ES2781703T3

ES2781703T3 - Predictores moleculares de sepsis

Info

Publication number: ES2781703T3
Application number: ES15717596T
Authority: ES
Inventors: Peter Ghazal; Paul Dickinson; Thorsten Forster; Claire Smith; Ben Stenson; Mizan Khondoker
Original assignee: University College Cardiff Consultants Ltd
Current assignee: University College Cardiff Consultants Ltd
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: EP3129496B1; GB201406259D0; WO2015155517A1; PT3129496T; US20170022568A1; EP3129496A1; US10851415B2

Abstract

Un método para diagnosticar sepsis, el método comprende las etapas de: a) analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto para determinar los niveles de cuatro o más biomarcadores, los biomarcadores comprenden SLC2A3, GPR84, RETN y LRRN3 y opcionalmente uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de cualquiera de; - grupo A, que consiste en: GYG1, B4GALT5, HK3, PFKFB3, STXBP2, FPR2, ALPL, GRINA, FFAR2,y MPO; - grupo B, que consiste en: IL1RN, BASP1, PSTPIP2, CKAP4, DYSF, C19orf59, IL18R1, MMP9, FGR, SPI1, PGLYRP1, RNF24, ANKRD22, CEBPD, IL1R2, LOC729021 (SCRAP-tipo helicasa), S100A12, ITGAM, FCGR1A, IFITM3, CSF3R, LCN2, TNFAIP6, HP, ORM1, CEACAM1 y PRTN3; - y el grupo C, que consiste en: GRAP, TRAJ17, CD3D, CD247, ITM2A, LIME1, HLA-DMB, CD7, MAL, TRBV28, RPS29; y b) comparar los niveles de los biomarcadores determinados en (a) con uno o más valores de referencia, en donde una diferencia en los niveles de expresión de los cuatro o más biomarcadores en la(s) muestra(s) del sujeto en comparación con el uno o más valores de referencia es indicativo de sepsis.

Description

DESCRIPCIÓN

Predictores moleculares de sepsis

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a la identificación de una red de 52 genes que se expresan diferencialmente en muestras de sangre tomadas de neonatos infectados. Los inventores desarrollaron un nuevo ensayo de diagnóstico que es capaz de identificar sepsis.

Antecedentes de la invención

A pesar de los avances en la atención neonatal, la infección permanece como una causa principal de morbilidad y mortalidad en neonatos en todo el mundo. Si bien se logró cierto progreso hacia la supervivencia de los niños menores de 5 años como uno de los Objetivos de desarrollo del milenio, la morbilidad y mortalidad neonatal es un problema importante en entornos ricos y pobres en recursos (Liu y otros, Lancet doi:10.1016/S0140-6736(12)60560-1 (2012)). De 7,6 millones de muertes en niños menores de 5 años en 2010, 64,0 % (4879 millones) se atribuyeron a causas infecciosas y 40,3 % (3072 millones) ocurrieron en neonatos (Liu y otros, 2012 ibid.). Hasta el 65 % de los lactantes con peso extremadamente bajo al nacer desarrollan una presunta sepsis en el período neonatal. (Stoll, BJ y otros, JAMA 292, 2357 2365 (2004)). En consecuencia hay un umbral bajo para la sospecha clínica de infección en neonatos, particularmente debido a que la presentación varía mucho de signos muy sutiles a colapso catastrófico. Actualmente, los antibióticos empíricos se usan ampliamente debido a la falta de pruebas sensibles confiables y las posibles consecuencias potencialmente mortales del tratamiento tardío de la infección. En consecuencia, muchos lactantes sin infección se exponen a antibióticos de amplio espectro. Hasta la fecha nuestra comprensión de cómo un recién nacido responde a la infección se investiga poco.

La investigación clínica de los neonatos es problemática y nuestra comprensión de la sepsis neonatal también se obstaculiza por la falta de modelos animales apropiados y las diferencias específicas de la especie en respuesta a la infección. La inmadurez de los sistemas inmunes de los neonatos los hace más susceptibles a la infección que los individuos mayores, aunque la inmunidad neonatal no está bien caracterizada (Sharma y otros, Clin Immunol 145, 61-68 (2012)). Además, se sabe que las respuestas inmunes del huésped desempeñan una función importante en la fisiopatología de la sepsis; sin embargo, no se sabe cómo responden los humanos a nivel de la vía sistémica a la infección en la vida temprana.

Varios estudios demostraron que los cambios en la expresión del gen del huésped pueden ocurrir presintomáticamente en respuesta a la infección en cualquier parte del cuerpo, con la interacción continua entre la sangre y el tejido lo que permite que las células sanguíneas actúen como biosensores para los cambios (Manger & Relman, Curr Opin Immunol 12, 215-218 (2000)); Liew y otros, J Lab Clin Med 147, 126-132 (2006)).

Varios grupos investigaron las interacciones huésped-patógeno mediante el uso de enfoques genómicos (Berry y otros, Nature 466, 973-977 (2010); Hyatt y otros, Nat Immunol 7, 686-691 (2006); Manger & Relman, Curr Opin Immunol 12, 215-218 (2000))). Similarmente, se examinaron los perfiles transcripcionales de sangre de adultos y niños con infección, pero faltan datos de nenonatos infectados (Berry y otros, Nature 466, 973-977 (2010); Ardura y otros, PLoS One 4, e5446 (2009); Fjaerli y otros, BMC Infect Dis 6, 175 (2006); Madsen-Bouterse y otros, Am J Reprod Immunol 63, 73-92 (2010); Ramilo y otros, Blood 109, 2066-2077 (2007); Tang y otros Am J Respir Crit Care Med 176, 676-684 (2007). Sin embargo, también se investigaron un número limitado de marcadores del huésped a nivel de proteína en neonatos (Layseca-Espinosa y otros, Pediatric allergy and immunology: official publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology 13, 319-327 (2002); Ng y otros, Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 77, F221-227 (1997); Ng & Lam, Curr Opin Pediatr 18, 125-131 (2006); Labib y otros, International Journal of Microbiological Research 4, 77-85 (2013); Hodge y otros, Clin Exp Immunol 135, 125-129 (2004).

A pesar de la prevalencia de la afección y la intensidad de la investigación en esta área, el progreso sustancial en la comprensión de la base molecular de la sepsis neonatal no se logra y continúa como un problema clínico importante en todo el mundo. Además, aunque muchas pruebas son informativas en relación al riesgo de infección, ningún biomarcador o grupo de biomarcadores actual es suficiente para excluir con confianza la infección en el momento de la sospecha (Ng & Lam, Curr Opin Pediatr 18, 125-131 (2006). Por lo tanto existe una necesidad apremiante de herramientas de diagnóstico novedosas, sensibles y específicas que detecten específicamente los biomarcadores asociados con las primeras etapas de la infección neonatal. El descubrimiento de biomarcadores específicos para la sepsis neonatal permitiría evitar la administración de antibióticos empíricos en todos los recién nacidos menos en los más críticos. Esto es particularmente importante debido a la preocupación de que los antibióticos empíricos pueden aumentar los riesgos de desarrollar enterocolitis necrotizante y mortalidad en bebés prematuros. (Algodón, Arch Dis Child Educ Pract Ed 95, 94, (2010)).

El documento núm. US2011/0105350 se relaciona con el diagnóstico de sepsis.

Los inventores descubrieron sorprendentemente la vía biológica subyacente a la sepsis neonatal en los primeros signos clínicos de infección y por lo tanto identificaron y validaron un panel de módulos de red conectados biológicamente. Los inventores descubrieron inesperadamente que el análisis de los niveles de expresión de combinaciones particulares de biomarcadores, y específicamente los de una vía previamente desconectada de las respuestas inmunes, proporciona una calidad diagnóstica inusualmente alta. A pesar de la heterogeneidad del paciente, la red de biomarcadores duales de 52 nodos tenía una precisión superior al 98 % para detectar infecciones bacterianas con una sensibilidad del 100 % que mostraba un rendimiento superior a los marcadores previamente caracterizados. Además, estas combinaciones específicas de biomarcadores permitieron la detección de sepsis neonatal en muestras que mostraron resultados negativos en hemocultivos, lo que ilustra los beneficios diagnósticos específicos de las combinaciones particulares de biomarcadores de la invención. Los inesperadamente altos valores de precisión y sensibilidad no resultarían de la investigación de ninguno de los biomarcadores individuales por sí solos, ni se predecirían a partir de la técnica anterior.

Resumen de la invención

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para diagnosticar la sepsis. La invención proporciona, además, un dispositivo para usar en el diagnóstico de la sepsis y un kit de piezas para usar en el diagnóstico de la sepsis. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación se refiere a un método de diagnóstico de sepsis, que comprende las etapas de:

a) analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto para determinar los niveles de dos o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, en donde los biomarcadores se seleccionan de cualquiera de los grupos A, B o C; y b) comparar los niveles de los biomarcadores determinados en (a) con uno o más valores de referencia, en donde una diferencia en los niveles de expresión de los dos o más biomarcadores en la(s) muestra(s) del sujeto en comparación con el uno o más valores de referencia es indicativo de sepsis.

En todo momento el término "diagnóstico" o "mediante el diagnóstico" en relación con la sepsis se usa tanto para indicar la presencia de sepsis en curso como para indicar las etapas iniciales de la sepsis donde pueden tomarse otras mediciones físicas o biológicas junto con la medición de los niveles de expresión de los biomarcadores. En particular, la invención se pretende que cubra la detección de la presencia de sepsis activa en una muestra biológica.

Dado la sorprendente potencia de la combinación de biomarcadores de la presente divulgación para diferenciar entre sepsis y no sepsis, pueden seleccionarse dos biomarcadores de los grupos A, B o C para el análisis. De acuerdo con la presente divulgación, sería una rutina para un experto en la técnica seleccionar cualquier combinación de biomarcadores de la lista divulgada en la Tabla 1. Las siguientes combinaciones representan combinaciones preferidas de biomarcadores:

SLC2A3 y LRRN3; SLC2A3, GPR84 y LRRN3; SLC2A3, GPR84, RETN, y LRRN3; SLC2A3, LRRN3 y TRAJ17; SLC2A3, GPR84, LRRN3 y TRAJ17; SLC2A3, GPR84, RETN, LRRN3 y TRAJ17; SLC2A3, LRRN3, TRAJ17 y CD3D; SLC2A3, GPR84, LRRN3, TRAJ17 y CD3D; SLC2A3, GPR84, RETN, LRRN3, TRAJ17 y CD3D; LRRN3 y BASP1; LRRN3, TRAJ17 y BASP1; LRRN3, TRAJ17, CD3D y BASP1; LRRN3, BASP1 y CKAP4; LRRN3, TRAJ17, BASP1 y CKAP4; LRRN3, TRAJ17, CD3D, BASP1 y CKAP4; LRRN3, BASP1, CKAP4 y C19orf59; LRRN3, TRAJ17, BASP1, CKAP4 y C19orf59; LRRN3, TRAJ17, CD3D, BASP1, CKAP4 y C19orf59; SLC2A3 y BASP1; SLC2A3, GPR84 y BASP1; SLC2A3, GPR84, RETN y BASP1; SLC2A3, BASP1 y CKAP4; SLC2A3, GPR84, BASP1 y CKAP4; SLC2A3, GPR84, RETN, BASP1 y CKAP4; SLC2A3, BASP1, CKAP4 y C19orf59; SLC2A3, GPR84, BASP1, CKAP4 y C19orf59; SLC2A3, GPR84, RETN, BASP1, CKAP4 y C19orf59.

En una modalidad particularmente preferida la invención proporciona un método para diagnosticar sepsis, que comprende las etapas de:

a) analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto para determinar los niveles de dos o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, en donde los biomarcadores son;

SLC2A3, GPR84, RETN, LRRN3, TRAJ17, CD3D, BASP1, CKAP4 y C19orf59; y

b) comparar los niveles de los biomarcadores determinados en (a) con uno o más valores de referencia, en donde una diferencia en los niveles de expresión de los dos o más biomarcadores en la(s) muestra(s) del sujeto en comparación con el uno o más valores de referencia es indicativo de sepsis.

La presente divulgación se refiere, además, a un método de diagnóstico de sepsis, que comprende las etapas de: a) analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto para determinar los niveles de dos o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, en donde al menos un biomarcador se selecciona del grupo A y al menos otro biomarcador se selecciona de cualquiera de los grupos A, B o C; y

El al menos un biomarcador seleccionado del grupo A puede ser GYG1, B4GALT5, SLC2A3, HK3, GPR84, PFKFB3, RETN, STXBP2, FPR2, ALPL, GRINA, FFAR2 y MPO. Preferentemente, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo A comprenderá SLC2A3. Con mayor preferencia, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo A comprenderá SLC2A3 y GPR84. Incluso con mayor preferencia, el al menos un biomarcador comprenderá SLC2A3, GPR84 y RETN.

El al menos un biomarcador seleccionado del grupo B o C puede seleccionarse del grupo IL1RN, BASP1, PSTPIP2, CKAP4, DYSF, C19orf59, IL18R1, MMP9, FGR, SPI1, PGLYRP1, RNF24, ANKRD22, CEBPD, IL1R2, LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), S100A12, ITGAM, FCGR1A, IFITM3, CSF3R, LCN2, TNFAIP6, HP, ORM1, CEACAM1, PRTN3, LRRN3, GRAP, TRAJ17, CD3D, CD247, ITM2A, LIME1, HLA-DMB, CD7, MAL, TRBV28 y RPS29. En una modalidad preferida el al menos un biomarcador seleccionado del grupo B o C comprenderá LRRN3. Con mayor preferencia, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo B o C comprenderá LRRN3 y TRAJ17. Incluso con mayor preferencia, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo B o C comprenderá LRRN3, TRAJ17 y CD3D. En una modalidad preferida el al menos un biomarcador seleccionado del grupo B o C comprenderá BASP1. Con mayor preferencia el al menos un biomarcador comprenderá BASP1 y CKAP4. Incluso con mayor preferencia el al menos un biomarcador comprenderá BASP1 CKAP4, y C190rf59.

La presente divulgación se refiere, además, a un método de diagnóstico de sepsis, que comprende las etapas de: a) analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto para determinar los niveles de tres o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, en donde se selecciona al menos un biomarcador de cada uno de los grupos A, B y C; y b) comparar los niveles de los biomarcadores determinados en (a) con uno o más valores de referencia, en donde una diferencia en los niveles de expresión de los dos o más biomarcadores en la(s) muestra(s) del sujeto en comparación con el uno o más valores de referencia es indicativo de sepsis.

Comúnmente, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo A puede ser cualquier miembro del grupo A. Sin embargo, adecuadamente al menos un biomarcador seleccionado del grupo A se seleccionará del grupo SLC2A3, GPR84 y RETN. Similarmente, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo B puede ser cualquier miembro del grupo B. Sin embargo, adecuadamente al menos un biomarcador seleccionado del grupo B se seleccionará del grupo BASP1, CKAP4, y C190rf59. Finalmente, el al menos un biomarcador seleccionado del grupo C puede ser cualquier miembro del grupo C. Sin embargo, adecuadamente al menos un biomarcador seleccionado del grupo C se seleccionará del grupo LRRN3, TRAJ17 y CD3D. En una modalidad preferida, los biomarcadores seleccionados comprenderán SLC2A3, BASP1 y LRRN3 y, con mayor preferencia, los biomarcadores seleccionados comprenderán, además, GPR84, CKAP4 y TRAJ17.

En la presente divulgación el grupo A consta de los siguientes biomarcadores asociados con las vías glicolítica, de transporte de glucosa y del metabolismo de esteroles:

GYG1, B4GALT5, SLC2A3, HK3, GPR84, PFKFB3, RETN, STXBP2, FPR2, ALPL, GRINA, FFAR2 y MPO. Se apreciará que cualquiera de estos biomarcadores puede usarse en combinación con cualquier biomarcador o combinación de biomarcadores seleccionados del grupo A, grupo B o grupo C.

En la presente divulgación el grupo B consta de los siguientes biomarcadores asociados con la vía de respuesta inmune innata:

IL1RN, BASP1, PSTPIP2, CKAP4, DYSF, C19orf59, IL18R1, MMP9, FGR, SPI1, PGLYRP1, RNF24, ANKRD22, CEBPD, IL1R2, LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), S100A12, ITGAM, FCGR1A, IFITM3, CSF3R, LCN2, TNFAIP6, HP, ORM1, CEACAM1 y PRTN3. Se apreciará que cualquiera de estos biomarcadores puede usarse en combinación con cualquier biomarcador o combinación de biomarcadores seleccionados del grupo A, grupo B o grupo C.

En la presente divulgación el grupo C consta de los siguientes biomarcadores asociados con la vía de respuesta inmune adaptativa:

LRRN3, GRAP, TRAJ17, CD3D, CD247, ITM2A, LIME1, HLA-DMB, CD7, MAL, TRBV28 y RPS29. Se apreciará que cualquiera de estos biomarcadores puede usarse en combinación con cualquier biomarcador o combinación de biomarcadores seleccionados del grupo A, grupo B o grupo C.

Típicamente puede seleccionarse más de un biomarcador de cada grupo de biomarcadores y sus niveles en una muestra biológica investigada en combinación. De acuerdo con la presente divulgación, un experto en la técnica apreciaría que cualquier combinación de biomarcadores puede seleccionarse de la lista divulgada en la Tabla 1. En una modalidad, se selecciona al menos un biomarcador para el análisis del grupo A y se selecciona al menos otro biomarcador de los grupos A, B o C. Preferentemente, se selecciona al menos un biomarcador del grupo A y se selecciona al menos otro biomarcador del grupo C. Normalmente se seleccionará más de un biomarcador del grupo A.

La presente divulgación se refiere a un método para diagnosticar sepsis que comprende analizar una muestra biológica para determinar los niveles de combinaciones de biomarcadores y comparar los niveles de dichos biomarcadores con valores de referencia y/o los niveles de los biomarcadores correspondientes de una o más muestras de control, en donde la combinación de biomarcadores comprende lo siguiente:

GYG1 y B4GALT5, o GYG1 y SLC2A3, o GYG1 y HK3, o GYG1 y GPR84, o GYG1 y PFKFB3, o GYG1 y RETN, o GYG1 y STXBP2, o GYG1 y FPR2, o GYG1 y ALPL, o GYG1 y GRINA, o GYG1 y FFAR2, o GYG1 y MPO, o B4GALT5 y GYG1, o B4GALT5 y SLC2A3, o B4GALT5 y HK3, o B4GALT5 y GPR84, o B4GALT5 y PFKFB3, o B4GALT5 y RETN, o B4GALT5 y STXBP2, o B4GALT5 y FPR2, o B4GALT5 y ALPL, o B4GALT5 y GRINA, o B4GALT5 y FFAR2, o B4GALT5 y MPO, o SLC2A3 y GYG1, o SLC2A3 y B4GALT5, o SLC2A3 y HK3, o SLC2A3 y GPR84, o SLC2A3 y PFKFB3, o SLC2A3 y RETN, o SLC2A3 y STXBP2, o SLC2A3 y FPR2, o SLC2A3 y ALPL, o SLC2A3 y GRINA, o SLC2A3 y FFAR2, o SLC2A3 y MPO, o HK3 y GYG1, o HK3 y B4GALT5, o HK3 y SLC2A3, o HK3 y GPR84, o HK3 y PFKFB3, o HK3 y RETN, o HK3 y STXBP2, o HK3 y FPR2, o HK3 y ALPL, o HK3 y GRINA, o HK3 y FFAR2, o HK3 y MPO, o GPR84 y GYG1, o GPR84 y B4GALT5, o GPR84 y SLC2A3, o GPR84 y HK3, o GPR84 y PFKFB3, o GPR84 y RETN, o GPR84 y STXBP2, o GPR84 y FPR2, o GPR84 y ALPL, o GPR84 y GRINA, o GPR84 y FFAR2, o GPR84 y MPO, o PFKFB3 y GYG1, o PFKFB3 y B4GALT5, o PFKFB3 y SLC2A3, o PFKFB3 y HK3, o PFKFB3 y GPR84, o PFKFB3 y RETN, o PFKFB3 y STXBP2, o PFKFB3 y FPR2, o PFKFB3 y ALPL, o PFKFB3 y GRINA, o PFKFB3 y FFAR2, o PFKFB3 y MPO, o RETN y GYG1, o RETN y B4GALT5, o RETN y SLC2A3, o RETN y HK3, o RETN y GPR84, o RETN y PFKFB3, o RETN y STXBP2, o RETN y FPR2, o RETN y ALPL, o RETN y GRINA, o RETN y FFAR2, o RETN y MPO, o STXBP2 y GYG1, o STXBP2 y B4GALT5, o STXBP2 y SLC2A3, o STXBP2 y HK3, o STXBP2 y GPR84, o STXBP2 y PFKFB3, o STXBP2 y RETN, o STXBP2 y FPR2, o STXBP2 y ALPL, o STXBP2 y GRINA, o STXBP2 y FFAR2, o STXBP2 y MPO, o FPR2 y GYG1, o FPR2 y B4GALT5, o FPR2 y SLC2A3, o FPR2 y HK3, o FPR2 y GPR84, o FPR2 y PFKFB3, o FPR2 y RETN, o FPR2 y STXBP2, o FPR2 y ALPL, o FPR2 y GRINA, o FPR2 y FFAR2, o FPR2 y MPO, o ALPL y GYG1, o ALPL y B4GALT5, o ALPL y SLC2A3, o ALPL y HK3, o ALPL y GPR84, o ALPL y PFKFB3, o ALPL y RETN, o ALPL y STXBP2, o ALPL y FPR2, o ALPL y GRINA, o ALPL y FFAR2, o ALPL y MPO, o GRINA y GYG1, o GRINA y B4GALT5, o GRINA y SLC2A3, o GRINA y HK3, o GRINA y GPR84, o GRINA y PFKFB3, o GRINA y RETN, o GRINA y STXBP2, o GRINA y FPR2, o GRINA y ALPL, o GRINA y FFAR2, o GRINA y MPO, o FFAR2 y GYG1, o FFAR2 y B4GALT5, o FFAR2 y SLC2A3, o FFAR2 y HK3, o FFAR2 y GPR84, o FFAR2 y PFKFB3, o FFAR2 y RETN, o FFAR2 y STXBP2, o FFAR2 y FPR2, o FFAR2 y ALPL, o FFAR2 y GRINA, o FFAR2 y MPO, o MPO y GYG1, o MPO y B4GALT5, o MPO y SLC2A3, o MPO y HK3, o MPO y GPR84, o MPO y PFKFB3, o MPO y RETN, o MPO y STXBP2, o MPO y FPR2, o MPO y ALPL, o MPO y GRINA, o MPO y FFAR2, o GYG1 e IL1RN, o GYG1 y BASP1, o GYG1 y PSTPIP2, o GYG1 y CKAP4, o GYG1 y DYSF, o GYG1 y C19orf59, o GYG1 e IL18R1, o GYG1 y MMP9, o GYG1 y FGR, o GYG1 y SPI1, o GYG1 y PGLYRP1, o GYG1 y RNF24, o GYG1 y ANKRD22, o GYG1 y CEBPD, o GYG1 e IL1R2, o GYG1 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o GYG1 y S100A12, o GYG1 e ITGAM, o GYG1 y FCGR1A, o GYG1 e IFITM3, o GYG1 y CSF3R, o GYG1 y LCN2, o GYG1 y TNFAIP6, o GYG1 y HP, o GYG1 y ORM1, o GYG1 y CEACAM1, o GYG1 y PRTN3, o GYG1 y LRRN3, o GYG1 y GRAP, o GYG1 y TRAJ17, o GYG1 y CD3D, o GYG1 y CD247, o GYG1 y ITM2A, o GYG1 y LIME1, o GYG1 y HLA-DMB, o GYG1 y CD7, o GYG1 y MAL, o GYG1 y TRBV28, o GYG1 y RPS29, o B4GALT5 e IL1RN, o B4GALT5 y BASP1, o B4GALT5 y PSTPIP2, o B4GALT5 y CKAP4, o B4GALT5 y DYSF, o B4GALT5 y C19orf59, o B4GALT5 e IL18R1, o B4GALT5 y MMP9, o B4GALT5 y FGR, o B4GALT5 y SPI1, o B4GALT5 y PGLYRP1, o B4GALT5 y RNF24, o B4GALT5 y ANKRD22, o B4GALT5 y CEBPD, o B4GALT5 e IL1R2, o B4GALT5 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o B4GALT5 y S100A12, o B4GALT5 e ITGAM, o B4GALT5 y FCGR1A, o B4GALT5 e IFITM3, o B4GALT5 y CSF3R, o B4GALT5 y LCN2, o B4GALT5 y TNFAIP6, o B4GALT5 y HP, o B4GALT5 y ORM1, o B4GALT5 y CEACAM1, o B4GALT5 y PRTN3, o B4GALT5 y LRRN3, o B4GALT5 y GRAP, o B4GALT5 y TRAJ17, o B4GALT5 y CD3D, o B4GALT5 y CD247, o B4GALT5 e ITM2A, o B4GALT5 y LIME1, o B4GALT5 y HLA-DMB, o B4GALT5 y CD7, o B4GALT5 y MAL, o B4GALT5 y TRBV28, o B4GALT5 y RPS29, o SLC2A3 e IL1RN, o SLC2A3 y BASP1, o SLC2A3 y PSTPIP2, o SLC2A3 y CKAP4, o SLC2A3 y DYSF, o SLC2A3 y C19orf59, o SLC2A3 e IL18R1, o SLC2A3 y MMP9, o SLC2A3 y FGR, o SLC2A3 y SPI1, o SLC2A3 y PGLYRP1, o SLC2A3 y RNF24, o SLC2A3 y ANKRD22, o SLC2A3 y CEBPD, o SLC2A3 e IL1R2, o SLC2A3 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o SLC2A3 y S100A12, o SLC2A3 e ITGAM, o SLC2A3 y FCGR1A, o SLC2A3 e IFITM3, o SLC2A3 y CSF3R, o SLC2A3 y LCN2, o SLC2A3 y TNFAIP6, o SLC2A3 y HP, o SLC2A3 y ORM1, o SLC2A3 y CEACAM1, o SLC2A3 y PRTN3, o SLC2A3 y LRRN3, o SLC2A3 y GRAP, o SLC2A3 y TRAJ17, o SLC2A3 y CD3D, o SLC2A3 y CD247, o SLC2A3 e ITM2A, o SLC2A3 y LIME1, o SLC2A3 y HLA-DMB, o SLC2A3 y CD7, o SLC2A3 y MAL, o SLC2A3 y TRBV28, o SLC2A3 y RPS29, o HK3 e IL1RN, o HK3 y BASP1, o HK3 y PSTPIP2, o HK3 y CKAP4, o HK3 y DYSF, o HK3 y C19orf59, o HK3 e IL18R1, o HK3 y MMP9, o HK3 y FGR, o HK3 y SPI1, o HK3 y PGLYRP1, o HK3 y RNF24, o HK3 y ANKRD22, o HK3 y CEBPD, o HK3 e IL1R2, o HK3 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o HK3 y S100A12, o HK3 e ITGAM, o HK3 y FCGR1A, o HK3 y IFITM3, o HK3 y CSF3R, o HK3 y LCN2, o HK3 y TNFAIP6, o HK3 y HP, o HK3 y ORM1, o HK3 y CEACAM1, o HK3 y PRTN3, o HK3 y LRRN3, o HK3 y GRAP, o HK3 y TRAJ17, o HK3 y CD3D, o HK3 y CD247, o HK3 e ITM2A, o HK3 y LIME1, o HK3 y HLA-DMB, o HK3 y CD7, o HK3 y MAL, o HK3 y TRBV28, o HK3 y RPS29, o GPR84 e IL1RN, o GPR84 y BASP1, o GPR84 y PSTPIP2, o GPR84 y CKAP4, o GPR84 y DYSF, o GPR84 y C19orf59, o GPR84 e IL18R1, o GPR84 y MMP9, o GPR84 y FGR, o GPR84 y SPI1, o GPR84 y PGLYRP1, o GPR84 y RNF24, o GPR84 y ANKRD22, o GPR84 y CEBPD, o GPR84 e IL1R2, o GPR84 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o GPR84 y S100A12, o GPR84 e ITGAM, o GPR84 y FCGR1A, o GPR84 e IFITM3, o GPR84 y CSF3R, o GPR84 y LCN2, o GPR84 y TNFAIP6, o GPR84 y HP, o GPR84 y ORM1, o GPR84 y CEACAM1, o GPR84 y PRTN3, o GPR84 y LRRN3, o GPR84 y GRAP, o GPR84 y TRAJ17, o GPR84 y CD3D, o GPR84 y CD247, o GPR84 e ITM2A, o GPR84 y LIME1, o GPR84 y HLA-DMB, o 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ANKRD22, o RETN y CEBPD, o RETN e IL1R2, o RETN y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o RETN y S100A12, o RETN e ITGAM, o RETN y FCGR1A, o RETN e IFITM3, o RETN y CSF3R, o RETN y LCN2, o RETN y TNFAIP6, o RETN y HP, o RETN y ORM1, o RETN y CEACAM1, o RETN y PRTN3, o RETN y LRRN3, o RETN y GRAP, o RETN y TRAJ17, o RETN y CD3D, o RETN y CD247, o RETN e ITM2A, o RETN y LIME1, o RETN y HLA-DMB, o RETN y CD7, o RETN y MAL, o RETN y TRBV28, o RETN y RPS29, o STXBP2 e IL1RN, o STXBP2 y BASP1, o STXBP2 y PSTPIP2, o STXBP2 y CKAP4, o STXBP2 y DYSF, o STXBP2 y C19orf59, o STXBP2 e IL18R1, o STXBP2 y MMP9, o STXBP2 y FGR, o STXBP2 y SPI1, o STXBP2 y PGLYRP1, o STXBP2 y RNF24, o STXBP2 y ANKRD22, o STXBP2 y CEBPD, o STXBP2 e IL1R2, o STXBP2 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o STXBP2 y S100A12, o STXBP2 e ITGAM, o STXBP2 y FCGR1A, o STXBP2 e IFITM3, o STXBP2 y CSF3R, o STXBP2 y LCN2, o STXBP2 y TNFAIP6, o STXBP2 y HP, o STXBP2 y ORM1, o STXBP2 y CEACAM1, o STXBP2 y PRTN3, o STXBP2 y LRRN3, o STXBP2 y 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GRINA y LRRN3, o GRINA y GRAP, o GRINA y TRAJ17, o GRINA y CD3D, o GRINA y CD247, o GRINA e ITM2A, o GRINA y LIME1, o GRINA y HLA-DMB, o GRINA y CD7, o GRINA y MAL, o GRINA y TRBV28, o GRINA y RPS29, o FFAR2 e IL1RN, o FFAR2 y BASP1, o FFAR2 y PSTPIP2, o FFAR2 y CKAP4, o FFAR2 y DYSF, o FFAR2 y C19orf59, o FFAR2 e IL18R1, o FFAR2 y MMP9, o FFAR2 y FGR, o FFAR2 y SPI1, o FFAR2 y PGLYRP1, o FFAR2 y RNF24, o FFAR2 y ANKRD22, o FFAR2 y CEBPD, o FFAR2 e IL1R2, o FFAR2 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o FFAR2 y S100A12, o FFAR2 e ITGAM, o FFAR2 y FCGR1A, o FFAR2 e IFITM3, o FFAR2 y CSF3R, o FFAR2 y LCN2, o FFAR2 y TNFAIP6, o FFAR2 y HP, o FFAR2 y ORM1, o FFAR2 y CEACAM1, o FFAR2 y PRTN3, o FFAR2 y LRRN3, o FFAR2 y GRAP, o FFAR2 y TRAJ17, o FFAR2 y CD3D, o FFAR2 y CD247, o FFAR2 e ITM2A, o FFAR2 y LIME1, o FFAR2 y HLA-DMB, o FFAR2 y CD7, o FFAR2 y MAL, o FFAR2 y TRBV28, o FFAR2 y RPS29, o MPO e IL1RN, o MPO y BASP1, o MPO y PSTPIP2, o MPO y CKAP4, o MPO y DYSF, o MPO y C19orf59, o MPO e IL18R1, o MPO y MMP9, o MPO y FGR, o MPO y SPI1, o MPO y PGLYRP1, o MPO y RNF24, o MPO y ANKRD22, o MPO y CEBPD, o MPO e IL1R2, o MPO y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o MPO y S100A12, o MPO e ITGAM, o MPO y FCGR1A, o MPO e IFITM3, o MPO y CSF3R, o MPO y LCN2, o MPO y TNFAIP6, o MPO y HP, o MPO y ORM1, o MPO y CEACAM1, o MPO y PRTN3, o MPO y LRRN3, o MPO y GRAP, o MPO y TRAJ17, o MPO y CD3D, o MPO y CD247, o MPO e ITM2A, o MPO y LIME1, o MPO y HLA-DMB, o MPO y CD7, o MPO y MAL, o MPO y TRBV28, o MPO y RPS29; o IL1RN y BASP1, o IL1RN y PSTPIP2, o IL1RN y CKAP4, o IL1RN y DYSF, o IL1RN y C19orf59, o IL1RN e IL18R1, o IL1RN y MMP9, o IL1RN y FGR, o IL1RN y SPI1, o IL1RN y PGLYRP1, o IL1RN y RNF24, o IL1RN y ANKRD22, o IL1RN y CEBPD, o IL1RN e IL1R2, o IL1RN y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o IL1RN y S100A12, o IL1RN e ITGAM, o IL1RN y FCGR1A, o IL1RN e IFITM3, o IL1RN y CSF3R, o IL1RN y LCN2, o IL1RN y TNFAIP6, o IL1RN y HP, o IL1RN y ORM1, o IL1RN y CEACAM1, o IL1RN y PRTN3, o BASP1 y PSTPIP2, o BASP1 y CKAP4, o BASP1 y DYSF, o BASP1 y C19orf59, o BASP1 e IL18R1, o BASP1 y MMP9, o BASP1 y FGR, o BASP1 y SPI1, o BASP1 y PGLYRP1, o BASP1 y RNF24, o BASP1 y ANKRD22, o BASP1 y CEBPD, o BASP1 e IL1R2, o BASP1 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o BASP1 y S100A12, o BASP1 e ITGAM, o BASP1 y FCGR1A, o BASP1 e IFITM3, o BASP1 y CSF3R, o BASP1 y LCN2, o BASP1 y TNFAIP6, o BASP1 y HP, o BASP1 y ORM1, o BASP1 y CEACAM1, o BASP1 y PRTN3, o PSTPIP2 y CKAP4, o PSTPIP2 y DYSF, o PSTPIP2 y C19orf59, o PSTPIP2 e IL18R1, o PSTPIP2 y MMP9, o PSTPIP2 y FGR, o PSTPIP2 y SPI1, o PSTPIP2 y PGLYRP1, o PSTPIP2 y RNF24, o PSTPIP2 y ANKRD22, o PSTPIP2 y CEBPD, o PSTPIP2 e IL1R2, o PSTPIP2 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o PSTPIP2 y S100A12, o PSTPIP2 e ITGAM, o PSTPIP2 y FCGR1A, o PSTPIP2 e IFITM3, o PSTPIP2 y CSF3R, o PSTPIP2 y LCN2, o PSTPIP2 y TNFAIP6, o PSTPIP2 y HP, o PSTPIP2 y ORM1, o PSTPIP2 y CEACAM1, o PSTPIP2 y PRTN3, o CKAP4 y DYSF, o CKAP4 y C19orf59, o CKAP4 e IL18R1, o CKAP4 y MMP9, o CKAP4 y FGR, o CKAP4 y SPI1, o CKAP4 y PGLYRP1, o CKAP4 y RNF24, o CKAP4 y ANKRD22, o CKAP4 y CEBPD, o CKAP4 e IL1R2, o CKAP4 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o CKAP4 y S100A12, o CKAP4 e ITGAM, o CKAP4 y FCGR1A, o CKAP4 e IFITM3, o CKAP4 y CSF3R, o CKAP4 y LCN2, o CKAP4 y TNFAIP6, o CKAP4 y HP, o CKAP4 y ORM1, o CKAP4 y CEACAM1, o CKAP4 y PRTN3, o DYSF y C19orf59, o DYSF e IL18R1, o DYSF y MMP9, o DYSF y FGR, o DYSF y SPI1, o DYSF y PGLYRP1, o DYSF y RNF24, o DYSF y ANKRD22, o DYSF y CEBPD, o DYSF e IL1R2, o DYSF y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o DYSF y S100A12, o DYSF e ITGAM, o DYSF y FCGR1A, o DYSF e IFITM3, o DYSF y CSF3R, o DYSF y LCN2, o DYSF y TNFAIP6, o DYSF y HP, o DYSF y ORM1, o DYSF y CEACAM1, o DYSF y PRTN3, o C19orf59 e IL18R1, o C19orf59 y MMP9, o C19orf59 y FGR, o C19orf59 y SPI1, o C19orf59 y PGLYRP1, o C19orf59 y RNF24, o C19orf59 y ANKRD22, o C19orf59 y CEBPD, o C19orf59 e IL1R2, o C19orf59 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o C19orf59 y S100A12, o C19orf59 e ITGAM, o C19orf59 y FCGR1A, o C19orf59 e IFITM3, o C19orf59 y CSF3R, o C19orf59 y LCN2, o C19orf59 y TNFAIP6, o C19orf59 y HP, o C19orf59 y ORM1, o C19orf59 y CEACAM1, o C19orf59 y PRTN3, o IL18R1 y MMP9, o IL18R1 y FGR, o IL18R1 y SPI1, o IL18R1 y PGLYRP1, o IL18R1 y RNF24, o IL18R1 y ANKRD22, o IL18R1 y CEBPD, o IL18R1 e IL1R2, o IL18R1 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o IL18R1 y S100A12, o IL18R1 e ITGAM, o IL18R1 y FCGR1A, o IL18R1 e IFITM3, o IL18R1 y CSF3R, o IL18R1 y LCN2, o IL18R1 y TNFAIP6, o IL18R1 y HP, o IL18R1 y ORM1, o IL18R1 y CEACAM1, o IL18R1 y PRTN3, o MMP9 y FGR, o MMP9 y SPI1, o MMP9 y PGLYRP1, o MMP9 y RNF24, o MMP9 y ANKRD22, o MMP9 y CEBPD, o MMP9 e IL1R2, o MMP9 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o MMP9 y S100A12, o MMP9 e ITGAM, o MMP9 y FCGR1A, o MMP9 e IFITM3, o MMP9 y CSF3R, o MMP9 y LCN2, o MMP9 y TNFAIP6, o MMP9 y HP, o MMP9 y ORM1, o MMP9 y CEACAM1, o MMP9 y PRTN3, o FGR y SPI1, o FGR y PGLYRP1, o FGR y RNF24, o FGR y ANKRD22, o FGR y CEBPD, o FGR e IL1R2, o FGR y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o FGR y S100A12, o FGR e ITGAM, o FGR y FCGR1A, o FGR e IFITM3, o FGR y CSF3R, o FGR y LCN2, o FGR y TNFAIP6, o FGR y HP, o FGR y ORM1, o FGR y CEACAM1, o FGR y PRTN3, o SPI1 y PGLYRP1, o SPI1 y RNF24, o SPI1 y ANKRD22, o SPI1 y CEBPD, o SPI1 e IL1R2, o SPI1 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o SPI1 y S100A12, o SPI1 e ITGAM, o SPI1 y FCGR1A, o SPI1 e IFITM3, o SPI1 y CSF3R, o SPI1 y LCN2, o SPI1 y TNFAIP6, o SPI1 y HP, o SPI1 y ORM1, o SPI1 y CEACAM1, o SPI1 y PRTN3, o PGLYRP1 y RNF24, o PGLYRP1 y ANKRD22, o PGLYRP1 y CEBPD, o PGLYRP1 y IL1R2, o PGLYRP1 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o PGLYRP1 y S100A12, o PGLYRP1 e ITGAM, o PGLYRP1 y FCGR1A, o PGLYRP1 e IFITM3, o PGLYRP1 y CSF3R, o PGLYRP1 y LCN2, o PGLYRP1 y TNFAIP6, o PGLYRP1 y HP, o PGLYRP1 y ORM1, o PGLYRP1 y CEACAM1, o PGLYRP1 y PRTN3, o RNF24 y ANKRD22, o RNF24 y CEBPD, o RNF24 e IL1R2, o RNF24 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o RNF24 y S100A12, o RNF24 e ITGAM, o RNF24 y FCGR1A, o RNF24 e IFITM3, o RNF24 y CSF3R, o RNF24 y LCN2, o RNF24 y TNFAIP6, o RNF24 y HP, o RNF24 y ORM1, o RNF24 y CEACAM1, o RNF24 y PRTN3, o ANKRD22 y CEBPD, o ANKRD22 e IL1R2, o ANKRD22 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o ANKRD22 y S100A12, o ANKRD22 e ITGAM, o ANKRD22 y FCGR1A, o ANKRD22 e IFITM3, o ANKRD22 y CSF3R, o ANKRD22 y LCN2, o ANKRD22 y TNFAIP6, o ANKRD22 y HP, o ANKRD22 y ORM1, o ANKRD22 y CEACAM1, o ANKRD22 y PRTN3, o CEBPD e IL1R2, o CEBPD y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o CEBPD y S100A12, o CEBPD e ITGAM, o CEBPD y FCGR1A, o CEBPD e IFITM3, o CEBPD y CSF3R, o CEBPD y LCN2, o CEBPD y TNFAIP6, o CEBPD y HP, o CEBPD y ORM1, o CEBPD y CEACAM1, o CEBPD y PRTN3, o IL1R2 y LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa), o IL1R2 y S100A12, o IL1R2 e ITGAM, o IL1R2 y FCGR1A, o IL1R2 e IFITM3, o IL1R2 y CSF3R, o IL1R2 y LCN2, o IL1R2 y TNFAIP6, o IL1R2 y HP, o IL1R2 y ORM1, o IL1R2 y CEACAM1, o IL1R2 y PRTN3, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y S100A12, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) e ITGAM, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y FCGR1A, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) e IFITM3, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y CSF3R, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y LCN2, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y TNFAIP6, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y HP, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y ORM1, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y CEACAM1, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y PRTN3, o S100A12 e ITGAM, o S100A12 y FCGR1A, o S100A12 e IFITM3, o S100A12 y CSF3R, o S100A12 y LCN2, o S100A12 y TNFAIP6, o S100A12 y HP, o S100A12 y ORM1, o S100A12 y CEACAM1, o S100A12 y PRTN3, o ITGAM y FCGR1A, o ITGAM e IFITM3, o ITGAM y CSF3R, o ITGAM y LCN2, o ITGAM y TNFAIP6, o ITGAM y HP, o ITGAM y ORM1, o ITGAM y CEACAM1, o ITGAM y PRTN3, o FCGR1A e IFITM3, o FCGR1A y CSF3R, o FCGR1A y LCN2, o FCGR1A y TNFAIP6, o FCGR1A y HP, o FCGR1A y ORM1, o FCGR1A y CEACAM1, o FCGR1A y PRTN3, o IFITM3 y CSF3R, o IFITM3 y LCN2, o IFITM3 y TNFAIP6, o IFITM3 y HP, o IFITM3 y ORM1, o IFITM3 y CEACAM1, o IFITM3 y PRTN3, o CSF3R y LCN2, o CSF3R y TNFAIP6, o CSF3R y HP, o CSF3R y ORM1, o CSF3R y CEACAM1, o CSF3R y PRTN3, o LCN2 y TNFAIP6, o LCN2 y HP, o LCN2 y ORM1, o LCN2 y CEACAM1, o LCN2 y PRTN3, o TNFAIP6 y HP, o TNFAIP6 y ORM1, o TNFAIP6 y CEACAM1, o TNFAIP6 y PRTN3, o HP y ORM1, o HP y CEACAM1, o HP y PRTN3, o ORM1 y CEACAM1, o ORM1 y PRTN3, o CEACAM1 y PRTN3; o IL1RN y LRRN3, o IL1RN y GRAP, o IL1RN y TRAJ17, o IL1RN y CD3D, o IL1RN y CD247, o IL1RN y ITM2A, o IL1RN y LIME1, o IL1RN y HLA-DMB, o IL1RN y CD7, o IL1RN y MAL, o IL1RN y TRBV28, o IL1RN y RPS29, o BASP1 y LRRN3, o BASP1 y GRAP, o BP1 y TRAJ17, o BASP1 y CD3D, o BASP1 y CD247, o BASP1 y ITM2A, o BASP1 y LIME1, o BASP1 y HLA-DMB, o BASP1 y CD7, o BASP1 y MAL, o BASP1 y TRBV28, o BASP1 y RPS29, o PSTPIP2 y LRRN3, o PSTPIP2 y GRAP, o PSTPIP2 y TRAJ17, o PSTPIP2 y CD3D, o PSTPIP2 y CD247, o PSTPIP2 e ITM2A, o PSTPIP2 y LIME1, o PSTPIP2 y HLA-DMB, o PSTPIP2 y CD7, o PSTPIP2 y MAL, o PSTPIP2 y TRBV28, o PSTPIP2 y RPS29, o CKAP4 y LRRN3, o CKAP4 y GRAP, o CKAP4 y TRAJ17, o CKAP4 y CD3D, o CKAP4 y CD247, o CKAP4 y ITM2A, o CKAP4 y LIME1, o CKAP4 y HLA-DMB, o CKAP4 y CD7, o CKAP4 y MAL, o CKAP4 y TRBV28, o CKAP4 y RPS29, o DYSF y LRRN3, o DYSF y GRAP, o DYSF y TRAJ17, o DYSF y CD3D, o DYSF y CD247, o DYSF y ITM2A, o DYSF y LIME1, o DYSF y HLA-DMB, o DYSF y CD7, o DYSF y MAL, o DYSF y TRBV28, o DYSF y RPS29, o C19orf59 y LRRN3, o C19orf59 y GRAP, o C19orf59 y TRAJ17, o C19orf59 y CD3D, o C19orf59 y CD247, o C19orf59 y ITM2A, o C19orf59 y LIME1, o C19orf59 y HLA-DMB, o C19orf59 y CD7, o C19orf59 y MAL, o C19orf59 y TRBV28, o C19orf59 y RPS29, o IL18R1 y LRRN3, o IL18R1 y GRAP, o IL18R1 y TRAJ17, o IL18R1 y CD3D, o IL18R1 y CD247, o IL18R1 e ITM2A, o IL18R1 y LIME1, o IL18R1 y HLA-DMB, o IL18R1 y CD7, o IL18R1 y MAL, o IL18R1 y TRBV28, o IL18R1 y RPS29, o MMP9 y LRRN3, o MMP9 y GRAP, o MMP9 y TRAJ17, o MMP9 y CD3D, o MMP9 y CD247, o MMP9 e ITM2A, o MMP9 y LIME1, o MP9 y HLA-DMB, o MMP9 y CD7, o MMP9 y MAL, o MMP9 y TRBV28, o MMP9 y RPS29, o FGR y LRRN3, o FGR y GRAP, o FGR y TRAJ17, o FGR y CD3D, o FGR y CD247, o FGR e ITM2A, o FGR y LIME1, o FGR y HLA-DMB, o FGR y CD7, o FGR y MAL, o FGR y TRBV28, o FGR y RPS29, o SPI1 y LRRN3, o SPI1 y GRAP, o SPI1 y TRAJ17, o SPI1 y CD3D, o SPI1 y CD247, o SPI1 e ITM2A, o SPI1 y LIME1, o SPI1 y HLA-DMB, o SPI1 y CD7, o SPI1 y MAL, o SPI1 y TRBV28, o SPI1 y RPS29, o PGLYRP1 y LRRN3, o PGLYRP1 y GRAP, o PGLYRP1 y TRAJ17, o PGLYRP1 y CD3D, o PGLYRP1 y CD247, o PGLYRP1 e ITM2A, o PGLYRP1 y LIME1, o PGLYRP1 y HLA-DMB, o PGLYRP1 y CD7, o PGLYRP1 y MAL, o PGLYRP1 y TRBV28, o PGLYRP1 y RPS29, o RNF24 y LRRN3, o RNF24 y GRAP, o RNF24 y TRAJ17, o RNF24 y CD3D, o RNF24 y CD247, o RNF24 e ITM2A, o RNF24 y LIME1, o RNF24 y HLA-DMB, o RNF24 y CD7, o RNF24 y MAL, o RNF24 y TRBV28, o RNF24 y RPS29, o ANKRD22 y LRRN3, o ANKRD22 y GRAP, o ANKRD22 y TRAJ17, o ANKRD22 y CD3D, o ANKRD22 y CD247, o ANKRD22 e ITM2A, o ANKRD22 y LIME1, o ANKRD22 y HLA-DMB, o ANKRD22 y CD7, o ANKRD22 y MAL, o ANKRD22 y TRBV28, o ANKRD22 y RPS29, o CEBPD y LRRN3, o CEBPD y GRAP, o CEBPD y TRAJ17, o CEBPD y CD3D, o CEBPD y CD247, o CEBPD e ITM2A, o CEBPD y LIME1, o CEBPD y HLA-DMB, o CEBPD y CD7, o CEBPD y MAL, o CEBPD y TRBV28, o CEBPD y RPS29, o IL1R2 y LRRN3, o IL1R2 y GRAP, o IL1R2 y TRAJ17, o IL1R2 y CD3D, o IL1R2 y CD247, o IL1R2 y ITM2A, o IL1R2 y LIME1, o IL1R2 y HLA-DMB, o IL1R2 y CD7, o IL1R2 y MAL, o IL1R2 y TRBV28, o IL1R2 y RPS29, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y LRRN3, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y GRAP, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y TRAJ17, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y CD3D, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y CD247, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) e ITM2A, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y LIME1, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y HLA-DMB, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y CD7, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y MAL, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y TRBV28, o LOC729021 (SRCAP-tipo helicasa) y RPS29, o S100A12 y LRRN3, o S100A12 y GRAP, o S100A12 y TRAJ17, o S100A12 y CD3D, o S100A12 y CD247, o S100A12 e ITM2A, o S100A12 y LIME1, o S100A12 y HLA-DMB, oS100A12 y CD7, o S100A12 y MAL, o S100A12 y TRBV28, o S100A12 y RPS29, o ITGAM y LRRN3, o ITGAM y GRAP, o ITGAM y TRAJ17, o ITGAM y CD3D, o ITGAM y CD247, o ITGAM e ITM2A, o ITGAM y LIME1, o ITGAM y HLA-DMB, o ITGAM y CD7, o ITGAM y MAL, o ITGAM y TRBV28, o ITGAM y RPS29, o FCGR1A y LRRN3, o FCGR1A y GRAP, o FCGR1A y TRAJ17, o FCGR1A y CD3D, o FCGR1A y CD247, o FCGR1A y ITM2A, o FCGR1A y LIME1, o FCGR1A y HLA-DMB, o FCGR1A y CD7, o FCGR1A y MAL, o FCGR1A y TRBV28, o FCGR1A y RPS29, o IFITM3 y LRRN3, o IFITM3 y GRAP, o IFITM3 y TRAJ17, o IFITM3 y CD3D, o IFITM3 y CD247, o IFITM3 e ITM2A, o IFITM3 y LIME1, o IFITM3 y HLA-DMB, o IFITM3 y CD7, o IFITM3 y MAL, o IFITM3 y TRBV28, o IFITM3 y RPS29, o CSF3R y LRRN3, o CSF3R y GRAP, o CSF3R y TRAJ17, o CSF3R y CD3D, o CSF3R y CD247, o CSF3R e ITM2A, o CSF3R y LIME1, o CSF3R y HLA-DMB, o CSF3R y CD7, o CSF3R y MAL, o CSF3R y TRBV28, o CSF3R y RPS29, o LCN2 y LRRN3, o LCN2 y GRAP, o LCN2 y TRAJ17, o LCN2 y CD3D, o LCN2 y CD247, o LCN2 e ITM2A, o LCN2 y LIME1, o LCN2 y HLA-DMB, o LCN2 y CD7, o LCN2 y MAL, o LCN2 y TRBV28, o LCN2 y RPS29, o TNFAIP6 y LRRN3, o TNFAIP6 y GRAP, o TNFAIP6 y TRAJ17, o TNFAIP6 y CD3D, o TNFAIP6 y CD247, o TNFAIP6 e ITM2A, o TNFAIP6 y LIME1, o TNFAIP6 y HLA-DMB, o TNFAIP6 y CD7, o TNFAIP6 y MAL, o TNFAIP6 y TRBV28, o TNFAIP6 y RPS29, o HP y LRRN3, o HP y GRAP, o HP y TRAJ17, o HP y CD3D, o HP y CD247, o HP e ITM2A, o HP y LIME1, o HP y HLA-DMB, o HP y CD7, o HP y MAL, o HP y TRBV28, o HP y RPS29, o ORM1 y LRRN3, o ORM1 y GRAP, o ORM1 y TRAJ17, o ORM1 y CD3D, o ORM1 y CD247, o ORM1 e ITM2A, o ORM1 y LIME1, o ORM1 y HLA-DMB, o ORM1 y CD7, o ORM1 y MAL, o ORM1 y TRBV28, o ORM1 y RPS29, o CEACAM1 y LRRN3, o CEACAM1 y GRAP, o CEACAM1 y TRAJ17, o CEACAM1 y CD3D, o CEACAM1 y CD247, o CEACAM1 e ITM2A, o CEACAM1 y LIME1, o CEACAM1 y HLA-DMB, o CEACAM1 y CD7, o CEACAM1 y MAL, o CEACAM1 y TRBV28, o CEACAM1 y RPS29, o PRTN3 y LRRN3, o PRTN3 y GRAP, o PRTN3 y TRAJ17, o PRTN3 y CD3D, o PRTN3 y CD247, o PRTN3 e ITM2A, o PRTN3 y LIME1, o PRTN3 y HLA-DMB, o PRTN3 y CD7, o PRTN3 y MAL, o PRTN3 y TRBV28, o PRTN3 y RPS29; o LRRN3 y GRAP, o LRRN3 y TRAJ17, o LRRN3 y CD3D, o LRRN3 y CD247, o LRRN3 e ITM2A, o LRRN3 y LIME1, o LRRN3 y HLA-DMB, o LRRN3 y CD7, o LRRN3 y MAL, o LRRN3 y TRBV28, o LRRN3 y RPS29, o GRAP y TRAJ17, o GRAP y CD3D, o GRAP y CD247, o GRAP e ITM2A, o GRAP y LIME1, o GRAP y HLA-DMB, o GRAP y CD7, o GRAP y MAL, o GRAP y TRBV28, o GRAP y RPS29, o TRAJ17 y CD3D, o TRAJ17 y CD247, o TRAJ17 e ITM2A, o TRAJ17 y LIME1, o TRAJ17 y HLA-DMB, o TRAJ17 y CD7, oTRAJ17y MAL, o TRAJ17 y TRBV28, o TRAJ17 y RPS29, o CD3D y CD247, o CD3D e ITM2A, o CD3D y LIME1, o CD3D y HLA-DMB, o CD3D y CD7, o CD3D y MAL, o CD3D y TRBV28, o CD3D y RPS29, o CD247 e ITM2A, o CD247 y LIME1, o CD247 y HLA-DMB, o CD247 y CD7, o CD247 y MAL, o CD247 y TRBV28, o CD247 y RPS29, o ITM2A y LIME1, o ITM2A y HLA-DMB, o ITM2A y CD7, o ITM2A y MAL, o ITM2A y TRBV28, o ITM2A y RPS29, o LIME1 y HLA-DMB, o LIME1 y CD7, o LIME1 y MAL, o LIME1 y TRBV28, o LIME1 y RPS29, o HLA-DMB y CD7, o HLA-DMB y MAL, o HLA-DMB y TRBV28, o HLA-DMB y RPS29, o CD7 y MAL, o CD7 y TRBV28, o CD7 y RPS29, o MAL y TRBV28, o MAL y RPS29, o RPS29 y TRBV28.

La presente divulgación se refiere a un método de diagnóstico de sepsis como se establece anteriormente, en donde al menos un biomarcador enumerado en la Tabla 1 se selecciona de cada uno de los grupos A, B y C. Preferentemente, los niveles de al menos un biomarcador de cada uno de los tres grupos de biomarcadores se analizarán. Preferentemente, se analizarán al menos dos biomarcadores de cada grupo. Con mayor preferencia, se analizarán al menos 3 biomarcadores de cada grupo. Adecuadamente se analizarán los niveles de todos los biomarcadores de cada uno de los tres grupos.

Tabla 1 - Biomarcadores expresados diferencialmente que conforman la red categorizada por vía

(Las secuencias para todos estos biomarcadores pueden obtenerse de NCBI RefSeq Release 38, y estas secuencias de referencia se usaron en la preparación de las matrices discutidas en el trabajo experimental a continuación).

Tabla 2 - Biomarcadores que conforman la red categorizados por vía y clasificados según la capacidad individual para diferenciar entre sepsis y no sepsis como se obtiene a través de las características operativas del receptor (ROC). Las abreviaturas son las siguientes; AUC - área bajo curva; Sens(%) - sensibilidad; Spec(%) - especificidad. Los últimos cuatro estimadores se basan en gil.

En algunas modalidades de la presente divulgación se prefiere que los biomarcadores comprendan una selección de subgrupos de los biomarcadores establecidos en los grupos A, B y C. En consecuencia:

- Los biomarcadores preferidos del grupo A se seleccionan del subgrupo A que consiste en:

MPO, HK3, STXBP2, RETN, GRNA, FPR2, y ALPL.

- Los biomarcadores preferidos del grupo B se seleccionan del subgrupo B que consiste en:

MMP9, DYSF, IL1R2, CKAP4, IL18R1, BASP1, CEBPD, FGR, y CSF3R.

- Los biomarcadores preferidos del grupo C se seleccionan del subgrupo C que consiste en:

TRAJ17, CD247, ITM2A, CD3D, MAL y TRBV28.

Estos subgrupos representan selecciones dentro de los grupos más grandes de biomarcadores, que funcionan sorprendentemente bien, y pueden usarse para proporcionar métodos de diagnóstico muy precisos.

Estos diversos subgrupos de marcadores, y varias selecciones preferidas de ellos, son particularmente preferidos para su uso en el diagnóstico de sepsis en humanos adultos, pero también pueden preferirse para diagnosticar sepsis en neonatos y niños (incluidos los lactantes). De hecho es una característica notable de la presente invención que estos biomarcadores, y particularmente aquellos dentro de los subgrupos mencionados anteriormente, tienen una amplia utilidad.

Preferentemente, se usan biomarcadores de al menos dos subgrupos (A+B, A+C o B+C), y pueden usarse adecuadamente biomarcadores de los tres subgrupos.

Preferentemente, se usan al menos cinco biomarcadores seleccionados de los subgrupos, y adecuadamente se usan al menos seis, siete u ocho biomarcadores de los subgrupos.

Cuando se usan biomarcadores de dos o más subgrupos, preferentemente, se usan al menos dos biomarcadores de cada subgrupo, y con mayor preferencia se usan al menos tres biomarcadores de cada uno de los subgrupos anteriores. En una modalidad preferida se usa al menos un marcador del subgrupo A en combinación con al menos dos biomarcadores de los subgrupos B y/o C (adecuadamente tres, cuatro, cinco o seis o más biomarcadores del subgrupo B y/o C). Con mayor preferencia al menos dos (adecuadamente tres, cuatro, cinco, seis o más) biomarcadores del subgrupo A se usan en combinación con al menos dos biomarcadores del subgrupo B y/o C.

Del subgrupo A se prefiere altamente que se usen los biomarcadores HK3 y MPO. En adición a HK3 y MPO, se usa, preferentemente, al menos uno de SLc 2a 3, STXBP2, RETN, GRINA, FPR2, ALPL GPR84, GYG1 y FfA r 2, con mayor preferencia se usa al menos uno de SLC2A3, STXBP2, RETN, GRINA, FPR2 y ALPL (adecuadamente se usan al menos dos, tres o cuatro de estos biomarcadores adicionales).

Del subgrupo B se prefiere altamente que se usen los biomarcadores MMP9, IL1R2 y DYSF. En adición a MMP9, IL1R2 y DYSF, se usa, preferentemente, al menos uno de CKAP4, IL18R1, BASP1, CEb Pd , FGR, PGLYRP1 y CSF3R, con mayor preferencia se usa al menos uno de CKAP4, IL18R1, BASP1, CEBPD, FGR y CSF3R (adecuadamente se usan al menos dos, tres o cuatro de estos biomarcadores adicionales).

Del subgrupo C se prefiere altamente que se usen los biomarcadores TRAJ17, CD247 e ITM2A. En adición a TRAJ17, CD247 e ITM2A, preferentemente, se usa al menos uno de CD3D, MAL, HLA-DMB y TRBV28, con mayor preferencia se usa al menos uno de CD3D, MAL, y TRBV28 (adecuadamente se usan al menos dos, tres o cuatro de estos biomarcadores adicionales).

Se identificaron varias combinaciones específicas de biomarcadores que dan como resultado niveles extremadamente altos de precisión (típicamente 100 % de precisión) en los datos de prueba. Por consiguiente, estas combinaciones específicas representan aspectos preferidos, particularmente con respecto al diagnóstico de sepsis en adultos, pero también en el diagnóstico de sepsis en niños (incluidos los lactantes) y neonatos.

En consecuencia:

En un aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO y SLC2A3 del grupo A, y

CD247, TRAJ17 y CD3D del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO, GYG1 y SLC2A3 del grupo A, y

CD247, TRAJ17 y CD3D del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO y SLC2A3 del grupo A, y

CD247, TRAJ17, CD3D y MAL del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO y SLC2A3 del grupo A, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y MAL del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO y SLC2A3 del grupo A, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y HLA-DMB del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO, RETN, GPR84, STXBP2, GYG1, FPR2, y FFAR2 del grupo A, y

MMP9, IL1R2, DYSF, PGLYRP1, BASP1, CKAP4 y FGR del grupo B.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

HK3, MPO, RETN, ALPL, GYG1 y GRINA del grupo A, y

MMP9, IL1R2, DYSF, BASP1, CEBPD, CKAP4 y FGR del grupo B.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

MMP9, IL1R2, DYSF, PGLYRP1, CEBPD y CKAP4 del grupo B, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y HLA-DMB del grupo C

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

MMP9, IL1R2, DYSF, BASP1, CKAP4 y FGR del grupo B, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y HLA-DMB del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

MMP9, IL1R2, DYSF, CEBPD, CKAP4, e IL18R1 del grupo B, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y HLA-DMB del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

MMP9, IL1R2, DYSF, CEBPD, CKAP4 y FGR del grupo B, y

CD247, TRAJ17, CD3D y MAL del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

MMP9, IL1R2, DYSF, CEBPD, CKAP4 y FGR del grupo B, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y MAL del grupo C.

En otro aspecto preferido los biomarcadores comprenden:

MMP9, IL1R2, DYSF, CEBPD, CKAP4 y FGR del grupo B, y

CD247, TRAJ17, TRBV28 y HLA-DMB del grupo C.

En algunos aspectos, puede preferirse que uno o más de CEACAM1, DYSF, RNF24 y HK3 no se seleccionen. En consecuencia, las variaciones sobre las combinaciones de biomarcadores mencionadas anteriormente en las que uno o más de CEACAM1, DYSF, RNF24 y HK3 se excluyan o no se seleccionen para su uso se contemplan explícitamente como modalidades de la invención.

Será evidente para el experto que las combinaciones de biomarcadores mencionadas anteriormente representan varios conjuntos de marcadores mínimos, y pueden incluirse, además, biomarcadores adicionales, seleccionados entre los grupos A, B o C o no.

La invención implica evaluar cambios en los niveles de biomarcadores, y en las modalidades preferidas este cambio es típicamente diferencialmente ascendente para marcadores de la vía inmune innata y metabólicos, pero diferencialmente descendente para la vía inmune adaptativa en sujetos con sepsis.

Para evitar dudas, debe tenerse en cuenta que la presente invención puede usarse tanto para el diagnóstico inicial de la sepsis como para la monitorización continua de la sepsis, por ejemplo, la respuesta al tratamiento.

En todo momento, se dice que los biomarcadores en la(s) muestra(s) biológica(s) del sujeto se expresan diferencialmente y son indicativos de sepsis, donde se regulan altamente positivamente o negativamente. En dependencia del biomarcador individual, la sepsis puede diagnosticarse en una muestra biológica mediante un aumento o una disminución en el nivel de expresión, escalado en relación con la media de la muestra y la varianza de la muestra, en relación con los controles no infectados o uno o más valores de referencia. Claramente, la variación en la sensibilidad de los biomarcadores individuales, el sujeto y las muestras significa que se unen diferentes niveles de confianza a cada biomarcador. Se dice que los biomarcadores de la invención se regulan altamente positivamente o negativamente cuando después de escalar los niveles de expresión de biomarcadores en relación con la media de la muestra y la varianza de la muestra, exhiben un cambio de 2 veces en comparación con los controles no infectados o uno o más valores de referencia. Preferentemente, los biomarcadores exhibirán un cambio de 3 veces o más en comparación con el valor de referencia. Con mayor preferencia, los biomarcadores de la invención exhibirán un cambio de 4 veces o más en comparación con el valor de referencia. Es decir, en el caso de un nivel de expresión aumentado (regulación positiva en relación con los valores de referencia), el nivel de biomarcador será más del doble que el valor de referencia. Preferentemente, el nivel de biomarcador será más de 3 veces el nivel del valor de referencia. Con mayor preferencia, el nivel de biomarcador será más de 4 veces el nivel del valor de referencia. Por el contrario, en el caso de un nivel de expresión disminuido (regulación negativa en relación con los valores de referencia), el nivel de biomarcador será menos de la mitad que el valor de referencia. Preferentemente, el nivel de biomarcador será inferior a un tercio del nivel del valor de referencia. Con mayor preferencia, el nivel de biomarcador será inferior a una cuarta parte del nivel del valor de referencia.

En todo momento el término "valor de referencia" puede referirse a un valor de referencia predeterminado, por ejemplo, mediante la especificación de un intervalo de confianza o valor umbral para el diagnóstico o predicción de la susceptibilidad de un sujeto a la sepsis. Alternativamente, el valor de referencia puede derivarse del nivel de expresión de un biomarcador o biomarcadores correspondientes en una muestra biológica de 'control', por ejemplo, un control positivo (infectado) o negativo (no infectado). Además, el valor de referencia puede ser un estándar o intervalo 'interno' de estándares internos, por ejemplo, una concentración conocida de una proteína, transcripto, etiqueta o compuesto. Alternativamente, el valor de referencia puede ser un control técnico interno para la calibración de valores de expresión o para validar la calidad de la muestra o las técnicas de medición. Esto puede implicar una medición de uno o varios transcriptos dentro de la muestra que se sabe que se expresan constitutivamente o se expresan a un nivel conocido (por ejemplo, un nivel invariante). En consecuencia, sería una rutina para el experto aplicar estas técnicas conocidas solas o en combinación para cuantificar el nivel del biomarcador en una muestra en relación con los estándares u otros transcriptos o proteínas o para validar la calidad de la muestra biológica, el ensayo o análisis estadístico.

Preferentemente, el sujeto es un neonato humano. Típicamente el neonato es sospechoso de tener una infección. Neonato se refiere a un lactante dentro de los primeros 28 días después del nacimiento. En algunas modalidades el neonato puede estar dentro de los primeros 14 días a partir del nacimiento, 7 días a partir del nacimiento, 3 días a partir del nacimiento o dentro de las primeras 48 horas a partir del nacimiento. Sin embargo, se anticipa que los biomarcadores serán adecuados, además, para diagnosticar sepsis en lactantes de 28 a 40 días a partir del nacimiento, de 40 a 50 días a partir del nacimiento o, alternativamente, de 50 a partir del nacimiento hasta 1 año a partir del nacimiento. Similarmente, se espera que los biomarcadores de la invención sean adecuados para el diagnóstico de sepsis en niños de 1 a 2 años después del nacimiento, de 1 a 3 años después del nacimiento o, alternativamente de 1 a 4 años después del nacimiento. Se espera, además, que los biomarcadores de la invención sean adecuados para el diagnóstico de la sepsis en neonatos, lactantes y niños de todos los orígenes y perfiles genéticos étnicos. En ciertas modalidades, el neonato, lactante o niño es de origen genético o ascendencia caucásica, asiática, africana. En una modalidad preferida, el sujeto es un neonato, lactante o niño con orígenes genéticos caucásicos. Un neonato evaluado en la presente invención puede ser de pretérmino o de término completo.

Los métodos descritos se llevan a cabo in vitro, pero se apreciará que los métodos de la invención pueden llevarse a cabo, además, in vivo.

El método se realiza en una muestra obtenida previamente, por ejemplo, una que se obtuviera previamente para otros fines clínicos.

La presente invención proporciona así un método para diagnosticar la sepsis mediante el análisis de una muestra biológica obtenida de un sujeto. Podrían usarse varios tipos diferentes de muestras biológicas, por ejemplo, una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido.

Típicamente la muestra biológica se selecciona del grupo que comprende: una muestra de sangre; una muestra de saliva; una muestra de líquido cefalorraquídeo; y una muestra de heces.

En modalidades de la presente invención en donde la muestra del paciente es una muestra de fluido corporal, pueden seleccionarse ejemplos adecuados de tal muestra del grupo que comprende: una muestra de sangre; una muestra de líquido cefalorraquídeo; una muestra de saliva, tal como un hisopado bucal; una muestra de fluido pulmonar; eritrocitos; leucocitos; y una muestra de heces.

Normalmente, la muestra biológica de la presente invención será una muestra de sangre. Preferentemente, la muestra biológica será una muestra de sangre completa.

Los métodos o dispositivos de la presente invención pueden hacer uso de una gama de muestras biológicas tomadas de un sujeto para determinar el nivel de expresión de un biomarcador.

Los métodos descritos pueden implicar, además, investigar mediciones fisiológicas seleccionadas de frecuencia cardíaca, temperatura, frecuencia respiratoria y presión sanguínea o realizar un cultivo de sangre.

Adecuadamente los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en:

la proteína biomarcadora; y la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína biomarcadora.

Se prefiere que el biomarcador sea una molécula de ácido nucleico, y se prefiere altamente que sea una molécula de ARNm.

Se prefiere que los niveles de los biomarcadores en la muestra biológica se investiguen mediante el uso de parejas de unión específicas.

Adecuadamente las parejas de unión se seleccionan del grupo que consiste en:

ácidos nucleicos complementarios; aptámeros; anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

Las clases adecuadas de parejas de unión para cualquier biomarcador dado serán evidentes para el experto.

Adecuadamente los niveles de los biomarcadores en la muestra biológica se detectan mediante evaluación directa de la unión entre las moléculas diana y las parejas de unión.

Adecuadamente los niveles de los biomarcadores en la muestra biológica se detectan mediante el uso de un resto informador unido a una pareja de unión.

Preferentemente, el resto informador se selecciona del grupo que consiste en:

fluoróforos; sustratos cromogénicos; y enzimas cromogénicas.

Parejas de unión

En ciertas modalidades de la invención, los niveles de expresión de los biomarcadores en una muestra biológica pueden investigarse mediante el uso de parejas de unión que se unen o hibridan específicamente a los biomarcadores o un fragmento de estos. En relación con la presente invención el término "parejas de unión" puede incluir cualquier ligando, que sea capaz de unirse específicamente al biomarcador relevante y/o las variantes de nucleótidos o péptidos de este con alta afinidad. Dichos ligandos incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos (ADN o ARN), proteínas, péptidos, anticuerpos, sondas de afinidad sintéticas, carbohidratos, lípidos, moléculas artificiales o pequeñas moléculas orgánicas tales como fármacos. En ciertas modalidades, las parejas de unión pueden seleccionarse del grupo que comprende: ácidos nucleicos complementarios; aptámeros; anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. En el caso de detectar ARNm, los ácidos nucleicos representan parejas de unión altamente adecuadas.

En el contexto de la presente invención, se debe considerar que una pareja de unión específica para un biomarcador requiere que la pareja de unión sea capaz de unirse a al menos uno de tales biomarcadores de manera que pueda distinguirse de la unión no específica a moléculas que no son biomarcadores. Una distinción adecuada puede, por ejemplo, basarse en diferencias distinguibles en la magnitud de tal unión.

En modalidades preferidas de los métodos o dispositivos de la invención, el biomarcador es un ácido nucleico, preferentemente, una molécula de ARNm, y la pareja de unión se selecciona del grupo que comprende:

ácidos nucleicos complementarios o aptámeros.

Adecuadamente, la pareja de unión es una molécula de ácido nucleico (típicamente ADN, pero puede ser ARN), que tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de ARNm o ADNc relevante contra la que se dirige. Tal ácido nucleico a menudo se denomina como una 'sonda' (o un informador o un oligo) y la secuencia complementaria a la que se une a menudo se denomina 'diana'. La hibridación diana-sonda generalmente se detecta y cuantifica mediante la detección de dianas marcadas con fluoróforo, plata, o quimioluminiscencia para determinar la abundancia relativa de secuencias de ácido nucleico en la diana.

Las sondas pueden tener de 25 a 1000 nucleótidos de longitud. Sin embargo, se prefieren longitudes de 30 a 100 nucleótidos, y las sondas de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud se usan comúnmente con gran éxito en el análisis completo del transcriptoma.

Si bien la determinación de sondas adecuadas puede ser difícil, por ejemplo, en matrices muy complejas, hay muchas fuentes comerciales de matrices de transcriptoma completo disponibles, y es una rutina desarrollar matrices a la medida para detectar cualquier conjunto de ARNm específico mediante el uso de información de secuencias disponible públicamente. Las fuentes comerciales de micromatrices para el análisis de transcriptomas incluyen Illumina y Affymetrix.

En una modalidad las secuencias de la sonda serán las enumeradas en la Tabla 3. Sin embargo, las secuencias de sondas de nucleótidos pueden diseñarse para cualquier región de secuencia de los transcriptos de biomarcadores (números de acceso enumerados en la Tabla 3) o una variante de estos. Las secuencias de sondas de nucleótidos, por ejemplo, pueden incluir, pero no se limitan a las enumeradas en la Tabla 3. El experto en la técnica apreciará que pueden diseñarse sondas igualmente efectivas a diferentes regiones del transcripto que a las que se dirigen las sondas enumeradas en la Tabla 3, y que la efectividad de las sondas particulares elegidas variará, entre otras cosas, de acuerdo con la plataforma usada para medir la abundancia de transcripto y las condiciones de hibridación empleadas. Por lo tanto se apreciará que las sondas dirigidas a diferentes regiones del transcripto también pueden usarse de acuerdo con la presente invención.

En otras modalidades adecuadas de la invención, el biomarcador puede ser una proteína, y la pareja de unión se selecciona del grupo que comprende:

anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o aptámeros.

Los polinucleótidos que codifican cualquiera de las parejas de unión específicas de los biomarcadores de la invención mencionados anteriormente pueden ser moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas y pueden ser moléculas de ARN o ADN.

En todo momento, el término "polinudeótido" como se usa en la presente se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma mono- o bicatenaria, o en sentido o antisentido, y abarca análogos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de manera similar a nucleótidos naturales. Tales polinucleótidos pueden derivarse de Homo sapiens o pueden ser sintéticos o pueden derivarse de cualquier otro organismo.

Comúnmente, las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos usadas como parejas de unión en la presente invención pueden aislarse o purificarse. Por "purificado" se entiende que están sustancialmente libres de otros componentes o material celular, o medio de cultivo. "Aislado" significa que también pueden estar libres de secuencias naturales que flanquean la secuencia nativa, por ejemplo, en el caso de la molécula de ácido nucleico, aislado puede significar que está libre de secuencias reguladoras 5' y 3'.

En una modalidad preferida el ácido nucleico es un ARNm. Existen numerosas técnicas adecuadas conocidas en la técnica para la medición cuantitativa de los niveles de transcriptos de ARNm en una muestra biológica dada. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a; transferencia de ARN "Northern", reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RTPCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), PCR digital (dPCR), PCR multiplex, Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR), amplificación de señal de ADN ramificado o por análisis de alto rendimiento tales como micromatrices de hibridación, secuenciación de próxima generación (NGS) o por cuantificación directa de ARNm, por ejemplo, por secuenciación "Nanopore". Alternativamente, pueden usarse tecnologías "basadas en etiquetas", que incluyen pero no se limitan al análisis en serie de la expresión génica (SAGE). Comúnmente, los niveles de transcriptos de ARNm de biomarcadores en una muestra biológica dada pueden determinarse por hibridación con sondas de nucleótidos complementarias específicas en una micromatriz de hibridación o "chip", por la tecnología de micromatrices de matriz de perlas o por ARN-Seq donde los datos de secuencia coinciden con una genoma de referencia o secuencias de referencia.

En una modalidad preferida, donde el ácido nucleico es ARNm, la presente invención proporciona un método de diagnóstico de sepsis, en donde los niveles de transcripto(s) de biomarcadores se determinarán por PCR. Preferentemente, la abundancia del transcripto de ARNm se determinará por qPCR, dPCR o PCR multiplex. Con mayor preferencia, la abundancia de transcripto se determinará por PCR multiplex. Las secuencias de cebadores de nucleótidos pueden diseñarse para cualquier región de secuencia de los transcriptos de biomarcadores (números de acceso enumerados en la Tabla 3) o una variante de estos. El experto en la técnica apreciará que pueden diseñarse cebadores igualmente efectivos para diferentes regiones del transcripto o ADNc de biomarcadores enumerados en la Tabla 3, y que la efectividad de los cebadores particulares elegidos variará, entre otras cosas, de acuerdo con la plataforma usada para medir la abundancia de transcripto, la muestra biológica y las condiciones de hibridación empleadas. Por lo tanto se apreciará que los cebadores que se dirigen a diferentes regiones del transcripto también pueden usarse de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, el experto en la técnica reconocerá que al diseñar secuencias de cebadores apropiadas para detectar la expresión de biomarcadores, se requiere que las secuencias de cebadores sean capaces de unirse selectivamente y específicamente a las secuencias de ADNc de biomarcadores correspondientes a los números de acceso de nucleótidos enumerados en la Tabla 3 o fragmentos o variantes de estos.

Tabla 3 Números de acceso y secuencias de sondas usados en el estudio actual. La anotación de las listas de genes se obtuvo del sitio web Clone/Gene ID Converter (http://idconverter.bioinfo.cnio.es/IDconverter.php) y se usó Unigene Build Hs # 210. Para los 2 genes sin ID de Unigene (TRAJ17 y TRBV28) se suministran ID de Entrez Gene (las entradas de Entrez Gene se actualizaron por última vez el 02/04/2014 (TRAJ17) y el 06/02/2014 (TRBV28) respectivamente).

Muchas técnicas diferentes conocidas en la técnica son adecuadas para detectar la unión de la secuencia diana y para el cribado y análisis de alto rendimiento de las interacciones proteicas. De acuerdo con la presente invención, las técnicas apropiadas incluyen (independientemente o en combinación), pero no se limitan a coinmunoprecipitación, complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), sistema de vector único basado en recombinasa de doble expresión (DERB), electroforesis de afinidad, ensayos de pull-down, transferencia de etiquetas, pantallas de dos híbridos de levadura, exhibición en fagos, reticulación in vivo, purificación por afinidad en tándem (TAP), ensayos de ChIP, reticulación química seguida de espectrometría de masas MALDI de alta masa, experimento de interacción estrepproteína (SPINE), inmunoprecipitación cuantitativa combinada con noqueo (QUICK), ensayo de ligamiento de proximidad (PLA), interferometría de biocapa, interferometría de polarización dual (DPI), dispersión de luz estática (SLS), dispersión de luz dinámica (DLS), resonancia de plasmón superficial (SPR), espectroscopía de correlación de fluorescencia, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), calorimetría de titulación isotérmica (ITC), termoforesis en microescala (MST), ensayo de inmunoprecipitación de cromatina, ensayo de cambio de movilidad electroforética, ensayo pull-down, ensayo de captura y detección en microplacas, ensayo de informador, ensayo de protección de RNasa, coubicación FISH/ISH, micromatrices, matrices de microesferas o detección basada en nanocables de silicio (SiNW). Cuando se deben cuantificar los niveles de proteína biomarcadora, preferentemente, las interacciones entre la pareja de unión y la proteína del biomarcador se analizarán mediante el uso de anticuerpos con un informador fluorescente unido.

En ciertas modalidades de la invención, el nivel de expresión de un biomarcador particular puede detectarse mediante evaluación directa de la unión del biomarcador a su pareja de unión. Los ejemplos adecuados de tales métodos de acuerdo con esta modalidad de la invención pueden utilizar técnicas tales como la espectroscopía de electroimpedancia (EIS) para evaluar directamente la unión de las parejas de unión (por ejemplo, anticuerpos) a biomarcadores diana (por ejemplo, proteínas biomarcadoras).

En ciertas modalidades de la presente invención, la pareja de unión puede ser un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, y la detección de las moléculas diana utiliza un método inmunológico. En ciertas modalidades de los métodos o dispositivos, el método inmunológico puede ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o utilizar un dispositivo de flujo lateral.

Un método de la invención puede comprender, además, la cuantificación de la cantidad de moléculas diana indicativas de la expresión de los biomarcadores que está presente en la muestra del paciente. Los métodos adecuados de la invención, en los que se cuantifica la cantidad de la molécula diana presente, y se conoce el volumen de la muestra del paciente, pueden comprender, además, la determinación de la concentración de las moléculas diana presentes en la muestra del paciente que puede usarse como la base de una evaluación cualitativa de la condición del paciente, que a su vez puede usarse para sugerir un curso de tratamiento adecuado para el paciente.

Restos informadores

En modalidades preferidas de la presente invención pueden determinarse los niveles de expresión de la proteína en una muestra biológica. En algunos casos, puede ser posible determinar directamente la expresión, por ejemplo, como con GFP o por acción enzimática de la proteína de interés (POI) para generar una señal óptica detectable. Sin embargo, en algunos casos puede elegirse determinar la expresión física, por ejemplo, mediante sondeo con anticuerpos, y confiar en pruebas separadas para verificar que la expresión física se acompañe por la función requerida.

En modalidades preferidas de la invención, los niveles de expresión de un biomarcador particular serán detectables en una muestra biológica mediante un método de cribado de alto rendimiento, por ejemplo, basado en la detección de una señal óptica, por ejemplo, mediante el uso de restos informadores. Para este propósito, puede ser necesario que la pareja de unión específica incorpore una etiqueta, o se etiquete con una etiqueta removible, que permita la detección de la expresión. Tal etiqueta puede ser, por ejemplo, una molécula informadora de fluorescencia fusionada traduccionalmente a la proteína de interés (POI), por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente cian (CFP) o mCherry. Tal etiqueta puede proporcionar un marcador adecuado para la visualización de la expresión de biomarcadores, ya que su expresión puede analizarse simple y directamente mediante medición de fluorescencia in vitro o en una matriz.

Alternativamente, puede ser una enzima que puede usarse para generar una señal óptica. Las etiquetas usadas para la detección de la expresión pueden ser, además, etiquetas de péptido antigénico. Similarmente, los restos informadores pueden seleccionarse del grupo que consiste en fluoróforos; sustratos cromogénicos; y enzimas cromogénicas. Pueden usarse otros tipos de etiqueta para marcar una pareja de unión de ácido nucleico, incluidas moléculas de colorante orgánico, radioetiquetas y etiquetas de rotación que pueden ser moléculas pequeñas.

Preferentemente, los niveles de un biomarcador o varios biomarcadores se cuantificarán mediante la medición de la hibridación específica de una sonda de nucleótidos complementaria con el biomarcador de interés en condiciones de alta rigurosidad o muy alta rigurosidad.

Preferentemente, la hibridación sonda-biomarcador se detectará y cuantificará mediante la detección de sondas marcadas con fluoróforo, plata, o quimioluminiscencia para determinar la abundancia relativa de secuencias de ácido nucleico de biomarcadores en la muestra. Alternativamente, los niveles de abundancia de transcriptos de ARNm de biomarcadores pueden determinarse directamente mediante tecnologías de secuenciación de ARN o secuenciación de nanoporos.

Los métodos o dispositivos de la invención pueden hacer uso de moléculas seleccionadas del grupo que consiste en: la proteína biomarcadora; y ácido nucleico que codifica la proteína biomarcadora.

Nucleótidos y condiciones de hibridación

En todo momento, el término "polinucleótido" como se usa en la presente se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma mono- o bicatenaria, o en sentido o antisentido, y abarca análogos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de manera similar a nucleótidos naturales.

Se proporcionan secuencias de sonda ejemplares en la Tabla 3, aunque se apreciará que pueden funcionar variaciones menores en estas secuencias. El experto en la técnica consideraría rutinario diseñar secuencias de sonda de nucleótidos que puedan diseñarse para cualquier región de secuencia de los transcriptos de biomarcadores (números de acceso enumerados en la Tabla 3) o una variante de estos. Este es también el caso con los cebadores de nucleótidos usados donde la detección de los niveles de expresión se determina mediante tecnología basada en PCR. Las secuencias de sondas de nucleótidos, por ejemplo, pueden incluir, pero no se limitan a las enumeradas en la Tabla 3. El experto en la técnica apreciará que las sondas igualmente efectivas (y en algunos casos más beneficiosas) pueden diseñarse a diferentes regiones del transcripto que las que van dirigidas las sondas enumeradas en la Tabla 3, y que la efectividad de las sondas particulares elegidas varían, entre otras cosas, de acuerdo con la plataforma usada para medir la abundancia del transcripto y las condiciones de hibridación empleadas. Por lo tanto se apreciará que las sondas dirigidas a diferentes regiones del transcripto también pueden usarse de acuerdo con la presente invención.

Por supuesto, el experto en la técnica reconocerá que al diseñar secuencias de sondas apropiadas para detectar la expresión de biomarcadores, se requiere que las secuencias de sondas sean capaces de unirse selectivamente y específicamente a los transcriptos o secuencias de ADNc de los biomarcadores correspondientes a los números de acceso a nucleótidos enumerados en la Tabla 3 o fragmentos o variantes de estos. Por lo tanto la secuencia de la sonda será hibridable con esa secuencia de nucleótidos, preferentemente, en condiciones rigurosas, con mayor preferencia en condiciones de muy alta rigurosidad. El término "condiciones rigurosas" puede entenderse que describe un conjunto de condiciones para hibridación y lavado y una variedad de condiciones de hibridación rigurosas serán familiares para el lector experto. La hibridación de una molécula de ácido nucleico ocurre cuando dos moléculas de ácido nucleico complementarias experimentan una cantidad de enlaces de hidrógeno entre sí conocida como emparejamiento de bases de Watson-Crick. La rigurosidad de la hibridación puede variar de acuerdo con las condiciones ambientales (es decir, químicas/físicas/biológicas) que rodean los ácidos nucleicos, temperatura, la naturaleza del método de hibridación, y la composición y longitud de las moléculas de ácido nucleico usadas. Los cálculos relativos a las condiciones de hibridación requeridas para alcanzar grados particulares de rigurosidad se discuten en Sambrook y otros. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny ); y Tijssen (1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2, Elsevier, NY). La Tm es la temperatura a la cual el 50 % de una cadena dada de una molécula de ácido nucleico se hibrida con su cadena complementaria.

En cualquiera de las referencias en la presente a las condiciones de hibridación, las siguientes son ejemplares y no limitantes:

Muy alta rigurosidad (permite que las secuencias que comparten al menos 90 % de identidad se hibriden)

Hibridación: SSC 5 x a 65 °C por 16 horas

Lavar dos veces: SSC 2 x a temperatura ambiente (RT) por 15 minutos cada vez

Lavar dos veces: SSC 0,5 x a 65 °C por 20 minutos cada vez

Alta rigurosidad (permite que las secuencias que comparten al menos un 80 % de identidad se hibriden)

Hibridación: SSC 5 x-6 x a 65 °C-70 °C por 16-20 horas

Lavar dos veces: SSC 2 x a RT por 5-20 minutos cada vez

Lavar dos veces: SSC 1 x a 55 °C-70 °C por 30 minutos cada vez

Baja rigurosidad (permite que las secuencias que comparten al menos un 50 % de identidad se hibriden)

Hibridación: SSC 6 x a RT hasta 55 °C por 16-20 horas

Lavar al menos dos veces: SSC 2 x-3 x a RT hasta 55 °C por 20-30 minutos cada vez

Kits y dispositivos de diagnóstico

Se divulga un dispositivo para su uso en el diagnóstico de sepsis, el dispositivo comprende:

a) un área de carga para la recepción de una muestra biológica;

b) parejas de unión específicas para moléculas diana indicativas de la expresión de dos o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, en donde al menos un biomarcadorse selecciona de donde los biomarcadores se seleccionan de cualquiera de los grupos A, B o C; y

c) medios de detección para detectar los niveles de dicho biomarcador presente en la muestra. Adecuadamente el dispositivo comprende parejas de unión específicas a los biomarcadores que se amplifican. Una variedad de tecnologías adecuadas basadas en la amplificación por PCR se conocen bien en la técnica.

Las parejas de unión son, preferentemente, cebadores de ácido nucleico adaptados para unirse específicamente a los transcritos de ADNc de biomarcadores, como se discutió anteriormente.

Los medios de detección comprenden adecuadamente medios para detectar una señal de un resto informador, por ejemplo, un resto informador como se discutió anteriormente.

El dispositivo se adapta para detectar y cuantificar los niveles de dichos biomarcadores presentes en la muestra biológica.

Se divulga un kit de partes para determinar selectivamente, en una muestra, los niveles de dos o más biomarcadores para sepsis, en donde el kit comprende:

a) al menos una pareja de unión que se une selectivamente al(los) biomarcador(es) seleccionado(s) del grupo A de la Tabla 1 o un fragmento de estos;

b) al menos una pareja de unión que se une selectivamente a al(los) biomarcador(es) seleccionado(s) del grupo B y/o el grupo C de la Tabla 1, o un fragmento de estos;

c) un control positivo para la detección de dichos biomarcadores;

d) al menos una pareja de unión que se une selectivamente a un ácido nucleico que opera como control interno; y e) opcionalmente un estándar interno.

Las aplicaciones de PCR son rutinarias en la técnica y el experto podrá seleccionar las polimerasas, tampones, restos informadores y condiciones de reacción apropiados.

Las parejas de unión son, preferentemente, cebadores de ácido nucleico adaptados para unirse específicamente a los transcritos de ADNc de biomarcadores, como se discutió anteriormente. Preferentemente, se proporcionarán cebadores que se dirigen específicamente a los siguientes biomarcadores:

Breve descripción de las figuras

Las modalidades de la invención se describen adicionalmente a continuación y con referencia a figuras y ejemplos específicos en los cuales:

La Figura 1 muestra los datos demográficos de las muestras usadas, los microorganismos identificados de los grupos infectados y las razones para tomar muestras de sangre en los grupos de control. A. Demografía de las muestras usadas. Los detalles de la muestra de pacientes se muestran mediante la presentación de la demografía de la población estudiada. B. Microorganismos aislados de grupos infectados. Se muestran los organismos detectados para cada lactante infectado: estas muestras se tomaron en el transcurso de las 6 horas posteriores a la sospecha clínica de infección. C. Razones para tomar muestras de sangre en el grupo de control. Se muestran los motivos del muestreo clínico de sangre en el grupo de control: todas las pruebas de cribado en estos lactantes fueron normales.

La Figura 2 muestra los cálculos de potencia para el uso de muestras de ARN de sangre entera de lactante en el perfilado de expresión en micromatrices. Tamaño de la muestra (eje X) para obtener una potencia del 90 % para una relación dada de genes en la matriz (eje Y), a p <0,01. Se usaron datos de perfil de expresión en micromatrices de un conjunto de 30 muestras de lactantes de Gambia prevacunados de 9 meses de control para realizar los cálculos de potencia.

La Figura 3 muestra el reclutamiento del estudio y el procesamiento de muestras. El diagrama de flujo muestra el proceso de reclutamiento de sujetos neonatales, procesamiento de muestras e hibridación en micromatrices. Los cuadros y las flechas se codifican por colores de la siguiente manera. Muestras de neonatos de control sanas (que se presentan por otras razones clínicas distintas de la sospecha de infección) = gris claro; muestras de neonatos de infecciones sospechosas pero no confirmadas = gris claro; muestras de neonatos con prueba de hemocultivo infección confirmada = gris oscuro; muestras de neonatos con prueba negativa de hemocultivo pero infección viral confirmada = rayado.

La Figura 4 muestra una secuencia de análisis de estudio antes de validar el conjunto de 52 genes como clasificador. Este diagrama de flujo identifica la secuencia de análisis realizados en los datos de micromatrices Illumina. Los recuadros punteados indican figuras manuscritas que son la representación principal de un proceso o análisis dado. El cuadro rojo indica que los análisis dentro se usan en combinación para informar un resultado posterior.

La Figura 5 muestra el entrenamiento y comprobación del clasificador de 52 genes de sepsis en neonatos. Este diagrama detalla las etapas que comprenden la capacitación y las pruebas del clasificador basado en ROC. El recuadro superior representa procesos en el entrenamiento del clasificador; el recuadro inferior representa los procesos en la comprobación del clasificador en varios tipos de conjuntos de prueba. LOOCV significa Validación cruzada y dejar uno fuera (del inglés Leave-One-Out-Out-Cross-Validation), que es el proceso iterativo en el que se predice una sola muestra del conjunto de entrenamiento basado en el clasificador entrenado en todas las muestras restantes. Las flechas negras son etapas de procesamiento de datos; las flechas rojas indican el entrenamiento del clasificador y las etapas de predicción. Codificación de color de la muestra: muestras de neonatos de control sanos (que se presentan por otras razones clínicas distintas de la sospecha de infección) = gris claro; muestras de neonatos de infecciones sospechosas pero no confirmadas = gris claro; muestras de neonatos con infección confirmada por prueba de hemocultivo = gris oscuro; muestras de neonatos con prueba negativa de hemocultivo pero infección viral confirmada = rayado.

La Figura 6 muestra un análisis de componentes principales de muestras de pacientes infectados y de control antes y después del filtrado estadístico de datos. (a) Los pacientes infectados (círculos huecos) y de control (círculos) se separan en gran medida en dos grupos distintos en un enfoque no supervisado por los 3 componentes principales que representan el 37,6 % de la variación en los datos. (b) Después del filtrado estadístico (adj.p <0,0l, cambio de veces >2) las muestras de pacientes se dividen en 2 grupos principales y uno menor representados por 3 componentes principales que representan el 87,6 % de la variación. El grupo menor que comprende 6 muestras de control y 1 muestra infectada (la muestra de infección viral única en el conjunto de datos) se distingue de los principales grupos infectados y de control. Este grupo de pacientes se identifica, además, por análisis de agrupamiento jerárquico en la Figura 1 b.

La Figura 7 muestra el análisis de correlación de la expresión de STAT1 y CXCL10 en neonatos de control e infectados. Los niveles de expresión Log2 de STAT1 y CXCL10 se trazan en neonatos de control (triángulos) e infectados (círculos) y se determina la correlación de expresión. La expresión se correlaciona pobremente en las muestras de control pero se correlacionan altamente en un subconjunto de muestras infectadas.

La Figura 8 muestra el análisis de la expresión génica de los módulos de la vía inmune y metabólica. Expresión génica de moléculas asociadas con (a) metabolismo de esteroles, (b) transporte de glucosa, (c) vía glicolítica, (d) señalización del receptor de células T, (e) variantes del receptor de células T y (f) marcadores inhibidores inmunes. Los gráficos de líneas muestran la expresión génica como gráficos de densidad de probabilidad para muestras de control (azul) e infección bacteriana (rojo). Los gráficos marcados con asteriscos indican que la diferencia de expresión media entre los dos grupos de estudio es estadísticamente significativa (**p<0,01, ***p<0,001).

La Figura 9 es un mapa de calor que muestra 30 muestras de lactantes de sospecha de infección basado en las 46 sondas que eran comunes entre el conjunto de genes clasificadores y la plataforma CodeLink.

La Figura 10 muestra la agrupación jerárquica de muestras de pacientes infectados y de control. (a) resultados del análisis no supervisado de datos normalizados antes de las pruebas estadísticas. En esta etapa la condición de si las muestras estaban infectadas o no se incluyó en el análisis. Control - no lleno, infectado - lleno. El panel (b) es un mapa de calor que muestra la agrupación jerárquica de muestras de lactantes basadas en las 824 sondas que se expresaron estadísticamente de forma diferencial entre los grupos infectados y de control (adj.p <0,01, cambio de veces absoluto >2). La agrupación jerárquica se basó en la distancia euclidiana. Tres grupos de genes se etiquetaron (1-3). Los genes del grupo 3 (resaltados con recuadro) se excluyeron del análisis adicional para la derivación de un clasificador de infección bacteriana neonatal debido a que no existe una separación clara entre infectados y controles. Control - azul, infectado -rojo.

La Figura 11 muestra el clasificador de red dual de 52 genes de infección bacteriana neonatal compuesta por las vías inmunes innatas, metabólicas e inmunitarias adaptativas. El panel (a) muestra un gráfico de líneas de valores de expresión normalizados por gen mediante el uso del clasificador de red dual de 52 genes de infección bacteriana neonatal con el orden de la muestra determinado mediante el uso del agrupamiento jerárquico basado en la distancia euclidiana. Gráficos lineales de valores de expresión normalizados por gen mediante el uso de genes asociados con (b) inmune innata, (c) metabólico (d) inmune adaptativo y (e) combinación de las tres vías presentes en el clasificador de red dual de 52 genes de infección bacteriana neonatal. Para las muestras en el eje x, control = gris oscuro (hacia la izquierda), infectado por bacterias = gris claro (hacia la derecha) de la 11b a la 11e.

La Figura 12 muestra las respuestas inmunitarias diferenciales adaptativas e innatas a la infección neonatal. El panel (a) muestra el cambio en la expresión de los genes de respuesta inmune adaptativa después de la infección neonatal. El panel (b) muestra el cambio de veces en la expresión de genes de la respuesta inmune innata después de una infección neonatal. El panel (c) muestra el cambio de veces en la expresión de genes asociados con células supresoras derivadas de mieloides después de la infección neonatal. La importancia se indica mediante valores p ajustados para el cambio de veces de cada sonda. El panel (d) muestra los conteos de células de neutrófilos de pacientes control e infectados. Los conteos de células de neutrófilos se examinaron en pacientes control (n = 12) e infectados (n = 28) y se expresan como números x106 células por ml de sangre con la gráfica que presenta valores medios ± desviación absoluta media. La prueba de significación entre las condiciones se realizó mediante una prueba ANOVA de una vía - * indica significancia en p <0,0005. Los paneles (e y f) muestran un análisis de enriquecimiento de tipo celular. Gráficos de volcanes de perfiles de expresión asociados con tipos y clases particulares de células sanguíneas. El cambio de veces log²está en el eje x y valor de p ajustado -log²en el eje y. Los paneles en (e) muestran perfiles de expresión para células linfoides y mieloides.

Los paneles en (f) muestran perfiles de expresión para células B, células T, células NK, células, neutrófilos, monocitos y células dendríticas. Las sondas significativamente expresadas diferencialmente con (adj.p <0,01) se muestran en gris. La Figura 13 muestra redes de interacciones moleculares directas apoyadas experimentalmente entre genes regulados diferencialmente en la sepsis neonatal. (a) Las relaciones de red derivadas de InnateDB se visualizaron con Cytoscape. (i) Red de interacciones moleculares directas entre genes sobrerregulados en pacientes con sepsis neonatal, sus productos codificados y todas las demás moléculas que interactúan. La inclusión de parejas interactivas no expresadas diferencialmente (mostradas en gris) en esta red permite la identificación potencial de nodos reguladores importantes (genes/proteínas) que no son evidentes solo a partir de datos de micromatrices (por ejemplo, nodosexpresados constitutivamente/nodos expresados en un punto de tiempo no muestreado en el estudio). (ii) Los 5 principales nodos centrales identificados por el algoritmo de Grado del complemento cytoHubba se etiquetan. Los tamaños de los nodos se definen por el grado del nodo: cuanto mayor es el tamaño del nodo, mayor es el grado. Los nodos codificados por genes regulados por aumento se muestran en gris oscuro, los 20 centros principales identificados por este análisis fueron STAT1, STAT3, NFKBIA, TNFRF1, CEBPB, SPI1, LYN, BCL6, PRKCD, HCK, MYD88, HSPA1B, UBA1, CEBPD, JUNB, IRF7, TNFAIP3, CTNNA1, ETS2 y GNAI2. (iii) La subred regulada positivamente de mayor puntuación identificada por el complemento jActiveModules. Los nodos que representan señales de ARN reguladas positivamente se muestran en gris oscuro; genes no expresados diferencialmente en gris claro. (b) Red de interacciones moleculares directamente entre genes regulados positivamente en pacientes con sepsis neonatal visualizados con el complemento Cerebral v.2. Los nodos codificados por genes regulados positivamente se muestran en rojo; no se muestran parejas de interacciones expresadas de manera no diferencial. (c) Red de interacciones moleculares directamente entre genes regulados negativamente en pacientes con sepsis neonatal visualizados con el complemento Cerebral v.2. Los nodos codificados por genes regulados negativamente se muestran en verde; no se muestran las parejas de interacción expresadas de forma no diferencial.

La Figura 14 muestra vías reguladoras metabólicas inmunes. Los paneles (a)-(c) muestran un análisis de correlación de la expresión del gen FFAR2 con el conteo de neutrófilos, la expresión del gen STAT3 y FCN1 (m-Ficolin) en el control (triángulos) y la infección bacteriana (círculos). Los paneles (d) y (e) muestran un análisis de la expresión génica en moléculas asociadas con interacciones coestimuladoras y coinhibidoras de células T y células presentadoras de antígeno. Los gráficos de líneas muestran la expresión génica como gráficos de densidad de probabilidad para muestras de control (azul) e infección bacteriana (rojo). Los gráficos marcados con asteriscos indican que la diferencia de expresión media entre los dos grupos de estudio es estadísticamente significativa (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

La Figura 15 muestra un análisis de red de la respuesta específica del paciente a la infección. (a) Perfiles de expresión específicos del paciente. Redes de 824 sondas expresadas diferencialmente estadísticamente (adj.p <0,01, cambio de veces >2) visualizado con BioLayout Express 3D. Se identifican tres grupos de genes que corresponden a los identificados por agrupamiento jerárquico en la Figura 1b. Los genes coexpresados dentro de las redes se definieron después con una correlación de Pearson r= 0,78 y mediante la aplicación de un valor de inflación de agrupación de Markov (MCL) de 4 y un valor de preinflación de 3 y se muestran como grupos de colores (por ejemplo, el grupo 01, etc.). (b) Se muestran doce grupos de genes MCL para pacientes infectados por bacterias para mostrar respuestas específicas de los pacientes. Los valores de expresión promedio de los grupos m Cl se calcularon a partir de cada gen normalizado frente a la media de las muestras de control y ordenados por distancia euclidiana. (c) Se analizaron 12 grupos de expresión génica que mostraban heterogeneidad dentro del grupo de neonatos infectados para determinar su asociación con parámetros clínicos. Para cada grupo y neonato infectado, se calculó la expresión génica media y se probó la asociación estadística con cada uno de los parámetros clínicos. Las pruebas de suma de intervalo de Wilcoxon se usaron para evaluar la asociación con parámetros clínicos binarios, las pruebas de correlación de intervalo de Spearman se usaron para probar la asociación con parámetros clínicos continuos (azúcar, recuento de neutrófilos, edad posnatal, plaquetas, duración de antibióticos, pH, CMI, Hb, edad gestacional). Los bloques oscuros identifican resultados de prueba significativos a p<0,05. (d) El análisis de enriquecimiento de tipo celular realizado a nivel de paciente individual muestra respuestas específicas del paciente. Los niveles medios de señal para las listas de genes específicos del tipo de célula se trazan (± desviación absoluta media) para las células B, células T, células NK, neutrófilos, monocitos y células dendríticas. Control - a la izquierda de la línea divisoria vertical, infectada por bacterias - a la derecha de la línea divisoria vertical.

La Figura 16 muestra la validación del clasificador de red dual de 52 genes. El panel (a) muestra a los miembros de la red como un clasificador de infección neonatal mediante el uso de un análisis de validación cruzada de dejar uno afuera mediante el uso de cuatro algoritmos de aprendizaje automático independientes ('círculo' - bosque aleatorio, 'triángulo' -máquinas de vectores de soporte, '+' - k vecino más cercano y 'x' - características del operador receptor). El panel (b) es un diagrama de flujo de validación del clasificador de biomarcadores. Diagrama de flujo que muestra las muestras usadas para la generación del clasificador y los resultados de validación. El panel (c) es un mapa de calor que muestra la agrupación jerárquica de 18 muestras de lactantes (9 infectadas por bacterias, 6 de control, 3 infectadas por virus) basadas en las 50 sondas que eran comunes entre el conjunto de genes clasificadores y la plataforma Affymetrix U219. La agrupación jerárquica se basó en la distancia euclidiana. Control - azul, infectado por bacterias - rojo, infectado por virus - negro. Se indica la clasificación de infección bacteriana (0 = no infectado, 1 = infectado). (d) Comparación de clasificador basado en micromatrices y evaluación experta para la clasificación de muestras de pacientes con sospecha de infección. i) Comparación de la evaluación de expertos y la clasificación basada en micromatrices en muestras con una puntuación de infección 'alta' y 'baja' por evaluación de expertos. ii) Predicción del clasificador basado en micromatrices y evaluación experta de casos sospechosos de sepsis (arriba a la izquierda = concordancia de 'infección', abajo a la derecha = concordancia de 'control', arriba a la derecha e inferior izquierda = discordancia del clasificador de micromatrices y evaluación de expertos). iii) La clasificación basada en micromatrices de muestras calificó la probabilidad de infección 'media' por evaluación experta. Se indica la clasificación de infección bacteriana (0 = no infectado (azul pálido), 1 = infectado (rosa)). En la Figura 8 se muestra un mapa de calor que muestra las 30 muestras de lactantes con sospecha de infección basado en las 46 sondas que eran comunes entre el conjunto de genes clasificadores y la plataforma CodeLink. El panel (e) contiene histogramas que muestran los criterios clínicos en casos sospechosos de infección según el clasificador de micromatrices y la evaluación experta. Se muestran los días de conteos de neutrófilos y antibióticos para muestras basadas en la clasificación del control (barra izquierda en cada gráfico) y la infección bacteriana (barra derecha en cada gráfico).

La Figura 17 muestra los resultados del análisis de ROC realizado para cada gen individual realizado para seleccionar los biomarcadores más precisos en la predicción de la sepsis en neonatos. Las abreviaturas son las siguientes; AUC, área bajo curva; Sens(%), sensibilidad; Especificaciones(%), Especificidad.

La Figura 18 muestra la identificación de los 3 biomarcadores principales para cada vía en función de su rendimiento ROC individual medido por el área bajo la curva AUC (es decir, qué tan bien el gen individual distingue entre el control y los neonatos infectados). Solo aquellos genes donde la predicción es para infección bacteriana (en lugar de infección viral) se retuvieron para análisis posteriores. Todas las tablas en la figura muestran la precisión de clasificación (%) del clasificador en una prueba de validación cruzada de dejar uno fuera (LOOCV). El panel A proporciona la precisión de clasificación para los genes principales 2 y 3 de cada vía (clasificación con escala de datos a la media). El panel B muestra los resultados de un análisis combinatorio de ROC que indica la precisión de la clasificación cuando se combinan genes de diferentes vías. Por ejemplo, cuando los dos principales genes de la vía metabólica (SLC2A3 y GPR84) se analizan en combinación con los dos principales genes de la vía de la inmunidad adaptativa (LRRN3 y TRAJ17), esos 4 genes en conjunto proporcionan una precisión de clasificación de sepsis del 98,4 %. El panel C proporciona la precisión de clasificación para el conjunto de genes clasificador completo de 52 genes, así como las vías completas y combinaciones de vías completas.

La Figura 19 muestra un gráfico de barras de la fuerza de predicción del clasificador de expresión génica para lactantes y niños gambianos confirmados por cultivo bacteriano.

La Figura 20 A muestra los datos demográficos del grupo de prueba y los controles, B muestra un gráfico de barras de la fuerza de predicción del clasificador de expresión génica para muestras de neumonía bacteriana en adultos.

La Figura 21 muestra un gráfico de barras de la fuerza de predicción del clasificador de expresión génica para 71 muestras de neonatos.

La Figura 22 muestra un gráfico de barras de la frecuencia con la que se representa un marcador dado en la parte superior (> = 85 % de sensibilidad y > = 70 % de especificidad) de las listas de combinación de marcadores de metabolismo. La Figura 23 muestra un gráfico de barras de la frecuencia con la que se representa un marcador dado en la parte superior (> = 85 % de sensibilidad y> = 70 % de especificidad) de las listas de combinación de marcadores de la inmunidad innata. La Figura 24 muestra un gráfico de barras de la frecuencia con la que se representa un marcador dado en la parte superior (> = 85 % de sensibilidad y> = 70 % de especificidad) de las listas de combinación de marcadores de la inmunidad adaptativa.

La Figura 25 muestra un gráfico de barras de la frecuencia con la que se representa un marcador dado en el 20 % superior (es decir, el 20 % que muestra la mayor precisión) de las listas de combinación de marcadores de la inmunidad innata. La Figura 26 muestra un gráfico de barras de la frecuencia con la que se representa un marcador dado en el 20 % superior de las listas de combinación de marcadores de la inmunidad adaptativa.

La Figura 27 muestra un gráfico de barras de la frecuencia con la que se representa un marcador determinado en el 20 % superior de las listas de combinación de marcadores metabólicos.

La Figura 28 muestra un diagrama de flujo que ilustra parte del análisis estadístico realizado para analizar y clasificar el rendimiento de varias listas de marcadores combinatorios.

Descripción detallada

Ejemplo 1 - Diseño del estudio, cálculos de potencia y participantes

El estudio se realizó en la Neonatal Unit, Royal Infirmary of Edinburgh y en la Division of Pathway Medicine, University of Edinburgh. Se estudiaron los lactantes a los que se les extrajeron hemocultivos para investigar la sospecha de infección (Figura 1) y a los lactantes de control "bien" que se les extrajo sangre por otros motivos clínicos (Figura 1). Cinco bebés tuvieron muestras incluidas de más de un episodio de infección. Después del consentimiento de los padres, obtuvimos muestras de sangre en el momento de los primeros signos clínicos de sospecha de infección con 0,5-1 ml adicionales de sangre completa para el perfil de expresión recolectada junto con el hemocultivo microbiológico "estándar de oro". Las muestras tomadas de pacientes con sospecha de infección clínica que demostraron tener evidencia microbiológica de infección de un sitio corporal generalmente estéril se identificaron y formaron el grupo infectado. La evaluación clínica completa de los síntomas y signos tempranos y tardíos de sepsis siguió los criterios de sepsis neonatal (Figura 1) con la prueba de hemocultivo usada como el "estándar de oro" para el diagnóstico de sepsis. Para las muestras de pacientes con estafilococo coagulasa negativo, dos clínicos (CLS y BJS/JO) realizaron una evaluación clínica completa y se revisaron las pruebas clínicas que respaldaban o rechazaban la inclusión. La unidad neonatal usa las definiciones de Vermont Oxford Network para la vigilancia de infecciones (Horbar y otros, Pediatrics 129, 1019-1026 (2012)) y el deterioro clínico asociado, los aislamientos repetidos y los recuentos sanguíneos alterados también se examinaron. Las muestras solo se incluyeron como positivas si ambos médicos estuvieron de acuerdo en que la infección estaba presente. Esto se realizó a ciegas a los resultados de cualquier perfil de expresión de ARN. Para los cálculos de potencia se obtuvieron muestras de 30 lactantes a los 9 meses de edad, antes de la vacunación,

Para el aislamiento de ARN, se inyectó sangre inmediatamente en un tubo de ARN de sangre PAXgene™. Las muestras congeladas se sometieron a extracción de ARN y se realizó un análisis de micromatrices. Antes de embarcarnos en este estudio, realizamos un cálculo de potencia mediante el uso de la plataforma de chip Illumina®, en un conjunto independiente de 30 muestras de lactantes (Figura 2). Esto muestra que el diseño del estudio tiene una potencia del 90 % para detectar un cambio de 2 veces en la expresión con una a del 1 % (corregido por FDR), para más del 99 % de las 35 177 sondas de genes presentes en la matriz. El ARN se extrajo mediante el uso de un protocolo validado para su uso en muestras de sangre neonatal de pequeño volumen (Smith y otros, Analista 132, 1200-1209 (2007)).

Ejemplo 2 - Análisis estadístico

El ARN de alta calidad de lactantes infectados y de control se hibridó en micromatrices BeadChip HT12v3 de expresión de genoma humano completo Illumina® que comprenden 48802 características (sondas de genes humanos). El análisis de calidad de micromatrices usó el paquete arrayQualityMetrics en Bioconductor (Kauffmann y otros, Bioinformatics 25, 415-416 (2009)) y se realizó una verificación de género mediante el uso de un loci específico del cromosoma Y. Mediante el uso del paquete 'Lumi' Bioconductor los datos brutos de 63 muestras se transformaron mediante el uso de una transformación estabilizadora de la varianza antes de la normalización robusta de la ranura para eliminar la variación sistemática entre muestras. Las características de las micromatrices que no se detectaron, mediante el uso de detectionCall en cualquiera de las matrices se eliminaron del análisis y las 23342 características restantes se usaron para el análisis estadístico posterior. Los datos se examinaron estadísticamente para evaluar la edad gestacional como un factor de confusión. Dentro de cada grupo de muestra (control, infectado), las muestras se clasificaron por edad en cajas basadas en los valores cuantitativos de edad gestacional corregidos del 33 % y 66 %, y se obtuvieron tres grupos de edad. La comparación de datos normalizados entre grupos utilizó el modelado lineal de los valores de expresión a escala log²entre grupos y los subsiguientes enfoques empíricos bayesianos para moderar el estadístico de prueba al agrupar información de varianza de múltiples genes. Esto incluyó el ajuste vertical del valor p para pruebas múltiples (Benjamini-Hochberg) para controlar la tasa de descubrimiento falso mediante el uso del paquete 'Limma' de Bioconductor (Shanley y otros, Mol Med 13, 495-508 (2007); Smyth, Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor (Ed Carey VJ Gentleman R, Huber W, Irizarry RA, Dudoit S.) cap. 23, (Springer, 2005)). Los genes estadísticamente significativos expresados diferencialmente se examinaron más a fondo: se examinaron mapas de calor y gráficos de líneas con agrupamiento jerárquico por distancia euclidiana mediante el uso de PartekGenomics Suite v65, y visualización de redes de genes que buscan respuestas específicas del paciente mediante el uso de BioLayout Express 3D (Theocharidis y otros, Nature protocolos 4, 1535-1550 (2009)). Se realizó una agrupación no supervisada de muestras de pacientes: se usaron sondas con un coeficiente de variación (CV) mayor que 01 (10206) y la agrupación jerárquica se basó en la distancia euclidiana.

Para fines de clasificación, nos referimos a las 62 muestras hibridadas con Illumina® con el subconjunto seleccionado de 52 genes como "conjunto de entrenamiento". Empleamos múltiples tipos de conjuntos de pruebas de clasificación, que se definen de la siguiente manera (Figura 3). En adición al análisis de micromatrices Illumina®, examinamos un subconjunto de 42 de estas muestras (18 infectadas, 24 controles) mediante el uso de matrices de genoma humano completo CodeLink™, denominado "conjunto de prueba de plataforma". Posteriormente, el clasificador se aplicó a otras 26 muestras nuevas e independientes (16 muestras infectadas con bacterias de 15 lactantes y diez muestras de control) que se ejecutaron en CodeLink™ (siete infectadas, tres de control), Affymetrix® HG-U133 (dos infectadas, tres controles) o Affymetrix® Human Genome U219 (nueve infectados, seis controles). Estos se denominan colectivamente "conjunto de prueba de validación". Evaluamos el rendimiento de nuestro clasificador en 30 muestras independientes con infección sospechada pero inicialmente no confirmada (matrices CodeLink™) y nos referimos a esto como "conjunto de prueba de sospechosos de infección".

El uso del término "clasificador" se refiere al algoritmo de clasificación y su estado entrenado basado en nuestro conjunto de 52 biomarcadores. En la discusión del conjunto de 52 biomarcadores mismos, nos referimos a estos como "conjunto de genes clasificadores" o "clasificador de 52 genes". Antes de entrenar y probar los algoritmos de clasificación, los valores de expresión log²originales para el conjunto de 52 genes se escalaron a media=0 y desviación estándar=1 (es decir, transformación z por muestra).

Los datos de micromatrices se depositaron en Gene Expression Omnibus con el código de acceso GSE25504, (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jxavvcscouykyxe&acc=GSE25504).

Ejemplo 3: análisis de redes, vías y clasificadores

Se usaron enfoques basados en redes computacionales para examinar las relaciones en los datos mediante el uso de la correlación de la expresión génica y las relaciones biológicas. El análisis de vías de Ingenuity (IPA -http://www.ingenuity.com), DAVID (Huang y otros, Nat Protocol 4, 44-57 (2009)) y un conjunto de datos curado manualmente de interacciones de genes humanos en InnateDB (http://www.innatedb.com) (Lynn y otros, Mol Syst Biol 4, 218 (2008)) se usaron para examinar las relaciones de la red biológica y la asociación con vías conocidas, por ejemplo, KEGG (Ogata, H. y otros, Nucleic Acids Res 27, 29-34 (1999)). La red InnateDB se analizó mediante el uso de Cytoscape 2.6.3 (Shannon, P. y otros, Genome Research 2498-2504 (2003)) y el complemento cytoHubba (Lin y otros, Nucleic Acids Res 36, W438-443 (2008)) para investigar una variedad de propiedades de una red, incluida la identificación de centros de red y cuellos de botella que pueden representar los nodos reguladores clave en la red. La red también se analizó para identificar 'subredes activas' mediante el uso del complemento jActiveModules (Idekery otros, Bioinformatics 18 Suppl 1, S233-240 (2002)) para identificar subredes densamente conectadas expresadas diferencialmente. Las visualizaciones celulares de los componentes de la red se visualizaron mediante el uso del complemento Cerebral v.2 (Barsky y otros, Bioinformatics 23, 1040-1042 (2007)). La contribución de subgrupos específicos de células sanguíneas se examinó y se clasificaron las respuestas de acuerdo con el tipo de célula mediante el uso de marcadores genéticos específicos de células descritos por Abbas y colegas (Abbas y otros, PLoS One 4, e6098 (2009)). Los análisis de vías se llevaron a cabo paso a paso mediante el uso de un enfoque de biología de vía, con más enfoque hasta que se identificó una subred definida de 52 genes expresados diferencialmente. Los genes seleccionados tenían valores de p ajustados de <10'5, cambios de veces de >4 y estuvieron altamente conectados en términos de redes y vías biológicas. Después se evaluaron estos 52 genes para determinar la precisión de predicción en un modelo de error de validación cruzada de dejar uno fuera mediante el uso de cuatro métodos de clasificación diferentes: Bosques aleatorios, máquinas de vectores de soporte, vecino más cercano K y clasificación basada en ROC. La validación cruzada de dejar uno fuera se repitió 100 veces para cada conjunto de genes seleccionados con el seguimiento de un orden aleatorio de los datos en cada replicación para minimizar la variabilidad de las estimaciones de error. Para la validación técnica independiente de los niveles de expresión de ARN del conjunto de genes clasificadores fuera del conjunto de muestras neonatales usado para la selección de características, se examinó un subconjunto de muestras ejecutadas en CodeLink™ Human Whole Genome Bioarrays (conjunto de prueba de plataforma). El subconjunto se eligió solo porque se ejecutó previamente en CodeLink™. La clasificación por ROC (Lauss y otros, BMC Cancer 10, 532 (2010)) se usó para repetir la validación cruzada interna en este subconjunto mediante el uso de los marcadores que estaban presentes en ambas matrices y luego mediante el uso del clasificador entrenado para predecir las muestras de CodeLink™. Para una validación adicional, un nuevo conjunto de muestras de 16 muestras infectadas por bacterias y 10 muestras de control (no usadas previamente para la selección de características u otros análisis, pero obtenidas en el mismo entorno de estudio con el mismo protocolo de recolección de muestras) se ejecuta en CodeLink™, Affymetrix® Human Genome HG-U133 Plus 2.0 o matrices Affymetrix® Human Genome U219 se les aplicó el clasificador basado en ROC (conjunto de prueba de validación). Todos los análisis de clasificación se realizaron con R (http://www.R-project.org, (2013)), el error de clasificación en relación con el tamaño del conjunto de genes se realizó con el paquete de R 'optBiomarker' (Khondoker y otros, Journal of Bioinformatics and Computational Biology 08, 945-965 (2010) y la clasificación basada en ROC usa el paquete de R 'rocc' (Lauss y otros, BMC Cancer 10, 532 (2010)).

Aprobación del estudio

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los padres de todos los lactantes inscritos de acuerdo con la aprobación otorgada por el Lothian Research Ethics Committee para muestras de sangre para aislamiento de ARN obtenidas a la primera vez de aparición de signos clínicos de sospecha de sepsis (Referencia 05/s1103/3). Las muestras usadas en los cálculos de potencia se obtuvieron con la aprobación del Gambia Government / MRC Laboratories Joint Ethics Committee y el comité de ética de la London School of Tropical Medicine (Referencia SCC1085, L2008.63).

Ejemplo 4 - reclutamiento de pacientes, flujo de trabajo de análisis de muestras y diseño del estudio

La Figura 1 muestra los datos demográficos del paciente, los organismos microbianos aislados y las razones para el muestreo de sangre en los controles para todos los conjuntos de pacientes. Todas las muestras se procesaron para el análisis transcripcional de todo el genoma mediante el uso de micromatrices. Sobre la base de los cálculos de potencia (Figura 2), el tamaño de la muestra de aproximadamente 25 para cada grupo tiene >90 % de potencia para detectar cambios de dos veces en el nivel de expresión del 99 % de las sondas en la micromatriz. En la Figura 3 se muestra un esquema del flujo de trabajo de reclutamiento de pacientes y procesamiento de muestras para las 285 muestras procesadas para el brazo del estudio principal y de validación. Para los aspectos biológicos de la vía computacional y estadística de este estudio, en la Figura 4 se proporciona un resumen del flujo de trabajo del análisis de datos y las cifras asociadas. El brazo principal del estudio usó principalmente datos de perfiles de ARN mediante el uso de la plataforma Illumina HT12 de 27 muestras de pacientes con una prueba positiva confirmada de hemocultivo para sepsis (casos infectados con bacterias), un caso infectado con citomegalovirus (CMV) y 35 controles coincidentes. Las muestras de estos casos (sin incluir el caso de infección viral) se denominan "conjunto de entrenamiento" en este estudio. Para evaluar la reproducibilidad con una plataforma de ensayo diferente, examinamos un subconjunto de 42 de estas muestras mediante el uso de la plataforma de expresión génica CodeLink (que comprende 18 muestras infectadas por bacterias y 24 muestras de control) nombradas en este estudio como "conjunto de prueba de plataforma". Posteriormente, para una evaluación clínica independiente, el clasificador del conjunto de 52 genes se aplicó a otras 29 muestras nuevas e independientes (que comprenden 16 muestras infectadas por bacterias, tres infectadas por virus y diez de control) nombradas en este estudio como "conjunto de prueba de validación". Finalmente, se analizó un conjunto de 30 nuevas muestras recolectadas bajo sospecha de infección con hemocultivo negativo, denominado en este estudio como "conjunto de prueba de sospechosos de infección". En la Figura 5 se muestra un resumen detallado del flujo de trabajo para el entrenamiento y comprobación del clasificador de sepsis de 52 genes en neonatos.

Ejemplo 5 - una perturbación vigorosa de la red huésped-ARN sistémico en la infección neonatal

Primero buscamos evaluar la magnitud y el grado de variabilidad de la respuesta a la infección mediante el uso del conjunto de entrenamiento y el único caso infectado por virus. En estos análisis, 23342 sondas de matriz dieron una señal detectable por encima del límite de detección para una o más muestras. De estas 10206 sondas de matriz mostraron un 10 % o más de coeficiente de variación (CV >0,1) en las 63 muestras, lo que indica una gran magnitud y amplitud de los cambios. Se llevó a cabo un análisis de componentes principales de muestras de pacientes basado en estas 10206 sondas y en la aglomeración de grupos no supervisados de datos normalizados sin filtrar. Los resultados de estos análisis revelaron una clara separación en los grupos de control e infectados, y mostraron una alteración dramática en la expresión de ARN entre las muestras infectadas y de control (Figura 6 y Figura 10). La única excepción a esta agrupación fue la única muestra infectada por virus (CMV) en este conjunto y se excluyó de los análisis posteriores.

La demarcación clara y a gran escala de esta respuesta se subraya aún más después de las pruebas estadísticas entre los grupos infectados y de control, y reveló 8242 sondas expresadas diferencialmente significativamente (adj.p <0,01) con valores de p ajustados tan bajos como 10-23 Para una selección de sondas adicional aplicamos cortes estadísticos y cuantitativos (adj.p <0,01, cambio de veces absoluto >2) que redujo el conjunto de sondas a 824 sondas expresadas diferencialmente y en consecuencia representa una firma global de infección para un sistema inmune neonatal virgen e inmaduro. A continuación, usamos la agrupación jerárquica basada en la distancia euclidiana de las 824 características expresadas diferencialmente (Figura 9) para caracterizar los patrones de expresión y revelar distintos conjuntos de genes regulados positivamente y negativamente. El resultado de este análisis de conglomerados desarrolló tres grupos demarcados: el grupo 1 representa sondas diferencialmente reguladas negativamente en lactantes infectados; grupo 2 aquellas diferencialmente reguladas positivamente en lactantes infectados; mientras que el grupo 3 no desarrolló una separación clara entre infectados y controles.

Un análisis de red de 824 sondas reguladas significativamente diferencialmente (adj.p <0,01, cambio de veces >2) tras la infección reveló que se identificaron cuatro redes principales de genes regulados negativamente que comprendían genes involucrados en los siguientes procesos; síntesis de proteínas, ensamblaje y organización celular, modificación postranscripcional de ARN (puntuación de red 96); muerte celular, compromiso celular, tráfico de proteínas (puntuación de red 80); respuesta inmune mediada por células, desarrollo celular, función y mantenimiento celular (puntuación de red 76); desarrollo celular, desarrollo y función del sistema nervioso, muerte celular (puntuación de red 63). En general, los genes en este grupo se asociaron con las siguientes enfermedades y funciones: respuesta inflamatoria, enfermedad inmunológica, enfermedad hematológica, respuesta inmune mediada por células, desarrollo y función del sistema hematológico, hematopoyesis, morfología tisular y tráfico de células inmunes.

El análisis de red de genes regulados positivamente en la infección (Grupo 2 de la Figura 10b) mostró que se identificaron cuatro redes principales de genes regulados positivamente que comprendían genes que participan en los siguientes procesos; respuesta inflamatoria, movimiento celular, desarrollo y función del sistema hematológico (puntuación de red 155); respuesta inflamatoria, función y mantenimiento celular, señalización celular (puntuación de red 104); movimiento celular, trastornos del tejido conectivo, enfermedad inmunológica (puntuación de red 84); respuesta inflamatoria, enfermedad inflamatoria, enfermedad inmunológica (puntuación de red 76). En general, los genes en este grupo se asociaron con las siguientes enfermedades y funciones: respuesta inflamatoria, enfermedad infecciosa, enfermedad respiratoria, trastornos del tejido conectivo, enfermedad inmunológica, desarrollo y función del sistema hematológico, tráfico de células inmunes, desarrollo de tejidos, supervivencia del organismo y respuesta inmune humoral.

Análisis de red de genes regulados positivamente por infección (Grupo 3 de la Figura 10b). Se identificaron dos redes principales de genes regulados positivamente que comprendían genes que participan en los siguientes procesos; enfermedad hematológica, lesión y anormalidades de organismos, muerte celular (puntuación de red 109); expresión génica, ciclo celular, mecanismo de infección (puntuación de red 44). En general, los genes en este grupo se asociaron con las siguientes enfermedades y funciones: enfermedad hematológica, lesión y anomalías organismales, trastorno genético, desarrollo y función del sistema hematológico, hematopoyesis, morfología del tejido, desarrollo y función del sistema cardiovascular y desarrollo y función del tejido conectivo.

Muchas de las 118 sondas en el grupo 3 detectan genes que codifican funciones relacionadas con el desarrollo de la sangre sobre la base de la ontología génica y el análisis de la vía y estos se excluyeron de los análisis posteriores.

A continuación buscamos determinar el conjunto de genes más altamente activo asociado con la infección mediante la aplicación de filtros adicionales a las sondas del grupo 1 y 2 mediante el uso de un umbral más estricto (adj. p <10-5, cambio de veces >4). Un análisis de red de los genes de la red dual de 52 genes altamente regulados positivamente y negativamente en la infección (adj.p <10-5, cambio de veces >4) reveló que se identificó una red principal (puntuación de red 72) y 3 redes menores (puntuaciones de red de 3, 2 y 2) de genes regulados positivamente. La red principal comprendía genes que participan en la señalización e interacción célula a célula, el movimiento celular y la respuesta inflamatoria. En general, los genes en este grupo se asociaron con las siguientes enfermedades y funciones: enfermedad infecciosa, enfermedad respiratoria, respuesta inflamatoria, enfermedad inflamatoria, desarrollo y función del sistema hematológico y tráfico de células inmunes. Las principales vías canónicas asociadas con esta red (con valores de p entre paréntesis) fueron las siguientes: Función de los macrófagos, fibroblastos y células endoteliales en la artritis reumatoide (9,54x10-6), activación de LXR/RXR (7,39x10-4), señalización de IL-6 (1,51x10-3), función de los osteoblastos, osteoclastos y condrocitos en la artritis reumatoide (2,03x10-3), metabolismo de fructosa y manosa (7,87x10-3).

Se identificó una red principal (puntuación de red 25) de genes regulados negativamente mediante la observación de las interacciones directas e indirectas. Esta red comprendía genes que participan en la señalización e interacción célula a célula, la respuesta inmune mediada por células y el desarrollo celular. En general, los genes en este grupo se asociaron con las siguientes enfermedades y funciones: enfermedad genética, enfermedad inmunológica, enfermedad hematológica, enfermedad gastrointestinal, enfermedad inflamatoria, desarrollo y función del sistema hematológico, morfología tisular, tráfico de células inmunes, respuesta inmune mediada por células y hematopoyesis. Las principales vías canónicas asociadas con esta red (con valores de p entre paréntesis) fueron las siguientes: Apoptosis de linfocitos T inducida por calcio (2,17x10-6), señalización de CTLA4 en linfocitos T citotóxicos (7,52x10-6), señalización de iCOS-iCOSL en células T auxiliadoras (1,17x10-5), señalización de diabetes mellitus tipo I (1,2x10-5), señalización de CD28 en células T auxiliadoras (1,54x10-5).

El análisis de los 52 genes resultantes reveló subredes (denominadas "red dual"), para la expresión regulada positivamente y negativamente. La red dual consiste en genes altamente relacionados que forman tres clases funcionales de inmunidad innata y adaptativa e inesperadamente genes asociados con funciones metabólicas de azúcar y lípidos (Figura 11b-e). Los niveles de expresión para esta red dual en el grupo infectado muestran una diferencia consistente y clara en la separación de la señal en redes de ARN activadas (amarillo) y suprimidas (azul) (Figura 11a). En general estos resultados respaldan la posibilidad de identificar redes específicas para la infección bacteriana.

Ejemplo 6 - respuestas biológicas de la vía celular y molecular a la infección en neonatos

Vías de señalización inmunitaria: Con el fin de interrogar más ampliamente los cambios en las respuestas biológicas de la vía celular y molecular que se producen tras la infección neonatal, se aplicaron una serie de análisis de la vía estadísticos. En primer lugar, el análisis de la respuesta transcripcional global identificada en los grupos de agrupaciones jerárquicas 1 y 2 se realizó mediante el uso de pruebas hipergeométricas para redes seleccionadas en la base de datos IPA (www.ingenuity.com). Este análisis desarrolló ocho redes altamente conectadas de genes funcionalmente relacionados. Genes regulados negativamente (grupo 1) asignados al procesamiento y presentación de antígenos a través de MHC II, diferenciación de linfocitos, activación de células T y señalización del receptor de células T. Genes regulados positivamente (grupo 2) asignados a procesos inmunes innatos que incluyen TLR, quimiocinas, IL-6, IL-1p y señalización de JAK-STAT, activación de plaquetas y vías de apoptosis.

El análisis de IPA de la lista de genes 52 más estricto reveló dos subredes, compuestas de 3 vías: dos que se asocian con el conjunto regulado positivamente y una para el conjunto regulado negativamente. El conjunto regulado positivamente mostró una firma inmune innata mieloide anclada alrededor de la metalopeptidasa 9 de la matriz (MMP9) y la lipocalina 2 (LCN2) asociada con la activación de los macrófagos y el metabolismo de los lípidos (Figura 11b). Otros genes metabólicos regulados positivamente incluyen el receptor de ácidos grasos libres 2 (FFAR2/GPR43) que proporciona un vínculo entre los ácidos grasos de cadena corta, los neutrófilos y las interacciones intestinales-microbiota, así como el metabolismo glicolítico y energético (Figura 11c). El conjunto regulado negativamente estaba compuesto en gran parte por marcadores linfoides de inmunidad adaptativa centrados alrededor del complejo receptor de células T/CD3 y se asoció con vías de señalización de células T (Figura 10d). En conjunto, estas alteraciones de la red proporcionan, por primera vez, enlaces de vías moleculares candidatas a los procesos metabólicos e inflamatorios que se producen en la sepsis neonatal (Figura 11e). Es de destacar que, el IFNy, aunque se expresa detectablemente en todas las muestras de pacientes, parece no activarse diferencialmente (Figura 12a y b). Si bien esto es consistente con la reducción en los niveles de expresión de los genes del sistema inmune adaptativo (Figura 11a) tales como los que participan en la presentación del antígeno (por ejemplo, moléculas MHC de clase II), encontramos que en los casos de sepsis el gen regulado por IFNy prototípico CXCL10 se induce (muy probablemente a través de STAT1) y muestra una buena correlación con STAT1 en los casos infectados (r=~0,8) pero no en los controles (r~0,3) (Figura 7).

Señalización inhibidora inmune: Mientras que los genes que participan en la respuesta inmune innata mostraron una fuerte regulación positiva de la señalización de TNF, TLR, y receptores/citocinas inflamatorias, también hubo una regulación positiva muy potente de los factores de señalización inhibidora, tales como el señuelo del receptor para IL-1p (IL1R2) y el antagonista del receptor de IL1 (IL1RN) (Figura 11b) que se sabe que moderan la respuesta inmune. Esto se manifiesta como una respuesta inhibidora innata intrínseca más general ya que los factores inhibidores principales contrarreguladores elevados incluyen los represores A20, kBa, TRAFD1, SOCS1 y SOCS3 de las vías de señalización NFkB, TLR y JAK-STAT, respectivamente (Figura 8). Estas vías contrarreguladoras son indicativas de desarrollar un punto de ajuste alterado en el control homeostático inmune (definido aquí como el nivel en el que el sistema inmune innato activa la respuesta adaptativa) y que se influenciará por el equilibrio neto entre las respuestas inhibidoras y estimuladoras. En consecuencia, mientras que un número significativo de bebés infectados muestran altos niveles del marcador de activación de macrófagos CD163 (adj.p<10-6), también exhiben ligandos coinhibidores aumentados tales como PD-L1 (CD274) que impedirían la proliferación de células T y la producción de citocinas. Además, los genes asociados con una firma de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) también se elevan notablemente (CD11B, CD97) incluido el aumento de ARG1 que marca un fenotipo antiinflamatorio potente (Figura 12c). En relación con ARG1 elevado, el marcador de células eritroides CD71 también se reguló positivamente en un número significativo de casos de sepsis (Figura 8) y esto se demostró recientemente en neonatos que contribuye a la supresión de la activación de las células inmunes (Elahi y otros, Nature 504, 158-162 (2013)). Un corolario importante de estas vías de señalización estimuladoras e inhibidoras es que probablemente tengan un impacto en los cambios funcionales en los compartimentos celulares inmunes, en particular el brazo linfoide.

Cambios en los compartimentos de las células inmunes: Para investigar si podían verse cambios en los compartimentos celulares en la infección utilizamos marcadores previamente identificados de linajes de células sanguíneas específicas (Abbas y otros, PLoS One 4, e6098 (2009)) que tradujimos a la plataforma Illumina para modelar módulos específicos de expresión celular de ARN. Estas investigaciones proporcionan información sobre los cambios de celularidad en la sangre completa en la sepsis neonatal. Observamos una firma diferencial de células mieloides, especialmente monocitos y neutrófilos, en muestras infectadas (Figura 12e y f, Tabla 4), que se validó por un conteo de células de neutrófilos significativamente mayor observado en este grupo de pacientes (Figura 12d). Por el contrario, los módulos de expresión génica para las células linfoides, particularmente las células B y las células T, fueron inferiores (Figura 12e y f). No se detecta una diferencia significativa para los módulos de expresión de células dendríticas o células asesinas naturales entre infectados y controles (Tabla 4). Concluimos que en la sepsis, la respuesta celular inmune innata aumentada se conduce por monocitos/macrófagos y neutrófilos y es contrarrestada por vías inhibidoras que dan como resultado una supresión neta del brazo inmune adaptativo, especialmente aquellos asociados con el compartimento de células T.

La Tabla 4 muestra un análisis de enriquecimiento del tipo celular. Un resumen de la detección de la sonda en función de las listas de genes específicos del tipo de célula y si la expresión de cada tipo de célula al enfrentar la infección se observó sin cambios, mayor (superior) o menor (disminuye).

Tabla 4

Vías regulatorias: Para obtener más información sobre las alteraciones de la vía reguladora subyacentes tras la infección, realizamos un análisis supervisado de conjuntos de genes regulados diferencialmente mediante el uso del recurso InnateDB (Lynn y otros, Mol Syst Biol 4, 218 (2008)), una base de datos de biología de sistemas que contiene >18 000 interacciones moleculares validadas experimentalmente de relevancia para la inmunidad innata. Para el propósito de esta investigación usamos solo un conjunto de datos de alta confianza de InnateDB que comprende aproximadamente 2500 interacciones humanas que se anotaron manualmente. El análisis de la red de interacciones directas entre genes regulados positivamente (grupo 2) y sus productos codificados se realizó para incluir a todos los interlocutores interactivos no expresados diferencialmente de los genes regulados positivamente (Figura 13ai). La red resultante reveló aquellos marcadores (representados como "nodos" en la red) que se conectan altamente a través de interacciones físicas o bioquímicas directas (denominadas "centros") o que tienen muchas vías más cortas de red que pasan a través de ellos (denominados "cuellos de botella") que marcan posibles puntos regulatorios claves en la red. Se identificaron los 20 centros principales en esta red, de los cuales, los 4 principales incluyeron los factores de transcripción inmunorreguladores STAT1, STAT3 y C/EBP-B, y el receptor TNFR1 (Figura 13aii). Estas respuestas inmunes innatas desencadenan la maduración de las células presentadoras de antígenos para instruir la respuesta inmunitaria adaptativa. El nivel de activación de la respuesta inmune innata refleja el punto de ajuste para la regulación inmune homeostática, y por lo tanto apunta a una sepsis neonatal con punto de ajuste aumentado. La red se analizó adicionalmente para identificar 'subredes activas' a través de la identificación de subredes de alta puntuación mediante el uso de un algoritmo de búsqueda basado en alineamiento simulado (Ideker y otros, Bioinformatics 18 suplemento 1, S233-240 (2002)). La subred regulada positivamente (Figura 13aiii), compuesta por 81 nodos y 176 bordes estaba enriquecida con genes implicados en la formación de tapón de plaquetas, fagocitosis mediada por R gamma Fc, activación de plaquetas, hemostasia, vías de señalización de integrina y vías de señalización de quimiocinas. Varios miembros de la vía de señalización de TLR también fueron componentes de esta subred.

Adicionalmente, mediante el uso de InnateDB, también realizamos otro análisis de red supervisado que investigó las interacciones directamente entre los nodos que se regulaban positivamente en la infección neonatal, es decir, no consideramos interacciones con nodos expresados de manera no diferencial o regulados negativamente en este análisis (Figura 13b). Esta red estaba compuesta por un componente conectado principal que consistía en proteínas que participan en la señalización de TLR (TLR5, TLR8, MYD88, IRAK3) y de TNF (entre otras vías) que conducen a la activación transcripcional de una variedad de genes a través de un panel de factores de transcripción que incluye BCL6, CEBPB, CEBPD, ETS2, IRF7, JUNB, SPI1, STAT1 y STAT3. El análisis de ontología génica reveló que los 2 principales términos significativamente enriquecidos fueron respuesta inmune innata y respuesta inflamatoria. Los componentes menores en la red consistieron en genes que participan en la activación plaquetaria (GNAI2, PPBP) y la señalización de quimiocinas/citocinas (GNAI2, IL8RA, IL8RB, PPBP) y que participan en la fagocitosis mediada por R gamma Fc (DNM2, FCGR1A, FCGR2A, HCK, LYN). En conjunto estos cambios son consistentes con las respuestas inmunes innatas que desencadenan la maduración de células presentadoras de antígeno.

A continuación, completamos un análisis similar para investigar las interacciones entre los nodos regulados negativamente y todas sus parejas de interacción. Se identificaron los 20 centros principales en la red regulada negativamente e incluyeron el factor de transcripción ETS1, varios genes que participan en la traducción (EIF3E, EIF4A2, RPLP1, TUT1), 2 genes que participan en la regulación del ciclo celular (ATM, RBL2) y el receptor de citoquinas, IL7R. Muchos de estos nodos también se identificaron como cuellos de botella en la red. Las 3 subredes principales expresadas diferencialmente consistían en una red enriquecida en genes implicados en la traducción, el módulo transcripcional de HNF4A y una red enriquecida en componentes de la vía de señalización de células T, respectivamente. El análisis de red de las interacciones moleculares entre genes regulados negativamente en la infección neonatal también se generó mediante el uso del InnateDB (Figura 13c). Esta red reveló que había muy pocas interacciones moleculares directamente entre los genes regulados negativamente o sus productos codificados.

Tomados en conjunto estos hallazgos muestran que la señal fisiopatológica dominante asociada con la infección neonatal es una respuesta aumentada inmune-metabólica innata con una regulación homeostática desequilibrada de la respuesta inmune adaptativa. La activación específica e intensa de la señalización inmune innata, moderada a través de vías inhibidoras, es consistente con la noción de un punto de ajuste elevado en neonatos en comparación con adultos para guiar una respuesta inmune adaptativa suprimida (Ghazal y otros, Curr Opin Infect Dis 26, 213-218 (2013).

Ejemplo 7: respuestas biológicas de la vía metabólica y de homeostasis inmune

Inesperadamente, encontramos cambios transcripcionales marcados asociados con la sepsis en vías metabólicas específicas, principalmente las asociadas con el metabolismo de la glucosa, energía y colesterol (Figura 8). Para la biosíntesis de colesterol y la homeostasis encontramos alteraciones significativas en SQLE, IDI1, DHCR7, SCAP, INSIG2, NR1H2, ABCA1, LDLR y LDLRAP1 (Figura 8). En el caso de la vía de la glicólisis, tres nodos reguladores principales de la vía forman parte de la red dual de 52 genes (Figura 16c). Estos son niveles aumentados del transportador de glucosa GLUT3 (SLC2A3), PFKFB3 (6-fofofructo-2-quinasa) que activa el flujo glicolítico en condiciones hipóxicas y HK3 una hexoquinasa que fosforila la glucosa para producir glucosa-6-fosfato, la primera etapa limitante de la tasa en el metabolismo de la glucosa; y es indicativo de cambios en el ciclo de TCA. Otro miembro de la red dual que participa en la regulación del metabolismo de los lípidos y la glucosa es LCN2 (Akelma y otros, JPEM 25, 525-528 (2012); Huang y otros, Cardiovascular Diabetology 11,11 (2012)) que también desempeña una función en la respuesta inmune innata a la infección bacteriana mediante el secuestro de hierro (Berger y otros, Proc Natl Acad Sci 103, 1834-1839 (2006); Flo y otros, Nature432, 917-921 (2004); Goetzyotros, Molecular Cell 10, 1033-1043(2002); Srinivasan y otros, J Immunol 189, 1911-1919 (2012)). Otros procesos metabólicos que son nodos principales en la red dual incluyen B4GALT5 que es responsable de la síntesis de oligosacáridos unidos a N complejos para glicoproteínas y glicolípidos; y GYG1 que forma un sustrato cebador de oligosacárido para la glicógeno sintasa. Es probable que estas alteraciones de la vía metabólica se relacionen con la respuesta inmune innata. En apoyo, el análisis de los promotores de la subred metabólica identificó 11 de 13 genes que contienen sitios de unión para el factor de transcripción específico mieloide PU.1 (SPI1), que también forma parte de la red dual de 52 genes (Tabla 5).

Otra contribución crucial para acoplar la homeostasis del metabolismo del huésped y el sistema inmune es la colonización microbiana del intestino al nacer. Aquí las vías reguladoras homeostáticas implican interacciones entre las células inmunes y los productos metabólicos (principalmente ácidos grasos de cadena pequeña como el butirato) de la fermentación de la microbiota que influye en el punto de ajuste para una respuesta inmune. En este sentido, la vía reguladora gobernada por el receptor 2 de ácidos grasos libres (FFAR2/GPR43) desempeña una función clave en la vinculación de la actividad metabólica de la microbiota intestinal con el metabolismo energético del cuerpo y la actividad inmune. FFAR2 también es un nodo inmune-metabólico dentro de la red dual que se regula significativamente en nuestros casos de sepsis neonatal y, en términos de homeostasis inmune, tiene funciones inmunoestimulantes al comprometerse con un ligando huésped m-ficolin (FCN1) o funciones inhibidoras inmunitarias al unirse ácidos grasos de cadena corta.

FFAR2 se expresa principalmente en neutrófilos y granulocitos, pero también está presente en las células T del colon. Se observa una correlación positiva entre los niveles de FFAR2 y el número de neutrófilos en el grupo de control (r~0,7) pero esta correlación se pierde en casos de infección bacteriana (r~0,2), lo que indica que la regulación positiva en la sepsis no se debe simplemente al aumento en el número de neutrófilos, sino que sugiere una respuesta regulada por el sistema inmunitario (Figura 14a). STAT3 es uno de los centros inmunorregulados principales en la sepsis (Figura 13aii) y el promotor FFAR2 tiene un sitio de unión a STAT3 predicho (puntuación de Fisher 0,9). De acuerdo, encontramos que FFAR2 tiene una fuerte correlación con los niveles de STAT3 en pacientes con sepsis neonatal (r~0,8) pero no en los controles (r~0,3) (Figura 14b). En contraste la correlación entre los niveles de FFAR2 y FCN1 en cualquiera de los controles (r—0,1) o grupo infectado (r—0,1) es bajo (Figura 14c). La M-ficolina (FCN1) codifica una proteína lectina de tipo colágeno (tipo C) secretada por macrófagos que se une a FFAR2 en las membranas plasmáticas que actúan como parte de la vía de activación inmune innata del huésped. Por lo tanto en lugar del factor huésped FCN1, los metabolitos de ácidos grasos de cadena corta microbianos derivados de la microbiota intestinal, como el butirato, probablemente actúen como ligandos afines para FFAR2 en neutrófilos que sintonizan funcionalmente el sistema inmunitario periférico. (Kamada y otros, Nat Rev Immunol 13, 321-335, doi: 10.1038/nri3430 (2013); Smith y otros, Science 341, 569-573, doi: 10.1126/science.1241165 (2013)). Estos resultados requerirán más investigación, pero es consistente con la visión emergente de que la actividad metabólica de la microbiota neonatal puede contribuir a controlar el umbral sistémico de activación de las células inmunes innatas y adaptativas.

Recientemente la actividad de las células eritroides CD71 inmunosupresora se relacionó en la supresión de la defensa del huésped contra la infección en neonatos (Elahi y otros, Nature 504, 158-162 (2013)). La regulación positiva de CD71 también se encuentra en nuestro estudio, pero ocurre solo en aproximadamente el 25 % de nuestros casos de sepsis (Figura 8) y aunque es consistente con el estudio de Elahi y otros (Elahi y otros, Nature 504, 158-162 (2013)) es insuficiente por sí sola para explicar la hiporreactividad más general del brazo adaptativo. Sin embargo, la interacción entre las células T linfoides y las células presentadoras de antígeno mieloides (APC) puede servir como un centro de integración homeostática más general para gobernar el brazo efector adaptativo del sistema inmune. La interacción de los complejos antígeno-HLA en la activación de células T requiere dos señales, señalización de TCR y regulación de la coseñal. En comparación con el grupo de control, la expresión de HLA clase II se regula significativamente en casos de sepsis neonatal, lo que indica un nivel potencialmente reducido de presentación de antígeno y señalización de TCR (Figura 12a). Además, las células T vírgenes dependen en gran medida de la señalización conjunta, que desempeña una función vital en la promoción o inhibición de la activación de las células T. La interacción CD80/CD86/CD28 es la vía coestimuladora más fuerte y las células deficientes en CD28 no proliferan. En nuestros casos de sepsis neonatal, encontramos que la expresión diferencial de genes para esta vía disminuye drásticamente, así como la expresión de ICOS, CD27, LIGHT y c D2 (Figura 14d). Aunque hubo un pequeño número de casos infectados que mostraron una mayor expresión de TNFSF15, ICAM1, LFA-1 y 3, la regulación notablemente marcada de CD3, LIGHt yCD2fue indicativa de una supresión del cebado de células T que desempeña una función en la transición de los estados inactivo a activado (Figura 14d y Figura 8). En el caso de las vías coinhibidoras, se observó una respuesta de expresión génica diferencial altamente específica y selectiva para las transcripciones inhibidoras de tipo Ig del receptor (CD85A, CD85D, E, F y K) (Shiroishi y otros, PNAS 100, 8856-8861 (2003); Brown y otros, Tissue Antigens 64, 215-225 (2004).); Anderson y Allen, Inmunología 127, 8-17 (2009); Chang y otros, Nat Immunol 3, 237-243 (2002)) (Figura 14e). La expresión aumentada de estos marcadores tiene la capacidad en el caso específico de CD85K de convertir las células T en células supresoras (Chang y otros, Nat Immunol 3, 237-243 (2002)). Por lo tanto el examen del complejo sistema regulador de coseñalización revela una respuesta altamente focalizada y selectiva en la sepsis neonatal. Si bien estas respuestas pueden variar dinámicamente en el momento del muestreo, muestran claramente un patrón bastante restringido y específico. Estas vías reguladoras negativas sugieren un nuevo mecanismo significativo en los neonatos para contribuir a la supresión del brazo adaptativo.

Ejemplo 8: respuestas de la red específicas a la infección

Una cuestión central es si las redes del hospedero específicas asociadas con la infección se desarrollan y se presentan de manera uniforme en todos los pacientes. De hecho, podríamos anticipar que los pacientes individuales tendrán diferentes respuestas. Para examinar este problema, aplicamos un enfoque basado en datos para determinar redes de ARN coexpresados que son exclusivos de los lactantes infectados. Para estas investigaciones, evaluamos la dependencia lineal de las 824 sondas genéticas estadísticamente significativas y usamos un algoritmo de agrupación de Markov (MCL) para revelar sondas correlacionadas entre muestras de pacientes mediante el uso de la herramienta BioLayout (Theocharidis y otros, Nature protocolos 4, 1535-1550 (2009)). Cabe señalar que estos análisis tienen un grado de subjetividad basado en los parámetros de agrupamiento elegidos para los grupos discretos visualmente discernientes llamados "camarillas" y estos variarán en tamaño y grado de conectividad en dependencia de la configuración de los parámetros. Sin embargo, este enfoque es óptimo para explorar una asignación basada en datos de genes altamente corregulados con los casos infectados. Las Figuras 15a y b muestran los módulos de red desarrollados de genes coexpresados a partir de los datos mediante el uso de parámetros umbrales de la correlación de Pearson r=0,78 y valor de inflación de MCL de 4 y valor de preinflación de 3. En este análisis de red, se observa que 12 redes coexpresadas discernibles se asocian estrictamente con la infección y el análisis de la vía pos-hoc muestra que cada una corresponde a un proceso biológico definido (Figura 15b).

Se visualizaron perfiles de expresión específicos del paciente de redes de 824 sondas expresadas diferencialmente estadísticamente (adj.p <0,01, cambio de veces >2) mediante el uso de BioLayout Express 3D. Los grupos de genes coexpresados dentro de las redes se definieron después mediante la aplicación de un valor de expansión de agrupamiento de Markov (MCL) de 4. Doce grupos de genes que exhiben respuestas discernibles en el grupo de pacientes infectados muestran que incluso dentro del grupo infectado hay diferencias en los niveles de expresión para un grupo dado de genes, lo que ilustra la respuesta individual del paciente. Las principales vías canónicas asociadas con estos grupos son las siguientes (los valores p se muestran entre paréntesis): 01 - Señalización de interferón (6,27x10-8), activación de IRF por receptores de reconocimiento de patrones citosólicos (2,46x10-3), función de los receptores de reconocimiento de patrones en el reconocimiento de bacterias y virus (3,62x10-3), comunicación entre células inmunes innatas y adaptativas (3,72x10-3) , patogenia de la esclerosis múltiple (1,1x10-2), 02 - glicólisis/gluconeogénesis (2,51x10-3), regulación diferencial de la producción de citocinas en células epiteliales intestinales por IL-17A e IL-17F (2,13x10-2), vía de pentosa fosfato (2,68x10' 2), ciclo de la urea y metabolismo de grupos amino (2,86x10-2), metabolismo del nitrógeno (3,13x10-2), agrupación 03 -señalización de IL-8 (5,93x10-3), metabolismo de metano (1,03x10-2), biosíntesis de estilbeno, cumarina y lignina (1,23x10' 2), metabolismo de fenilalanina (2,45x10-2), señalización de TREM1 (3,46x10-2), 04 - función de los macrófagos, fibroblastos y células endoteliales en la artritis reumatoide (1,26x10-11), señalización de NF-kB (4,77x10-8), señalización de IL-10 (6,16x10-8), 38 señalización de MAPK (1,35x10-7), señalización de respuesta de fase aguda (7,61x10-7), 05 -señalización iCOS-iCOSL en células T auxiliadoras (1,45x10-5), apoptosis de células diana mediada por linfocitos T citotóxicos (3,81x10-5), vía de señalización de OX40 (5,31x10-5), señalización sistémica de lupus eritematoso (1,34x10-4), regulación de la expresión de IL-2 en linfocitos T activados y anérgicos (2,1x10-4), 06 - patogenia de la esclerosis múltiple (2,66x10-9), función de PKR en la inducción de interferón y la respuesta antiviral (1,18x10-2), función de la hipercitocinemia/hiperquimiocinemia en la patogénesis de la gripe (1,21x10-2), señalización de IL-10 (1,99x10-2), fagocitosis mediada por el receptor Fcy en macrófagos y monocitos (2,66x10-2), 07 - señalización de EIF2 (1,66x10-2), 08 - señalización de invasión de glioma (1,64x10-2), metabolismo de aminoazúcares (1,96x10-2), señalización de IL-17 (2,11x10-2), fibrosis hepática/activación de células estrelladas hepáticas (3,98x10-2), señalización de unión de células germinales de células de Sertoli (4,49x10-2), 09 - vía de pentosa fosfato (1,96x10-5), metabolismo del inositol (1,23x10-3), metabolismo de fructosa y manosa (1,05x10-2) metabolismo del glutatión (1,27x10-2), glicólisis/gluconeogénesis (1,95x10-2), 10 - señalización de eicosanoides (1,12x10-2), señalización de endocitosis mediada caveolar (1,39x10-2), activación de TR/RXR (1,66x10-2), señalización de paxilina (1,92x10-2), metabolismo del ácido araquidónico (1,94x10-2), 11 - desarrollo de células B (4,01x10-6), señalización de FcyRIIB en linfocitos B (1,19x10-5), señalización alterada de células T y células B en la artritis reumatoide (4,13x10-5), señalización de p70S6K (1,03x10-4), señalización de PI3K en linfocitos B (1,16x10-4) , y 12 - metabolismo de almidón y sacarosa (1,25x10-2), fagocitosis mediada por el receptor Fcy en macrófagos y monocitos (1,78x10-2), señalización de fMLP en neutrófilos (2,09x10-2), metabolismo de pirimidina (2,61x10-2), producción de óxido nítrico y especies de oxígeno reactivo en macrófagos (3,44x10-2).

Estas redes están de acuerdo con las investigaciones de biología de la vía descritas en la sección anterior, pero revelan claramente una heterogeneidad subyacente en términos de la respuesta de un paciente individual a la infección. Por ejemplo, la agrupación 01 define una subred específica de IFN tipo I (y vale la pena señalar que el gen CXCL10 sensible a IFN tipo II es un miembro importante de esta red que sugiere interrelación redundante entre la señalización de tipo I y II). La señalización de IFN tipo I en algunos casos puede ser perjudicial para los individuos con infecciones bacterianas que contribuye a la patogénesis de la infección (Decker y otros, Nat Rev Immunol 5, 675-687 (2005)). En los casos de pacientes que presentan la agrupación 01, no podemos descartar que aquellos pacientes que muestran una respuesta de IFN tipo I también puedan estar infectados por virus. El grupo 02 consiste en una red asociada con el metabolismo energético, mientras que el grupo 03 representa una red antimicrobiana de neutrófilos/IL-8. La asociación estadística de las 12 redes con 23 parámetros clínicos se investigó y resumió en la Figura 15c que muestra un número limitado de asociaciones con solo la agrupación 04 que carece de asociación estadística. La muerte se asoció débilmente con las agrupaciones 03 y 02; mientras que los niveles de azúcar se asociaron con las agrupaciones 01 y 06. La asociación con la agrupación 01 no es obvia y puede ser indicativa de la regulación de la glicólisis por IFN, mientras que la agrupación 06 consta de miembros asociados con la captación y el metabolismo de glicerol y también tiene una asociación con el requisito de ventilación. Las agrupaciones 05 y 02 tienen un sesgo de género, mientras que ninguna de las agrupaciones se asocia con la edad gestacional. No es sorprendente que la asociación más común sea con los neutrófilos y las agrupaciones 01, 05, 06, 11 y 12. Debe considerarse que el tamaño de la muestra general para estas asociaciones es pequeño y requerirá más estudios de validación.

La variabilidad entre pacientes observada para estas redes es tanto cualitativa como cuantitativamente alta y por lo tanto limita su utilidad como señal de infección dirigida por el huésped. También se observa heterogeneidad adicional en las respuestas entre pacientes para compartimentos de células inmunes específicas (Figura 6d). Por ejemplo, mientras que la mayoría de los casos de sepsis muestran altos niveles de marcadores de neutrófilos, un pequeño subconjunto tiene niveles proporcionales a la neutropenia. Por lo tanto un examen de los compartimentos celulares solo también es insuficientemente uniforme. Es particularmente notable que esto está en marcado contraste con la red dual de 52 genes identificada mediante el procedimiento de selección de características basado solo en información estadística y de vía (Figura 11a) que parece ser más uniformemente representativa de una respuesta a la infección invariante del paciente. Además, no existen asociaciones de confusión significativas con ninguno de los 23 parámetros clínicos probados.

Ejemplo 9: especificidad y validación de la red dual de 52 genes como clasificador de infección neonatal

Con la expectativa de que la red dual de 52 genes podría funcionar bien como clasificador, nos propusimos evaluar aún más su especificidad para la respuesta a la infección mediante el uso de cuatro algoritmos de aprendizaje automático distintos; bosque aleatorio, máquina de vectores de soporte, vecino más cercano k y características del operador receptor (ROC) para la clasificación. Para evaluar el rendimiento de cada algoritmo con respecto al rendimiento del nodo, estimamos el error de generalización (que mide qué tan bien se desempeña un algoritmo de aprendizaje en datos nuevos y no vistos) mediante el uso de un enfoque de validación cruzada de dejar uno fuera replicado. Replicamos el algoritmo de validación cruzada 100 veces para promediar cualquier variación en las estimaciones de error resultantes de la aleatoriedad involucrada en el procedimiento de validación cruzada mientras dividimos el conjunto de datos en conjuntos de entrenamiento y prueba en cada etapa. La Figura 16a muestra la tasa de error promedio de omisión de más de 100 repeticiones como una medida de rendimiento con biomarcadores enumerados secuencialmente. Cuando el número de genes incluidos estaba entre 4 y 19, la tasa de error estaba entre 0 y 2 %. Cuando se incluyeron 19 o más marcadores, la tasa de error fue consistentemente 0 % con los cuatro métodos de aprendizaje automático probados, lo que confirma la consistencia interna del conjunto de genes seleccionado como clasificador. Agradablemente, este número de genes de red está en buen acuerdo con el número óptimo estimado de biomarcadores de nuestros estudios de simulación predictivos previos in silico(Khondoker y otros, Journal of Bioinformatics and Computational Biology 08, 945-965 (2010). Para realizar más pruebas de nuestro conjunto de marcadores de 52 genes, procedimos con el clasificador basado en ROC, ya que esto no requiere ningún ajuste de parámetros y simplifica la clasificación a una decisión univariada que puede aplicarse fácilmente a conjuntos de prueba independientes. Un análisis de las vías individuales mediante el uso del clasificador basado en ROC proporcionó una precisión del 84 % para los marcadores innatos, el 65 % para los marcadores adaptativos y el 74 % con los marcadores metabólicos; mientras que los tres marcadores de vías combinados dieron una precisión mejorada del 98 % (sensibilidad=100 %, especificidad=97 %). Por lo tanto, la combinación de las tres vías proporciona un clasificador óptimamente robusto.

A continuación, se realizó la replicación y validación del clasificador en diferentes plataformas de micromatrices y muestras de pacientes que no formaban parte del proceso original de selección de genes (Figura 16b y Figura 5). En nuestro conjunto de pruebas de plataforma, usamos 42 muestras de pacientes existentes (18 infectadas, 24 controles) para 48 genes (emparejados) con una plataforma de micromatrices completamente diferente. Un clasificador ROC basado en el conjunto de entrenamiento cuando se aplicó a esta plataforma asignó correctamente el 100 % de las muestras para grupos infectados por bacterias o de control (sensibilidad=100 %, especificidad=100 %).

En nuestro conjunto de pruebas de validación, usamos un conjunto nuevo e independiente de 26 muestras (16 infectadas, 10 controles) que se analizaron en tres plataformas de micromatrices diferentes. La clasificación por ROC basada en el conjunto de entrenamiento cuando se aplica al nuevo conjunto de prueba de validación asignó correctamente el 100 % de las muestras a grupos de control o infectados por bacterias con sensibilidad=100 % y una especificidad=100 %. Cabe destacar que otras tres muestras infectadas por virus se clasifican como control y se alinean con las muestras de control en agrupación jerárquica (Figura 16c). Estos resultados están de acuerdo con el caso infectado con CMV que se muestra en la Figura 10 que tampoco es reconocido por la red dual y también se agrupa con los controles y las muestras no infectadas por bacterias. A continuación buscamos comparar el resultado de la red dual de 52 genes con otros biomarcadores de proteínas del huésped recientemente publicados (CD69 y FGCR1A) de sepsis neonatal que informan una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 22-44 % (Labib y otros, International Journal of Microbiological Research 4, 77-85 (2013)). Vale la pena señalar que FGCR1A también es miembro del clasificador de red dual de 52 genes. Para este propósito, probamos si los niveles de expresión de CD69 y FGCR1A (CD64) predecirían la infección en el conjunto de entrenamiento de Illumina. El análisis LOOCV de estos marcadores a nivel de ARN desarrolló una sensibilidad del 74 % con una especificidad del 91 % con una precisión general del 84 %. Si bien estos resultados muestran el uso potencial de estos marcadores, exhiben claramente valores de sensibilidad menores que la especificidad y tienen una precisión reducida en comparación con el clasificador de red dual.

La necesidad clínica más apremiante, sin embargo, es identificar la infección bacteriana en individuos que se sospecha que tienen infección la primera vez que se desarrollan los síntomas, que posteriormente tienen cultivos bacterianos negativos. Para explorar esta posibilidad seleccionamos un grupo completamente nuevo de 30 pacientes que se sospechaba que estaban infectados al momento de la recolección de la muestra, pero que tenían resultados negativos en los análisis de hemocultivo. Cuando el algoritmo de clasificación basado en las características del operador del receptor se aplicó a este conjunto de pruebas de sospechosos de infección, asignó 17 de las 30 muestras de pacientes al grupo infectado por bacterias (Figura 16d). La evaluación posterior de expertos basada en criterios clínicos indicó 6 infectados y 16 no infectados (Figura 16di) con 9 donde no se pudo realizar una categorización clínica con confianza (Figura 16diii). La concordancia entre la predicción del clasificador y la opinión de expertos para los infectados y no infectados se probó como moderada (kappa de Cohen k= 0,24, en relación con lo empíricamente alcanzable k= 0,46) (Figura 16dii) y la comparación de la infección pronosticada por el clasificador con la evaluación experta mostró un buen acuerdo con las diferencias estadísticamente significativas en días sobre antibióticos y conteo de neutrófilos entre el control clasificado y las muestras sospechosas de infección (Figura 16e). Estos hallazgos destacan la dificultad que enfrentan los médicos para determinar los casos de sepsis negativa en hemocultivos y respaldan firmemente la posible utilidad clínica futura del clasificador evaluado en un estudio transversal. En total, concluimos que la red dual de 52 genes tiene una excelente eficacia para identificar infecciones bacterianas con muy alta sensibilidad y especificidad.

Ejemplo 10: la red dual de 52 genes es robusta frente a la edad gestacional

Estos resultados respaldan la posibilidad de usar la red dual de 52 genes como un clasificador para la infección bacteriana. Sin embargo, al considerar los datos demográficos es evidente que hay una diferencia en la edad gestacional corregida media de los grupos infectados y de control. Por lo tanto es importante asegurarse de que las diferencias observadas en la expresión génica de los 52 genes en la red dual entre el control y los grupos infectados no son un reflejo de la diferente madurez del sistema inmune. Por lo tanto examinamos nuestro conjunto de genes clasificadores adicionalmente al observar la expresión de genes dentro de los grupos de acuerdo con la edad gestacional. En particular encontramos que no hay diferencia estadística en la expresión génica de la red dual de 52 genes entre lactantes de diferentes edades gestacionales (Tabla 6). Por lo tanto en este grupo de estudio el rasgo de la red dual de 52 genes es robusto contra la variación a través de las edades gestacionales. También es digno de mención que aunque en general se detecta un aumento estadísticamente significativo en los neutrófilos (Figura 12d); la red dual también es confiable para estratificar a los lactantes infectados que tenían neutropenia. Esta observación fortalece aún más la propuesta de usar un rasgo unificado de redes de genes altamente conectadas en lugar de genes individuales para un clasificador.

La Tabla 6 muestra pruebas estadísticas del efecto de la edad gestacional en la expresión génica durante la sepsis neonatal. Dentro de cada grupo de muestra (control, infectado), las muestras se clasificaron por edad en cajas basadas en el 33 % y el 66 % de los valores cuantitativos de edad gestacional corregidos, y se obtuvieron tres grupos de edad (joven, medio, mayores). Las edades gestacionales corregidas para los grupos de edad fueron: control de jóvenes <279, control medio 279-293, control mayores> 293, infección joven <209, infección medio 209-222 e infección mayores> 222. Las comparaciones por pares de las agrupaciones mayores vs joven y mayores vs medio se realizaron mediante el uso de eBayes y el número de loci significativos (adj.p <0,05) se muestran en la tabla. Los genes regulados diferencialmente fueron: mayores vs medio infectados (POTEA y POTEG), mayores vs joven infectados (POTEA, POTEG, A4GNT, AAAS y AACS) y mayores vs joven control (POTEA, POTEG, A4Gn T, AAAS, AACS, NCEH1, AAK1 y AAMP). Ninguno de estos genes se expresó significativamente de manera diferencial entre las muestras infectadas y de control.

Tabla 6

Ejemplo 11 - Análisis combinatorio

Las combinaciones de biomarcadores de la red de nodo dual de 52 genes, dentro y entre las vías, se analizaron para determinar su precisión de detección al predecir la sepsis en neonatos en dos etapas. (1) Con inicio con las 62 muestras referidas como el 'conjunto de entrenamiento' (todos los datos procesados y transformados log2), aplicamos un análisis ROC para cada gen individual. (1a) Para el gen dado, el valor de expresión más bajo se tomó de entre sus 62 mediciones, y se denominó el delta del umbral actual. (1b) Todas las muestras para las que la medición de la expresión de este gen cae por debajo de delta se clasificaron como "sin sepsis" (para el valor mínimo sería cero), y todas las que caen por encima de delta como "sepsis" (para el valor de expresión mínimo, todas las muestras se clasificarían como casos de sepsis). (1c) Las clases asignadas se compararon con la clase real conocida, es decir, se obtuvieron sensibilidad y especificidad para el delta actual. Las etapas anteriores (1a-1c) se repitieron con el siguiente valor de expresión más bajo entre las mediciones del gen dado hasta que se alcanzó el valor de expresión máximo para el gen. Finalmente, a partir de los datos de sensibilidad y especificidad recolectados para cada delta, se construyeron curvas ROC para cada gen (Figura 17).

En una segunda etapa, los biomarcadores del conjunto de 52 marcadores que se encontraron expresados diferencialmente en relación con los controles durante la infección por influenza se eliminaron del análisis y solo aquellos genes donde la predicción era para infección bacteriana (en lugar de infección viral) se retuvieron para su posterior análisis. La Figura 18 muestra la identificación de los 3 biomarcadores principales para cada vía en función de su rendimiento ROC individual medido por el área bajo la curva AUC (es decir, qué tan bien el gen individual distingue entre el control y los neonatos infectados).

La precisión de clasificación (%) (que se muestra en todos los paneles) del clasificador se determinó mediante una prueba de validación cruzada de dejar uno fuera (LOOCV). El panel A proporciona la precisión de clasificación para los genes principales 2 y 3 de cada vía (clasificación con escala de datos a la media). El panel B muestra los resultados de un análisis combinatorio de ROC que indica la precisión de detección cuando se combinan genes de diferentes vías. Cuando los dos genes principales de la vía metabólica (SLC2A3 y GPR84) se analizan en combinación con los dos principales genes de la vía de inmunidad adaptativa (LRRN3 y TRAJ17), esos 4 genes en conjunto proporcionan una precisión de clasificación de sepsis del 98,4 %. Cuando se analizan los dos principales genes de la vía metabólica (SLC2A3 y GPR84) en combinación con los tres principales genes de la vía de inmunidad adaptativa (LRRN3, TRAJ17 y CD3D), esos 5 genes en conjunto proporcionan una precisión de clasificación de sepsis del 100 %. Adicionalmente, cuando los tres principales genes de la vía metabólica (SLC2A3, GPR84 y RETN) se analizan en combinación con los dos principales genes de la vía de inmunidad adaptativa (LRRN3 y TRAJ17), esos 5 genes en conjunto proporcionan una precisión de clasificación de sepsis del 100 %.

Una combinación de los dos principales genes de la vía de inmunidad innata (BASP1 y CKAP4) con los dos principales genes de la vía de inmunidad adaptativa (LRRN3 y TRAJ17), proporciona una precisión de clasificación de sepsis del 100 %. Además, cuando los dos principales genes de la vía de inmunidad innata (BASP1 y CKAP4) se analizan en combinación con los tres principales genes de la vía de inmunidad adaptativa (LRRN3, TRAJ17 y CD3D), esos 5 genes de conjunto proporcionan una precisión de clasificación de sepsis del 98,4 %. Adicionalmente, cuando los tres principales genes de la vía de inmunidad innata (BASP1, CKAP4 y C190rf59) se analizan en combinación con los dos principales genes de la vía de inmunidad adaptativa (LRRN3 y TRAJ17), esos 5 genes en concierto proporcionan una precisión de clasificación de sepsis del 100 %.

El panel C proporciona la precisión de clasificación para el conjunto de genes clasificador completo de 52 genes, así como las vías completas y combinaciones de vías completas. El uso de biomarcadores de cualquiera de las vías en combinación proporciona una precisión de clasificación de más del 93,6 %. Los resultados apoyan la posibilidad de usar combinaciones de biomarcadores de las 3 vías como clasificadores para la infección bacteriana.

Las Tablas 7-11 muestran los criterios clínicos evaluados en las muestras de estudio.

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Tabla 10

Tabla 11

Trabajo experimental y analítico adicional

Se realizaron estudios adicionales para validar aún más los resultados iniciales discutidos en los Ejemplos del 1 al 11. En particular, estudios adicionales se centraron en una población de fuera del Reino Unido con una composición étnica diferente, una población adulta y una población neonatal adicional. Este trabajo respalda los hallazgos en los estudios anteriores discutidos anteriormente, y proporciona evidencia de que los biomarcadores de la presente invención proporcionan una detección robusta y precisa de la sepsis.

Adicionalmente, se realizaron análisis estadísticos adicionales para identificar biomarcadores preferidos para la sepsis en adultos, pero estos hallazgos también pueden ser muy relevantes para pacientes pediátricos y neonatales.

Ejemplo 12 - Muestras de Gambia

Ahora analizamos el rendimiento del clasificador mediante el uso de ARN de sangre completa de 117 lactantes y niños africanos con sepsis positiva en hemocultivos: este estudio se realizó en Gambia. Este es un grupo mucho más antiguo que el analizado en el estudio anterior de lactantes pretérminos neonatales anterior y se encuentra en un entorno étnico muy diferente. En general se detectó una precisión del 92 % para predecir la sepsis, que es un resultado notablemente bueno. Los resultados se muestran en la Figura 19, junto con los detalles del grupo de pacientes. Los resultados se estratifican para que pueda verse cómo esto se desglosa en términos de demografía de edad, sexo y gravedad clínica de la enfermedad. Este análisis se realizó con 47 de los 52 biomarcadores, ya que algunos de los biomarcadores estaban ausentes de la plataforma usada en los estudios gambianos. Se usó el sistema Affymetrix Human Genome U219.5. Los biomarcadores omitidos por razones técnicas (es decir, que no están presentes en la matriz o que faltan anotaciones o son incorrectos) fueron LIME1, SLC2A3, TRAJ17, TRBV28, "LOC729021 // LOC729010".

Ejemplo 13 - Muestras de adultos

Ahora se analizó el rendimiento del clasificador de 52 marcadores con datos de adultos para sepsis. Los resultados observados fueron muy positivos. Se observó una precisión del 91 % en adultos, que es solo un porcentaje (8 %) inferior en rendimiento en comparación con la población neonatal. No hay sesgo de género. Además, en este conjunto de datos se tomaron muestras en diferentes días después del diagnóstico de la sepsis (días 1-5) y por lo tanto esto nos permite puntuar la sensibilidad en diferentes tiempos de muestreo. Esto funciona al 100 % y, como igualamos los controles para las muestras del día 5, también podemos calcular la precisión, que en este caso es del 85 %. En consecuencia el rendimiento se mantiene en diferentes momentos del muestreo. La Figura 20B muestra el resultado en forma gráfica y la Figura 20A muestra la demografía del grupo de estudio.

Ejemplo 14 - muestras neonatales adicionales

El clasificador de 52 marcadores ahora se aplicó a los neonatos mediante el uso de un conjunto de muestras completamente diferente. El rendimiento en este conjunto muestra una precisión que está en el intervalo de 83 % -100 %. Esto proporciona pruebas contundentes de un alto rendimiento repetido en tres poblaciones completamente independientes, lo que respalda nuevamente la promesa de la presente invención. Los resultados se muestran en la Figura 21.

Es interesante notar que en los casos levemente enfermos la sensibilidad disminuye ligeramente. Por lo tanto esto apoya el uso de los biomarcadores de la presente invención como un indicador pronóstico y para determinar la respuesta terapéutica antibiótica.

Ejemplo 15 - Análisis estadístico adicional

Se realizaron análisis estadísticos adicionales mediante el uso de los 52 biomarcadores y varios conjuntos de datos, incluidos los nuevos datos para adultos discutidos anteriormente. El objetivo era tanto identificar combinaciones de biomarcadores de dos de los grupos de marcadores inmunes adaptativos, innatos y metabólicos (es decir, A, B y C) que proporcionan una prueba muy precisa, como también identificar qué biomarcadores aparecen con mayor frecuencia en las listas de mejor desempeño cuando se examinan grandes cantidades de combinaciones posibles. Por lo tanto se examinó un gran número de posibilidades combinatorias entre las listas de vías con el objetivo de optimizar la precisión de la detección de sepsis en adultos y determinar biomarcadores clave de manera más general. La Figura 28 ilustra esquemáticamente este trabajo.

Los resultados se resumen en las Tablas de la 12 a la 14 a continuación. Estas muestran que es posible lograr una precisión del 100 % mediante la combinación de biomarcadores seleccionados de dos vías. La combinación de biomarcadores de las vías de inmunidad innata y metabólica proporciona 2 listas combinadas que alcanzan un 100 % de precisión (100 % de precisión es 100 % de sensibilidad con 100 % de especificidad). La combinación de biomarcadores de las vías de inmunidad adaptativa con metabólica proporciona 331 listas combinadas que alcanzan el 100 % de precisión, pero solo los 5 con menos o igual a 7 genes se muestran en la tabla a continuación. La combinación de vías de inmunidad innata y adaptativa produce 210 listas combinadas que alcanzan el 100 % de precisión, pero solo las 6 con menos de 10 genes.

Todas estas listas combinadas demuestran una precisión del 100 % en los datos de prueba. Será evidente que el 100 % de precisión es un estándar muy riguroso, y tal precisión puede no ser necesaria para una prueba clínicamente útil. Por lo tanto usar menos biomarcadores, o un conjunto de marcadores menos óptimo, puede proporcionar un resultado muy útil.

El conjunto más pequeño de biomarcadores proviene de la combinación de inmunidad adaptativa con metabólica (Tabla 13) - aquí el número más pequeño de genes combinados es 6 que tienen una precisión del 100 % para detectar sepsis en adultos.

T a b la 12 - L is ta s c o m b in a d a s d e b io m a rc a d o re s c a p a c e s d e lo g ra r 100 % d e p rec is ió n

Listas de marcadores de la Inmunidad innata más Listas de marcadores del metabolismo

Tabla 13 - Listas combinadas de biomarcadores capaces de lograr 100 % de precisión

L is tas d e m a rc a d o re s d e la In m u n id ad in n a ta m á s L is tas d e m a rc a d o re s d el m e ta b o lis m o

Tabla 14 - Listas combinadas de biomarcadores capaces de lograr 100 % de precisión

L is tas d e m a rc a d o re s d e la In m u n id ad in n a ta m ás L istas d e m a rc a d o re s del m e tab o lism o

Este trabajo apuntala aún más la potencia de diagnóstico de los biomarcadores de la presente invención. Además, muestra que hay una multitud de selecciones potenciales de los biomarcadores de los grupos A, B y C, que pueden combinarse para formar la base de un ensayo de diagnóstico/pronóstico adecuado.

Las Figuras de la 22 a la 24 muestran los resultados de un análisis para determinar con qué frecuencia aparecen varios biomarcadores de los grupos A, B y C en las combinaciones de biomarcadores para diagnosticar sepsis en adultos que alcanzan una sensibilidad de al menos 85 % y una especificidad de al menos 70 % - estos valores se correlacionan con una prueba diagnóstica potente y robusta y, por lo tanto representan un umbral adecuado para este análisis estadístico (sin embargo, valores de sensibilidad/especificidad más altos o más bajos pueden, por supuesto, ser apropiados en dependencia del contexto). Puede considerarse que los biomarcadores que aparecen con más frecuencia son particularmente útiles para el diagnóstico en contextos clínicos típicos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar sepsis, el método comprende las etapas de:

a) analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto para determinar los niveles de cuatro o más biomarcadores, los biomarcadores comprenden SLC2A3, GPR84, RETN y LRRN3 y opcionalmente uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de cualquiera de;

- grupo A, que consiste en: GYG1, B4GALT5, HK3, PFKFB3, STXBP2, FPR2, ALPL, GRINA, FFAR2,y MPO; - grupo B, que consiste en: IL1RN, BASP1, PSTPIP2, CKAP4, DYSF, C19orf59, IL18R1, MMP9, FGR, SPI1, PGLYRP1, RNF24, ANKRD22, CEBPD, IL1R2, LOC729021 (SCRAP-tipo helicasa), S100A12, ITGAM, FCGR1A, IFITM3, CSF3R, LCN2, TNFAIP6, HP, ORM1, CEACAM1 y PRTN3;

- y el grupo C, que consiste en: GRAP, TRAJ17, CD3D, CD247, ITM2A, LIME1, HLA-DMB, CD7, MAL, TRBV28, RPS29; y

b) comparar los niveles de los biomarcadores determinados en (a) con uno o más valores de referencia, en donde una diferencia en los niveles de expresión de los cuatro o más biomarcadores en la(s) muestra(s) del sujeto en comparación con el uno o más valores de referencia es indicativo de sepsis.

2. El método de la reivindicación 1 en donde, en la etapa a) los biomarcadores son SLC2A3, GPR84, RETN, LRRN3, TRAJ17, CD3D, BASP1, CKAP4 y C19orf59.

3. El método de la reivindicación 1 en donde, en la etapa a) los biomarcadores adicionales comprenden TRAJ17, y opcionalmente comprenden CD3D.

4. El método de cualquier reivindicación anterior en donde el sujeto es un niño o neonato humano.

5. El método de cualquier reivindicación anterior en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que comprende: una muestra de sangre; una muestra de líquido cefalorraquídeo; una muestra de saliva, tal como un hisopado bucal; una muestra de fluido pulmonar; eritrocitos; leucocitos; y una muestra de heces.

6. El método de cualquier reivindicación anterior en donde el biomarcador comprende una proteína biomarcadora o una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína biomarcadora.

7. El método de cualquier reivindicación anterior en donde el biomarcador es una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína biomarcadora.

8. El método de la reivindicación 7 en donde el biomarcador es una molécula de ARNm que codifica la proteína biomarcadora.

9. El método de cualquier reivindicación anterior en donde los niveles de los biomarcadores en la muestra biológica se investigan mediante el uso de parejas de unión específicas seleccionadas del grupo que consiste en ácidos nucleicos complementarios; aptámeros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

10. Un dispositivo para usar en el diagnóstico de la sepsis, el dispositivo comprende:

a) un área de carga para la recepción de una muestra biológica;

b) parejas de unión que consisten en parejas de unión específicas para moléculas diana indicativas de la expresión de los biomarcadores como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9; y

c) medios de detección para detectar los niveles de dicho biomarcador presente en la muestra.

11. Un kit de partes para determinar selectivamente, en una muestra, los niveles de los biomarcadores para la sepsis como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, en donde el kit comprende:

a) parejas de unión que consisten en parejas de unión que se unen selectivamente y específicamente a los biomarcadores como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9;

b) un control positivo para la detección de dichos biomarcadores;

c) al menos una pareja de unión que se une selectivamente a un ácido nucleico que opera como un control interno; y

d) opcionalmente un estándar interno.