ES2776198T3 - Uso de leche desnatada como vehículo para una composición que comprende Lactobacillus - Google Patents

Abstract

Uso de leche desnatada como vehículo para Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus, que comprende paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus para la agregación de Helicobacter pylori, donde el Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus es capaz de agregar Helicobacter pylori bajo condiciones fisiológicas.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de leche desnatada como vehículo para una composición que comprende Lactobacillus

[0001] La invención se refiere a una composición alimenticia que comprende Lactobacillus, que es capaz de agregar Helicobacter pylori en condiciones fisiológicas, y un vehículo, en el que el vehículo comprende leche desnatada. La invención también se refiere a métodos para producir tales composiciones alimenticias, a usos de estas y a usos de vehículos.

Antecedentes de la invención

[0002] Helicobacter pylori (H. pylori) es una bacteria de forma helicoidal que coloniza el estómago. Para colonizar el estómago, las bacterias entran en el moco que cubre la capa de células epiteliales del estómago. H. pylori también se encuentra en la superficie interna de las células epiteliales del estómago y ocasionalmente dentro de las células epiteliales. Las células están unidas a la pared del estómago por moléculas específicas, como las adhesinas. En contraste, H. pylori tiene una estabilidad limitada en el lumen ácido y se secreta fácilmente a partir de este. En la mayoría de los individuos, una infección con H. pylori es inofensiva. Sin embargo, pueden desarrollarse infecciones agudas que se asocian con diversas enfermedades, como gastritis o úlceras. El contacto de la capa epitelial con la bacteria se considera un requisito para el desarrollo de tales enfermedades infecciosas.

[0003] Se sabe en la técnica que los Lactobacillus tienen efectos ventajosos contra H. pylori. Los Lactobacillus son un género de bacterias específicas, que son capaces de convertir la lactosa y otros azúcares en ácido láctico.

[0004] En la patente US 5,716,615 se describen composiciones farmacéuticas que comprenden Lactobacillus y otros ingredientes activos. La composición es útil para tratar trastornos del tubo digestivo. En sUS 2005/0186190 A1 se describe una composición dietética o farmacéutica que comprende esfingomielinasa o Lactobacillus, que comprende esfingomielinasa. La composición es útil para el tratamiento de infecciones por H. pylori. En WO2004/087891 A1 se describen cepas específicas de Lactobacillus, que son útiles para preparar composiciones farmacéuticas o dietéticas para el tratamiento de infecciones del tubo digestivo causadas por H. pylori.

[0005] En WO2005/060937 A1 se describen formulaciones de tipo en pastilla que comprenden células viables de Lactobacillus. Las formulaciones son útiles para la administración oral y el tratamiento de infecciones del tubo digestivo causadas por patógenos.

[0006] WO2007/073709 describe nuevas cepas de Lactobacillus y su uso contra las infecciones por H. pylori. A diferencia de las cepas conocidas de Lactobacillus, las nuevas cepas son capaces de agregar H. pylori en condiciones fisiológicas. Los agregados parecen formarse porque las células de Lactobacillus se unen al H. pylori e inducen la formación de agregados mixtos. Los agregados relativamente grandes ya no son capaces de entrar o penetrar en el moco. En consecuencia, las células agregadas ya no son capaces de entrar en contacto con las células epiteliales del estómago e infectarlas. Los agregados no se unen a las paredes internas del tubo digestivo. Se acumulan en el lumen, pasan por el tubo digestivo y se secretan de manera natural. El nivel general de H. pylori se reduce y las reacciones inflamatorias del sistema inmunitario se curan o se previenen. Específicamente, las infecciones causadas por H. pylori, como la gastritis y las úlceras, se tratan o se previenen.

[0007] Estas nuevas cepas descritas en WO2007/073709 tienen un modo de acción diferente y también una eficacia diferente en comparación con las cepas de Lactobacillus previamente conocidas útiles contra H. pylori. Las cepas conocidas en la técnica no pueden formar agregados con H. pylori. En general, las cepas conocidas ejercen un efecto beneficioso contra H. pylori al competir con las células de H. pylori en el estómago y, por lo tanto, reemplazar lentamente las células. La rápida formación y secreción de agregados proporciona un enfoque novedoso en el tratamiento de las infecciones por H. pylori.

[0008] Los ejemplos de WO2007/073709 proporcionan pruebas de que la coagregación ocurre en un ensayo con soluciones bacterianas tamponadas y jugo gástrico artificial. Sin embargo, sería deseable proporcionar el Lactobacillus en una forma que sea más aceptable para el consumidor. La coagregación de dos cepas bacterianas diferentes es un proceso complejo y no se puede suponer que la reacción también sería eficaz en otros entornos.

[0009] Existe una necesidad básica de proporcionar composiciones de Lactobacillus que sean más aceptables para el consumidor pero que no interfieran con la agregación deseada y, por lo tanto, sean eficaces contra H. pylori. Dado que las infecciones por H. pylori están muy extendidas, también es deseable proporcionar medios eficaces para la prevención y el tratamiento que estén disponibles fácilmente y a bajo costo también para un gran número de personas.

Problema subyacente a la invención

[0010] El problema subyacente a la invención es proporcionar nuevas composiciones, métodos y usos que superen los problemas mencionados anteriormente y que sean altamente eficaces en el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con H. pylori.

[0011] Un problema específico subyacente a la invención es proporcionar composiciones alimenticias que sean altamente eficaces contra H. pylori. El nivel de células de H. pylori en el tubo digestivo de un animal, especialmente un ser humano, se reducirá de manera rápida y extensa. Además, el número de células de H. pylori presentes en el estómago y el intestino se mantendrá a un nivel bajo. La composición no tendrá efectos secundarios fisiológicos desventajosos y será farmacológicamente aceptable. Además, el sabor de la composición será agradable para el consumidor, de modo que el consumo regular no esté limitado. La composición se fabricará y se almacenará convenientemente y a costos relativamente bajos. Por lo tanto, será posible un tratamiento simple, barato y eficaz de un gran número de personas.

Divulgación de la invención

[0012] Sorprendentemente, el problema subyacente a la invención se resuelve mediante el uso de leche desnatada como vehículo para Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus, que comprende paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus para la agregación de Helicobacter pylori, donde el Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus es capaz de agregar Helicobacter pylori en condiciones fisiológicas El Lactobacillus puede estar muerto o ser viable. En una forma de realización específica de la invención, el Lactobacillus o una gran parte de este está muerto. Se supone que la capacidad del Lactobacillus para agregar H. pylori está mediada por las paredes celulares del Lactobacillus, y que las paredes celulares o las células muertas agregan de manera eficaz H. pylori. Por lo tanto, en una forma de realización específica, el Lactobacillus es una preparación de Lactobacillus, que comprende o consiste en paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus. Preferiblemente, la preparación de Lactobacillus comprende membranas y/o fragmentos de membrana. Por ejemplo, la preparación de Lactobacillus puede ser una preparación de Lactobacillus secada por pulverización. Tal preparación secada por pulverización comprende células muertas y un vehículo, tal como carbohidratos, tal como dextrina. En consecuencia, se ha descubierto que el Lactobacillus secado por pulverización es altamente eficaz en la composición alimenticia de la invención, y que el vehículo no inhibe la reacción de coagregación. Las células secadas por pulverización son ventajosas, ya que pueden ser manejadas convenientemente por la industria alimentaria y los consumidores al preparar la composición alimentaria. El Lactobacillus secado por pulverización está disponible comercialmente bajo la marca registrada Pylopass de Lonza AG, CH. Alternativamente, las paredes celulares pueden aislarse mediante métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, las paredes celulares se pueden obtener por disrupción y/o lisis celular y posterior centrifugación. En otras formas de realización, al menos el 10 por ciento del total de células de Lactobacillus, preferiblemente más del 50 por ciento o más del 90 por ciento, son células vivas. En otra forma de realización, esencialmente todas las células son viables, es decir, más del 95 por ciento o más del 99 por ciento del total de células de Lactobacillus. La composición alimenticia es, por lo tanto, un probiótico. En una forma de realización preferida, la composición alimenticia es un producto final que está listo para su consumo por parte del consumidor. Por lo tanto, puede ser comprada u obtenida de otra manera por el consumidor. Sin embargo, la composición alimentaria también puede ser un componente básico para la producción de otros alimentos. En una forma de realización preferida de la invención, el Lactobacillus se selecciona de Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis y Lactobacillus pentosus.

[0013] El Lactobacillus es capaz de agregar H. pylori en condiciones fisiológicas. Preferiblemente, el Lactobacillus capaz de agregar H. pylori es una cepa descrita por WO 2007/073709, que se incorpora a la presente expresamente. Como ya se ha descrito anteriormente, este documento describe cepas de Lactobacillus que son capaces de unir y agregar células de Helicobacter pylori en el tubo digestivo en condiciones fisiológicas. Los agregados ya no son capaces de entrar en el moco o atravesarlo y se secretan, evitando así una reacción inflamatoria del sistema inmune. Las cepas de Lactobacillus son, por lo tanto, altamente eficaces contra enfermedades asociadas con H. pylori, como la gastritis o las úlceras.

[0014] Las cepas son utilizables para prevenir y/o tratar una infección con H. pylori. Incluso cuando ya se ha producido una infección, el Lactobacillus previene una mayor infección con las células bacterianas de H. pylori y la infección existente se puede tratar más fácilmente mediante la eliminación de H. pylori, que ya ha pasado por el moco. La eliminación de las células, que ya han causado la infección, está respaldada o mediada por la respuesta inmune natural del individuo. Además, se supone que las cepas de Lactobacillus divulgadas por WO 2007/073709 también son eficaces para inhibir la actividad ureasa de H. pylori. De este modo, las células de H. pylori dentro de los agregados formados pierden su protección contra el ácido gástrico, lo que hace que su eliminación sea aún más efectiva. El término "bajo condiciones fisiológicas" se refiere a las condiciones en las que habita (vive) e1 H. pylori que se va a agregar. Si se debe tratar H. pylori en el tubo digestivo, entonces las condiciones fisiológicas son las presentes en el tubo digestivo, es decir, en presencia de ácido gástrico. Preferiblemente, las "condiciones fisiológicas" corresponden a las condiciones de ensayo con jugo gástrico artificial (JGA; solución nueva 5 g/L de solución de NaCl, pH 4.0, más 3 g/L de pepsina). El pH del jugo gástrico artificial se puede ajustar con un ácido apropiado, como HCl.

[0015] El término "agregado" se refiere a la formación de agregados de bacterias, en los que las células bacterianas se unen o se adhieren entre sí. Tales agregados son visibles bajo el microscopio. Típicamente, los agregados formados durante la agregación tienen un diámetro de aproximadamente 1 a 10 pm, pero pueden ser incluso más grandes en algunos casos. Los agregados comprenden células de Lactobacillus y de H. pylori y, por lo tanto, son coagregados. No se desea la autoagregación de Lactobacillus, porque el Lactobacillus autoagregado ya no está disponible para la coagregación. En los ejemplos de trabajo se describe un ensayo de agregación útil para probar la formación de agregados. Típicamente, se seleccionan condiciones de cultivo que imitan condiciones fisiológicas en el tubo digestivo del animal respectivo, tal como un ser humano. Un ensayo útil similar se describe en WO2007/073709 en los ejemplos 2 y 3 y en las páginas 9 a 12. Preferiblemente, e1 H. pylori se proporciona en jugo gástrico artificial. El Lactobacillus se proporciona en un vehículo, como la leche. Luego, el Lactobacillus presente en el vehículo se diluye con tampón PBS, preferiblemente en una proporción de 1:10. El ensayo también podría llevarse a cabo con una dilución de <1:10 o> 1:10, pero esto es menos preferido. Luego, e1 H. pylori del jugo gástrico artificial se mezcla en una proporción de 1:1 con el Lactobacillus en el vehículo/PBS. También son posibles otras proporciones de mezcla >1:1 o <1:1, pero menos preferidas. Preferiblemente, la cantidad de H. pylori que se coagrega es al menos 10 por ciento, al menos 50 por ciento o al menos 100 por ciento mayor con la composición alimenticia de la invención, en comparación con la cantidad de H. pylori que se autoagrega en la composición alimenticia correspondiente sin el Lactobacillus o la preparación de Lactobacillus capaz de agregar H. pylori.

[0016] El Lactobacillus se selecciona de las cepas de Lactobacillus depositadas como N.° DSM 17648, DSM 17646, DSM 17647, DSM 17649, DSM 17650, DSM 17651, DSM 17652 o DSM 17653 en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg, Brunswick, Alemania). Como se describe en WO 2007/073709, estas cepas están depositadas para su uso público. Las cepas DSM 17646, 17649, 17652 y 17653 son Lactobacillus brevis. DSM 17650 es Lactobacillus pentosus. En una forma de realización preferida de la invención, el Lactobacillus es DSM 17648. Las cepas d Sm 17647, 17648 y 17651 son Lactobacillus fermentum. Según el ejemplo 5 de WO 2007/073709, la determinación taxonómica de las cepas se realizó determinando los patrones de fermentación de carbohidratos de acuerdo con los sistemas API50CH (BioMerieux, Francia). Esta prueba se basa en la fermentación de 49 carbohidratos diferentes y permite la identificación de una cepa como Lactobacillus fermentum con alta certeza. Además, los presentes inventores examinaron la cepa DSM 17648 usando un método basado en ADN 16s. Al utilizar este enfoque, la cepa se clasificó como Lactobacillus reuteri. Más específicamente, la cepa se correlacionó con la cepa de tipo L. reuteri LMG9213T, pero parece ser un clon diferente. Hoy en día, el método basado en el ADN 16s se considera más fiable que los patrones de fermentación de carbohidratos. Sin embargo, la determinación taxonómica precisa de cepas relacionadas del mismo género suele ser difícil.

[0017] En una forma de realización preferida de la invención, la cantidad de Lactobacillus en la composición está entre 104 y 1015, preferiblemente entre 106 y 1013, más preferiblemente entre 108 y 1012 células, más preferiblemente entre 109 y 1011 células. Específicamente, se ha descubierto que una cantidad apropiada de células en una sola dosis diaria es 2x1010. El número total se refiere a la cantidad total de células vivas y muertas. El número de células se puede determinar mediante métodos conocidos, por ejemplo, con un contador de células. La referencia es una única dosis diaria. Sin embargo, la referencia también puede ser una unidad de envasado. Si se usa una preparación de Lactobacillus, entonces la cantidad de paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular usados corresponde a las cantidades de paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de células enteras. En otras palabras, se requieren menos paredes celulares o fragmentos o constituyentes de estas en la composición.

[0018] El término "vehículo" sugiere que el Lactobacillus está distribuido por todo el vehículo. Por lo tanto, el vehículo es el componente principal de la composición alimenticia. Preferiblemente, la cantidad total de Lactobacillus en el vehículo es inferior al 5 por ciento (p/p), más preferiblemente inferior al 2 por ciento (p/p) o inferior al 0,5 por ciento (p/p), en función de la cantidad combinada de vehículo y Lactobacillus. En una forma de realización específica, la composición alimenticia consiste en Lactobacillus y el vehículo. Sin embargo, la composición puede comprender aditivos. Preferiblemente, dichos aditivos también están distribuidos por todo el vehículo.

[0019] Según la invención, el vehículo es leche desnatada. La leche desnatada puede ser una fracción de leche líquida, o puede obtenerse disolviendo leche desnatada en polvo en agua o medio acuoso. La leche desnatada en polvo se obtiene generalmente extrayendo el agua de la leche desnatada. La leche desnatada es una fracción de la leche entera, que se obtiene cuando la grasa (nata) se elimina de la leche entera. La grasa de la leche está presente en la leche entera en forma de glóbulos, que están compuestos principalmente de triacilgliceroles y están rodeados por una membrana que consiste en lípidos complejos tales como fosfolípidos, junto con proteínas. Los lípidos grasos de la leche son 97-98 por ciento de triacilgliceroles, pequeñas cantidades de di- y monoacilgliceroles, ésteres libres de colesterol y colesterol, ácidos grasos libres y fosfolípidos. La leche entera de vaca comprende aproximadamente un 4 por ciento de grasa láctea. La leche desnatada disponible comercialmente todavía puede tener un contenido bajo en grasa de leche de hasta el 0,3 por ciento. Según la invención, el contenido de grasa de la leche desnatada y/o del vehículo es preferiblemente inferior al 0,5 por ciento (p/p), más preferiblemente inferior al 0,3 por ciento (p/p) o inferior al 0,1 por ciento (p/p), de la manera más preferible de alrededor del 0 por ciento (p/p). A lo largo de esta solicitud, todos los valores porcentuales relacionados con partes de composiciones están en porcentaje en peso, a menos que se indique específicamente lo contrario.

[0020] Sorprendentemente, se ha descubierto que la coagregación de H. pylori con Lactobacillus es más eficaz en el vehículo de leche desnatada en comparación con una leche entera. Se ha descubierto que la autoagregación no deseada de Lactobacillus era menos pronunciada en la leche desnatada y que la coagregación general era mejor. Sin limitarse a la teoría, la leche entera puede comprender ingredientes que interfieren con la reacción de coagregación que no están presentes en la leche desnatada.

[0021] En otra forma de realización de la invención, el vehículo es leche semidesnatada. La leche semidesnatada y/o el vehículo pueden comprender entonces entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2,5 por ciento (p/p) de grasa láctea.

[0022] En otra forma de realización de la invención, el vehículo es leche entera (leche sin descremar, leche). La leche entera es la leche que contiene todos sus componentes tal como se reciben de la vaca u otro animal que dé la leche, es decir, es leche de la que no se ha eliminado ningún componente, como la grasa. La leche entera se puede usar sin ningún tratamiento térmico. Sin embargo, la leche entera también se puede usar después de la pasteurización y/u homogeneización. Alternativamente, se puede usar leche entera deshidratada o leche entera en polvo. La leche entera deshidratada o la leche entera en polvo generalmente se obtienen al eliminar el agua de la leche entera pasteurizada y homogeneizada. Aunque la leche entera es menos eficiente que la leche desnatada, una composición alimenticia inventiva con leche entera es capaz de la agregación deseada. Por lo tanto, la leche entera es un vehículo útil y aplicable en la composición alimenticia de la invención. En esta forma de realización, el vehículo puede comprender entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6 por ciento (p/p), preferiblemente entre aproximadamente 3 y 5 por ciento (p/p) de grasa láctea. La leche semidesnatada y la leche entera comprenden leche desnatada como una fracción de la misma. En general, el vehículo puede comprender entre 0 y 6 por ciento (p/p) de grasa láctea. La leche puede ser leche UHT (leche ultrapasteurizada). La leche desnatada, la leche semidesnatada o la leche entera pueden proporcionarse como un polvo, que se redisuelve en la composición. Preferiblemente, la leche es leche de vaca. Sin embargo, la leche también puede ser de otros mamíferos, como las cabras. La leche desnatada puede diluirse, preferiblemente con agua o un tampón. En esta forma de realización, el vehículo puede comprender del 10 al 95 por ciento (p/p), preferiblemente del 20 al 80 por ciento (p/p) de leche desnatada.

[0023] El vehículo no se deriva de la leche mediante un proceso de fermentación. Preferiblemente, el vehículo no ha sido fermentado y/o no comprende un producto lácteo fermentado (leche). Preferiblemente, la composición no comprende un producto lácteo fermentado. A este respecto, el Lactobacillus capaz de agregar H. pylori, que había sido cultivado, no se considera un producto lácteo. Específicamente, el vehículo no comprende yogur y/o suero, o fracciones de estos. Algunos yogures disponibles comercialmente comprenden leche desnatada o leche desnatada en polvo que ha sido fermentada. Tras la fermentación, especialmente por bacterias, la composición química y la estructura cambian significativamente. Por ejemplo, la lactosa se convierte en lactato. Preferiblemente, el contenido de lactato del vehículo no se redujo, en comparación con la leche de la que derivaba. Preferiblemente, la composición de la invención tiene un contenido de lactato entre 2 y 8 por ciento (p/p), más preferiblemente entre 3 y 7 por ciento (p/p) o entre 4 y 6 por ciento (p/p). Sin embargo, el Lactobacillus puede derivarse de un medio de fermentación y la composición puede comprender trazas o pequeñas cantidades de este medio de fermentación. En una forma de realización preferida de la invención, al menos el 50 por ciento, más preferiblemente al menos el 90 por ciento o al menos el 98 por ciento de las células de H. pylori se coagregan al entrar en contacto con la composición inventiva, como se determina en un ensayo de agregación llevado a cabo in vitro, preferiblemente en las condiciones descritas en los ejemplos de trabajo. Preferiblemente, menos del 20 por ciento, menos del 5 por ciento o menos del 2 por ciento de los Lactobacillus se autoagrega en un ensayo de control respectivo sin H. pylori.

[0024] El uso inventivo preferiblemente no se administra con el estómago vacío. El pH del fluido gástrico en un estómago vacío está típicamente en el rango de 1 a 2. El pH del fluido gástrico después de una comida es típicamente de entre 2 a 6. De acuerdo con la invención, se ha descubierto que la coagregación deseada se inhibe a un pH bajo, especialmente por debajo de pH 2,5. A un valor de pH más alto, especialmente de pH 3,0 a 6,0, la coagregación es altamente efectiva. Por lo tanto, el uso es especialmente para la administración cuando el pH del estómago está por encima de 2,5, especialmente pH 3,0 o más, por ejemplo, hasta pH 6 o hasta pH 5, por ejemplo, de pH 25 a 7, o de pH 3 a pH 6. La composición descrita se administra preferiblemente durante una comida y/o después de una comida, preferiblemente en los 30 minutos, 1 hora o 2 horas posteriores a una comida.

[0025] En una forma de realización preferida de la invención, el pH de la composición alimenticia está entre 4 y 10, preferiblemente entre 5 y 8. El pH de la leche fresca es de aproximadamente 6,5. En principio, es ventajoso que el pH de la composición sea relativamente alto, de modo que el consumo aumente el pH del fluido gástrico. Sin embargo, el pH puede elegirse y ajustarse de modo que la composición sea estable durante el almacenamiento. La composición alimenticia de la invención puede consistir en el Lactobacillus, o la preparación de Lactobacillus, y el vehículo. Sin embargo, puede comprender aditivos, por ejemplo, para proporcionar un sabor o funcionalidad deseados.

[0026] En una forma de realización preferida de la invención, la composición comprende al menos un azúcar adicional. Como se usa en el presente documento, el término "azúcar" se refiere a carbohidratos que funcionan como edulcorantes. El azúcar es "adicional", ya que no se introduce en la composición como componente de la leche desnatada. Según la invención, se ha descubierto que la composición alimenticia de la invención es capaz de agregar H. pylori en presencia de azúcar, incluso si se incluyen grandes cantidades de azúcares de aproximadamente el 16 por ciento (p/p). Esto ha sido un hallazgo importante, ya que las composiciones alimenticias edulcoradas basadas en productos lácteos a menudo son más aceptables para el consumidor. También ha sido inesperado, porque un contenido de azúcar de alrededor del 16 por ciento (p/p) altera significativamente el entorno de H. pylori y Lactobacillus.

[0027] El azúcar adicional puede ser un compuesto de bajo peso molecular, como glucosa, lactosa, fructosa, galactosa o sacarosa. El azúcar adicional también puede ser, o comprender, un compuesto polimérico, tal como dextrinas, preferiblemente nutriose. El azúcar adicional también podría agregarse como una mezcla de azúcares, tales como maltodextrinas, preferiblemente Maltodextrina DE19, o jarabe de glucosa. El azúcar adicional se puede agregar como parte de un aditivo que tiene contenido de azúcar, preferiblemente un contenido de azúcar alto, por ejemplo, un aditivo que comprende más del 50 por ciento (p/p), más del 80 por ciento (p/p) o más de 90 porcentaje (p/p) de azúcar. Por ejemplo, se puede agregar miel o un jarabe, como jarabe de maíz, jarabe de arce, jarabe de remolacha azucarera, jarabe de glucosa o jarabe de fructosa, o un concentrado de zumo de frutas.

[0028] En formas de realización altamente preferidas de la invención, el azúcar adicional se selecciona de glucosa, lactosa, fructosa, dextrina y maltodextrina, o se proporciona en forma de miel. Se ha descubierto que estos azúcares o miel no inhiben significativamente la agregación de H. pylori cuando están presentes en la composición alimenticia de la invención en combinación con un vehículo de leche desnatada. En formas de realización preferidas, el azúcar adicional se selecciona de galactosa, sacarosa, nutriose y jarabe de glucosa. Se ha descubierto que estos azúcares inhiben la agregación de H. pylori solo moderadamente cuando están presentes en combinación con un vehículo de leche desnatada. El azúcar adicional se agrega en una cantidad para proporcionar el grado deseado de dulzor. Por ejemplo, se puede agregar hasta un 25 por ciento (p/p) o hasta un 20 por ciento (p/p) de azúcar. La cantidad de azúcar adicional puede ser de 0,1 a 25 por ciento (p/p) o de 0,5 a 20 por ciento (p/p) de la composición alimenticia. Para lograr un dulzor comparable a los productos lácteos comerciales, se puede agregar entre 10 y 20 por ciento (p/p), preferiblemente alrededor de 16 por ciento (p/p) de azúcar adicional. En otra forma de realización, la composición comprende un alcohol de azúcar, tal como sorbitol, isomalt, maltitol, manitol, lactitol y xilitol. Sin embargo, se ha descubierto que la agregación de H. pylori, aunque no se ve completamente inhibida, se reduce en presencia de sorbitol. En otra forma de realización, la composición comprende un edulcorante, que no es un sacárido (azúcar). Los edulcorantes comunes sin azúcar son estevia, aspartamo, sucralosa, neotame, acesulfamo de potasio y sacarina.

[0029] En otra forma de realización, se añaden otros microorganismos o compuestos con actividad contra Helicobacter pylori. Alternativamente o además, se pueden incluir otros microorganismos o compuestos que son beneficiosos para el individuo por otros motivos, como las vitaminas. La composición alimenticia puede comprender otros ingredientes típicos para mejorar el sabor, el aroma, la estabilidad y similares. Dichos ingredientes pueden ser frutas o preparaciones de frutas, aditivos de sabor, conservantes y similares. En formas de realización específicas, la composición alimenticia puede comprender hasta 25 por ciento (p/p), hasta 10 por ciento (p/p) o hasta 5 por ciento (p/p) de aditivos. Preferiblemente, los aditivos están distribuidos por todo el vehículo.

[0030] Al agregar tales aditivos, se debe verificar en un ensayo de agregación que la eficacia del Lactobacillus no disminuya en dicha mezcla. Por lo tanto, se deben seleccionar ingredientes adicionales que no interfieran con el Lactobacillus o inhiban el Lactobacillus. Específicamente, los aditivos no deberían aumentar la autoagregación de Lactobacillus ni disminuir la coagregación con H. pylori.

[0031] El vehículo es preferiblemente un líquido. Por lo tanto, la composición es preferiblemente una bebida. En una forma de realización preferida de la divulgación, la composición alimenticia comprende o consiste en

(A) de 60 a 96 por ciento de leche, preferiblemente leche desnatada,

(B) de 0,01 a 0,5 por ciento de Lactobacillus o preparación de Lactobacillus,

(C) de 0 a 25 por ciento, preferiblemente de 10 a 20 por ciento, de azúcar adicional

(D) de 0 a 20 por ciento de aditivos, en donde el total de componentes (A) a (D) es del 100 por ciento (todos los porcentajes están en porcentaje en peso), en donde la leche, preferiblemente leche desnatada, puede obtenerse disolviendo leche o leche desnatada en polvo en agua o en un medio acuoso.

[0032] En una forma de realización preferida de la invención, el vehículo comprende o consiste en

(a) de 2 a 8 por ciento de proteínas

(b) de 0 a 6 por ciento, preferiblemente de 0 a 0,5 por ciento de grasa de leche

(c) de 2 a 8 por ciento de lactosa

(d) de 0 a 25 por ciento de carbohidratos diferentes de la lactosa

(e) de 0,1 a 2 por ciento de minerales

(f) de 0 a 4 por ciento de otra materia seca y

(g) de 60 a 96 por ciento de agua, en donde el total de componentes (a) a (g) es del 100 por ciento (todos los porcentajes están en porcentaje en peso).

[0033] El objeto de la invención es el uso de leche desnatada como vehículo para Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus, que comprende paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus para la agregación de Helicobacter pylori, donde el Lactobacillus o la preparación de Lactobacillus es capaz de agregar Helicobacter pylori en condiciones fisiológicas.

[0034] El uso de la invención puede ser la administración a animales que padecen infecciones por H. pylori, o que se sospecha que padecen infecciones por H. pylori, o para prevenir tales infecciones. Preferiblemente, el animal es un mamífero, más preferiblemente humano. Los animales también pueden ser no humanos, por ejemplo, una mascota, como un gato o un perro, o un animal doméstico, como ganado vacuno, caballos, cerdos u ovejas.

[0035] Otro objeto de la invención es un método para producir una composición alimenticia capaz de agregar Helicobacter pylori, que comprende los pasos de: a) proporcionar Lactobacillus, o una preparación de Lactobacillus que comprende paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus, que es capaz de agregar Helicobacter pylori en condiciones fisiológicas, b) proporcionar un vehículo, en el que el vehículo comprende leche desnatada, y c) mezclar el Lactobacillus o la preparación de Lactobacillus y el vehículo para obtener la composición alimenticia.

[0036] En este método de producción, antes, durante o después del paso c), se pueden agregar ingredientes adicionales. Preferiblemente, Lactobacillus se cultiva inicialmente en un medio de fermentación apropiado. Las condiciones para el cultivo de Lactobacillus son conocidas en la técnica y, por ejemplo, se describen en WO2007/073709. Preferiblemente, las células se separan del medio de cultivo mediante centrifugación, opcionalmente se lavan y se resuspenden en una solución deseada, por ejemplo agua o tampón. Los pasos de lavado y centrifugación pueden repetirse para evitar la transferencia del medio de fermentación a la composición alimenticia. La capacidad de las células y composiciones para agregar H. pylori puede verificarse rutinariamente en ensayos de agregación durante el proceso de producción. Las células pueden agregarse directamente a la composición alimenticia o preferiblemente deshidratarse en una matriz apropiada antes de agregarse a la composición alimenticia. De esta manera, la actividad de la preparación de Lactobacillus puede estandarizarse.

[0037] También se describe un método para reducir el nivel de Helicobacter pylori en el tubo digestivo de un animal, que comprende administrar al animal una composición alimenticia inventiva. En otras palabras, el método es para agregar H. pylori al tubo digestivo de un animal y/o secretar H. pylori del tubo digestivo de un animal.

[0038] También se describe un medicamento para reducir el nivel de Helicobacter pylori en el tubo digestivo de un animal. El medicamento es cualquier composición como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, el medicamento es una composición alimenticia. La composición del medicamento corresponde a la composición alimenticia descrita anteriormente. Por lo tanto, el medicamento es una composición que comprende Lactobacillus, o una preparación de Lactobacillus que comprende paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus, que es capaz de agregar H. pylori en condiciones fisiológicas, y un vehículo, en la que el vehículo comprende leche desnatada. Preferiblemente, el vehículo es leche desnatada. El medicamento es para tratar y/o prevenir infecciones por H. pylori, especialmente infecciones del tubo digestivo. Preferiblemente, el medicamento se usa para tratar gastritis, úlceras gástricas o cáncer de estómago. Las formas de realización específicas del medicamento son las descritas en las reivindicaciones y las formas de realización específicas anteriores para la composición alimenticia. El medicamento puede comprender ingredientes adicionales típicos para tales medicamentos, tales como otros principios activos.

[0039] La composición alimenticia resuelve los problemas mencionados anteriormente. Sorprendentemente, se ha descubierto que la leche desnatada o un producto lácteo que comprende leche desnatada es aplicable como vehículo para Lactobacillus. No podría esperarse que una coagregación compleja de dos cepas bacterianas fuera eficiente en un vehículo tan complejo. En línea con esto, y como se muestra en los ejemplos, la mayoría de los productos lácteos no son vehículos adecuados para composiciones alimenticias que comprenden Lactobacillus para agregar H. pylori. En vehículos como el yogur o el suero de leche, el Lactobacillus o se autoagrega o no hay coagregación. La invención proporciona una composición y un método simples y eficaces para prevenir y tratar infecciones asociadas o causadas por la colonización por H. pylori del tubo digestivo. El vehículo de la invención está disponible en grandes cantidades, se puede producir y almacenar a bajo costo y es altamente aceptable para los consumidores. Por lo tanto, la composición también se puede proporcionar a un gran número de individuos, que no tienen acceso, o que solo tienen acceso limitado, a la atención médica.

Figuras:

[0040]

La Figura 1 muestra los resultados del ensayo dinámico según el ejemplo 35 en forma gráfica. La fluorescencia global (485/535 nm) determinada durante la reacción de agregación con el vehículo de leche desnatada se muestra dependiente del tiempo de incubación (minutos). El gráfico superior (x) corresponde a la sonda de coagregación con H. pylori y L. reuteri. El gráfico inferior (I) corresponde a la autoagregación del control ciego con H. pylori en ausencia de L. reuteri.

La Figura 2 muestra los resultados del ensayo dinámico según el ejemplo 36 en forma gráfica. La fluorescencia global (485/535 nm) determinada en la reacción de agregación con el vehículo de leche entera se muestra dependiente del tiempo de incubación (minutos). El gráfico superior (x) corresponde a la sonda de coagregación con H. pylori y L. reuteri. El gráfico inferior (•) corresponde a la autoagregación del control ciego con H. pylori en ausencia de L. reuteri.

Ejemplos:

[0041] Todos los valores porcentuales relacionados con las partes de las composiciones se proporcionan en porcentaje en peso, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Cepas y cultivos celulares

[0042] Se preparó un cultivo celular de trabajo (WCC) de H. pylori DSM 21031 cultivando la cepa en medio Brucella suplementado con 5 por ciento de sangre de caballo desfibrinada (Oxoid) a 37 grados centígrados en condiciones microaerófilas. La sangre de caballo se trató previamente mediante congelación a -20 grados centígrados y luego se descongeló para garantizar la lisis de las células sanguíneas, que liberaron sus factores de crecimiento en el medio. Al final de la fase de crecimiento, el cultivo se mezcló con glicerol estéril para lograr una concentración final del 50 por ciento. Este cultivo celular de trabajo se dejó durante 2-3 horas a temperatura ambiente antes de almacenarlo a -80 grados centígrados. Este WCC (500 |_il) se usó para inocular medio Brucella suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento que se incubó a 37 grados centígrados durante 72 h. El cultivo de prueba activo se caracterizaba por bastones móviles de curvados a en espiral. Si el cultivo se caracterizaba por una forma cocoide inmóvil, este cultivo se descartaba, ya que no es adecuado para la prueba de agregación. Después del crecimiento, se preparó una solución de H. pylori con una densidad óptica de 2,0 (A = 600 nm) centrifugando el cultivo a 4500 g durante 5 min. El sobrenadante se desechó y las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,0 (PBS). El sedimento se volvió a suspender cuidadosamente en este tampón y luego se centrifugó nuevamente a 4500 g durante 5 min. Este sobrenadante se desechó y el sedimento se volvió a suspender cuidadosamente en jugo gástrico artificial (JGA; solución nueva de 5 g/L de solución de NaCl, pH 4,0 más 3 g/L de pepsina). Es importante que la solución de jugo gástrico artificial y H. pylori se prepare justo antes de la prueba de agregación.

[0043] Se preparó un cultivo fresco de L. reuteri DSM17648 (clasificado como L. fermentum en WO2007/073709 por patrones de carbohidratos), que es capaz de agregarse con H. pylori (control positivo). Se cultivó un cultivo en medio MRS en tubos cerrados durante la noche a 37 grados centígrados sin agitar. Análogamente a la recolección de H. pylori (descrita anteriormente), las células se centrifugaron, el sedimento se lavó en PBS, se volvió a centrifugar y luego el sedimento se volvió a suspender en PBS en lugar de jugo gástrico artificial para lograr soluciones con una densidad óptica de 4,0 (A = 600 nm).

Ensayos de agregación

[0044] Se utilizó una prueba de agregación en jugo gástrico artificial de acuerdo con WO2007/073709, que se basa en mezclar L. reuteri en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,5) con Helicobacter pylori en jugo gástrico artificial (pH 4,0). En algunos ejemplos, la prueba se modificó alterando el pH del jugo gástrico artificial para determinar el efecto del pH de la solución de L. reuteri en la agregación. En la prueba, se examinaron la autoagregación no deseada y la coagregación deseada, respectivamente. Las muestras se mezclaron cuidadosamente y la agregación se controló después de aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. La coagregación se evalúa tanto macroscópica como microscópicamente (400 aumentos). Los resultados de la agregación se clasificaron como: +++ = muy fuerte; ++ = fuerte; + = alguna; = poca; - = ninguna; nd = no determinada.

Ejemplos comparativos 1 a 7: efecto del pH sobre la agregación sin vehículo

[0045] En los siguientes ejemplos, se llevaron a cabo pruebas de agregación según WO2007/073709 como se ha descrito anteriormente con las cepas preparadas anteriormente. En el ejemplo 7, se aplicó el protocolo de prueba de WO2007/073709. La mezcla resultante tenía un pH de aproximadamente 5,5 y se observó una buena coagregación. En los ejemplos 1 a 6, la prueba se modificó para determinar el efecto del pH de la solución de L. reuteri sobre la agregación. Los experimentos cubrieron un rango de pH de 1,5 a 6,0 del jugo gástrico artificial, lo que refleja las diferencias de pH entre un estómago "hambriento" con un pH bajo y un estómago después de la ingesta de alimentos con un pH alto. También se llevaron a cabo controles negativos. Los resultados no constan en el presente documento, ya que en todos los casos fueron negativos para la coagregación, tal como se esperaba. El tampón se usó para preparar la solución de L. reuteri para la prueba, que se combinó con el jugo gástrico artificial (pH 4) que comprendía H. pylori. Los materiales y resultados se resumen a continuación en la tabla 1 (panel superior). Los resultados muestran que la coagregación no se observa a un pH de 2,5 o inferior, mientras que se observa una buena coagregación entre un pH de 3 a 6.

Ejemplos comparativos 8 a 14: vehículo de suero de leche

[0046] El efecto del suero como vehículo en la prueba de coagregación se probó a un pH de 3 a 6. Los experimentos 8 a 14 se llevaron a cabo junto con los experimentos 1 a 7, que son, por lo tanto, controles válidos. El suero era un producto lácteo disponible comercialmente (marca registrada Yuma, producida por Mercola, CH) y tenía los siguientes contenidos por 100 g de polvo: 12 g de proteína, 74 g de carbohidratos, 1.2 g de grasa, 890 mg de calcio, 180 mg de magnesio, 570 mg fósforo, 2.4 g de potasio, vitaminas. El suero se disolvió al 5 por ciento (p/p) en el tampón apropiado y este vehículo se usó para preparar la solución de L. reuteri para la prueba. El efecto del tampón con suero se probó en la capacidad de coagregación de la cepa de L. reuteri con H. pylori. Los resultados de control negativo no constan en este documento, ya que en todos los casos fueron negativos para la coagregación como se esperaba. Los materiales y resultados se resumen en la tabla 1. Los resultados muestran que la coagregación no se produce a ningún pH. Esto demuestra que el suero, incluso en cantidades relativamente pequeñas, inhibe la coagregación y no es un vehículo apropiado.

Tabla 1: Ejemplos comparativos 1 a 7 (panel superior): autoagregación y coagregación dependientes del pH sin vehículo; ejemplos comparativos 8 a 14 (panel inferior): coagregación y autoagregación dependiente del pH con vehículo de suero.

Ejemplos comparativos 15 a 27: vehículos de yogur y suero de yogur

[0047] Los ensayos de agregación como se ha descrito anteriormente se llevaron a cabo con diferentes yogures disponibles comercialmente como vehículos y L. reuteri suspendidos en tampón PBS. La autoagregación de L. reuteri se observó en los experimentos de control sin H. pylori (datos no mostrados).

[0048] Por lo tanto, se examinó si el suero de yogur solo sería un vehículo apropiado con jugo gástrico artificial (JGA) a un pH que oscila entre 1,5 y 4,0. El suero de yogur se preparó a partir de yogur natural disponible comercialmente (marca registrada "Natural yogur classic", Migros, CH; fabricado a partir de leche desnatada y crema; que comprende 3,6 g de grasa/100 ml, 3,5 g de proteína/100 ml, 5 g de carbohidratos/100 ml, minerales y vitaminas). El suero de yogur (pH 4,08) se preparó centrifugando el yogur natural y usando el suero sin alterar en la prueba. Se llevaron a cabo experimentos de agregación en suero de yogur/PBS y controles en tampón PBS que comprendía L. reuteri. Los resultados se resumen en la tabla 2 a continuación. Los resultados muestran que, a un pH relevante entre 1,5 y 4, existe una tendencia a la autoagregación en el vehículo de suero de yogur que no se observa en la misma medida en el tampón PBS. Por lo tanto, en un vehículo de suero de yogur y con un pH relevante entre 1,5 y 4, L. reuteri parece ser capaz de coagregarse, pero el efecto positivo se ve disminuido al menos parcialmente por la autoagregación.

Tabla 2: Ejemplos comparativos 21 a 26: coagregación y autoagregación con vehículo de yogur con ex erimentos de control 15 a 20 sin suero de o ur.

[0049] Se realizó un ejemplo adicional 27 con suero de yogur de frutas. El suero de yogur de frutas (pH 4,07) se preparó como se ha descrito anteriormente a partir de yogur de fresa (marca registrada Migros Bio). Este yogur se produjo a partir de leche entera, leche desnatada en polvo, fresas (8,8 por ciento) y 10,7 por ciento de azúcar (yogur que comprende 3,4 g de grasa/100 ml, 3,5 g de proteína/100 ml, 16 g de carbohidratos/100 ml). El suero de yogur de frutas se probó en un ensayo de acuerdo con el ejemplo 26. No se observaron ni coagregación ni autoagregación en las condiciones de prueba. El suero de yogur de frutas mostró un efecto diferente en comparación con el suero de yogur natural, inhibiendo completamente la agregación con H. pylori.

Ejemplos 28 a 34: vehículo de leche desnatada y adición de azúcar

[0050] Se examinaron los efectos de la leche desnatada (10 por ciento p/p de solución de leche desnatada en polvo en PBS, o 100 por ciento de leche desnatada, pH 6,5) y cuatro azúcares diferentes (solución al 16 por ciento de glucosa, galactosa, fructosa o lactosa en PBS), solos y en combinación. El ejemplo comparativo 29 es otro control con suero de yogur natural a pH 4,2. Las condiciones y los resultados se resumen en la tabla 3 a continuación. Sorprendentemente, la leche desnatada no induce una autoagregación significativa ni inhibe la coagregación. Los resultados muestran también que los azúcares no afectan a la coagregación y no inducen la autoagregación. Se llevaron a cabo experimentos de control, en los que se añadió suero de yogur natural a cada muestra. Los resultados de las pruebas de coagregación con leche desnatada y diferentes azúcares muestran el mismo grado de agregación que con el control, lo que indica que la leche desnatada, así como los azúcares agregados, no tienen un efecto negativo en la agregación a las concentraciones probadas. Nuevamente, la coagregación también se observa en el suero de yogur natural, pero la autoagregación es relativamente fuerte.

Tabla 3: Ejemplos comparativos 28 a 32: coagregación y autoagregación con diversos azúcares y suero de yogur n r l E m l inv n iv 4: n v hí l l h n .

[0051] Nota: experimento de control 26: L. reuteri PBS, pH 7,5 mezclado con H. pylori jugo gástrico artificial (JGA, pH 4,0); glu = glucosa, gal = galactosa; lac = lactosa; fruct = fructosa En una serie adicional de experimentos, se verificó si la agregación también es eficiente en presencia de leche desnatada en combinación con un azúcar adicional, alcohol de azúcar o un producto natural que comprende azúcar. Los ensayos de agregación se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente en presencia de 10 por ciento de leche desnatada en polvo y 16 por ciento en peso adicional de azúcar, alcohol de azúcar o aditivo que contiene azúcar (miel o zumo de naranja), respectivamente. Se descubrió que la agregación de glucosa de H. pylori en presencia de un vehículo de leche desnatada está al mismo nivel en presencia de lactosa, fructosa, maltodextrina o miel adicionales, en comparación con la composición correspondiente sin azúcar adicional. Por lo tanto, estos aditivos no afectan a la agregación en absoluto. La galactosa, sacarosa, nutriose y el jarabe de glucosa inhiben la agregación de H. pylori moderadamente en presencia de un vehículo de leche desnatada, pero la agregación general sigue siendo eficiente. En presencia de sorbitol y vehículo de leche desnatada, la agregación de H. pylori se reduce, aunque no se inhibe por completo. En presencia de zumo de naranja, el nivel de agregación fue similar al nivel de autoagregación.

Ejemplos 35 y 36: Comparación de leche desnatada y leche entera

[0052] Los siguientes ejemplos se llevaron a cabo para determinar si los efectos ventajosos como vehículo son específicos para la leche desnatada o también para la leche entera. Para una comparación cuantitativa del vehículo de leche desnatada y de leche entera, se usó un ensayo de fluorescencia.

Cepas y cultivos celulares

[0053] Las cepas y los cultivos se prepararon de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente para los ejemplos 1 a 34. Además, el H. pylori se tiñó con un marcador fluorescente como se describe a continuación. Antes de la resuspensión de H. pylori en jugo gástrico artificial, la solución madre de 10 ml de células de H. pylori se tiñó con 50 |_il de una solución para fluorescencia de 1mM 5(6)-CFDA-SE (5-(y-6)-carboxifluoresceína succinimidil éster; Invitrogen, # V12883) recién preparada sobre una base de solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,5). Después de incubar esta mezcla durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad, la suspensión teñida se centrifugó a 4500 g durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó y las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,5 (PBS). Justo antes de la prueba de agregación, el sedimento se volvió a suspender cuidadosamente en 10 ml de jugo gástrico artificial como se ha descrito anteriormente para los ejemplos 1 a 34.

[0054] La suspensión de L. reuteri DSM 17648 se preparó a partir de células secadas por pulverización (Pylopass™, Lonza AG, con dextrina como excipiente de secado por pulverización) mediante el siguiente procedimiento. Se resuspendieron 2 g de células en la matriz (PBS, pH 7,5, leche entera o desnatada). Esta suspensión resuspendida contenía 12 g de dextrina por 100 ml de suspensión debido a la composición de las células de L. reuteri secadas por pulverización. Esta suspensión se preparó 30 minutos antes de su uso en la prueba de coagregación (tiempo de hinchamiento). Para la prueba de coagregación, se preparó una dilución de 1:10 en PBS, pH 7, para minimizar el efecto matriz en el ensayo y simular una dilución típica comparable a las concentraciones presentes en el estómago. De ese modo, se ajustó la misma concentración de células (densidad óptica de 4, a 600 nm, 1 cm) como se ha descrito anteriormente para los ejemplos 1 a 34, donde se ha usado PBS en lugar de matriz de leche.

Ensayos de coagregación

[0055] Los ensayos de agregación y de coagregación se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente para los ejemplos 1 a 34. Además, se determinó la coagregación en ensayos de fluorescencia. La diferencia de los valores de fluorescencia de las muestras que comprenden H. pylori y L. reuteri en comparación con las muestras con H. pylori solo da una indicación de la cantidad de H. pylori que se ha coagregado. La coagregación se determinó en un ensayo estático y un ensayo dinámico. Las muestras respectivas se examinan en placas de 96 pocillos mediante espectroscopia de fluorescencia con los siguientes parámetros:

Modo: Lectura superior de fluorescencia en placas de 96 pocillos con fondo negro Longitud de onda de excitación: 485 nm

Longitud de onda de emisión: 535 nm

Ancho de banda de excitación: 9 nm

Ancho de banda de emisión: 20 nm

[0056] En el ensayo estático, la coagregación se determinó comparando la fluorescencia en los sobrenadantes de las muestras. Los valores de fluorescencia son más bajos en el caso de la coagregación de H. pylori con L. reuteri en comparación con los controles sin L. reuteri, porque hay menos H. pylori en el sobrenadante. La evaluación de los resultados se realizó sobre una base semicuantitativa mediante el cálculo de las diferencias relativas de los valores de fluorescencia y su clasificación con respecto a las intensidades de agregación conocidas: (+++) = muy fuerte, (++) = fuerte, (+) = alguna; (+/-) = poca y (-) = ninguna, (nd) = no determinada.

[0057] En el ensayo dinámico, la coagregación se determinó directamente en una placa de 96 pocillos mediante la medición de la fluorescencia general de las muestras. Si se produce una coagregación, la fluorescencia es mayor en comparación con sondas ciegas con H. pylori solo sin agregación. El efecto se observa porque la sedimentación de los coagregados da como resultado una mayor fluorescencia debido a una menor turbidez de la muestra.

Resultados de los ejemplos 35 y 36

[0058] Se llevó a cabo un ensayo estático como se describe para determinar la coagregación de H. pylori con L. reuteri en leche desnatada y leche entera ultrapasteurizada (UHT) como vehículos. Como control, se determinó la autoagregación de L. reuteri en ausencia de H. pylori. Los resultados se resumen en la tabla 1 a continuación. Se observó una fuerte agregación con ambos vehículos. La sedimentación de los coagregados fue macroscópicamente visible. La leche desnatada no tuvo un efecto significativo sobre la autoagregación de L. reuteri, pero el uso de leche entera coincidió con una fuerte autoagregación de L. reuteri.

Tabla 1: Ejemplos comparativos 35 y 36: Coagregación y autoagregación con leche desnatada en comparación con leche entera UHT

[0059] Se llevaron a cabo ensayos dinámicos como se ha descrito anteriormente con vehículos de leche desnatada y leche entera. Los resultados se muestran en forma de gráfico en las figuras 1 y 2. La fluorescencia global (485/535 nm) determinada en la reacción de agregación con el vehículo de leche desnatada se muestra dependiente del tiempo de incubación en minutos. La Figura 1 muestra los resultados del ejemplo 35. El gráfico superior (x) corresponde a la sonda de coagregación con células de H. pylori y L. reuteri. El gráfico inferior (I) es un control, en el que se observa la autoagregación de H. pylori en ausencia de L. reuteri. La Figura 2 muestra los resultados del ejemplo 36. El gráfico superior (x) muestra los resultados para la sonda de coagregación con células H. pylori y L. reuteri. El gráfico inferior (•) corresponde a la autoagregación en el control ciego con H. pylori en ausencia de L. reuteri. La coagregación fue ligeramente más pronunciada con el vehículo de leche desnatada que con el vehículo de leche entera. La autoagregación del control sin L. reuteri fue más fuerte con leche entera en comparación con la leche desnatada. Sin embargo, en ambos casos la sedimentación de H. pylori se incrementó por la formación de coagregados en presencia de L. reuteri. En general, el ensayo dinámico confirmó los resultados del ensayo estático.

[0060] En otros experimentos, el efecto del vehículo de leche entera UHT se comparó con el vehículo de PBS, pH 7,5, en ensayos de coagregación. Se observó una menor sedimentación de H. pylori en el vehículo de leche entera en comparación con el vehículo de PBS (datos no mostrados). Se supone que la diferencia de los valores de fluorescencia fue provocada por la sedimentación de H. pylori, lo que resulta en una fluorescencia más baja en el sobrenadante

[0061] Se llevaron a cabo experimentos de control adicionales para asegurar que el aditivo dextrina, que está presente en las sondas de L. reuteri secadas por pulverización, no inhiba la reacción de coagregación. En experimentos comparativos directos entre células nuevas de L. reuteri y células secadas por pulverización (marca registrada Pylopass), se observó una agregación comparable (datos no mostrados). Por lo tanto, puede excluirse que la dextrina afecte a los ensayos de coagregación.

[0062] En resumen, los ejemplos 35 y 36 proporcionan pruebas de que el vehículo de leche desnatada tiene un mejor rendimiento general que el vehículo de leche entera con respecto a la agregación específica de H. pylori con L. reuteri en jugo gástrico artificial. Por lo tanto, la leche desnatada es el vehículo preferido para aplicaciones lácteas. Los experimentos también proporcionan pruebas de que la leche entera y la leche desnatada inhiben ligeramente la coagregación de L. reuteri y H. pylori en el jugo gástrico artificial. Se supone que el efecto es el resultado de un ligero aumento de la autoagregación de L. reuteri con componentes en la leche y la leche desnatada.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Uso de leche desnatada como vehículo para Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus, que comprende paredes celulares, fragmentos de pared celular y/o constituyentes de la pared celular de Lactobacillus para la agregación de Helicobacter pylori, donde el Lactobacillus o una preparación de Lactobacillus es capaz de agregar Helicobacter pylori bajo condiciones fisiológicas.