ES2784182T3 - Composiciones y métodos para inducir la apoptosis - Google Patents

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Jindrich Henry Kopecek
Jiyuan Yang
Te-Wei Chu
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Abstract

Un primer complejo y un segundo complejo para usar en el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes con participación de linfocitos B en un paciente: (i) donde dicho primer complejo comprende una fracción de direccionamiento y un morfolino, y donde dicho tratamiento involucra poner la población de linfocitos B de dicho paciente en contacto con dicho primer complejo; y (ii) donde dicho segundo complejo comprende un copolímero portador y uno o más morfolinos, y donde dicho tratamiento involucra poner la población de linfocitos B de dicho paciente en contacto con dicho segundo complejo; donde poner en contacto las células con el primer complejo y con el segundo complejo induce la apoptosis de las células, donde el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo son complementarios, donde la fracción de direccionamiento es específica para el receptor CD20.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para inducir la apoptosis
Referencia a solicitud relacionada
La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisoria estadounidense n.° 61/776,999 presentada el 12 de marzo de 2013.
Estado de la técnica
Las plataformas terapéuticas macromoleculares sin fármacos poseen gran potencial para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos. Por ejemplo, la reticulación de los antígenos CD20 seguida por la inducción de la apoptosis que se describe en la presente puede usarse para tratar una variedad de enfermedades y trastornos como los tumores malignos de linfocitos B, los trastornos inflamatorios y las enfermedades autoinmunes con participación de linfocitos B.
El linfoma no Hodgkin (LNH) es un tipo de cáncer con alta prevalencia a nivel mundial con una alta tasa de mortalidad. En 2012, tan solo en los Estados Unidos, hubo 70130 nuevos casos de LNH y 18940 atribuidas a la enfermedad. Aproximadamente el 85 % de los LNH son tumores malignos que se originan en linfocitos B, mientras que los restantes se originan en linfocitos T. Los LNH de linfocitos B incluyen los linfomas de Burkitt, los linfomas difusos de linfocitos B grandes, los linfomas foliculares, los linfomas inmunoblásticos de células grandes, los linfomas linfoblásticos de células B precursoras y los linfomas de células de manto. Estos tipos de cáncer generalmente se clasifican como indolentes o agresivos, y más del 95 % de los linfomas de linfocitos B expresan el antígeno de superficie celular CD20. Los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD20, principalmente el rituximab, son inmunoterapias frecuentemente empleadas para el tratamiento de pacientes con LNH. Sin embargo, la inmunoterapia tiene una tasa de respuesta general baja (menor del 50 % en el caso del LNH recurrente o resistente) y puede provocar efectos secundarios poco frecuentes, pero potencialmente letales (p. ej., leucoencefalopatía multifocal progresiva). Muchos investigadores han atribuido la falta de respuesta clínica y los efectos adversos de los anticuerpos monoclonales anti-CD20 a los eventos celulares inducidos por el receptor Fc.
El documento de patente US 2003/003102 A1 aborda la cuestión de mejorar la eficacia de un tratamiento contra el cáncer mediante un método para direccionar un agente terapéutico o de diagnóstico a un sitio tumoral blanco en mamíferos. En este contexto, el documento de patente US 2003/003102 A1 divulga un complejo de morfolino que transporta un agente terapéutico o de diagnóstico. Sin embargo, parece que dicho complejo sufre de problemas de biodistribución.
Así, aún escasean en la técnica composiciones y métodos efectivos para el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes que involucran linfocitos B. La presente invención atiende estas necesidades, entre otras.
Objeto de la invención
En la presente, se divulgan complejos que comprenden una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido.
En la presente, se divulgan complejos que comprenden una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, donde la fracción de direccionamiento es un fragmento Fab', donde el fragmento Fab' es específico para un receptor CD20, donde el oligonucleótido es un morfolino y donde el fragmento Fab' está conjugado al morfolino mediante un enlace tioéter.
En la presente, se divulgan complejos que comprenden un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos.
En la presente, se divulgan complejos que comprenden un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, donde el copolímero portador comprende una cadena principal y una o más cadenas secundarias, donde el copolímero portador comprende N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicinatiazolidina-2-tiona, donde la(s) cadena(s) secundaria(s) pueden conjugarse con el/los oligonucleótido(s), donde el/los oligonucleótido(s) son morfolinos.
En la presente, se divulgan kits que comprenden un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos.
En la presente, se divulgan kits que comprenden un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, e instrucciones para administrar el primer complejo y el segundo complejo.
En la presente se divulgan métodos para inducir la apoptosis, donde el método comprende poner una población de células en contacto con un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido; y poner una población de células en contacto con un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; donde el contacto de las células con el primer complejo y con el segundo complejo induce la apoptosis de las células.
En la presente se divulgan métodos para inducir la apoptosis, donde el método comprende poner una población de células en contacto con una composición que comprende un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un segundo complejo que comprende
un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; donde la administración de la primera composición y de la segunda composición induce la apoptosis de una población de células blanco en el sujeto.
En la presente se divulgan procesos para sintetizar un complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, donde el proceso comprende obtener una fracción de direccionamiento, modificar un oligonucleótido y conjugar la fracción de direccionamiento con el oligonucleótido.
En la presente se divulgan procesos para sintetizar un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, donde el proceso comprende obtener un copolímero portador, modificar el/los oligonucleótido(s) y conjugar el copolímero portador con el/los oligonucleótido(s).
En la presente se divulgan procesos para sintetizar un complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, donde el proceso comprende poner un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido con un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos.
Descripción de las figuras
Las Figuras adjuntas, que se incorporan a esta especificación y forman parte de ella, ilustran varios aspectos de las invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.
La FIG. 1 muestra un diagrama esquemático que describe un diseño ejemplar de una plataforma terapéutica macromolecular sin fármacos para el agotamiento de linfocitos B mediante la apoptosis mediada por la reticulación de receptores CD20 inducida por la hibridación de oligonucleótidos.
La FIG. 2 muestra la estructura química y las secuencias de bases nitrogenadas de un par ejemplar de morfolinos complementarios: MORF1-m (ID DE SEC. N.° 25) y MORF2-m (ID DE SEC. N.° 26).
La FIG. 3A y la FIG. 3B muestran la síntesis de un complejo Fab'-MORFI y un complejo copolímero-MORF2 con múltiples copias de MORF2.
La FIG. 4 muestra la hibridación in vitro del complejo Fab'-MORFI con el complejo copolímero-MORF2 caracterizada por medio de dispersión dinámica de luz (DLS).
La FIG. 5 muestra el biorreconocimiento del complejo Fab'-MORFI y del complejo copolímero-MORF2 en la superficie de linfocitos B Raji, analizado mediante microscopia de fluorescencia confocal.
La FIG. 6A y la FIG. 6C muestran la inducción de la apoptosis en linfocitos B Raji utilizando el complejo Fab'-MORFI y el complejo copolímero-MORF2, analizada por los tres métodos.
La FIG. 7 muestra la inducción de la apoptosis dependiente de la concentración de los linfocitos B, analizada mediante una determinación de unión de anexina V/ioduro de propidio (PI).
La FIG. 8A y la FIG. 8B muestran los estudios de control de la determinación de unión de anexina V/ioduro de propidio (PI) en linfocitos B Raji (CD20+) y células DG-75 (CD20‘).
La FIG. 9 muestra un diagrama esquemático del autoensamblado de nanoconjugados híbridos para la inducción de la apoptosis.
Las FIG. 10A a 10D muestran la síntesis y caracterización del complejo Fab'-MORFI y del complejo P-MORF2. Las FIG. 11A a 11C muestran la hibridación in vitro de los complejos Fab'-MORFI y P-MORF2.
Las FIG. 12A a 12C muestran el biorreconocimiento del complejo Fab'-MORFI y del complejo P-MORF2 en la superficie celular.
Las FIG. 13A a 13C muestran la inducción de la apoptosis en linfocitos B Raji usando los complejos y/o las composiciones divulgados.
La FIG. 14 muestra la eficacia terapéutica de los complejos divulgados y/o las composiciones divulgados contra el linfoma en ratones SCID.
Las FIG. 15A a 15E muestran la erradicación de células Raji en ratones SCID usando los complejos divulgados y/o las composiciones divulgados.
Las FIG. 16A a 16C muestran un examen histopatológico de ratones luego del tratamiento con PBS, y con Fab'-MORF1 y P-MORF2.
Las FIG. 17A a 17E muestran la caracterización del complejo Fab'-MORF1.
Las FIG. 18A a 18E muestran la caracterización del complejo P-MORF2.
La FIG. 19 muestra el efecto hipocrómico ante la hibridación de MORF1 y MORF2 libres no conjugados.
La FIG. 20 muestra los diámetros hidrodinámicos efectivos de los complejos Fab'-MORF1 y P-MORF2, así como de los precursores Fab'-SH y P-TT.
Las FIG. 21A a 21D muestran el análisis de hibridación de MORF libres no conjugados, los conjugados y sus mezclas mediante espectroscopia de dicroísmo circular.
La FIG. 22A y la FIG. 22B muestran un análisis de la temperatura de desnaturalización (Tm) de la hibridación Fab'-MORF1/P-MORF2 mediante espectroscopia de dicroísmo circular.
Las FIG. 23A a 23C muestran un análisis de la temperatura de desnaturalización (Tm) de la hibridación MORF1/MORF2 mediante espectroscopia de dicroísmo circular.
La FIG. 24A y la FIG. 24B muestran estudios de la apoptosis in vitro en células Raji y células DG75.
La FIG. 25A y la FIG. 25B muestran la apoptosis de linfocitos B Raji analizada mediante distintas determinaciones y con distintos tiempos de incubación.
Las FIG. 26A a 26C muestran resonancias magnéticas poscontraste en plano sagital ponderadas en Ti de ratones inyectados con linfocitos B Raji y expuestos a diferentes tratamientos.
Las FIG. 27A a 27F muestran un análisis por citometría de flujo de los linfocitos B residuales en diferentes órganos/tejidos de ratones con tumores sometidos a diferentes tratamientos.
La FIG. 28 muestra el peso corporal de ratones inyectados con linfocitos B Raji y expuestos a diferentes tratamientos. La FIG. 29 muestra los perfiles de actividad en sangre en función del tiempo de conjugado Fab'-MORF marcado con 125I en ratones SCID.
Otras ventajas de la invención se comunican, en parte, en la descripción siguiente y, en parte, serán evidentes a partir de la descripción o podrán conocerse con la práctica de la invención. Debe entenderse que tanto la descripción general precedente como la descripción detallada siguiente son ejemplares y no pretenden limitar la invención que se reivindica.
Descripción detallada de la invención
La presente invención puede entenderse más fácilmente consultando la descripción detallada de la invención y los ejemplos incluidos en la presente.
Antes de describir los compuestos, las composiciones, los artículos, los sistemas, los dispositivos y/o los métodos de la presente, debe entenderse que estos no se limitan a métodos de síntesis específicos a menos que se indique lo contrario, ni se limitan a reactivos particulares a menos que se indique lo contrario dado que estos, naturalmente, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente es únicamente para describir aspectos particulares y no pretende limitar el alcance de la presente. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente para la aplicación o evaluación de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales ejemplares.
A. De f in ic io n e s
En la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen a los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
En la presente, los rangos podrán expresarse como desde “aproximadamente” un valor particular y/o hasta “aproximadamente” otro valor particular. Cuando se expresa un rango de este modo, otro aspecto incluye el rango desde el primer valor particular y/o hasta el otro valor particular. Análogamente, cuando los valores se expresan como aproximaciones mediante el término “aproximadamente”, se entenderá que el valor particular conforma otro aspecto. Asimismo, se entenderá que los extremos de cada uno de los rangos son significativos tanto en relación con el otro extremo como independientemente de él. También se entiende que en la presente se divulgan una serie de valores y que cada uno de los valores también se divulga como “aproximadamente” dicho valor particular además del valor en sí. Por ejemplo, si se divulga el valor “10”, también se divulga “aproximadamente 10”. También se entiende que se divulga cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se divulgan los valores 10 y 15, también se divulgan 11, 12, 13 y 14.
Las referencias en la especificación y las reivindicaciones a partes por peso de un elemento o componente particular en una composición denotan la relación de pesos entre el elemento o componente y cualquiera otros elementos o componentes en la composición o artículo de la que se expresa una parte por peso. Así, en un compuesto que contiene 2 partes por peso de un componente X y 5 partes por peso de un componente Y, X e Y están presentes en una proporción de pesos de 2:5, y están presentes en tal proporción independientemente de que el compuesto contenga otros componentes.
En la presente, los términos “opcional” u “opcionalmente” indican que el evento o la circunstancia que se describe posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye los casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y los casos en los que no ocurre. Por ejemplo, en un aspecto, un complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido puede comprender opcionalmente una marca detectable. En un aspecto, un método divulgado puede comprender opcionalmente repetir la administración de una composición y/o un complejo divulgados.
En la presente, el término “análogo” hace referencia a un compuesto que tiene una estructura derivada de la estructura de un compuesto padre (p. ej., un compuesto divulgado en la presente) y cuya estructura es suficientemente similar a aquellos divulgados en la presente como para que, sobre la base de dicha similitud, la persona versada en la técnica espere que el compuesto exhiba actividad o utilidad idénticas o similares a las de los compuestos reivindicados o para inducir, como precursor, actividad o utilidad idénticas o similares a las de los compuestos reivindicados.
En la presente, el término “homólogo” hace referencia a un polipéptido o ácido nucleico que presenta homología con una secuencia conocida. Específicamente, se divulgan variantes de los ácidos nucleicos y polipéptidos divulgados en la presente que tienen una homología de al menos 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más por ciento con la secuencia indicada o conocida. La persona versada en la técnica entenderá fácilmente cómo determinar la homología entre dos o más proteínas, o entre dos o más ácidos nucleicos. Por ejemplo, la homología puede calcularse luego de alinear las dos o más secuencias para que la homología sea máxima. Se entiende que una forma de definir variantes, modificaciones o derivados de los genes y las proteínas que se divulgan es definiendo las variantes, las modificaciones y los derivados en términos de su homología con secuencias específicas conocidas.
En la presente, el término “aptámeros” hace referencia a moléculas que interactúan con una molécula blanco, preferentemente de forma específica. Por lo general, los aptámeros son ácidos nucleicos pequeños de entre 15 y 50 bases de longitud que se pliegan formando estructuras secundarias y terciarias definidas, como estructuras en tallo-bucle (stem-loop) o cuartetos de guanina (G-quartets). Los aptámeros pueden hibridar con moléculas pequeñas o con moléculas grandes. Los aptámeros pueden unirse muy estrechamente a la molécula blanco con valores de Kd menores de 10-12 M. Los aptámeros pueden unirse a la molécula blanco con un grado muy alto de especificidad. Los aptámeros son conocidos en la técnica; algunos ejemplos de la construcción de aptámeros y su uso para hibridar con distintas moléculas blanco se pueden consultar en la siguiente lista no exhaustiva de patentes estadounidenses: 5,476,766, 5,503,978, 5,631,146, 5,731,424, 5,780,228, 5,792,613, 5,795,721, 5,846,713, 5,858,660, 5,861,254, 5,864,026, 5,869,641, 5,958,691,6,001,988, 6,011,020, 6,013,443, 6,020,130, 6,028,186, 6,030,776 y 6,051,698.
En la presente, una “fracción de direccionamiento” puede ser específica para una molécula de reconocimiento en la superficie de una célula o una población de células, como, por ejemplo, linfocitos B. En un aspecto de las composiciones y los métodos que se divulgan, una fracción de direccionamiento puede incluir, sin carácter taxativo: un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo quimérico, un fragmento Fab', un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un fragmento F(ab')2, un anticuerpo de dominio único (DAB), un fragmento variable Fv, un fragmento variable Fv monocatenario (scFv), un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, fragmentos híbridos, un anticuerpo de expresión en fagos (phage display), un anticuerpo de expresión en ribosomas (ribosome display), un péptido, un ligando de un péptido, una hormona, un factor de crecimiento, una citoquina, un sacárido o un polisacárido, y un aptámero.
En la presente, el término “sujeto” hace referencia al organismo al que se administra algo, por ejemplo, un animal. El término “sujeto” también incluye los animales domésticos (p. ej., perros, gatos, etc.), el ganado (p. ej., el ganado bovino, equipo, porcino, ovino, caprino, etc.) y los animales de laboratorio (p. ej., ratones, conejos, ratas, cobayos, moscas de la fruta, etc.). Así, el sujeto de los métodos divulgados en la presente puede ser un vertebrado, como un mamífero, un pez, un pájaro, un reptil o un anfibio. Alternativamente, el sujeto de los métodos divulgados en la presente puede ser un humano, un primate no humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, una vaca, un gato, un cobayo o un roedor. El término no denota una edad ni un sexo particulares. Así, se pretende cubrir a los sujetos adultos, los recién nacidos y los fetos, sean de sexo masculino o femenino. En un aspecto, un sujeto puede ser un paciente humano.
El término “paciente” hace referencia a un sujeto que padece una o más enfermedades o trastornos, como, por ejemplo, un tumor maligno de linfocitos B, un trastorno inflamatorio o una enfermedad autoinmune que involucra linfocitos B. En un aspecto, las enfermedades y los trastornos incluyen, sin carácter taxativo: linfoma no Hodgkin, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, un sujeto puede presentar uno o más de los siguientes: linfoma no Hodgkin, trasplante de órgano, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, un paciente tiene virus JC. En un aspecto, un paciente ha recibido un trasplante de órgano. En un aspecto de un método divulgado, el diagnóstico de un paciente ha identificado que necesita tratamiento para uno o más de las enfermedades o los trastornos anteriores antes del paso de administración. En un aspecto de un método divulgado, el diagnóstico de un paciente ha identificado que necesita la inducción de la apoptosis de células malignas, como, por ejemplo, linfocitos B malignos.
En la presente, “ linfoma no Hodgkin” o “LNH” hace referencia a un cáncer del tejido linfático. Como afección heterogénea, el LNH puede provocar un crecimiento de los nodos linfáticos y los sistemas en general.
En la presente, el término “tratamiento” hace referencia a la atención médica de un paciente con la intención de curar, atenuar, estabilizar o prevenir una enfermedad, una afección patológica o un trastorno (como, por ejemplo, tumores malignos de linfocitos B, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes con participación de linfocitos B). Este término incluye tanto el tratamiento activo (es decir, el tratamiento dirigido específicamente a mejorar una enfermedad, una afección patológica o un trastorno) como el tratamiento causal (es decir, el tratamiento que busca eliminar la causa de la enfermedad, la afección patológica o el trastorno en cuestión). Además, el término incluye: el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para aliviar los síntomas en lugar de curar la enfermedad, la afección patológica o el trastorno en cuestión; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento que busca minimizar o inhibir total o parcialmente el avance de la enfermedad, la afección patológica o el trastorno en cuestión; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento que se emplea para complementar otro tratamiento específico que busca mejorar la enfermedad, la afección patológica o el trastorno en cuestión. En varios aspectos, el término cubre cualquier tratamiento de un sujeto, incluido un mamífero (p. ej., un humano) e incluye: (i) prevenir que la enfermedad ocurra en un sujeto que puede tener predisposición a la enfermedad, pero todavía no tiene un diagnóstico que indique que la padece; (ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener su avance; o (iii) combatir la enfermedad, es decir, provocar su remisión.
En la presenta, los términos “prevenir” o “prevención” hacen referencia a impedir, evitar, obviar, frustrar, detener o dificultar algo, especialmente mediante acciones anticipadas. Se entiende que, siempre que se use uno de los términos “reducir”, “inhibir” o “prevenir”, también se divulga expresamente el uso de los otros dos términos, a menos que se indique específicamente lo contrario. En un aspecto, se pretende prevenir el crecimiento de células malignas.
En la presente, los términos “diagnosticado” y “diagnóstico” significan que un sujeto ha sido sometido a un examen físico realizado por una persona cualificada (por ejemplo, un médico), tras el cual se determinó que padece una afección que puede ser diagnosticada o tratada por medio de los compuestos, las composiciones o los métodos divulgados en la presente. Por ejemplo, “diagnosticado con LNH” significa que un sujeto ha sido sometido a un examen físico realizado por una persona cualificada (por ejemplo, un médico), tras el cual se determinó que padece una afección que puede ser diagnosticada o tratada por medio de un compuesto o una composición que puede prevenir o inhibir el crecimiento de células malignas y/o inducir la apoptosis en una población de células, como linfocitos B. Como otro ejemplo, “el diagnóstico de un sujeto ha identificado que necesita la inducción de la apoptosis” hace referencia a que un sujeto ha sido sometido a un examen físico realizado por una persona cualificada (por ejemplo, un médico), tras el cual se determinó que padece una afección caracterizada por un crecimiento celular maligno u otra enfermedad en la que inducir la apoptosis en una población de células sería beneficioso para el sujeto. Tal diagnóstico puede ser en relación con un trastorno, como el LNH y otros similares que se abordan en la presente.
En la presente, “uno o más oligonucleótido” puede hacer referencia a “uno o más morfolinos”. Por ejemplo, en un aspecto, un copolímero portador divulgado puede comprender uno o más oligonucleótidos injertados o puede comprender uno o más morfolinos injertados. En un aspecto, “uno o más oligonucleótidos” o “uno o más morfolinos” puede comprender 1 morfolino, 2 morfolinos, 3 morfolinos, 4 morfolinos, 5 morfolinos, 6 morfolinos, 7 morfolinos, 8 morfolinos, 9 morfolinos o 10 morfolinos. Por ejemplo, en un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 1 morfolino. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 3 morfolinos. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 10 morfolinos. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender más de 10 morfolinos injertados. En un aspecto, el/los morfolino(s) pueden comprender uno o más morfolinos MORF2 injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 1 morfolino injertado, 3 morfolinos injertados, 10 morfolinos injertados o más de 10 morfolinos injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 1 MORF2 injertado, 3 MORF2 injertados, 10 MORF2 injertados o más de 10 MORF2 injertados.
En la presente, la frase “ identificado que necesita tratamiento para un trastorno”, u otras similares, hacen referencia a la selección de un sujeto sobre la base de la necesidad de un tratamiento para el trastorno. Por ejemplo, puede haberse identificado que un sujeto necesita tratamiento para un trastorno (p. ej., LNH u otro trastorno relacionado con el crecimiento celular maligno o un trastorno que requiere la apoptosis de una población de células) sobre la base de un diagnóstico anterior por parte de una persona cualificada y, posteriormente, el sujeto puede hacer recibido tratamiento para el trastorno. En un aspecto, se contempla que dicha identificación puede ser realizada por una persona diferente de quien realiza el diagnóstico. En otro aspecto, también se contempla que la administración pueda ser realizada por quien realizó el diagnóstico.
En la presente, los términos “administrar” o “administración” hacen referencia a cualquier método para proporcionar una composición, un complejo o una preparación farmacéutica divulgados a un sujeto. Tales métodos son bien conocidos para la persona versada en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, la administración oral, la administración transdérmica, la administración por inhalación, la administración nasal, la administración tópica, la administración intravaginal, la administración oftálmica, la administración intraaural, la administración intracerebral, la administración rectal, la administración sublingual, la administración bocal y la administración parenteral, incluidos los métodos por inyección, como la administración intravenosa, la administración intraarterial, la administración intramuscular y la administración subcutánea. La administración puede ser continua o intermitente. En varios aspectos, una preparación puede administrarse con fines terapéuticos, es decir, administrarse para tratar una enfermedad o afección existente. En varios otros aspectos, una preparación puede administrarse con fines profilácticos, es decir, administrarse para prevenir una enfermedad o afección. En un aspecto, la persona versada en la técnica puede determinar una dosis eficaz, un programa eficaz o una vía de administración eficaz de una composición divulgada o un complejo divulgado para el tratamiento de un sujeto o para la inducción de la apoptosis. En un aspecto, la persona versada en la técnica también puede alterar o modificar un aspecto de un paso de administración de manera de mejorar la eficacia de un complejo divulgado o una composición divulgada.
En la presente, “alterar uno o más pasos de administración” puede comprender cambiar o modificar la administración de uno o más complejos divulgados o composiciones divulgadas. En un aspecto, la administración del complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido puede alterarse, por ejemplo, cambiando la vía de administración, cambiando la dosis de la composición, cambiando el momento de administración o cambiando la frecuencia de administración, o mediante una combinación de los cambios anteriores. En un aspecto, la administración del complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos puede alterarse, por ejemplo, cambiando la vía de administración, cambiando la dosis de la composición, cambiando el momento de administración o cambiando la frecuencia de administración, o mediante una combinación de los cambios anteriores. En un aspecto, alterar uno o más pasos de administración puede comprender alterar la administración del complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido y alterar la administración de un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos.
En la presente, la expresión “poner en contacto” hace referencia a juntar una composición, un compuesto o un complejo divulgados con un blanco previsto (como, p .ej., una célula o una población de células, un receptor, un antígeno u otra entidad biológica) de tal manera que la composición, el compuesto o el complejo divulgados puedan afectar la actividad del blanco previsto (p. ej., un receptor, un factor de transcripción, una célula, una población de células, etc.), sea directamente (por interacción con el propio blanco) o indirectamente (por interacción con otra molécula, cofactor, factor o proteína de los que depende la actividad del blanco). En un aspecto, una composición o un complejo divulgados pueden ponerse en contacto con una célula o una población de células, como, por ejemplo, linfocitos B.
En la presente, el término “determinar” puede hacer referencia a medir o establecer una actividad, un evento, una cantidad, una magnitud o un cambio en el nivel de expresión y/o actividad, o en la prevalencia y/o incidencia. Por ejemplo, “determinar” puede hacer referencia a medir o establecer la cantidad o magnitud de la inducción de la apoptosis. “Determinar” también puede hacer referencia a medir o establecer la cantidad o magnitud de la actividad o expresión de la caspasa. En la presente, los métodos y las técnicas para medir una actividad, un evento, una cantidad, una magnitud o un cambio en el nivel de expresión y/o actividad, o en la prevalencia y/o incidencia pueden hacer referencia a los pasos que la persona versada en la técnica tomaría para medir o determinar un valor cuantificable. En la técnica son bien conocidas formas de medir una actividad, un evento, una cantidad, una magnitud o un cambio en el nivel de expresión y/o actividad, o en la prevalencia y/o incidencia.
En la presente, el término “cantidad efectiva” hace referencia a una cantidad que es suficiente para lograr el resultado deseado o para tener un efecto sobre una afección no deseada. Por ejemplo, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” hace referencia a una cantidad que es suficiente para lograr el resultado terapéutico deseado o para tener un efecto sobre síntomas no deseados, pero, en general, no es suficiente para causar efectos secundarios adversos. Por ejemplo, en un aspecto, una cantidad efectiva de una composición divulgada o un complejo divulgado es la cantidad suficiente para inducir la apoptosis en una célula o una población de células blanco. La dosis terapéuticamente efectiva para un paciente en particular dependerá de una serie de factores, como: el trastorno tratado y la gravedad del trastorno; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración; la vía de administración; el ritmo de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidencia con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Por ejemplo, un enfoque bien conocido en la técnica es iniciar las dosis de una composición o un complejo divulgados a valores menores que los necesarios para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta alcanzar el efecto deseado. Si se desea, la dosis diaria efectiva puede dividirse en múltiples dosis a los fines de su administración. Por consiguiente, las composiciones de dosis única pueden contener tales cantidades o submúltiplos de ellas para alcanzar la dosis diaria. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en caso de contraindicaciones. La dosis puede variar y puede administrase en una o más administraciones diarias durante uno o varios días. En un aspecto, una preparación puede administrarse en una “cantidad profilácticamente efectiva”, es decir, una cantidad efectiva para prevenir una enfermedad o afección.
El término “farmacéuticamente admisible” describe un material que no es indeseable por motivos biológicos ni de otro tipo, ese decir, que no causa un nivel inadmisible de efectos biológicos indeseables ni interactúa de forma adversa. En la presente, el término “portador farmacéuticamente admisible” hace referencia a dispersiones, suspensiones, emulsiones o soluciones acuosas o no acuosas estériles, así como polvos estériles previstos para reconstituirse en dispersiones o soluciones inyectables estériles inmediatamente antes del uso. Algunos ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados son el agua, el etanol, los polioles (como el glicerol, el propilenglicol, el polietilenglicol y otros similares), la carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas a base de ella, los aceites de origen vegetal (como el aceite de oliva) y los ésteres orgánicos inyectables, como el oleato de etilo. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes como conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede garantizar incluyendo distintos agentes antibacterianos y antifúngicos como parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y otros similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos como azúcares, cloruro de sodio y otros similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes retardadores de la absorción, como el monoestearato de aluminio y la gelatina. Las formas de inyección tipo depósito (depot) involucran formar matrices de microcápsulas del fármaco en polímeros biodegradables como poliláctido-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). El ritmo de liberación del fármaco se puede controlar mediante la proporción entre fármaco y polímero, así como la naturaleza del polímero particular empleado. Las formulaciones inyectables tipo depósito también se pueden preparar atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones compatibles con los tejidos del organismo. Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene las bacterias o mediante la incorporación de agentes esterilizantes bajo la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso. Algunos portadores inertes adecuados son los azúcares como la lactosa.
i) COPOLÍMEROS
Los copolímeros tradicionales se han usado en múltiples laboratorios en todo el mundo y en múltiples ensayos clínicos (véase la patente estadounidense n.° 5,037,883, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad). Por ejemplo, los copolímeros de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) (HPMA): (1) son biocompatibles y tienen un perfil de seguridad bien establecido; (2) son solubles en agua y tienen una farmacocinética favorable en comparación con los fármacos de bajo peso molecular (libres, no unidos); y (3) poseen excelente flexibilidad química (pueden sintetizarse fácilmente monómeros con distintas cadenas secundarias y se los puede incorporar fácilmente a la estructura). Sin embargo, los polímeros de HPMA no son degradables y su peso molecular se debe mantener por debajo del umbral renal para preservar su biocompatibilidad. Esto limita la vida media intravascular y la acumulación de polímeros de HPMA en tumores sólidos mediante el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR).
Para superar estas limitaciones, se desarrolló un copolímero portador de HPMA con una cadena principal degradable. El copolímero portador puede contener secuencias degradables enzimáticamente (p. ej., degradables por la catepsina B, por las metalopeptidasas de matriz, etc.) en la cadena principal y cadenas secundarias degradables enzimáticamente (para la liberación del fármaco) (véase, p. ej., la solicitud de patente estadounidense n.° 13/583,270, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad). Al llegar al compartimiento lisosómico de las células, el fármaco se libera y, de forma concomitante, el polímero portador se degrada en moléculas que se encuentran por debajo del umbral renal y pueden ser excretadas del sujeto. Así, pueden producirse copolímeros biodegradables de dos o más bloques que tengan un peso molecular mayor. Esto puede mejorar aún más el tiempo de circulación en sangre de los complejos copolímero-MORF2 divulgados en la presente, lo que resulta favorable para las terapias macromoleculares sin fármacos dirigidas, por ejemplo, a las células cancerosas circulantes (linfocitos B malignos). Además, la patente estadounidense n.° 4,062,831 describe una serie de polímeros solubles en agua y la patente estadounidense n.° 5,037,883 describe una serie de secuencias peptídicas. Ambos documentos se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.
i) Mo r f o lin o s
Las composiciones y los métodos que se divulgan en la presente pueden utilizar un análogo biocompatibles sintético de un oligonucleótido con una cadena principal químicamente modificada. El esquema que se muestra a continuación enumera varios análogos y compara las propiedades de estos análogos con las del ADN natural.
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Sobre la base de estas propiedades, las composiciones y los métodos que se divulgan no son compatibles con el ADN ni el ARN naturales. En su lugar, dado que el análogo debe ser biocompatible y no degradable, las composiciones y los métodos que se divulgan pueden utilizar oligonucleótidos de morfolino fosforodiamidato (también conocidos como morfolinos o MORF). Los morfolinos tienen una cadena principal químicamente modificada y de carga neutra, y se construyen a partir de cuatro subunidades diferentes, cada una de las cuales contiene una de las cuatro bases nitrogenadas (A, T, G y C) unida a un anillo morfolínico de 6 miembros. Las subunidades están unidas por enlaces fosforodiamidato no iónicos que forman un oligonucleótido de morfolino. Los morfolinos también poseen alta afinidad de unión (con un valor de Kd en el orden de los pocos nM a los pM), alta especificidad de secuencia y perfiles de seguridad comprobados. Además, la inmunogenicidad de los morfolinos es altamente dependiente de la secuencia, por lo que se puede controlar. La síntesis, las estructuras y las características de unión de los morfolinos se detallan en las patentes estadounidenses n.° 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063 y 5,506,337, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.
Un morfolino divulgado con una longitud mayor provee una mayor especificidad y una mayor afinidad de unión; sin embargo, tales morfolinos también tienen menor solubilidad en agua. En la técnica, se considera que un morfolino debe tener una longitud mínima de 14 bp o 15 bp para mantener un efecto de direccionamiento ideal. Un morfolino de 25 bp puede asegurar una buena afinidad de unión y una buena solubilidad en agua (aproximadamente 5 a 30 mM). Por ejemplo, usar los morfolinos de 25 bp de las composiciones y los métodos que se divulgan, se puede evitar el efecto del impedimento estérico sobre la hibridación del MORF1 y el MORF2. Una secuencia más larga puede proveer mayor “flexibilidad estérica” para la hibridación. Así, en las composiciones y los métodos que se divulgan en la presente, los morfolinos pueden comprender entre 10 y 40 bp. En un aspecto, por ejemplo, un morfolino puede tener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 bp de longitud.
El contenido de A/T/C/G de un morfolino divulgado puede determinarse sobre la base de tres factores: (1) el contenido de G+C (n.° o % de bases G y C), (2) contenido de G (n.° o % de bases G) y (3) contenido de C (n.° o % de bases C).
En relación con el contenido de G+C, un morfolino divulgado puede comprender un contenido de G+C entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. Este rango puede proveer una eficacia y una especificidad óptimas. En relación con el contenido de G, un morfolino divulgado puede comprender un contenido de G menor de aproximadamente 36 %. Este nivel de contenido de G puede proporcionar una buena solubilidad acuosa; sin embargo, deben evitarse las repeticiones de 4 o más G. En relación con el contenido de C, un morfolino divulgado puede comprender un contenido de C menor de 7. Este nivel de contenido de C puede garantizar que se pueda evitar el efecto desfavorable de incrementar la acumulación renal de un morfolino. Además, la conjugación de uno o más morfolinos con un copolímero puede mejorar los perfiles farmacocinéticos de los morfolinos y reducir la acumulación renal (en comparación con la conjugación de morfolinos y un fragmento Fab'). La Tabla 1 muestra la acumulación renal de morfolinos con diferentes niveles de contenido de C. El morfolino que tiene 25 C mostró el mayor porcentaje de acumulación renal en ratones normales apenas 3 horas después de la inyección (Liu et al., 2004).
Tabla 1.
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En las composiciones y los métodos de la divulgación, un morfolino conjugado con el fragmento Fab' puede comprender más A y menos C, mientras que el/los morfolino(s) conjugado(s) con el copolímero pueden comprender más C y menos A. Así, en un aspecto, un morfolino de 25 bp puede comprender 3 C, 6 G, 12 A y 4 T (G+C = 36 %, G = 24 %). Un morfolino complementario de 25 bp puede comprender 6 C, 3 G, 4 A y 12 T (G+C = 36 %, G = 12 %).
Luego de determinar la composición de bases nitrogenadas de cada morfolino, puede usarse un “permutador” en línea y de acceso público para garantizar que la unión inespecífica con ARNm humano sea mínima. Además, se puede usar software de análisis de secuencias en línea y de acceso público para garantizar que la autocomplementariedad sea mínima. En los experimentos que se divulgan en la presente, al momento de realizar un análisis de secuencias con el fin de evitar la autocomplementariedad, los parámetros “Minimum base pairs required for self-dimerization” (Mínima cantidad de bases necesarias para la autodimerización) y “Minimum base pairs required for a hairpin” (Mínima cantidad de bases necesarias para la formación de una horquilla) se configuraron en “2” y “2” (para 10 bp y 12 bp); en “3” y “3” (para 15 bp, 18 bp, 20 bp, 23 bp y 25 bp); en “4” y “4” (para 28 bp, 30 bp, 32 bp y 35 bp); y en “5” y “4” (para 38 bp y 40 bp). La Tabla 2 enumera ejemplos de morfolinos para usar en las composiciones y los métodos de la divulgación.
Tabla 2: Ejemplos de morfolinos
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En un aspecto, la hibridación entre un par de morfolinos divulgados puede lograrse por apareamiento entre bases (es decir, mediante patrones de enlaces de hidrógeno específicos). La hibridación puede mantenerse por apilamiento de bases (interacciones pi). Nótese que la hibridación entre un par de morfolinos divulgados es más específica que la formación de péptidos de hélice superenrollada.
En un aspecto, los morfolinos empleados en las composiciones y los métodos divulgados pueden ser perfectamente complementarios (100 % de complementariedad) o pueden tener una complementariedad imperfecta. Así, en un aspecto, la complementariedad porcentual entre el morfolino del complejo Fab'-MORF1 y el/los morfolino(s) del complejo copolímero-MORF2 puede ser entre 80 y 85 %, entre 85 y 90 %, entre 90 y 95 % o entre 95 y 100 %. En un aspecto, el morfolino del complejo Fab'-MORF1 y el/los morfolino(s) del complejo copolímero-MORF2 pueden tener una complementariedad de 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En un aspecto, el morfolino del complejo Fab'-MORF1 y el/los morfolino(s) del complejo copolímero-MORF2 pueden tener una complementariedad de al menos 93 %.
En un aspecto, el morfolino del complejo Fab'-MORF1 y el/los morfolino(s) del complejo copolímero-MORF2 pueden tener una constante de disociación de equilibrio Kd < 15 nM. En un aspecto, el morfolino del complejo Fab'-MORF1 y el/los morfolino(s) del complejo copolímero-MORF2 pueden tener una constante de asociación (Kd) menor de 10-7 M. En un aspecto, el morfolino del complejo Fab'-MORF1 y el/los morfolino(s) del complejo copolímero-MORF2 pueden tener una constante de asociación (Kd) menor de 10-9 M.
B. Co m p o s ic io n e s
i) COMPLEJO QUE COMPRENDE UNA FRACCIÓN DE DIRECCIONAMIENTO Y UN OLIGONUCLEÓTIDO
En la presente, se divulgan complejos que comprenden una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido. En un aspecto, un complejo divulgado comprende una marca detectable. Las marcas detectables son conocidas para la persona versada en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, las siguientes: rodamina, FITC, Cy3, Cy3.5, Cy5, Texas Red, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647 y Alexa Fluor 750.
En un aspecto de un complejo divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser específica para una molécula de superficie celular no internalizante o para una molécula de superficie celular lentamente internalizante. Los ejemplos de moléculas de superficie celular no internalizantes o moléculas de superficie celular lentamente internalizantes son conocidas para la persona versada en la técnica. En un aspecto, una molécula de superficie celular no internalizante o una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede encontrarse en una célula o una población de células. En un aspecto, una célula o una población de células pueden ser linfocitos B. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B normales. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B malignos.
En un aspecto de un complejo divulgado, una molécula de superficie celular no internalizante puede ser un receptor. En un aspecto, una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede ser un receptor. Por ejemplo, las moléculas de superficie celular no internalizantes y las moléculas de superficie celular lentamente internalizantes incluyen, sin carácter taxativo: un receptor CD20, un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC), un receptor superficial de muerte celular, un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA) y un receptor perteneciente a la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR). La superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR) comprende el receptor de muerte celular 5 (DR5), el receptor FAS (CD95), el miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18) y el inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor CD20. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor superficial de muerte celular. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de muerte celular 4 (DR4). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA). En un aspecto, un receptor es un receptor de muerte celular 5 (DR5). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor FAS (CD95). En un aspecto, un receptor puede ser un miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18). En un aspecto, un receptor puede ser un inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12).
En un aspecto de un complejo divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido, un ligando peptídico, un aptámero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido. En un aspecto, un receptor puede ser un ligando peptídico. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un aptámero. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, un receptor puede ser un fragmento Fab'. En un aspecto, un fragmento Fab' puede ser humanizado. En un aspecto, un fragmento Fab' puede derivarse de un anticuerpo anti­ receptor CD20. Hay ejemplos de anticuerpos anti-receptor CD20 conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, los siguientes: 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab y BLX-301. En un aspecto, el anticuerpo anti-receptor CD20 puede ser 1F5.
Los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto de un complejo divulgado, un oligonucleótido puede ser biocompatible. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser de carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible y no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua y con carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede tener una o más de las siguientes propiedades: biocompatible, no degradable, soluble en agua y de carga neutra. Por ejemplo, en un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible, no degradable, soluble en agua y con carga neutra.
En un aspecto de un complejo divulgado, un oligonucleótido puede ser un ácido peptidonucleico. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser un morfolino. En un aspecto, un morfolino divulgado no se une a ningún blanco de ARNm de un genoma, como, por ejemplo, el genoma humano. En un aspecto, un morfolino divulgado no es autocomplementario. En un aspecto, un morfolino puede estar modificado con succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC).
En un aspecto de un complejo divulgado, un morfolino comprende entre 10 bp y 40 bp. Por ejemplo, un morfolino puede tener una longitud de 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp o 40 bp.
En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAA CTA ATG CAA TAA CTA TCA CGA ATG CGG GTA ACT TAA T 3' (ID DE SEC. N.° 1). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATT AAG TTA CCC GCA TTC GTG ATA GTT ATT GCA TTA GTT C 3' (ID DE SEC. N.° 2). En un aspecto, un morfolino puede ser GAA ACC GCT ATT TAT TGG CTA AGA ACA GAT ACG AAT CAT A 3' (ID DE SEC. N.° 3). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT GAT TCG TAT CTG TTC TTA GCC AAT AAA TAG CGG TTT C 3' (ID DE SEC. N.° 4). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GTA AAC GCG ACA AAT GCC GAT AAT GCT TCG At A ATA AT 3' (ID d E SEC. N.° 5). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATT ATT ATC GAA GCA TTA TCG GCA TTT GTC GCG TTT AC 3' (ID DE SEC. N.° 6). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAC AGA GTT CAC TAT GAC AAA CGA TTT CAC GAG TAA TA 3' (ID DE SEC. N.° 7). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT TAC TCG TGA AAT CGT TTG TCA TAG TGA ACT CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 8). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' CCT GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE Se C. N.° 9). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TCA GG 3' (ID DE SEC. N.° 10). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAA CAA CGA GAG GTG CTC AAT ACA GAT ATC a At CA 3' (ID DE SEC. N.° 11). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TGA TTG ATA TCT GTA TTG AGC ACC TCT CGT TGT TC 3' (ID DE s Ec . N.° 12). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AGT CAT AGA TAG ACA GAA TAG CCG GAT AAA CT 3' (ID DE SEC. N.° 13). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTC TAT CTA TGA CT 3' (ID DE SEC. N.° 14). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA Ta 3' (ID DE SEC. N.° 15). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TC 3' (ID DE SEC. N.° 16). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GGC ATA GAT AAC AGA ATA GCC GGA TAA ACT 3' (ID DE SEC. N.° 17). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTT ATC TAT GCC 3' (ID DE SEC. N.° 18). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAC CAG TAG ATA AGT GAA CCA GAT TGA ACA 3' (ID DE SEC. N.° 19). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TGT TCA ATC TGG TTC ACT TAT CTA CTG GTC 3' (ID DE SEC. N.° 20). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAG TAC AGC CAG AGA GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 21). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT ATT GAT TCT CTC TCT GGC TGT ACT C 3' (ID De SEC. N.° 22). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GTG AAC ACG AAA GAG TGA CGC AAT AAA T 3' (ID DE SEC. N.° 23). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATT TAT TGC GTC ACT CTT TCG TGT TCA C 3' (ID DE SEC. N.° 24). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAG TAA GCC AAG GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 25). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' (ID DE s Ec . N.° 26). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AGA TGA CGA TAA AGA CGC AAA GAT T 3' (ID DE SEC. N.° 27). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AAT CTT TGC GTC TTT ATC GTC ATC T 3' (ID DE s Ec . N.° 28). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GGA CCA AGT AAA CAG GGA TAT AT 3' (ID DE SEC. N.° 29). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATA TAT CCC TGT TTA CTT GGT CC 3' (ID DE SEC. N.° 30). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GCT GAA AAC CAA TAT GAG AGT GA 3' (ID DE Se C. N.° 31). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TCA CTC TCA TAT TGG TTT TCA GC 3' (ID DE SEC. N.° 32). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAT GAA GTA CCG ACA AGA TA 3' (ID DE SEC. N.° 33). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAT CTT GTC GGT ACT TCA TC 3' (ID DE SEC. N.° 34). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GAC AGG ATG AAT AAC ACA GT 3' (ID DE SEC. N.° 35). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' a Ct GTG TTA TTC ATC CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 36). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GCA GCA AAC GAA GTA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 37). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATA TAC TTC GTT TGC TGC 3' (ID DE SEC. N.° 38). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' GTC ATA ACA GAA CAG GTA 3' (ID DE SEC. N.° 39). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAC CTG TTC TGT TAT GAC 3' (ID DE SEC. N.° 40). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TCA AGA CAG AAG GAT 3' (ID DE SEC. N.° 41). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATC CTT CTG TCT TGA 3' (ID DE SEC. N.° 42). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAG CAA CAT AGG AAG 3' (ID DE SEC. N.° 43). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' CTT CCT ATG TTG CTA 3' (ID DE SEC. N.° 44). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' CAG Ag A GCA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 45). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATA TGC TCT CTG 3' (ID DE SEC. N.° 46). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' CAA GAG GTA CAT 3' (ID DE SEC. N.° 47). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' ATG TAC CTC TTG 3' (ID DE SEC. N.° 48). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AAG AGG TAC A 3' (ID DE SEC. N.° 49). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TGT ACC TCT T 3' (ID DE SEC. N.° 50). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' AAG GAC AGT A 3' (ID DE SEC. N.° 51). En un aspecto, un morfolino puede ser 5' TAC TGT CCT T 3' (ID DE SEC. N.° 52).
En un aspecto de un complejo divulgado, un morfolino puede tener una longitud de 25 bp y puede comprender 3 citidinas, 6 guanosinas, 12 adenosinas y 4 timidinas. Por ejemplo, en un aspecto, un morfolino que comprende 3 citidinas, 6 guanosinas, 12 adenosinas y 4 timidinas puede ser 5' GAGTAAGCCAAGGAGAATCAATATA 3' (ID DE SEC. N.° 25). En un aspecto, un morfolino de un complejo divulgado puede comprender un contenido de GC de entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. En un aspecto, un morfolino puede comprender un contenido de G menor de 36 %. En un aspecto, un morfolino puede comprender no más de 7 C.
En un aspecto de un complejo divulgado, una fracción de direccionamiento puede conjugarse con un oligonucleótido. Los tipos de conjugación y los métodos para lograrla son conocidos en la técnica. En un aspecto, una fracción de direccionamiento de un complejo divulgado puede conjugarse con un oligonucleótido, por ejemplo, por medio de un enlace covalente. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede conjugarse con un oligonucleótido por medio de un grupo tiol. Los grupos tiol son conocidos en la técnica. En un aspecto de un complejo divulgado, una fracción de direccionamiento puede conjugarse con un oligonucleótido por medio de un enlace tioéter, un enlace tiol-maleimida, un enlace tiol-vinilsulfona, un enlace tiol-halógeno, un enlace tiol-pentafluorofenil éster, un enlace tiol-eno o un enlace tiol-ino.
En la presente, se divulgan complejos que comprenden una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, donde la fracción de direccionamiento es un fragmento Fab', donde el fragmento Fab' es específico para un receptor CD20, donde el oligonucleótido es un morfolino y donde el fragmento Fab' está conjugado al morfolino mediante un enlace tioéter.
ii) Co m p l e j o q u e c o m p r e n d e un c o p o l ím e r o p o r ta d o r y u n o o m á s o l ig o n u c le ó tid o s
En la presente, se divulgan complejos que comprenden un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos. En un aspecto, un complejo divulgado comprende una marca detectable. Las marcas detectables son conocidas en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, las siguientes: rodamina, FITC, Cy3, Cy3.5, Cy5, Texas Red, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647 y Alexa Fluor 750.
En un aspecto de los complejos divulgados, un copolímero portador puede ser soluble en agua. En un aspecto de un copolímero divulgado, un copolímero portador puede comprender una cadena principal y una o más cadenas secundarias. En un aspecto, una cadena principal de un portador puede comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un portador pueden comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias pueden terminar en un grupo funcional. Los grupos funcionales son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, los siguientes: un éster activo amino-reactivo, una maleimida, una azida y un alquino. En un aspecto, un grupo funcional puede permitir la unión de uno o más oligonucleótidos a una o más cadenas secundarias de un complejo de copolímero divulgado. En un aspecto, una o más cadenas secundarias pueden conjugarse con uno o más oligonucleótidos mediante un grupo funcional divulgado. En un aspecto, una cadena principal puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-Tt ). En un aspecto, una cadena principal puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-p-nitrofenil éster (MA-GG-ONp).
Los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto de un complejo divulgado, un oligonucleótido puede ser biocompatible. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser de carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible y no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua y con carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede tener una o más de las siguientes propiedades: biocompatible, no degradable, soluble en agua y de carga neutra. Por ejemplo, en un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible, no degradable, soluble en agua y con carga neutra.
En un aspecto de un complejo divulgado, uno o más oligonucleótidos pueden ser ácidos peptidonucleicos. En un aspecto, uno o más oligonucleótidos pueden ser morfolinos. En un aspecto, el/los morfolino(s) divulgado(s) no se une(n) a ningún blanco de ARNm de un genoma, como, por ejemplo, el genoma humano. En un aspecto, el/los morfolino(s) divulgado(s) no es/son autocomplementario(s). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser derivatizados con amina. La derivatización, que generalmente involucra la incorporación de un nucleófilo como grupo funcional e incluye la derivatización con amina y la derivatización con tiol, es conocida en la técnica. En un aspecto, el/los morfolino(s) divulgado(s) puede(n) generarse mediante el uso de un amino-pentafluorofenil éster, un aminosuccinimidoxi éster o un amino-carboxilo. En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser derivatizados con tiol. En un aspecto, el/los morfolino(s) divulgado(s) puede generarse mediante el uso de tiol-maleimida.
En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender uno o más morfolinos injertados. En un aspecto, “uno o más morfolinos” puede comprender 1 morfolino, 2 morfolinos, 3 morfolinos, 4 morfolinos, 5 morfolinos, 6 morfolinos, 7 morfolinos, 8 morfolinos, 9 morfolinos o 10 morfolinos. Por ejemplo, en un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 1 morfolino. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 3 morfolinos. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 10 morfolinos. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender más de 10 morfolinos injertados. En un aspecto, el/los morfolino(s) pueden comprender uno o más morfolinos MORF2 injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 1 morfolino injertado. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 3 morfolinos injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 10 morfolinos injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender más de 10 morfolinos injertados. En un aspecto, el/los oligonucleótido(s) puede(n) comprender los mismos oligonucleótidos o puede(n) comprender oligonucleótidos diferentes. En un aspecto, el/los morfolino(s) puede(n) comprender los mismos morfolinos o puede(n) comprender morfolinos diferentes. En un aspecto, el/los morfolino(s) o morfolino(s) injertado(s) puede(n) tener la misma secuencia. En un aspecto, el/los morfolino(s) puede(n) tener secuencias diferentes. Por ejemplo, en un aspecto, puede haber múltiples morfolinos presentes, donde el/los morfolino(s) comprende(n) diferentes secuencias o donde el/los morfolino(s) comprende(n) la misma secuencia, o una combinación de las posibilidades anteriores
En un aspecto de un complejo divulgado, uno o más morfolinos pueden comprender un contenido de GC de entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. En un aspecto, uno o más morfolinos pueden comprender un contenido de G menor de 36 %. En un aspecto, uno o más morfolinos pueden comprender no más de 7 C.
En un aspecto de un complejo divulgado, uno o más morfolinos comprenden entre 10 bp y 40 bp. Por ejemplo, un morfolino puede tener una longitud de 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp o 40 bp.
En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAA CTA ATG CAA TAA CTA TCA CGA ATG CGG GTA ACT TAA T 3' (ID DE SEC. N.° 1). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATT AAG TTA CCC GCA TTC GTG ATA GTT ATT GCA TTA GTT C 3' (ID DE SEC. N.° 2). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser GAA ACC GCT ATT TAT TGG CTA AGA ACA GAT ACG AAT CAT A 3' (ID DE SEC. N.° 3). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT GAT TCG TAT CTG TTC TTA GCC AAT AAA TAG CGG TTT C 3' (ID DE SEC. N.° 4). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GTA AAC GCG ACA AAT GCC GAT AAT g Ct TCG ATA ATA At 3' (ID d E SEC. N.° 5). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATT ATT ATC GAA GCA TTA TCG GCA TTT GTC GCG TTT AC 3' (ID DE SEC. N.° 6). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAC AGA GTT CAC TAT GAC AAA CGA t Tt CAC GAG TAA TA 3' (ID De SEC. N.° 7). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT TAC TCG TGA AAT CGT TTG TCA TAG TGA ACT CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 8). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' CCT GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 9). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TCA GG 3' (ID DE SEC. N.° 10). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAA CAA CGA GAG GTG CTC AAT ACA GAT ATC AAT CA 3' (ID DE Se C. N.° 11). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TGA TTG ATA TCT GTA TTG AGC ACC TCT CGT TGT TC 3' (ID DE s Ec . N.° 12). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AGT CAT AGA TAG ACA GAA TAG CCG Ga T AAA CT 3' (ID DE SEC. N.° 13). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTC TAT CTA TGA CT 3' (ID DE SEC. N.° 14). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 15). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TC 3' (ID De SEC. N.° 16). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GGC ATA GAT AAC AGA ATA GCC GGA TAA ACT 3' (ID DE SEC. N.° 17). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTT ATC Ta T GCC 3' (ID DE SEC. N.° 18). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAC CAG TAG ATA AGT GAA CCA GAT t Ga ACA 3' (ID DE SEC. N.° 19). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TGT TCA ATC TGG TTC ACT TAT CTA Ct G GTC 3' (ID DE s Ec . N.° 20). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAG TAC AGC CAG AGA GAG AAT CAA Ta T A 3' (ID DE SEC. N.° 21). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT ATT GAT TCT CTC TCT GGC TGT a Ct C 3' (ID DE SEC. N.° 22). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GTG AAC ACG AAA GAG TGA CGC AAT a Aa T 3' (ID DE SEC. N.° 23). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATT TAT TGC GTC ACT CTT TCG TGT TCA C 3' (ID DE SEC. N.° 24). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAG TAA GCC AAG GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 25). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 26). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AGA TGA CGA TAA AGA CGC AAA GAT T 3' (ID DE SEC. N.° 27). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AAT CTT TGC GTC TTT ATC GTC ATC T 3' (ID DE SEC. N.° 28). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GGA CCA AGT AAA CAG GGA TAT AT 3' (ID DE SEC. N.° 29). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATA TAT CCC TGT TTA CTT GGT CC 3' (ID DE SEC. N.° 30). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GCT GAA AAC CAA TAT GAG AGT GA 3' (ID DE SEC. N.° 31). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TCA CTC TCA TAT TGG TTT TCA GC 3' (ID DE SEC. N.° 32). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAT GAA GTA CCG ACA AGA TA 3' (ID d E SEC. N.° 33). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAT CTT GTC GGT ACT TCA TC 3' (ID d E SEC. N.° 34). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GAC AGG ATG AAT AAC ACA GT 3' ( iD DE SEC. N.° 35). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ACT GTG TTA TTC ATC CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 36). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GCA GCA AAC GAA GTA TAT 3' (ID DE Se C. N.° 37). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATA TAC TTC GTT TGC TGC 3' (ID DE SEC. N.° 38). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' GTC ATA ACA GAA CAG GTA 3' (ID DE SEC. N.° 39). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAC CTG TTC TGT TAT GAC 3' (ID DE s Ec . N.° 40). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TCA AGA CAG AAG GAT 3' (ID DE SEC. N.° 41). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATC CTT CTG TCT TGA 3' (ID DE SEC. N.° 42). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' Ta G CAA CAT AGG AAG 3' (ID DE SEC. N.° 43). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' c Tt CCT ATG TTG CTA 3' (ID DE SEC. N.° 44). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' c Ag AGA GCA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 45). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATA t Gc TCT CTG 3' (ID DE SEC. N.° 46). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' CAA GAG GTA CAT 3' (ID DE SEC. N.° 47). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' ATG t Ac CTC TTG 3' (ID DE SEC. N.° 48). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AAG a Gg TAC A 3' (ID DE SEC. N.° 49). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TGT ACC TCT T 3' (ID DE SEC. N.° 50). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' AAG GAC AGT A 3' (ID DE SEC. N.° 51). En un aspecto, uno o más morfolinos pueden ser 5' TAC TGT CCT T 3' (ID DE SEC. N.° 52).
En un aspecto, uno o más morfolinos de un complejo divulgado pueden tener una longitud de 25 bp y pueden comprender 6 citidinas, 3 guanosinas, 4 adenosinas y 12 timidinas. Por ejemplo, en un aspecto, el/los morfolino(s) que comprende(n) 6 citidinas, 3 guanosinas, 4 adenosinas y 12 timidinas puede(n) ser 5' TATATTGATTCTCCTTGGCTTACTC 3' (ID DE SEC. N.° 26).
En la presente, se divulga un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, donde el copolímero portador comprende una cadena principal y una o más cadenas secundarias, donde el copolímero portador comprende N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT), donde la(s) cadena(s) secundaria(s) pueden conjugarse con el/los oligonucleótido(s), donde el/los oligonucleótido(s) son morfolinos.
Mi) Kits
En la presente, se divulgan kits que comprenden un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos. En un aspecto, un kit divulgado puede comprender instrucciones para administrar un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos.
En la presente, se divulgan kits que comprenden un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, e instrucciones para administrar el primer complejo y el segundo complejo.
En un aspecto, el primer complejo y el segundo complejo se formulan juntamente. En un aspecto, el primer complejo y el segundo complejo se empacan juntamente.
En un aspecto de un kit divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser específica para una molécula de superficie celular no internalizante o para una molécula de superficie celular lentamente internalizante. Los ejemplos de moléculas de superficie celular no internalizantes o moléculas de superficie celular lentamente internalizantes son conocidas en la técnica. En un aspecto, una molécula de superficie celular no internalizante o una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede encontrarse en una célula o una población de células. En un aspecto, una célula o una población de células pueden ser linfocitos B. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B normales. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B malignos.
En un aspecto de un kit divulgado, una molécula de superficie celular no internalizante puede ser un receptor. En un aspecto, una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede ser un receptor. Por ejemplo, las moléculas de superficie celular no internalizantes y las moléculas de superficie celular lentamente internalizantes incluyen, sin carácter taxativo: un receptor CD20, un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC), un receptor superficial de muerte celular, un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA) y un receptor perteneciente a la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR). La superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR) comprende el receptor de muerte celular 5 (DR5), el receptor FAS (CD95), el miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18) y el inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor CD20. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor superficial de muerte celular. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de muerte celular 4 (DR4). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de antígeno de células madre prostéticas (PSCA). En un aspecto, un receptor es un receptor de muerte celular 5 (DR5). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor FAS (CD95). En un aspecto, un receptor puede ser un miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18). En un aspecto, un receptor puede ser un inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12).
En un aspecto, una fracción de direccionamiento de un kit divulgado puede ser un polisacérido, un ligando peptídico, un aptémero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacérido. En un aspecto, un receptor puede ser un ligando peptídico. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un aptémero. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, un receptor puede ser un fragmento Fab'. En un aspecto, un fragmento Fab' puede ser humanizado. En un aspecto, un fragmento Fab' puede derivarse de un anticuerpo anti­ receptor CD20. Hay ejemplos de anticuerpos anti-receptor CD20 conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, los siguientes: 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab y BLX-301. En un aspecto, el anticuerpo anti-receptor CD20 puede ser 1F5.
En un aspecto de un kit divulgado, un copolímero portador puede ser soluble en agua. En un aspecto, un copolímero portador divulgado puede comprender una cadena principal y una o més cadenas secundarias. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador puede comprender secuencias enziméticamente degradables. En un aspecto, una o més cadenas secundarias de un copolímero portador pueden comprender secuencias enziméticamente degradables. En un aspecto, una o més cadenas secundarias de un copolímero portador pueden terminar en un grupo funcional. Los grupos funcionales son conocidos en la técnica e incluyen, sin carécter taxativo, los siguientes: un éster activo amino-reactivo, una maleimida, una azida, un disulfuro y un alquino. En un aspecto, un grupo funcional puede permitir la unión de uno o més oligonucleótidos a una o més cadenas secundarias de un complejo de copolímero. En un aspecto, una o més cadenas secundarias pueden conjugarse con uno o més oligonucleótidos mediante un grupo funcional. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador divulgado puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT). En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-p-nitrofenil éster (MA-GG-ONp).
Los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible. En un aspecto, un oligonucleótido de un kit divulgado puede ser no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser de carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible y no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua y con carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede tener una o més de las siguientes propiedades: biocompatible, no degradable, soluble en agua y de carga neutra. Por ejemplo, en un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible, no degradable, soluble en agua y con carga neutra.
En un aspecto de un kit divulgado, un oligonucleótido puede ser un écido peptidonucleico. En un aspecto, un oligonucleótido divulgado puede ser un morfolino. En un aspecto, un morfolino divulgado no se une a ningún blanco de ARNm de un genoma, como, por ejemplo, el genoma humano. En un aspecto, un morfolino divulgado no es autocomplementario. En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden ser complementarios. En un aspecto, el morfolino del primer complejo no es autocomplementario. En un aspecto, el/los morfolino(s) del segundo complejo no es/son autocomplementario(s). En un aspecto, el morfolino del primero complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10‘7 M. En un aspecto, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10‘9 M.
En un aspecto, un copolímero de un kit divulgado puede comprender uno o més morfolinos injertados. En un aspecto, “uno o més morfolinos” puede comprender 1 morfolino, 2 morfolinos, 3 morfolinos, 4 morfolinos, 5 morfolinos, 6 morfolinos, 7 morfolinos, 8 morfolinos, 9 morfolinos o 10 morfolinos. Por ejemplo, en un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 1 morfolino. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 3 morfolinos. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender 10 morfolinos. En un aspecto, un copolímero divulgado puede comprender més de 10 morfolinos injertados. En un aspecto, el/los morfolino(s) pueden comprender uno o més morfolinos MORF2 injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 1 morfolino injertado. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 3 morfolinos injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender 10 morfolinos injertados. Por ejemplo, un complejo copolímero-MORF2 divulgado puede comprender més de 10 morfolinos injertados. En un aspecto, el/los morfolino(s) o morfolino(s) injertado(s) puede(n) tener la misma secuencia. En un aspecto, el/los morfolino(s) puede(n) tener secuencias diferentes. Por ejemplo, en un aspecto, puede haber múltiples morfolinos presentes, donde el/los morfolino(s) comprende(n) diferentes secuencias o donde el/los morfolino(s) comprende(n) la misma secuencia, o una combinación de las posibilidades anteriores.
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede comprender entre 10 bp y 40 bp y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender entre 10 bp y 40 bp. Por ejemplo, en un aspecto, cada uno de los morfolinos en un kit divulgado puede tener una longitud de 10 bp, 12 bp, 15 bp, 18 bp, 20 bp, 23 bp, 25 bp, 28 bp, 30 bp, 32 bp, 35 bp, 38 bp o 40 bp. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender un contenido de GC de entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. En un aspecto, cada uno de lo morfolinos puede comprender un contenido de G menor de 36 %. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender no más de 7 C.
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 40 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 40 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CTA ATG CAA TAA CTA TCA CGA ATG CGG GTA ACT TAA T 3' (ID DE SEC. N.° 1) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT AAG TTA CCC GCA TTC GTG ATA GTT ATT GCA TTA GTT C 3' (ID DE SEC. N.° 2). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA ACC GCT ATT TAT TGG Ct A AGA ACA GAT ACG AAT CAT A 3' (ID DE SEC. N.° 3) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT GAT TCG TAT CTG TTC TTA GCC AAT AAA TAG CGG TTT C 3' (ID DE SEC. N.° 4).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 38 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 38 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTA AAC GCG ACA AAT GCC GAT AAT GCT TCG ATA ATA AT 3' (ID DE SEC. N.° 5) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT ATT ATC GAA GCA TTA TCG GCA TTT GTC GCG TTT AC 3' (ID DE SEC. N.° 6). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGA GTT CAC TAT GAC a Aa CGA TTT CAC GAG TAA TA T 3' (ID DE SEC. N.° 7) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT TAC TCG TGA AAT CGT TTG TCA TAG TGA ACT CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 8).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 35 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 35 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CCT GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 9) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TCA GG 3' (ID DE SEC. N.° 10). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CAA CGA GAG GTG CTC a At ACA GAT ATC AAT CA 3' (ID DE SEC. N.° 11) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGA TTG ATA TCT GTA TTG AGC ACC TCT CGT TGT TC 3' (ID DE SEC. N.° 12).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 32 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 32 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGT CAT AGA TAG ACA GAA TAG CCG GAT AAA CT 3' (ID DE SEC. N.° 13) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTC TAT CTA TGA CT 3' (ID DE SEC. N.° 14). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT ACA GAA GTA GAA AGC Ag T CAC GCA ATA t A 3' (ID DE SEC. N.° 15) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT a Ct TCT GTA TC 3' (ID DE SEC. N.° 16).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 30 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 30 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGC ATA GAT AAC AGA ATA GCC GGA TAA ACT 3' (ID DE SEC. N.° 17) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTT ATC TAT GCC 3' (ID DE SEC. N.° 18). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC CAG TAG ATA AGT GAA CCA GAT TGA ACA 3' (ID DE SEC. N.° 19) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGT TCA ATC TGG TTC ACT TAT CTA CTG GTC 3' (ID DE SEC. N.° 20).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 28 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 28 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAC AGC CAG AGA GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 21) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CTC TCT GGC TGT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 22). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTG AAC ACG AAA GAG TGA Cg C AAT AAA T 3' (ID DE SEC. N.° 23) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT TAT TGC GTC ACT CTT TCG TGT TCA C 3' (ID DE SEC. N.° 24).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 25 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 25 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAA GCC a A g GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 25) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 26). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGA TGA CGA TAA AGA CGC AAA GAT T 3' (ID DE SEC. N.° 27) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AAT CTT TGC GTC TTT ATC GTC ATC T 3' (ID DE SEC. N.° 28). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede comprender 3 C, 6 G, 12 A y 4 T, y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender 6 C, 3 G, 4 A y 12 T.
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 23 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 23 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGA CCA AGT AAA CAG Gg A TAT AT 3' (ID DE SEC. N.° 29) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAT CCC TGT TTA CTT GGT c C 3' (ID DE SEC. N.° 30). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCT GAA AAC CAA TAT GAG AGT GA 3' (ID DE SEC. N.° 31) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TCA CTC TCA TAT TGG TTT TCA GC 3' (ID DE SEC. N.° 32).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 20 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 20 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT GAA GTA Cc G ACA a GA TA 3' (ID De SEC. N.° 33) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT CTT GTC GGT ACT TCA TC 3' (ID DE SEC. N.° 34). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGG ATG AAT AAC ACA GT 3' (ID DE SEC. N.° 35) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ACT GTG TTA TTC ATC CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 36).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 18 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 18 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCA GCA AAC Ga A GTA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 37) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAC TTC GTT TGC TGC 3' (ID DE SEC. N.° 38). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTC ATA ACA GAA CAG GTA 3' (ID DE SEC. N.° 39) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAC CTG TTC TGT TAT GAC 3' (ID DE SEC. N.° 40).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 15 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 15 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TCA AGA CAG Aa G GAT 3' (iD DE SEC. N.° 41) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATC CTT CTG TCT TGA 3' (ID DE SEC. N.° 42). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TAG CAA CAT AGG AAG 3' (ID DE SEC. N.° 43) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' CTT CCT ATG TTG CTA 3' (ID DE SEC. N.° 44).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 12 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 12 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAG AGA GCA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 45) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TGC TCT CTG 3' (ID DE SEC. N.° 46). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' c Aa GAG GTA CAT 3' (ID DE SEC. N.° 47) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' At G TAC CTC TTG 3' (ID DE SEC. N.° 48).
En un aspecto de un kit divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 10 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 10 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG AGG TAC A 3' (iD DE SEC. N.° 49) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' t Gt ACC TCT T 3' (ID DE SEC. N.° 50). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG GAC AGT A 3' (ID DE SEC. N.° 51) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAC TGT CCT T 3' (ID DE SEC. N.° 52).
iv) Co m p o s ic io n e s fa r m a c é u tic a s
En la presente, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una composición divulgada que comprende uno o más complejos divulgados. Por ejemplo, en un aspecto, una composición farmacéutica divulgada comprende (i) un complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido; y (ii) un portador farmacéuticamente admisible. En un aspecto, una composición farmacéutica divulgada comprende (i) un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; y (ii) un portador farmacéuticamente admisible. En un aspecto, una composición farmacéutica divulgada comprende (i) un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido; (ii) un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; y (iii) un portador farmacéuticamente admisible.
En un aspecto, una composición farmacéutica divulgada puede administrarse a un sujeto que necesita tratamiento para un tumor maligno de linfocitos B, un trastorno inflamatorio o una enfermedad autoinmune con participación de linfocitos B. Por ejemplo, en un aspecto, una composición farmacéutica divulgada puede administrarse a un sujeto que necesita tratamiento para un LNH. En un aspecto, una composición farmacéutica divulgada puede administrarse a un sujeto que necesita tratamiento para uno o más de los siguientes: linfoma no Hodgkin, trasplante de órgano, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, un sujeto puede presentar uno o más de los siguientes: linfoma no Hodgkin, trasplante de órgano, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, una composición farmacéutica divulgada puede administrarse a un sujeto que necesita tratamiento luego de recibir un trasplante de órgano. En un aspecto, una composición farmacéutica divulgada puede administrarse a un sujeto que necesita tratamiento, donde el sujeto tiene virus JC.
El portador farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, un sólido, un líquido o un gas. Algunos ejemplos de portadores sólidos son la lactosa, la terra alba, la sacarosa, el talco, la gelatina, el agar, la pectina, la goma arábiga, el estearato de magnesio y el ácido esteárico. Algunos ejemplos de portadores líquidos son el almíbar, el aceite de maní, el aceite de oliva y el agua. Algunos ejemplos de portadores gaseosos son el dióxido de carbono y el nitrógeno.
Para la preparación de las composiciones para la vía de administración oral, puede emplearse cualquier medio farmacéutico práctico. Por ejemplo, pueden emplearse agua, glicoles, aceites, alcoholes, saborizantes, conservantes, colorantes y otros agentes similares para formar preparaciones líquidas para administrar por vía oral como suspensiones, elixires y soluciones. En tanto, pueden emplearse portadores como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, dispersantes y agentes similares para formar preparaciones sólidas para administrar por vía oral como polvos, cápsulas y tabletas. Los comprimidos y las cápsulas son las unidades de dosificación por vía oral preferidas para el empleo de portadores farmacéuticos sólidos. Opcionalmente, los comprimidos pueden recubrirse mediante técnicas convencionales de recubrimiento acuoso o no acuoso. Un comprimido que contiene una composición o un complejo divulgados en la presente puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares o adyuvantes. Los comprimidos propiamente dichos pueden prepararse comprimiendo, en una máquina adecuada, un complejo divulgado de una composición en formato fluido (por ejemplo, en forma de polvo o gránulos), opcionalmente mezclado con un aglutinante, un lubricante, un diluyente inerte, un tensoactivo o un dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando, en una máquina adecuada, una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.
Se entiende que las composiciones divulgadas pueden prepararse a partir de los compuestos divulgados. También se entiende que las composiciones divulgadas pueden emplearse en los método de uso divulgados.
C. Mé to d o s
i) Mé to d o pa ra in d u c ir la a p o p t o s is
En la presente, se divulgan métodos para inducir la apoptosis, que comprenden poner una población de células en contacto con un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido; y poner una población de células en contacto con un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; donde el contacto de las células con el primer complejo y con el segundo complejo induce la apoptosis de las células. En un aspecto, un método divulgado puede comprender repetir el contacto de una población de células con un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido. En un aspecto, un método divulgado puede comprender repetir el contacto de una población de células con un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos. En un aspecto, un método divulgado puede comprender poner una población de células en contacto con un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido; y poner en contacto una población de células con un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos. En un aspecto, la persona versada en la técnica puede determinar una dosis eficaz, un programa eficaz o una vía de administración eficaz de una composición divulgada o un complejo divulgado para la inducción de la apoptosis.
En un aspecto, un método divulgado para inducir la apoptosis puede comprender confirmar la apoptosis de las células. Los métodos para confirmar la apoptosis son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo: la medición de la actividad de la caspasa-3, la medición de la unión de anexina V/ioduro de propidio y la medición de la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender una de las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender dos de las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender todas las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, la población de células puede ser una población de linfocitos B. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B normales. En un aspecto, las células pueden ser linfocitos B malignos. En un aspecto, la población de células puede encontrarse en un sujeto. En un aspecto, los linfocitos B pueden encontrarse en un sujeto. En un aspecto, un sujeto puede tener un linfoma no Hodgkin. En un aspecto, un sujeto puede haber recibido un trasplante de órgano. En un aspecto, un sujeto puede tener virus JC. En un aspecto, un sujeto puede presentar artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, un sujeto puede presentar uno o más de los siguientes: linfoma no Hodgkin, trasplante de órgano, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser específica para una molécula de superficie celular no internalizante o para una molécula de superficie celular lentamente internalizante. Los ejemplos de moléculas de superficie celular no internalizantes o moléculas de superficie celular lentamente internalizantes son conocidas en la técnica. En un aspecto, una molécula de superficie celular no internalizante o una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede encontrarse en una célula o una población de células. En un aspecto, una célula o una población de células pueden ser linfocitos B. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B normales. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B malignos.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, una molécula de superficie celular no internalizante puede ser un receptor. En un aspecto, una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede ser un receptor. Por ejemplo, las moléculas de superficie celular no internalizantes y las moléculas de superficie celular lentamente internalizantes incluyen, sin carácter taxativo: un receptor CD20, un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC), un receptor superficial de muerte celular, un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA) y un receptor perteneciente a la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR). La superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR) comprende el receptor de muerte celular 5 (DR5), el receptor FAS (CD95), el miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18) y el inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor CD20. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de proteínatirosina fosfatasa tipo C (PTPRC). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor superficial de muerte celular. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de muerte celular 4 (DR4). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA). En un aspecto, un receptor es un receptor de muerte celular 5 (DR5). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor FAS (CD95). En un aspecto, un receptor puede ser un miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18). En un aspecto, un receptor puede ser un inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12).
En un aspecto de un método divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido, un ligando peptídico, un aptámero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido. En un aspecto, un receptor puede ser un ligando peptídico. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un aptámero. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, un receptor puede ser un fragmento Fab'. En un aspecto, un fragmento Fab' puede ser humanizado. En un aspecto, un fragmento Fab' puede derivarse de un anticuerpo anti­ receptor CD20. Hay ejemplos de anticuerpos anti-receptor CD20 conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, los siguientes: 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab y BLX-301. En un aspecto, el anticuerpo anti-receptor CD20 puede ser 1F5.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, un copolímero portador puede ser soluble en agua. En un aspecto, un copolímero portador puede comprender una cadena principal y una o más cadenas secundarias. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador puede comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un copolímero portador pueden comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un copolímero portador pueden terminar en un grupo funcional. Los grupos funcionales son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, los siguientes: un éster activo amino-reactivo, una maleimida, una azida, un disulfuro y un alquino. En un aspecto, un grupo funcional puede permitir la unión de uno o más oligonucleótidos a una o más cadenas secundarias de un complejo de copolímero divulgado. En un aspecto, una o más cadenas secundarias pueden conjugarse con uno o más oligonucleótidos mediante un grupo funcional divulgado. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador divulgado puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT). En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador divulgado puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-p-nitrofenil éster (MA-GG-ONp).
Los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, un oligonucleótido puede ser biocompatible. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser de carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible y no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua y con carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede tener una o más de las siguientes propiedades: biocompatible, no degradable, soluble en agua y de carga neutra. Por ejemplo, en un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible, no degradable, soluble en agua y con carga neutra.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, un oligonucleótido puede ser un ácido peptidonucleico. En un aspecto de un método divulgado, un oligonucleótido puede ser un morfolino. En un aspecto, un morfolino no se une a ningún blanco de ARNm de un genoma, como, por ejemplo, el genoma humano. En un aspecto, un morfolino no es autocomplementario. En un aspecto de un método divulgado, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden ser complementarios. En un aspecto, el morfolino del primer complejo no es autocomplementario. En un aspecto, el/los morfolino(s) del segundo complejo no es/son autocomplementario(s). En un aspecto, el morfolino del primero complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10-7 M. En un aspecto, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10-9 M.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, el morfolino del primer complejo puede comprender entre 10 bp y 40 bp y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender entre 10 bp y 40 bp. Por ejemplo, en un aspecto, cada uno de los morfolinos en un método divulgado puede tener una longitud de 10 bp, 12 bp, 15 bp, 18 bp, 20 bp, 23 bp, 25 bp, 28 bp, 30 bp, 32 bp, 35 bp, 38 bp o 40 bp. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender un contenido de GC de entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. En un aspecto, cada uno de lo morfolinos puede comprender un contenido de G menor de 36 %. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender no más de 7 C.
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 40 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 40 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CTA ATG CAA TAA CTA TCA CGA ATG CGG GTA ACT TAA T 3' (ID DE SEC. N.° 1) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT AAG TTA CCC GCA TTC GTG a Ta GTT ATT GCA TTA GTT C 3' (ID DE SEC. N.° 2). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA ACC GCT ATT TAT TGG CTA AGA ACA GAT ACG AAT CAT A 3' (ID DE SEC. N.° 3) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT GAT TCG TAT CTG TTC TTA GCC AAT AAA TAG CGG TTT C 3' (ID DE SEC. N.° 4).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 38 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 38 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTA AAC GCG ACA AAT GCC GAT AAT GCT TCG ATA ATA AT 3' (ID DE SEC. N.° 5) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT ATT ATC GAA GCA TTA TCG g Ca TTT GTC GCG TTT AC 3' (ID DE s Ec . N.° 6). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGA GTT CAC TAT GAC AAA CGA TTT CAC GAG TAA TA T 3' (ID DE SEC. N.° 7) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT TAC TCG TGA AAT CGT TTG TCA TAG TGA ACT CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 8).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 35 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 35 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CCT GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 9) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA Tc A GG 3' (ID DE Se C. N.° 10). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CAA CGA GAG GTG CTC a At ACA GAT ATC AAT CA 3' (ID DE SEC. N.° 11) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGA TTG ATA TCT GTA TTG AGC ACC TCT CGT TGT TC 3' (ID DE SEC. N.° 12).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 32 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 32 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGT CAT AGA TAG ACA GAA TAG CCG GAT AAA CT 3' (ID DE SEC. N.° 13) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTC t At CTA TGA CT 3' (iD DE SEC. N.° 14). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT ACA GAA GTA GAA AGC a Gt CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 15) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TC 3' (ID DE SEC. N.° 16).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 30 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 30 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGC ATA GAT AAC AGA ATA GCC GGA TAA ACT 3' (ID DE SEC. N.° 17) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTT ATC TAT GCC 3' (ID DE SEC. N.° 18). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC CAG TAG ATA AGT GAA CCA GAT TGA ACA 3' (ID DE s Ec . N.° 19) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGT TCA ATC TGG TTC ACT TAT CTA CTG GTC 3' (ID DE SEC. N.° 20).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 28 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 28 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAC AGC Ca G AGA GAG AAT c Aa TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 21) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CTC TCT GGC TGT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 22). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTG AAC ACG AAA GAG TGA c Gc AAT AAA T 3' (ID DE SEC. N.° 23) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT TAT TGC GTC ACT CTT TCG TGT TCA C 3' (ID DE SEC. N.° 24).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 25 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 25 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAA g Cc a Ag g AG AAT CAA TAT A 3' (ID DE Se C. N.° 25) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT Ac T C 3' (ID DE SEC. N.° 26). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGA TGA CGA TAA AGA CGC a Aa GAT T 3' (ID DE SEC. N.° 27) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AAT CTT TGC GTC TTT ATC GTC ATC T 3' (ID DE SEC. N.° 28). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede comprender 3 citidinas, 6 guanosinas, 12 adenosinas y 4 timidinas, y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender 6 citidinas, 3 guanosinas, 4 adenosinas y 12 timidinas.
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 23 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 23 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGA CCA AGT Aa A Ca G GGA TAT AT 3' (ID DE SEC. N.° 29) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAT CCC TGT TTA CTT GGT CC 3' (ID DE SEC. N.° 30). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCT GAA AAC CAA TAT GAG AGT GA 3' (ID DE Se C. N.° 31) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TCA CTC TCA TAT TGG TTT TCA GC 3' (ID DE SEC. N.° 32).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 20 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 20 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT GAA GTA c Cg ACA AGa TA 3' (ID DE SEC. N.° 33) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT CTT GTC GGT ACT TCA TC 3' (ID DE SEC. N.° 34). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGG ATG AAT AAC ACA GT 3' (ID DE SEC. N.° 35) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ACT GTG TTA TTC ATC CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 36).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 18 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 18 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCA GCA AAC GAa Gt A TAT 3' (ID DE SEC. N.° 37) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAC TTC GTT TGC TGC 3' (ID DE SEC. N.° 38). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTC ATA ACA GAA CAG GTA 3' (ID DE SEC. N.° 39) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAC CTG TTC TGT TAT GAC 3' (ID DE SEC. N.° 40).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 15 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 15 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TCA AGA CAG AAG GAT 3' (ID DE SEC. N.° 41) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATC CTT CTG TCT TGA 3' (ID DE SEC. N.° 42). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TAG CAA CAT AGG AAG 3' (ID DE SEC. N.° 43) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' CTT CCT ATG TTG CTA 3' (ID DE SEC. N.° 44).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 12 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 12 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAG AGA GCA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 45) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TGC TCT CTG 3' (ID DE SEC. N.° 46). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAA GAG GTA CAT 3' (ID DE SEC. N.° 47) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATG TAC CTC TTG 3' (ID DE SEC. N.° 48).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 10 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 10 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG AGG TAC A 3' (ID DE SEC. N.° 49) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' t Gt ACC TCT T 3' (ID DE SEC. N.° 50). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG Ga C AGT A 3' (ID DE SEC. N.° 51) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' t Ac TGT CCT T 3' (ID DE SEC. N.° 52).
ii) Método para inducir la apoptosis
En la presente, se divulgan métodos para inducir la apoptosis, que comprenden poner una población de células en contacto con una composición que comprende un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un segundo complejo que comprende un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; donde el contacto de las células con la composición induce la apoptosis de las células. Un método divulgado puede comprender repetir el contacto de las células con la composición. Un método divulgado puede comprender confirmar la apoptosis de las células. Los métodos para confirmar la apoptosis son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo: la medición de la actividad de la caspasa-3, la medición de la unión de anexina V/ioduro de propidio y la medición de la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender una de las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender dos de las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender todas las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, la persona versada en la técnica puede determinar una dosis eficaz, un programa eficaz o una vía de administración eficaz de una composición divulgada o un complejo divulgado para la inducción de la apoptosis.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, la población de células puede ser una población de linfocitos B. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B normales. En un aspecto, las células pueden ser linfocitos B malignos. En un aspecto, la población de células puede encontrarse en un sujeto. En un aspecto, los linfocitos B pueden encontrarse en un sujeto. En un aspecto, un sujeto puede tener un linfoma no Hodgkin. En un aspecto, un sujeto puede haber recibido un trasplante de órgano. En un aspecto, un sujeto puede tener virus JC. En un aspecto, un sujeto puede presentar artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, un sujeto puede presentar uno o más de los siguientes: linfoma no Hodgkin, trasplante de órgano, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, una molécula de superficie celular no internalizante puede ser un receptor. En un aspecto, una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede ser un receptor. Por ejemplo, las moléculas de superficie celular no internalizantes y las moléculas de superficie celular lentamente internalizantes incluyen, sin carácter taxativo: un receptor CD20, un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC), un receptor superficial de muerte celular, un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA) y un receptor perteneciente a la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR). La superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR) comprende el receptor de muerte celular 5 (DR5), el receptor FAS (CD95), el miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18) y el inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor CD20. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de proteínatirosina fosfatasa tipo C (PTPRC). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor superficial de muerte celular. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de muerte celular 4 (DR4). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA). En un aspecto, un receptor es un receptor de muerte celular 5 (DR5). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor FAS (CD95). En un aspecto, un receptor puede ser un miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18). En un aspecto, un receptor puede ser un inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12).
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido, un ligando peptídico, un aptámero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido. En un aspecto, un receptor puede ser un ligando peptídico. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un aptámero. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, un receptor puede ser un fragmento Fab'. En un aspecto, un fragmento Fab' puede ser humanizado. En un aspecto, un fragmento Fab' puede derivarse de un anticuerpo anti-receptor CD20. Hay ejemplos de anticuerpos anti-receptor CD20 conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, los siguientes: 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab y BLX-301. En un aspecto, el anticuerpo anti-receptor CD20 puede ser 1F5.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, un copolímero portador puede ser soluble en agua. En un aspecto, un copolímero portador puede comprender una cadena principal y una o más cadenas secundarias. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador puede comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un copolímero portador pueden comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un copolímero portador pueden terminar en un grupo funcional. Los grupos funcionales son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, los siguientes: un éster activo amino-reactivo, una maleimida, una azida y un alquino. En un aspecto, un grupo funcional puede permitir la unión de uno o más oligonucleótidos a una o más cadenas secundarias de un complejo de copolímero divulgado. En un aspecto, una o más cadenas secundarias pueden conjugarse con uno o más oligonucleótidos mediante un grupo funcional divulgado. En un aspecto, una cadena principal puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT). En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador puede comprender N-(2hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-p-nitrofenil éster (MA-GG-ONp).
Los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto de un método divulgado, un oligonucleótido puede ser biocompatible. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser de carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible y no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua y con carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede tener una o más de las siguientes propiedades: biocompatible, no degradable, soluble en agua y de carga neutra. Por ejemplo, en un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible, no degradable, soluble en agua y con carga neutra.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, un oligonucleótido puede ser un ácido peptidonucleico. En un aspecto de un método divulgado, un oligonucleótido puede ser un morfolino. En un aspecto, un morfolino no se une a ningún blanco de ARNm de un genoma, como, por ejemplo, el genoma humano. En un aspecto, un morfolino no es autocomplementario. En un aspecto de un método divulgado, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden ser complementarios. En un aspecto, el morfolino del primer complejo no es autocomplementario. En un aspecto, el/los morfolino(s) del segundo complejo no es/son autocomplementario(s). En un aspecto, el morfolino del primero complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10-7 M. En un aspecto, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10-9 M.
En un aspecto de un método para inducir la apoptosis divulgado, el morfolino del primer complejo puede comprender entre 10 bp y 40 bp y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender entre 10 bp y 40 bp. Por ejemplo, en un aspecto, cada uno de los morfolinos en un método divulgado puede tener una longitud de 10 bp, 12 bp, 15 bp, 18 bp, 20 bp, 23 bp, 25 bp, 28 bp, 30 bp, 32 bp, 35 bp, 38 bp o 40 bp. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender un contenido de GC de entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. En un aspecto, cada uno de lo morfolinos puede comprender un contenido de G menor de 36 %. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender no más de 7 C.
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 40 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 40 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CTA ATG CAA TAA CTA TCA CGA ATG CGG GTA ACT TAA T 3' (ID DE SEC. N.° 1) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT AAG TTA CCC GCA TTC GTG a Ta GTT ATT GCA TTA GTT C 3' (ID DE SEC. N.° 2). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA ACC GCT ATT TAT TGG CTA AGA ACA GAT ACG AAT CAT A 3' (ID DE SEC. N.° 3) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT GAT TCG TAT CTG TTC TTA GCC AAT AAA TAG CGG TTT C 3' (ID DE SEC. N.° 4).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 38 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 38 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTA AAC GCG ACA AAT GCC GAT AAT GCT TCG ATA ATA AT 3' (ID DE SEC. N.° 5) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT ATT ATC GAA GCA TTA TCG g Ca TTT GTC GCG TTT AC 3' (ID DE s Ec . N.° 6). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGA GTT CAC TAT GAC AAA CGA TTT CAC GAG TAA TA T 3' (ID DE SEC. N.° 7) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT TAC TCG TGA AAT CGT TTG TCA TAG TGA ACT CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 8).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 35 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 35 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CCT GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 9) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA Tc A GG 3' (ID DE Se C. N.° 10). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CAA CGA GAG GTG CTC a At ACA GAT ATC AAT CA 3' (ID DE SEC. N.° 11) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGA TTG ATA TCT GTA TTG AGC ACC TCT CGT TGT TC 3' (ID DE SEC. N.° 12).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 32 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 32 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGT CAT AGA TAG ACA GAA TAG CCG GAT AAA CT 3' (ID DE SEC. N.° 13) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTC t At CTA TGA CT 3' (iD DE SEC. N.° 14). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT ACA GAA GTA GAA AGC a Gt CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 15) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TC 3' (ID DE SEC. N.° 16).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 30 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 30 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGC ATA GAT AAC AGA ATA GCC GGA TAA ACT 3' (ID DE SEC. N.° 17) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTT ATC TAT GCC 3' (ID DE SEC. N.° 18). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC CAG TAG ATA AGT GAA CCA GAT TGA ACA 3' (ID DE SEC. N.° 19) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGT TCA ATC TGG TTC ACT TAT CTA CTG GTC 3' (ID DE SEC. N.° 20).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 28 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 28 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAC AGC Ca G AGA GAG AAT c Aa TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 21) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CTC TCT GGC TGT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 22). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTG AAC ACG AAA GAG TGA c Gc AAT AAA T 3' (ID DE SEC. N.° 23) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT TAT TGC GTC ACT CTT TCG TGT TCA C 3' (ID DE SEC. N.° 24).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 25 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 25 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAA g Cc a Ag g AG AAT CAA TAT A 3' (ID DE Se C. N.° 25) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT Ac T C 3' (ID DE SEC. N.° 26). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGA TGA CGA TAA AGA CGC a Aa GAT T 3' (ID DE SEC. N.° 27) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AAT CTT TGC GTC TTT ATC GTC ATC T 3' (ID DE SEC. N.° 28). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede comprender 3 citidinas, 6 guanosinas, 12 adenosinas y 4 timidinas, y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender 6 citidinas, 3 guanosinas, 4 adenosinas y 12 timidinas.
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 23 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 23 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGA CCA AGT Aa A Ca G GGA TAT AT 3' (ID DE SEC. N.° 29) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAT CCC TGT TTA CTT GGT CC 3' (ID DE SEC. N.° 30). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCT GAA AAC CAA TAT GAG AGT GA 3' (ID DE Se C. N.° 31) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TCA CTC TCA TAT TGG TTT TCA GC 3' (ID DE SEC. N.° 32).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 20 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 20 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT GAA GTA c Cg ACA AGa TA 3' (ID DE SEC. N.° 33) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT CTT GTC GGT ACT TCA TC 3' (ID DE SEC. N.° 34). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGG ATG AAT AAC ACA GT 3' (ID DE SEC. N.° 35) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ACT GTG TTA TTC ATC CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 36).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 18 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 18 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCA GCA AAC GAa Gt A TAT 3' (ID DE SEC. N.° 37) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAC TTC GTT TGC TGC 3' (ID DE SEC. N.° 38). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTC ATA ACA GAA CAG GTA 3' (ID DE SEC. N.° 39) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAC CTG TTC TGT TAT GAC 3' (ID DE SEC. N.° 40).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 15 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 15 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TCA AGA CAG AAG GAT 3' (ID DE SEC. N.° 41) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATC CTT CTG TCT TGA 3' (ID DE SEC. N.° 42). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TAG CAA CAT AGG AAG 3' (ID DE SEC. N.° 43) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' CTT CCT ATG TTG CTA 3' (ID DE SEC. N.° 44).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 12 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 12 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAG AGA GCA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 45) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TGC TCT CTG 3' (ID DE SEC. N.° 46). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAA GAG GTA CAT 3' (ID DE SEC. N.° 47) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATG TAC CTC TTG 3' (ID DE SEC. N.° 48).
En un aspecto de un método divulgado para inducir la apoptosis, el morfolino del primer complejo puede tener 10 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 10 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG AGG TAC A 3' (ID DE SEC. N.° 49) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' t Gt ACC TCT T 3' (ID DE SEC. N.° 50). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG Ga C AGT A 3' (ID DE SEC. N.° 51) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' t Ac TGT CCT T 3' (ID DE SEC. N.° 52).
Mi) Método de tratamiento
En la presente se divulgan métodos para el tratamiento de un sujeto que lo necesite, donde el método comprende administrar a un sujeto una primera composición que comprende un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido; y administrar al sujeto una segunda composición que comprende un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos; donde la administración de la primera composición y de la segunda composición induce la apoptosis de una población de células blanco en el sujeto. En un aspecto, administrar comprende la administración intravenosa. En un aspecto, un método divulgado puede comprender repetir la administración de la primera composición. En un aspecto, un método divulgado puede comprender repetir la administración de la segunda composición. En un aspecto, un método divulgado puede comprender repetir la administración de la primera composición y repetir la administración de la segunda composición. En un aspecto, un método divulgado puede comprender confirmar la apoptosis de la población de células blanco. En un aspecto, la persona versada en la técnica puede determinar una dosis eficaz, un programa eficaz o una vía de administración eficaz de una composición divulgada o un complejo divulgado para el tratamiento de un sujeto que lo requiera.
Los métodos para confirmar la apoptosis son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo: la medición de la actividad de la caspasa-3, la medición de la unión de anexina V/ioduro de propidio y la medición de la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender una de las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender dos de las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal. En un aspecto, confirmar la apoptosis puede comprender todas las siguientes acciones: medir la actividad de la caspasa-3, medir la unión de anexina V/ioduro de propidio y medir la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, la población de células puede ser una población de linfocitos B. En un aspecto, los linfocitos B pueden ser linfocitos B normales. En un aspecto, las células pueden ser linfocitos B malignos. En un aspecto, la población de células puede encontrarse en un sujeto. En un aspecto, los linfocitos B pueden encontrarse en un sujeto. En un aspecto, un sujeto puede tener un linfoma no Hodgkin. En un aspecto, un sujeto puede haber recibido un trasplante de órgano. En un aspecto, un sujeto puede tener virus JC. En un aspecto, un sujeto puede presentar artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves. En un aspecto, un sujeto puede presentar uno o más de los siguientes: linfoma no Hodgkin, trasplante de órgano, artritis reumatoide, leucemia linfocítica crónica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, aplasia pura de glóbulos rojos, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Evans, vasculitis, dermatosis ampollosas, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Sjogren, enfermedad de Devic u oftalmopatía de Graves.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, una molécula de superficie celular no internalizante puede ser un receptor. En un aspecto, una molécula de superficie celular lentamente internalizante puede ser un receptor. Por ejemplo, las moléculas de superficie celular no internalizantes y las moléculas de superficie celular lentamente internalizantes incluyen, sin carácter taxativo: un receptor CD20, un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC), un receptor superficial de muerte celular, un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA) y un receptor perteneciente a la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR). La superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR) comprende el receptor de muerte celular 5 (DR5), el receptor FAS (CD95), el miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18) y el inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor CD20. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor superficial de muerte celular. En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de muerte celular 4 (DR4). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor de antígeno de células madre prostáticas (PSCA). En un aspecto, un receptor es un receptor de muerte celular 5 (DR5). En un aspecto, un receptor puede ser un receptor FAS (CD95). En un aspecto, un receptor puede ser un miembro 18 de la superfamilia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFRSF18). En un aspecto, un receptor puede ser un inductor débil de apoptosis celular similar al TNF (TWEAK o TNFSF12).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido, un ligando peptídico, un aptámero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un polisacárido. En un aspecto, un receptor puede ser un ligando peptídico. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un aptámero. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento variable monocatenario. En un aspecto, un receptor puede ser un fragmento Fab'. En un aspecto, un fragmento Fab' puede ser humanizado. En un aspecto, un fragmento Fab' puede derivarse de un anticuerpo anti-receptor CD20. Hay ejemplos de anticuerpos anti-receptor CD20 conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, los siguientes: 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab y BLX-301. En un aspecto, el anticuerpo anti-receptor CD20 puede ser 1F5.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, un copolímero portador puede ser soluble en agua. En un aspecto, un copolímero portador puede comprender una cadena principal y una o más cadenas secundarias. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador puede comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un copolímero portador pueden comprender secuencias enzimáticamente degradables. En un aspecto, una o más cadenas secundarias de un copolímero portador pueden terminar en un grupo funcional. Los grupos funcionales son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter taxativo, los siguientes: un éster activo amino-reactivo, una maleimida, una azida y un alquino. En un aspecto, un grupo funcional puede permitir la unión de uno o más oligonucleótidos a una o más cadenas secundarias de un complejo de copolímero divulgado. En un aspecto, una o más cadenas secundarias pueden conjugarse con uno o más oligonucleótidos mediante un grupo funcional divulgado. En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador divulgado puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT). En un aspecto, una cadena principal de un copolímero portador divulgado puede comprender N-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) copolimerizada con monómeros de N-metacriloilglicilglicina-p-nitrofenil éster (MA-GG-ONp).
Los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, un oligonucleótido puede ser biocompatible. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser de carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible y no degradable. En un aspecto, un oligonucleótido puede ser soluble en agua y con carga neutra. En un aspecto, un oligonucleótido puede tener una o más de las siguientes propiedades: biocompatible, no degradable, soluble en agua y de carga neutra. Por ejemplo, en un aspecto, un oligonucleótido puede ser biocompatible, no degradable, soluble en agua y con carga neutra.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, un oligonucleótido puede ser un ácido peptidonucleico. En un aspecto de un método divulgado, un oligonucleótido puede ser un morfolino. En un aspecto, un morfolino no se une a ningún blanco de ARNm de un genoma, como, por ejemplo, el genoma humano. En un aspecto, un morfolino no es autocomplementario. En un aspecto, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden ser complementarios. En un aspecto, el morfolino del primer complejo no es autocomplementario. En un aspecto, el/los morfolino(s) del segundo complejo no es/son autocomplementario(s). En un aspecto, el morfolino del primero complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10'7 M. En un aspecto, el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo pueden tener una Kd menor de 10'9 M.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede comprender entre 10 bp y 40 bp y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender entre 10 bp y 40 bp. Por ejemplo, en un aspecto, cada uno de los morfolinos en un método divulgado puede tener una longitud de 10 bp, 12 bp, 15 bp, 18 bp, 20 bp, 23 bp, 25 bp, 28 bp, 30 bp, 32 bp, 35 bp, 38 bp o 40 bp. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender un contenido de GC de entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 65 %. En un aspecto, cada uno de lo morfolinos puede comprender un contenido de G menor de 36 %. En un aspecto, cada uno de los morfolinos puede comprender no más de 7 bases nitrogenadas C.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 40 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 40 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CTA ATG CAA TAA CTA TCA CGA ATG CGG GTA ACT TAA T 3' (ID DE SEC. N.° 1) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT AAG TTA CCC GCA TTC GTG ATA GTT ATT GCA t TA GTT C 3' (ID DE SEC. N.° 2). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA ACC GCT ATT TAT TGG CTA AGA ACA GAT a Cg AAT c At A 3' (ID DE SEC. N.° 3) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT GAT TCG TAT CTG TTC TTA GCC AAT AAA TAG CGG TTT C 3' (ID DE SEC. N.° 4).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 38 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 38 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTA AAC GCG ACA AAT GCC GAT AAT GCT TCG ATA ATA AT 3' (ID DE SEC. N.° 5) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT ATT ATC GAA GCA TTA TCG GCA TTT GTC GCG TTT AC 3' (ID DE SEC. N.° 6). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGA GTT CAC TAT GAC a Aa CGA TTT CAC GAG TAA Ta T 3' (ID DE SEC. N.° 7) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT TAC TCG TGA AAT CGT TTG TCA TAG TGA ACT CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 8).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 35 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 35 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CCT GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 9) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TCA GG 3' (ID DE SEC. N.° 10). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAA CAA CGA GAG GTG CTC a At ACA GAT ATC AAT CA 3' (ID DE SEC. N.° 11) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGA TTG ATA TCT GTA TTG AGC ACC TCT CGT TGT TC 3' (ID DE SEC. N.° 12).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 32 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 32 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGT CAT AGA TAG ACA GAA TAG CCG GAT AAA CT 3' (ID DE SEC. N.° 13) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTC TAT CTA TGA CT 3' (ID DE SEC. N.° 14). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT ACA GAA GTA GAA AGC AGT CAC GCA ATA TA 3' (ID DE SEC. N.° 15) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GCG TGA CTG CTT TCT ACT TCT GTA TC 3' (ID DE SEC. N.° 16).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 30 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 30 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGC ATA GAT AAC AGA ATA GCC GGA TAA ACT 3' (ID DE SEC. N.° 17) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AGT TTA TCC GGC TAT TCT GTT ATC TAT GCC 3' (ID DE SEC. N.° 18). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC CAG TAG ATA AGT GAA CCA GAT TGA ACA 3' (ID DE SEC. N.° 19) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGT TCA ATC TGG TTC ACT TAT CTA CTG GTC 3' (ID DE SEC. N.° 20).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 28 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 28 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAC AGC CAG AGA GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 21) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CTC TCT GGC TGT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 22). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTG AAC ACG AAA GAG TGA Cg C AAT AAA T 3' (ID DE SEC. N.° 23) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATT TAT TGC GTC ACT CTT TCG TGT TCA C 3' (ID DE SEC. N.° 24).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 25 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 25 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAG TAA Gc C Aa G GAG AAT CAA t At A 3' (ID DE SEC. N.° 25) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 26). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AGA TGA CGA TAA AGA CGC AAa GAT T 3' (ID DE SEC. N.° 27) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' AAT CTT TGC GTC TTT ATC GTC At C T 3' (ID DE SEC. N.° 28). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede comprender 3 citidinas, 6 guanosinas, 12 adenosinas y 4 timidinas, y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) comprender 6 citidinas, 3 guanosinas, 4 adenosinas y 12 timidinas.
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 23 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 23 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GGA CCA AGT a AA Ca G GGA TAT AT 3' (ID DE SEC. N.° 29) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAT CCC TGT TTA CTT GGT CC 3' (ID DE SEC. N.° 30). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCT GAA AAC CAA TAT GAG AGT GA 3' (ID DE Se C. N.° 31) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TCA CTC TCA TAT TGG TTT TCA GC 3' (ID DE SEC. N.° 32).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 20 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 20 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAT GAA Gt A Cc G ACA AGA TA 3' (ID DE SEC. N.° 33) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAT CTT GTC GGT ACT TCA TC 3' (ID DE SEC. N.° 34). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GAC AGG ATG AAT AAC ACA GT 3' (ID DE SEC. N.° 35) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ACT GTG TTA TTC ATC CTG TC 3' (ID DE SEC. N.° 36).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 18 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 18 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GCA GCA AAC g AA GTA t AT 3' (ID DE SEC. N.° 37) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATA TAC TTC GTT TGC TGC 3' (ID DE SEC. N.° 38). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' GTC ATA ACA GAA CAG GTA 3' (ID DE SEC. N.° 39) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TAC CTG TTC TGT TAT GAC 3' (ID DE SEC. N.° 40).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 15 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 15 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TCA AGA Ca G a AG GAT 3' (ID DE SEC. N.° 41) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATC CTT CTG TCT TGA 3' (ID DE SEC. N.° 42). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' TAG CAA CAT AGG AAG 3' (ID DE SEC. N.° 43) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' CTT CCT ATG TTG CTA 3' (ID DE SEC. N.° 44).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 12 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 12 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAG AGA GCA TAT 3' (ID DE SEC. N.° 45) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' At A TGC TCT CTG 3' (ID DE SEC. N.° 46). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' CAA GAG GTA CAT 3' (ID DE SEC. N.° 47) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' ATG TAC CTC TTG 3' (ID DE SEC. N.° 48).
En un aspecto de un método de tratamiento divulgado, el morfolino del primer complejo puede tener 10 bp de longitud y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) tener 10 bp de longitud. En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG AGG TAC A 3' (ID DE SEC. N.° 49) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' TGT ACC TCT T 3' (ID DE SEC. N.° 50). En un aspecto, el morfolino del primer complejo puede ser 5' AAG GAC AGT A 3' (ID DE SEC. N.° 51) y el/los morfolino(s) del segundo complejo puede(n) ser 5' t Ac TGT CCT T 3' (ID DE SEC. N.° 52).
D. Sín te s is
i) SÍNTESIS DE UN COMPLEJO QUE COMPRENDE UNA FRACCIÓN DE DIRECCIONAMIENTO Y UN OLIGONUCLEÓTIDO
En la presente, se divulgan procesos para sintetizar un complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, donde el proceso comprende obtener una fracción de direccionamiento, modificar un oligonucleótido y conjugar la fracción de direccionamiento con el oligonucleótido. En un aspecto, una fracción de direccionamiento puede conjugarse con el oligonucleótido por medio de un enlace tioéter. En un aspecto, un oligonucleótido puede estar modificado con SMCC. En un aspecto, el oligonucleótido puede contener un grupo 3'-maleimido. En un aspecto, el proceso de sintetizar un complejo puede comprender introducir una marca detectable. En un aspecto de un proceso divulgado para sintetizar un complejo, una fracción de direccionamiento puede ser una fracción de direccionamiento divulgada. Por ejemplo, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento Fab' específico para CD20. En un aspecto de un proceso divulgado para sintetizar un complejo, un oligonucleótido puede ser un oligonucleótido divulgado. Por ejemplo, un oligonucleótido divulgado puede ser un morfolino que comprenda entre 10 y 40 bp.
ii) SÍNTESIS DE UN COMPLEJO QUE COMPRENDE UN COPOLÍMERO PORTADOR Y UNO O MÁS OLIGONUCLEÓTIDOS
En la presente se divulgan procesos para sintetizar un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, donde el proceso comprende obtener un copolímero portador, modificar el/los oligonucleótido(s) y conjugar el copolímero portador con el/los oligonucleótido(s). En un aspecto, un copolímero portador puede comprender una cadena principal y una o más cadenas secundarias. En un aspecto, puede emplearse la polimerización RAFT para generar una cadena principal divulgada. En un aspecto, el proceso de sintetizar un complejo puede comprender introducir una marca detectable. En un aspecto de un proceso divulgado para sintetizar un complejo, un copolímero portador puede ser un copolímero portador divulgado. Por ejemplo, un copolímero portador divulgado puede comprender copolímeros de HPMA copolimerizados con monómeros de MA-GG-Tt . En un aspecto de un proceso divulgado para sintetizar un complejo, uno o más oligonucleótidos pueden ser uno o más oligonucleótidos divulgados. Por ejemplo, uno o más oligonucleótidos divulgados pueden ser morfolinos que comprendan entre 10 y 40 bp.
iii) SÍNTESIS DE UNA COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE UN COMPLEJO QUE COMPRENDE UNA FRACCIÓN DE DIRECCIONAMIENTO Y UN OLIGONUCLEÓTIDO, Y UN COMPLEJO QUE COMPRENDE UN COPOLÍMERO PORTADOR Y UNO O MÁS OLIGONUCLEÓTIDOS
En la presente se divulgan procesos para sintetizar un complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido, y un complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos, donde el proceso comprende poner un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido con un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos. En un aspecto, un oligonucleótido de un primer complejo hibrida con el/los oligonucleótido(s) de un segundo complejo. En un aspecto, un proceso divulgado puede comprender generar un primer complejo. En un aspecto, un proceso divulgado puede comprender generar un segundo complejo. En un aspecto, un proceso divulgado puede comprender generar un primer complejo y generar un segundo complejo. En un aspecto, un primer complejo puede ser cualquier complejo divulgado que comprenda una fracción de direccionamiento y un oligonucleótido. En un aspecto, un segundo complejo puede ser cualquier complejo divulgado que comprenda un copolímero portador y uno o más oligonucleótidos. Por ejemplo, en un aspecto de un proceso divulgado, una fracción de direccionamiento puede ser un fragmento Fab' específico para CD20, un copolímero portador puede comprender copolímeros de HPMA copolimerizados con monómeros de MA-GG-TT, y cada uno de los oligonucleótidos puede ser un morfolino que comprenda entre 10 y 40 bp, donde el morfolino del primer complejo es complementario al/a los morfolino(s) del segundo complejo.
Se contempla que cada uno de los métodos divulgados puede comprender, a su vez, pasos, manipulaciones y/o componentes adicionales. También se contempla que uno o más pasos, manipulaciones y/o componentes cualesquiera pueden omitirse opcionalmente. Se entiende que uno de los métodos divulgados puede usarse para proveer los compuestos divulgados. También se entiende que los productos de los métodos divulgados pueden emplearse en los método de uso divulgados.
E. E je m p lo s
Los siguientes ejemplos se proveen para ofrecer a la persona razonablemente versada en la técnica una divulgación y una descripción completas de cómo se hacen y evalúan los compuestos, las composiciones, los artículos, los dispositivos y/o los métodos que se reivindican en la presente, pero debe entenderse que estos son únicamente ejemplares de la invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Sin embargo, la persona versada en la técnica debería, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y, de todas formas, obtener un resultado idéntico o similar sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención. Se ha hecho un esfuerzo por garantizar la exactitud de las cifras (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero es posible que persistan algunos errores y desviaciones.
i) Ev a l u a c ió n in v itr o
a. D is e ñ o de m o r f o lin o s
Se diseñó un par de morfolinos complementarios de 25 bp (MORF1-m = 5' GAG TAA GCC AAG GAG AAT CAA TAT A 3' [ID DE SEC. N.° 25] y MORF2-m = 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' [ID DE SEC. N.° 26]). Los morfolinos se modificaron con una amina primaria 3' usada para la conjugación (FIG. 2, Gene Tools, LLC [Philomath, OR]). Los oligonucleótidos de 25 bp se seleccionaron de manera de garantizar una afinidad de unión elevada para los experimentos posteriores; el valor de Kd de la hibridación entre ambos morfolinos de 25 bp está en el orden de los pM. La composición de secuencia de cada uno de estos dos morfolinos se diseñó para lograr una eficacia y una especificidad óptimas de unión. En este caso, el contenido de GC de cada morfolino fue de aproximadamente 35 a 65 %. Para garantizar una buena solubilidad acuosa, el contenido total de G fue menor de 36 %. Para garantizar una farmacocinética favorable evitando la depuración renal rápida, la cantidad total de bases nitrogenadas C fue menor de 7. Luego de determinar la composición de bases de cada morfolino, se usó un “permutador” en línea y de acceso público para garantizar que la unión inespecífica con ARNm humano y murino fuera mínima (a saber, el sitio web disponible en www.sirnawizard.com/scrambled.php). Además, se usó un software de análisis de secuencias en línea y de acceso público para garantizar que la autocomplementariedad fuera mínima (a saber, el sitio web disponible en www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).
b. S ín t e s is d e l c o m p le jo Fa b '-M O R F1
Se preparó anticuerpo IgG murino anti-CD20 (1F5) a partir del clon de hibridoma 1F5 en un bioreactor (CellMax) y se lo purificó en una columna de proteína G. Los anticuerpos se digirieron con pepsina para obtener el fragmento F(ab')2 y, posteriormente, se redujeron con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para obtener el fragmento Fab'. Luego, el fragmento Fab' se conjugó con un morfolino modificado con succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (es decir, un morfolino con un grupo 3'-maleimida). Aquí, el morfolino estaba representado por el ID DE SEC. N.° 25 y tenía un grupo 3'-maleimida tiol-reactivo, y la conjugación se realizó mediante un enlace tioéter. El producto final fue un complejo Fab'-MORFI (FIG. 3A). El complejo Fab'-MORFI se marcó con rodamina para la obtención de imágenes.
c. S ín t e s is d e l c o m p le jo c o p o l ím e r o -M O R F 2
Un copolímero de HPMA que contenía cadenas secundarias con grupos tiazolidina-2-tiona (TT) amino-reactivos se sintetizó mediante polimerización por reacción reversible de adición-fragmentación con transferencia de cadena (RAFT). La polimerización RAFT es bien conocida en la técnica (FIG. 3B). Se usó monómero de N-metacriloilglicilglicina-TT (MA-GG-TT) para introducir la TT mediante un separador glicina-glicina. Para la obtención de imágenes, se agregó una pequeña cantidad de comonómero que contenía FITC (isotiocianato de fluoresceína), que era una opción. Mediante la polimerización RAFT, se logró sintetizar de forma reproducible la cadena polimérica principal con una distribución estrecha de pesos moleculares. La reacción de los grupos TT de las cadenas secundarias con el MORF2 derivatizados con amina (ID DE SEC. N.° 26) produjeron un copolímero de HPMA injertado con múltiples copias de MORF2 mediante enlaces amídicos estables. El producto resultante fue un complejo copolímero-MORF2. Se sintetizaron complejos copolímero-MORF2 con distintas valencias (cantidad de morfolinos injertados en la cadena del copolímero) para permitir una comparación de los efectos biológicos de estos complejos. El complejo copolímero-MORF2 se marcó con FITC para la obtención de imágenes (FIG. 3B).
d. Ev a l u a c ió n in vitro de lo s c o m p le jo s
La hibridación in vitro del complejo Fab'-MORFI y del complejo copolímero-MORF2 se determinó mediante los tres métodos siguientes: (1) espectroscopia UV-visible (la hibridación causa un efecto hipocrómico en la absorbancia a 260 nm); (2) SDS-PAGE (la hibridación causa un retardo en la migración por el gel); y (3) dispersión dinámica de luz (la hibridación causa un cambio en el diámetro hidrodinámico efectivo). A nivel celular, se usaron linfocitos B humanos de la línea celular Raji de LNH de Burkitt (ATCC, Bethesda, MD) para estudiar el biorreconocimiento del complejo Fab'-MORFI y del complejo copolímero-MORF2. El reconocimiento y la unión de los complejos a la superficie celular de las células Raji se determinó mediante microscopía de fluorescencia confocal. La inducción de la apoptosis se analizó con tres medidas diferentes: (1) la actividad de la caspasa-3 (expresión génica apoptótica); (2) unión de anexina V/ioduro de propidio (PI) (inversión de la membrana como evento apoptótico temprano); y (3) la medición de la marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) (fragmentación del ADN genómico como evento apoptótico tardío). A lo largo de estos estudios, se usó anticuerpo monoclonal (mAb) 1F5 hiperreticulado con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (GAM) como control positivo clínicamente relevante. Además, se usaron linfocitos B DG-75 de LNH con expresión baja o nula de CD20 como línea celular de control negativo.
Para evaluar la hibridación del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2, así como el efecto directo de tal hibridación sobre la inducción de la apoptosis, se realizó una serie de experimentos de control. Específicamente, se realizaron los siguientes experimentos: (1) un tratamiento de un único componente con el complejo Fab'-MORF1; (2) un tratamiento de un único componente con el complejo copolímero-MORF2; (3) un tratamiento de dos componentes con el complejo Fab'-MORF1 y copolímero libre; (4) un tratamiento de dos componentes con el complejo copolímero-MORF2 y el fragmento Fab' libre; y (5) los controles de “bloqueo” tratados con exceso de (i) MORF1 libre no conjugado y (ii) MORF2 libre no conjugado (es decir, donde el MORF1 libre y el MORF2 libre competían por la unión con los complejos).
La síntesis exitosa del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2 se confirmó mediante FPLC, HPLC, espectroscopia UV-visible y espectrometría de masas MALDI-ToF. La hibridación in vitro del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2 se confirmó mediante (1) espectroscopia UV-visible (260 nm), (2) SDS-PAGE (la hibridación causa un retardo en la migración por el gel); y (3) dispersión dinámica de luz (DLS) (FIG. 4). La rápida cinética de unión de la hibridación entre el complejo Fab'-MORF1 y el complejo copolímero-MORF2 (~10 min) quedó demostrada por el aumento significativo y rápido de los diámetros hidrodinámicos efectivos de las partículas tras la mezcla de ambos complejos (caracterizados mediante DLS). En estos experimentos, se analizaron los tamaños de partícula hidrodinámicos de cada complejo MORF, así como de la mezcla de ambos complejos MORF (con un cociente molar 1:1 entre MORF1 y MORF2) La rápida hibridación (~10 min) del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2 se reflejó en el hecho de que los tamaños de partícula medidos 10 minutos, 30 minutos y 60 minutos después de la mezcla fueron similares. Las mediciones se hicieron por triplicado. La hibridación fue muy rápida en comparación con la hibridación de la formación del péptido de hélice superenrollada (~60 min) (véase Wu et al., 2010, que muestra el autoensamblado de un péptido anti-CD20 Fab'-CCE con copolímero HPMA-CCK péptido).
e. Resultados experimentales
El linfoma no Hodgkin (LNH) es un tipo de cáncer con alta prevalencia a nivel mundial con una alta tasa de mortalidad. Aproximadamente el 85 % de los l Nh tienen su origen en linfocitos B y más del 95 % de los linfomas de linfocitos B expresan el antígeno de superficie celular CD20. Por lo tanto, el biorreconocimiento de dos complejos MORF en la superficie celular de linfocitos B Raji (células con alto nivel de expresión de CD20) se evaluó mediante microscopia fluorescente confocal (FIG. 5). En la FIG. 5, se usan las siguientes abreviaturas. Trans: imágenes de células obtenidas con transiluminación; R: canal rojo; G: canal verde; O: superposición de R y G. La exposición de los linfocitos B al complejo Fab'-MORF1 (marcado con rodamina) produjo una “decoración” de la superficie de los linfocitos B con el complejo Fab'-MORF1 mediante la unión del complejo Fab'-MORF1 al CD20 (según indica la señal roja). Las células expuestas al complejo copolímero-MORF2 (marcadas con FITC) no mostraron ninguna señal de fluorescencia detectable, lo que era esperable debido a la ausencia de un par de biorreconocimiento. Sin embargo, cuando se usaron ambos complejos (complejo Fab'-MORF1 y complejo copolímero-MORF2), ambos protocolos de tratamiento (tratamiento con exposición simultánea a ambos complejos premezclados o tratamiento con exposición consecutiva a cada complejo) resultaron en una colocalización de ambos complejos en la superficie de los linfocitos B y, por ende, a la hibridación del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2 (se muestran en fluorescencia amarilla). Esta hibridación se indica por la superposición de las señales de fluorescencia en la superficie del linfocito B.
El protocolo de tratamiento simultáneo (con complejos premezclados) pareció generar una señal de fluorescencia más intensa en la superficie celular, lo cual es el resultado de la multivalencia de los complejos premezclados que posees mayores afinidades de unión. En los experimentos de control, la mezcla previa del complejo Fab'-MORF1 y del polímero libre marcado con FITC (es decir, sin complejo copolímero-MORF2) produjo únicamente señal roja en la superficie del linfocito B. Análogamente, en los experimentos de control, la mezcla previa del complejo Fab'-MORF1 y un exceso de MORF1 libre no conjugado produjo únicamente señal roja en la superficie del linfocito B. Estos resultados confirmaron que la hibridación entre el complejo MORF1 y el complejo MORF2 confiere un excelente biorreconocimiento.
La eficacia de la hibridación entre ambos complejos MORF demostró ser mucho mayor que la de otras moléculas (p. ej., los péptidos de hélice superenrollada). Por ejemplo, se aplicó un cociente molar de 1:1 (MORF1:MOr F2). En contraste con la excelente eficacia de hibridación y el excelente biorreconocimiento que proveen las composiciones y los métodos divulgados en la presente, los péptidos de hélice superenrollada requirieron un exceso de 25 veces del segundo péptido para lograr un biorreconocimiento detectable. Estos experimentos demostraron que había mayor accesibilidad de los morfolinos en la cadena de copolímero que en el caso de los péptidos de hélice superenrollada. La mayor accesibilidad de los morfolinos, combinada con la cinética de unión más rápida (según demuestran los resultados de DLS en la FIG. 4), indica que las composiciones divulgadas que comprenden morfolinos tienen ventajas en términos de la inducción de la apoptosis y de la eficacia terapéutica in vivo.
La inducción de la apoptosis de linfocitos B Raji luego del tratamiento con los complejos divulgados que comprenden morfolinos se confirmó mediante tres métodos distintos, a saber: (A) activación de la caspasa-3; (B) unión de anexina V/ioduro de propidio (PI); y (C) determinación TUNEL (FIGS. 6A a 6C). El tratamiento con ambos complejos (complejo Fab'-MORF1 y complejo copolímero-MORF2), fueran administrados consecutivamente o previamente mezclados, indujo una apoptosis celular detectable. El nivel de inducción de la apoptosis en los grupos de control (es decir, en los grupos de tratamiento con el complejo Fab'-MORF1 solo o con el complejo copolímero-MORF2 solo) no fue estadísticamente diferente del nivel en el caso de las células no tratadas. Cuando el cociente molar MORF1:MORF2 era de 1:10, los niveles de inducción de la apoptosis eran indistinguibles de los niveles en los grupos con un cociente molar MORF1:MORF2 de 1:1. Estos datos indican una posible saturación de los sitios de unión a MORF1 en la superficie celular. Estos datos también confirman la excelente accesibilidad de los morfolinos en la cadena del copolímero. En los experimentos que se muestran en las FIG. 6A a 6C, se usó una solución 0,5 pM de los dos complejos de morfolinos o mAb 1F5 para tratar 2*105 células/0,4 mL (en el caso de las determinaciones de caspasa-3 [FIG. 6A] y de anexina V/ioduro de propidio [FIG. 6B]) o 106 células/0,5 mL (en el caso de la determinación TUNEL [FIG. 6C]). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
La Tabla 3 muestra una comparación entre la inducción de la apoptosis con los complejos de morfolinos divulgados en la presente y con péptidos de hélice superenrollada. En estos experimentos, se evaluó el índice apoptótico (%) de linfocitos B humanos Raji de LNH en las mismas condiciones de cantidad de células y concentración (2*105 células en 400 pL de medio de cultivo). El cociente molar entre ambos componentes (CCE:CCK o MORF1:MORF2) es 1:1 en ambos casos. El peso molecular de la cadena principal de los polímeros también es muy similar (~100 kDa). Estos datos indican que las composiciones y los métodos basados en morfolinos (que se evaluaron con menor concentración o menor valencia de los conjugados poliméricos) indujeron niveles mayores de apoptosis en comparación con el sistema de péptidos de hélice superenrollada. Los datos se observaron en ambos protocolos de tratamiento (es decir, tanto en el caso de administrar los complejos consecutivamente como en el caso de administrarlos como una composición premezclada).
Tabla 3: Comparación de la inducción de la apoptosis
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En la Tabla 3, el índice apoptótico (%) se evaluó mediante una determinación de unión de anexina V/PI y se cuantificó mediante citometría de flujo. Los dos sistemas se compararon a intervalos de tiempo correspondientes a la apoptosis máxima (es decir, 12 horas en el caso de los péptidos de hélice superenrollada [CCE-CCK] y 48 horas en el caso de la hibridación entre MORF1 y MORF2). Se indica la concentración molar de Fab' (conc. equivalente de CCE o MORF1) y la valencia de los conjugados poliméricos (n.° CCK o n.° MORF2/cadena).
Como se muestra en la FIG. 7, aumentar la concentración de los complejos (de 0,5 pM en la FIG. 6 a 1 pM, 2 pM y 5 pM) produjo la inducción de niveles mayores de apoptosis (FIG. 7). El nivel de inducción de la apoptosis dependiente de la dosis se observó con ambos protocolos de tratamiento (es decir, cuando los dos complejos se administraron como una composición premezclada o cuando se administraron de forma consecutiva), así como en el control positivo (mAb 1F5 anticuerpo secundario de cabra anti-ratón). Cuando la concentración se aumentó de 2 a 5 pM, el índice apoptótico de las células control positivo comenzó a saturarse. Sin embargo, no se observó saturación en los protocolos de tratamiento que utilizaban la hibridación del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2. En la FIG. 7, complejos de morfolino o mAb 1F5 a una concentración de 1 pM, 2 pM o 5 pM se usaron para tratar 2*105 células en 0,4 mL de medio. El tiempo de incubación fue de 48 horas y el análisis se realizó mediante citometría de flujo.
La FIG. 8A y la FIG. 8B muestran los resultados de varios experimentos de control. El protocolo de tratamiento con (i) el complejo Fab'-MORF1 premezclado con copolímero libre (sin MORF2) y (ii) el complejo copolímero-MORF2 premezclado con fragmento Fab' libre (sin MORF1) resultaron en índices apoptóticos similares en comparación con los índices apoptóticos de las células no tratadas. Los protocolos con grupos de control “bloqueantes” tratados consecutivamente (complejo premezclado con exceso de MORF1 libre o con exceso de MORF2 libre para competir con los sitios de unión para la hibridación) tampoco produjeron una inducción observable de la apoptosis. Estos resultados demostraron que la hibridación entre MORF1 y MORF2 era necesaria para la inducción de la apoptosis. Por último, como control negativo (FIG. 8B) se usó la línea de linfocitos B de LNH DG-75, que no expresa c D20 en la superficie celular. Este control se analizó con una determinación de anexina V/yoduro de propidio. La exposición de las células DG-75 resultó en una inducción de la apoptosis muy baja o nula. Este resultado demostró que la eficacia in vitro del enfoque basado en morfolinos de la divulgación estaba mediada por la reticulación de los receptores CD20. En la FIG. 8A y la FIG. 8B, P-deMF2 indica que el complejo copolímero-MORF2 premezclado con MORF1 libre (exceso de 20 veces, 1 hora a temperatura ambiente) y Fab'-deMF1 indica complejo Fab'-MORF1 premezclado con MORF2 libre (exceso de 20 veces, 1 hora a temperatura ambiente).
ii) Evaluación in vivo
a. Experimento i n v i v o n.° 1
Para contar con un modelo animal del LNH, se pueden trasplantar linfocitos B Raji de forma intravenosa a ratones hembra SCID (C.B-17). Este modelo representa la diseminación, la infiltración y el crecimiento de linfocitos B malignos (LNH) en distintos órganos, particularmente la columna vertebral y la médula ósea. El sujeto desarrolla parálisis de las extremidades posteriores y muere. En este contexto, puede determinarse la cantidad de tiempo que transcurre entre el momento en que el sujeto recibe tratamiento con una composición divulgada o un complejo divulgado y el inicio de la parálisis de las extremidades posteriores. Así, la cantidad de tiempo que transcurre entre el tratamiento y el inicio de la parálisis puede usarse como indicador de la eficacia terapéutica.
La inmunogenicidad del complejo Fab'-MORF1 y del complejo copolímero-MORF2 pueden evaluarse en ratones inmunocompetentes (p. ej., ratones Balb/c). Una determinación por inmunoabsorción con unión a enzimas (ELISA) puede detectar la liberación temprana de citoquinas (p. ej., IFNa y TNFa) en la sangre de ratones ante la inyección intravenosa de los conjugados, y puede detectar la producción de anticuerpos a largo plazo en la sangre y el bazo de ratones Balb/c inmunizados.
b. Experimento i n v i v o n.° 2
Los nanomateriales híbridos compuestos por bloques sintéticos y biológicos tienen un gran potencial para el diseño de nanomedicamentos. Se diseñó una plataforma terapéutica que imita el mecanismo de las células efectoras inmunitarias consistente en reticular los receptores de superficie de las células blanco e inducir la apoptosis. Esta plataforma se probó en linfomas de linfocitos B con alta expresión del antígeno de superficie CD20. Se sintetizaron dos nanoconjugados: (1) un fragmento Fab' anti-CD20 unido de forma covalente a un oligonucleótido morfolino de hebra simple (MORF1); y (2) un polímero lineal de W-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA) injertado con múltiples copias del oligonucleótido complementario MORF2. Los dos conjugados se autoensamblaron mediante la hibridación entre MORF1 y MORF2 en la superficie de los linfocitos B malignos CD20+, lo que reticuló los antígenos CD20 e inició la apoptosis. Cuando se ensayaron con un modelo murino de linfoma no Hodgkin humano, ambos conjugados (fueran administrados de forma consecutiva o como una premezcla) erradicaron las células cancerosas y produjeron supervivientes a largo plazo. El experimento descrito demuestra que los métodos divulgados, así como las composiciones y los complejos divulgados, no contenían compuestos citotóxicos de moléculas pequeñas y eran inmunoindependientes.
El biorreconocimiento molecular es una característica fundamental de la vida: muchos procesos biológicos se rigen por las interacciones complejas pero específicas entre macromoléculas ( p.ej., la unión anticuerpo-antígeno y el apareamiento entre bases de ADN). Estos motivos de reconocimiento de alta fidelidad de la naturaleza pueden emplearse para diseñar nanobiomateriales autoensamblantes con aplicaciones en la administración de fármacos (Douglas et al., 2012; Mulvey et al., 2013; Lu et al., 1999), ingeniería de tejidos (Gungormus et al., 2010; Holmes et al., 2000), biodetección (Yuan et al., 2008; Ehrick et al. 2005; Liu et al., 2006), etc. Una nueva línea de investigación explora el uso de estos materiales “inteligentes” precisamente definidos para incitar o controlar las actividades celulares (Wu et al., 2010; Cho et al., 2012; Kopecek et al., 2012). Como se describió en la presente, el uso de los materiales por sí solos, sin ningún fármaco convencional, logró un efecto terapéutico.
El linfoma no Hodgkin (LNH) es un tipo de cáncer con alta prevalencia a nivel mundial con una alta tasa de mortalidad(Siegel et al., 2013). La quimioterapia y la radioterapia convencionales están asociadas con reacciones adversas considerables, particularmente citopenias, que aumentan el riesgo de infección y la necesidad de transfusiones. Dado que la mayoría de los LNH tienen su origen en linfocitos B, las inmunoterapias que emplean anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos al antígeno de superficie CD20 de los linfocitos B se han convertido en tratamientos habituales (Cheson et al., 2008). Sin embargo, existen grandes poblaciones de pacientes que no responden a las inmunoterapias, particularmente en caso de recidivas. Por ejemplo, el rituximab, el mAb anti-CD20 más común, tiene una tasa de respuesta general menor del 50 % en frente al LNH recidivante/resistente (Molina et al., 2008). Esto se atribuye principalmente a la inactividad de las células efectoras inmunitarias a la hora de hiperreticular los mAb ligados (Cartron et al., 2002; Smith et al., 2003). Además, los tratamientos con mAb tienen efectos secundarios poco frecuentes pero letales como la leucoencefalopatía multifocal progresiva (Allison 2010) y lesiones pulmonares (Lands 2010; Kamei et al., 2010), que se deben a eventos de células efectoras mediados por el receptor Fc (p. ej., la activación del complemento) (van der Kolk, et al., 2001).
Se diseñó una plataforma de material biomimético compuesta por nanoconjugados híbridos autoensamblantes (FIG.
9) como sistema terapéutico contra los linfomas de linfocitos B (FIG. 1). La plataforma comprende un fragmento Fab' de anticuerpo anti-CD20, un par de oligómeros de morfolino fosforodiamidato complementarios (MORF1 y MORF2), y un polímero lineal (P) de W-(2-hidroxipropil)metilacrilamida (HPMA). Los experimentos que se describen en la presente demuestran que (1) la exposición de linfocitos B malignos CD20+ al conjugado de Fab' anti-CD20 y MORF1 (complejo Fab'-MORF1) decoró la superficie de las células con MORF1; y (2) el tratamiento ulterior de los linfocitos B decorados con copolímero de HPMA injertado con múltiples copias de MORF2 (complejo P-MORF2) produjo la hibridación entre MORF1 y MORF2 en la superficie celular con reticulación concomitante de los receptores CD20, que desencadenó la apoptosis (FIG. 1). Específicamente, la FIG. 1 muestra la inducción de la apoptosis en linfocitos B mediante la reticulación de los antígenos CD20 mediada por la hibridación extracelular de oligonucleótidos de morfolino complementarios (MORF1-MORF2). Específicamente, la FIG. 9 muestra un concepto de diseño general de la plataforma terapéutica. Dos nanoconjugados que se autoensamblan por biorreconocimiento pueden administrarse consecutivamente como dosis de predireccionamiento y reticulación, o bien mezclarse previamente para formar un constructo multivalente y emplearse en una única dosis.
Cuando los anticuerpos unidos a los antígenos CD20 son hiperreticulados por células efectoras inmunitarias que expresan el receptor Fc (FcR) (p. ej., macrófagos o células NK), se produce un agrupamiento de los antígenos CD20 dentro de balsas lipídicas, lo que induce la apoptosis (Deans et al., 2002). Ninguno de los componentes del sistema divulgado (p. ej., el fragmento Fab', el oligómero de morfolino y el polímero de HPMA) tuvo un efecto farmacológico usado de forma individual. La inducción de la apoptosis fue directa (es decir, independiente de la función inmune) y específica (es decir, dirigida a los antígenos CD20). De este modo, se evitaron los efectos secundarios y problemas asociados con la inmunoterapia, la quimioterapia y la radioterapia usadas actualmente.
El sistema divulgado se basa en un par de oligonucleótidos de morfolino (MORF) con secuencias complementarias. Los oligonucleótidos MORF forman hélices dobles por apareamiento de bases de Watson y Crick (hibridación) y sirven como reticulantes físicos. Los oligonucleótidos MORf tiene una cadena principal de fosforodiamidato con carga neutra, lo que resulta en una afinidad de unión mucho mayor que en el caso del ADN o el ARN (Nielsen 1995). Los oligonucleótidos MORF son biocompatibles y resistentes a las nucleasas, lo que garantiza la estabilidad y seguridad in vivo (Summerton et al., 1997). Gracias a estas ventajas, los oligonucleótidos MORF se han usado exitosamente como ligantes macromoleculares para mejorar la administración terapéutica (Mulvey et al., 2013; Liu et al., 2004; Mang'era et al., 2001). Los copolímeros de HPMA descritos en la presente son solubles en agua y tienen un tiempo de circulación prolongado en el torrente sanguíneo. Los copolímeros divulgados tienen perfiles de seguridad bien definidos y se usan extensamente como portadores terapéuticos (Kopecek et al., 2010). En soluciones acuosas, los copolímeros lineales de HPMA tienen una conformación de hélice aleatoria y son capaces de presentar efectivamente fracciones de direccionamiento injertadas a las cadenas secundarias (Ulbrich et al., 2010).
En los experimentos que se describen en la presente, se abordó el desarrollo y la evaluación preclínica de las composiciones y los complejos antilinfoma (nanomedicamentos) propuestos. Se caracterizó el biorreconocimiento de ambos nanoconjugados (Fab'-MORF1 y P-MORF2). El sistema terapéutico se optimizó para lograr una inducción eficiente de la apoptosis en líneas celulares de linfocitos B malignos. Se demostró una excelente eficacia anticancerígena (100 % de supervivencia sin tumores residuales) en un modelo murino de LNH humano.
Para verificar el concepto de la terapia macromolecular sin fármacos mediada por la hibridación, se seleccionó el antígeno CD20 como blanco farmacológico. El CD20 es un receptor no internalizante que se expresa en la mayoría de los linfocitos B malignos de LNH, así como en linfocitos B normales (Stashenko et al., 1980). Sin embargo, el CD20 no se expresa en células plasmáticas (linfocitos B efectores) ni en células madre. Por consiguiente, la inmunidad humoral de los pacientes no se ve afectada considerablemente y pueden restablecerse números normales de linfocitos B luego del tratamiento (Anderson et al., 1984; Kimby et al., 2005).3 Aquí, se empleó un fragmento Fab' anti-CD20 en el sistema terapéutico, que usó el LNH como modelo de enfermedad para demostrar el primer ejemplo del sistema divulgado.
(1) Diseño de MORF1 y MORF2
Los oligómeros MORF usados tenían 25 bp y aproximadamente 8,5 kDa (FIG. 10A, FIG. 10C y FIG. 2). Sus extremos 3' se modificaron con una amina primaria usada para la conjugación El contenido de A/T/C/G se seleccionó de manera de lograr una eficacia y una especificidad óptimas (GC = 35-65 %), mantener una buena solubilidad acuosa (G < 36 % [Summerton, et al., 1997]) y lograr una farmacocinética favorable (cantidad de C menor de 7 para evitar una captación renal rápida [Liu et al., 2004]). Luego de determinar la composición de bases, las secuencias se generaron con un software permutador de manera de minimizar la unión no específica con ARNm humano y murino, y se optimizaron también para evitar la autocomplementariedad.
(2) Síntesis y caracterización de Fab'-MORF1 y P-MORF2
Para preparar el conjugado Fab'-MORF1 (FIG. 10A), el fragmento Fab' de un mAb IgG2a murino anti-CD20 humano (1F5) (Press et al., 1987) se enlazó al extremo 3' del MORF1 mediante un enlace tioéter. En la FIG. 10A, * indica el ligador heterobifuncional SMCC o succinimidil-4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato. Los conjugados se marcaron opcionalmente con rodamina (RHO) para la obtención de imágenes. La síntesis exitosa del complejo Fab'-MORFI se confirmó mediante HPLC (FIG. 10B), realizada en una columna Agilent Zorbax 300SB-C18 (4.6 x 250 mm) eluida con un gradiente de buffer A (H2O ácido trifluoroacético al 0,1 %v/v) y buffer B (acetonitrilo ácido trifluoroacético al 0,1 %v/v), y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (FIG. 17A), realizada en una columna Sephacryl S-100 HR16/60 eluida con PBS. La reacción de acoplamiento siguió una proporción estequiométrica de 1:1 de acuerdo con la espectrometría de masas MALDI-ToF (FIG. 17B) y espectroscopia UV-visible (FIGS. 17C a 17E). El peso molecular del complejo Fab'-MORF1 fue de aproximadamente 57,5 kDa. En la FIG. 17, el perfil del complejo Fab'-MORF1 demostró el proceso de purificación mediante ÁKTA FPLC: el primer pico (eluido a 53 mL) representó el conjugado (obtenido durante la purificación); el segundo pico (eluido a 70 mL) indicó el MORF1 no conjugado (eliminado). El complejo Fab'-MORF1 se caracterizó por un volumen de elución anterior que el Fab'-SH (56 mL). En la FIG. 17B, la fracción principal muestra que el peso molecular fue de aproximadamente 57,5 kDa (Fab': ~48,8 kDa, MORF1: ~8,6 kDa); se observó una pequeña fracción de Fab' no conjugado. También se muestran el espectro UV-visible del conjugado Fab'-MORF1 purificado (FIG. 17C), del MORF1 no conjugado (FIG. 17D) y del fragmento Fab' (FIG. 17E). Las concentraciones de todos los componentes fueron 2,5 pM. El conjugado Fab'-MORF1 se caracteriza por una combinación de absorbancia a 260 nm (contribuida por MORF1) y a 280 nm (contribuida por Fab').
Para preparar los conjugados multivalentes P-MORF2 (FIG. 10C), se sintetizaron copolímeros de HPMA que contenían cadenas secundarias de glicilglicina (GG; separador) terminadas con grupos (aminorreactivos) tiazolidina-2-tiona (TT). En la FIG. 10C, MA-GG-TT indica N-metacriloilglicilglicina-tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT). Estos precursores poliméricos (P-TT) se sintetizaron mediante polimerización por reacción reversible de adiciónfragmentación con transferencia de cadena (RAFT). Un derivado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) polimerizable se agregó opcionalmente para la obtención de imágenes. Mediante polimerización RAFT, se sintetizaron de forma reproducible cadenas poliméricas principales con una distribución estrecha de pesos moleculares (índice de polidispersión medido por SEC < 1,15). Además, los oligómeros MORF2 derivatizados con amina (MORF2-NH2) se injertaron mediante enlaces amídicos estables a las cadenas secundarias de los copolímeros de HPMA para producir P-MORF2 multivalente. Los conjugados se purificaron y caracterizaron por SEC (FIG. 10D). La FIG. 10D muestra un análisis por SEC de precursores P-TT y conjugados P-MORF2 representativos (valencia = 3) usando una columna Superose 6 HR10/30 (buffer de acetato acetonitrilo al 30 %v/v). Se sintetizaron tres conjugados P-MORF2 diferentes con diferentes pesos moleculares de la cadena principal y diferentes valencias (cantidad de MORF2 por cadena polimérica) (FIGS. 18A a 18E). Los pesos moleculares promedio por número (Mn) de estos conjugados se variaban entre 70 y 136 kDa. Las valencias de los tres preparados de P-MORF2 fueron 2, 3 y 10, respectivamente.
La FIG. 18 muestra el espectro UV-visible del conjugado P-MORF2 purificado por SEC (1 mg/mL [FIG. 18A]), del MORF2 no conjugado (2,5 pM [FIG. 18B]) y de los polímeros de Hp Ma (P) (1 mg/mL [F iG. 18C]). Los conjugados multivalentes P-MORF2 se caracterizaron mediante su absorbancia UV a 260 nm (contribuida por MORF2). La FIG.
18D provee una tabla que resume las propiedades fisicoquímicas de diferentes conjugados P-MORF2 y sus precursores poliméricos (P-TT) que se sintetizaron y usaron en los experimentos aquí descritos. El peso molecular promedio por número (Mn) y la polidispersión (Pd) se determinaron por SEC. La cantidad de grupos tiazolidina-2-tiona (TT) por cadena polimérica (TT/P) se determinó mediante la absorbancia UV a 305 nm; la cantidad de FITC por cadena (FITC/P) de determinó mediante la absorbancia a 495 nm; la cantidad de oligómeros MORF2 por cadena (MORF2/P) se determinó mediante la absorbancia UV a 260 nm. La FIG. 18E muestran un análisis por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) del conjugado P-MORF2 n.° 3 y su precursor polimérico P-TT mediante ÁKTA FPLC con una columna Superose 6 HR10/30 (buffer de acetato con pH 6,5 acetonitrilo al 30 %v/v). El límite de retención de esta columna es de aproximadamente 7 mL.
(3) Hibridación i n v i t r o entre Fab '-MORF1 y P-MORF2
La hibridación de los dos conjugados mediante el biorreconocimiento entre MORF1 y MORF2 se evaluó, en primer lugar, mediante espectroscopia UV-visible. Los dos conjugados se mezclaron en diferentes proporciones y se midió la densidad óptica (OD) a 260 nm (contribuida por las bases). Al mezclar los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2, se observó un “efecto hipocrómico” (FIG. 11A); la OD a 260 nm alcanzó un mínimo cuando se usó un cociente molar de 1:1 (MORF1:MORF2). Dicha disminución se debió a los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, que limitaron la resonancia de los anillos aromáticos. Con el mismo método, se midió la hibridación de los morfolinos MORF1 y MORF2 libres no conjugados, y se observó la misma hipocromía (FIG. 19). En la FIG. 19, la densidad óptica (DO) a 260 nm disminuyó cuando los dos MORF (en PBS, pH = 7,4) se mezclaron (en diferentes %). Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3). Estos resultados indicaron que la función de la hibridación entre MORF1 y MORF2 se preservaba luego de la conjugación con Fab' o polímeros.
Además, la unión de Fab'-MORFI y P-MORF2 se caracterizó mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (FIG. 11B, FIG. 20). Como se muestra en la FIG. 11B, se observó un aumento considerable y rápido del tamaño hidrodinámico tras mezclar los dos conjugados (con MORF1 y MORF2 en la misma molaridad). La rapidez con que se alcanza un diámetro estable (~40 nm) refleja una cinética de unión rápida (< 10 min) de la hibridación entre MORF1 y MORF2 de los conjugados. Esta característica es favorable para el diseño de terapias macromoleculares sin fármacos. En la FIG.
11B, la valencia de P-MORF2 fue 3. Las estadísticas, a menos que se indique lo contrario, se obtuvieron comparando la mezcla con el conjugado P-MORF2 (*: p < 0,05; **: p < 0,005; n.s.: diferencia no significativa). En la FIG. 20, todos los componentes se disolvieron en PBS (pH = 7,4) y se midieron en línea con un patrón de tamaño de poliestireno Nanosphere™ con un diámetro de 102 ± 3 nm (STD100nm). Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3).
Se usó espectroscopia de dicroísmo circular (CD) para determinar la temperatura de desnaturalización (Tm) del complejo Fab'-MORF1/P-MORF2 en condiciones fisiológicas (PBS, pH = 7,4) (FIG. 11C). En primer lugar, se obtuvo un perfil óptico pronunciado (máximo a 260 nm, mínimo a 210 nm) indicativo de hélices doble tipo A (Johnson et al., 2000) al mezclar ambos conjugados; se observó un perfil de CD similar al mezclar MORF1 y MORF2 no conjugados (FIGS. 21A a 21D).
Por ejemplo, la FIG. 21 muestra el espectro de CD de MORF libres no conjugados, de los conjugados y de sus mezclas para el análisis de hibridación. Todos los componentes se disolvieron en PBS (pH 7,4) hasta una concentración equivalente de MORF de 50 pM. El eje y muestra la elipticidad molar (0). La FIG. 21A muestra MORF1 y MORF2 libres, junto con una mezcla equimolar de ambos. En la mezcla, el perfil óptico (máximos a 260 nm, mínimos a 210 nm) indica que se obtuvieron hélices dobles tipo A. La FIG. 21B muestra una comparación entre el conjugado P-MORF2 (valencia = 3) y el MORF2 libre. Se observó un espectro idéntico. La FIG. 21C muestra una comparación entre el conjugado Fab'-MORF1, el fragmento Fab' libre y el MORF1 libre. El conjugado parece tener la suma de los perfiles ópticos del Fab' y el MORF1. La FIG. 21D muestra que la mezcla del conjugado P-MORF2 con MORF1 libre o con conjugado Fab'-MORF1 (con igual molaridad de MORF1 y MORF2) desplazó el espectro de CD del correspondiente al MORF2 de simple hebra a uno indicativo de una hebra doble tipo A. Dicho desplazamiento espectral indica que la función de la hibridación entre MORF1 y MORF2 se preserva luego de la conjugación con Fab' o polímeros.
En segundo lugar, se realizó un estudio de desnaturalización térmica para analizar la mezcla de los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2. Los datos mostraron que la firma de CD anterior desaparecía a 95 °C, en tanto que la banda positiva a 260 nm sufría un desplazamiento batocrómico considerable que producía un pico centrado en torno de 275 nm (FIG. 22A-FIG. 22B, FIG. 23A-FIG. 23C). La curva de desnaturalización térmica que se muestra en la FIG.
11C muestra que la señal a 260 nm disminuyó de forma sigmoidea al aumentar la temperatura. Los resultados de una regresión no linean indicaron un valor de Tm de aproximadamente 57 a 62 °C. Este valor de Tm se encuentra bastante por encima de la temperatura corporal, lo que indica la estabilidad in vivo de la unión. En la FIG. 11C, la temperatura de desnaturalización (Tm) se obtuvo ajustando los datos a una función logística mediante regresión no lineal (software GraphPad Prism 5). Todos los experimentos se realizaron en condiciones fisiológicas (PBS, pH = 7,4). Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3).
La FIG. 22A y la FIG. 22B muestran un análisis de la temperatura de desnaturalización (Tm) de la hibridación Fab'-MORF1/P-MORF2 mediante espectroscopia de dicroísmo circular. La FIG. 22A muestra un espectro de CD de la mezcla de Fab'-MORF1 (concentración equivalente de MORF1 5 pM) y P-MORF2/v3 (concentración equivalente de MORF25 pM; valencia = 3) en PBS (pH 7,4) a diferentes temperaturas. Cuando la temperatura aumentó de 25 °C a 60 °C y a 95 °C, la banda positiva a 260 nm sufrió un desplazamiento batocrómico que produjo un pico centrado en torno de 275 nm. La elipticidad molar (0) a 260 nm se usó en los siguiente estudios de desnaturalización térmica. La FIG.22B muestra una curva de CD de desnaturalización térmica de la hibridación entre los conjugados Fab'-MORF1/P-MORF2. Se observó una disminución sigmoidea de 0 a 260 nm ante un aumento de la temperatura. Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3). Estos datos se ajustaron a una función logística para obtener Tm; los resultados de una regresión no lineal indicaron un valor de Tm en el rango 60-62 °C. El análisis con barrido ascendente (aumentar la temperatura) que se muestra aquí dio resultados similares al barrido inverso (disminuir la temperatura; véase la FIG. 11C).
La FIG. 23 muestra un análisis de la temperatura de desnaturalización (Tm) de la hibridación MORF1/MORF2 mediante espectroscopia de dicroísmo circular. Por ejemplo, la FIG. 23A muestra un espectro de CD de la mezcla de MORF1 (5 pM) y MORF2 (5 pM) en PBS (pH 7,4) a diferentes temperaturas. Cuando la temperatura aumentó de 25 °C a 60 °C y a 95 °C, la banda positiva a 260 nm sufrió un desplazamiento batocrómico que produjo un pico centrado en torno de 275 nm. La elipticidad molar (0) a 260 nm se usó en los siguiente estudios de desnaturalización térmica. La FIG. 23B muestra una curva de CD de desnaturalización térmica de la hibridación entre MORF1/MORF2 en la que los datos se obtuvieron a medida que se aumentaba la temperatura (barrido ascendente). La FIG. 23C muestra una curva de CD de desnaturalización térmica de la hibridación entre MORF1/MORF2 en la que los datos se obtuvieron a medida que se disminuía la temperatura (barrido descendente). El perfil que muestra un cambio sigmoideo de 0 a 260 nm fue idéntico en los barridos ascendente y descendente. Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3). Los resultados de una regresión no lineal mediante una función logística indicaron un valor de Tm en el rango 57-61 °C.
(4) Biorreconocimiento de los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2 en la superficie de linfocitos B
Se usó la línea celular Raji de linterna de linfocitos B humano (CD20+) (Stashenko et al., 1980; Shan et al., 1998) para estudiar el biorreconocimiento de los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2 (valencia = 2) en la superficie celular. Este estudio se realizó mediante microscopia de fluorescencia confocal. En primer lugar, la exposición de células Raji al conjugado Fab'-MORF1 marcado con rodamina resultó en la decoración de la superficie celular con señal roja (RHO) debido a la unión de Fab'-MORF1 al CD20; las células expuestas únicamente al conjugado P-MORF2 marcado con FITC no mostraron ninguna seña fluorescente (FIG. 12A, Fab'-MORFI 0,4 pM o P-MORF2 0,4 pM [conc. equivalente de MORF2]). En segundo lugar, cuando células Raji se expusieron a ambos conjugados marcados fluorescentemente (Fab'-MORFI y P-MORF2), fuera consecutivamente (con 1 hora de diferencia) o premezclados (mezcla de Fab'-MORFI [0,4 pM] y P-MORF2 [0,4 pM, conc. equivalente de MORF2]), la señal roja y la verde (FITC) se colocalizaron en la superficie de los linfocitos B (FIG. 12B). Esta observación indicó una hibridación exitosa entre MORF1 y MORF2 en la superficie celular. La FIG. 12C muestra las imágenes de microscopia obtenidas de dos grupos de control: (1) células expuestas a la premezcla de Fab'-MORF1(-RHO) y un copolímero de HPMA con colorante FITC pero sin MORF2 (P-FITC, en exceso); (2) un control de “prebloqueo” que se obtuvo exponiendo las células consecutivamente a Fab'-MORF1 (0,5 pM) (-r HO) seguido por P-Mo RF2(-FITC) con un exceso de MORF1 no conjugado (esto produjo copolímeros de HPMA injertados con MORF de hebra doble, P-dsMORF). Ambos tratamientos de control mostraron únicamente la señal roja en la superficie celular (FIG. 12C) debido a la ausencia de un par de biorreconocimiento. Los resultados de estos controles confirmaron que el biorreconocimiento de Fab'-MORF1 y P-MORF2 en la superficie celular estaba efectivamente mediada por la hibridación entre MORF1 y MORF2.
(5) Inducción de la apoptosis en linfocitos B humanos de LNH
La inducción de la apoptosis en líneas celulares de linfocitos B humanos (Raji y DG75) se evaluó mediante tres métodos: determinación de activación de la caspasa-3; determinación de unión de anexina V/ioduro de propidio (PI); y determinación de marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). En estos experimentos, se usaron mAb anti-CD201F5 hiperreticulado con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (2.° Ab) como control positivo para imitar la función de las células efectoras inmunitarias FcR+ (Shan et al., 1998). Este control reflejó parcialmente la eficacia terapéutica de los mAb anti-CD20. Los resultados muestran que el cotratamiento con Fab'-MORF1 y P-MORF2, sea consecutivo o como premezcla, indujo de forma efectiva la apoptosis de los linfocitos B Raji (FIG. 13). En contraste, los tratamientos de un único componente con Fab'-MORF1 o P-MORF2 por separado no lograron iniciar la apoptosis. Una serie de experimentos de control (FIG.
24) validaron la hipótesis de que la hibridación entre MORF1 y MORF2 con reticulación concomitante de los antígenos CD20 es responsable por la inducción de la apoptosis. Las células Raji se expusieron a: (1) una mezcla de Fab'-MORF1 y el precursor polimérico P-TT; (2) una mezcla de Fab' y P-MORF2; (3) conjugados “prebloqueados” en los que los sitios de unión de MORF1 o MORF2 se bloquearon con un exceso de MORF complementarios no conjugados antes del tratamiento. Ninguno de estos tratamientos indujo la apoptosis debido a la ausencia de la hibridación entre MORF1 y MORF2 (FIG. 24A). Además, se evaluó la apoptosis en una línea celular de linfocitos B (DG75) usada como control negativo ya que no expresa el antígeno CD20 o lo expresa en un nivel muy bajo (Ben-Bassat et al., 1977). Los niveles de apoptosis luego del cotratamiento con dos nanoconjugados fue muy bajo y similar al de las células no tratadas (FIG. 24B). Este resultado indicó que la unión con el antígeno CD20 es un evento necesario para la inducción de la apoptosis.
Por ejemplo, la FIG. 24 muestra estudios de control de la apoptosis in vitro mediante una determinación de unión de anexina V/yoduro de propidio. La FIG. 24A muestra la inducción de la apoptosis en linfocitos B Raji (altos niveles de expresión de CD20). El tiempo de incubación fue de 48 h. La FIG. 24b muestra la inducción de la apoptosis en linfocitos B DG75 (expresión de CD20 muy baja o nula). El tiempo de incubación fue el que se indica en cada caso. Se aplican las siguientes indicaciones a la FIG. 24A y a la FIG. 24B: No tratadas: células en medio de cultivo; mAb 2.° Ab: mAb 1F5 (0,5 pM) seguido (1 h después) por Ab secundario de cabra anti-ratón (0,25 pM); Fab'-MORF1: componente único 0,5 pM; P-MORF2: componente único P-MORF2/v3 0,5 pM (conc. equivalente de MORF2); Consecutivo: Fab'-MORF1 (0,5 pM) seguido (1 h después) por P-MORF2/v3 (conc. equivalente de MORF2 0,5 pM); Premezcla: premezcla de Fab'-MORF1 (0,5 pM) y P-Mo r F2/v3 (conc. equivalente de MORF20,5 pM); Fab'-MORF1 P-TT: premezcla de Fab'-MORF1 (0,5 pM) y el precursor polimérico P-TT n.° 2 (1 mg/mL); Fab'-SH P-MORF2: premezcla de Fab' libre (0,5 pM) y P-m Or F2 (conc. equivalente de MORF2 0,5 pM); Fab'-MORF1 P-dsMORF: tratamiento consecutivo (intervalo de 1 h) de Fab'-MORF1 (0,5 pM) y P-MORF2 “prebloqueado” (~1 mg/mL) en el que los sitios de unión de MORF2 se bloquearon con exceso de MORF1 libre (1 h antes del tratamiento); Fab'-dsMORF P-MORF2: tratamiento consecutivo (intervalo de 1 h) de Fab'-MORF1 “prebloqueado” (0,5 pM) en el que los sitios de unión de MORF1 se bloquearon con exceso de MORF2 libre (1 h antes del tratamiento) y P-MORF2 (conc. equivalente de MORF2 0,5 pM). El porcentaje de células apoptóticas se cuantificó mediante citometría de flujo. Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3).
(6) Optimización de la inducción de la apoptosis
Para optimizar el sistema terapéutico divulgado, se examinaron varios factores y su impacto sobre la apoptosis de linfocitos B Raji, incluidos la concentración de los conjugados, la proporción entre ellos, la valencia del conjugado P MORF2 y el tiempo de exposición. En primer lugar, se usó un P-MORF2 que contenía aproximadamente 3 oligómeros por cadena polimérica (P-MORF2/v3). Los resultados de la tinción con anexina V/yoduro de propidio indicaron que el uso de Fab'-MORFI 1 pM y una concentración equimolar de P-MORF2/v3 (MORF1:m Or F2 = 1:1) indujo aproximadamente 40 % de células apoptóticas (más de 4 veces más que en el caso de las células no tratadas) (FIG.
13A). En la FIG. 13A, se aplican las siguientes indicaciones: No tratadas: células en medio de cultivo; mAb 2.° Ab: mAb 1F5 (1 pM) seguido (1 h después) por Ab secundario de cabra anti-ratón (0,5 pM); Fab'-MORFI: componente único 1 pM; P-MORF2: componente único P-MORF2/v3 1 pM (conc. equivalente de MORF2); Consecutivo: Fab'-MORF1 (1 pM) seguido (1 h después) por P-MORF2/v3 (1 pM); Premezclados: premezcla de Fab'-MORF1 (1 pM) y P-MORF2/v3 (1 pM). Las estadísticas, a menos que se indique lo contrario, se obtuvieron comparando cada grupo con el grupo de células no tratadas (***: p < 0,0001; n.s.: diferencia no significativa).
Cuando todas las condiciones se mantuvieron idénticas excepto por la diferencia en la concentración de Fab'-MORF1 (y la concentración correspondiente de P-MORF2/v3), se observó una inducción de la apoptosis dependiente de la concentración (FIG. 13B). En la FIG. 13B, se aplican las siguientes indicaciones: **: p < 0,005; n.s.: diferencia no significativa. Los datos indicaron que aumentar las concentraciones de los conjugados de 0,5 pM a 2 y 5 pM (conc. equivalente de Fab') resultó en niveles mayores de apoptosis. La tendencia dependiente de la dosis se observó tanto en el régimen de tratamiento consecutivo como en el de tratamiento con premezcla y en el control de positivo (mAb 2° Ab). En la máxima concentración probada (5 pM), la inducción de la apoptosis por el tratamiento macromolecular sin fármacos (Fab'-MORF1 P-MORF2/v3) alcanzó un nivel aproximadamente 7 veces mayor que en los controles no tratados. Además, el porcentaje de células apoptóticas inducido por el uso de mAb 2.° Ab parecía saturarse cuando la concentración de mAb 1F5 aumentó de 2 a 5 pM, pero dicha saturación no se observó en los grupos de tratamiento que recibieron las composiciones y los complejos de la divulgación. Esta diferencia probablemente se debió a que P-MORF2 tiene interacciones multiméricas con los blancos, en contraste con los mAb, que solo tienen dos sitios de unión.
Además, se examinó la influencia de la valencia del conjugado P-MORF2 y del cociente entre Fab'-MORF1 y P-MORF2 sobre la inducción de la apoptosis en linfocitos B Raji. Un conjugado P-MORF2 de “alta valencia”que contenía 10 oligómeros por cadena (P-MORF2/v10) se comparó con un conjugado P-MORF2/v3 (3 oligómeros por cadena). Los resultados mostraron que, cuando todas las demás condiciones de tratamiento eran idénticas (Fab' 0,5 pM, MORF1:MORF2 = 1:1 o 1:10), el conjugado P-MORF2/v10 indujo niveles de apoptosis aproximadamente 2 veces mayores que el conjugado P-MORF2/v3 (FIG. 13C). El tratamiento consecutivo con Fab'-MORF1 y P-MORF2/v10 indujo la apoptosis de forma más efectiva que el control positivo (tratamiento consecutivo con mAb y 2.° Ab, es decir, mAb 1F5 [0,5 pM] seguido por anticuerpo secundario de cabra anti-ratón [0,25 pM]). El mayor nivel de inducción de la apoptosis observado se debió a la multivalencia del conjugado P-MORF2/v10, que resultó en una mayor avidez por los linfocitos B, así como un agrupamiento más efectivo de los antígenos CD20 (Johnson et al., 2009, 2012; Chu et al., 2012). Cuando las células Raji se expusieron a la misma concentración de Fab'-MORF1 (0,5 pM) pero con un exceso de 10 veces de P-MORF2 (MORF1:MORF2 = 1:10), los niveles apoptóticos no fueron considerablemente mayores que en el caso del tratamiento con MORF1 y MORF2 en concentraciones equimolares (FIG. 13C). Las estadísticas, a menos que se indique lo contrario, se obtuvieron comparando cada grupo de “alta valencia” con el correspondiente grupo de “baja valencia” (**: p < 0,005, n.s.: diferencia no significativa). Todos los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3). Los sitios de unión MORF1 en la superficie de las células decoradas con Fab'-MORF1 se encontraban saturados, lo que indica una buena accesibilidad de los MORF en la cadena polimérica para su hibridación (el efecto de impedimento estérico causado por la cadena polimérica es mínimo). Las mismas tendencias de inducción de la apoptosis se observaron con diferentes tiempos de exposición y con diferentes determinaciones de apoptosis (FIG. 25A-FIG. 25B).
La FIG. 25 muestra la apoptosis de linfocitos B Raji analizada mediante distintas determinaciones y con distintos tiempos de incubación. La FIG. 25A muestra una determinación de activación de la caspasa-3. La FIG. 25B muestra una determinación TUNEL. El tiempo de incubación fue el que se indica en cada caso. Las siguientes indicaciones se aplican a ambas figuras. No tratadas: células en medio de cultivo; mAb 2.° Ab: mAb 1F5 (0,5 pM) seguido (1 h después) por Ab secundario de cabra anti-ratón (0,25 pM); Fab'-MORF1: componente único 5 pM; P-MORF2: componente único P-MORF2/v3 0,5 pM (conc. equivalente de MORF2); Consecutivo (1:1): Fab'-MORF1 (0,5 pM) seguido (1 h más tarde) por P-MORF2/v3 (conc. equivalente de MORF2 0,5 pM); Consecutivo (1:10): Fab'-MoRF1 (0,5 pM) seguido (1 h más tarde) por P-Mo Rf2/v3 (conc. equivalente de MORF25 pM); Premezclado (1:1): premezcla de Fab'-MORF1 (0,5 pM) y P-m Or F2/v3 (conc. equivalente de MORF2 0,5 pM); Premezclado (1:10): premezcla de Fab'-MORF1 (0,5 pM) y P-MORF2/v3 (conc. equivalente de MORF2 5 pM). El porcentaje de células apoptóticas se cuantificó mediante citometría de flujo. Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 3). Los niveles de apoptosis de células Raji obtenidas mediante tratamientos con equimolaridad entre MORF1 y MORF2 (1:1) fueron similares que los obtenidos con un exceso de 10 veces de P-MORF2 (1:10). Esto indicó la saturación de los sitios de unión de MORF1 en la superficie de las células decoradas con Fab'-MORF1.
(7) Evaluación preclínica en un modelo murino de LNH humano
La eficacia terapéutica de la terapia sin fármacos mediada por la hibridación se evaluó en ratones SCID (C.B-17) son linfocitos B Raji diseminados sistémicamente. Este modelo animal tiene una tasa de implantación del tumor de casi 100 % (Ghetie et al., 1990) y el tiempo de supervivencia sin parálisis de las extremidades posteriores refleja con precisión la eficacia anticancerígena (Ghetie et al., 1992; Griffiths et al., 2003). Cuatro millones de linfocitos B Raji se inyectaron a través de la vena de la cola el día 0 y la incidencia de la parálisis de las extremidades posteriores o la supervivencia de los ratones se supervisó hasta el día 125. Los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2/v10 se inyectaron a través de la vena de la cola, sea consecutivamente o premezclados. Los ratones, divididos en diferentes grupos (n =6-7), recibieron una o tres dosis del tratamiento que comprendía las composiciones y los complejos divulgados, comenzando 24 h después de la inyección del tumor. El tratamiento con una dosis se administró el día 1; el tratamiento con tres dosis se administró los días 1, 3 y 5. La curva de supervivencia de los animales se muestra en la FIG. 14. Los ratones tratados con PBS (n = 8), usados como control negativo, desarrollaron parálisis de las extremidades posteriores 17 a 35 días después de la inyección de células cancerosas; el tiempo medio de supervivencia fue de 24 días. Esta observación mostró coincidencia con lo informado en la literatura (Griffiths et al., 2003; Wu et al., 2012). Una única administración del tratamiento consecutivo (Cons *1; MORF1:Mo RF2 = 1:1) prolongó considerablemente la supervivencia de los animales (mediana del tiempo de supervivencia: 81 días). Una única dosis premezclada (Prem *1; MORF1:MORF2 = 1:1) mostró una eficacia similar a la del tratamiento consecutivo, con una media de supervivencia de 78 días. Cuando se administró la misma dosis de Fab'-MORF1 (57,5 |jg/20 g) pero seguida por un exceso de 5 veces de P-MORF2/v10 (MORF1:MORF2 = 1:5), la eficacia mejoró considerablemente respecto del tratamiento con MORF1/MORF2 en concentraciones equimolares. Una única administración de este tratamiento (Cons (1:5) *1) produjo una tasa de supervivencia de 67 % (4/6 supervivientes a largo plazo [125 días]). La discrepancia entre los datos in vivo e in vitro (FlG. 13C) al usar un exceso de P-MORF2 puede explicarse por la dilución de los conjugados en la sangre, que interfiere con la saturación de los sitios de unión. Para resumir, en la FIG.
14, se aplican las siguientes indicaciones: PBS: ratones inyectados con PBS (n = 8); Cons *1: tratamiento consecutivo con Fab'-MORF1 y P-MORF2/v10, 1 dosis (n = 7); Prem *1: premezcla de Fab'-MORF1 y P-MORF2/v10, 1 dosis (n = 7); Cons (1:5) *1: tratamiento consecutivo, MORF1:MORF2=1:5, 1 dosis (n = 6); Cons *3: 3 dosis de tratamiento consecutivo (n = 7); Prem *3: 3 dosis de premezcla (n = 7); 1F5 mAb *3: 3 dosis de mAb 1F5 (n = 7). La supervivencia sin parálisis de los ratones se presenta en una gráfica de Kaplan-Meier. Se indica la cantidad de supervivientes a largo plazo en cada grupo (si los hubo). Las estadísticas se realizaron con una prueba de Mantel-Cox (*: p < 0,05; ***: p < 0,0001; n.s.: diferencia no significativa).
Se observó una excelente eficacia terapéutica con los grupos de ratones que recibieron 3 dosis de tratamiento consecutivo (Cons *3; n = 7) o 3 dosis premezcladas (Prem *3; n = 7). Todos los ratones sobrevivieron hasta el fin del experimento (día 125). El grupo de control positivo (n = 7) que recibió 3 dosis equivalentes de mAb 1F5 (i.v.) tuvo una tasa de supervivencia de 86 %. La diferencia respecto de los grupos que recibieron el tratamiento de 3 dosis (es decir, que recibieron las composiciones y los complejos divulgados) no es estadísticamente significativa. Sin embargo, a diferencia de los mAb, las composiciones y los complejos divulgados son independientes de los mecanismos efectores inmunitarios como la citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Okroj et al., 2013). Estos datos indican que el sistema de inducción directa de la apoptosis que se divulga puede ser tan efectivo como la inmunoterapia a la vez que reduce las inquietudes relativas a los efectos secundarios, principalmente asociados con la ADCC y la CDC (van der Kolk et al., 2001; Okroj et al., 2013)..
( 8 ) Análisis de la eficacia anti-linfoma i n v i v o
Ratones inyectados por vía intravenosa con 4*106 linfocitos B Raji el día 0 se expusieron a los siguientes tratamientos. PBS: ratones inyectados con PBS; Cons *3: tratamiento consecutivo con Fab'-MORF1 y P-MORF2/v10 los días 1, 3 y 5; Prem *3: 3 dosis de premezcla de Fab'-MORF1 y P-MORF2/v10 los días 1, 3 y 5. La erradicación de las células Raji en ratones SCID luego del tratamiento con Fab'-MORF1 y P-MORF2 se confirmó mediante resonancia magnética, citometría de flujo e histología. Estudios de resonancia magnética realizados con contraste a base de gadolinio 4­ 5 semanas después de la inyección de las células cancerosas demostraron que los ratones de control tratados con PBS desarrollaron tumores en la sección lumbar de la columna vertebral (FlG. 15A), mientras que tres dosis de las composiciones y los complejos divulgados evitaron el desarrollo tumoral (FlG. 15B y FlG. 15C). Las FlG. 15A a 15C muestran resonancias magnéticas poscontraste en plano sagital ponderadas en T1 de la sección lumbar de la columna vertebral de ratones. Se observaron masas de apariencia heterogénea y forma irregular indicativas de nódulos tumorales (flechas rojas) de los ratones de control (PBS, n = 4, FlG. 15A), pero no en los ratones tratados (Cons *3 y Prem *3, n = 4). Los ratones sobrevivientes tratados con Cons *3 (FlG. 15B) o Prem *3 (FlG. 15C) se estudiaron nuevamente en la semana 16 y no se observó recidiva (FlGS. 26A a 26C).
La FlG. 26 muestra resonancias magnéticas poscontraste en plano sagital ponderadas en T1 de ratones inyectados con linfocitos B Raji y expuestos a diferentes tratamientos. La FlG. 26A muestra que los ratones de control tratados con PBS desarrollaron tumores en la sección lumbar de la columna vertebral, caracterizados por una apariencia heterogénea y masas de forma irregular indicativas de nódulos tumorales (flechas). Se muestra una barra en escala de grises que indica el rango de la intensidad de la señal de resonancia magnética (unidades arbitrarias). La FlG. 26B muestra imágenes de resonancia magnética de los ratones tratados con las composiciones y los complejos divulgados (Cons *3), y la FlG. 26C muestra imágenes de resonancia magnética de ratones tratados con las composiciones y los complejos divulgados (Prem *3) enfocadas en la sección lumbar de la columna vertebral. Las imágenes se tomaron el día 105 luego de la inyección de las células cancerosas; no se observaron tumores en ninguno de los ratones de los que se obtuvieron imágenes (n = 4).
Luego de sacrificar los ratones, se empleó citometría de flujo para analizar las células Raji residuales (células humanas CD10+ y CD19+) en la médula ósea femoral (FIG. 15D). Para el análisis por citometría de flujo se usaron dos anticuerpos marcados fluorescentemente: anticuerpos murinos anti-CD10 humano marcados con PE y anticuerpos murinos anti-CD19 humano marcados con APC (Wu et al., 2012; Chen et al., 2010). Los resultados indicaron que los animales paralizados (tratados con PBC) tenían cantidades considerables de células Raji en la médula ósea (obtenida del fémur), mientras que ninguno de los sobrevivientes a largo plazo en los grupos de tratamiento (Cons *3 y Prem *3) presentaban tumor (FIG. 15E). El análisis por citometría de flujo también confirmó la presencia de células Raji en la columna vertebral de los ratones paralizados (tratados con PBS) pero no en los sobrevivientes a largo plazo (FIGS.
27A a 27F), lo que era consistente con los datos de resonancia magnética. Además, la FIG. 15E muestra una comparación cuantitativa del porcentaje de células Raji (células humanas CD10+ y CD19+) en la médula ósea de los ratones de control (PBS, n = 6) y de los ratones tratados con las composiciones y los complejos divulgados (Cons *3 y Prem *3, n = 7 por grupo) de acuerdo con un análisis de citometría de flujo (FIG. 15D). Cada punto representa un ratón; se indica el porcentaje medio. Las estadísticas se analizaron con una prueba t de Student entre muestras no apareadas (*: p < 0,05).
La FIG. 27 muestra un análisis por citometría de flujo de los linfocitos B residuales en diferentes órganos/tejidos de ratones con tumores sometidos a diferentes tratamientos. La FIG. 27 muestra células aisladas de los nodos linfáticos (LN) inguinales y mesentéricos de ratones tratados con PBS (FIG. 27A), con tres dosis de tratamiento consecutivo (FIG. 27B) y con tres dosis de tratamiento con premezcla (FIG. 27C). La FIG. 27 también muestra células aisladas de la columna vertebral (SC) de ratones tratados con PBS (FIG. 27D), con tres dosis de tratamiento consecutivo (FIG. 27E) y con tres dosis de tratamiento con premezcla (FIG. 27F). Estas células se tiñeron con anticuerpos murinos anti-CD10 humano marcados con PE y con anticuerpos murinos anti-CD19 marcados con APC; el cuadrante superior derecho (CD10+ y CD19+) representa las células Raji. Los resultados indicaron que los ratones tratados con PBS paralizados (PBS) tenían células Raji tanto en los LN (n = 6) como en la SC (n = 3), mientras que los sobrevivientes a largo plazo en los grupos de tratamiento (Cons *3, Prem *3; FIG. 27B, FIG. 27C, FIG. 27E y FIG.
27F) no presentaban tumor (n = 6 por grupo).
Un examen histológico posterior reveló la diseminación de linfoma en el hígado, el pulmón y el cerebro de los ratones tratados con PBS (FIG. 16A-FIG. 16C). En cambio, no se observaron tumores en los sobrevivientes a largo plazo. No se detectó toxicidad causada por los tratamientos en ninguno de los tejidos sobre la base de exámenes histológicos y de la estabilidad del crecimiento del peso corporal en los animales tratados (FIG. 28). La FIG. 28 muestra el peso corporal de ratones inyectados con linfocitos B a través de la vena de la cola Raji y expuestos a diferentes tratamientos. El tratamiento con una dosis se administró el día 1; el tratamiento con tres dosis se administró los días 1, 3 y 5. El peso corporal se presenta en la forma media - desvío estándar. Se muestra una línea negra de trazos que indica el 80 % del promedio de los pesos corporales iniciales de todos los ratones. Estos resultados indican que las composiciones y los complejos divulgados inhibieron exitosamente el crecimiento y la diseminación de células de linfoma in vivo sin toxicidad aguda. En la FIG. 16A, ratones de control inyectados con células Raji y tratados con PBS desarrollaron tumores metastásicos en el hígado (2 ratones con tumor/4 ratones examinados), el pulmón (3/4) y el cerebro (1/4), según demuestra la invasión de células de linfoma monomórficas (asteriscos) y la disrupción de la arquitectura normal del tejido. En la FIG. 16B, tres dosis del tratamiento consecutivo con Fab'-MORF1 y P-MORF2 (Cons *3) resultaron en una ausencia de evidencia de invasión del linfoma (0/3 en todos los órganos). En la FIG. 16C, tres dosis del tratamiento premezclado (Prem *3) evitaron la diseminación del linfoma (0/3 en todos los órganos). Muestras de tejido teñidas con hematoxilina y eosina (tinción HE) fueron examinadas a ciego por un patólogo veterinario. No se observó toxicidad del tratamiento en ninguno de los órganos evaluados.
(1) Materiales y métodos relevantes
(a) MORF1 Y MORF2
Los dos oligómeros complementarios de fosforodiamidato de morfolino de 25 bp de longitud derivatizados con amina en el extremo 3' se obtuvieron de Gene Tools, LLC (Philomath, OR). MORF1: 5'-GAGTAAGCCAAGGAGAATCAATATA-ligador-amina-3' (peso molecular = 8630,5 Da); MORF2: 5'-TATATTGATTCTCCTTGGCTTACTC-ligador-amina-3' (peso molecular = 8438,5 Da). La estructura del ligador se muestra en la FIG. 2. Para el diseño de las secuencias de bases, se usó un software permutador de secuencias (http://www.sirnawizard.com/scrambled.php) y un software de análisis de secuencias (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).
(b) Preparación del conjugado Fab '-MORF1
El mAb 1F5 se preparó a partir de un subclon de hibridoma murino 1F5 (ATCC, Bethesda, MD) en un biorreactor CellMax® (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA). Los anticuerpos se recuperaron del medio de cultivo y se purificaron en una columna de proteína G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La preparación del fragmento Fab' a partir del mAb siguió el protocolo que se explica en Fowers et al., 2001. Brevemente, el mAb se digirió a F(ab')2 con pepsina al 10 %p/p (Sigma, St. Louis, MO) en buffer cítrico (pH 4,0). Inmediatamente antes de la conjugación, el F(ab')2 se redijo a Fab' con tris(2-carboxietil)fosfina 10 mM (Thermo Scientific, Waltham, MA). Para preparar el conjugado Fab'-MORF1, el oligómero MORF1 que contenía una amina primaria 3' se hizo reaccionar con succinimidil-4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) para introducir un grupo maleimida (tiol-reactive) terminal. Esto produjo MORF1 con maleimida 3' (MORF1-mal). Luego, el MORF1-mal se conjugó con el fragmento Fab' (que contenía un grupo tiol terminal) mediante un enlace tioéter para obtener un conjugado Fab'-MORFI. Los conjugados se purificaron mediante SEC para eliminar el Fab' y el MORFI libres no conjugados.
Específicamente, para preparar el conjugado Fab'-MORFI, se realizaron los siguientes pasos: en primer lugar, se hicieron reaccionar 200 nmol de MORFI-NH2 (que contenía una amina primaria 3') (Gene Tools, Philomath, OR) con 0,67 mg (2 pmol) de succinimidil-4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (Soltec Ventures, Beverly, MA) en 170 pL de DMSO para producir el MORF1-mal (que contiene una maleimida 3'). La reacción se realizó a temperatura ambiente durante 24 h. El producto se aisló por precipitación en 1,5 mL de acetona, se purificó por disolución-precipitación en agua desionizada dos veces y se secó al vacío. En segundo lugar, 200 nmol de MORF1-mal se disolvieron en 200 pL de PBS 10 mM (pH 6,5) y la solución se mezcló con 200 nmol (~10 mg) de Fab'-SH recién reducido en 2 mL de PBS (pH 6,5). La reacción se realizó a 4 °C durante 24 h. Por último, el conjugado Fab'-MORF1 se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para eliminar el Fab' y el MORF1 libres no conjugados. Se usó un sistema ÁKTA FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ) equipado con una columna Sephacryl S-100 HR16/60 (GE Healthcare) eluida con PBS (pH 7,2). Opcionalmente, el conjugado Fab'-MORF1 se marcó con un exceso molar de 5 a 10 veces de Rhodamine RedTM-X succinimidil éster (R6010) (Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA) para la obtención de imágenes. El producto se purificó con una columna de desalado PD-10 (GE Healthcare). La determinar la concentración de Fab' equivalente del conjugado Fab'-MORF1, se usó una determinación de proteínas basada en ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL). Los valores obtenidos se compararon con las concentraciones equivalentes de MORF1 obtenidas a partir de espectroscopia UV-visible (usando una absortividad de 278000 M_1 cm-1). Dicha comparación confirmó la proporción estequiométrica 1:1 de la reacción de acoplamiento.
(c) Preparación del conjugado P-MORF2
Los precursores poliméricos (P-TT y P-TT-FITC), a saber, copolímeros de W-(2-hidroxipropil)metacnlamida (HPMA), W-metacriloilglicilglicina tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT) y, opcionalmente, W-metacriloilaminopropil fluoresceína tiourea (MA-FITC), se sintetizaron mediante copolimerización RAFT. Se usó diclorhidrato de 2,2'-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] (VA-044; Wako Chemicals, Richmond, VA) como iniciador y ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico (CPDB) como agente de transferencia de cadena. Se sintetizó CPDB (Pan et al., 2011) y los monómeros HPMA (Kopecek et al., 1973), MA-GG-TT (Subr et al., 2006) y MA-FITC (Omelyaneko et al., 1998).
Los conjugados P-MORF2 multivalentes se prepararon en dos pasos. En primer lugar, los precursores poliméricos (P-TT), a saber, copolímeros de W-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA), W-metacriloilglicilglicina tiazolidina-2-tiona (MA-GG-TT) y, opcionalmente (solo para la obtención de imágenes), W-metacriloilaminopropil fluoresceína tiourea (MA-FITC), se sintetizaron mediante copolimerización RAFT. En segundo lugar, el P-TT se hizo reaccionar con MORF2-NH2 para producir P-MORF2 multivalente.
En relación con la síntesis del P-TT, en la copolimerización RAFT, se usó ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico (CPDB) como agente de transferencia de cadena y diclorhidrato de 2,2'-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] (VA-044) como iniciador. La reacción se realizó en metanol que contenía ácido acético al 0,3 %v/v (MeOH/H+) Un procedimiento típico empleado fue el siguiente: Se agregaron HPMA (272 mg, 1,9 mmol) y MA-GG-TT (30,1 mg, 0,1 mmol) a una ampolla conectada a una línea de Schlenk. Luego de tres ciclos de vacíonitrógeno para eliminar el oxígeno, se agregó 1 mL de MeOH/H+ desgasificado para disolver los monómeros y, a continuación, se agregó solución de CPDB (0,43 mg en 50 pL de MeOH/H+) y solución de VA-044 (0,25 mg en 50 pL de MeOH/H+) mediante una jeringa. La mezcla se burbujeó con nitrógeno durante 15 minutos antes de sellar la ampolla; la copolimerización se realizó a 40 °C durante 36 h. El copolímero se aisló por precipitación en acetona, se purificó por disolución-precipitación en metanol-acetona dos veces y se secó al vacío. El rendimiento de P-TT fue de 160 mg (53 %). El peso molecular promedio por número (Mn) y la distribución de pesos moleculares (polidispersión, Pd) del P-TT se determinaron por SEC usando un equipo ÁKTA FPLC equipado con detectores miniDAWN y OptilabREX (GE Healthcare).. Se usó una columna Superose 6 HR10/30 (GE Healthcare) con buffer de acetato de sodio (pH 6,5) y acetonitrilo al 30 %v/v como fase móvil. Para eliminar los grupos ditiobenceno (activos) terminales, los copolímeros de P-TT se hicieron reaccionar con 2,2'-azobis(2,4-dimetil valeronitrilo) (V-65) (Wako Chemicals, Richmond, VA). Brevemente, se agregaron P-TT (39 mg, Mn = 92 kDa, ~0,42 mmol) y V-65 (exceso de 20 veces, 2,1 mg, ~8,47 mmol) en una ampolla. Luego de tres ciclos de vacío-nitrógeno para eliminar el oxígeno, se agregaron 0,4 mL de MeOH/H+. La solución se burbujeó con nitrógeno durante 15 min, se selló y se dejó reaccionar a 50 °C durante 3 h. El copolímero con extremo modificado se purificó por precipitación en acetona dos veces y, luego, se secó al vacío (rendimiento: 34 mg u 86 %). El contenido de grupos TT en los copolímeros se determinó midiendo la absorbancia UV a 305 nm (absortividad molar = 10900 M_1 cm-1; en metanol) (Subr et al., 2006). El contenido de FITC se determinó midiendo la absorbancia a 495 nm (absortividad molar = 82000 M-1 cm-1 en buffer de borato pH 9,2 DMF al 10 %v/v) (Omelyanenko et al., 1998).
El relación con la unión del MORF2-NH2 al P-TT para producir el conjugado P-MORF2, el P-TT descrito anteriormente se hizo reaccionar con MORF2-NH2 para producir P-MORF2 multivalente. Por ejemplo, se realizaron los pasos siguientes: 10 mg de P-TT (92 kDa; conteniendo 3,83 jm ol de grupos TT) se mezclaron con 6,46 mg (766 nmol) de MORF2-NH2 en 400 |jL de PBS 10 mM (pH 7,4). La solución mezclada se agitó a temperatura ambiente durante 24 h en una ampolla; luego, se agregó 1 j L de 1-amino-2-propanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se agitó durante otros 15 min para aminolizar los grupos TT no reaccionados en las cadenas poliméricas. Luego de la reacción, la solución se filtró por un filtro de 0,22 jm y el conjugado se purificó mediante SEC mediante un equipo ÁKTA FPLC con una columna Superose 6 HR16/60 (GE Healthcare) eluida con PBS (pH 7,2). El P-MORF2 se caracterizó por su absorbancia UV a 265 nm luego eliminar el MORF2 no conjugado (si lo hubiera). Para cuantificar el contenido de MORF2 y determinar la valencia (cantidad de MORF2 por cadena polimérica), los conjugados P-MORF2 fraccionados se liofilizaron y disolvieron en HCl 0,1 N antes del análisis UV-visible. Se usó una absortividad molar de 252000 M' 1 cm’1 para la cuantificación del MORF2. Las valencias de los conjugados P-MORF2 se calcularon en función del contenido resultante de MORF2 y el Mn de las cadenas principales poliméricas (determinado previamente por SEC).
(d) Caracterización de Fab '-MORF1 y P-MORF2
Se uso espectroscopia UV-visible para cuantificar los oligómeros MORF1 y MORF2 así como para determinar el contenido de ellos en los conjugados. Las absortividades de MORF1 y MORF2 (a 265 nm en HCl 0,1 N) fueron de 278000 y 252000 (M_1 cirr1), respectivamente. La valencia de los conjugados P-MORF2 se determinó usando el coeficiente de extinción del MORF2 y los valores de Mn de la cadena principal polimérica. La concentración de MORF2 equivalente de los conjugados P-MORF2 se cuantificó mediante espectroscopia UV-visible. La concentración de Fab' equivalente del conjugado Fab'-MORF1 se cuantificó mediante una determinación de proteínas basada en ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL).
El análisis del efecto hipocrómico ante la hibridación entre MORF1 y MORF2 se realizó con un espectrofotómetro UV-visible Varian Cary 400 Bio (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). En primer lugar, el MORF1 y el MORF2 (o Fab'-MORF1 y P-MORF2) se disolvieron en 1 mL de PBS (pH = 7,4), cada uno a una concentración de 2,5 j M (conc. equivalente de MORF) y, luego, se mezclaron en diferentes proporciones. Las concentraciones finales de oligómeros MORF (MORF1 MORF2) en cada mezcla se mantuvieron constantes (2,5 j M). Por ejemplo, la mezcla que contenía 75 % de MORF1 (o 25 % de MORF2) se preparó mezclando 0,75 mL de solución de Mo Rf 12,5 j M con 0,25 mL de solución de MORF22,5 j M. Las mezclas se colocaron en una cubeta de cuarzo de 1 cm para su medición. Se registró la densidad óptica (OD) a 260 nm (contribuida por las bases). Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Los diámetros hidrodinámicos de los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2, así de como sus precursores Fab'-SH y P-TT, se analizaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) con un goniómetro Brookhaven BI-200SM y un correlacionador digital BI-9000AT equipado con un láser de He-Ne (A = 633 nm) a temperatura ambiente en PBS (pH 7,4). El ángulo de dispersión fue de 90°. Se midió en línea un patrón de tamaño de poliestireno Nanosphere™ con un diámetro de 102 ± 3 nm (STD100nm) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Antes de la medición, los conjugados y precursores a una concentración de aproximadamente 1 mg/mL se filtraron por un filtro de 0,22 jm . Todas las muestras mostraron una polidispersión menor de 0,2 y se registró el diámetro medio de las partículas. Además, se usó DLS para caracterizar el cambio en el tamaño de las partículas ante la unión entre Fab'-MORF1 y P-MORF2. El análisis se realizó en distintos momentos (10 min, 30 min y 60 min) luego de mezclar ambos conjugados (en concentraciones equimolares de MORF1/MORF2). Todas las muestras contenían una población mayoritaria de partículas (polidispersión < 0,2) que indicaba la hibridación entre los conjugados, así como poblaciones menores que indicaban conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2 libres. Se registró el diámetro efectivo medio de la población principal. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Se usó un espectrómetro de CD Aviv 62DS con un sistema de control de temperatura termoeléctrico (Aviv Biomedical, Lakewood, NJ). Se realizaron mediciones periódicas a 25 °C (excepto el análisis de desnaturalización térmica) en las que cada muestra se barrió entre 200 y 340 nm con pasos de 1 nm (ancho de banda = 1 nm, duración de cada paso = 2 s). Las muestras se prepararon en PBS 10 mM (pH 7,4) con concentraciones equivalentes de MORF de 50 j M (Fab'-SH a conc. equivalente de Fab' de 50 j M). Antes de la medición, las muestras se filtraron con un filtro de 0,22 jm y se colocaron en una cubeta de cuarzo con una longitud del camino de 0,1 cm. Los espectros obtenidos se restaron del espectro de fondo (PBS, pH 7,4) y se realizó un promedio de los datos de tres barridos consecutivos. Para los estudios de desnaturalización térmica, se registró la señal de CD a 260 nm (n = 3).
Los conjugados Fab'-MORF1 y P-MORF2 (o bien los oligómeros MORF1 y MORF2) se mezclaron equimolarmente (5 j M/5 j M de MORF1/MORF2) en PBS, pH = 7,4 durante 1 h a temperatura ambiente. Las mezclas se filtraron y se colocaron en una cubeta de cuarzo con una longitud de camino de 1 cm antes de la medición. Cada muestra se sometió primero a un barrido ascendente en el que la temperatura aumentó de 25 a 95 °C a razón de 2 °C/paso. En cada paso, la muestra se dejó equilibrar durante 2 minutos y, luego, se promediaron las mediciones obtenidas a lo largo de 30 segundos. Posteriormente, se realizó un barrido descendente en el que la temperatura disminuyó de 95 a 25 °C a razón de -10 °C/paso. En cada paso, la muestra se dejó equilibrar durante 5 minutos y, luego, se promediaron las mediciones obtenidas a lo largo de 30 segundos.
La elipticidad observada (0obs) se convirtió a una elipticidad molar (0) con la siguiente ecuación: 0 = 0obs/(l * c) donde l es la longitud del camino óptico de la cubeta y c es la concentración molar equivalente de MORF. Para analizar la temperatura de desnaturalización (Tm) de la hibridación entre MORF1 y MORF2, se graficó 0 (a 260 nm) en función de la temperatura (T) y los datos se ajustaron a una curva de desnaturalización térmica mediante una regresión no lineal (software GraphPad Prism 5) usando la siguiente función logística de cuatro parámetros:
0 = 0min (0max — 0mm)/[1 (T/Tm )AH ]
donde 0min es la mínima elipticidad molar (a 260 nm) en la curva, 0max es la máxima elipticidad molar (a 260 nm) en la curva y H es la pendiente de Hill.
(e) Microscopía de fluorescencia confocal
Linfocitos B humanos de la línea celular Raji de LNH de Burkitt (ATCC, Bethesda, MD) se cultivaron en medio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Hyclone, Logan, UT) a 37 °C en una atmósfera humedecida con 5 %v/v de CO2. Todos los experimentos se realizaron usando células en la fase de crecimiento exponencial. En el caso del tratamiento consecutivo, células a una densidad de 106 por pocillo se incubaron con 0,4 mL de Fab'-MORFI-RHO (conc. equivalente de Fab' 0,4 pM) en medio de cultivo a 37 °C durante 1 h. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS antes de incubarse con 0,4 mL de P-MORF2-FITC (conc. equivalente de MORF20,4 pM) durante 1 h más. En el caso del tratamiento con premezcla, primero se mezclaron los conjugados Fab'-MORF1-RHO y P-MORF2-FITC equimolarmente (0,4 pM) en medio de cultivo durante 1 h. Luego, células a la misma densidad que en el caso anterior se incubaron con 0,4 mL de la premezcla durante 1 h. Luego de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS (para descartar el medio que contenía los conjugados) y se sembraron en placas estériles de 35 mm con fondo de vidrio con micropocillos de 14 mm (MatTek Corporation, Ashland, MA) para la obtención de imágenes con un microscopio confocal de barrido láser Olympus (FV 1000). En los estudios de control, se mantuvo una concentración consistente de todos los componentes correspondientes; se usaron cantidades en exceso de P-FITC y P-dsMORF. Antes del análisis, se usaron células incubadas con mAb 1F5 marcado con FITC, F(ab')2 marcado con rodamina y PBS para ajustar el canal y confirmar la unión a los antígenos CD20.
( f ) Evaluación de la apoptosis i n v i t r o
La apoptosis de los linfocitos B de LNH se evaluó mediante tres métodos: una determinación de caspasa-3, una determinación de anexina V/yoduro de propidio y una determinación TUNEL. Estas determinaciones evaluaron la apoptosis desde distintos puntos de vista, a saber: la activación de la caspasa-3 representó la expresión proteica apoptótica; la unión de anexina V/yoduro de propidio caracterizó la inversión de la membrana celular como evento apoptótico temprano; la determinación TUNEL analizó la fragmentación del ADN genómico como evento apoptótico tardío. La cuantificación de la actividad apoptótica (% de células apoptóticas) se realizó mediante citometría de flujo.
La inducción de la apoptosis in vitro en linfocitos B humanos de la línea celular Raji de LNH de Burkitt mediante el cotratamiento con Fab'-MORF1 y P-MORF2 se evaluó mediante tres determinaciones: determinación de activación de la caspasa-3; determinación de unión de anexina V/ioduro de propidio (PI); y determinación de marcación de extremos de muescas de dUTP mediada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). En todos los experimentos, se usó como control positivo un mAb 1F5 hiperreticulado con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (GAM, 2.° Ab) (KPL, Gaithersburg, MD) (cociente molar 1F5:GAM = 2:1). Como controles negativos se usaron células no tratadas (en medio de cultivo).
Para evaluar la actividad de la caspasa-3, se usó un kit Phi-PhiLux (Oncolmmunin, Gaithersburg, MD). Para el tratamiento consecutivo, 2*105 células Raji se suspendieron en 0,4 mL de medio de cultivo fresco con Fab'-MORF1 0,5 pM. Las células se incubaron durante 1 h en una atmósfera humidificada a 37 °C con 5 % de CO2 y, luego, se lavaron dos veces con PBS albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, seguido por la resuspensión en 0,4 mL de medio con P-MORF2 a una concentración equivalente de MORF2 de 0,5 pM o 5 pM. La suspensión de células se incubó durante 6 o 24 h. En el caso del tratamiento con premezcla, primero, se mezcló Fab'-MORF1 0,5 pM con P-MORF2 0,5 pM o 5 pM (conc. equivalente de MORF2) en medio de cultivo a temperatura ambiente durante 1 h y, luego, se suspendieron 2*105 células Raji en 0,4 mL de la solución premezclada. La suspensión de células se incubó durante 6 o 24 h. En el caso del control positivo, las células primero se incubaron con 0,4 mL de mAb 1F50,5 pM en medio de cultivo durante 1 h y, luego, se lavaron dos veces con PBS BSA al 1 %, seguido por la resuspensión en 0,4 mL de medio de cultivo fresco con GAM 0,25 pM. Las células se incubaron durante otras 6 o 24 h a 37 °C. Luego del tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS y se analizaron para detectar actividad de caspasa-3 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Se realizaron tinciones con anexina V-FITC y PI de acuerdo con el protocolo RAPID™ provisto por el fabricante (Oncogene Research Products, Boston, MA). En el caso del tratamiento consecutivo, 2*105 células Raji o DG75 (CD20-; control) se suspendieron en 0,4 mL de medio de cultivo fresco con Fab'-MORF1 0,5 pM, 1 pM, 2 pM o 5 pM. Las células se incubaron durante 1 h en una atmósfera humidificada a 37 °C con 5 % de CO2 y, luego, se lavaron dos veces con PBS albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, seguido por la resuspensión en 0,4 mL de medio con P-MORF2 a una concentración equivalente de MORF2 de 0,5 j M, 1 j M, 2 j M o 5 j M. La suspensión de células se incubó durante 24 h o 48 h. En el caso del tratamiento con premezcla, primero, se mezcló Fab'-MORFI 0,5 j M, 1 j M, 2 j M o 5 j M con P-MORF2 0,5 j M, 1 j M, 2 j M o 5 j M (conc. equivalente de MORF2) en medio de cultivo a temperatura ambiente durante 1 h y, luego, se suspendieron 2*105 células Raji o DG75 en 0,4 mL de la solución premezclada. La suspensión de células se incubó durante 24 h o 48 h. En el caso del control positivo, las células primero se incubaron con 0,4 mL de mAb 1F50,5 j M, 1 j M, 2 j M o 5 j M en medio de cultivo durante 1 h y, luego, se lavaron dos veces con PBS BSA al 1 %, seguido por la resuspensión en 0,4 mL de medio de cultivo fresco con GAM 0,25 j M, 0,5 j M, 1 j M, 2,5 j M. Las células se incubaron durante otras 24 h o 48 h a 37 °C. Antes de la tinción, las células se lavaron dos veces con PBS. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Para la determinación TUNEL, se usó un kit Apo Direct TUNEL (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Para el tratamiento consecutivo, 106 células Raji se suspendieron en 0,5 mL de medio de cultivo fresco con Fab'-MORF1 0,5 j M. Las células se incubaron durante 1 h en una atmósfera humidificada a 37 °C con 5 % de CO2 y, luego, se lavaron dos veces con PBS albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, seguido por la resuspensión en 0,5 mL de medio con P-MORF2 a una concentración equivalente de MORF2 de 0,5 j M o 5 j M . La suspensión de células se incubó durante 24 o 48 h. En el caso del tratamiento con premezcla, primero, se mezcló Fab'-MORF1 0,5 j M con P-MORF2 0,5 j M o 5 j M (conc. equivalente de MORF2) en medio de cultivo a temperatura ambiente durante 1 h y, luego, se suspendieron 106 células Raji en 0,5 mL de la solución premezclada. La suspensión de células se incubó durante 24 o 48 h. En el caso del control positivo, las células primero se incubaron con 0,5 mL de mAb 1F50,5 j M en medio de cultivo durante 1 h y, luego, se lavaron dos veces con PBS BSA al 1 %, seguido por la resuspensión en 0,5 mL de medio de cultivo fresco con GAM 0,25 j M. Las células se incubaron durante otras 24 o 48 h a 37 °C. Luego del tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 2 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las células se permeabilizaron en etanol al 70 % de un día para el otro a 4 °C. Antes del análisis, se realizó un marcado de extremos de muescas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
( g ) Determinación de la eficacia anticancerígena i n v i v o
Ratones C.B-17 SCID hembra (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) de aproximadamente 7 semanas de edad fueron inyectados por vía intravenosa con 4*10® células Raji en 200 j L de solución salina a través de la vena de la cola (día 0). Este modelo animal representa la diseminación, la infiltración y el crecimiento de células de linfoma en distintos órganos, incluida la columna vertebral, donde provoca parálisis de las extremidades posteriores seguida de muerte del animal (Ghetie et al., 1990, 1992; Griffirths et al., 2003). El inicio de la parálisis de las extremidades posteriores fue el criterio de valoración experimental; además, los ratones se sacrificaron cuando la pérdida de peso corporal fue mayor de 20 %. Los animales sin signos de parálisis ni enfermedad se mantuvieron con vida hasta los 125 días y se consideraron supervivientes a largo plazo. Los conjugados, Fab'-MORF1 (57,5 jg/20 g; 1 nmol MORF1) y P-MORF2/v10 (22 jg/20 g; 1 nmol MORF2), se disolvieron en 100 j L de PBS y se inyectaron a través de la vena de la cola, sea consecutivamente (con un intervalo de 1 h) o como premezcla (mezclados 1 h antes del tratamiento). Los ratones inoculados se dividieron en siete grupos: (1) control negativo (ratones inyectados con 200 j L PBS); (2) dosis única del tratamiento consecutivo (Cons *1); (3) dosis única del tratamiento con premezcla (Prem *1); (4) tres dosis del tratamiento consecutivo (Cons *3); (5) tres dosis del tratamiento con premezcla (Prem *3); (6) dosis única del tratamiento consecutivo pero con exceso de 5 veces de P-MORF2/v10 (110 jg/20 g; 5 nmol de MORF2) respecto de Fab'-MORF1 (Cons (1:5) *1); y (7) control positivo (ratones inyectados con 3 dosis de mAb 1F5 a través de la vena de la cola [75 jg/20 g; 1 nmol Fab' equivalente por dosis]). En los grupos de dosis única, los conjugados se administraron el día 1 (24 h después de la inyección de células cancerosas); en los grupos de dosis múltiples, los conjugados (o mAb) se administraron los días 1, 3 y 5. Para supervisar el avance de la enfermedad, se tomaron imágenes de resonancia magnética ponderadas en T1 de los ratones (entre 2 y 4 por grupo) en las semanas 4, 5 y 16.
20 min antes de la obtención de las imágenes, se inyectó (por vía intravenosa) gadobenato de dimeglumina (MultiHance®; Bracco SpA, Milán, Italia) a razón de 0,3 mmol/kg. Se usaron imágenes precontraste para fines de comparación.
Le eficacia terapéutica de la terapia macromolecular sin fármacos mediada por hibridación, es decir, el cotratamiento con Fab'-MORF1 y P-MORF2, se evaluó en un modelo animal de LNH avanzado obtenido trasplantando por vía intravenosa linfocitos B humanos Raji a ratones SCID (C.B-17). Todos los regímenes de tratamiento se describen en el artículo principal. Se realizó una supervisión de los animales dos veces al día luego del tratamiento. El peso corporal de los ratones se registró cada dos días. Los principales aspectos de los ratones analizados en detalle incluyeron los siguientes: parálisis de las extremidades posteriores, consumo de alimento/agua, signos vitales de movilidad/actividad anómala (p. ej., lamerse, morder, rascarse una zona específica y vocalizar), y apariencia física (p. ej., no acicalarse, apariencia descuidada, descanso anómalo/postura encorvada, piloerección). Los animales se sacrificaron en las siguientes situaciones (la que ocurriera primero): (1) al inicio de la parálisis (de las extremidades posteriores); y (2) ante una pérdida de peso corporal mayor de 20 % respecto del peso inicial (un día antes de la inyección de las células cancerosas). Los animales sin ninguno de los signos mencionados se mantuvieron con vida durante 125 días (después de la inyección de las células cancerosas) y se sacrificaron para su análisis posterior.
Para la obtención de imágenes de resonancia magnética in vivo, ratones se anestesiaron con isoflurano al 1 %-2,5 % (IsoFlo®, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) en oxígeno mediante un vaporizador de precisión. Los ratones se colocaron en decúbito prono en el centro de la bobina. Un resonador magnético Bruker BioSpec de 7 Tesla (Bruker Biospin, Billerica, MA) con una abertura cilíndrica de 30 cm de ancho y un accesorio de gradiente de 12 cm. En primer lugar, se obtuvieron imágenes precontraste. Luego, se inyectó a los ratones un agente de contraste a base de gadolinio, gadobenato de dimeglumina (Multihance®; Bracco Imaging, Milán, Italia) a través de la vena de la cola a razón de 0,3 mmol/kg (100 pL, en solución fisiológica). Veinte minutos después de la inyección, se obtuvieron imágenes poscontraste. Durante la resonancia, la temperatura corporal de los ratones se mantuvo a 37 °C con un sistema de circulación de aire caliente (SA Instruments, Stony Brook, NY). La respiración se supervisó en forma continua. La resonancia se realizó con el entorno de software ParaVision® 5.1. Los parámetros de adquisición fueron los siguientes: secuencia FLASH ponderada en T1 con disparo retrospectivo para eliminar artefactos introducidos por la respiración, tiempo de eco (TE) 2,9 ms, tiempo de repetición (TR) 43,2 ms, ángulo de inclinación de 50°, sección de plano sagital 6 con espesor 0,5 mm, matriz 256 * 256, campo de visión (FOV) 3 cm * 3 cm, 50 repeticiones. Luego de la resonancia, las imágenes se analizaron y procesaron en una estación de trabajo fuera de línea (OsiriX).
(h) Análisis por citometría de flujo de células Raji residuales
Luego de sacrificar los ratones, los siguientes órganos se analizaron por citometría de flujo en busca de células Raji residuales: médula ósea (fémur), nodos linfáticos mesentéricos e inguinales, columna vertebral y bazo. Dos anticuerpos marcados fluorescentemente, anticuerpo murino anti-CD10 humano (IgG1, isotipo k) marcado con R-ficoeritrina (PE) y anticuerpo murino anti-CD19 humano (IgG1, isotipo k) marcado con aloficocianina (APC) (BD Biosciences, San Jose, CA) se usaron para teñir linfocitos B Raji (Chen et al., 2010). Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de los órganos/tejidos usando los procedimientos siguientes. En el caso de la médula ósea, fémures frescos se purgaron con 1 mL de PBS para obtener suspensiones de células. Las células se resuspendieron en 5 mL de buffer de lisis de glóbulos rojos y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, las células se lavaron con 5 mL de PBS y se centrifugaron para eliminar los restos. A continuación, se resuspendieron en 400 pL de buffer de lavado frío y se dividieron por igual en 4 tubos: (1) células de control sin tinción, (2) células con tinción individual de CD10, (3) células con tinción individual de CD19 y (4) células con tinción doble de CD10/CD19. Para la tinción, se agregaron 20 pL de cada anticuerpo a 100 pL de suspensión de células que contenían aproximadamente 106 células. Las células se incubaron durante 30 min a 4 °C en la oscuridad y se lavaron con 1,5 mL de buffer de lavado antes del análisis. En el caso de los nodos linfáticos, la columna vertebral y el bazo, se usó un método mecánico. Los tejidos se disgregaron delicadamente con ayuda de pinzas en una placa de Petri con 1 mL de PBS. Las suspensiones se pasaron por un filtro de células Falcon™ de 70 pm (BD Biosciences) para eliminar los cúmulos grandes y los restos y, luego, las células se centrifugaron y resuspendieron en 5 mL de buffer de lisis de glóbulos rojos. El resto de los procedimientos fueron idénticos a los ya descritos. En el análisis por citometría de flujo, se registraron datos de 1-1,5*105 células.
(i) Exámenes patológicos e histológicos
Inmediatamente después de sacrificar los ratones, se recuperaron los siguientes órganos/tejidos para su evaluación patológica: cerebro, corazón, pulmón, hígado, bazo, riñones, columna vertebral y nodos linfáticos. Estos órganos/tejidos se fijaron en formalina al 10 % de un día para otro a temperatura ambiente y, luego, se transfirieron y preservaron en etanol al 70 %. El examen histopatológico fue realizado a ciego por un patólogo veterinario en ARUP Laboratories (Salt Lake City, UT). Las secciones se cortaron con un espesor de 4 pm, se montaron sobre portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE).
(j) Análisis estadístico
Todos los experimentos de este estudio se realizaron, al menos, por triplicado. Los datos cuantificados se presentaron en la forma media ± desvío estándar (SD). Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student para comparar entre dos grupos, o bien mediante un análisis de la varianza (ANOVA) unidireccional para comparar tres o más grupos (donde un valor p < 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa). El análisis de supervivencia de animales se realizó con una prueba de Mantel-Cox usando el software GraphPad Prism 5.
Mi) Ventajas experimentales
En la presente se divulga un sistema que comprende la reticulación de antígenos en la superficie celular y la inducción de la apoptosis mediadas por la hibridación. El evento celular (apoptosis) se dispara a partir de un biorreconocimiento específico definido a nivel molecular (apareamiento entre bases), lo que lo hace adecuado para el diseño de terapias precisamente dirigidas. El tratamiento divulgado en dos pasos (consecutivo) ofrece la posibilidad de predireccionamiento (Goodwin et al., 2001; Gun et al., 2011; Zhou et al., 2009). Esta es una ventaja respecto del tratamiento con premezcla y de otros constructos anti-CD20 de componentes individuales, como los polímeros de rituximab (Zhang et al., 2005) y los polímeros multivalente funcionalizados con Fab' anti-CD20 (Johnson et al., 2009, 2012; Chu et al., 2012). Por ejemplo, el momento de la administración de la dosis de reticulación (P-MORF2) puede optimizarse en función de la biodistribución de la dosis de predireccionamiento (Fab'-MORF1) para lograr una acumulación máxima en el tumor respecto del tejido en cada paciente y permitir un tratamiento más eficiente. Este enfoque también limita las posibles reacciones adversas asociadas con la unión inespecífica, lo que lo hace beneficioso para el tratamiento de tumores sólidos así como enfermedades diseminadas. En el caso de los cánceres de la sangre, la farmacocinética del conjugado Fab'-MORF1 y la cinética de unión del conjugado Fab'-MORF1 a las células enfermas se puede estudiar en mayor detalle para determinar el momento más adecuado para la administración del conjugado P-MORF2.
Por ejemplo, para explorar un programa de administración óptimo del conjugado P-MORF2 luego de Fab'-MORF1 en el caso del tratamiento consecutivo, se investigó la farmacocinética del conjugado Fab'-MORF1. El perfil de (radio)actividad en función del tiempo de conjugado Fab'-MORF1 marcado con 125I en ratones se muestra en la FIG.
29, donde los círculos cerrados representan la radiactividad media, expresada como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de sangre (%ID/g). Los datos se presentan en la forma media ± desvío estándar (n = 5). Los resultados indican que, para lograr una eficiencia máxima de predireccionamiento en el tratamiento consecutivo, el conjugado P-MORF2 se puede administrar aproximadamente 5 h después de la inyección por vía intravenosa del conjugado Fab'-MORF1 (cuando la mayoría de los conjugados se han depurado de la sangre). En este momento, es mínima la cantidad de conjugado Fab'-MORF1 libre (no unido a linfocitos B) que pudiera interferir con la hibridación. Estos datos indican que la eficacia terapéutica de las composiciones y los métodos propuestos se pueden optimizar más.
Los experimentos sobre animales que se presentaron aquí muestran que, a dosis equivalentes, un tratamiento único con Fab'-MORF1 P-MORF2 (1:1) fue significativamente más efectivo que un tratamiento único con Fab'-CCE P-CCK (1:25) a la hora de evitar la diseminación del linfoma (tratamiento consecutivo: mediana de supervivencia de 81 días en el caso de los MORF vs. mediana de supervivencia de 50 días en el caso de los CC; tratamiento con premezcla: mediana de supervivencia de 78 días en el caso de los MORF vs. mediana de supervivencia de 55 días en el caso de los CC). Estos datos indican una unión y accesibilidad superior de los oligómeros MORF en las cadenas del polímero de HPMA en comparación con los péptidos de hélice superenrollada. Además, en relación con la hibridación entre MORF1 y MORF2, se observó una cinética de unión rápida (~10 min de acuerdo con un análisis de DLS; FIG. 11B). Por su parte, la formación de la hélice superenrollada CCE-CCK requirió un tiempo mucho mayor (~60 min) (Wu et al., 2010). La comparación entre los CC y los MORF indica que las composiciones, los complejos y los métodos divulgados en la presente son beneficiosos para el diseño de terapias macromoleculares sin fármacos.
Las composiciones, los complejos y los métodos divulgados en la presente poseen al menos dos ventajas considerables: (1) un direccionamiento superior hacia los linfocitos B gracias a la multivalencia; y (2) potencial de disminución de los efectos secundarios asociados con las funciones inmunes. En comparación con el diseño anterior usando péptidos (un sistema terapéutico macromolecular anti-CD20 sin fármacos que empleaba un par de péptidos tipo pentahéptada que formaban heterodímeros de hélices superenrolladas antiparalelas como fracciones de biorreconocimiento [Wu et al., 2010; Wu et al., 2012]), los oligómeros MORF que se divulgan en la presente demuestran una cinética de unión más rápida, que mejora la inducción de la apoptosis y las propiedades anti-linfoma in vivo. Otras ventajas de los oligómeros MORF divulgados incluyen las siguientes: (1) una cadena principal químicamente modificada que garantiza la estabilidad in vivo (resistente a las nucleasas); (2) una especificidad de unión bien definida (evita los posibles efectos inespecíficos); (3) una carga neutral (que resulta en una afinidad de unión intensa); (4) un perfil de seguridad comprobado (aborda los posibles problemas de inmunogenicidad de los péptidos de hélice superenrollada); y (5) una buena solubilidad en agua y una farmacocinética favorable.
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Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un primer complejo y un segundo complejo para usar en el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes con participación de linfocitos B en un paciente:
    (i) donde dicho primer complejo comprende una fracción de direccionamiento y un morfolino, y donde dicho tratamiento involucra poner la población de linfocitos B de dicho paciente en contacto con dicho primer complejo; y
    (ii) donde dicho segundo complejo comprende un copolímero portador y uno o más morfolinos, y donde dicho tratamiento involucra poner la población de linfocitos B de dicho paciente en contacto con dicho segundo complejo;
    donde poner en contacto las células con el primer complejo y con el segundo complejo induce la apoptosis de las células,
    donde el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo son complementarios, donde la fracción de direccionamiento es específica para el receptor CD20.
  2. 2. El primer complejo y el segundo complejo para usar de acuerdo con la reivindicación 1, donde su uso comprende, además, repetir el paso (i) y el paso (ii).
  3. 3. El primer complejo y el segundo complejo para usar de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde el paciente padece linfoma no Hodgkin.
  4. 4. El primer complejo y el segundo complejo para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la fracción de direccionamiento es un polisacárido, un ligando peptídico, un aptámero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario y donde, preferentemente, el fragmento Fab'se deriva de un anticuerpo anti-receptor CD20 y donde, preferentemente, el anticuerpo anti-receptor CD20 es 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab o BLX-301.
  5. 5. El primer complejo y el segundo complejo para usar para el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, donde el morfolino del primer complejo es 5' GAG TAA GCC AAG GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 25) y donde el/los morfolino(s) del segundo complejo es/son 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 26).
  6. 6. Un kit que comprende (i) un primer complejo que comprende una fracción de direccionamiento y un morfolino;
    y (ii) un segundo complejo que comprende un copolímero portador y uno o más morfolinos, donde el morfolino del primer complejo y el/los morfolino(s) del segundo complejo son complementarios y donde la fracción de direccionamiento es específica para el receptor CD20.
  7. 7. El kit de la reivindicación 6, donde el primer complejo y el segundo complejo se coformulan.
  8. 8. El kit de la reivindicación 6, donde la fracción de direccionamiento es un polisacárido, un ligando peptídico, un aptámero, un fragmento Fab' o un fragmento variable monocatenario y donde, preferentemente, el fragmento Fab'se deriva de un anticuerpo anti-receptor CD20 y donde, preferentemente, el anticuerpo anti­ receptor CD20 es 1F5, rituximab, tositumomab, ibritumomab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, ocaratuzumab, obinutuzumab, PRO131921, BCD-020, IBI-301, ublituximab o BLX-301.
  9. 9. El kit de la reivindicación 6, donde el morfolino del primer complejo es 5' GAG TAA GCC AAG GAG AAT CAA TAT A 3' (ID DE SEC. N.° 25) y donde el/los morfolino(s) del segundo complejo es/son 5' TAT ATT GAT TCT CCT TGG CTT ACT C 3' (ID DE SEC. N.° 26).
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