamente o preferentemente a SEMA4D.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (dominio VL), en la que al menos una de las RDC del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a CDR1, CDR2 o CDR3 de SEQ ID NO: 17 o 18.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (dominio VL), en la que al menos una de las RDC del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (dominio VL), en la que al menos una de las RDC del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto para 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservadas, con SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

En una realización adicional, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, en la que el anticuerpo anti-SEMA4D que comprende el dominio VL codificado se une específicamente o preferentemente a SEMA4D.

También se incluyen para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento polipéptidos que codifican anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos descritos en el presente documento, polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, vectores que comprenden tales polinucleótidos, y células huésped que comprenden tales vectores o polinucleótidos, todo ello para producir anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento.

Variantes biológicamente activas adecuadas de los anticuerpos anti-SEMA4D útiles en la divulgación pueden usarse en los procedimientos de la presente divulgación. Tales variantes retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti-SEMA4D parental. Procedimientos de producción de variantes de anticuerpo están generalmente disponibles en la técnica.

Procedimientos de mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel y col., Methods Enzymol.

154:367-382 (1987); Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); patente de EE.UU. n.° 4.873.192; y las referencias citadas en los mismos. La guía con respecto a sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés pueden encontrarse en el modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), págs. 345-352. El modelo de Dayhoff y col. usa la matriz de similitud de aminoácidos de mutación puntual aceptada (MPA) (matriz MPA 250) para determinar sustituciones de aminoácidos conservadoras adecuadas. En ciertas realizaciones, pueden usarse sustituciones conservadoras, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras como se enseñan por la matriz MPA 250 del modelo de Dayhoff y col., incluyen, entre otros, G ly^Ala, Val^Ile^-Leu, Asp^G lu, Lys^Arg, Asn^G ln, y P he^Trp^Tyr.

En la construcción de variantes de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, polipéptidos de interés, se hacen modificaciones de manera que las variantes continúan poseyendo las propiedades deseadas, p. ej., son capaces de unirse específicamente a una SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D, p. ej., expresada sobre la superficie de o secretada por una célula y que tiene actividad de bloqueo de SEMA4D, como se describe en el presente documento. Obviamente, cualquier mutación realizada en el ADN que codifica el polipéptido de variante no ha de colocar la secuencia fuera del marco de lectura y en ciertas realizaciones no creará regiones complementarias que pudieran producir una estructura de ARNm secundaria. Véase la publicación de solicitud de patente EP n.° 75.444.

Procedimientos de medición de la especificidad de unión de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, incluyen, entre otros, ensayos de unión competitiva convencionales, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por linfocitos T o linfocitos B, ensayos de proliferación de linfocitos T, ensayos de apoptosis, ensayos de ELISA, y similares. Véanse, por ejemplo, tales ensayos desvelados en el documento WO 93/14125; Shi y col., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh y col., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe y col., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang y col., Blood 97:3498-3504 (2001); y Giraudon y col., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004).

Cuando se discute en el presente documento si cualquier polipéptido particular, que incluye las regiones constantes, RDC, dominios VH, o dominios VL desvelados en el presente documento, es al menos aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99%, o incluso aproximadamente 100% idéntico a otro polipéptido, el % de identidad puede determinarse usando procedimientos y programas informáticos/software conocidos en la técnica tales como, pero no se limitan a, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489, para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFlT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia según la presente divulgación, los parámetros se establecen, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de polipéptidos de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

Para los fines de la presente divulgación, el porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferenciarse de un anticuerpo anti-SEMA4D de referencia (p. ej., AM VX15/2503, 67 o 76) en tan solo 1 a 15 restos de aminoácidos, en tan solo 1 a 10 restos de aminoácidos, tales como 6-10, en tan solo 5, en tan solo 4, 3, 2, o incluso 1 resto de aminoácido.

El porcentaje de "identidad de secuencia" también puede determinarse comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación. Con el fin de alinear óptimamente las secuencias para la comparación, la porción de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones denominadas huecos mientras la secuencia de referencia se mantiene constante. Un alineamiento óptimo es ese alineamiento que, incluso con huecos, produce el mayor número posible de posiciones "idénticas" entre las secuencias de referencia y de comparación. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias puede ser determinado usando la versión del programa "BLAST 2 Sequences" que estaba disponible en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica a partir del 1 de septiembre de 2004, cuyo programa incorpora los programas BLASTN (para la comparación de secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para la comparación de secuencias de polipéptidos), cuyos programas se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Cuando se usa "BLAST 2 Sequences", los parámetros que eran parámetros por defecto a partir del 1 de septiembre de 2004, pueden usarse para el tamaño de las palabras (3), la penalización por apertura de hueco (11), la penalización por extensión de hueco (1), la disminución de hueco (50), el valor esperado (10) y cualquier otro parámetro requerido, incluyendo, entre otros, la opción de la matriz.

La región constante de un anticuerpo anti-SEMA4D puede ser mutada para alterar la función efectora de varias formas. Por ejemplo, véanse la patente de EE.UU. n.° 6.737.056B1 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132101A1, que desvelan mutaciones de Fc que optimizan la unión del anticuerpo a receptores de Fc.

En ciertos anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos útiles en los procedimientos proporcionados en el presente documento, la porción Fc puede ser mutada para reducir la función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la región constante puede reducir la unión al receptor de Fc del anticuerpo modificado circulante aumentando así la localización tumoral. En otros casos, modificaciones de la región acorde con la presente divulgación moderan la unión del complemento y reducen por tanto la semivida en suero. Pueden usarse otras modificaciones de la región constante para modificar los enlaces disulfuro o fracciones de oligosacárido que permiten la localización mejorada debido a la elevada especificidad por antígenos o flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización del tumor, biodistribución y semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente usando técnicas inmunológicas muy conocidas sin experimentación indebida. Los anticuerpos anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen derivados que se modifican, p. ej., por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de modo que la unión covalente no prevenga que el anticuerpo se una específicamente al epítopo cognado. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, entre otros, escisiones químicas específicas, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden identificarse selectivamente para actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad (p. ej., la capacidad de unirse a un polipéptido anti-SEMA4D, para bloquear la interacción de SEMA4D con su receptor, o para aliviar los síntomas asociados con un trastorno neurodegenerativo en un paciente).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en regiones marco conservadas o solo en regiones RDC de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones sustitutivas silenciosas o neutras, es decir, no tienen, o tienen poco efecto sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones, o mejorar la producción de anticuerpos del hibridoma. Como alternativa, mutaciones sustitutivas no neutras pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Un experto en la materia sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como sin alteración en la actividad de unión al antígeno o alteración en la actividad de unión (p. ej., mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse rutinariamente y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada, (p. ej., la capacidad para unirse inmunoespecíficamente a al menos un epítopo de un polipéptido SEMA4D) puede determinarse usando técnicas descritas en el presente documento o modificando rutinariamente técnicas conocidas en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (RDC) optimizada. Por "RDC optimizada" se tiene por objeto que la RDC se haya modificado y optimizado para mejorar la afinidad de unión y/o actividad anti-SEMA4D que se imparte a un anticuerpo anti-SEMA4D que comprende la RDC optimizada. "Actividad anti-SEMA4D" o "actividad de bloqueo de SEMA4D" puede incluir actividad que modula una o más de las siguientes actividades asociadas con SEMA4D: activación, agregación y supervivencia de linfocitos B; proliferación inducida por CD40 y la producción de anticuerpos; respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; proliferación de linfocitos T u otras células inmunitarias; maduración de células dendríticas; desmielinización y degeneración axonal; apoptosis de precursores neurales pluripotentes y/u oligodendrocitos; inducción de migración de células endoteliales; inhibición de la migración espontánea de monocitos; unión a plexina-B1 de la superficie celular u otro receptor; o cualquier otra actividad asociada con SEMA4D soluble o SEMA4D que se expresa sobre la superficie de células SEMA4D+. La actividad anti-SEMA4D también puede atribuirse a una disminución en la incidencia o gravedad de enfermedades asociadas con la expresión de SEMA4D, incluyendo, entre otros, ciertos tipos de cánceres, incluyendo linfomas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, que incluyen enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central (SNC) y del sistema nervioso periférico (SNP), rechazos de trasplantes y angiogénesis invasiva. Ejemplos de anticuerpos optimizados basados en los AM anti-SEMA4D BD16 y BB18 murinos, se describieron en la publicación de EE. UU. n.° 2008/0219971 A1, solicitudes de patente internacional WO 93/14125 y Herold y col., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995). Las modificaciones pueden implicar el reemplazo de restos de aminoácidos dentro de la RDC de modo que un anticuerpo anti-SEMA4D retiene la especificidad para el antígeno SEMA4D y tiene afinidad de unión mejorada y/o actividad anti-SEMA4D mejorada.

IV. Astrocitos

Los astrocitos son células gliales especializadas que realizan muchas funciones complejas esenciales en el SNC sano, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo, homeostasis del fluido/ion/pH/neurotransmisor, formación/función de la sinapsis, energía y metabolismo, y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica (Barres BA (2008) The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron 60:430-440). De manera importante, los astrocitos responden a la lesión del SNC a través de un proceso denominado astrogliosis reactiva, que sirve como un distintivo patológico importante de las enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. Cada vez hay más pruebas que apuntan a la posibilidad de que la astrogliosis reactiva desempeñe un papel bien primario o bien contribuyente en los trastornos del SNC mediante la pérdida de las funciones normales de los astrocitos o la ganancia de las actividades anormales. Dado su papel central en muchas enfermedades del SNC, existe una necesidad significativa de identificar y probar rigurosamente nuevas dianas moleculares que restauren la función normal de los astrocitos para ralentizar eficazmente o incluso revertir la progresión de la enfermedad. Hay varias vías potenciales a través de las cuales los astrocitos pueden tener efecto en las enfermedades del SNC.

Astrocitos y soporte de CPO. La desmielinización que se produce en las enfermedades neuroinflamatorias, tales como la esclerosis múltiple, se asocia con una marcada destrucción y pérdida de las células que comprenden el linaje de los oligodendrocitos (Ozawa K, y col. Patterns of oligodendroglia pathology in multiple sclerosis. Brain.

1994;117:1311-1322.). Los mecanismos de remielinización endógena fallan durante la fase de recuperación, en parte debido a la incapacidad de las CPO para diferenciarse completamente en oligodendrocitos mielinizantes maduros (Wolswijk G. Oligodendrocyte survival, loss and birth in lesions of chronic-stage multiple sclerosis. Brain. 2000;123:105-115.). Los datos obtenidos de otros modelos de desmielinización inducida experimentalmente indican que las CPO de reciente maduración, a diferencia con los oligodendrocitos maduros supervivientes, se requieren para la remielinización durante la fase de recuperación (Levine JM, Reynolds R. Activation and proliferation of endogenous oligodendrocyte precursor cells during ethidium bromide-induced demyelination. Exp Neurol. 1999;160:333-347). Se ha mostrado que los astrocitos desempeñan un papel importante en el apoyo a la función y la viabilidad del linaje de oligodendrocitos. Por ejemplo, Talbott y sus colegas mostraron que en las lesiones desmielinizadas inducidas por el bromuro de etidio, se necesitan astrocitos para que las CPO Nkx2.2+/Olig2+ se diferencien completamente en oligodendrocitos y lleven a cabo la remielinización (Exp Neurol. marzo de 2005, 192(1):11-24. Las células precursoras de los oligodendrocitos endógenas Nkx2.2+/Olig2+ no logran la remielinización de la médula espinal desmielinizada ^{de una rata adulta en ausencia de astrocitos. Talbott JF, Loy DN, Liu Y, Qiu MS, Bunge MB, Rao}Ms, ^{Whittemore SR).}Arai y Lo demostraron in vitro que los astrocitos proporcionan soporte del factor trófico soluble a las CPO que protegen estas células del aumento del estrés oxidativo (Arai, K. y Lo, E. H. (2010), Astrocytes protect oligodendrocyte precursor cells via MEK/ERK and PI3K/Akt signaling. J. Neurosci. Res., 88: 758-763. doi: 10.1002/jnr.22256). Otros han mostrado que la inhibición de la activación de los astrocitos en el marco de la encefalomielitis autoinmune experimental, neuritis óptica experimental y lesión de la médula espinal conducen a una mejora de los perfiles de remilinización y de las medidas de resultados funcionales (Brambilla R, Persaud T, Hu X, Karmally S, Shestopalov VI, Dvoriantchikova G, Ivanov D, Nathanson L, Barnum SR, Bethea JR. 2009. Transgenic inhibition of astroglial NF-kappa B improves functional outcome in experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing chronic central nervous system inflammation. J Immunol 182:2628-2640; Brambilla R, Dvoriantchikova G, Barakat D, Ivanov D, Bethea JR, Shestopalov VI. 2012. Transgenic inhibition of astroglial NF-kappaB protects from optic nerve damage and retinal ganglion cell loss in experimental optic neuritis. J Neuroinflammation 9:213; Brambilla R, Bracchi-Ricard V, Hu WH, Frydel B, Bramwell A, Karmally S, Green EJ, Bethea JR. 2005. Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces inflammation and improves functional recovery after spinal cord injury. J Exp Med 202:145-156).

Dado el papel que desempeñan los astrocitos en la facilitación de la supervivencia y función de la CPO, la yuxtaposición de las CPO que expresan SEMA4D y los astrocitos que expresan receptores SEMA4D identificados aquí, sugiere que la activación de los astrocitos relacionada con la enfermedad, con la regulación positiva asociada de los receptores de plexina-B y la señalización de SEMA4D tienen profundos efectos sobre la función de las CPO.

Astrocitos y soporte neuronal La creciente evidencia indica que los astrocitos desempeñan un papel directo en la transmisión sináptica a través de la liberación regulada de moléculas sinápticamente activas, que incluyen glutamato, purinas (ATP y adenosina), GABA, y D-serina (revisado por Halassa MM, Fellin T, Haydon PG (2007), The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends Mol Med 13:54-63; Nedergaard M, Ransom B, Goldman SA (2003) New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci 26:523-530). La liberación de tales gliotransmisores se produce en respuesta a los cambios en la actividad sináptica neuronal, participa en la excitabilidad de los astrocitos como se refleja en el aumento de la señalización del calcio de los astrocitos, y puede alterar la excitabilidad neuronal (Halassa MM, Fellin T, Haydon PG (2007), The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends Mol Med 13:54-63; Nedergaard M, Ransom B, Goldman SA (2003) New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci 26:523-530). Además de tener efectos directos en la actividad sináptica a través de la liberación de gliotransmisores, los astrocitos tienen el potencial de ejercer poderosas influencias a largo plazo en la función sináptica mediante la liberación de factores de crecimiento y moléculas relacionadas (Barres BA (2008) The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron 60:430-440).

Astrocitos e integridad de la BHE. Los astrocitos desempeñan un papel esencial en la formación de la barrera ^{hematoencefálica (BHE) y en la regulación del transporte a través de la}bHe, ^{un proceso homeostático crítico para la}función neuronal apropiada. La BHE es una estructura endotelial cerebral altamente compleja del sistema neurovascular diferenciado comprendido de pericitos, astrocitos y células endoteliales. El compromiso de la BHE ha sido implicado en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo meningitis, edema cerebral, epilepsia, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), apoplejía, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y esclerosis múltiple (EM); revisado por Zlokovic BV. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 2011;12:723-738).

Los astrocitos son células "polarizadas" en el sentido de que extienden procesos membranosos especializados comprendidos de maquinaria celular única y componentes de membrana que interactúan con tipos de células específicas. Por ejemplo, los procesos astrocíticos próximos a los microvasos cerebrales o pía se caracterizan por una alta densidad del canal de agua, acuaporina 4 (Acp4) (Neely JD, Amiry-Moghaddam M, Ottersen OP, Froehner SC, Agre P, Adams ME (2001) Syntrophin-dependent expression and localization of Aquaporin-4 water channel protein. ^{Proc Natl Acad Sci U S A 98, 14108-14113; Amiry-Moghaddam M, Otsuka T, Hurn}Pd, ^{Traystman RJ, Haug FM,}Froehner SC, Adams ME, Neely JD, Agre P, Ottersen OP, Bhardwaj A (2003) An alpha-syntrophin-dependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2106-2111.). Por el contrario, los procesos astrocíticos que se enfrentan a las regiones sinápticas se enriquecen en los transportadores de glutamato, mientras que la densidad de Acp4 es comparativamente baja (Nielsen S, Nagelhus EA, Amiry-Moghaddam M, Bourque C, Agre P, Ottersen OP (1997) Specialized membrane domains for water transport in glial cells: High-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain. J Neurosci 17, 171-180; Chaudhry FA, Lehre KP, van Lookeren Campagne M, Ottersen OP, Danbolt NC, Storm-Mathisen J (1995) Glutamate transporters in glial plasma membranes: Highly differentiated localizations revealed by quantitative ultrastructural immunocytochemistry. Neuron 15, 711-720). De manera interesante, la polarización astrocítica se interrumpe en un cerebro que experimenta neurodegeneración. Por ejemplo, en el marco de la EA, las intensidades de tinción con Acp4 disminuyen significativamente en las regiones con una importante carga de placa amiloide. De hecho, Yang y sus colegas mostraron que la acumulación de patología amiloide en los ratones tg-ArcSwe con EA está acoplada temporal y espacialmente a la pérdida de polarización de astrocitos (J Alzheimer's Dis. 2011;27(4):711-22. doi: 10.3233/JAD-2011-110725; Loss of astrocyte polarization in the tg-ArcSwe mouse model of Alzheimer's disease. Yang JL, Lunde LK, Nuntagij P, Oguchi T, Camassa LM, Nilsson LN, Lannfelt L, Xu Y, Amiry-Moghaddam M, Ottersen OP, Torp R.).

Papel de la señalización de SEMA4D en la promoción de la activación de los astrocitos. Dada la asociación de la expresión del receptor SEMA4D y el marcador de activación de astrocitos PAFG, existe la posibilidad de que la señalización de SEMA4D pueda potenciar la activación de los astrocitos, proporcionando así un mecanismo de "proacción" durante los estados de enfermedad. Para examinar los efectos de SEMA4D en la activación de los astrocitos, se generaron cultivos primarios de astrocitos de rata y se trataron con SEMA4D en forma aislada o en combinación con tioacetamida (TAA) (Ejemplo 6 y Figura 18A más adelante), un conocido agente hepatotóxico y hepatocarcinógeno que ha mostrado inducir la expresión in vivo de la plexina-B1 (Lim, J. S., Jeong, S. Y., Hwang, J. Y., Park, H. J., Cho, J. W., & Yoon, S. (2006), o prostaglandina D2 (Ejemplo 6 y Figura 18B más adelante), un conocido factor de activación producido por la microglia en el SNC, Toxicogenomics Analysis on Thioacetamide-induced Hepatotoxicity in Mice. MOLECULAR & CELLULAR TOXICOLOGY, 2(2), 126-133.).

V. Procedimientos de tratamiento que usan anticuerpos anti-SEMA4D terapéuticos

Los procedimientos de la divulgación se dirigen al uso de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión al antígeno, variantes y derivados de los mismos, para tratar a un sujeto que tiene un trastorno neurodegenerativo. En ciertas realizaciones, las células endoteliales expresan un receptor SEMA4D, en otras, las células neuronales expresan un receptor SEMA4D, y en otras tanto las células endoteliales como las neuronales expresan un receptor SEMA4D. En ciertas realizaciones, el receptor es plexina-BI. Aunque la siguiente discusión se refiere a la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D, los procedimientos descritos en el presente documento también son aplicables a los fragmentos de unión al antígeno, variantes y derivados de estos anticuerpos anti-SEMA4D u otros productos biológicos o pequeñas moléculas que conservan las propiedades deseadas de los anticuerpos anti-SEMA4D de la divulgación, p. ej., capaces de unirse específicamente a SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, de ratón, o humana y de ratón SEMA4D, que tienen actividad neutralizante de SEMA4D, y/o bloquean la interacción de SEMA-4D con su receptor, p. ej., plexina-B1. En otra realización, el procedimiento se refiere a la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D, los procedimientos descritos en el presente documento también pueden referirse a la administración de moléculas de unión a anti-plexina-B1 o a anti-plexina-B2 capaces de unirse específicamente a plexina-Bl y/o a plexina-B2 y bloquear la interacción de SEMA-4D con uno o ambos de sus receptores de plexina, p. ej., plexina-BI y/o plexina B2.

En una realización, el tratamiento incluye la aplicación o administración a un paciente de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo u otra molécula biológica o pequeña que se une y neutraliza SEMA4D como se describe en el presente documento, en el que el paciente tiene, o tiene el riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo. En otra realización, el tratamiento también pretende incluir la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo a un paciente, en el que el paciente tiene, o tiene el riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo.

Las moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, como se describe en el presente documento, son útiles para el tratamiento de varios trastornos neurodegenerativos. En algunas realizaciones, el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo tiene por objeto inducir una mejora de los síntomas asociados con el trastorno. En otras realizaciones, el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo tiene por objeto reducir, retrasar o detener el aumento de las manifestaciones de los síntomas. En otras realizaciones, el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo tiene por objeto inhibir, p. ej., suprimir, retardar, prevenir, detener o revertir la manifestación de los síntomas. En otras realizaciones, el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo tiene por objeto aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En estas situaciones, los síntomas pueden ser síntomas neuropsiquiátricos, síntomas cognitivos, y/o disfunción motora. En otras realizaciones, el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo tiene por objeto reducir la morbilidad y la mortalidad. En otras realizaciones, el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo tiene por objeto mejorar la calidad de vida.

En una realización, la divulgación se refiere al uso de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, como medicamento, en particular para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos para mejorar los síntomas asociados con el trastorno.

Según los procedimientos de la presente divulgación, al menos una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, u otra molécula biológica o pequeña como se define en otra parte del presente documento puede usarse para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto al trastorno neurodegenerativo. Una "respuesta terapéutica positiva" con respecto al trastorno neurodegenerativo tiene por objeto incluir una mejora en los síntomas asociados con el trastorno. Tales respuestas terapéuticas positivas no se limitan a la vía de administración y pueden comprender la administración al donante, al tejido del donante (tal como por ejemplo la perfusión de órganos), al huésped, cualquier combinación de los mismos, y similares. En particular, los procedimientos proporcionados en el presente documento están dirigidos a inhibir, prevenir, reducir, aliviar o disminuir la progresión de un trastorno neurodegenerativo en un paciente. De este modo, por ejemplo, una mejora en el trastorno puede caracterizarse como una ausencia de síntomas clínicamente observables, una disminución de la incidencia de los síntomas clínicamente observables, o un cambio en los síntomas clínicamente observables.

Las actividades que cambian los síntomas asociados con los trastornos neurodegenerativos pueden detectarse y medirse usando modelos de ratones in vivo. En ciertas realizaciones, se puede emplear un modelo de ratón CVN. El ratón CVN incorpora mutaciones de la proteína precursora Ap que son características de la enfermedad de Alzheimer (EA) familiar en tres linajes independientes, junto con una mutación que reproduce algunas de las condiciones de inflamación cerebral asociadas con la EA (Colton y col., J Alzheimer's Dis.15:571-587, 2008; Van Nostrand y col., Stroke 41:S135-S138, 2010). El modelo CVN muestra algunas de las patologías primarias asociadas con la enfermedad de Alzheimer: placas de Ap, tau hiperfosforilado que causa ovillos neurofibrilares y muerte celular (pérdida neuronal), y un consistente deterioro de la memoria espacial y déficits neurovasculares. En comparación con otros ratones mutantes usados para modelar la enfermedad de Alzheimer, el ratón CVN muestra más patologías relacionadas con el Alzheimer a una edad más temprana. En otras realizaciones, se puede emplear el modelo de ratón YAC128 de la enfermedad de Huntington (EH). Los ratones YAC128 expresan el gen mutante de longitud completa de la huntingtina humana (HTTm) y recapitulan con precisión muchos de los signos y síntomas de la EH. Debe apreciarse que los expertos en la materia reconocerán que en la literatura se han descrito otros modelos que se han empleado útilmente para los estudios de los mecanismos de la enfermedad y el tratamiento de los síntomas en los trastornos neurodegenerativos, y que la presente divulgación no debe limitarse a un modelo en particular.

Las moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o los derivados de los mismos, u otras moléculas biológicas o pequeñas pueden usarse en combinación con al menos uno o más tratamientos para los trastornos neurodegenerativos; cuando la terapia adicional se administre antes, durante o después de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, terapia. De este modo, cuando las terapias combinadas comprenden la administración de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, en combinación con la administración de otro agente terapéutico, los procedimientos de divulgación abarcan la coadministración, usando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, con administración simultánea o consecutiva en cualquier orden.

Para aplicar los procedimientos y sistemas de la divulgación en ciertas realizaciones, se pueden obtener muestras o imágenes de un paciente antes o después, o tanto antes como después de la administración de una terapia que comprende una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D), a un sujeto que se ha determinado que tiene un trastorno neurodegenerativo, o a un sujeto que se sospecha que tiene un trastorno neurodegenerativo. En algunos casos, se pueden obtener muestras o imágenes sucesivas del paciente después de que se haya iniciado la terapia, o después de que haya cesado la terapia, o tanto antes como después de la terapia. Las muestras o imágenes pueden, por ejemplo, ser solicitadas por un proveedor de asistencia sanitaria (p. ej., un médico) o un proveedor de prestaciones de asistencia sanitaria, obtenidas y/o procesadas por el mismo o por otro proveedor de asistencia sanitaria (p. ej., enfermero, un hospital) o un laboratorio clínico, y después de ser procesadas, los resultados pueden ser enviados a otro proveedor de asistencia sanitaria, el proveedor de prestaciones de asistencia sanitaria, o al paciente. De la misma forma, la medición/determinación de uno o más puntajes, comparaciones entre los puntajes, la evaluación de los puntajes y las decisiones respecto al tratamiento pueden ser realizadas por uno o más proveedores de asistencia sanitaria, los proveedores de prestaciones de asistencia sanitaria, y/o los laboratorios clínicos.

En ciertos aspectos de cualquiera de los procedimientos mencionados, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH, lupus del SNC, deterioro cognitivo leve, o una combinación de los mismos. En ciertos aspectos de cualquiera de los procedimientos mencionados, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington,

En algunos aspectos, un proveedor de asistencia sanitaria puede administrar o instruir a otro proveedor de asistencia sanitaria a administrar una terapia que comprende una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D), en la que el sujeto tiene, se determina que tiene, o se sospecha que tiene, un trastorno neurodegenerativo. Un proveedor de asistencia sanitaria puede implementar o instruir a otro proveedor de asistencia sanitaria o paciente a realizar las siguientes acciones: obtener una muestra o imagen, procesar una muestra o imagen, enviar una muestra o imagen, recibir una muestra o imagen, transferir una muestra o imagen, analizar o medir una muestra o imagen, cuantificar una muestra o imagen, proporcionar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra o imagen, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra o imagen, comparar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras o imágenes, proporcionar la comparación/puntaje de una o más muestras, obtener la comparación/puntaje de una o más muestras o imágenes, administrar una terapia, p. ej., una cantidad eficaz de una molécula de unión aislada que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D), comenzar la administración de una terapia, dejar de administrar una terapia, continuar con la administración de una terapia, interrumpir temporalmente la administración de una terapia, aumentar la cantidad de un agente terapéutico administrado, disminuir la cantidad de un agente terapéutico administrado, continuar la administración de una cantidad de un agente terapéutico, aumentar la frecuencia de administración de un agente terapéutico, disminuir la frecuencia de administración de un agente terapéutico, mantener la misma frecuencia de dosificación en un agente terapéutico, reemplazar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico, combinar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico adicional.

En algunos aspectos, un proveedor de prestaciones de asistencia sanitaria puede autorizar o negar, por ejemplo, una recogida de una muestra, un procesamiento de una muestra, una presentación de una muestra, una recepción de una muestra, una transferencia de una muestra, un análisis o medición de una muestra, una cuantificación de una muestra, provisión de los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, transferencia de los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparación/puntaje de los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras, transferencia de la comparación/puntaje de una o más muestras, administración de una terapia o agente terapéutico, comienzo de la administración de una terapia o agente terapéutico, cese de la administración de una terapia o agente terapéutico, continuación de la administración de una terapia o agente terapéutico, interrupción temporal de la administración de una terapia o agente terapéutico, aumento de la cantidad de agente terapéutico administrado, disminución de la cantidad de agente terapéutico administrado, continuación de la administración de una cantidad de un agente terapéutico, aumento de la frecuencia de administración de un agente terapéutico, disminución de la frecuencia de administración de un agente terapéutico, mantener la misma frecuencia de dosificación en un agente terapéutico, reemplazar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico, o combinar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico adicional.

En ciertos aspectos de cualquiera de los procedimientos mencionados, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH, lupus del SNC, deterioro cognitivo leve, o una combinación de los mismos. En ciertos aspectos de cualquiera de los procedimientos mencionados, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington.

Además, un proveedor de prestaciones de asistencia sanitaria puede, p. ej., autorizar o denegar la prescripción de una terapia, autorizar o denegar la cobertura de una terapia, autorizar o denegar el reembolso del costo de una terapia, determinar o denegar la elegibilidad para una terapia, etc.

En algunos aspectos, un laboratorio clínico puede, por ejemplo, recoger u obtener una muestra, procesar una muestra, presentar una muestra, recibir una muestra, transferir una muestra, analizar o medir una muestra, cuantificar una muestra, proporcionar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras, proporcionar la comparación/puntaje de una o más muestras, obtener la comparación/puntaje de una o más muestras, u otras actividades relacionadas.

En ciertos aspectos, cualquiera de los procedimientos mencionados puede usarse para determinar si un sujeto tiene un trastorno neurodegenerativo. En ciertos aspectos, el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre un grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT), deterioro cognitivo relacionado con el VIH, lupus del SNC, deterioro cognitivo leve, o una combinación de los mismos. En ciertos aspectos de cualquiera de los procedimientos mencionados, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington,

En algunos aspectos, un proveedor de asistencia sanitaria, laboratorio clínico, u otra entidad puede, por ejemplo, recoger u obtener una imagen, procesar una imagen, presentar una imagen, recibir una imagen, transferir una imagen, analizar o medir una imagen, cuantificar una imagen, proporcionar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una imagen, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una imagen, comparar/puntuar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más imágenes, proporcionar la comparación/puntaje de una o más imágenes, obtener la comparación/puntaje de una o más imágenes, u otras actividades relacionadas. Las imágenes que pueden ser usadas en tales aspectos incluyen, entre otros, imágenes obtenidas por angiografía, ultrasonidos, tomografía computarizada (TC), imágenes de resonancia magnética (IRM), tomografía por emisión de positrones (TEP), tomografía de coherencia óptica (TCO), espectroscopia por infrarrojo cercano (EIC), y fluorescencia IC. En ciertas realizaciones, pueden usarse técnicas de formación de imágenes que se han descrito en la literatura (Tardif y col. Circ Cardiovasc Imaging 4:319-333 (2011)).

VI. Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración

Los procedimientos de preparación y administración de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos a un sujeto en necesidad de los mismos son muy conocidos o son fácilmente determinados por aquellos expertos en la materia. La vía de administración de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye, p. ej., administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Aunque todas estas formas de administración son claramente contempladas como que están dentro del ámbito de la divulgación, un ejemplo de una forma para administración sería una solución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (p. ej., tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (p. ej., polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (p. ej., albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las enseñanzas en el presente documento, pueden administrarse moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos, directamente al sitio de la población celular adversa, aumentado así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Como se analiza en el presente documento, pueden administrarse moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos, pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de trastornos neurodegenerativos. En este sentido, se apreciará que las moléculas de unión desveladas pueden formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas según la presente divulgación comprenden un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable, no tóxico, tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente solicitud, debe mantenerse una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, que significa una cantidad suficiente para lograr la unión eficaz a una diana y para lograr un beneficio, p. ej., mejorar los síntomas asociados con un trastorno neurodegenerativo.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente divulgación comprenden vehículos farmacéuticamente, que incluyen, p. ej., intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como seroalbúmina humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen, p. ej., agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medios tamponados. En la divulgación objeto, vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, 0,01-0,1 M, p. ej., aproximadamente tampón fosfato 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato, o aceites no volátiles. Vehículos intravenosos incluyen recargadores de fluidos y de nutrientes, recargadores de electrolitos, tales como aquellos a base de dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en las que son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición ha de ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenaje y puede estar preservada contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento como la lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para su uso en los procedimientos terapéuticos desvelados en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).

La prevención de la acción de microorganismos pueden lograrse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, pueden ser incluidos agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando un compuesto activo (p. ej., un anticuerpo anti-SEMA4D, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización, que produce un polvo de un principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se envasan en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan bajo condiciones asépticas según procedimientos conocidos en la técnica. Además, Las preparaciones pueden envasarse y venderse en forma de un kit. Tales artículos de fabricación pueden tener etiquetas o prospectos que indican que las composiciones asociadas son útiles para tratar un sujeto que padece, o está predispuesto a una enfermedad o trastorno.

Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis en bolo única, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos fijos o variables específicos, p. ej., una vez al día, o en una base "según sea necesario".

Ciertas composiciones farmacéuticas usadas en la presente divulgación pueden administrarse por vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, p. ej., cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

La cantidad de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, a combinar con los materiales de vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. La composición puede administrarse como una dosis única, dosis múltiple o durante un periodo de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proporcionar la óptima respuesta deseada (p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica).

En consonancia con el ámbito de la presente divulgación, pueden administrarse anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos a un ser humano u otro animal según los procedimientos mencionados anteriormente de tratamiento en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Los anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse a tal ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo de la divulgación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional según técnicas conocidas. Un experto en la materia reconocerá que la forma y carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable están dictados por la cantidad de principio activo con la que va a combinarse, la vía de administración y otras variables muy conocidas. Los expertos en la materia apreciarán además que puede usarse un cóctel que comprende una o más especies de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, de la divulgación.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se tiene por objeto una cantidad de molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, que cuando se administra provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con una enfermedad a tratar. En el caso de un trastorno neurodegenerativo, una respuesta terapéutica positiva puede aliviar los síntomas del trastorno; disminuir, reducir, retardar o detener la incidencia de los síntomas; disminuir, reducir, retardar la gravedad de los síntomas; inhibir, p. ej., suprimir, retardar, prevenir, detener o revertir la manifestación de los síntomas; aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno; reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; una combinación de tales efectos.

Dosis terapéuticas eficaces de las composiciones de la presente divulgación, para la disminución de la incidencia de los síntomas, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En ciertas realizaciones, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos. Pueden valorarse dosificaciones de tratamiento usando procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y eficacia.

La cantidad de al menos una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión, variante o derivado del mismo, a administrar es fácilmente determinada por un experto en la materia sin experimentación indebida dada la presente divulgación. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo, fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo incluyen, entre otros, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo que recibe la terapia. De la misma forma, la cantidad de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, a administrar dependerá del modo de administración y si el sujeto recibirá una dosis única o dosis múltiples de este agente.

La divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar un sujeto para tratar un trastorno neurodegenerativo, en la que el medicamento se usa en un sujeto que ha sido pretratado con al menos otra terapia. Por "pretratado" o "pretratamiento" se tiene por objeto que el sujeto haya recibido una o más de otras terapias (p. ej., ha sido tratado con al menos otra terapia neurodegenerativa) antes de recibir el medicamento que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. "Pretratado" o "pretratamiento" incluye sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia en el plazo de 2 años, en el plazo de 18 meses, en el plazo de 1 año, en el plazo de 6 meses, en el plazo de 2 meses, en el plazo de 6 semanas, en el plazo de 1 mes, en el plazo de 4 semanas, en el plazo de 3 semanas, en el plazo de 2 semanas, en el plazo de 1 semana, en el plazo de 6 días, en el plazo de 5 días, en el plazo de 4 días, en el plazo de 3 días, en el plazo de 2 días, o incluso en el plazo de 1 día antes del inicio del tratamiento con el medicamento que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales VX15/2503, 67, o 76 desvelados en el presente documento, o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. No es necesario que el sujeto sea un respondedor al pretratamiento con la terapia o terapias previas. De este modo, el sujeto que recibe el medicamento que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo podría haber respondido, podría haber dejado de responder, al pretratamiento con la terapia previa, o a una o más de las terapias previas en las que el pretratamiento comprendió terapias múltiples.

La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las habilidades en la técnica. Tales técnicas se explican detalladamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, Sambrook y col., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook y col., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DnA Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis y col., patente de EE. UU. n.° 4.683.195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (iRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu y col., eds., Methods in Enzymology, Vols. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel y col. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley y Sons, Baltimore, Md.).

Principios generales de la genomanipulación de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2a ed.; Oxford Univ. Press). Principios generales de la genomanipulación de proteínas se exponen en Rickwood y col., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Principios generales de anticuerpos y unión de anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman y Hall, Nueva York, N.Y.). Adicionalmente, los procedimientos convencionales en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente son generalmente seguidos como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites y col., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8a ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman y Co., NY).

Los trabajos de referencia convencionales que exponen principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett y col., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden y col., (Elsevere, Ámsterdam); Goldsby y col., eds. (2000) Kuby Immunology (4a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt y col. (2001) Immunology (6a ed.; Londres: Mosby); Abbas y col. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlang); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

Los siguientes ejemplos se presentan como ilustración y no como limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1: Prueba del efecto de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, p. ej., VX15/2503, 67, o 76 sobre la enfermedad de Alzheimer (EA) en el modelo de ratón CVN

Diseño experimental. El modelo CVN se usó para estudiar el efecto del anticuerpo anti-SEMA4D (p. ej., AM 67) en las patologías y síntomas asociados con la EA. El ratón CVN incorpora mutaciones de la proteína precursora Ap humana que son características de la enfermedad de Alzheimer (EA) familiar en tres linajes independientes junto con una deleción de un gen (óxido nítrico sintasa-2) para promover los mecanismos neuroinflamatorios asociados con la EA (Colton y col., J Alzheimers Dis. 15:571-587, 2008; Van Nostrand y col., Stroke 41:S135-S138, 2010).

El diseño experimental básico se muestra en la FIG. 1. Los ratones CVN propensos a la enfermedad de Alzheimer (obtenidos de Charles River) fueron usados para probar el efecto de una molécula de unión a anti-SEMA4D en la EA. A las 10 semanas de edad, los ratones se desangraron para obtener los niveles de serología de valor basal. Entre las 10-12 semanas de edad, los ratones se sometieron a pruebas preliminares de comportamiento para asegurarse de que eran capaces de participar en el estudio. Después de la aleatorización, los ratones c Vn fueron tratados semanalmente con anticuerpos anti-SEMA4D (AM-67) o control de isotipo (AM 2B8) (30 mg/kg, i.v.) de la semana 26 a la 38 en la que se les aplicaron varias pruebas de comportamiento. Las pruebas conductuales fueron la prueba de campo abierto y el laberinto de agua de brazo radial.

Prueba de campo abierto - La actividad exploratoria del animal se estudia en la prueba de campo abierto a las 10 y 38 semanas de edad para una posible hipo o hiperactividad inducida por tratamiento (prueba de control) u otro efecto. Los ratones son llevados a la sala de experimentación durante al menos 30 minutos de aclimatación a las condiciones de la sala de experimentación antes de la prueba. Las cámaras de actividad (Med Associates Inc, St Albans, VT; 27 x 27 x 20,3 cm) están equipadas con haz de rayos IR. Los ratones se colocan en el centro de la cámara y su comportamiento se graba durante 30 minutos en intervalos de 5 minutos. El análisis cuantitativo se realiza en las siguientes cinco medidas dependientes: locomoción total, locomoción en el centro del campo abierto, tasa de erguirse sobre sus patas en el centro, frecuencia y velocidad totales de erguirse sobre sus patas. Los animales son probados en condiciones de baja tensión en las que la intensidad de la luz se baja a aproximadamente 10-30 lux de luz roja.

Laberinto de agua de brazo radial - A las 11 y 39 semanas de edad, los ratones son llevados a la sala de experimentación durante al menos 30 minutos de aclimatación a las condiciones de la sala de experimentación antes de la prueba. El laberinto de agua de brazo radial de dos días se ha descrito en detalle anteriormente (Alamed y col., 2006). Brevemente, un laberinto de seis brazos se sumerge en un charco de agua, y se coloca una plataforma en el extremo de un brazo. El ratón recibe 15 ensayos por día durante 2 d y cada ensayo se inicia en un brazo diferente mientras que el brazo que contiene la plataforma sigue siendo el mismo para cada ratón. La ubicación de la plataforma se mantiene constante durante el 2 d para cada ratón a una edad determinada, pero esta ubicación cambia para cada ratón entre las 11 y 40 semanas de edad del punto de tiempo de la prueba. Usando señales visuales alrededor de la habitación, el ratón aprende la posición de la plataforma de escape. Los primeros 10 ensayos se consideran de entrenamiento y se alternan entre una plataforma visible y otra oculta. Los ensayos finales del día 1 y todos los ensayos del día 2 usan una plataforma oculta. El número de errores (entradas incorrectas en los brazos) se contó durante un periodo de 1 min. Los errores se promedian sobre tres ensayos resultando en 10 bloques para el periodo del 2 d.

Después de la conclusión de las pruebas de comportamiento, los ratones fueron sacrificados y se procesaron por inmunohistoquímica los tejidos cerebrales embebidos en parafina y fijados con formalina (EPFF). En vista de los informes sobre el papel de SEMA4D en la inducción de sinapsis inhibidoras de la GABAérgica (Kuzirian y col., J Neuroscience, 33:8961- 8973 • 8961, 2013), la densidad de las vesículas y la intensidad de la expresión del transportador vesicular GABA (TVGA) se determinó en la circunvolución dentada de los ratones CVN tratados. La circunvolución dentada es uno de los pocos centros principales de neurogénesis continuada en el SNC adulto y se cree que desempeña un papel en la formación y retención de la memoria. Para todas las pruebas, se realizó un análisis estadístico usando la prueba de ANOVA bidireccional.

Anti-SEMA4D reduce el comportamiento similar a la ansiedad. La actividad exploratoria fue estudiada en grupos de 12 ratones con predisposición a la EA, tratados con anti-SEMA4D o control de isotipo. Se aplicó una prueba de campo abierto a las 38 semanas de edad para detectar posibles efectos inducidos por el tratamiento en la actividad locomotora y el comportamiento similar a la ansiedad. Los ratones fueron colocados en el centro de una cámara iluminada y su comportamiento fue grabado durante 30 min en seis intervalos de 5 minutos. Se realizó un análisis cuantitativo para la locomoción total (FIG. 2A) y la locomoción en el centro del campo abierto (FIG. 2B), que, como se sabe en la técnica, es una medida del comportamiento relacionado con la ansiedad.

Los resultados mostraron que los ratones CVN con predisposición a la EA, tratados semanalmente con anticuerpos anti-SEMA4D, manifiestan una mayor exploración de campo abierto y un comportamiento menos similar a la ansiedad (incursiones en el centro del campo) que los ratones tratados con el Am ^{2B8 de control. Estos resultados se muestran}en la FIG. 2.

Anti-SEMA4D mejora la memoria espacial. A las 39 semanas de edad, los ratones CVN tratados con anti-SEMA4D o 2B8 o control de isotipo (n=9-13/grupo) fueron probados durante 2 días en un laberinto de agua de brazo radial ^{(Alamed y col., 2006, como se muestra en la FIG.}3a). ^{Brevemente, cada ratón recibió 15 ensayos por día (3 ensayos}por bloque) en cada uno de los dos días consecutivos. Cada ensayo se inició desde un brazo diferente, mientras que el brazo que contenía la plataforma se mantuvo igual en cada ensayo. Los bloques de ensayo del día 1 se alternaban entre una plataforma visible y otra oculta para fines de entrenamiento. Todos los ensayos del día 2 se realizaron con una plataforma oculta para evaluar la memoria espacial. El día 1 fue un periodo de entrenamiento/aprendizaje y en el día 2 se registró la latencia para encontrar la plataforma.

Los resultados mostraron que la administración de anticuerpo anti-SEMA4D (AM 67) lleva a una disminución mensurable de la latencia, lo que sugiere una mejora de la memoria espacial en comparación con la cohorte de control (tratado con AM 2B8). Los resultados se muestran en la FIG. 3B.

Anti-SEMA4D disminuye las sinapsis GABAérgicas. Secciones de tejido cerebral EPFF de ratones CVN y WT tratados con AM-67 o AM-2B8 (n=9-13/grupo) fueron teñidas con anticuerpo anti-TVGA para detectar vesículas sinápticas GABAérgicas. Se cuantificaron los porcentajes de la señal de la vesícula positiva para TVGA y las intensidades de la señal TVGA por vesícula dentro de la circunvolución dentada de todos los animales y se normalizaron respecto al área total de la circunvolución dentado escaneada.

Los resultados mostraron que el tratamiento de anticuerpo anti-SEMA4D de los ratones CVN con EA lleva a una tendencia de disminución de la densidad de las vesículas positivas para TVGA (FIG. 4A) y una disminución estadísticamente significativa en el nivel de intensidad de tinción TVGA por vesícula (FIG. 4B), un hallazgo que sugiere un papel para SEMA4D en la modulación de la señalización GABAérgica in vivo y puede proporcionar un conocimiento sobre el mecanismo de los efectos conductuales observados en los ratones CVN tratados con AM 67. La señalización GABAérgica se asocia con una clase heterogénea de neuronas inhibidoras. Como se demuestra en la FIG. 15 del Ejemplo 6 a continuación, se observan efectos más significativos del tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D en la densidad de las neuronas inhibidoras cuando el análisis se centra en el subconjunto de las neuronas positivas para somatostatina, NPY, o NPY2R.

Ejemplo 2: Prueba del efecto de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, p. ej., AM VX15/2503 o 67 sobre la enfermedad de Huntington (EH) en el modelo de ratón YAC128.

Diseño experimental. Se realizó un segundo experimento empleando un modelo in vivo de YAC128 para estudiar el efecto del anticuerpo anti-SEMA4D en las patologías y síntomas asociados a la EH. El diseño experimental básico fue similar al mostrado en el Ejemplo 1, y en la FIG. 1, anterior, pero la dosificación de AM (anticuerpo) en este caso se realizó semanalmente de la semana 6 a la semana 47 con entre 13 y 22 ratones YAC128 o TS por grupo. Los ratones YAC128 fueron criados y mantenidos en la Universidad de British Columbia, Centro de Medicina Molecular y Terapéutica.

Anti-SEMA4D reduce el comportamiento similar a la ansiedad en el modelo de ratón YAC128. Para evaluar la ansiedad durante la exploración en campo abierto, los ratones tratados con AM fueron colocados en la esquina inferior izquierda de una caja acrílica gris abierta de 50 x 50 cm con lados de 20 cm de altura en una habitación intensamente iluminada por lámparas fluorescentes de techo. La actividad en campo abierto fue grabada durante 10 minutos por una cámara de vídeo montada en el techo. Las entradas en (FIG. 5A) y el tiempo de permanencia en el centro del campo (FIG. 5B) fueron anotados como una medida del comportamiento similar a la ansiedad.

A diferencia de los animales tratados con control en el que los ratones YAC128 manifiestan un mayor comportamiento similar a la ansiedad en la exploración de campo abierto que los ratones de tipo silvestre (TS), no hay diferencia entre los ratones TS y YAC128 tratados con el anticuerpo anti-SEMA4D (AM 67), lo que indica que el AM-67 mejora el comportamiento similar a la ansiedad en los ratones YAC128. Estos resultados se muestran en la FIG. 5.

Anti-SEMA4D mejora la memoria espacial en el modelo de ratón YAC128. Para evaluar la preferencia por un objeto conocido en una nueva ubicación, dos objetos novedosos diferentes fueron colocados en las esquinas superiores izquierda y derecha de una caja de campo abierto. Se introdujeron ratones tratados con anti-SEMA4D en la caja en la esquina inferior izquierda y fueron grabados durante 5 minutos (min) por una cámara de vídeo montada en el techo, tiempo durante el cual se anotó el número de investigaciones de los dos objetos novedosos (Ensayo 1, FIG. 6A). A continuación, se retiraron los ratones de la caja durante 5 min, y el objeto de la esquina superior derecha de la caja se movió a la esquina inferior derecha de la caja. Los ratones fueron reintroducidos en la caja y grabados durante 5 min adicionales (Ensayo 2, FIG.6B). Se calculó el porcentaje de las investigaciones, o punciones en la nariz, al objeto diana (el que está en la nueva ubicación) en relación con todos las punciones de la nariz.

A diferencia con los animales de tipo silvestre (TS) tratados con AM 67 que exploran preferentemente un objeto en una nueva ubicación en el Ensayo 2, los ratones YAC128 tratados con control no reconocen o muestran preferencia por el objeto en una ubicación novedosa. El tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D restaura la preferencia normal por el objeto novedoso en los ratones YAC128 (p<0,01). Esto sugiere que la memoria espacial en los ratones YAC128 fue mejorada por el tratamiento con AM-67 de manera que reconocieron que un objeto estaba en una nueva ubicación. Los resultados se muestran en la FIG. 6.

Anti-SEMA4D previene la degeneración del cortical y del cuerpo calloso en los ratones YAC128. Se tiñeron secciones de tejido cerebral de flotación libre de ratones YAC128 y Ts (n=13-21/grupo) de 12 meses tratados con AM con anticuerpo anti-NeuN. Los volúmenes de cortical (FIG. 7A) y cuerpo calloso (FIG. 7B) se determinaron trazando el perímetro de la estructura definida en secciones seriadas usando el software StereoInvestigator (Microbrightfield) y los volúmenes se determinaron usando el principio de Cavalieri.

Los resultados muestran que el tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D inhibe la reducción normal relacionada con la enfermedad del volumen de cortical y del cuerpo calloso en los ratones YAC128 a los 12 meses de edad. Los resultados se muestran en la FIG. 7.

AM 67 previene la degeneración testicular en ratones YAC128. La degeneración testicular se observa en pacientes varones con EH y se recapitula en los ratones YAC128 machos. Como se muestra en la FIG. 8, el tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D previene la degeneración testicular en ratones YAC128 de 12 meses. Es posible que los efectos de la enfermedad y del anticuerpo anti-SEMA4D tanto en el cerebro como en los testículos reflejen una dependencia común de los mecanismos de transporte dependientes de la actina intracelular en la función normal de estos tejidos.

Ejemplo 3: Examinación de los patrones de expresión de SEMA4D, plexina-B1, plexina-B2 y CD72 en el SNC de la rata

Para visualizar los tipos de células en el SNC que expresan SEMA4D y sus receptores plexina-BI, plexina-B2 y CD72, se realizó co-inmunohistoquímica en secciones de la médula espinal de ratas no expuestas (FIG. 9A-P). Co-tinción para el marcador de células precursoras de oligodendrocitos, Nkx2.2, y SEMA4D (FIG. 9A-C), plexina-B1 y el marcador astrocítico, PAFG (FIG. 9E-G), plexina-B1 y CD72 (FIG. 9I-K), y plexina-B1 y el marcador microglial, Iba1 (FIG. 9M-O) se realizó en secciones de la médula espinal de ratas no expuestas. Además, todas las secciones fueron teñidas con DAPI para visualizar los núcleos celulares (FIG. 9D, H, L, y P). Los portaobjetos fueron fotografiados con un aumento de 60X usando una cámara EXi-Aqua de 14 bits acoplada a un microscopio Olympus Ix50.

Los resultados en la FIG. 9 muestran que en el SNC normal, SEMA4D se expresa fuertemente en precursores de oligodendrocitos positivos para Nkx2.2, mientras que sus receptores, plexina-B1, plexina-B2 (datos no mostrados), y CD72, se expresan en múltiples tipos de células y son especialmente prominentes en los astrocitos positivos para la proteína ácida fibrilar glial (PAFG).

Ejemplo 4: Caracterización de patrones de expresión de los receptores de plexina-B1 y plexina-B2 en el modelo de ratón CVN de la enfermedad de Alzheimer

Los ratones homocigóticos bigénicos CVN con EA muestran patología amiloide clásica y activación glial en el subículo en comparación con los ratones de tipo silvestre de la misma edad. Los patrones de expresión de plexina-B1 fueron examinados en el modelo de ratón CVN de la enfermedad de Alzheimer. Los ratones bigénicos CVN (también conocidos como APPSwDI/NOS2-/-) albergan el transgén de la proteína precursora amiloide mutante sueco-holandésiowa (APPSwDI) y una mutación "nula" dirigida del locus de la óxido nítrico sintasa 2 (Nos2, o NOS inducible, iNOS). A las 41 semanas de edad, los ratones CVN y de control de tipo silvestre fueron sacrificados y procesados para la inmunohistoquímica DAB. Los resultados se muestran en la FIG. 10, con las secciones de ratón de tipo silvestre en los paneles superiores y las secciones de ratón CVN en los paneles inferiores). Las secciones fueron teñidas por separado para el péptido amiloide-beta 1-42 (paneles superior e inferior a la izquierda), marcador microglial Iba1 (paneles centrales superior e inferior), o marcador astrocitario PAFG (paneles superior e inferior a la derecha). Los portaobjetos fueron fotografiados con un aumento de 20X usando una cámara Retiga QICAM de 12 bits acoplada a un microscopio Olympus Ix50.

Los resultados en la FIG. 10 muestran que los ratones homocigóticos bigénicos CVN (APPSwDI/NOS2-/-) desarrollan patología amiloide clásica, activación microglial, y astrogliosis (paneles inferiores).

Los astrocitos activados en los ratones CVN con EA presentan una mayor expresión de plexina-BI en comparación con los ratones de tipo silvestre de la misma edad. A las 41 semanas de edad, se sacrificaron y procesaron ratones CVN y de control de tipo silvestre por co-inmunohistoquímica fluorescente (FIG. 11A). Las secciones se tiñeron por separado para el receptor SEMA4D plexina-B1 y el marcador de astrocitos PAFG, y DAPI para visualizar los núcleos celulares. Las imágenes compuestas se muestran en los paneles más a la izquierda. Los portaobjetos fueron fotografiados con un aumento de 60X usando una cámara EXi-Aqua de 14 bits acoplada a un microscopio Olympus Ix50.

Como se muestra en la FIG. 11A, los análisis co-inmunohistoquímicos de plexina-B1 (segundo panel de la izquierda) y de los astrocitos positivos para PAFG (tercer panel de la izquierda) en los cerebros de los ratones CVN y de tipo silvestre de la misma edad demuestran que la activación astrocítica, como se evidencia por el aumento de la tinción del marcador PAFG, se correlaciona positivamente con una mayor expresión de plexina-B1 co-registrada, sugiriendo que la señalización de SEMA4D/plexina participa en el proceso de activación de los astrocitos.

La inhibición de la señalización de SEMA4D en ratones CVN con EA restaura la expresión de plexina-B2 en comparación con los ratones de tipo silvestre de la misma edad. Para determinar si el bloqueo de la señalización de SEMA4D en los ratones CVN con EA afectaría la expresión de plexina-B1 y/o su receptor cognado alternativo, plexina-B2, en las regiones cerebrales afectadas en las primeras etapas de la patogénesis de la EA, A ratones CVN y de control de tipo silvestre de 26 semanas se les inyectó semanalmente c30 mg/kg de anticuerpo monoclonal anti-SEMA4D (67-2) o IgG de control (2B8) por vía intravenosa durante 13 semanas. A las 41 semanas de edad, los ratones fueron sacrificados y se tiñeron secciones de tejido cerebral de ratones tratados con AM con anti-plexina-B1 o antiplexina-B2 para detectar si el tratamiento anti-SEMA4D alteraba la expresión de los receptores cognados en el marco de la patogénesis relacionada con la EA en desarrollo. El porcentaje de señales positivas para plexina-B1 y plexina-B2 fue cuantificado en el subículo de todos los animales y normalizado respecto al área total del subículo escaneado.

Como se muestra en la FIG. 11B, el tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D de los ratones CVN con EA lleva a una restauración en los niveles de intensidad de tinción de plexina-B2 (gráfico de la derecha) a los cuantificados en los ratones de control TS, pero no hay cambios significativos en los niveles de plexina-B1 (gráfico de la izquierda) en relación con los ratones de control con EA CVN de la misma edad. Estos resultados sugieren que la inhibición de SEMA4D mediada por anticuerpos conduce selectivamente a la desestabilización de plexina-B2 y/o impide un mecanismo de proacción estimulada por SEMA4D que promueve selectivamente la expresión de plexina-B2.

Ejemplo 5: Caracterización de los patrones de expresión del receptor plexina-B2 en un modelo de ratón de la enfermedad de Huntington YAC128

Los ratones YAC128 expresan el gen mutante de longitud completa de la huntingtina humana (HTTm) y recapitulan con precisión muchos de los signos y síntomas de la EH (véase también el Ejemplo 2). Los astrocitos activados en los ratones con enfermedad de Huntington YAC128 muestran una mayor expresión de plexina-B2 en comparación con los ratones de tipo silvestre de la misma edad. A los 12 meses de edad, se sacrificaron y procesaron ratones YAC128 y de control de tipo silvestre por co-inmunohistoquímica fluorescente (FIG. 12). Las secciones fueron co-teñidas para plexina-B2 (plexina-B2, tercer panel de la izquierda), marcador de astrocitos PAFG (segundo panel de la izquierda) y DAPI para visualizar los núcleos celulares. Las imágenes compuestas se muestran en los paneles más a la izquierda. Los portaobjetos fueron fotografiados con un aumento de 60X usando una cámara EXi-Aqua de 14 bits acoplada a un microscopio Olympus Ix50.

Como se muestra en la FIG. 12, los análisis co-inmunohistoquímicos de los astrocitos positivos para plexina-B2 y PAFG en los cerebros de ratones YAC128 y de tipo silvestre demuestran que la activación astrocítica, como se evidencia por el aumento de la tinción del marcador PAFG, de nuevo se correlaciona positivamente con la expresión del receptor SEMA4D co-registrado. La plexina-B2, cuyo ligando mejor caracterizado es SEMA4C, también tiene una afinidad intermedia para SEMA4D (Azzarelli R, y col. An antagonistic interaction between PlexinB2 and Rnd3 controls RhoA activity and cortical neuron migration. Nature Commun. 2014; DOI:10.1038/ncomms4405).

Ejemplo 6: Examen de los mecanismos por los cuales la señalización de SEMA4D puede modular la función de los astrocitos

La correlación entre el aumento de la expresión del receptor SEMA4D y la activación astrocítica en el marco tanto de la enfermedad neurodegenerativa de la EA y la EH sugiere que la señalización de SEMA4D desempeña un papel en la función y/o disfunción de los astrocitos. Aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, este ejemplo proporciona pruebas de que la señalización de SEMA4D puede participar en la regulación de la función astrocítica durante las respuestas a las lesiones del SNC, ya sea por estímulos agudos o crónicos. En la FIG. 13 se representa un modelo esquemático apoyado por los datos, que muestra tres mecanismos por los cuales la señalización de SEMA4D puede potencialmente modular la función de los astrocitos. Estos tres mecanismos se analizan a continuación.

Papel de los astrocitos y soporte de CPO. Los procesos astrocíticos de plexina+ se interdigitan entre las células precursoras de oligodendrocitos (CPO) SEMA4D+ NKX2.2+ y proporcionan soporte trófico. En la enfermedad del SNC, los astrocitos activados regulan positivamente la expresión de plexina y los procesos de retracción mediante la señalización de SEMA4D. Localmente, esta pérdida de proximidad astrocito:CPO puede resultar en una disminución del soporte trófico y un aumento del movimiento de CPO estimulado por la quimiotaxis hacia las regiones de daño, mientras que la falta de soporte astrocítico en el lugar de la lesión puede impedir la diferenciación y remielinización de CPO.

Para ensayar esta hipótesis, se sacrificaron ratas de control de tipo silvestre y se procesaron las médulas espinales por co-inmunohistoquímica fluorescente (FIG. 14). Las secciones se co-tiñeron para SEMA4D (segundo panel de la izquierda), marcador de astrocitos PAFG (tercer panel de la izquierda) y DAPI para visualizar los núcleos celulares (panel de la derecha). Las imágenes compuestas se muestran en los paneles más a la izquierda y el cuadro de puntos representa un recuadro ampliado 1,67X en la parte inferior. Los portaobjetos fueron fotografiados con un aumento de 60X usando una cámara EXi-Aqua de 14 bits acoplada a un microscopio Olympus Ix50.

Como se muestra en la FIG. 14, Las CPO que expresan SEMA4D se orientan en estrecha proximidad con los procesos astrocitarios PAFG+. Dado el papel que desempeñan los astrocitos en la facilitación de la supervivencia y función de la CPO, la yuxtaposición de las CPO que expresan SEMA4D y los astrocitos que expresan receptores SEMA4D sugiere que la activación de los astrocitos relacionada con la enfermedad con la regulación positiva asociada de los receptores de plexina-B y la señalización de SEMA4D puede afectar a la función de las CPO.

Papel de los astrocitos en el soporte neuronal. En la enfermedad del SNC, la activación astrocítica lleva a una regulación positiva de la expresión de plexina, aumento de la señalización de SEMA4D y procedimiento de retracción, lo que resulta en una pérdida de la guía de los axones neuronales, disminución del soporte trófico, y/o alteración de la regulación de la captación/liberación de glutamato. En última instancia, dependiendo de la gravedad del estímulo de la enfermedad, se puede producir la pérdida de sinapsis y la subsiguiente muerte de neuronas excitotóxicas.

Para determinar si el bloqueo de la señalización de SEMA4D en ratones CVN con EA tendría un impacto en la expresión de los marcadores sinápticos en las regiones cerebrales afectadas al principio de la patogénesis de la EA, a ratones CVN y de control de tipo silvestre de 26 semanas se les inyectó semanalmente 30 mg/kg de anticuerpo monoclonal anti-SEMA4D (67-2) o IgG de control (2B8) por vía intravenosa durante 13 semanas. A las 41 semanas de edad, se sacrificaron ratones y se tiñeron secciones de tejido cerebral de ratones tratados con AM con el anticuerpo anti-somatostatina, anti-neuropéptido-Y (NPY), receptor anti-NPY 1 (NPY1R), o el receptor anti-NPY 2 (NPY2R) para detectar subconjuntos específicos de neuronas inhibidoras que degeneran en la eA temprana. Se cuantificaron porcentajes de señal positiva para somatostatina en el subículo, y la señal positiva para NPY, NPY1R, o NPY2R fue cuantificada en la circunvolución dentada para todos los animales y normalizada, respectivamente, con respecto a un subículo total o con respecto a un área de circunvolución dentada escaneada. Los resultados se muestran en la FIG.

15 A-D.

Las FIGS. 15A-15D muestran que el tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D de los ratones CVN con EA conduce a una restauración en la somatostatina (panel A), NPY (panel B), y NPY2R (panel D) tiñendo los niveles de intensidad a niveles característicos de ratones de tipo silvestre. De manera interesante, se notifican agonistas de NPY1R para reducir el estrés y la ansiedad, mientras que los antagonistas específicos para NPY2R reducen el estrés y la ansiedad (Markus Heilig. The NPY system in stress, anxiety and depression. Neuropeptides 38 (2004) 213-224). Como se muestra en la FIG. 2 anterior, los ratones CVN tratados con anti-SEMA4D exhibieron una reducción de la gravedad de la ansiedad en las pruebas de campo abierto, hallazgos que se correlacionaron con los niveles normalizados de NPY2R (más bajos), mientras que los niveles de NPY1R no se modificaron con el tratamiento con AM anti-SEMA4D y se mantuvieron más altos que los de los ratones silvestres. Por ende, estos cambios en los niveles del receptor NPY coinciden con la reducción de los comportamientos de ansiedad observados en los ratones CVN tratados con anti-SEMA4D, un hallazgo que apoya aún más el papel de SEMA4D en la modulación de la neurotransmisión in vivo. Cabe señalar que también se ha notificado acerca de una regulación negativa del neurotransmisor inhibidor NPY observado en el modelo CVN con EA en la corteza cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer (Beal, y col., Ann. Neurol.

20, 282-288 (1986).

Papel de los astrocitos en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica. Como se analiza en otra parte del presente documento, los procesos astrocíticos próximos a los microvasos cerebrales o pía se caracterizan por una alta densidad del canal de agua, acuaporina 4 (Acp4). Los procesos astrocíticos que se enfrentan a las regiones sinápticas se enriquecen en los transportadores de glutamato, en los que la densidad de Acp4 es comparativamente baja. La activación de los astrocitos inducida por enfermedades del SNC aumenta la señalización de SEMA4D a través de plexina, que conlleva a una retracción de los procesos del pie astrocítico como se evidencia en la redistribución de la acuaporina-4. Esto da como resultado una alteración de la regulación y permeabilidad de la BHE, facilitando así la inflamación endotelial y la subsiguiente entrada de leucocitos en el SNC. En el marco de la EA, las intensidades de tinción con Acp4 disminuyen significativamente en las regiones con una importante carga de placa amiloide.

Para medir los patrones de expresión de la acuaporina-4 en los ratones CVN con EA en comparación con los ratones de tipo silvestre de la misma edad, los ratones CVN y de control de tipo silvestre fueron sacrificados a las 41 semanas de edad y procesados para la co-inmunohistoquímica fluorescente. Los resultados se muestran en la FIG. 16, con ratones silvestres en los paneles superiores y ratones CVN en los paneles inferiores. Las secciones se co-tiñeron para acuaporina-4 (segundo panel de la izquierda), marcador de astrocitos PAFG (tercer panel de la izquierda) y DAPI para visualizar los núcleos celulares. Las imágenes compuestas se muestran en los paneles más a la izquierda. Los portaobjetos fueron fotografiados con un aumento de 60X usando una cámara EXi-Aqua de 14 bits acoplada a un microscopio Olympus Ix50.

Como se muestra en la FIG. 16, la tinción de Acp4 en los ratones CVN de la misma edad reveló un cambio significativo hacia un patrón difuso. Esto contrasta con los análisis co-inmunohistoquímicos de los astrocitos positivos para Acp4 y PAFG en los cerebros de los ratones de tipo silvestre, que demuestran el patrón de tinción de Acp4 en el subículo que está restringido en las áreas próximas a la microvasculatura. Esta alteración en la distribución de Acp4, o pérdida de polaridad, se correlaciona con una alta activación de los astrocitos, como se evidencia por el aumento de la intensidad de la tinción de PAFG. Dado el fuerte co-registro en la tinción de plexina-B1 en los astrocitos activados (FIG. 11) y el papel de la señalización de SEMA4D/plexina-B1 en la retracción del proceso celular, estos datos sugieren que la señalización de SEMA4D puede desempeñar un papel en la alteración de la polaridad de los astrocitos en la interfaz BHE durante la enfermedad.

Para analizar el impacto de SEMA4D en la BHE, se empleó un modelo dinámico de barrera hematoencefálica in vitro (DIV-BBB). Brevemente, el modelo consiste en fibras de polipropileno huecas que contienen poros transcapilares de 2 a 4 |jm de diámetro. Las fibras se conectaron a una bomba pulsátil que facilita el flujo continuo de medios, y compuestos experimentales a través de las fibras y la estimulación normal de los receptores de flujo endotelial. Se inocularon células endoteliales del cerebro humano en el compartimiento luminal y se les permitió adherirse y revestir las paredes internas de las fibras, mientras que los astrocitos humanos fueron sembrados en el compartimiento abluminal bañando la superficie exterior de las fibras. Las células endoteliales y los astrocitos interactúan a través de la membrana para inducir la formación de una barrera con estrechas uniones entre las células endoteliales. La integridad de esta barrera puede ser controlada continuamente por medio de la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (RETE). Se inocularon células endoteliales del cerebro humano en el compartimento luminal y se les permitió adherirse a las fibras de polipropileno, y se sembraron astrocitos humanos por separado en la superficie abluminal de las fibras. En RETE máxima (aproximadamente 14 días in vitro), se añadieron sucesivamente 0,5, 5 y 50 jg/m l de SEMA4D recombinante en intervalos de 12 h. A las 36 h después de la exposición inicial a SEMA4D, se añadieron 250 jg/m l de IgG de control (AM 2955; 1 unidad DIV-BBB) o anti-SEMA4D (VX15/2503; 2 unidades DIV-BBB) y se midió RETE durante otras 132 h. Los resultados se muestran en la FIG. 17. Las barras de error representan la desviación típica. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes, con cada uno demostrando efectos similares de SEMA4D y anticuerpo en la integridad de DIV-BBB.

Como se muestra en la FIG. 17, la descomposición de la BHE fue revertida en 24 h por la adición del anticuerpo anti-SEMA4D (VX15/2503). La introducción de una proteína recombinante de control no resultó en una disminución de RETE (datos no mostrados). Es más, la introducción del anticuerpo de IgG de control (AM 2955) no afectó el compromiso de la BHE inducido por SEMA4D.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a un antígeno del mismo que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene la enfermedad de Huntington, en la que el anticuerpo aislado o fragmento del mismo inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso de la reivindicación 1, en el que el receptor se selecciona entre el grupo que consiste en plexina-B1, plexina-B2 y CD72.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la transducción de la señal de plexina-B1 mediada por SEMA4D.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente al mismo epítopo de SEMA4D como un anticuerpo monoclonal de referencia que comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno inhibe competitivamente un anticuerpo monoclonal de referencia que comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo monoclonal que comprende una VH que comprende las VHCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 6, 7 y 8, respectivamente, y una Vl que comprende las VLCDR 1-3 que comprende SEQ ID NOs 14, 15 y 16, respectivamente.

7. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal que comprende una VH y una VL que comprenden, respectivamente, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 18.

8. El anticuerpo o fragmento de unión a un antígeno del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sujeto es un ser humano.