ES2791279T3 - Indicadores fosforescentes - Google Patents

Abstract

Un indicador fosforescente que comprende: una partícula fosforescente inorgánica; una cubierta que encapsula la partícula fosforescente inorgánica; y al menos un resto de reconocimiento molecular seleccionado de entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, un ácido nucleico, un péptido, una proteína o un aptámero dispuesto en la cubierta, donde la partícula fosforescente inorgánica forma el núcleo del indicador fosforescente, caracterizado porque la partícula fosforescente inorgánica es una nanopartícula de aluminato de estroncio que comprende aluminato de estroncio dopado con al menos un metal de tierras raras, el al menos un metal de tierras raras comprende europio o disprosio, o lantánidos o una combinación de los mismos, y porque dicha partícula presenta un tamaño en un intervalo comprendido entre 50 nm y 600 nm y una vida útil de luminiscencia en un intervalo comprendido entre 10 microsegundos y una hora.

Description

DESCRIPCIÓN

Indicadores fosforescentes

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos N.° 61/867,263, depositada en la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos el 19, de agosto de 2013.

ANTECEDENTES

Se utilizan diversas pruebas y metodologías de detección para detectar específicamente numerosos tipos de analitos en distintas aplicaciones, tales como diagnósticos médicos, seguridad alimentaria y garantía de calidad, y monitorización ambiental. Los procedimientos y sistemas actuales para utilizar indicadores analíticos presentan numerosas limitaciones en términos de coste, eficiencia, sensibilidad, versatilidad y capacidad de implementación en entornos de recursos bajos. Por lo tanto, se desean tecnologías y procedimientos de detección más efectivos para superar estas limitaciones.

Paterson Andrew et al. (Abstracts of Papers American Chemical Society, vol. 245, April 2013) describe partículas de aluminato de estroncio dopado con tierras raras como indicadores en diagnósticos en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria.

Zhu Y et al. (Materials Chemistry and Physics, col. 113, no. 2-3, 15 February 2009) describe la encapsulación potenciadora de la luminiscencia para fosfatos y fósforos de aluminato de estroncio.

Song X et al. (Analytica Chimica Acta, vo. 626, no. 2, 26 September 2008) describe la tecnología de ensayo de flujo lateral luminiscente de resolución temporal.

Se puede encontrar más información de antecedentes en US 5674698, US 2005/112703, US 2012/286203, US 5922537.

RESUMEN

Según la presente invención, se proporciona un indicador fosforescente según la reivindicación 1, un procedimiento para realizar un indicador fosforescente según la reivindicación 6 y un procedimiento para usar un indicador fosforescente según la reivindicación 16. Las características opcionales se recogen en las reivindicaciones dependientes.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a nuevas composiciones de materia que comprenden indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes son pequeñas partículas fosforescentes, tales como fósforos inorgánicos. Los fósforos inorgánicos presentan una vida útil de luminiscencia mayor que 10 microsegundos y preferiblemente mayor que un minuto. En algunas realizaciones, los fósforos inorgánicos presentan una vida útil lo suficientemente larga como para que las partículas puedan excitarse brevemente con una fuente de luz de longitud de onda de excitación adecuada, y a continuación emitir luz a una longitud de onda más larga que la fuente de excitación a una intensidad suficientemente alta y durante un periodo de tiempo suficientemente duradero después de la excitación para obtener imágenes o mediciones de luminiscencia de resolución temporal.

Los indicadores fosforescentes de la presente invención comprenden aluminato de estroncio. En algunas realizaciones, el aluminato de estroncio se dopa con europio y disprosio (SrAbO4:Eu2+, Dy3+) o combinaciones de uno o más metales de tierras raras, preferiblemente lantánidos. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción comprenden fósforos inorgánicos creados por el dopaje adecuado de tierras raras o metales de transición en un material huésped inorgánico. En algunas realizaciones, el material huésped inorgánico puede incluir, sin limitación, sulfuro de zinc, sulfuro de calcio, silicatos alcalinotérreos (por ejemplo, silicatos de berilio, calcio, magnesio y bario), aluminatos alcalinotérreos (por ejemplo, aluminato de calcio, aluminato de magnesio, aluminato de berilio y aluminato de bario y magnesio), titanatos (p. ej., titanatos de calcio, magnesio y plomo) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden incluir un material huésped de óxido metálico inorgánico dopado con un metal para alterar la estructura electrónica, lo que da lugar a fosforescencia.

Los indicadores fosforescentes están recubiertos o encapsulados con una barrera o cubierta, tal como una cubierta a base de silicio (por ejemplo, óxido de silicio, sílice, silicatos o silanos organofuncionales), óxido de aluminio, otros óxidos metálicos inorgánicos, redes poliméricas altamente entrelazadas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los recubrimientos o encapsulaciones pueden ayudar a impedir la pérdida o degradación de las propiedades de luminiscencia del núcleo fosforescente mediante reacciones con agua o productos químicos, o compuestos en el entorno circundante. En algunas realizaciones, los recubrimientos o encapsulaciones pueden llevarse a cabo mediante el proceso Stober o variantes modificadas del proceso Stober.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden recubrirse o funcionalizarse con restos hidrosolubles como poli(etilenglicol) o polímeros hidrófilos para que los indicadores se dispersen fácilmente en agua o disoluciones acuosas. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden recubrirse o funcionalizarse con restos que reducen la unión no específica en pruebas o ensayos analíticos. Los indicadores fosforescentes de la presente invención se modifican con elementos de reconocimiento molecular, tales como anticuerpos o aptámeros. En algunas realizaciones, los elementos de reconocimiento molecular pueden estar unidos covalentemente a indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, los elementos de reconocimiento molecular pueden estar unidos de forma no covalente a indicadores fosforescentes, tal como por adsorción física. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden estar asociados con enlazadores, tales como trietoxisililbutiraldehído (TESBA), poli(etilenglicol) (PEG), (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES), alcanos y similares. En algunas realizaciones, los enlazadores de silano reactivo que se unen con una superficie de sílice y que también comprenden grupos funcionales para el acoplamiento a otras moléculas se pueden unir a la superficie de los indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, las moléculas de trialcoxisilanopolietilenglicol disponibles comercialmente con grupos funcionales reactivos para el acoplamiento a proteínas pueden unirse directamente a una superficie de sílice o alúmina inorgánica en un indicador fosforescente. En algunas realizaciones, los enlazadores pueden conjugarse con un indicador fosforescente antes, durante o después de recubrir el indicador fosforescente con restos hidrosolubles. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden recubrirse con un silano reactivo y posteriormente conjugarse con polietilenglicoles.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden funcionalizarse con diversos grupos funcionales en sus superficies. Los ejemplos de grupos funcionales incluyen, sin limitación, grupos amina, grupos carboxilo, aldehídos, cetonas, hidroxilos, tioles, hidrazidas, anhídridos, alquenos, alquinos, azidas y combinaciones de los mismos. En realizaciones más específicas, los indicadores fosforescentes funcionalizados se pueden acoplar directamente a aldehídos en anticuerpos creados oxidando los polisacáridos en la porción Fc del anticuerpo con periodato. En realizaciones adicionales, la proteína A u otras proteínas que se unen específicamente a la porción Fc de un anticuerpo pueden unirse a la superficie del indicador fosforescente, y luego usarse para unirse a un anticuerpo de una manera orientada para mejorar la eficiencia de unión del indicador fosforescente.

Los indicadores fosforescentes de la presente invención se encuentran en forma de partículas. Según la presente invención reivindicada, el indicador fosforescente es una nanopartícula de aluminato de estroncio que comprende aluminato de estroncio dopado con al menos un metal de tierras raras, el al menos un metal de tierras raras comprende europio o disprosio, o lantánidos o una combinación de los mismos, y en dicha partícula presenta un tamaño en un intervalo comprendido entre 50 nm y 600 nm y una vida útil de luminiscencia en un intervalo comprendido entre 10 microsegundos y una hora.

Las realizaciones adicionales de la presente descripción se refieren a procedimientos para preparar los indicadores fosforescentes mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye la reducción de tamaño de polvos fosforescentes inorgánicos mediante una combinación de molienda húmeda y sedimentación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molienda húmeda se lleva a cabo con un molino de bolas o molino de jarro. A continuación, se dispersa un polvo fosforescente inorgánico seco en un líquido y se coloca en un recipiente de molienda de cerámica, metal o plástico en presencia de medios de molienda (por ejemplo, medios de molienda compuestos de un material duro y denso como la circona) y se muele.

En algunas realizaciones, la molienda húmeda se lleva a cabo en presencia de disolventes orgánicos, tales como acetato de etilo, tolueno, ciclohexano, ciclopentano, decano y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los disolventes orgánicos son hidrófobos y presentan baja higroscopicidad. En algunas realizaciones, los disolventes orgánicos no afectan a la luminiscencia de los materiales inorgánicos. En algunas realizaciones, la molienda húmeda se lleva a cabo en presencia de alcoholes, tales como etanol, isopropanol, butanol o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, se pueden usar técnicas e instrumentos de molienda alternativos para reducir el tamaño medio de partícula de los polvos fosforescentes inorgánicos. En algunas realizaciones, las técnicas incluyen, sin limitación, criomolienda, molienda vibratoria, molienda de cuentas, molienda en seco, molienda por desgaste, molienda por chorro, pulverización y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se pueden usar técnicas de fraccionamiento distintas de la sedimentación (por ejemplo, tamizado, fraccionamiento de flujo de campo, filtración de flujo tangencial) para aislar distribuciones de tamaño de partícula más estrechas.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la detección de al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende la etapa de proporcionar un indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto el indicador fosforescente con la muestra. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de detectar la señal de luminiscencia del indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de determinar la presencia de un analito y cuantificar el analito en función de la señal de luminiscencia detectada.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la detección in vitro de al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende el paso de proporcionar un indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además cargar el indicador fosforescente en un material poroso. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con el material poroso cargado con el indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende permitir que la muestra y el indicador fosforescente fluyan a través de una membrana porosa. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende detectar zonas de luminiscencia o ausencia de luminiscencia en la membrana para indicar la presencia o ausencia del al menos un analito.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la detección in vitro de al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende las etapas de proporcionar un indicador fosforescente; y proporcionar al menos un primer elemento de reconocimiento molecular inmovilizado en una superficie, donde el elemento de reconocimiento molecular inmovilizado es capaz de unirse al al menos un analito. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra con la superficie para permitir la unión del al menos un analito al elemento de reconocimiento molecular de modo que el analito se inmovilice. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto el indicador fosforescente con la superficie para permitir la unión del indicador fosforescente al al menos un analito inmovilizado; y medir la señal de luminiscencia del indicador fosforescente para permitir la detección o cuantificación del analito.

En algunas realizaciones, la superficie comprende chips de sistemas microfluídicos, o sistemas microfluídicos de papel, o membranas, o microplacas, o microburbujas para flotación, o superficies transparentes. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica; una cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente; y un segundo resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, el segundo resto de reconocimiento molecular se une al al menos un analito inmovilizado para generar la señal luminiscente.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un indicador fosforescente magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende una cubierta que encapsula el al menos una partícula fosforescente inorgánica y al menos un resto magnético dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos un resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, la partícula fosforescente inorgánica forma el núcleo del indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica y al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, una cubierta encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica y la al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos un resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, la partícula fosforescente inorgánica y la al menos una partícula magnética o capa magnética forman el núcleo del indicador fosforescente.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para detectar al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende proporcionar un indicador fosforescente magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica y al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende además una cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica y la al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, el indicador comprende al menos un primer resto de reconocimiento molecular específico para el analito dispuesto en la cubierta.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto con la muestra el indicador fosforescente magnético mencionado anteriormente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende concentrar el indicador fosforescente magnético mediante el uso de un campo magnético. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto con una superficie el indicador fosforescente magnético concentrado. En algunas realizaciones, la superficie se funcionaliza con al menos un segundo resto de reconocimiento molecular específico para el analito. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además detectar una señal de luminiscencia del indicador magnético fosforescente; y determinar la presencia de un analito o cuantificar el analito en función de la señal de luminiscencia detectada. En algunas realizaciones, el primer resto de reconocimiento molecular se une al al menos un analito para generar la señal de luminiscencia.

En realizaciones adicionales, la presente descripción se refiere a procedimientos para detectar los indicadores fosforescentes en diversos entornos, tales como los entornos de diagnóstico (por ejemplo, la figura 31). En algunas realizaciones, los procedimientos implican la detección de luminiscencia de los indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, la luminiscencia de un indicador fosforescente puede detectarse por excitación del indicador fosforescente. En diversas realizaciones, el indicador fosforescente puede ser excitado por electrones, un campo eléctrico, fotones y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la luminiscencia se puede detectar simultáneamente con la excitación usando mecanismos selectivos de longitud de onda. En algunas realizaciones, la luminiscencia puede mejorarse mediante la aplicación de calor. En algunas realizaciones, la luminiscencia se puede detectar dentro de 1, 10, 100, 1000 o 10000000 milisegundos de interrupción de la excitación. En algunas realizaciones, la luminiscencia puede detectarse mediante mecanismos electrónicos, mecanismos ópticos, mecanismos optoelectrónicos, encofrado mecánico, rotación, mecanismos de reposicionamiento o flujo.

En algunas realizaciones, la luminiscencia se usa para obtener cuantitativa o cualitativamente una señal en un ensayo mediante imágenes con una cámara digital o basada en película (por ejemplo, una cámara digital con un CMOS, CCD u otro tipo de sensor). En algunas realizaciones, la luminiscencia se puede medir con un luminómetro, fluorómetro, espectrofotómetro u otro instrumento similar capaz de medir la intensidad de la luz.

En algunas realizaciones, se puede usar un teléfono móvil, un teléfono inteligente o un dispositivo electrónico portátil tal como, entre otros, una tableta, un asistente digital personal o un ordenador portátil para detectar la luminiscencia de los indicadores fosforescentes para la lectura de un ensayo cualitativo o cuantitativo. En algunas realizaciones, un teléfono móvil o dispositivo electrónico portátil puede estar acoplado a un accesorio para permitir la detección de luminiscencia de los indicadores fosforescentes para comprobar la presencia o ausencia de un analito en una muestra. En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a procedimientos para mejorar la detección de indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, las técnicas promedio como las presentadas en las figuras 36-40 se utilizan para lograr una mayor relación entre señal y ruido de la señal de luminiscencia de los indicadores fosforescentes utilizados en un ensayo para detectar la presencia o ausencia de un analito.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden utilizarse en diversos entornos de ensayo. En algunas realizaciones, los ajustes de ensayo pueden incluir, sin limitación, flujo lateral, ensayos de superficie unida, ensayos de flujo a través, ensayos asociados con materiales flotantes, o ensayos asociados con materiales magnéticos para concentración o astringencia de fuerza. En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a composiciones de materia que comprenden indicadores fosforescentes y membranas porosas tales como, pero sin limitación, nitrocelulosa, fibras de vidrio y fibras de algodón. En algunas realizaciones, las composiciones de materia que comprenden indicadores fosforescentes y membranas porosas se usan en ensayos para la detección de analitos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra distintas muestras de polvo fosforescente de aluminato de estroncio que se emiten a distintas longitudes de onda. Los distintos colores del material pueden permitir ensayos multiplexados en función del espectro. La figura 2 muestra datos de espectroscopía de rayos X dispersiva de energía (EDS, del inglés energy dispersive xray spectroscopy) de polvo fosforescente de aluminato de estroncio adquirido, con picos para C, O, Al, Dy, Sr, Ca, Eu y Dy indicados.

Las figuras 3A-3B muestran varios esquemas. Ilustran esquemáticamente el procedimiento de molienda para la reducción de tamaño de partículas fosforescentes con un molino de bolas o jarro habitual (figura 3A). Dibujo que representa los diversos defectos de una partícula que pueden conducir a la fractura y la reducción de tamaño durante la molienda (figura 3B) (adaptado de Introduction the Principles of Ceramic Processing - J. Reed, 1988).

La figura 4 muestra imágenes de polvo fosforescente de aluminato de estroncio después de la molienda húmeda en etanol en un recipiente de molienda de acero inoxidable con un molino mezclador de alta velocidad Retsch MM301. El aluminato de estroncio demostró ser demasiado abrasivo para el recipiente y la bola de molienda de acero, lo que resultó en una contaminación considerable del producto con partículas de acero, lo que dio lugar al color gris. Se llevaron a cabo experimentos con otros líquidos de molienda para garantizar que la contaminación fuera un efecto mecánico de la abrasión física del acero y no un fenómeno químico.

La figura 5 muestra imágenes de microscopía óptica de partículas fosforescentes de aluminato de estroncio. (A) Los polvos de aluminato de estroncio comercial de grado más fino, con diámetros de partículas efectivos de más de 50 |jm. (B) Partículas fosforescentes de aluminato de estroncio después de la molienda húmeda que producen partículas de menos de 10 jm de diámetro.

La figura 6 muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM, del inglés scanning electron microscopy) de partículas fosforescentes de aluminato de estroncio molidas. Una fracción considerable de las partículas presenta diámetros submicrométricos.

La figura 7 muestra el espectro de emisión de fósforos de aluminato de estroncio verde y una fotografía de una dispersión coloidal de partículas fosforescentes molidas tomada varios segundos después de la excitación. Las partículas molidas no se depositan rápidamente y también retienen una vida útil de luminiscencia larga.

La figura 8 muestra una distribución de tamaño de partícula de fósforos de aluminato de estroncio fraccionados por tamaño y molidos. Los datos fueron adquiridos con un instrumento resonador de microcanal suspendido.

La figura 9 muestra la reacción entre tetraetoxisilano (TEOS) y agua para producir sílice, y un esquema que muestra la encapsulación de sílice de una partícula fosforescente de radio inicial ro y un radio total r (t) que aumenta con el tiempo a medida que crece la capa de sílice.

La figura 10 muestra predicciones modelo de las concentraciones transitorias de tetraetoxisilano y sus hidrolizados durante el procedimiento de encapsulación de sílice. Se muestran dos condiciones iniciales distintas para la concentración inicial de agua. (Izquierda) Concentración inicial de agua del 5 % en volumen. (Derecha) Concentración inicial de agua del 20 % en volumen.

La figura 11 muestra el espesor calculado de la cubierta de sílice alrededor de una partícula con un diámetro inicial de 500 nm en función del tiempo y para distintas condiciones iniciales para la concentración inicial de agua.

La figura 12 muestra resultados de experimentos de encapsulación de sílice con distintas relaciones molares entre agua y tetraetoxisilano. Las partículas sometidas a distintos protocolos de encapsulación se resuspendieron en agua pura para formar coloides de la misma concentración, y se midió la luminiscencia como una función del tiempo para observar la efectividad de la cubierta de sílice para prevenir la hidrólisis. (Izquierda) tetraetoxisilano 20 mM, amoniaco 0,5 M (derecha), tetraetoxisilano 40 mM, amoniaco 0,5 M.

La figura 13 muestra espectros XPS de partículas fosforescentes de aluminato de estroncio sin encapsular desnudas y fósforos de aluminato de estroncio encapsulado en sílice.

La figura 14 muestra espectros XPS de fósforos de aluminato de estroncio encapsulados en sílice y fósforos encapsulados en sílice funcionalizados con NeutrAvidina.

La figura 15 muestra una distribución del tamaño de partícula de fósforos de aluminato de estroncio encapsulados en sílice funcionalizados con PEG. Los datos se obtuvieron con un instrumento de nanoporos ajustables por tamaño (IZON).

La figura 16 es un esquema que muestra la reacción de una partícula fosforescente encapsulada en sílice que reacciona con trietoxisililbutiraldehído (TESBA) para introducir aldehídos de superficie para la unión covalente de restos a la superficie.

La figura 17 muestra un esquema de un indicador fosforescente encapsulado en sílice con un anticuerpo acoplado a la superficie mediante aminación reductora entre un aldehído de superficie introducido por TESBA y una amina de la proteína.

Las figuras 18A -18B muestran un experimento de LFA de fósforo con indicadores fosforescentes antilisozima HyHEL-5 funcionalizados como se muestra en la figura 17. Las dos tiras del LFA marcadas con "+" presentaban una línea de análisis preparada al colocar lisozima de huevo de gallina directamente sobre la membrana de nitrocelulosa. La tira marcada con "-" fue un control negativo sin lisozima. Las tiras del LFA bajo iluminación de campo brillante (figura 18A). Las tiras del LFA después del modo de obtención de imágenes por fotoexcitación y luminiscencia (figura 18B).

La figura 19 muestra un experimento de LFA de fósforo con líneas de prueba D1.3 antilisozima. La lisozima del huevo de gallina (HEL, del inglés hen egg lysozyme) y la albúmina de suero bovino (BSA, del inglés bovine serum albumin) se utilizaron como analitos en las concentraciones especificadas. Partículas fosforescentes HyHEL-5 antilisozima funcionalizadas como se muestra en la figura 17 fueron utilizadas como indicadores.

La figura 20 muestra un experimento de LFA de fósforo con lisozima de huevo de gallina directamente localizada en la membrana como la línea de análisis en todas las tiras. (Izquierda) Los fósforos HyHEL-5 antilisozima utilizados como indicadores (Derecha) Los fósforos encapsulados de sílice se utilizaron como control para evaluar el efecto de los restos superficiales en el transporte de los indicadores fosforescentes a través de las membranas.

La figura 21 muestra un experimento de LFA de fósforo con una línea de análisis de lisozima localizada en una membrana de fibra de vidrio Fusion 5 con seis réplicas. Se usaron fósforos HyHEL-5 antilisozima como indicadores. Las figuras 22A-22C muestran un esquema que representa un indicador fosforescente funcionalizado con biotina-PEG-amina mediante aminación reductora con aldehídos de superficie en el fósforo de TESBA (figura 22A). Imagen de campo claro de tiras del LFA funcionalizadas con líneas de prueba de NeutrAvidina y corridas con fósforos de biotina-PEG como indicadores (figura 22B). Imagen de campo oscuro de las tiras del LFA que muestra luminiscencia de la línea de análisis de indicadores fosforescentes de biotina-PEG unidos (figura 22C). Las tiras 2 ' y 4 ' desde la izquierda no se detectaron con fósforos para mostrar que la luz que emana de la línea de análisis en las tiras 1' y 3 ' es de fósforos y no de las proteínas adsorbidas en la línea de análisis.

La figura 23 representa un indicador fosforescente con un anticuerpo unido covalentemente por un enlace amida formado por la química de carbodiimida entre un resto PEG injertado con un grupo terminal de ácido carboxílico y una amina primaria en el anticuerpo. El PEG se injertó en el indicador fosforescente mediante aminación reductora con aldehídos de TESBA.

La figura 24 es un esquema que representa la detección de lisozima biotinilada por un emparedado entre un anticuerpo antilisozima y un indicador fosforescente de NeutrAvidina.

La figura 25 muestra un experimento de LFA con analito de lisozima biotinilado, línea de análisis HyHEL-5, indicadores fosforescentes NeutrAvidina-PEG y línea de control BSA biotinilada.

La figura 26 muestra una repetición del experimento LFA en la figura 25 con concentraciones de analito más bajas evaluadas.

La figura 27 muestra un experimento de LFA con lisozima biotinilada como analito e indicadores fosforescentes de NeutrAvidina como en la figura 25 y la figura 26, pero con un anticuerpo monoclonal antilisozima distinto en la línea de análisis, D1.3.

La figura 28 muestra un experimento de LFA con fósforos de NeutrAvidina, analito de lisozima biotinilado, líneas de prueba D1.3 y líneas de control de BSA biotiniladas como en la figura 27, pero con membranas pasivizadas con leche en polvo sin grasa.

La figura 29 ilustra el principio de los ensayos de luminiscencia controlada en el tiempo o de resolución temporal con indicadores fosforescentes. En algún momento inicial, la intensidad de la luz de las partículas fosforescentes y el fondo es cercana a cero. La aplicación de una fuente de luz de excitación da como resultado un aumento en la fotoluminiscencia de los indicadores fosforescentes, y la luminiscencia de fondo contiene tanto fluorescencia automática como luz de excitación dispersa. Cuando se apaga la luz de excitación, el fondo decae rápidamente, y la señal del indicador fosforescente decae lentamente, lo que conduce a una mayor relación señal/fondo y un límite más bajo de detección.

La figura 30 muestra un experimento de LFA con indicadores fosforescentes de NeutrAvidina como en la figura 25 y la figura 26 después de una mayor optimización de los protocolos. El límite de detección es cercano a 100 pg/ml. La figura 31 muestra perfiles de intensidad de línea de análisis a través del ancho de las tiras del LFA del experimento mostrado en la figura 30. La figura ilustra el potencial para la cuantificación de la concentración de analito y ayuda a demostrar el límite bajo de detección.

Las figuras 32A-32B muestran una comparación de nanopartículas de oro e indicadores fosforescentes en LFA para detectar lisozima biotinilada. La figura 32a y la figura 32B son ensayos independientes.

La figura 33 muestra un análisis cuantitativo de experimentos de LFA con analitos de lisozima biotinilados e indicadores fosforescentes. El gráfico representa la relación de intensidad de la línea de análisis sobre la línea de control en función de la concentración de analito.

La figura 34 es un esquema general que muestra la detección de un analito arbitrario en un inmunoensayo de emparedado con anticuerpos de captura inmovilizados en una superficie y un indicador fosforescente.

Las figuras 35A-35B muestran un ensayo de flotación con indicadores fosforescentes para detectar un analito. Un objeto flotante como una microburbuja de vidrio se funcionaliza con anticuerpos y se une al analito que se reubica en la parte superior del líquido debido a la flotación del objeto flotante (figura 35a ). La luminiscencia se detecta desde la parte superior del líquido y la luminiscencia de fondo de los indicadores fosforescentes no unidos se bloquea por la absorción de colorante dentro del líquido. Imagen SEM que muestra indicadores fosforescentes unidos a microburbujas de vidrio en un experimento preliminar de ensayo de flotación (figura 35B).

Las figuras 36A - 36B muestran escaneados de líneas a lo largo de una tira de flujo lateral con indicadores fosforescentes de NeutrAvidina con 1 ng/ml de lisozima biotinilada como analito. Las imágenes fueron adquiridas con un iPhone 5s. Escaneado de línea desde el medio de la tira de flujo lateral a partir de una sola imagen (figura 36A). Escaneo de la línea desde el medio de la misma tira de flujo lateral, pero a partir de un promedio de 40 imágenes, lo que ilustra una disminución en el ruido de la promediación de la imagen (figura 36B).

La figura 37 ilustra un procedimiento alternativo para promediar imágenes para obtener escaneados de líneas de tiras del LFA con una alta relación entre señal y ruido usando el mismo sistema modelo con analito de lisozima biotinilada a 1 ng/ml e indicadores fosforescentes de NeutrAvidina como en la figura 36. En este caso, se toma una sola imagen de una tira de flujo lateral y se promedian múltiples escaneados de línea a lo largo de la tira desde esa imagen individual.

La figura 38 muestra el procedimiento de promediación de imágenes presentado en la figura 37, pero con una concentración de analito de 0,1 ng/ml. En un escaneado de línea individual, la línea de análisis queda enmascarada por el ruido, pero la señal de la línea de análisis se distingue fácilmente después de reducir el ruido promediando múltiples escaneados de línea.

Las figuras 39A -39B muestran imágenes en escala de grises adquiridas con un iPhone 5s de una tira del LFA con 0,1 ng/ml de lisozima biotinilada e indicadores fosforescentes de NeutrAvidina. La figura 39A muestra una imagen individual. La figura 39B muestra un promedio de 16 imágenes.

Las figuras 40A -40B muestran resultados del LFA para indicadores fosforescentes de NeutrAvidina que detectan 1 ng/ml de lisozima biotinilada. La imagen promedio de 40 imágenes en color RGB tomadas con un iPhone 5s (figura 40A). Perfil de intensidad correspondiente (figura 40B).

La Figura 41 muestra el procedimiento y la realización preferidos de la presente invención para detectar analitos. Los indicadores fosforescentes se aplican en un ensayo de flujo lateral, donde se unen a la línea de análisis en presencia de un analito. Una línea de control asegura que el ensayo funcionó correctamente. Los indicadores fosforescentes se cargan en una almohadilla conjugada que está conectada a una almohadilla de muestra. Una almohadilla absorbente actúa como una depresión para ayudar a absorber el líquido a través de la tira reactiva.

La figura 42 muestra un ensayo de flujo lateral con lectura de electroluminiscencia. La tira de flujo lateral se intercala parcial o totalmente entre dos electrodos, donde al menos uno de los cuales es transparente para permitir la transmisión de la luz. Se aplica un campo eléctrico constante o alterno entre los electrodos, lo que estimula a los indicadores fosforescentes para que emitan luminiscencia.

La figura 43 muestra un ejemplo de un accesorio de teléfono móvil para permitir la obtención de imágenes de luminiscencia controlada en el tiempo de ensayos o pruebas que incorporan indicadores fosforescentes que usan el hardware óptico nativo del teléfono. El accesorio, en parte, es similar a una funda protectora del teléfono y el teléfono simplemente se desliza en el accesorio. Se carga un cartucho de análisis en el puerto de inserción del accesorio y la región de interés dentro del cartucho de análisis se alinea con la cámara del teléfono. El flash de las luces integradas en el teléfono se utiliza para la fotoexcitación de los indicadores fosforescentes. El accesorio también puede incorporar una o más lentes que se alinean con las ópticas de la cámara en el teléfono para permitir la ampliación, una mayor sensibilidad o una menor distancia de trabajo. El accesorio también puede contener elementos tales como superficies reflectantes que redirigen la luz del teléfono de una manera que mejore la excitación de los indicadores fosforescentes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Deberá entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ilustrativas y explicativas, y no son restrictivas del tema en cuestión, como se reivindica. En esta aplicación, el uso del singular incluye el plural, la palabra «un» o «una» significa «al menos uno/a», y el uso de «o» significa «y/o», a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, el uso del término «incluido», así como otras formas, como «incluye» e «incluida», no es limitante. Además, términos tales como «elemento» o «componente» comprenden elementos o componentes que comprenden una unidad y elementos o componentes que comprenden más de una unidad, a menos que se indique específicamente lo contrario. Los parámetros descritos en la presente invención (p. ej., temperatura, tiempo, concentraciones, etc.) pueden ser aproximados.

Los encabezados de sección usados en la presente memoria sirven para propósitos organizativos y no se deben interpretar como limitantes de la materia en cuestión.

Muchas tecnologías y formatos de ensayo en biodetección y química analítica implican el uso de indicadores o marcadores para transducir la unión específica de un analito a un resto de reconocimiento molecular en una señal observable. La sensibilidad analítica o el límite de detección de un ensayo, por lo tanto, depende en gran medida de la detectabilidad de la señal generada por el indicador. Las tecnologías de los indicadores varían ampliamente en composición y mecanismos de generación de señal, lo que afecta a la sensibilidad, la linealidad y la estabilidad, lo que hace que algunas clases de indicadores se adapten mejor a aplicaciones particulares que otras.

Actualmente, algunos de los formatos de prueba más consistentes y ampliamente utilizados en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria se basan en membranas, tales como el ensayo de flujo lateral (LFA, del inglés lateral flow assay) o el ensayo de flujo continuo. Estas pruebas usan una membrana funcionalizada con elementos de reconocimiento molecular para unirse y capturar específicamente uno o más analitos y partículas submicrónicas coloreadas, como nanopartículas de oro o partículas de látex teñidas unidas al analito capturado, lo que permite la lectura visual de los resultados de la prueba. Sin embargo, estos indicadores colorimétricos limitan la sensibilidad del ensayo, y las pruebas que utilizan el mismo sistema de restos de reconocimiento con distintos indicadores, como las enzimas, pueden proporcionar límites de detección superiores. Otros indicadores, como las nanopartículas fluorescentes, pueden proporcionar una mejor linealidad entre la señal medida y la concentración de analito, además de un límite mejorado de detección.

A pesar de estas ventajas, las tecnologías indicadoras de alta sensibilidad poseen múltiples problemas que impiden su adopción generalizada en entornos de lugares en los que se presta la asistencia sanitaria. Las enzimas son propensas a la desnaturalización, lo que lleva a la pérdida de actividad con el tiempo. Además, muchas enzimas usan sustratos que requieren condiciones de refrigeración o almacenamiento que no son susceptibles de uso en la práctica. Casi todos los colorantes fluorescentes son propensos a la fotodecoloración, y muchas son propensas a la degradación química.

Se ha realizado un esfuerzo considerable en la industria y la comunidad científica e investigadora para mejorar los ensayos analíticos mediante el desarrollo de varios indicadores que incluyen nanopartículas de oro, marcadores fluorescentes, puntos cuánticos, fósforos de conversión ascendente, nanopartículas magnéticas y otros. Los indicadores que usan fotoluminiscencia para la lectura de la señal como nanopartículas fluorescentes o puntos cuánticos pueden mejorar la sensibilidad de los ensayos en comparación con los marcadores convencionales como las nanopartículas de oro, y también tienden a ser más estables que los indicadores enzimáticos. La mayoría de los indicadores de fotoluminiscencia requieren una fuente continua de luz de excitación para imágenes y mediciones cuantitativas, ya que la vida útil del estado excitado es generalmente corta (por ejemplo, 10 ns para colorantes fluorescentes orgánicos). Los filtros de emisión óptica no son perfectamente eficientes para bloquear la transmisión de la luz de excitación al detector, y muchos materiales utilizados en los ensayos, como las membranas de flujo lateral o flujo a través, además de las matrices de muestras biológicas, muestran cierta autofluorescencia. La autofluorescencia de fondo reduce la relación entre señal y ruido y, como resultado, a menudo dificulta la sensibilidad o el límite de detección de los ensayos. La fotoluminiscencia de resolución temporal puede mejorar aún más la sensibilidad de los ensayos al permitir que la autofluorescencia de fondo decaiga después de apagar la fuente de excitación y obtener imágenes tardías o mediciones cuantitativas, lo que aumenta la relación señal-ruido. Sin embargo, las mediciones con resolución temporal requieren que la sonda permanezca en un estado excitado durante más tiempo que el tiempo de descomposición de la autofluorescencia de fondo.

Los colorantes orgánicos fosforescentes, los complejos organometálicos y los quelatos metálicos presentan habitualmente vidas más largas en estado excitado que las sondas fluorescentes y los puntos cuánticos, y se han utilizado en ensayos con resolución temporal para la detección de analitos. Sin embargo, los colorantes organometálicos fosforescentes y los quelatos metálicos son generalmente caros y propensos a la fotodecoloración, lo que puede comprometer la fiabilidad en los ensayos de diagnóstico. Además, estos colorantes fosforescentes presentan una vida útil de emisión que todavía es relativamente corta, del orden de 10 ps a 1 ms. Por lo tanto, los ensayos de fotoluminiscencia con resolución temporal con quelatos metálicos o indicadores fosforescentes organometálicos requieren instrumentación cuidadosamente diseñada con tiempos de respuesta rápidos y demoras controladas con precisión entre la excitación y la medición.

Los análisis de laboratorio y en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria que utilizan fotoluminiscencia para la detección de analitos a menudo presentan una sensibilidad limitada con ciertos tipos de muestra debido a la autofluorescencia de moléculas no analíticas en la matriz de la muestra. Los fósforos de conversión ascendente que emiten luz visible en la excitación infrarroja o cercana al infrarrojo superan el problema de la autofluorescencia de la matriz de la muestra. Sin embargo, los fósforos de conversión ascendente presentan rendimientos cuánticos bajos y, por lo tanto, requieren fuentes de luz intensa como diodos láser para la excitación, y generalmente requieren el uso de sistemas complejos con hardware óptico relativamente costoso para lograr la sensibilidad deseable. Prácticamente todos los indicadores fotoluminiscentes que presentan una vida útil de emisión corta requieren una excitación continua para la lectura y, por lo tanto, se necesitan filtros ópticos para reducir la intensidad de la señal de fondo de la luz de excitación dispersa.

La fotoluminiscencia controlada en el tiempo puede superar los problemas de autofluorescencia utilizando un indicador con una vida útil de emisión relativamente larga en comparación con la fluorescencia (por ejemplo, 100 ps frente a 10 ns) e introduciendo una demora temporal entre la excitación y la medición para permitir que la señal de fondo no específica decaiga. Además, la fotoluminiscencia controlada en el tiempo puede permitirle a uno construir un dispositivo sin la necesidad de filtros ópticos, ya que la luz de excitación dispersa también decae rápidamente durante la demora temporal. Sin embargo, los indicadores existentes para fotoluminiscencia controlada en el tiempo requieren demoras definidas con precisión y relativamente cortas de 10-50 ps para una sensibilidad óptima, ya que la vida útil de las emisiones de los colorantes organometálicos o quelatos metálicos habituales en estos indicadores varía entre 100 y 500 ps. Por lo tanto, sería difícil implementar fotoluminiscencia controlada en el tiempo usando estos indicadores y los sistemas optoelectrónicos integrados en muchos dispositivos de consumo, como cámaras en teléfonos móviles y tabletas.

Los materiales fosforescentes inorgánicos tales como los aluminatos alcalinotérreos dopados con metales de tierras raras o metales de transición han encontrado uso en pantallas y pinturas luminiscentes. Los fósforos inorgánicos presentan una vida útil de emisión considerablemente más larga y una mayor estabilidad química y óptica que muchos de los indicadores utilizados en biodetección y química analítica. Estas propiedades hacen que los fósforos inorgánicos sean candidatos atractivos para superar los problemas con los indicadores en la técnica anterior. Sin embargo, la técnica anterior no enseña procedimientos para preparar indicadores basados en dichos materiales para aplicaciones de detección de analitos, ni demuestra cómo utilizar las propiedades ópticas de estos materiales para la detección altamente sensible.

Los materiales sólidos inorgánicos, cerámicos o cristalinos que emiten luz tras la estimulación con una fuente de energía tal como, entre otros, fotones, electrones, campos eléctricos o calor se denominan generalmente fósforos o materiales fosforescentes. El término «fosforescencia», en el contexto de sólidos inorgánicos, cerámicos o cristalinos, no debe confundirse con el fenómeno físico de la fosforescencia que ocurre o está asociada con colorantes o moléculas orgánicas, compuestos o moléculas organometálicos, o complejos de quelatos metálicos. En la presente descripción, los términos «fosforescencia», «fosforescente» y fósforo se refieren a material sólido inorgánico, cerámico o cristalino, a menos que se indique específicamente lo contrario. En la presente descripción, los términos «fosforescencia», «fosforescencia a largo plazo» y «luminiscencia persistente», son términos utilizados indistintamente para describir el fenómeno en el que un material sólido inorgánico, cerámico o cristalino emite luz durante largos períodos de tiempo, en el orden de microsegundos a horas, después de la estimulación con una fuente de energía como se menciona en esta invención.

Las nanopartículas o micropartículas de luminiscencia persistentes que emiten luz durante varios milisegundos a varias horas después de la excitación presentan una nueva y potencialmente vasta forma mejorada de diseñar ensayos cualitativos y cuantitativos con lectura de luminiscencia y sensibilidad mejorada debido a una autofluorescencia de fondo considerablemente menor, y con un hardware óptico mínimo. Además, las nanopartículas de luminiscencia persistentes inorgánicas son habitualmente mucho más resistentes a la fotodecoloración que los colorantes fluorescentes, las tinciones o los compuestos organometálicos y orgánicos fosforescentes e incluso los puntos cuánticos.

En una realización, la presente descripción se refiere a un indicador fosforescente que comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica. En algunas realizaciones, la partícula fosforescente inorgánica está encapsulada por una cubierta. En algunas realizaciones, al menos un resto de reconocimiento molecular está dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, la partícula fosforescente inorgánica forma el núcleo del indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente se une a través del al menos un resto de reconocimiento molecular a un analito diana para generar una señal de luminiscencia. En algunas realizaciones, la señal de luminiscencia se detecta por excitación de la al menos una partícula fosforescente inorgánica. En algunas realizaciones, la excitación de la al menos una partícula fosforescente inorgánica se logra mediante luz UV, o luz visible u otros fotones del espectro electromagnético. En algunas realizaciones, la al menos una partícula fosforescente inorgánica presenta una vida útil de luminiscencia que varía de aproximadamente 10 microsegundos a aproximadamente una hora. En algunas realizaciones, la al menos una partícula fosforescente inorgánica presenta una vida útil de luminiscencia de varias horas.

En algunas realizaciones, la al menos una partícula fosforescente inorgánica comprende un material huésped inorgánico dopado con al menos un metal de tierras raras o al menos un metal de transición. En algunas realizaciones, el al menos un material huésped inorgánico es sulfuro de zinc, o sulfuro de calcio, o silicatos alcalinotérreos, o aluminatos alcalinotérreos o titanatos. En algunas realizaciones, los silicatos alcalinotérreos se seleccionan de entre un grupo que consiste en silicato de berilio, silicato de calcio, silicato de magnesio y silicato de bario. En algunas realizaciones, los aluminatos alcalinotérreos se seleccionan de entre un grupo que consiste en aluminato de estroncio, aluminato de calcio, aluminato de magnesio, aluminato de berilio y aluminato de bario y magnesio. En algunas realizaciones, los titanatos se seleccionan de entre el grupo que consiste en titanato de calcio, titanato de magnesio y titanato de plomo. En algunas realizaciones, la al menos una partícula fosforescente inorgánica comprende aluminato de estroncio dopado con al menos un metal de tierras raras. En algunas realizaciones, el al menos un metal de tierras raras comprende europio, o disprosio, o lantánidos o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la al menos una partícula fosforescente inorgánica comprende un material huésped de óxido metálico inorgánico dopado con un metal.

En algunas realizaciones, la envoltura que encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica comprende un recubrimiento a base de silicio. En algunas realizaciones, el revestimiento a base de silicio se selecciona de entre el grupo que consiste en óxido de silicio, sílice, silicatos y silanos organofuncionales. En algunas realizaciones, la cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica comprende un polímero hidrófilo. En algunas realizaciones, el polímero hidrófilo es polietilenglicol.

En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento molecular comprende un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o un antígeno, o ácido nucleico, o péptido, o un aptámero. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento molecular comprende conectores dispuestos en la cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica. En alguna realización, los enlazadores se seleccionan de entre el grupo que consiste en trietoxisililbutiraldehído (TESBA), polietilenglicol (PEG), polietilenglicol homobifuncional, polietilenglicol heterobifuncional, (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) y trialcoxisilanos. En algunas realizaciones, los enlazadores comprenden además un grupo funcional para el acoplamiento a una molécula diana. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento molecular comprende grupos funcionales dispuestos directamente sobre la cubierta. En algunas realizaciones, los grupos funcionales se seleccionan de entre el grupo que consiste en grupos amina, grupos carboxilo, aldehídos, cetonas, hidroxilos, tioles e hidrazida, anhídridos, alquinos y azidas. En algunas realizaciones, la al menos una partícula fosforescente inorgánica es una nanopartícula. En algunas realizaciones, el tamaño del indicador fosforescente es de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nM.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para realizar un indicador fosforescente que comprende preparar partículas fosforescentes inorgánicas. En algunas realizaciones, el procedimiento implica encapsular las partículas fosforescentes inorgánicas en una cubierta. En alguna realización, el procedimiento se refiere a disponer al menos un resto de reconocimiento molecular en la cubierta. En algunas realizaciones, las partículas fosforescentes inorgánicas forman el núcleo del indicador fosforescente. En algunas realizaciones, la etapa de preparar partículas fosforescentes inorgánicas comprende la reducción del tamaño de los polvos fosforescentes inorgánicos. En algunas realizaciones, la reducción de tamaño comprende molienda húmeda, o criomolienda, o molienda vibratoria, o molienda de cuentas, o molienda en seco, o molienda por desgaste, o molienda por chorro, o molienda, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la reducción de tamaño es mediante molienda húmeda y fraccionamiento. En algunas realizaciones, la molienda húmeda se lleva a cabo en presencia de disolventes orgánicos o alcoholes. En algunas realizaciones, el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo que consiste en acetato de etilo, tolueno, ciclohexano, ciclopentano y decano. En algunas realizaciones, el alcohol es etanol, o isopropanol, o butanol.

En algunas realizaciones, la etapa de encapsular las partículas fosforescentes inorgánicas usa el proceso de Stober o variantes modificadas del proceso de Stober. En algunas realizaciones, la etapa de disponer un resto de reconocimiento molecular se realiza antes, durante o después de la etapa de encapsulación. En algunas realizaciones, la etapa de disponer el al menos un reconocimiento molecular es por adsorción física o por enlace covalente. En algunas realizaciones, la etapa de disponer el al menos un resto de reconocimiento molecular comprende la funcionalización de la superficie de la cubierta con al menos una molécula enlazadora. En algunas realizaciones, la al menos una molécula enlazadora se selecciona de entre el grupo que consiste en trietoxisililbutiraldehído (TESBA), polietilenglicol (PEG), (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) y trialcoxisilanos. En algunas realizaciones, la al menos una molécula enlazadora comprende al menos un grupo funcional para acoplar al al menos un resto de reconocimiento molecular. En algunas realizaciones, el al menos un grupo funcional se selecciona de entre el grupo que consiste en grupos amina, grupos carboxilo, aldehídos, cetonas, hidroxilos, tioles, hidrazidas, anhídridos, azidas y alquinos. En algunas realizaciones, la etapa de disponer al menos un resto de reconocimiento molecular comprende además conjugar la molécula enlazadora con un resto de reconocimiento molecular a través del grupo funcional. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento molecular comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, ácido nucleico, péptido, proteína o un aptámero. En algunas realizaciones, la etapa de disponer un resto de reconocimiento molecular comprende al menos un grupo funcional dispuesto directamente sobre la cubierta. En algunas realizaciones, el grupo funcional está acoplado a un extremo de al menos una cadena de polietilenglicol. En algunas realizaciones, el otro extremo de la cadena de polietilenglicol está acoplado al al menos un resto de reconocimiento molecular.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la detección de al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende la etapa de proporcionar un indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto el indicador fosforescente con la muestra. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de detectar la señal de luminiscencia del indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de determinar la presencia de un analito y cuantificar el analito en función de la señal de luminiscencia detectada.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la detección in vitro de al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende la etapa de proporcionar un indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además cargar el indicador fosforescente en un material poroso. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con el material poroso cargado con el indicador fosforescente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende permitir que la muestra y el indicador fosforescente fluyan a través de una membrana porosa. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende detectar zonas de luminiscencia o ausencia de luminiscencia en la membrana para indicar la presencia o ausencia del al menos un analito. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la cuantificación del analito detectado.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la detección in vitro de al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende los pasos de proporcionar un indicador fosforescente; y proporcionar al menos un primer elemento de reconocimiento molecular inmovilizado en una superficie, donde el elemento de reconocimiento molecular inmovilizado es capaz de unirse al al menos un analito. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto la muestra con la superficie para permitir la unión del al menos un analito al elemento de reconocimiento molecular de modo que el analito se inmovilice. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto el indicador fosforescente con la superficie para permitir la unión del indicador fosforescente al al menos un analito inmovilizado; y medir la señal de luminiscencia del indicador fosforescente para permitir la detección o cuantificación del analito. En algunas realizaciones, la superficie comprende chips de sistemas microfluídicos, o sistemas microfluídicos de papel, o membranas, o microplacas, o microburbujas para flotación, o superficies transparentes. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica; una cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente; y un segundo resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, el segundo resto de reconocimiento molecular se une al al menos un analito inmovilizado para generar la señal luminiscente. En algunas realizaciones, la luminiscencia del indicador fosforescente se detecta proporcionando una fuente de luz adecuada para la fotoexcitación del indicador fosforescente; proporcionando un sensor capaz de detectar luminiscencia del indicador fosforescente; iluminando el indicador fosforescente con la fuente de luz; apagando la fuente de luz; esperando un período de tiempo definido para permitir la descomposición del fondo; y midiendo la luminiscencia emitida por el indicador fosforescente.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un indicador fosforescente magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende una cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica y al menos un resto magnético dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos un resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, la partícula fosforescente inorgánica forma el núcleo del indicador fosforescente.

En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica y al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, una cubierta encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica y la al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos un resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta. En algunas realizaciones, la partícula fosforescente inorgánica y la al menos una partícula magnética o capa magnética forman el núcleo del indicador fosforescente.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento para detectar al menos un analito dentro de una muestra. Tal procedimiento comprende proporcionar un indicador fosforescente magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende al menos una partícula fosforescente inorgánica y al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente magnético comprende además una cubierta que encapsula la al menos una partícula fosforescente inorgánica y la al menos una partícula magnética o capa de material magnético. En algunas realizaciones, el indicador comprende al menos un primer resto de reconocimiento molecular específico para el analito dispuesto en la cubierta.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además poner en contacto con la muestra el indicador fosforescente magnético mencionado anteriormente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende concentrar el indicador fosforescente magnético mediante el uso de un campo magnético. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto con una superficie el indicador fosforescente magnético concentrado. En algunas realizaciones, la superficie se funcionaliza con al menos un segundo resto de reconocimiento molecular específico para el analito. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además detectar una señal de luminiscencia del indicador magnético fosforescente; y determinar la presencia de un analito o cuantificar el analito en función de la señal de luminiscencia detectada. En algunas realizaciones, el primer resto de reconocimiento molecular se une al al menos un analito para generar la señal de luminiscencia.

El aluminato de estroncio dopado con europio y disprosio (SrAhO4:Eu2+, Dy3+) es un fósforo inorgánico de larga duración con luminiscencia observable durante varias horas después de la excitación. Presenta una intensidad de emisión más alta que los fósforos comerciales más comunes, como los fósforos de sulfuro de zinc dopados, por lo que es un material ideal para marcadores en diagnósticos in vitro y otros ensayos de unión. El aluminato de estroncio presenta la ventaja adicional de ser altamente fotoestable, lo que permite volver a obtener imágenes más tarde de las tiras reactivas u otros ensayos que utilizan los fósforos sin una pérdida considerable de luminiscencia y sensibilidad, lo que permite una confirmación secundaria fiable de los resultados del ensayo. La fotoestabilidad del indicador también ayuda a garantizar la coherencia entre los ensayos y puede prolongar la vida útil de un kit de diagnóstico que utiliza marcadores luminiscentes.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un procedimiento de fabricación de fósforos de aluminato de estroncio para ensayos de diagnóstico, tales como inmunoensayos de diagnóstico o ensayos de hibridación de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a polvos de aluminato de estroncio fosforescentes. La figura 1 muestra muestras de fósforo de aluminato de estroncio de distintos tamaños de grano y longitud de onda de emisión obtenidas como imágenes en la oscuridad. Las recetas de síntesis en estado sólido para producir fósforos dan como resultado grandes trozos del material que se pueden moler utilizando equipos como trituradoras y rodillos en combinación con tamices de un tamaño de malla específico para obtener el material más fino necesario para aplicaciones típicas como pintura que brille en la oscuridad.

Las imágenes de microscopía óptica (figura 5A) de los fósforos de grado más fino adquiridos revelaron que la mayor parte del material estaba confinado en partículas con diámetros efectivos mucho mayores que 10 pm, que es demasiado grande para la mayoría de los formatos de ensayo ya que las velocidades de sedimentación de Stokes son demasiado rápidas (p. ej., 150 pm/s en agua para una esfera de 10 pm de aluminato de estroncio). Para usar indicadores fosforescentes en la mayoría de los formatos de ensayo, es deseable que las partículas sean sustancialmente más pequeñas que el material comercial de grado más fino, de modo que las partículas se suspendan fácilmente en tampones u otros líquidos.

En algunas realizaciones, se puede usar un mortero y una mano de mortero típicos para reducir la mayor parte del polvo comercial a dimensiones submicrométricas. En algunas realizaciones, se puede usar un procedimiento de molienda húmeda para reducir el tamaño medio de partícula a dimensiones submicrométricas (figura 3). En algunas realizaciones, el polvo comercial de grado fino puede suspenderse en un disolvente anhidro o hidrófobo con medios de molienda adecuados en un recipiente de molienda y situarse en un molino durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, hasta 9 días).

En algunas realizaciones, la molienda húmeda es deseable para una reducción de tamaño efectiva, ya que la molienda en seco puede dar como resultado aglomerados de polvo densamente empaquetados en los lados del recipiente de molienda que mantiene una gran fracción del material aislado del procedimiento de molienda. En algunas realizaciones, mantener las partículas suspendidas en disolución ayuda a asegurar que casi todo el material se muela uniformemente. Muchos fósforos inorgánicos son propensos a la hidrólisis, por lo que es deseable un líquido anhidro o hidrófobo en algunas realizaciones para reducir el tamaño de partícula mientras se conservan las propiedades de luminiscencia de las partículas.

Los solicitantes han descubierto que la dureza relativa del material sometido a trituración a través del recipiente de molienda y los medios de molienda es un factor importante que influye en el rendimiento del procedimiento de molienda. En algunas realizaciones, los solicitantes usaron dos molinos distintos, un molino de bolas de gres cerámico de EE. UU. y un molino mezclador de alta velocidad Retsch MM301. El molino mezclador de alta velocidad usó un recipiente de molienda de acero inoxidable y una bola de molienda de acero inoxidable de 2 cm como medio de molienda, lo que resultó ineficaz para reducir el tamaño de partícula ya que el aluminato de estroncio era altamente abrasivo para el acero y daba como resultado la contaminación (figura 4). Además, incluso los niveles traza de algunos elementos pueden matar efectivamente la luminiscencia de los sólidos inorgánicos, como es el caso del hierro en los fósforos de sulfuro de zinc, que deben tenerse en cuenta al seleccionar los medios de molienda y el recipiente de molienda. Una imagen de una dispersión coloidal de fósforos molidos que muestra fotoluminiscencia brillante y el espectro de emisión correspondiente se presenta en la figura 7.

El molino de gres cerámico de EE. UU. usó un recipiente de cerámica y medios de molienda de zirconia, y demostró ser mucho más efectivo para reducir el tamaño de partícula sin contaminación cuando la molienda húmeda se realizó con aproximadamente 5 gramos de polvo de aluminato de estroncio suspendido en 50 ml de acetato de etilo. La figura 5 muestra imágenes de microscopía óptica del polvo fosforescente adquirido y una amplia reducción de tamaño después de 24 horas de molienda húmeda.

La microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló muchas partículas submicrométricas después de aproximadamente una semana de molienda húmeda (figura 6). Se usó la sedimentación diferencial con una centrífuga para eliminar las partículas más grandes y aislar las fracciones con distribuciones de tamaño más estrechas. Los procedimientos de molienda y fraccionamiento permiten el aislamiento de partículas pequeñas que no se depositan rápidamente en líquidos y aún conservan sus propiedades de luminiscencia persistentes (figura 7). Una combinación de molienda y fraccionamiento puede lograr distribuciones de tamaño relativamente estrechas de partículas de tamaño nanométrico (figura 8).

El aluminato de estroncio no es estable en agua y se hidroliza fácilmente, lo que disminuye en gran medida o destruye por completo las propiedades luminiscentes del material. La encapsulación con sílice utilizando un proceso Stober modificado se llevó a cabo para que las partículas fueran estables en agua a la vez que conservaban sus propiedades de luminiscencia. La encapsulación de sílice de los fósforos de aluminato de estroncio no es trivial ya que el agua no solo es un reactivo esencial en el proceso de Stober, sino que también degrada los fósforos hidrolíticamente. Se necesita una hidrólisis extensa del precursor de silicio tetraetoxisilano (TEOS) para formar una barrera de sílice resistente al agua afectiva que encapsule las partículas, como se ilustra en las figuras 9-11. Ejecutar el proceso Stober durante demasiado tiempo o con una baja concentración de fósforos puede dar como resultado partículas de sílice pura indeseables en la mezcla sin núcleos fosforescentes, y podría encapsular partículas en demasiada sílice de manera que afecte negativamente a la luminiscencia. La figura 12 muestra los resultados de los experimentos de optimización del proceso Stober, que demuestran que se necesita una alta concentración de agua (“ Í8 % v/v) para que las partículas sean estables en agua, lo que coincide con las predicciones del modelo del espesor de la cubierta de sílice como una función de concentración de agua inicial (figura 11). Los datos muestran que los fósforos encapsulados pueden suspenderse en agua durante al menos 2 semanas sin una pérdida considerable de luminiscencia. Según la experiencia de los solicitantes, los fósforos encapsulados aparentemente no experimentan degradación hidrolítica, incluso después de un mes en agua.

La espectroscopía de rayos X dispersiva de energía (EDS) se usó para el análisis elemental básico de los fósforos adquiridos, para confirmar la presencia de picos de Si después del proceso Stober, y buscar contaminación de circonio debida a la molienda. La figura 2 muestra el espectro EDS de fósforos de aluminato de estroncio desnudos. Los solicitantes no observaron ningún pico de EDS de circonio a partir de fósforos molidos, lo que indica una contaminación insignificante. Los picos de Si Ka y Sr La se superponen a alrededor de 1,7-1,8 keV, lo que dificulta la verificación mediante EDS de la encapsulación de sílice exitosa, motivo por el que se usó espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) para la caracterización y análisis de la superficie. Los datos XPS en la figura 13 confirman la presencia de Si, y la supresión de los picos de Sr y Al indica que las partículas están efectivamente encapsuladas en sílice, con un espesor de capa de sílice de al menos 20 nm.

Se usaron varias técnicas de dimensionamiento de partículas para analizar los fósforos, incluidas dispersión dinámica de luz (DLS), mediciones de masa de resonador de microcanal suspendido con un Sistema de Metrología de Partículas Archimedes de Affinity Biosensors (figura 8), y mediciones basadas en el volumen de partículas individuales con un nanoporo de tamaño ajustable IZON (figura 15). Los datos demuestran que los solicitantes pueden aislar fósforos submicrométricos mediante una combinación de molienda húmeda y fraccionamiento. Eliminar las partículas más grandes de aproximadamente una micra de diámetro es esencial para formatos de diagnóstico como el análisis de flujo lateral y el análisis de flujo a través para minimizar el bloqueo de los poros en las membranas.

La estrategia inicial para acoplar anticuerpos a la superficie de las partículas implicaba la introducción de aldehídos de superficie por trietoxisililbutiraldehído (TESBA) como se muestra en la figura 16, seguido de aminación reductora directa de aldehídos de superficie con proteínas (figura 17).

En diversas realizaciones, se pueden usar otros trialcoxisilanos como (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) y diversos clorosilanos como sustitutos de TESBA con algunas ligeras modificaciones de los protocolos de química conjugada. En diversas realizaciones, los reticuladores como 1, 2-bis (trietoxisilil) etano (BTEOSE) y bis [3-(trimetoxisilil) propil] amina (BTMOSPA) también se pueden usar en combinación con un alcoxisilano para mejorar la estabilidad hidrolítica de los grupos reactivos de la superficie cuando las partículas se suspenden en agua o tampón.

El ensayo de flujo lateral (LFA) es uno de los formatos de diagnóstico in vitro más comunes para aplicaciones en lugares en los que se presta la asistencia sanitaria. Muchos LFA se llevan a cabo utilizando un dispositivo como el presentado en la figura 41, con una almohadilla de muestra, una almohadilla conjugada, una membrana y una almohadilla absorbente conectadas para formar una tira inmunocromatográfica que se funcionaliza con algún tipo de restos de reconocimiento molecular para detectar un analito. Existen numerosas variaciones del dispositivo de la figura 41, como combinar todos los componentes (por ejemplo, la almohadilla de muestra, la almohadilla conjugada, etc.) en una única membrana o almohadilla para la detección de analitos. En el contexto de la presente descripción y aplicación, un LFA generalmente se refiere a cualquier prueba en la que una muestra fluye o se absorbe dentro o lateralmente a través de un material poroso para permitir la detección de al menos un analito o permitir la confirmación de la ausencia de al menos un analito. Un LFA puede ser únicamente cualitativo y proporcionar un resultado sí/no, y también puede ser un análisis cuantitativo para determinar la cantidad o concentración total de un analito. Un LFA puede diseñarse de manera que la presencia de una señal y la intensidad de esa señal, como la luminiscencia de un indicador fosforescente, sea proporcional a la concentración de un analito. Un LFA también se puede diseñar en un formato competitivo de modo que la presencia de un analito disminuya la intensidad de una señal específica, una técnica que se emplea comúnmente para detectar moléculas pequeñas como las drogas.

Las figuras 18-21 muestran resultados de intentos de experimentos de LFA con indicadores de fósforo donde los anticuerpos se acoplaron directamente a los fósforos a través de aldehídos, como se muestra en la figura 17. Por lo general se observó agregación y fue difícil hacer que las partículas fluyeran a través de las membranas de nitrocelulosa y fibra de vidrio. Se realizó un experimento preliminar para ver si la conjugación de PEG con las partículas podría mejorar el transporte de fósforos a través de las membranas de flujo lateral mediante el acoplamiento de los aldehídos de la superficie de los indicadores fosforescentes a la amina-PEG-biotina (figura 22A-22B). Las líneas de prueba se detectaron con NeutrAvidina en membranas de nitrocelulosa. Se observó poca señal de fondo en las tiras del LFA a partir de fósforos en la membrana y se observó una fuerte señal en la línea de análisis. Los solicitantes también han observado que los indicadores fosforescentes se resuspenden más fácilmente en disoluciones acuosas después de la sedimentación centrífuga cuando se funcionalizan con PEG. Se podrían usar otros polímeros hidrófilos o hidrosolubles en combinación con o en lugar de PEG para funcionalizar indicadores fosforescentes. En todos los experimentos posteriores, los indicadores fosforescentes se funcionalizaron con PEG antes de la bioconjugación.

La amina heterobifuncional-PEG-carboxilo se acopló a los aldehídos de la superficie de los indicadores fosforescentes por aminación reductora, y los grupos carboxilo terminales se usaron para el acoplamiento a las aminas primarias mediante química de carbodiimida usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (figura 23). Las figuras 25-28 y 30-33 muestran los resultados de varios experimentos de LFA para detectar lisozima biotinilada con indicadores fosforescentes funcionalizados con amina-PEG-carboxilo y NeutrAvidina. En la figura 24 se muestra un esquema que ilustra la detección de lisozima biotinilada con un indicador fosforescente de NeutrAvidina. Los indicadores fosforescentes dieron como resultado una detección altamente sensible del analito, con un rendimiento mejor que la nanopartícula de oro comúnmente utilizada en los LFA (figura 32), y potencialmente permiten una cuantificación directa de la señal de luminiscencia. La figura 31 muestra perfiles de intensidad desde la línea de análisis a través del ancho de las tiras del LFA del experimento en la figura 30.

La intensidad de la señal en la línea de análisis es proporcional a la concentración de analito, y podría estar relacionada con una curva de calibración para permitir la determinación de la concentración o la cantidad de un analito de una muestra desconocida. La figura 33 muestra un ejemplo de un tipo de curva de calibración que podría generarse para permitir la cuantificación de analitos. En este caso, la relación entre la intensidad de la línea de análisis y la intensidad de la línea de control se usa como una medida cuantitativa para la señal. Se podrían emplear otros medios de cuantificación, como el recuento absoluto de fotones.

En algunas realizaciones, un ensayo, tal como un ensayo de flujo continuo o LFA, está diseñado para analizar múltiples analitos usando indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, se analizan múltiples analitos mediante el uso de multiplexación espectral en la que se funcionalizan distintos fósforos con espectros de emisión distintos para permitir la detección de distintos analitos. En algunas realizaciones, la multiplexación se lleva a cabo utilizando distintas entidades de reconocimiento que se unen a distintos analitos y funcionalizando distintas ubicaciones de una superficie utilizada en un ensayo con distintas entidades de reconocimiento.

La detección de luminiscencia de los indicadores fosforescentes en cualquier formato de ensayo arbitrario se muestra en la figura 29. En algún momento inicial, se enciende una fuente de luz de excitación que causa un aumento en la fotoluminiscencia de los indicadores fosforescentes y un aumento en la señal de fondo de la autofluorescencia del entorno local, incluidos los materiales del dispositivo de ensayo y la matriz de muestra, además de la luz de fondo de la dispersión de la fuente de excitación. En esta ilustración, la intensidad relativa de los indicadores fosforescentes y el fondo son iguales. Cuando se apaga la luz de excitación, la señal de fondo decae rápidamente mientras que el indicador fosforescente emite continuamente luminiscencia, lo que resulta en una relación señal/fondo aumentada.

Los solicitantes han observado que los fósforos pueden servir como marcadores en LFA para una variedad de analitos después de la optimización, incluida la detección de virus completos, bacterias y una variedad de proteínas. Los indicadores fosforescentes son útiles en formatos de ensayo distintos del LFA y generalmente se pueden usar en cualquier ensayo de unión como se muestra en el esquema de la figura 34. El esquema muestra anticuerpos en la superficie para capturar analito y anticuerpos en las partículas, pero tanto los anticuerpos en las partículas como los anticuerpos inmovilizados en la superficie pueden sustituirse por cualquier otra entidad capaz de reconocimiento molecular, como un ácido nucleico, lectina, aptámero u otra molécula.

Un formato de ensayo con el que los solicitantes han realizado experimentos preliminares es el ensayo de flujo continuo (FTA). En un FTA, las entidades de reconocimiento molecular se adsorben o inmovilizan en una membrana, y a continuación una muestra e indicadores fosforescentes se hacen fluir directamente a través de la membrana en lugar de lateralmente. La muestra y los indicadores fosforescentes pueden agregarse secuencialmente a la membrana de flujo a través, o mezclarse previamente y luego agregarse a la membrana. A continuación, se realizan imágenes o mediciones cuantitativas para examinar la luminiscencia que emana de la membrana, que es habitualmente, pero no necesariamente, proporcional a la concentración de analito.

Los solicitantes también han experimentado con fósforos en ensayos de flotación en los que un objeto flotante (una microburbuja de sílice o una lámina delgada de polietileno) forma un complejo de emparedado con un analito y un fósforo y flota hasta la parte superior de la disolución de muestra, por lo que arrastra el fósforo él. Agregar colorante a la mezcla reduce la señal de fondo de los indicadores fosforescentes suspendidos en la solución y asegura que la mayor parte de la señal de luminiscencia provenga de fósforos unidos al analito y al objeto flotante en la parte superior de la muestra. Un esquema del ensayo de flotación se muestra en la figura 35 junto con una imagen SEM de fósforos unidos a una microburbuja de un experimento de ensayo de flotación anterior. En este experimento, los indicadores fosforescentes funcionalizados con anti-E. coli se agregaron a un tubo de microcentrífuga que contenía una muestra con E. coli y microburbujas funcionalizadas con anticuerpos anti-E. coli. El contenido del tubo se mezcló y luego se dejó sedimentar antes de medir la luminiscencia desde la parte superior que surge de las burbujas con los indicadores fosforescentes unidos.

Los datos de los experimentos de LFA mostrados hasta la figura 33 fueron adquiridos utilizando un sistema estándar de obtención de imágenes por fluorescencia y quimioluminiscencia en gel. La lectura de ensayos realizados con indicadores fosforescentes también se puede llevar a cabo con dispositivos de bajo coste en electrónica de consumo, como una cámara de teléfono móvil. Las figuras 39-40 muestran imágenes de tiras del LFA con indicadores fosforescentes excitadas con un LED UV/azul de 2,5 mW y obtenidas con un iPhone 5s. Estas imágenes se adquirieron de forma controlada en el tiempo como se muestra en la figura 29, iluminando brevemente las tiras para excitarlas, apagando el LED y capturando una imagen. También se podría usar la luz nativa en un teléfono o dispositivo móvil como fuente de excitación.

Una interpretación típica de los resultados del LFA (es decir, si la muestra es positiva o negativa), puede llevarse a cabo buscando la presencia o ausencia de una línea de análisis en la tira. Por ejemplo, la línea de análisis es claramente visible en la figura 40A, que indica la presencia de un analito. También es posible interpretar los resultados observando escaneados de líneas que muestran la intensidad relativa a lo largo de una franja de flujo lateral y buscando un pico de magnitud suficiente o zona en la línea de análisis para indicar la presencia de un analito (figura 36-38, figura 40B).

Los solicitantes han demostrado que pueden usarse diversas técnicas de promediación para mejorar la detectabilidad de los indicadores fosforescentes mediante reducción de ruido. La figura 36 muestra un escaneado de línea de una sola imagen de una tira de flujo lateral con indicadores fosforescentes de NeutrAvidina, y un escaneado de línea del promedio de múltiples imágenes de la misma tira, lo que demuestra la efectividad de la promediación de la imagen para reducir el nivel de ruido. Esta estrategia de promediación de imagen también se muestra en la figura 39 con una baja concentración de analito a 0,1 ng/mL. La figura 37 muestra un escaneado de una sola línea y promedios de múltiples escaneados de línea obtenidos de una sola imagen de una tira del LFA. Esta estrategia de promediación de escaneado de línea puede permitir la detección de analitos de una imagen individual relativamente ruidosa de luminiscencia de indicadores fosforescentes. La efectividad de la promediación de escaneado de línea se demuestra adicionalmente en la figura 38, donde el pico de la línea de análisis en el perfil de intensidad se distingue fácilmente del ruido después de promediar múltiples escaneados de línea. Se puede usar una combinación de la promediación de obtención de imágenes junto con la promediación de escaneado de línea para mejorar la detectabilidad de la señal de los indicadores fosforescentes.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden incorporarse en pruebas, tales como, pero sin limitarse a, LFA, ensayos de flujo continuo, ensayos de inmersión, ensayos de laboratorio en un chip, ensayos de aglutinación, sistemas microfluídicos, sistemas microfluídicos de papel, ensayos de microplacas, sistemas multifásicos, inmuno-PCR u otros formatos de ensayo. En algunas realizaciones, estas pruebas pueden leerse, interpretarse o analizarse usando un dispositivo electrónico con algún tipo de detector de luz. En algunas realizaciones, el dispositivo electrónico es un dispositivo electrónico portátil tal como un teléfono móvil, teléfono inteligente, asistente digital personal, reloj inteligente, tableta u ordenador portátil. En algunas realizaciones, el dispositivo electrónico portátil puede estar conectado a un accesorio tal como el ilustrado en la figura 43. En algunas realizaciones, dicho accesorio puede servir para varios propósitos que pueden incluir bloquear la luz ambiental y de fondo, contener un cartucho de análisis o dispositivo en una posición para permitir la detección de luminiscencia de los indicadores fosforescentes, proporcionar una fuente de luz para la fotoexcitación de indicadores fosforescentes, redirigir la luz que surge del dispositivo electrónico portátil para iluminar o fotoexcitar a los indicadores fosforescentes, proporcionar otros elementos como elementos de calentamiento o circuitos electrónicos para mejorar la señal u otras funciones o procedimientos en un ensayo como la desnaturalización, hibridación, amplificación, electroforesis y otros.

En algunas realizaciones, el dispositivo electrónico portátil para la lectura de ensayos de análisis que usan indicadores fosforescentes puede transmitir resultados de los análisis a otros dispositivos electrónicos, una red, nube, base de datos o sistema de información para análisis, interpretación o almacenamiento adicionales. En algunas realizaciones, como para estudios y encuestas epidemiológicas, el dispositivo electrónico portátil es capaz de geomarcar una prueba individual, de modo que se registre la ubicación geográfica y la hora en que se realizó la prueba.

A menudo es deseable tener un indicador que también sea magnético, ya que esto puede ser útil en la preparación de muestras, para la concentración previa de analito antes de realizar un ensayo, u otros procedimientos que den como resultado una mejora general del rendimiento del ensayo. Los indicadores fosforescentes pueden hacerse magnéticos uniéndolos a nanopartículas magnéticas, mediante encapsulación simultánea de fósforos y nanopartículas magnéticas, o por otros medios.

Se informa que las partículas fosforescentes inorgánicas se pueden oscurecer o desexcitar de manera efectiva mediante fotoestimulación con radiación electromagnética de longitud de onda larga como un láser rojo o luz infrarroja. Esta propiedad óptica podría explotarse en varios formatos de ensayos analíticos que utilizan indicadores fosforescentes. Por ejemplo, la iluminación láser podría usarse para reducir el brillo de emisión de todos o un subconjunto de fósforos, especialmente fósforos ubicados específicamente en un área particular, o que no estén sombreados.

En la presente descripción, la excitación de los marcadores fosforescentes se consigue preferiblemente usando luz, y por lo tanto la luminiscencia medida se clasifica como fotoluminiscencia, y la excitación por luz de los marcadores fosforescentes se denomina fotoexcitación. En la presente descripción, los marcadores fosforescentes se excitan preferiblemente con luz visible o UV, pero también se pueden excitar con fotones en otras longitudes de onda del espectro electromagnético. Cabe señalar que los fósforos inorgánicos, como los fosfatos de aluminato de estroncio mencionados en el presente documento, también pueden excitarse o estimularse para emitir luminiscencia por otros medios que no sean la fotoexcitación, incluidos, entre otros, el bombardeo con electrones o iones, la aplicación de una corriente oscilante, alternante o constante, la inyección de portadores de carga, el calentamiento o la aplicación de una diferencia de campo eléctrico o de potencial eléctrico a través de una región del espacio donde se encuentran las partículas fosforescentes, lo que da lugar a catodoluminiscencia o electroluminiscencia. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente puede detectarse usando un dispositivo o instrumento que explote el efecto Destriau, en el que un fósforo muestra luminiscencia sostenida por la aplicación de un campo eléctrico oscilante. Por ejemplo, uno puede construir un instrumento analítico donde los marcadores fosforescentes, en presencia de un analito, se unen en una región de interés ubicada cerca o dentro de un dispositivo como un condensador que aplica un campo eléctrico directo o alterno de manera que da lugar a la luminiscencia o electroluminiscencia.

Un ejemplo de dicho dispositivo para estimular la electroluminiscencia de los indicadores fosforescentes en un LFA se presenta en la figura 42. En este dispositivo, los indicadores fosforescentes están ubicados en una región entre dos electrodos y al menos uno de los electrodos es transparente para permitir la transmisión de la luminiscencia a un detector. El electrodo transparente podría estar compuesto por un sustrato transparente con una película conductora transparente tal como, pero sin limitación, óxido de indio y estaño; óxido de estaño dopado con flúor, óxido de zinc dopado, nanotubos de carbono, grafeno u óxidos conductores transparentes. El sustrato transparente podría estar compuesto de una variedad de materiales que incluyen, entre otros, vidrio, óxido de metal transparente, polímero, mezcla de polímeros, compuestos de polímeros y otros.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden detectarse usando un dispositivo o un instrumento que explote el efecto Gudden-Pohl, donde un fósforo que fue excitado previamente por luz visible o UV emite luminiscencia o un destello momentáneo de luz cuando se aplica un campo eléctrico, y se detecta la luz emitida, lo que indica la presencia o ausencia de un analito. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes están excitados por una combinación de radiación electromagnética y los campos eléctricos aplicados dan lugar a la luminiscencia, que se detecta, lo que indica la presencia o ausencia de un analito.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes se fotoexcitan inicialmente y luego se calientan a temperaturas elevadas, lo que da lugar a la termoluminiscencia que se detecta para indicar la presencia o ausencia de un analito. El calentamiento de los indicadores fosforescentes puede llevarse a cabo por diversos medios, que incluyen, entre otros, reacciones químicas exotérmicas, cambios de fase de materiales cerca de los indicadores fosforescentes, cristalización, condensación, radiación electromagnética, radiación corpuscular, bombardeo iónico, inducción, calentamiento por conducción, calentamiento por convección, calentamiento por fricción o una combinación de los mismos.

Las aplicaciones expuestas en los párrafos anteriores mencionan ensayos en los que la detección del analito implica la unión directa del indicador al analito en una región específica de interés y un aumento en la luminiscencia de la región de interés indica una señal positiva. En otra realización, un procedimiento de lectura mediante el cual se detecta el analito es mediante la determinación de la presencia o ausencia del marcador en ubicaciones distintas de las ubicaciones esperadas en ausencia del analito. De particular interés son los ensayos homogéneos, en los que la unión (o la supresión de la unión, o la competencia) da lugar a la presencia o ausencia de una señal. Por ejemplo, un marcador fosforescente puede desplazarse de una región especificada previamente por la presencia de analito, y a continuación una disminución en la luminiscencia de esa región o un aumento en la luminiscencia en otra parte indicaría una señal positiva.

Preparación de las muestras

En diversas realizaciones, los procedimientos analíticos pueden incluir una o más etapas de preparación de muestras. En algunas realizaciones, las etapas de preparación de muestras pueden utilizar diversos agentes de preparación de muestras. En algunas realizaciones, la preparación de muestras puede incluir, sin limitación, concentrar, enriquecer y/o purificar parcialmente analitos de interés.

En algunas realizaciones, la preparación de la muestra puede incluir, sin limitación, el uso de diversas concentraciones de una especie diluida de un entorno líquido o gaseoso usando un filtro, aislamiento de un subconjunto de células de una muestra de sangre compleja, rotura de células para liberar analitos de interés, extracción del analito de una muestra sólida o eliminación de lípidos y partículas que podrían interferir con el análisis posterior.

En algunas realizaciones, la preparación de la muestra puede implicar la amplificación del analito a detectar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la amplificación puede incluir el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar ácidos nucleicos o la reacción en cadena de nucleación para amplificar proteínas priónicas, o el crecimiento de un organismo. Otra forma de amplificar la detectabilidad de un marcador es hacer crecer un conjunto de biomoléculas, como un filamento de actina o un complejo inmunitario. Otro procedimiento es usar un agente nucleante (por ejemplo, de burbujas, cristales o polimerización) como elemento del marcador. Cuando están disponibles, estos procedimientos pueden facilitar enormemente el análisis posterior.

Analitos de Interés

Los procedimientos y los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden utilizarse para detectar diversos analitos de interés de diversas muestras. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los analitos de interés incluyen, sin limitación, ADN genómico, ADN metilado, secuencias de ADN metilado específicas, ARN mensajero, ADN fragmentado, ARN fragmentado, ARNm fragmentado, ADN mitocondrial, ARN vírico, microARN, producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) in situ, ARNm poliA, híbrido de ARN/ADN, ADN patógeno, ARN patógeno, producto de la amplificación de la proteína de replicación A (RPA), producto de la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), metabolito, intermediario metabólico, hormona, patógeno, virus, bacteria, hongo, orgánulo, biomarcador, lípido, carbohidrato, proteína, glucoproteína, lipoproteína, fosfoproteína, variante específica fosforilada o acetilada de una proteína o proteínas de la cubierta vírica, receptor de la superficie celular, proteína, ácido nucleico, ARNm, ADN genómico, producto de PCR, ADNc, péptido, hormona, fármaco, espora, virus, ARN de SSU, ARNr de LSU, ARNr de 5S, ADN de la región espaciadora de complejos génicos de ARNr, ARNr de 5,8S, ARNr de 4,5S, ARN de 10S, ARN de ARNseP, ARN guía, Ar N de telomerasa, ARNnp, p. ej., ARN U1, ARNcp, ADN mitocondrial, ADN vírico, ARN vírico, producto de PCR, ADN humano, ADNc humano, ARN artificial, ARNpi, sustrato enzimático, enzima, producto de reacción enzimática, bacteria, virus, planta, animal, hongo, levadura, moho, arqueas; eucariotas; esporas; pez; humano; bacteria gramnegativa, Y. pestis, VIH1, Bacillus anthracis, virus de la viruela, Cryptosporidium parvum, ADN cromosómico; ARNr; ADNr; ADNc; ADNmt, ADNcp, ARN artificial, ADN plasmídico, oligonucleótidos; producto de PCR; ARN vírico; ADN vírico; fragmento de restricción; YAC, BAC, cósmidos, hormonas, fármacos, pesticidas, digoxina, insulina, HCG, atrazina, esporas de ántrax, ácido teicoico, priones, químicos, toxinas, agentes de guerra química, agentes de guerra biológica, contaminantes, ADN genómico, ADN metilado, ARN mensajero , ADN fragmentado, ARN fragmentado, ARNm fragmentado, ADN mitocondrial, ARN vírico, microARN, producto de PCR in situ, ARNm poliA, híbrido de ARN/ADN, proteína, glucoproteína, lipoproteína, fosfoproteína, variante fosforilada específica de proteína, virus o un cromosoma .

Fuente de analito

Los analitos a detectar o cuantificar pueden aislarse de diversas fuentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los analitos pueden aislarse de células, fluidos corporales, tejidos, una muestra de biopsia, sangre, suero, plasma, heces, saliva, sudor, esputo, vómito, LCR, líquido de lavado, lágrimas, líquidos oculares, líquido transcelular, secreciones uretrales o genitales, exudado de lesiones o zonas de inflamación, lavado nasal, hisopo nasal, hisopo de garganta, orina, cabello, lisado celular, células tumorales circulantes, células FNAB, fracción FACS, aislamiento inmunomagnético, filtrado de aire, cortes FFPE, especímenes recién congelados, agua potable, agua natural, agua de mar, agua del suelo, lixiviados del suelo, tejido fresco, tejido congelado, tejido tratado con formalina neutra, un bloque de tejido incluido en parafina fijado con formalina, un bloque de tejido incluido en parafina fijado con etanol, una muestra de sangre, filtrado de aire, biopsia de tejido, aspiración con aguja fina, célula cancerosa, sitio quirúrgico, muestra de suelo, muestra de agua, organismo completo, espora, células indicadoras genéticamente modificadas, secreciones corporales animales o humanas (sangre, orina, saliva, sudor, esputo, vómito, esperma, muestra de biopsia, muestras forenses, células tumorales, placas vasculares, tejidos de trasplante, piel, orina, heces, líquido cefalorraquídeo); hisopos de un humano o animal, hisopos de cualquiera de las secreciones corporales humanas o animales mencionados anteriormente, productos agrícolas (granos, semillas, plantas, carne, ganado, vegetales, contenido ruminal, leche, etc.); tierra, partículas de aire; productos de PCR; ácidos nucleicos purificados, ácidos nucleicos amplificados, aguas naturales, líquidos contaminados; raspados de superficie o hisopos; biopelículas, ARN animal, cultivos celulares, cultivos de producción farmacéutica, cultivos celulares CHO, cultivos bacterianos, cultivos infectados por virus, colonias microbianas, población clasificada por FACS, fracción de microdisección de captura con láser, subpoblación de separación magnética, extractos de FFPE y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se puede analizar una fuente de muestra completa. En algunas realizaciones, solo se puede analizar una porción de una fuente de muestra.

En algunas realizaciones, el analito a detectar puede obtenerse de superficies o componentes de ropa, zapatos, prendas de vestir, equipo de protección personal y equipo personal, u otro material, equipo u objetos en la vecindad o cerca de un centro para la producción de productos agrícolas o alimenticios. En algunas realizaciones, el analito a detectar puede obtenerse de cualquier superficie o componente de objetos sospechosos de contaminación con sustancias ilícitas o materiales peligrosos o analitos asociados con la producción de sustancias ilícitas o materiales peligrosos.

Pretratamiento de las muestras

Las muestras a analizar pueden tratarse previamente de varias maneras. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las muestras pueden tratarse previamente mediante centrifugación, sedimentación, fraccionamiento, fraccionamiento de flujo de campo, elutriación, separación monolítica, extracción, adsorción, proteasa, nucleasa, diálisis, osmosis, intercambio de tampón, separación, lavado, desparafinado, lixiviación, lisis, osmolisis, amplificación, desnaturalización/renaturalización, cristalización, congelación, descongelación, enfriamiento/calentamiento, desgasificación, sonicación, presurización, secado, magnetoforesis, electroforesis, dielectroforesis, acustoforesis, precipitación, microencapsulación, esterilización, esterilización en autoclave, germinación, cultivo, PCR, desintegración de tejido, extracción de FFPE, LAMP, NASBA, PCR en emulsión, extracción con fenol, adsorción de sílice, cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC, del inglés immobilized metal affinity chromatography), filtración, captura por afinidad, captura de un gran volumen de una fuente líquida diluida, filtración de aire, biopsia quirúrgica, FNA, citometría de flujo, microdisección de captura con láser y combinaciones de los mismos.

Modificación de analitos

Los analitos de la presente descripción pueden modificarse de diversas maneras. En algunas realizaciones, los analitos pueden modificarse mediante marcado, conjugación, metilación, esterificación, desfosforilazión, fosforilación, acetilación, desacetilación, metilación, desmetilación, desnaturalización, conjugación, modificación de ácido haloacético, incubación, crecimiento, exquistación, pasaje, cultivo, desbloqueo, proteólisis, digestión de nucleasas, preparación de ADNc, amplificación, preparación de bolas de ADN, PEGilación, amplificación clonal, multiplicación, mejora de la carga, hibridación, unión de anticuerpos, adsorción, unión de aptámeros, fotoenlace, reducción, oxidación y combinaciones de los mismos.

Elementos de los marcadores

En algunas realizaciones, los analitos de la presente descripción pueden marcarse mediante diversos elementos. En algunas realizaciones, los elementos del marcador que pueden ser parte de, ser todo el, estar asociados a o estar unidos a los marcadores incluyen una nanopartícula, una partícula de oro, una partícula de plata, plata, cobre, zinc, hierro, óxido de hierro u otro depósito o revestimiento de metal, polímero, marcador de arrastre, partículas magnéticas, partículas flotantes, microburbujas, partículas metálicas, restos cargados, dióxido de silicio, con y sin impurezas (p. ej., cuarzo, vidrio, etc.), poli(metilmetacrilato), poliimida, nitruro de silicio, oro, plata, punto cuántico, CdS, punto de carbono, un fósforo tal como sulfuro de zinc activado por plata o aluminato de estroncio dopado, un flúor, un colorante inhibidor, polímero, PMMA, poliestireno, retrorreflector, partículas con código de barras o marcadas, partículas porosas, partículas peliculares , partículas sólidas, nanocubiertas, nanovarillas, absorbedores IR, absorbedores de microondas, microesferas, liposomas, microesferas, iniciadores de la polimerización, reactivos de fotoinjerto, proteínas, elementos de reconocimiento molecular, enlazadores, monocapas autoensambladas, PEG, dendrímeros, modificadores de carga, PEG, agentes de acoplamiento de silano, iniciadores del crecimiento a partir de injertos de polímeros desde la superficie del marcador, recubrimientos estabilizadores, iones dipolares, péptidos iónicos dipolares, polímeros iónicos dipolares, materiales magnéticos, materiales magnéticos de temperatura Curie por debajo de 200 °C, enzimas, nanocables microbianos, ADN que incluye secuencias de aptámeros, fagos modificados para la conductividad, fusiones o conjugados de elementos detectables con elementos de reconocimiento molecular, estreptavidina, NeutrAvidina, avidina o proteínas de unión a biotina, biotina, moléculas biotiniladas, polímeros biotinilados, proteínas biotiniladas, aptámero antianticuerpo, aptámero dirigido a proteína de unión a anticuerpos, una azida o un alquino terminal u otro participante de química clic, y combinaciones de los mismos.

Procedimientos de síntesis

En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente de un indicador fosforescente se prepara mediante un procedimiento de síntesis en estado sólido, donde los óxidos metálicos o precursores de los elementos del núcleo fosforescente final deseado se mezclan y calientan, calcinan, recuecen o sinterizan a altas temperaturas comprendidas entre unos pocos cientos de grados Celsius y dos mil grados Celsius en condiciones reductoras o inertes en una atmósfera controlada. En algunas realizaciones, se agrega un fundente tal como ácido bórico para mejorar el procedimiento de recocido, lo que permite temperaturas reducidas, cristalinidad mejorada o conduce a polvos fosforescentes con mejores propiedades ópticas y de luminiscencia. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente se prepara mediante un procedimiento de síntesis de combustión, donde los precursores están en forma de óxidos o sales, habitualmente nitratos, que se mezclan en un disolvente. Se agrega un combustible como la urea a la disolución que luego se mezcla y se calienta a unos pocos cientos de grados centígrados, lo que desencadena la ignición y forma un material que luego puede reducirse aún más para mejorar las propiedades de luminiscencia al recocer a alta temperatura en una atmósfera controlada. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente se prepara mediante técnicas de síntesis solgel, que implican la hidrólisis de los precursores en una disolución líquida o dispersión coloidal, seguida de secado y calcinación o recocido. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente se prepara mediante procedimientos de microemulsión donde los componentes inmiscibles tales como agua y aceite se combinan en presencia de componentes estabilizantes tales como tensioactivos, alcoholes o pequeñas moléculas orgánicas. Los precursores de los elementos en el material fosforescente final se añaden junto con un agente fundente y la mezcla se calienta a temperaturas elevadas en una atmósfera reductora, y posiblemente se recuece o calcina para producir un material fosforescente inorgánico.

Procedimientos de modificación de superficie

En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente puede tratarse para reducir la degradación del núcleo fosforescente mediante agua, productos químicos u otros compuestos que puedan entrar en contacto con el núcleo. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente está encapsulado o recubierto en un material para impedir la degradación del núcleo. En la realización preferida de la invención, el material que encapsula el núcleo está compuesto de sílice u óxido de silicio. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente puede encapsularse mediante reacciones con ácido fosfórico. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente puede encapsularse usando trietanolamina o compuestos similares. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente puede encapsularse con óxido de hierro o materiales magnéticos. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente está encapsulado en un óxido metálico tal como alúmina. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente puede encapsularse en un material polimérico tal como, pero sin limitación, poliestireno, PEG, polietileno, poliamidas, poliuretanos, poliéteres, poliésteres, polímeros de olefinas sustituidas con halógeno, polímeros acrílicos o de acrilato, polímeros a base de silicio tales como poli(dimetilsiloxano), polímeros de alquenos, policarbonatos, polímeros electroactivos, polímeros ferroeléctricos, polímeros cristalinos líquidos u otros. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente está encapsulado en un material compuesto polimérico o una mezcla polimérica. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente puede encapsularse o recubrirse con copolímeros o mezclas de cualquiera de los polímeros mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, el material que encapsula el núcleo fosforescente puede contener colorantes fluorescentes, preferiblemente aquellos con distintas longitudes de onda de emisión que el núcleo. En algunas realizaciones, el núcleo fosforescente se encapsula con una combinación de materiales tales como una capa interna de sílice en el núcleo fosforescente y una capa de matriz polimérica en la capa de sílice.

En algunas realizaciones, la superficie de la partícula encapsulada se trata para que tenga grupos reactivos para el acoplamiento covalente de moléculas tales como, pero sin limitación, polímeros, ligandos, elementos de reconocimiento molecular, colorantes fotoluminiscentes, péptidos, moléculas iónicas dipolares, ácidos nucleicos u otras. En algunas realizaciones, la superficie de la partícula encapsulada se trata para mejorar la estabilidad coloidal y la agregación reducida o la unión no específica en los ensayos. En algunas realizaciones, las moléculas con grupos reactivos para acoplamiento covalente o adsorción mejorada de elementos de reconocimiento molecular se introducen en la superficie de la partícula encapsulada. En algunas realizaciones, estas moléculas pueden incluir polímeros heterobifuncionales, polímeros homobifuncionales y polímeros con múltiples cadenas laterales o grupos reactivos para el acoplamiento. En algunas realizaciones, la superficie del polímero encapsulado puede modificarse con activadores para injertar polímeros de la superficie mediante polimerización por radicales, polimerización por radicales de transferencia de átomos, polimerización viva, polimerización por crecimiento en etapas o polimerización por condensación. En algunas realizaciones, la superficie de la partícula encapsulada puede tratarse para que tenga grupos reactivos para permitir el injerto de polímeros a la superficie desde la disolución. En algunas realizaciones, la superficie está modificada por silanos reactivos tales como trietoxisililbutiraldehído o (3-aminopropil) trietoxisilano. En algunas realizaciones, se añaden otros compuestos durante la modificación de la superficie para mejorar la estabilidad, como la adición de 1, 2-bis-(trietoxisilil) etano o bis (3-(trimetoxisilil) propilamina durante la silanización. En algunas realizaciones, la superficie de un indicador fosforescente se modifica mediante la unión covalente de elementos de reconocimiento molecular. En algunas realizaciones, la superficie de un indicador fosforescente se modifica por adsorción de moléculas para la estabilidad coloidal o el reconocimiento molecular.

Elemento de reconocimiento molecular

En algunas realizaciones, los elementos marcadores de la presente descripción también pueden estar asociados con diversos elementos de reconocimiento molecular. En algunas realizaciones, los elementos de reconocimiento molecular pueden ser parte de, estar asociados o unidos a marcadores. En algunas realizaciones, los elementos de reconocimiento molecular pueden incluir, sin limitación, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, análogo de anticuerpo, Affibody, análogo de anticuerpo de camélido o tiburón, ácido nucleico, carbohidrato, aptámero, ligando, quelantes, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico bloqueado, ácido nucleico de cadena principal modificada, DARPin, polímeros impresos a nivel molecular, lectina, sonda de candado, sustrato, receptor, proteína vírica, mezcla, ADNc, quelato de metal, boronato, péptido, sustrato enzimático, producto de reacción enzimática, bicapa lipídica, célula, tejido, microorganismo, levadura, bacteria, parásito, protozoo, virus, antígeno, hapteno, biotina, hormona, fármaco, anticuerpo híbrido anti-ARN/ADN, mutS, anticuerpo anti-ADN, anticuerpo antimetilación o un anticuerpo antifosforilación.

Muchos procedimientos analíticos, incluidos los de interés en la presente invención, implican el reconocimiento molecular, y también la transducción del acontecimiento de reconocimiento molecular en una señal utilizable. El reconocimiento molecular se refiere a la alta afinidad y tendencia específica de especies químicas particulares a asociarse entre sí o con organismos o virus que muestran especies químicas diana. Ejemplos bien conocidos de reconocimiento molecular incluyen la hibridación de secuencias de ADN complementarias en la famosa estructura de doble hélice con una afinidad muy alta y el reconocimiento de organismos o moléculas extrañas en el torrente sanguíneo por los anticuerpos producidos por mamíferos, o analitos seleccionados por anticuerpos monoclónicos seleccionados deliberadamente. Hay muchos otros ejemplos de elementos de reconocimiento molecular, incluido el reconocimiento de moléculas de carbohidratos por lectinas, el reconocimiento de ácidos nucleicos por proteínas y análogos de ácidos nucleicos, la unión de analitos por fragmentos de anticuerpos, derivados y análogos, y una gran cantidad de otros ejemplos.

Procedimientos de mejora de la señal o amplificación

En algunas realizaciones, el acontecimiento de reconocimiento molecular puede leerse en una señal utilizable. En algunas realizaciones, la señal puede amplificarse o mejorarse mediante un procedimiento de mejora de señal, que puede actuar sobre el analito, un marcador o un componente del marcador. En algunas realizaciones, el procedimiento de amplificación o mejora de la señal puede incluir incubación, crecimiento, PCR, PCR en fase sólida, RPA, LATE, EATL o amplificación de reinicio en caliente, RCA en fase sólida, tinción de plata, deposición de metal o siembra en placas de Petri, níquel, deposición de cobre o zinc, crecimiento de partículas de oro, polimerización, unión de partículas, injerto, fotoinjerto, química clic, una reacción de formación de 1,2,3-triazol catalizada por cobre(I) entre una azida y un alquino terminal, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la señal de luminiscencia de los elementos del marcador puede ser leída o detectada por un sensor óptico tal como, pero no limitado a, un sensor de dispositivo acoplado a carga (CCD), sensor de imagen CCD, sensor semiconductor de óxido de metal complementario (CMOS), sensor de imagen CMOS, cámara, cámara de teléfono móvil, fotodiodo, fotodiodo de avalancha, diodo de avalancha de fotón único, detector de fotón único de nanohilos superconductores, fotorresistor, fotomultiplicador, tubo fotomultiplicador, fototubo, célula fotoemisiva, fotoconmutador, fototransistor, cristal fotónico, sensor de fibra óptica, sensor electroóptico, luminómetro o fluorómetro. En algunas realizaciones, la señal de luminiscencia de los elementos del marcador puede leerse, detectarse o inferirse a partir de reacciones fotoquímicas, tales como las que se producen en una película fotográfica, donde la luminiscencia de los elementos del marcador estimula o inicia las reacciones fotoquímicas. En algunas realizaciones, la señal de luminiscencia de los elementos del marcador puede leerse o detectarse visualmente a simple vista o con la ayuda de un amplificador o intensificador óptico.

En algunas realizaciones, la señal de luminiscencia o la relación entre señal y ruido puede mejorarse o amplificarse mediante la ciclación del procedimiento de fotoexcitación y la posterior detección tardía de la fotoluminiscencia resultante a partir de los elementos del marcador, seguido de una promediación de los datos de los ciclos. Un ejemplo específico de este procedimiento de ciclación es el uso de un teléfono móvil como sistema de detección de luminiscencia, donde el flash de la cámara del teléfono móvil se usa como fuente de fotoexcitación y la cámara del teléfono móvil se usa como un detector de luz para obtener imágenes de la luminiscencia emitida por los elementos del marcador. El flash de la cámara del teléfono móvil se enciende y apaga periódicamente, de modo que mientras está en el estado «encendido» los elementos del marcador se someten a fotoexcitación, y cuando la luz está en el estado «apagado», la cámara del teléfono móvil detecta la luminiscencia emitida por los elementos del marcador. Las imágenes resultantes del procedimiento de ciclación se promedian o apilan, lo que resulta en una señal amplificada o una mayor relación entre señal y ruido. Este procedimiento de ciclación no se limita a una cámara de teléfono móvil y un flash; el flash se puede reemplazar con cualquier fuente de luz adecuada para la fotoexcitación, como un láser, diodo láser, diodo emisor de luz (LED), diodo emisor de luz orgánico (OLED), bombilla incandescente, bombilla fluorescente, lámpara fluorescente compacta, lámpara de xenón, lámpara de mercurio, lámpara halógena, pantalla de plasma, pantalla de cristal líquido, vela, luz solar u otros. La cámara del teléfono móvil se puede reemplazar con cualquier sistema de detección adecuado, como los descritos en esta invención.

En algunas realizaciones, la señal de luminiscencia de los indicadores fosforescentes se puede mejorar usando técnicas de comparación de índices. La coincidencia de índices, en este contexto, implica sumergir un material poroso como una membrana utilizada en flujo lateral o sistemas microfluídicos de papel en un disolvente con un índice de refracción similar, lo que reduce la dispersión de la luz y mejora la transmisión de la luz. La coincidencia de índice puede mejorar la detectabilidad de la señal de luminiscencia de los indicadores fosforescentes al mejorar la fotoexcitación y reducir la pérdida de luminiscencia de un indicador fosforescente por dispersión.

En algunas realizaciones, donde la detección de luminiscencia de indicadores fosforescentes se lleva a cabo usando un dispositivo con más de un tipo de elemento de detección de luz, como los píxeles rojo, verde y azul en una cámara de color RGB típica, la señal de indicadores fosforescente se puede mejorar mediante el cálculo de los valores de luminancia con factores de ponderación que representan el espectro de emisión del indicador fosforescente y los rendimientos cuánticos respectivos de los canales rojo, verde y azul. Por ejemplo, la luminancia calculada a partir de una imagen RGB dada de indicadores fosforescentes de aluminato de estroncio verde que tienen un pico de emisión intenso cercano a 520 nm tendría una fuerte ponderación hacia el canal verde y una ponderación más ligera hacia el canal rojo.

Mejora de la especificidad

En algunas realizaciones, la especificidad de detección de analitos puede mejorarse mediante la eliminación de marcadores inespecíficamente unidos por medios químicos o físicos. En algunas realizaciones, los medios químicos de eliminación incluyen desnaturalizantes, temperatura, ácidos, bases, osmolitos, tensioactivos, polímeros y disolventes. En algunas realizaciones, los medios físicos de eliminación incluyen fuerza, vibración, flotabilidad, centrifugación, flujo de campo de sedimentación, fuerza magnética, fuerza electroforética, fuerza dielectroforética, sonicación y fuerza lateral. En algunas realizaciones, la susceptibilidad a los medios de eliminación se puede mejorar mediante la incorporación de restos particularmente sensibles a los medios de eliminación, tales como restos cargados o densos para la eliminación electroforética o basada en la sedimentación.

Lugar del análisis

Se pueden usar diversas ubicaciones para el análisis de las muestras. En algunas realizaciones, la ubicación de las etapas del análisis, que pueden usarse individualmente o en combinación, incluyen placas de microtitulación, tubos, superficies de partículas o perlas, matrices de nanopocillos, dispositivo de análisis de inyección de flujo, chips microfluídicos, superficies conductoras, ambientes con temperatura controlada, cámaras de presión, hornos, cámaras de irradiación, dispositivos electroforéticos, de flujo de campo y cromatográficos, platinas de microscopios, luminómetros, dispositivos de principio de Coulter, sensores voladizos y FET, cámaras de vacío, dispositivos ópticos electrónicos, dispositivos de detección de moléculas individuales, dispositivos de detección por fluorescencia de moléculas individuales, superficies portadores de electrodos o pilares, emulsiones, membranas de flujo lateral, membranas de flujo a través, lectores de ensayo de flujo lateral, lectores de ensayo de flujo a través, sistemas de documentación en gel, dispositivos robóticos y combinaciones de los mismos. Los dispositivos de rotación y flujo, o los obturadores electrónicos o mecánicos rápidos, mejoran la sensibilidad al permitir la detección de la luminiscencia antes de que decaiga muy lejos. El análisis de inyección de flujo, las estrategias «Laboratorio en un chip» y «Laboratorio en un CD» pueden ser deseables en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, puede ser ventajoso realizar más de un tipo de análisis en serie, ya sea fraccionando una muestra usando o basándose en los resultados de un procedimiento antes de realizar un procedimiento adicional, o interpretando juntos los resultados de múltiples procedimientos.

Realizaciones adicionales

Ahora se hará referencia a varias realizaciones de la presente descripción y resultados experimentales que proporcionan respaldo para tales realizaciones. Los solicitantes señalan que la descripción en esta invención es solo para fines ilustrativos y no pretende limitar el alcance del tema reivindicado de ninguna manera.

Ejemplo 1

Preparación de partículas fosforescentes encapsuladas con sílice

El polvo de aluminato de estroncio fosforescente preparado por un procedimiento tal como síntesis de estado sólido, síntesis de combustión, síntesis de sol-gel o síntesis de microemulsión se dispersa en acetato de etilo anhidro a una concentración de aproximadamente 0,1 g/ml en un recipiente de molienda de zirconia que contiene medios de molienda de zirconia cilíndricos o esféricos en un molino de bolas de gres cerámico de EE. UU. durante 6-9 días en funcionamiento continuo. Después de la molienda, se recoge la dispersión de fósforos y el acetato de etilo se elimina por evaporación. Las suspensiones coloidales de partículas fosforescentes de aluminato de estroncio molido se preparan a una concentración de 1-5 mg/ml en etanol en tubos de centrífuga de 50 ml o recipientes más grandes adecuados para la centrifugación. Las líneas de demarcación en los tubos marcan la distancia a la que una partícula mayor que un tamaño específico se asentará durante un período de tiempo definido (por ejemplo, 10 minutos) a una fuerza centrífuga relativa específica. Después de la centrifugación, se recoge el sobrenadante (es decir, el líquido por encima de la línea de demarcación) que contiene las partículas pequeñas y las partículas se concentran por centrifugación adicional. El fraccionamiento se puede llevar a cabo para eliminar partículas más pequeñas que el tamaño mínimo deseado mediante centrifugación para inducir la sedimentación y eliminar el sobrenadante que contiene las partículas pequeñas. El procedimiento de centrifugación se repite hasta obtener una fracción con una concentración y un coeficiente de variación deseables. La encapsulación de sílice se lleva a cabo preparando una disolución con aproximadamente 1 mg/ml de partículas fosforescentes suspendidas en una mezcla de agua/etanol 1:4 que contiene tetraetoxisilano 20 mM y amoníaco 0,25 M. La encapsulación de sílice se lleva a cabo durante 7-8 horas, después de las cuales se detiene la reacción y las partículas se lavan en etanol para eliminar el exceso de reactivo.

Ejemplo 2

Preparación de indicadores fosforescentes PEGilados mediante un procedimiento de «injerto a»

Los aldehídos de superficie se introducen en partículas fosforescentes encapsuladas en sílice mediante la reacción de 1 mg/ml de partículas fosforescentes en etanol que contiene 5 % v/v de agua y TESBA 50 mM durante 30-60 minutos. Se puede agregar 1-2-bis-(trietoxisilil) etano (BTEOSE) a 10-100 mM con el TESBA para mejorar la estabilidad hidrolítica del PEG injertado, con la proporción exacta de TESBA/BTEOSE en función de la cobertura de PEG deseada. La reacción se detiene y las partículas se lavan en etanol y a continuación se curan a presión reducida a temperatura elevada (por ejemplo, 36-50 °C). Las partículas funcionalizadas con aldehído se suspenden en un tampón acuoso con agente reductor de cianoborohidruro de sodio 50-250 mM y aproximadamente H2N-PEG-COOH 0,5 mM hasta que se logra la PEGilación deseada. El lavado puede llevarse a cabo con solución acuosa. La bioconjugación se lleva a cabo mediante la química de la carbodiimida mediante el uso de una combinación de EDC y NHS para activar los grupos carboxilo, seguido de la adición de proteínas o elementos de reconocimiento molecular que contienen grupos amina, que reaccionan para formar enlaces amida con los carboxilos activados. La pasivación se puede llevar a cabo utilizando una o más soluciones que contienen una proteína de bloqueo, como la albúmina sérica bovina o la caseína, o pequeñas moléculas que reaccionarán con los carboxilos activados como la etanolamina o la hidroxilamina.

Ejemplo 3

Inmovilización orientada de anticuerpos mediante aminación reductora

Las partículas fosforescentes encapsuladas de sílice se funcionalizan con aldehidos mediante TESBA como se describió anteriormente. Se agrega amina-PEG-amina homobifuncional, preferiblemente con un peso molecular de 3.400-10.000 g/mol a un tampón fosfato que contiene partículas fosforescentes funcionalizadas con aldehído con agente reductor de cianoborohidruro de sodio al menos 50 mM. La concentración molar de amina-PEG-amina añadida durante el injerto deberá ser de al menos 1-2 órdenes de magnitud en exceso de la cantidad máxima de cadenas de PEG necesarias para recubrir todas las partículas en el coloide con una monocapa. El número de moléculas de PEG bifuncionales necesarias para una monocapa en una sola partícula se puede estimar si se considera el área de superficie promedio de una partícula y los valores típicos para la densidad teórica de empaquetamiento del PEG (p. ej., 5 cadenas/nm2). Una cantidad insuficiente de amina-PEG-amina puede dar como resultado el acoplamiento covalente de ambos grupos amina de la molécula a los aldehídos de la superficie. La PEGilación se puede llevar a cabo durante un intervalo comprendido entre unas pocas horas y hasta 24 horas o más a temperatura ambiente. La reacción puede detenerse mediante intercambio de tampón y las partículas deberán lavarse en agua o tampón. Los anticuerpos que se van a acoplar a las partículas fosforescentes amina-PEGiladas se pueden unir covalentemente de una manera orientada que mejore la eficacia de la unión en comparación con otros procedimientos de inmovilización. Los polisacáridos en los anticuerpos, que se encuentran cerca de la región Fc, pueden oxidarse con periodato de sodio 1 mM a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos o temperatura reducida (p. ej., 4 °C) durante 2 horas en tampón de fosfato o tampón de acetato de sodio con los anticuerpos a una concentración de alrededor de 1 mg/ml. Las partículas fosforescentes amina-PEGiladas y los anticuerpos, que ahora contienen aldehídos del tratamiento con periodato, pueden acoplarse mediante aminación reductora con cianoborohidruro de sodio como se describió previamente.

Ejemplo 4

Inmovilización orientada de anticuerpos mediante química clic

Las partículas fosforescentes encapsuladas de sílice se modifican con aldehídos de superficie de TESBA como se describió previamente o con APTES seguido de aminación reductora con un exceso de glutaraldehído de 10 a 100 veces. Las moléculas de amina-PEG-alquino, preferiblemente con pesos moleculares de 3.400-10.000 g/mol se mezclan en un tampón de fosfato entre pH 6 y 8 con las partículas fosforescentes funcionalizadas con aldehído en presencia de cianoborohidruro de sodio hasta que se logre la cobertura de PEG deseada. El grupo alquino terminal de la cadena PEG se puede acoplar muy específicamente con una cinética rápida a un grupo azida. Los polisacáridos de la Fc de un anticuerpo pueden modificarse para contener grupos azida. La mezcla de los anticuerpos modificados en presencia de partículas fosforescentes alquino-PEG en presencia de un catalizador de cobre a temperatura ambiente dará como resultado la unión covalente de anticuerpos a las partículas de una manera orientada con una mejor funcionalidad.

Ejemplo 5

Detección de Dengue NS1 en sangre entera en el ensayo de flujo lateral

Las partículas fosforescentes estabilizadas en agua se preparan y funcionalizan usando un conector de polímero iónico dipolar o hidrófilo con grupos funcionales para el acoplamiento covalente de anticuerpos de la proteína 1 (NS1) no estructurales frente al virus del dengue. Los indicadores fosforescentes anti-NS1 se cargan en una almohadilla de liberación de conjugado como la que se muestra en la figura 41 mediante dispensación, manchado o inmersión con aditivos para mejorar la estabilización, la consistencia y la velocidad de liberación del conjugado durante la prueba del LFA, y reducir la unión no específica de los indicadores fosforescentes dentro de la tira de análisis del LFA. Los aditivos pueden incluir varios tensioactivos como Tween o Triton, polímeros como PEG, poli (alcohol vinílico) y sacáridos o polisacáridos como la trehalosa. El material de la almohadilla de liberación del conjugado se selecciona para minimizar la unión no específica de analitos e indicadores fosforescentes a la almohadilla, y en la realización preferida de la invención es una membrana de fibra de vidrio. Se selecciona un material poroso capaz de separar sangre entera para el análisis sin hemólisis considerable de glóbulos rojos; tales materiales pueden incluir algodón, membranas de fibra de vidrio u otras membranas porosas. Se selecciona una membrana con un tamaño de poro apropiado para permitir el transporte efectivo de los indicadores fosforescentes y controlar la velocidad de flujo para una sensibilidad óptima o la detección de analitos. En la realización preferida de la invención, la membrana está construida a partir de nitrocelulosa sobre un material de soporte de respaldo basado en polímero. La membrana se ve con una línea de análisis para la detección de analitos que comprende anticuerpos anti-NS 1 que son policlonales o monoclonales y se unen a un epítopo distinto de la proteína NS1 que los anticuerpos en los indicadores fosforescentes. La membrana también se ve con una línea de control que puede consistir en algún tipo de resto de reconocimiento molecular que se une específicamente a los indicadores fosforescentes. Se selecciona una almohadilla absorbente para absorber eficazmente la muestra líquida a través de la tira, e idealmente impedir el flujo de retorno, lo que puede dificultar la sensibilidad. Toda la tira del LFA está encerrada en un material de cubierta, que podría diseñarse para encajar en un accesorio de dispositivo electrónico portátil como el presentado en la figura 43. Se recoge una muestra de sangre de 10-100 |jl y se aplica a la almohadilla de muestra, seguido de la adición de un tampón de lavado o detección para ayudar a conducir la muestra y los indicadores fosforescentes a través de la tira del LFA. Después de un período de tiempo específico (por ejemplo, 10 minutos), el cartucho de análisis del LFA se carga en el puerto de inserción del accesorio y el dispositivo electrónico portátil se usa para detectar la luminiscencia de los indicadores fosforescentes. El dispositivo electrónico portátil puede tener datos de calibración precargados que se pueden usar para determinar la cantidad o concentración de NS1 en la muestra. Los datos pueden geomarcarse o cargarse en una red o servidor para su almacenamiento o procesamiento o análisis posterior.

Ejemplo 6

Ensayo múltiple gastrointestinal en el ensayo de flujo continuo

Los norovirus son patógenos altamente contagiosos que a menudo son responsables de epidemias de gastroenteritis. Sin embargo, varios otros patógenos como E. coli y Salmonella pueden provocar enfermedades con síntomas similares. Una prueba rápida y sensible en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria que puede permitir la multiplexación de patógenos gastrointestinales y puede funcionar con muestras relativamente complejas, como las heces diluidas, sería una herramienta invaluable. En una realización de la presente invención, podría diseñarse un ensayo de flujo continuo con indicadores fosforescentes en el que se prepararían distintos conjuntos de indicadores fosforescentes funcionalizados con elementos de reconocimiento molecular que se unen a distintos analitos. Una membrana se funcionaliza con entidades de reconocimiento molecular complementarias en puntos discretos, y cada punto corresponde a un patógeno distinto. Se recoge una muestra y se mezcla con los indicadores fosforescentes, lo que permite la unión de los indicadores fosforescentes a los antígenos en la muestra. La muestra se transporta directamente a través de la membrana, y los complejos indicadores antígeno-fosforescentes se capturan específicamente en los puntos predefinidos de la membrana, lo que permite determinar qué patógeno es la causa de la enfermedad.

Ejemplo 7

Detección de ácidos nucleicos

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden usarse para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden detectarse a partir de una variedad de tipos de muestras según la aplicación, como los lisados de células tumorales para el diagnóstico del cáncer. Muchas pruebas de ácido nucleico pueden implicar una etapa de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR isotérmica, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) o amplificación de la proteína de replicación A (RPA). Los indicadores fosforescentes pueden funcionalizarse con ADN o ARN monocatenario que se hibrida con parte de una cadena complementaria de una muestra que es específica de un analito. En algunas realizaciones, la cadena de ácido nucleico complementaria diana tiene un marcador específico que se introduce durante la amplificación o por otros medios, y permite que la cadena marcada sea capturada por una superficie que reconoce el marcador. Por ejemplo, un producto de amplificación puede biotinilarse para que se una a las superficies recubiertas con avidina. En otras realizaciones, la superficie se funcionaliza con una cadena de ácido nucleico que hibrida específicamente con un pequeño segmento de la cadena de ácido nucleico diana, que es lo suficientemente larga como para permitir también la hibridación con un indicador fosforescente que contiene una secuencia complementaria a una parte distinta de la cadena de ácido nucleico diana.

Ejemplo 8

Multiplexación espectral en un ensayo de flujo lateral

Los ensayos de flujo lateral multiplexados se pueden diseñar fácilmente agregando múltiples líneas de análisis a una tira y usando indicadores funcionalizados con distintos elementos de reconocimiento molecular para unirse específicamente en cada línea de análisis en presencia de un analito. Un procedimiento de multiplexación alternativo es usar indicadores de distintos colores o espectralmente distintos que se unen a distintos analitos. En una realización, los indicadores fosforescentes de la presente invención pueden usarse para distinguir infecciones provocadas por el virus del chicungunya y del Nilo Occidental, enfermedades debilitantes transmitidas por mosquitos. Se prepara una línea de análisis con anticuerpos antihumanos que se unen específicamente a los anticuerpos IgG humanos. Los indicadores fosforescentes con espectros de emisión distintos, como partículas que emiten verde y rojo, se funcionalizan con antígenos como proteínas de envoltura o proteínas no estructurales implicadas en la replicación viral que son específicas de los distintos virus. Por ejemplo, las partículas que emiten rojo podrían funcionalizarse con antígenos específicos del virus del chicungunya y las partículas que emiten verde con antígenos específicos del virus del Nilo Occidental. Un paciente infectado con cualquiera de los virus durante el tiempo suficiente para provocar una respuesta inmune será seropositivo para los anticuerpos IgG que reconocen esos antígenos. Por lo tanto, la infección por virus del chicungunya dará una línea de análisis roja y la infección por virus del Nilo Occidental una línea de análisis verde.

Ejemplo 9

Detección de luminiscencia con un teléfono móvil

En algunas realizaciones, es deseable poder llevar a cabo una detección altamente sensible de analitos en entornos de lugares en los que se presta la asistencia sanitaria y tener la capacidad de vincular esos datos a sistemas de información. Esta capacidad se puede lograr fácilmente utilizando indicadores fosforescentes y varios sistemas distintos de detección de luz, pero de particular interés es la incorporación de pruebas basadas en indicadores fosforescentes con dispositivos electrónicos portátiles como teléfonos móviles y tabletas. El uso de la cámara nativa del dispositivo electrónico portátil para detectar la luminiscencia de los indicadores fosforescentes puede permitir el análisis automatizado inmediato de la prueba por parte del software en el dispositivo y a continuación mostrar los resultados al usuario. La cuantificación consistente de los niveles de analito con el dispositivo electrónico portátil se puede lograr utilizando la ciclación del procedimiento de detección de fosforescencia controlada en el tiempo ilustrado en la figura 29 con procedimientos de promediación de imágenes presentados en la figura 36 y la figura 39 para reducir el ruido. Los procedimientos de promediación de los escaneados de línea mostrados en las figuras 37-38 y la figura 40 también se pueden usar para obtener picos agudos o señales correspondientes a los niveles de analito. Los indicadores fosforescentes de la presente invención son probablemente los únicos indicadores fotoluminiscentes actualmente capaces de obtener imágenes sensibles de fosforescencia controlada en el tiempo con teléfonos móviles y hardware similar. Los colorantes organometálicos y los quelatos metálicos utilizados actualmente en los esquemas de detección con resolución temporal generalmente tienen vidas que son demasiado cortas para los tiempos de respuesta del sistema optoelectrónico de un teléfono móvil habitual. La capacidad cuantitativa combinada con las capacidades de un teléfono móvil, como el geomarcado y la conectividad de red podrían ser particularmente útiles en aplicaciones de monitorización ambiental donde los niveles de contaminantes podrían cuantificarse en ubicaciones específicas, y los datos a continuación geomarcados y enviados a una institución o tercero para la toma de decisiones y gestión.

Ejemplo 10

Detección del virus de la gripe y monitorización epidemiológica

Los procedimientos de multiplexación descritos en esta invención podrían usarse para distinguir entre las infecciones por virus de la gripe A y de la gripe B, y también podrían identificar infecciones provocadas por cepas recientes del virus particularmente virulentas o amenazadoras. Los formatos de ensayo podrían usar hisopos nasales para la recolección de muestras con cartuchos de flujo lateral para la detección de analitos. La combinación de la prueba con las capacidades de tecnología de la información de un teléfono móvil o tableta podría ser particularmente útil en la monitorización en tiempo real de la incidencia de enfermedades infecciosas y la distribución geográfica. Por ejemplo, durante el brote de una epidemia de gripe, los profesionales sanitarios o las personas que efectúan el análisis en su propio domicilio podrían usar la prueba junto con un teléfono móvil y un accesorio como el que se muestra en la figura 43 para lectura automática y análisis de la prueba. La información sobre los resultados de la prueba, como el tipo de cepa de virus de la gripe y la ubicación, podría cifrarse con datos anónimos del paciente y actualizarse en un sistema de información que podría informar a la población general y a los profesionales sanitarios sobre el número actual de brotes de virus de la gripe en una región en particular.

Ejemplo 10

Análisis cuantitativos de drogas en la saliva

Las moléculas pequeñas tales como las drogas o los metabolitos de las drogas se pueden detectar usando indicadores fosforescentes. En algunas realizaciones, un anticuerpo de captura que se une a la molécula pequeña de interés se inmoviliza en una superficie. Cuando la molécula pequeña se une al anticuerpo, el complejo resultante tiene una estructura conformacional distinta que los restos en los indicadores fosforescentes reconocen específicamente. En otras realizaciones, se usa un formato de ensayo competitivo en el que un indicador fosforescente y un analito de molécula compiten por los sitios de unión. A altas concentraciones de analito, más de los indicadores fosforescentes se desplazan, lo que resulta en una disminución de la luminiscencia. Cuando no hay analito presente, los indicadores fosforescentes ocupan completamente los sitios de unión, lo que provoca una alta intensidad de luminiscencia.

Ejemplo 11

Electroluminiscencia para la detección de analitos sensibles

Los indicadores fosforescentes de la presente invención pueden ser estimulados para emitir luminiscencia mediante la aplicación de campos eléctricos. La electroluminiscencia ofrece el potencial para la detección de analitos de alta sensibilidad al reducir en gran medida la señal de fondo, ya que la mayoría de los materiales utilizados en una prueba de diagnóstico o en la matriz de la muestra no emiten radiación electromagnética por debajo de los campos eléctricos necesarios para excitar a los indicadores fosforescentes. La emisión continua de luz de los indicadores fosforescentes mediante la aplicación de un campo eléctrico alterno durante un cierto período de tiempo junto con la detección de luz integrada podría mejorar la sensibilidad. Se pueden construir varios sistemas para la lectura de la electroluminiscencia, como el ilustrado en la figura 42. Las membranas finas o los chips microfluídicos se pueden diseñar para contener electrodos que producen un campo eléctrico a través de una distancia relativamente pequeña (por ejemplo, 100 pm -2 mm) y permiten la detección de la electroluminiscencia resultante de los indicadores fosforescentes. También se podría utilizar una combinación de fotoestimulación y la aplicación de campos eléctricos.

Ejemplo 12

Lectura del ensayo a simple vista

En algunas realizaciones, las pruebas que incorporan indicadores fosforescentes pueden interpretarse visualmente observando la presencia o ausencia de luminiscencia en ubicaciones predefinidas. Se podría construir un dispositivo que bloquee la luz ambiental y permita al usuario ver la luz que emana específicamente de los indicadores fosforescentes. El dispositivo podría incorporar una fuente de luz para fotoexcitación, o hardware para inducir electroluminiscencia o estimular la termoluminiscencia. Las lentes, tales como lentes planas convexas, lentes bioconvexas, lentes asféricas, lentes cóncavas, o combinaciones de las mismas, podrían agregarse al dispositivo para aumentar el aumento y la visibilidad. En otra realización, se puede usar un dispositivo tal como un intensificador de imagen portátil para ayudar en la lectura visual. Algunos intensificadores de imagen son más adecuados para mejorar la señal de los fotones en la región roja a infrarroja del espectro electromagnético. Los fósforos de sulfuro de zinc rojos o el aluminato de estroncio fosforescente que emite luz roja como resultado del dopaje con metales de tierras raras y metales de transición como el cromo o el manganeso podrían usarse directamente en una aplicación de lectura de intensificador de imagen. En algunas realizaciones, el acoplamiento de fluoróforos rojos, IR cercanos o IR a la superficie de un fósforo con un espectro de emisión que se superpone con el espectro de excitación del fluoróforo podría mejorar la detectabilidad mediante un intensificador de imágenes.

Ejemplo 13

Amplificación de la señal de termoluminiscencia

El mecanismo de la luminiscencia persistente en sólidos fosforescentes inorgánicos es algo análogo a la termoluminiscencia e implica la captura de portadores de carga en estados excitados metaestables, seguida de liberación térmica gradual. La luminiscencia resultante es una función de la temperatura, y una temperatura más alta puede aumentar la velocidad de recombinación de los agujeros de electrones y, por lo tanto, la intensidad de la luminiscencia. Los indicadores fosforescentes en la presente invención pueden estimularse para que tengan una mayor intensidad de luminiscencia mediante la elevación de la temperatura local. En algunas realizaciones, un ensayo podría diseñarse para incorporar elementos de calentamiento o usar reacciones exotérmicas para suministrar calor para aumentar la intensidad de la luminiscencia de los indicadores fosforescentes, lo que conduce a una detección de analitos más sensible.

Ejemplo 14

Procedimientos de mejora de la fiabilidad del ensayo y la autocalibración

En algunas realizaciones, las partículas fosforescentes inorgánicas pueden incrustarse o inmovilizarse en alguna ubicación definida en un ensayo o en una superficie de cartucho de análisis para proporcionar una señal de luminiscencia conocida que pueda usarse como referencia para calibrar la intensidad de los indicadores fosforescentes usados en la prueba. En algunas realizaciones, al menos dos conjuntos de partículas fosforescentes que tienen restos de reconocimiento o espectros de emisión distintos pueden usarse en paralelo en un ensayo como un medio de calibrar la señal de luminiscencia que resulta de la unión del analito. En algunas realizaciones, la detección del mismo analito con distintos conjuntos de indicadores fosforescentes, tales como partículas con distintas longitudes de onda de emisión, puede usarse para mejorar la confianza en los resultados de la prueba y reducir la tasa de falsos negativos y falsos positivos.

Ejemplo 15

Ensayo de flotación

El formato de ensayo de flotación como se representa en la figura 35 ofrece una manera simple de detectar analitos con una mínima intervención del usuario y bajo riesgo de contaminación del ambiente local con un analito potencialmente peligroso. En un tubo pequeño que se pueda cerrar, como un tubo de PCR, se proporciona un tubo que contiene microburbujas de vidrio funcionalizadas con restos de reconocimiento molecular para un analito específico, indicadores fosforescentes y colorante absorbente de luz, como colorante alimentario. Se agrega una muestra, como sangre entera o heces diluidas, directamente al tubo, que a continuación se cierra para minimizar el riesgo de contaminación ambiental. Los contenidos del tubo se mezclan y luego se dejan sedimentar, y cualquier complejo indicador de burbujas-analito-fosforescente formado flota en la parte superior del líquido. El colorante absorbente de luz reduce la luminiscencia de fondo de los indicadores fosforescentes no unidos, y la luminiscencia se detecta específicamente de los indicadores que flotan en la parte superior del líquido.

EJEMPLO 16

Indicadores fosforescentes magnéticos

En algunas realizaciones, es particularmente ventajoso tener un indicador que tenga propiedades magnéticas. Por ejemplo, los indicadores fosforescentes magnéticos pueden mezclarse con una muestra y dejar que se unan a al menos uno o más analitos, después de lo cual los indicadores magnéticos pueden concentrarse aplicando un campo magnético para permitir la eliminación del analito no marcado. La eliminación del analito no marcado podría reducir o eliminar en gran medida el efecto de gancho de dosis alta, lo que podría extender el intervalo dinámico de un ensayo. Además, la aplicación de la disolución concentrada de indicadores fosforescentes magnéticos después de la eliminación del analito no marcado en una prueba de diagnóstico, como una prueba de flujo continuo o LFA, podría mejorar la sensibilidad o el límite de detección del ensayo. En otras realizaciones, las propiedades magnéticas pueden mejorar el rendimiento del ensayo mediante la aplicación de campos magnéticos para mejorar el transporte de masa de los indicadores a una superficie para su detección. Por ejemplo, en un formato de microplaca o sistemas microfluídicos, la superficie en el fondo de un pocillo o canal se funcionaliza con restos de reconocimiento molecular específicos de un analito. Permitir que los indicadores fosforescentes entren en contacto con la superficie para la unión es relativamente lento cuando la sedimentación y la difusión por el movimiento browniano son las principales fuerzas impulsoras para el transporte de masas. Sin embargo, la aplicación de un campo magnético para conducir indicadores magnéticos a la superficie podría reducir el tiempo total de ensayo y mejorar la sensibilidad. Existen varias estrategias para preparar indicadores fosforescentes magnéticos. Los procedimientos de coprecipitación con óxido de hierro podrían usarse para agregar una capa de óxido de hierro superparamagnético directamente sobre una cubierta que encapsula un núcleo fosforescente. Las nanopartículas magnéticas y los núcleos fosforescentes pueden encapsularse simultáneamente usando los procedimientos descritos en esta invención para producir partículas híbridas con propiedades fosforescentes y magnéticas. En otras realizaciones, la superficie de partículas fosforescentes encapsuladas puede funcionalizarse con restos magnéticos o nanopartículas.

Aplicaciones y ventajas

Una ventaja de utilizar indicadores fosforescentes de la presente descripción es que la fosforescencia es sensiblemente detectable usando instrumentación simple o nula. Además, los indicadores fosforescentes de la presente descripción (por ejemplo, aluminato de estroncio dopado con metales de tierras raras) son relativamente económicos y muestran eficiencias cuánticas más altas, vidas más largas de luminiscencia e intensidades relativas más altas que muchos fósforos inorgánicos típicos. Además, los indicadores fosforescentes de la presente descripción (por ejemplo, fósforos de aluminato de estroncio) no son propensos a una fotodegradación o fotodecoloración considerable, lo cual es un problema importante con muchos marcadores fotoluminiscentes. La falta de fotodecoloración significa que los análisis que usan los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden excitarse y se pueden volver a obtener imágenes de ellos y se pueden volver a medir numerosas veces sin una pérdida importante de actividad de la luminiscencia.

Debido a su larga vida útil de emisión, los indicadores fosforescentes de la presente descripción también se pueden usar en sistemas de lectura sin excitación continua. Las principales ventajas de la detección de fotoluminiscencia de resolución temporal son la autofluorescencia de fondo reducida de la matriz de muestra o los materiales de ensayo y el potencial para diseñar un dispositivo de lectura de ensayo más simple al eliminar la necesidad de hardware óptico costoso tales como filtros. Prácticamente cada tipo de marcador fotoluminiscente, aparte de un número selecto de colorantes organometálicos o quelatos metálicos, tiene una vida útil corta y requiere filtros ópticos para reducir la intensidad de fondo de la luz de excitación dispersa y la autofluorescencia. Los colorantes fluorescentes orgánicos como la fluoresceína que tienen un espacio relativamente estrecho o el cambio de Stokes entre el pico del espectro de excitación y el pico del espectro de emisión, requieren el uso de filtros ópticos de alta calidad en dispositivos de lectura de ensayos para la detección sensible del fluoróforo y el analito. En teoría, los marcadores fotoluminiscentes que tienen bandas de excitación con un gran cambio de Stokes de la banda de emisión podrían usarse en ensayos sin filtros ópticos seleccionando una fuente de excitación altamente monocromática. En la práctica, sin embargo, no es factible encontrar una fuente de excitación que también sea rentable, ya que la mayoría de las fuentes de excitación tienen un pico de emisión lo suficientemente amplio como para causar una señal de fondo que se superpone con las longitudes de onda de emisión del indicador fotoluminiscente, lo que interfiere con la detectabilidad del indicador y reduce la sensibilidad del ensayo. Los indicadores fosforescentes de la presente invención pueden permitir la construcción de dispositivos de lectura para ensayos de fotoluminiscencia altamente sensibles con hardware óptico mínimo. En algunas realizaciones, un dispositivo simple tal como una cámara de teléfono móvil y flash o LED son suficientes para la lectura de fotoluminiscencia de ensayos que usan indicadores fosforescentes de la presente descripción. Como tal, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden encontrar numerosas aplicaciones en diversos procedimientos de diagnóstico y análisis. Además, los indicadores fosforescentes de la presente descripción se pueden usar de manera cualitativa y cuantitativa.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden utilizarse en entornos de ensayo, tales como flujo lateral. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden unirse a superficies en ensayos de flujo a través. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden utilizarse en inmunoensayos de diagnóstico, ensayos para detectar ácidos nucleicos, proteínas, virus completos, bacterias o moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden servir como marcadores en ensayos utilizados para diagnosticar enfermedades, monitorizar niveles de moléculas biológicamente o clínicamente relevantes, detectar sustancias narcóticas, detectar patógenos en agua, alimentos u otras muestras, imágenes in vivo, aplicaciones de citometría de flujo, niveles de monitorización de productos químicos en el medio ambiente y aplicaciones adicionales. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción podrían utilizarse en dispositivos diseñados para detectar biomarcadores para controlar la salud o diagnosticar enfermedades en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria. En algunas realizaciones, los dispositivos diseñados para leer la luminiscencia para flujo lateral, flujo a través, flotación y otros formatos pueden incorporar los indicadores fosforescentes de la presente descripción como marcadores.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción se pueden usar para mejorar los diagnósticos en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria. Los diagnósticos en los lugares en los que se presta la asistencia sanitaria tienen el potencial de mejorar la calidad de la atención sanitaria al proporcionar sistemas simples y de bajo coste para la detección de patógenos infecciosos y biomarcadores de enfermedades. Se han desarrollado numerosas plataformas de diagnóstico para lugares en los que se presta la asistencia sanitaria que incorporan marcadores fluorescentes como señal de lectura. Sin embargo, los colorantes orgánicos utilizados en estos marcadores son propensos a la fotodecoloración, y las imágenes de fluorescencia requieren un sistema óptico complejo con costosos filtros de excitación y emisión debido a la corta vida útil del estado excitado.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción se usan en dispositivos de flujo lateral. En algunas realizaciones, el indicador fosforescente de la presente descripción se pone en contacto con un analito y fluye a través de una membrana a una línea de análisis donde los anticuerpos u otros elementos de reconocimiento inmovilizados en la membrana se unen al analito. La luminiscencia se mide mediante imágenes con una cámara o mediante mediciones cuantitativas con un luminómetro u otro dispositivo de detección de luz. La intensidad de la luz de los indicadores fosforescentes se utiliza en el análisis de diagnóstico.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción se usan como componentes de dispositivos de sedimentación, reubicación magnética o flotación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción se inmovilizan en un objeto de flotación como una microburbuja o una lámina de polímero delgada para formar un inmunoemparedado con el analito y los fósforos biofuncionalizados. Las fuerzas de flotación pueden reubicar el módulo de flotación con los fósforos unidos a la parte superior de la disolución donde se mide o se forma una imagen de la luminiscencia. Se puede usar un colorante para reducir la señal de fondo de los fósforos en una disolución no unida al objeto de flotación.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción se usan como componentes de dispositivos de flujo a través. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos o elementos de biorreconocimiento se inmovilizan en una membrana. A continuación, se aplica una muestra que contiene un indicador fosforescente (por ejemplo, fósforos biofuncionalizados) en contacto con un analito en la parte superior de la membrana. A continuación, se forman inmunoemparedados entre los elementos de biorreconocimiento en la membrana, el analito y los indicadores fosforescentes. Los indicadores fosforescentes no unidos pasan a través de la membrana. A continuación, se obtienen imágenes de o se mide la luminiscencia de la membrana.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente descripción pueden usarse en la unión a la superficie. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos u otros elementos de reconocimiento molecular se inmovilizan en una superficie. A continuación, se aplica a la superficie una muestra que contiene indicadores fosforescentes que están en contacto con un analito. Se forman inmunoemparedados entre los elementos de biorreconocimiento en la superficie, el analito y los indicadores fosforescentes. Los fósforos no unidos se eliminan, opcionalmente por la astringencia de la fuerza de flujo. A continuación, se obtienen imágenes de o se mide la luminiscencia de la superficie.

En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes de la presente invención pueden excitarse o estimularse para producir luminiscencia por medios distintos a la luz. En algunas realizaciones, los indicadores fosforescentes pueden ser estimulados por la aplicación de calor, corriente o campos eléctricos. Estos procedimientos de excitación permiten una mayor flexibilidad en el diseño del formato del ensayo y pueden conducir a una sensibilidad mejorada.

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Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un indicador fosforescente que comprende:

una partícula fosforescente inorgánica;

una cubierta que encapsula la partícula fosforescente inorgánica; y

al menos un resto de reconocimiento molecular seleccionado de entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, un ácido nucleico, un péptido, una proteína o un aptámero dispuesto en la cubierta,

donde la partícula fosforescente inorgánica forma el núcleo del indicador fosforescente,

caracterizado porque la partícula fosforescente inorgánica es una nanopartícula de aluminato de estroncio que comprende aluminato de estroncio dopado con al menos un metal de tierras raras, el al menos un metal de tierras raras comprende europio o disprosio, o lantánidos o una combinación de los mismos, y porque dicha partícula presenta un tamaño en un intervalo comprendido entre 50 nm y 600 nm y una vida útil de luminiscencia en un intervalo comprendido entre 10 microsegundos y una hora.

2. El indicador fosforescente según la reivindicación 1, donde el indicador fosforescente se une a través del al menos un resto de reconocimiento molecular a un analito objetivo para generar una señal de luminiscencia, donde la señal de luminiscencia se detecta por excitación de la partícula fosforescente inorgánica, y donde la excitación de la partícula fosforescente inorgánica se logra mediante luz UV o luz visible.

3. El indicador fosforescente según la reivindicación 1 o la reivindicación 2,

donde la cubierta que encapsula la partícula fosforescente inorgánica comprende un revestimiento a base de silicio, donde el revestimiento a base de silicio se selecciona del entre el grupo que consiste en óxido de silicio, sílice, silicatos y silanos organofuncionales,

donde la cubierta que encapsula la partícula fosforescente inorgánica comprende un polímero hidrófilo, opcionalmente

donde el polímero hidrófilo es polietilenglicol.

4. El indicador fosforescente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el al menos un resto de reconocimiento molecular seleccionado de entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, un ácido nucleico, un péptido, una proteína o un aptámero comprende enlazadores dispuestos en la cubierta que encapsula la partícula fosforescente inorgánica,

y donde los enlazadores se seleccionan de entre el grupo que consiste en trietoxisililbutiraldehído (TESBA), polietilenglicol (PEG), polietilenglicol homobifuncional, polietilenglicol heterobifuncional, (3-aminopropil)trietoxilano (APTES) y trialcoxisilano.

5. El indicador fosforescente según la reivindicación 1, que comprende además al menos una partícula magnética o capa de material magnético encapsulada por la cubierta.

6. Un procedimiento para hacer un indicador fosforescente que comprende:

preparar partículas fosforescentes inorgánicas;

encapsular las partículas fosforescentes inorgánicas en una cubierta; y

disponer al menos un resto de reconocimiento molecular seleccionado de entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, un ácido nucleico, un péptido, una proteína o un aptámero en la cubierta,

donde la partícula fosforescente inorgánica forma el núcleo del indicador fosforescente,

y donde la partícula fosforescente inorgánica es una nanopartícula de aluminato de estroncio que comprende aluminato de estroncio dopado con al menos un metal de tierras raras, el al menos un metal de tierras raras comprende europio o disprosio, o lantánidos o una combinación de los mismos, y presenta un tamaño en un intervalo comprendido entre 50 nm y 600 nm y una vida útil de luminiscencia en un intervalo comprendido entre 10 microsegundos y una hora.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, donde la etapa de preparar partículas fosforescentes inorgánicas comprende la reducción del tamaño de los polvos fosforescentes inorgánicos, y donde la reducción del tamaño comprende la molienda húmeda, o molienda criogénica, o molienda vibratoria, o molienda de cuentas, o molienda en seco, o molienda por desgaste, o molienda por chorro, o molienda, o combinaciones de las mismas.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, donde la reducción de tamaño se lleva a cabo mediante molienda húmeda.

9. El procedimiento según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, donde la molienda húmeda se lleva a cabo en presencia de disolventes orgánicos o alcoholes.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, donde el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo que consiste en acetato de etilo, tolueno, ciclohexano, ciclopentano y decano.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde las partículas fosforescentes inorgánicas tienen una vida útil de luminiscencia mayor que un minuto.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde la etapa de encapsular las partículas fosforescentes inorgánicas usa el proceso de Stober o variantes modificadas del proceso de Stober.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, donde la cubierta que encapsula las partículas fosforescentes inorgánicas comprende un revestimiento a base de silicio,

donde el revestimiento a base de silicio comprende óxido de silicio, sílice, silicatos o silanos organofuncionales, donde la cubierta que encapsula las partículas fosforescentes inorgánicas comprende un polímero hidrófilo, donde el polímero hidrófilo es polietilenglicol.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, donde la etapa de disponer un resto de reconocimiento molecular se realiza antes, durante o después de la etapa de encapsulación,

donde la etapa de disponer el al menos un resto de reconocimiento molecular se realiza por adsorción física o por enlace covalente,

donde la etapa de disponer al menos un resto de reconocimiento molecular comprende la funcionalización de la superficie de la cubierta con al menos una molécula enlazadora,

donde la al menos una molécula enlazadora se selecciona de entre el grupo que consiste en trietoxisililbutiraldehído (TESBA), polietilenglicol (PEG), (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) y trialcoxisilanos,

donde la al menos una molécula enlazadora tiene al menos un grupo funcional para acoplar al al menos un resto de reconocimiento molecular,

donde el al menos un grupo funcional se selecciona de entre el grupo que consiste en grupos amina, grupos carboxilo, aldehídos, cetonas, hidroxilos, tioles, hidrazidas, anhídridos, azidas y alquinos,

donde la etapa de disponer al menos un resto de reconocimiento molecular comprende además conjugar la molécula enlazadora con un resto de reconocimiento molecular a través del grupo funcional.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, donde la etapa de disponer un resto de reconocimiento molecular comprende disponer al menos un grupo funcional directamente sobre la cubierta, donde el al menos un grupo funcional se selecciona de entre el grupo que consiste en grupos amina, grupos carboxilo, aldehídos, cetonas, hidroxilos, tioles, hidrazidas, anhídridos, azidas y alquinos,

donde el grupo funcional está acoplado a un extremo de al menos una cadena de polietilenglicol,

donde el otro extremo de la cadena de polietilenglicol se acopla al al menos un resto de reconocimiento molecular.

16. Un procedimiento para usar un indicador fosforescente para la detección de al menos un analito dentro de una muestra que comprende:

proporcionar un indicador fosforescente según la reivindicación 1;

poner en contacto al indicador fosforescente con la muestra;

detectar la señal de luminiscencia del indicador fosforescente; y

determinar la presencia de un analito o cuantificar el analito en función de la señal de luminiscencia detectada.

17. El procedimiento de uso según la reivindicación 16, que comprende además la etapa de pretratar la muestra que contiene el analito, donde la etapa de pretratamiento implica la amplificación del analito.

18. El procedimiento de uso según la reivindicación 16 o la reivindicación 17, donde la detección de la señal de luminiscencia comprende la aplicación de una corriente eléctrica, o calor, o una combinación de los mismos.

19. El procedimiento de uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la detección in vitro de al menos un analito dentro de una muestra, comprendiendo el procedimiento además:

cargar un indicador fosforescente según la reivindicación 1 en un material poroso;

poner en contacto la muestra con el material poroso cargado con el indicador fosforescente;

permitir que la muestra y el indicador fosforescente fluyan a través de una membrana porosa;

detectar zonas de luminiscencia o ausencia de luminiscencia en la membrana para indicar la presencia o ausencia del al menos un analito, y

cuantificar el analito detectado,

donde el indicador fosforescente se une a través del al menos un resto de reconocimiento molecular al al menos un analito dentro de la muestra para generar la luminiscencia.

20. El procedimiento de uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 para la detección in vitro de al menos un analito dentro de una muestra, comprendiendo el procedimiento además:

proporcionar al menos un primer elemento de reconocimiento molecular inmovilizado en una superficie, donde el primer elemento de reconocimiento molecular es capaz de unirse al al menos un analito;

poner en contacto la muestra con la superficie para permitir la unión del al menos un analito al elemento de reconocimiento molecular de modo que el analito se inmovilice en la superficie;

poner en contacto el indicador fosforescente con la superficie para permitir la unión del indicador fosforescente al al menos un analito inmovilizado; y

medir una señal de luminiscencia del indicador fosforescente para permitir la detección o cuantificación del analito detectado,

donde el indicador fosforescente comprende además:

un segundo resto de reconocimiento molecular dispuesto en la cubierta, donde el segundo resto de reconocimiento molecular se une al al menos un analito inmovilizado para generar la señal luminiscente.

21. El procedimiento según la reivindicación 20, donde la superficie comprende chips de sistemas microfluídicos, o sistemas microfluídicos de papel, o membranas, o microplacas, o microburbujas para flotación, o superficies transparentes.

22. Procedimiento según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, donde la luminiscencia del indicador fosforescente se detecta al:

proporcionar una fuente de luz adecuada para la fotoexcitación del indicador fosforescente;

proporcionar un sensor capaz de detectar luminiscencia del indicador fosforescente;

iluminar el indicador fosforescente con la fuente de luz;

apagar la fuente de luz;

esperar un período de tiempo definido para permitir la descomposición del fondo; y

medir la luminiscencia emitida por el indicador fosforescente,

donde el sensor capaz de detectar luminiscencia es un dispositivo optoelectrónico,

23. El procedimiento según la reivindicación 16 para detectar al menos un analito dentro de una muestra, donde el indicador fosforescente comprende además:

al menos una partícula magnética o capa de material magnético encapsulada dentro de la cubierta; y al menos un primer resto de reconocimiento molecular específico para el analito dispuesto en la cubierta; comprendiendo el procedimiento además:

concentrar el indicador fosforescente magnético mediante el uso de un campo magnético;

poner en contacto el indicador fosforescente magnético concentrado con una superficie, donde la superficie se funcionaliza con al menos un segundo resto de reconocimiento molecular específico para el analito; detectar una señal de luminiscencia del indicador fosforescente magnético; y

determinar la presencia de un analito o cuantificar el analito en función de la señal de luminiscencia detectada, donde el primer resto de reconocimiento molecular se une al al menos un analito para generar la señal luminiscente.

24. El procedimiento según la reivindicación 23, donde la fuente de luz y el sensor son ambos parte de un teléfono móvil, teléfono inteligente u otro dispositivo electrónico portátil.