ES2780526T3

ES2780526T3 - Transformación estable de una población y un procedimiento de biocontención utilizando principios de haploinsuficiencia y subdominancia

Info

Publication number: ES2780526T3
Application number: ES13814963T
Authority: ES
Inventors: Guy Reeves; Floyd Reed
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2020-08-26
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: EP2934093A1; HUE048642T2; US20150373937A1; EP2934093B1; PL2934093T3; GB201223097D0; US20200093084A1; US12031139B2; WO2014096428A1; DK2934093T3

Abstract

Procedimiento de reducción de la aptitud competitiva de un organismo eucariota hemicigótico para un locus transgénico en comparación con el organismo eucariota homocigótico para el locus transgénico, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; y (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, dando un organismo que es menos apto competitivamente si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para el locus transgénico.

Description

DESCRIPCIÓN

Transformación estable de una población y un procedimiento de biocontención utilizando principios de haploinsuficiencia y subdominancia

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo eucariota hemicigótico para un locus transgénico en comparación con el organismo eucariota homocigótico para el locus transgénico, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; y (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, lo que produce un organismo que es menos apto competitivamente si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para el locus transgénico. Se prevén además los correspondientes sistemas genéticos, usos de los mismos y organismos genéticamente modificados.

Antecedentes de la invención

La subdominancia genética surge cuando los heterocigotos o hemicigotos tienen una aptitud inferior a los homocigotos. Históricamente, se han propuesto una serie de aplicaciones que explotan la subdominancia genética, e incluyen (i) la Biocontención: limitar la introgresión involuntaria entre organismos con reproducción sexual en el entorno, (ii) Transformación de la población: para llevar a una alta frecuencia genes convenientes en poblaciones silvestres de organismos con reproducción sexual y (iii) Supresión del tamaño de las poblaciones de plagas silvestres: se pueden utilizar liberaciones artificiales de grandes cantidades de homocigotos durante varias generaciones para reducir el tamaño de la próxima generación de la población silvestre. La generación de locus transgénicos que son subdominantes, que permitiría la implementación de estos enfoques, técnicamente representa un reto y debe lograrse de una manera que permita la flexibilidad para ser utilizada en una amplia gama de aplicaciones y especies.

La explotación de la subdominancia en la biocontención se ha considerado principalmente en el contexto de limitar la introgresión accidental de transgenes de variedades de plantas genéticamente modificadas en parientes silvestres u otras variedades de cultivares (véase, por ejemplo, http://www.isb.vt.edu/articles/feb0603.htm). Solo se ha implementado un subdominante, sin embargo, este enfoque es inflexible, estando limitado a especies de Brassica y siendo dependiente de genes no identificados distribuidos por todo el genoma. Se han previsto o implementado una serie de otros enfoques de biocontención que no dependen de la subdominancia, sin embargo, el valor aplicado de todos estos enfoques aún debe probarse en aplicaciones comerciales. Existe una gran necesidad de desarrollar mecanismos flexibles de biocontención que no afecten significativamente el valor agronómico de las variedades vegetales (Plant gene containment. 224 (Wiley-Blackwel: 2012). Esta necesidad es principalmente importante para tres aplicaciones, (1) los ensayos de campo de nuevas plantas experimentales, (2) facilitar la producción comercial de semillas no contaminadas por los proveedores y (3) la plantación comercial de plantas genéticamente modificadas fuera de los invernaderos.

La explotación de la subdominancia en la transformación de poblaciones (también denominado reemplazo de poblaciones) fue propuesta por Curtis en 1968, (Nature 218, 368-69 (1968)). En esta publicación científica, Curtis utilizó el ejemplo de la subdominancia para mostrar cómo los genes de insensibilidad a enfermedades podrían ser conducidos de manera sostenible a altas frecuencias en poblaciones silvestres (incluso si no son selectivamente ventajosos) a través de la liberación de estirpes subdominantes homocigóticas de la misma especie. Se preveía que los genes que hacían a los insectos resistentes a la propagación de enfermedades a los seres humanos, el ganado y las plantas podrían ser conducidos a la población silvestre, donde podrían permanecer de manera autosuficiente. Se han propuesto una serie de enfoques para lograr la transformación de la población que puede describirse como subdominante, pero aún no se han implementado (por ejemplo, Davis y col. Journal of theoretical biology, 212, 83-98 (2001); y Marshall y Hay, The Journal of heredity, 102, 336-41 (2011)). Se han implementado enfoques alternativos que no se describen como dependientes de una subdominancia en poblaciones de insectos de laboratorio, pero ninguno se ha probado en poblaciones silvestres (por ejemplo, Chen y col., Science 316, 597 (2007) y Windbichler y col., Nature (2011); doi:10.1038/nature09937). Por lo tanto, existe una clara necesidad de desarrollar y mejorar sistemas de transformación poblaciones, que podrían utilizarse para controlar enfermedades, ya que es poco probable que un único sistema tenga propiedades ideales para toda la muy amplia gama de aplicaciones potenciales. De particular valor sería el desarrollo de sistemas que puedan transferirse fácilmente entre especies.

La explotación de la subdominancia en la transformación de poblaciones ha estado en desarrollo desde los años 40. Si la progenie hemicigótica es parcialmente inviable o infértil, entonces la liberación a gran escala de la estirpe homocigótica apropiado puede utilizarse para reducir el tamaño de la siguiente generación de la población silvestre. Se hizo un esfuerzo considerable entre 1960 y 1980 para desarrollar estirpes subdominantes apropiadas en una amplia gama de especies, utilizando reordenamientos cromosómicos inducidos por radiación (Asman y col., Annual Review of Entomology 26, 289-318 (1981). Sin embargo, este enfoque para generar estirpes subdominantes demostró ser inflexible y solo marginalmente eficaz, y fue en gran parte abandonado. En la actualidad, las poblaciones silvestres de plagas de insectos se suprimen utilizando la liberación masiva de individuos esterilizados por radiación como parte de la 'técnica de insectos estériles' en numerosos programas de supresión de plagas por todo el mundo (Dyck y col., Sterile Insect Technique. 760; Springer-Verlag: Berlín/Heidelberg, 2005). A pesar del éxito de este enfoque, existe una serie de limitaciones en términos de eficacia o de enfoques basados en radiación que podrían abordarse utilizando estirpes transgénicas. Estas incluyen la reducción de los costos de producción de un gran número de individuos para su liberación, particularmente si se requiere clasificación por sexo, y las posibles mejoras en la aptitud competitiva de los individuos liberados. Esto condujo al desarrollo de un pequeño número de sistemas que podrían utilizarse en la supresión de poblaciones de insectos (por ejemplo, Windbichler y col., PLoS genetics 4, (2008) y Fu y col., Nature 23, 453-456 (2005)). Sin embargo, todavía existe una clara necesidad de desarrollar y mejorar aún más los sistemas de supresión de poblaciones, ya que es poco probable que un solo sistema tenga propiedades ideales para la amplia gama de aplicaciones potenciales que podrían ser útiles. De particular valor sería el desarrollo de sistemas adicionales que puedan transferirse fácilmente entre especies.

Objetos y sumario de la invención

La presente invención aborda esta necesidad y proporciona medios y procedimientos, que permiten la reducción de la aptitud competitiva de un organismo eucariota hemicigótico para un locus transgénico en comparación con el organismo eucariota homocigótico para el locus transgénico, con la condición de que el organismo no sea un ser humano. Este objetivo se logra mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; y (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, lo que produce un organismo que es menos apto competitivamente si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para el locus transgénico.

Este tipo alternativo de sistema de subdominancia basado en haploinsuficiencia que está contenida dentro de un solo locus o región génica puede recombinarse con distintos acervos genéticos y no afecta la estructura cromosómica. Sorprendentemente, el homocigoto transgénico tiene una aptitud lo suficientemente alta con respecto a los homocigotos y hemicigotos de tipo silvestre para efectos subdominantes con una dinámica robusta. Como desvela la presente descripción, tal sistema de subdominancia basado en haploinsuficiencia permite transformar de manera eficaz y estable las poblaciones de organismos con reproducción sexual.

La metodología de subdominancia proporcionada ofrece varias ventajas y tiene una amplia gama de usos potenciales, lo cual se ve facilitado por la medida en que puede utilizarse en una variedad de especies. La metodología puede, por ejemplo, utilizarse para la biocontención para limitar la propagación de genes genéticamente modificados en cultivos tradicionales o especies silvestres relacionadas. Se describe además que la metodología de subdominancia se puede utilizar como parte de una estrategia de transformación de poblaciones para volver poblaciones de insectos que son vectores de enfermedades humanas, ganaderas o vegetales resistentes a la transmisión de enfermedades. Adicionalmente, el concepto puede aplicarse a vectores de enfermedades que no son insectos y a enfermedades que afectan a otras especies, por ejemplo, especies en peligro de extinción amenazadas por enfermedades y vectores no nativos (Warner, R. E., 1968, Condor 70:101-120). La subdominancia se puede combinar adicionalmente con sistemas dirigidos por genes diseñados técnicamente para mejorar sus propiedades en términos de seguridad y reversibilidad. Se desvela adicionalmente que el uso de la subdominancia para transformar una población significa que la transformación es potencialmente reversible en una amplia gama de circunstancias realistas. Por lo tanto, las liberaciones de individuos que portan el alelo de tipo silvestre alternativo en el locus transgénico en cantidades suficientes pueden volver a cruzar el umbral de la frecuencia del alelo y se espera que el alelo transgénico se elimine por completo de la población durante las siguientes generaciones, junto con genes efectores ligados. Por lo tanto, si se desea, la población puede regresar teóricamente a un estado de tipo completamente silvestre. Adicionalmente, se espera que las poblaciones transformadas de acuerdo con la metodología de subdominancia descrita actualmente sean geográficamente estables. Los migrantes raros, tanto dentro como fuera de una región transformada, tenderá a tener descendencia hemicigótica con una aptitud reducida. En consecuencia, los alelos migrantes tenderán a ser eliminados por selección natural y, si las tasas de migración son suficientemente bajas (Altrock y col., 2010, Journal of Theoretical Biology 267:62-75), no se espera que una construcción transgénica se propague sin control de una población a otra. Se desvela adicionalmente que la metodología de subdominancia se puede utilizar para mejorar la eficacia de las técnicas de supresión de poblaciones, lo que puede utilizarse para facilitar la transformación de poblaciones al reducir el tamaño de la población silvestre diana.

La presente descripción desvela además que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de liberar un organismo transgénico obtenido en la etapa (b) en una población de la misma especie, de forma que se establezca una construcción transgénica a una frecuencia alta en un locus en la población.

La presente descripción desvela además que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de utilizar un organismo transgénico obtenido en la etapa (b) en un entorno que comprende individuos del organismo de tipo silvestre con reproducción sexual de otro modo interfértiles, por lo que se reduce la aptitud competitiva de la progenie hemicigótica.

En un ejemplo adicional, la invención desvela un procedimiento para la transformación de una población de organismos de reproducción sexual, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, y (c) liberar organismos homocigóticos obtenidos en la etapa anterior en una población de la misma especie, de forma que el locus transgénico se establezca con una frecuencia alta en la población.

La presente descripción desvela además que dicha etapa de liberación comprende la liberación, en una única generación o a lo largo de múltiples generaciones, de cantidades relativas suficientes de organismos para dar como resultado una frecuencia en la población de la misma especie mayor que la frecuencia de equilibrio alélico inestable predicha por la aptitud competitiva.

Además, se desvela un procedimiento para disminuir la introgresión de un locus transgénico en un organismo en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo; y (c) utilizar un organismo transgénico obtenido en la etapa (b) en un entorno que comprende individuos del organismo de tipo silvestre con reproducción sexual de otro modo interfértiles, en el que se reduce la aptitud competitiva de la progenie hemicigótica, disminuyendo de este modo la tasa de reproducción sexual y/o la viabilidad de la progenie hemicigótica.

La presente descripción desvela además un procedimiento para la reducción del tamaño de poblaciones silvestres de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, y (c) utilizar un organismo transgénico hemicigótico obtenido en la etapa (b) o una mezcla de organismos transgénicos homocigóticos y hemicigóticos obtenidos en la etapa (b) en un entorno que comprende individuos del organismo de tipo silvestres con reproducción sexual de otro modo interfértiles, en el que se reduce la aptitud competitiva de la progenie hemicigótica, disminuyendo de este modo la tasa de reproducción sexual y/o la viabilidad de la progenie hemicigótica.

En una realización preferente de los procedimientos como se definen anteriormente en el presente documento, dicha aptitud competitiva reducida en la progenie hemicigótica es la no viabilidad y/o la no fertilidad del organismo.

La presente descripción desvela además que dicha disminución de la introgresión de un locus transgénico en un organismo como se menciona anteriormente en el presente documento es una prevención de la introgresión de un locus transgénico y en la que la reducción de la aptitud competitiva de una progenie hemicigótica elimina o limita la reproducción sexual de la progenie hemicigótica.

En una realización preferente adicional, dicha reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente comprende la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente.

En otra realización preferente más, dicho agente que degrada o que inactiva específicamente comprende un ARNip, miARN, una molécula de ARN antisentido, una molécula de ADN antisentido o un agente que media la metilación de ADN dirigida por ARN.

En otra realización preferente, dicho medio, que altera específicamente dicha secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, es una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN, forma siglada de Transcription Activator-Like Effector Nuclease), CRISPR o una meganucleasa.

En una realización preferente adicional, dicho rescate de la expresión de un gen haploinsuficiente comprende una modificación de la secuencia génica haploinsuficiente. En una realización específica, el gen haploinsuficiente modificado puede basarse en una secuencia ortóloga o paráloga. Dicha modificación del gen haploinsuficiente comprende preferentemente la proporción de un rescate al menos parcial a un medio, que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente; o el uso de una secuencia de ortóloga o paráloga.

En una realización preferente adicional, dicho locus transgénico comprende una construcción subdominante. Dicha construcción subdominante comprende preferentemente una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente.

En una realización preferente adicional, un procedimiento de la invención comprende la transformación del organismo con una construcción subdominante que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. En una realización particularmente preferente, dicha construcción subdominante comprende una secuencia que conduce a la proporción de ARNsi, miARN o una molécula de ARN o ADN antisentido, o la expresión de nucleasas de dedos de zinc, una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN, forma siglada de Transcription Activator-Like EffectorNuclease), CRISPR (forma siglada de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares) o una actividad de meganucleasa.

En otra realización preferente más, dicha secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, comprende secuencias alterantes flanqueadas por sitios de reconocimiento específico de sitio para una recombinasa, preferentemente Cre o FLP, lo que permite volver a dicha secuencia, que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, inactiva.

En otra realización preferente más, dicha secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, se inactiva por la exposición in vivo de dicha recombinasa, preferentemente Cre o FLP.

En una realización preferente adicional, dicha construcción subdominante comprende adicionalmente una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente.

En otra realización preferente más, dicho procedimiento comprende la transformación inicial del organismo con una construcción transgénica independiente que comprende una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, seguido de la transformación del organismo con una construcción subdominante que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente y un gen haploinsuficiente que comprende la proporción de un rescate al menos parcial a un medio que degrada o inactiva específicamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente.

En otra realización preferente, el procedimiento de la invención comprende la cotransformación del organismo con una construcción transgénica independiente que comprende una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente al medio por el cual una construcción subdominante dada degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, y con una construcción subdominante que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente y un gen haploinsuficiente que comprende la proporción de un rescate al menos parcial a un medio que degrada o inactiva específicamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. El procedimiento puede comprender adicionalmente las etapas de obtención de organismos homocigóticos para dicha construcción infradominante; y de eliminación de dicha construcción transgénica independiente por recombinación o segregación cromosómica.

En otra realización preferente más, la expresión de más de un gen haploinsuficiente del organismo puede reducirse y rescatarse en el organismo. Dicha reducción y rescate de la expresión de un gen haploinsuficiente pueden ser transportadas preferentemente por un solo locus transgénico en el organismo o por múltiples locus transgénicos en el organismo. En una realización adicional, dicha reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente puede ser transportada por múltiples locus transgénicos y dicho rescate de la expresión de un gen haploinsuficiente puede ser transportada por un solo locus transgénico.

En una realización preferente adicional, dicha reducción y rescate de la expresión de dos o más genes haploinsuficientes puede ser transportada por locus transgénicos entrecruzados funcionalmente. Preferentemente, dicho locus funcionalmente ligado comprende un medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente de un primer gen haploinsuficiente, y un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de un segundo gen haploinsuficiente en un primer locus transgénico; y un medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente de un segundo gen haploinsuficiente, y un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de un primer gen haploinsuficiente en un segundo locus transgénico.

En otra realización preferente más, dicha reducción de la expresión de dos o más genes haploinsuficientes es transportada por un locus transgénico y en el que dicho rescate de la expresión de dos o más genes haploinsuficientes es transportado por dos o más locus transgénicos, en los que dichos locus transgénicos están funcionalmente ligados.

En un ejemplo, el procedimiento comprende la etapa de introducir adicionalmente en el organismo una construcción de transformación de la población mecanísticamente distinta.

Es preferente que una construcción subdominante como se menciona anteriormente en el presente documento comprenda adicionalmente un gen efector. Dicho gen efector puede seleccionarse preferentemente del grupo que comprende un gen de insensibilidad al virus del dengue, un gen de insensibilidad a la malaria humana, un gen de insensibilidad a la malaria aviar, un gen de insensibilidad al virus del bronceado del tomate, un gen de resistencia a herbicidas, un gen insecticida, un gen de resistencia a la sequía, un gen de resistencia a nematodos parásitos y un gen que produce un rendimiento mejorado de la planta.

En un aspecto adicional, La presente invención se refiere a un sistema genético para transformación que comprende los siguientes componentes: (a) un medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente; y (b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente, en el que el sistema genético se proporciona como una entidad de transformación única y en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico.

En una realización preferente, dicho medio para reducir específicamente la expresión de dicho gen haploinsuficiente degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente.

En otra realización preferente de la presente invención, dicho medio que degrada o inactiva específicamente comprende un ARNip, miARN, una molécula de ARN antisentido, una molécula de ADN antisentido o un agente que media la metilación de ADN dirigida por ARN.

En otra realización preferente del sistema genético, dichos medio, que altera específicamente dicha secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, es una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN, forma siglada de Transcription Activator-Like Effector Nuclease), CRISPR o una meganucleasa.

En una realización preferente adicional del sistema genético, dicho agente de rescate es una versión modificada de dicha secuencia génica haploinsuficiente. Preferentemente, dicha versión modificada de dicha secuencia génica haploinsuficiente es resistente a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. Adicionalmente, se prefiere que dicho agente de rescate comprenda adicionalmente un gen efector. En otra realización preferente del sistema genético de acuerdo con la presente invención, dicho gen efector se selecciona del grupo de un gen de insensibilidad al virus del dengue, un gen de insensibilidad a la malaria humana, un gen de insensibilidad a la malaria aviar, un gen de insensibilidad al virus del bronceado del tomate, un gen de resistencia a herbicidas, un gen insecticida, un gen de resistencia a la sequía, un gen de resistencia a nematodos parásitos y un gen que produce un rendimiento mejorado de la planta.

En otra realización particularmente preferente de la presente invención, dicho sistema genético está comprendido o se proporciona en forma de un elemento genético móvil, un ADN plasmídico o exógeno capaz de integración genómica.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un uso de un sistema genético que comprende los siguientes componentes: a) un medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente; y b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente para la transformación de un organismo eucariota, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, en el que dicha transformación se lleva a cabo simultáneamente y en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico.

La presente descripción desvela además un uso de un sistema genético como se define anteriormente en el presente documento para disminuir su introgresión en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano.

Además se desvela que dicha disminución en la introgresión es una prevención de la introgresión que da como resultado la eliminación o limitación de la reproducción sexual de la progenie hemicigótica.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un organismo eucariota genéticamente modificado, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende (a) un medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente; y (b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida en dicho gen haploinsuficiente, en el que dicho organismo es un organismo potencialmente con reproducción sexual, en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico, y en el que dicho organismo es una planta o un insecto. Preferentemente, dicho medio para reducir específicamente la expresión de dicho gen haploinsuficiente degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. En una realización preferente, dicho medio que degrada o inactiva específicamente comprenden un ARNip, miARN, una molécula de ARN antisentido, una molécula de ADN antisentido o un agente que media la metilación de ADN dirigida por ARN. En otra realización preferente más, dicho medio, que altera específicamente dicha secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, es una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN, forma siglada de Transcription Activator-Like Effector Nuclease), un CRISPR o una meganucleasa. Además, es preferente que dicho agente de rescate sea una versión modificada de dicha secuencia génica haploinsuficiente. En una realización preferente adicional de la presente invención, la versión modificada de dicha secuencia del gen haploinsuficiente es resistente a un medio que degrada o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. El agente de rescate puede, en una realización preferente, comprende además un gen efector. El gen efector puede seleccionarse preferentemente del grupo de un gen de insensibilidad al virus del dengue, un gen de insensibilidad a la malaria humana, un gen de insensibilidad a la malaria aviar, un gen de insensibilidad al virus del bronceado del tomate, un gen de resistencia a herbicidas, un gen insecticida, un gen de resistencia a la sequía, un gen de resistencia a nematodos parásitos y un gen que produce un rendimiento mejorado de la planta.

En una realización preferente adicional relacionada con el organismo genéticamente modificado como se define anteriormente en el presente documento, una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, comprende secuencias alterantes flanqueadas por sitios de reconocimiento específico de sitio para una recombinasa, preferentemente Cre o FLP, lo que permite hacer que dicha secuencia conduzca a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente. Es preferente que dicho medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente; y dicho agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente, estén comprendidos en una construcción subdominante.

En una realización adicional, el organismo genéticamente modificado es homocigótico para la construcción subdominante. En una realización alternativa, el organismo genéticamente modificado es hemicigótico para la construcción subdominante.

En aún otra realización preferente de la presente invención, el organismo genéticamente modificado tiene una aptitud competitiva reducida en comparación con el organismo homocigótico para dicha construcción subdominante.

En una realización preferente adicional, el gen haploinsuficiente como se menciona anteriormente en el presente documento es una proteína ribosómica citoplasmática endógena (PRC), un factor de transcripción, un gen supresor de tumor, un gen relacionado con la función muscular, un gen codificante de una proteína de homeodominio u otro gen con evidencia que indique que es potencialmente haploinsuficiente en un organismo específico. Es particularmente preferente que dicho gen haploinsuficiente sea Rpl 14 o Rpl 23aA.

En otra realización preferente más de la presente invención, dicho organismo como se menciona anteriormente en el presente documento es un animal vector de enfermedades, un animal que provoca enfermedades o un animal de ganado, o una planta, o un hongo o un protista.

Dicho animal vector de enfermedades es preferentemente un insecto, un arácnido. Dicho insecto es preferentemente un mosquito o una mosca. Dicho arácnido es, en una realización preferente, una garrapata. Dicho roedor es, en una realización preferente, una rata o un ratón.

Dicho animal que provoca enfermedades es, en una realización preferente, un nematodo que provoca enfermedades humanas, un nematodo que provoca una enfermedad animal o un nematodo que provoca una enfermedad vegetal.

Dicha planta es, en una realización preferente adicional, una planta agrícola o una planta plaga. Una planta agrícola preferente es un cultivo básico, más preferentemente un cultivo de cereales, cultivos de plantas de raíz, tubérculos, legumbres, sorgo o leguminosas; o un cultivo productor de azúcar, preferentemente caña de azúcar o remolacha azucarera; o una planta productora de aceite, más preferentemente colza, soja, aceite de palma, cártamo o girasol.

En una realización adicional, dicha planta plaga es una planta invasora, una planta venenosa o una planta que provoca reacciones alergénicas en animales, preferentemente en seres humanos.

En otra realización más, dicha planta es un alga, preferentemente un alga utilizada en la producción de biocombustibles.

Adicionalmente, se prefiere que el hongo como se menciona anteriormente sea un hongo tóxico o un hongo utilizado en la producción en biorreactores. El hongo puede, en una realización específica, obtenerse del género Saccharomyces o Aspergillus.

Descripción de las figuras

La Figura 1 representa una construcción de subdominancia. El primer gen de la construcción es un ARNi de ARNbc de atenuación génica (gris intermedio) bajo el control de un promotor UAS (negro). Este se dirige a 72 pb del exón 2 del gen endógeno de tipo silvestre RpL14+ (posición citogenética 66D8). El segundo gen (gris claro) de la construcción es un gen de rescate RpL14r que es insensible a la atenuación génica de ARNi. RpL14r es un gen completo RpL14, que incluye todas sus regiones flanqueantes genómicas y porciones de los genes flanqueantes (blanco), en el que, estratégicamente, se han realizado 14 sustituciones sinónimas (14*) en el exón 2.

La Figura 2 muestra la estrategia de subdominancia de rescate de toxina haploinsuficiente de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Todas las moscas son w- en el primer cromosoma y tienen GAL4 dirigido por actina equilibrado con respecto a CyO para el segundo cromosoma. Cabe destacar que, el inserto elemento p actina5c-GAL4 está marcado con mini-white, por lo que todas las moscas son efectivamente de tipo silvestre para white. La Fig.2(A) representa moscas homocigóticas (GFP) de "tipo silvestre" que tienen dos copias del gen RpL14 endógeno con niveles normales de expresión. La Fig. 2(B) representa heterocigotos de {Ud}86 (RFP/GFP), ARNibc, activado por el sistema binario GAL4-UAS, dirigido a RpL14 endógeno, efectúa atenuación génica de la expresión de RpL14. Esta atenuación génica de RpL14 es parcialmente rescatada por la copia de rescate, RpL14r, que está diseñado para ser resistente al ARNibc. La Fig. 2(C) muestra homocigotos de {Ud}86 (RFP), en que están presentes dos copias de rescate de RpL14r, para superar los efectos de haploinsuficiencia de tener, funcionalmente, menos de dos copias de la expresión de RpL14.

La Figura 3 muestra la secuencia de RpL14.ARNbc, su diana RpL14+ y el gene insensible RpL14r. Además se representa el exón 2 completo de RpL14. Los tres segmentos corren continuamente de 5' a 3', de izquierda a derecha, desde los segmentos Bloque A al engarce al Bloque B, y en este caso solo se dividen e intercalan para facilitar la ilustración. La primera línea de la secuencia (SEQ ID NO: 15) muestra el ARNi dirigido a RpL14.ARNbc (no se muestra la secuencia de la repetición invertida). Dos bloques no contiguos de secuencias son el objetivo de RpL14.ARNbc. El engarce entre el bloque A y B se coloca de forma arbitraria y no tiene similitud con ninguna otra secuencia. Las líneas verticales muestran la identidad entre el ARNbc y los genes RpL14+ (SEQ ID NO: 16) y RpL14r (SEQ ID NO: 17). Si bien ARNi se direcciona de forma eficaz a RpL14+, el número y la distribución de las 14 mutaciones sinónimas en RpL14r impide el mismo grado de atenuación génica mediante ARNi y rescata la expresión de RpL14.

La Figura 4 representa un esquema a escala del plásmido que contiene pUASattB {Ud} que se inyectó en embriones de mosca para colocar la construcción en un sitio de llegada marcado con RFP utilizando el sistema de integración basado en phiC31. La secuencia de ADN se proporciona en el archivo con formato de genbank adjunto. La Figura 5 muestra la cantidad de ARNm de RpL14 en adultos y larvas con respecto a tres genes de normalización. Las alturas de las barras indican la cantidad total de RpL14 basada en transcripción inversa PCR cuantitativa basada en verde SYBR y cada barra se divide para representar la proporción de RpL14 total expresada a partir del gen RpL14r gen en {Ud}86 (blanco) y el gen endógeno RpL14+ (negro), basado en sondas TaqMan específicas de genes. Las barras de error representan 1 error típico para tres repeticiones biológicas.

La Figura 6 muestra los niveles genotípicos de expresión total de ARNm de RpL14 sin expresión de GAL4. Se representa la cantidad de ARNm de RpL14 en genotipos de machos adultos (las dos barras de la izquierda) y de hembras adultas (las 2 barras de la derecha) en ausencia de expresión de Act5C-GAL4, con respecto a tres genes de normalización. Las alturas de las barras indican la cantidad total de RpL14 basada en transcripción inversa PCR cuantitativa basada en verde SYBR a la misma escala que se muestra en la Fig. 5 y cada barra se divide para representar la proporción de RpL14 total expresada a partir del gen RpL14r gen en {Ud}86 (blanco) y el gen endógeno RpL14+ (negro), basado en sondas TaqMan específicas de genes. Las barras de error representan 1 error típico para tres repeticiones biológicas.

La Figura 7 representa el tiempo de desarrollo de huevo a adulto y la supervivencia. La Fig. 7 (A) muestra la fracción acumulada de adultos que eclosionan en cada día de desarrollo. Las hembras se indican con líneas continuas y los machos con líneas discontinuas. Los números de la leyenda proporcionan el tiempo promedio en días para la eclosión para cada genotipo. La diferencia entre los homocigotos en el tiempo de desarrollo no es significativa (prueba de Kolmogorov-Smirnov de machos D=0,0749, n1=674, n2=566, P=0,0634; prueba de K-S de hembras D=0,0445, n1=778, n2=715, P=0,452). La diferencia entre los homocigotos y heterocigotos agrupados en el tiempo de desarrollo es altamente significativa (prueba de K-S de machos D=0,272, n1=1240, n2=966, P=2,56x10-35; prueba de K-S de hembras D=0,292, n1=1493, n2=1149, P=1,64x10'48). La Fig. 7 (B) muestra la abundancia relativa de la descendencia de diversos cruces. Las columnas corresponden a la proporción de genotipos de la descendencia de cada tipo de cruce. Las etiquetas en la parte inferior indican los genotipos parentales. La proporción promedio de homocigotos se estableció en 1. En todos los casos hay una deficiencia de heterocigotos que sobreviven a la eclosión con respecto a los homocigotos. La barra horizontal indica la proporción relativa esperada de heterocigotos. En todos los casos, la deficiencia heterocigótica es significativa (de izquierda a derecha, g.l.=2, x2=24,37, P=5x10-6; g.l. = 1, x2=8,33, P=0,0039; g.l. = 1, x2=11,34, P=0,000759; g.l. = 1, X2=4,40, P=0,0359; g.l. = 1, x2=37,68, P<10-6).

La Figura 8 muestra experimentos de población de {Ud}86 que demuestran subdominancia. La Fig. 8 (A) muestra resultados de experimentos de población multigeneracionales que proporcionan el cambio de frecuencia de individuos transgénicos (+/{Ud}86 y {Ud}86/{Ud}86) a partir de diversas frecuencias iniciales (líneas grises). Las poblaciones con valores iniciales más altos que el umbral estimado de 0,61 (línea recta discontinua en negrita) proceden a la fijación, mientras que las están por debajo dan como resultado la pérdida de {Ud}86 (verificado por cruces y PCR en las 12 poblaciones). Las líneas discontinuas indican las trayectorias predichas en ausencia de deriva genética y error de muestreo, con la estimación de máxima verosimilitud (EMV) de los parámetros de aptitud mostrados en las partes B y C (12). La Fig. 8 (B) muestra la superficie de probabilidad de estimaciones de la aptitud relativa. La aptitud se infiere del cambio en las frecuencias alélicas en A; {Ud}86/{Ud}86 = 0,71 (I.C. del 95 % 0,62 0,81) y /{Ud}86=0,22 (I.C. del 95 % 0,16-0,28) La Fig. 8 (C) muestra estimaciones de EMV de la aptitud de los genotipos transgénicos. Las barras de error indican los intervalos de confianza estimados en la parte B.

La Figura 9 ilustra la asociación entre la abundancia de ARNm de RpL14 total de adultos y la aptitud total del ciclo de vida como se estiman a partir de los cambios de la frecuencia alélicas entre generaciones. Una reducción de la expresión es consistente con una reducción en la aptitud. Los datos representados en este caso son los mismos que se utilizan en la Fig. 5 y la Fig. 8. Los datos para los machos se representan con cuadrados y para las hembras con círculos. El gris claro indica genotipos /+, el gris intermedio indica homocigotos {Ud}86/{Ud}86 y el negro indica hemicigotos {Ud}86/+. Las líneas de regresión de mínimos cuadrados ajustadas para los machos y hembras se proporcionan solo con fines ilustrativos.

La Figura 10 representa datos de estabilidad geográfica. La figura muestra poblaciones interconectadas que se representan como círculos, (gris claro para el tipo silvestre y gris oscuro para una población transformada con {Ud}86). Si se transforma una única población diana (centro), la migración puede dar como resultado dos transiciones no deseadas; el colapso de la transformación de la población a través de la pérdida de {Ud}86 de la población diana (izquierda), o la propagación de {Ud}86 por la transformación de una población de tipo silvestre adyacente (derecha). Para una tasa de migración de 0,065 cada generación y con la configuración de aptitud proporcionada en la Fig. 8B; es probable que se produzca un colapso solo si la frecuencia de {Ud}86 cae por debajo de <0,77; la propagación solo es probable que se produzca si {Ud}86 alcanza una frecuencia de >0,53 en una población adyacente de tipo silvestre. Las simulaciones que incorporan deriva indican que, para tamaños de población superiores a 25 individuos, la probabilidad relativa de colapso es, esencialmente, infinitamente mayor que para la propagación.

La Figura l1 representa un esquema para una construcción de {Ud} direccionada al gen RpL23aA de Aradabopsis thaliana y un plásmido de transformación de control apropiado. S35 = un promotor, OCS=terminador, rbcs=terminador y rescate= gen RpL23aA con regiones flanqueantes donde se han introducido sustituciones sinónimas. En el plásmido de control, solo las proteínas fluorescentes se expresan a partir de los dos promotores S35, mientras que en el plásmido de {Ud} funcional se expresan dos genes de miARN que se dirigen a dos regiones de RpL23aA. El gen de rescate en ambos plásmidos es el gen RpL23aA completo, incluidas las regiones flanqueantes en que se han introducido mutaciones sinónimas para volverlo insensible a la atenuación génica por ARNi dirigida (véase también la Figura 12). Lox= sitios de reconocimiento de recombinasa CRE que se pueden utilizar para eliminar el gen de rescate in vivo, para determinar el fenotipo de atenuación génica no rescatado por los genes de miARN.

La Figura 12 representa la complementaria de las secuencias de miARN de direccionamiento expresadas en los genes de miARN, miARN1 y miARN2, mostrados en la Figura 11. Las secuencias de direccionamiento de miARN son similares pero no idénticas a las secuencias que se tienen como objetivo en RpL23aA, como se describe en el procedimiento de Schwab y col. The Plant Cell, Vol. 18, 1121-1133. Además se muestra la secuencia del gen de rescate en que se han introducido mutaciones sinónimas en una copia del RpL23aA (rescate). La frecuencia y la posición de las mutaciones sinónimas están destinadas a hacer que este gen sea insensible (o sustancialmente insensible) a la reducción por el miARN direccionado. Además, se muestra la secuencia correspondiente del RpL23aB, que presenta un alto grado de similitud de secuencia con RpL23aA. La ubicación y las diferencias en la secuencia de RpL23aB deberían dar como resultado una sensibilidad limitada al direccionamiento de miARN con respecto a RpL23aA.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo eucariota hemicigótico para un locus transgénico en comparación con el organismo homocigótico para el locus transgénico, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; y b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, lo que produce un organismo que es menos apto competitivamente si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para el locus transgénico.

Aunque la presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares, la presente descripción no ha de interpretarse en un sentido limitante. Antes de describir en detalle realizaciones ejemplares de la presente invención, se proporcionan definiciones importantes para comprender la presente invención.

Como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de "un" y "una" también incluyen los respectivos plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

En el contexto de la presente invención, las expresiones "alrededor de" y "aproximadamente" denotan un intervalo de precisión que un experto en la materia comprenderá que aún garantiza el efecto técnico de la característica en cuestión. La expresión normalmente indica una desviación del valor numérico indicado del ±20 %, preferentemente del ±15 %, más preferentemente del ±10 % e incluso más preferentemente del ±5 %. En determinados aspectos, el término "aproximadamente" también puede referirse a un valor, que es más grande o más pequeño en varios números enteros, preferentemente en 5, 4, 3, 2 o 1 en comparación con el valor inicial.

Ha de entenderse que la expresión "que comprende" no es limitante. Para los fines de la presente invención, se considera que la expresión "que consiste en" es una realización preferente de la expresión "que comprende". Si en lo sucesivo en el presente documento se define que un grupo comprende al menos un determinado número de realizaciones, esto significa que también abarca un grupo, que preferentemente consiste en estas realizaciones solamente.

Si el término "que comprende" se utiliza en el contexto de secuencias, en particular secuencias de nucleótidos, el término puede no solo referirse a la secuencia mencionada en el listado de secuencias, sino también a la secuencia complementaria de las mismas, a menos que el contexto indique otra cosa.

Adicionalmente, los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" o "(i)", "(ii)", "(Ni)", "(iv)", "(v)", "(vi)", "(vii)" etc. y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Ha de entenderse que los términos utilizados de este modo son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención que se describen en el presente documento son capaces de funcionar en secuencias distintas de las que se describen o se ilustran en el presente documento.

En caso de que los términos "primero", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" o "(i)", "(ii)", "(iii)", "(iv)", "(v)", "(vi)", "(vii)" etc. se refieran a etapas de un procedimiento o uso, no existe coherencia de tiempo o intervalos de tiempo entre las etapas, es decir, las etapas pueden llevarse a cabo de manera simultánea o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años entre tales etapas, a menos que se indique otra cosa en la solicitud o las reivindicaciones como se expone anteriormente a continuación en el presente documento.

Ha de entenderse que la presente invención no se limita a la metodología particular, protocolos, proteínas, bacterias, vectores, reactivos, etc. descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el ámbito de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia.

Si no se define otra cosa, los términos utilizados en el presente documento pueden obtenerse de "Un glosario multilingüe de términos biotecnológicos: (Recomendaciones de la IUPAC)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza. Si no se define otra cosa, los términos utilizados en el contexto de evolución o herencia pueden obtenerse de Hartl, D. L. y Clark, A. G. Principles of Population Genetics., Sinauer Associates: 1997.

Como se ha expuesto anteriormente, la presente invención se refiere en un aspecto a un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo eucariota hemicigótico para un locus transgénico en comparación con el organismo eucariota homocigótico para el locus transgénico, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; y (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, lo que produce un organismo que es menos apto competitivamente si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para el locus transgénico.

La expresión "aptitud competitiva", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad promedio de los organismos con un determinado genotipo para sobrevivir y reproducirse en el entorno natural. Una pérdida completa de la aptitud competitiva puede conducir a la inviabilidad y/o infertilidad de un organismo. Una "aptitud competitiva normal", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad promedio para sobrevivir y/o reproducirse presentada en los individuos u organismos que no comprenden una construcción subdominante de acuerdo con la presente invención. Una "aptitud competitiva reducida" o un estado "menos competitivamente apto" de un organismo se refiere a una reducción de la viabilidad y/o fertilidad de un organismo, y/o a su capacidad para atraer parejas y/o a su fecundidad. Dicha reducción puede no ser letal para un organismo, sin embargo, disminuye su capacidad de sobrevivir y/o de reproducirse. Dicha reducción puede incluir una disminución de la aptitud de un organismo de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, o cualquier valor entre estos valores en comparación con un organismo con una aptitud competitiva normal, como se define anteriormente en el presente documento. La reducción puede medirse o determinarse, o inferirse de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, la supervivencia de un organismo en un entorno puede determinarse después de un plazo de tiempo específico, por ejemplo, dentro del 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de un período de generación típico. La fertilidad puede determinarse de acuerdo con el número de progenie en comparación con un valor promedio dentro de una especie o grupo de individuos de la especie. La aptitud competitiva relativa de los genotipos se puede inferir de los cambios en la frecuencia alélica entre generaciones, por ejemplo, de acuerdo con Catteruccia y col., Science 299, 2001-2003 (2003), utilizando un marco estadístico apropiado (por ejemplo, basado en Clark y col., Heredity 46, 321-46 (1981)). Se pueden obtener más detalles de la Fig. 8 de la presente solicitud. Como alternativa, la aptitud competitiva relativa de los genotipos puede estimarse midiendo los rasgos del ciclo de vida en una única generación que probablemente contribuyen a la aptitud competitiva. Dichos rasgos pueden incluir o seleccionarse de fecundidad, variabilidad, peso de los individuos, atractivo sexual, cantidad de gametos generados, ritmo (o ritmos) de crecimiento y/o movilidad en una única generación. Se pueden obtener más detalles en Irvin y col., PNAS, 101, 891-6 (2004) o Amenya y col., Insect Molecular Biology 19, 263-269 (2010).

En realizaciones específicas adicionales, la reducción de la aptitud competitiva también puede reflejarse en el rendimiento, producto o producción de compuestos o de material. Por ejemplo, una planta, en particular de una variedad de cultivo de una planta, puede considerarse que tiene una aptitud competitiva reducida si se reduce el rendimiento o la ganancia de producción.

En el contexto de los animales, el fenotipo que provoca la reducción de la aptitud competitiva puede deberse a una reducción de la expresión antes y después de la gastrulación embrionaria. En tal escenario, el fenotipo puede mostrarse durante fases posteriores. En realizaciones muy específicas, los procedimientos y realizaciones como se describen en el presente documento excluyen los procedimientos que dependen únicamente del medio para reducir la expresión de genes en el organismo, en los que dicha reducción se transmite por deposición materna de ARN o proteínas, o una modificación de ADN, que da como resultado un fenotipo letal embrionario y donde la expresión cigótica antes de la gastrulación embrionaria de genes transgénicos proporciona un rescate de dicho fenotipo letal. En particular, los procedimientos y realizaciones como se describen en el presente documento excluyen específicamente procedimientos o enfoques como se describe en Chen y col. Science 316, 597 (2007) o Marshall y col., The Journal of heredity 102, 336-41 (2011).

En realizaciones muy específicas adicionales, los procedimientos o realizaciones como se describen en el presente documento excluyen procedimientos o enfoques en que están presentes más de dos construcciones transgénicas mecanísticamente distintas en un único locus, representando alelos distintos del mismo locus transgénico, y donde se pretende que más de un alelo persista a una frecuencia intermedia en un equilibrio estable en aplicaciones de transformación de poblaciones. En particular, los procedimientos y realizaciones como se describen en el presente documento excluyen específicamente procedimientos o enfoques como se describe en Davis y col., Journal of theoretical biology, 212, 83-98 (2001). Más particularmente, los procedimientos y realizaciones como se describen en el presente documento excluyen específicamente procedimientos o enfoques como se describe en la parte superior derecha de la Fig. 4 de Davis y col., Journal of theoretical biology, 212, 83-98 (2001).

La expresión "hemicigótico para un locus transgénico" como se usa en el presente documento significa que, en un organismo diploide o poliploide, un locus transgénico está presente con solo un alelo transgénico por locus por genoma, por par homólogo o grupo de cromosomas. En organismos poliploides, puede estar presente más de un par de cromosomas homólogos. Dentro de este grupo de cromosomas, el locus transgénico puede estar presente con un solo alelo transgénico. En caso de que estén presentes pares de cromosomas funcionalmente equivalentes pero no homólogos en un organismo poliploide, el locus transgénico puede estar presente con un alelo transgénico solo dentro de este grupo de cromosomas. En el caso de un organismo diploide, la hemicigosis para un locus transgénico es esencialmente igual a la heterocigosis para dicho locus transgénico. La expresión "heterocigótico para un locus transgénico" como se usa en el presente documento significa que en un organismo diploide, un locus transgénico está presente con un alelo transgénico únicamente. La expresión "homocigótico para un locus transgénico" como se usa en el presente documento significa que en un organismo diploide o poliploide está presente un alelo transgénico en un locus específico en ambas o en todas las copias de un cromosoma específico. En los organismos poliploides, en los cuales puede estar presente más de un par de cromosomas homólogos, el término homocigótico puede incluir situaciones en que está presente más de un alelo transgénico en el locus transgénico. Por consiguiente, tal alelo puede estar presente con tantas copias como cromosomas están presentes en este grupo.

En caso de que estén presentes pares de cromosomas funcionalmente equivalentes pero no homólogos en un organismo poliploide, el término homocigótico incluye situaciones en que hay más de un alelo transgénico presente en el locus transgénico. Por consiguiente, tal alelo puede estar presente con tantas copias como cromosomas están presentes en este grupo.

La expresión "cromosomas homólogos" como se usa en el presente documento se refiere a pares de cromosomas de aproximadamente la misma longitud, posición del centrómero y patrón de tinción, que comprenden genes para las mismas características en los locus correspondientes. Normalmente, un cromosoma homólogo se hereda del progenitor femenino del organismo; el otro del progenitor masculino del organismo. Los cromosomas homólogos normalmente no son completamente idénticos, pero pueden portar el mismo tipo de información. Un "cromosoma funcionalmente equivalente pero no homólogo", como se usa en el presente documento, puede portar un tipo de información similar a un cromosoma homólogo, pero puede mostrar diferencias de longitud, posición del centrómero, patrón de tinción y/o la presencia de genes en los locus correspondientes. Normalmente, dichos cromosomas también se designan cromosomas homólogos. Dichos cromosomas que pueden proceder de subgenomas parentales normalmente pueden emparejarse con exactitud durante la meiosis, lo que conduce a la herencia disómica. En realizaciones específicas, puede tener lugar un emparejamiento de 4 veces que conduzca a una herencia tetrasómica o equivalentes de orden superior.

La expresión "locus transgénico", como se usa en el presente documento, se refiere al sitio genómico de una integración estable de una construcción subdominante en un cromosoma de un par de cromosomas homólogos o un grupo de cromosomas homólogos. Por consiguiente, el locus transgénico puede comprender todos los elementos o secuencias proporcionados en una construcción subdominante como se define en el presente documento. Los alelos en este locus transgénico pueden ser homocigóticos, hemicigóticos/heterocigóticos o de tipo silvestre. En el caso de un genotipo de tipo silvestre, no ha tenido lugar una inserción transgénica. El locus que comprende la construcción subdominante puede, en determinadas realizaciones, ser también cisgénico. El término "cisgénico", como se usa en el presente documento, significa que el locus puede comprender solo genes o elementos genéticos procedentes de organismos estrechamente relacionados, o de organismos que de otro modo podrían reproducirse de forma convencional. En realizaciones adicionales, el locus que comprende la construcción subdominante también puede ser intragénico, es decir, preceder del mismo genoma, famigénico, es decir, proceder de una especie de la misma familia o linegénico, es decir, proceder de una especie del mismo linaje. En realizaciones específicas de la invención, el sitio genómico de una integración estable de una construcción subdominante en un cromosoma de un par de cromosomas homólogos o un grupo de cromosomas homólogos puede tener lugar en único solo locus, proporcionando así un único locus transgénico en el organismo, o en múltiples locus, proporcionando así múltiples locus transgénicos en el organismo. Los locus múltiples pueden diferir en términos de los cromosomas en los que se encuentran, por ejemplo, un locus en el cromosoma 1, otro en el cromosoma 2, etc., y/o en términos de las posiciones dentro de un cromosoma, por ejemplo, un locus en el brazo p, otro locus en el brazo q etc. La presente invención también prevé variaciones adicionales y todas las posiciones de localización adecuadas dentro del genoma de un organismo.

La expresión "alelo en el locus transgénico" como se usa en el presente documento se refiere a las variantes de secuencia en un locus transgénico. Los alelos en este locus transgénico pueden ser homocigóticos, hemicigóticos/heterocigóticos o de tipo silvestre. Un alelo de tipo silvestre indica que no hay inserto transgénico en el sitio de inserción del locus transgénico que está presente en homocigotos y hemicigotos. En el caso de un genotipo diploide de tipo silvestre, ambos alelos de tipo silvestre no tienen inserción transgénica en el sitio de inserción del locus transgénico.

Una "construcción subdominante", como se usa en el presente documento, significa una construcción que provoca subdominancia de acuerdo con el procedimiento de la invención. Puede proporcionarse una funcionalidad o medio que permite reducir la expresión de un gen haploinsuficiente y/o que proporciona una funcionalidad o medio que permite rescatar la expresión reducida de un gen haploinsuficiente. La construcción subdominante puede estar integrada en el genoma de un organismo, por ejemplo, de un plásmido o cualquier otro elemento genético transferible, para transformar un organismo para transformar un organismo. La integración puede tener lugar en una posición específica o en más de una posición, lo que da como resultado múltiples copias por locus. El número de construcciones subdominantes integradas puede variar. Por ejemplo, pueden transformarse y/o estar presentes en el genoma de un organismo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más construcciones subdominantes, por ejemplo, en un número correspondiente de locus transgénicos como se define anteriormente, o en un número distinto de locus transgénicos. Las construcciones pueden, por ejemplo, estar presente en un locus transgénico, por ejemplo, como repeticiones en tándem o cualquier otra forma repetida, o pueden estar presentes en 2, 3 o más locus dentro del genoma, por ejemplo, en 2 o más cromosomas distintos.

La construcción subdominante puede comprender regiones flanqueantes en el extremo 5' y/o 3', preferentemente en ambos extremos, que son homólogas a las regiones genómicas de un organismo a transformar. Las regiones flanqueantes pueden tener cualquier longitud adecuada, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 170, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 nucleótidos o más, o cualquier valor entre estos valores. Las regiones flanqueantes se pueden elegir de forma que la integración de modificaciones genéticas se pueda llevar a cabo de una manera específica de sitio, por ejemplo, la eliminación de un gen o elemento genético, la modificación de una secuencia genómica, un reordenamiento cromosómico etc. Las regiones flanqueantes homólogas pueden tener una complementariedad de aproximadamente el 100 %, o al menos del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 85 %, 80 % o 75 %, o cualquier valor entre estos valores, con una secuencia en el genoma de un organismo a transformar. En caso de ubicación en cromosomas distintos, la construcción subdominante puede estar provista de distintas regiones flanqueantes, por ejemplo, la región flanqueante del cromosoma A para la construcción 1, y las regiones flanqueantes del cromosoma B para la construcción 2, en las que las construcciones 1 y 2 solo difieren esencialmente en las distintas regiones flanqueantes. La eficacia de estos enfoques de integración específicos de sitio puede potenciarse mediante la inducción transitoria de roturas bicatenarias cromosómicas, por ejemplo, a través de la expresión de los TALEN o los ZFN dirigidos al sitio de integración pretendido.

La construcción subdominante puede comprender, en realizaciones específicas, solo una funcionalidad o un medio que permita reducir la expresión de un gen haploinsuficiente. La construcción subdominante puede, por consiguiente, comprender una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente como se define en el presente documento, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. La construcción subdominante puede, por ejemplo, comprender una secuencia que conduce a la proporción de ARNip, miARN, una molécula de ADN antisentido o de ARN antisentido, o que permite la expresión de una nucleasa específica de secuencia, tal como una nucleasa de dedos de zinc, CRISPr , actividad de meganucleasa o TALEN.

La construcción subdominante puede, en realizaciones alternativas, comprender solo una funcionalidad o un medio que permita rescatar la expresión reducida de un gen haploinsuficiente.

En realizaciones preferentes adicionales, la construcción subdominante puede comprender ambas funcionalidades, es decir, una funcionalidad que permite reducir la expresión de un gen haploinsuficiente y una funcionalidad que permite rescatar la expresión reducida de un gen haploinsuficiente. La construcción subdominante puede comprender además elementos adecuados adicionales. Por ejemplo, pueden estar presentes genes o elementos marcadores ópticos o visuales, genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a herbicidas, elementos promotores, elementos potenciadores, elementos terminadores, etc.

Es particularmente preferente que la construcción subdominante comprenda, además de la actividad reductora y/o de rescate, como se define anteriormente en el presente documento, un gen efector. El gen efector puede proporcionarse en una forma que permita su expresión y/o la proporción del producto proteico expresado. Por lo tanto, se pueden proporcionar elementos accesorios adecuados, por ejemplo, un elemento promotor, elementos terminadores, un elemento potenciador etc. En determinadas realizaciones, se prevé la ausencia de un gen efector de la construcción subdominante.

En una realización muy específica, la construcción subdominante puede comprender secuencias alterantes, lo que permite hacer que cualquier secuencia de la construcción subdominante proporcionada dentro o entre las secuencias alterantes esté inactiva. Los ejemplos previstos de tales secuencias alterantes son sitios de reconocimiento específico de sitio para una recombinasa. Los sitios de reconocimiento específico de sitio para una recombinasa pueden, por ejemplo, proporcionarse en o cerca de los extremos 5' y 3' de una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente como se define en el presente documento, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente.

Los sitios de reconocimiento específico de sitio para una recombinasa pueden, en realizaciones alternativas, proporcionarse en o cerca de los extremos 5 'y 3' de una secuencia que conduce a la proporción de un medio que permite la activación de los medios para la expresión reducida de un gen haploinsuficiente. Se prevé además que se pueden proporcionar sitios de reconocimiento específico de sitio para una recombinasa en o cerca del extremo 5' y 3' de una secuencia que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada o inactiva específicamente el transcrito o producto de expresión de un gen haploinsuficiente como se define en el presente documento, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente y una secuencia que conduce a la proporción de un medio que permite rescatar la expresión reducida de un gen haploinsuficiente.

Las recombinasas que se pueden utilizar para la activación o inactivación de genes comprenden secuencias entre sitios de reconocimiento específicos de sitio que conocerán los expertos en la materia. En el presente documento se prevé el uso de cualquier recombinasa adecuada y sus sitios de reconocimiento afines. Es preferente el empleo de la recombinasa Cre o la recombinasa FLP, y sus respectivos sitios de reconocimiento. Es particularmente preferente utilizar sistemas Cre-Lox o derivados de los mismos, o sistemas FLP-FRT o derivados de los mismos. Al proporcionar los sitios de reconocimiento de una manera directa repetida, se puede lograr una deleción de la secuencia entre las repeticiones. De forma similar, proporcionando otras orientaciones o más de dos sitios de reconocimiento, puede ser posible un patrón de reordenamiento adicional, por ejemplo, una inversión de las secuencias. Se pueden obtener más detalles de Ryder y col. Genetics 167, 797-813 (2004); Golic y Golic Genetics 144, 1693-711 (1996); Ito y col., Development, 771, 761-771 (1997)).

En realizaciones específicas, el gen de la recombinasa puede constituir un gen de activación de acuerdo con la presente invención, es decir, la recombinasa puede conducir a la activación de la secuencia que degrada específicamente o inactiva el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente como se define en el presente documento, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. En realizaciones específicas adicionales, también puede utilizarse una recombinasa para fines de inactivación de una o más partes de los sistemas genéticos de subdominancia como se describe en el presente documento.

La activación o inactivación de la secuencia, que degrada o inactiva específicamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente como se define en el presente documento, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, se puede lograr preferentemente a través de una exposición in vivo de la célula por dicha recombinasa, por ejemplo, recombinasa Cre o recombinasa FLP. La exposición in vivo puede implementarse de acuerdo con cualquier medio adecuado. Las recombinasas que se utilizarán para tal enfoque, es decir, una exposición in vivo, pueden proporcionarse, por ejemplo, de forma externa, por ejemplo, las proteínas pueden administrarse al organismo o la célula, o pueden proporcionarse mediante expresión interna, por ejemplo, en un sistema de expresión en un plásmido o un sistema de expresión codificado en el genoma. En realizaciones adicionales, la actividad recombinasa puede proporcionarse con los límites de la propia construcción subdominante, por ejemplo, dentro de secuencias alterantes o sitios específicos de reconocimiento de recombinasa en dicha construcción subdominante. Por consiguiente, la expresión de la recombinasa puede conducir a una deleción de las secuencias abarcadas, incluida su propia secuencia. La exposición in vivo puede controlarse mediante cualquier mecanismo de control adecuado, por ejemplo, a través de un promotor inducible, como un promotor de choque térmico o un promotor inducido por un compuesto alimentario.

La expresión "de tipo silvestre", como se usa en el presente documento, se refiere a los niveles esperados de expresión o aptitud competitiva que se pueden encontrar comúnmente en individuos de una especie, que no tienen una integración genómica de una construcción subdominante de acuerdo con la presente invención. En el caso de las variedades vegetales, la expresión puede referirse específicamente a los niveles esperados de expresión o aptitud competitiva que es probable que se encuentren comúnmente en individuos de la misma variedad sin una construcción subdominante de acuerdo con la presente invención.

El locus transgénico o los derivados del locus como se menciona anteriormente pueden incluir o estar asociados con uno o más genes efectores, o pueden no incluir o estar asociados con un gen efector. Se puede prever la ausencia de un gen efector en los casos en que el locus transgénico transmite de por sí un efecto molecular, por ejemplo, una resistencia a una enfermedad vírica. Ha de entenderse que la capacidad de algunos virus para replicar en las células puede ser altamente sensible a la expresión de la proteína ribosómica citoplasmática (véase, por ejemplo, Cherry y col., Genes & development, 19, 445-52 (2005)). Cuando un gen haploinsuficiente que se tiene como objetivo tiene un papel en la reducción de la transmisión de una enfermedad, es concebible que la construcción subdominante pueda conferir total o parcialmente la insensibilidad a la enfermedad en ausencia de genes efectores adicionales. Los genes efectores también pueden estar ausentes en una construcción transgénica si un gen efector está presente en otro locus transgénico. Los genes efectores pueden estar además ausentes en una construcción transgénica cuando se utilizan con fines de biocontención en una estirpe de cultivar donde están los rasgos agronómicos, por ejemplo, distribuidos en otras ubicaciones no ligadas o ligadas débilmente al locus transgénico. En una realización específica, esto puede implementarse cuando se intenta utilizar una construcción subdominante para garantizar la verdadera reproducción de un cultivar de élite convencional donde los rasgos agronómicos se distribuyen por todo el genoma, a menudo en locus no identificados. En un ejemplo adicional, una implementación puede ser la biocontención de un cultivar que previamente había sido modificado genéticamente, por ejemplo, por la integración genómica de una construcción transgénica que le confirió un rasgo agronómico, pero que no era en sí misma subdominante.

Los ejemplos de transgenes que pueden integrarse en genomas sin utilizar construcciones subdominantes o como genes efectores en el contexto de construcciones subdominantes como se describe en el presente documento, pueden identificarse sobre la base de cualquier base de datos adecuada. Es preferente el registro de genes mantenido en el Centro de intercambio de información sobre seguridad de la biotecnología (Biological Clearing House (BCH)) como parte del Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la biotecnología sobre la biodiversidad. Se puede acceder a la base de datos, por ejemplo, a través de https://bch.cbd.int/database/gene-registry/.

Los ejemplos de transgenes o de genes efectores que pueden integrarse en genomas sin utilizar construcciones subdominantes o que pueden utilizarse como genes efectores en el contexto de construcciones subdominantes como se describe en el presente documento, incluyen (con el número de referencia/identificación del BCH entre paréntesis): Péptido 7Crp (n.° de ID BCH: 46121), 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa (NCED) (n.° de ID BCH: 45879), bloque génico triple (n.° de ID BCH: 45834), nitrilasa específica de bromoxinilo (n.° de ID b CH: 14976), Péptido CP (n.° de ID BCH: 104319), subunidad grande de acetil-CoA carboxilasa (n.° de ID Bc H: 102613), acetolactato sintasa (ALS) (n.° de ID BCH: 15177), acetolactato sintasa (ALS) quimérica (n.° de ID BCH: 15164), Filamina A (FLNA) (n.° de ID BCH: 45847), proteína portadora de acil-acilo tioesterasa CIFatB4 (n.° de ID BCH: 101362), proteína E3 (n.° de ID BCH: 45813), adiponectina (n.° de ID BCH: 46072), glucoquinasa dependiente de ADP (ADP-GK) (n.° de ID BCH: 45854), ácido acetohidroxi sintasa (n.° de ID Bc H: 48073), toxina colérica (n.° de ID BCH: 102896), antocianina 5-aciltransferasa (n.° de ID Bc H: 43794), apirasa (n.° de ID BCH: 48365), UDP-glucosa:sinapato glucosiltransferasa (n.° de ID BCH: 101523), inhibidor de la ribonucleasa barnasa (n.° de ID BCH: 14973), beta-lactamasa (n.° de ID b Ch : 14975), fitoeno desaturasa (n.° de ID BCH: 103621), ácidos grasos desaturasa 2 (n.° de ID BCH: 104323), catecol dioxigenasa (n.° de ID BCH: 45877), Cafeoil coenzimaA O-metiltransferasa (n.° de iD BCH: 102123), chaperonina que contiene el polipéptido 1 del complejo t (n.° de ID BCH: 45914), CDC25 (n.° de ID BCH: 102013), glucoproteína (Gp ) (n.° de ID BCH: 45851), cloranfenicol acetiltransferasa (n.° de ID BCH: 100382), Cinamoilo coenzimaA reductasa (n.° de ID BCH: 102122), complejo principal de histocompatibilidad clase III (n.° de ID BCH: 45905), complejo principal de histocompatibilidad clase III (n.° de ID BCH: 45906), complejo principal de histocompatibilidad clase III (n.° de ID BCH: 45907), proteína de cubierta del virus de la mancha anular de Odontoglossum (n.° de ID BCH: 45835), eritromicina ribosomal metilasa (n.° de ID BCH: 45859), eritromicina ribosomal metilasa A (n.° de ID BCH: 45860), péptido Cryj (n.° de ID BCH: 102150), proteína de choque en frío B (CSPB) (n.° de ID BCH: 103065), cianoficina sintasa (n.° de ID BCh : 103096), citocromo b (cyt-b) (n.° de ID BCH: 45832), ADN adenina metilasa (n.° de ID BCH: 15008), 5'metiltioadenosina nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45819), 5'metiltioadenosina (MTA) nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45820), 5'metiltioadenosina (MTA) nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45821), 5' metiltioadenosina (MTA) nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45827, n.° de ID BCH: 45828; n.° de ID BCH: 45829; n.° de ID BCH: 45830; n.° de ID BCH: 45831), dihidrodipicolinato sintasa (n.° de ID BCH: 14978), dicamba monooxigenasa (n.° de ID BCH: 100728), Doc1/Apc10 (n.° de ID BCH: 45817), nodD FITA (n.° de ID BCH: 45912), proteína fluorescente DsRed2 (n.° de ID BCH: 101476), proteína E1 (n.° de ID BCH: 45803), proteína E1 (n.° de ID BCH: 45811), proteína E4 (n.° de ID BCH: 45805), proteína E5 (n.° de ID BCH: 45806), elastina 100xELP (n.° de ID BCH: 103553), proteína E2 (n.° de ID BCH: 45812), proteína secretada A EPEC (n.° de ID BCH: 45844), factor de iniciación 4A (eIF4AI) (n.° de ID BCH: 46098), factor de iniciación 4A (eIF4AIII) (n.° de ID BCH: 45798), factor de iniciación 4A (eIF4AlI) (n.° de ID BCH: 45797), luciferasa de luciérnaga (n.° de ID b Ch : 104332), flavonoide hidroxilasa (n.° de ID BCH: 43793), Flavonoide 3'; 5' hidroxilasa (n.° de ID BCH: 15010), giberelina (GA) 20-oxidasa [giberelina; 2-oxoglutarato:oxígeno oxidorreductasa (20-hidroxilante; oxidante (n.° de ID Bc H: 103517), gamma-glutamilcisteína sintetasa (GSH) (n.° de ID BCH: 101271), inhibidor de la serina proteasa (n.° de ID BCH: 101929), ácido fítico bajo 1 (n.° de ID BCH: 103619), glucoproteína gl (n.° de ID BCH: 103649), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (n.° de ID BCH: 45837), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa doble mutante (n.° de ID BCH: 46333), glifosato-N-acetiltransferasa (GAT4621) (n.° de ID BCH: 48363), proteína de choque térmico 60 (n.° de ID BCH: 45842), Hormona de crecimiento de tilapia (n.° de ID BCH: 103750), Anclaje de hexa histidina (n.° de ID BCH: 103022), fosforribosil-ATP pirofosforilasa (PR-a Tp sintasa) (n.° de ID BCH: 46077), Sinapoilglucosa:colina sinapoiltransferasa (SCT); sinapina sintasa (n.° de ID BCH: 101519), zeaxantina epoxidasa (n.° de ID BCH: 100278), proteína E4 (n.° de ID BCH: 45814), hemaglutinina (HA) (n.° de ID BCH: 45883), proteína cristalina (n.° de ID Bc H: 102269), proteína Cry 1Ac truncada (n.° de ID BCH: 103215), proteína Cry1Ab/Ac (n.° de ID BCH: 103109), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (n.° de ID BCH: 45913), sacarosa:sacarosa 1 -fructosil transferasa (n.° de ID BCH: 46095), nitrato reductasas (n.° de ID BCH: 46097), proteína GIGANTEA (n.° de ID BCH: 45816), proteína killer 4 (n.° de ID BCH: 47790), proteína L1 (n.° de ID BCH: 45809), proteína L2 (n.° de ID BCH: 45810), lactoferrina (n.° de ID BCH: 45794), subunidad alfa de luciferasa (n.° de ID Bc H: 100377), subunidad beta de luciferasa (n.° de ID BCH: 100378), proteínas de matriz (M1) (n.° de ID BCH: 45881), intimina (n.° de ID BCH: 45843), metalotionenina 1A humana (n.° de ID BCH: 104312), complejo principal de histocompatibilidad clase I (n.° de ID BCH: 45899), complejo principal de histocompatibilidad clase II (n.° de ID BCH: 45900; n.° de ID BCH: 45903; n.° de ID BCH: 45904), complejo principal de histocompatibilidad clase I (n.° de ID BCH: 45901; n.° de ID BCH: 45902), miostatina (n.° de ID b Ch : 45853), proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle (F) (n.° de ID BCH: 48971), NodZ (n.° de ID BCH: 45910), NoIL (n.° de ID BCH: 45911), Proteína no estructural (NS2) (n.° de ID BCH: 45898), Nopalina sintasa (n.° de ID b Ch : 15171), Nucleoproteína (NP) (n.° de ID BCH: 45880), galactosidasa (n.° de ID BCH: 45875), beta-lactoglobulina (n.° de ID BCH: 45848), Orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (n.° de ID BCH: 46076), Orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (n.° de ID BCH: 46080), proteína P2X2 (n.° de ID BCH: 45878), subunidad PA de la polimerasa (n.° de ID BCH: 45895), subunidad PB1 de la polimerasa (n.° de ID BCH: 45886), subunidad PB2 de la polimerasa (n.° de ID BCH: 45894), fosfofructoquinasa (n.° de ID BCH: 104350), fosfomanosa isomerasa (PMI) (n.° de ID BCH: 15003), fitoeno sintasa 1 (n.° de ID Bc H: 103620), inhibidor de proteinasa II (n.° de ID BCH: 104338), galectina 1 (LGALS1) (n.° de ID BCH: 45796), poliedrina (n.° de ID BCH: 46002), PRP8 (n.° de ID BCH: 45908), PRP8 (n.° de ID BCH: 45909), proteína E7 (n.° de ID BCH: 45808), renina 2 (n.° de ID BCH: 45815), delta-endotoxiona mCry3A (n.° de ID BCH: 43634), ARN polimerasa 1 (n.° de ID b Ch : 101870), Inhibidor de la proteinasa de seda 2 (n.° de ID b Ch : 104313), proteína Cry1C (n.° de ID Bc H: 103217), estilbeno sintasa (n.° de ID BCH: 101520), proteína talina (n.° de ID BCH: 45799), Toxoide tetánico (n.° de ID BCH: 101618), transactivador controlado por tetraciclina (n.° de ID BCH: 101475), delta-endotoxina Cry1Ab (n.° de ID BCH: 14985), acetolactato sintasa (modificada de forma sintética) (n.° de ID BCH: 100268), 3"(9)-O-aminoglucósido adenilil transferasa (n.° de ID BCH: 15033), ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico sintasa (n.° de ID BCH: 15014), ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico sintasa (n.° de ID BCH: 15012), ácido 1-amino-ciclopropano-1-arboxílico desaminasa (n.° de ID BCH: 15013), acetohidroxiácido sintasa (por otro nombre, acetolactato sintasa; ALS) (n.° de ID BCH: 48364), acetolactato sintasa (n.° de ID BCH: 15007), alfa-amilasa termoestable (n.° de ID BCH: 14966), micolil-transferasa/antígeno 85A (n.° de ID BCH: 45818), aminoglucósido 3 fosfotransferasa II (APH-II) (n.° de ID Bc H: 14967), inhibidor de la ribonucleasa barstar (n.° de ID BCH: 14974), enzima ramificante 1 (n.° de ID BCH: 48366), enzima ramificante 2 (n.° de ID BCH: 48453), beta-galactósido alfa-2;6-sialiltransferasa (n.° de ID BCH: 45800), caseína alfa S1 (n.° de ID BCH: 45795), proteína de la cubierta de PLRV (n.° de ID BCH: 103751), proteína de la cubierta vírica de CMV (n.° de ID BCH: 15027), proteína de la cubierta (PC) vírica del PEMV (n.° de iD BCH: 101930), proteína de la cubierta vírica de PPV (n.° de ID BCH: 104309), proteína de la cubierta (PC) vírica del PRSV (n.° de ID BCH: 15026), proteína de la cubierta (PC) del virus transmitido por semilla del mosaico del guisante (n.° de iD BCH: 101940), proteína de la cubierta vírica de pVy (n.° de ID BCH: 15020), proteína de la cubierta vírica del WMV-2 (n.° de ID BCH: 15024), proteína de la cubierta vírica de ZYMV (n.° de ID Bc H: 15025), 5-enolpiruvulshikimato-3-fosfato sintasa (n.° de ID BCH: 14979), proteína Cry1A.105 (n.° de ID BCH: 43771), deltaendotoxina cry1Ac (n.° de ID BCH: 14986), delta-endotoxina cry1F (n.° de ID BCH: 14987), delta-endotoxina Cry2Ab (n.° de ID BCH: 14988), proteína cristalina Cry2Ae (n.° de ID Bc H: 101895), delta-endotoxina Cry34Ab1 (n.° de ID BCH: 14994), delta-endotoxina Cry35Av1 (n.° de ID BCH: 14995), delta-endotoxina cry3A (n.° de ID BCH: 14989), proteína Cry3Bb1 (n.° de ID BCH: 14993), delta-endotoxina Cry9c (n.° de ID BCH: 14996), acil-lípido desaturasa (n.° de ID BCH: 102160), proteína E2 (n.° de ID BCH: 45804), proteína E6 (n.° de ID BCH: 45807), endoquintinasa (n.° de ID BCH: 100280), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (n.° de ID BCH: 15000; n.° de ID BCH: 45463; n.° de ID BCH: 101942), glucoproteína de la envoltura del virus de la leucemia felina (n.° de ID BCH: 45046), proteínas gag del virus de la leucemia felina (n.° de ID BCH: 45047), transcriptasa inversa del virus de la leucemia felina (n.° de ID BCH: 45048), dihidroflavonol-4-reductasa (n.° de ID BCH: 15009), N-acetilglucosaminidasa (n.° de ID BCH: 45945), Densidad y distribución de estomas (n.° de ID BCH: 48460), Densidad y distribución de estomas (n.° de ID BCH: 48458), homólogos de genes de resistencia a Cladosporium fulvum de la región Vf (HcrVf) (n.° de ID BCH: 103738), fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) (n.° de ID BCH: 14972), ácido graso delta (12) deshidrogenasa (n.° de ID BCH: 100267), glifosato oxidorreductasa (n.° de ID BCH: 14998), sintasa de almidón unido a gránulos (n.° de ID BCH: 48072), proteína fluorescente verde (n.° de ID BCH: 45846), HSP70 (n.° de ID BCH: 101614; n.° de ID BCH: 45839; n.° de iD BCH: 45916), transportador de sacarosa de Hordeum vulgare (n.° de ID BCH: 45917), transportador de sacarosa de Hordeum vulgare 1 (HvSUT1) (n.° de ID BCH: 101594), Higromicina B fosfotransferasa (n.° de ID BCH: 100292; n.° de ID BCH: 14991), proteína de fusión de subunidades alfa y beta de luciferasa (n.° de ID BCH: 103755), LuxA; LuxB; LuxC; LuxD; LuxE (n.° de ID BCH: 45874), proteínas de matriz (M2) (n.° de iD BCH: 45882), proteína espidroína mayor I (n.° de ID BCH: 48455), proteína espidroína mayor II (n.° de ID BCH: 48456), proteína quinasa PK (n.° de ID BCH: 103650), proteína Cry2Ab2 (n.° de ID BCH: 43772), lipooxigenasa 3 (n.° de ID BCH: 48030), neuraminidasa (NA) (n.° de ID BCH: 45885), Proteína no estructural (NS1) (n.° de ID BCH: 45896), neomicina fosfotransferasa II (n.° de ID BCH: 15001), ácido quinolínico fosforribosiltransferasa (QPT) (n.° de ID BCH: 15416), replicasa/ARN polimerasa ARN dependiente [virus del enrollamiento de la hoja de patata] (n.° de ID BCH: 15019), helicasa (n.° de ID BCH: 15018), fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) (n.° de ID BCH: 15002), mio-inositolhexakisfosfato-3-fosfohidrolasa (3-fitasa) (n.° de ID BCH: 15378), poligalacturonasa (n.° de ID BCH: 15015), fibrinógeno (n.° de ID BCH: 45801), glucoproteína (n.° de ID BCH: 100344), proteína fluorescente roja (n.° de ID BCH: 103740), gen de resistencia 1 (n.° de ID BCH: 41317; n.° de ID BCH: 102164; n.° de ID BCH: 102155), gen de resistencia 2 (n.° de ID BCH: 41318), , gen de resistencia 3 (n.° de ID BCH: 102165)), S-adenosilmetionina hidrolasa (n.° de ID BCH: 15387), S-adenosilmetionina hidrolasa (SAM) (n.° de ID BCH: 15017), scFv BA11 (n.° de ID BCH: 103024), proteína de la seda de araña sintética (n.° de ID BCH: 48457), tioesterasa (TE) (n.° de ID BCH: 15005), betaglucuronidasa (n.° de ID BCH: 46004), aminoácido desaturasa 1 (n.° de ID BCH: 48368), proteína insecticida vegetativa 3A (n.° de ID BCH: 14990), proteína de la cápside VP60 (n.° de ID BCH: 102024), factores de transcripción WRKY45 (n.° de ID BCH: 103726), alfa-hordotionina (n.° de ID BCH: 46091), chaperonina que contiene el polipéptido 1 del complejo t (n.° de ID BCH 45840; n.° de ID BCH: 45915), endo-(1;3-1;4)-beta-glucanasa (n.° de ID BCH: 100274), proteína telAB (n.° de ID BCH: 103758), proteína kilA (n.° de ID b Ch : 103757), subunidad grande del sitio de unión al ribosoma de la ribulosa-bisfosfato carboxilasa (rbcL) (n.° de ID BCH: 102611), receptor de intimina translocada (n.° de ID BCH: 45845), insulina (n.° de ID BCH: 102337), proteína insecticida vegetativa 3Aa20 (n.° de ID BCH: 100887) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (n.° de ID BCH: 45836; n.° de ID BCH: 45838).

En determinadas realizaciones, el locus transgénico puede estar físicamente ligado al gen efector, que puede ser una parte o subsección de una molécula de ácido nucleico a introducir en un organismo, o puede estar insertado en el genoma de un organismo. En otras realizaciones, el locus transgénico puede no estar físicamente ligado o puede estarlo débilmente a un gen efector o a un rasgo agronómico de interés. Por consiguiente, el gen efector puede proporcionarse, por ejemplo, en un cromosoma distinto o en una posición distinta no ligada dentro del genoma, por ejemplo, puede obtenerse del listado de genes efectores proporcionado anteriormente en el presente documento.

La expresión "gen efector", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier gen o unidad que se puede expresar que confiera un efecto fenotípicamente detectable en un organismo o un grupo de organismos. Dicho gen efector puede proporcionar, por ejemplo, un efecto con respecto a las propiedades bioquímicas de un organismo o sus células, por ejemplo, la proporción, reducción o supresión de actividades enzimáticas, la proporción de interfaces de interacción con factores reguladores, la expresión de nuevos genes o nuevos patrones de expresión de genes endógenos. El gen efector puede proporcionar además efectos al organismo con respecto a la susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, una resistencia a una enfermedad o insensibilidad a una enfermedad, o alternativamente una vulnerabilidad aumentada a una enfermedad. Por ejemplo, se puede proporcionar como efecto una resistencia a infecciones víricas, infecciones bacterianas, infecciones por protistas, infecciones fúngicas o infecciones por nematodos.

Otros ejemplos de efectos previstos son un rasgo agronómico, por ejemplo, un rasgo que conduce al aumento del rendimiento de una planta, resistencia a influencias ambientales tales como la temperatura, el estrés salino, el suministro de agua, el suministro de nitrógeno, etc. Los genes efectores preferentes son un gen de insensibilidad al virus del dengue, un gen de insensibilidad a la malaria humana, un gen de insensibilidad a la malaria aviar, un gen de insensibilidad al virus del bronceado del tomate, un gen de resistencia a herbicidas, un gen insecticida, un gen de resistencia a la sequía, un gen de resistencia a nematodos parásitos y un gen que produce un rendimiento mejorado de la planta.

Los genes de insensibilidad a la malaria humana son preferentes genes que codifican péptidos tales como TP10 (que codifica un péptido con la secuencia AGYLLGKINLKALAALAKKIL; SEQ ID NO: 1), Angll (que codifica un péptido con el péptido de secuencia, DRVYIHPF; SEQ ID NO: 2) o genes que codifican anticuerpos monocatenarios tales como m1C3 (número de referencia de GenBank HQ315886), m4B7 (número de referencia de GenBank HQ315885) o m2A10 (número de referencia de GenBank HQ315884). Un gen de insensibilidad a la malaria aviar preferente es un gen que codifica un péptido tal como Angll (que comprende la secuencia DRVYIHPF (SEQ ID NO: 2) como se mencionó anteriormente).

Para la aplicación en organismos vegetales, la presente invención prevé preferentemente el uso de uno o más genes efectores o transgenes seleccionados del grupo que comprende: Péptido 7Crp (n.° de ID BCH: 46121), 9-cisepoxicarotenoide dioxigenasa (NCED) (n.° de iD BCH: 45879), bloque génico triple (n.° de ID BCH: 45834), nitrilasa específica de bromoxinilo (n.° de ID BCH: 14976), Péptido CP (n.° de ID BCH: 104319), subunidad grande de acetil-CoA carboxilasa (n.° de iD BCH: 102613), acetolactato sintasa (ALS) (n.° de ID BCH: 15177), acetolactato sintasa (ALS) quimérica (n.° de ID BCH: 15164), Filamina A (FLNA) (n.° de ID Bc H: 45847), proteína portadora de acil-acilo tioesterasa CIFatB4 (n.° de ID BCH: 101362), proteína E3 (n° de ID BCH: 45813), adiponectina (n° de ID BCH: 46072), glucoquinasa dependiente de ADP (ADP-GK) (n.° de ID BCH: 45854), ácido acetohidroxi sintasa (n.° de ID BCH: 48073), toxina colérica (n.° de ID BCH: 102896), antocianina 5-aciltransferasa (n.° de ID BCH: 43794), apirasa (n.° de ID BCH: 48365), UDP-glucosa:sinapato glucosiltransferasa (n.° de ID BCH: 101523), inhibidor de la ribonucleasa barnasa (n.° de ID BCH: 14973), beta-lactamasa (n.° de ID BCH: 14975), fitoeno desaturasa (n.° de ID BCH: 103621), ácidos grasos desaturasa 2 (n.° de ID BCH: 104323), catecol dioxigenasa (n.° de ID BCH: 45877), Cafeoil coenzimaA O-metiltransferasa (n.° de ID BCH: 102123), chaperonina que contiene el polipéptido 1 del complejo t (n.° de ID BCH: 45914), CDC25 (n.° de ID BCH: 102013), glicoproteína GP (n.° de ID BCH: 45851), cloranfenicol acetiltransferasa (n.° de ID BCH: 100382), Cinamoilo coenzimaA reductasa (n.° de ID BCH: 102122), complejo principal de histocompatibilidad clase III (n.° de ID BCH: 45905), complejo principal de histocompatibilidad clase III (n.° de ID BCH: 45906), complejo principal de histocompatibilidad clase i Ii (n.° de ID BCH: 45907), proteína de cubierta del virus de la mancha anular de Odontoglossum (n.° de ID BCH: 45835), eritromicina ribosomal metilasa (n.° de ID BCH: 45859), eritromicina ribosomal metilasa A (n.° de ID BCH: 45860), péptido Cryj (n.° de ID BCH: 102150), proteína de choque en frío B (CSPB) (n.° de ID BCH: 103065), cianoficina sintasa (n.° de ID BCH: 103096), citocromo b (cyt-b) (n.° de ID BCH: 45832), a DN adenina metilasa (n.° de ID BCH: 15008), 5'metiltioadenosina nucleosidasa (n° de ID BCH: 45819), 5'metiltioadenosina (MTA) nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45820), 5'metiltioadenosina (MTA) nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45821), 5' metiltioadenosina (MTA) nucleosidasa (n.° de ID BCH: 45827, n.° de ID BCH: 45828; n.° de ID BCH: 45829; n.° de ID BCH: 45830; n.° de ID BCH: 45831), dihidrodipicolinato sintasa (n.° de ID BCH: 14978), dicamba monooxigenasa (n.° de ID BCH: 100728), Doc1/Apc10 (n.° de ID BCH: 45817), nodD FITA (n.° de ID BCH: 45912), proteína fluorescente DsRed2 (n.° de ID BCH: 101476), proteína E1 (n.° de ID BCH: 45803), proteína E1 (n.° de iD BCH: 45811), proteína E4 (n.° de ID BCH: 45805), proteína E5 (n.° de ID BCH: 45806), elastina 100xELP (n.° de ID BCH: 103553), proteína E2 (n.° de ID BCH: 45812), proteína secretada A EPEC (n.° de ID BCH: 45844), factor de iniciación 4A (elF4Al) (n.° de ID BCH: 46098), factor de iniciación 4A (eIF4AIII) (n.° de ID BCH: 45798), factor de iniciación 4A (eIF4AII) (n.° de ID BCH: 45797), luciferasa de luciérnaga (n.° de ID BCh : 104332), flavonoide hidroxilasa (n.° de ID BCH: 43793), Flavonoide 3'; 5' hidroxilasa (n.° de ID BCH: 15010), giberelina (GA) 20-oxidasa [giberelina; 2-oxoglutarato:oxígeno oxidorreductasa (20-hidroxilante; oxidante (n.° de ID BCH: 103517), gamma-glutamilcisteína sintetasa (GSH) (n.° de ID BCH: 101271), inhibidor de la serina proteasa (n.° de ID BCH: 101929), ácido fítico bajo 1 (n.° de ID BCH: 103619), glucoproteína gl (n.° de ID BCH: 103649), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (n.° de ID BCH: 45837), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa doble mutante (n.° de ID BCH: 46333), glifosato-N-acetiltransferasa (GAT4621) (n.° de ID BCH: 48363), proteína de choque térmico 60 (n.° de ID BCH: 45842), hormona de crecimiento de tilapia (n.° de ID BCH:103750), Anclaje de hexa histidina (n.° de ID BCH: 103022), fosforribosil-ATP pirofosforilasa (PR-ATP sintasa) (n.° de ID BCH: 46077), Sinapoilglucosa:colina sinapoiltransferasa (SCT); sinapina sintasa (n.° de ID BCH: 101519), zeaxantina epoxidasa (n.° de ID BCH: 100278), proteína E4 (n.° de ID BCH: 45814), hemaglutinina (HA) (n.° de ID Bc H: 45883), proteína cristalina (n.° de ID BCH: 102269), proteína Cry 1Ac truncada (n.° de ID BCH: 103215), proteína Cry1Ab/Ac (n.° de ID BCH: 103109), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (n.° de ID BCH: 45913), sacarosa:sacarosa 1 -fructosil transferasa (n.° de ID Bc H: 46095), nitrato reductasas (n.° de ID BCH: 46097), proteína GIGANTEA (n.° de ID BCH: 45816), proteína killer 4 (n.° de ID BCH: 47790), proteína L1 (n.° de ID BCH: 45809), proteína L2 (n.° de ID BCH: 45810), lactoferrina (n.° de ID BCH: 45794), subunidad alfa de luciferasa (n.° de ID b Ch : 100377), subunidad beta de luciferasa (n.° de ID BCH: 100378), proteínas de matriz (M1) (n.° de ID BCH: 45881), intimina (n.° de ID BCH: 45843), metalotionenina 1A humana (n.° de ID BCH: 104312), complejo principal de histocompatibilidad clase I (n.° de ID BCH: 45899), complejo principal de histocompatibilidad clase II (n.° de ID BCH: 45900; n.° de ID BCH: 45903; n.° de ID BCH: 45904), complejo principal de histocompatibilidad clase I (n.° de ID BCH: 45901; n.° de ID BCH: 45902), miostatina (n.° de ID Bc H: 45853), proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle (F) (n.° de ID BCH: 48971), NodZ (n.° de ID BCH: 45910), NolL (n.° de ID BCH: 45911), Proteína no estructural (NS2) (n.° de ID BCH: 45898), Nopalina sintasa (n.° de ID BCH: 15171), Nucleoproteína (NP) (n.° de ID BCH: 45880), galactosidasa (n.° de ID Bc H: 45875), beta-lactoglobulina (n.° de ID BCH: 45848), orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (n.° de ID Bc H: 46076), Orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (n.° de ID BCH: 46080), proteína P2X2 (n.° de ID BCH: 45878), subunidad PA de la polimerasa (n.° de ID BCH: 45895), subunidad PB1 de la polimerasa (n.° de ID BCH: 45886), subunidad PB2 de la polimerasa (n.° de ID BCH: 45894), fosfofructoquinasa (n.° de ID BCH: 104350), fosfomanosa isomerasa (PMI) (n.° de ID BCH: 15003), fitoeno sintasa 1 (n.° de ID BCH: 103620), inhibidor de proteinasa II (n.° de ID BCH: 104338), galectina 1 (LGALS1) (n.° de ID BCH: 45796), poliedrina (n.° de ID BCH: 46002), PRP8 (n.° de ID BCH: 45908), PRP8 (n.° de ID BCH: 45909), proteína E7 (n.° de ID BCH: 45808), renina 2 (n.° de ID BCH: 45815), delta-endotoxiona mCry3A (n.° de ID BCH: 43634), ARN polimerasa 1 (n.° de ID BCH: 101870), Inhibidor de la proteinasa de seda 2 (n.° de ID b Ch : 104313), proteína Cry1C (n.° de ID BCH: 103217), estilbeno sintasa (n.° de ID BCH: 101520), proteína talina (n.° de ID BCH: 45799), Toxoide tetánico (n.° de ID BCH: 101618), transactivador controlado por tetraciclina (n.° de ID BCH: 101475), delta-endotoxina Cry1Ab (n.° de ID BCH: 14985), acetolactato sintasa (modificada de forma sintética) (n.° de ID BCH: 100268), 3"(9)-O-aminoglucósido adenilil transferasa (n.° de ID BCH: 15033), ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico sintasa (n.° de ID BCH: 15014), ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico sintasa (n.° de ID BCH: 15012), ácido 1-amino-ciclopropano-1-arboxílico desaminasa (n.° de ID BCH: 15013), acetohidroxiácido sintasa (por otro nombre, acetolactato sintasa; ALS) (n.° de ID BCH: 48364), acetolactato sintasa (n.° de ID BCH: 15007), alfa-amilasa termoestable (n.° de ID BCH: 14966), micoliltransferasa/antígeno 85A (n.° de ID BCH: 45818), aminoglucósido 3 fosfotransferasa II (APH-II) (n.° de ID BCH: 14967), inhibidor de la ribonucleasa barstar (n.° de ID BCH: 14974), enzima ramificante 1 (n.° de ID BCH: 48366), enzima ramificante 2 (n.° de ID BCH: 48453), beta-galactósido alfa-2;6-sialiltransferasa (n.° de ID BCH: 45800), caseína alfa S1 (n.° de ID Bc H: 45795), proteína de la cubierta de PLRV (n.° de ID BCH: 103751), proteína de la cubierta vírica de CMV (n.° de ID BCH: 15027), proteína de la cubierta (PC) vírica del PEMV (n.° de ID BCH: 101930), proteína de la cubierta vírica de PPV (n.° de ID BCH: 104309), proteína de la cubierta (PC) vírica del PRSV (n.° de ID BCH: 15026), proteína de la cubierta (PC) del virus transmitido por semilla del mosaico del guisante (n.° de ID BCH: 101940), proteína de la cubierta vírica de Pv Y (n.° de ID BCH: 15020), proteína de la cubierta vírica del WMV-2 (n.° de ID Bc H: 15024), proteína de la cubierta vírica de ZYMV (n.° de ID BCH: 15025), 5-enolpiruvulshikimato-3-fosfato sintasa (n.° de ID BCH: 14979), proteína Cry1A.105 (n.° de ID BCH: 43771), delta-endotoxina cry1Ac (n.° de ID BCH: 14986), deltaendotoxina cry1F (n.° de iD BCH: 14987), delta-endotoxina Cry2Ab (n.° de ID BCH: 14988), proteína cristalina Cry2Ae (n.° de ID BCH: 101895), delta-endotoxina Cry34Ab1 (n.° de ID BCH: 14994), delta-endotoxina Cry35Av1 (n.° de ID BCH: 14995), delta-endotoxina cry3A (n.° de ID BCH: 14989), proteína Cry3Bb1 (n.° de ID BCH: 14993), deltaendotoxina Cry9c (n.° de ID BCH: 14996), acil-lípido desaturasa (n.° de ID Bc H: 102160), proteína E2 (n.° de ID BCH: 45804), proteína E6 (n.° de ID BCH: 45807), endoquintinasa (n.° de ID BCH: 100280), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (n.° de ID BCH: 15000; n.° de ID b Ch : 45463; n.° de ID BCH: 101942), glucoproteína de la envoltura del virus de la leucemia felina (n.° de ID BCH: 45046), proteínas gag del virus de la leucemia felina (n.° de ID BCH: 45047), transcriptasa inversa del virus de la leucemia felina (n.° de ID BCH: 45048), dihidroflavonol-4-reductasa (n.° de ID BCH: 15009), N-acetilglucosaminidasa (n.° de ID Bc H: 45945), Densidad y distribución de estomas (n.° de ID BCH: 48460), Densidad y distribución de estomas (n.° de ID BCH: 48458), homólogos de genes de resistencia a Cladosporium fulvum de la región Vf (HcrVf) (n.° de ID BCH: 103738), fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) (n.° de ID BCH: 14972), ácido graso delta (12) deshidrogenasa (n.° de ID BCH: 100267), glifosato oxidorreductasa (n.° de ID BCH: 14998), sintasa de almidón unido a gránulos (n.° de ID BCH: 48072), proteína fluorescente verde (n.° de ID BCH: 45846), HSP70 (n.° de ID BCH: 101614; n.° de ID BCH: 45839; n.° de ID BCH: 45916), transportador de sacarosa de Hordeum vulgare (n.° de ID BCH: 45917), transportador de sacarosa de Hordeum vulgare 1 (HvSUT1) (n.° de ID BCH: 101594), Higromicina B fosfotransferasa (n.° de ID BCH: 100292; n.° de ID BCH: 14991), proteína de fusión de subunidades alfa y beta de luciferasa (n.° de ID BCH: 103755), LuxA; LuxB; LuxC; LuxD; LuxE (n.° de ID BCH: 45874), proteínas de matriz (M2) (n.° de ID BCH: 45882), proteína espidroína mayor I (n.° de ID BCH: 48455), proteína espidroína mayor II (n.° de ID BCH: 48456), proteína quinasa PK (n.° de ID Bc H: 103650), proteína Cry2Ab2 (n.° de ID BCH: 43772), lipooxigenasa 3 (n.° de ID BCH: 48030), neuraminidasa (NA) (n.° de ID BCH: 45885), Proteína no estructural (Ns 1) (n.° de ID BCH: 45896), neomicina fosfotransferasa II (n.° de ID BCH: 15001), ácido quinolínico fosforribosiltransferasa (QPT) (n.° de ID BCH: 15416), replicasa/ARN polimerasa ARN dependiente [virus del enrollamiento de la hoja de patata] (n.° de ID BCH: 15019), helicasa (n.° de ID BCH: 15018), fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) (n.° de ID BCH: 15002), mio-inositol-hexakisfosfato-3-fosfohidrolasa (3-fitasa) (n.° de ID BCH: 15378), poligalacturonasa (n.° de ID BCH: 15015), fibrinógeno (n.° de ID BCH: 45801), glucoproteína (n.° de ID BCH: 100344), proteína fluorescente roja (n.° de ID b Ch : 103740), gen de resistencia 1 (n.° de iD BCH: 41317; n.° de ID BCH: 102164; n.° de ID BCH: 102155), gen de resistencia 2 (n.° de ID BCH: 41318), , gen de resistencia 3 (n.° de ID BCH: 102165)), S-adenosilmetionina hidrolasa (n.° de ID Bc H: 15387), S-adenosil-metionina (SAM) hidrolasa (n.° de ID BCH: 15017), scFv BA11 (n.° de ID BCH: 103024), proteína de la seda de araña sintética (n.° de ID BCH: 48457), tioesterasa (Te ) (n.° de ID BCH: 15005), beta-glucuronidasa (n.° de ID BCH: 46004), aminoácido desaturasa 1 (n.° de ID BCH: 48368), proteína insecticida vegetativa 3A (n.° de ID BCH: 14990), proteína de la cápside VP60 (n.° de ID BCH: 102024), factores de transcripción WRKY45 (n.° de ID BCH: 103726), alfa-hordotionina (n.° de ID BCH: 46091), chaperonina que contiene el polipéptido 1 del complejo t (n.° de ID BCH 45840; n.° de ID BCH: 45915), endo-(1;3-1;4)-beta-glucanasa (n.° de ID BCH: 100274), proteína telAB (n.° de ID BCH: 103758), proteína kilA (n.° de ID BCH: 103757), subunidad grande del sitio de unión al ribosoma de la ribulosa-bisfosfato carboxilasa (rbcL) (n.° de ID BCH: 102611), receptor de intimina translocada (n.° de ID BCH: 45845), insulina (n.° de ID BCH: 102337), proteína insecticida vegetativa 3Aa20 (n.° de ID BCH: 100887) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDh ) (n.° de ID BCH: 45836; n.° de ID BCH: 45838).

La expresión "gen haploinsuficiente", como se usa en el presente documento, se refiere a un gen o un grupo de genes parálogos que son sustancialmente redundantes desde el punto de vista funcional, que están presentes en el genoma de un organismo en el que una reducción en los niveles de expresión con respecto a una situación de tipo silvestre provoca un fenotipo que da como resultado una reducción de la aptitud competitiva y donde este fenotipo solo podría ser rescatado parcialmente por un único alelo transgénico que incluye una única copia o múltiples copias de rescate del gen haploinsuficiente, por ejemplo, una o más construcciones subdominantes. La idoneidad de un gen haploinsuficiente para un enfoque según lo previsto en el presente documento puede analizarse mediante cualquier experimento adecuado o basarse en cualquier situación molecular adecuada. Por ejemplo, los datos experimentales que se pueden utilizar para indicar que un gen o una familia paráloga de genes funcionalmente redundantes son adecuadamente haploinsuficientes. Dichos datos experimentales pueden incluir datos fenotípicos de heterocigotos, de mutaciones anuladoras, de mutaciones hipomórficas, de alelos de baja expresividad, de aneuploides cromosómicos y de deleciones cromosómicas. Las técnicas adicionales que pueden suprimir genes específicos o familias de genes a través de una degradación potenciada de ARNm o inhibir la traducción de ARNm también pueden proporcionar evidencia para apoyar la haploinsuficiencia. Los datos que sugieren haploinsuficiencia en una especie pueden indicar haploinsuficiencia en genes homólogos en otras especies y, por consiguiente, pueden utilizarse como punto de partida para los experimentos correspondientes.

La haploinsuficiencia puede considerarse en determinadas realizaciones como un efecto de dosificación dominante de un fenotipo que surge cuando solo hay un nivel normal de expresión a partir de una copia génica, por ejemplo, si una única copia genética es insuficiente para mantener un estado de expresión de tipo silvestre. La haploinsuficiencia, por ejemplo, está asociada con determinados componentes proteicos que forman los ribosomas. Los ribosomas contienen normalmente 60-80 componentes proteicos en las distintas especies, designados como proteínas ribosómicas citoplasmáticas (las PRC) o proteínas ribosómicas mitocondriales (las PRM). Las mutaciones que dan como resultado una pérdida de la función de las PRC normalmente puede dar como resultado un fenotipo de aptitud reducida, por ejemplo, el fenotipo Minute, cuando son hemicigóticas o heterocigóticas, y pueden ser letales como homocigóticas. En Drosophila melanogaster este fenotipo puede asociarse con un mayor tiempo de desarrollo, cerdas más delgadas y una reducción en la viabilidad y la fertilidad, que se supone es el resultado de una reducción en la tasa de producción de proteínas (véase también Marygold y col. 2007, Genome Biol. 8:R216), así como varios defectos morfológicos. La haploinsuficiencia ligada a las proteínas ribosómicas citoplasmáticas se puede encontrar en una amplia diversidad de organismos y se ha descrito en una amplia variedad de especies con reproducción sexual, incluidos los humanos (véase Gazda, H. T. y col., 2004, Br. J. Haematol. 127:105-113.), los ratones (véase Oliver y col., 2004, Development 131:3907-3920), el pez cebra (véase Amsterdam y col., 2004, PLoS Biol. 2:E139), la planta Arabodopsis thaliana (véase Weijers y col., 2001, Development 128:4289-4299) y en levadura (véase Deutschbauer y col., 2005, Genetics 169: 1915-1925).

La haploinsuficiencia puede, aparte de los locus de PRC, incluir también o estar asociada con varios otros genes en varios organismos. A continuación en la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de genes haploinsuficientes previstos por la presente invención:

Tabla 1

Reino Especie genes de Referencia Otros Referencia PRC genes

Animales Caenorhabditis elegans (nematodo) gld-1 Jones y Schdel

1995

Drosophile melanogaster (mosca 64 PRC Marygold y col. Mlc-2 Warmke y col. 1992 de fruta) 2007

Nasonia vitripennis (avispa) ho Pultz y col. 2000 Tribollum castaneum (escarabajo mxp Shippy y col. 2000 de la harina)

Felis sylvestris (gato) CRX Menotti-Raymond y col. 2010 Canis lupus (perro) T Haworth y col. 2001 Mesocricetus auratus (hámster) Wh Hodgkinson y col.

1998

Mus musculus (ratón) RpL24 Oliver y col. 2004 DII4 Krebs y col. 2004 Rattus norvegicus (rata) TSC2 Habib y col. 2008 Homo sapiens (humano) RpS19 Choesmel y col. Nkx 2-1 Pohlenz y col. 2002

2007

Macaca mulatta (macaco) TCOF1 Shows y col. 2006 Danio rerio (pez cebra) 11 PRC Amsterdam y col.

2004

Hongos Aspergillus nidulans (moho) prpA Sermighini y col.

2006

Candida albicans (levadura CBK1 Uhl y col. 2003 intestinal)

Saccharomyces cerevisiae 72 PRC Deutschbauer y TLC1 Mozdy y Cech 2006 (levadura) col. 2005

Schizosaccharomyces pombe 8 PRC Kim y col. 2010 taf12 Kim y col. 2010 (levadura de fisión)

Plantas Arabidopsis thaliana (berro de AtRpS5a/b Weijers y col. 2001 ERL2 Pillitteri y col. 2007 thale)

Pisum sativum (guisante) CRY1 Platten y col. 2005 Solanum lycopersicum (tomate) CRY1 Weller y col. 2001

Otros ejemplos previstos de genes haploinsuficientes incluyen un factor de transcripción (se pueden obtener más detalles de Seidman y Seidman, 2002, The Journal of Clinical Investigation, 109: 451-455); se pueden obtener más detalles de un gen supresor tumoral de Santarosa y Ashworth, 2004, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer 1654: 105-122); un gen relacionado con la función muscular o un gen codificante de la proteína de homeodominio (se pueden obtener más detalles de Cook, y col., 2012, Genome Biology 13:R21).

Los ejemplos particularmente previstos de genes haploinsuficientes, que puede utilizarse dentro del contexto de la presente invención, incluyen los genes Drosophila melanogaster, RPl 36, Rp L35, RPL17, RPS6, RPL37A, RPS19A, RPS5A, RPS10B, DPP, RPL37A, RPL36A, RPS13, RPL13, RPL7, RPL9, RPL24, RPL31, RPS11, RPS15, RPL18A, RPL11, RPL23, RPL12A, RPL39A, RPL23A, RPL8, RPL28, RPL18, RPL14, RPS4, RPL10, RPL35A, RPL13A, RPL34B, SU(VAR)3-9, ABD-B, RPS3, RPL27, RPL4, RPS8, RPL32, RPS7, RPL6, N, HUPB, RUN, S, PKD2, B, MHC, LOK, VG, NP/CG34350C, PCL, BSD, DLL, KR, MTRM, PC, SCR, TM2, ACT88F, UBX, DL, BNL, H, E, P53, MLC2. También se contemplan homólogos de estos genes en otras especies. En una realización preferente, puede llevarse a cabo en Drosophila melanogaster un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo como se define en el presente documento, sobre la base de uno o más de estos genes haploinsuficientes. En realizaciones adicionales, puede llevarse a cabo un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo como se define en el presente documento en un organismo distinto, por ejemplo, en una mosca, insecto o artrópodo, sobre la base de un homólogo de uno o más de estos genes haploinsuficientes.

En realizaciones adicionales, un gen haploinsuficiente de acuerdo con la presente invención puede ser un gen seleccionado del listado de genes de Homo sapiens, TP73, DFFB, KCNAB2, CHD5, CAMTA1, PINK1, SAM68, KCNQ4, GLUT1, MYH, FOXE3, HUD, INK4C, NFIA, CCN1, ABCA4, WNT2B, ADAR, ATP1A2, MPZ, MYOC, HRPT2, LRH-1, IRF6, PROX1, TP53BP2, NLRP3, ID2, MYCN, GCKR, SPAST, MSH6, FSHR, SPR, PAX8, SMADIP1, RPRM, SCN1A, HOXD13, COL3A1, SLC40A1, SATB2, SUMO1, BMPR2, XRCC5, PAX3, STK25, CHL1, SRGAP3, VHL, GHRL, PPARG, SRG3, RASSF1A, TKT, MITF, FOXP1, ROBO1, DIRC2, ATP2C1, FOXL2, ATR, SI, TERC, SOX2, OPA1, TFRC, FGFR3, LETM1, SH3BP2, MSX1, RBPJ, PHOX2B, ENAM, MAPK10, PKD2, SNCA, RIEG, ANK2, MAD2L1, PLK4, FBXW7, TERT, SEMA5A, GDNF, FGF10, PIK3R1, APC, RAD50, SMAD5, EGR1, TCOF1, NPM1, NKX2-5, MSX2, NSD1, FOXC1, DSP, EEF1E1, TNXA, TNX, HMGA1, RUNX2, CD2AP, ELOVL4, NT5E, SIM1, COL10A1, PARK2, TWIST1, GLI3, GCK, FKBP6, ELN, LIMK1, RFC2, GTF3, GTF2I, NCF1, KRIT1, COL1A2, SHFM1, RELN, FOXP2, CAV1, ST7, BRAF, SHH, HLXB9, GATA4, NKX3-1, FGFR1, CHD7, CSN5, EYA1, TRPS1, DMRT1, DMRT2, MLLT3, ARF, CDKN2B, BAG1, PAX5, GCNT1, ROR2, PTCH1, NR5A1, LMX1B, ENG, TSC1, COL5A1, NOTCH1, EHMT1, KLF6, GATA3, ANX7, PTEN, PAX2, FGF8, BUB3, CDKN1C, NUP98, PAX6, WT1, EXT2, ALX4, FEN1, SF1, FGF3, FZD4, ATM, H2AX, FLI1, NFRKB, PHB2, ETV6, CDKN1B, COL2A1, KRT5, MYF6, IGF1, SERCA2, TBX5, TBX3, HNF1A, BRCA2, FKHR, RB1, ZIC2, LIG4, COCH, NPAS3, NKX2-1, PAX9, BMP4, GCH1, SIX6, RAD51B, BCL11B, SPRED1, BUBR1, DLL4, FBN1, ALDH1A2, TPM1, P450SCC, BLM, COUP-TFII, SOX8, TSC2, PKD1, CBP, SOCS1, PRM2, PRM1, ABCC6, ERAF, SALL1, CBFB, CTCF, WWOX, FOXF1, FOXC2, YWHAE, HIC1, LIS1, P53, PMP22, COPS3, RAI1, TOP3A, SHMT1, RNF135, NF1, SUZ12, MEL-18, KLHL10, STAT5B, STAT5A, BECN1, BRCA1, PGRN, MAPT, CSH1, POLG2, PRKAR1A, SOX9, NHERF1, FSCN2, DSG1, DSG2, TCF4, FECH, MC4R, GALR1, SALL3, LKB1, PNPLA6, RYR1, TGFB1, RPS19, DMPK, CRX, PRPF31, JAG1, PAX1, GDF5, HNF4A, SALL4, MC3R, RAE1, GNAS, EDN3, KCNQ2, SOX18, SLC5A3, RUNX1, DYRK1A, COL6A1, PRODH, DGCR2, HIRA, TBX1, COMT, RTN4R, PCQAP, LZTR1, INI1, MYH9, SOX10, FBLN1, PPARA, PROSAP2, SHOX, P2RY8, NLGN4X, TRAPPC2, RPS4X y CSF2RA. Además, se contemplan homólogos de estos genes en otras especies. En una realización preferente, puede llevarse a cabo en un mamífero o animal superior un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo como se define en el presente documento sobre la base de uno o más de estos genes haploinsuficientes o sobre la base de un homólogo de uno o más de estos genes haploinsuficientes.

En un grupo adicional de realizaciones, un gen haploinsuficiente de acuerdo con la presente invención puede ser un gen seleccionado del listado de genes de Arabidopsis thaliana, RPSaA, RPSaB, RPS2A, RPS2B, RPS2C, RPS2D, RPS3A, RPS3B, RPS3C, RPS3aA, RPS3aB, RPS4A, RPS4B, RPS4C, RPS4D, RPS5A, RPS5B, RPS6A, RPS6B, RPS7A, RPS7B, RPS7C, RPS8A, RPS8B, RPS9A, RPS9B, RPS9C, RPS10A, RPS10B, RPS10C, RPS11A, RPS11B, RPS11C, RPS12A, RPS12B, RPS12C, RPS13A, RPS13B(A), RPS14A, RPS14B, RPS14C, RPS15A, RPS15B, RPS15C, RPS15D, RPS15E, RPS15F, RPS15aA, RPS15aB, RPS15aC, RPS15aD, RPS15aE, RPS15aF, RPS16A, RPS16B, RPS16C, RPS17A, RPS17B, RPS17C, RPS17D, RPS18A(A), RPS18B (B), RPS18C(C), RPS19A, RPS19B, RPS19C, RPS20A, RPS20B, RPS20C, RPS21A, RPS21B, RPS21C, RPS23A, RPS23B, RPS24A, RPS24B, RPS25A, RPS25B, RPS25C, RPS25D, RPS25E, RPS26B, RPS26A, RPS26C, RPS27A(C), RPS27B (A), RPS27D (B), RPS27aA, RPS27aB, RPS27aC, RPS28A, RPS28B, RPS28C, RPS29A, RPS29B, RPS29C, RPS29D, RPS30A, RPS30B, RPS30C, RPP0A, RPP0B, RPP0C, RPP1A, RPP1B, RPP1C, RPP2A, RPP2B, RPP2C, RPP2D, RPP2E, RPP3A, RPP3B, RPL3A(1), RPL3B(2), RPL3C, RPL4A, RPL4B, RPL4C, RPL4D, RPL5A, RPL5B, RPL5C, RPL6A, RPL6B, RPL6C, RPL7A, RPL7B, RPL7C, RPL7D, RPL7aA, RPL7aB, RPL8A, RPL8B, RPL8C, RPL9A, RPL9B, RPL9C, RPL9D, RPL10A, RPL10B, RPL10C, RPL10aA, RPL10aB, RPL10aC, RPL11A(A), RPL11B, RPL11C(B), RPL11D, RPL12A, RPL12B, RPL12C, RPL13A, RPL13B, RPL13C, RPL13D, RPL13aA, RPL13aB, RPL13aC, RPL13aD, RPL14A, RPL14B, RPL15A, RPL15B, RPL17A, RPL17B, RPL18A, RPL18B, RPL18C, RPL18aA, RPL18aB, RPL18aC, RPL19A, RPL19B, RPL19C, RPL21A, RPL21B, RPL21C, RPL21D, RPL21E, RPL21F, RPL22A, RPL22B, RPL22C, RPL23A, RPL23B, RPL23C, RPL23aA(2), RPL23aB(3), RPL24A, RPL24B, RPL26A, RPL26B, RPL27A, RPL27B, RPL27C, RPL27aA, RPL27aB, RPL27aC, RPL28A, RPL28B, RPL28C, RPL29A, RPL29B, RPL30A, RPL30B, RPL30C, RPL31A, RPL31B, RPL31C, RPL32A, RPL32B, RPL34A, RPL34B, RPL34C, RPL35A, RPL35B, RPL35C, RPL35D, RPL35aA, RPL35aB, RPL35aC, RPL35aD, RPL36A, RPL36B, RPL36C, colRPL36aA, RPL36aB, RPL37A, RPL37B, RPL37C, RPL37aA, RPL37aB, RPL37aC, RPL38A, RPL38B, RPL39A, RPL39B, RPL39C, RPL40A, RPL40B, RPL41A, RPL41B, RPL41C, RPL41D, RPL41E, RPL41F y RPL41G. También se contemplan homólogos de estos genes en otras especies. En una realización preferente, puede llevarse a cabo en Arabidopsis thaliana un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo como se define en el presente documento, sobre la base de uno o más de estos genes haploinsuficientes. En realizaciones adicionales, puede llevarse a cabo un procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo como se define en el presente documento en un organismo distinto, por ejemplo, en una planta distinta, sobre la base de un homólogo de uno o más de estos genes haploinsuficientes. Es particularmente preferente el uso del gen haploinsuficiente RpL14 (que tiene el número de referencia de HomoloGene: 68375) o Rpl 23aA (que tiene el número de referencia de HomoloGene: 110453).

En una primera etapa del procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo de acuerdo con la invención, se reduce la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo. La reducción puede ser una reducción de la expresión de tipo silvestre normal o típica de un gen haploinsuficiente en un valor de aproximadamente el 10 % 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en hemicigotos.

Es preferente que esta reducción se produzca en al menos un subconjunto de células que sean haploinsuficientes sensibles que puedan contribuir a un fenotipo reductor de la aptitud. Ha de entenderse que, en algunas realizaciones, no todas las células son sensibles haploinsuficientes. Por ejemplo, en vista de la naturaleza limitada de los fenotipos descritos de, por ejemplo, mutaciones de Drosophila minuta, se supone que un subconjunto de células puede experimentar una deficiencia en la síntesis de proteínas y contribuir a un fenotipo perjudicial, mientras que otras células pueden no experimentar tal deficiencia. El experto en la materia conocerá técnicas y enfoques adecuados para distinguir entre estos grupos celulares. Los tejidos que pueden experimentar haploinsuficiencia pueden identificarse utilizando procedimientos convencionales, por ejemplo, la expresión de ARNm tal como pruebas de análisis de Northern y/o pueden analizarse los polipéptidos traducidos mediante pruebas de análisis de Western, o tinción con Coomassie o experimentos de pulso y caza isotópico. Se pueden obtener más detalles y pruebas adicionales en libros de texto cualificados, por ejemplo, de Ausubel y col., eds, 2007, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. El papel que podrían desempeñar los tejidos identificados como sensibles a la haploinsuficiencia en los fenotipos potencialmente reductores de la aptitud puede investigarse utilizando una serie de procedimientos convencionales, por ejemplo, medir la aptitud competitiva de los genotipos en el tipo de experimento multigeneracional descrito en el Ejemplo 5, mientras se dirige específicamente la haploinsuficiencia a los tipos celulares candidatos. El direccionamiento específico de tejidos puede lograrse colocando genes que reducen la expresión de un gen haploinsuficiente bajo el control de promotores específicos de tejido.

Una expresión de tipo silvestre normal o típica del gen haploinsuficiente se entiende como la expresión del gen haploinsuficiente en una situación fisiológica típica sin influencia de factores de estrés o interferencia o inhibición del crecimiento. La reducción de la expresión del gen haploinsuficiente puede proporcionarse en todos los niveles de expresión adecuados. Se prevé además el uso de más de un gen haploinsuficiente a la vez, es decir, para realizar un procedimiento de la presente invención. Por ejemplo, pueden reducirse en su actividad o funcionalidad de acuerdo con los principios mencionados en el presente documento 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes haploinsuficientes, por ejemplo, al mismo tiempo o en una manera escalonada oportuna.

La reducción puede basarse, por ejemplo, en una modificación permanente de todas las copias genómicas de un gen haploinsuficiente. Un ejemplo de tal modificación es una deleción, una deleción parcial o una modificación funcional de todas las copias genómicas de un gen haploinsuficiente. Adicionalmente, los elementos genéticos necesarios para el funcionamiento de un gen haploinsuficiente, tal como un promotor, un sitio de unión de factores de transcripción, un potenciador o un terminador, pueden modificarse de forma que el gen haploinsuficiente ya no se exprese o su expresión se reduzca. En realizaciones preferentes, la reducción de la expresión es específica, es decir, es dirigida y no es aleatoria con respecto al gen haploinsuficiente cuya expresión debería reducirse. Esta reducción específica esencialmente excluye la reducción aleatoria de la expresión basada en mutagénesis aleatoria o mutagénesis insercional.

En realizaciones específicas de la invención, la reducción puede basarse en la presencia de un único locus transgénico como se define en el presente documento. En una realización adicional, la reducción puede basarse en múltiples locus transgénicos como se define en el presente documento.

La modificación funcional de un gen haploinusuficiente puede basarse en la introducción de codones terminación, influyendo así en la traducción o proporcionando especies proteicas truncadas. Como alternativa, se puede introducir una modificación en la secuencia codificante en un gen haploinsuficiente. Dicha modificación puede, por ejemplo, conducir a un intercambio de uno, dos, tres o más aminoácidos en uno, dos, tres o más sitios distintos de la secuencia codificante. Estos intercambios de aminoácidos pueden prevenir posteriormente la interacción de la proteína codificada con otros factores, por ejemplo, otras proteínas, factores celulares o estructuras. Es preferente que la modificación de la secuencia codificante conduzca a una reducción o una supresión completa de la funcionalidad de tipo silvestre del gen haploinsuficiente. La elección de tales sitios diana de modificación puede hacerse en función de la información estructural o funcional de un gen haploinsuficiente. Como alternativa, se podría inferir la importancia funcional a partir del grado de conservación filogenética a nivel del uso de la secuencia de restos de aminoácidos. Dicha información sería conocida por el experto en la materia o puede obtenerse de fuentes adecuadas de literatura o bases de datos. Ejemplos de bases de datos adecuadas son NCBI: Homologene, NCBI:Genbank o EBI:swiss-prot.

En una realización preferente, la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente puede basarse en medios que alteran específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. La expresión "alterar específicamente" como se usa en el presente documento significa que una entidad es capaz de modificar de forma permanente la secuencia de ADN de un gen, en particular la secuencia genómica de un gen, o cualquier copia de ADN extragenómico del gen, de una manera específica de secuencia. Esta especificidad pueden proporcionarla uno o más motivos de secuencia, que están presentes solo en el gen haploinsuficiente diana (motivo de secuencia exclusivo), por ejemplo, en todos los alelos de los genes haploinsuficientes dentro de una célula o dentro del genoma de un organismo. Los motivos de secuencia pueden, en realizaciones especiales, estar presentes además en las secuencias ortólogas o parálogas del gen haploinsuficiente. En una realización preferente, tales motivos de secuencia pueden estar presentes solo en un solo, o pueden estar presentes en no más de dos genes, a menos que formen parte de una familia de genes funcionalmente redundante. Los motivos de secuencia que pueden utilizarse para tal enfoque pueden tener cualquier longitud adecuada. La longitud puede definirse de acuerdo con el tamaño y la variabilidad del genoma del organismo en el que se va a llevar a cabo la alteración. Normalmente, se pueden utilizar motivos de secuencia de aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos. La facilidad de uso del motivo de secuencia puede comprobarse y verificarse en comparación con la información de bases de datos, por ejemplo, la información genómica disponible sobre un organismo diana. Una interrupción puede conducir a una ausencia completa o parcial de la actividad de un gen haploinsuficiente. La ausencia de actividad puede basarse en la ausencia de la proteína misma, por ejemplo, debido a la no expresión, a dificultades de traducción, a una degradación rápida, etc., o puede basarse en el suministro de proteínas con propiedades modificadas, por ejemplo, propiedades de unión, actividades enzimáticas, propiedades de localización, etc. La interrupción específica puede, en realizaciones específicas, ser una alteración transitoria, por ejemplo, una alteración que puede invertirse mediante una modificación adicional del gen haploinsuficiente.

Los ejemplos preferentes de medios que son capaces de alterar específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, incluyen una nucleasa de dedos de zinc, un CRISPR, una meganucleasa y TALEN (nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción).

La expresión "nucleasa de dedos de zinc" como se usa en el presente documento se refiere a enzimas de restricción artificiales, que se generan normalmente fusionando un dominio de unión a ADN de dedos de zinc con un dominio de escisión de ADN. Los dominios de dedos de zinc pueden diseñarse técnicamente o modificarse preferentemente para dirigirse a cualquier secuencia de ADN deseada, es decir, una secuencia de ADN de un gen haploinsuficiente de acuerdo con la presente invención. Dichos procedimientos de diseño técnico serían conocidos para el experto en la materia o pueden obtenerse de fuentes bibliográficas adecuadas tales como Bae y col., 2003, Nat Biotechnol, 21,275 80; Wright y col., 2006, Nature Protocols, 1, 1637-1652.)

Normalmente, puede utilizarse como el dominio de escisión de las ZFN el dominio de escisión no específica de las endonucleasas de restricción de tipo IIs, por ejemplo, de FokI. Dado que este dominio de escisión se dimeriza para escindir el ADN, normalmente se precisa un par de ZFN para dirigirse a sitios de ADN no palindrómicos. Los ZFN previstos por la presente invención pueden comprender además una fusión de la escisión no específica al extremo C de cada dominio de dedos de zinc. Por ejemplo, para permitir que dos dominios de escisión dimericen y escindan el ADN, se precisan normalmente dos ZFN individuales para que se unan a cadenas opuestas de ADN con los extremos C proporcionados en una distancia específica. Ha de entenderse que las secuencias enlazadoras entre el dominio del dedos de zinc y el dominio de escisión pueden precisar que el extremo 5' de cada sitio de unión esté separado por aproximadamente 5 a 7 pb.-La presente invención prevé cualquier forma o variante de ZNF adecuada, por ejemplo, fusiones de Fokl clásica o una versión optimizada de Fokl, así como enzimas con interfaces de dimerización modificadas, una funcionalidad de unión mejorada o variantes que puedan proporcionar especies heterodiméricas. Los detalles adicionales serían conocidos para el experto en la materia o pueden obtenerse de fuentes bibliográficas adecuadas tales como Bitinaite y col. PNAS, 95, 10570-10575 (1998); o Szczepek y col. Nature biotechnology 25, 786 93 (2007).

Las "meganucleasas" se entienden como endodesoxirribonucleasas, que normalmente tienen un sitio de reconocimiento en forma de secuencias de ADN bicatenario de aproximadamente 12 a 40 nucleótidos. Las meganucleasas normalmente funcionan como tijeras moleculares de ADN que proporcionan la posibilidad de eliminar o modificar secuencias de una manera específica de secuencia. Los ejemplos de meganucleasas adecuadas incluyen endonucleasas de intrones y endonucleasas de inteínas. La secuencia de reconocimiento de una meganucleasa puede modificarse mediante ingeniería genética o de proteínas para dirigirse a cualquier secuencia de ADN deseada, es decir, una secuencia de ADN de un gen haploinsuficiente de acuerdo con la presente invención. Para proporcionar una especificidad de secuencia, la especificidad de las meganucleasas existentes puede modificarse introduciendo una variación en la secuencia de aminoácidos, seguido de la selección de proteínas funcionales. Como alternativa, pueden fusionarse a las nucleasas dominios proteicos de distintas enzimas, dando como resultado meganucleasas quiméricas. Dichas meganucleasas quiméricas pueden tener, por ejemplo, un nuevo sitio de reconocimiento compuesto por un medio sitio de una meganucleasa y un medio sitio de una proteína. En realizaciones adicionales, ambos enfoques pueden combinarse, es decir, la modificación de la secuencia de unión de la meganucleasa y la fusión a un dominio proteico de una enzima distinta. Las meganucleasas a utilizar dentro del contexto de la presente invención pueden proporcionarse, por ejemplo, sobre la base de una tecnología propiedad de Cellectis, es decir, basada en dominios proteicos de la meganucleasa I-CreI homodimérica, así como de otros armazones de meganucleasas. Pueden diseñarse técnicamente meganucleasas adecuadas adicionales de acuerdo con la tecnología proporcionada por Precision Biosciences, por ejemplo, la plataforma Directed Nuclease Editor (DNE). Los detalles adicionales, en particular con respecto a las posibilidades de diseño técnico de meganuclasas, serían conocidos para el experto en la materia o pueden obtenerse de fuentes bibliográficas adecuadas tales como Gao y col., The Plant journal for cell and molecular biology, 61, 176-87 (2010).

Es particularmente preferente el uso del sistema TALEN (forma siglada de Transcription Activator-Like Effector Nuclease, nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción), es decir, una enzima de restricción artificial, que se genera fusionando el dominio de unión a ADN efector TAL con un dominio de escisión de ADN. Los efectores TAL son proteínas que normalmente son secretadas por las bacterias Xanthomonas o especies relacionadas, o que se obtienen de ella, y que han modificado. El dominio de unión a ADN del efector TAL puede comprender una secuencia altamente conservada, por ejemplo, de una secuencia de aproximadamente 33-34 aminoácidos con la excepción de los aminoácidos 12 y 13 que son altamente variables (Diresto variable repetido o RVD, forma siglada de Repeat Variable Diresidue) y normalmente muestran una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específico. Sobre la base de este principio, los dominios de unión a ADN se pueden diseñar técnicamente seleccionando una combinación de segmentos repetidos que contienen Direstos Variables de Repetición correspondientes a una secuencia de ADN de gen haploinsuficiente. El dominio de escisión de ADN de TALEN puede proceder de nucleasas adecuadas. Por ejemplo, puede utilizarse el dominio de escisión de ADN de la endonucleasa Fokl o de las variantes de la endonucleasa Fokl para construir nucleasas híbridas. Las TALEN se pueden proporcionar preferentemente como entidades separadas debido a las peculiaridades del dominio Fokl, que funciona como un dímero. En realizaciones específicas, el número de restos de aminoácidos entre el dominio de unión a ADN de TALEN y el dominio de escisión de Fokl, y el número de bases entre los dos sitios de unión a TALEN individuales, pueden modificarse u optimizarse de acuerdo con la secuencia de la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente para proporcionar niveles altos de actividad. Las TALEN o los componentes de las TALEN pueden diseñarse técnicamente o modificarse preferentemente para dirigirse a cualquier secuencia de ADN deseada, es decir, una secuencia de ADN de un gen haploinsuficiente de acuerdo con la presente invención. Dicho diseño técnico puede llevarse a cabo de acuerdo con metodologías adecuadas, por ejemplo, Zhang y col., Nature Biotechnology, 1-6 (2011) o Reyon y col., Nature Biotechnology, 30, 460-465 (2012).

La presente invención prevé además el uso de CRISPR (grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares). CRISPR se puede utilizar para reducir la expresión de genes específicos (o grupos o genes similares). Esto se logra normalmente mediante la expresión de ARN monocatenario además de un gen CRISPR. La técnica normalmente se basa en la expresión de un gen CRISPR tal como CAS9 además de las secuencias de ARN de guía (véase, por ejemplo, Cong y cols. DOI: 1013: 10.1126/science.1231143). La escisión de la doble cadena puede dirigirse a secuencias específicas utilizando la expresión de secuencias de ARN de guía flanqueantes apropiadas. La escisión cromosómica podría así potenciar de forma local la mutagénesis. Esto, a su vez, puede contribuir a una reducción de la expresión génica normal. Como alternativa, la expresión de CRISPR puede utilizarse para escindir ARNm, reduciendo de este modo la expresión. En una realización preferente, las secuencias de ARN de guía y la expresión de genes CRISPR (por ejemplo, CAS9) pueden incluirse como parte de una construcción {Ud}, por ejemplo, una construcción como se describe en el presente documento. La reducción puede basarse, alternativamente, en una interferencia con la transcripción de un gen haploinsuficiente. Por ejemplo, el transcrito ARNm de un gen haploinsuficiente puede reconocerse e inactivarse, o degradarse, de acuerdo con los medios adecuados conocidos por el experto en la materia.

En una realización preferente, la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente puede basarse en un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el transcrito del gen haploinsuficiente. La expresión "degrada o inactiva específicamente" como se usa en el presente documento significa que una entidad o medio es capaz de reconocer e inactivar una especie de secuencias de ARNm correspondientes a un gen haploinsuficiente como se define en el presente documento. La inactivación o degradación puede ser una destrucción, degradación o degeneración completa de la molécula de ARNm, o puede ser una degradación o destrucción parcial de la molécula de ARNm, lo que conduce a la supresión o prevención de la actividad traduccional (potencial) basada en la molécula de ARNm. En realizaciones adicionales, la secuencia de ARNm puede inactivarse mediante procesamiento, modificación, reordenamiento, reubicación, almacenamiento u otra actividad realizada sobre la molécula de ARNm, lo que también conduce a una supresión o prevención de la actividad traduccional (potencial) basada en la molécula de ARNm. La especificidad pueden proporcionarla uno o más motivos de secuencia, que estén presentes solo en el transcrito (o transcritos) del gen haploinsuficiente (motivo de secuencia exclusivo). Los motivos de secuencia pueden, en realizaciones especiales, estar presentes además en transcritos de ortólogos o parálogos del gen haploinsuficiente. En una realización preferente, tales motivos de secuencia pueden estar presentes en una sola especie de transcripción o pueden estar presentes en no más de dos especies de transcritos. Los motivos de secuencia que pueden utilizarse para tal enfoque pueden tener cualquier longitud adecuada. La longitud se puede definir de acuerdo con el enfoque molecular elegido, el organismo en el que tiene lugar la inactivación, la presencia y complejidad del transcriptoma, o con parámetros fisiológicos, etc. Una degradación o inhibición del transcrito del gen haploinsuficiente puede conducir a una ausencia completa o parcial de la actividad de un gen haploinsuficiente. Es preferente que la actividad de un gen haploinsuficiente esté completamente ausente. La inactivación específica de los transcritos puede, en determinadas realizaciones, ser una inactivación transitoria, por ejemplo, una inactivación que se puede detener, pausar o terminar en un organismo, lo que conduce a la proporción de nuevos transcritos después de la finalización de la inactivación.

Los ejemplos preferentes de medios que pueden degradar específicamente o inactivar directamente el transcrito del gen haploinsuficiente incluyen una molécula de ARNip, una molécula de miARN, una molécula de ácido nucleico antisentido, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN, o un agente que media la metilación de ADN dirigida por ARN.

El término "ARNip" como se usa en el presente documento se refiere a un tipo particular de molécula antisentido, a saber, pequeños dúplex de ARN inhibidores que inducen la ruta de interferencia de ARN (ARNi). Estas moléculas pueden variar en longitud y pueden ser de entre 18 y 28 nucleótidos de longitud, por ejemplo, tener una longitud de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 nucleótidos. Preferentemente, la región tiene una longitud de 21, 22 o 23 nucleótidos. La molécula de ARNip de acuerdo con la presente invención puede contener grados variables de complementariedad con su ARNm diana, preferentemente en la cadena antisentido. Los ARNip pueden tener bases protuberantes no apareadas en el extremo 5' o 3' de la cadena sentido y/o la cadena antisentido. El término "ARNip" también incluye dúplex de dos cadenas distintas, así como cadenas monocatenarias que pueden formar estructuras de horquilla que comprenden una región dúplex. Preferentemente, el ARNip puede ser bicatenario, en el que la molécula de ARNip bicatenario comprende una primera y una segunda cadena, cada cadena de la molécula de ARNip es aproximadamente 18 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud, la primera cadena de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente complementariedad con el ARN diana a través de interferencia de ARN, y la segunda cadena de dicha molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con la primera cadena. Los procedimientos para diseñar ARNip adecuados dirigidos a un transcrito diana dado, es decir, un transcrito del gen haploinsuficiente, son conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, de Elbashir y col., 2001, Genes Dev. 15, 188-200. Además, son preferentes los ARNip contra un transcrito de del gen haploinsuficiente que se proporcionan en forma de ARN horquillados cortos. Dichos ARN horquillados cortos pueden producirse o diseñarse de acuerdo con cualquier procedimiento o técnica adecuados conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse para diseñar moléculas de ARNhc específicas para transcritos de genes haploinsuficientes una herramienta como la que se proporciona en http://www.molgyn.kgu.de/genesilencer/genesilencer.html (Kappel y col., Nature Protocols, 2007, 2(12):3257-69). Un ARN horquillado corto o molécula codificante de ARN horquillado corto puede comprender una primera molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende al menos una primera secuencia correspondiente a un tramo de un transcrito de un gen haploinsuficiente y al menos una segunda secuencia correspondiente a la complementaria inversa de dicha primera secuencia. El tramo puede comprender entre 17 y 25 nucleótidos, preferentemente entre 18 y 22, más preferentemente 19 nucleótidos. Además, u opcionalmente, puede estar presente una secuencia de bucle entre los dos tramos de la secuencia de ácido nucleico. Esta secuencia de bucle puede tener una longitud de entre aproximadamente 6 y 12 nucleótidos, preferentemente una longitud de 9 nucleótidos. Adicionalmente, el ARN horquillado corto o molécula codificante de ARN horquillado corto puede comprender una señal de terminación y/o secuencias que comprenden sitios de restricción para endonucleasas. La al menos primera secuencia correspondiente a un transcrito del gen haploinsuficiente y al menos una segunda secuencia correspondiente a la complementaria inversa de dicha primera secuencia puede ser completamente complementaria a la secuencia de un transcrito del gen haploinsuficiente o su complementaria inversa, o las secuencias pueden comprender uno o más emparejamientos incorrectos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 emparejamientos incorrectos.

El término "miARN" o "microARN", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN de monocatenaria corta de normalmente 18-27 nucleótidos de longitud, que regula la expresión génica. Los miARN normalmente están codificados por genes de cuyo ADN se transcriben pero no se traducen en una proteína. En un contexto natural, los miARN se transcriben primero como transcritos primarios o pri-miARN con una caperuza y una cola poli A y se procesan a estructuras cortas de tallo-bucle de 70 nucleótidos conocidas como pre-miARN en el núcleo celular. Este procesamiento se realiza en animales mediante un complejo proteico conocido como el complejo Microprocesador, que consiste en la nucleasa Drosha y la proteína de unión a ARN bicatenario Pasha. Estos premiARN se procesan luego para dar lugar miARN maduros en el citoplasma por interacción con la endonucleasa Dicer, que también inicia la formación del complejo silenciador inducido por ARN (RISC, forma siglada de RNA-induced silencing complex). Se cree que este complejo es responsable del silenciamiento génico observado debido a la expresión de miARN y la interferencia por a Rn . La cadena sentido o la cadena antisentido de ADN pueden funcionar como moldes para dar lugar a miARN. Normalmente, el procesamiento eficaz del pri-miARN por Drosha precisa la presencia de ARN monocatenario extendido en los extremos 3' y 5' de la molécula en horquilla. Estos motivos de ARNmc podrían tener una composición distinta, mientras que su longitud es de gran importancia para que el procesamiento tenga lugar. Generalmente, el complejo Drosha escinde la molécula de ARN aproximadamente a 22 nucleótidos del bucle terminal. Los pre-miARN pueden no tener una estructura perfecta de ARN bicatenario (ARNbc) rematada por un bucle terminal. Cuando Dicer escinde el tallo-bucle del pre-miARN, normalmente se forman dos moléculas cortas de ARN complementarias, pero solo una está integrada en el complejo RISC. Esta cadena se conoce como la cadena de guía y normalmente es seleccionada por la proteína argonauta, la ARNasa catalíticamente activa en el complejo RISC, sobre la base de la estabilidad del extremo 5'. La cadena restante, conocida como la cadena antiguía o pasajera, se degrada normalmente como un sustrato del complejo RISC. Después de la integración en un complejo RISC activo, los miARN pueden emparejarse con sus moléculas de ARNm complementarias e inhibir la traducción, o pueden inducir la degradación del ARNm por los miembros catalíticamente activos del complejo RISC, por ejemplo, las proteínas argonauta.

Las moléculas de miARN maduras son normalmente al menos parcialmente complementarias con los transcritos de un gen haploinsuficiente de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, los miARN previstos por la presente invención pueden ser identificables y/u obtenibles de acuerdo con los ensayos y procedimientos descritos en Hüttenhofer y Vogel, 2006, NAR, 34(2): 635-646. Pueden ser, por ejemplo, el 100% complementarios a sus secuencias diana, es decir, los transcritos de genes haploinsuficientes. Como alternativa, pueden tener 1, 2 o 3 emparejamientos incorrectos, por ejemplo, en los restos terminales o en la porción central de la molécula. Las moléculas de miARN de acuerdo con la presente invención pueden tener una longitud de entre aproximadamente 18 y 27 nucleótidos, por ejemplo de 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 o 27 nucleótidos. Son preferentes de 21 a 23 meros. Los miARN que tienen un 100 % de complementariedad se pueden utilizar preferentemente para la degradación de transcritos de genes haploinsuficientes de acuerdo con la presente invención, mientras que los miARN que muestran menos del 100% de complementariedad pueden utilizarse preferentemente para el bloqueo de los procesos traduccionales.

La expresión "molécula antisentido" se refiere a un ácido nucleico que es al menos parcialmente complementario a al transcrito de un gen haploinsuficiente como se define en el presente documento. La molécula antisentido de la invención puede comprender, por ejemplo, una secuencia complementaria a al menos una porción de un transcrito de un gen haploinsuficiente como se define en el presente documento. Las moléculas antisentido pueden ser además complementarias a la secuencia de la región codificante de un transcrito de un gen haploinsuficiente o complementarias a la región no traducida transcrita de un transcrito de un gen haploinsuficiente. El ARNbc complementario del que podría obtenerse una molécula de ARNi de direccionamiento puede tener distintas longitudes, por ejemplo, de aproximadamente 21 a 1000 pb, preferentemente de aproximadamente 21, 40, 100, 200, 300 o 1000 pb o más, o cualquier valor entre estos valores. Por consiguientes, estos ARNbc pueden procesarse por una diversidad de rutas en la ARNasa catalíticamente activa en el complejo RISC.

Es preferente que la molécula antisentido sea complementaria a la región transcrita traducida o transcrita no traducida de un transcrito de un gen haploinsuficiente. Generalmente, las moléculas antisentido pueden utilizarse para controlar la expresión génica a través de ADN o ARN antisentido, o mediante la formación de triple hélices. La molécula antisentido de la invención puede normalmente comprender una secuencia, que es complementaria a al menos una porción de un transcrito de un gen haploinsuficiente. La complementariedad absoluta, aunque es preferente, no es necesaria. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un transcrito de un gen haploinsuficiente" como se denomina en el presente documento, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridar con el transcrito, formando así una formación estable de triplex dúplex. La capacidad de hibridar dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo es el ácido nucleico que hibrida, más emparejamientos incorrectos de bases con un transcrito puede contener y aún formar un dúplex o triplex estable. Una persona experta en la materia sabría cómo determinar un grado tolerable de emparejamientos incorrectos mediante el uso de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. La molécula antisentido puede ser además complementaria a cualquier parte de los ARNm expresados por el gen diana. Preferentemente, las moléculas antisentido complementarias al extremo 5' del transcrito, por ejemplo, la secuencia 5' no traducida hasta e incluyendo el codón de iniciación AUG, puede utilizarse en o para la inhibición de la translocación. En una realización preferente adicional, también se pueden utilizar secuencias complementarias a las secuencias 3' no traducidas de los transcritos.

Una molécula antisentido de acuerdo con la presente invención puede ser ADN o ARN o mezclas quiméricas, o derivados o versiones modificadas de los mismos, monocatenarias o bicatenarias.

La expresión "agente que media la metilación de ADN dirigida por ARN" se refiere a un ácido nucleico que es capaz de silenciar un gen haploinsuficiente de acuerdo con un proceso epigenético. La metilación de ADN dirigida por ARN o RdDM está normalmente presente en células vegetales y animales, y puede ser transmitida por moléculas de ARN bicatenarias o ARNbc. Estos ARN son procesados normalmente por una célula y pueden conducir a la metilación de locus genómicos complementarios y, por lo tanto, interferir con la transcripción de estos locus a través de la interacción con restos de histonas.

En una realización adicional específica de la invención, el medio que degrada o inactiva específicamente el transcrito del gen haploinsuficiente puede ser un ARN catalítico o una ribozima. La expresión "ARN catalítico" o "ribozima" se refiere a una molécula de ARN no codificante, que es capaz de unirse específicamente a un ARNm diana, es decir, un transcrito de un gen haploinsuficiente, y de cortar o degradar dicho ARNm diana. Normalmente, las ribozimas escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio y pueden diseñarse, diseñarse técnicamente y utilizarse para destruir transcritos de genes haploinsuficientes de acuerdo con la presente invención. Un ejemplo previsto de una ribozima es una ribozima de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo normalmente escinden los ARNm en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el ARNm diana. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo se conocen en la técnica y se describe en Haseloff y Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591. Preferentemente, la ribozima se puede diseñar técnicamente de forma que el sitio de reconocimiento de escisión se ubique cerca del extremo 5' del transcrito del gen haploinsuficiente.

En una realización más alternativa, la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo puede basarse en la interferencia con el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Por ejemplo, la presente invención prevé cualquier medio adecuado que se sepa que interfiere con la presencia y/o la cantidad de un producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Dichos medios podrían, por ejemplo, ser un antagonista del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Los ejemplos de antagonistas adecuados incluyen un compuesto que inhibe o modula directa o indirectamente la actividad del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, una variante dominante negativa del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, un aptámero específico para el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, un anticuerpo o intracuerpo contra el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente o una molécula pequeña capaz de unirse específicamente al producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente.

Un "compuesto que inhibe o modula directamente la actividad de un producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" puede ser cualquier compuesto que sea capaz de disminuir la actividad del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente y que esté interactuando directamente, por ejemplo, mediante unión, con el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Dicho compuesto puede, por ejemplo, ser un interactor que tiene influencia negativa sobre la actividad catalítica del producto proteico de un gen haploinsuficiente, por ejemplo, obstruyendo la interacción adicional o uniéndose a superficies o bolsillos.

Un "compuesto que inhibe o modula indirectamente la actividad de un producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" puede ser cualquier compuesto que sea capaz de disminuir la actividad de un producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente mediante una interacción con un interactor directo de un producto proteico de un gen haploinsuficiente o mediante una ruta de trabajo indirecta que no implica una interacción con un producto proteico de un gen haploinsuficiente. Los ejemplos de tales interactores incluyen actividades enzimáticas que degradan activadores de productos proteicos de un gen haploinsuficiente o proteínas capaces de unirse y desactivar activadores de un producto proteico de un gen haploinsuficiente. Como alternativa, tales interactores pueden modular de forma positiva actividades que conducen a la degradación de un producto proteico de un gen haploinsuficiente, por ejemplo, proteinasas.

Una "variante dominante negativa del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" puede ser una proteína que comprende una modificación antimórfica, que afecta de forma adversa al producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Normalmente, puede producirse un comportamiento dominante negativo si la variante antimórfica puede interactuar con el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente pero bloquea algún aspecto de su función. Dichas variantes pueden, por ejemplo, comprender o carecer de dominios específicos del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, por ejemplo, uno o más dominios de interacción proteína-proteína o de dimerización, dominios de ensamblaje de complejos, uno o más dominios asociados a membrana, etc. Esto es particular importancia en una proteína que funciona como un dímero o un multímero. Si, por ejemplo, una parte de ese complejo de proteínas es mutante en algún aspecto funcional del multímero, pero aún puede formar el multímero, puede tener un efecto dominante sobre las otras porciones de tipo silvestre del complejo y un efecto negativo si la mutación impide que el complejo lleve a cabo su función normal. Una forma dominante-negativa puede, por ejemplo, bloquear específicamente la acción del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente del que procede.

Un "aptámero específico para el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" puede ser un péptido corto capaz de interactuar con y unirse específicamente al producto proteico expresado de un gen haploinsuficente como se define en el presente documento. Dicho aptámero peptídico puede contener un bucle peptídico variable que comprenda, por ejemplo, de 10 a 20 aminoácidos. En el contexto de la presente invención, el aptámero peptídico se puede unir preferentemente en uno o ambos extremos a una estructura de armazón. La estructura de armazón puede ser cualquier molécula, preferentemente una proteína, que tenga buenas propiedades de solubilidad y compacidad. Las moléculas de armazón adecuadas serían conocidas para el experto en la materia. Una molécula de armazón preferente para utilizar en el contexto de la presente invención es la proteína bacteriana tiorredoxina A.

Un "anticuerpo contra el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" puede ser cualquier molécula de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de una molécula de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno o epítopo presente en un producto proteico de un gen haploinsuficiente. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, multiespecífico, humano, humanizado o quimérico, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un diacuerpo o fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En una realización preferente, el anticuerpo que se une a un antígeno o epítopo presente en un producto proteico de un gen haploinsuficiente es capaz de interferir con la actividad o función del producto proteico unido. Dicha interferencia puede ser, por ejemplo, una reducción de la actividad, la inhibición de la actividad, la desviación de la ubicación normal, la inhibición o reducción de la interacción con otras proteínas, la degradación, la degradación parcial, etc.

Un "intracuerpo contra el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" como se usa en el presente documento es un anticuerpo que funciona dentro de la célula. El intracuerpo está preferentemente modificado para la localización intracelular. En determinadas realizaciones, los intracuerpos pueden mostrar modificaciones especiales, tal como una modificación de los dominios VL de inmunoglobulina para la hiperestabilidad, la proporción de resistencia a un medio intracelular reductor o la expresión como una proteína de fusión con la proteína de unión a maltosa u otras proteínas intracelulares estables. En realizaciones adicionales, el intracuerpo puede ser un anticuerpo monocatenario (los scFv). En una realización preferente, el intracuerpo que se une a un antígeno o epítopo presente en un producto proteico de un gen haploinsuficiente es capaz de interferir con la actividad o función del producto proteico unido. Dicha interferencia puede ser, por ejemplo, una reducción de la actividad, la inhibición de la actividad, la desviación de la ubicación normal, la inhibición o reducción de la interacción con otras proteínas, la degradación, la degradación parcial, etc.

La expresión "molécula pequeña capaz de unirse específicamente al producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente" como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un compuesto orgánico pequeño que es preferentemente biológicamente activo, es decir, una biomolécula, pero preferentemente no es un polímero y que se une al producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Dicho compuesto orgánico puede tener cualquier forma o propiedad química adecuadas. El compuesto es preferentemente un compuesto natural, por ejemplo, un metabolito secundario que puede producirse y/o modificarse sobre la base de rutas genéticas/bioquímicas presentes en una célula o que puede proporcionarse a una célula. En una realización preferente, la molécula pequeña que se une a un producto proteico de un gen haploinsuficiente es capaz de interferir con la actividad o función del producto proteico unido. Dicha interferencia puede ser, por ejemplo, una reducción de la actividad, la inhibición de la actividad, la desviación de la ubicación normal, la inhibición o reducción de la interacción con otras proteínas, la degradación, la degradación parcial, etc. Los expertos en la materia conocen procedimientos y técnicas para la identificación y producción de moléculas pequeñas, así como ensayos para el análisis de moléculas pequeñas.

La metodología de la presente invención precisa que dicho medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo sea transportado por un locus transgénico en el propio organismo. Por consiguiente, cualquier medio que degrada o inactiva específicamente un transcrito de un gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento, cualquier medio que altere específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente y/o cualquier medio que interfiera con el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, puede proporcionarse a través de un locus transgénico dentro de un organismo. Por ejemplo, las moléculas de ARN o ADN como se describen en el presente documento pueden proporcionarse a través de construcciones de expresión adecuadas presentes en dicho locus transgénico. La construcción de expresión puede, por ejemplo, comprender elementos de control que permitan regular la expresión de cualquiera de las especies de ARN o ADN mencionadas anteriormente en el presente documento. La regulación puede, por ejemplo, realizarse a través de elementos promotores unidos operativamente a casetes de expresión o módulos de expresión para ARNip, miARN, ARN o ADN antisentido, ARNbc, nucleasas, por ejemplo, ZFN, las TALEN, CRISPR o meganucleasas, o compuestos proteináceos que inhiben o modulan directa o indirectamente la actividad del producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, variantes dominantes negativas de productos proteicos expresados de un gen haploinsuficiente, aptámeros específicos para el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente, anticuerpos o intracuerpos contra el producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente o una molécula pequeña capaz de unirse específicamente al producto proteico expresado de un gen haploinsuficiente. Dicha regulación puede, por ejemplo, basarse en promotores, que pueden controlarse mediante distintos parámetros tales como la presencia de metabolitos o moléculas pequeñas, el pH, la temperatura, la luz, la presencia de factores de crecimiento, etc. Además se prevén promotores activos de forma constitutiva. En el caso de que se generen especies de ARN, los módulos de expresión pueden proporcionar estructuras enlazadoras adecuadas que permitan producir moléculas de ARN en bucle o bicatenarias, sitios de unión para ARN polimerasas, sitios de unión internos o de escisión, etc. En el caso de construcciones de expresión para proteínas o polipéptidos, o péptidos, puede proporcionarse cualquier elemento adecuado para la potenciación de la transcripción y/o la traducción de la secuencia codificante, por ejemplo, sitios de entrada al ribosoma, un sitio de unión de factores de transcripción, etc. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, expresarse en una forma de único gen o de múltiples genes. Para la proporción de moléculas pequeñas, pueden expresarse uno o más miembros de ruta de rutas sintéticas, por ejemplo, rutas sintéticas heterólogas u homólogas.

En realizaciones adicionales de la invención, los medios para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo pueden proporcionarse de una manera de dos o de múltiples etapas. Por ejemplo, un locus transgénico puede proporcionar una actividad que conduzca a la proporción de un ADN, ARN, proteína o especie de molécula pequeña. El locus transgénico también puede proporcionar adicionalmente una actividad adicional, que sea capaz de modificar dicho ADN previamente generado, ARN, proteína o especie de molécula pequeña. Esta modificación puede conducir a un aumento de su función, un cambio de su direccionamiento, una modificación de sus capacidades de interacción. Los casetes de expresión pueden comprender además regiones terminadoras, regiones necesarias para la integración genómica y/o regiones necesarias para evitar el silenciamiento genómico.

Las secuencias codificantes de proteínas pueden adaptarse además en su uso de codificación al uso de codones prevalente del organismo, especie, clase, orden o familia en la que se utilizan. La adaptación del uso del codón puede, por ejemplo, ser una adaptación de uso de monocodones, es decir, una adaptación a la frecuencia de uso de codones únicos entre todos los genes expresados, o entre el 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o 60 % de los genes más frecuentemente expresados. Como alternativa, la adaptación del uso de codones puede ser una adaptación de uso de dicodones, es decir, una adaptación a la frecuencia de uso de una combinación de dos codones consecutivos entre todos los genes expresados, o entre el 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o 60 % de los genes más frecuentemente expresados. Dicho uso de dicodones puede ser útil para evitar la presencia de motivos de secuencia, las cuales pueden tener un efecto perjudicial en la transcripción del gen, por ejemplo, secuencias de terminación crípticas o de degradación de ARN, etc.

En realizaciones específicas adicionales, una actividad que conduce a la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente en un organismo puede proporcionarse como un compuesto externo a administrar a una célula u organismo, pero que no revela su función antes de haber sido activado o modificado. La activación o modificación se puede proporcionar mediante un medio como se describe anteriormente en el presente documento, por ejemplo, mediante una proteína o ácido nucleico que se expresa a través de un locus transgénico como se define en el presente documento. Por ejemplo, la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente en un organismo puede iniciarse mediante la administración a una célula u organismo de un compuesto precursor, que no puede interactuar con el transcrito o el producto proteico expresado del gen haploinsuficiente, y precisa una modificación mediante una actividad proporcionada por el locus transgénico, por ejemplo, una etapa de escisión enzimática, una conversión enzimática y similares.

En una segunda etapa del procedimiento para reducir la aptitud competitiva de un organismo en hemicigotos de acuerdo con la invención, se rescata la expresión reducida de un gen haploinsuficiente en el organismo. El término "rescatar" como se usa en el presente documento significa que se proporciona una actividad que esencialmente hace que una célula u organismo sea al menos parcialmente resistente a la supresión de la expresión de un gen haploinsuficiente en hemicigotos como se define en el presente documento y un rescate completo en los homocigotos. El uso del término rescate incluye cualquier caso en que los fenómenos genéticos de transvección contribuyan al rescate del fenotipo de reducción de la aptitud competitiva en los homocigotos.

La proporción de tal resistencia al menos parcial o rescate al menos parcial de una supresión de la expresión de un gen haploinsuficiente significa que se genera una situación, en que la actividad o funcionalidad total del gen haploinsuficiente no se reduce o ya no se reduce, o no se reduce o ya no se reduce sustancialmente. Por ejemplo, la actividad o funcionalidad de la situación de expresión de rescate con respecto a una situación de expresión de tipo silvestre puede estar en un intervalo de aproximadamente al menos aproximadamente el 20 % 30 % 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, o 90 %, o cualquier valor entre estos valores de una situación de expresión de tipo silvestre, en al menos algunas células sensibles haploinsuficientes que contribuyen al fenotipo de reducción de la aptitud competitiva, es decir, una situación en que la actividad o funcionalidad de tipo silvestre está presente si el rescate se proporciona mediante un hemicigótico, por ejemplo, locus transgénico heterocigótico. La actividad o funcionalidad de una situación de expresión de rescate con respecto a una situación de expresión de tipo silvestre puede estar en un intervalo de aproximadamente al menos aproximadamente el 30 % 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o el 90 % 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, o cualquier valor intermedio o cualquier valor entre estos valores de una situación de expresión de tipo silvestre, es decir, una situación en que la actividad o funcionalidad de tipo silvestre está presente si el rescate se proporciona mediante un locus transgénico homocigótico. La situación de expresión de rescate o de tipo silvestre se refiere, por consiguiente, a la expresión de todas las copias de un gen haploinsuficiente dentro de un organismo, incluyendo las copias resistentes que forman parte de una construcción subdominante. Esto puede, por ejemplo, medirse en ensayos de detección de transcritos, en ensayos de actividad enzimática, mediante la detección de la presencia de complejos estructurales en una célula o por cualquier otro enfoque adecuado.

El número de copias de un gen de rescate por genoma puede ser de una o más. El número de copias puede variar de acuerdo con la configuración genética de un organismo, el mecanismo de rescate, las propiedades de expresión en el sitio de inserción del locus transgénico, la ploidía del organismo o el número de genes parálogos en el genoma de un organismo, u otros parámetros adecuados, en particular la hemicigosis u homocigosis del organismo para un locus transgénico como se define en el presente documento. Por ejemplo, en un organismo diploide, un alelo transgénico como se define en el presente documento, que puede incluir una única copia de un gen de rescate, puede estar presente en una situación hemicigótica, o en un organismo diploide dos locus transgénicos como se define en el presente documento, que pueden incluir cada uno una copia única de un gen de rescate, pueden estar presentes en una situación homocigótica. Además se prevén organismos diploides con más de un gen de rescate por locus transgénico.

En un organismo poliploide, por ejemplo, un organismo tetraploide, una configuración hemicigótica puede incluir la presencia de 1, 2 o 3 alelos transgénicos en un locus, mientras que una configuración homocigótica puede incluir la presencia de 4 alelos transgénicos en un locus. Estos alelos transgénicos pueden comprender una o más de una copia de un gen de rescate.

En realizaciones específicas adicionales de la invención, una segunda copia o más de un gen de rescate puede estar presente en una segunda posición o más dentro del genoma de un organismo. El número exacto de copias del gen de rescate en el locus transgénico se puede determinar, preferentemente, empíricamente, por ejemplo, en función de las propiedades de expresión de la posición de integración del locus transgénico, la ploidía del organismo, el número de genes parálogos en el genoma que son sustancialmente redundantes desde el punto de vista funcional, etc.

En determinadas realizaciones, el rescate puede conducir a un restablecimiento completo de la actividad o funcionalidad de tipo silvestre de un gen haploinsuficiente cuya expresión se redujo en una etapa inicial como se define anteriormente en el presente documento. En realizaciones adicionales, el rescate puede conducir a un restablecimiento parcial de la actividad, o funcionalmente, de tipo silvestre de un gen haploinsuficiente cuya expresión se redujo en una etapa inicial como se define anteriormente en el presente documento, por ejemplo, un restablecimiento de aproximadamente el 20 % 30 % 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% en al menos algunas células sensibles haploinsuficientes que contribuyen al fenotipo de reducción de aptitud competitiva en hemicigotos, o más, o cualquier valor entre estos valores de la actividad de tipo silvestre, o funcionalmente, del gen haploinsuficiente cuya expresión se redujo en una etapa inicial como se define anteriormente en el presente documento.

El rescate puede ser proporcionado, por ejemplo, por una modificación del gen haploinsuficiente, cuya expresión se redujo en una etapa inicial como se define anteriormente en el presente documento, o por la proporción de un gen de rescate.

La expresión "gen de rescate" como se usa en el presente documento se refiere a una copia de un gen haploinsuficiente que puede incluir regiones reguladoras flanqueantes y que se ha modificado para que se vuelva resistente a la supresión de la expresión de un gen haploinsuficiente como se define en el presente documento. La proporción de un rescate al menos parcial a una supresión de la expresión de un gen haploinsuficiente puede ser preferentemente sin reducir su funcionalidad, o sin reducir sustancialmente su funcionalidad. Por ejemplo, la funcionalidad de un gen de rescate con respecto a un alelo de tipo silvestre puede estar en un intervalo de al menos el 5 % 10 % 20 % 30 % 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o cualquier valor entre estos valores de una actividad o funcionalidad de tipo silvestre en células que son sensibles haploinsuficientes. En una realización en que un único locus haploinsuficiente no parálogo, preferentemente, no una familia génica de genes haploinsuficientes sustancialmente redundantes desde el punto de vista funcional, es el objetivo en un diploide de un solo locus subdominante, se prevé que la funcionalidad del rescate por alelo transgénico no excederá aproximadamente el 200 % de la funcionalidad de un alelo de tipo silvestre en el locus haploinsuficiente que se tiene como objetivo. Ha de entenderse que tal efecto asegura una deficiencia de funcionalidad en hemicigotos frente a homocigotos, lo que es la base de subdominancia.

En realizaciones adicionales, puede ser el objetivo una familia génica de genes haploinsuficientes sustancialmente redundantes desde el punto de vista funcional, o el organismo puede ser poliploide. En tales situaciones, la funcionalidad del rescate por alelo transgénico puede asumir cualquier valor de funcionalidad relativa con respecto a todos los alelos de tipo silvestre en la familia génica, que puede estar en un intervalo de al menos el 5 % al 190 %, por ejemplo, el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o cualquier valor entre estos valores de una actividad o funcionalidad de tipo silvestre en células que son sensibles haploinsuficientes. La funcionalidad puede, por ejemplo, medirse en unidades de actividad enzimática, por la presencia de complejos estructurales en una célula o por cualquier otro enfoque adecuado.

El número de copias de un gen de rescate por genoma puede ser de uno o más por genoma haploide y, en algunas realizaciones, puede ubicarse en más de un locus transgénico. El número de copias del gen de rescate, que puede ser parte de la construcción transgénica, puede variar de acuerdo con la configuración genética de un organismo, el mecanismo de rescate, las propiedades de expresión en el sitio de inserción del locus transgénico, la ploidía del organismo o el número de genes parálogos en el genoma de un organismo, u otros parámetros adecuados. Por ejemplo, en un organismo diploide, un locus transgénico como se define en el presente documento puede incluir un locus único con un número variable de copias del locus transgénico. En un organismo poliploide, por ejemplo, un organismo tetraploide, puede haber más de un locus transgénico dirigido a o rescatando el mismo grupo de genes haploinsuficientes. En realizaciones adicionales, la actividad de rescate de un gen puede dividirse en múltiples locus transgénicos. Por ejemplo, una segunda copia o más de un gen de rescate o actividad de rescate puede estar presente en un segundo o más locus dentro del genoma de un organismo. El número exacto de copias del gen de rescate o la actividad de rescate en el locus transgénico se puede determinar, preferentemente, empíricamente, por ejemplo, en función de las propiedades de expresión de la posición de integración del locus transgénico, la ploidía del organismo, el número de genes parálogos en el genoma que son sustancialmente redundantes desde el punto de vista funcional, etc.

La modificación del gen haploinsuficiente para permitir el rescate de una expresión reducida puede ser una modificación de la secuencia genómica del gen haploinsuficiente. La modificación puede, por ejemplo, ser una modificación por mutación de la secuencia primaria de un gen haploinsuficiente, que no tenga efecto fenotípico, es decir, conduce a la misma secuencia de aminoácidos. Además, se prevén mutaciones que conduzcan a una secuencia de aminoácidos distinta, que proporcione una actividad o funcionalidad similar o equivalente a la secuencia de aminoácidos original o de tipo silvestre. Una reducción de la actividad o funcionalidad de tipo silvestre por alelo por la modificación a aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % también se prevé en una realización muy específica de la presente invención. Es preferente utilizar mutaciones sinónimas, que no modifiquen la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. Dichas mutaciones pueden llevarse a cabo en todos los codones, o en una parte de los codones, o en uno solo, dos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más codones de un gen haploinsuficiente. Las mutaciones pueden proporcionarse en una ubicación dentro del marco de lectura abierto del gen haploinsuficiente, o en 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más ubicaciones dentro del marco de lectura abierto del gen haploinsuficiente. En realizaciones adicionales, las mutaciones también pueden estar presentes en regiones no codificantes del gen haploinsuficiente, por ejemplo, en la región 3' no traducida, en la región 5' no traducida, o en ambas. Las mutaciones pueden proporcionarse en una ubicación en regiones no codificantes del gen haploinsuficiente, o en 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más ubicaciones en la región (o regiones) no codificantes del gen haploinsuficiente. Además, se prevé una combinación de mutaciones en ambos sectores del gen haploinsuficiente.

La modificación puede ser además una modificación sinónima de acuerdo con cualquier posibilidad de aminoácidos codificados de forma sinónima de acuerdo con el código genético de un organismo a utilizar. En realizaciones adicionales, la modificación puede ser una modificación sinónima, que se basa en el uso de codones preferentes en el organismo a utilizar. La modificación de la secuencia primaria o de la secuencia genómica del gen haploinsuficiente puede conducir a la evitación o la ausencia de sitios de reconocimiento de medios que degradan específicamente transcritos de genes, o que alteren las secuencias de ADN como se define en el presente documento.

Por ejemplo, la modificación de rescate del gen haploinsuficiente como se define en el presente documento puede conducir a la evitación de la unión de moléculas, ARNip, miARN, antisentido, etc. con el transcrito del gen haploinsuficiente, evitando así la degradación de dicho transcrito. Como alternativa, la modificación de rescate del gen haploinsuficiente como se define en el presente documento puede conducir a la prevención del reconocimiento y/o unión de nucleasas tales como ZNF, meganucleasa, CRISPR o TALEN, evitando así la modificación genómica de la secuencia primaria subyacente. En una alternativa adicional, la modificación de rescate puede conducir a una secuencia de aminoácidos cambiada del producto proteico expresado del gen haploinsuficiente, que ya no puede ser reconocido y/o inhibido, y/o interferido por entidades tales como aptámeros, anticuerpos, intracuerpos, moléculas pequeñas, variantes dominantes negativas, etc., como se define anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, los epítopos pueden modificarse, los dominios de interacción que no son importantes desde el punto de vista funcional pueden modificarse, las interfaces que no son importantes desde el punto de vista funcional pueden modificarse, etc.

En realizaciones específicas, la actividad de rescate puede proporcionarla una secuencia ortóloga o paráloga del gen haploinsuficiente, que es equivalente desde el punto de vista funcional pero es suficientemente divergente al nivel de secuencia como para ser insensible a la supresión. La expresión "secuencia ortóloga" como se usa en el presente documento significa secuencias procedentes de genes que están presentes en especies distintas, que se originaron por ascendencia vertical a partir de un solo gen del último ancestro común. La secuencia ortóloga tiene preferentemente la misma actividad que la secuencia de tipo silvestre en un organismo, o tiene una actividad que es similar a la secuencia de tipo silvestre en un organismo y/o que puede complementar una actividad de tipo silvestre faltante. La secuencia ortóloga puede mostrar modificaciones a nivel de secuencia primaria, es decir, a nivel de ADN o de secuencia genómica, lo que puede volverla resistente a cualquier actividad reductora como se define en el presente documento. De forma similar, la secuencia ortóloga puede mostrar modificaciones a nivel de aminoácidos mientras que mantiene esencialmente la actividad de tipo silvestre de su homólogo de tipo silvestre, lo que puede volverla resistente a cualquier actividad reductora como se define en el presente documento. La expresión "secuencia paráloga" como se usa en el presente documento se refiere a secuencias homólogas que se separaron mediante una duplicación génica. La secuencia paráloga tiene preferentemente la misma actividad que la secuencia de tipo silvestre en un organismo, o tiene una actividad que es similar a la secuencia de tipo silvestre en un organismo y/o que puede complementar una actividad de tipo silvestre faltante. La secuencia paráloga puede mostrar modificaciones a nivel de secuencia primaria, es decir, a nivel de ADN o de secuencia genómica, lo que puede volverla resistente a cualquier actividad reductora como se define en el presente documento. De forma similar, la secuencia paráloga puede mostrar modificaciones a nivel de aminoácidos mientras que mantiene esencialmente la actividad de tipo silvestre de su homólogo de tipo silvestre, lo que puede volverla resistente a cualquier actividad reductora como se define en el presente documento.

El gen de rescate o la actividad de rescate como se define en el presente documento se puede proporcionar en cualquier ubicación adecuada dentro del organismo. La actividad puede, por ejemplo, proporcionarse dentro de una construcción que esté integrada genómicamente en el organismo. Es preferente que el gen de rescate o la actividad de rescate se proporcionen al organismo en una construcción subdominante como se define en el presente documento. Por consiguiente, el organismo puede tener un locus transgénico que comprenda una construcción subdominante que comprenda al menos la actividad de rescate o el gen de rescate, y el medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo. Además se pueden incluir uno o más genes efectores como se define en el presente documento.

En realizaciones, en que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes haploinsuficientes están reducidos en su actividad o funcionalidad de acuerdo con los principios mencionados en el presente documento, por ejemplo, al mismo tiempo o de manera escalonada oportuna, estos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes haploinsuficientes reducidos en su actividad o funcionalidad pueden rescatarse en un organismo como se describe en el presente documento.

En realizaciones de la invención en que la reducción de la actividad o funcionalidad de uno o más genes haploinsuficientes se basa en la presencia de un único locus transgénico como se define en el presente documento, un rescate también puede basarse en un único locus transgénico, es decir, el mismo locus transgénico que el utilizado para la actividad de reducción. En realizaciones alternativas, en que la reducción de la actividad o funcionalidad de uno o más genes haploinsuficientes se basa en la presencia de más de un locus transgénico, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, como se define en el presente documento, un rescate también puede basarse en más de un locus transgénico, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 locus transgénicos, por ejemplo, el mismo número y secuencia de locus transgénicos como se utilizan para la actividad de reducción, o un número y secuencia distintos de locus transgénicos.

En una realización adicional, la reducción de la actividad o funcionalidad de uno o más genes haploinsuficientes puede basarse en la presencia de más de un locus transgénico, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más locus transgénicos como se define en el presente documento, y el rescate puede basarse en un único locus transgénico, por ejemplo, uno de los locus transgénicos como se utiliza para la actividad de reducción o un locus transgénico distinto.

Es preferente que la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente y el rescate de la expresión de dicho gen haploinsuficiente se transmita mediante locus transgénicos ligados físicamente. La expresión "físicamente ligado", como se usa en el presente documento, significa que las actividades de reducción y rescate se proporcionan en proximidad directa dentro de un locus transgénico, por ejemplo, a una distancia de aproximadamente 50 nt, 100 nt, 150 nt, 300 nt, 500 nt, 1000 nt, 5000 nt o 10000 nt, o cualquier valor entre estos valores.

Es particularmente preferente que la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente y el rescate de la expresión de dicho gen haploinsuficiente se transmita mediante locus transgénicos entrecruzados funcionalmente. La expresión "funcionalmente entrecruzado", como se usa en el presente documento, significa que las actividades de reducción y rescate se proporcionan en locus transgénicos distintos. El entrecruzamiento funcional entre locus transgénicos se puede proporcionar en cualquier forma adecuada. En una realización específica de la presente invención, dicho ligamiento funcional puede tener una forma tal que los locus ligados comprendan un medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente de un primer gen haploinsuficiente, y un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de un segundo gen haploinsuficiente en un primer locus transgénico; y un medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente de un segundo gen haploinsuficiente, y un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de un primer gen haploinsuficiente en un segundo locus transgénico. Dicho entrecruzamiento funcional de dos o más genes haploinsuficientes distintos y las actividades de reducción y rescate correspondientes tienen el potencial de aumentar la eficacia de los enfoques subdominantes que tienen como objetivo la biocontención, la transformación de poblaciones y/o la supresión de poblaciones. Ha de entenderse que a diferencia de las construcciones subdominantes que no están funcionalmente entrecruzadas, es posible, en construcciones funcionalmente entrecruzadas, generar por ejemplo a través de la acción de la recombinación meiótica y la segregación cromosómica, genotipos no rescatados en que la expresión de un haploinsuficiente se reduce por la acción de un locus transgénico y no se proporciona rescate de ningún locus transgénico. En una realización preferente, el fenotipo de los genotipos no rescatados puede ser la letalidad embrionaria de la esterilidad. Este fenotipo no rescatado puede ser mecanísticamente distinto del fenotipo de reducción de la aptitud competitiva hemicigótico que se detalla en el presente documento, mientras que este último se basa en la haploinsuficiencia, el primero no. En una realización específica, el haploinsuficiente y el fenotipo no rescatado pueden funcionar en concierto en toda generación después de la generación F2 de cruces con individuos que poseen alelos de tipo silvestre en algunos o todos los locus transgénicos. Se pueden obtener más detalles del Ejemplo 10, cuyo contenido o partes de su contenido se considerarán como realización de la invención. Además, se prevén proporciones cruzadas similares de más de dos genes haploinsuficientes. Por ejemplo, se proporcionan en el locus transgénico 1, un medio para reducir el gen haploinsuficiente 1 y un medio para rescatar el gen haploinsuficiente 3, en el locus transgénico 2, un medio para reducir el gen haploinsuficiente 2 y un medio para rescatar el gen haploinsuficiente 1, y en el locus transgénico 3, un medio para reducir el gen haploinsuficiente 3 y un medio para rescatar el gen haploinsuficiente 2, o cualquier variación de esto, etc.

En una realización preferente adicional, la reducción de la expresión de dos o más genes haploinsuficientes puede ser transportada por un locus transgénico como se define en el presente documento, y el rescate de la expresión de estos dos o más genes haploinsuficientes puede ser transportado por dos o más locus transgénicos, en los que dichos locus transgénicos están funcionalmente entrecruzados.

En una realización específica adicional, la reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente y su rescate como se define en el presente documento pueden combinarse con el uso de un sistema de transformación de poblaciones mecanísticamente distinto. Por ejemplo, se puede introducir adicionalmente en un organismo de acuerdo con la invención una construcción de transformación mecanísticamente distinta. La construcción de transformación mecanísticamente distinta puede comprender además un gen efector como se define en el presente documento.

Los ejemplos de sistemas de transformación mecanísticamente distintos, que están previstos por la presente invención, son el sistema Medea (interrupción embrionaria dominante de efecto materno) como se describe en Lorenzen y col., 2008, PNAS, 105 (29): 10085-10089, el sistema HEG descrito por Windbichler y col. Nature 473, 212 215 (2011). Burt, Proceedings. Biological sciences / The Royal Society 270, 921-8 (2003) o el sistema Wolbachia como describen Sinkins y col. Nature 7, 427-435 (2006)), u otros sistemas tales como el sistema descrito por Huang y col., Insect biochemistry and molecular biology 37, 1054-63 (2007), o cualquier otro sistema que incluya un sistema que pueda desarrollarse en el futuro.

La proporción de medios que reduzcan la expresión de un gen haploinsuficiente en los organismos, y de medios que rescaten la expresión reducida dentro de un organismo, puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado de introducción genética o molecular. Por ejemplo, los medios que reducen la expresión de un gen haploinsuficiente en los organismos, y los medios que rescatan la expresión reducida en el organismo, pueden introducirse en una célula o un organismo como construcciones o entidades de ácido nucleico como se define en el presente documento. Los procedimientos de introducción adecuados serían conocidos para el experto en la materia. Los procedimientos de introducción pueden adaptarse al organismo o clase u organismos en los que se emplean y, por consiguiente, pueden variar. Por ejemplo, tal introducción puede llevarse a cabo por transfección, por ejemplo, transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o de bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, transfección mediada por lípidos catiónicos, fusión de esferoplastos, etc. La técnica de introducción adicional contemplada por la presente invención incluye el contacto con retrovirus defectuosos o atenuados, bombardeo de micropartículas, el uso de recubrimientos con lípidos o receptores de superficie celular, o agentes transfectantes, el uso de encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, por ejemplo, administrándolos asociados a un péptido que se sepa que entra al núcleo o administrándolos asociados a un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor. Normalmente, se introduce un vector plasmídico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empaquetar preferentemente in vitro utilizando una línea celular de empaquetamiento apropiada y luego transducirlo en células hospedadoras. Estas y numerosas técnicas adicionales son conocidas en la técnica para la introducción de moléculas de ácido nucleico o vectores en las células, y pueden utilizarse en conformidad con la presente invención. Después de la introducción del ácido nucleico, se puede permitir que las células técnicamente diseñadas crezcan en condiciones adecuadas, tal como conoce el experto en la materia, por ejemplo, durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio de selección. Los medios de cultivo apropiados y las condiciones para las células hospedadoras y los vectores descritos anteriormente se conocen en la técnica. Un vector plasmídico que contiene la construcción subdominante y un marcador fenotípico visible puede, por ejemplo, microinyectarse en un embrión incipiente o en una diversidad de animales. Después de los procedimientos de cuidados normales o mejorados, la progenie de los embriones inyectados puede explorarse en cuanto a un marcador fenotípico visible o en cuanto a la presencia de un marcador genético adecuado. Estas y numerosas técnicas adicionales son conocidas en la técnica para la introducción de moléculas de ácido nucleico o vectores en genomas animales, y pueden utilizarse en conformidad con la presente invención.

La presencia de los elementos introducidos puede controlarse mediante numerosos procedimientos convencionales, por ejemplo, pruebas de expresión génica, o pruebas de digestión genómica y de hibridación, técnicas de amplificación tales como PCR, etc., que serían conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, la transcripción de un ácido nucleico introducido puede analizarse en pruebas de análisis de Northern y/o la presencia de los polipéptidos traducidos de forma correspondiente puede analizarse mediante pruebas de análisis de Western. Se pueden obtener más detalles y pruebas adicionales en libros de texto cualificados, por ejemplo, de Ausubel y col., eds, 2007, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York.

En una realización de la invención, un organismo de acuerdo con la invención puede transformarse con una construcción subdominante como se define en el presente documento, que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente; y que comprende adicionalmente una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente como se ha definido anteriormente en el presente documento. La presencia de la construcción introducida en el organismo que se tiene como objetivo, por ejemplo, en el genoma del organismo que se tiene como objetivo, puede analizarse mediante digestión genómica y pruebas de hibridación, o mediante técnicas de amplificación específicas de sitio o gen. El control del resultado de la introducción puede comprender además un control del número de construcciones introducidas, por ejemplo, una comprobación de si la construcción está presente como copia única o múltiple y/o si la construcción está presente en un contexto hemicigótico (por ejemplo, en solo uno o en un único cromosoma), o en un contexto homocigótico (por ejemplo, en dos o en todos los cromosomas). Los organismos adecuados que comprenden la construcción introducida en una cantidad deseada y/o en un locus deseado pueden elegirse para usos o etapas del procedimiento posteriores.

En una realización adicional, un organismo de acuerdo con la invención se transforma inicialmente con una construcción transgénica independiente que comprende una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento. La presencia de la construcción introducida puede analizarse mediante digestión genómica y pruebas de hibridación, o técnicas de amplificación específicas de sitio o gen. El control del resultado de la introducción puede comprender además un control del número de construcciones introducidas, por ejemplo, una comprobación de si la construcción está presente como copia única o múltiple y/o si la construcción está presente en un contexto hemicigótico (por ejemplo, en solo uno o en un único cromosoma), o en un contexto homocigótico (por ejemplo, en dos o en todos los cromosomas). Los organismos adecuados que comprenden la construcción introducida en una cantidad deseada y/o en un locus deseado pueden elegirse para etapas de transformación posteriores. Dichas etapa de transformación posterior puede ser una transformación del organismo con una construcción subdominante como se define en el presente documento, que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento; y un gen haploinsuficiente que comprende la proporción de un rescate al menos parcial a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento. Este enfoque ofrece la ventaja de que, por ejemplo, una vez que se ha establecido una estirpe de 'rescate' eficaz, puede utilizarse para todos los intentos posteriores de colocar una construcción subdominante completa que comprenda tanto un gen de rescate como un medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente.

La presencia de la segunda construcción introducida puede analizarse mediante digestión genómica y pruebas de hibridación, o mediante técnicas de amplificación específicas de sitio o gen. El resultado de esta segunda etapa de transformación también se puede controlar, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. El control puede comprender además un control del número de construcciones introducidas, por ejemplo, una comprobación de si la construcción está presente como copia única o múltiple y/o si la construcción está presente en contexto hemicigótico (por ejemplo, en solo uno o en un único cromosoma), o en un contexto homocigótico (por ejemplo, en dos o en todos los cromosomas). Los organismos adecuados que comprenden la segunda construcción introducida en una cantidad deseada y/o en un locus deseado pueden elegirse para usos o etapas del procedimiento adicionales posteriores como se describe en el presente documento.

En una realización adicional, un organismo de acuerdo con la invención puede cotransformarse con una construcción transgénica independiente que comprende una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente al medio por el cual una construcción subdominante dada degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente, como se define anteriormente en el presente documento, y con una construcción subdominante que comprende una secuencia que conduce a la proporción de un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente; y un gen haploinsuficiente que comprende la proporción de un rescate al menos parcial a un medio que degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. La cotransformación puede realizarse utilizando dos entidades de transformación distintas, tales como plásmidos o vectores víricos, etc. Los expertos en la materia conocerán los procedimientos adecuados para la cotransformación de células o embriones. Estos procedimientos pueden corresponder preferentemente a protocolos convencionales, excepto en que se utiliza una mezcla de más plásmidos, por ejemplo, dos plásmidos. La presencia de las construcciones cotransformadas en el organismo que se tiene como objetivo, por ejemplo, en el genoma del organismo que se tiene como objetivo, puede analizarse mediante digestión genómica y pruebas de hibridación, o mediante técnicas de amplificación específicas de sitio o gen. El control del resultado de la introducción puede comprender además un control del número de construcciones introducidas, por ejemplo, una comprobación de si la construcción está presente como copia única o múltiple y/o si la construcción está presente en un contexto hemicigótico (por ejemplo, en solo uno o en un único cromosoma), o en un contexto homocigótico (por ejemplo, en dos o en todos los cromosomas). Los organismos adecuados que comprenden las construcciones cotransformadas en una cantidad deseada y/o en un locus deseado pueden elegirse para usos o etapas del procedimiento posteriores. Este enfoque ofrece la ventaja de que puede ser una ruta experimental más rápida que establecer primero una estirpe de solo rescate, que luego podría inyectarse.

La transformación o introducción como se menciona anteriormente puede llevarse a cabo en un único organismo. En un único organismo, la transformación o introducción puede llevarse a cabo en una única célula o en multitud de células, por ejemplo, en tejido específico, tal como tejido regenerativo, etc. En una realización adicional, la transformación o introducción como se menciona anteriormente puede llevarse a cabo en un grupo de organismos, por ejemplo, una población de organismos de una especie. Además, se prevé la transformación de organismos de más de una especie, por ejemplo, especies estrechamente relacionadas o incluso especies no relacionadas. El número de miembros de un grupo a transformar puede variar y depender de parámetros talos como el tamaño del organismo, el uso de técnicas de transformación, el esquema y momento de reproducción del organismo, etc. La transformación puede llevarse a cabo además en tal grupo una o más de una vez, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 veces, etc., si una primera, 2', 3' etc. ronda de transformación no produce la introducción deseada de una construcción subdominante como se describe en el presente documento.

En una realización preferente de la invención, la metodología de transformación o introducción como se describe anteriormente en el presente documento puede comprender además la etapa de obtención de un organismo que sea homocigótico para la construcción introducida, por ejemplo, la construcción subdominante introducida, o para el locus transgénico establecido de forma correspondiente. Dicha etapa puede incluir una selección de un organismo homocigótico como se define en el presente documento o una separación de organismos homocigóticos y hemicigóticos como se define en el presente documento.

En una realización adicional, los organismos homocigóticos obtenidos de forma correspondiente pueden modificarse adicionalmente mediante la eliminación de la construcción transgénica independiente como se menciona en el presente documento, es decir, una construcción transgénica que comprende una versión modificada del gen haploinsuficiente, que es resistente al medio por el cual una construcción subdominante dada degrada específicamente o inactiva directamente el producto de expresión o transcrito del gen haploinsuficiente, o que altera específicamente la secuencia de ADN del gen haploinsuficiente. Dicha eliminación se puede lograr por recombinación cromosómica o por segregación. Una recombinación cromosómica puede, por ejemplo, basarse en el uso de recombinasas específicas de sitio tales como Cre o FLP y en la presencia de sitios de reconocimiento afines para Cre o FLP, o cualquier otra recombinasa adecuada en los flancos de la construcción independiente. En realizaciones adicionales, la eliminación puede llevarse a cabo por segregación, es decir, a través de rondas repetidas de reproducción sexual y selección en cuanto a la ausencia de la construcción independiente. Esto podría, por ejemplo, facilitarse por marcadores visuales o genéticos adecuados que estén presentes en los distintos locus en cuestión, permitiendo la selección simultánea frente a construcciones solo de rescate en cada generación y para locus subdominantes.

Después de haber realizado una reducción de la expresión de un gen haploinsuficiente en un organismo y un rescate de la expresión reducida como se describe en el presente documento, por ejemplo, basado en el procedimiento de transformación como se define anteriormente en el presente documento, se obtiene un organismo o un grupo de organismos, que son menos competitivamente aptos si son hemicigóticos para el locus transgénico que si son homocigóticos para el locus transgénico. Por consiguiente, el organismo obtenido puede ser homocigótico para el locus transgénico o ser hemicigótico para el locus transgénico. La proporción de individuos homocigóticos o hemicigóticos puede controlarse mediante una adaptación del procedimiento de transformación genética. Por ejemplo, una transformación de alta eficacia de construcciones subdominantes en un organismo puede conducir a una situación genética homocigótica, o a la introducción de dos o más alelos de una construcción subdominante en el genoma en la misma ubicación. Por consiguiente, es preferente utilizar sistemas de sitios de llegada definidos, por ejemplo, un sistema basado en recombinasa PhiC31, Cre o FLP (se pueden obtener detalles adicionales en Nimmo y col., Insect molecular biology, 15, 129-36 (2006); o de Bischof y col., PnAS, 104, 3312-7 (2007)). Este enfoque puede proporcionar preferentemente estirpes homocigóticas de generación directa sin la necesidad transitoria de generar hemicigóticos.

En una realización preferente de la presente invención, el procedimiento como se define anteriormente en el presente documento, que comprende reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo y rescatar la expresión reducida, produciendo así un organismo que es competitivamente menos apto si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para dicho locus, puede comprender adicionalmente la etapa de seleccionar organismos homocigóticos. Dicha etapa de selección puede llevarse a cabo sobre la base de la aptitud competitiva como se define en el presente documento, lo que conduce a desventajas de viabilidad y/o la eventual eliminación de organismos hemicigóticos. La selección de estirpes completamente homocigóticas puede facilitarse adicionalmente mediante el uso de marcadores visibles o genéticos adecuados. La propiedad detallada de las construcciones subdominantes de eliminar alelos de tipo silvestre en un locus transgénico una vez que la frecuencia de la construcción subdominante excede la frecuencia de equilibrio alélico inestable, puede aprovecharse ventajosamente como un procedimiento para establecer homocigóticos de manera rápida y eficiente. Dicho enfoque puede, por ejemplo, utilizarse como una alternativa al procedimiento de selección de familias establecidas a partir de cruces de una sola pareja o autofecundación en que durante dos generaciones consecutivas un patrón de herencia de marcadores informativos es consistente con el individuo fundador o individuos que han sido homocigóticos. Los marcadores adecuados en tales procedimientos pueden incluir la observación de diferencias de crecimiento u otras diferencias fenotípicas que son indicativas de homocigosis o hemicigosis. Se prevén además enfoques de detección molecular, que pueden, por ejemplo, estar vinculados a genes efectores tales como marcadores visuales o marcadores de color, etc. La presencia de un determinado color o su intensidad puede proporcionar información sobre la homocigosis y/o hemicigosis de un organismo individual. La presencia y la cantidad de un locus transgénico y/o su identidad pueden determinarse adicionalmente mediante análisis molecular, por ejemplo, técnicas de hibridación de ADN, enfoques de amplificación de ADN o ARN, por ejemplo, basados en la reacción en cadena de la polimerasa, o determinando un rasgo fenotípico basado en genes o elementos marcadores ópticos o visuales, genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a herbicidas, incluidos en las construcciones transgénicas Los organismos obtenidos de acuerdo con un procedimiento como se define anteriormente en el presente documento, por ejemplo, con o sin una etapa posterior de separación de homocigóticos/hemicigóticos, pueden utilizarse para la posterior reproducción sexual interfértil dentro de este grupo de organismos. Esto puede conducir a la proporción adicional de individuos homocigóticos o hemicigóticos.

Para determinadas aplicaciones del procedimiento, puede ser ventajoso obtener y utilizar organismos que sean homocigóticos para el locus transgénico. Dichos organismos muestran una aptitud competitiva normal o restablecida en comparación con los organismos de tipo silvestre, y pueden conducir a una progenie hemicigótica o heterocigótica en una próxima generación si se aparean con organismos de tipo silvestre, conduciendo a la reproducción sexual. Para otras aplicaciones del procedimiento, puede ser ventajoso obtener y utilizar organismos que sean homocigóticos o hemicigóticos para un locus transgénico. La liberación de individuos hemicigóticos para la aplicación de la supresión del tamaño de la población se puede utilizar preferentemente en situaciones en que el fenotipo de reducción de la aptitud competitiva está limitado en gran medida a la fertilidad reducida.

En el presente documento se desvela que un organismo obtenible de acuerdo con un procedimiento como se define anteriormente en el presente documento, en particular, obtenible reduciendo la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo y rescatando la expresión reducida, lo que produce un organismo que es menos competitivamente apto si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para dicho locus, puede liberarse en una población de la misma especie. La expresión "población de la misma especie" como se usa en el presente documento significa un grupo de individuos de otro modo interfértiles que se considera que pertenecen al mismo grupo taxonómico. La expresión "de otro modo interfértil", como se usa en el presente documento, describe agrupaciones de individuos que, con la excepción del efecto de algún locus transgénico integrado en su genoma, serían sustancialmente interfértiles y capaces de producir descendencia viable y competitiva a frecuencias apreciables.

Se desvela adicionalmente que, con el objetivo de suprimir el tamaño de la población, una población o grupos de poblaciones diana pueden tener cualquier tamaño. El número de individuos puede depender del número, la proporción de sexos y/o la aptitud competitiva de los individuos transgénicos que pueden estar disponibles para la liberación. Podrían precisarse para múltiples generaciones consecutivas relaciones de liberación de individuos transgénicos:silvestres de más de 1:1, 10:1, 100:1 o 1000:1, o más, o cualquier valor entre estos valores

Además se desvela en el presente documento que, con el objetivo de transformar una población, una población o grupos de poblaciones diana pueden, en teoría, tener cualquier tamaño. La idoneidad de las poblaciones diana puede depender de la especie, su tiempo de generación o reproducción y la tasa de migración entre poblaciones diana y no diana. Por ejemplo, poblaciones que presentan una tasa de emigración promedio a cualquiera de las poblaciones no diana de aproximadamente o menos del 0,1 %, 1 %, 2 %, 4 %, 6 %, 8 %, 10 % o 20 % tendrían más probabilidades de limitar la propagación de alta frecuencia de la construcción subdominante a las poblaciones vecinas no diana. Por ejemplo, las poblaciones que presentan una tasa de inmigración neta promedio desde poblaciones no diana de tipo silvestre de aproximadamente o menos del 0,1 %, 1 %, 2% , 4%, 6%, 8%, 10% o 20% serían más estables, manteniendo la construcción subdominante a alta frecuencia en las poblaciones diana. Para calcular aproximadamente el número de individuos a liberar necesarios para lograr la transformación de la población, se puede utilizar cualquier metodología adecuada. Es preferente que se utilice la ecuación 1 como se menciona en el Ejemplo 5. La ecuación 1 del Ejemplo 5 también se puede utilizar para calcular el número aproximado de individuos de tipo silvestre que se necesitaría liberar en una población ya transformada para eliminar construcciones transgénicas subdominantes. Para calcular aproximadamente la estabilidad geográfica de la transformación de la población en términos de la capacidad de restringir la presencia de una alta frecuencia de los locus subdominantes, es preferente utilizar las ecuaciones 2 a 12 del Ejemplo 5. Como alternativa, pueden utilizarse sus derivados o cualquier otra metodología adecuada conocida por el experto en la materia.

Como se desvela adicionalmente en el presente documento, el organismo a liberar puede ser hemicigótico para el locus transgénico u homocigótico para el locus transgénico como se define anteriormente en el presente documento. Además se describe la liberación de una mezcla de organismos homocigóticos y hemicigóticos. La liberación de tales organismos puede conducir a un establecimiento del locus transgénico en una alta frecuencia en la población.

La expresión "establecimiento del locus transgénico" como se usa en el presente documento significa que el locus transgénico se mantiene dentro de la población a una frecuencia de equilibrio elevada de alelos transgénicos en un locus transgénico cercana al 100 %, o al menos al 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 85 %, 80 % o 75 %, o cualquier valor entre estos valores. Este equilibrio de alta frecuencia está destinado a persistir hasta que se produzca la extinción de la población o la transformación de la población se revierta intencionalmente mediante la liberación de un número suficiente de individuos de tipo silvestre durante una sola generación o sucesivas, para superar el umbral de transformación de la población alélica o si la inmigración hacia la población transformada por individuos de tipo silvestre es suficiente en una sola generación o sucesivas para superar el umbral de transformación de la población alélica. La pérdida de la transformación de la población en todos estos casos implica que la población vuelve a su estado de tipo silvestre original con respecto a los locus transgénicos.

La expresión "alta frecuencia en la población", como se usa en el presente documento, significa que el locus transgénico o la construcción subdominante insertada genómicamente está presente en la población cerca del 100 %, o al menos el 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 85 %, 80 % o 75 %, o cualquier valor entre estos valores.

La presente descripción desvela además que la liberación de los organismos con fines de transformación de la población puede realizarse una sola vez, o puede llevarse a cabo en fases o etapas, cubriendo múltiples generaciones consecutivas, por ejemplo, después de una liberación inicial, puede tener lugar una segunda liberación después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3, meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1,5 años, 2 años, etc., o cualquier punto de tiempo entre estos puntos de tiempo, dependiendo del tiempo de generación del organismo diana. La liberación de los organismos puede llevarse a cabo además de manera continua, por ejemplo, cada día o en días alternos durante un determinado período de tiempo, por ejemplo, por 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3, meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, etc. Las ecuaciones proporcionadas en el Ejemplo 5 proporcionan algunas aproximaciones de los umbrales de alelos inestables que deberán atravesarse para lograr la transformación o inversión de la población. Durante los períodos de migración excepcionalmente alta o de extinción y recolonización de la población local, en algunas circunstancias puede ser conveniente reiniciar temporalmente las liberaciones.

La liberación de los organismos puede llevarse a cabo durante una generación de un organismo, o durante más de una generación, por ejemplo, durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más generaciones.

Se desvela adicionalmente que el número de organismos liberados depende de varios parámetros, tal como el mismo organismo, su especie, su papel ecológico y comportamiento, la tasa de reproducción, el tiempo de generación, la movilidad de los organismos, el tamaño de la población silvestre presente, la propagación geográfica de los organismos, la interfertilidad de los organismos, el clima, las temperaturas medias, las estaciones etc. Un experto en la materia puede llevar a cabo una adaptación de los números de liberación a uno o más de estos parámetros. En un ejemplo, la liberación puede llevarse a cabo con un número suficiente de individuos transgénicos para dar como resultado una frecuencia en la población de la misma especie que sea mayor que la frecuencia alélica de equilibrio inestable predicha por la aptitud competitiva. La expresión "frecuencia de equilibrio alélico inestable predicha por la aptitud competitiva" como se usa en el presente documento significa que se espera que las frecuencias alélicas de la población que comienzan por debajo de este punto disminuyan con el tiempo, debido a la selección natural. Se espera que las frecuencias alélicas que comiencen por encima de este punto aumenten con el tiempo debido a la selección natural (se pueden obtener más detalles de Fisher, 1922, Proc. Roy. Soc. Edinburgh 42:321-341; Wright, 1931, Genetics 16:97-159; Wright, 1941, The American Naturalist 75:513-522; Wiener, 1942, Science 96:407-408; o Li, 1955, Am. Nat. 89:281-295). Este punto crítico se conoce como frecuencia alélica 'inestable umbral'. La frecuencia alélica umbral para la transformación de la población puede calcularse para una población aislada con cualquier metodología adecuada, preferentemente utilizando la ecuación 1 representada en el Ejemplo 5. Basándose en la frecuencia alélica inestable umbral aproximada calculada se puede desarrollar una estrategia de liberación que minimice los recursos prácticos necesarios para lograr la transformación de la población.

Se desvela adicionalmente que el procedimiento como se define anteriormente en el presente documento puede comprender adicionalmente la etapa de utilizar un organismo obtenible de acuerdo con un procedimiento como se define anteriormente en el presente documento, en particular, obtenible reduciendo la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo y rescatando la expresión reducida, lo que produce un organismo que es menos competitivamente apto si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para dicho locus, siendo por lo tanto transgénico, en un entorno que comprende individuos del organismo de tipo silvestre con reproducción sexual de otro modo interfértiles. Este uso implica el apareamiento eventual de un organismo transgénico con organismos de tipo silvestre. Es preferente utilizar organismos homocigóticos, por ejemplo, obtenidos y seleccionados para este enfoque de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. El apareamiento con organismos de tipo silvestre puede proporcionar progenie hemicigótica, que tenga una aptitud competitiva reducida en comparación con la progenie homocigótica. Por consiguiente, la aptitud competitiva de un organismo transgénico hemicigótico puede tener un valor de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % u 85 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo de tipo silvestre correspondiente. En realizaciones adicionales, por consiguiente, la aptitud competitiva de un organismo transgénico hemicigótico puede tener un valor de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % u 85 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo transgénico homocigótico correspondiente La aptitud competitiva relativa de los genotipos puede, por ejemplo, deducirse de los cambios de frecuencias alélicas entre generaciones (véase Catteruccia y Godfray Science 299, 2001-2003 (2003)) utilizando un marco estadístico apropiado (se pueden obtener más detalles en Clark y col., Heredity 46, 321-46 (1981) o de la Fig. 8 de la solicitud). Como alternativa, la aptitud competitiva relativa de los genotipos puede estimarse midiendo los rasgos del ciclo de vida en una única generación que probablemente contribuyen a la aptitud competitiva. Dichos rasgos pueden incluir, fecundidad, variabilidad, peso de los individuos, atractivo sexual, cantidad de gametos generados, tasas de crecimiento y/o movilidad en una sola generación (se pueden obtener más detalles de Irvin y col., PNAS, 101, 891-6 (2004); o Amenya y col., Insect Molecular Biology, 19, 263-269 (2010)).

En realizaciones preferentes, la aptitud competitiva reducida es una viabilidad reducida y/o una fertilidad reducida del organismo. Por ejemplo, la viabilidad de un organismo transgénico hemicigótico puede reducirse en un valor de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % u 85 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo de tipo silvestre correspondiente, o la viabilidad de un organismo transgénico hemicigótico puede reducirse en un valor de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % u 85 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo transgénico homocigótico correspondiente. La fertilidad de un organismo transgénico hemicigótico puede reducirse en un valor de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % u 85 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo de tipo silvestre correspondiente, o la fertilidad de un organismo transgénico hemicigótico puede reducirse en un valor de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % u 85 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo transgénico homocigótico correspondiente. En determinadas realizaciones, las reducciones de viabilidad y fertilidad pueden estar presentes al mismo tiempo o en el mismo organismo.

La fecundidad relativa o la viabilidad de los genotipos puede, por ejemplo, estimarse utilizando las técnicas biológicas convencionales como se describe en Irvin y col., PNAS, 101, 891-6 (2004); o Amenya y col., Insect Molecular Biology, 19, 263-269 (2010).

En una realización muy específica, la reducción de la aptitud competitiva en un organismo hemicigótico puede no implicar una reducción sustancial en la viabilidad media. En una realización adicional muy específica, la reducción de la aptitud competitiva en un organismo hemicigótico implica una reducción sustancial en la viabilidad media. Es concebible que la aptitud competitiva se reduzca sustancialmente al deprimir el atractivo sexual, por ejemplo, a través de la alteración de las características sexuales secundarias utilizadas en la elección de pareja.

Además se desvela un procedimiento para la transformación de una población de organismos con reproducción sexual, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en la que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo como se define anteriormente en el presente documento; (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo como se define anteriormente en el presente documento, y (c) liberar organismos homocigóticos obtenidos en la etapa anterior en una población de la misma especie, de forma que el locus transgénico se establezca con una frecuencia alta en la población. La expresión "transformación de una población", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un procedimiento mediante el cual, mediante la liberación masiva deliberada de individuos que comprende un locus transgénico, aumenta la frecuencia del locus transgénico en el transcurso de las generaciones posteriores de manera predecible, hasta que se mantenga de forma estable en la población diana en una frecuencia alta, por ejemplo, una frecuencia de alta frecuencia de equilibrio de alelos transgénicos en un locus transgénico cercana al 100 %, o al menos el 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 85 %, 80 % o 75 %, o cualquier valor entre estos valores.

En ejemplos específicos, la transformación de una población se puede lograr superando una frecuencia umbral del locus transgénico como se describe en el presente documento en la población diana. La frecuencia umbral puede, por ejemplo, ser mayor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9, o más, cuando no se combina con otros sistemas de transformación de poblaciones. El organismo homocigótico a utilizar puede seleccionarse o separarse de los organismos hemicigóticos de acuerdo con las etapas del procedimiento como se define anteriormente en el presente documento. La transformación de una población puede así dar como resultado un reemplazo de la población, es decir, un reemplazo de organismos de tipo silvestre por organismos que son homocigóticos o hemicigóticos para el locus transgénico como se describe en el presente documento. Se puede lograr una transformación de la población, por ejemplo, mediante una liberación masiva de individuos que portan los locus transgénicos. La expresión "liberación masiva" como se usa en el presente documento significa que al menos el 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 200 %, 300 %, 1000 % o más, o cualquier valor entre estos valores del número actual de individuos de tipo silvestre de una población dada, son liberados. Esta liberación masiva se puede realizar una vez, o más de una vez, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más veces. La liberación puede llevarse a cabo durante una generación o durante múltiples generaciones, y puede configurarse durante fases o intervalos de tiempo como se define anteriormente en el presente documento. Las liberaciones pueden ser de un solo sexo, preferentemente solo masculino, o constituir una mezcla de ambos sexos en diversas proporciones.

En el presente documento se desvela adicionalmente un procedimiento para la reducción del tamaño de un población silvestre de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, y (c) utilizar un organismo transgénico hemicigótico obtenido en la etapa (b) o una mezcla de organismos transgénicos homocigóticos y hemicigóticos obtenidos en la etapa (b) en un entorno que comprende individuos del organismo de tipo silvestres con reproducción sexual de otro modo interfértiles, en el que se reduce la aptitud competitiva de la progenie hemicigótica. Las liberaciones pueden ser de un solo sexo, preferentemente solo masculino, o constituir una mezcla de ambos sexos en diversas proporciones. La expresión "población silvestre", como se usa en el presente documento, significa que los individuos incluidos en dicha población no comprenden o contienen un locus transgénico o una construcción subdominante como se define en el presente documento. Dichos individuos se consideran individuos de tipo silvestre u organismos de tipo silvestre.

Una "reducción del tamaño" de tales poblaciones silvestres como se usa en el presente documento se refiere a una reducción relativa del número de miembros de un determinado genotipo, por ejemplo, un genotipo que no comprende un locus transgénico como se define en el presente documento, si bien el número total de individuos de una especie que comprende genotipos transgénicos y no transgénicos puede no alterarse ni aumentarse. Además es posible una reducción del número total de individuos de una especie que comprenda genotipos transgénicos y no transgénicos, que sin embargo sea más pequeña o menos pronunciado que la reducción de los individuos de tipo silvestre. La reducción de la población silvestre de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser una reducción del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o más, o cualquier valor entre estos valores en comparación con el número de individuos de tipo silvestre antes de la realización del procedimiento, o en comparación con una población silvestre que no fue tratada o en la que no se liberaron individuos transgénicos. En determinados casos, el grado de supresión puede ser del 100 %, lo que da como resultado la extinción local de la población diana. Las liberaciones pueden ser de un solo sexo, preferentemente solo masculino, o constituir una mezcla de ambos sexos en diversas proporciones.

En otro ejemplo de supresión de poblaciones, los individuos transgénicos homocigóticos y/o hemicigóticos pueden liberarse en áreas sin una población de tipo silvestre interfértil conocida. Dicha etapa se desvela para realizarla como parte de un programa de liberación preventivo para reducir el potencial de las poblaciones silvestres para establecerse en un área sensible o de riesgo.

La reducción de una población silvestre de individuos puede basarse en una disminución de la reproducción sexual de individuos hemicigóticos para el locus transgénico como se define en el presente documento. La disminución de la reproducción sexual puede deberse a una reducción de la aptitud general, por ejemplo, debido al rescate parcial de un gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento El organismo que se utilizará en este procedimiento es un organismo transgénico hemicigótico o una mezcla de organismos transgénicos homocigóticos y hemicigóticos. Se prevé particularmente la liberación de individuos hemicigóticos para la aplicación de la supresión del tamaño de la población, donde el fenotipo de reducción de la aptitud competitiva está limitado en gran medida a la fertilidad reducida. Es preferente liberar organismos transgénicos homocigóticos.

Se desvela adicionalmente que la frecuencia del locus transgénico en un procedimiento para la transformación de una población o un procedimiento para la reducción del tamaño de una población silvestre puede aumentar durante la liberación y/o después de la liberación de organismos individuales como se define en el presente documento.

En un ejemplo adicional, la presente invención desvela un procedimiento para disminuir la introgresión de un locus transgénico en un organismo en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; (b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo, y (c) utilizar un organismo transgénico obtenido en la etapa (b) un entorno que comprende individuos del organismo de tipo silvestres con reproducción sexual de otro modo interfértiles, en el que se reduce la aptitud competitiva de la progenie hemicigótica, disminuyendo de este modo la tasa de reproducción sexual y/o la viabilidad de la progenie hemicigótica. La expresión "disminución de la introgresión de un locus transgénico en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles", como se usa en el presente documento, significa que la frecuencia de un locus transgénico en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles se lleva por debajo de un nivel que se esperaría para un rasgo neutral, un rasgo selectivamente ventajoso o selectivamente perjudicial, o un rasgo que no tiene influencia en la aptitud competitiva del organismo en el entorno. La disminución de la introgresión se logra ventajosamente por el hecho de que el locus transgénico conduce a una reducción de la aptitud competitiva si está presente de manera hemicigótica en un organismo. Para los organismos diploides, el locus transgénico conduciría a una reducción de la aptitud competitiva si está presente de manera heterocigótica, es decir, como una sola copia o alelo.

El uso del organismo puede incluir la plantación de individuos subdominantes transgénicos homocigóticos en zonas amortiguadora, por ejemplo, alrededor de plantas de cruzamiento exogámi

individuos a través de la zona amortiguadora, al mismo tiempo que limita el potencial de introgresión en las generaciones posteriores debido a la reducción de la aptitud competitiva de los hemicigóticos en las siguientes generaciones. Esta aplicación es de uso particular en la contención del cruzamiento exogámico involuntario de plantas genéticamente modificadas.

La reducción de la aptitud competitiva de la progenie hemicigótica puede ser, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o, preferentemente, el 100 %, o cualquier valor entre estos valores de la aptitud competitiva de un organismo de tipo silvestre correspondiente o de un organismo transgénico homocigótico correspondiente. En realizaciones preferentes, la aptitud competitiva reducida es una viabilidad reducida y/o una fertilidad reducida del organismo. Por ejemplo, la viabilidad de un organismo transgénico hemicigótico puede reducirse en un valor de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o, preferentemente el 100 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo de tipo silvestre correspondiente o de un organismo transgénico homocigótico correspondiente. La fertilidad de un organismo hemicigótico puede reducirse en un valor de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %, o cualquier valor entre estos valores de un organismo de tipo silvestre correspondiente o de un organismo transgénico homocigótico correspondiente. Se desvela adicionalmente que la aptitud competitiva reducida en el contexto de un procedimiento para disminuir la introgresión de un locus transgénico en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles, como se describe en el presente documento, también puede ser o dar como resultado una no viabilidad completa de la progenie, y/o una no fertilidad completa de la progenie. Esto se puede observar en cualquier fase de crecimiento adecuada. En el caso de no viabilidad, la ausencia de progenie puede ser detectable. En el caso de infertilidad, los cigotos fertilizados pueden puntuarse.

En otro ejemplo más, la disminución de la introgresión de un locus transgénico en un organismo es una prevención de la introgresión de un locus transgénico en la población de individuos de tipo silvestres del organismo con reproducción sexual de otro modo interfértiles. La reducción de la aptitud competitiva puede, por consiguiente, eliminar la viabilidad de la progenie.

En un ejemplo alternativo, puede eliminarse la posibilidad de reproducción sexual de la progenie hemicigótica. La progenie hemicigótica puede, por ejemplo, mostrar un crecimiento normal o saludable o un comportamiento de supervivencia ambiental, pero puede ser incapaz de reproducirse dentro de su población o con cualquier otra población de individuos de tipo silvestre u homocigóticos o hemicigóticos de su especie, o con otras especies. Este comportamiento puede, por ejemplo, deberse a una reducción en la capacidad de las plantas hemicigóticas para generar polen u óvulos viables, o de sostener el desarrollo de semillas. Las mutaciones haploinsuficientes de genes de PRC en plantas pueden, por ejemplo, dar como resultado la reducción de la viabilidad del polen y los óvulos, por ejemplo, en un 70 % y un 50 %, respectivamente, además de la producción reducida de semillas (se pueden obtener más detalles en Weijers y col., Cell 4299, 4289-4299 (2001); o Degenhardt, Plant physiology, 147, 128-42 (2008)).

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un sistema genético que comprende (a) un medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento; y (b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento, en el que el sistema genético se proporciona como una entidad de transformación única y en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico. La expresión "que reducir específicamente" como se usa en el presente documento se refiere a un enfoque dirigido, no aleatorio, hacia un gen de haploinsuficiencia. La expresión excluye los enfoques para la reducción de la expresión que se basan en modificaciones aleatorias, tal como la mutagénesis aleatoria o los enfoques insercionales, los que, por ejemplo, producen al azar un resultado positivo en un gen de haploinsuficiencia. Dichos enfoques se consideran inespecíficos y, por lo tanto, no se pueden incluir bajo la expresión utilizada. En particular, la mutagénesis aleatoria o los enfoques insercionales tienden a modificar las secuencias genómicas no solo en una posición, sino, a menudo, en varias posiciones, lo que conduce a implicaciones genéticas imprevisibles, las cuales no se puede esperar que sean rescatadas específicamente por la expresión de un gen de rescate específico o genes de rescate específicos. El sistema genético se proporciona como una entidad de transformación individual, es decir, como una entidad que se puede introducir como molécula individual en un organismo diana. Las moléculas pueden ser cualquier vehículo de introducción adecuado, tal como un elemento genético móvil, un ADN plásmido, vector vírico o casete de inserción genómica o ADN exógeno capaz de integración genómica. El vehículo puede ser circular o lineal, por ejemplo, se ha linealizado cortando con una enzima de restricción o se ha cortado mediante fuerzas físicas. Un elemento genético móvil puede ser, por ejemplo, un elemento transponible, que es capaz de insertarse en una ubicación arbitraria o predefinida dentro del genoma de un organismo. Este elemento transponible puede comprender una o más construcciones subdominantes como se define en el presente documento. Los ejemplos de elementos transponibles adecuados incluyen transposones de ADN tales como sleeping beauty o derivados de los mismos, Ac/Ds o derivados de los mismos, elementos P o derivados de los mismos, elementos mariner o derivados de los mismos, Tc1 o Tc3 o derivados de los mismos, elementos a piggybac, elementos minos o retrotransposones tales como Ty1 o derivados de los mismos. Además, se pueden utilizar diversos sistemas de sitio de llegada definido basados en las recombinasas PhiC31, Cre o FLP con plásmidos adecuados para integrarlas en posiciones definidas en el genoma (se pueden obtener más detalles de Nimmo y col., Insect molecular biology, 15, 129-36 (2006); o Bischof y col., PNAS, 104, 3312 7 (2007)).

Además se desvela el uso de un sistema genético como se describe anteriormente para la transformación de la población de un organismo. La transformación de la población se puede llevar a cabo esencialmente como se describe anteriormente en el presente documento en el contexto de la introducción de construcciones subdominantes en un organismo. La transformación puede llevarse a cabo en una multitud de organismos o en una población de organismos. Esta multitud de organismos o población de organismos se describe como de la misma especie.

En una realización preferente adicional, el sistema genético de acuerdo con la invención puede utilizarse para establecer un medio para reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo y para establecer un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida del gen haploinsuficiente en un organismo. Preferentemente, el sistema genético puede utilizarse para establecer las actividades de reducción y de rescate en una forma homocigótica en un organismo. El organismo obtenido correspondiente puede conducir además a un establecimiento del sistema genético con una alta frecuencia en una población de un organismo.

Se desvela adicionalmente que el sistema genético de acuerdo con la invención puede utilizarse para disminuir su propia introgresión en una población de organismos con reproducción sexual de otro modo interfértiles. Por consiguiente, puede proporcionarse el sistema genético en un organismo, que de otro modo es interfértil y que con reproducción sexual con otros organismos de la misma especie. El sistema genético puede proporcionarse preferentemente en un organismo en una forma homocigótica. Basándose en la aptitud competitiva reducida de la progenie hemicigótica de un organismo que comprende un sistema genético como se define en el presente documento, se puede lograr una introgresión del sistema genético en una población de individuos no transformados. Por ejemplo, los organismos de tipo silvestre que se aparean con organismos que comprenden un sistema genético como se define en el presente documento pueden tener una aptitud competitiva reducida, por ejemplo, ser no viables y/o no fértiles, o tener viabilidad reducida y/o fertilidad reducida. Dichos organismos pueden no contribuir a una diseminación del sistema genético en la progenie posterior y, por lo tanto, a una introgresión del sistema genético en la población silvestre. En una realización específica, el sistema genético como se define en el presente documento puede utilizarse para la prevención de la introgresión del propio sistema genético en una población de organismos de tipo silvestre mediante una eliminación o limitación de la reproducción sexual de la progenie hemicigótica. Dicha eliminación o limitación puede basarse en los efectos debidos a uno o más genes haploinsuficientes o debidos a los efectos basados en uno o más genes efectores, los cuales pueden proporcionarse junto con el sistema genético como se describe anteriormente en el presente documento.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un organismo eucariota genéticamente modificado, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende (a) un medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente como se define anteriormente en el presente documento; y (b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida en dicho gen haploinsuficiente, en el que dicho organismo es un organismo potencialmente con reproducción sexual, en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico, y en el que dicho organismo es una planta o un insecto. La expresión "que reduce específicamente" como se usa en este contexto debe entenderse como se define anteriormente en el presente documento. En una realización específica, el organismo genéticamente modificado no es un ser humano. En una realización específica adicional, los organismos genéticamente modificados pueden obtenerse o son obtenibles llevando a cabo el procedimiento de reducción de la aptitud competitiva de un organismo como se define en el presente documento. El organismo genéticamente modificado de acuerdo con la invención puede ser homocigótico para una o más construcciones subdominantes como se define en el presente documento. En una realización adicional, el organismo genéticamente modificado puede ser hemicigótico para una o más construcciones subdominantes como se define en el presente documento. En otra realización preferente más, el organismo genéticamente modificado que es hemicigótico para una o más construcciones subdominantes como se define en el presente documento, puede tener una aptitud competitiva reducida en comparación con el organismo homocigótico para una construcción subdominante de acuerdo con la invención.

Un organismo como se menciona anteriormente en el presente documento, por ejemplo, un organismo con el que se llevan a cabo los procedimientos de acuerdo con la invención, o un organismo genéticamente modificado incluido en la presente invención, puede ser cualquier organismo adecuado conocido por el experto en la materia. Los ejemplos de tales organismos incluyen animales, plantas, hongos o protistas. Entre los animales que son vectores de enfermedades, son preferentes los animales que provocan enfermedades y animales de ganado. La expresión "animal que es vector de enfermedades" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier animal, que transmite una enfermedad de un hospedador a otro. Dicha enfermedad puede ser una enfermedad animal, por ejemplo, humana, o una enfermedad vegetal. Los ejemplos de tales animales son un insecto, un arácnido o un roedor. Entre los insectos es preferente un mosquito o una mosca. Son particularmente preferentes los insectos que son vectores de enfermedades animales, por ejemplo, Acyrthosiphon pisum, Agromyzidae sp., Anthomyiidae sp., saltamontes de la remolacha, Brevicoryne brassicae, Cacopsylla melanoneura, saltamontes marrón común, culmícolas, CurculionidaeE, Eumetopina flavipes, Frankliniella occidentalis, Frankliniella triticiG, chicharrita de alas cristalinas, Piojo saltarines de plantas, escarabajo de las hojas, chicharrita, cochinilla, mosca del melón, Molytinae, Pegomya hyoscyami, Pissodes, Pissodes strobi, Pissodini, Planthopper, Pseudococcus viburni, Psylla pyri, Rhabdophaga rosaria, Rhynchophorus palmarum, Scaphoideus titanus, Scirtothrips dorsalis, mosca blanca, Tephritidae, Thripidae, Thrips palmi, Tomicus piniperda, Toxoptera citricida, membrácidos, Triozidae. Además, se prevén insectos que son vectores de enfermedades animales, por ejemplo, Aedes sp., Anopheles sp., Calliphoridae sp., Culex sp., Glossinidae sp., Haemagogus sp., Hippelate sp., Ixodoidea sp., Phlebotomus sp., Rhodnius sp., Simuliinae sp., Simuliini sp., Simulium sp. o Triatoma sp.

Un arácnido preferente es una garrapata. El roedor puede ser una rata o un ratón. En una realización adicional, el animal que provoca la enfermedad puede ser un nematodo que provoca una enfermedad humana, un nematodo que provoca una enfermedad animal o un nematodo que provoca una enfermedad vegetal. Los ejemplos de tales nematodos incluyen Ancylostoma sp., Aphelenchoides sp., Ascari sp., Bursaphelenchus sp., Ditylenchus sp., Enterobius sp., Globodera sp., Heterodera sp., Longidorus sp., Meloidogyne sp., Nacobbus sp., Pratylenchus sp., Toxocara sp., Trichodorus sp., Trichuris sp., Tylenchulus sp. y Xiphinema sp.

En una realización adicional particularmente preferente, dicho organismo es una planta agrícola. Una planta agrícola puede ser cualquier planta que utilicen los seres humanos para fines agrícolas. Los ejemplos incluyen un cultivo básico, por ejemplo, un cultivo de cereales, cultivos de plantas de raíz, tubérculos, legumbres o leguminosas; o un cultivo productor de azúcar o una planta productora de aceite, por ejemplo, aceite de palma o cártamo. Los ejemplos particularmente preferentes de plantas agrícolas son la alfalfa, Anthurium, manzana, álamo temblón, Bacterium, césped Bahía, banana, cebada, remolacha, Belladona, césped Bermuda, arándano azul, camelina, zanahoria, mandioca, achicoria, Chrysanthemum, Clavibacter, maíz, algodón, Crambe, arándano rojo, pepino, berenjena, sésamo bastardo, Gladiolus, uva, pomelo, vid, guayule, lechuga, melón, Miscanthus, cebolla, papaya, guisante, cacahuete, Pelargonium, pimiento, menta, caqui, petunia, ciruela, álamo, patata, Pseudomonas, colza, Rhizobium, arroz, cártamo, sorgo, soja, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, estoraque, pasto varilla, tabaco, tomate, nuez, sandía o trigo.

En una realización adicional, la planta puede ser una planta plaga. La expresión "planta plaga", como se usa en el presente documento, se refiere a una planta que se considera que perturba los esfuerzos agrícolas u hortícolas del ser humano. Los ejemplos previstos o las plantas plagas incluyen Acmena smithii, Ailanthus altissima, Akebia quinata, Alternanthera philoxeroides, Anredera cordifolia, Araujia sericifera, Aristea ecklonii, Arundo donax, Asparagus asparagoides, Asparagus densiflorus, Asparagus scandens, Berberis darwinii, Bomarea multiflora, Bryonia cretica, Calluna vulgaris, Cardiospermum grandiflorum, Cardiospermum halicacabum, Carpobrotus edulis, Celastrus orbiculatus, Ceratophyllum demersum, Cestrum parqui, Chrysanthemoides monilifera, Clematis flammula, Clematis vitalba, Cobaea scandens, Cortaderia jubata, Cortaderia selloana, Cotoneaster simonsii, Cotyledon orbiculata, Crassula multicava, Cyathea cooperi, Dipogon lignosus, Drosera capensis, Eccremocarpus scaber, Egeria densa, Ehrharta villosa, Eichhornia crassipes, Eomecon chionantha, Equisetum, Eragrostis curvula, Erigeron karvinskianus, Euonymus japonicas, Ficus rubiginosa, Fuchsia boliviana, Galeobdolon luteum, Gunnera tinctoria, Gymnocoronis spilanthoides, Hedychium flavescens, Hedychium gardnerianum, Heracleum mantegazzianum, Hieracium, Homalanthus populifoliusm, Homeria collina, Houttuynia cordata, Hydrilla verticillata, Hydrocleys nymphoides, Hypericum androsaemum, Ipomoea indica, Iris pseudacorus, Jasminum humile, Lagarosiphon major, Lantana camara, Ligustrum lucidum, Lilium formosanum, Lonicera japonica, Ludwigia peploides subsp. Montevidensis, Lythrum salicaria, Macfadyena unguis-cati, Menyanthes trifoliate, Myoporum insulare, Myrica faya, Myricaria germanica, Myriophyllum aquaticum, Nassella, Nephrolepis cordifolia, Nuphar lutea, Nymphaea Mexicana, Nymphoides geminate, Nymphoides peltata, Ochna serrulata, Osmunda regalis, Panicum maximum, Passiflora caerulea, Passiflora tarminiana, Passiflora tripartite, Pennisetum, Phragmites australis, Pinus contorta, Pistia stratiotes, Pittosporum undulatum, Plectranthus ciliates, Polygala myrtifolia, Potamogeton perfoliatus, Prunus serotina, Pyracantha angustifolia, Reynoutria japonica, Reynoutria sachalinensis, Rhamnus alaternus, Rhododendron ponticum, Sagittaria montevidensis, Sagittaria platyphylla, Sagittaria sagittifolia, Salix cinerea, Salix fragilis, Salvinia molesta, Schinus terebinthifolius, Schoenoplectus californicus, Selaginella kraussiana, Solanum marginatum, Solanum mauritianum, Tradescantia fluminensis, Tropaeolum speciosum, Tussilago farfara, Typha latifolia, Utricularia arenaria, Utricularia gibba, Utricularia livida, Utricularia sandersonii, Vallisneria gigantean, Vallisneria spiralis, Zantedeschia y Zizania latifolia.

En una realización preferente adicional, la planta es un alga. Los ejemplos previstos de algas dentro del contexto de la presente invención son las Macrocystis. Particularmente preferentes son las algas para la producción de biocombustibles tales como Botryococcus braunii, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum, Ankistrodesmus, Botryococcus braunii, Chlorella protothecoides, Cyclotella, Dunaliella tertiolecta, Hantzschia, Nannochloris, Nannochloropsis, Nitzschia, Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus, Stichococcus, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana, Crypthecodinium cohnii, Neochloris oleoabundans y Schiochytrium.

En una realización adicional preferente, el organismo es un hongo, por ejemplo, un hongo tóxico o un hongo utilizado en la producción de un biorreactor. Los ejemplos de hongos que se utilizarán en el contexto de la presente invención proceden del género Saccharomyces o Aspergillus.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan con fines ilustrativos. Por lo tanto, se entiende que los ejemplo y las figuras no han de interpretarse como limitantes. El experto en la materia podrá prever claramente modificaciones adicionales de los principios establecidos en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1

El gen haploinsuficiente endógeno que se tiene como objetivo en la construcción descrita es RpL14 (ubicación citogenética 66D8), que es una proteína ribosómica citoplasmática (PRC). Las mutaciones heterocigóticas en RpL14 dan como resultado un fenotipo clásico Minute fuerte con desarrollo retrasado, cerdas escutelares finas y fertilidad femenina reducida (S ^ b 0e-Larssen y col., 1997 Molecular and General Genetics 255:141-151). La atenuación génica (RpL14.ARNbc) es una repetición invertida de ARNbc, que direcciona ARNi a 67 pb del ARNm de tipo silvestre de RpL14 endógeno (RpL14+). El rescate (RpL14r) es una copia completa del gen RpL14 de tipo silvestre (incluido su promotor y las regiones flanqueantes) en que se han introducido 14 mutaciones sinónimas dentro de la región de 67 pb selectiva para ARNi mediante RpL14.ARNbc (descrito con más detalle a continuación). El número y la posición de los cambios sinónimos aseguraron que todos los fragmentos de ARNip de aproximadamente 21 pb predichos a producir por las proteínas Dicer para el direccionamiento de ARNi incorporaran un mínimo de 3 emparejamientos incorrectos. Se integró un plásmido de transformación genética combinando ambos genes (véase la Fig. 1) en un sitio de llegada attP/$C31 marcado con RFP en el cromosoma tres (ubicación citogenética 86Fb; Bischof, 2007, PNAS, 104:3312-7), lo que da como resultado el genotipo M{3x-P3-RFP, {attR, w+mC, RpL14r, UAS-RpL14.dsRNA}}86Fb denominado {Ud}86 (el sufijo 86 denota la ubicación genómica del inserto). Para dirigir la expresión constitutiva de la atenuación génica de UAS-ARNi, se seleccionó segundo impulsor de cromosoma Actina5c-GAL4, P{w+mC=Act5C-GAL4}25FO1.

Desarrollo de la atenuación génica ARNibc.RpL14 de RdL14+

El gen RpL14 (FBgn0017579 o CG6253) se seleccionó como un gen PRC representativo, del cual se ha descrito previamente que presenta un fenotipo Minute fuerte (S ^b 0e-Larssen y col., 1997, Molecular and General Genetics 255:141-151). Fue el primer gen seleccionado para el desarrollo de este enfoque.

Para identificar una región de aproximadamente 70 pb de RpL14 para ser diana de la atenuación génica de ARNi, se aplicaron los siguientes cuatro criterios para la secuencia del ARNm de tipo silvestre: (1) No se predicen efectos inespecíficos (configuración predeterminada con 'Tamaño inespecífico' establecido en 16 pb, http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl), (2) No hay regiones con un alto número de codones no degenerados ATG o TGG, (3) la diana debe estar presente en todas las variantes de corte y empalme alternativo y (4) la región presenta un alto grado de accesibilidad estructural (de acuerdo con los parámetros predeterminados de S-Fold, http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/sirna.pl). Cuando se aplicaron estos criterios, no fue posible dirigirse a una única región contigua, por lo que se seleccionaron dos regiones no contiguas (llamadas bloques A y B); ambos bloques estaban en el exón 2. La secuencia de RpL14.ARNbc se muestra en la Fig. 3. El bloque A tiene 41 pb (direccionado a 3L:8594414..8594454 de RpL14+) y el bloque B tiene 31 pb de largo (3L:8594485..8594515 de RpL14+). Se insertó un engarce que contenía KpnI entre el bloque A y el B después de verificar que el engarce no provoca ningún efecto inespecífico predicho.

Se ensambló y clonó una repetición invertida de la secuencia de direccionamiento en el plásmido pUASattB (Genbank: EF362409; Bischof, 2007, PNAS 104:3312-7), en el sitio de clonación múltiple, corriente abajo del promotor Ua S. Para garantizar la estabilidad de la estructura de horquilla corta se utilizaron para la transformación bacteriana células E. coli supercompetentes SURE 2 (Agilent Techologies).

La eficacia de RpL14.ARNbc para dirigirse a RpL14+ se demostró de forma experimental utilizando moscas transformadas con {UAS-RpL14.ARNbc} cruzadas con los impulsores GAL4: (w*; P{w+mC=GAL4-ninaE.GMR}12 dando como resultado manchas oculares necróticas, y1 w* P{w+mC=GAL4-Act5C(FRT.CD2).P}D dando como resultado letalidad, y w*; P{w+mC = GAL4-ey.H}3-8 dando como resultado adultos sin cabeza no eclosionados (véase Enerly y col., 2003, Gene 320:41-48).

Desarrollo del rescate RpL14r

La región RpL14 se amplificó utilizando Phusion Taq (Finnzyme) a partir de ADN preparado a partir de la estirpe de referencia de genoma (Estirpe de Bloomington: 2057, y[1]; Gr22b[1] Gr22d[1] cn[1] CG33964[R4.2] bw[1] sp[1]; LysC[1] MstProx[1] GsfD5[1] Rh6[1]). Esto se realizó utilizando los siguientes cebadores Notl -5'-TATGCGGCCGCttgattagtttcctggccactt (Se Q ID NO: 3) y EcoRI-5'-TATGAATTCaaggcataagagctttgaatcg (SEQ ID NO: 4). Esto dio como resultado la amplificación de 3L: 8593592..8596494. Para maximizar la probabilidad de que se hayan incorporado regiones reguladoras de RpL14, también se incluyeron fragmentos de los genes flanqueantes en el producto de PCR (Fig. 1). El fragmento RpL14 endógeno se clonó en el sitio HindIII inmediatamente corriente arriba del promotor UAS en el plásmido pUASattB, que ya contiene la secuencia de UAS-RpL14.ARNbc descrita anteriormente (véase la Fig. 4). La secuencia completa del ADN plasmídico se proporciona en el archivo con formato de genbank adjunto.

Las 14 mutaciones sinónimas que confieren insensibilidad de RpL14r al direccionamiento de ARNi se introdujeron en el exón 2 sintetizando una nueva secuencia (DNA2.0, Inc., https://www.dna20.com/). Esta se ligó después al plásmido en el lugar de la secuencia de tipo silvestre correspondiente, utilizando técnicas de clonación convencionales. Las 14 mutaciones sinónimas se distribuyeron para garantizar que cada 21 pb incluyeran al menos 3 emparejamientos incorrectos sinónimos con el ARNm de RpL14r. En la medida de lo posible, las mutaciones introducidas conservaron el mismo equilibrio entre los codones preferidos y no preferidos de D. melanogaster.

Los transformantes de línea germinal de D. melanogaster se generaron insertando el plásmido {Ud} (véase la Fig. 4) en el sitio de llegada 86Fb (3R:7634329) por BestGene, Inc. (http://www.thebestgene.com/), utilizando el sistema de integración attP/$C31 (Bischof, 2007, PNAS, 104:3312-7).

La insensibilidad de RpL14r al direccionamiento de ARNi se demostró por su capacidad para rescatar la letalidad de UAS-RpL14.ARNbc en presencia de la expresión de GAL4-Act5C. Esta construcción fue utilizada después en todos los experimentos posteriores. La expresión del gen de rescate se confirmó en adultos usando RT-qPCR específica de alelo (véase el Ejemplo 2) tanto en presencia como en ausencia de GAL4 (véase la Fig. 5 y la Fig. 6, respectivamente).

Generación de estirpes transgénicas exogámicas

Se generaron dos estirpes de ojos rojos para experimentos posteriores a fin de estudiar la subdominancia fuerte: w*; {Act5C-GAL4}/ CyO; {Ud}86/{Ud}86 y w*; {Act5C-GAL4}/ CyO : /+. Las líneas de Drosophila que son altamente homocigóticas y que se mantienen en el laboratorio durante varias generaciones pueden haber disminuido drásticamente la aptitud y acumulado rápidamente mutaciones perjudiciales adicionales en todo el genoma (Seager y col., 1982, Genetics 102:485-502; Wallace, 1956, J. Genetics 54:280-293). Para garantizar una prueba robusta de la subdominancia, ambas estirpes se cruzaron inicialmente durante 3 generaciones a una estirpe mixta compuesta de líneas obtenidas en conjunto.

Se cruzaron de forma exogámica transformantes heterocigóticos de {Ud} (y1 w*;M{3x-P3-RFP, {attR, w+mC, RpL14r, UAS-RpL14.dsRNA}}86Fb/+) a una combinación mixta de las siguientes estirpes silvestres derivadas que se hicieron de ojos blancos, w1118, estableciéndolos desde la descendencia F2 de w a partir de un retrocruzamiento parental femenino, las líneas de tipo silvestre son la estirpe de Bloomington 3848, CO3 (Ny , EE. UU.); la estirpe de Bloomington 3885, Wild 5A (GA, EE. Uu .); Aquadro lab, B96 (Beijing, China) y 9 líneas puras establecidas en 2009 (de Plon y Kiel, Alemania). Los individuos transformados w+mC se dejaron a una frecuencia de <0,3 (para maximizar la recombinación con cromosomas de tipo silvestre) durante >3 generaciones para recombinarse en masa. Después de las 4' generación se seleccionaron los individuos y*, RFP, w+mC para los cruces descritos en el siguiente esquema:

Los cruces se realizaron recíprocamente con la mayor cantidad de individuos posible (>10) para maximizar la variación natural en las estirpes finales. Los cruces 1 y 2 se hacen en paralelo y la descendencia se utiliza para iniciar el cruce 3.

Cruce 1

w[*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/CyO; TM3, Sb[1] (Bloomington 2475)

X

w[*]; ; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/+ (heterocigotas para {Ud}86 cruzados de forma exogámica) Seleccionar progenie ap+, w+, RFP, Cy-, Sb‘ que produce w[*]; /CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/TM3, Sb[1]

Cruce 2

y[1] w[*]; P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1/CyO, y[+] (Bloomington 4414)

X

w[*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/CyO; TM3, Sb[1] (Bloomington 2475)

Seleccionar progenie y+, ap+, w+, r Fp , Cy-, Sb- que produce w[*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1; /TM3, Sb[1]

Cruce 3

w[*]; /CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/TM3, Sb[1] (progenie cruce 1)

X

w[*]; T(2;3)ap[Xa], ap[Xa]/P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1; /TM3, Sb[1] (progenie cruce 2)

Seleccionar progenie Cy-, Rf P que produce w[*]; P{w[+mC] =Act5C-GAL4}25FO1/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/TM3, Sb[1]

y

w[*]; P{w[+mC] =Act5C-GAL4}25FO1/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86/+

Este último cruce produce dos tipos de heterocigotos para el tercer cromosoma. {Ud} 86 con el equilibrador TM3 y {Ud}86 con un cromosoma de tipo silvestre. En las siguientes generaciones Sb‘ se selecciona en contra de eliminar el equilibrador. Los homocigotos de tipo silvestres /+ para el tercer cromosoma y los homocigotos {Ud}/{Ud} se seleccionan (seleccionando a favor y en contra de RFP) para iniciar los siguientes experimentos.

Los genotipos resultantes completos son

w[*]; P{w[+mC] =Act5C-GAL4}25FO1/CyO; M{3x-P3-RFP, w[+mC], {Ud}}86

y

w[*]; P{w[+mC] =Act5C-GAL4}25F01 /CyO;

Como los genotipos difieren solo en los terceros cromosomas, en otras partes del texto se indica solamente el genotipo de los terceros cromosomas. Cabe destacar que el promotor impulsor, act5c, podría utilizarse para dirigir directamente el ARNi y generar subdominancia en un único casete (act5c-RpL14.ARNbc, RpL14r), pero en este caso los inventores utilizaron el sistema binario GAL4/UAS para tener la flexibilidad de analizar los efectos de distintos patrones de expresión.

Cría de moscas

En este y en los siguientes ejemplos, todas las moscas se mantuvieron en medios convencionales (http://flystocks.bio.indiana. edu/FlyWork/ media-recipes/bloomfood.htm) en una incubadora a 24 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 horas. Se utilizaron viales de 50 ml o frascos de 300 ml, como se especifica a continuación, que contenían alimento. Cuando se añadieron moscas a un nuevo recipiente, se añadió levadura a la superficie del alimento para estimular la puesta de huevos. Cuando se retiraba a los adultos de una botella, se añadían dos kimwipes™ para reducir las tasas de mortalidad de adultos emergentes (por quedarse atascado en alimento licuado).

Genotipado epi-fluorescente de moscas

En este y en los siguientes ejemplos, el genotipado de las moscas se realizó mediante un estudio de la fluorescencia de RFP del gen 3x-P3-RFP en el lugar de llegada de {Ud}86. La puntuación de fluorescencia se realizó en un microscopio epi-fluorescente Leica MZ10 F con una fuente de luz Leica EL 6000 en una habitación oscura. Las moscas anestesiaron ligeramente utilizando CO2. Todas las moscas tenían ojos rojos, w+. La puntuación de RFP en el ojo no era fiable debido a la extinción; sin embargo, el uso de las moscas ocelos /+ podía distinguirse de manera fiable de las moscas /{Ud}86 o {Ud}86/{Ud}86. Para la puntuación de RFP se utilizó un conjunto de filtros Leica-dsRED (excitación 545/30 nm, emisión 620/60 nm). Para los experimentos que precisan la identificación de los tres genotipos, la expresión de 3x-P3-GFP podría puntuarse de forma codominante junto con RFP mediante el uso adicional de un conjunto de filtros Leica-GFP2 (excitación 480/40 nm, emisión 510 nm).

Ejemplo 2

Determinación de los niveles de expresión génica con RT-PCR cuantitativa

Las cantidades totales de ARNm de RpL14 y las relaciones de transcrito endógeno de RpL14+ con respecto a la construcción de rescate de RpL14r se evaluaron con transcripción inversa PCR cuantitativa (RT-qPCR) de dos etapas. El ARN se aisló de 10 moscas adultas para cada sexo o 10 larvas de la fase L3 no sexadas utilizando Trizol (Invitrogen), y se trató con ADNasa utilizando un PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen). La calidad del ARN se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop y se utilizaron 100 ng de ARN para la síntesis de ADNc, utilizando el kit Maxima First Strand cDNA synthesis para RT-qPCR (Fermentas). Se utilizó 1 pl de la reacción resultante como molde para la qPCR, utilizando la TaqMan Fast Master Mix (Applied Biosystems) para las relaciones relativas o SYBR Green Fast Master Mix (Applied Biosystems) para los niveles totales de ARNm de RpL14. Cada muestra se procesó por triplicado en una máquina ABI 7900HT (Applied Biosystems).

Tanto los productos de PCR de tipo silvestre como de rescate se amplificaron con la misma pareja de cebadores ubicados sobre un límite intrón-exón; 5'-TCTTTCCGGTTAGCGTCAT (SEQ ID NO: 5); 5'-CGCCAGTCAGAGGACCAT (SEQ ID NO: 6).

La expresión de los transcritos de tipo silvestre y de rescate se detectó con sondas MGB TaqMan (Applied Biosystems) marcadas con FAM (tipo silvestre) y VIC (rescate). Ambas sondas tenían la misma composición de bases, pero difería en dos bases, lo que permitió la detección específica de transcritos de tipo silvestre y de rescate, y facilitando el cálculo de las relaciones de expresión; sonda-tipo silvestre FAM-TTGCCAAGGCCTCCGC-MGB (SEQ ID NO: 7); sondarescate VIC-TCGCCAAAGCCTCCGC-MGB (SEQ ID NO: 8).

Para la normalización de la señal de qPCR, los inventores utilizaron el procedimiento GeNorm (véase Vandesompele y col., 2002 Genome Biology 3: 1-12) y utilizaron 8 genes (seleccionados por Chintapalli y col., 2007, Nature Genetics 39:715-20) como un conjunto para la normalización de las reacciones de qPCR. Se analizó la estabilidad de expresión de estos genes en las condiciones experimentales descritas (en larvas y adultos para todos los genotipos) a través de diluciones seriadas de log de base 10 del molde de ADNc. Tres de estos genes, FBgn0032882, FBgn0039259 y FBgn0002021, se identificaron como los menos variables en las moscas y se utilizaron para el cálculo del factor de normalización. Los niveles de ARNm de RpL14 se expresan con respecto a la media geométrica normalizada de los tres genes de normalización.

Se pudo observar una reducción inducida por ARNi específica de locus en el ARNm de tipo silvestre de RpL14+ en ambos genotipos transgénicos (véase la Fig. 5). En los machos y hembras adultos, los heterocigotos tuvieron la menor cantidad total de RpL14. Sin embargo, hubo diferencias notables en la extensión de la reducción de RpL14+ entre machos y hembras, teniendo los machos {Ud}86/{Ud}86 mucho menos ARNm de RpL14 total en comparación con las hembras (véase Fig. 5). Las larvas L3 no se sexaron y no se sabe si también hay grandes diferencias en los niveles de expresión entre las larvas masculinas y femeninas, por lo tanto, las larvas no se pueden utilizar de manera fiable en este momento para estimar los niveles relativos de expresión de genotipos; sin embargo, las larvas sí verifican que la atenuación génica por ARNi y la expresión de rescate son funcionales en la fase L3.

Ejemplo 3

Efectos de {Ud}86 sobre los rasgos del ciclo de vida

Dada la fuerte reducción de la aptitud en los heterocigotos y el impacto pleiotrópico de los hipomorfos de PCR (véase S. J. Marygold y col., 2007 Genome Biology 8:R216; S ^ b 0e-Larssen, S. y col., 1997 Molecular and General Genetics 255:141-151), se examinaron el ciclo de vida y los rasgos morfológicos que podrían correlacionarse con este genotipo. No se observaron anomalías morfológicas evidentes en ninguno de los genotipos {Ud}86. De forma interesante, los heterocigotos no presentan las cerdas escutelares cortas y finas que son un rasgo característico del fenotipo Minute de RpL14 y la mayoría de las mutaciones de PRC de D. melanogaster. Sin embargo, en común con los fenotipos Minute, los heterocigotos presentaron un tiempo de desarrollo prolongado, de aproximadamente 20 horas (véase la Fig. 7A, P <1x10-30), mientras que los homocigotos {Ud}86/{Ud}86 no presentaron diferencias significativas con respecto a los homocigotos de tipo silvestre (experimentos descritos a continuación). Adicionalmente, no se observó diferencia en el peso seco entre los adultos de los tres genotipos (machos, F=0,55, p=0,591; hembras, F=1,34, p=0,298). La viabilidad relativa de huevo a adulto del genotipo heterocigótico fue el 20% - 50 % menor que la de los homocigotos (véase Fig. 7B); sin embargo, esto por sí solo es insuficiente para explicar completamente la reducción del 70-80 % de la aptitud durante todo el ciclo de vida con respecto a los homocigotos (véase la Fig. 8C; el Ejemplo 4) y sugiere que factores adicionales en el ciclo de vida se ven afectados de forma negativa en los hemicogóticos {Ud}86/+.

Para cuantificar con mayor precisión el tiempo de desarrollo y el paso de huevo a adulto (debido a las diferencias en la viabilidad) a partir de las proporciones mendelianas esperadas entre los tres genotipos, se creó una línea con expresión de g Fp a partir del sitio citológico del inserto 86Fb como una aproximación al tipo silvestre (véase Fig. 2). Esta estirpe de GFP tenía el genotipo w[*];CyO/P{w[+mC]=Act5C-GAL4}25FO1; M{{3x-P3-GFP}}86Fb y se generó a partir de una modificación de un plásmido (pGFP-lox-attB_12.gb.1) proporcionado por el Dr. Johannes Bischof (Universidad de Zurich). Las estirpes de {Ud}86 RFP y GFP se cruzaron entre sí en masa durante >6 generaciones, antes del experimento, para ayudar a homogeneizar los acervos genéticos y proporcionar alguna variación genética natural en cada acervo cromosómico.

Se utilizaron viales en este experimento y se establecieron cruces de acuerdo con los tipos parentales indicados en la Fig. 7B. Las moscas parentales se transfirieron a nuevos viales cada día, durante un total de 10 días, y se puntuaron las descendencias recién eclosionadas resultantes, en cuanto al sexo y la presencia/ausencia de RFP/GFP, cada día durante los siguientes 25 días. Los datos se proporcionan a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2: Datos del tiempo de desarrollo y experimentos de viabilidad del genotipo. A continuación se proporcionan los recuentos de la descendencia de los diversos tipos de cruces presentados en la Fig. 7B. Las nueve descendencias con genotipos observados que no estaban permitidos por la configuración del cruce están subrayadas y en negrita. Estas se utilizaron para estimar la tasa de error de genotipado y se excluyeron de todos los demás cálculos. El parental femenino se enumera en primer lugar. La descendencia masculina se indica con "m" y la descendencia femenina con "f".

{Ud}86/+ x {Ud}86/+

Día 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 /+ m 0 50 103 68 29 24 10 9 0 3 1 1 0 {Ud}86/+ m 0 8 122 107 84 52 46 24 6 5 2 0 0 {Ud}86/ {Ud}86 m 0 39 94 63 22 26 14 12 3 0 0 2 0 /+ f 2 82 81 52 36 25 14 9 4 4 1 0 0 {Ud}86/+ f 0 28 144 124 84 78 47 16 8 1 3 1 0 {Ud}86/ {Ud}86 f 0 85 103 68 37 21 16 4 2 3 0 0 0 /+ x {Ud}86/+

Día 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 /+ m 0 3 60 105 38 17 4 2 1 3 0 0 0 {Ud}86/+ m 0 0 23 49 62 27 12 3 2 2 1 0 0 {Ud}86/ {Ud}86 m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 /+ f 0 11 115 98 38 6 2 3 2 1 0 0 0 {Ud}86/+ f 0 1 22 106 60 26 16 5 1 2 0 1 0 {Ud}86/ {Ud}86 f 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 {Ud}86/{Ud}86 x {Ud}86/+

Día 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 /+ m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 {Ud}86/+ m 0 0 18 43 43 29 12 2 0 0 0 0 0 {Ud}86/ {Ud}86 m 0 10 65 72 25 11 6 0 0 0 0 0 0 /+ f 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 {Ud}86/+ f 0 0 12 75 55 34 9 1 1 0 0 1 0 {Ud}86/ {Ud}86 f 0 11 96 91 26 7 7 0 1 0 0 0 0 {Ud}86/+ x /+

Día 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 /+ m 0 0 21 49 13 1 1 0 0 1 0 0 0 {Ud}86/+ m 0 0 2 22 33 14 2 1 0 0 0 1 0 {Ud}86/ {Ud}86 m 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 +/+ f 0 0 52 52 9 0 2 0 0 0 1 0 0 {Ud}86/+ f 0 0 4 42 26 11 3 1 0 0 0 0 0 {Ud}86/ {Ud}86 f 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 {Ud}86/+ X {Ud}86/{Ud}86

Día 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 /+ m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 {Ud}86/+ m 0 0 11 24 11 5 3 1 1 0 0 0 0 {Ud}86/ {Ud}86 m 0 3 43 31 6 8 4 2 1 0 0 0 0 /+ f 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 {Ud}86/+ f 0 0 16 17 16 5 7 1 0 0 0 0 0 {Ud}86/ {Ud}86 f 0 11 64 26 19 9 3 2 1 0 0 0 0

Los retrocruces parentales heterocigóticos a homocigóticos permitieron estimar la tasa de puntuación errónea de genotipos. Los viales para cada cruce recibieron un identificador alfanumérico y las descendencias se puntuaron cada día "a ciegas" sin conocimiento del cruce parental. Se detectaron un total de 9 descendencias con genotipos no permitidos por el cruce (por ejemplo, descendencia homocigótica RFP/RFP de padres GFP/RFP x GFP/GFP) de 2.636 descendencias de cruces donde se pudieron detectar este tipo de errores. Suponiendo que la mitad de las puntuaciones erróneas de genotipo son detectables (el resto cae en una categoría de genotipo permitida para un cruce en particular), la tasa de error de genotipado prevista es del 0,68 %. En el peor de los casos, en que todos los errores de genotipado pierden heterocigotos puntuados como genotipos homocigóticos, este factor no es lo suficientemente grande como para explicar la reducción de heterocigotos en los datos observados sin diferencias de aptitud entre los genotipos (Fig. 7B).

Peso seco

Cinco conjuntos de 10 moscas adultas de un día de edad de cada sexo y genotipo se congelaron durante una noche y luego se secaron en un calentador durante seis horas a 30 °C. Las moscas se pesaron en grupos de 10 a la vez para obtener mediciones más precisas. Estos datos se proporcionan a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3: Datos de peso seco. Pesos secos en gramos para grupos de 10 moscas pesadas a la vez para cada sexo, duplicado y genotipo.

Genotipo femenino {Ud}86/{Ud}86 {Ud}86/+ /+ Duplicado 1 0,0031 0,0032 0,0031 Duplicado 2 0,0030 0,0031 0,0032 Duplicado 3 0,0037 0,0030 0,0032 Duplicado 4 0,0033 0,0038 0,0031 Duplicado 5 0,0033 0,0034 0,0026 Media 0,00328 0,0033 0,00304

Genotipo masculino {Ud}86/{Ud}86 {Ud}86/+ /+ Duplicado 1 0,0020 0,0022 0,0022 Duplicado 2 0,0022 0,0023 0,0023 Duplicado 3 0,0024 0,0022 0,0025 Duplicado 4 0,0026 0,0028 0,0022 Duplicado 5 0,0024 0,0026 0,0022 Media 0,00232 0,00242 0,00228

Ejemplo 4

Experimentos de población

Para probar la fijación dependiente de la frecuencia de los alelos que es diagnóstica de subdominancia, se iniciaron frascos por duplicado en un intervalo de frecuencias. Se puntuaron los genotipos en cada generación utilizando la fluorescencia dominante del marcador 3x-P3-RFP, que es parte del sitio de llegada utilizado en {Ud}86.

El experimento para medir el cambio de frecuencia alélicas a lo largo de múltiples generaciones se inició con 20 hembras apareadas de las estirpes homocigóticas exogámicas anteriores, a las frecuencias iniciales de {Ud}86/{Ud}86 ya sea del 20 %, 50 % u 80 %. A estas hembras ya apareadas se les permitió poner huevos en viales durante tres días y luego se retiraron. Estas moscas parentales hembras homocigóticas se denominaron G0. El fin de esta generación era minimizar la posibilidad de que las diferencias en la condición o madurez entre las estirpes no sesgaran fuertemente las frecuencias iniciales. La siguiente generación, G1, es genotípicamente idéntica a los padres en la generación G0, pero las condiciones del desarrollo larvario están mejor controladas. Se recogieron hasta 100 adultos G1 de un vial, se puntuó en cuanto al sexo y RFP, utilizando microscopía de epi-fluorescencia, y después se dejó que pusieran huevos en una botella nueva durante 3 días antes de retirarlos. Después de 12 días adicionales de desarrollo larvario, se recogieron hasta (aproximadamente) 100 descendencias G2 puntuadas por sexo y RFP, y se introdujeron en un frasco durante tres días. Esta secuencia se repitió para todas las generaciones posteriores. La generación G2 es la primera en la que están presentes los heterocigotos y, en consecuencia, es la primera generación en la que se puede detectar un efecto subdominante. Es por lo que la generación 2 es la primera generación mostrada en la Fig. 8A.

Se eligió un tiempo de puesta de huevos de 3 días y un espaciado de generaciones de 15 días, desde el momento de la adición inicial de moscas a cada frasco, para maximizar los tamaños de las poblaciones y minimizar los posibles efectos del retraso del desarrollo, es decir, el equilibrio entre los genotipos de eclosión temprana que mueren en el alimento y, por lo tanto, subpuntuados y los genotipos de eclosión tardía que se subpuntuan. Utilizando la curva del tiempo de desarrollo, Figura 7A, en el peor de los casos (100 % de supervivencia del genotipo homocigótico), esto solo daría como resultado una pérdida relativa del 7 % de los genotipos heterocigóticos esperados, lo cual no es suficiente para explicar la reducción en la aptitud del 78 % estimada para los heterocigotos.

La estrategia de puntuación un marcador RFP para inferir la frecuencia de {Ud}86 hace suposiciones mínimas con respecto a la aptitud (asume proporciones de Hardy-Weinberg en ausencia de selección). La frecuencia de {Ud}86 se estimó como p = 1V (R -ln)., en que R- es la fracción de adultos que no expresan RFP y n es el número total puntuado (representado en la Fig. 8A). Los datos se proporcionan a continuación en la Tabla 4:

Tabla 4: Datos de los experimentos multigeneracionales de población. La tabla proporciona los recuentos de machos (m) y hembras (f), positivos para RFP (RFP+) y negativos para RFP (RFP-), cada generación. Para la representación y la inferencia de la aptitud se utilizaron solamente las generaciones 2-7, en que los heterocigotos podrían estar presentes durante todo el ciclo de vida. En la generación 2, la línea G se estableció a partir de las hembras de la línea A después de retirarlas de A, la línea H se estableció a partir de B, I a partir de C, J a partir de D, K a partir de E y L a partir de F de la misma manera. La frecuencia de inserto {Ud}86 también se proporciona junto con el número total de adultos puntuados. La puntuación se interrumpió en los duplicados que habían alcanzado una pérdida o fijación aparente durante dos generaciones consecutivas.

Duplicado A

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado

0 0 8 0 8 0,5 16

1 17 13 6 10 0,652174 46

2 44 29 18 5 0,510527 96

3 33 34 20 13 0,425544 100

4 16 32 28 25 0,275602 101

5 15 15 37 33 0,16334 100

6 3 6 50 43 0,045136 102

7 2 0 50 48 0,010051 100

Duplicado B

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado

0 0 12 0 3 0,8 15

1 21 37 6 5 0,84058 69

2 41 45 9 5 0,625834 100

3 45 49 3 3 0,755051 100

4 58 48 1 0 0,903326 107

5 38 64 0 0 1 102

6 49 53 0 1 0,901467 103

7 47 54 0 0 1 101

Duplicado C

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado

0 0 3 0 12 0,2 15

1 8 4 16 22 0,24 50

2 18 19 31 32 0,206275 100

3 8 3 39 51 0,056025 101

4 4 1 53 42 0,025321 100

5 3 0 44 53 0,015114 100

6 0 0 60 44 0 104

7 0 0 55 43 0 98

Duplicado D

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado

0 0 8 0 8 0,5 16

1 6 10 17 12 0,355556 45

2 30 33 18 19 0,391724 100

3 20 18 26 36 0,212599 100

4 19 15 29 37 0,187596 100

(continuación)

Duplicado A

5 1 4 48 50 0,024574 103

6 1 0 49 48 0,005115 98

7 0 0 47 55 0 102

Duplicado E

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado

0 0 12 0 3 0,8 15

1 6 11 2 0 0,894737 19

2 47 49 2 2 0,8 100

3 48 49 1 2 0,826795 100

4 48 52 0 0 1 100

5 45 44 0 0 1 89

6

7

Duplicado F

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado

0 0 3 0 12 0,2 15

1 6 3 14 16 0,230769 39

2 14 12 42 33 0,138273 101

3 3 1 46 50 0,020204 100

4 0 0 42 58 0 100

5 0 0 48 52 0 100

6

7

Duplicado G

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado 0

i

(continuación)

Duplicado A

2 44 29 18 5 0,510527 96

3 32 44 9 10 0,552786 95

4 38 34 16 16 0,4453 104

5 43 36 16 9 0,50971 104

6 17 50 4 29 0,425544 100

7 16 17 32 33 0,185589 98

Duplicado H

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado 0

1

2 41 45 9 5 0,625834 100

3 39 59 2 0 0,858579 100

4 50 53 0 0 1 103

5 58 40 0 0 1 98

6

7

Duplicado I

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado 0

1

2 18 19 31 32 0,206275 100

3 4 4 57 35 0,040834 100

4 2 0 41 60 0,009756 103

5 3 0 44 54 0,014963 101

6 0 0 45 52 0 97

7 0 0 48 53 0 101

Duplicado J

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado 0

1

2 30 33 18 19 0,391724 100

3 14 30 27 30 0,248763 101

4 14 24 26 36 0,212599 100

5 15 13 40 35 0,14668 103

6 13 7 46 36 0,103383 102

7 4 5 49 50 0,042573 108

Duplicado K

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado 0

1

2 47 49 2 2 0,8 100

3 37 61 1 0 0,899496 99 (continuación)

Duplicado A

4 48 58 1 0 0,903326 107

5 38 62 0 0 1 100

6 50 50 0 0 1 100

7

Duplicado L

Frecuencia de número Generación m RFP+ RFP+ f RFP- m RFP- f {Ud86} puntuado 0

1

2 14 12 42 33 0,138273 101

3 10 0 54 36 0,051317 100

4 0 1 46 53 0,005013 100

5 0 0 38 62 0 100

6 0 0 44 56 0 100

7

Se usó un marco de máxima verosimilitud (minimizando un estadístico G; véase Clark y col., 1981, Heredity 46:321-46) para analizar los recuentos de machos y hembras RFP y no RFP entre generaciones en una cuadrícula de valores de aptitud de homocigotos y heterocigóticos transgénicos. Los cambios en la frecuencia entre generaciones y entre duplicados se consideraron independientes, lo que permitió multiplicar las probabilidades relativas para generar una superficie de verosimilitud compuesta. Los intervalos de confianza se calcularon utilizando una aproximación de la x2 convencional para superficies de verosimilitud (representado en la Fig. 8B), es decir, suponiendo que los errores tienen una distribución normal.

Confirmación de la homocigosis de las estirpes

La homocigosis de los duplicados que habían fijado o perdido la construcción {Ud}86 en el experimento de poblaciones se confirmó cruzando grandes cantidades (n =>30) de machos evaluadores con hembras vírgenes (de una estirpe virginizadora w[1118]I, Dp(2;Y)G, P{w[+mC]=hs-hid}Y) y determinando si toda la descendencia era fluorescente o no fluorescente por RFP. Además se utilizaron los siguientes cebadores en extracciones de ADN de una sola mosca, 5' gggccaaagtgtaaataactgg-3' (SEQ ID NO: 9) y 5' aaaatgtccattactttggtgct-3' (SEQ ID NO: 10) para proporcionar un producto de PCR de 136 bp (3R:7634237..7634372), identificando la presencia de terceros cromosomas de tipo silvestre (+) y un producto teórico de >10 kb para {Ud}86. La presencia de {Ud}86 podría confirmarse utilizando 5' actttccttccgatggacct-3' (SEQ ID NO: 11) y 5' aatgaccaccgtctttcagc-3' (SEQ ID NO: 12), dando como resultado un producto de PCR de 135 pb del gen RFP. No se realizó el genotipado por PCR multiplexando ambos conjuntos de cebadores, ya que se descubrió que esto no era fiable.

En resumen, la Figura 8A muestra un aumento constante y rápido en la frecuencia de {Ud}86 cuando está por encima de una frecuencia umbral (estimada en 0,61) y una disminución correspondiente cuando está por debajo de ella. La eliminación de o {Ud}86, basada en gran medida en su frecuencia inicial, demuestra la reversibilidad inherente de la transformación de la población subdominante y también subyace en la naturaleza espacialmente autolimitada de la transformación de la población subdominante. Usando un enfoque de máxima verosimilitud, la aptitud relativa de los tres genotipos se estimó como /+ = 1, /{Ud}86 =0,22, {Ud}86/{Ud}86=0,71 (Fig. 8B y 8C). La reducción en la aptitud entre los genotipos es consistente con los cambios en la abundancia total de ARNm de RpL14 (Fig. 9). Estos valores de aptitud representan un sistema fuertemente subdominante en que si el alelo {Ud}86 está por encima del 61 % en una población, se predice que procederá a la fijación de manera determinista (en ausencia de estocasticidad). Considerando a 3x-P3-RFP como un gen efector, hemos demostrado que la construcción {Ud}86 es capaz de transformar de forma estable una población para portar el marcador para la producción de proteína fluorescente roja.

Debido a la reducción de >3 veces de la aptitud de los heterocigotos /{Ud}86 con respecto a los homocigotos {Ud}86/{Ud}86 (véase la Fig. 8C), se espera que {Ud} sea adecuado para la fijación de genes efectores ligados, incluso fuertemente perjudiciales, y permanecer subdominante (véase Scott y col., 2002, Science 298:117-9).

Ejemplo 5

Estabilidad geográfica y dinámica de la transformación de la población subdominante

Se han evaluado estrategias de liberación óptimas en Altrock y col., 2011 PLoS Computational Biology, 7:e1002260 y Altrock y col., 2010 Journal of Theoretical Biology, 267:62-75, para un patrón geográfico simple pero significativo. A continuación se proporciona un análisis cuantitativo de las propiedades de estabilidad geográfica de la transformación de la población subdominante con construcciones {Ud}. Los procedimientos matemáticos indicados sirven como una justificación cuantitativa para las propiedades de estabilidad geográfica discutidas en el presente documento.

Se supone que la transformación de una población diana ya se ha logrado y es de interés el potencial de los sistemas de mayor propagación de {Ud} en comparación con la posibilidad de pérdida completa de {Ud}. El modelo evolutivo matemático se basa en parámetros de aptitud genotípica, en las tasas de migración entre poblaciones vecinas y el tamaño de la población, lo que determina la escala de tiempo intrínseca del proceso de extinción.

En un modelo de dos alelos de un único locus, los valores de aptitud genotípica que determinan la dinámica de la población del sistema descrito son

W+/+, W+l{Ud¡86 y W{Ud¡86{Ud¡86.

Para los resultados analíticos y de simulación se utilizaron las estimaciones de aptitud por EMV de los genotipos transgénicos, (véase la Fig. 8(C)):

w+/+ = 1, w+/{ud¡86 = 0,22 y W{ud¡86{ud¡86 = 0,71.

Con apareamiento aleatorio (unión aleatoria de gametos) se supone que los individuos diploides pasan por las expectativas de Hardy-Weinberg antes de la selección y, por lo tanto, describen el sistema de la población en términos de alelos individuales (véase Altrock y col., 2010 Journal of Theoretical Biology, 267:62-75; Hartl y Clark, Principles of Population Genetics A. D. Sinauer, Ed. (Sinauer Associates, 1997), pág. 542). El umbral de frecuencia para transformar una población diana, ignorando la migración, es

--------- w+/+ - w+l{ud>---------, (ec. 1)

W+/+ W{udi/{udi - 2W+/{ud}

que determina un equilibrio inestable de la dinámica evolutiva.

Dado que se ha transformado la población diana, se pueden estimar otras dos frecuencias alélicas umbral, en cuanto a la migración de gametos antes del apareamiento. En primer lugar, se puede calcular una aproximación del umbral para transformar la población vecina, bajo el supuesto de que la población diana no se ve afectada. En segundo lugar, el umbral para una transformación de la población diana de nuevo a tipo silvestre, debido a los migrantes de las poblaciones silvestres vecinas, puede ser aproximado.

Para la dinámica de selección de migración, los valores de aptitud alélica esperados se ven afectados por la tasa de migración por generación (o cualquier otra unidad de tiempo), pero los valores de aptitud genotípica permanecen constantes. La tasa de inmigrantes en una población dada antes del apareamiento viene dada por m. Los valores de aptitud alélica esperados dependen de las frecuencias alélicas y, por lo tanto, de la tasa de migración. Bajo el supuesto de Hardy-Weinberg, todos los valores de aptitud pueden expresarse en términos de la frecuencia de {Ud}: pT en la población diana y pN en una población vecina. Para un alelo de tipo silvestre

f+ = (1 - pT) w+/+ pfw+nudi m(pT - pw)(w+/+ - w+/{ud}) (ec. 2)

Asimismo, para el alelo de la construcción subdominante {Ud}

f{ud} = (1 - pf)w+/{ud} Pfw{ud}/{ud} - m (p f - pN)(w{ud}/{ud} - w+/{ud}) (ec. 3)

En los segundos términos de las ecuaciones (2) y (3) se puede apreciar una importante asimetría en el efecto de la migración sobre los valores promedio de aptitud de los dos alelos, lo que finalmente conduce a la asimetría descrita en la Figura 10. El promedio de aptitud poblacional en la población diana es

Ft = (1 - p f) f+ p f f{ud} - m (p f - pN)(f{udi - f+)(ec. 4).

Con las funciones de aptitud (2), (3) y (4), se puede describir el cambio temporal de las frecuencias del alelo {Ud} en la población diana, ApT, y en la población vecina, ApN, por etapa de tiempo At (normalmente una generación) (véase Altrock y col., 2011 PLoS Computational Biology, 7:e1002260; Altrock y col., 2010, Journal of Theoretical Biology, 267:62-75; Hartl y Clark, Principles of Population Genetics A. D. Sinauer, Ed. (Sinauer Associates, 1997), pág. 542),

ApfpT,pN) = A íp f (f{ud¡ - Ff) - m A i(p f - pN) f{ud¡ (ec. 5)

La ecuación para ApN sigue intercambiando pN y pt,

ApN (pt,pn) = A p fp N p ) (ec. 6).

Las dos ecuaciones para la dinámica evolutiva de la frecuencia de {Ud} en las poblaciones diana y vecina (ecuaciones 5 y 6) se utilizan para proporcionar estimaciones cuantitativas de las propiedades biestables y la estabilidad geográfica en poblaciones infinitamente grandes, Figs. 8 y 10. El cálculo de los umbrales utilizados en la Fig. 10 se deduce entonces de encontrar las raíces de

A p rp r, 0) = 0 y Apn(Pn, 1) = 0.

Para la retrotransformación de la población diana debida a la inmigración desde las poblaciones vecinas, pT tiene que estar por debajo de p«, es decir, aumentar el tipo silvestre de una frecuencia de 0 a 1-pT. En poblaciones silvestres, Pn es el umbral para transformar una sola población vecina debido a la emigración desde la diana transformada. A lo que sigue, la aptitud constante de los homocigotos de tipo silvestre se estableció en uno, todos los demás valores de aptitud se proporcionan en términos relativos, W+/+ = 1.

Con esto, se puede encontrar que los umbrales tienen la siguiente forma

^{_________ a t +} JT r ^________

^{P t =} (ec.7) ,

2(1 - m)(1 w{M}/{M} - w+/{M})

con

A r = 2 W{ud}i{ud} - 3w+i{udi - m(w{ud}/{ud} - w+/{ud}) (ec. 9)

A n = 1 - w+{ud} - m(1 - 2W{ud}i{ud} - 3w+i{ud}) (ec. 10)

y

B r = (1 - m)2 (w{ud¡i{ud¡ - w+i{ud¡)2 -4m(w{umud¡ -(w+i{ud¡)2) (ec. 11),

Bn = (1 - m)2 (1 - w+i{ud¡)2 - 4m(w{ud¡i{ud¡ -(w+i{ud¡)2) (ec. 12).

Solo puede haber resultados significativos siempre que Bt, y Bn no sean negativos, lo que es válido para la migración por debajo de los umbrales críticos. A medida que la migración llega a cero, ambos umbrales convergen en el umbral conocido en poblaciones aisladas, ecuación (1). Además se hace obvio que p n < p t para la migración por debajo de límites críticos. Esta asimetría es responsable de la propiedad autolimitante: la pérdida es más probable que la propagación (véase Altrock y col., 2011, PLoS Computational Biology, 7:e1002260).

Las ecuaciones (2), (3) y (4) también pueden utilizarse para modelar matemáticamente dinámicas estocásticas en poblaciones finitas, ya sea utilizando un enfoque de Moran o de Wright-Fisher (véase Altrock y col., 2011, PLoS Computational Biology, 7:e1002260 y Altrock y col., 2010, Journal of Theoretical Biology, 267:62-75). Dichas simulaciones también revelan que solo los tamaños de población de una magnitud inferior a 102 tienen una posibilidad realista de que se produzca una propagación no deseada a las poblaciones vecinas.

Ejemplo 6

En la actualidad, solo hay dos sistemas de transformación de poblaciones que han funcionado en experimentos de laboratorio: un sistema de rescate de toxina materna denominado Medea y un sistema de base de endonucleasa de referencia al lugar de origen llamado HEG. Como un locus único, ni Medea ni HEG lograron una fijación completa en poblaciones experimentales, permaneciendo la frecuencia de equilibrio de los alelos de tipo silvestre en aproximadamente 0,1 para Medea (véase la Fig. 1F en Chen y col., 2007, Science, 316:597-600) y >0,1 para HEG (Fig. complementaria 5 en Windbichler y col., 2011, Nature, 473, 212-215), mientras que para {Ud}86 se logra una fijación completa (Fig. 8A). Una posible preocupación es que los alelos de tipo silvestre persistentes podrían facilitar la selección por la resistencia por parte del insecto a las propiedades conductoras del HEG o de Medea o por parte del patógeno al gen de resistencia a enfermedades ligado (véase Scott y col., 2002, Science 298:117-9). El enfoque subdominante demostrado en este caso evita esta complicación al eliminar rápidamente todos los alelos de tipo silvestre en una población (véase, por ejemplo, la Fig. 8A).

El inicio de la transformación de la población subdominante es un enfoque más intensivo en recursos que para HEG o Medea, donde pueden liberarse cantidades muy pequeñas de individuos y la modificación genética invade desde bajas frecuencias; para {Ud}86, esto precisaría números mucho más grandes para superar una frecuencia alélicas de 0,61 en una población silvestre (véase la Fig. 8A). Sin embargo, los tamaños de liberación previstos son mucho más pequeños que los utilizados satisfactoriamente en las técnicas de insectos estériles (que pueden ser >10 veces el tamaño de la población silvestre). Adicionalmente, en situaciones en las que se valora el control espacial, o la capacidad de recuperación, la Fig. 10 ilustra el grado de estabilidad geográfica que {Ud}86 podría presentar incluso con niveles sustanciales de migración. Los candidatos obvios para la transformación con {Ud} incluyen los mosquitos Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti y Anopheles stephensi, en que se han desarrollado genes insensibles para la fiebre del dengue, la malaria humana y la malaria aviar (véase Isaacs y col., 2011., PLoS Pathogens 7:e1002017; Jasinskiene y col., 2007, The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 76:1072-8; y Franz y col., 2006, PNAS, 103:4198-203).

Ejemplo 7

{Ud} en plantas

Además de la transformación de la población de insectos, las construcciones de {Ud} tienen otras aplicaciones de alto valor, por ejemplo, al limitar el cruzamiento no deseado de cultivares de plantas genéticamente modificados mientras se preservan los rendimientos de los cultivos y la capacidad de los agricultores de guardar semillas de un año a otro (véase Hills y col., 2007, Trends in Plant Science, 12:177-83).

El hecho de que el peso seco y la morfología de las moscas {Ud}86/{Ud}86 eran indistinguibles del tipo silvestre sugiere que sería posible desarrollar plásmidos de transformación de {Ud} de línea germinal para plantas que no afectarían negativamente los rendimientos de los cultivos. Si la transformación de la línea germinal del cultivo utilizó rutinariamente plásmidos subdominantes, el cruzamiento puede volver a las plantas híbridas altamente no aptas o hacer que mueran. En el campo, esto limitaría la hibridación entre distintas variedades de cultivos genéticamente modificados adyacentes y controlaría la hibridación con parientes silvestres o cultivos no modificados genéticamente, incluyendo variedades tradicionales. Esto también puede permitir que las estirpes reproductoras puras se mantengan de manera más eficaz debido a que se suprimirían los cruces no deseados. Adicionalmente, una elaboración útil en plantas es limitar la expresión de {Ud} a las raíces de forma que la competencia celular en la línea germinal, que puede propiciar mutaciones que alteran el sistema {Ud}, esté inhibida.

Ejemplo 8

{Ud} y nucleasas técnicamente diseñadas

El hecho de que RpL14 fuera el primer gen seleccionado para el desarrollo de esta técnica sugiere que este enfoque puede aplicarse fácilmente en otros organismos no modelo. La haploinsuficiencia y la naturaleza perjudicial de las mutaciones de PCR están bien conservadas a través de una amplia distancia evolutiva, con numerosos ejemplos en hongos, Arabidopsis, Drosophila, pez cebra, seres humanos y ratones (véase la Tabla 1). En consecuencia, las PRC deberían representar una rica fuente de genes que potencialmente pueden ser diana de construcciones de {Ud} en cualquier eucariota con reproducción sexual.

Como alternativa a dirigirse el ARNm de genes haploinsuficientes mediante ARNi, también es posible dirigirse a su ADN cromosómico utilizando nucleasas de dedos de zinc (ZFN), la nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN), un CRISPR o meganucleasas. Estas son endonucleasas de restricción sintéticas en que es posible diseñar técnicamente la secuencia de reconocimiento. Estas nucleasas sintéticas podrían utilizarse para la atenuación génica de la expresión induciendo mutaciones anuladoras en genes haploinsuficientes, a través de reparación de unión de extremos no homólogos de roturas cromosómicas de doble cadena inducidas por las ZFN, las TALEN, CRISPR o meganucleasas (por ejemplo, dirigidas a sitios de inicio de la transcripción). La copia de rescate volvería a ser insensible al direccionamiento debido a la introducción de mutaciones benignas, esta vez en el sitio de reconocimiento de la nucleasa. Además de potenciar la predictibilidad y eficacia del direccionamiento, el uso de las ZFN, las TALEN, CRISPR o meganucleasas, tiene el potencial de reducir aún más la pérdida de aptitud en homocigotos {Ud}/{Ud}. Para finalizar, el uso de las ZFN, las TALEN, CRISPR o meganucleasas extiende el enfoque {Ud} a los organismos con reproducción sexual en que el direccionamiento por ARNi es ineficaz.

Ejemplo 9

{Ud} y contrarresto del efecto en colonias

Las construcciones de {Ud} también tienen el potencial de superar un problema común a muchos programas que implican la liberación masiva de insectos a largo plazo, particularmente los genéticamente modificados. Esta es una reducción pronunciada en la aptitud de los individuos liberados debido a la selección de fenotipos que son ventajosos para el mantenimiento de colonias, pero que son perjudiciales tras la liberación en el entorno. La acumulación de alelos perjudiciales en poblaciones pequeñas en cautividad también puede contribuir, y la endogamia asociada con el mantenimiento de colonias a largo plazo exacerba estos efectos. La reproducción continua de colonias con individuos capturados en la naturaleza mientras se mantiene la homocigosis en un locus transgénico en individuos de liberación generalmente no es práctica. Sin embargo, las colonias subdominantes podrían mantenerse fácilmente como completamente exogámicas añadiendo un porcentaje de individuos capturados en su hábitat natural cada generación muy por debajo de la frecuencia umbral necesaria para la transformación. Los individuos homocigotos destinados a la liberación podrían provenir de subcolonias mantenidas durante un pequeño número de generaciones sin la adición de individuos capturados en su hábitat natural que se volverían sustancialmente homocigotos en el locus {Ud}. Es probable que esta reducción de la aptitud de las colonias no comprometa las liberaciones a corto plazo necesarias para los enfoques de transformación poblaciones, pero la supresión a largo plazo de los tamaños de las poblaciones de insectos utilizando la técnica de insecto estéril transgénico (SIT, forma siglada de sterile insect technique) probablemente se vea afectada. El uso de construcciones de transformación de línea germinal de {Ud} sería extremadamente valorado para mantener la aptitud a largo plazo de este tipo de colonias.

Ejemplo 10

Entrecruzado de locus subdominantes desde el punto de vista funcional

Un enfoque de entrecruzado funcional subdominante se basa en la presencia de los siguientes elementos:

P1 = gen haploinsuficiente reductor de toxina 1

P2 = gen haploinsuficiente reductor de toxina 2 (no el mismo gen que 1)

R1 = gen de rescate 1

R2 = gen de rescate 2

En una configuración, la fórmula ejemplifica los dos locus subdominantes funcionalmente independientes en distintos cromosomas en el mismo genoma:

{P1, R1}/{P2, R2}

En esta configuración, el gen de rescate y el de toxina están físicamente ligados en cada locus, mientras que los locus no están funcionalmente entrecruzados.

Los individuos homocigóticos para ambos locus se aparean con un tipo silvestre, como se describe a continuación:

estirpe individuos silvestres {P1, R1} /{P1, R1} ;{P2, R2}/{P2, R2} X / ; /+

{P1, R1} /+;{P2, R2}/+ fenotipo haploinsuficiente {1 y 2)

La descendencia se aparea, mientras que el fenotipo no sea el 100% letal o infértil, con cualquier genotipo. El resultado de este apareamiento se muestra a continuación:

{P1, R1} /{P1, R1} ;{P2, R2}/+ fenotipo haploinsuficiente (2)

{P1, R1} /{P1, R1}; /+ fenotipo de rescate de tipo silvestre {P1, R1} /{P1, R1} ;{P2, R2}/{P2, R2} fenotipo de rescate de tipo silvestre

{P1, R1} / ;{P2, R2}/+ fenotipo haploinsuficiente (1 y 2)

{P1, R1} / ; /+ fenotipo haploinsuficiente (1)

{P1, R1} / ;{P2, R2}/{P2, R2} fenotipo haploinsuficiente (1)

/ ;{P2, R2}/+ fenotipo haploinsuficiente (2)

/ ; /+ tipo silvestre

/ ;{P2, R2}/{P2, R2} fenotipo de rescate de tipo silvestre En un enfoque alternativo, los dos locus están funcionalmente entrecruzados:

{P1, R2} / {P1, R2}; {P2, R1} / {P2, R1}

Los individuos homocigóticos para ambos locus se aparean con un tipo silvestre de acuerdo con el siguiente esquema:

estirpe individuos silvestres

{P1, R2} / {P1, R2}; {P2, R1} / {P2, R1} X / ; /+

{P1, R2} / ; {P2, R1} / fenotipo haploinsuficiente (1 y 2)

La descendencia se aparea, mientras que el fenotipo no sea el 100% letal o infértil, con cualquier genotipo. El resultado de este apareamiento en generaciones posteriores se muestra a continuación:

{P1 R2} / {P1, R2}; {P2, R1} / fenotipo haploinsuficiente (1)

{P1 R2} / {P1, R2}; / LETAL (sin R1)

{P1 R2} / {P1, R2}; {P2, R1} / {P2, R1} fenotipo de rescate de tipo silvestre

{P1 R2} / ; {P2, R1} / fenotipo haploinsuficiente (1 2)

{P1 R2} / ; / LETAL (sin R1)

{P1 R2} / ; {P2, R1} / {P2, R1} fenotipo haploinsuficiente (2)

+ / ; {P2, R1} / LETAL (sin R2) /+ ; /+ tipo silvestre / ; {P2, R1} / {P2, R1} LETAL (sin R2) ___________________________________________ (continuación)___________________________________________ Dado que en la configuración entrecruzada desde el punto de vista funcional, la introgresión o transformación de la población depende tanto de la haploinsuficiencia como de la letalidad, el segundo enfoque con P1, R2 y P2, R1 entrecruzados es altamente eficaz, en particular para:

(1) BIOCONTENCIÓN ya que cualquier escape de F1 solo tiene 1 genotipo de 9 donde tienen una aptitud de tipo silvestre. En el enfoque no entrecruzado, 4 de 9 genotipos son de tipo silvestre (basados únicamente en haploinsuficiencia).

(2) SUPRESIÓN DEL TAMAÑO DE LA POBLACIÓN SILVESTRE ya que cualquier escape de F1 tiene viabilidad reducida.

(3) TRANSFORMACIÓN DE LA POBLACIÓN ya que se basa en dos mecanismos distintos, a saber, haploinsuficiencia e intoxicación no rescatada.

Ejemplo 11

Subdominancia en plantas utilizando TALEN y miARN u otros mecanismos de direccionamiento

El éxito del enfoque experimental para demostrar la subdominancia se basa en encontrar inserciones de {Ud} que provoquen un fenotipo fuertemente haploinsuficiente como heterocigotos, pero que no son tan graves que todas las plantas sean inviables o infértiles. Este fenotipo entonces necesita ser rescatado sustancialmente en algunas o todas las plantas homocigotas para el inserto. El éxito oportuno dependerá del estudio de un número suficiente de sitios de inserción para encontrar los que sean subdominantes No se espera que las inserciones en tándem de >3 sean subdominantes debido a que tienen copias de rescate excesivas para la haploinsuficiencia. Se sabe que la transformación del plásmido T proporciona una gama de números de copias en tándem. En algunas circunstancias, las inserciones múltiples también pueden ser subdominantes.

El experimento para identificar insertos subdominantes en plantas se realiza utilizando variaciones de acuerdo con el siguiente esquema:

A p rin c ip io s de la generación T2 (13-16 sem anas) se podría tener un fuerte ind ic io

si las inserc iones subdom inan tes de {U d} se han recuperado (confirm ado porT3*>

U tiliza r ho jas de la g en e ra c ió n T2 para el a n á lis is de in se rc ió n de núm e ro de co p ia s y c u a lq u ie r a n á lis is de la e xp re s ió n gén ica Tam b ién se p rec isa rán co n tro le s de fe n o tip o /+ en T2 y T3

El fenotipo aberrante se describe con respecto a las plantas de tipo silvestre o de control, en términos de propiedades que pueden afectar la aptitud competitiva de las plantas (por ejemplo, la fertilidad, la tasa de crecimiento, la tolerancia al estrés). El grado de rescate fenotípico se describe en términos de la reducción relativa de la gravedad del fenotipo aberrante y o la aptitud competitiva de los heterocigotos con respecto a los homocigotos.

Las inserciones en que rasgos agronómicos tales como la tolerancia al estrés y el rendimiento del cultivo no se ven afectados negativamente en los homocigotos, mientras los heterocigotos experimentan una pérdida significativa de aptitud competitiva, serán de particular valor. Si la frecuencia del fenotipo aberrante se reduce sustancialmente en la generación T2 en comparación con la generación T1, indica un inserto subdominante.

Ejemplo 12

Generación de plásmidos de entrada para el experimento de TALEN

Para una implementación del enfoque de subdominancia basado en TALEN, se clona directamente una construcción de TALEN en vectores de entrada, dado que las TALEN no pueden amplificarse por PCR y no pueden suministrarse en un vector gateway (plásmido 1 y 3).

El plásmido 2 también se ensambla directamente en el vector de entrada dado que debe incorporarse en 3 fragmentos. TALEN1 y TALEN2 son medios sitios de la misma proteína. La clonación se realiza en células normales.

La construcción del plásmido se lleva a cabo de acuerdo con la siguiente tabla:

Generación de plásmidos de entrada para el experimento de miARN y marcadores fluorescentes

Para los experimentos de miARN, se proporcionan plásmidos para dos miARN distintos (TTACTTACCAGTTATAGGCAT (SEQ ID NO: 13) y TGTAAGCCTCACGTAAGGCTA (SEQ ID NO: 14)). La construcción plasmídica para los experimentos de miARN y marcadores fluorescentes se llevaron a cabo de acuerdo con la siguiente tabla:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de reducción de la aptitud competitiva de un organismo eucariota hemicigótico para un locus transgénico en comparación con el organismo eucariota homocigótico para el locus transgénico, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, que comprende las etapas de:

(a) reducir la expresión de un gen haploinsuficiente en el organismo, en el que dicha reducción es transportada por un locus transgénico en el organismo; y

(b) rescatar la expresión reducida en el organismo, en el que dicho rescate es transportado por el mismo locus transgénico en el organismo,

dando un organismo que es menos apto competitivamente si es hemicigótico para el locus transgénico que si es homocigótico para el locus transgénico.

2. Un sistema genético para transformación que comprende los siguientes componentes:

(a) un medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente; y

(b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente, en el que el sistema genético se proporciona como una entidad de transformación única y en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico.

3. Uso de un sistema genético que comprende los siguientes componentes:

(b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente para la transformación de un organismo eucariota, con la condición de que el organismo no sea un ser humano, en el que dicha transformación se lleva a cabo simultáneamente y en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico.

4. Un organismo eucariota genéticamente modificado, con la condición de que dicho organismo no sea un ser humano, que comprende

(b) un agente de rescate capaz de aumentar la expresión reducida de dicho gen haploinsuficiente, en el que dicho organismo es un organismo potencialmente con reproducción sexual, en el que dicho medio para reducir específicamente la expresión de un gen haploinsuficiente y dicho agente de rescate están presentes en el mismo locus transgénico, y en el que dicho organismo es una planta o un insecto.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, el sistema genético de la reivindicación 2, el uso de la reivindicación 3 o el organismo genéticamente modificado de la reivindicación 4, en los que dicho gen haploinsuficiente es una proteína ribosómica citoplasmática (PRC) endógena, un factor de transcripción, un gen supresor de tumor, un gen relacionado con la función muscular, un gen codificante de una proteína de homeodominio u otro gen con evidencia que indique que es potencialmente haploinsuficiente en un organismo específico, preferentemente Rpl14 o Rpl 23aA.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 o 5, el sistema genético de la reivindicación 2 o 5, o el uso de la reivindicación 3 o 5, en los que dicho organismo es un animal vector de enfermedades, un animal que provoca enfermedades o un animal de ganado, o una planta, o un hongo o un protista.

7. El procedimiento, sistema genético, uso u organismo genéticamente modificado de la reivindicación 4, 5 o 6, en los que dicha planta es una planta agrícola tal como un cultivo de base, preferentemente un cultivo de cereales, cultivos de plantas de raíz, tubérculos, legumbres, sorgo o leguminosas; o un cultivo productor de azúcar, preferentemente caña de azúcar o remolacha azucarera; o una planta productora de aceite, preferentemente colza, soja, aceite de palma, cártamo o girasol; o una planta plaga tal como una planta invasora, una planta venenosa o una planta que provoca reacciones alergénicas en animales, preferentemente en seres humanos.