ES2774533T3 - Método para cuantificar la pureza de muestras de partículas subvisibles - Google Patents

Método para cuantificar la pureza de muestras de partículas subvisibles Download PDF

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Abstract

Un método para cuantificar la pureza de muestras de partículas subvisibles, que comprende: colocar una muestra para ser analizada en un microscopio electrónico para obtener una imagen (100) de microscopía electrónica de la muestra, muestra que contiene objetos (114); realzar los objetos (114) en la imagen que tienen tamaños que son diferentes de un intervalo de tamaños de partículas primarias (120) y tamaños que están dentro del intervalo de tamaños de partículas primarias (120); detectar los objetos (114) en la imagen como que son partículas primarias (120) o restos (106); excluir las partículas primarias (120) detectadas de los objetos (114) de modo que los objetos (114) contengan restos (106) pero ninguna partícula primaria (120); medir una primera área total (T1) de los restos (106) detectados; medir una segunda área total (T2) de las partículas primarias (120) detectadas; y calcular la relación de la primera área total (T1) a la segunda área total (T2) para determinar una medición cuantitativa de la pureza de la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para cuantificar la pureza de muestras de partículas subvisibles
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para evaluar y medir cuantitativamente cuán pura es una muestra usando microscopía electrónica.
Antecedentes y sumario de la invención
El desarrollo y la producción de productos biofarmacéuticos generalmente implican varias etapas de purificación donde los restos celulares, las partículas rotas, otros contaminantes y agrupaciones, etc., deben separarse para que el producto final contenga sólo las partículas primarias deseables. La pureza y dispersión de las partículas primarias de interés (es decir, partículas primarias no agrupadas) en el producto final es importante por su calidad y eficacia. Por lo tanto, evaluar cuantitativamente la pureza es importante para el producto final, pero también durante el desarrollo de las etapas aguas arriba y los procesos de producción para evaluar la eficacia y el efecto de cada etapa de purificación. La microscopía electrónica es un método mediante el cual se pueden obtener imágenes de las partículas subvisibles con una resolución suficiente para identificar las partículas de interés (partículas primarias), así como los restos, contaminantes y agrupaciones no deseadas en la muestra. En muchos procesos es importante una medida cuantitativa objetiva de la pureza de una muestra de partículas subvisibles tales como partículas de virus, partículas similares a virus, perlas inorgánicas y otras nanopartículas y micropartículas de muestras líquidas. Por ejemplo, los vectores de virus modificados se usan comúnmente en aplicaciones de terapia génica y las partículas de virus modificadas se usan como vacunas. Las solicitudes de patente WO 2008/150588 A1 y u S 2012/0250975 A1 son ejemplos de la técnica anterior en el campo de la identificación de partículas de virus en micrografías electrónicas. Las solicitudes de patente US 2012/0262703 A1 y EP 2317303 A2 se refieren a métodos existentes para diferenciar en la citometría restos de partículas en muestras. Sin embargo, los métodos disponibles actualmente para evaluar cuantitativamente la pureza no son muy precisos y a menudo implican etapas manuales que pueden distorsionar el resultado final. Existe la necesidad de un método más efectivo y fiable para evaluar y medir la pureza de las muestras líquidas que contienen partículas primarias subvisibles y contaminantes/restos.
El método de la presente invención proporciona una solución a los problemas descritos anteriormente. Más particularmente, el método es para cuantificar la pureza de muestras de partículas subvisibles. Una muestra que analizar se coloca en un microscopio electrónico para obtener una imagen de microscopía electrónica de la muestra. La muestra contiene objetos de partículas primarias, así como también restos. Los restos podrían romperse o partes (subunidades) de partículas primarias y/o contaminantes, y/o partículas primarias o agrupaciones o agregados de restos, y/o material sobrante de la fase de producción. Los objetos en la imagen están realzados y tienen tamaños diferentes de un intervalo de tamaño de partículas primarias y tamaños que están dentro del intervalo de tamaño de partículas primarias. Los objetos en la imagen se detectan como partículas primarias o restos. Las partículas primarias detectadas se excluyen de los objetos restantes para que los objetos detectados como restos contengan sólo restos y no partículas primarias. Se mide una primera área total (T1) de los restos detectados. Se mide una segunda área total (T2) de las partículas primarias detectadas. Se calcula la relación de la primera área total (T1) a la segunda área total (T2) para determinar una medida cuantitativa de la pureza de la muestra.
En otra realización, los bordes de los objetos en la imagen se realzan y los objetos tienen un tamaño que es sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias. Se analiza la redondez de los objetos para identificar partículas primarias.
En otra realización, los objetos en la imagen que tienen una forma que es sustancialmente similar a la de las partículas primarias se identifican como partículas primarias.
En otra realización, los bordes de los objetos en la imagen se realzan y los objetos tienen un tamaño que es sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias y se analiza el perfil de densidad radial de los objetos para identificar partículas primarias.
En aún otra realización, los bordes de los objetos en la imagen se realzan y los objetos tienen un tamaño que es sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias, y una relación señal a ruido en el borde de los objetos se analiza midiendo una intensidad promedio del interior de los objetos en comparación con una intensidad promedio justo fuera de los objetos.
En otra realización, los bordes de los objetos en la imagen se realzan y los objetos tienen un tamaño que es sustancialmente similar a un intervalo de tamaño de partículas primarias y se mide el contraste local de los objetos analizando la nitidez de un borde exterior de los objetos.
En otra realización, los bordes de los objetos en la imagen se realzan y los objetos tienen un tamaño que es sustancialmente similar a un intervalo de tamaño de partículas primarias y la estructura de los objetos se mide por medio de análisis de textura para identificar partículas primarias.
En otra realización, la estructura de los objetos en la imagen se mide por medio de análisis de textura y se analiza para identificar partículas primarias.
En otra realización, se coloca una muestra que contiene partículas de virus o partículas similares a virus en el microscopio electrónico.
En aún otra realización, la imagen se filtra con dos filtros de suavizado para crear una primera imagen filtrada y una segunda imagen filtrada y restando la primera imagen filtrada de la segunda imagen filtrada.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una imagen electrónica de transmisión de una muestra de partículas biológicas teñidas negativamente en solución;
La Figura 2 es una imagen que muestra el resultado después de que la diferencia del método gaussiano se haya utilizado para realzar los bordes finos;
La Figura 3 es una imagen de objetos primarios detectados en la imagen mostrada en la Figura 2 usando un método de detección específico;
La Figura 4 es una imagen que muestra el resultado después de realzar objetos del tamaño típico de los restos utilizando la diferencia del método gaussiano en la imagen original;
La Figura 5 es una imagen que muestra el resultado después de umbralizar la imagen con objetos realzados;
La Figura 6 es una imagen que muestra el resultado después de eliminar objetos correspondientes a las partículas primarias; y
La Figura 7 es una imagen que muestra el resultado final que incluye tanto partículas primarias como restos.
Descripción detallada
La presente invención describe un método único para medir cuantitativamente la pureza de una muestra que contiene partículas subvisibles o nanopartículas (que, por ejemplo, pueden tener un tamaño de aproximadamente 100 nm) en solución, basado en un análisis de imágenes automático y objetivo de imágenes de microscopía electrónica de la muestra. La muestra puede, por ejemplo, ser muestras líquidas, sólidos o polvos disueltos.
Se pueden utilizar imágenes de microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. En general, la medida de pureza de la presente invención es, preferiblemente, la relación de áreas de partículas primarias a partículas no primarias (incluidos los restos pequeños, así como las agrupaciones de restos grandes). Las etapas principales del método de la presente invención son:
1. Colocación de una muestra para ser analizada en un microscopio electrónico para obtener una imagen de microscopía electrónica de la muestra;
2. Realce de los bordes (tales como los bordes finos) de partículas primarias en la imagen que tienen un tamaño que es típico de la partícula primaria;
3. Detección específica de todas las partículas primarias en la imagen utilizando un método que esté adaptado para identificar las partículas primarias particulares;
4. Realce de los objetos de tamaños típicos para agrupaciones de restos y contaminantes en la imagen;
5. Detección de todos los objetos realzados en la etapa 4 utilizando, por ej., un método de umbralización;
6. Exclusión (resta) de las partículas primarias identificadas de los objetos realzados detectados;
7. Medición de un área total de las agrupaciones de restos y contaminantes detectados y restantes de la etapa 6; 8. Medición de un área total de las partículas primarias detectadas, detectadas en la etapa 3; y
9. Cálculo de la relación del área resultante de la etapa 7 al área resultante de la etapa 8.
En la Figura 1 se muestra una imagen 100 ejemplo típica, y las etapas 2-6 se ilustran en las Figuras 2-6. La Figura 7 muestra el resultado final 102, es decir, las partículas primarias 120 y los objetos 106 de restos. Las áreas medidas de las partículas primarias y los objetos de restos, respectivamente, se usan en las etapas 7 a 9 para obtener la medida de la pureza.
Más particularmente, la Figura 1 es una imagen 100 de microscopía electrónica de transmisión de una muestra de partículas biológicas teñidas negativamente en solución. Las partículas biológicas pueden ser partículas de virus o cualquier otra partícula orgánica. Las muestras que contienen partículas inorgánicas también pueden analizarse con el método de la presente invención. Se puede utilizar un método adecuado, tal como la diferencia de gaussianos o cualquier otro método adecuado, para realzar, por ejemplo, los bordes finos (o regiones de contraste/finas) de los objetos 116 en la imagen que tienen un tamaño que es típicamente el de la partícula primaria (etapa 2) a analizar. La Figura 2 muestra el resultado 105 después de que se haya utilizado la diferencia del método gaussiano para realzar los bordes finos de los objetos 116 identificados. El objeto 116 identificado es principalmente partículas primarias, pero puede contener algunos restos y contaminantes 106 indeseables (explicados con más detalle a continuación). Un cierto tipo de partículas de virus puede tener un tamaño esperado de 100 nm, de modo que las partículas que tienen un tamaño que es sustancialmente diferente probablemente no sean partículas primarias sino en su lugar partículas de restos 106 indeseables. Cabe señalar que el análisis en la etapa 2 puede no estar limitado al tamaño de las partículas enteras. También es posible centrarse en partes de la estructura de la partícula primaria que son específicas de las partículas primarias deseadas, tales como el patrón de la partícula o el grosor del borde exterior. Entonces es posible realzar una porción específica de la partícula tal como el patrón o el grosor del borde exterior de la partícula.
El realce de los bordes finos de partículas seleccionadas o partículas primarias (tale como usando la diferencia gaussiana) en la imagen ha proporcionado resultados inesperados y sorprendentemente buenos. Por ejemplo, la tinción de muestras biológicas (tales como partículas de virus) da como resultado diferentes cantidades de manchas que rodean a los objetos/partículas en la imagen debido al diferente grosor de la mancha en diferentes partes de la muestra, así como alrededor de objetos/partículas de diferentes tamaños. La cantidad (grosor) de la mancha y, por lo tanto, en qué parte de la cuadrícula se calcula la medida de la pureza influye directamente en la medida de la pureza y puede hacer que la medida sea menos correcta. Como se indicó anteriormente, los bordes u objetos en un intervalo de tamaños seleccionado en la imagen se mejoran utilizando, por ejemplo, la diferencia de enfoque gaussiano. Debe entenderse que también se pueden usar otros enfoques para realzar bordes u objetos. En la diferencia del método gaussiano, una imagen se filtra con dos filtros de suavizado gaussiano (que tienen un factor de suavizado sigma diferente). A continuación, una imagen filtrada se resta de la otra, lo que da como resultado una imagen con bordes u objetos realzados de, por ejemplo, un cierto tamaño. El resultado depende en parte de la combinación de factores de suavizado utilizados. Es en estas imágenes modificadas en las que se detectan entonces las partículas primarias, los restos y los contaminantes. Como se indicó anteriormente, la etapa de realzar el borde/objeto reduce el efecto de diferentes cantidades y una distribución desigual de la tinción. Por lo tanto, esta importante e innovadora etapa es necesaria en aplicaciones/casos en los que la tinción desigual es un problema, tal como cuando se analizan muestras biológicas de partículas de virus y otras partículas. En las muestras que solo contienen partículas/material inorgánico, puede excluirse la etapa de realzar el borde. Además, el realce de los objetos (es decir, partículas primarias en las etapas 2/3) de un cierto tamaño o característica seleccionada, tal como el grosor del borde o el patrón, antes de detectar todos los objetos después del realce de acuerdo con la etapa 4 (descrita a continuación), reduce el problema de la coloración y la iluminación de fondo desiguales en la imagen, que de otro modo podrían conducir fácilmente a un falso posicionamiento de los bordes del objeto e incluso dar como resultado objetos perdidos o detectados falsa o incorrectamente. En otras palabras, el realce en la etapa 2 facilita la identificación de las partículas primarias en vista de los variados colores de fondo y la iluminación del microscopio. Por ejemplo, el realce mejora, elimina o reduce el efecto de colores más claros en ciertos segmentos de la imagen y el efecto de gradientes de intensidad.
Sin embargo, algunas de las partículas indeseables de restos y contaminación pueden tener un tamaño similar al de las partículas primarias a analizar. En otras palabras, el realce en la etapa 2 puede realzar las partículas que tienen un tamaño similar o tienen otras características similares a las partículas primarias, pero no son partículas primarias. Entonces es necesario analizar más a fondo los objetos realzados en la etapa 2, por ejemplo, analizando la forma o la redondez de los objetos 116 con el fin de identificar y distinguir las partículas primarias 120 de los restos que pueden tener tamaños que están dentro del intervalo de tamaños de las partículas primarias. Esto se realiza en la etapa 3 (y el resultado 107 se muestra en la Figura 3) que identifica (en blanco) las partículas primarias 120 detectadas mediante el uso de un método de detección tal como el análisis de la simetría radial de las partículas/objetos identificados en la etapa 2 y como se muestra en la Figura 2.
Con el fin de hacer que el método de la presente invención y la medida cuantitativa de la pureza sean objetivas (es decir, imparciales para el usuario) y robustas, las etapas del presente método deben realizarse preferiblemente automáticamente con la entrada del usuario solo para seleccionar los tamaños aproximados de las partículas primarias, así como los límites inferior y superior de las partículas/objetos no primarios (restos y agrupaciones). Un aspecto importante de la presente invención es la capacidad de distinguir automáticamente las partículas primarias de las partículas/objetos no primarios. Como se indicó con respecto a la etapa 3, las partículas primarias circulares (tales como los vectores virales) pueden detectarse, por ejemplo, basándose en las características simétricas circulares u otros métodos que detectan específicamente las partículas primarias 120. Por ejemplo, la estructura de partículas de virus radialmente simétricas puede transformarse en un perfil de nivel gris. Se puede usar para describir la estructura calculando el nivel de gris medio a cada distancia desde el centro que va desde el centro hacia la periferia o caparazón de la estructura de partícula del virus. También es posible desarrollar algoritmos matemáticos para describir las estructuras o la forma de las partículas del virus en lugar de confiar en los perfiles de escala de grises.
Una característica importante del método de la presente invención es que es posible crear plantillas basadas en los perfiles de escala de grises para describir objetivamente las partículas de virus. Las plantillas también se pueden crear utilizando métodos matemáticos. De esta manera, todos los objetos detectados en un intervalo de tamaños pueden compararse con un perfil o plantilla que representa una partícula primaria típica y usar el perfil/plantilla para determinar si el objeto detectado es suficientemente similar al perfil/plantilla para ser clasificado como una verdadera partícula primaria 120. También puede ser posible utilizar otros métodos en la etapa 3 para identificar las partículas 120 primarias, tales como los métodos para detectar formas elípticas, semejantes a varillas o similares a cristales.
Debe entenderse que la referencia anterior a partículas de virus es meramente un ejemplo y la presente invención no se limita a partículas de virus. Además, la referencia a la circularidad/redondez de la partícula es meramente un ejemplo, y también se pueden usar otras características tales como patrones específicos, formas específicas y superficies de objetos.
Con respecto a la etapa 3 que está relacionada con la detección específica de partículas primarias 120 (y para eliminar las partículas no primarias que tienen un tamaño que es similar a las partículas primarias), se puede incluir una etapa adicional, que utiliza la relación señal a ruido o contrastes locales en el borde de los objetos 116. Esto se hace para mejorar aún más la detección de partículas primarias 120 y la decisión automática sobre qué es una partícula primaria o no. La relación señal a ruido se mide, preferiblemente, como la intensidad promedio en el interior de la partícula en comparación con la intensidad promedio justo fuera de la partícula. El enfoque de contraste local puede usarse para analizar qué tan afilados son los bordes externos y/o internos de la partícula para ser capaces de determinar mejor si es una partícula primaria o no. También con respecto a la etapa 3, para partículas no esféricas, se pueden usar otros métodos diseñados para la detección de formas específicas u otras características de las partículas primarias 120, tales como la textura (patrón en la superficie de la partícula).
La siguiente etapa es detectar restos y contaminantes indeseables en la muestra. La Figura 4 muestra el resultado 108 después de que los objetos se hayan realzado en la imagen original. Un problema es que el análisis y el realce en la etapa 4 también identifica e incluye algunas o todas las partículas primarias 120 identificadas en la etapa 3. En la etapa 4, todos los objetos 114 en la imagen se realzan utilizando, por ejemplo, la diferencia del método gaussiano. Los restos y las agrupaciones también pueden detectarse, por ejemplo, mediante un método de umbralización de intensidad (automático) como el método de umbralización de Otsu. Elegir manualmente el umbral de intensidad también funcionaría, pero podría introducir fácilmente sesgos de usuario no deseados.
Preferiblemente, los objetos 114 se identifican focalizándose en un cierto intervalo de tamaños que es típico de las agrupaciones de restos y contaminantes porque los restos/contaminantes pueden tener cualquier forma y color. Es posible enfocarse primero en objetos con tamaños que son típicos de restos y contaminantes, pero más pequeños que las partículas primarias y luego enfocarse en objetos con tamaños que son más grandes que las partículas primarias. La intensidad de los objetos 114 se analiza, preferiblemente, para identificar regiones o áreas que incluyen restos y contaminantes.
De esta manera, todos los objetos 114 realzados en la imagen se detectan en la etapa 5 y el resultado 110 se muestra en la Figura 5. En otras palabras, el método de identificación utilizado en la etapa 4 no es lo suficientemente específico para excluir las partículas primarias 120 por lo que tanto las partículas de restos como algunas o todas las partículas primarias se identifican como objetos 114 y se muestran en el resultado 110.
En la etapa 6, las partículas primarias identificadas 120, como se identifican en la etapa 3, que también se incluyen en los objetos 114, se excluyen o restan de los objetos 114 mostrados en la Figura 5, de modo que sólo los restos y contaminantes 106 detectados se muestran en el resultado 112 en la Figura 6. Esto significa que cualquier partícula primaria que se haya incluido en los objetos 114 como resultado del método de realce utilizado en la etapa 5, se elimina de modo que el resultado 112 sólo muestre partículas de restos y contaminación 106.
En la etapa 7, se mide el área total T1 de los objetos o restos 106 restantes después de la etapa 6, es decir, después de que se hayan eliminado las partículas primarias. En la etapa 8, se mide el área total T2 de las partículas primarias detectadas 120, como se muestra en la Figura 3. En la etapa 9, se calcula la relación R de las áreas resultantes después de la etapa 7 y la etapa 8, respectivamente.
El enfoque descrito, cuantificando la pureza como la relación de áreas de partículas primarias frente a otros objetos, es robusto. Unas pocas partículas primarias falsamente detectadas o perdidas sólo afectan el resultado de una manera no significativa ya que la medición se basa en una gran cantidad de imágenes que representan bien la muestra, preferiblemente como resultado de la adquisición de imágenes automatizada (imparcial para el usuario) o imágenes adquiridas manualmente.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para cuantificar la pureza de muestras de partículas subvisibles, que comprende:
colocar una muestra para ser analizada en un microscopio electrónico para obtener una imagen (100) de microscopía electrónica de la muestra, muestra que contiene objetos (114);
realzar los objetos (114) en la imagen que tienen tamaños que son diferentes de un intervalo de tamaños de partículas primarias (120) y tamaños que están dentro del intervalo de tamaños de partículas primarias (120);
detectar los objetos (114) en la imagen como que son partículas primarias (120) o restos (106);
excluir las partículas primarias (120) detectadas de los objetos (114) de modo que los objetos (114) contengan restos (106) pero ninguna partícula primaria (120);
medir una primera área total (T1) de los restos (106) detectados;
medir una segunda área total (T2) de las partículas primarias (120) detectadas; y
calcular la relación de la primera área total (T1) a la segunda área total (T2) para determinar una medición cuantitativa de la pureza de la muestra.
2. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además realzar bordes de objetos (116) en la imagen que tengan un tamaño que sea sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias (120), y analizar la redondez de los objetos (116) para identificar partículas primarias (120).
3. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además realzar bordes de objetos (116) en la imagen que tengan un tamaño que es sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias (120), y analizar un perfil de densidad radial de los objetos (116) para identificar partículas primarias (120).
4. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además realzar bordes de objetos (116) en la imagen que tengan un tamaño que sea sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias (120), y analizar la relación señal a ruido en el borde de los objetos (116) midiendo la intensidad promedio del interior de los objetos en comparación con la intensidad promedio justo afuera de los objetos (116).
5. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además realzar bordes de objetos (116) en la imagen que tengan un tamaño que sea sustancialmente similar a un intervalo de tamaños de partículas primarias (120), y analizar el contraste local de los objetos (116) analizando la nitidez del borde de los objetos.
6. El método según la reivindicación 1, en el que los objetos comprenden virus o partículas semejantes a virus.
7. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además filtrar la imagen con dos filtros de suavizado para crear una primera imagen filtrada y una segunda imagen filtrada y restar la primera imagen filtrada de la segunda imagen filtrada.
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