ES2777836T3

ES2777836T3 - Tratamiento del glaucoma

Info

Publication number: ES2777836T3
Application number: ES18727467T
Authority: ES
Inventors: Lars Bruce; Adam Bruce
Original assignee: TX Medic AB
Current assignee: TX Medic AB
Priority date: 2017-05-17
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2020-08-06
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: KR20200005560A; JP2020519742A; RU2019136633A; PL3532072T3; JP6817466B2; EP3532072B1; RU2759998C2; CA3063851C; CA3063851A1; CN110621320A; IL270362B; US20210315920A1; KR102331421B1; BR112019024087A2; CN110621320B; PT3532072T; EP3532072A1; US11291684B2; RU2019136633A3; DK3532072T3

Abstract

Sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10 000 Da para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento del glaucoma

CAMPO TÉCNICO

Las presentes realizaciones se refieren en general a la prevención, el tratamiento o la inhibición del glaucoma, y en particular al uso de sulfato de dextrano para prevenir, tratar o inhibir el glaucoma.

ANTECEDENTES

Glaucoma describe un grupo de neuropatías ópticas progresivas que tienen el potencial de causar ceguera irreversible, en las que un factor de riesgo principal es la presión intraocular (PIO) elevada. En el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), se producen aumentos en la PIO cuando se reduce el flujo de salida del humor acuoso (HAc) a través de la malla trabecular (MT), normalmente como resultado de anomalías en la celularidad de la MT, la contracción de la MT y los niveles de matriz extracelular (MEC). Las fibras de tipo elástico de la MT están rodeadas por una vaina de fibrillas finas incrustadas en una MEC amorfa formada por colágeno IV, laminina y fibronectina. La presencia de material de placa asociado a las vainas de las fibras elásticas en el tejido yuxtacanalicular (TYC) dentro de la MT, denominadas placas derivadas de la vaina (DV), también es una característica patológica del GPAA. Por tanto, los pacientes con GPAA presentan significativamente más placas DV. y más gruesas, en su MT en comparación con los ojos de controles de la misma edad. Sin embargo, no se cree que estas placas DV contribuyan a una resistencia al flujo de salida aumentada, ya que se ha demostrado que los ojos con glaucoma pseudoexfoliativo presentaban niveles similares de material de placa DV en comparación con los ojos sanos, pero aún tenían niveles más altos de PIO. No obstante, se observan niveles mayores de MEC alrededor de las vainas de la MT y esta deposición podría contribuir a la resistencia al flujo de salida aumentada. Estos cambios celulares y de la MEC en la MT, junto con la capacidad contráctil alterada de las células de la MT dan como resultado una MT disfuncional y, en última instancia, la pérdida del control estricto del flujo de salida del HAc.

Los mecanismos que conducen a la disfunción de la MT en el GPAA son probablemente multifactoriales, pero se cree que contribuyen los niveles patológicamente altos de factor de crecimiento transformante p (TGF-p) dentro de1HAc. Algunos pacientes con GPAA presentan niveles elevados de TGF-p en su HAc en comparación con e1HAc tomado de pacientes de la misma edad con cataratas u otras formas de glaucoma. Se ha demostrado que el TGF-p juega un papel en el aumento de la deposición de MEC de la MT y la PIO mediante experimentos de perfusión ocular en humanos y en modelos de glaucoma en roedores. Los estudios de expresión genética de células de la MT humana cultivadas también respaldan la afirmación de que ambas isoformas, TGF-p1 y TGF-p2, inducen la sobreexpresión de proteínas de la MEC que pueden contribuir a los cambios en la MT observados en el glaucoma. Además, el TGF-p impide la descomposición de la MEC inhibiendo la activación de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) a través del aumento de los niveles del inhibidor del activador del plasminógeno (PAI)-1 y los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP). El PAI-1 inhibe la conversión del plasminógeno a plasmina, que es necesaria para la activación dependiente de la plasmina de las MMP. Los efectos del aumento de la PIO del TGF-p también se han atribuido a la capacidad de la citoquina para reducir la proliferación e inducir la apoptosis de las células de la MT, reduciendo de ese modo el número total de células de la MT.

El TGF-p también estimula la contracción de las células de la MT a través de la vía de señalización RhoA-proteína quinasa asociada a Rho (ROCK), influyendo significativamente la contractilidad de la MT en la PIO. Los estudios que han reducido o eliminado la contracción de la MT mediada por RhoA usando inhibidores de Rho/ROCK han conducido a que se consideren nuevas clases de agentes reductores de la PIO para tratar el glaucoma y otras afecciones médicas que implican aumentos en la PIO. Sin embargo, es improbable que los inhibidores de Rho/ROCK por sí solos puedan abordar la patología fibrótica crónica que se produce en algunos pacientes con GPAA, su eficacia aún está bajo escrutinio. En última instancia, las elevaciones de la PIO conducen a cambios metabólicos y bioquímicos en las células de la cabeza del nervio óptico y la retina. Asimismo, la compresión axonal mecánica afecta el transporte axonal tanto retrógrado y anterógrado. Los cambios metabólicos y bioquímicos, junto con la compresión axonal mecánica, privan a las células ganglionares retinianas (CGR) de los factores neurotróficos, lo que culmina en la apoptosis de las CGR y la formación de ventosas en el disco óptico, características que son diagnósticas del glaucoma.

El objetivo de cualquier tratamiento para el glaucoma es impedir la pérdida de visión, ya que la pérdida de visión por glaucoma es irreversible. Actualmente, el glaucoma se trata con gotas oculares, píldoras, cirugía láser, cirugía tradicional o una combinación de estos procedimientos. La mayoría de estos tratamientos están diseñados para reducir y/o controlar la PIO, que puede dañar el nervio óptico que transmite la información visual al cerebro. Sin embargo, el control de la PIO es, en el mejor de los casos, imperfecto y hay una necesidad insatisfecha de terapias mejoradas que puedan limitar o incluso revertir la progresión de la enfermedad.

RESUMEN

Un objetivo general es tratar, inhibir o impedir el glaucoma en un sujeto.

Este y otros objetivos se consiguen mediante las realizaciones descritas en esta invención.

La invención se define en las reivindicaciones independientes. Las realizaciones adicionales de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

Un aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10 000 Da para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma en un sujeto.

Otro aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10 000 Da para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención de la hipertensión ocular en un sujeto.

Un aspecto adicional de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da para uso en la inhibición de la pérdida de células ganglionares retinianas y la reducción de la capa de fibras del nervio retiniano en un sujeto que padece glaucoma y/o hipertensión ocular.

Otro aspecto más de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da para uso en la reducción de la presión intraocular en un sujeto que padece glaucoma.

El sulfato de dextrano de las presentes realizaciones causa una restauración rápida y reproducible de la PIO normal en sujetos que padecen glaucoma. La reducción de la PIO hasta el intervalo normal de los sujetos sanos se asoció con la preservación de las CGR en la retina y una preservación de la capa de fibras del nervio retiniano (CFNR). Se sugiere que la restauración de los niveles normales de PIO es el resultado de la disolución de los elementos cicatriciales creados en la MT como se verifica mediante los niveles significativamente reducidos de laminina y fibronectina en el ángulo de los sujetos tratados con sulfato de dextrano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La invención, junto con los objetivos y ventajas adicionales de la misma, puede comprenderse mejor consultando la descripción siguiente tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 ilustra los cambios en la presión intraocular (PIO) en sujetos que padecen glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 2 ilustra los cambios en el número de células ganglionares retinianas (CGR) en sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 3 ilustra los cambios en el espesor de la capa de fibras del nervio retiniano (CFNR) en sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 4 ilustra la adquisición de imágenes del segmento anterior del ángulo iridocorneal en sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 5 ilustra los cambios en la inmunorreactividad de la laminina en el ángulo en sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 6 ilustra los cambios en la inmunorreactividad de la fibronectina en el ángulo en sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 7 ilustra las diferencias en el peso corporal en sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 8 son imágenes representativas de la angiografía con fluoresceína de sujetos que padecen GPAA tratados con control de solución salina o sulfato de dextrano según las realizaciones.

La Figura 9 ilustra la neovascularización conoidea usando tinción con isolectina B4. Las imágenes representativas de la neovascularización en el grupo control (Figura 9A) y tratamiento (Figura 9B). (Figura 9C): La cifra de la barra muestra las áreas neovasculares promedio.

La Figura 10 ilustra la neovascularización coroidea usando tinción con colágeno IV. Las imágenes representativas de la neovascularización en el grupo control (Figura 10A) y tratamiento (Figura 10B). (Figura 10C): La cifra de la barra muestra las áreas neovasculares promedio.

La Figura 11 ilustra los resultados de un análisis por tomografía de coherencia óptica (TCO) de la CFNR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las presentes realizaciones se refieren en general a la prevención, el tratamiento o la inhibición del glaucoma, y en particular al uso de sulfato de dextrano para impedir, tratar o inhibir el glaucoma.

El tratamiento con sulfato de dextrano condujo a una restauración rápida y reproducible de la presión intraocular (PIO) normal en ojos glaucomatosos de sujetos que padecen glaucoma y, en particular, glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA). La restauración de los niveles normales de PIO se asoció a la preservación de las células ganglionares retinianas (CGR) en la retina como se demuestra mediante los recuentos de CGR mantenidos y una preservación del espesor de la capa de fibras del nervio retiniano (CFNR) en los ojos de los sujetos tratados con sulfato de dextrano. El tratamiento con sulfato de dextrano también dio como resultado la disolución de los elementos cicatriciales creados en la malla trabecular (MT), ya que los niveles de laminina y fibronectina fueron significativamente inferiores en el ángulo de los sujetos tratados con sulfato de dextrano.

Las implicaciones clínicas de las observaciones son las siguientes. Los pacientes con glaucoma se tratan actualmente con gotas oculares diarias de fármacos que reducen la PIO indistintamente limitando la producción de fluido ocular o aumentando el flujo de salida del fluido ocular. Estos tratamientos presentan un cumplimiento terapéutico deficiente y, por consiguiente, la PIO se controla de manera imperfecta, lo que conduce a una pérdida de visión progresiva en la mayoría de los pacientes. Un tratamiento que impida y revierta la patología ocular que conduce a la pérdida de visión y mejore significativamente el control de la PIO sería muy valioso.

Los fármacos candidatos útiles para tratar el glaucoma no deben inducir la angiogénesis o neovascularización en los ojos. Tal angiogénesis patológica en el ojo puede conducir, de otro modo, a una discapacidad visual grave. Los datos experimentales como se presentan en esta invención indican que el sulfato de dextrano no presentó efectos antiangiogénicos o proangiogénicos en los ojos de los sujetos tratados (comparar con los Ejemplos de ensayo 1-4 del documento US 5135920 A) Por consiguiente, el sulfato de dextrano se puede usar de forma segura en indicaciones oculares sin el riesgo de angiogénesis patológica en el ojo.

El sulfato de dextrano de las realizaciones se puede usar eficazmente de ese modo en la prevención, el tratamiento o la inhibición del glaucoma.

Por consiguiente, un aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma en un sujeto.

El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares que dan como resultado daños en el nervio óptico y la retina con pérdida de visión asociada. El tipo más común de glaucoma es el glaucoma de ángulo abierto, incluyendo los tipos menos comunes el glaucoma de ángulo cerrado y el glaucoma de tensión normal. El glaucoma de ángulo abierto se desarrolla lentamente a lo largo del tiempo y no hay dolor. La visión lateral puede comenzar a disminuir, seguida de pérdida de la visión central, lo que da como resultado ceguera si no se trata. El glaucoma de ángulo cerrado puede presentarse gradual o repentinamente. La presentación repentina puede implicar dolor ocular intenso, visión borrosa, pupila medio dilatada, enrojecimiento del ojo y náuseas. La pérdida de visión por glaucoma, una vez que se ha presentado, es permanente.

Si se trata de manera temprana, puede ser posible ralentizar o detener la progresión del glaucoma con medicamentos, tratamiento con láser o cirugía. Los objetivos modernos del tratamiento del glaucoma son evitar el daño glaucomatoso y daño nervioso, y preservar el campo visual y la calidad de vida total de los pacientes, con efectos secundarios mínimos. Esto requiere técnicas de diagnóstico apropiadas y exámenes de seguimiento, y una selección juiciosa de los tratamientos para cada paciente a nivel individual. Aunque la presión intraocular es solo uno de los factores de riesgo principales para el glaucoma, reducirla por medio de diversos medicamentos y/o técnicas quirúrgicas es actualmente la base del tratamiento del glaucoma.

La presión intraocular se puede reducir con medicamentos, normalmente gotas oculares. Se usan varias clases de medicamentos para tratar el glaucoma, con varios medicamentos en cada clase. Cada uno de estos medicamentos puede tener efectos secundarios locales y sistémicos. La adherencia al protocolo de medicación puede resultar confusa y costosa. El cumplimiento terapéutico deficiente con los medicamentos y las visitas de seguimiento es una razón importante para la pérdida de visión en los pacientes con glaucoma.

Se realizan cirugías tanto láser como convencionales para tratar el glaucoma. La cirugía y el tratamiento con láser son generalmente soluciones temporales, ya que no son capaces de curar el glaucoma.

Por tanto, desde hace tiempo, hay una necesidad de proporcionar un medicamento que se pueda usar para tratar, inhibir o impedir el glaucoma en un sujeto.

El sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable, según las realizaciones induce, cuando se administra a un sujeto que padece PIO aumentada, es decir, hipertensión ocular, tal como la causada por glaucoma, una reducción de la PIO. De hecho, la PIO se normaliza, es decir, se reduce al intervalo normal de PIO de los sujetos sanos después de la administración de sulfato de dextrano. Por consiguiente, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, según las realizaciones es capaz de combatir y tratar uno de los componentes más perjudiciales del glaucoma, es decir, la PIO anómala y aumentada.

Asimismo, la administración de sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, según las realizaciones proporciona un efecto neuroprotector a las CGR. Pormenorizadamente, la administración de sulfato de dextrano protegió a las CGR del daño y la muerte celular como se observa en los recuentos de CGR mantenidos y una preservación del espesor de la CFNr en los ojos de los sujetos tratados.

La CGR es un tipo de neurona situada cerca de la superficie interna de la retina del ojo, típicamente simbolizada por la capa de células ganglionares. Las CGR transmiten colectivamente la información visual formadora de imágenes y no formadora de imágenes desde la retina en forma de potencial de acción a varias regiones del tálamo, hipotálamo y mesencéfalo, o cerebro medio. Las CGR varían significativamente en términos de su tamaño, conexiones y respuestas a la estimulación visual, pero todas ellas comparten la propiedad determinante de tener un axón largo que se extiende al cerebro. Estos axones forman el nervio óptico, quiasma óptico y tracto óptico.

La CFNR, a veces denominada capa de fibras nerviosas o estrato óptico, se forma mediante la expansión de las fibras del nervio óptico. La CFNR es una estructura sensible y algunos procesos, tales como la PIO alta, pueden provocar su apoptosis natural.

El efecto neuroprotector del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones impide eficazmente el daño y la apoptosis de las CGR y preserva de ese modo la CFNR.

Como se mencionó anteriormente, la disfunción de la MT, tal como anomalías en la celularidad de la MT y contracción de la MT, puede ser una causa subyacente de la PIO alta como se observa en los sujetos que padecen glaucoma. El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones dispersa y atenúa la formación de cicatrices en la MT en los sujetos con glaucoma. Esto, a su vez, normaliza el flujo de salida de1HAc a través de la MT.

Se sugiere que el efecto anti formación de cicatrices del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones es el resultado de varios mecanismos inducidos por el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por tanto, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, induce las metaloproteinasas de la matriz (MMP), que son enzimas capaces de degradar las proteínas de la matriz extracelular (MEC) y suprimir la actividad de los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP). El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, induce además moléculas naturales anti formación de cicatrices, tales como la decorina que, a su vez, bloquea el TGF-p y diversos factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc. El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también tiene un efecto inhibidor sobre la actividad del TGF-p e inhibe la fibrosis incluso en presencia de niveles excesivos de TGF-p. El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, inhibe además la adhesión de las células inmunes y la agregación celular. La formación de cicatrices es impulsada por las citoquinas inflamatorias, en particular el TGF-p, y suprime los niveles de proteína quinasa 1 activada por TGF-p (TAK-1). El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, bloquea el TGF-p y otras citoquinas que favorecen la formación de cicatrices y la fibrosis y estimula paralelamente las moléculas anti formación de cicatrices. En conjunto, estos mecanismos inducidos por el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tienen un efecto positivo en los ojos glaucomatosos dispersando y atenuando la formación de cicatrices en la MT.

Los medicamentos antiglaucoma de la técnica anterior generalmente no son capaces de tratar o curar el glaucoma, ni de combatir las causas subyacentes del glaucoma, sino que alivian los síntomas del glaucoma, tal como reducen la PIO indistintamente limitando la producción de fluido ocular o aumentando el flujo de salida del fluido. Sin embargo, los tratamientos que usan tales medicamentos típicamente tienen un cumplimiento terapéutico deficiente y un control imperfecto de la PIO, lo que conduce de ese modo a la pérdida de visión progresiva en la mayoría de los sujetos. Esto está en claro contraste con el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones que no solo reduce y normaliza la PIO, sino que también proporciona un efecto neuroprotector sobre las CGR y la CFNR y disuelve los elementos cicatriciales formados en la MT para permitir de ese modo una inhibición y tratamiento reales del glaucoma.

El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, consigue el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma sin causar angiogénesis patológica en el ojo. Por tanto, es importante que un medicamento usado para el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma no induzca angiogénesis o neovascularización en los ojos, lo que de otro modo conduciría a discapacidad visual grave. Los datos experimentales como se presentan en esta invención indican que el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no presentó efectos antiangiogénicos ni proangiogénicos en el ojo y, de ese modo, es adecuado para su aplicación en indicaciones oculares.

El glaucoma de ángulo abierto es la forma más común de glaucoma y justifica al menos el 90 % de todos los casos de glaucoma. Es causado por la obstrucción de los canales de drenaje, lo que da como resultado una presión ocular aumentada. Ángulo abierto significa que el ángulo donde el iris se encuentra con la córnea es tan ancho y abierto como debería ser. El glaucoma de ángulo abierto también se denomina glaucoma primario, glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) o glaucoma crónico en la técnica.

En una realización particular, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma de ángulo abierto, tal como GPAA, en un sujeto.

El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, reduce eficazmente la PIO de los intervalos de hipertensión ocular al intervalo normal de PIO.

Por tanto, otro aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención de la hipertensión ocular en un sujeto.

En una realización particular, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es para uso en la reducción de la presión intraocular en un sujeto que padece hipertensión ocular.

Por lo tanto, un aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la reducción de la presión intraocular en un sujeto que padece glaucoma, preferentemente que padece glaucoma de ángulo abierto, tal como GPAA.

En humanos, el intervalo normal de PIO es típicamente entre 10 mmHg y 20 mmHg, con el valor promedio de PIO de aproximadamente 15,5 mmHg con fluctuaciones de aproximadamente 2,75 mmHg. La hipertensión ocular (HTO) se define como una PIO que es superior a la normal, es decir, típicamente superior a 20 mmHg para los humanos. Por tanto, en una realización, reducir la presión intraocular comprende reducir la presión intraocular, o restaurar la presión intraocular, para que esté dentro de un intervalo normal de PIO de 10 mmHg a 20 mmHg, tal como dentro de un intervalo de PIO de 12,75 mmHg a 18,25 mmHg.

En una realización, el sujeto padece hipertensión ocular causada por glaucoma, preferentemente glaucoma de ángulo abierto, tal como GPAA.

Aunque el glaucoma, y en particular el glaucoma de ángulo abierto y GPAA, es una causa principal de hipertensión ocular, hay otras causas de hipertensión ocular posibles que incluyen, por ejemplo, presión arterial alta; estrés; una dieta con exceso de sal, aceites hidrogenados, alcohol y azúcar; traumatismo ocular; fumar; diabetes y enfermedades cardíacas. Asimismo, algunos medicamentos tienen el efecto secundario de causar hipertensión ocular en ciertos individuos. Por ejemplo, se ha demostrado que los medicamentos esteroides usados para tratar el asma y otras afecciones aumentan el riesgo de hipertensión ocular. Diversos traumatismos oculares que pueden afectar al equilibrio entre la producción y el drenaje acuoso desde el ojo pueden causar hipertensión ocular. La hipertensión ocular también se ha asociado a otras afecciones oculares, tales como PIO nocturna elevada, presencia de picos de PIO, síndrome de pseudoexfoliación, síndrome de dispersión pigmentaria y arco corneal.

El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, proporciona un efecto neuroprotector para impedir, o al menos reducir, los daños y la muerte de las CGR y preservar la integridad y el espesor de la CFNR. Por tanto, un aspecto adicional de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la inhibición de la pérdida de células ganglionares retinianas y la reducción de la capa de fibras del nervio retiniano en un sujeto que padece glaucoma, preferentemente glaucoma de ángulo abierto, tal como GPAA y/o hipertensión ocular.

La PIO aumentada y la muerte de las CGR también pueden afectar, directa o indirectamente, a otras neuronas retinianas, tales como las interneuronas y los fotorreceptores. Por ejemplo, la muerte de CGR puede causar atrofia que, a su vez, induce la pérdida de sinapsis y muerte de otras neuronas retinianas.

Por consiguiente, la normalización de la PIO y la reducción de los daños y la muerte de las CGR serán útiles para tratar, impedir o inhibir otras afecciones retinianas, tales como la retinopatía diabética y diversas afecciones genéticas vinculadas a la pérdida de fotorreceptores.

El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es un agente único para el tratamiento, la prevención o la inhibición del glaucoma y afecciones retinianas relacionadas, no solo reduciendo la PIO, sino también protegiendo directa y simultáneamente las neuronas retinianas del daño y la muerte.

En una realización, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración sistémica al sujeto. En una realización, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración parenteral como ejemplo de administración sistémica.

Los ejemplos de las vías de administración parenterales incluyen la administración intravenosa (iv), administración intraarterial, administración intramuscular, administración intracerebral, administración intracerebroventricular, administración intratecal y administración subcutánea (sc).

En una realización, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado preferentemente para la administración intravenosa (iv) o subcutánea (sc) al sujeto. Por consiguiente, la administración iv y sc son ejemplos preferidos de la administración sistémica de sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración sc al sujeto.

En una realización, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado como una solución acuosa para inyección, preferentemente como una solución acuosa para inyección iv o sc. Por tanto, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones está formulado preferentemente como una solución acuosa para inyección con un disolvente o excipiente seleccionado. El disolvente es ventajosamente un disolvente acuoso y en particular una solución de tampón. Un ejemplo no limitante de tal solución de tampón es un tampón de ácido cítrico, tal como tampón de ácido cítrico monohidratado (CAM), o un tampón de fosfato. Por ejemplo, el sulfato de dextrano de las realizaciones se puede disolver en solución salina, tal como solución salina de NaCl a 0,9 %. y a continuación tamponar opcionalmente con CAM 75 mM y ajustar el pH a aproximadamente 5,9 usando hidróxido de sodio. También son posibles las soluciones no tamponadas, lo que incluye soluciones acuosas para inyección, tales como solución salina, es decir, NaCl (ac). Asimismo, se podrían usar otros sistemas de tampón distintos del CAM y los tampones de fosfato si se desea una solución tamponada.

Las realizaciones no se limitan a las inyecciones y, alternativamente, se pueden usar otras vías de administración que incluyen la administración intraocular, intravítrea, transzonular, nasal, bucal, dérmica, traqueal, bronquial o tópica. El compuesto activo, sulfato de dextrano, se formula a continuación con un excipiente, disolvente o vehículo adecuado que se selecciona en función de la vía de administración particular.

Administración intraocular se refiere a una administración que se introduce en el globo ocular de un sujeto. Administración intravítrea se refiere a una administración a través de un ojo de un sujeto, preferentemente directamente en la cavidad interna del ojo. Administración transzonular se refiere a una administración a través de la zónula ciliar, que es una serie de fibras que conectan el cuerpo ciliar y el cristalino del ojo.

Vehículo se refiere a una sustancia que actúa como un vehículo para mejorar la eficacia de administración y/o la efectividad del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Excipiente se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva que está formulada en combinación con el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, e incluye, por ejemplo, agentes de carga, cargas, diluyentes y productos usados para facilitar la absorción o solubilidad del fármaco o para otras consideraciones farmacocinéticas.

Sal farmacéuticamente aceptable de sulfato de dextrano se refiere a una sal de sulfato de dextrano que tiene los efectos como se describen en esta invención y no es perjudicial para el receptor de la misma a la(s) dosis administrada(s).

El sulfato de dextrano es preferentemente uno denominado sulfato de dextrano de bajo peso molecular.

En lo sucesivo, la mención al peso molecular (promedio) y el contenido de azufre del sulfato de dextrano se aplica también a cualquier sal farmacéuticamente aceptable de sulfato de dextrano. Por lo tanto, la sal farmacéuticamente aceptable de sulfato de dextrano tiene preferentemente el peso molecular promedio y contenido de azufre como se describen en las realizaciones siguientes.

El sulfato de dextrano es un polisacárido sulfatado y en particular un glucano sulfatado, es decir, un polisacárido compuesto por muchas moléculas de glucosa. El peso molecular promedio, como se define en esta invención, indica que los polisacáridos sulfatados individuales pueden tener un peso molecular diferente de este peso molecular promedio, pero que el peso molecular promedio representa el peso molecular medio de los polisacáridos sulfatados. Esto implica además que habrá una distribución natural de los pesos moleculares en torno a este peso molecular promedio para una muestra de sulfato de dextrano.

El peso molecular promedio (M^w) del sulfato de dextrano se determina típicamente usando métodos indirectos, tales como cromatografía de exclusión/penetración en gel, dispersión de la luz o viscosidad. La determinación del peso molecular promedio usando tales métodos indirectos dependerá de una serie de factores, que incluyen la elección de columna y eluyente, el caudal, los procedimientos de calibración, etc.

Peso molecular promedio ZMiN¿ típico para métodos sensibles al tamaño molecular en lugar de al valor numérico, p. ej., métodos de dispersión de la luz y cromatografía de exclusión por tamaño (CEM). Si se supone una distribución normal, entonces hay un mismo peso a cada lado de M^w, es decir, el peso total de las moléculas de sulfato de dextrano de la muestra que tienen un peso molecular inferior a M^wes igual al peso total de las moléculas de sulfato de dextrano de la muestra que tienen un peso molecular superior a M^w.

Según la invención, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da.

El sulfato de dextrano de un peso molecular promedio que supera los 10000 Da generalmente tiene un perfil inferior de efecto frente a toxicidad en comparación con el sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio inferior. Esto significa que la dosis máxima de sulfato de dextrano que se puede administrar de forma segura a un sujeto es inferior para las moléculas de sulfato de dextrano mayores (> 10000 Da) en comparación con las moléculas de sulfato de dextrano que tienen un peso molecular promedio dentro del intervalo preferido. Como consecuencia, tales moléculas de sulfato de dextrano mayores son menos apropiadas en usos clínicos cuando el sulfato de dextrano se administra a los sujetos in vivo.

En una realización, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un peso molecular promedio dentro de un intervalo de 2000 a 10000 Da. En otra realización, el peso molecular promedio está dentro de un intervalo de 2500 a 10000 Da. En una realización preferida, el peso molecular promedio está dentro de un intervalo de 3000 a 10000 Da.

En una realización opcional, pero preferida, menos de 40 % de las moléculas de sulfato de dextrano tienen un peso molecular inferior a 3000 Da, preferentemente menos de 35 %, tal como menos de 30 % o menos de 25 % de las moléculas de sulfato de dextrano tienen un peso molecular inferior a 3000 Da. Además, o alternativamente, menos de 20 % de las moléculas de sulfato de dextrano tienen un peso molecular superior a 10000 Da, preferentemente menos de 15 %, tal como menos de 10 % o menos de 5 % de las moléculas de sulfato de dextrano tienen un peso molecular superior a 10000 Da. Por tanto, en una realización particular, el sulfato de dextrano tiene una distribución de pesos moleculares sustancialmente estrecha en torno al peso molecular promedio.

En una realización particular, el peso molecular promedio del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está dentro de un intervalo de 3500 a 9500 Da, tal como dentro de un intervalo de 3500 a 8000 Da. En otra realización particular, el peso molecular promedio del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está dentro de un intervalo de 4500 a 7500 Da.

En otra realización particular adicional, el peso molecular promedio del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está dentro de un intervalo de 4500 a 5500 Da.

Por tanto, en una realización actualmente preferida, el peso molecular promedio del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es preferentemente aproximadamente 5000 Da, o al menos sustancialmente cercano a 5000 Da, tal como 5000 ± 500 Da, por ejemplo 5000 ± 400 Da, preferentemente 5000 ± 300 Da o 5000 ± 200 Da, tal como 5000 ± 100 Da. Por lo tanto, en una realización, el peso molecular promedio del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es 4,5 kDa, 4,6 kDa, 4,7 kDa, 4,8 kDa, 4,9 kDa, 5,0 kDa, 5,1 kDa, 5,2 kDa, 5,3 kDa, 5,4 kDa o 5,5 kDa.

En una realización particular, el peso molecular promedio del sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente del mismo como se presentó anteriormente es M^wpromedio, y se determina preferentemente mediante cromatografía de exclusión/penetración en gel, cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de la luz o métodos basados en la viscosidad.

En una realización particular, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, consiste, en promedio, en aproximadamente o ligeramente por encima de 5 unidades de glucosa y tiene un número promedio de sulfato por unidad de glucosa de al menos 2,0, tal como de al menos 2,5.

El sulfato de dextrano es un derivado polianiónico del dextrano y contiene azufre. El contenido promedio de azufre para el sulfato de dextrano de las realizaciones es preferentemente 15 a 20 % y más preferentemente aproximadamente 17 %, lo que corresponde generalmente a aproximadamente, o al menos, dos grupos sulfato por residuo glucosilo. En una realización particular, el contenido de azufre del sulfato de dextrano es preferentemente igual, o al menos cercano, al grado máximo posible de contenido de azufre de las moléculas de dextrano correspondientes.

En una realización particular, el sulfato de dextrano de las realizaciones tiene un peso molecular medio numérico (Mⁿ), como se mide mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), dentro de un intervalo de 1850 a 3500 Da.

Peso molecular medio numérico

típicamente obtenido mediante ensayos del grupo terminal, p. ej., espectroscopía de RMN o cromatografía. Si se supone una distribución normal, entonces hay un mismo número de moléculas de sulfato de dextrano a cada lado de Mⁿ, es decir, el número de moléculas de sulfato de dextrano de la muestra que tienen un peso molecular inferior a Mⁿes igual al número de moléculas de sulfato de dextrano de la muestra que tienen un peso molecular superior a Mⁿ.

En una realización preferida, el sulfato de dextrano de las realizaciones tiene un Mⁿ, como se mide mediante espectroscopía de RMN, dentro de un intervalo de 1850 a 2500 Da, preferentemente dentro de un intervalo de 1850 a 2300 Da y más preferentemente dentro de un intervalo de 1850 a 2000 Da.

En una realización particular, el sulfato de dextrano de las realizaciones tiene un número promedio de sulfato por unidad de glucosa dentro de un intervalo de 2,5 a 3,0, preferentemente dentro de un intervalo de 2,5 a 2,8 y más preferentemente dentro de un intervalo de 2,6 a 2,7.

En una realización particular, el sulfato de dextrano de las realizaciones tiene un número promedio de unidades de glucosa dentro de un intervalo de 4,0 a 6,0, preferentemente dentro de un intervalo de 4,5 a 5,5 y más preferentemente dentro de un intervalo de 5,0 a 5,2, tal como aproximadamente 5,1.

En otra realización particular, el sulfato de dextrano de las realizaciones tiene en promedio 5,1 unidades de glucosa y un número promedio de sulfato por unidad de glucosa de 2,6 a 2,7, lo que típicamente da como resultado un peso molecular medio numérico (Mⁿ), como se mide mediante espectroscopía de RMN, dentro de un intervalo de 1850 a 2000 Da.

Un sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se puede usar según las realizaciones se describe en el documento WO 2016/076780.

El sulfato de dextrano según las realizaciones se puede proporcionar como una sal farmacéuticamente aceptable de sulfato de dextrano. Tales sales farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., una sal sódica o potásica de sulfato de dextrano.

En una realización particular, la sal sódica de sulfato de dextrano, que incluye contraiones Na+, tiene un Mⁿ, como se mide mediante espectroscopía de RMN, dentro de un intervalo de 2000 a 2500 Da, preferentemente dentro de un intervalo de 2100 a 2300 Da.

Los intervalos de dosis adecuados para el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones pueden variar según el tamaño y peso del paciente, la afección para la que se trata al paciente y otras consideraciones. En particular, para sujetos humanos, un posible intervalo de dosificación podría ser de 1 pg/kg a 150 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 10 pg/kg a 100 mg/kg de peso corporal.

En realizaciones preferidas, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para ser administrado a una dosificación en un intervalo de 0,05 a 50 mg/kg de peso corporal del sujeto, preferentemente de 0,05 o 0,1 a 40 mg/kg de peso corporal del sujeto y más preferentemente de 0,05 o 0,1 a 30 mg/kg, o 0,1 a 25 mg/kg o de 0,1 a 15 mg/kg o 0,1 a 10 mg/kg, de peso corporal del sujeto.

La administración de sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones se inicia preferentemente tan pronto como sea posible después de la aparición de un evento o afección que de otro modo puede causar glaucoma, hipertensión ocular y/o daños a las CGR y la CFNR en el sujeto.

La administración de sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no tiene que estar necesariamente limitada al tratamiento del glaucoma, sino que podría usarse alternativamente o, además, para profilaxis. En otras palabras, el sulfato de dextrano de las realizaciones se podría administrar a un sujeto que tiene un riesgo aumentado de desarrollar glaucoma, hipertensión ocular y/o daños a las CGR y la CFNR.

La inhibición del glaucoma, de la hipertensión ocular y/o de la pérdida de CGR y de la reducción de la CFNR, como se emplea en esta invención, implica que el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, reduce los síntomas y efectos de la afección a pesar de que no se produce necesariamente un tratamiento o cura al 100 %. Por ejemplo, la inhibición de la hipertensión ocular implica una reducción en la PIO, posiblemente incluso por debajo del intervalo normal de PIO, tal como igual o inferior a 20 mmHg. La inhibición de la pérdida de CGR implica reducir el número de CGR que de otro modo podrían dañarse o perderse, lo que incluye hasta impedir cualquier pérdida de CGR superior a cualquier pérdida normal de CGR observada en sujetos sanos. En consecuencia, la inhibición de la reducción de la CFNR implica detener, o al menos disminuir, cualquier reducción en el espesor de la CFNR, lo que incluye hasta impedir cualquier reducción de la CFNR superior a cualquier reducción normal de la CFNR observada en sujetos sanos. La inhibición del glaucoma incluye reducir, o al menos mitigar, los síntomas y las afecciones causados por el glaucoma, tal como reducir la PIO, reducir la pérdida de CGR, disminuir la reducción de la CFNR y/o disolver los elementos cicatriciales de la MT.

El sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones se puede administrar en una única ocasión de administración, tal como en forma de una inyección única o inyección en bolo. Esta dosis en bolo se puede inyectar bastante rápidamente al paciente, pero se infunde ventajosamente a lo largo del tiempo, de modo que la solución de sulfato de dextrano se infunde al paciente a lo largo de unos minutos, tal como durante 5 a 10 minutos o más.

Alternativamente, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de las realizaciones se puede administrar en múltiples ocasiones, es decir, al menos dos, durante un período de tratamiento. Por tanto, el sulfato de dextrano de las realizaciones se podría administrar una o múltiples veces al día, una o múltiples veces a la semana, una o múltiples veces al mes como ejemplos ilustrativos.

En una realización particular, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración en múltiples veces, tal como 2-14 veces, preferentemente 2-7 veces, una semana durante una o múltiples semanas consecutivas, tal como al menos 2-5 semanas consecutivas. En una realización particular, el sulfato de dextrano, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración una o dos veces al día durante múltiples días, tal como múltiples días consecutivos, p. ej., 2-14 días.

En una realización, el sujeto es un sujeto mamífero, preferentemente un primate y más preferentemente un sujeto humano. Aunque las realizaciones están dirigidas en particular al tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma en sujetos humanos, las realizaciones pueden usarse también, o alternativamente, en aplicaciones veterinarias. Los ejemplos no limitantes de sujetos animales incluyen primate, gato, perro, cerdo, caballo, ratón y rata. Otros aspectos de las realizaciones se refieren al uso de sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma en un sujeto; para el tratamiento, la inhibición o la prevención de la hipertensión ocular en un sujeto; para la reducción de la presión intraocular en un sujeto que padece glaucoma; o para la pérdida de CGR y la reducción de la CFNR en un sujeto que padece glaucoma, preferentemente glaucoma de ángulo abierto y/o hipertensión ocular.

Otro aspecto más de la presente descripción se refiere a un procedimiento para tratar, inhibir o impedir el glaucoma. El procedimiento comprende administrar sulfato de dextrano, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que padece glaucoma, preferentemente glaucoma de ángulo abierto.

Otro aspecto adicional de la presente descripción se refiere a un procedimiento para tratar, inhibir o impedir la hipertensión ocular. El procedimiento comprende administrar sulfato de dextrano, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que padece hipertensión ocular.

[0097]Otro aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para inhibir la pérdida de células ganglionares retinianas y la reducción de la capa de fibras del nervio retiniano. El procedimiento comprende administrar sulfato de dextrano, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que padece glaucoma, preferentemente glaucoma de ángulo abierto, y/o hipertensión ocular.

Otro aspecto más de la presente descripción se refiere a un procedimiento para reducir la presión intraocular en un sujeto que padece glaucoma. El procedimiento comprende administrar sulfato de dextrano, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que padece glaucoma.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - Efecto del sulfato de dextrano sobre ojos glaucomatosos

Resultados

Presión infraocular (PIO)

La PIO elevada se indujo mediante inyecciones intracamerales dos veces a la semana de la citoquina inflamatoria TGF-p durante todo el período de tiempo de 28 días. Esto indujo la formación de cicatrices en los portales de drenaje de la malla trabecular (MT) en el día 14 con PIO elevada asociada. Los tratamientos subcutáneos diarios con sulfato de dextrano/solución salina comenzaron en el día 14.

La PIO se elevó en el día 14 en ambos grupos, progresando la PIO elevada en los animales que recibieron inyecciones subcutáneas de solución salina. Sin embargo, la PIO elevada comenzó a reducirse después de 7 días de tratamiento con sulfato de dextrano y en el día 24 hubo una PIO significativamente inferior (P < 0,001) y normalizada en el grupo de sulfato de dextrano en comparación con los controles. La PIO permaneció significativamente inferior (P > 0,001) a la del grupo de control al final del experimento, en el día 28 (Figura 1).

Número de células ganglionares retinianas (CGR)

El tratamiento con sulfato de dextrano impidió significativamente (P > 0,001) el descenso en el número de CGR presentes en la retina en el día 28 (Figura 2), lo que sugiere un efecto neuroprotector del sulfato de dextrano. Este efecto neuroprotector puede ser por medio de un efecto directo o indirecto debido a la PIO reducida.

Análisis por tomografía de coherencia óptica (TCO) de la capa de fibras del nervio retiniano (CFNR)

La CFNR comprende axones que pertenecen a las CGR y se pierde simultáneamente a la pérdida del cuerpo celular de las CGR. La CFNR se preservó después del tratamiento con sulfato de dextrano en comparación con el tratamiento con solución salina (Figuras 3 y 11), lo que sugiere un efecto neuroprotector del sulfato de dextrano. Este efecto neuroprotector puede ser por medio de un efecto directo o indirecto debido a la PIO reducida.

Adquisición de imágenes del segmento anterior del ángulo

En los ojos tratados tanto con solución salina como con sulfato de dextrano, el ángulo iridocorneal permaneció “abierto”, lo que demuestra que los aumentos de la PIO no fueron debidos al cierre del ángulo, véase la Figura 4.

Formación de cicatrices en la malla trabecular (MT)

El tratamiento con sulfato de dextrano atenuó significativamente la formación de cicatrices en la MT, como se demuestra mediante los niveles significativamente reducidos (P < 0,001 laminina; P < 0,01 fibronectina) de laminina (Figura 5) y fibronectina (Figura 6) inmunorreactivas en el ángulo.

Peso corporal

Las ratas del grupo tratado con sulfato de dextrano estuvieron más activas. Cuando se midió el peso corporal en ambos grupos, hubo una diferencia pequeña, pero no significativa, debido a que los animales tratados con sulfato de dextrano ganaron menos peso a lo largo del período de tratamiento que los animales tratados con solución salina (Figura 7).

Conclusiones

El tratamiento con sulfato de dextrano condujo a una restauración rápida y reproducible de la PIO normal en los ojos glaucomatosos. La restauración de los niveles normales de PIO se asoció a la preservación de las células ganglionares retinianas (CGR) en la retina, como se demuestra mediante los recuentos de CGR mantenidos, y una preservación del espesor de la CFNR en los ojos de las ratas tratadas con sulfato de dextrano. La caída de la PIO probablemente fue consecuencia de la disolución de los elementos cicatriciales creados en la MT, ya que los niveles de laminina y fibronectina fueron significativamente inferiores en el ángulo de las ratas tratadas con sulfato de dextrano.

Las implicaciones clínicas de las observaciones son las siguientes. Los pacientes con glaucoma se tratan actualmente con gotas oculares diarias de fármacos que reducen la PIO indistintamente limitando la producción de fluido ocular o aumentando el flujo de salida del fluido ocular. Estos tratamientos presentan un cumplimiento terapéutico deficiente y, por consiguiente, la PIO se controla de manera imperfecta, lo que conduce a una pérdida de visión progresiva en la mayoría de los pacientes. Un tratamiento que revierta la patología ocular que conduce a la pérdida de visión y mejore significativamente el control de la PIO sería muy valioso. El sulfato de dextrano según las realizaciones permite tal tratamiento que conduce a PIO normalizada, preservación de las CGR y la CFNR y disolución de los elementos cicatriciales de la MT.

Material y procedimientos

Diseño del estudio

Se indujo glaucoma en ratas Sprague Dawley macho adultas mediante inyecciones intracamerales (IC) repetidas dos veces a la semana de factor de crecimiento transformante p (TGF-p) para aumentar la presión intraocular (PIO). Los aumentos constantes en la PIO (después de dos semanas) conducen a la muerte de las células ganglionares retinianas (30-40 %). El sulfato de dextrano (Tikomed AB, Suecia, WO 2016/076780) se administró a 15 mg/kg mediante inyección subcutánea diaria desde el inicio del experimento para evaluar la protección de las CGR en comparación con los controles.

Grupo 1 n = 12 ratas; 24 ojos PIO TGF-p IC (dos veces a la semana durante 28 días) entre el día 0 y el día 28 administración subcutánea diaria de sulfato de dextrano del día 14 al día 28.

Grupo 2 n = 8 ratas; 16 ojos PIO TGF-p IC (dos veces a la semana durante 28 días) entre el día 0 y el día 28 administración subcutánea diaria de vehículo (solución salina) del día 14 al día 28.

Grupo 3 n = 8 ratas; 8 ojos PIO intactos (ojo no lesionado) y 8 ojos PIO solución salina tamponada con fosfato (PBS) IC diariamente durante 28 días.

Variables medidas

• PIO dos veces a la semana durante todo el estudio, del día 0 al día 28;

• Inmunohistoquímica para contar las CGR que son inmunorreactivas para la proteína 3A de dominio homeobox/POU específica del cerebro (Brn3a) en el día 28 (supervivencia de las CGR);

• Inmunohistoquímica para detectar laminina y fibronectina para evaluar la formación de cicatrices en la malla trabecular en el día 28 en los Grupos 1 y 2; •

• Adquisición de imágenes del segmento anterior y TCO en el día 28 para examinar el ángulo y el espesor de la capa de fibras del nervio retiniano que comprende los axones de las CGR; y

• Peso corporal en el día 28.

Animales y cirugía

Se usaron dieciséis ratas Sprague Dawley macho de 8 a 10 semanas de edad y 175-200 g (Charles River, Kent, Reino Unido), alojadas con acceso libre a alimentos y agua con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad, para estos experimentos. La cirugía se realizó en la Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Birmingham según las directrices del Ministerio del Interior presentadas en la Ley sobre Animales de 1986 (Reino Unido) y la Declaración de la ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y de la Visión. Todos los procedimientos quirúrgicos oculares y las mediciones de la PIO se realizaron bajo anestesia inhalatoria usando 2-5 % de isofluorano/95 % de O²(National Vet Supplies, Stoke, Reino Unido) a un caudal de 1,5L/min. El bienestar posoperatorio de todas las ratas se supervisó estrechamente.

En el día 0, se realizó una incisión autosellante a través de la córnea hacia la cámara anterior de ambos ojos usando una cuchilla desechable de 15° que permitía inyecciones IC repetidas de 3,5 pl, dos veces a la semana (bisemanalmente, cada lunes y jueves), a través del túnel generado usando micropipetas de vidrio estériles y desechables de fabricación propia (Harvard Apparatus, Kent, Reino Unido) durante 28 días de TGF-p1 recombinante humano activo (5 ng/pl; Peprotech, Londres, Reino Unido).

Mediciones de la PIO

Usando un tonómetro de rebote iCare de Tonolab (Icare, Helsinki, Finlandia), se registró la PIO bisemanalmente de 9-11 de la mañana durante la duración de cada experimento para evitar confundir las lecturas con la variabilidad circadiana. Inmediatamente después de la inducción de la anestesia con 5 % de isoflurano, se tomaron seis mediciones de rebote de la córnea central con el tonómetro en cada ocasión de medición para proporcionar una medición de la PIO promedio total (mmHg) y todos los puntos de los datos gráficos representan la media ± EEM de 3 lecturas (de 6 rebotes cada una) tomadas secuencialmente para garantizar mediciones exactas.

Adquisición de imágenes de TCO y el segmento anterior

La tomografía de coherencia óptica permite la medición in vivo del espesor retiniano, siendo la CFNR una medida sustituta de la densidad de CGR. El análisis de la capa de fibras del nervio retiniano por TCO se realizó en el día 28 en todas las ratas bajo anestesia por inhalación usando un oftalmoscopio láser de barrido confocal Spectralis HRA3 (Heidelberg Engineering). Se tomaron imágenes del segmento anterior en el ángulo junto con imágenes de TCO de la retina en torno a la cabeza del nervio óptico. El software integrado se utilizó para segmentar las imágenes y cuantificar el espesor de la CFNR.

Preparación de tejidos para inmunohistoquímica (IHQ)

Las ratas fueron sacrificadas mediante exposición a concentraciones crecientes de CO²y perfundidas transcardialmente con 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar la sangre antes de la perfusión adicional con 100 ml de 4 % de paraformaldehído (PFA) en PBS a pH 7,4. Los ojos diseccionados para la IHQ se fijaron posteriormente mediante inmersión en 4 % de PFA en PBS durante 2 h a 4 °C antes de la crioprotección mediante inmersión en concentraciones crecientes de soluciones de sucrosa (PBS con 10 %, 20 % y 30 % de sucrosa; todas ellas de Sigma, Poole, Reino Unido) durante 24 h cada una a 4 °C, a continuación se incorporaron en un medio de inclusión de temperatura de corte óptima (Thermo Shandon, Runcorn, Reino Unido) en recipientes de moldes despegables (Agar Scientific, Essex, Reino Unido). Los ojos sumergidos en el medio de inclusión a la temperatura de corte óptima se congelaron rápidamente en hielo seco triturado antes de almacenarlos a -80 °C y posteriormente se seccionaron en el plano parasagital a través de la cabeza del nervio óptico a -22 °C usando un micrótomo de criostato Bright (Bright, Huntingdon, Reino Unido) a un espesor de 15 pm. Las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio cargados positivamente (Superfrost plus; Fisher Scientific, Pittsburgh, EE. UU.), se dejaron secar durante 2 h a 37 °C y se almacenaron a -20 °C.

Inmunohistoquímica

Las secciones congeladas se dejaron descongelar durante 30 min antes del lavado 3 * 5 min en PBS seguido de una permeabilización de 20 min con 0,1 % de Triton X-100 (Sigma). Las secciones se bloquearon durante 30 min en 0,5 % de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,3 % de Tween-20 (todos ellos de Sigma) en PBS y se incubaron durante la noche en anticuerpo primario (Tabla 1) antes del lavado 3 * 5 min en PBS y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente (TA; 20-25 °^c) con anticuerpo secundario (Tabla 1). Las secciones se lavaron a continuación 3 x 5 min en PBS y se montaron en medio de montaje Vectorshield que contenía 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories). Las secciones de tejido de control incubadas solo con anticuerpo secundario presentaron todas tinción negativa (no mostradas).

Tabla 1. Anticuer os usados en inmunohisto uímica.

*Proteína de unión a ARN con corte y empalme múltiple

Cuantificación de la inmunohistoquímica

Después de la tinción de inmunofluorescencia, las secciones se observaron en un microscopio epifluorescente Axioplan 2 de Zeiss (Carl Zeiss Ltd) y se capturaron imágenes usando los mismos tiempos de exposición para cada anticuerpo usando un AxioCam HRc de Zeiss. La IHQ se cuantificó según los procedimientos descritos anteriormente [1]. Brevemente, se definió la región de interés usada para la cuantificación de la fibrosis de la MT mediante un cuadrante del mismo tamaño prescrito para todos los ojos/tratamientos dentro de la MT, se cuantificó la deposición de MEC dentro de este cuadrante definido de la MT y se calculó el % de píxeles inmunofluorescentes por encima de un umbral de fondo estandarizado usando el software ImageJ (Institutos Nacionales de la Salud, EE. UU.). Para cada anticuerpo, el nivel umbral de brillo en el área de la MT se estableció usando secciones oculares intactas no tratadas para definir el nivel de referencia para el análisis de la intensidad de píxeles del grupo de ensayo. Se asignaron números aleatorios a las imágenes para garantizar el enmascaramiento de los grupos de tratamiento durante la cuantificación por parte del evaluador.

Para la cuantificación de las CGR en las secciones retinianas, se contaron las CGR RPBMS+/DAPI+ en las secciones parasagitales de retina de 15 pm de espesor a partir de una porción lineal de 250 pm de la capa de células ganglionares a cada lado del nervio óptico. Se cuantificaron cuatro secciones retinianas de cada ojo en los grupos de control y tratamiento. Se asignaron números aleatorios a las imágenes para garantizar el enmascaramiento de los grupos de tratamiento durante la cuantificación por parte del evaluador.

Estadísticas

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el SPSS 20 (IBM, EE. UU.). Se llevaron a cabo ensayos de distribución normal para determinar el análisis estadístico más apropiado para comparar los tratamientos. La significancia estadística se determinó en p < 0,05. Los datos de PIO, fibrosis de la MT y supervivencia de las CGR se ensayaron para detectar diferencias significativas usando la prueba t de Student o ANOVA de 1 vía para comparaciones de > 2 grupos ± EEM y se proporcionan en el texto o se presentan gráficamente como media ± EEM. EJEMPLO 2 - Investigación de los efectos vasculares del sulfato de dextrano en un modelo de ratón de degeneración macular neovascular asociada a la edad (DMAEn)

La angiogénesis patológica en el ojo puede conducir a discapacidad visual grave. Por consiguiente, los fármacos que inducen la neovascularización o mejoran las patologías neovasculares están claramente contraindicados.

El modelo de neovascularización coroidea (NVC) en ratones inducida por láser ha sido un modelo básico crucial para la investigación de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Provocando la lesión mediante láser dirigido al epitelio pigmentario retiniano (EPR) y la membrana de Bruch, el procedimiento induce la angiogénesis, lo que modela la patología característica observada en la DMAE. Desarrollado por primera vez en primates no humanos, el modelo de NVC inducida por láser se ha llegado a implementar en muchas otras especies, siendo la más reciente de ellas el ratón. El modelo se puede aplicar para estudiar muchos aspectos de la biología neovascular ocular, tales como los mecanismos moleculares, el efecto de las manipulaciones genéticas y los efectos del tratamiento farmacológico.

Resultados

Visualización de la membrana neovascular coroidea en la angiografía con fluoresceína del fondo del ojo

Los vasos sanguíneos retiñíanos se visualizaron claramente en la angiografía con fluoresceína del fondo del ojo. Las neovascularizaciones coroideas se presentaron como parches de hiperfluorescencia. La Figura 8 presenta imágenes representativas de la angiografía con fluoresceína de cada ratón. Hubo variaciones en el tamaño de la NVC en los diferentes ojos. Ocasionalmente, dos NVC se fusionaron con una pérdida intensiva de fluoresceína, estas se excluyeron de los análisis cuantitativos. El examen visual de las imágenes de angiografía con fluoresceína del fondo de ojo no presentó diferencias significativas en el tamaño de la NVC entre los dos grupos.

Análisis de la NVC

Se realizaron setenta y dos puntos de quemadura con láser en cada grupo. Las NVC que estaban fusionadas a partir de dos puntos láser o sobredimensionadas (> 100000 |jm2) debido a hemorragia subretiniana o inflamación grave se excluyeron del análisis final de los datos. La Tabla 2 resume el número de NVC incluidas en el análisis final de los datos.

T l 2. NV n r x rim n l

Cuantificación de la neovascularización usando isolectina B4

La isolectina B4 (lectina I-isolectina B4 de Griffonia simplicifolia) se ha usado como marcador para los vasos sanguíneos retinianos, ya que se expresa en las células endoteliales. También se expresa en la microglia activada y los macrófagos infiltrantes en la retina. El área positiva promedio de isolectina B4 fue 43972 ± 2302 jm 2 en el grupo de tratamiento con el compuesto de ensayo y 42432 ± 2015 jm 2 en el grupo de control con solución salina (Figura 9). No hubo una diferencia estadística entre los dos grupos en las lesiones lectina B4+.

Cuantificación del área de vasos sanguíneos nuevos usando colágeno IV

El colágeno IV forma la capa laminar de la matriz de los vasos sanguíneos. Por lo tanto, se ha usado para demostrar la presencia de vasos sanguíneos nuevos. En el grupo de tratamiento con sulfato de dextrano, la media del área de vasos sanguíneos nuevos fue 54681 ± 2378 jm 2, en comparación con 58215 ± 2293 jm 2 en el grupo de control de tratamiento con vehículo (solución salina) (Figura 10). No hubo una diferencia estadística significativa entre los dos grupos.

Conclusiones

Los resultados indican que el sulfato de dextrano no tiene efectos ni antiangiogénicos ni proangiogénicos sobre la NVC inducida por láser a la dosis de 0,6 mg/ml al día. Esto indica la aplicabilidad del sulfato de dextrano para indicaciones oculares.

Material y procedimientos

Ratones

Se adquirieron veinticuatro ratones C57BL/6J de 10 a 12 semanas de edad de la Unidad de Servicios Biológicos de la Queen's University de Belfast. Todos los ratones fueron alojados con acceso libre a una dieta de agua y alimento comercial para roedores y expuestos a un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad. Todos los procedimientos relativos al uso de animales en este estudio se realizaron según la Declaración de la Asociación para la Investigación Oftalmológica y de la Visión (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y de la Visión y bajo los reglamentos de la Ley sobre Animales (Procedimientos científicos) de 1986 (Reino Unido). El protocolo fue homologado por la Junta de Ética y Bienestar Animal de la Queen's University de Belfast.

Compuesto de ensayo

El compuesto de ensayo sulfato de dextrano (Tikomed AB, Suecia, WO 2016/076780) fue suministrado a una concentración de 6 mg/ml. Se usó solución salina estéril (adquirida de Aqupharm) para diluir el compuesto a la concentración de trabajo (0,6 mg/ml).

Inducción de NVC

Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 75 mg/kg de ketamina y 7,5 mg/kg de xilazina. Las pupilas se dilataron con 1 % de atropina y 2,5 % de fenilefrina (Bausch & Lomb). Para inducir la NVC, la ruptura del complejo membrana de Bruch-coroides se consiguió mediante fotocoagulación con láser usando el láser verde HGM Elite 532 (Litechnica Ltd, Middesex, Reino Unido) con el tamaño de punto de 100 |jm, 250 mW de potencia y 100 ms de duración. Los puntos láser se colocaron entre los vasos retinianos y a un diámetro de 2 a 3 discos de distancia del disco óptico. La formación de una burbuja en el lugar de aplicación del láser indica la ruptura adecuada de la membrana de Bruch. Solo se incluyeron en este estudio las quemaduras por láser en las que se produjo una burbuja. Además, se excluyeron del estudio las quemaduras por láser que presentaron hemorragia subrretiniana grave durante la inducción de la NVC. Se aplicaron tres quemaduras con láser a cada retina.

Administración del fármaco

Inmediatamente después de la inducción de la NVC, todos los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 500 j l de sulfato de dextrano o solución salina. La inyección se repitió una vez al día durante 9 días después de la inducción con láser de la NVC. Los tratamientos pormenorizados se presentan en la Tabla 3.

Tabla 3. Gru os ex erimentales

Angiografía fluorescente

En el día 10 después de la inducción de la NVC, se seleccionaron aleatoriamente 3 ratones de cada grupo para realizar la angiografía con fluoresceína del fondo del ojo. Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 75 mg/kg de ketamina y 7,5 mg/kg de xilazina. Las pupilas se dilataron con 1 % de atropina y 2,5 % de fenilefrina. Se inyectaron intraperitonealmente 100 j l de fluoresceína de sodio a 1 %. Las imágenes del fondo de ojo fueron capturadas usando el microscopio de adquisición de imágenes retinianas Micron IV (Phoenix Research Labs). Los ratones se sacrificaron después de la angiografía con fluoresceína y se recogieron los ojos.

Recogida de muestras

En el día 10 después de la inducción de la NVC, se sacrificaron todos los ratones y se retiraron cuidadosamente los ojos. Todos los ojos se fijaron en 2 % de paraformaldehído/PBS (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido) durante 2 h a temperatura ambiente y a continuación se lavaron y almacenaron en PBS a 4 °C. Los montajes completos de EPR-coroides-esclerótica se prepararon usando el protocolo descrito [2, 3]. Brevemente, se retiró el segmento anterior del ojo, que incluye la córnea, el cuerpo ciliar, el iris y el cristalino. Se realizaron cinco cortes verticales en la copa óptica y a continuación se retiró cuidadosamente el tejido retiniano. Los tejidos extraoculares, que incluyen la conjuntiva y los músculos oculares, se retiraron cuidadosamente de la copa óptica (que contiene EPR/coroides/esclerótica). Los montajes completos de EPR/coroides/esclerótica se procesaron adicionalmente para la Inmunotinción con lecitina I-isolectina B4 de Griffonia simplicifolia y colágeno IV.

Inmunotinción de los montajes completos de EPR/coroides/esclerótica

La NVC se detectó usando la ya consolidada técnica de marcado con isolectina B4 y colágeno IV. La isolectina B4 marca tanto los macrófagos infiltrantes como las células endoteliales vasculares. El colágeno IV marca la lámina basal de los vasos sanguíneos. Ambos marcadores se han usado ampliamente para detectar la NVC.

Los montajes completos de EPR/coroides/esclerótica se permeabilizaron con 0,5 % de Triton X-100/PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras se bloquearon a continuación con 10 % de BSA en 0,5 % de Triton X-100/PBS durante 1 h y se incubaron con lectina I-isolectina B4 de Griffonia simplicifolia (GSL Isolectina B4, 1:50, Vector Laboratories Ltd, Reino Unido) y colágeno IV (1:50, BIO-RAD, Reino Unido) biotinilados durante la noche a 4 °C. Después del lavado exhaustivo en PBS (10 minutos x 3), las muestras se incubaron con estreptavidina-isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:100, Vector Laboratories, Reino Unido) y AF594 de cabra anticonejo (1:100, Invitrogen, Reino Unido) durante dos horas a temperatura ambiente. Las muestras se montaron horizontalmente sobre portaobjetos de vidrio con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories Ltd, Reino Unido) y se observaron mediante microscopía fluorescente.

Adquisición y análisis de imágenes.

Se usó un microscopio fluorescente Leica para adquirir imágenes de las muestras de montaje completo de EPR-coroides/esclerótica preparadas anteriormente. Se usó una lente de objetivo 10x para permitir capturar toda el área de una NVC. Se usó el software de adquisición de imágenes ImageJ para analizar las imágenes. Para medir el tamaño de la NVC, se perfiló manualmente el borde de la NVC y se calculó automáticamente el tamaño usando el software Image J.

Análisis estadístico

Todos los datos (el tamaño de la NVC en cada grupo) se expresaron como media ± EEM. Se usó la prueba t de Student para comparar la diferencia entre el grupo de sulfato de dextrano y el grupo de control de solución salina. Diseño del estudio

En este estudio se usaron 24 ratones C57BL/6J (10-12 semanas de edad). Los ratones se aleatorizaron en dos grupos (12 ratones por grupo).

• Grupo 1: tratamiento con sulfato de dextrano (500 pl de 0,6 mg/ml de sulfato de dextrano en solución salina), inyección subcutánea, una vez al día después de la inducción de la NVC durante 9 días.

• Grupo 2: tratamiento con vehículo (500 pl de solución salina), inyección subcutánea, una vez al día después de la inducción de la NVC durante 9 días.

En el día 10 posterior a la inducción de la NVC, se seleccionaron aleatoriamente 3 ratones de cada grupo para realizar la angiografía con fluoresceína del fondo del ojo. Todos los ratones se sacrificaron en el día 10 después de la inducción de la NVC. Se recogieron y procesaron los ojos para realizar los estudios de inmunohistoquímica.

EJEMPLO 3 - Análisis de los cambios en la expresión genética inducidos por sulfato de dextrano en células de Schwann

Resultados

Análisis de la expresión de células de Schwann

Los genes no expresados en las células de Schwann se retiraron antes del análisis de los datos. El nivel de “expresión inferior” se estableció en 5 para los valores de expresión transformados a log2. Esto dejó 15842 sondas únicas que se debían analizar en los cultivos de células de Schwann. En la siguiente etapa del análisis, se analizaron tres conjuntos de datos (comparación del control D0 con las muestras de control D2; comparación del control D0 con las muestras tratadas con sulfato de dextrano D2; comparación del control D2 con las muestras tratadas con sulfato de dextrano D2) para determinar el efecto del MC sobre las células y los cambios relativos inducidos por el sulfato de dextrano.

Se expresaron diferencialmente 585 genes en cultivos de células de Schwann para la comparación del control D0 con las muestras de control D2. Las funciones moleculares afectadas por estos genes consisten en: movimiento celular (1,14E-07-2,49E-03); morfología celular (5,56E-07-2,36E-03); desarrollo celular (7,3E-06-2,48E-03); crecimiento y proliferación celular (7,3E-06-2,48E-03); montaje y organización celular (1,23E-05-2,36E-03); función y mantenimiento celular (1,23E-05-2,47E-03); muerte y supervivencia celular (1,53E-05-2,51E-03); metabolismo lipídico (8,14E-05-1,6E-03); bioquímica de las moléculas pequeñas (8,14E-05-1,6E-03); transporte molecular (1,18E-04-2,29E-03); tráfico de proteínas (1,62E-04-1,6E-03); metabolismo de los carbohidratos (3,22E-04-1,78E-03); expresión genética (3,98E-04-2,2E-03); señalización celular (4,39E-04-2,25E-03); señalización e interacción de célula a célula (5,05E-04-2,48E-03); compromiso celular (7,69E-04-1,58E-03); ciclo celular (1,12E-03-1,8E-03); metabolismo de los aminoácidos (1,6E-03-1,6E-03) y metabolismo de los ácidos nucleicos (1,6E-03-1,6E-03).

Los valores presentados anteriormente son valores p que representan la significancia estadística de la asociación de estos genes con las diferentes vías. Los dos valores de p representan los límites inferior y superior de la significancia estadística observada (p < 0,05 es significativo).

El sulfato de dextrano indujo la expresión diferencial en el cultivo de células de Schwann de 1244 genes según se evaluó al comparar el control D0 con las muestras tratadas con sulfato de dextrano D2. Las funciones moleculares afectadas por estos genes consisten en: morfología celular (1,43E-08-8,39E-04); movimiento celular (1,4E-07-9,6E-04); modificación postraduccional (3,93E-07-6,71E-05); síntesis de proteínas (3,93E-07-1,08E-04); tráfico de proteínas (3,93E-07-1,26E-06); muerte y supervivencia celular (2,13E-06-8,65E-04); ensamblaje y organización celular (7,46E-06-8,24E-04); replicación, recombinación y reparación del ADN (7,46E-06-7,46E-06); función y mantenimiento celular (9,53E-06-6,46E-04); expresión genética (1,27E-05-4,92E-04); desarrollo celular (1,29E-05-9,06E-04); crecimiento y proliferación celular (1,29E-05-9,06E-04); señalización e interacción de célula a célula (1,97E-05-8,81E-04); metabolismo de los aminoácidos (4,22E-05-8,24E-04); bioquímica de las moléculas pequeñas (4,22E-05-8,24E-04); metabolismo lipídico (4,81E-05-3,64E-04); transporte molecular (3,64E-04-3,64E-04) y ciclo celular (4,53E-04-4,86E-04).

El sulfato de dextrano indujo la expresión diferencial en el cultivo de células de Schwann de 700 genes según se evaluó al comparar el control D2 con las muestras tratadas con sulfato de dextrano D2. Las funciones moleculares afectadas por estos genes consisten en: morfología celular (1,49E-07-5,62E-03); ensamblaje y organización celular (1,49E-07-5,95E-03); movimiento celular (7,24E-07-6,06E-03); muerte y supervivencia celular (9,41E-06-5,95E-03); metabolismo de los aminoácidos (2,56E-05-3,7E-03); modificación postraduccional (2,56E-05-1,05E-03); bioquímica de las moléculas pequeñas (2,56E-05-3,7E-03); señalización e interacción de célula a célula (5,05E-05-5,76E-03); expresión genética (7,18E-05-4,94E-03); ciclo celular (1,06E-04-5,95E-03); desarrollo celular (1,06E-04-5,95E-03); función y mantenimiento celular (1,96E-04-5,95E-03); crecimiento y proliferación celular (2,35E-04-5,95E-03); replicación, recombinación y reparación del ADN (2,75E-04-5,95E-03); señalización celular (5,92E-04-2,54E-03); compromiso celular (6,26E-04-6,26E-04); metabolismo lipídico (6,26E-04-1,85E-03); transporte molecular (6,26E-04-5,95E-03); síntesis de proteínas (1,05E-03-1,93E-03); respuesta celular a los productos terapéuticos (1,85E-03-1,85E-03); tráfico de proteínas (2,66E-03-5,95E-03) y modificación postranscripcional del ARN (4,32E-03-4,32E-03).

El modelo mecanicista de la red molecular simula el efecto de las moléculas reguladas diferencialmente por el sulfato de dextrano, lo que permite evaluar las consecuencias funcionales de estos cambios. El modelo de simulación por ordenador indicó que el sulfato de dextrano inhibe la muerte celular neuronal, apoptosis y síntesis de proteínas y activa la angiogénesis; migración de células; viabilidad celular; supervivencia celular; movimiento celular; proliferación de células; diferenciación de células; homeostasis celular; progresión del ciclo celular; transformación celular y expresión del ARN.

La Tabla 4 resume los resultados de los cambios en la expresión genética en las células de Schwann cultivadas.

T l 4 - P r n n r l m i n l x r i n n i n l l hw nn

21 genes que tenían una expresión alterada en los cultivos de control en los dos días no presentaron ningún cambio en absoluto en los cultivos tratados con sulfato de dextrano durante los mismos dos días. 1 gen que presentaba una expresión aumentada en los cultivos de control se reguló negativamente en los cultivos tratados con sulfato de dextrano durante los mismos dos días. 13 genes que presentaban una regulación negativa en los cultivos de control se regularon positivamente en los cultivos tratados con sulfato de dextrano durante los mismos dos días. 122 genes presentaron una regulación significativamente negativa por los factores de crecimiento en el medio de cultivo y esta regulación negativa fue aún más fuerte en los cultivos tratados con sulfato de dextrano. 441 genes presentaron una regulación positiva en los cultivos de control y la adición de sulfato de dextrano hizo que esta regulación positiva fuera significativamente más fuerte.

Efecto del sulfato de dextrano sobre la adhesión celular

Uno de los efectos fenotípicos fuertes evidentes del sulfato de dextrano fue el efecto sobre la adhesión celular.

El análisis de la expresión genética indicó que esto es debido al efecto del sulfato de dextrano sobre la expresión de enzimas que regulan la fijación celular, lo que incluye las metalopeptidasas, también denominadas metaloproteinasas de la matriz (MMP), véase la Tabla 5.

El efecto conjunto de estas moléculas sobre las vías que regulan el movimiento y la fijación celular en las células de Schwann (17 moléculas, véase la Tabla 5) fue tal que inhibiría la adhesión celular, pero activaría el movimiento celular.

T l - M l l l ví r l l m vimi n l fi i n l l r n l l hw nn

Este hallazgo condujo a la reevaluación de todas las interacciones moleculares que afectan a la fijación celular y las moléculas relacionadas con la adhesión y su efecto sobre la fijación celular en células de Schwann. La lista completa de las 217 moléculas relacionadas con la fijación (197 genes y 20 fármacos) se presenta a continuación: ACE2, ACP1, ADAM15, ADGRB1, ADGRE2, ADIPOQ, AG490, AMBN, ANGPT1, ANTXR1, ARAP3, ARMS2, batimastat, BCAM, BCAP31, BCAR1, benciloxicarbonil-Leu-Leu-Leu-Leu-aldehído, BMP2, BMP4, BTC, C1QBP, Ca2+, CA9, CADM1, CALR, caliculina A, caspasa, CBL, CD209, CD36, CD44, CD46, CDH13, cerivastatina, cloranfenicol, sulfato de condroitina, CLEC4M, colchicina, colágeno tipo I, colágeno(s), COMP, CRK, CRP, CSF1, CSF2RB, CTGF, curcumina, CXCL12, AMP cíclico, DAB2, DAG1, DCN, DDR1, desferriexoquelina 772SM, DOCK2, DSG2, DSG4, durapatita, Efna, EFNA1, EFNB, EFNB1, EGF, EGFR, EGR1, EGN, ENG, EGR1 EP300, receptor de Eph, EPHA8, EPHB1, eptifibatida, ácido etilendiaminotetraacético, ETS1, F11R, F3, FBLN5, FBN1, receptor de Fc, FCN2, FERMT2, FES, FGF2, FGFR1, fibrina, FN1, quinasa de adhesión focal, FSH, FUT3, FUT6, FUT7, FYN, HACD1, heparina, histona h3, histona h4, HRAS, HSPG2, HTN1, ácido hialurónico, hidrocortisona, peróxido de hidrógeno, ICAM1, ICAM2, IGF1R, IgG, Igg3, IL1, IL1B, IL6, ILK, integrina, integrina alfa 4 beta 1, integrina, IPO9, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA5, ITGA6, ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB5, JAK2, Jnk, KP-SD-1, LAMC1, laminina, laminina 1, levotiroxina, LGALS3, LIF, lipopolisacárido, LOX, LRP1, LRPAP1, MAD1L1, manosa, MAPK7, MBL2, MERTK, metronidazol, MGAT5, MMP2, Mn2+ , NCK, NEDD9, NRG1, ácido okadaico, OLR1, P38 MAPK, PDGF BB, fosfatidilinositol, PKM, factor activador de plaquetas, PLD1, PLG, PMP22, PODXL, POSTN, PRKCD, PTAFR, PTEN, PTGER2, PTK2, PTK2B, PTN PTPN11, PTPRZ1, ditiocarbamato de pirrolidina, Rac, RALB, RANBP9, RHOA, RHOB, RPSA, SDC3, SELE, selectina, SELL, SEMA3A, simvastatina, SIRPA, SPARC, esfingosina-1-fosfato, SPI1, SPC1, SPRY2, SRC, STARD13 , SWAP70, TEK, TFPI, TFPI2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGM2, THBS2, THY1, hormona tiroidea, TIMP2, tirofibán, TLN1, TLN2, TNF, TP63, tretinoína, VAV1, VCAM1, VCAN, Vegf, VHL, VTN, VWF, y WRR-086.

De los 197 genes que regulan la fijación celular, 17 moléculas se expresaron diferencialmente en los cultivos de células de Schwann, lo que condujo a una fijación global ligeramente aumentada.

Los resultados son relevantes para un efecto anti formación de cicatrices del sulfato de dextrano (véase el EJEMPLO 1) reduciendo las señales de fibrosis tisular y la adhesión de células inmunes.

Rutas reguladoras en dirección 5’ afectadas por el sulfato de dextrano

En las células de Schwann, el análisis del regulador en dirección 5' reveló que el sulfato de dextrano modulaba el efecto de varios factores de crecimiento indistintamente aumentando su activación o reduciendo su inhibición en el sistema como se presenta en la Tabla 6.

T l - m r i n l r l r n ir i n ’ n l l hw nn

(continuación)

El sulfato de dextrano regula positivamente el gen de la decorina

Curiosamente, los datos de expresión genética demostraron que el sulfato de dextrano activaba la producción de una molécula natural reductora de las cicatrices denominada decorina, que bloquea además la producción de cicatrices “neutralizando” los factores de crecimiento que estimulan la producción de cicatrices por los fibroblastos.

La decorina es una glicoproteína de peso molecular promedio 90-140 kD. Pertenece a la familia de los pequeños proteoglucanos ricos en leucina (SLRP) y consiste en un núcleo de proteína que contiene repeticiones de leucina con una cadena de glucosaminoglucano (GAG) que consiste indistintamente en sulfato de condroitina o sulfato de dermatán. Se une a las fibrillas de colágeno tipo I a través de la región de unión al colágeno de la decorina tipo I. La decorina actúa como un antagonista del factor de crecimiento transformante beta 1/2 (TGF-p1/2) y reduce la formación de cicatrices. Los informes demuestran que, en la formación aguda de cicatrices, el efecto dominante de la decorina es antifibrogénico a través de la supresión de la fibrosis inflamatoria mediante neutralización del TGF-p1/2. La decorina también se une directamente al colágeno y una de sus funciones es influir en la organización del colágeno durante la cicatrización de heridas.

La decorina se ha descrito previamente en la inhibición de la formación de cicatrices en un modelo de lesión cerebral, hidrocefalia y heridas crónicas de la médula espinal. La decorina también induce la fibrólisis de las cicatrices existentes en la malla trabecular en un modelo de glaucoma.

El sulfato de dextrano indujo un aumento en la expresión de la decorina con un cambio de 1,242 veces.

Conclusiones

En las células de Schwann, los cultivos de control, con alto contenido de nutrientes y glucosa, recuerdan la activación de las células de Schwann. Los cultivos tratados con sulfato de dextrano imitaron el efecto del sulfato de dextrano añadido después de 24 horas de activación glial.

A partir de los resultados, resulta claro que los efectos moleculares observados en las células de Schwann respaldan un papel del sulfato de dextrano en la protección contra la apoptosis; la inducción de angiogénesis; la migración aumentada y el movimiento de las células; la viabilidad y supervivencia celular aumentadas y la inducción de la diferenciación celular.

El sulfato de dextrano favoreció el desprendimiento y movimiento celular en las células de Schwann. El efecto sobre la adhesión celular fue debido principalmente a la expresión de enzimas de tipo metaloproteinasa, pero la modulación de otras moléculas de adhesión también contribuyó a este efecto.

Este hallazgo también explicaría un efecto anti formación de cicatrices del sulfato de dextrano como se observa en el EJEMPLO 1. El resultado sugiere que el efecto anti formación de cicatrices observado en el EJEMPLO 1 está mediado por enzimas degradantes activadoras del sulfato de dextrano que ayudan a la remodelación tisular y bloquean las señales fibrogénicas (formación de cicatrices) en los tejidos dañados.

La formación de cicatrices como reacción patológica es impulsada por el TGF-p. El TGF-p induce una red interconectada grande de 171 moléculas que provocan la adhesión de las células inmunes, la activación de las células, el movimiento celular, la agregación de las células, la fibrosis y la inducción del TGF-p. La administración de sulfato de dextrano suprimió totalmente el efecto sobre la adhesión de las células inmunes, la activación de las células, la agregación de las células, la fibrosis y la autoactivación del TGF-p inducidas por el TGF-p. Estos efectos desactivadores del sulfato de dextrano sobre las redes moleculares impulsados por el TGF-p en las células de Schwann también se observan incluso cuando el TGF-p está activado, es decir, incluso en presencia de exceso de TGF-p.

El análisis de los reguladores de los genes regulados por el sulfato de dextrano en dirección 5' indicó que el sulfato de dextrano mejoraba el efecto de los factores de crecimiento existentes en las células, similar al efecto de la heparina. Una hipótesis es que el sulfato de dextrano se une a las moléculas del factor de crecimiento y facilita la unión a sus receptores.

Las acciones anti formación de cicatrices del sulfato de dextrano indican un uso potencial para tratar afecciones fibroproliferativas (formación de cicatrices), lo que incluye el glaucoma. Los resultados experimentales respaldan el papel del sulfato de dextrano tanto en la prevención del desarrollo de afecciones fibroproliferativas (formación de cicatrices) como en la resolución de cicatrices fibróticas ya existentes en tales afecciones fibroproliferativas (formación de cicatrices).

Por tanto, el sulfato de dextrano que tiene un efecto anti formación de cicatrices sería efectivo en la remodelación tisular, en la que hay una necesidad de disolver las cicatrices ya existentes. Se cree que este efecto anti formación de cicatrices del sulfato de dextrano es una consecuencia de los mecanismos de acción del sulfato de dextrano descritos anteriormente, que incluyen, por ejemplo, la inhibición de la adhesión celular, la inducción de la movilización celular, la inducción de metaloproteasas y enzimas que disuelven las cicatrices y la inhibición del TGF-p, en particular el TGF-p1, a través de la inducción de la decorina. Este último efecto obtenido con el sulfato de dextrano es adicionalmente relevante en la prevención, o al menos inhibición, de la fibrosis y formación de cicatrices a través de la inducción de la decorina.

Material y procedimientos

Diseño experimental

Se prepararon n = 8 x 25 cm²matraces de cultivo. Se recogieron dos matraces en el día del tratamiento (24 horas después de la siembra). Esto representa el momento Día0. De los matraces restantes, tres matraces se trataron con medio de control y tres se trataron con medio de cultivo (MC) que contenía sulfato de dextrano para proporcionar una concentración final de 0,01 mg/ml. Las células de los matraces tratados se recogieron después de 48 horas. Por lo tanto, los datos recopilados representan (a) células no tratadas (controles del Día0 y controles del Día2) y (b) células tratadas con sulfato de dextrano durante 48 horas (tratadas con sulfato de dextrano el Día2).

Revestimiento de las placas de cultivo tisular para todas las células

Se revistieron matraces de 25 cm²añadiendo 2 ml por matraz de una solución de 50 pg/ml de poli-d-lisina en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) e incubando durante la noche a 37 °C en la oscuridad. Los matraces se lavaron con agua del cultivo celular y se secaron al aire durante 30 min en la oscuridad. Los matraces se revistieron añadiendo 1 ml por matraz de una solución de 25 pg/ml de laminina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubando durante 2 horas a 37 °C en la oscuridad. Los matraces de laminina se lavaron con PBS tres veces antes de emplatar las células.

Células de Schwann humanas

El medio de crecimiento de las células de Schwann se preparó añadiendo 10 % de suero fetal bovino (FBS) a DMEM con alto contenido de glucosa y precalentado a 37 °C. Las células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C durante un máximo de 2 min.

Las células de 12 viales se transfirieron cuidadosamente a un tubo que contenía 10 ml de medio DMEM con alto contenido de glucosa y se centrifugaron a 400 campos centrífugos relativos (CCR) durante 10 min. El sedimento se resuspendió en medio de cultivo. Las células de los 12 viales se mezclaron y se distribuyeron equitativamente en los matraces de 25 cm²revestidos previamente (n = 8). Las células se incubaron a 37 °C con 5 % de CO². Las células se dejaron asentar durante 24 horas antes del tratamiento con sulfato de dextrano.

Tratamiento con fármaco

El sulfato de dextrano (Tikomed AB, Suecia, WO 2016/076780) se proporcionó a una concentración de solución madre de 20 mg/ml y se mantuvo en un refrigerador de temperatura controlada a 4 °C. Se preparó una solución madre fresca de sulfato de dextrano 100X (1,0 mg/ml) en DMEM-F12 estéril. La solución madre de fármaco concentrado se filtró de forma estéril y se añadió a los medios de cultivo respectivos (19,6 ml de MC y 0,4 ml de solución madre de sulfato de dextrano). El control se preparó usando 19,6 ml de MC y 0,4 ml de DMEM-F12. El sulfato de dextrano y el MC se añadieron a los matraces respectivos (5 ml cada uno) para alcanzar la concentración de 0,01 mg/ml de sulfato de dextrano en cada placa con un total de 10 ml de MC en cada una.

Recogida del cultivo y lisis celular.

El MC se aspiró a un tubo Falcon de 15 ml limpio y etiquetado. Los matraces (sin medio de cultivo) se colocaron en el congelador a -80 °C durante 30 minutos. El MC de los tubos Falcon se centrifugó a 3000 * g durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se volvió a suspender el pequeño sedimento en 2,5 ml de solución de Trizol: agua (4:1) a temperatura ambiente (TA, ~22 °C).

Los matraces congelados se retiraron uno a uno del congelador y el Trizol-agua de los tubos apropiados se transfirió al matraz. Los matraces se dejaron a TA durante 5 minutos antes de volver a aspirar el contenido al tubo Falcon de 15 ml (después de lavar exhaustivamente el fondo del matraz con la solución). Los matraces se inspeccionaron al microscopio para garantizar la retirada completa de las células. Los lisados recogidos en los tubos Falcon de 15 ml se colocaron en el congelador a -80 °C.

Extracción del ARN

[0173]Los tubos Falcon que contenían los homogeneizados se retiraron del congelador y se almacenaron durante 5 minutos a TA para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína.

Se retiraron dos alícuotas de lisado de 1 ml de cada muestra y se añadieron 200 pl de cloroformo a cada una (0,2 ml de cloroformo por 1 ml de reactivo Trizol usado durante la etapa de lisis celular) y se agitó el tubo enérgicamente. Las muestras se almacenaron a TA durante 2-3 minutos y posteriormente se centrifugaron a 12000 * g durante 15 minutos a 4 °C.

La mezcla se separó en tres capas: una fase inferior roja de fenol-cloroformo, una interfase y una fase acuosa superior incolora. El ARN permaneció en la fase acuosa superior, el ADN en la fase media blanca (interfase) y la proteína en la fase inferior rosada (orgánica). Los % superiores de la fase acuosa se transfirieron a un nuevo tubo Eppendorf limpio.

El ARN se precipitó de la fase acuosa añadiendo una cantidad igual de etanol a 100 %. El ARN precipitado se fijó en un cartucho giratorio, se lavó dos veces y se secó. El ARN se eluyó en 50 pl de agua caliente exenta de ARNasa. La cantidad y calidad del ARN purificado se midió mediante Nanodrop. El ARN se almacenó a -80 °C antes de transferirlo a Source Bioscience para el análisis de las matrices.

Plan de análisis para los datos de expresión

Los datos de expresión se descargaron en archivos individuales para cada línea celular. La expresión “corregida con la señal de fondo” consiste en los datos de la “señal procesada” de las matrices que es el resultado de la extracción de la señal de fondo de la señal real de la sonda relevante. Esta es la variable usada más frecuentemente en el análisis de matrices. La señal corregida con la señal de fondo se transformó a log2 para todas las muestras para realizar el análisis estadístico. Para reducir la tasa de descubrimientos falsos en las muestras, se retiraron las señales que estaban por debajo del “nivel de expresión”. El nivel de “expresión inferior” se estableció en 5 para los valores de expresión transformados a log2.

Análisis estadístico

En función del patrón de expresión de las sondas de control en cada matriz, se decidió llevar a cabo el centrado en la mediana para todas las matrices antes del análisis para reducir la variabilidad de los resultados. Los datos se analizaron usando los siguientes algoritmos:

• Comparación del control D0 con las muestras de control D2: cambios de expresión observados en las células en cultivos normales

• Comparación del control D0 con las muestras tratadas con sulfato de dextrano D2: cambios de expresión observados en las células en los cultivos tratados con sulfato de dextrano

• Comparación del control D2 con las muestras tratadas con sulfato de dextrano D2: expresión diferencial inducida por el sulfato de dextrano en el cultivo.

Se llevó a cabo un análisis preliminar para cribar los genes que no se expresaban diferencialmente entre cualquier combinación de los tres conjuntos de datos. Se llevó a cabo un ANOVA sencillo y no estricto (p < 0,05) para buscar patrones de expresión. Se eliminaron las sondas sin cambios en los tres conjuntos de datos. Los conjuntos de sondas restantes se analizaron para determinar el cambio en veces y la significancia usando gráficos de Volcano. El cambio de más de 20 % en la expresión de una sonda (FC > 1,2 o FC < 0,84) se consideró significativo en primera instancia para permitir la detección de los patrones de expresión.

Parámetros de calidad

Las densidades de siembra se calcularon a partir de los recuentos celulares recuperados de las soluciones madre de células para las células de Schwann.

El control de calidad adicional del proveedor de servicios Array indicó que el ARN era de alta calidad (sin degradación) y que las cantidades estaban dentro de los parámetros de la micromatriz con baja concentración de ARN de Agilent. El análisis de los datos sin procesar indicó que, como era de esperar, había diferencias significativas entre las matrices. Sin embargo, estas diferencias (reflejadas por las diferencias en las mismas muestras de control incluidas en todas las matrices) se eliminaron fácilmente mediante técnicas de normalización. El centrado en la mediana de los datos elegido que elimina la variación de matriz a matriz no afectó a las diferencias generales que se esperaba ver entre los controles que representaban concentraciones diferentes de ARN.

BIBLIOGRAFÍA

[1] Hill et al., Decorin reduces intraocular pressure and retinal ganglion cell loss in rodents through fibrolysis of the scarred trabecular meshwork. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015, 56(6): 3743-37572

[2] Chen et al., RAGE regulates immune cell infiltration and angiogenesis in choroidal neovascularization. Plos One.

2014, 9(2): e89548

[3] Chen et al., Age- and light- dependent development of localised retinal atrophy in CCL2 (-/-) CX3CR1 (GFP/GFP) mice. Plos One. 2013, 8(4): e61381

Claims

REIVINDICACIONES

1. Sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma en un sujeto.

2. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención del glaucoma de ángulo abierto, preferentemente glaucoma primario de ángulo abierto, en dicho sujeto.

3. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da para uso en la reducción de la presión intraocular en un sujeto que padece glaucoma.

4. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 3, para uso en la reducción de la presión intraocular para que esté dentro de un intervalo normal de presión intraocular de 10 mmHg a 20 mmHg.

5. Sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da para uso en el tratamiento, la inhibición o la prevención de la hipertensión ocular en un sujeto.

6. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 5, donde dicho sujeto padece hipertensión ocular causada por glaucoma.

7. Sulfato de dextrano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 10000 Da para uso en la inhibición de la pérdida de células ganglionares retinianas y la reducción de la capa de fibras del nervio retiniano en un sujeto que padece glaucoma, preferentemente glaucoma de ángulo abierto y/o hipertensión ocular.

8. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 3, 4, 6 o 7, donde dicho sujeto padece glaucoma de ángulo abierto, preferentemente glaucoma primario de ángulo abierto.

9. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración sistémica a dicho sujeto.

10. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 9, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado para la administración intravenosa o subcutánea a dicho sujeto, preferentemente formulado para la administración subcutánea a dicho sujeto.

11. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicho peso molecular promedio está dentro de un intervalo de 2000 a 10000 Da, preferentemente dentro de un intervalo de 3000 a 10000 Da y más preferentemente dentro de un intervalo de 3500 a 9500 Da, como dentro de un intervalo de 4500 a 7500 Da, preferentemente dentro de un intervalo de 4500 a 5500 Da.

12. Sulfato de dextrano o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un contenido promedio de azufre en un intervalo de 15 a 20 %, preferentemente 17 %.

13. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un peso molecular medio numérico (Mⁿ), como se mide mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), dentro de un intervalo de 1850 a 3500 Da, preferentemente dentro de un intervalo de 1850 a 2500 Da y más preferentemente dentro de un intervalo de 1850 a 2300 Da.

14. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 13, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un Mⁿ, como se mide mediante espectroscopía de RMN, dentro de un intervalo de 1850 a 2000 Da.

15. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según la reivindicación 13 o 14, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un número promedio de sulfato por unidad de glucosa dentro de un intervalo de 2,5 a 3,0, preferentemente dentro de un intervalo de 2,5 a 2,8 y más preferentemente dentro de un intervalo de 2,6 a 2,7.

16. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene en promedio 5,1 unidades de glucosa y un número promedio de sulfato por unidad de glucosa de 2,6 a 2,7.

17. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está formulado como una solución acuosa para inyección.

18. Sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo es una sal sódica de sulfato de dextrano.