ES2774976T3 - Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado - Google Patents

Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado Download PDF

Info

Publication number
ES2774976T3
ES2774976T3 ES13721243T ES13721243T ES2774976T3 ES 2774976 T3 ES2774976 T3 ES 2774976T3 ES 13721243 T ES13721243 T ES 13721243T ES 13721243 T ES13721243 T ES 13721243T ES 2774976 T3 ES2774976 T3 ES 2774976T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
antibodies
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13721243T
Other languages
English (en)
Inventor
Adam Clarke
Matthew Pollard
Anthony Doyle
Collette Behrens
Tetsuo Yamagishi
David Wilson
Sarah Pogue
Tetsuya Taura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Original Assignee
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd filed Critical Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2774976T3 publication Critical patent/ES2774976T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente con CD38, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 185.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere en general al campo de la ingeniería de anticuerpos. De manera más específica, la presente divulgación se refiere a anticuerpos que se unen específicamente con CD38, así como construcciones que comprenden dichos anticuerpos y ligandos de interferón alfa atenuados y métodos de tratamiento que usan estas construcciones. En estas construcciones, los anticuerpos dirigen los ligandos a células que expresan tanto CD38 como receptores para los ligandos y el interferón alfa atenuado reduce la señalización de interferón en células que no expresan CD38.
Antecedentes de la divulgación
Diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos, artículos académicos y números de referencia de genes o proteínas se citan a lo largo de la memoria descriptiva.
CD38 es una glucoproteína transmembrana de tipo II de 46 kDa. Tiene una cola citoplasmática N-terminal corta de 20 aminoácidos, una única hélice transmembrana y un dominio extracelular largo de 256 aminoácidos. Se expresa en la superficie de muchas células inmunitarias, incluyendo linfocitos T CD4 y CD8 positivos, linfocitos B, linfocitos NK, monocitos, células plasmáticas y en una proporción significativa de células precursoras de médula ósea normales. En algunos casos, la expresión de CD38 en linfocitos puede depender de la diferenciación y el estado de activación de la célula, por ejemplo, los linfocitos T y B en reposo pueden ser negativos, mientras que los linfocitos inmaduros y activados pueden ser predominantemente positivos para expresión de CD38. La expresión de ARNm de CD38 se ha detectado en órganos no hematopoyéticos tales como el páncreas, cerebro, bazo e hígado (Koguma, T. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1223:160).
CD38 es una ectoenzima multifuncional que está implicada en señalización transmembrana y adhesión celular. También se conoce como ADP ribosa hidrolasa cíclica debido a que puede transformar NAD+ y NADP+ en cADPR, ADPR y NAADP, dependiendo del pH extracelular. Estos productos inducen movilización de Ca2+ dentro de la célula, que puede conducir a fosforilación de tirosina y activación de la célula. CD38 también es un receptor que puede interactuar con un ligando, CD31. La activación del receptor a través de CD31 conduce a acontecimientos intracelulares que incluyen movilización de Ca2+, activación celular, proliferación, diferenciación y migración.
CD38 se expresa a altos niveles en células de mieloma múltiple, en la mayoría de los casos de leucemias linfoblásticas agudas de linaje T y B, algunas leucemias mielocíticas agudas, linfomas de células del centro folicular y linfomas linfoblásticos T. CD38 también se expresa en células de leucemia linfoblástica crónica de linaje B (LLC-B). En algunos casos, los pacientes con LLC-B que presentan un clon CD38+ se caracterizan por una evolución clínica desfavorable con un estadio más avanzado de la enfermedad, mala respuesta a la quimioterapia y tiempo de supervivencia más corto. Se ha propuesto el uso de anticuerpos contra CD38 para el tratamiento de cánceres que expresan CD38 y neoplasias hematológicas. Por lo tanto, puede ser ventajoso proporcionar anticuerpos alternativos contra CD38 que tengan propiedades de fabricación, estabilidad e inmunogénicas deseables.
Se ha descrito que numerosos ligandos peptídicos y polipeptídicos actúan interactuando con un receptor en una superficie celular y de este modo estimulando, inhibiendo o modulando de otro modo una respuesta biológica, que implica habitualmente rutas de transducción de señales dentro de la célula que porta dicho receptor. Los ejemplos de dichos ligandos incluyen hormonas peptídicas y polipeptídicas, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y factores inductores de apoptosis.
Debido a las actividades biológicas de dichos ligandos, muchos tienen usos potenciales como productos terapéuticos. Los organismos reguladores han aprobado varios ligandos peptídicos o polipeptídicos como productos terapéuticos incluyendo, por ejemplo, hormona del crecimiento humano, insulina, interferón (IFN)-alfa2b, IFN-alfa2a, IFNp, eritropoyetina, G-CSF y GM-CSF.
Aunque estos y otros ligandos han demostrado potencial en aplicaciones terapéuticas, también pueden presentar toxicidad cuando se administran a pacientes humanos. Una razón para la toxicidad es que la mayoría de estos ligandos desencadenan receptores en diversas células, incluyendo células distintas de las que median en el efecto terapéutico deseado. Una consecuencia de dicha actividad "fuera de diana" de los ligandos es que muchos ligandos actualmente no son adecuados para su uso como agentes terapéuticos debido a que los ligandos no pueden administrarse a dosis suficientemente altas para producir efectos terapéuticos máximos u óptimos en las células diana que median en el efecto terapéutico.
Por ejemplo, se sabe desde mediados de la década de 1980 que los interferones, en particular IFN-alfa, son capaces de aumentar la apoptosis y disminuir la proliferación de determinadas células cancerosas. La FDA ha aprobado el IFN-alfa para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluyendo melanoma, carcinoma de células renales, linfoma de linfocitos B, mieloma múltiple, leucemia mielógena crónica (LMC) y tricoleucemia. Un efecto directo del IFN-alfa en las células tumorales está mediado por la unión de IFN-alfa directamente con el receptor de IFN de tipo I en esas células y la estimulación de la apoptosis, diferenciación terminal o reducción de la proliferación. Un efecto indirecto adicional del IFN-alfa en células no cancerosas es estimular el sistema inmunitario, lo que puede producir un efecto antineoplásico adicional al provocar que el sistema inmunitario rechace el tumor.
Estas actividades biológicas están mediadas por receptores de interferón de tipo I en la superficie de las células cancerosas que, cuando se estimulan, inician diversas rutas de transducción de señales que conducen a reducción de la proliferación y/o la inducción de diferenciación terminal o apoptosis. El receptor de interferón de tipo I, sin embargo, también está presente en la mayoría de las células no cancerosas. La activación de este receptor en células no cancerosas por IFN-alfa provoca la expresión de numerosas citocinas y quimiocinas proinflamatorias, lo que conduce a toxicidad y efectos adversos. Dicha toxicidad puede provocar síntomas de tipo gripal graves, lo que evita la dosificación de IFN-alfa a un sujeto a niveles que ejerzan la máxima actividad antiproliferativa y proapoptótica en las células cancerosas.
Cuando se usa IFN-alfa2b para tratar el mieloma múltiple, su utilidad reside, al menos en parte, en su unión con receptores de interferón de tipo I en las células de mieloma, que a su vez desencadena apoptosis y/o reducción de la proliferación y, por lo tanto, limita la progresión de la enfermedad. Desafortunadamente, sin embargo, este IFN también se une a células sanas dentro del cuerpo, desencadenando diversas respuestas celulares adicionales, algunas de los cuales son perjudiciales.
Una publicación de Ozzello (Breast Cancer Research and Treatment 25: 265-76, 1993) describe la conjugación química de IFN-alfa humano con un anticuerpo dirigido a tumor, localizando de este modo la actividad inhibidora directa de IFN-alfa en el tumor como una forma de reducir las velocidades de crecimiento tumoral, y demostró que dichos conjugados tienen actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de un cáncer humano. El mecanismo de la actividad antineoplásica observada se atribuyó a un efecto directo de IFN-alfa en las células cancerosas, ya que el IFN-alfa humano usado en los experimentos no interactuó de forma apreciable con el receptor de IFN de tipo I murino, lo que podría haber conducido a un efecto antineoplásico indirecto. Debido a esta falta de unión del IFN-alfa humano con las células murinas, no se evaluó la toxicidad del conjugado de anticuerpo-IFN-alfa con respecto al INF-alfa libre.
También pueden conectarse entre sí anticuerpos e IFN-alfa en forma de una proteína de fusión. Por ejemplo, el documento WO 01/97844 describe una fusión directa de IFN-alfa humano con el extremo C de la cadena pesada de una IgG específica para el antígeno tumoral CD20.
En general, el IFN puede dirigirse a células cancerosas. Aunque este enfoque puede dar como resultado un aumento de la actividad del IFN contra células cancerosas, no aborda por completo el problema de la actividad no deseada del IFN en células sanas. La fusión de IFN-alfa con el extremo C de la cadena pesada de una IgG puede prolongar la semivida del IFN-alfa, lo que conduce a acontecimientos adversos indeseables. En consecuencia, existe la necesidad de disminuir la actividad fuera de diana de los fármacos basados en ligandos, conservando al mismo tiempo el efecto terapéutico "en diana" de dichos ligandos.
En la técnica anterior, el documento WO 2011/154453 desvela anticuerpos humanos anti CD38 adecuados para el tratamiento, usados también en combinación con interferón alfa 2b, el documento WO 2012/092612 desvela anticuerpos monoclonales anti CD38, que presentan una afinidad en el intervalo nanomolar y median en CDC y ADCC, el documento US 2002/164788 desvela un anticuerpo humanizado específico para CD38 humano, el documento WO 2007/042309 desvela anticuerpos murinos, quiméricos y completamente humanos contra CD38 y el documento WO 2005/103083 desvela anticuerpos antagonistas humanos contra CD38 que median en ADCC y CDC y reducen el crecimiento de xenoinjertos de mieloma humano en un modelo murino.
Sumario de la divulgación
El primer aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente con CD38, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 156 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 185.
La divulgación presenta nuevos anticuerpos anti-CD38 y construcciones que comprenden un anticuerpo anti-CD38 e IFN-alfa atenuado. Los anticuerpos, que comprenden una o una pluralidad de mutaciones en sus regiones variables de cadena pesada y/o ligera conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38, incluyendo CD38 expresado en la superficie de células. Los anticuerpos pueden fusionarse, por ejemplo, con una forma atenuada de interferón alfa para formar una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón atenuado. El anticuerpo según el primer aspecto puede comprender una región constante de cadena pesada de IgG1 humana o una región constante de cadena pesada de IgG4 humana. La región constante de cadena pesada de IgG4 humana puede comprender una prolina en la posición 228 según el sistema de numeración EU. La región constante de la cadena pesada de IgG4 humana puede comprender una tirosina en la posición 252, una treonina en la posición 254 y un ácido glutámico en la posición 256 de la región constante según el sistema de numeración EU.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b, que comprende: un anticuerpo del primer aspecto; y un interferón alfa-2b que comprende una sustitución de alanina a ácido aspártico o de alanina a glicina en la posición correspondiente a la posición 168 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 7.
El interferón alfa-2b puede ser un interferón alfa-2b truncado en el extremo N, opcionalmente en donde el interferón alfa-2b truncado en el extremo N no tiene los veintitrés aminoácidos N-terminales. El interferón alfa-2b puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 649. El interferón alfa-2b puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 651 o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 647 o la SEQ ID NO: 650.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición, que comprende el anticuerpo del primer aspecto o la construcción del segundo aspecto y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona el anticuerpo del primer aspecto, la construcción del segundo aspecto o la composición del tercer aspecto para su uso en medicina.
La invención también proporciona el anticuerpo del primer aspecto, la construcción del segundo aspecto o la composición del tercer aspecto para su uso en el tratamiento de linfoma de linfocitos B, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica o leucemia mielógena aguda.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente con CD38 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 559 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 664. También se desvela un anticuerpo aislado que se une específicamente con CD38 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 665 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 666. También se desvela un anticuerpo aislado que se une específicamente con CD38 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 739 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 664. La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 559 excluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 664 excluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. También se desvela un anticuerpo aislado que se une específicamente con CD38 que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 514 o SEQ ID NO: 697, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 698 o SEQ ID NO: 737 y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 699 o SEQ ID NO: 738, y puede comprender además una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de las Se Q ID NO: 233, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 590 o SEQ ID NO: 696, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 591 o SEQ ID NO: 605, una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 587 o SEQ ID NO: 594.
La región variable de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731. La región variable de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 663. SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711.
El anticuerpo preferiblemente es capaz de unirse con células CD38 positivas. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 100 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula c D38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 75 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 50 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 30 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 25 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 20 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 15 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 13 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 10 nM.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal y es preferentemente un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo puede comprender un FAb. El anticuerpo puede comprender una región constante de IgG1 humana o una región constante de IgG4 humana. La región constante de IgG1 o IgG4 puede comprender una tirosina en la posición 252, una treonina en la posición 254 y un ácido glutámico en la posición 256 según el sistema de numeración EU. La región constante de IgG4 puede comprender una prolina en la posición 228 según el sistema de numeración EU, y la prolina en la posición 228 puede ser además de una tirosina en la posición 252, una treonina en la posición 254 y un ácido glutámico en la posición 256.
En algunos aspectos, el anticuerpo se fusiona con interferón alfa-2b atenuado. El interferón alfa-2b puede comprender una sustitución de la alanina en la posición 145 por glicina o ácido aspártico, incluyendo un interferón alfa-2b que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 649 o la SEQ ID NO: 651. El interferón alfa-2b atenuado puede fusionarse directamente con el extremo C de la región constante de IgG1 o IgG4 y el anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 658 o SEQ ID NO: 694. El anticuerpo, incluyendo el anticuerpo fusionado con un interferón alfa-2b atenuado puede estar comprendido en una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se desvelan en el presente documento polinucleótidos aislados que codifican el anticuerpo y el anticuerpo fusionado con un interferón alfa-2b atenuado. El polinucleótido puede comprender la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676 o SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746. Los polinucleótidos pueden comprender un vector. El vector puede usarse, por ejemplo, para transformar una célula. También se proporciona una célula transformada que comprende dichos polinucleótidos. La célula transformada puede comprender una célula de mamífero, una célula de levadura o una célula de insecto.
También se desvelan en el presente documento células estables que expresan los anticuerpos. Las células que expresan anticuerpos pueden ser células de mamífero. Son células preferidas las células de ovario de hámster chino (CHO).
Se desvelan en el presente documento equipos que comprenden anticuerpos fusionados con interferón alfa-2b atenuado. Los equipos comprenden la construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado e instrucciones para usar la construcción en un método para inhibir la proliferación de una célula tumoral que expresa CD38 y un receptor para interferón alfa-2b en su superficie, instrucciones para usar la construcción en un método para inducir apoptosis en una célula tumoral que expresa CD38 y un receptor para interferón alfa-2b en su superficie, instrucciones para usar la construcción en un método para tratar un tumor que comprende células que expresan CD38 y un receptor para interferón alfa-2b en su superficie en un sujeto que lo necesite y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se desvelan en el presente documento equipos que comprenden anticuerpos anti-CD38 y dichos equipos comprenden el anticuerpo anti-CD38 e instrucciones para usar el anticuerpo en un método para detectar una célula tumoral CD38-positiva en una muestra tisular aislada de un sujeto, el anticuerpo puede fusionarse opcionalmente con una proteína de interferón alfa-2b atenuado.
Las construcciones de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado pueden usarse como terapia en el tratamiento de un tumor que comprende células que expresan CD38 y un receptor para interferón alfa-2b en su superficie. En general, un método de tratamiento comprende administrar a un sujeto que tiene el tumor una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado con en una cantidad eficaz para tratar el tumor. La construcción puede comprender cualquier construcción descrita o ejemplificada en el presente documento. El sujeto es preferentemente un mamífero, más preferentemente un primate no humano y lo más preferentemente un ser humano. El tumor puede comprender un linfoma de células p, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica o leucemia mielógena aguda.
Los anticuerpos anti-CD38, opcionalmente fusionados con una proteína de interferón alfa-2b atenuado, se pueden usar en un método para detectar CD38 o una célula tumoral positiva para CD38 en una muestra tisular aislada de un sujeto. En general, el método comprende poner en contacto un anticuerpo que se une específicamente con CD38 con una muestra tisular aislada de un sujeto y detectar un complejo del anticuerpo y CD38 o una célula CD38 positiva en la muestra tisular. Se puede saber que la muestra tisular tiene o se sospecha que tiene células tumorales CD38 positivas. El tejido puede comprender sangre o médula ósea. La célula tumoral CD38 positiva puede ser una célula de linfoma de células p CD38 positivas, célula de mieloma múltiple, célula de linfoma no Hodgkin, célula de leucemia mielógena crónica, célula de leucemia linfocítica crónica o célula de leucemia mielógena aguda. El sujeto es preferentemente un mamífero, más preferentemente un primate no humano y lo más preferentemente un ser humano. El método puede incluir la etapa de aislar la muestra tisular del sujeto. El método puede comprender además poner en contacto el anticuerpo con una muestra tisular que no incluye ninguna célula CD38 positiva, por ejemplo, para que actúe como control negativo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un ejemplo de una construcción de fusión de anti-CD38-interferón atenuado.
Las figuras 2A y 2B muestran secuencias de regiones variables de cadena pesada de X02.1, construcciones relacionadas y la secuencia de anticuerpo de línea germinal más homóloga. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
Las figuras 3A y 3B muestran secuencias de regiones variables de cadena ligera de X02.1, construcciones relacionadas y la secuencia de anticuerpo de línea germinal más homóloga. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
Las figuras 4A-4D muestran las secuencias de regiones variables de cadena ligera de A02.1 y construcciones relacionadas. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
La figura 5 muestra la secuencia de cadena pesada variable consenso de A02.1 y construcciones relacionadas. Las regiones en cajas contienen CDR (como se indica) según lo definido por el sistema de numeración de Kabat y el sistema de numeración de Chothia mejorado. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat se muestran en negrita. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Chothia potenciado están subrayadas. La figura 6 muestra la secuencia de cadena ligera variable consenso de A02.1 y construcciones relacionadas. Las regiones en cajas contienen CDR (como se indica) según lo definido por el sistema de numeración de Kabat y el sistema de numeración de Chothia mejorado. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat se muestran en negrita. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Chothia están subrayadas.
Las figuras 7A-7C muestran secuencias de regiones variables de cadena pesada de regiones variables de cadena pesada humanizadas. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
Las figuras 8A-8C muestran secuencias de regiones variables de cadena pesada de regiones variables de cadena ligera humanizadas. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
Las figuras 9A y 9B muestran la cadena pesada variable de A10.0 y construcciones relacionadas. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
Las figuras 10A y 10B muestran la cadena ligera variable de A10.0 y construcciones relacionadas. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat están subrayadas.
La figura 11 muestra la secuencia consenso de cadena pesada variable de A10.0 y construcciones relacionadas. Las regiones en cajas contienen CDR (como se indica) según lo definido por el sistema de numeración de Kabat y el sistema de numeración de Chothia mejorado. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat se muestran en negrita. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Chothia potenciado están subrayadas. La figura 12 muestra la secuencia consenso de cadena ligera variable de A10.0 y construcciones relacionadas. Las regiones en cajas contienen CDR (como se indica) según lo definido por el sistema de numeración de Kabat y el sistema de numeración de Chothia mejorado. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat se muestran en negrita. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Chothia potenciado están subrayadas. La figura 13 muestra la actividad de unión de variantes de A02.1 con la línea celular de mieloma múltiple ARP-1 que expresa CD38, medida por citometría de flujo. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos de la presente memoria descriptiva.
La figura 14 muestra la actividad de unión de variantes de A02.1 con la línea celular de mieloma múltiple NCI-H929 que expresa CD38, medida por citometría de flujo. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos de la presente memoria descriptiva.
Las figuras 15 y 16 muestran la actividad antiproliferativa de variantes de A02.1 en la línea celular de mieloma múltiple ARP-1. El isotipo A es un anticuerpo de especificidad irrelevante fusionado con el interferón atenuado como control. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de proliferación celular).
La figura 17 muestra la actividad antiproliferativa de IFN-alfa2b (Intrón A) en comparación con A02.1 y A10.0 y sus anticuerpos no fusionados X02.1 y X10.0 correspondientes en la línea celular de mieloma múltiple ARP-1. El isotipo A es un anticuerpo de especificidad irrelevante fusionado con el interferón atenuado como control. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de proliferación celular).
La figura 18 muestra el factor de cambio relativo de la producción de anexina V en la línea celular de mieloma múltiple NCI-H929 que expresa CD38 cuando se trata con A02.1 y A10.0 y sus anticuerpos no fusionados X02.1 y X10.0 correspondientes durante 24 horas en comparación con un control no tratado. El isotipo A es un anticuerpo de especificidad irrelevante fusionado con el interferón atenuado como control. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de anexina V).
La figura 19 muestra el factor de cambio relativo de la activación de caspasa en la línea celular de mieloma múltiple H929 que expresa CD38 de IFN-alfa2b (Intrón A) frente a A02.1 y construcciones relacionadas en comparación con células no tratadas. El isotipo 145D es un anticuerpo de especificidad irrelevante fusionado con el interferón atenuado como control. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de caspasa).
La figura 20 muestra la actividad fuera de diana de IFN-alfa2b (Intrón A) frente a A02.6 y A02.6 fusionados con IFN-alfa2b de tipo silvestre (A02.6 (IFN ts)) en las células CD38 negativas. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (HEK-BLUE™).
La figura 21 muestra el factor de cambio relativo de la producción de anexina V en la línea celular de mieloma múltiple H929 que expresa CD38 entre los subtipos IgG1 e IgG4 de construcciones de proteína de fusión de anti-CD38-IFN-alfa atenuado. El isotipo A es un anticuerpo IgG4 inespecífico fusionado con el interferón atenuado como control. Los anticuerpos, A02.12 y A10.0 contienen regiones constantes de IgG4 fusionadas con IFN-alfa atenuado, mientras que A02.112 y A10.59 contienen regiones constantes de IgG1 fusionadas con IFN-alfa atenuado. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de anexina V/7AAD).
La figura 22 muestra la actividad de unión de variantes de A10.0 con la línea celular de mieloma múltiple NCI-H929 que expresa CD38, medida por citometría de flujo. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos de la presente memoria descriptiva.
La figura 23 muestra la activación de caspasa en la línea celular de mieloma múltiple H929 que expresa CD38 de A10.0 y A10.38 en comparación con células no tratadas. El isotipo A es un anticuerpo de especificidad irrelevante fusionado con el IFN atenuado como control. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de caspasa).
La figura 24 muestra el factor de cambio relativo de la activación de caspasa en la línea celular de mieloma múltiple H929 que expresa CD38 por variantes A10.0 en comparación con células no tratadas. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de caspasa).
La figura 25 muestra el factor de cambio relativo de producción de anexina V en la línea celular de mieloma múltiple H929 que expresa CD38 por variantes A10.0. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de anexina V/7Aa D).
La figura 26 muestra la actividad antiproliferativa de IFN-alfa2b (Intrón A) en comparación con construcciones de anticuerpos quiméricos A02.6, A10.0, A10.38 y A10A2.0 original en la línea celular de linfoma de Burkitt Daudi. El isotipo A es un anticuerpo de especificidad irrelevante fusionado con el IFN atenuado como control. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos (ensayo de proliferación celular).
La figura 27 muestra los efectos de A10.0 humanizado frente a la construcción de interferón atenuado con anticuerpo quimérico A10A2.0 original sobre el crecimiento de tumores de mieloma H929 subcutáneo en ratones SCID. La barra etiquetada "fase de tratamiento" muestra la duración del tratamiento con los compuestos.
La figura 28 muestra la actividad de IFN dirigido a antígeno distinta de anticuerpo de variantes A10.0 fusionadas con la misma proteína de IFN-alfa2b atenuado. Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos ("Ensayos fuera de diana" - ensayo indicador de genes iLite). La figura 29 muestra la actividad "fuera de diana" de IFN-alfa2b (Intrón A) en comparación con variantes A10.0 y el anticuerpo quimérico A10A2.0 original fusionado con IFN-alfa2b de tipo silvestre (quimérico A10A2.0 (IFN ts)). Los detalles del ensayo se describen en los ejemplos ("Ensayos fuera de diana" - HEK-BLUE™).
La figura 30 muestra secuencias consenso de cadena pesada variable de IgG4 de X910/12-HC-L0-Interferón-alfa (A145D) y secuencias relacionadas. Las regiones en cajas contienen CDR (como se indica) según lo definido por el sistema de numeración de Kabat y el sistema de numeración de Chothia mejorado. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat se muestran en negrita. Las CDR definidas por el sistema de numeración de Chothia potenciado están subrayadas.
Descripción detallada de la divulgación
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se usan diversos términos relacionados con aspectos de la divulgación. Dichos términos van a tener su significado habitual en la técnica, a menos que se indique otra cosa. Otros términos definidos de manera específica deben interpretarse de un modo coherente con la definición proporcionada en el presente documento.
Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente e incluyen cualquier animal. Se prefieren los mamíferos, incluyendo mamíferos de compañía y de granja, así como roedores, incluyendo ratones, conejos y ratas, y otros roedores. Se prefieren más primates no humanos, tales como monos Cynomolgus, y se prefieren en gran medida seres humanos.
Una molécula tal como un anticuerpo se ha "aislado" si se ha alterado y/o eliminado de su ambiente natural por la mano de un ser humano.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que se indique expresamente otra cosa.
Una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado incluye, pero sin limitación, cualquier anticuerpo descrito o ejemplificado en el presente documento que se une específicamente con CD38 que se fusiona con una proteína de interferón alfa-2b atenuado, incluyendo un interferón alfa-2b de las SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 648, Se Q ID NO: 649, SEQ ID NO: 650 o SEQ ID NO: 651. En algunos aspectos, la fusión de una proteína de interferón alfa-2b no mutado, tal como la SEQ ID NO: 7, con un anticuerpo anti-CD38 atenúa las actividades biológicas de la molécula de interferón. En la presente divulgación, interferón atenuado, interferón alfa-2b atenuado, IFN-alfa2b A145D e IFN-alfa2b A145G se usan indistintamente.
La especificidad no es necesariamente una designación absoluta, pero puede constituir un término relativo que significa el grado de selectividad de una construcción de proteína de fusión de IFN-alfa con anticuerpo para una célula positiva para antígeno en comparación con una célula negativa para antígeno. La especificidad de una construcción de proteína de fusión de IFN-alfa de anticuerpo para una célula positiva para antígeno está mediada por las regiones variables del anticuerpo y habitualmente por las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo. Una construcción puede tener una especificidad de 100 veces para células positivas para antígeno en comparación con células negativas para antígeno.
CD38 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y CD38 de mono cynomolgus comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
Se ha observado además que el interferón alfa2b puede atenuarse con respecto a su actividad biológica que está mediada a través de la unión del interferón con un receptor de interferón en una superficie celular mediante introducción de determinados cambios de aminoácidos en la secuencia proteica. Una molécula de interferón atenuado puede fusionarse con anticuerpos que se unen específicamente con CD38, de manera que el anticuerpo puede actuar como un vehículo de suministro para el interferón atenuado a células CD38 positivas con una disminución resultante de la actividad de interferón fuera de diana provocada por la molécula de interferón atenuado. Se ha observado además que la fusión del interferón atenuado con los anticuerpos de CD38 no afecta significativamente a la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente con CD38 en células que expresan CD38, incluyendo células en el cuerpo de los animales. Se ha observado además que pueden obtenerse por ingeniería genética variantes de los anticuerpos de CD38 y expresarse de modo que los anticuerpos tengan inmunogenicidad reducida y estabilidad y semivida mejoradas sin una pérdida significativa de especificidad o afinidad del anticuerpo por el antígeno CD38. Estas variantes de anticuerpos pueden fusionarse con un interferón atenuado.
En consecuencia, se presentan anticuerpos que se unen específicamente con CD38. También se ha observado que dichos anticuerpos anti-CD38 pueden emplearse como vehículos de suministro para ligandos atenuados tales como interferón alfa. Sin pretender limitarse a ninguna teoría o mecanismo de acción particular, se cree que los anticuerpos dirigen el interferón alfa con el que están unidos a células CD38 positivas, donde el interferón puede interactuar con su receptor. Se cree que el anticuerpo, como vehículo de suministro, compensa la capacidad disminuida de la molécula de interferón para unirse con su receptor. En este sentido, el interferón atenuado tiene capacidad reducida para interactuar con su receptor en células sanas y en particular células que no expresan CD38. Se cree que aproximando el interferón atenuado a su receptor en células CD38 positivas, los anticuerpos pueden mejorar la capacidad del interferón atenuado para unirse con su receptor relevante e inducir un efecto terapéutico, presentando al mismo tiempo una capacidad disminuida para inducir efectos indeseables en células sanas que no expresan CD38.
Los anticuerpos pueden ser policlonales, pero, en algunos aspectos, no son policlonales. Los anticuerpos son preferentemente monoclonales. Los anticuerpos son preferentemente anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos de longitud completa comprenden en general una cadena pesada de región variable y una cadena ligera de región variable. Los anticuerpos pueden comprender derivados o fragmentos o partes de anticuerpos que conservan la especificidad de unión a antígeno y también preferentemente conservan la mayor parte o la totalidad de la afinidad, de la molécula de anticuerpo original (p. ej., para CD38). Por ejemplo, los derivados pueden comprender al menos una región variable (bien una región variable de cadena pesada o de cadena ligera). Otros ejemplos de derivados y fragmentos de anticuerpos adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, diacuerpos, moléculas monocatenarias, así como moléculas FAb, F(ab')2, Fd, Fabc y Fv, anticuerpos de cadena sencilla (Sc), anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv), cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones entre cadenas de anticuerpos y otras moléculas, monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y una ligera y otros multímeros. Los anticuerpos Fv de cadena sencilla pueden ser multivalentes. Todos los isotipos de anticuerpos pueden usarse para producir derivados, fragmentos y partes de anticuerpos. Pueden producirse derivados, fragmentos y/o partes de anticuerpos de manera recombinante y ser expresados por cualquier tipo celular, procariota o eucariota.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado puede referirse a un anticuerpo monoclonal con el que se ha fusionado IFN-alfa o un IFN-alfa atenuado, con el extremo C de la región constante de IgG de cadena pesada. Cuando el anticuerpo monoclonal tiene una especificidad de unión con CD38 y el IFN-alfa es IFN-alfa 2b atenuado, el anticuerpo aislado también se denomina proteína de fusión de IFN-alfa atenuado con anti-CD38 o una construcción de fusión de IFN-alfa atenuado con anti-CD38 en el presente documento.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FWR o FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FWR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, FWR4. Normalmente, es menos probable que las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo sean alteradas por cambios en las secuencias de FWR que por cambios en las secuencias de CDR. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAI e IgA2) o subclase.
Los anticuerpos pueden obtenerse de cualquier especie. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de ratón, rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, camello, pollo, conejo, burro, llama, dromedario, tiburón o humanos, así como anticuerpos de cualquier otra especie animal. Para su uso en el tratamiento de seres humanos, los anticuerpos no obtenidos de seres humanos pueden alterarse estructuralmente para que sean menos antigénicos tras su administración a un paciente humano, incluso por quimerización o humanización o sobrehumanización.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados son aquellos en donde los aminoácidos implicados directamente en la unión a antígeno, p. ej., las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y, en algunos casos, las regiones marco conservadas (FWR), o partes de las mismas, de las cadenas pesadas y/o ligeras no son de origen humano, mientras que el resto de los aminoácidos en el anticuerpo son humanos o de otro modo de origen humano, p. ej., un armazón de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos en los que uno o más restos de la proteína humana se modifican mediante una o más sustituciones de aminoácidos y/o uno o más restos de FWR de la proteína humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo humano ni en el anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo sobrehumanizado, p. ej., como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 7.732.578. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos humanizados.
Se prefiere en gran medida que los anticuerpos sean completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos son aquellos en los que la molécula completa es humana o de otro modo de origen humano o incluye una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo. Los anticuerpos completamente humanos incluyen los obtenidos de una biblioteca de genes V humanos, por ejemplo, donde los genes humanos que codifican regiones variables de anticuerpos se expresan de manera recombinante. Pueden expresarse anticuerpos completamente humanos en otros organismos (p. ej., ratones y tecnología xenomouse) o células de otros organismos transformados con genes que codifican anticuerpos humanos. No obstante, los anticuerpos completamente humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas, p. ej., mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de longitud completa de cualquier clase, por ejemplo, IgG1, IgG2 o IgG4. Los dominios constantes de dichos anticuerpos son preferentemente humanos. Las regiones variables de dichos anticuerpos pueden ser de origen no humano o preferentemente son de origen humano o están humanizadas. También pueden usarse fragmentos de anticuerpos en lugar de los anticuerpos de longitud completa.
Los anticuerpos pueden ser minicuerpos. Los minicuerpos comprenden versiones pequeñas de anticuerpos completos, que codifican en una sola cadena los elementos esenciales de un anticuerpo completo. Por ejemplo, el minicuerpo puede estar compuesto por los dominios VH y VL de un anticuerpo nativo fusionado con la región bisagra y el dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina.
El anticuerpo puede comprender marcos de proteínas no derivadas de inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede hacer referencia a (Ku y Schutz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556, 1995) que describe un citocromo b562 de proteína de haz de cuatro hélices que tiene dos bucles aleatorizados para crear c Dr , que se han seleccionado para unión a antígeno.
Pueden existir variaciones de secuencia natural entre las cadenas pesadas y ligeras y los genes que las codifican y, por lo tanto, se esperaría que los expertos habituales en la materia encontraran algún nivel de variación dentro de las secuencias de aminoácidos, o los genes que las codifican, de los anticuerpos descritos y ejemplificados en el presente documento. Estas variantes mantienen preferentemente las propiedades de unión únicas (p. ej., especificidad y afinidad) del anticuerpo original. Dicha expectativa se debe en parte a la degeneración del código genético, así como al éxito evolutivo conocido de variaciones de secuencias de aminoácidos conservativas, que no alteran de forma apreciable la naturaleza de la proteína codificada. En consecuencia, dichas variantes y homólogos se consideran sustancialmente iguales entre sí y se incluyen dentro del alcance de la divulgación. Los anticuerpos incluyen por tanto variantes que tienen sustituciones, supresiones, adiciones o reemplazos de aminoácidos individuales o múltiples que conservan las propiedades biológicas (p. ej., especificidad de unión y afinidad de unión) de los anticuerpos originales. Las variantes son preferentemente conservadoras, pero pueden no ser conservadoras.
Las posiciones de aminoácidos asignadas a CDR y FWR pueden definirse según Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991 (también denominado en el presente documento sistema de numeración de Kabat). Además, las posiciones de aminoácidos asignadas a CDR y FWR pueden definirse según el esquema de numeración de Chothia mejorado (http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html). La región constante de cadena pesada de un anticuerpo puede ser definida por el sistema de numeración EU (Edelman, GM et al. (1969), Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85).
Según el sistema de numeración de Kabat, las FWR y CDR de VH se pueden colocar de la siguiente manera: restos 1-30 (FWR1), 31-35 (CDR1), 36-49 (FWR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FWR3), 95-102 (CDR3) y 103-113 (FWR4), y las FWR y CDR de VL se colocan de la siguiente manera: restos 1-23 (FWR1), 24-34 (CDR1), 35-49 (Fw R2), 50-56 (CDR2), 57-88 (FWR3), 89-97 (CDR3) y 98-107 (FWR4). En algunos casos, las regiones variables pueden aumentar en longitud y, según el sistema de numeración de Kabat, algunos aminoácidos pueden designarse por un número seguido de una letra. Esta especificación no se limita a las FWR y CDR definidas por el sistema de numeración de Kabat, sino que incluye todos los sistemas de numeración, incluyendo el sistema de numeración canónico o de Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-83; y/o Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-48; el sistema de numeración de Honnegher et al. (2001) J. Mol. Biol., 309: 657-70; o el sistema IMGT analizado en Giudicelli et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 206-11. Las CDR pueden definirse según el sistema de numeración de Kabat.
Para cualquiera de los subdominios de CDR2 de cadena pesada descritos en el presente documento, según el sistema de numeración de Kabat, los cinco aminoácidos C-terminales pueden no participar directamente en la unión a antígeno y, en consecuencia, se entenderá que uno o más de estos cinco aminoácidos C-terminales pueden sustituirse con otro aminoácido de origen natural sin afectar sustancialmente de manera adversa a la unión a antígeno. Para cualquiera de los subdominios de CDR1 de cadena ligera descritos en el presente documento, según el sistema de numeración de Kabat, los cuatro aminoácidos N-terminales pueden no participar directamente en la unión a antígeno y, en consecuencia, se entenderá que uno o más de estos cuatro aminoácidos pueden sustituirse con otro aminoácido de origen natural sin afectar sustancialmente de manera adversa a la unión a antígeno. Por ejemplo, según lo descrito por Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139, los cinco aminoácidos C terminales de CDR2 de cadena pesada y/o los cuatro aminoácidos N terminales de CDR1 de cadena ligera pueden no participar en la unión a antígeno. Tanto la CDR2 de cadena pesada como la CDR1 de cadena ligera pueden no participar directamente en la unión a antígeno.
Se pueden usar análogos químicos de aminoácidos en los anticuerpos descritos y/o ejemplificados en el presente documento. El uso de análogos químicos de aminoácidos es útil, por ejemplo, para estabilizar las moléculas, tal como si es necesario administrarlas a un sujeto. Los análogos de los aminoácidos contemplados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, modificaciones de cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de péptidos, polipéptidos o proteínas y el uso de reticuladores y otros métodos que imponen restricciones conformacionales a la molécula proteica o sus análogos.
Los anticuerpos pueden comprender modificaciones o restos postraduccionales, que puede influir en la actividad o estabilidad del anticuerpo. Estas modificaciones o restos incluyen, pero sin limitación, restos metilados, acetilados, glucosilados, sulfatados, fosforilados, carboxilados y amidados y otros restos que son bien conocidos en la técnica. Los restos incluyen cualquier grupo químico o combinaciones de grupos que se encuentran habitualmente en moléculas de inmunoglobulina en la naturaleza o que se añaden de otro modo a anticuerpos mediante sistemas de expresión recombinantes, incluyendo sistemas de expresión procariotas y eucariotas.
Los ejemplos de modificaciones de las cadenas laterales contempladas por la divulgación incluyen modificaciones de grupos amino tales como por alquilación reductora mediante reacción con un aldehído seguido de reducción con NaBH4; amidinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido de reducción con NaBH4.
El grupo de guanidina de restos de arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo puede modificarse mediante la activación de carbodiimida a través de la formación de O-acilisourea seguido de una derivación posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino.
Los restos de triptófano pueden modificarse mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los restos de tirosina, por otro lado, pueden alterarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.
Se puede realizar modificación del anillo de imidazol de un resto de histidina mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.
Se pueden usar reticuladores, por ejemplo, para estabilizar las conformaciones 3D de los anticuerpos y las construcciones, usando reticuladores homobifuncionales tales como los imidoésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH2)n con n=1 a n=6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que habitualmente contienen un resto reactivo a amino tal como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico de grupo tal como resto de maleimido o ditio (SH) o carbodiimida (COOH).
Los anticuerpos pueden madurar por afinidad o pueden comprender cambios de aminoácidos que disminuyen la inmunogenicidad, por ejemplo, eliminando motivos de unión al MHC de clase II predichos. La utilidad terapéutica de los anticuerpos descritos en el presente documento puede mejorarse adicionalmente modulando sus características funcionales, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), semivida en suero, biodistribución y unión a receptores de Fc o la combinación de cualquiera de estos. Esta modulación puede lograrse mediante ingeniería de proteínas, glucoingeniería o métodos químicos. Dependiendo de la aplicación terapéutica necesaria, podría ser ventajoso aumentar o disminuir cualquiera de estas actividades. Un ejemplo de glucoingeniería usó el método Potelligent® como se describe en Shinkawa T. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 3466-73.
Los anticuerpos pueden incluir modificaciones que modulan su semivida y biodistribución en suero, incluyendo modificaciones que modulan la interacción del anticuerpo con el receptor de Fc neonatal (FcRn), un receptor con un papel clave en la protección de la IgG del catabolismo y el mantenimiento de alta concentración de anticuerpo en suero. Pueden producirse modificaciones moduladoras de la semivida en suero en la región Fc de IgG1 o IgG4, incluyendo la triple sustitución de M252Y/S254T/T256E (numeración según el sistema de numeración EU (Edelman, G.M. et al. (1969) Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85)), (p. ej., SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 694), como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 7.083.784. Pueden producirse otras sustituciones en las posiciones 250 y 428, véase, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 7.217.797, así como en las posiciones 307, 380 y 434, véase, p. ej., documento WO 00/42072. Se describen ejemplos de sustituciones de aminoácidos de dominio constante que modulan la unión con receptores de Fc y la función posterior mediada por estos receptores, incluyendo unión a FcRn y semivida en suero, en las publicaciones de los Estados Unidos n.° 2009/0142340, 2009/0068175 y 2009/0092599. Los anticuerpos desnudos pueden tener la lisina C-terminal de la cadena pesada omitida o eliminada para reducir la heterogeneidad. La sustitución de S228P (numeración EU) en la IgG4 humana puede estabilizar el intercambio de la rama de Fab de anticuerpos in vivo (Labrin et al. (2009) Nature Biotechnology 27: 8; 767-773).
Se sabe que los glucanos unidos con moléculas de anticuerpos influyen en las interacciones del anticuerpo con receptores de Fc y receptores de glucanos y, de este modo, influyen en la actividad de los anticuerpos, incluyendo la semivida en suero. Por tanto, determinadas glucoformas que modulan las actividades de anticuerpos deseadas pueden conferir una ventaja terapéutica. Los métodos para generar glucoformas modificadas por ingeniería genética incluyen, pero sin limitación, los descritos en las patentes de los Estados Unidos n.° 6.602.684, 7.326.681 y 7.388.081 y publicación PCT n.° WO 08/006554. Como alternativa, las secuencias de anticuerpos pueden modificarse para eliminar sitios de unión a glucoforma relevantes.
Los anticuerpos pueden marcarse o conjugarse con cualquier resto químico o biomolecular. Los anticuerpos marcados pueden encontrar uso en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico o de investigación básica. Dichos marcadores/conjugados pueden ser detectables, tales como fluorocromos, radiomarcadores, enzimas, proteínas fluorescentes y biotina. Los marcadores/conjugados pueden ser agentes quimioterapéuticos, toxinas, isótopos y otros agentes usados para tratar afecciones tales como la destrucción de células cancerosas. Los agentes quimioterapéuticos pueden ser cualquiera que sea adecuado para el fin para el que se usa el anticuerpo.
Los anticuerpos pueden derivatizarse mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos para evitar la escisión proteolítica o mejorar la actividad o la estabilidad.
Los anticuerpos tienen preferentemente una afinidad de unión por un epítopo en CD38 que incluye una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 x 10'2 M. En algunas realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'3 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'4 M. En algunas realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'5 M. En otras realizaciones más, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'6 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'7 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'8 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'9 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'10 M. En otras realizaciones más, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'11 M. En algunas realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'12 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'13 M. En otras realizaciones, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'14 M. En otras realizaciones más, la Kd es menos de aproximadamente 1 x 10'15 M. Los valores de afinidad se refieren a los obtenidos mediante metodologías convencionales, incluyendo resonancia de plasmón superficial, tales como análisis de Biacore™ o análisis usando un sistema Dip-and-Read Octet® Red 96 (Forte Bio).
Los anticuerpos pueden comprender una molécula Fv de cadena sencilla (scFv), Fab o IgG completa. En el presente documento se desvela cualquiera de dichos anticuerpos que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o al menos aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 659 o SEQ ID NO: 665 o SEQ ID NO: 736, siempre que una cadena pesada que comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 659 o una variante de la misma excluya la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. Se entenderá que los anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos en su cadena pesada conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38. La actividad de unión específica de CD38 conservada (incluyendo afinidad) es preferentemente aproximadamente igual que la actividad de unión (incluyendo afinidad) de un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en la cadena pesada, aunque la actividad de unión (incluyendo afinidad) puede ser menor o mayor que un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en la cadena pesada. El anticuerpo puede comprender una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o al menos aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 664 o SEQ ID NO: 666, siempre que una cadena ligera que comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 664 o una variante de la misma excluya la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. Se entenderá que los anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos en su cadena ligera conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38. La actividad de unión específica de CD38 conservada (incluyendo afinidad) es preferentemente aproximadamente igual que la actividad de unión (incluyendo afinidad) de un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en la cadena ligera, aunque la actividad de unión (incluyendo afinidad) puede ser menor o mayor que un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en la cadena ligera.
La FWR1 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 577 o SEQ ID NO: 748, y la FWR1 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 577 o SEQ ID NO: 748. La FWR2 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 749 o SEQ ID NO: 750, y la FWR2 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 749 o SEQ ID NO: 750. La FWR3 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 751 o SEQ ID NO: 752 y la FWR3 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 751 o SEQ ID NO: 752.
La FWR4 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 581 o SEQ ID NO: 753, y la FWR4 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 581 o SEQ ID NO: 753. Se entenderá que los anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos en la región o las regiones marco conservadas de cadena pesada (FWR1, FWR2, FWR3 y/o FWR4) conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38. La actividad de unión específica de CD38 conservada (incluyendo afinidad) es preferentemente aproximadamente igual que la actividad de unión (incluyendo afinidad) de un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones marco conservadas de cadena pesada, aunque la actividad de unión (incluyendo afinidad) puede ser menor o mayor que un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones marco conservadas de cadena pesada.
La CDR1 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529 o SEQ ID NO: 697 y la CDR1 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529 o SEQ ID NO: 697. La CDR2 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 698 o SEQ ID NO: 737 y la CDR2 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 698 o SEQ ID NO: 737. La CDR3 de cadena pesada puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 699 o SEQ ID NO: 738 y la CDR3 de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 699 o SEQ ID NO: 738. Se entenderá que los anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos en la región o las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y/o CDR3) conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38. La actividad de unión específica de CD38 conservada (incluyendo afinidad) es preferentemente aproximadamente igual que la actividad de unión (incluyendo afinidad) de un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada, aunque la actividad de unión (incluyendo afinidad) puede ser menor o mayor que un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada.
La FWR1 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 634 o SEQ ID NO: 638 y la FWR1 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 634 o SEQ ID NO: 638. La FWR2 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 635 o SEQ ID NO: 639 y la FWR2 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 635 o SEQ ID NO: 639. La FWR3 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 636 o SEQ ID NO: 640 y la FWR3 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 636 o SEQ ID NO: 640. La FWR4 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 637 o SEQ ID NO: 641 y la FWR4 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 637 o SEQ ID NO: 641. Se entenderá que los anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos en la región o las regiones marco conservadas de cadena ligera (FWR1, FWR2, FWR3 y/o FWR4) conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38. La actividad de unión específica de CD38 conservada (incluyendo afinidad) es preferentemente aproximadamente igual que la actividad de unión (incluyendo afinidad) de un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones marco conservadas de cadena ligera, aunque la actividad de unión (incluyendo afinidad) puede ser menor o mayor que un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones marco conservadas de cadena ligera.
La CDR1 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 608 o SEQ ID NO: 696, y la CDR1 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 608 o SEQ ID NO: 696. La CDR2 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 610 o SEQ ID NO: 747 y la CDR2 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 610 o SEQ ID NO: 747. La CDR3 de cadena ligera puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 606 o SEQ ID NO: 612 y la CDR3 de cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 606 o SEQ ID NO: 612. Se entenderá que los anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos en la región o las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y/o CDR3) conservan la capacidad de unirse específicamente con CD38. La actividad de unión específica de CD38 conservada (incluyendo afinidad) es preferentemente aproximadamente igual que la actividad de unión (incluyendo afinidad) de un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera, aunque la actividad de unión (incluyendo afinidad) puede ser menor o mayor que un anticuerpo sin ningún cambio de aminoácidos en ninguna región o regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera.
El anticuerpo puede comprender pares de cadenas pesadas y ligeras particulares. Las cadenas pesadas que tienen las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 659 pueden emparejarse con cualquier cadena ligera que tenga las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 664, o las cadenas pesadas que tienen las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 665 pueden emparejarse con cualquier cadena ligera que tenga las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 666, o la cadena pesada que tiene las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 736 puede emparejarse con cualquier cadena ligera que tenga las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 664.
Los pares de cadenas variables pesadas y variables ligeras pueden comprender pares de la siguiente tabla:
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0001
(continuación)
Figure imgf000018_0001
(continuación)
Figure imgf000019_0001
(continuación)
Figure imgf000020_0001
(continuación)
Figure imgf000021_0001
(continuación)
Figure imgf000022_0001
(continuación)
Figure imgf000023_0001
(continuación)
Figure imgf000024_0001
(continuación)
Figure imgf000025_0001
Los anticuerpos pueden fusionarse con ligandos atenuados, por ejemplo, para formar construcciones de anticuerpoligando atenuado, que muestran un índice de especificidad de antígeno elevado con respecto a la activación de rutas de señalización debido a la acción del ligando atenuado en un receptor de superficie celular. Estas construcciones se basan en la observación de que, en el contexto de una construcción de anticuerpo-ligando, la parte de ligando se puede mutar de tal manera que la actividad del ligando en células negativas para antígeno se atenúe drásticamente, mientras que la actividad del ligando en células positivas para antígeno solo se atenúa moderadamente, o no se atenúa. Dichas construcciones presentan potencia uno, dos, tres, cuatro o cinco órdenes de magnitud mayor en células positivas para antígeno en comparación con células negativas para antígeno que el ligando libre. En algunos aspectos, la construcción de anticuerpo-ligando atenuado conserva al menos 1 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 % o al menos 50 % de la potencia en células positivas para antígeno como el ligando libre no atenuado (es decir, no unido a un anticuerpo). En algunos aspectos, la construcción de anticuerpo-ligando atenuado conserva al menos 30 %, al menos 50 %, al menos 75 % o al menos 90 % de la actividad máxima del ligando libre no atenuado (es decir, no unido a un anticuerpo). La actividad máxima incluye la cantidad de actividad de señalización (o efecto corriente abajo de la misma) en la parte de meseta alta de una curva de dosis-respuesta, donde aumentos adicionales en el agente no aumentan adicionalmente la cantidad de respuesta.
En algunos aspectos, la fusión de anticuerpo con y la inclusión de una mutación o mutaciones atenuantes en el ligando de interferón aumenta el índice de especificidad de antígeno (IEA) en más de 10 veces, preferentemente más de 50 veces, preferentemente más de 100 veces, preferentemente más de 1000 veces o preferentemente más de 10.000 veces, en relación con un anticuerpo sin fusión. El IEA comprende la potencia con factor de aumento en la actividad de señalización de la construcción de anticuerpo-ligando de IFN en relación con el ligando de polipéptido libre no mutado en células positivas para antígeno diana, multiplicado por la potencia con factor de reducción en la actividad de señalización en relación con el ligando polipeptídico libre no mutado en células negativas para antígeno diana. La potencia puede estar representada cuantitativamente por el valor de CE50, que es el punto medio matemático de una curva de dosis-respuesta, en el que la dosis se refiere a la concentración de ligando o construcción de anticuerpoligando en un ensayo y la respuesta se refiere a la respuesta cuantitativa de las células a la actividad de señalización del ligando a una dosis particular. Por tanto, por ejemplo, cuando se muestra que un primer compuesto posee una CE50 (expresada, por ejemplo, en unidades molares) que es 10 veces menor que la CE50 de un segundo compuesto en las mismas células, normalmente cuando se mide por el mismo método, se dice que el primer compuesto tiene una potencia 10 veces mayor. Por el contrario, cuando se muestra que un primer compuesto posee una CE50 que es 10 veces mayor que la CE50 de un segundo compuesto en las mismas células, normalmente cuando se mide por el mismo método, se dice que el primer compuesto tiene una potencia 10 veces menor.
Los anticuerpos son preferentemente capaces de unirse con células CD38 positivas. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 100 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 75 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 50 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 30 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 25 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 20 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 18 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 15 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 13 nM. El anticuerpo puede unirse con una célula CD38 positiva con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 10 nM.
El interferón unido al anticuerpo comprende preferentemente alteraciones en su secuencia de aminoácidos, incluyendo mutaciones puntuales y/o supresiones que hacen que el interferón sea menos activo en la estimulación de sus respectivos receptores en las células que carecen de la expresión de la superficie celular del antígeno CD38 con el que se une el anticuerpo. Una variante muy preferida de interferón alfa comprende un cambio de aminoácido en la posición 168 de la molécula de interferón alfa 2b de la SEQ ID NO: 7. Por ejemplo, el aminoácido en la posición 168, que es una alanina en la molécula de IFN-alfa2b original, preferentemente se cambia a una glicina (Gly/G) (SEQ ID NO: 650) o ácido aspártico (Asp/D) (SEQ ID NO: 647). En algunos aspectos, el IFN-alfa2b se trunca en su extremo N cuando el IFN-alfa2b se fusiona con un dominio constante de cadena pesada de IgG tal como el dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana o IgG4 humana. El IFN-alfa2b truncado no tiene los veintitrés aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 7 (se suprimen de Met 1 a Gly 23) y el IFN-alfa2b truncado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 648. El IFN-alfa2b truncado también puede comprender el cambio de aminoácidos en lo que anteriormente era la posición 168, pero que se convierte en la posición 145 en la proteína truncada (p. ej., la alanina 168 se convierte en alanina 145). En el IFN-alfa2b truncado, la alanina preferentemente se cambia a una glicina (Gly/G) (SEQ ID NO: 651) o ácido aspártico (Asp/D) (SEQ ID NO: 649). Se prefiere en particular interferón con alteración A145D (SEQ ID NO: 647 o SEQ ID NO: 649) como el ligando atenuado fusionado con los anticuerpos de la divulgación. Cualquiera de estas versiones atenuadas, mutadas puntualmente, de IFN-alfa puede unirse con cualquier anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, como una construcción de anticuerpo-interferón atenuado.
El enlace entre el anticuerpo y el interferón comprende preferentemente una fusión, por ejemplo, un enlace peptídico entre el extremo N o el C del interferón y el extremo N o C de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. En aspectos muy preferidos, no hay ningún conector presente entre el anticuerpo y el interferón, y por tanto el anticuerpo y el interferón se fusionan directamente. Se cree que la fusión directa, sin un péptido conector intermedio, proporciona al menos un grado medible de atenuación de la proteína de interferón y también se cree que esta atenuación es aditiva con la atenuación de la proteína de interferón que surge de las mutaciones introducidas en la proteína de interferón, incluyendo las descritas o ejemplificadas en el presente documento.
Se presentan secuencias polinucleotídicas que codifican anticuerpos y sus subdominios (p. ej., FWR y CDR) en la divulgación. Los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, ARN, ADN, ADNc, híbridos de ARN y ADN y cadenas mono, bi o tricatenarias de ARN, ADN o híbridos de los mismos.
Los polinucleótidos pueden codificar la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente con un epítopo en CD38. El polinucleótido puede codificar una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO:, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745 o SEQ ID NO: 746. El polinucleótido puede codificar una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718 o SEQ ID NO: 719. El polinucleótido puede comprender la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO:, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718 o SEQ ID NO: 719. El polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 86 %, al menos aproximadamente 87 %, al menos aproximadamente 88 %, al menos aproximadamente 89 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO:, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718 o SEQ ID NO: 719, y dichas variantes codifican preferentemente los mismos aminoácidos codificados por la secuencia polinucleotídica de las SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO:, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718 o SEQ ID NO: 719. Preferentemente, los anticuerpos codificados por las variantes polinucleotídicas se unirán específicamente con CD38 con una afinidad aproximadamente igual a la afinidad del anticuerpo codificado por la secuencia polinucleotídica original (no variante). La afinidad se puede medir, por ejemplo, según cualquier técnica descrita o ejemplificada en el presente documento, incluyendo técnicas descritas en los ejemplos. Los complementos de las secuencias polinucleotídicas y las secuencias polinucleotídicas variantes también están dentro del alcance de la divulgación.
Se desvelan en el presente documento vectores que los polinucleótidos de la divulgación. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Se proporcionan por tanto vectores de expresión recombinante que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés. El comprenden vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales, tales como, pero sin limitación, secuencias reguladoras, un marcador de selección, un marcador de purificación o una señal de poliadenilación. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de la transcripción, potenciadores, sitios de unión ribosómica de ARNm o secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.
Los vectores de expresión, especialmente vectores de expresión de mamíferos, puede incluir uno o más elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador ligado al gen para expresar, otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3', secuencias no traducidas 5' o 3' (tales como sitios de unión a ribosomas necesarios), un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme o secuencias de terminación de la transcripción. También puede incorporarse un origen de replicación que confiere la capacidad de replicar en un hospedador específico.
Los vectores pueden usarse para transformar cualquiera de una amplia gama de células hospedadoras bien conocidas por los expertos en la materia y preferentemente células hospedadoras capaces de expresar anticuerpos. Los vectores incluyen, sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) y baculovirus, así como otros vectores bacterianos, eucariotas, de levadura y víricos. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células CHO, células HEK293 o cualquier línea celular estable eucariota conocida o producida, y también incluyen bacterias, levadura y células de insectos.
Los anticuerpos también pueden ser producidos por células de hibridoma; siendo los métodos para producir hibridomas bien conocidos y establecidos en la técnica.
Se ha observado de acuerdo con la divulgación que cuando el ligando de interferón alfa, que tiene una o más mutaciones que disminuyen sustancialmente la afinidad del ligando por un receptor de interferón, está ligado con un anticuerpo anti-CD38 que dirige el ligando alfa de interferón mutado con células diana que presentan el antígeno correspondiente del anticuerpo, la actividad del ligando en células positivas para antígeno diana se mantiene, mientras que la actividad del ligando en células negativas para antígeno no diana se reduce sustancialmente. El resultado neto es una molécula de señalización de ligando que tiene una potencia mucho mayor en la activación de sus receptores en células diana positivas para antígeno en comparación con células no diana negativas para antígeno, que proporciona un medio para reducir la toxicidad que surge de actividad del ligando fuera de diana.
Una construcción polipeptídica puede comprender una variante de IFN-alfa unida a un anticuerpo anti-CD38 o una parte de unión a antígeno del mismo. Dicho polipéptido será capaz de ejercer con alta potencia la actividad antiproliferativa del IFN en células tumorales CD38 positivas ejerciendo al mismo tiempo una potencia mucho menor en células no tumorales, CD38 negativas, dentro del cuerpo.
La divulgación también proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos y las construcciones de anticuerpo-interferón atenuado de la divulgación. Estas composiciones pueden comprender además al menos uno de cualquier adyuvante adecuado, tal como, pero sin limitación, uno o más diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, tampones, sales, disolventes lipófilos, conservantes, adyuvantes u otro vehículo y/o excipiente adecuado. Se prefieren adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones pueden comprender cualquiera de los anticuerpos y construcciones de anticuerpo-interferón atenuado descritos y/o ilustrados en el presente documento y un vehículo aceptable tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados incluyen cualquier medio que no interfiera con la actividad biológica del anticuerpo y/o del interferón y preferentemente no sea tóxico para un hospedador al que se administra. El vehículo puede ser una solución acuosa, tal como agua, solución salina o alcohol, o un tampón fisiológicamente compatible, tal como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. El vehículo puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Los excipientes y aditivos farmacéuticos útiles en la composición incluyen, pero sin limitación, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (p. ej., azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, tetra y oligosacáridos; azúcares derivatizados tales como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y otros azúcares conocidos; y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes solos o en combinación, comprendiendo solos o en combinación cualquier peso o volumen adecuado. Los excipientes proteicos ilustrativos incluyen albúmina sérica, tal como albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y otras proteínas conocidas. Los aminoácidos representativos que también pueden actuar como tampones incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina y aspartamo. Un aminoácido preferido es histidina. Un segundo aminoácido preferido es arginina.
Los excipientes de carbohidratos adecuados para su uso en la composición incluyen, por ejemplo, monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa y sorbosa; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa y celobiosa; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos y almidones; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) y mioinositol. Son excipientes de carbohidratos preferidos para su uso en la divulgación manitol, trehalosa y rafinosa.
Las composiciones de anticuerpos también pueden incluir un tampón o un agente de ajuste del pH; normalmente, el tampón es una sal preparada a partir de un ácido o base orgánicos. Los tampones representativos incluyen sales de ácidos orgánicos, tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o acido ftálico; Tris, clorhidrato de trometamina o tampones de fosfato. Son tampones preferidos para su uso en las presentes composiciones son sales de ácidos orgánicos, tales como citrato.
Adicionalmente, las composiciones de la divulgación pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos, tales como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérico), dextratos (p. ej., ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-pciclodextrina), polietilenglicoles, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensioactivos (p. ej., polisorbatos tales como "TWEEN® 20" y "TWEEN® 80"), lípidos (p. ej., fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (p. ej., colesterol) y agentes quelantes (p. ej., EDTA).
Las composiciones también pueden formularse en vehículos de liberación sostenida o preparaciones de depósito. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro adecuados para su uso como vehículos para fármacos hidrófobos.
Las composiciones pueden formularse para su administración a un sujeto en cualquier forma farmacéutica adecuada. Las composiciones pueden formularse para administraciones orales, bucales, nasales, transdérmicas, parenterales, inyectables, intravenosas, subcutáneas, intramusculares, rectales o vaginales. Las composiciones pueden formularse en un vehículo de liberación controlada adecuado, con un adyuvante o como una formulación de depósito.
Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para su inyección, productos solubles secos estériles listos para combinar con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, polvos insolubles secos estériles listos para combinar con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles.
Se puede usar una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado, por ejemplo, para inhibir, reducir, disminuir, bloquear o prevenir la proliferación de una célula que expresó CD38 en su superficie. Los métodos para inhibir o reducir la proliferación de una célula que expresa c D38 en su superficie comprenden en general poner en contacto una célula que expresa CD38 con una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en una cantidad eficaz para inhibir o reducir la proliferación de la célula. El anticuerpo que se une específicamente con CD38 puede ser cualquier anticuerpo descrito o ilustrado en el presente documento. El interferón alfa 2b atenuado puede comprender IFN-alfa2b A145D o IFN-alfa2b A145G. La célula puede ser un linfocito, un linfocito autoinmunitario o una célula tumoral tal como una célula de leucemia, una célula de mieloma múltiple o una célula de linfoma. La construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado puede estar comprendida en una composición, por ejemplo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más adyuvantes o excipientes, incluyendo cualquier vehículo, adyuvante o excipiente descrito o ilustrado en el presente documento. Los métodos pueden llevarse a cabo in vitro, ex vivo, in vivo o in situ.
Se puede usar también una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado, por ejemplo, para inducir, facilitar o potenciar la apoptosis de una célula que exprese CD38 en su superficie. Los métodos para inducen la apoptosis en una célula que expresa CD38 en su superficie comprenden en general poner en contacto una célula que expresa CD38 con una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en una cantidad eficaz para inducir la apoptosis en la célula. El anticuerpo que se une específicamente con CD38 puede ser cualquier anticuerpo descrito o ilustrado en el presente documento. El interferón alfa 2b atenuado puede comprender IFN-alfa2b A145D o IFN-alfa2b A145G. La célula puede ser un linfocito, un linfocito autoinmunitario o una célula tumoral tal como una célula de leucemia, una célula de mieloma múltiple o una célula de linfoma. La construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado puede estar comprendida en una composición, por ejemplo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más adyuvantes o excipientes, incluyendo cualquier vehículo, adyuvante o excipiente descrito o ilustrado en el presente documento. Los métodos pueden llevarse a cabo in vitro, ex vivo, in vivo o in situ.
También se puede usar una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado para tratar a un sujeto que tiene un tumor que comprende y/o está mediado, al menos en parte, por células que expresan CD38 en su superficie. Los métodos para tratar un tumor que comprende células que expresan CD38 en su superficie comprenden en general administrar a un sujeto que lo necesite una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto. El tratamiento eficaz puede incluir, por ejemplo, inhibir o reducir la proliferación de células CD38 positivas en el tumor y/o inducir apoptosis de células CD38 positivas en el tumor. El anticuerpo que se une específicamente con CD38 puede ser cualquier anticuerpo descrito o ilustrado en el presente documento. El interferón alfa 2b atenuado puede comprender IFN-alfa2b A145D o IFN-alfa2b A145G. La construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado puede estar comprendida en una composición, por ejemplo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más adyuvantes o excipientes, incluyendo cualquier vehículo, adyuvante o excipiente descrito o ilustrado en el presente documento.
Las construcciones de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado o composición que comprende dichas construcciones pueden administrarse al tumor administrando las construcciones de composición a la sangre. Las construcciones de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado o composición que comprende dichas construcciones pueden administrarse de modo que la construcción se difunda a través del torrente sanguíneo a y/o en las células tumorales. La construcción puede ser internalizada por una célula tumoral.
Se proporciona uso de un anticuerpo anti-CD38 o una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en el tratamiento de tumores. Se desvelan en el presente documento métodos para tratar tumores con un anticuerpo anti-CD38 o una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado. Se puede usar cualquier construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38 o anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado descrito o ilustrado en el presente documento. Los tumores que pueden tratarse incluyen, pero sin limitación, cánceres relacionados con SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoquístico, cáncer corticosuprarrenal, metaplasia mieloide agnógena, alopecia, sarcoma alveolar de partes blandas, cáncer de ano, angiosarcoma, anemia aplásica, astrocitoma, ataxia-telangiectasia, carcinoma basocelular (piel), cáncer de vejiga, cánceres óseos, cáncer de intestino, glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales y del SNC, cáncer de mama, tumores del SNC, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, tumores cerebrales infantiles, cáncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tejidos blandos infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cánceres colorrectales, linfoma cutáneo de linfocitos T, dermatofibrosarcoma protuberante, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, carcinoma ductal, cánceres endocrinos, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de ojo, ojo: melanoma, retinoblastoma, cáncer de las trompas de Falopio, anemia de Fanconi, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cánceres gastrointestinales, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres genitourinarios, tumores de células germinales, enfermedad gestacional-trofoblástica, glioma, cánceres ginecológicos, neoplasias hematológicas, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, histiocitosis, enfermedad de Hodgkin, virus del papiloma humano, mola hidatiforme, hipercalcemia, cáncer de la hipofaringe, melanoma intraocular, cáncer de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome de Li-Fraumeni, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama masculino, tumor maligno rabdoide de riñón, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de rotura de Nimega, cáncer de piel distinto de melanoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cánceres oculares, cáncer de esófago, cáncer de la cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario con ostomía, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer paratiroideo, cáncer de glándula parótida, cáncer de pene, tumores neuroectodérmicos periféricos, cáncer de hipófisis, policitemia vera, cáncer de próstata, cánceres raros y trastornos asociados, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico (CPM), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumores de la médula espinal, carcinoma de células escamosas (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición (vejiga), cáncer de células de transición (pelvis renal/uréter), cáncer trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer del sistema urinario, uroplaquinas, sarcoma uterino, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms. En una realización, el tumor se selecciona de un grupo de mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin.
Los métodos pueden usarse para el tratamiento de mieloma múltiple, leucemia o linfoma en un sujeto que lo necesite. Dichos métodos pueden comprender además tratar al sujeto con un retinoide, tal como ácido holo transretinoico. Cuando el antígeno asociado a la superficie celular es CD38, el tumor o el cáncer se puede seleccionar de mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica o leucemia mielógena aguda.
Una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado puede combinarse con otros fármacos y/o usarse además de otros regímenes o modalidades de tratamiento del cáncer, como radioterapia o cirugía. Cuando se usan construcciones de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en combinación con agentes terapéuticos conocidos, la combinación se puede administrar en secuencia (de manera continua o dividida por periodos sin tratamiento) o simultáneamente o como una mezcla. En el caso del cáncer, existen numerosos agentes antineoplásicos conocidos que pueden usarse en este contexto. El tratamiento en combinación también se contempla para abarcar el tratamiento con la construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado seguido de un tratamiento conocido o tratamiento con un agente conocido seguido de tratamiento con construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado, por ejemplo, como terapia de mantenimiento. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer se contempla que la construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado se pueda administrar en combinación con un agente alquilante (tal como mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamidecisplatino o agentes de tipo alquilante que contienen platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), un antimetabolito (como un análogo de purina o pirimidina o un agente antifolato, tal como azatioprina y mercaptopurina), una antraciclina (tal como daunorrubicina, doxorrubicina, epirubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona o análogo de antraciclina), un alcaloide vegetal (tal como un alcaloide de la vinca o un taxano, tal como vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, paclitaxel o dosetaxel), un inhibidor de topoisomerasa (tal como un inhibidor de topoisomerasa de tipo I o tipo II), una podofilotoxina (tal como etopósido o tenipósido) o un inhibidor de tirosina cinasa (tal como mesilato de imatinib, nilotinib o dasatinib).
En el caso del tratamiento del mieloma múltiple, se puede administrar una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en combinación con otras terapias adecuadas, tales como tratamiento del sujeto con la administración de esteroides tales como dexametasona, inhibidores de proteasoma (tales como bortezomib o carfilzomib), fármacos inmunomoduladores (tales como talidomida, lenalidomida o pomalidomida) o quimioterapia de inducción seguida de trasplante de células madre hematopoyéticas autólogas, con o sin otros agentes quimioterapéuticos tales como clorhidrato de melfalán o los agentes quimioterapéuticos enumerados anteriormente.
En el caso del tratamiento del linfoma de Hodgkin, se puede administrar una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en combinación con enfoques terapéuticos actuales, tales como ABVD (adriamicina (doxorrubicina), bleomicina, vinblastina y dacarbazina) o Stanford V (doxorrubicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, mecloretamina, etopósido, prednisona) o BEACOPP (doxorrubicina, bleomicina, vincristina, ciclofosfamida, procarbazina, etopósido, prednisona).
En el caso del linfoma no Hodgkin u otros linfomas, se puede administrar una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado en combinación con enfoques terapéuticos actuales. Los ejemplos de fármacos aprobados para linfoma no Hodgkin incluyen abitrexato (metotrexato), adriamicina PFS (clorhidrato de doxorrubicina), adriamicina RDF (clorhidrato de doxorrubicina), amboclorina (clorambucilo), amboclorina (clorambucilo), Arranon (nelarabina), clorhidrato de bendamustina, Bexxar (tositumomab y tositumomab de yodo I 131), Blenoxane (bleomicina), bleomicina, bortezomib, clorambucilo, Clafen (ciclofosfamida), ciclofosfamida, citoxano (ciclofosfamida), denileucina-diftitox, DepoCyt (citarabina liposómica), clorhidrato de doxorrubicina, DTIC-Dome (dacarbazina), Folex (metotrexato), Folex PFS (metotrexato), Folotyn (pralatrexato), Ibritumomab tiuxetan, Istodax (romidepsina), Leukeran (clorambucilo), Linfolizin (clorambucilo), citarabina liposómica, Matulane (clorhidrato de procarbazina), metotrexato, metotrexato LPF (metotrexato), Mexate (metotrexato), Mexate-AQ (metotrexato), Mozobil (Plerixafor), nelarabina, Neosar (ciclofosfamida), Ontak (denileucina diftitox), Plerixafor, pralatrexato, Rituxan (rituximab), rituximab, romidepsina, tositumomab y tositumomab de yodo I 131, Treanda (clorhidrato de bendamustina), Velban (sulfato de vinblastina), Velcade (bortezomib) y Velsar (sulfato de vinblastina), sulfato de vinblastina, Vincasar PFS (sulfato de vincristina), sulfato de vincristina, vorinostat, Zevalin (tiuxetano de ibritumomab), Zolinza (vorinostat). Los ejemplos de combinaciones farmacológicas usadas en el tratamiento de linfoma no Hodgkin incluyen CHOP (C = ciclofosfamida, H = clorhidrato de doxorrubicina (hidroxidaunomicina), O = sulfato de vincristina (oncovina), P = prednisona); COPP (C = ciclofosfamida, O = sulfato de vincristina (oncovina), P = clorhidrato de procarbazina, P = prednisona); CVP (C = ciclofosfamida, V = sulfato de vincristina, P = prednisona); EPOCH (E = Etopósido, P = prednisona, O = sulfato de vincristina (oncovina), C = ciclofosfamida, H = clorhidrato de doxorrubicina (hidroxidaunomicina)); ICE (I = ifosfamida, C = carboplatino, E = etopósido) y R-CHOP (R = rituximab, C = ciclofosfamida, H = clorhidrato de doxorrubicina (hidroxidaunomicina), O = sulfato de vincristina (oncovina), P = prednisona.
Un anticuerpo anti-CD38 o una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado puede usarse para detectar células positivas para CD38, incluyendo células tumorales positivas para CD38. Se pueden usar en métodos para detectar una célula tumoral positiva para CD38 en una muestra tisular aislada de un sujeto, pudiendo dichos métodos comprender en general poner en contacto un anticuerpo anti-CD38 o una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado, con una muestra tisular aislada de un sujeto y detectar un complejo del anticuerpo o la construcción y una célula positiva para CD38 en la muestra tisular. La muestra tisular es preferentemente sangre. La célula puede ser una célula de linfoma de linfocitos B positivos para CD38, célula de mieloma múltiple, célula de linfoma no Hodgkin, célula de leucemia mielógena crónica, célula de leucemia linfocítica crónica o célula de leucemia mielógena aguda. El método puede comprender además aislar la muestra tisular del sujeto.
La divulgación también presenta equipos que comprenden cualquiera de los anticuerpos y construcciones de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado descritas e ilustradas en el presente documento. Los equipos pueden usarse para suministrar anticuerpos y otros agentes para su uso en métodos de diagnóstico, investigación básica o terapéuticos, entre otros.
Un equipo puede comprender una construcción de fusión de anti-CD38-interferón alfa-2b atenuado, la construcción comprendida opcionalmente en una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable e instrucciones para usar el equipo en uno o más de un método para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral que expresa CD38 en su superficie, un método para inducir apoptosis en una célula tumoral que expresa CD38 en su superficie y/o un método para tratar un tumor que comprende y/o está mediado por células que expresan CD38 en su superficie. Dichos métodos pueden ser cualquier método descrito o ilustrado en el presente documento. Los equipos pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los equipos pueden comprender uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables y/o uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En los equipos, el anticuerpo anti-CD38 puede ser cualquier anticuerpo descrito o ilustrado en el presente documento y el interferón alfa-2b atenuado puede comprender cualquier interferón alfa-2b atenuado descrito o ilustrado en el presente documento. Las construcciones pueden estar comprendidas en soluciones estériles listas para inyección o administración intravenosa o pueden comprender una forma estéril, liofilizada, lista para combinar con un vehículo justo antes de su uso.
Un equipo puede comprender un anticuerpo anti-CD38 e instrucciones para usar el equipo en un método para detectar células positivas para CD38 en una muestra, incluyendo una muestra tisular aislada de un sujeto. El anticuerpo anti-CD38 puede ser cualquier anticuerpo descrito o ilustrado en el presente documento. El anticuerpo puede fusionarse opcionalmente con una proteína de interferón alfa-2b atenuado.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la divulgación con mayor detalle. Se pretende que ilustren, no limiten, la divulgación.
Ejemplo de referencia 1
Optimización de IgG4 X355/02-HC-L0-IFN-alfa (A145D)
Otras proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado se describen en la solicitud PCT n.° PCT/AU2012/001323. Estas incluyen la construcción de anticuerpo designada en la solicitud PCT como IgG4 X355/02-HC-L0-IFN-alfa (A145D). En la presente memoria descriptiva, IgG4 X355/02-HC-L0-IFN-alfa (A145D) se ha renombrado A02.1. La secuencia de cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. La cadena ligera variable de A02.1 (SEQ ID NO: 14) se coexpresó con su cadena pesada variable A02.1 (SEQ ID NO: 13) formateada en una región constante de IgG4 humana que contiene la sustitución S228P (numeración EU) (SEQ ID NO: 3). Este anticuerpo se denominado en el presente documento X02.1. A02.1 incluye una fusión con IFN-alfa2b mientras que X02.1 no, a pesar de que ambos anticuerpos comparten secuencias idénticas de cadena pesada y cadena ligera.
Se realizó una búsqueda BLAST (Altschul SF (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) contra una base de datos de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana usando la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de X02.1. El gen de cadena pesada variable de línea germinal humana más cercano fue IGHV4-61*01 (SEQ ID NO: 16). En la figura 2 se muestra una alineación de X02.1 VH e IGHV4-61*01. La región pesada variable X02.1 difiere en ocho aminoácidos de su secuencia de aminoácidos de la línea germinal más cercana. Para reducir la inmunogenicidad de la región variable de cadena pesada X02.1, podrían producirse sustituciones de restos de aminoácidos de línea germinal en restos donde difiere de la secuencia de línea germinal y las variantes de anticuerpos resultantes ensayadas para determinar la actividad de unión anti-CD38.
En la figura 2 se detallan varias variantes de cadena pesada de la secuencia original de X02.1. Estas regiones variables de cadena pesada se formatearon en la región constante de IgG4 S228P y se coexpresaron con la cadena ligera de A02.1. Las tablas 1a y 1b detallan las secuencias de las variantes ensayadas junto con su capacidad para unirse a CD38 humano según se evaluó usando citometría de flujo y resonancia de plasmón superficial (RPS). En resumen, las cadenas de anticuerpos se coexpresaron transitoriamente en células CHO y se purificaron mediante cromatografía de proteína A como se describe en el ejemplo 5. Se usaron ensayos de unión de flujo como se describe en el ejemplo 5 para evaluar las variantes. La CE50 de la curva de respuesta a dosis obtenida para cada anticuerpo también se proporciona en las tablas 1a y 1b.
Tabla 1a
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Tabla 1b
Figure imgf000032_0002
La unión por RPS de las variantes detalladas en la tabla 1a se evaluó por separado de las de la tabla 1b. La Kd (M) del anticuerpo parental X02.1 varió de 2,7 x 10-8 a 3,78 x 10-10 en los experimentos de unión de RPS. Los experimentos de unión de citometría de flujo mostraron que los anticuerpos X02.8, X02.11, X02.69 y X02.71 se unían intensamente con la línea celular positiva para CD38 ARP-1.
Los anticuerpos con las sustituciones de aminoácidos anteriores se exploraron posteriormente en el contexto de una proteína de fusión mediante conjugación con IFN-alfa2b atenuado (denominado A02 cuando se une con IFN, representando el número después del punto la misma variante que tiene la designación X02). Estas regiones variables de cadena pesada se formatearon en una región constante de IgG4 que comprende la sustitución S228P fusionada con IFN-alfa2b atenuado A145D y coexpresada en células CHO o HEK con la cadena ligera A02.1 como se describe en el ejemplo 5. Las proteínas que se purificaron con éxito a partir del sobrenadante celular se ensayaron después en un ensayo de unión de flujo con la línea celular ARP-1. El valor de CE50 de la curva de respuesta a dosis para cada anticuerpo se proporciona en la tabla 2. Todas las construcciones de fusión de anticuerpo-IFN atenuado se probaron unidas con la línea celular positiva para CD38 ARP-1. Se observó que la variante de cadena pesada X02.9 (no fusionada a IFN) no pudo purificarse fácilmente mientras que una variante idéntica fusionada con IFN (A02.9) se purificó. En algunos casos, las proteínas de fusión de IFN atenuado pudieron expresarse y purificarse, cuando el anticuerpo monoclonal equivalente parecía más difícil de expresar y/o purificar.
Tabla 2
Figure imgf000032_0003
Se realizaron búsquedas BLAST usando la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable A02.1 frente a la base de datos de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. El gen de cadena ligera variable de línea germinal humana más cercano fue IGLV5-37*01. En la figura 3 se proporciona un alineamiento de secuencias de aminoácidos de A02.1VL e IGLV5-37*01. Este alineamiento ilustra una diferencia de 12 aminoácidos entre estas secuencias.
Se realizaron varias sustituciones de aminoácidos en la cadena ligera variable de X02.1. Estas sustituciones se muestran en la figura 3. Se realizó coexpresión de estas regiones variables de cadena ligera con la cadena pesada variable de X02.1 formateada en una región constante de IgG4 que contenía la sustitución S228P en células CHO como se describe en el ejemplo 5.
Se probaron posteriormente anticuerpos purificados a partir de sobrenadantes de células CHO en ensayos de unión basados en citometría de flujo con la línea celular positiva para CD38 ARP-1. La tabla 3 detalla valores de CE50 de la curva de respuesta a dosis obtenida para cada anticuerpo.
Tabla 3
Figure imgf000033_0001
Loa anticuerpos X02.96, X02.99, X02.101, X02.102, X02.103 y X02.104 se unieron intensamente con la línea celular ARP-1 positiva para CD38. X02.105 pudo unirse intensamente con la línea celular H929, positiva para CD38.
El análisis de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena pesada variable de X02.1 y A02.1 identificó aminoácidos que podrían potencialmente experimentar oxidación o isomerización. Estos incluyen un sitio de isomerización potencial en D101 y un sitio de oxidación potencial en M(100C). Para eliminar los posibles sitios de isomerización y oxidación, se realizaron sustituciones de aminoácidos de la siguiente manera: D(101)E (SEQ ID NO: 30), M(100C)L (SEQ ID NO: 29) y la combinación tanto de D(101)E como de M(100C)L (SEQ ID NO: 27) (figura 2). Se prepararon anticuerpos con combinaciones de estas sustituciones de aminoácidos en la cadena pesada variable como se muestra en la tabla 4. Se formatearon regiones variables de cadena pesada de anticuerpos con una región constante de IgG4 que contenía la sustitución S228P y se coexpresaron con la cadena ligera A02.1 en células CHO. Los anticuerpos se purificaron después mediante cromatografía de proteína A y se exploraron para determinar la unión con células ARP-1 mediante citometría de flujo. Los datos de unión obtenidos se muestran en la tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000033_0002
Los anticuerpos X02.76 y X02.77 mantuvieron su fuerte unión con la línea celular ARP-1, lo que indica que las sustituciones de aminoácidos para eliminar los sitios potenciales de oxidación e isomerización en la cadena pesada de X02.1 y A02.1 tuvieron poco impacto en su actividad a CD38. La combinación de estas sustituciones para formar el anticuerpo X02.74 dio como resultado un anticuerpo que no se purificó usando el protocolo del ejemplo 5.
El análisis de aminoácidos de la secuencia de cadena ligera variable de X02.1 y A02.1 identificó aminoácidos que podrían potencialmente experimentar oxidación o desamidación. Estos incluyeron un sitio de desamidación potencial en N69 y un sitio de oxidación potencial en M89. Adicionalmente, se predijo que existía un posible sitio de glucosilación ligado a N dentro de CDR3 de la cadena ligera en la posición N94. La presencia de glucanos ligados a N puede provocar heterogeneidad en proteínas terapéuticas, lo que complica el desarrollo. Para eliminar estos posibles problemas, se sintetizaron las siguientes variantes puntuales: N69A (SEQ ID NO: 39), M89L (SEQ ID NO: 52) y M89I (SEQ ID NO: 51), N94T (SEQ ID NO: 48), N94Q (SEQ ID NO: 38), G95P (SEQ ID NO: 50) y S96A (SEQ ID NO: 45) (véase figura 3). Se generaron anticuerpos mediante coexpresión de las cadenas pesadas y ligeras en células CHO como se detalla en la tabla 5. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de proteína A y se exploraron para determinar la unión con células ARP-1 mediante citometría de flujo. Los datos de unión obtenidos se presentan en la tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000034_0003
X02.94 se unió a la línea celular positiva para CD38 ARP-1, lo que indica que la sustitución M89L tuvo poco impacto en la actividad de unión a CD38. La sustitución N94Q en el anticuerpo X02.80 eliminó el posible motivo de glucosilación ligada a N con una influencia mínima en la actividad de unión a CD38 como se mide mediante citometría de flujo (tabla 5). Otras sustituciones que eliminan este motivo de glucosilación dieron como resultado anticuerpos que no pudieron purificarse fácilmente o anticuerpos que presentaron unión atenuada con la línea celular positiva para CD38 ARP-1. El posible sitio de desamidación en la posición 69 se eliminó mediante sustitución a alanina, aunque este anticuerpo (X02.81) no se purificó fácilmente.
Otros anticuerpos probados que comprendían variantes de cadena pesada variable de X02.1 se enumeran en la tabla 6. Estas regiones variables de cadena pesada se formatearon en una región constante de IgG4 que contenía una sustitución S228P. Estas cadenas pesadas se coexpresaron con la cadena ligera de A02.1 en células CHO. Los anticuerpos se expresaron y los anticuerpos resultantes se probaron en ensayos basados en citometría de flujo para determinar la unión con la célula positiva para CD38 ARP-1. Todas las sustituciones de cadena pesada variables con la excepción de T23K (SEQ ID NO: 21; X02.68) tuvieron una influencia mínima en la unión a la línea celular positiva para CD38 ARP-1 en ensayos basados en citometría de flujo.
Tabla 6
Figure imgf000034_0001
También se produjeron anticuerpos que comprendían otras sustituciones de región variable de cadena ligera en la secuencia de X02.1. Estas cadenas ligeras variantes se combinaron con la cadena pesada de X02.1 formateada en una región constante de IgG4 que contenía la sustitución S228P y se expresaron en células CHO como se describe en el ejemplo 5. En la tabla 7 se proporciona un sumario de las cadenas pesadas y ligeras usadas para producir estas variantes de anticuerpos. Loa anticuerpos X02.83, X02.85, X02.91, X02.82 se unían intensamente con la línea celular positiva para CD38 ARP-1.
Tabla 7
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0001
Se produjeron sustituciones que provocan poco impacto en la actividad de unión a CD38 y la purificación de anticuerpos variantes X02 posteriormente como anticuerpos armados mediante fusión con IFN-alfa2b atenuado A145D. Las sustituciones de cadena ligera de X02.1 se combinaron y las variantes resultantes se coexpresaron con variantes puntuales y combinatorias de la cadena pesada de X02.1 en células HEK293E, como se enumera en la tabla 8. Estos anticuerpos se centraron principalmente en eliminar el posible sitio de desamidación de cadena ligera de X02.1, un sitio de oxidación de CDR3 de la cadena pesada de X02.1 y un posible péptido de unión del MHC de clase II fuerte de la región marco conservada 3 de la cadena pesada de X02.1 predicha a través de análisis por ordenador (Epibase, Lonza, Reino Unido), figura 4.
Tabla 8
Figure imgf000035_0002
(continuación)
Figure imgf000036_0001
Los anticuerpos enumerados en la tabla 8 se analizaron para determinar la expresión de proteínas y la unión con CD38 mediante resonancia de plasmón superficial (RPS). También se realizaron ensayos de potencia usando sobrenadante de cultivo celular tomado de células transfectadas para evaluar la actividad relativa de cada una de estas proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado como se perfila en el ejemplo 5. Los datos obtenidos se proporcionan en la tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000036_0002
De las proteínas probadas, A02.12 se expresó bien y demostró potencia en los ensayos de anexina V, caspasa y proliferación celular. La sustitución de N69T en el anticuerpo A02.47 no afectó los niveles de expresión o la potencia en los ensayos de anexina V o caspasa, lo que sugiere que es posible la eliminación de este sitio de desamidación. La sustitución N69T podría incorporarse en otras construcciones en el presente documento para eliminar este posible sitio de desamidación con pérdidas mínimas en la actividad funcional del anticuerpo resultante.
Ejemplo de referencia 2
Análisis de inmunogenicidad por ordenador de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de A02.1
Se identificaron posibles epítopos inmunogénicos en la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de A02.1 usando el software de análisis Epibase (Lonza, Reino Unido). Para eliminar los posibles epítopos inmunogénicos, se introdujeron sustituciones en la cadena ligera variable de A02.1 (figura 4). Las cadenas ligeras con menor inmunogenicidad predicha se coexpresaron en células HEK293E con la región variable de cadena pesada A02.12 (SEQ ID NO: 34) formateada en una región constante de IgG4 que contiene la sustitución S228P fusionada con IFN atenuado con A145D. Las variantes de anticuerpos producidas se detallan en la tabla 10.
Tabla 10
Figure imgf000037_0001
Los anticuerpos anteriores se analizaron para determinar la expresión de proteínas, unión con CD38 a través de RPS y potencia usando la exploración de sobrenadante de cultivo celular como se describe en el ejemplo 5. Los resultados de estos ensayos se detallan en la tabla 11. Estos datos indican que la sustitución de algunos restos para reducir la inmunogenicidad prevista del anticuerpo da como resultado proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado que expresan y tienen potencia funcional en los ensayos de anexina V, caspasa y proliferación celular.
Tabla 11
Figure imgf000037_0002
(continuación)
Figure imgf000038_0002
Ejemplo de referencia 3
Múltiples sustituciones de aminoácidos producen variantes optimizadas de A02.1
Al combinar sustituciones que mejoran la inmunogenicidad, la capacidad de fabricación o la potencia de los anticuerpos anti-CD38 descritos anteriormente en una sola construcción génica, se obtuvieron anticuerpos anti-CD38 muy optimizados y proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado. La tabla 12 resume dichas sustituciones combinatorias y detalla combinaciones de cadenas pesadas y ligeras coexpresadas en células HEK293E y posteriormente probadas.
Tabla 12
Figure imgf000038_0001
(continuación)
Figure imgf000039_0002
Cada anticuerpo descrito en la tabla 12 se analizó para determinar la expresión de proteínas, unión con CD38 a través de RPS y potencia usando sobrenadante de cultivo celular. Los datos resultantes se proporcionan en la tabla 13. Estos resultados demuestran que la combinación de sustituciones que se ha predicho que son beneficiosas por ordenador dio lugar a algunas proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado que expresaron y tuvieron potencia funcional en los ensayos de anexina V, caspasa y proliferación celular.
Tabla 13
Figure imgf000039_0001
(continuación)
Figure imgf000040_0001
Ejemplo de referencia 4
Emparejamiento de diferentes anticuerpos anti-CD38 de cadena pesada y ligera
Para determinar si se pueden obtener proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado funcionales, las cadenas pesada (SEQ ID NO: 110) y ligera (SEQ ID NO: 112) del anticuerpo IgG4 X910/12-HC-L0-IFN-alfa (A145D) descrito en el documento PCT/AU2012/001323 y las cadenas pesada (s Eq ID NO: 111) y ligera (SEQ ID NO: 113) del anticuerpo IgG4 X913/15-HC-L0-IFN-alfa (A145D) descrito en el documento PCT/a U2012/001323, se combinaron entre sí en diversas combinaciones y con cadenas pesadas y ligeras descritas en los ejemplos anteriores. En la tabla 14 se proporciona un resumen de los emparejamientos de cadena pesada y ligera.
Tabla 14
Figure imgf000040_0003
Cada anticuerpo producido se analizó para determinar la expresión de proteínas, unión con CD38 a través de RPS y potencia usando los ensayos de potencia de sobrenadante de cultivo celular. Los resultados de estos ensayos se presentan en la tabla 15a. Estos datos muestran que el emparejamiento de diferentes cadenas pesadas y ligeras de distintos anticuerpos dio lugar a algunas proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado que expresaron y tuvieron potencia funcional en la anexina V, Ensayos de caspasa y proliferación celular.
Tabla 15a
Figure imgf000040_0002
(continuación)
Figure imgf000041_0002
Una selección de las proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado anteriores se purificó y analizó para determinar la unión con células positivas para CD38 en ensayos basados en células. Además, se repitieron ensayos de potencia para dar una determinación más precisa de la actividad relativa de cada proteína de fusión de anti-CD38-IFN atenuado. Los resultados de estos ensayos se proporcionan en la tabla 15b.
Tabla 15b
Figure imgf000041_0001
(continuación)
Figure imgf000042_0001
La figura 5 enumera la cadena pesada variable de consenso y la figura 6 enumera la cadena ligera variable de consenso de construcciones relacionadas con A02.1 con actividad funcional. Se podría prever además que podrían realizarse combinaciones de sustituciones tales como las descritas para los anticuerpos anti-CD38 X02.114, X02.115, X02.116, X02.117, X02.118, X02.119 (figura 6), X02.120, X02.121, X02.122, X02.123, X02.124, X02.125, X02.126 o X02.127 (figura 30). Además, los anticuerpos anti-CD38 anteriores también podrían construirse como proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado y probarse para determinar la actividad funcional como se describe en el presente documento.
Modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple H929
La potencia in vivo de A02.1 se ha probado previamente en el modelo de mieloma múltiple NCI-H929 s.c. como se ha descrito en el ejemplo 5. Se mostró que A02.1 tenía potente actividad antitumoral. Los datos se presentan en el documento PCT/AU2012/001323.
El modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple H929 podría usarse para probar la actividad antitumoral de cualquiera de las proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado descritas anteriormente.
Se requiere IFN atenuado para potente activación apoptótica y de caspasa en líneas celulares tumorales
Usando el ensayo de anexina V y el ensayo de caspasa, se demostró que la potente actividad apoptótica y activación de caspasa dependen de las proteínas de fusión de Anti-CD38-IFN atenuado que contienen un iFn atenuado (tabla 16a, figura 18). En el ensayo de anexina V, las proteínas que contienen IFN atenuado (A02.1 y A02.6) tuvieron una actividad 2 veces mayor que las proteínas que no contienen IFN atenuado (X02.1 y X02.6).
Tabla 16a
Figure imgf000042_0002
Ejemplo 1
Métodos generales
Producción de anticuerpos y construcciones de fusión de anticuerpos en células HEK-293E. Se prepararon plásmidos de ADN que codificaban construcciones de proteínas (anticuerpos y construcciones relacionadas con anticuerpo-IFN-alfa2b) usando el equipo maxi de plásmidos HiSpeed (Qiagen, Valencia, CA) y después se transfectaron en células HEK293E (CNRC, Montreal, Canadá), cultivadas en medio sintético F17 complementado con D-(+)-Glucosa al 0,45 % (p/v) (Sigma, Castle Hill, NSW), Geneticina 25 pg/ml (Invitrogen, Carlsbad, CA) y GlutaMAX 1 x (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando un reactivo de transfección disponible en el mercado y medio OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de permitir la expresión durante 6 días en una incubadora a la que se ha proporcionado CO2 al 5 % y agitación a 120 rpm, los medios de cultivo se aislaron y se sometieron a purificación por afinidad usando perlas de agarosa de proteína A Mab Select SuRe™ (GE Healthcare, Pisataway, NJ). Se intercambió el tampón de las construcciones de proteínas purificadas a arginina HCl 0,2 M, ácido cítrico 25 mM, Hidróxido de sodio 71,5 mM a pH 6,0 usando una columna PD Midi-Trap G-25 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) o una columna de desalación HiPrep 26/10 (desalación de HiTrap desalación de HiPrep 26/10). Las construcciones de proteínas purificadas se concentraron después usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon Ultra de 50 kDa (Millipore, Billerica, MA), seguido de determinación de la concentración de proteínas leyendo la absorbancia a 280 nm.
Producción de anticuerpos y construcciones de fusión de anticuerpos en células CHO.
Se prepararon plásmidos de ADN que codificaban construcciones de proteínas (anticuerpos y construcciones relacionadas con anticuerpo-IFN-alfa2b) usando el equipo maxi de plásmidos HiSpeed (Qiagen, Valencia, CA) y después se transfectaron en células CHO (Lonza) cultivadas en medio de expresión de CHO Freestyle™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando un reactivo de transfección disponible en el mercado y medio OptiPro SFM™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de permitir la expresión durante 6 días en una incubadora a la que se ha proporcionado CO2 al 10 % y agitación a 120 rpm, los medios de cultivo se aislaron y se sometieron a purificación por afinidad usando perlas de agarosa de proteína A Mab Select SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se intercambió el tampón de las construcciones de proteínas purificadas a arginina HCl 0,2 M, ácido cítrico 25 mM, Hidróxido de sodio 71,5 mM a pH 6,0 usando una columna PD Midi-Trap G-25 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) o una columna de desalación HiPrep 26/10 (desalación de HiTrap desalación de HiPrep 26/10). Las construcciones de proteínas purificadas se concentraron después usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon Ultra de 50 kDa (Millipore, Billerica, MA), seguido de determinación de la concentración de proteínas leyendo la absorbancia a 280 nm.
Proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado que se unen con CD38 según lo medido por la resonancia de plasmón superficial (RPS). La capacidad de los anticuerpos anti-CD38 y las proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado para unirse con CD38 humano se midió usando sobrenadante celular transfectado no purificado preparado 7:1 con reductor de unión inespecífico (GE Healthcare, Piscataway, NJ). En resumen, usando un Biacore™ 3000 o un T200, se inmovilizó proteína A en la celda de flujo (FC) 1 (FC1) y FC2 (o como alternativa FC3 y FC4) de un chip sensor de uso en investigación CM5 usando acoplamiento de amina, proporcionando aproximadamente 1500 UR. Se usó FC2 (o FC4) como referencia a lo largo de los experimentos. Los experimentos se ejecutaron a 37 °C en tampón HBS-P+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, tensioactivo P200,005 % v/v, pH 7,4). A un caudal de 20 pl/min, ambas celdas de flujo se regeneraron con 10 pl de hidróxido de sodio 50 mM antes de pasar 40 pl de sobrenadante que contiene la proteína sobre FC1 (o FC3) solamente. Se inyectaron 30 pl de CD38 (10 pg/ml en tampón de ejecución) o 30 pl de tampón de ejecución sobre FC1 y FC2 con un tiempo de disociación de 5 minutos. Ambas superficies se regeneraron dos veces con hidróxido de sodio. Los resultados se generaron usando el software BIAevaluation proporcionado con la máquina. Se usó Microsoft Excel para los cálculos. El software BIAevaluation restó automáticamente el sensorgrama de referencia proporcionando una traza de FC2-1 (o FC4-3) para cada muestra. Se realizó una doble referencia para cada anticuerpo probado restando el sensorgrama con una inyección de CD38 del sensorgrama con una inyección de tampón de ejecución en blanco. La captura de proteína A se refiere a las unidades de respuesta medidas a partir de un sensorgrama en un punto temporal fijo de 412,5 s y esto corresponde al nivel de proteína capturada en la superficie de proteína A. La unión con CD38 es las unidades de respuesta medidas a 507,5 s y es una indicación del nivel de CD38 unido con el sensor con proteína capturada. La disociación de CD38 es las unidades de respuesta medidas a 865,5 s y es una indicación del nivel de CD38 unido con la superficie con proteína capturada después de aproximadamente 300 s de fase de disociación. Se usó BIAevalution para ajustar el sensorgrama usando una ecuación de Langmuir 1:1 para generar una constante de asociación en equilibrio (Kd )
HPLC de proteína A.
Los sobrenadantes se analizaron mediante HPLC de proteína A usando una columna POROS A/20 de 2,1x30 mm Id (Applied Biosystems) conectada con un sistema de cromatografía Agilent 1100. La columna se equilibró con PBS a pH 7,4 y la proteína se eluyó con PBS ajustado a pH 2,2. Se generó una curva patrón usando cantidades conocidas de un anticuerpo monoclonal en PBS. Los cromatogramas, a las longitudes de onda de 215 nm o 280 nm, se integraron usando el software del fabricante y el área bajo la curva (ABC) señalada e interpolada frente a la curva patrón generada para estimar la concentración.
Unión por citometría de flujo de anticuerpos y proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado con una línea celular positiva para CD38 humano, ARP-1 y H929.
La línea celular de mieloma múltiple ARP-1 fue un regalo de Dr. Bart Barlogie, director del Instituto de mieloma del Centro médico de la Universidad de Arkansas (Little Rock, AK). Se describe en Hardin J. et al. (1994) Blood. 84: 3063­ 70). La línea celular de mieloma múltiple NCI-H929 (H929) se adquirió de ATCC (CRL-9068, Gazdar, Blood 67: 1542­ 1549, 1986).
Se probó la capacidad de los anticuerpos o las construcciones de anticuerpo-interferón para unirse con las líneas celulares de mieloma positivas para CD38 humano ARP-1 o H929 en ensayos basados en citometría de flujo. Se incubaron células ARP-1 o células H929 (5 x 105, según se valoró por exclusión de azul de tripano) con cada proteína o con un anticuerpo monoclonal IgG4 humano con una construcción de proteína de especificidad irrelevante a diversas concentraciones en 50 pl de tampón de FACS (PBS más suero de ternero fetal al 1 %, FCS, HEPES 0,2 M, EDTA 0,5 M) en placas de 96 pocillos durante 60 minutos en hielo en la oscuridad. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS antes de la incubación durante 30 minutos en 50 pl de tampón FACS que contenía IgG de cabra antihumana (específica de Fc, conjugado con isotiocianato de fluoresceína, FITC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de lavar tres veces con tampón FACS, las células se fijaron con 50 pl de PBS que contenían formaldehído 4 % v/v y se incubaron a 4 °C en la oscuridad durante 16 horas. Las células incubadas en suspensión se diluyeron con 150 pl adicionales de tampón FACS y se analizaron para determinar la unión por citometría de flujo en un FACS Canto II (BD Biosciences, San Diego, CA) usando dispersión directa, dispersión lateral e intensidad de fluorescencia en el canal de FITC. El valor señalado es la intensidad de fluorescencia media (IFM).
Ensayos diana
Ensayo de proliferación de células Daudi: Este ensayo se usó para cuantificar la actividad antiproliferativa de IFN y construcciones de proteína de fusión de anticuerpo-FN en células que presentan CD38. Las células Daudi expresan CD38 como un antígeno asociado a la superficie celular. La viabilidad de las células se midió usando el reactivo CellTiter-Glo®, Cat n.° G7570, de Promega (Madison, Wisconsin). Este es un ensayo basado en la luminiscencia que determina la viabilidad de las células en cultivo en función de la cuantificación de ATP. La intensidad de la señal es proporcional al número de células viables en un pocillo de placa de microtitulación. Los detalles del ensayo son los siguientes: se cultivaron células Daudi (obtenidas de ATCC, Manassas, VA) en un matraz T75 (TPP, Trasadingen, Suiza, cat n.° 90076) a una densidad preferida de entre 0,5 x 105 y 0,8 x 105 células viables/ml en RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, VA, cat n.° 10-040-CV) con suero bovino fetal al 10 % (FBS; Hyclone, Logan, UT cat n.° SH30070.03). Las células se recogieron centrifugando a 400 x g durante cinco minutos, decantando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento celular en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después se contaron las células y se ajustó la densidad a 3,0 x 105 células/ml en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después, se repartieron alícuotas de 50 pl de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa experimental") (TPP, cat n.° 92067). En una placa separada, estéril, de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa de dilución"; Costar, Corning, NY cat n.° 3879), se diluyeron en serie artículos de prueba por duplicado en RPMi 1640 FBS al 10 %. Después, se transfirieron 50 pl/pocillo de la placa de dilución a la placa experimental. La placa experimental se incubó después durante cuatro días a 37 °C con CO2 al 5 %. Una mezcla del tampón de ensayo suministrado por el fabricante y el sustrato de ensayo (en lo sucesivo en el presente documento, "reactivo CellTiter-Glo®", mezclado según las instrucciones del fabricante) se añadió a la placa experimental a 100 pl/pocillo. La placa se agitó durante dos minutos.
Después, se transfirieron 100 pl/pocillo de la placa experimental a una placa opaca blanca de fondo plano de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa de ensayo"; BD Biosciences, Franklin 5 Lakes, Nj cat n.° 35 3296). Después, el contenido de la placa de ensayo se dejó estabilizar en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La placa se leyó en un contador Victor 3V de múltiples marcadores (Perkin Elmer, Waltham, MA, modelo n.° 1420-041) en el canal de luminometría y se midió la luminiscencia. Los resultados se presentan como "unidades relativas de luminiscencia" (URL).
Los datos se analizaron usando Prism 5 (Graphpad, San Diego, CA) usando regresión no lineal y ajuste de curva de tres parámetros para determinar el punto medio de la curva (CE50).
Ensayo de proliferación celular de ARP-1: Este ensayo se usó para cuantificar la actividad antiproliferativa de IFN y construcciones de proteína de fusión de anticuerpo-IFN frente a células positivas para antígeno CD38. Las células ARP-1 expresan c D38 como antígenos asociados a la superficie celular. La viabilidad de las células se midió usando el reactivo CellTiter-Glo®, Cat n.° G7570, de Promega (Madison, Wisconsin). Este es un ensayo basado en la luminiscencia que determina la viabilidad de las células en cultivo mediante cuantificación de ATP. La intensidad de la señal es proporcional al número de células viables en un pocillo de placa de microtitulación.
Los detalles del ensayo son los siguientes: Las células ARP-1 se cultivaron en un matraz T175 (Costar, Corning, NY Lakes, NJ, cat n.° CLS431080) a una densidad preferida de entre 2,0 x 105 y 2,0 x 106 células viables/ml en RPMI 1640 (Life technologies, Mulgrave, VIC, cat n.° 11875-093) con suero bovino fetal al 10 % (FBS; AusGeneX, Molendinar, QLD, Australia cat n.° FBS500S). Las células se recogieron centrifugando a 400 x g durante cinco minutos, decantando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento celular en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después se contaron las células y se ajustó la densidad a 2,0 x 105 células/ml en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después, Se distribuyeron en alícuotas 50 pl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa opaca blanca de fondo plano de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa experimental"; Costar, Corning, NY Lakes, NJ, cat n.° CLS3917). En una placa separada, estéril, de 96 pocilios (en lo sucesivo en el presente documento, "placa de dilución"; Costar, Corning, NY cat n.° 3799), se diluyeron en serie artículos de prueba por duplicado en RPMI 1640 FBS al 10 %. Posteriormente, se transfirieron 50 pl/pocillo de la placa de dilución a la placa experimental. La placa experimental se incubó después durante cuatro días a 37 °C con CO2 al 5 %. Cada placa experimental incluyó la construcción de IFN con anticuerpo parental como control relativo.
Una mezcla del tampón de ensayo suministrado por el fabricante y el sustrato de ensayo (reactivo CellTiter-Glo®, mezclado según las instrucciones del fabricante) se añadió a la placa experimental a 100 pl/pocillo. La placa se agitó durante dos minutos. Después, el contenido de la placa de ensayo se dejó estabilizar en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La placa se leyó en un lector de placas FLUOstar Galaxy (BMG Labtech, Durham, NC) en el canal de luminometría y se midió la luminiscencia. Los datos se analizaron usando Prism 5 (Graphpad, San Diego, CA) usando regresión no lineal y ajuste de curva de tres parámetros para determinar el punto medio de la curva (CE50).
Ensayo de anexina V: Las células H929 se recogieron centrifugando a 400 x g durante cinco minutos, decantando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento celular en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después se contaron las células y se ajustó la densidad a 1,0 x 106 células/ml en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después, se distribuyeron en alícuotas 50 pl de la suspensión celular en cada pocillo de placas transparentes de fondo redondo de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa experimental"; Costar, Corning, NY cat n.° CL3799). En una placa separada, estéril, de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa de dilución"; Costar, Corning, NY cat n.° CL3799), los artículos de prueba se diluyeron a 40 nM por cuadruplicado en RPMI 1640 FBS al 10 %. Posteriormente, se transfirieron 50 pl/pocillo de la placa de dilución a la placa experimental. La placa experimental se incubó después durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Las células se centrifugaron a 400 xg durante 5 minutos, se decantó el sobrenadante y se resuspendieron en 100 pl de tampón HEPES que contenía anexina V-FITC (1/200) y 7-AAD (1/50). Después, las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se analizaron para determinar la tinción de anexina V y 7-AAD mediante citometría de flujo en un FACS Canto II (BD Biosciences, San Diego, CA) usando dispersión directa, dispersión lateral, FITC y canales PerCP-Cy5.5. Las células positivas para anexina V se refieren a células teñidas positivamente por anexina V-FITC después de 24 h de tratamiento con construcciones de anticuerpos a 20 nM y se expresan como factor de cambio en relación con células no tratadas.
Ensayo de caspasa: Las caspasas activadas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 se midieron con el reactivo de ensayo de caspasas homogéneo, fluorimétrico cat n.° 12236869001, de Roche (West Sussex, Reino Unido) después de tratamiento con anticuerpos de prueba. A continuación se muestran los detalles del ensayo.
Se cultivaron células ARP-1, que expresan altos niveles de CD38, en un matraz T175 (Costar, Corning, NY, cat n.° CLS431080) a una densidad preferida de entre 2,0 x 105 y 2,0 x 106 células viables/ml en RPMI 1640 (Life technologies, Mulgrave, VIC, cat n.° 11875-093) con FBS al 10 % (AusGeneX, Molendinar, QLD, Australia cat n.° FBS500S). Las células se recogieron centrifugando a 400 x g durante cinco minutos, decantando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento celular en RPMI 1640 sin rojo fenol (Life Technologies, Mulgrave, VIC, cat n.° 11835-030) FBS al 10 %. Después se contaron las células y se ajustó la densidad a 2,0 x 105 células/ml en RPMI 1640 sin rojo fenol FBS al 10 %. Después, se distribuyeron en alícuotas 50 pl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de fondo transparente de paredes negras de fondo plano de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa experimental"; Costar, Corning, NY cat n.° CLS3603). En una placa separada, estéril, de 96 pocillos (en lo sucesivo en el presente documento, "placa de dilución"; Costar, Corning, NY cat n.° 3799), los artículos de prueba se diluyeron a 40 nM por cuadruplicado en RPMI 1640 sin rojo fenol FBS al 10 %. Posteriormente, se transfirieron 50 pl/pocillo de la placa de dilución a la placa experimental. La placa experimental se incubó después durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. El tampón de ensayo proporcionado por el fabricante se añadió al sustrato suministrado por el fabricante y se mezcló según las instrucciones del fabricante para crear la "solución de sustrato". Después, se añadieron 100 pl de la solución de sustrato a cada pocillo de la placa de ensayo. La placa se agitó durante 2 minutos. La placa se incubó después a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad y finalmente se leyó en el lector de placas FLUOstar Galaxy (BMG Labtech, Durham, NC) con un filtro de excitación de 470-500 nm y un filtro de emisión de 500-560 nm y la fluorescencia medida y presentada como factor de cambio en relación con células no tratadas. El ensayo de caspasa se refiere a la activación de células por caspasa después de 24 h de tratamiento con construcciones de anticuerpos a 20 nM.
Ensayos fuera de diana
Ensayo indicador génico iLite: El ensayo iLite "fuera de diana" (PBL Interferon Source, Piscataway, NJ, Cat n.° 51100) se realizó en gran medida según lo descrito por el fabricante, con la adición de una etapa de bloqueo de IgG humana. El fabricante describe la línea celular iLite como "una línea celular transfectada estable derivada de una línea celular humana promonocítica disponible en el mercado caracterizada por la expresión de antígenos del MHC de clase II, en particular el antígeno linfocítico humano (HLADR), en la superficie celular". La línea celular contiene un gen de luciferasa transfectado de manera estable, cuya expresión es impulsada por un elemento de respuesta a interferón (IRE), que permite cuantificar la actividad de interferón en función de la producción de luminiscencia. El fabricante suministró la placa iLite (en lo sucesivo en el presente documento, placa de ensayo) y el diluyente se retiró del congelador a -80 °C y se dejó equilibrar a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 pl del diluyente por pocillo a la placa de ensayo. El vial de células indicadoras suministradas por el fabricante se retiró del congelador a -80 °C y se descongeló en un baño de agua a 37 °C. Después, se distribuyeron alícuotas de células de 25 j l en cada pocillo de la placa de ensayo. A continuación, se añadieron 12,5 j l de IgG humana 8 mg/ml que se diluyó en RPMI 1640 FBS 1o % (Sigma Chemicals, St. Louis, MO; cat n.° 14506) por cada pocillo. Los contenidos se mezclaron y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. En una "placa de dilución" separada, se diluyeron en serie artículos de prueba por duplicado en RPMI 1640 FBS al 10 %. Después, se transfirieron 12,5 j l de los artículos de prueba desde la placa de dilución a la placa de ensayo. La placa de ensayo se incubó después a 37 °C con CO2 al 5 % durante 17 horas. El tampón de ensayo y el sustrato suministrados por el fabricante se retiraron del congelador a -80 °C y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante dos horas. El tampón de ensayo suministrado por el fabricante se añadió al vial de sustrato suministrado por el fabricante y se mezcló bien según las instrucciones del fabricante para crear la "solución de luminiscencia". Después, se añadieron 100 j l de la solución de luminiscencia a cada pocillo de la placa de ensayo. La placa se agitó durante 2 minutos. Después, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad y finalmente se leyó en un contador Victor 3V de múltiples marcadores en un canal de luminometría y la luminiscencia se midió y se presentó como URL. Los datos se analizaron con Graphpad Prism 5 como se describe para el "ensayo en la diana (Daudi)". Para probar las construcciones de proteína de fusión de anticuerpo anti-CD38-IFN en el ensayo iLite, el diluyente suministrado por el fabricante se complementó con anticuerpo anti-CD38 0,25 mg/ml (el mismo clon de anticuerpo que se prueba como una construcción de proteína de fusión de anticuerpo-IFN, para bloquear cualquier unión de las construcciones de proteína de fusión de anticuerpo anti-CD38-IFN con el CD38 expresado en las células iLite).
Ensayo HEK-Blue™ fuera de diana: El ensayo se usó para cuantificar la capacidad de las construcciones de fusión de anticuerpo-IFN para unirse con el receptor de interferón alfa/p (IFNAR) usando la línea celular HEK-Blue™ IFN-alfa/p (InvivoGen, San Diego, CA). El "ensayo fuera de diana (HB-IFN)" se realizó en gran medida como lo describe el fabricante de la línea celular HEK-Blue™ IFN-alfa/p. Las células HEK-Blue™ IFN-alfa/p están específicamente diseñadas para supervisar la activación de la ruta de JAK-STAT, que es inducida por IFN de tipo I. Las células se generaron introduciendo los genes humanos STAT2 e IRF9 en células HEK293 para obtener una ruta de señalización de IFN de tipo I completamente activa. Las células HEK-Blue™ IFN-alfa/p expresan de manera estable un gen indicador, fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP), bajo el control del promotor de ISG54. ISG54 es un ISG bien conocido activado a través de un mecanismo dependiente de ISRE por iFn de tipo I. Tras la estimulación con IFN-alfa o IPNp, las células HEK-Blue™ IFN-alfa/p activan la ruta de jAk -STAT y después la expresión del gen indicador de SEAP. SEAP se secreta en los medios y se puede cuantificar usando el reactivo colorimétrico QUANTI-Blue™. En resumen, las células HEK-Blue IFN-alfa/p (Invivogen, San Diego CA cat n.° hkb-ifnab) se descongelaron y cultivaron en medios DMEM (Mediatech, Manassas VA, cat n.° 10-013-CV) FBS al 10 % (Hyclone, Logan UT, cat n.° SH30070.03) que habían sido inactivados por calor (HI FBS). Cuando las células alcanzaron 60-80 % de confluencia, se levantaron con Cell Stripper (Mediatech, cat n.° 25-056-CI). Las células se lavaron dos veces en DMEM HI FBS y se contaron. Las células se ajustaron a 3,3 x 105 células viables/ml en DMEM HI FBS y se distribuyeron 150 j l en alícuotas por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (en lo sucesivo en el presente documento, la "placa experimental"). Después, se añadieron 50 j l de IFN-alfa2b o construcción de proteína de fusión, diluida en DMEM HI FBS, por pocillo. La placa se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 16-24 horas. QUANTI-Blue (Invivogen, cat n.° rep-qb1) se preparó según las instrucciones del fabricante. QUANTI-Blue (150 j l) se dividió en alícuotas en cada pocillo de una placa de fondo plano (en lo sucesivo en el presente documento, la "placa de ensayo"). Después, se transfirieron 50 j l de sobrenadante por pocillo de la placa experimental a la placa de ensayo. La placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1-3 horas. La absorbancia de la placa de ensayo a 630 nm se leyó en un contador de múltiples marcadores modelo 1420-41 Victor 3V de Perkin-Elmer. Los datos se analizaron usando Graph Pad Prism.
Modelo de xenoinjerto H929
El efecto de diferentes dosis de las construcciones de proteína de fusión de IFN-alfa atenuado-anti-CD38 A10.38 y A10.0, se comparó con la construcción de proteína de fusión no dirigida a CD38, en el crecimiento tumoral de mieloma. Para estas comparaciones, se usó el modelo de mieloma múltiple NCI-H929 s.c.
La línea celular de mieloma múltiple, NCI-H929 (ATCC CRL-9068, Gazdar, Blood 67: 1542-1549, 1986) se cultiva por vía subcutánea en ratones inmunodeprimidos (SCID).
Se inyectaron por vía subcutánea en el costado de ratones CB.17 SCID de ocho a doce semanas de edad 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel™ al 50 %. Cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó 170-350 mm3, los ratones se agruparon en 4 cohortes de 7 ratones cada una y el tratamiento comenzó en el momento cero (T0). Todos los tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal, (i.p.) dos veces por semana durante 3 semanas (indicado por la barra debajo del gráfico). Todos los compuestos se dosificaron a 100 jg/dosis (aproximadamente 4,5 mg/kg) excepto el grupo de vehículo. El volumen tumoral se midió dos veces por semana mediante medición por calibrador. El punto final fue un volumen tumoral de 2.000 mm3.
El efecto de diferentes dosis de las construcciones de proteína de fusión de IFN-alfa atenuado-anti-CD38 A02.6, A10.0 y A10.38, se comparó con vehículo, en el crecimiento tumoral de mieloma. Para estas comparaciones, se usó el modelo de mieloma múltiple NCI-H929 s.c.
La línea celular de mieloma múltiple, NCI-H929 (ATCC CRL-9068, Gazdar, Blood 67: 1542-1549, 1986) se cultiva por vía subcutánea en ratones inmunodeprimidos (SCID).
Se inyectaron por vía subcutánea en el costado de ratones CB.17 SCID de ocho a doce semanas de edad 1 x 107 células tumorales NCI-H929 en Matrigel al 50 %. Cuando el tamaño promedio del tumor alcanza 90 mm3, los ratones se agruparán en 4 cohortes de 5 ratones cada una y el tratamiento comenzará en el momento cero (T0). Todos los tratamientos se administrarán mediante inyección intraperitoneal, (i.p.) dos veces por semana durante 3 semanas (indicado por la barra debajo del gráfico). Todos los compuestos se dosificarán a 100 pg/dosis (aproximadamente 4,5 mg/kg) excepto el grupo de vehículo. El volumen tumoral se medirá dos veces por semana mediante medición por calibrador.
Ejemplo de referencia 5
Proteína de fusión de anti-CD38-IFN atenuado con región constante alternativa
A02.12 comprende una proteína de fusión de anti-CD38-IFN atenuado en la que la región constante de la proteína es IgG4 HC-L0-IFN-alfa (A145D) (SEQ ID NO: 9). La región variable de cadena pesada de este anticuerpo se volvió a formatear en una región constante de IgG1 fusionada con IFN-alfa2b atenuado A145D (SEQ ID NO: 10). La coexpresión de esta cadena pesada con la cadena ligera de X02.107 (SEQ ID NO: 65) en células HEK293E produjo el anticuerpo A02.112. La comparación de los anticuerpos A02.12 y A02.112 usando ensayos de unión a CD38 basados en citometría de flujo y ensayos de potencia demuestra que también puede usarse otras regiones constantes de anticuerpos, tales como IgG1 humana, lo que da como resultado proteínas de fusión de anticuerpo-IFN atenuado con potente actividad biológica equivalente a las generadas usando una región constante IgG4 humana (tabla 16b).
Tabla 16b
Figure imgf000047_0001
Ejemplo de referencia 6
Humanización de regiones variables de R5D1, R5E8 y R10A2
Los anticuerpos anti-CD38 procedentes de rata R5D1, R5E8 y R10A2 se describen en el documento PCT/AU2012/001323 y se seleccionaron para humanización. Las regiones variables de estos anticuerpos se sobrehumanizaron como se describe en la publicación de los Estados Unidos n.° 2003/0039649. En resumen, se asignaron estructuras canónicas a cada cadena pesada y ligera de roedores mediante la inspección de sus secuencias de aminoácidos respectivas. A R10A2 se le asignó la estructura canónica 2-1-1/1-2 (Vl/Vh), A R5E8 se le asignó la estructura canónica 4-1-1/1-2 y a R5D1 se le asignó la estructura canónica 2-1-1/1-2. Se usaron secuencias de línea germinal humana de la misma estructura canónica como marcos conservados aceptores para el injerto de CDR donantes. También se diseñaron variantes de los genes de anticuerpos sobrehumanizados resultantes que contienen sustituciones de aminoácidos en posiciones dentro de sus secuencias consideradas probablemente importantes para el mantenimiento de su actividad de unión. Las diferentes regiones variables sobrehumanizadas de cadena pesada se muestran en la figura 7. Las diferentes regiones variables sobrehumanizadas de cadena ligera se muestran en la figura 8.
Las secuencias de región variable de cadena pesada se subclonaron en el vector pEE6.4 que contiene una región constante de IgG4 humana que posee la sustitución S228P fusionada con IFN-alfa2b atenuado A145D (SEQ ID NO: 9). Se subclonaron regiones variables de cadena ligera en el vector pEE12.4 que contiene una región constante kappa humana (SEQ ID NO: 5). Los anticuerpos se produjeron mediante la coexpresión de cadenas pesadas en pEE6.4 y cadenas ligeras en pEE12.4 en células CHO como se ha descrito anteriormente. La tabla 17 resume los emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras usados para producir cada proteína sobrehumanizada basada en 5D1. La tabla 18 detalla los emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras para la proteína sobrehumanizada basada en 5E8 generada, mientras que los emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras usados para generar proteínas sobrehumanizadas basadas en 10A2 se proporcionan en la tabla 19. Se realizó clasificación de una vez por constante de disociación en equilibrio (Kd) de los anticuerpos sobrehumanizados mediante análisis BIAcore™ de los sobrenadantes de transfección de CHO resultantes. El método se usó para determinar si los anticuerpos se expresaban (captura de proteína A) y tenían un nivel de actividad de unión con CD38 humano.
Tabla 17
Figure imgf000048_0001
(continuación)
Figure imgf000049_0001
Tabla 18
Figure imgf000049_0002
(continuación)
Figure imgf000050_0001
Tabla 19
Figure imgf000050_0002
(continuación)
Figure imgf000051_0001
(continuación)
Figure imgf000052_0001
Para cada familia de anticuerpos humanizados - 5D1, 5E8 y 10A2 - varias combinaciones de cadenas pesadas y ligeras humanizadas no lograron expresar proteína ni unirse con CD38 humano. Un número considerable de anticuerpos en las 3 familias de anticuerpos humanizados expresados y unidos con CD38 humano con constantes de disociación en equilibrio en el intervalo nanomolar (nM). A10A2.53 y A10A2.25, que comparten una cadena ligera común, se eligieron para optimización adicional. A10A2.53 se renombró A10.0 y A10A2.25 se renombró A10.38.
Ejemplo 2
Variantes mejoradas de A10.0
El anticuerpo A10.0 se optimizó mediante alteraciones en las secuencias variables de cadena pesada y/o ligera con el objetivo de producir un efecto positivo en la inmunogenicidad biofísica y por ordenador del anticuerpo provocando al mismo tiempo un impacto mínimo en la actividad funcional del anticuerpo.
Análisis de inmunogenicidad por ordenador de cadenas pesadas y ligeras A10.0
Se realizaron análisis de inmunogenicidad por ordenador de las regiones variables de cadena pesada y ligera A10.0 usando el paquete de software Epibase. Se introdujeron varias sustituciones de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de A10.0 para eliminar posibles epítopos inmunogénicos. En la figura 9 se muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las variantes de región variable de cadena pesada producidas alineadas con la cadena pesada humanizada (SEQ ID NO: 156). En la figura 10 se muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las variantes de región variable de cadena ligera alineadas con la cadena ligera humanizada (SEQ ID NO: 161). Los detalles de las variantes de cadenas pesada y ligera coexpresadas en células HEK293E para producir proteínas se resumen en la tabla 20.
Tabla 20
Figure imgf000053_0001
Se evaluó el nivel de expresión de proteínas y la unión con CD38 a través de RPS para cada anticuerpo generado usando los emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras descritos en la tabla 20. Asimismo, se realizaron ensayos de potencia usando sobrenadantes de cultivo celular para evaluar la actividad funcional relativa de cada una de estas proteínas de fusión de anticuerpo anti-CD38-IFN atenuado, tabla 21.
Tabla 21
Figure imgf000053_0002
(continuación)
Figure imgf000054_0001
Los análisis de las secuencias de aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada y ligera de A10.0 identificaron varios posibles sitios de desamidación y un posible sitio de oxidación. Se preparó la sustitución de cadena pesada variable N98Q para eliminar un sitio de desamidación de CDR3 de la cadena pesada, SEQ ID NO: 197. Se generó una variante adicional de la cadena ligera variable A10.0 que contenía la sustitución de CDR2 N53Q (SEQ ID NO: 198) para eliminar este supuesto sitio de desamidación. M89 dentro de CDR3 de la cadena ligera también se alteró mediante sustituciones de aminoácidos en esta posición con los objetivos combinados de eliminar este posible sitio de oxidación y reducir la inmunogenicidad predicha de esta región de la cadena ligera. Estas sustituciones se resumen en la tabla 22, junto con los emparejamientos de cadenas pesada y ligera coexpresados para producir cada proteína de fusión de anti-CD38-IFN atenuado.
Tabla 22
Figure imgf000054_0002
Se evaluó el nivel de expresión de proteínas y la unión con CD38 a través de RPS para cada anticuerpo generado usando los emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras descritos en la tabla 22. Asimismo, se realizaron ensayos de potencia usando sobrenadantes de cultivo celular para evaluar la actividad funcional relativa de cada una de estas proteínas de fusión de anticuerpo anti-CD38-IFN atenuado, mostrados en la tabla 23.
Tabla 23
Figure imgf000055_0001
Ejemplo 3
Generación de variantes mejoradas de A10.38
A10.0 y A10.38 que comparten una cadena ligera común. Las secuencias de cadena ligera optimizadas de A10.0 se emparejaron con la cadena pesada del anticuerpo A10.38 con el objetivo de producir un efecto positivo en las propiedades de inmunogenicidad biofísica y por ordenador teniendo al mismo tiempo un impacto mínimo en la actividad funcional. Se describe un resumen de los cambios y los emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras en la tabla 24.
Tabla 24
Figure imgf000055_0002
Cada uno de los anticuerpos anteriores se evaluó para determinar el nivel de expresión de proteínas y la unión con CD38 a través de RPS. Se realizaron ensayos de potencia usando sobrenadantes de cultivo celular para evaluar la actividad funcional relativa de cada una de estas proteínas de fusión de anticuerpo anti-CD38-IFN atenuado, tabla 25.
Tabla 25
Figure imgf000056_0002
Se requiere IFN atenuado para potente activación apoptótica y de caspasa en líneas celulares tumorales
La potencia relativa de los anticuerpos anti-CD38 A10.0 (fusión de IFN atenuado) y X10.0 (sin fusión) se comparó usando los ensayos de anexina V, caspasa y proliferación celular descritos en el ejemplo 5. También se comparó la potencia relativa de A10.38 y X10.38, tabla 26.
Tabla 26
Figure imgf000056_0001
Estos datos demuestran que la potente actividad apoptótica presentada por los anticuerpos A10.0 y A10.38 en relación con X10.0 y X10.38, respectivamente, requiere la presencia de la fusión de IFN atenuado. No se observó actividad antiproliferativa con anticuerpos sin un IFN atenuado.
En la figura 11 se muestra una alineación de secuencias consenso de regiones variables de cadena pesada de proteínas con actividad funcional. En la figura 12 se muestra una alineación de secuencias consenso de regiones variables de cadena ligera de proteínas con actividad funcional. Se podría prever además que podrían realizarse combinaciones de sustituciones tales como las descritas para los anticuerpos anti-CD38 X10.60, X10.61, X10.62, X10.63, X10.64, X10.65, X10.66, X10.67, X10.68, X10.69, X10.70, X10.71, X10.72, X10.73, X10.74, X10.75, X10.76, X10.77, X10.78, X10.79, X10.80, X10.81, X10.82, X10.83, X10.84, X10.85, X10.86, X10.87, X10.88, X10.89, X10.90, 10.115,
10.127,
Figure imgf000057_0001
10.139, X10.140, X10.141, X10.142, X10.143, X10.144, X10.145, X10.146, X10.147 (figura 11, figura 12). Además, los anticuerpos anti-CD38 anteriores también podrían construirse como proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado y probarse para determinar la actividad funcional como se describe en el presente documento.
Modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple H929
La potencia in vivo de las variantes de 10A2 A10.0 y A10A2.0 se evaluó en un modelo de mieloma múltiple de ratón NCI-H929 s.c., figura 27. Se mostró que ambos tenían potente actividad antitumoral en este modelo. Dicho modelo podría usarse para probar la actividad antitumoral de otras construcciones de proteínas descritas en este documento.
Actividad fuera de diana para las variantes de 10A2
La actividad fuera de diana de las variantes de 10A2 A10.0, A10.38, A10A2.37 y A10A2.39 en comparación con el anticuerpo quimérico A10A2.0 original fusionado con interferón 145D de tipo silvestre y atenuado se evaluó en el ensayo de gen indicador iLite y/o el ensayo HEK Blue y se muestra en la figura 28 y la figura 29. Los valores de CE50 se proporcionan en la figura 28 y la figura 29. La actividad fuera de diana confirma la atenuación del interferón y la necesidad de que el anticuerpo se dirija a CD38 para restaurar la función.
Datos de potencia in vitro adicionales para A10.0 y construcciones relacionadas
Una selección de las proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado anteriores se purificó y analizó para determinar la unión con células positivas para CD38 en ensayos basados en células. Además, se repitieron ensayos de potencia para determinar de manera más precisa la actividad relativa de cada una de estas proteínas de fusión de anti-CD38-IFN atenuado. Los métodos para estos diversos ensayos se describen en el ejemplo 1. Los resultados de cada uno de estos ensayos se proporcionan en la tabla 27.
Tabla 27
Figure imgf000057_0002
(continuación)
Figure imgf000058_0001
Proteína de fusión de anti-CD38-IFN atenuado con región constante alternativa
A10.0 comprende una proteína de fusión de anti-CD38-IFN atenuado en la que la región constante de la proteína es IgG4 HC-LO-IFN-alfa (A145D) (SEQ ID NO: 9). Usando síntesis génica, la región constante de esta proteína se reemplazó con IgG1 HC-L0-IFN-alfa (A145D) (s Eq ID NO: 10), se emparejó con cadena ligera de A10.0 (Se Q ID NO: 161) y se le dio la designación A10.59. La proteína se expresó y se descubrió que era potente en ensayos funcionales (tabla 28). Aunque la mayoría de las proteínas probadas en los ejemplos anteriores se construyeron en la región constante de IgG4 humana, estos datos demuestran que también se pueden usar otras regiones constantes de anticuerpos, tales como IgG1 humana, teniendo la construcción de fusión de anticuerpo-IFN atenuado resultante actividad biológica potente equivalente a construcciones que utilizan una región constante de IgG4 humana.
Tabla 28
Figure imgf000058_0002
La tabla 29 enumera el emparejamiento de cadena pesada variable, cadena ligera variable y región constante para cada anticuerpo descrito en el presente documento. La tabla 30 enumera las secuencias usadas en la divulgación. AA se refiere a aminoácido (tipo de secuencia) y ADN se refiere a polinucleótido (tipo de secuencia).
Tabla 29
Figure imgf000059_0001
(continuación)
Figure imgf000060_0001
(continuación)
Figure imgf000061_0001
(continuación)
Figure imgf000062_0001
(continuación)
Figure imgf000063_0001
(continuación)
Figure imgf000064_0001
(continuación)
Figure imgf000065_0001
(continuación)
Figure imgf000066_0001
(continuación)
Figure imgf000067_0001
(continuación)
Figure imgf000068_0001
Tabla 30
Figure imgf000068_0002
(continuación)
Figure imgf000069_0001
(continuación)
Figure imgf000070_0001
(continuación)
Figure imgf000071_0001
(continuación)
Figure imgf000072_0001
(continuación)
Figure imgf000073_0001
(continuación)
Figure imgf000074_0001
(continuación)
Figure imgf000075_0001
(continuación)
Figure imgf000076_0001
(continuación)
Figure imgf000077_0001
(continuación)
Figure imgf000078_0001
(continuación)
Figure imgf000079_0001
(continuación)
Figure imgf000080_0001
(continuación)
Figure imgf000081_0001
(continuación)
Figure imgf000082_0001
(continuación)
Figure imgf000083_0001
La divulgación no se limita a las realizaciones descritas e ilustradas anteriormente, sino que es susceptible de variaciones y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une específicamente con CD38, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 185.
2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 humana.
3. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG4 humana.
4. El anticuerpo según la reivindicación 3, en donde la región constante de cadena pesada de IgG4 humana comprende una prolina en la posición 228 según el sistema de numeración EU.
5. El anticuerpo según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la región constante de cadena pesada de IgG4 humana comprende una tirosina en la posición 252, una treonina en la posición 254 y un ácido glutámico en la posición 256 de la región constante según el sistema de numeración EU.
6. Una construcción de fusión de anticuerpo anti-CD38-interferón alfa-2b, que comprende:
un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
un interferón alfa-2b que comprende una sustitución de alanina a ácido aspártico o de alanina a glicina en la posición correspondiente a la posición 168 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 7.
7. La construcción según la reivindicación 6, en donde el interferón alfa-2b es un interferón alfa-2b truncado en el extremo N, opcionalmente en donde el interferón alfa-2b truncado en el extremo N no tiene los veintitrés aminoácidos N-terminales.
8. La construcción según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el interferón alfa-2b comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 649.
9. La construcción según la reivindicación 6 o 7, en donde el interferón alfa-2b comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 651.
10. La construcción según la reivindicación 6, en donde el interferón alfa-2b comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 647 o la SEQ ID NO: 650.
11. Una composición, que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o la composición según la reivindicación 11 para su uso en medicina.
13. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o la composición según la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de linfoma de linfocitos B, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica o leucemia mielógena aguda.
ES13721243T 2013-04-29 2013-04-29 Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado Active ES2774976T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2013/038659 WO2014178820A1 (en) 2013-04-29 2013-04-29 Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2774976T3 true ES2774976T3 (es) 2020-07-23

Family

ID=48325957

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13721243T Active ES2774976T3 (es) 2013-04-29 2013-04-29 Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
ES19213030T Active ES2938708T3 (es) 2013-04-29 2013-04-29 Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19213030T Active ES2938708T3 (es) 2013-04-29 2013-04-29 Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado

Country Status (22)

Country Link
US (1) US9963515B2 (es)
EP (2) EP2992013B1 (es)
JP (1) JP6286532B2 (es)
KR (1) KR102094022B1 (es)
CN (2) CN110526971B (es)
AU (2) AU2013388126B2 (es)
BR (1) BR112015027313A2 (es)
CA (1) CA2909952C (es)
DK (1) DK3677591T5 (es)
EA (1) EA033115B1 (es)
ES (2) ES2774976T3 (es)
FI (1) FI3677591T3 (es)
IL (1) IL242296B (es)
MX (1) MX370377B (es)
NZ (1) NZ713641A (es)
PH (1) PH12015502439B1 (es)
PL (2) PL2992013T3 (es)
PT (2) PT3677591T (es)
SG (1) SG11201508923VA (es)
UA (1) UA113129C2 (es)
WO (1) WO2014178820A1 (es)
ZA (1) ZA201507789B (es)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
CA2866126A1 (en) 2012-03-03 2013-09-12 Immungene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
ES2658953T3 (es) 2012-09-25 2018-03-13 Morphosys Ag Combinaciones y usos de los mismos
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
CA2909952C (en) 2013-04-29 2021-10-12 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US9603927B2 (en) * 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
PE20170676A1 (es) 2014-09-09 2017-05-22 Janssen Biotech Inc Terapias de combinacion con anticuerpos anti-cd38
UA125637C2 (uk) 2014-10-29 2022-05-11 Тева Фармасьютікалз Острейліа Пті Лтд ЗЛИТИЙ ПОЛІПЕПТИД ІНТЕРФЕРОНУ <font face="Symbol">a2</font>b
EA202092609A1 (ru) 2014-12-04 2021-10-29 Янссен Байотек, Инк. Антитела к cd38 для лечения острого миелолейкоза
CA2986594C (en) 2015-05-20 2025-06-10 Tufts Medical Center, Inc. Anti-CD38 antibodies for the treatment of light chain amyloidosis and other CD38-positive hematological malignancies
CN107708734B (zh) 2015-06-22 2022-01-11 詹森生物科技公司 用抗cd38抗体和生存素抑制剂联合治疗血红素恶性肿瘤
HRP20240338T1 (hr) 2015-06-24 2024-05-24 Janssen Biotech, Inc. Imunomodulacija i liječenje solidnih tumora s protutijelima koja se specifično vežu na cd38
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
US20180155411A1 (en) * 2015-07-08 2018-06-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Heterotypic antibodies specific for human rotavirus
HUE053366T2 (hu) 2015-11-03 2021-06-28 Janssen Biotech Inc Szubkután anti-CD38-ellenanyag-készítmények és alkalmazásuk
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
CN108699161B (zh) 2016-03-04 2022-06-03 莫佛塞斯公司 多发性骨髓瘤中m-蛋白应答的临床评估
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
US11618784B2 (en) 2016-07-19 2023-04-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD47 combination therapy
WO2018014068A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Attenuated type i ifn cd47 combination therapy
EP3487506A1 (en) 2016-07-20 2019-05-29 Hybrigenics SA Combinations of inecalcitol with an anti-cd38 agent and their uses for treating cancer
US10688412B2 (en) * 2016-07-25 2020-06-23 Cehpalon, Inc. Affinity chromatography wash buffer
EP4509143A3 (en) * 2017-06-20 2025-04-23 Sorrento Therapeutics, Inc. Cd38 antibody drug conjugate
WO2018237159A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Cephalon, Inc. Cation exchange chromatography wash buffer
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CN111565751A (zh) 2017-10-31 2020-08-21 詹森生物科技公司 治疗高危多发性骨髓瘤的方法
JP6648171B2 (ja) * 2018-02-02 2020-02-14 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
BR112021007227A2 (pt) 2018-10-17 2021-08-10 Janssen Biotech, Inc. método para fornecer administração subcutânea de anticorpos anti-cd38
IL317328A (en) 2018-12-14 2025-01-01 Morphosys Ag Antibody formulations
AU2020211407A1 (en) * 2019-01-23 2021-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD38 antibodies
PH12021552002A1 (en) 2019-02-20 2022-09-19 Denali Therapeutics Inc Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
KR20220131246A (ko) 2020-01-13 2022-09-27 데날리 테라퓨틱스 인크. 항-trem2 항체 및 이의 사용 방법
MX2022010034A (es) * 2020-02-16 2022-12-13 Aulos Bioscience Inc Anticuerpos anti-il-2 diseñados.
US20220275090A1 (en) 2021-02-22 2022-09-01 Janssen Biotech, Inc. Combination Therapies with Anti-CD38 Antibodies and PARP or Adenosine Receptor Inhibitors
CA3228311A1 (en) * 2021-08-12 2023-02-16 Ke HE Bispecific recombinant protein and use thereof
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
EP4472740A1 (en) 2022-01-31 2024-12-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd38 as a biomarker and biotarget in t-cell lymphomas
CN119584982A (zh) * 2022-05-18 2025-03-07 武田药品工业株式会社 抗cd38融合蛋白制剂
TW202423968A (zh) * 2022-09-29 2024-06-16 日商武田藥品工業股份有限公司 Ｃｄ３８結合融合蛋白組合療法

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
US4908431A (en) 1986-01-22 1990-03-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies to human kininogen and methods of preparing same
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5846534A (en) 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5976531A (en) 1990-04-19 1999-11-02 The Dow Chemical Company Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
SK281143B6 (sk) 1991-03-06 2000-12-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung Chimérická monoklonálna protilátka, expresné vektory a farmaceutický prostriedok
ES2134212T3 (es) 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US6042828A (en) 1992-09-07 2000-03-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Humanized antibodies to ganglioside GM2
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
ES2191702T3 (es) 1994-03-17 2003-09-16 Merck Patent Gmbh Fv monocatenarios anti-egfr y anticuerpos anti-egfr.
ES2167391T3 (es) 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
US20020164788A1 (en) * 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
DE69638269D1 (de) 1995-06-14 2010-11-18 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
WO1997042329A1 (en) 1996-05-04 1997-11-13 Zeneca Limited Monoclonal antibody to cea, conjugates comprising said antibody, and their therapeutic use in an adept system
US6417337B1 (en) 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
CN1269805A (zh) 1997-07-14 2000-10-11 博尔德生物技术公司 生长激素和相关蛋白的衍生物
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CN100480266C (zh) 1998-10-16 2009-04-22 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
NZ512185A (en) 1998-12-09 2004-02-27 Dow Chemical Co A method for manufacturing glycoproteins having human- type glycosylation in plant cells
US7223397B1 (en) 1999-01-07 2007-05-29 Research Development Foundation Potentiation of anti-CD38-Immunotoxin cytotoxicity
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
EP1161266A4 (en) 1999-03-12 2007-09-19 Univ Georgetown Matriptase, a serine protease and its applications
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US7521047B2 (en) 2000-05-12 2009-04-21 Gpc Biotech Ag Human polypeptides causing or leading to the killing of cells including lymphoid tumor cells
AU6541801A (en) * 2000-06-22 2002-01-02 Idec Pharma Corp Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
ATE440959T1 (de) 2000-06-28 2009-09-15 Glycofi Inc Verfahren für die herstellung modifizierter glykoproteine
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
JP4336498B2 (ja) 2000-12-12 2009-09-30 メディミューン，エルエルシー 延長した半減期を有する分子ならびにその組成物および用途
PA8535501A1 (es) 2001-01-05 2003-07-28 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
FR2823764B1 (fr) 2001-04-24 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides du gene ifn alpha-17
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
PT1409544E (pt) 2001-07-03 2009-09-16 Genentech Inc Anticorpos de dr4 humanos e suas utilizações
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
JP4562395B2 (ja) 2002-01-09 2010-10-13 メダレックス， インク． Ｃｄ３０に対するヒトモノクローナル抗体
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP4472351B2 (ja) 2002-03-01 2010-06-02 イミューノメディクス、インコーポレイテッド インターナライジング抗ｃｄ７４抗体およびその使用方法
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CA2491017A1 (en) 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7534427B2 (en) * 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
EP1594965A2 (en) 2003-02-18 2005-11-16 MERCK PATENT GmbH Fusion proteins of interferon alpha muteins with improved properties
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
DE10343708A1 (de) 2003-09-18 2005-05-12 Nexpress Solutions Llc Verfahren für das Befestigen von Toner an einem Bedruckstoff und Mikrowelleneinrichtung
WO2005044307A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Methods of therapy for b cell-related cancers
ES2541436T3 (es) * 2004-02-06 2015-07-20 Morphosys Ag Anticuerpos humanos anti-CD38 y usos para ellos
AU2005235811B2 (en) 2004-02-06 2011-11-03 Morphosys Ag Anti-CD38 human antibodies and uses therefor
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US7273608B2 (en) 2004-03-11 2007-09-25 City Of Hope Humanized anti-CEA T84.66 antibody and uses thereof
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
JP5112863B2 (ja) 2004-07-01 2013-01-09 ノヴォ ノルディスク アー／エス ヒト抗−ｋｉｒ抗体
EP1799262A4 (en) 2004-10-15 2009-10-21 Seattle Genetics Inc ANTI-CD70 ANTIBODIES AND ITS USE FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER DISORDERS AND IMMUNE DISORDERS
EP3312196B1 (en) * 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
EP1888647A2 (en) 2005-05-24 2008-02-20 MorphoSys AG Generation and profiling of fully human hucal gold®-derived therapeutic antibodies specific for human cd38
MX2007014889A (es) 2005-05-26 2008-02-19 Schering Corp Fusion de interferon-inmunoglobulina g.
JP5208733B2 (ja) 2005-06-29 2013-06-12 イエダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）変異体
DK1915398T3 (en) 2005-07-18 2016-07-04 Amgen Inc Humane anti-B7RP1 neutraliserende antistoffer
NZ566395A (en) 2005-09-26 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to CD70
PL2860192T3 (pl) * 2005-10-12 2018-03-30 Morphosys Ag Wytwarzanie i profilowanie w pełni ludzkich, uzyskanych z HuCAL GOLD terapeutycznych przeciwciał swoistych wobec ludzkiego CD38
WO2007053718A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Antibodies and immunotoxins that target human glycoprotein nmb
GB0525214D0 (en) 2005-12-12 2006-01-18 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
CN101045156B (zh) 2006-03-29 2012-05-02 刘宏利 特异靶向性药物及其用途
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
CA2660795C (en) * 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
AU2007302448C1 (en) 2006-09-26 2019-02-14 Genmab A/S Combination treatment of CD38-expressing tumors
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US11535673B2 (en) 2007-04-05 2022-12-27 President and Fellows of Harvard CoHege Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
TW200902554A (en) 2007-05-08 2009-01-16 Genentech Inc Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates
EP2152751A1 (en) 2007-05-31 2010-02-17 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
WO2009017823A2 (en) 2007-08-01 2009-02-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
US20090076249A1 (en) 2007-09-19 2009-03-19 Michel De Weers Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
CN101868246A (zh) 2007-09-21 2010-10-20 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
HRP20140604T1 (hr) 2007-12-26 2014-09-12 Biotest Ag Sredstva koja djeluju na cd138 i njihova upotreba
US8187601B2 (en) 2008-07-01 2012-05-29 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) binding proteins
MX2011009704A (es) 2009-03-16 2011-09-28 Cephalon Australia Pty Ltd Anticuerpos humanizados con actividad anti-tumor.
EP2580243B1 (en) * 2010-06-09 2019-10-16 Genmab A/S Antibodies against human cd38
NZ607473A (en) 2010-09-27 2014-11-28 Morphosys Ag Anti-cd38 antibody and lenalidomide or bortezomib for the treatment of multiple myeloma and nhl
CA2824279A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Cephalon Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
WO2013059885A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
AU2013211059B8 (en) 2012-01-20 2017-12-21 Centre Hospitalier Regional Universitaire De Montpellier Targeted mutant alpha-helical bundle cytokines
CA2866126A1 (en) 2012-03-03 2013-09-12 Immungene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
WO2014028502A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
CA2909952C (en) 2013-04-29 2021-10-12 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
UA125637C2 (uk) 2014-10-29 2022-05-11 Тева Фармасьютікалз Острейліа Пті Лтд ЗЛИТИЙ ПОЛІПЕПТИД ІНТЕРФЕРОНУ <font face="Symbol">a2</font>b

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019204016A1 (en) 2019-06-27
AU2019204016B2 (en) 2021-03-25
KR102094022B1 (ko) 2020-03-30
US20160068612A1 (en) 2016-03-10
PT3677591T (pt) 2023-02-17
CN110526971B (zh) 2023-06-30
NZ713641A (en) 2019-08-30
ES2938708T3 (es) 2023-04-14
JP2016522816A (ja) 2016-08-04
PH12015502439A1 (en) 2016-03-28
AU2013388126A1 (en) 2015-11-12
WO2014178820A1 (en) 2014-11-06
SG11201508923VA (en) 2015-11-27
UA113129C2 (xx) 2016-12-12
HK1216650A1 (en) 2016-11-25
DK3677591T5 (da) 2024-08-26
CN105473615B (zh) 2019-05-07
AU2013388126B2 (en) 2019-03-07
MX2015015043A (es) 2016-08-11
IL242296B (en) 2020-06-30
CN110526971A (zh) 2019-12-03
CA2909952C (en) 2021-10-12
PL2992013T3 (pl) 2020-09-07
PH12015502439B1 (en) 2019-01-11
DK3677591T3 (da) 2023-03-20
FI3677591T3 (fi) 2023-04-03
CN105473615A (zh) 2016-04-06
JP6286532B2 (ja) 2018-02-28
EP3677591A1 (en) 2020-07-08
EP2992013A1 (en) 2016-03-09
PL3677591T3 (pl) 2023-06-26
MX370377B (es) 2019-12-11
EA201592076A1 (ru) 2016-07-29
PT2992013T (pt) 2020-03-05
ZA201507789B (en) 2017-01-25
EP2992013B1 (en) 2019-12-04
KR20160002864A (ko) 2016-01-08
US9963515B2 (en) 2018-05-08
CA2909952A1 (en) 2014-11-06
BR112015027313A2 (pt) 2017-09-26
EA033115B1 (ru) 2019-08-30
EP3677591B1 (en) 2022-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2938708T3 (es) Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
ES2860988T3 (es) Anticuerpos anti-TFR y su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos e inflamatorios
ES2936317T3 (es) Anticuerpos contra OX40 y usos de los mismos
ES2784131T3 (es) Polipéptidos de unión beta del receptor PDGF
ES3033729T3 (en) Polypeptide constructs and uses thereof
ES3060430T3 (en) Anti-btn3a antibodies and their use in treating cancer or infectious disorders
WO2020223221A1 (en) Biparatopic fr-alpha antibodies and immunoconjugates
CN114341186A (zh) 双特异性抗LRRC15和CD3ε抗体
JP2019514844A (ja) 抗ｃｄ７３抗体を用いた併用療法
CN115023441A (zh) 与cd38结合的重链抗体
US11117975B2 (en) Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
KR20230110303A (ko) 폴레이트 수용체 알파에 결합하는 중쇄 항체
JP7104153B2 (ja) 癌を治療するための抗プロガストリン抗体と免疫療法の併用療法
JP6648171B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
JP6853392B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
HK40033583B (en) Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
HK40033583A (en) Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
HK1216650B (en) Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
EA043099B1 (ru) АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD38 И СЛИТЫЕ БЕЛКИ С ОСЛАБЛЕННЫМ ИНТЕРФЕРОНОМ АЛЬФА-2b
NZ715807B2 (en) Polypeptide constructs and uses thereof