ES2776823T3 - Método de esporulación de una bacteria de Bacillus - Google Patents

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Abstract

Método de producción de esporas de Bacillus que comprende una etapa de cultivar la bacteria de Bacillus usando un medio líquido que tiene una razón C/N (razón en peso del contenido de carbono con respecto al contenido de nitrógeno) de más de 4,0 y menos de 9,5, en el que la bacteria de Bacillus es Bacillus siamensis, Bacillus simplex o Bacillus megaterium y en el que el contenido de potasio en el medio líquido es de menos de 2,0 g/l.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de esporulación de una bacteria de Bacillus
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método de producción de manera eficiente de esporas de Bacillus.
Técnica anterior
Se usan bacterias de Bacillus en diversos campos tales como producción de enzimas y sustancias útiles, producción de alimentos fermentados, descomposición de sustancias orgánicas, pesticidas microbianos y fertilizantes microbianos. En situaciones en las que se usan tales pesticidas microbianos, fertilizantes microbianos y similares, se utilizan comúnmente esporas de bacterias de Bacillus. Sin embargo, incluso las cepas que ejercen un excelente rendimiento para tales aplicaciones han sido difíciles de comercializar sin una capacidad de esporulación eficiente. Algunos medios usados frecuentemente para cultivo líquido de bacterias de Bacillus incluyen caldo nutritivo (DIFCO), caldo de Luria Bertani y caldo con triptona y soja (Beckton Dickinson), pero en estos medios, no se obtuvo suficiente proliferación y apenas se observó formación de esporas en algunos casos.
El documento de patente 1 da a conocer un método para permitir la esporulación llevando a cabo cultivos que incluyen una etapa de reducción de la concentración de oxígeno disuelto después de la proliferación. En determinadas bacterias de Bacillus, sin embargo, es difícil permitir de manera eficiente la esporulación incluso usando la misma técnica. Además, en este método, es necesario ajustar las condiciones de agitación y ventilación en la etapa de cultivo, lo que complica el procedimiento de fabricación.
El documento de patente 2 da a conocer un método para permitir la esporulación continuando el cultivo durante un largo periodo de tiempo después de que la fuente de carbono se haya agotado. Sin embargo, este método no es adecuado para la producción real ya que el coste de cultivo será alto debido al cultivo prolongado. Además, en determinadas bacterias de Bacillus, es difícil permitir la esporulación incluso usando la misma técnica.
El documento de patente 3 da a conocer un método de producción de esporas definiendo el intervalo de la concentración de fosfato en el medio de cultivo y el intervalo del suministro de oxígeno y la tasa de agitación como condiciones de cultivo. En determinadas bacterias de Bacillus, sin embargo, es difícil formar de manera eficiente esporas incluso usando la misma técnica. Además, es necesario usar una instalación de cultivo que pueda lograr las condiciones de cultivo indicadas en la práctica.
Bibliografía de la técnica anterior
Documentos de patentes
Documento de patente 1: solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2007-236286 Documento de patente 2: solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2000-217567 Documento de patente 3: solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2007-195542 Sumario de la invención
Problemas que se van a resolver mediante la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de cultivo que pueda producir de manera eficiente esporas de una bacteria de Bacillus que apenas forma esporas en medio líquido general para bacterias.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores estudiaron intensamente con el fin de resolver los problemas anteriores, y, por consiguiente, ha encontrado composiciones de medio líquido adecuadas para proliferación y esporulación eficiente de bacterias de Bacillus cuya eficiencia de producción de esporas no es suficiente en cultivo usando medios líquidos convencionales para bacterias, completaron así la presente invención.
La presente invención es tal como sigue:
[1] Un método de producción de esporas de Bacillus que comprende una etapa de cultivar la bacteria de Bacillus usando un medio líquido que tiene una razón C/N (razón en peso del contenido de carbono con respecto al contenido de nitrógeno) de más de 4,0 y menos de 9,5, en el que la bacteria de Bacillus es Bacillus siamensis, Bacillus simplex o Bacillus megaterium y en el que el contenido de potasio en el medio líquido es de menos de 2,0 g/l.
[2] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en [1], en el que la razón C/N en el medio líquido usado para cultivar es de 4,5 o más y menos de 9,5.
[3] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en [1], en el que la razón C/N en el medio líquido usado para cultivar es de 4,5 o más y 7,5 o menos.
[4] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en [1], en el que la razón C/N en el medio líquido usado para cultivar es de 6,0 o más y 7,5 o menos.
[5] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en uno cualquiera de [1] a [4], en el que el contenido de carbono en el medio líquido es de 50 g/l o menos.
[6] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en uno cualquiera de [1] a [4], en el que el contenido de carbono en el medio líquido es de 25 g/l o menos.
[7] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en uno cualquiera de [1] a [6], en el que el contenido de potasio en el medio líquido es de 1,9 g/l o menos.
[8] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en uno cualquiera de [1] a [7], en el que las fuentes de carbono y nitrógeno contenidas en el medio líquido son fuentes de carbono y nitrógeno que pueden utilizarse por la bacteria de Bacillus.
[9] El método de producción de esporas de Bacillus descrito en [8], en el que la fuente de carbono que puede utilizarse por la bacteria de Bacillus es una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en almidón, glucosa, lactosa, glicerol, arabinosa, ribosa, xilosa, galactosa, fructosa, manosa, inositol, manitol, sorbitol, glucosamina, N-acetilglucosamina, celobiosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, xilitol, alcoholes, ácidos orgánicos, sales orgánicas y alcanos; y la fuente de nitrógeno que puede utilizarse por la bacteria de Bacillus es una o más fuentes de nitrógeno seleccionadas de grupo que consiste en componentes derivados de soja, componentes derivados de levadura, componentes derivados de maíz, proteínas animales y vegetales e hidrolizados de las mismas, y sales de amonio tales como nitrato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, amoníaco, nitrato de sodio, nitrato de potasio, glutamato de sodio, urea y similares.
Efecto de la invención
La presente invención puede permitir una proliferación y esporulación estable de bacterias de Bacillus, y además proliferación a mayor concentración y esporulación a una mayor tasa.
Realizaciones para llevar a cabo la invención
En la presente divulgación, las bacterias de Bacillus no están particularmente limitadas siempre que sean bacterias clasificadas como Bacillus, e incluyen Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus popilliae, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus firmus, Bacillus velezensis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pichinotyi, Bacillus acidocaldarius, Bacillus alcalophilus, Bacillus alkalicola, Bacillus coagulans, Bacillus azotoformans, Bacillus anthracis, Bacillus siamensis, Bacillus badius, Bacillus bataviensis, Bacillus brevis, Bacillus cycloheptanicus, Bacillus circulans, Bacillus aneurinilyticus, Bacillus migulanus, Bacillus abyssalis, Bacillus aestuarii, Bacillus polimyxa o Bacillus sp..
Entre estas se prefieren Bacillus simplex, Bacillus siamensis y Bacillus megaterium.
En la presente invención, se usa un medio líquido que tiene una razón C/N (razón en peso del contenido de carbono con respecto al contenido de nitrógeno) de más de 4,0 y menos de 9,5 para el cultivo. La razón C/N es preferiblemente de 4,5 o más y menos de 9,5, más preferiblemente 4,5 o más y 7,5 o menos, todavía más preferiblemente 6,0 o más y 7,5 o menos. La razón C/N se calcula tal como sigue:
Razón C/N = contenido de carbono total en cada componente de los medios/contenido de nitrógeno total en cada componente de los medios.
El contenido de carbono en el medio líquido usado en la presente invención es preferiblemente de 50 g/l o menos, más preferiblemente de 25 g/l o menos. Por otro lado, el contenido de carbono es preferiblemente de 3 g/l o más.
Para las fuentes de carbono y nitrógeno en el medio líquido usado para el cultivo, pueden usarse aquellas que pueden utilizarse por bacterias de Bacillus. Los ejemplos de la fuente de carbono que puede utilizarse incluyen azúcares que pueden utilizarse por bacterias de Bacillus (tales como almidón, glucosa, lactosa, glicerol, arabinosa, ribosa, xilosa, galactosa, fructosa, manosa, inositol, manitol, sorbitol, glucosamina, N-acetilglucosamina, celobiosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, xilitol), alcoholes, ácidos orgánicos, sales orgánicas, alcanos u otras fuentes de carbono comunes. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno que puede utilizarse incluyen componentes derivados de soja, componentes derivados de levadura, componentes derivados de maíz, proteínas animales y vegetales e hidrolizados de las mismas, y sales de amonio tales como nitrato de amonio, sulfato de amonio , cloruro de amonio y acetato de amonio, amoníaco, nitrato de sodio, nitrato de potasio, glutamato de sodio, urea.
En el medio líquido usado en la presente invención, el contenido de potasio es preferiblemente de menos de 2 g/l, más preferiblemente 1,9 g/l o menos, con el fin de lograr una mayor tasa de esporulación. El contenido de potasio es preferiblemente de 0,2 g/l o más. Como fuentes de potasio, por ejemplo, se seleccionan al menos uno de componente derivado de soja, componente derivado de levadura, componente derivado de maíz, proteínas animales y vegetales e hidrolizados de las mismas, KH2PO4, K2HPO4 y KCl para el cultivo.
Pueden añadirse otras composiciones del medio, tales como sales de metales traza comúnmente usada para cultivar bacterias de Bacillus, siempre que no afecten negativamente a la esporulación y, si es necesario, por ejemplo, pueden añadirse aminoácidos o vitaminas.
Condiciones de cultivo pueden ser aquellas usadas generalmente para el cultivo líquido de bacterias de Bacillus, incluyendo condiciones de cultivo a de 20 a 40°C en condiciones aerobias (por ejemplo, del 15 al 50% de concentración de oxígeno) con agitación durante de 10 a 100 horas. El pH del medio es preferiblemente de 6,5 a 8,5, más preferiblemente de 7,0 a 8,0. Puede realizarse cultivo previo antes del cultivo en el medio líquido que tiene las razones C/N descritas anteriormente.
De esta manera, pueden obtenerse células bacterianas de Bacillus que tienen una alta tasa de esporulación (por ejemplo, el 50% o más, preferiblemente el 80% o más). Tales células bacterianas de Bacillus que tienen una alta tasa de esporulación pueden usarse para un fin deseado después de someterse a operaciones adecuadas tales como concentración o retirada de medio y secado.
Ejemplos
La presente invención se describirá en detalle a continuación con referencia a los ejemplos, pero no se limita a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Evaluación de la cepa de Bacillus simplex NBRC15720
Usando un matraz de Erlenmeyer de 500 ml, se prepararon cada uno de 100 ml de medios que contenían glucosa (Wako Pure Chemicals), harina de soja desgrasada (Ajinomoto Healthy Supply), extracto de levadura (Difco), CSL (líquido de maceración de maíz, por sus siglas en inglés, Corn Steep Liquor. ROQUETTE), peptona (Difco) y KH2PO4 (Wako Pure Chemicals) de modo que se lograron las concentraciones finales enumeradas en la tabla 1 y que contenían además 100 ppm de MnCl2 (Wako Pure Chemicals), 400 ppm de NaCl (Wako Pure Chemicals), 250 ppm de MgCh (Wako Pure Chemicals), 75 ppm de CaCh (Wako Pure Chemicals) y 0,3 ppm de FeSO4 (Wako Pure Chemicals), y se llevó a cabo esterilización en autoclave con un SILICOSEN (la glucosa se esterilizó por separado y se mezcló de manera aséptica con el fin de evitar la reacción de Maillard).
En primer lugar, se tomó un asa de siembra de la cepa de Bacillus simplex NBRC15720 de una colonia que ha crecido sobre una placa de agar nutritivo, se inoculó de manera aséptica en el medio descrito en la condición del medio 1 en la tabla 1 y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm para obtener un medio de cultivo previo.
Se inoculó de manera aséptica tres mililitros del medio de cultivo previo obtenido en diversos medios descritos en la tabla 1 y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm durante de 40 horas a 72 horas para obtener un medio de cultivo.
Después del cultivo, se midieron la concentración de células bacterianas en el medio de cultivo y la tasa de esporulación de las células bacterianas usando un microscopio óptico y un contador de células bacterianas.
Algunos métodos para medir la concentración de células bacterianas, concentración de esporas y tasa de esporulación son tal como sigue. La cepa de Bacillus simplex que ha crecido en el medio de cultivo se diluyó con, por ejemplo, agua estéril que contenía Tween 20 al 0,01%, y entonces se contaron la concentración de células bacterianas (esporas y células vegetativas) y la concentración de esporas con un contador de células bacterianas. La tasa de esporulación se calculó mediante. concentración de esporas/concentración de células bacterianas.
La razón C/N se calculó a partir de la razón en peso del contenido de carbono con respecto al contenido de nitrógeno en cada componente del medio. Razón C/N = contenido de carbono total en cada componente de los medios/contenido de nitrógeno total en cada componente de los medios.
El contenido de carbono en cada componente del medio se calculó mediante la determinación de la concentración de azúcar reductor mediante el método de Somogyi después de hidrólisis en ácido y, posteriormente, multiplicando la cantidad de azúcar total por 0,4.
El contenido de nitrógeno en cada componente del medio se determinó mediante el método de Kjeldahl.
El contenido de potasio en cada componente del medio se determinó mediante espectrofotometría de absorción atómica (longitud de onda de medición. 766,5 nm).
Tabla 1. Composición del medio
Figure imgf000005_0001
Los resultados se muestran en la tabla 2. A la razón C/N de 9,5 o más, aunque se observó crecimiento de las células bacterianas, se detectó una disminución en la tasa de esporulación. Por otro lado, a la razón C/N de 4,0 o menos, aunque se observó crecimiento de las células bacterianas, se detectó una disminución en la tasa de esporulación. Se encontró que el contenido de potasio preferido estaba en el intervalo de 0,2 a 1,9 g/l.
Tabla 2. Resultados del cultivo para la cepa NBRC15720
Figure imgf000006_0001
Ejemplo 2
Evaluación de la cepa de Bacillus simplex NBRC104473
Usando un matraz de Erlenmeyer de 500 ml, se prepararon cada uno de 100 ml de medios que contenían glucosa (Wako Pure Chemicals), harina de soja desgrasada (Ajinomoto Healthy Supply), extracto de levadura (Difco), CSL (ROQUETTE), peptona (Difco) y KH2PO4 (Wako Pure Chemicals) de modo que se lograron las concentraciones finales de las condiciones del medio 1 a 3 enumeradas en la tabla 3 y que contenían además cada uno 100 ppm de MnCl2 (Wako Pure Chemicals), 400 ppm de NaCl (Wako Pure Chemicals), 250 ppm de MgCh (Wako Pure Chemicals), 75 ppm de CaCb (Wako Pure Chemicals) y 0,3 ppm de FeSO4 (Wako Pure Chemicals), y se llevó a cabo esterilización en autoclave con un SILICOSEN (la glucosa se esterilizó por separado y se mezcló de manera aséptica con el fin de evitar la reacción de Maillard).
Se tomó un asa de siembra de la cepa de Bacillus simplex NBRC104473 de una colonia que ha crecido sobre una placa de agar nutritivo, se inoculó de manera aséptica en el medio descrito en la condición del medio 1 enumerada en la tabla 3 y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm para obtener un medio de cultivo previo. Se inoculó cada uno de 3 ml del medio de cultivo previo obtenido usado para cultivar la cepa de Bacillus simplex NBRC104473 de manera aséptica en cada medio descrito en la tabla 3 y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm durante de 40 horas a 72 horas para obtener un medio de cultivo. Después del cultivo, se midieron la concentración de células bacterianas en el medio de cultivo y la tasa de esporulación de las células bacterianas usando un microscopio óptico y un contador de células bacterianas.
Tabla 3. Composición del medio
Figure imgf000006_0002
Los resultados se muestran en la tabla 4. La cepa NBRC104473 también mostró la misma tendencia que en el ejemplo 1.
Tabla 4. Resultados del cultivo para la cepa NBRC104473
Figure imgf000007_0002
Ejemplo 3
Evaluación en el sistema de fermentación en bote
Usando un tanque de cultivo de 5 l, se prepararon cada uno de 2.000 ml de medios que contenían glucosa (Wako Pure Chemicals), harina de soja desgrasada (Ajinomoto Healthy Supply), extracto de levadura (Difco), CSL (ROQUETTE), peptona (Difco) y KH2PO4 (Wako Pure Chemicals) de modo que se lograron las concentraciones finales de las condiciones del medio 1 a 3 enumeradas en la tabla 5 y que contenían además cada uno 100 ppm de MnCl2 (Wako Pure Chemicals), 400 ppm de NaCl (Wako Pure Chemicals), 250 ppm de MgCh (Wako Pure Chemicals), 75 ppm de CaCl2 (Wako Pure Chemicals) y 0,3 ppm de FeSO4 (Wako Pure Chemicals), y se llevó a cabo esterilización en autoclave (la glucosa se esterilizó por separado y se mezcló de manera aséptica con el fin de evitar la reacción de Maillard).
Se tomó un asa de siembra de Bacillus simplex NBRC15720 de una colonia que ha crecido sobre una placa de agar nutritivo, se inoculó de manera aséptica en el medio de la condición del medio 1 descrito en el ejemplo 1 (tabla 1) preparado en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm para obtener un medio de cultivo previo. Se inoculó cada uno de 60 ml del medio de cultivo previo obtenido usado para cultivar la cepa de Bacillus simplex NBRC15720 de manera aséptica en cada medio descrito en la tabla 5 y se cultivó durante la noche con aireación y agitación a 37°C y 400 rpm durante 40 horas para obtener un medio de cultivo. Después del cultivo, se midieron la concentración de células bacterianas en el medio de cultivo y la tasa de esporulación de las células bacterianas usando un microscopio óptico y un contador de células bacterianas.
Tabla 5. Composición del medio
Figure imgf000007_0003
Los resultados se muestran en la tabla 6. Siempre que C/N esté dentro de un determinado intervalo, se obtuvo el 50% o más de la tasa de esporulación de la cepa de Bacillus simplex NBRC15720 incluso en un sistema de fermentación en bote.
Tabla 6. Resultados del cultivo para la cepa NBRC15720 (sistema de fermentación en bote)
Figure imgf000007_0001
Ejemplo 4
Evaluación de Bacillus siamensis en el sistema de fermentación en bote
Usando un tanque de cultivo de 5 l, se prepararon cada uno de 2.000 ml de medios que contenían glucosa (Wako Pure Chemicals), harina de soja desgrasada (Ajinomoto Healthy Supply), extracto de levadura (Difco), CSL (ROQUETTE), peptona (Difco) y KH2PO4 (Wako Pure Chemicals) de modo que se lograron las concentraciones finales de las condiciones del medio 1 a 3 enumeradas en la tabla 7 y que contenían además cada uno 100 ppm de MnCl2 (Wako Pure Chemicals), 400 ppm de NaCl (Wako Pure Chemicals), 250 ppm de MgCb (Wako Pure Chemicals), 75 ppm de CaCb (Wako Pure Chemicals) y 0,3 ppm de FeSO4 (Wako Pure Chemicals), y se llevó a cabo esterilización en autoclave (la glucosa se esterilizó por separado y se mezcló de manera aséptica con el fin de evitar la reacción de Maillard).
Se tomó un asa de siembra de Bacillus siamensis de una colonia que ha crecido sobre una placa de agar nutritivo, se inoculó de manera aséptica en el medio de la condición del medio 1 descrito en la tabla 7 preparado en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm para obtener un medio de cultivo previo. Se inoculó cada uno de 60 ml del medio de cultivo previo obtenido usado para cultivar el Bacillus siamensis de manera aséptica en diversos medios descritos en la tabla 7 y se cultivó durante la noche con aireación y agitación a 37°C y 400 rpm durante 40 horas para obtener un medio de cultivo. Después del cultivo, se midieron la concentración de células bacterianas en el medio de cultivo y la tasa de esporulación de las células bacterianas usando un microscopio óptico y un contador de células bacterianas.
Tabla 7. Composición del medio
Figure imgf000008_0002
Los resultados se muestran en la tabla 8. Siempre que C/N esté dentro de un determinado intervalo, se obtuvo el 88% o más de la tasa de esporulación del Bacillus siamensis incluso en un sistema de fermentación en bote.
Tabla 8. Resultados del cultivo para Bacillus siamensis (sistema de fermentación en bote)
Figure imgf000008_0001
Ejemplo 5
Resultados de cultivo para Bacillus megaterium (sistema de fermentación en bote)
Usando un tanque de cultivo de 5 l, se prepararon cada uno de 2.000 ml de medios que contenían glucosa (Wako Pure Chemicals), harina de soja desgrasada (Ajinomoto Healthy Supply), extracto de levadura (Difco), CSL (ROQUETTE), peptona (Difco) y KH2PO4 (Wako Pure Chemicals) de modo que se lograron las concentraciones finales de las condiciones del medio 1 a 3 enumeradas en la tabla 9 y que contenían además cada uno 100 ppm de MnCl2 (Wako Pure Chemicals), 400 ppm de NaCl (Wako Pure Chemicals), 250 ppm de MgCb (Wako Pure Chemicals), 75 ppm de CaCb (Wako Pure Chemicals) y 0,3 ppm de FeSO4 (Wako Pure Chemicals), y se llevó a cabo esterilización en autoclave (la glucosa se esterilizó por separado y se mezcló de manera aséptica con el fin de evitar la reacción de Maillard).
Se tomó un asa de siembra de Bacillus megaterium de una colonia que ha crecido sobre una placa de agar nutritivo, se inoculó de manera aséptica en el medio de la condición del medio 1 descrito en la tabla 9 preparado en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml y se cultivó durante la noche con agitación a 37°C y 150 rpm para obtener un medio de cultivo previo. Se inoculó cada uno de 60 ml del medio de cultivo previo obtenido usado para cultivar el Bacillus megaterium de manera aséptica en diversos medios descritos en la tabla 9 y se cultivó durante la noche con aireación y agitación a 37°C y 400 rpm durante 40 horas para obtener un medio de cultivo. Después del cultivo, se midieron la concentración de células bacterianas en el medio de cultivo y la tasa de esporulación de las células bacterianas usando un microscopio óptico y un contador de células bacterianas.
Tabla 9. Composición del medio
Figure imgf000009_0002
Los resultados se muestran en la tabla 10. Siempre que C/N esté dentro de un determinado intervalo, se obtuvo el 78% o más de la tasa de esporulación del Bacillus megaterium incluso en un sistema de cultivo a granel.
Tabla 10. Resultados del cultivo para Bacillus siamensis (sistema de fermentación en bote)
Figure imgf000009_0001

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método de producción de esporas de Bacillus que comprende una etapa de cultivar la bacteria de Bacillus usando un medio líquido que tiene una razón C/N (razón en peso del contenido de carbono con respecto al contenido de nitrógeno) de más de 4,0 y menos de 9,5, en el que la bacteria de Bacillus es Bacillus siamensis, Bacillus simplex o Bacillus megaterium y en el que el contenido de potasio en el medio líquido es de menos de 2,0 g/l.
  2. 2. Método de producción de esporas de Bacillus según la reivindicación 1, en el que la razón C/N en el medio líquido usado para cultivar es de 4,5 o más y menos de 9,5
  3. 3. Método de producción de esporas de Bacillus según la reivindicación 1, en el que la razón C/N en el medio líquido usado para cultivar es de 4,5 o más y 7,5 o menos.
  4. 4. Método de producción de esporas de Bacillus según la reivindicación 1, en el que la razón C/N en el medio líquido usado para cultivar es de 6,0 o más y 7,5 o menos.
  5. 5. Método de producción de esporas de Bacillus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el contenido de carbono en el medio líquido es de 50 g/l o menos.
  6. 6. Método de producción de esporas de Bacillus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el contenido de carbono en el medio líquido es de 25 g/l o menos.
  7. 7. Método de producción de esporas de Bacillus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el contenido de potasio en el medio líquido es de 1,9 g/l o menos.
  8. 8. Método de producción de esporas de Bacillus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las fuentes de carbono y nitrógeno contenidas en el medio líquido son fuentes de carbono y nitrógeno que pueden utilizarse por la bacteria de Bacillus.
  9. 9. Método de producción de esporas de Bacillus según la reivindicación 8, en el que la fuente de carbono que puede utilizarse por la bacteria de Bacillus es una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en almidón, glucosa, lactosa, glicerol, arabinosa, ribosa, xilosa, galactosa, fructosa, manosa, inositol, manitol, sorbitol, glucosamina, N-acetilglucosamina, celobiosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, xilitol, alcoholes, ácidos orgánicos, sales orgánicas y alcanos; y la fuente de nitrógeno que puede utilizarse por la bacteria de Bacillus es una o más fuentes de nitrógeno seleccionadas de grupo que consiste en componentes derivados de soja, componentes derivados de levadura, componentes derivados de maíz, proteínas animales y vegetales e hidrolizados de las mismas, y sales de amonio tales como nitrato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, amoníaco, nitrato de sodio, nitrato de potasio, glutamato de sodio, urea y similares.
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