ES2787261T3 - Nuevos vectores de baculovirus y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Un baculovirus recombinante que presenta en su envoltura una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión: (i) un antígeno heterólogo; y (ii) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 3 ubicada dentro de la región básica central de la proteína GP64; en la que el antígeno heterólogo se encuentra en el extremo terminal N de la proteína de fusión que se presenta en la envoltura del baculovirus recombinante.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos vectores de baculovirus y métodos de uso
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a baculovirus recombinantes.
Antecedentes de la invención
El baculovirus infecta insectos y no es patógeno para los humanos, pero puede transducir una amplia gama de células de mamíferos y aves. Gracias a la bioseguridad, la gran capacidad de clonación, la baja citotoxicidad y la naturaleza de no replicación en las células transducidas, así como la facilidad de manipulación y producción, el baculovirus ha ganado una popularidad explosiva como vector de administración de genes para una amplia variedad de aplicaciones, tales como terapia antiviral, terapia contra el cáncer, medicina regenerativa y vacunas.
La patente de los Estados Unidos No. 7.527.967 (o US 2005/0208066) describe un baculovirus recombinante que muestra un polipéptido heterólogo de fusión en la superficie del baculovirus para usar en la generación de un anticuerpo o una respuesta inmune contra una proteína o virus heterólogo en un sujeto que requiera del mismo. Los polipéptidos heterólogos de fusión se preparan fusionando un antígeno heterólogo con los aminoácidos del extremo terminal carboxilo de 227 a 529 de la proteína GP64 de baculovirus (Figura 2C). El constructo contiene una porción sustancial del dominio extracelular de GP64 que incluye el sitio de unión a B12D5. Cuando se usa en la inmunización, el dominio extracelular de GP64 puede provocar una respuesta inmune y producir anticuerpos no deseados, tales como el anticuerpo B12D5 anti-GP64 inútil (Zhou et al., Virology 2006; 352 (2): 427-437). El anticuerpo B12D5 GP64 es un anticuerpo de neutralización contra el baculovirus en sí mismo en lugar de un antígeno foráneo de interés. Además, el baculovirus es ligeramente inmunogénico para el porcino.
La patente taiwanesa No. 1368656 describe un método para usar el péptido señal, el dominio transmembrana y el dominio de transducción citoplasmático de GP64 para presentar un antígeno. El constructo contiene solo el dominio transmembrana y el dominio de trunsducción citoplasmático sin el dominio extracelular de GP64 (Figura 2D). Tiene menos expresión de antígeno foráneo y es sensible a los reactivos de inactivación (Premanand et al., PLoS ONE 2013; 8 (2): e55536).
Por lo tanto, existe una necesidad hasta ahora no abordada en la técnica para abordar las deficiencias e insuficiencias mencionadas anteriormente, especialmente en relación con un vector de baculovirus que es insensible al reactivo de inactivación y tiene inmunogenicidad mejorada.
Spenger et al., (Eur. J. Biochem. 269, 4458-4467, 2002) describen la alteración de las propiedades de superficie del baculovirus Autographa californica NPV mediante mutagénesis de inserción de la proteína de envoltura gp64.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende un transgén que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión: (a) un péptido señal situado en el extremo terminal N de la proteína de fusión; (b) un antígeno; y (c) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 3 ubicada dentro de la región básica central de la proteína GP64; en la que el antígeno se encuentra en el extremo terminal C del péptido señal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende un transgén que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión:
(a) un péptido señal situado en el extremo terminal N de la proteína de fusión;
(b) un antígeno; y
(c) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que tiene al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 ubicado dentro de la región básica central de la proteína GP64 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
en la que el antígeno se encuentra en el extremo terminal C del péptido señal.
En una realización de la invención, el vector de la invención es un baculovirus recombinante.
En otro aspecto, la invención se refiere a un baculovirus recombinante que presenta en su envoltura una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión: (i) un antígeno heterólogo; y (ii) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 3 ubicada dentro de la región básica central de la proteína GP64; en la que el antígeno heterólogo se localiza en el extremo terminal N de la proteína de fusión que se presenta en la envoltura del baculovirus recombinante.
Además, en otro aspecto, la invención se refiere a un baculovirus recombinante que presenta en su envoltura una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión:
(i) un antígeno heterólogo; y
(ii) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 ubicado dentro de la región básica central de la proteína GP64 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
en la que el antígeno heterólogo se localiza en el extremo terminal N de la proteína de fusión que se presenta en la envoltura del baculovirus recombinante.
En una realización de la invención, el genoma del baculovirus recombinante comprende un transgén que codifica una proteína de fusión que comprende: (a) un péptido señal; (b) el antígeno heterólogo; y (c) la región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus; en la que el antígeno se encuentra en el extremo terminal C del péptido señal.
En otra realización de la invención, el transgén está operativamente unido a un promotor. En otra realización de la invención, el promotor es polihedrina.
En otra realización de la invención, la región del extremo terminal C de la proteína GP64 tiene una longitud de 186 a 220 aminoácidos.
En otra realización de la invención, la región del extremo terminal C de la proteína GP64 carece de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 3 o 4.
En otra realización de la invención, la región del extremo terminal C de la proteína GP64 comprende los aminoácidos de 293 a 512 de la SEQ ID NO: 1.
En otra realización de la invención, la región del extremo terminal C de la proteína GP64 comprende aminoácidos de 327 a 512 de la SEQ ID NO: 1.
En otra realización de la invención, la región del extremo terminal C de la proteína GP64 tiene un extremo terminal N que comienza entre los residuos de aminoácidos 292 y 328 de la SEQ ID NO: 1.
En otra realización de la invención, el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
Además, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula de insecto o una célula que comprende el vector o el baculovirus recombinante de la invención.
En otra realización de la invención, el antígeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en una proteína patógena, una proteína de células cancerosas y una proteína de punto de control inmune.
El patógeno puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en virus del papiloma humano, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de inmunodeficiencia humana-1, virus del dengue, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, circovirus porcino 2, virus de la peste porcina clásica, virus de la fiebre aftosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la gastroenteritis transmisible, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la influenza, virus de la pseudorrabia, parvovirus, virus de la enfermedad vesicular porcina, poxvirus, rotavirus, neumonía por micoplasma, virus del herpes, bronquitis infecciosa y virus de la enfermedad infecciosa de la bursa. El cáncer puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de mama, melanoma, linfomas, carcinoma de colon, carcinoma hepatocelular y cualquier combinación de los mismos. El punto de control inmune puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2 y CTLA-4.
En otra realización de la invención, el antígeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en la glicoproteína E2 de la envoltura del virus de la peste porcina clásica, la proteína S1 del virus de la diarrea epidémica porcina, la proteína 1 de muerte celular programada y un antígeno asociado a tumor.
Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un vector o un baculovirus recombinante de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento para provocar una respuesta inmunogénica específica de antígeno en un sujeto que lo necesite.
Estos y otros aspectos serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la realización preferida tomada junto con los siguientes dibujos. Los dibujos adjuntos ilustran una o más realizaciones de la invención y, junto con la descripción escrita, sirven para explicar los principios de la invención. Siempre que sea posible, se usan los mismos números de referencia en todos los dibujos para referirse a los mismos elementos o elementos similares de una realización.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es un dibujo esquemático que ilustra un diseño de plataforma de vector de baculovirus de acuerdo con una realización de la invención.
La Figura 1B es un dibujo esquemático que ilustra un antígeno foráneo o genes foráneos que no solo se pueden anclar en la envoltura del virus sino que también se expresan en la fracción de membrana de las células de insecto mediante una plataforma de presentación en la superficie de gBac. El rectángulo representa un virus.
La Figura 2A es un dibujo esquemático que muestra una proteína GP64 de longitud completa. GP64 mínimo (GP64327-482), dominio transmembrana GP64 (TM) (GP64483-505); dominio de transducción citoplasmático (CTD) (GP64506-512). La Figura 2B es un dibujo esquemático que muestra un vector de baculovirus de acuerdo con una realización de la invención. SP: péptido señal; TM: dominio transmembrana, CTD: dominio de transducción citoplasmático.
La Figura 2C es un dibujo esquemático que muestra un diseño de vector de baculovirus descrito en la patente de los Estados Unidos No. 7.527.967.
La Figura 2D es un dibujo esquemático que muestra un diseño de vector de baculovirus descrito en la patente de Taiwán No. 1368656.
La Figura 3 es un gráfico que muestra una respuesta inmune inducida por vectores de baculovirus en ratones después de la vacunación (panel izquierdo) y la medición del título de suero de neutralización (SN) de la vacuna de la subunidad E2-gBac (panel derecho) en ratones. Cada valor de ELISA que se muestra es un valor promedio de 5 ratones. La diferencia entre los grupos gBac y Bac es estadísticamente significativa, P □ 0,05. La cepa de baculovirus utilizada fue AcNPV. El término "SN" significa suero de neutralización. El término "E2-gBac" significa "vector de baculovirus CSFV E2-gBac" de acuerdo con el diseño del vector de la Figura. 2B. El término "E2-gBac (inactivado)" significa que el baculovirus se inactivó antes de usarse para la inmunización. El término "E2-Bac" significa "vector de baculovirus CSFV E2-Bac" de acuerdo con el diseño del vector de la Figura 2D
La Figura 4 es un gráfico que muestra una respuesta inmune inducida por vectores de baculovirus en cerdos después de la vacunación. Cada valor de ELISA que se muestra es un valor promedio de 3 cerdos. La diferencia entre los grupos gBac y gp64 es estadísticamente significativa, P □ 0,05. El término "E2-gp64" significa "vector de baculovirus CSFV E2-gp64" de acuerdo con el diseño del vector de la Figura 2C.
La Figura 5 es un gráfico que muestra títulos de anticuerpos contra el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) en 3 cerdos libres de patógenos específicos (SPF) después de la vacunación con el vector de baculovirus PEDV S1-gBac. Los 3 cerdos s Pf fueron etiquetados como los números 73, 74 y 75, respectivamente. El término "IFA" significa anticuerpo inmunofluorescente. Los resultados indicaron que el suero de los cerdos vacunados podría ser reconocido por el virus de la PED.
Las Figuras 6A-B son fotografías de transferencias Western que muestran que se detectaron los antígenos E2 de CSFV E2-gBac (Figura 6A) y S1 de PEDV S1-gBac (Figura 6B) de las muestras de células Sf9.
Las Figuras 6C-D son fotografías de transferencias Western que muestran que los antígenos de hPD-1-gBac en las muestras fueron reconocidos y detectados por el mAb anti-gp64 (panel izquierdo) y el anticuerpo PD-1 humano (panel derecho), respectivamente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que pretenden ser solo ilustrativos. Varias realizaciones de la invención se describen ahora en detalle.
Definiciones
Un vector es un vehículo utilizado para transferir material genético a una célula objetivo. Un vector viral es un virus modificado para suministrar material genético foráneo en una célula.
El término "transducción génica", "transducir" o "transducción" es un proceso mediante el cual se introduce un ADN foráneo en otra célula a través de un vector viral.
Una secuencia señal o péptido señal (a veces denominada secuencia señal, señal de direccionamiento, señal de localización, secuencia de localización, péptido de tránsito, secuencia líder o péptido líder) es un péptido corto (de 5 a 30 aminoácidos de longitud) presente en el extremo terminal N de la mayoría de las proteínas recién sintetizadas que están destinadas a la vía secretora. Estas proteínas incluyen aquellas que residen dentro de ciertos orgánulos (el retículo endoplásmico, golgi o los endosomas), secretadas por la célula o insertadas en la mayoría de las membranas celulares.
El término "B12D5" se refiere a un anticuerpo monoclonal contra gp64. B12D5 tiene un epítopo de unión de KKRPPTWRHNV (SEQ ID NO: 3) en 277-287 de gp64 (SEQ ID NO: 1), o HRVKKRPPTW (SEQ ID NO: 2) ubicado dentro de la región central de los residuos 271 a 292 (SEQ ID NO: 4) de gp64 (SEQ ID nO: 1). Véase Zhou et al., (2006) citado anteriormente; Wu et al., (2012) "A pH-Sensitive Heparin-Binding Sequence from Baculovirus gp64 Protein Is Important for Binding to Mammalian Cells but Not to Sf9 Insect Cells" Journal of Virology, Vol. 86 (1) 484­ 491.
La proteína 1 de muerte celular programada, también conocida como PD-1 y CD279 (grupo de diferenciación 279), es una proteína que en los humanos está codificada por el gen PDCD1. PD-1 es un receptor de superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y se expresa en células T y células pro-B. PD-1 une dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-1, que funciona como un punto de control inmunitario, desempeña un papel importante en la subregulación del sistema inmunitario al evitar la activación de las células T, lo que a su vez reduce la autoinmunidad y promueve la auto tolerancia. El efecto inhibidor de PD-1 se logra a través de un mecanismo dual de promoción de la apoptosis (muerte celular programada) en células T específicas de antígeno en los ganglios linfáticos mientras se reduce simultáneamente la apoptosis en las células T reguladoras (células T supresoras). Una nueva clase de medicamentos que bloquean la PD-1, los inhibidores de la PD-1, activan el sistema inmunitario para atacar tumores y, por lo tanto, se usan con un éxito variable para tratar algunos tipos de cáncer.
Un antígeno puede ser una proteína, polipéptido o péptido patógeno que es responsable de una enfermedad causada por el patógeno o es capaz de inducir una respuesta inmunológica en un huésped infectado por el patógeno, o antígeno asociado a tumor (TAA) que es un polipéptido expresado específicamente en células tumorales. El antígeno puede seleccionarse de un patógeno o células cancerosas que incluyen, entre otros, virus del papiloma humano (HPV), virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), virus de inmunodeficiencia humana-1 (HIV-1), virus del dengue, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis B (HBV), circovirus porcino 2 (PCV2), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV) ), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de la influenza, virus de la pseudorrabia, parvovirus, virus de la pseudorrabia, virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV), poxvirus, rotavirus, neumonía por micoplasma, virus del herpes, bronquitis infecciosa o virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de mama, melanoma, linfomas, carcinoma de colon, carcinoma hepatocelular y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la proteína E7 de1HPV (E7), la proteína del núcleo del HCV (núcleo del HCV), proteína X del HBV (HBx) se seleccionaron como antígenos para el desarrollo de la vacuna. El antígeno puede ser un antígeno de fusión de una fusión de dos o más antígenos seleccionados de una o más proteínas patógenas. Por ejemplo, un antígeno de fusión de fragmentos ORF6 y ORF5 del PRRSV, o una fusión de antígenos de patógenos del PRRSV y PCV2.
Como alternativa, un antígeno puede ser una proteína inhibidora del punto de control inmunitario, tal como PD-1, PD-L1, PD-L2 y CTLA-4, etc.
Los términos "proteína de punto de control inmunitario" y "punto de control inmunitario" son intercambiables. Los puntos de control inmunitarios afectan el funcionamiento del sistema inmunitario. Los puntos de control inmunitarios pueden ser estimulantes o inhibitorios. Los tumores pueden usar estos puntos de control para protegerse de los ataques del sistema inmunitario. La terapia de puntos de control puede bloquear los puntos de control inhibitorios, restaurando la función del sistema inmune. Una interacción ligando-receptor bajo investigación es la interacción entre la proteína de muerte celular programada transmembrana 1 (PDCD1, PD-1; también conocida como CD279) y su ligando, el ligando 1 de PD-1 (PD-L1, CD274). PD-L1 en la superficie celular se une a PD1 en una superficie celular inmune, lo que inhibe la actividad celular inmune. Entre las funciones de PD-L1 hay un papel regulador clave en las actividades de las células T. Parece que la sobrerregulación (mediada por el cáncer) de PD-L1 en la superficie celular puede inhibir las células T que de otro modo podrían atacar. Los anticuerpos que se unen a PD-1 o PD-L1 y, por lo tanto, bloquean la interacción pueden permitir que las células T ataquen el tumor. Ipilimumab es el primer anticuerpo de punto de control aprobado por la f Da . Bloquea el punto de control inmunitario inhibitorio de CTLA-4.
El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad efectiva de la proteína de fusión a un sujeto que lo necesita, que tiene cáncer o infección, o un síntoma o predisposición a dicha enfermedad, con el fin de curar, aliviar, mitigar, remediar, mejorar o prevenir la enfermedad, los síntomas o la predisposición hacia ella. Tal objetivo puede ser identificado por un profesional de la salud con base en los resultados de cualquier método de diagnóstico adecuado.
El término "una cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de un compuesto activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado. Las dosis efectivas variarán, como reconocen los expertos en la materia, dependiendo de la ruta de administración, el uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.
Ejemplos
Ejemplo 1
Construcción de vectores y generación de baculovirus recombinantes, partículas similares a virus y proteínas La Figura 1A muestra una plataforma gBac. Se puede obtener un gen foráneo (por ejemplo, genes enriquecidos optimizados del virus E2 de la peste porcina clásica (CSFV) del virus diarrea epidémica porcina (PEDV)) mediante síntesis por PCR y luego clonarse en un vector gBac a través de sitios de enzimas de restricción (por ejemplo, SacI/ Notl) utilizando el kit de clonación IN-FUSION® (Clontech). El vector gBac se deriva del vector de transferencia de baculovirus pBACPAK8MR (GENBANKMR número de acceso U02446). Usando la plataforma de presentación en superficie de gBac de la Figura 1A, un antígeno foráneo o genes foráneos pueden anclarse en la envoltura del virus y también expresarse en la fracción de la membrana de células de insecto (Figura 1B). La Figura 2A muestra un GP64 de longitud completa. La proteína de fusión de envoltura GP64 del baculovirus (EFP GP64) es la glicoproteína de fusión principal de la envoltura en algunos, aunque no en todos, los baculovirus. Se encuentra en la superficie de las células infectadas y de los viriones en gemación como un homotrímero. El baculovirus ingresa a sus células huésped por endocitosis, seguido de una fusión de la envoltura viral con la membrana endosómica inducida por un pH bajo, lo que permite la entrada viral al citoplasma celular. Esta fusión de membrana, y también la gemación eficiente de viriones de la célula infectada, depende de GP64.
Las Figuras. 2B-D muestran comparaciones de tres vectores, gBac (o Reber-gBac), antígeno-gp64 (o abreviado como "gp64" descrito en el documento US 7527967) y antígeno-Bac (o abreviado como "Bac" descrito en el documento TW 1368656). El vector gBac se construyó usando el péptido señal (SP) y una región del extremo terminal C de GP64, que es de los aminoácidos 327 a 512 de la SEQ ID NO: 1. El vector gp64 se construyó usando el SP y una región del extremo terminal C de GP64, que es de los aminoácidos 227 a 512 de la SEQ ID NO: 1. El vector Bac comprende el péptido señal (SP) de insecto, el TM (dominio transmembrana) y CTD (dominio de transducción citoplasmático) de GP64 y no comprende los aminoácidos del dominio extracelular GP64. El símbolo de triángulo antes del "SP" representa el promotor de polihedrina, que se encuentra en el sitio -1 del codón de inicio del gen de inserción.
Se generó un fragmento de ADN que codifica el SP y se amplificó por PCR con cebadores directo e inverso 5'-GAGCTCATGGTAAGC-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'-AGGCAGAATGCG-3' (SEQ ID NO: 20). respectivamente. La porción del extremo terminal C del gen gp64 (que codifica GP64 de aa 327 a aa 512 de la SEQ ID NO: 1) se generó y amplificó por PCR usando los cebadores directo e inverso 5'-GCGTGTCTGCTCA-3' (SEQ ID NO: 21) ) y 5-TTAATATTGTCTA-3' (SEQ ID NO: 22), respectivamente. La porción del extremo terminal C del gen gp64 (que codifica GP64 de aa 227 a aa 512 de la SEQ ID NO: 1) se generó y amplificó por PCR usando los cebadores directo e inverso 5'-ATCAACAAGCTAA-3' (SEQ ID NO: 23 ) y 5'-TTAATATTGTCTA-3' (SEQ ID NO: 24), respectivamente. Los genes foráneos anteriores se clonaron respectivamente en el vector de transferencia pBACPAK8MR.
Usando la plataforma gBac de 2B (o la Figura 1A), se generaron dos vectores de baculovirus: el vector de baculovirus E2-gBac de CSFV y el vector de baculovirus S1-gBac de PEDV (diseño de la Figura 2B). El primero transduce un gen que codifica la glicoproteína E2 de la envoltura del virus de la peste porcina clásica (CSFV), y el segundo transduce un gen que codifica la proteína S1 del virus de la diarrea epidémica porcina.
Para una comparación paralela, también se usaron los vectores de las Figuras 2C y 2D y generaron dos vectores de baculovirus separados: el vector de baculovirus E2-gp64 de CSFV (diseño de la Figura 2C) y el vector de baculovirus E2-Bac de CSFV (diseño de la Figura 2D) para transducir un gen foráneo que codifica el antígeno E2 de CSFV. Los genes de fusión en los vectores gBac, gp64 y Bac (diseños de las Figuras 2B-D, respectivamente) se secuenciaron para confirmar sus identidades. Los virus de baculovirus recombinantes que contienen el gen GP64 recombinante sin la cadena principal del vector de transferencia se generaron por recombinación homóloga. Los métodos para esta construcción y recombinación son bien conocidos en la técnica. Estos virus recombinantes se usaron para preparar antígenos. El gen GP64 modificado se insertó en un vector de transferencia de baculovirus bajo el promotor poliedro por PCR para formar el vector gBac. Debido a que el vector gBac tiene dos sitios de recombinación homólogos, el locus poliedro original del baculovirus de tipo silvestre se reemplaza por la secuencia de gBac cuando se cotransfecta con plásmido gBac y baculovirus de tipo silvestre.
Ejemplo 2
Expresión de proteínas y purificación de antígenos
Se usaron células Sf9 para propagación e infección de baculovirus recombinante. El baculovirus se propagó en líneas celulares Sf-9 Spodoptera frugiperda y se hizo crecer a 26 °C en un medio sin suero. Los baculovirus recombinantes se produjeron infectando células Sf-9 a una MOI de 5-10 y se recolectaron 3 días después de la infección. Para producir baculovirus a gran escala, las células pueden cultivarse e infectarse en biorreactores. La fracción de baculovirus se aisló del sobrenadante de cultivo de la célula infectada. Las partículas de baculovirus se recogieron por filtración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana adecuada de corte de proteína y una membrana estéril de 0,45 |jm.
Para probar la producción de los antígenos, los baculovirus parcialmente purificados o los lisados celulares infectados se sometieron a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 8-10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los antígenos foráneos se detectaron mediante mAb anti-gp64 de ratón (disponible a través de fuentes comerciales y utilizado a una dilución 1:5.000) como el anticuerpo primario. Los anticuerpos secundarios fueron mAb anti-conejo de cabra o anti-ratón de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (dilución 1: 5.000). Las bandas de proteínas se visualizaron con los reactivos de detección de transferencia Western ECL PLUSMR (GE Healthcare). En el sistema de presentación en superficie del baculovirus, los antígenos anteriores se pueden expresar primero en la membrana celular del insecto, luego el baculovirus incipiente toma parte de la membrana celular para formar su envoltura. Como resultado, los antígenos de presentación de baculovirus se pueden recolectar del lisado celular infectado (fracción de membrana) y la superficie del virus.
Ejemplo 3
Expresión de los antígenos por virus recombinantes
Antes de la inmunización con vacunas de gBac, para confirmar si la proteína de fusión E2-gBac de CSFV o S1-gBac e PEDV se presentaron con éxito en la envoltura de baculovirus, se recogieron baculovirus recombinantes por centrifugación y TFF. Los baculovirus recombinantes se resuspendieron en PBS a diferentes concentraciones de pfu /|jL. La incorporación de proteínas recombinantes en las partículas de baculovirus se analizó mediante transferencia Western usando mAb anti-gp64 (eBioscience). La proteína de fusión E2-gBac de CSFV se detectó con un peso molecular de aproximadamente 80 kDa y la proteína de fusión S1-gBac de PEDV se detectó con un peso molecular de 130 kDa.
Ejemplo 4
Preparación de la vacuna e inmunización
Los baculovirus recombinantes que presentan antígenos se mezclaron con adyuvante de agua en aceite en agua (w /o/w) (MONTANIDE ISA 206 vG. SEPPIC.) para la preparación de la vacuna. Los ratones BALB/c hembra de 4 semanas de edad, adquiridos a través del Centro Experimental Nacional de Animales, Taiwán, R.O.C., se dividieron en cuatro grupos con 5 ratones por grupo. Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea dos veces el día 0 y el día 14 (Figura 3) con 200 jL de una solución que contenía 107 pfu de baculovirus recombinante. El virus de E2-gBac, E2-gp64 y E2-Bac. (Figuras 2B-D), que contiene la glicoproteína E2 de la envoltura de CSFV, se inactivaron y se formularon como vacunas. Como controles negativos, se inyectó a los ratones baculovirus de tipo silvestre (107 pfu) o PBS. Las muestras de sangre se recogieron de la vena caudal en la semana 6. Se usó etilenimina binaria (BEl) para inactivar los baculovirus. Se preparó disolviendo el bromhidrato de 2-bromoetilamina (BEA) 0,1 M en NaOH 0,2 N a 37 °C durante 1 h. Para inactivar el baculovirus, se añadió el medio viral BEl 4 mM y se incubó el virus durante 16 horas a 37 °C. Después de la inactivación, se añadió tiosulfato de sodio (Na2S2O3) al medio a una concentración final de 10 veces la concentración final de BEl para detener la inactivación.
Ejemplo 5
Inmunogenicidad de antígenos producidos por virus recombinantes
Después de la inmunización, se analizaron los suero de ratones por la presencia de anticuerpos E2 anti-CSFV utilizando el kit de prueba de Ab de CSFV IDEXX (IDEXX) para detectar anticuerpos del virus de la peste porcina clásica (CSFV). El grado de anticuerpos específicos de E2 de CSFV en el suero se calculó como positivo cuando el porcentaje de bloqueo era superior al 40% (Figura 3). Los resultados indican que el vector de baculovirus presentó la proteína de fusión E2-Bac de CSFV. La Figura 3 muestra que el vector de baculovirus E2-gBac de CSFV, tanto si el baculovirus se inactivó como si no, indujo un título de anticuerpo E2 anti-CSFV mucho mayor que el vector de baculovirus E2-Bac de CSFV en ratones.
También se compararon los efectos de los tres vectores de baculovirus en la inducción de respuestas inmunogénicas en cerdos. Se inmunizaron tres cerdos SPF (sin patógenos específicos) dos veces (6 semanas y 9 semanas) por vía intramuscular con 108 pfu de vectores de baculovirus recombinantes E2-gBac, E2-gp64, E2-Bac y PBS, respectivamente. Después de la inmunización, los sueros de lechones se analizaron para detectar la presencia del anticuerpo E2 de CSFV usando el kit de prueba Ab CSFV de IDEXX (IDEXX). El grado de anticuerpos de neutralización específicos de E2 de CSFV en el suero se calculó como positivo y eficiente cuando el porcentaje de bloqueo fue superior al 43%.
Como se muestra en la Figura 4, los cerdos inmunizados con E2-gBac pudieron sobrevivir al desafío del CSFV. Indica que se había inducido un anticuerpo de neutralización competente en los cerdos (título SN >16, relación de bloqueo IDEXX > 43%). Esto prueba que la plataforma gBac es una plataforma de vacuna. La Figura 4 muestra que el vector de baculovirus E2-gBac de CSFV indujo un título de anticuerpo E2 anti-CSFV mucho mayor que los vectores de baculovirus E2-Bac de CSFV y E2-gp64 de CSFV en cerdos. Los resultados indican que la plataforma de presentación en superficie de gBac de la invención puede inducir una inmunidad más fuerte que los vectores de baculovirus de la técnica anterior.
También se ha generado un vector de baculovirus para transducir la proteína S1 del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV S1) en células para aplicaciones de vacunación. Se probaron sus efectos al inducir una respuesta inmunogénica. En resumen, tres cerdos SPF de 9 semanas de edad (marcados con los números 73, 74 y 75, respectivamente) se inmunizaron cada uno dos veces por vía intramuscular con 108 pfu del vector de baculovirus recombinante S1-gBac de PEDV o PBS. Después de la inmunización, los sueros de cerdos (de 1 a 4 semanas después de la vacunación) se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos anti-PEDV usando un ensayo ELISA de virus de PED. La Figura 5 muestra que el vector de baculovirus S1-gBac de PEDV indujo títulos de anticuerpos contra el virus de la diarrea epidémica porcina en los 3 cerdos.
Las Figs. 6A-B son fotografías de transferencias Western que muestran que se detectaron los antígenos E2 de E2-gBac de CSFV (Figura 6A) y S1 de S1-gBac de PEDV (Figura 6B) de las muestras de células Sf9. Los lisados celulares y el virus recogido se cargaron con diferentes números de células y títulos de virus. También se construyó la proteína de muerte celular programada humana del vector de baculovirus (hPD-1gBac) -gBac (hPD-1gBac). Para probar la producción del antígeno, los baculovirus recombinantes o los lisados celulares infectados se sometieron a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 8-10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los antígenos foráneos se detectaron mediante un mAb anti-gp64 de ratón (Figura 6C) y un anticuerpo anti-PDCD-1 (Figura 6D) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) como los anticuerpos primarios. Las bandas de proteínas se visualizaron con los reactivos de detección de transferencia Western Ec L PLUSmr (GE Healthcare). La Figura 6D muestra que el baculovirus que presentó el antígeno PD-1 humano en la envoltura, y el antígeno PD-1 presentado puede ser reconocido por el anticuerpo comercial anti-PDCD-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
En resumen, el vector de la invención es insensible a los reactivos de inactivación (Figura 3) y exhibe una mayor inmunogenicidad (Figura 4). La Tabla 1 muestra las secuencias de péptidos y las SEQ ID NOs.
Tabla 1
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Proteína o péptido Secuencia de aminoácidos* (SEQ ID NO:) Longitud de aa Precursor de MRAIFATLAVLASCAALVQS (SEQ ID NO: 11)
quitinasa Hormona MYKLTVFLMFIAF VIIAGAQSMASLTRQDLA (SEQ ID NO: 12)
Figure imgf000009_0001
adipocinética
E2 de CSFV MLRGQVVQGIIWLLLVTGAQGRLSCKEDHRYAISSTNEIGPLGA 363 (Glicoproteína E2 de la envoltura del EGLTTTWKEYNHGLQLDDGTVRAICIAGSFKVTALNVVSRRYL virus de la peste ASLHKRALPTSVTFELLFDGTSPAIEEMGDDFGFGLCPFDTTPVV porcina clásica (CSFV)) CSFV KGKYNTTLLN GS AF YLV CPIGWTG VIECT A V SPTTLRTE VVKTF
96TD KREKPFPHRYDCVTTIVEKEDLFYCKLGGNWTCVKGNPVTYTG
GQVRQCRWCGFDFKEPDGLPHYPIGKCILTNETGYRVVDSPDCN
RDG V VISTEGEHECL1GN TT V K V H ALDGRLAPMPCRPKEIV S S A
GPVRKTSCTFNYTKTLRNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDL
DVTDHHTDYFAEF (SEQ ID NO: 13)
Figure imgf000009_0002
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Proteína o péptido
Figure imgf000010_0001
Secuencia de aminoácidos* (SEQ ID NO:) Longitud de aa
M.y$AJ l- L) YLLAAAAMSAfAMLKUU V VQUii W L.LL V 1 UA
Figure imgf000010_0002
KEDHRYAISSTNMGPLGAEGLTTTWKEYNHGLQLDDGTVRAÍCI
AGSFKVTALNVVSRRYLASLBKR/UPTSVmEIJDGTSPAffiEM GDDFGFGLCPFDTTPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGViE CTAVSPITLRTEVVKTFíCRJiKPFPFIRVDCVITIVEKEDj.FYCKLG
Proteína B2-gBac GNWTCVKGNPVTYTGGQYRQCRWCGFDFKEPDGL.PHYPIGKCI
(SP-E2-GP64 mini- 569 TM/CTD) LTNETGYRVVDSPDCNRDGYrVIS1'EGEHECUGN'H'VK.VFIALDG RLAPMPCRPKE]VSSAGPVRKTSCTFNYTKTi:,RNK.YYEPRDSYF
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KDS VYKP A SG WSFIAOOKSNL FFT MENTKFGfíV G IS LSD ÍTS MAE
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un baculovirus recombinante que presenta en su envoltura una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión:
(i) un antígeno heterólogo; y
(ii) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 3 ubicada dentro de la región básica central de la proteína GP64;
en la que el antígeno heterólogo se encuentra en el extremo terminal N de la proteína de fusión que se presenta en la envoltura del baculovirus recombinante.
2. El baculovirus recombinante de la reivindicación 1, cuyo genoma comprende un transgén que codifica una proteína de fusión que comprende:
(a) un péptido señal;
(b) el antígeno heterólogo; y
(c) la región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus,
en la que el antígeno se encuentra en el extremo terminal C del péptido señal.
3. Un vector que comprende un transgén que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión: (a) un péptido señal situado en el extremo terminal N de la proteína de fusión;
(b) un antígeno; y
(c) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 3 ubicada dentro de la región básica central de la proteína GP64;
en la que el antígeno se encuentra en el extremo terminal C del péptido señal.
4. El vector de la reivindicación 3, que es un baculovirus recombinante.
5. Un baculovirus recombinante que presenta en su envoltura una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión:
(i) un antígeno heterólogo; y
(ii) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 ubicado dentro de la región básica central de la proteína GP64 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
en la que el antígeno heterólogo se encuentra en el extremo terminal N de la proteína de fusión que se presenta en la envoltura del baculovirus recombinante.
6. Un vector que comprende un transgén que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión: (a) un péptido señal situado en el extremo terminal N de la proteína de fusión;
(b) un antígeno; y
(c) una región del extremo terminal C de la proteína GP64 de la envoltura del baculovirus, que comprende al menos 100 residuos de aminoácidos de longitud y que carece de un epítopo de unión a B12D5 ubicado dentro de la región básica central de la proteína GP64 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
en la que el antígeno se encuentra en el extremo terminal C del péptido señal.
7. El baculovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que la región del extremo terminal C de la proteína GP64 comprende aminoácidos de 327 a 512 de la SEQ ID NO: 1.
8. El baculovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que la región del extremo terminal C de la proteína GP64 tiene un extremo terminal N que comienza entre los residuos de aminoácidos 292 y 328 de la SEQ ID NO: 1.
9. El baculovirus recombinante de la reivindicación 2, en el que el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
10. Una célula de insecto que comprende el baculovirus recombinante de la reivindicación 1.
11. El baculovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que el antígeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en una proteína patógena, una proteína de células cancerosas y una proteína de punto de control inmune.
12. El baculovirus recombinante de la reivindicación 11, en el que:
(i) el patógeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en virus del papiloma humano, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de inmunodeficiencia humana-1, virus del dengue, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, circovirus porcino 2, virus de la peste porcina clásica, virus de la fiebre aftosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la gastroenteritis transmisible, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la influenza, virus de la pseudorrabia, parvovirus, virus de la enfermedad vesicular porcina, poxvirus, rotavirus, neumonía por micoplasma, virus del herpes, bronquitis infecciosa y virus infecciosa de la enfermedad de la bursa;
(ii) el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de mama, melanoma, linfomas, carcinoma de colon, carcinoma hepatocelular y cualquier combinación de los mismos; y
(iii) el punto de control inmunitario es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2 y CTLA-4.
13. El baculovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que el antígeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en la glicoproteína E2 de la envoltura del virus de la peste porcina clásica, la proteína S1 del virus de la diarrea epidémica porcina, la proteína 1 de muerte celular programada y un antígeno asociado a un tumor.
14. El vector de la reivindicación 3, en el que el antígeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en una proteína patógena, una proteína de células cancerosas y una proteína de punto de control inmune.
15. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3 o 6 o un baculovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 5 para uso en el tratamiento para provocar una respuesta inmunogénica específica de antígeno en un sujeto que lo necesite.
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