ES2787902T3 - Vacunas contra FMDV vectorizadas con adenovirus recombinantes y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Composición o vacuna que comprende un vector viral recombinante que expresa un antígeno del virus de la fiebre aftosa (FMDV), en el que el antígeno de FMDV comprende un polipéptido que tiene la secuencia que se indica en la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia que se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas contra FMDV vectorizadas con adenovirus recombinantes y usos de las mismas

[0001] La presente invención se realizó con apoyo del Gobierno. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0002] Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos 62/288.540 presentada el 29 de enero 2016.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0003] La presente invención se refiere a composiciones para la lucha contra la infección por el virus de la fiebre aftosa (FMDV, por sus siglas en inglés) en animales. La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno de FMDV, procedimientos de vacunación contra FMDV y kits para usar con tales procedimientos y composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] La fiebre aftosa (FMD) es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a los animales de granja. Esta enfermedad es endémica en numerosos países del mundo, especialmente en África, Asia y América del Sur. Además, los brotes epidémicos pueden ocurrir periódicamente. La presencia de esta enfermedad en un país puede tener consecuencias económicas muy graves como resultado de la pérdida de productividad, pérdida de peso y producción de leche en rebaños infectados, y de embargos comerciales impuestos a estos países. Las medidas adoptadas contra esta enfermedad consisten en la aplicación estricta de restricciones a la importación, controles de higiene y cuarentena, sacrificio de animales enfermos y programas de vacunación utilizando vacunas, ya sea como medida preventiva a nivel nacional o regional, o periódicamente cuando se produce un brote epidémico.

[0005] La fiebre aftosa se caracteriza por su corto período de incubación, su naturaleza altamente contagiosa, la formación de úlceras en la boca y en los pies y, a veces, la muerte de animales jóvenes. La fiebre aftosa afecta a varias especies animales, en particular bovinos, porcinos, ovinos y caprinos. El agente responsable de esta enfermedad es un virus del ácido ribonucleico (ARN) que pertenece al género Aphthovirus de la familia Picornaviridae (Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). En la actualidad, se conocen al menos siete tipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV): los tipos europeos (A, O y C), los tipos africanos (SAT1, SAT2 y SAT3) y un tipo asiático (Asia 1). También se han distinguido numerosos subtipos (Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129).

[0006] El virus de la fiebre aftosa es un virus icosaédrico desnudo de aproximadamente 25 nm de diámetro, que contiene una molécula de ARN monocatenario que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF), que codifica una única poliproteína que contiene, entre otras cosas, el precursor de la cápside también conocido como proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino terminal. Durante el proceso de maduración, la proteína P1 se escinde por la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C, respectivamente; Belsham GJ, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína VP0 se divide entonces en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B, respectivamente). Se desconoce el mecanismo para la conversión de las proteínas VP0 en VP4 y VP2, y para la formación de viriones maduros. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26,000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeña con aproximadamente 8.000 Da.

[0007] La simple combinación de las proteínas de la cápside forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápside de FMDV. Este protómero se compleja a continuación en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión resulta de la encapsidación de una molécula de ARN genómico mediante el ensamblaje de doce pentámeros 12S, lo que constituye las partículas 146S. La cápside viral también se puede formar sin la presencia de una molécula de ARN en su interior (en lo sucesivo "cápside vacía"). La cápside vacía también se designa como partícula 70S. La formación de cápsides vacías puede ocurrir de forma natural durante la replicación viral o puede ser producida artificialmente mediante tratamiento químico.

[0008] Se han realizado algunos estudios sobre cápsides vacías naturales. En particular, Rowlands et al. (Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238) han demostrado que los viriones de la fiebre aftosa A10 comprenden principalmente las cuatro proteínas VP1, VP2, VP3 y VP4. En comparación, las cápsides vacías naturales (no obtenidas mediante recombinación, pero purificadas de cultivos del virus de la fiebre aftosa A10) contienen esencialmente la proteína no escindida VP0; Rweyemamu describe los mismos resultados con el virus de la fiebre aftosa A-Pando (Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79). Las cápsides vacías artificiales, obtenidas después de la diálisis en presencia de Tris-EDTA y después de la centrifugación, no contienen proteína VP4. Estas cápsides artificiales son ligeramente inmunogénicas según Rowlands et al., y las cápsidas vacías naturales solo son inmunogénicas después del tratamiento con formaldehído para estabilizarlas, mientras que la respuesta de anticuerpos inducida por las cápsides vacías naturales en cobaya es, sin embargo, inconstante, tal como señaló el autor. Además, Rowlands et al. y Rweyemamu et al. no están de acuerdo con la necesidad de estabilizar las cápsides vacías naturales. Para Rweyemamu et al., la ausencia de tratamiento con formaldehído no es perjudicial para el nivel de antigenicidad de las cápsides vacías naturales. La inmunogenicidad solo se prueba mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes en la cobaya.

[0009] La expresión del gen que codifica el precursor P1 de las proteínas de la cápside por medio de un baculovirus recombinante en células de insecto se compara con la expresión del gen que codifica P1 asociadq con la proteasa 3C en E. coli (Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829; Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572-6580). La coexpresión de P1 y 3C en E. coli da como resultado el ensamblaje de cápsidas vacías 70S. El producto de expresión de estas dos construcciones produce anticuerpos neutralizantes en cobayas y cerdos. Los títulos obtenidos con la construcción P1/baculovirus son bajos. Estos mismos productos de expresión inducen protección parcial en cerdos. Sin embargo, algunos cerdos protegidos contra la enfermedad no están protegidos contra la replicación del virus de estimulación. Sin embargo, el sistema de expresión de E. coli no miristila las proteínas y la proteasa 3C es tóxica para esta célula. Lewis et al. concluyen que las cuestiones fundamentales relacionadas con la composición del virus y la estructura de la cápside necesarias para obtener la máxima protección en el animal no han sido respondidas. Además, Grubman et al. declaran que sería necesario estabilizar las cápsides vacías antes de formular la vacuna; en este punto, están de acuerdo sobre los problemas encontrados con las cápsides vacías obtenidas por extracción de cultivos virales (ver anteriormente).

[0010] Las proteínas de fusión que contienen todas o algunas de proteína P1 también se han obtenido mediante el uso de vectores virales, a saber, un virus del herpes o virus vaccinia. El documento CA-A-2.047.585 en particular describe un virus del herpes bovino utilizado para producir proteínas de fusión que contienen una secuencia peptídica del virus de la fiebre aftosa (aminoácidos 141 a 158 de P1 unidos a los aminoácidos 200 a 213 de P1) fusionada con la glicoproteína gpIII de este virus del herpes bovino. El vector de adenovirus se ha usado para expresar la cápside del virus vacío de FMDV (documento US 8.323.663). Los vectores virales también se han utilizado para expresar la cápside vacía de FMDV estabilizada (US 7.531.182, USSN14/863,181). Recientemente, se han investigado células de plantas e insectos como fuente para la producción de antígenos de FMDV (US 2011/0236416, USSN14/863,181).

[0011] Se ha descrito que los anticuerpos derivados de la madre (MDA) son capaces de inhibir la respuesta de terneros (ganado menor de 2 años de edad) a la vacunación contra la fiebre aftosa (Graves, 1963, Journal of Immunology 91: 251-256; Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardization, 25: 117-122).

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0012] Se proporcionan composiciones o vacunas que comprenden vectores virales recombinantes que expresan el polipéptido de FMDV y fragmentos y variantes del mismo. Los antígenos y fragmentos de FMDV y sus variantes poseen propiedades inmunogénicas y protectoras. Los vectores virales recombinantes pueden ser vectores de adenovirus que expresan antígenos de FMDV.

[0013] Los vectores virales recombinantes se pueden formular en vacunas y/o composiciones farmacéuticas. Dichas vacunas o composiciones se pueden usar para vacunar a un animal y proporcionar protección contra cepas de FMDV homólogas y heterólogas. Las vacunas o composiciones formuladas con portadores, excipientes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente o veterinariamente aceptables ofrecen mejoras de termoestabilidad y capacidad para manejar variaciones de temperatura.

[0014] Se proporcionan procedimientos para una protección mejorada en animales convencionales y animales positivos para anticuerpos derivados de la madre (MDA-positivos) contra infecciones por FMDV. También se proporcionan kits que comprenden al menos un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo e instrucciones de uso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0015] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la descripción únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 representa una tabla que resume las secuencias de ADN y proteínas.

La figura 2 representa los genes para la cepa de FMDV A24 y los genes A24 (p1-2AB') utilizados en la construcción quimérica A24-A12.

La figura 3 representa los genes para la cepa de FMDV A12 y los genes A12 (3B '/ 3C) utilizados en la construcción quimérica A24-A12.

La figura 4 representa el ensayo de identidad estructural genética de la vacuna contra FMDV A24-A12 vectorizada con adenovirus recombinante mediante PCR.

La figura 5 representa la transferencia Western de la vacuna contra FMDV A24-A12 vectorizada con adenovirus recombinante.

La figura 6 representa los genes para la cepa de FMDV O1M utilizada en la vacuna contra FMDV O1M vectorizada con adenovirus recombinante.

La figura 7 representa los genes para la cepa de FMDV Irn utilizada en la vacuna contra FMDV Irn vectorizada con adenovirus recombinante.

La figura 8 representa los genes para la cepa de FMDV Asia utilizada en la vacuna contra FMDV Asia vectorizada con adenovirus recombinante.

La figura 9 representa el porcentaje de protección por la vacuna contra FMDV de serotipo O a diferentes dosis. La figura 10 representa la serología de la vacuna contra FMDV de serotipo O a diferentes dosis.

La figura 11 representa la actividad viricida de FMDV vectorizado con adenovirus recombinante adyuvantes a 25 °C.

La figura 12 representa la actividad viricida de FMDV vectorizados con adenovirus recombinante adyuvantes a 4 °C.

La figura 13 representa la media geométrica del título de FMDV VN.

La figura 14 representa la media geométrica del título SAV.

La figura 15 representa la media geométrica del título de FMDV VN.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0016] Se proporcionan composiciones o vacunas que comprenden vectores virales recombinantes que expresan antígenos de FMDV que provocan una respuesta inmunogénica en un animal. Los vectores virales recombinantes pueden ser vectores de adenovirus que expresan antígenos de FMDV. Los vectores virales recombinantes que expresan los antígenos pueden formularse en vacunas o composiciones farmacéuticas y usarse para provocar o estimular una respuesta protectora en un animal. En una realización, el antígeno polipeptídico es una proteína estructural de FMDV P1 (VP4-VP2-Vp3-VP1), una proteína no estructural P2 (2A, 2B y 2C) o una proteína no estructural P3 (3A, 3B, 3C y 3D) o fragmento activo o variante de las mismas.

[0017] Se reconoce que los polipéptidos antigénicos de la descripción pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos activos o variantes de los mismos. Por "fragmentos activos" o "variantes activas" se entiende que los fragmentos o variantes retienen la naturaleza antigénica del polipéptido. Por lo tanto, la presente descripción abarca cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV que provoque una respuesta inmunogénica en un animal. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento o variante de los mismos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como un ovino, bovino, caprino o porcino.

[0018] La simple combinación de las proteínas de la cápside forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápside de FMDV. Este protómero se compleja a continuación en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión resulta de la encapsidación de una molécula de ARN genómica mediante el ensamblaje de doce pentámeros 12S, constituyendo así las partículas 146S. La cápside viral también se puede formar sin la presencia de una molécula de ARN en su interior (en adelante "cápside vacía"). La cápside vacía también se designa como partícula 70S. La formación de cápsides vacías puede tener lugar de forma natural durante la replicación viral o puede ser producida artificialmente mediante tratamiento químico.

[0019] La presente descripción se refiere a vacunas o composiciones para especies bovina, ovina, caprina o porcina que pueden comprender una cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante o un vector viral recombinante que expresa el antígeno de FMDV, y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0020] En algunas realizaciones, las vacunas comprenden, además, adyuvantes, tales como emulsiones de aceiteen-agua (O/W) descritas en la patente US 7.371.395.

[0021] En otras realizaciones más, los adyuvantes incluyen emulsiones TS6, TS7, TS8 y TS9, emulsiones LR3, LR4 y LR6, emulsión LF2, adyuvante CARBIGEN™, adyuvante ENABL®, ácido poliacrílico, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, saponina, CpG, emulsión de agua en aceite y emulsión de aceite en agua, o combinaciones de los mismos.

[0022] En algunas realizaciones, la respuesta en el animal es una respuesta inmunitaria protectora.

[0023] Por "animal" se entienden mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado, vaca), porcino (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, mono), y pescado. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo etapas embrionaria y fetal.

[0024] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0025] Los polipéptidos antigénicos de la descripción son capaces de proteger contra FMDV. Es decir, son capaces de estimular una respuesta inmunitaria en un animal. Por "antígeno" o "inmunógeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

[0026] El término "proteína, polipéptido o péptido inmunogénico", como se usa en el presente documento incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administra al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. En realizaciones, el fragmento de proteína tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína según la descripción puede comprender o consistir esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier técnica de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.708.871; Geysen et al., 1984, PNAS, USA 81(13): 3998-400; Geysen et al., 1985, PNAS USA, 82(1): 178-82. De manera similar, los epítopos conformacionales son fácilmente identificados mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen en el documento PCT/US2004/022605.

[0027] Como se describe en el presente documento, la descripción abarca fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "protéina, polipéptido o péptido inmunogénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, algunas sustituciones serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

[0028] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0029] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará tanto una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, tal que la resistencia a una nueva infección se verá aumentada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas y/o signos clínicos de la enfermedad normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.

[0030] Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Los fragmentos inmunogénicos para los fines de la descripción incluirán generalmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 5 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos, o aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No existe un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprenda al menos un epítopo de la proteína.

[0031] Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es que comprende o consiste esencialmente o consiste en nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antigénico de un polipéptido de FMDV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido de FMDV puede comprender o consistir esencialmente en un mínimo de 15 nucleótidos, aproximadamente 30-45 nucleótidos, aproximadamente 45­ 75, o al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipéptido.

[0032] El término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son los agentes de bloqueo, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivados de un microorganismo.

[0033] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0034] La descripción comprende además una hebra complementaria a un polinucleótido que codifica un antígeno epítopo o inmunógeno de FMDV. La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación.

[0035] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "polipéptido fragmento" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede ser interrumpido por restos químicos distintos de los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.

[0036] Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce naturalmente el componente, por ejemplo, otro de ADN y ARN, proteínas y orgánulos cromosómicos y extracromosómicos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por tecnología recombinante, así como síntesis química.

[0037] El término "purificado" como se usa en el presente documento no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido purificado es una en la que el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido está en su medio natural. En algunos casos, el polipéptido se separa de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" se entiende el polipéptido representa, en varias realizaciones, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, o más de los componentes o materiales celulares se han eliminado. Del mismo modo, un polipéptido puede estar parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entiende que se elimina menos del 60% de los componentes o materiales celulares. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en este documento se pueden purificar por cualquiera de los medios conocidos en la técnica.

[0038] Como se señaló anteriormente, los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes de los mismos son polipéptidos antigénicos de FMDV que son producidos por un vector viral in vivo. La presente descripción también abarca los fragmentos y variantes de los polinucleótidos y polipéptidos descritos codificados por los mismos. Por "fragmento" se entiende una porción del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos antigénica codificada por el mismo. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y, por lo tanto, tienen actividad inmunogénica como se indica en otra parte del presente documento. Los fragmentos de la secuencia de polipéptidos conservan la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal.

[0039] "Variantes" pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se usa en el presente documento, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. Las variantes de un polinucleótido particular de la descripción (por ejemplo, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. La proteína "variante" pretende significar una proteína derivada de la proteína nativa por deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las proteínas variantes abarcadas por la presente descripción son biológicamente activas, es decir, tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria.

[0040] En un aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos de FMDV de aislados de FMDV de ovino, bovino, caprino o porcino. En otro aspecto, la presente descripción proporciona un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, y una variante o fragmento de la misma.

[0041] Además, homólogos de polipéptidos de FMDV de especie ovina, bovina, caprina, o porcina pretenden estar dentro del alcance de la presente descripción. Como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o funciones similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos generalmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, los ortólogos y los parálogos de un polipéptido de FMDV de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido de FMDV de tipo salvaje por modificaciones postraduccionales, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. En particular, los homólogos de la descripción exhibirán generalmente al menos 80-85%, 85-90%, 90-95% o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con toda o parte de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos de FMDV de tipo salvaje, y exhibirán una función similar. Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Dichas variaciones alélicas naturales típicamente pueden dar como resultado una variación de 1 a 5% en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse secuenciando la secuencia de ácido nucleico de interés en varias especies diferentes, que puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético genético en esas especies. Se pretende que cualquiera y todas estas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos de aminoácidos resultantes o variaciones que sean el resultado de una variación alélica natural y que no alteren la actividad funcional del gen de interés, estén dentro del alcance de la descripción.

[0042] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservativas de aminoácidos u otras modificaciones menores, tales que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido de FMDV que pueden dar lugar a péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento.

[0043] El término "variación conservativa" indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, tal como se describe anteriormente.

[0044] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Tal como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos de FMDV, la secuencia de ADN del gen de proteína de FMDV se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos con el hallado sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, la poliadenilación inapropiada, la degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. Se puede lograr una mayor expresión de la proteína de FMDV en dichas especies utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen en la descripción siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de FMDV codificada por la secuencia de nucleótidos no cambie funcionalmente.

[0045] La identidad de secuencia entre dos secuencias de amino ácido puede ser establecida por el “blast” por pares y la matriz blosum62 de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) utilizando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el "Centro Nacional de Información Biotecnológica "(NCBI, Bethesda, Maryland, EE. UU.).

[0046] La "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en la que la alineación de las dos secuencias puede determinarse de de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 80, pp726-730). La identidad de secuencia o la similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la descripción y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0047] Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferente "rigurosidad". Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", cuarta edición (Sambrook et al., 2014).

[0048] La descripción abarca además los polinucleótidos de FMDV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y unidos operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0049] Un "vector" se refiere a un plásmido de ADN o ARN recombinante o virus que comprende un polinucleótido heterólogo para ser liberado a una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para fines de prevención o terapia, y opcionalmente puede estar en forma de un casete de expresión. Como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replicarse en la célula o sujeto diana final. El término incluye vectores de clonación y vectores virales.

[0050] El término "recombinante" significa un polinucleótido semisintético, o de origen sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

[0051] "Heterólogos" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia de codificación nativa y unido operativamente a una secuencia de codificación distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0052] La presente descripción se refiere a vacunas o composiciones farmacéuticas o inmunológicas para especies ovina, bovina, caprina y porcina que pueden comprender una cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante y un portador, adyuvante, excipiente, o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0053] La materia objeto descrita en este documento está dirigida en parte, a composiciones y procedimientos relacionados con el antígeno de FMDV preparado en un sistema de expresión de baculovirus/células de insecto que es altamente inmunogénico y protege a los animales contra la estimulación de cepas de FMDV homologas y

heterólogas.

Composiciones

[0054] La presente descripción se refiere a vacunas o composiciones contra FMDV que pueden comprender una

cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica

o veterinariamente aceptable. En una realización, la vacuna o composición contra FMDV comprende un vector viral

recombinante que expresa antígenos de FMDV.

[0055] Una realización de la descripción se refiere a una vacuna o composición que comprende un vector viral que

expresa antígenos de FMDV. Los antígenos de FMDV se obtienen por expresión del ADNc de las regiones P1 (VP4-VP2-VP3-VP1), 2A/2B'/3B' y 3C, o P1 (VP4-VP2-VP3-VP1), 2A/2B/2C y 3A/3B/3C/3D. La región estructural P1 y las

regiones no estructurales P2 o P3 pueden derivar del mismo serotipo de FMDV o serotipo diferente (antígenos

quiméricos).

[0056] La presente descripción abarca cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV que provoca

una respuesta inmunogénica en un animal, tal como un animal ovino, bovino, caprino o porcino. El polipéptido,

antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de

FMDV, tal como, entre otros, una proteína, péptido o fragmento del mismo, que provoca, induce o estimula una

respuesta en un animal, tal como un animal ovino, bovino, caprino o porcino.

[0057] En una realización en la que la composición inmunológica o vacuna contra FMDV es una composición

inmunológica o vacuna recombinante, la composición o vacuna comprende un vector recombinante y un excipiente,

portador, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable; el vector recombinante es un vector de

expresión de baculovirus que puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epítopo o

inmunógeno de FMDV. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser VP1, VP2, VP3, VP4,

2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C o 3D, o cualquier combinación de los mismos.

[0058] En una realización, los polipéptidos P1 (VP4-VP2-VP3-VP1) 2A/2B parcial/3B parcial y 3C se pueden

expresar en un vector viral y la expresión puede ser regulada por una o más secuencias promotoras. En otra

realización, el antígeno de FMDV puede ser un antígeno quimérico que comprende P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A-2B

parcial del serotipo A24 de FMDV y 3B parcial del serotipo A12 de FMDV y antígeno 3C del serotipo A24 de

FMDV. En otra realización más, el antígeno de FMDV puede ser P1 (VP4-VP2-VP3-VP1) -2A-2B-2C parcial-3a

parcial-3B-3C.

[0059] En otra realización, el antígeno de FMDV puede derivarse de O1 Manisa, O1 BFS o Campos, A24 Cruzeiro,

A l2, Asia 1 Shamir, A Iran'96, Asia/IRN/05, A22 Iraq, SAT2 Arabia Saudita de FMDV.

[0060] La presente descripción se refiere a una vacuna contra FMDV que puede comprender una cantidad eficaz de

un antígeno de FMDV recombinante o un vector viral recombinante que expresa un antígeno de FMDV, y un

portador, excipiente, adyuvante, o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0061] En otra realización, el portador, excipiente, adyuvante, o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable

puede ser una emulsión de agua-en-aceite. En otra realización más, el portador, excipiente, adyuvante, o vehículo

farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de aceite en agua.

[0062] La descripción abarca además los polinucleótidos de FMDV contenidos en una molécula de vector o un

vector de expresión y unido operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0063] En un aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos de FMDV, particularmente polipéptidos

ovinos, bovinos, caprinos o porcinos que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8, y

variantes o fragmentos de las mismas.

[0064] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%,

al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con

un polipéptido antigénico de la descripción, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se

establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.

[0065] En otro aspecto más, la presente descripción proporciona fragmentos y variantes de los polipéptidos de

FMDV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 2, 4, 6, o 8), que fácilmente se puede preparar por un experto en la

técnica usando técnicas de biología molecular.

[0066] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos como la expuesta en SEQ

ID NO: 2, 4, 6 u 8.

[0067] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido de FMDV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 amino ácidos, por lo menos 23 aminoácidos, al menos 25 amino ácidos, o al menos 30 amino ácidos de un polipéptido de FMDV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o variantes de las mismas. En otra realización, un fragmento de un polipéptido de FMDV incluye un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido de FMDV de longitud completa.

[0068] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de FMDV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8. En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o una variante conservativa, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez consecutivos aminoácidos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.

[0069] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone conjunto en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, o 7, o una variante del mismo. En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7, o una variante del mismo.

[0070] Los polinucleótidos de la descripción pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o uno diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier construcción que sea deseable para proporcionar realizaciones de esta descripción.

[0071] Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV están ventajosamente presentes en un vector de la invención. De manera mínima, comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un codón de iniciación (ATG), un codón de parada y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores, tales como plásmidos y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos de los poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, por ejemplo, un péptido de FMDV, ventajosamente, en el vector, se coloca un ATG en 5' del marco de lectura y se coloca un codón de parada en 3'. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizadoras, tales como secuencias de intrones y señales que permiten la secreción de la proteína.

[0072] La presente descripción también se refiere a preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, por ejemplo, composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden y expresan uno o más polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de FMDV. En una realización, el vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleótido que codifica (y ventajosamente expresa) un antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, en un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Por lo tanto, de acuerdo con una realización de la descripción, el otro vector o vectores en la preparación comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleótido que codifica, y en circunstancias apropiadas, el vector expresa una o más proteínas adicionales de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, o un fragmento del mismo.

[0073] De acuerdo con otra realización, el vector o vectores en la preparación comprenden o consisten esencialmente en, o consisten en polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmento o fragmentos de las mismas de un polipéptido de, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, el vector o los vectores que expresan los polinucleótidos. En otra realización, la preparación comprende uno, dos o más vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan, ventajosamente in vivo, un polipéptido, antígeno, proteína de fusión de FMDV o un epítopo del mismo. La descripción también se dirige a mezclas de vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan diferentes polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de FMDV, por ejemplo, un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV de diferentes especies animales tales como, pero no limitado a, animales ovinos, bovinos, caprinos o porcinos.

[0074] De acuerdo con una realización adicional de la descripción, el vector de expresión es un vector plásmido o un vector de plásmido de ADN, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo específico, no limitativo, el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL, Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7 (10): 1205-17; véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos: 5.846.946 y 6.451.769) se pueden utilizar como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 deriva de pVR1012 y contiene la secuencia señal de tPA humana. En una realización, la señal de tPA humana comprende desde el aminoácido M (1) hasta el aminoácido S (23) en Genbank con el número de acceso HUMTPA14. En otro ejemplo específico, no limitante, el plásmido utilizado como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos puede contener la secuencia del péptido señal de IGF1 equino del aminoácido M (24) al aminoácido A (48) en Genbank bajo la accesión número U28070. Se puede consultar o empelar información adicional sobre los plásmidos de ADN en la práctica, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473; y 6.221.362.

[0075] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido según la decripción y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseados; y, en este sentido, se observa que un plásmido circular superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, se pretende que estén dentro del alcance de la descripción.

[0076] Un plásmido puede comprender o contener o consistir esencialmente en, además del polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, opcionalmente fusionado con una secuencia, variante, análogo o fragmento de péptido heterólogo, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. El promotor fuerte puede ser, entre otros, el promotor inmediato inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente que tiene otro origen, tal como la rata o el conejillo de indias, el Super promotor (Ni, M. et al.., Plant J. 7, 661-676, 1995.). El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real, que puede o no estar asociada con la parte potenciadora. Se puede hacer referencia a EP-A-260 148, EP-A-323 597, Patentes de Estados Unidos: 5,168,062, 5,385,839 y 4,968,615, así como a la Solicitud PCT No WO87/03905. En realizaciones, el promotor CMV-IE es un CMV-IE humano (Boshart et al., 1985, Cell, 41 (2): 521-30) o CMV-IE murino.

[0077] En términos más generales, el promotor tiene un origen viral, vegetal o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto del CMV-IE que puede emplearse de forma útil en la práctica de la descripción es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse de forma útil en la práctica de la descripción es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18(22): 2337-44), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989, Gene, 79(2): 269-77).

[0078] Los plásmidos pueden comprender otros elementos de control de expresión. Es particularmente ventajoso incorporar secuencia(s) estabilizadora(s), por ejemplo, secuencias de intrones, por ejemplo, intrón de deshidrogenasa de alcohol de maíz (Callis et al. Genes & Dev.1 (10): 1183-1200, diciembre de 1987), el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud PCT No. WO1989/01036), el intrón II del gen de la p-globina de conejo (van Ooyen et al., 1979, Science, 206 (4416): 337-44). En otra realización, los plásmidos pueden comprender 3' UTR. 3' UTR puede ser, pero no limitado a, 3' UTR de agrobacterium nopalina sintasa (Nos) (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12 (22): 8711-8721).

[0079] En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede usarse la señal poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal poli(A) del gen de beta-globina de conejo o la señal poli(A) del virus SV40.

[0080] Una "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma.

[0081] En una realización, el antígeno de FMDV recombinante se expresa en células de insecto.

Procedimientos de uso

[0082] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a un procedimiento de vacunación de un animal ovino, bovino, caprino, o porcina que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino, o porcino una cantidad eficaz de una vacuna que puede comprender una vector viral recombinante que expresa un antígeno de FMDV y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0083] En una realización de la presente descripción, el procedimiento comprende una única administración de una composición de vacuna formulada con una emulsión según la descripción. Por ejemplo, en una realización, la composición inmunológica o de vacuna comprende un vector viral recombinante que expresa un antígeno de FMDV.

[0084] En otra realización de la presente descripción, el procedimiento comprende una única administración de dos composiciones de vacunas heterólogas. Las vacunas o composiciones heterólogas pueden ser diferentes tipos de vacunas, tales como la vacuna VLP de FMDV o las vacunas de vector viral de FMDV. Las vacunas heterólogas también pueden ser el mismo tipo de vacunas que expresan las cápsides de diferentes serotipos de FMDV, tales como las cepas A24, A12, O1 Manisa, Asia o Iraq.

[0085] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a un procedimiento de vacunación de un animal ovino, bovino, caprino, o porcino que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino, o porcino una vacuna que comprende un vector viral recombinante que expresa un antígeno de FMDV in vivo.

[0086] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino, o porcino una vacuna que comprende un vector viral recombinante que expresa un antígeno de FMDV in vivo.

[0087] Ambas cepas de FMDV homólogas y heterólogas se utilizan para la estimulación para probar la eficacia de la vacuna. La administración puede ser subcutánea o intramuscular. La administración puede estar libre de agujas (por ejemplo, Pigjet o Bioject).

[0088] En una realización de la descripción, puede emplearse un régimen de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración de sensibilización es de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo. Sin embargo, se observa que se puede usar la misma composición como administración de sensibilización y el refuerzo. Este protocolo de administración se llama "sensibilización-refuerzo".

[0089] Una sensibilización-refuerzo de acuerdo con la presente descripción puede incluir un vector viral recombinante que se utiliza para expresar una secuencia de codificación de FMDV o fragmentos de la misma que codifica un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo. Específicamente, el vector viral puede expresar un gen de FMD^v o fragmento del mismo que codifica un polipéptido antigénico. El vector viral contemplado en el presente documento incluye, pero no se limita a, poxvirus [por ejemplo, virus vaccinia o virus vaccinia atenuado, virus avipox o virus avipox atenuado (por ejemplo, viruela canaria, viruela aviar, viruela paloma, viruela de pichón, viruela de codorniz, ALVAC, TROVAC; ver, por ejemplo, patentes de Estados Unidos: 5,505,941 y 5,494,807), virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.], adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), virus del herpes (por ejemplo, Virus del herpes canino, virus del herpes del pavo, virus de la enfermedad de Marek, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus del herpes felino, virus de la laringototitis (ILTV), virus del herpes bovino, virus del herpes porcino), baculovirus, retrovirus, etc. En otra realización, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de viruela canaria, tal como ALVAC. En otra realización más, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de viruela aviar, tal como, TROVAC. El antígeno de FMDV de la descripción que se va a expresar se inserta bajo el control de un promotor específico de poxvirus, por ejemplo, el promotor de entomopoxvirus 42K de Amsacta moorei (Barcena, Lorenzo et al., 2000, J Gen Virol., 81 (4): 1073- 85), el promotor de vaccinia 7,5 kDa (Cochran et al., 1985, J Virol, 54 (1): 30-7), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al., 1992, J Virol, 66 (6): 3424 -34), el promotor de vaccinia HA (Shida, 1986, Virology, 150 (2): 451-62), el promotor de viruela ATI (Funahashi et al., 1988, J Gen Virol, 69 (1): 35-47), el promotor de vaccinia H6 (Taylor et al., 1988, Vaccine, 6 (6): 504-8; Guo et al., 1989, J Virol, 63 (10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol, 63 (9): 3829-36.), entre otros.

[0090] En otra realización, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de viruela del canario, tal como, ALVAC. El antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser FMDV P1-3C. El vector viral de FMDV puede ser un virus de la viruela del canario como vCP2186, vCP2181 o vCP2176, o un virus de la viruela aviar como vFP2215 (véase la Patente de Estados Unidos 7.527.960). En otra realización más, el antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede producirse en lenteja de agua (solicitud de patente publicada de Estados Unidos 2011/0236416).

[0091] En otro aspecto del protocolo de sensibilización-refuerzo de la descripción, una composición que comprende el antígeno de FMDV de la descripción se administra seguido de la administración de la vacuna o la composición que comprende una vacuna de subunidades que comprende VLP de FMDV expresada por baculovirus en células de insecto (véase USSN14/863,181), o una vacuna o composición viral inactivada que comprende el antígeno de FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa el antígeno de FMDV. Asimismo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una vacuna o composición que comprende una vacuna de subunidades que comprende VLP de FMDV expresadas por baculovirus en células de insecto, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno de FMDV, seguido de la administración de una composición que comprende el antígeno de FMDV de la descripción. Se observa además que tanto la administración primaria como la secundaria pueden comprender la composición que comprende el antígeno de FMDV de la descripción.

[0092] Un protocolo de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración de sensibilización puede ser de naturaleza diferente de las utilizadas como una vacuna de refuerzo posterior. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0093] El volumen de dosis de composiciones de las especies diana que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de composiciones para animales ovinos, bovinos, caprinos o porcinos, basados en vectores virales, por ejemplo, composiciones basadas en vectores virales no poxvirus, es generalmente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5,0 ml, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 3,0 ml y entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 2,5 ml.

[0094] La eficacia de las vacunas puede ser probada alrededor de 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante estimulación de los animales, tales como ovinos, bovinos, caprinos o porcinos, con una cepa virulenta de FMDV, tal como el cepas O1 Manisa, O1 BFS o Campos, A24 Cruzeiro, A12, Asia 1 Shamir, A Irán '96, Asia/IRN/05, A22 Iraq, SAT2 Arabia Saudita de FMDV.

[0095] Todavía otras cepas pueden incluir cepas de FMDV A10-61, A5, A12, A24/Cruzeiro, C3/Indaial, O1, C1-Santa Pau, C1-C5, A22/550/Azerbaiyán/65, SAT1-SAT3, A , A/TNC/71/94, A/IND/2/68, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/25/81, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/57/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05 , A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/Asia/1, A/IRN/05, Asia/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, Asia 1/HNK/CHA/05 (número de acceso GenBank EF149010, incorporado aquí como referencia), Asia I/XJ (Li, ZhiYong et al. Chin Sci Bull, 2007), HK/70 (Chin Sci Bull, 2006, 51 (17): 2072-2078), O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001 , O/ES/2001, HKN/2002, O5India, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KE N/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/Holanda, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IND210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/India/17/77.

[0096] Otros detalles de estas cepas de FMDV se pueden encontrar en las páginas web de European Bioinformatics Information (EMBL-EBI), y todas las secuencias de nucleótidos asociadas se incorporan aquí por referencia. Los inventores contemplan que todas las cepas de FMDV, ambas enumeradas aquí, y aquellas aún por identificar, podrían expresarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente descripción para producir, por ejemplo, composiciones de vacuna eficaces. Tanto las cepas homólogas como las heterólogas se usan como estimulación para evaluar la eficacia de las vacunas. El animal puede ser estimulado por vía intradérmica, subcutánea, pulverización, intranasal, intraocular, intratraqueal y/u oral.

[0097] Las administraciones de sensibilización-refuerzo pueden llevarse a cabo ventajosamente de 1 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, aproximadamente 3 semanas de diferencia. De acuerdo con una realización, también se prevé un refuerzo semestral o un refuerzo anual, que utiliza ventajosamente la vacuna viral basada en vectores. Los animales tienen ventajosamente al menos 6 a 8 semanas de edad o aproximadamente 6 meses de edad en el momento de la primera administración.

[0098] Las composiciones que comprenden los polipéptidos antigénicos recombinantes de la descripción utilizados en los protocolos de sensibilización-refuerzo están contenidos en un vehículo, diluyente, adyuvante o excipiente farmacéutico o veterinariamente aceptable. Los protocolos de la descripción protegen al animal del FMDV ovino, bovino, caprino o porcino y/o evitan la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

[0099] Se debe entender por un experto en la técnica que la presente descripción se proporciona a modo de ejemplo y la presente descripción no se limita a los mismos. A partir de la descripción en el presente documento y del conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar el número de administraciones, la ruta de administración y las dosis que se utilizarán para cada protocolo de inyección, sin ninguna experimentación indebida.

[0100] La presente descripción contempla al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica fabricada de acuerdo con la descripción. El animal puede ser macho, hembra, hembra preñada y recién nacido. Esta administración puede realizarse a través de varias vías, que incluyen, entre otras, inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal u oral. La composición terapéutica según la descripción también puede administrarse mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE. UU.), Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE. U^u .)). Otro enfoque para administrar composiciones de plásmidos es usar electroporación (véase, por ejemplo, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; Solicitud PCT No. WO99/01158). En otra realización, la composición terapéutica se administra al animal mediante pistola genética o bombardeo con partículas de oro.

[0101] En una realización, la descripción proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y expresión de un antígeno o epítopo de FMDV en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente efectiva es una experimentación de rutina para un experto en la materia. En una realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un antígeno o epítopo de FMDV y un portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, el portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección u otros medios de transferencia de polinucleótidos a un animal huésped y/o mejora la conservación del vector o proteína en un huésped.

[0102] En una realización, la materia aquí descrita proporciona un procedimiento de detección para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA).

[0103] Se describe en el presente documento que el uso de la vacuna o composición de la presente descripción permite la detección de infección por FMDV en un animal. Se describe en el presente documento que el uso de la vacuna o composición de la presente descripción permite la detección de la infección en animales mediante la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA). Los procedimientos se describen en el presente documento para diagnosticar la infección por FMDV en un animal usando una proteína no estructural de FMDV (por ejemplo, un ELISA específico de 3ABC o 3d de FMDV).

Artículo de fabricación

[0104] En una realización, la materia aquí descrita se dirige a un kit para realizar un procedimiento para provocar o inducir una respuesta inmunitaria que puede comprender cualquiera de las composiciones o vacunas inmunológicas recombinantes contra FMDV, o composiciones o vacunas inmunológicas contra FMDV inactivadas, composiciones virales o vacunas contra FMDV recombinantes e instrucciones para realizar el procedimiento.

[0105] Otra realización de la descripción es un kit para realizar un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra FMDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno de FMDV de la descripción y una composición inmunológica o vacuna viral contra FMDV recombinante, e instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0106] Otra realización de la descripción es un kit para realizar un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra FMDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno de FMDV de la descripción y una composición inmunológica o vacuna contra FMDV inactivada, y las instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0107] Otro aspecto más de la presente descripción se refiere a un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo de acuerdo con la presente descripción, tal como se describe anteriormente. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente descripción, y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de refuerzo según la presente descripción. El kit puede contener primeros o segundos viales adicionales para vacunas de sensibilización adicionales o vacunas de refuerzo adicionales.

[0108] En una realización, se describe una composición que comprende un antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, se describe una composición que comprende un vector viral recombinante que expresa antígenos de FMDV y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, la composición descrita anteriormente en la que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo comprende un fragmento inmunogénico que comprende al menos 15 aminoácidos de un antígeno de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo está parcialmente purificado. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo está sustancialmente purificado.

[0109] En una realización, se describen las composiciones anteriores en la que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo es un polipéptido de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el polipéptido de FMDV es un polipéptido P1, polipéptido VP0, polipéptido VP1, polipéptido VP3, polipéptido VP2, polipéptido VP4, polipéptido 2A, polipéptido 2B, polipéptido 2C, polipéptido 3A, polipéptido 3B, polipéptido 3C, o polipéptido 3D. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV está codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable es una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua. En otra realización, se describe un procedimiento para vacunar un animal susceptible a FMDV ovino, bovino, caprino o porcino que comprende administrar las composiciones anteriores al animal. En una realización, se describe un procedimiento para vacunar a un animal susceptible a FMDV ovino, bovino, caprino o porcino que comprende un régimen de sensibilización-refuerzo. En una realización, se describe un polipéptido antigénico sustancialmente purificado expresado en células de insecto, en el que el polipéptido comprende: una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, o 8. En cualquier realización, el animal es preferiblemente un animal ovino, un bovino, un porcino o un caprino. En una realización, se describe un procedimiento para diagnosticar una infección por FMDV en un animal. En otra realización más, se describe un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo que comprende al menos dos viales, en el que un primer vial contiene la composición que comprende un antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo, y un segundo vial que contiene un vector viral recombinante que contiene o expresa el antígeno de FMDV.

[0110] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden utilizar para los procedimientos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. Los portadores o vehículos o adyuvantes o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y volúmenes de dosis se describen en el presente documento en la descripción general y también se pueden determinar por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0111] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:

en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo DOPE.

[0112] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N, N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

[0113] Ventajosamente, la mezcla de plásmido con el adyuvante se forma de manera extemporánea y ventajosamente simultáneamente con la administración de la preparación o poco antes de la administración de la preparación; por ejemplo, poco antes o antes de la administración, se forma la mezcla de plásmido-adyuvante, ventajosamente para dar tiempo suficiente antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0114] Cuando DOPE está presente, la relación molar de DMRIE:DOPE es de aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, más ventajosamente de aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.

[0115] La relación en peso de adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE:plásmido puede ser de entre aproximadamente 50:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y de aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.

[0116] En otra realización, el portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuados incluyen emulsiones de agua-en-aceite vacunales de base aceite que son estables y fluidas a 4°C que contienen: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene antígeno, preferiblemente de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de una fase aceite que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral, tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ácido graso, un poliol o ésteres de alcohol), de 0,2 a 20% p/v de tensioactivos, preferiblemente de 3 a 8% p/v, estando el último en total o en parte, o en una mezcla, ya sea de ésteres de poliglicerol, siendo dichos ésteres de poliglicerol preferiblemente (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino polioxietilenados u otros aceites de ricino polioxietilenados hidrogenados. Ejemplos de tensioactivos que pueden usarse en una emulsión de agua-en-aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®), disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua-en-aceite, véase también el documento US 6.919.084, por ejemplo, el ejmplo 8 de la misma, incorporado en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, la fase acuosa que contiene antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tamponantes. Un ejemplo de una solución tampón adecuada es solución salina tamponada con fosfato. En una realización ventajosa, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una emulsión triple de agua/aceite/agua (W/O/W) (documento US 6.358.500). Ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en US 7.371.395.

[0117] Las composiciones y vacunas inmunológicas según la descripción pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente descripción son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados con alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al, 1996, PNAS USA, 93(7): 2879-83; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma obra, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes tratados en cualquier documento citado e incorporado por referencia en la presente solicitud, o (9) cualquier combinación o mezclas de los mismos.

[0118] La emulsión de aceite en agua (3), que es especialmente apropiada para vectores virales, puede basarse en: aceite de parafina líquido ligero (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tal como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes grasos o ácidos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

[0119] El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por una parte, sorbitán, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímero de polioxipropilenopolioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121.

[0120] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la técnica también puede hacer referencia al documento US 2909462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de tales grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre CARBOPOL ® (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente adecuados. Se reticulan por alil sacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a CAr Bo OL® 974P, 934P y 971P.

[0121] En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA® (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por divinil éter.

[0122] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA® están formados preferentemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3

- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

- y = 1 o 2, con x y = 2.

[0123] Para EMA®, x = 0 e y = 2 y para carbómeros x = y = 1.

[0124] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH se puede ajustar a de 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se puede incorporar el vector o vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede oscilar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,5% p/v, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1% p/v, y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4% p/v.

[0125] La citoquina o citoquinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición inmunológica o de vacuna, o pueden coexpresarse en el huésped con el inmunógeno o inmunógenos o epítopo o epítopos de los mismos. Se da preferencia a la coexpresión de la citoquina o citoquinas, ya sea por el mismo vector que el que expresa el inmunógeno o inmunógenos o epítopo epítopos del mismo, o por un vector separado del mismo.

[0126] La descripción comprende la preparación de tales composiciones de combinación; por ejemplo mezclando los componentes activos, de forma ventajosa, entre sí y con un adyuvante, portador, citoquina, y/o diluyente.

[0127] Las citoquinas que se pueden usar en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNa), interferón b (IFN-b), interferón g (IFN-g), interleuquina-1a (IL-1a), interleuquina-1 b (IL-1b), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-9 (IL-9) , interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL-11), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de necrosis tumoral b (TNF-b), ácido polinosínico y policitidílico, oligodesoxinucleótidos de citidina-fosfato-guanosina (CpG ODN) y factor de crecimiento transformante b (TGF-b). Se entiende que las citoquinas se pueden coadministrar y/o administrar secuencialmente con la composición inmunológica o de vacuna de la presente descripción. Así, por ejemplo, la vacuna de la presente descripción puede también contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina emparejada a este huésped a vacunar o en el que debe provocarse una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina bovina para las preparaciones a administrar a bovinos).

[0128] En una realización particular, el adyuvante puede incluir emulsiones TS6, TS7, TS8 y TS9 (Patente de Estados Unidos número 7.371.395); LR3 y LR4 (documento US 7.691.368); TSAP (solicitud de patente publicada en los Estados Unidos 20110129494); TRIGEN™ (Newport Labs); dsARN sintéticos (por ejemplo, poli-IC, poli-ICLC [HILTONOL®]); adyuvante CARBiGe N™ (MVP Laboratories, Inc.); adyuvante EnAb L® (VaxLiant); y adyuvantes MONTANIDE™ (W/O, W/O/W, O/W, IMS y Gel) (SEPPIC). La concentración de adyuvante en la composición inmunológica final o la composición de la vacuna puede variar entre 5% y 80% v/v.

[0129] En el caso de la composición inmunológica y/o vacuna basada en un polipéptido expresado por baculovirus/ células de insecto, una dosis puede incluir, de aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 1000 mg, y de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 pg de antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV. La dosis puede incluir de aproximadamente 102 a aproximadamente 1020, de aproximadamente 103 a aproximadamente 1018, de aproximadamente 104 a aproximadamente 1016, de aproximadamente 105 a aproximadamente 1012 VLP (partículas similares a virus). En el caso de composición inmunológica y/o vacuna basada en un vector viral que expresa antígenos de FMDV, una dosis puede incluir, de aproximadamente 103 partículas virales a aproximadamente 1015 partículas virales, de aproximadamente 103 partículas virales a aproximadamente 1014 partículas virales, de aproximadamente 103 partículas virales a aproximadamente 1013 partículas virales, de aproximadamente 103 partículas virales a aproximadamente 1012 partículas virales. Las partículas virales se pueden calcular en función de cualquier procedimiento de titulación de virus, incluidos, pero no limitado a, FFA (ensayo de formación de foco) o FFU o UFF (unidad formadora de foco), TCID⁵⁰ (50% de dosis infectiva de cultivo tisular), PFU o UFP (unidades formadoras de placas) y FAID⁵⁰ (50% de dosis infecciosa de anticuerpos fluorescentes). Los volúmenes de dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 5 ml.

[0130] La descripción se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

[0131] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2014).

Ejemplo 1 Construcción de antígenos de FMDV vectorizados con adenovirus 5 humano recombinante

Ejemplo 1.2 Construcción de antígeno A24-A12 quimérico de FMVV con adenovirus 5 humano recombinante [0132] El vector de adenovirus C humano, serotipo 5 (Ad5) (vector de adenovirus) con deleciones en las regiones El, E3 y E4 del genoma (estructura de GV11, véase la patente US 8.323.663) se usó para construir la vacuna contra FMDV recombinante que expresa la vacuna proteína quimérica de FMDV. La proteína quimérica de FMDV contiene el gen de la cápside estructural del serotipo A24 de FMDV (A24 Pl) y los genes no estructurales A24 (2A-2B parcial), el gen 3B no estructural parcial y el gen de proteasa del serotipo A12 de FMDV (3B parcial-C3) (SEQ ID NO: 2)

[0133] El polinucleótido quimérico que codifica A24 (P1-2A-2B parcial)-A12 (3B parcial-3C) ce FMDV se introdujo en el plásmido lanzadera (ver las figuras 2 y 3). Después de la co-transformación del plásmido de la estructura de GV11 linealizado (que lleva un gen de resistencia a la kanamicina) y el plásmido lanzadera linealizado que contiene el polinucleótido quimérico de FMDV en células E. coli BJDE3, se seleccionaron los clones resistentes a la kanamicina de E. coli. Los clones con plásmidos recombinantes fueron confirmados por RFLP. Se seleccionó un solo clon, el plásmido se linealizó y transfectó en células M2A. El lisado de la transfección de células M2A se pasó en serie para producir un stock de título elevado de vacuna contra FMDV quimérica vectorizada con adenovirus recombinante.

[0134] El sitio de inserción del gen donante está entre el promotor de CMV y poli A de SV40 de un casete de expresión Ad5 E1, y el casete de expresión se inserta en el BBA en la región E1. El casete de expresión de A24-A12, situado en la unión de la región de deleción E1, se lee de derecha a izquierda con respecto a la transcripción del ARN del genoma viral. No hay señales reguladoras conocidas en la secuencia de nucleótidos flanqueante del casete de inserción. El potenciador/promotor de CMV controla el inicio de la transcripción. Dentro de esta secuencia se encuentran el potenciador viral la caja CAAT, la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción y las secuencias del sitio de empalme 5'.

[0135] Las secuencias de CMV van seguidas por una región artificial no traducida (UTR) que contiene una secuencia donante de empalme. El marco de lectura abierto del gen que se va a expresar sigue a las secuencias del sitio de empalme 3' y la señal de poliadenilación temprana del Virus de Simio 40 (SV40) se coloca 3' con respecto al marco de lectura abierto para finalizar la transcripción.

[0136] Los pares de cebadores se diseñaron para el ensayo de identidad estructural genética RBA (GSI). El ensayo GSI usa PCR para identificar el agente biológico de la estructura y el casete de expresión. La transferencia de GSI (ver Figura 4) mostró la estructura correcta y el casete de expresión de A24-A12 de FMDV. El análisis de secuencia del casete de expresión de A24-A12 también confirmó la identidad de la secuencia de nucleótidos entre el plásmido lanzadera y el ADN extraído de la vacuna contra FMDV A24-A12 quimérica vectorizada con adenovirus recombinante.

[0137] Se confirmó que la vacuna contra FMDV A24-A12 quimérica vectorizada con adenovirus recombinante expresaba la proteína A24 in vitro en células 293 mediante un ensayo de transferencia Western, produciendo una proteína reactiva que migraba a la posición de aproximadamente 28 KDa (ver Figura 5). El anticuerpo utilizado para la detección en el ensayo de transferencia Western es un anticuerpo monoclonal. El peso molecular de la proteína A24 expresada a partir de la vacuna contra FMDV A24-A12 quimérica vectorizada con adenovirus recombinante era indistinguible del observado después de la transfección del plásmido lanzadera de control positivo en células 293 (ver Figura 5).

Ejemplo 1.2 Construcción de antígeno de O1M de FMDV vectorizado con adenovirus 5 humano recombinante [0138] El vector de adenovirus C humano, serotipo 5 (Ad5) (vector de adenovirus) con deleciones en las regiones El, E3 y E4 del genoma (estructura de GV11, véase la patente US 8.323.663) se usó para construir la vacuna contra FMDV recombinante que expresa la proteína de FMDV. La proteína de FMDV contiene la cápside estructural Pl (VP4-VP2-VP3-VP1) y las proteínas no estructurales 2ABC y 3ABC, incluida la proteasa 3C de longitud completa (SEQ ID NO: 4) de la cepa de FMDV Ol/Man/87.

[0139] El polinucleótido sintético (SEQ ID NO: 3) que codifica O1M Pl (VP4-VP2-VP3-VP1-2ABC'3A,BC) de FMDV se introdujo en el plásmido lanzadera (véase la figura 6). La vacuna contra FMDV O1M vectorizada con adenovirus recombinante se construyó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.2.

[0140] El casete de expresión de FMDV O1M87, situado en la unión de deleción de la región E1, se lee de derecha a izquierda con respecto a la transcripción del ARN del genoma viral. No hay señales reguladoras conocidas en la secuencia de nucleótidos flanqueante del casete de inserción. El potenciador/promotor de CMV controla el inicio de la transcripción. Dentro de esta secuencia se encuentran el potenciador viral, la caja CAAT, la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción y las secuencias del sitio de empalme 5'.

[0141] Las secuencias de CMV van seguidas por una región artificial no traducida (UTR) que contiene una secuencia donante de empalme. El marco de lectura abierto del gen que se va a expresar sigue a las secuencias del sitio de empalme 3' y la señal de poliadenilación temprana del Virus de Simio 40 (SV40) se coloca 3' con respecto al marco de lectura abierto para finalizar la transcripción.

[0142] La transferencia GSI mostró la estructura correcta y el casete de expresión de O1M87 de FMDV. El análisis de secuencia del casete de expresión de O1M87 de FMDV también confirmó la identidad de la secuencia de nucleótidos entre el plásmido lanzadera y el ADN extraído de la vacuna contra FMDV O1M87 vectorizada con adenovirus recombinante. Se confirmó que la vacuna contra FMDV O1M87 vectorizada con adenovirus recombinante expresaba la proteína O1M87 in vitro en células 293 mediante un ensayo de transferencia Western.

Ejemplo 1.3 Construcción de antígeno Irn de FMDV vectorizado con adenovirus 5 humano recombinante

[0143] El vector de adenovirus C humano, serotipo 5 (Ad5) (vector de adenovirus) con deleciones en las regiones El, E3 y E4 del genoma (estructura de GV11, véase la patente US 8.323.663) se usó para construir la vacuna contra FMDV recombinante que expresa la proteína del virus de la fiebre aftosa. La secuencia de codificación de la cápside de FMDV sintética de P1 y los genes no estructurales 2A, 2B, 2C parcial (2C'), 3A parcial (3A'), 3B y la secuencia de codificación de proteasa de 3C del serotipo de FMDV A/Im/05 se introdujeron en un plásmido lanzadera (ver Figura 7). La vacuna contra FMDV Irn vectorizada con adenovirus recombinante se construyó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.2.

[0144] El casete de expresión de FMDV Irn, situado en la unión de deleción de la región E1, se lee de derecha a izquierda con respecto a la transcripción del ARN del genoma viral. No hay señales reguladoras conocidas en la secuencia de nucleótidos flanqueante del casete de inserción. El potenciador/promotor de CMV controla el inicio de la transcripción. Dentro de esta secuencia se encuentran el potenciador viral, la caja CAAT, la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción y las secuencias del sitio de empalme 5'.

[0145] Las secuencias de CMV van seguidas por una región artificial no traducida (UTR) que contiene una secuencia donante de empalme. El marco de lectura abierto del gen que se va a expresar sigue a las secuencias del sitio de empalme 3' y la señal de poliadenilación temprana del Virus de Simio 40 (SV40) se coloca 3' con respecto al marco de lectura abierto para finalizar la transcripción.

[0146] La vacuna Irn FMDV vectorizada con adenovirus recombinante se identificó usando un ensayo de Identidad Estructural Genética (GSI) basada en PCR y se confirmó usando la expresión de proteínas mediante la técnica de transferencia Western.

Ejemplo 1.4 Construcción de antígeno de Asia de FMDV vectorizado con adenovirus 5 recombinante humano

[0147] El vector de serotipo 5 de Adenovirus C humano, (Ad5) (vector de adenovirus) con deleciones en las regiones E1, E3 y E4 del genoma (estructura principal GV11, véase la patente de Estados Unidos 8.323.663) se usó para construir la vacuna contra FMDV recombinante que expresa la proteína de FMDV. Se introdujo la secuencia codificante de la cápside de FMDV sintética de P1 y genes no estructurales 2A, 2B, 2C parcial (2C'), 3A parcial (3A'), 3B y la secuencia codificante de proteasa de 3C de la cepa de FMDV Asia/Leb/89 en un plásmido lanzadera (ver Figura 8). La vacuna contra el FMDV de Asia vectorizada con adenovirus recombinante se construyó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.2.

[0148] El casete de expresión de FMDV Asia, situado en la unión a la deleción de la región E1, lee de derecha a izquierda con respecto a la transcripción del ARN del genoma viral. No hay señales reguladoras conocidas en la secuencia de nucleótidos flanqueante del casete de inserción. El potenciador/promotor de CMV controla el inicio de la transcripción. Dentro de esta secuencia se encuentra el potenciador viral, caja CAAT, caja TATA, sitio de inicio de la transcripción y secuencias del sitio de empalme 5'.

[0149] Las secuencias de CMV van seguidas por una región artificial no traducida (UTR) que contiene una secuencia donante de empalme. El marco de lectura abierto del gen que se va a expresar sigue a las secuencias del sitio de empalme 3' y la señal de poliadenilación temprana del Virus de Simio 40 (SV40) se coloca 3' con respecto al marco de lectura abierto para finalizar la transcripción.

[0150] Se confirmó que la vacuna contra FMDV de Asia vectorizado con adenovirus recombinante expresaba la proteína Asia in vitro en células 293 mediante un ensayo de transferencia Western, produciendo una proteína reactiva que migraba a la posición de aproximadamente 38 kDa. El anticuerpo usado para la detección en el ensayo de transferencia Western es el policlonal VP2 de FMD. El peso molecular de la proteína AsiaSS.2B expresada era indistinguible del observado después de la transfección del plásmido de control positivo en células 293.

Ejemplo 2 Estudio de estimulación en ganado bovino y cerdos.

[0151] El ganado bovino y los cerdos fueron vacunados con la vacuna A24-A12 contra FMDV o la vacuna O1M87 contra FMDV una vez en el día 0 a través de IM y se estimularon en el día 14 por muchos serotipos de FMDV, tales como cepas A24, A12, O1, Asia, Irn e Iraq .

[0152] La Figura 9 muestra la protección de la vacuna O1 contra FMDV en animales contra la estimulación al FMDV a tres dosis diferentes y controles. En este estudio de titulación de dosis, se evaluó la capacidad de la vacuna O1M contra FMDV adenovectorizada recombinante para conferir protección contra la enfermedad generalizada de la fiebre aftosa (lesiones podales) después de una estimulación homóloga IDL directa a los 14 días después de la vacunación (dpv). Las terneras hembras sanas Holstein de 6 meses de edad fueron aleatorizadas a uno de los cuatro grupos de tratamiento. El ganado bovino sin tratar (T01; n = 4) se inmunizó por vía intramuscular con una dosis única de 2 ml de tampón de formulación final (FFB). El ganado en T02-T04 (n = 7/grupo) se vacunó con dosis decrecientes [Unidades formadoras de focos de hexón anti-adenovirus (UFF) o ensayo de formación de focos (FFA); log¹⁰] del principio activo preparado a partir del pase 2 del virus de semilla maestra (MSV 2) formulado en el adyuvante ENABL™ C1. T02-T04 recibió 2,38x105, 5,94x104 UFF o 1,49 x104 UFF de dosis total, respectivamente. A las 2 semanas después de la vacunación (día de la estimulación), el 100% de los vacunados T02 y T03 tenían títulos de neutralización del virus en suero (SVN) de O1 Manisa de FMD, frente al 43% en el grupo de tratamiento con la dosis de vacuna más baja (T04). Después de la estimulación lingual intradérmica con 1 x 104 unidades de 50% de dosis infecciosas bovinas (BID⁵ ) de FMDV O1 Manisa, 100% del ganado sin tratar de control T01 exhibió una enfermedad generalizada (lesiones podales). Por el contrario, el nivel de protección contra la enfermedad generalizada en los grupos vacunados varió del 86% (T04) al 100% (T02 y T03). Los cuatro bovinos de control (T01) fueron positivos para el virus de la fiebre aftosa en plasma recolectado en 1-3 días después de la estimulación (dpc), mientras que ninguno de los veintiún vacunados presentaba viremia de plasma detectable en 1-5 dpc. En T01, el 88% de las muestras nasales recogidas 2-5 dpc fueron positivas al virus, en comparación con el 25% (T03), el 27% (T02) y el 36% (T04) de las muestras analizadas de 2-5 dpc. La Figura 10 muestra la serología de la vacuna O1 FMDV a tres dosis y control.

[0153] Estos resultados demuestran que el principio activo de la vacuna contra FMDV O1M con adenovector recombinado formulado en el adyuvante ENABL C1 es altamente inmunogénico y eficaz contra la estimulación IDL homóloga contra FMDV en ganado bovino, y proporciona datos sobre la dosis protectora mínima estimada.

[0154] Se probaron las vacunas A24-A12 y O1M87 para ver si eran seguras en terneros y ratones.

Ejemplo 3 Inmunogenicidad de serología de adyuvante y el correspondiente estudio viricida/estabilidad.

[0155] El adyuvante de una vacuna puede reducir la dosis protectora mínima (MPD) y dar como resultado una vacuna más efectiva. Una MPD reducida puede equilibrarse por el coste del adyuvante y suministrar seguridad. Sin embargo, algunos adyuvantes pueden reducir la efectividad de la vacuna. El adyuvante puede empujar al sistema inmunitario hacia una respuesta indeseable o el adyuvante puede ser perjudicial para el agente inmunizante (por ejemplo, falta de estabilidad).

[0156] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la serología de adyuvante. Se realizó un estudio serológico de eficacia en ganado bovino y, paralelamente, se realizó un estudio virucida/de estabilidad para determinar si alguno de los cinco adyuvantes tiene efectos perjudiciales sobre las vacunas contra FMDV con adenovirus. Cada dosis consiste en 200 pl de PI final (principio activo) por dosis a una dosis de 2 ml con cada uno de los adyuvantes. Los adyuvantes son ácido poliacrílico, emulsión LF2, emulsión LR6, CARBIGEN™ M y ENABL® C1 (ver Tabla 1.1 a continuación).

Tabla 1.1 Preparación de vacunas contra FMDV con adenovirus

Tabla 1.2 Emulsión TS6 (preemulsión descrita en los documentos US 7.608.279 y US 7.371.395)

Tabla 1.3 Emulsión LR4 (preemulsión descrita en US 7.691.368)

[0157] Las vacunas se almacenaron a 4 °C y 25 °C y se probaron con el tiempo. Los virus en cada vacuna se titularon de acuerdo con el ensayo de titulación del ensayo de formación de focos estándar en el que la cantidad de virus detectado se lee mediante anticuerpos anti-adenovirus específicos en la monocapa celular. Se compararon los títulos respectivos. Los datos de los primeros 3 meses se presentan a continuación, en la Tabla 2 y en las Figuras 11 (25 °C) y 12 (4 °C). A 4 °C, la mayoría de los antígenos o virus presentes en las vacunas formuladas son estables a los 3 meses. A 25 °C, los antígenos o virus formulados con adyuvantes de ácido poliacrílico, LF2 y Carbigen M son relativamente estables a las 7 semanas. La estabilidad de estas tres formulaciones mostró una ligera disminución a 25 °C en el punto de 3 meses. Sin embargo, esta caída es menor cuando el virus recombinante se combina con adyuvante, lo que confirma el efecto protector del adyuvante. Los antígenos o virus formulados con el adyuvante LR6 experimentaron alguna interferencia en el ensayo, tal como se evidencia en el nivel de detección siguiente, tanto a 4 °C como a 25 °C. Sin embargo, la formulación adyuvada con LR6 generó un título de virus específico a los 3 meses y es estable a 25 °C.

Tabla 2 Estudio viricida y de estabilidad de cinco adyuvantes hasta 3 meses

[0158] El estudio de serología correspondiente se llevó a cabo en el ganado bovino. Cada grupo contenía 10 animales por grupo experimental (5 en control) y se le administró una dosis de 2 ml en el día cero seguido de un

refuerzo en el día 21. Se tomaron muestras de sangre en varios puntos temporales durante todo el estudio y se

analizaron las muestras de suero. Se realizó la serología mediante título neutralizante de virus. Los datos iniciales

indicaron respuestas serológicas en el día 14 después de la primera vacunación en varios grupos. Tomados en

conjunto, los datos indican que las vacunas contra la fiebre aftosa con adenovirus formuladas en ciertos adyuvantes

pueden brindar oportunidades para mejorar la termoestabilidad y la capacidad de manejar las variaciones de

temperatura. Cuando se combina con estos datos iniciales, la respuesta inmunológica se mantiene o se mejora

potencialmente.

Ejemplo 4 Inmunogenicidad por serología de vacunación de dos dosis con múltiples antígenos O1M de FMDV

vectorizados con adenovirus humanos recombinantes en ganado bovino

[0159] El objetivo del estudio es evaluar la respuesta de anticuerpos serológicos en ganado bovino después de la

administración de OlManisa de FMDV adenovectorizado formulado con y sin diferentes adyuvantes.

[0160] Cincuenta y cinco terneros criados convencionalmente (aproximadamente 5 meses de edad) fueron

asignados al azar a uno de los seis grupos de tratamiento como se presenta en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4

[0161] Todas las terneras excepto las del Grupo 6 (centinelas) se vacunaron con una construcción de O1/Manisa

vectorizada con Adenovirus con (Grupos 1-4) o sin un adyuvante (Grupo 5), dos veces en un intervalo de 21 días

con 2 ml de la vacuna de ensayo. Todas las inyecciones se administraron por vía intramuscular (IM) sobre el hombro

alternativamente en los lados derecho e izquierdo. La Tabla 4 anterior contiene un resumen del tratamiento para

cada grupo.

[0162] Los terneros se observaron intermitentemente durante al menos 1 hora después de cada vacunación para

analizar signos clínicos de eventos adversos sistémicos agudos. Se recogieron muestras de sangre de todo el

ganado en los días -1 (antes de la vacunación), 7, 15, 21 (antes de la vacunación), 28 y 35. Las muestras de suero

de todo el ganado se analizaron para detectar anticuerpos contra el virus de la fiebre aftosa por neutralización del

virus en suero (SVN). Además, las respuestas de anticuerpos al Adenovirus (SAV) se determinaron en todos los

animales de todos los grupos en muestras recogidas en los días -1 y 35. Los resultados para SVN y SAV se

describieron en Log¹⁰ y un valor < 0,6 Log¹⁰ se consideró negativo para anticuerpo sérico.

[0163] Las evaluaciones de la seguridad posteriores a la vacunación incluyeron temperatura rectal, inspección visual

y palpación de los sitios de inyección durante al menos 3 días después de cada vacunación. Las vacas con eventos adversos en el sitio de inyección local se observaron de forma intermitente hasta la resolución de la anormalidad. El estudio se terminó en D35 después de la recogida de sangre final.

[0164] Los resultados de la respuesta serológica a FMDV usando anticuerpos contra FMDV mediante el log¹⁰ de neutralización del virus en suero (SVN) se describen a continuación.

[0165] Todos los terneros de todos los grupos dieron negativo para anticuerpos contra el FMDV antes del comienzo del estudio. Todos los centinelas fueron negativos para los anticuerpos contra el FMDV durante todo el estudio. La seroconversión después de la vacunación se definió como un aumento del título en Log¹⁰ > 0,9. Para el día 14 (2 semanas después de la primera vacunación), 5/10 terneros (50%) en ENABL® C1 (Grupo 1) se habían seroconvertido. Aquellos en los grupos vacunados restantes (2-5) tenían entre 20-40% de los terneros seroconvertidos. Además, el título promedio de anticuerpos por grupo fue ligeramente mayor en el grupo 1 (ENABL® C1) seguido de los Grupos 2 (LF) y 3 (ácido poliacrílico) (Figura 13).

[0166] Para el día 35 (2 semanas después de la 2a vacunación), todos los animales vacunados (Grupo 1 [ENABL®], grupo 2 [LF] y grupo 5 [sin adyuvante]) se habían seroconvertido, seguidos por el noventa y ochenta por ciento de aquellos en los grupos 3 (ácido poliacrílico) y 4 (Carbigen M), respectivamente. Los animales vacunados con el adyuvante LF, seguidos por los vacunados sin adyuvante (Grupo 5) y los vacunados con el adyuvante ENABL® C1 (Grupo 1) tuvieron una mayor respuesta de anticuerpos después de un régimen de vacunación de dos dosis (ver Figura 13).

[0167] Los resultados de la respuesta serológica al virus de la fiebre aftosa usando anticuerpos de adenovirus mediante el log¹⁰ de neutralización del virus del suero (SVN) se describen a continuación.

[0168] Todos los centinelas y terneros vacunados fueron negativos para Adenovirus mediante los títulos de anticuerpos de SN en el día -1 (< 0,6 Log¹⁰). Para el día 35, todos menos uno de los terneros vacunados (ID: 134; Grupo 5) se seroconvirtieron con una media geométrica global del título más alta por grupo en aquellos vacunados con una vacuna que contenía adyuvante (Grupos 1-4) (ver Figura 14).

[0169] Los resultados indicaron respuestas serológicas en el día 14 después de la primera vacunación en varios grupos. Dos semanas después de la segunda vacunación, se observó una mayor respuesta de anticuerpos en terneros vacunados con el adyuvante LF seguido de aquellos vacunados sin adyuvante y con el adyuvante Enable C1.

[0170] Los resultados sugieren que la respuesta de anticuerpos después de una sola vacunación independientemente de la presencia o ausencia de adyuvante es pequeña. Sin embargo, usando un régimen de dos vacunas (sensibilización-refuerzo), la respuesta de anticuerpos es en general más alta. No se observaron eventos adversos sistémicos cuando la construcción de la vacuna se administró dos veces (con 3 semanas de diferencia) por vía intramuscular.

Ejemplo 5 Evaluación serológica de vacunas contra FMDV después de la vacunación en cerdos

[0171] El objetivo del estudio es evaluar la respuesta de anticuerpos en lechones después de la administración de formulaciones de vacunas monovalentes que contienen O1 Manisa contra FMDV vectorizada con Adeno 5) y/o partícula similar a virus (VLP) recombinante O1 Manisa expresada por baculovirus contra FMDV.

[0172] Veinte lechones criados convencionalmente (aproximadamente 5 semanas de edad) fueron asignados al azar a dos grupos de tratamiento, cada uno con 10 lechones. La composición del grupo se presenta en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5

[0173] Los lechones en el grupo 1 se vacunaron con 2 ml de la vacuna. Todas las inyecciones se administraron por vía intramuscular (IM) sobre el hombro alternativamente en los lados derecho e izquierdo. Los lechones se observaron antes de cada vacunación por su estado general de salud. Se recogieron muestras de sangre de todos los lechones los días 0 (antes de la vacunación), 7, 14, 21 (antes de la vacunación), 28 y 35. Las muestras de suero del día 35 de todos los lechones se analizaron para detectar anticuerpos contra FMDV mediante neutralización del virus en suero (SVN). Las muestras de esos lechones en el grupo 1 fueron sometidas a un ensayo de SVN en todos los días de recogida, ya que tuvieron una respuesta global de anticuerpos más alta después del día 35. Los resultados se describieron en Log¹⁰ y un valor < 0,75 Log¹⁰ se consideró negativo para el anticuerpo en suero. Las evaluaciones de seguridad posteriores a la vacunación incluyeron temperatura rectal, inspección visual y palpación de los sitios de inyección durante 3 días después de cada vacunación.

[0174] Los resultados de la respuesta serológica de FMDV usando anticuerpos contra FMDV mediante el log¹⁰ de neutralización del virus en suero (SVN) se describen a continuación.

[0175] Todos los centinelas fueron negativos para los anticuerpos contra el FMDV antes y al final del estudio. Para el día 28 (1 semana después de la segunda vacunación), todos los lechones del grupo 1 seroconvirtieron (títulos > 1,20 log¹⁰) (ver Figura 15). No se observaron eventos adversos sistémicos y/o locales atribuibles a la vacunación. Los resultados mostraron claramente que a pesar de que el grupo vacunado tuvo una pequeña respuesta de anticuerpos después de la primera vacunación, la respuesta de anticuerpos después de la segunda vacunación (sensibilización-refuerzo) fue alta al final del estudio.

Ejemplo 6 Ruta de administración

[0176] El objetivo del estudio es evaluar la respuesta serológica de la vacunación de dos dosis en ganado o cerdos cuando se usan dos vacunas contra FMDV vectorizadas con Adenovirus recombinante, una vacuna contra FMDV vectorizada con Adenovirus recombinante y una vacuna de partículas similar al virus de FMDV recombinante expresado por baculovirus o dos vacunas VLP contra FMDV, y cuando se usan diferentes vías de administración (vía de administración transdérmica, subcutánea o intradérmica). El estudio también está diseñado para abordar el problema de interferencia cuando se administran múltiples vacunas.

[0177] Los adyuvantes son ácido poliacrílico, emulsión LF2, emulsión LR6, CARBIGEN™ M y ENABL® C1. Los grupos de tratamiento están representados en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6

[0178] Los terneros se observan de forma intermitente durante al menos 1 hora después de cada vacunación por signos clínicos de eventos adversos sistémicos agudos. Se recogen muestras de sangre de todo el ganado en los días -1 (antes de la vacunación), 7, 15, 21 (antes de la vacunación), 28 y 35. Las muestras de suero de todo el ganado se analizaron para detectar anticuerpos contra FMDV mediante neutralización del virus en suero (SVN). Además, las respuestas de anticuerpos al Adenovirus (SAV) se determinan en todos los animales de todos los grupos en muestras recogidas en los días -1 y 35.

[0179] Las evaluaciones de seguridad posteriores a la vacunación incluyen temperatura rectal, inspección visual y palpación de los sitios de inyección durante al menos 3 días después de cada vacunación. Las vacas con eventos adversos en los sitios de inyección local se observan de forma intermitente hasta la resolución de la anomalía.

[0180] Los resultados muestran un efecto de sensibilización-refuerzo para todos los grupos, pero el efecto de sensibilización-refuerzo es mayor en animales que recibieron una vacuna de sensibilización con adenovirus seguido de un refuerzo con la construcción de baculovirus-FMD. Además, la vía de administración tiene un impacto en la respuesta y protección serológica, así como en la duración de la inmunidad. Las rutas específicas de administración y/o la combinación específica de las rutas de administración TD, IM y SQ parecen exacerbar la respuesta inmunitaria, amplían aún más la protección, superan la interferencia y protegen a los animales positivos a los anticuerpos derivados de la madre (MDA-positivo).

Ejemplo 7 Eficacia en cerdos

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Composición o vacuna que comprende un vector viral recombinante que expresa un antígeno del virus de la fiebre aftosa (FMDV), en el que el antígeno de FMDV comprende un polipéptido que tiene la secuencia que se indica en la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia que se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.

2. Composición o vacuna, según la reivindicación 1, en la que el vector viral es un adenovirus.

3. Composición o vacuna, según la reivindicación 1 o 2, en la que el antígeno de FMDV está codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia que se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7.

4. Composición o vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la composición o vacuna comprende, además, un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

5. Composición o vacuna, según la reivindicación 4, en la que el portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en ácido poliacrílico, emulsión LF2, emulsión LR6, emulsión TS6, emulsión LR4, carbómero, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, saponina, CpG, emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua y adyuvante a base de carbómero.

6. Composición o vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en un procedimiento para vacunar un animal susceptible a la infección por FMDV o provocar una respuesta inmunitaria en el animal contra FMDV que comprende al menos una administración de la composición.

7. Composición o vacuna para usar, según la reivindicación 6, en la que el procedimiento comprende un régimen de administración de sensibilización-refuerzo.

8. Composición o vacuna para usar, según la reivindicación 7, en la que el régimen de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de una composición o vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y una administración de refuerzo de una composición que comprende un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, un antígeno de FMDV, o una composición que comprende un antígeno de FMDV, o una composición viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, para proteger al animal del FMDV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

9. Composición o vacuna para usar, según la reivindicación 7, en la que el régimen de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de una composición que comprende un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, un antígeno de FMDV, o una composición que comprende un antígeno de FMDV, o una composición viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, y una administración de refuerzo de una composición o vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para proteger al animal del FMDV y/o prevenir la progresión de la enfermedad en un animal infectado.