ES2792849T3 - Expresión de polipéptido químico con receptores de linfocitos variables en células inmunes y usos para tratar el cáncer - Google Patents

Expresión de polipéptido químico con receptores de linfocitos variables en células inmunes y usos para tratar el cáncer Download PDF

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Abstract

Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento de un dominio de receptor de linfocitos variable, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal de un dominio receptor de antígeno de células T, en el que el receptor de linfocitos variable tiene la SEQ ID NO: 4, 6, 8 o 10, o una secuencia con más del 95% de identidad con la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
Expresión de polipéptido químico con receptores de linfocitos variables en células inmunes y usos para tratar el cáncer
Antecedentes
La quimioterapia es el estándar de atención para el tratamiento de muchos tipos de cáncer, y se necesitan métodos alternativos para tratar el cáncer en situaciones donde la quimioterapia no es efectiva. El sistema inmunitario humano a veces puede prevenir o retrasar el crecimiento de células cancerosas mediante el reconocimiento por las células T. Para mejorar la capacidad de las células inmunes de matar células cancerosas, las células T pueden aislarse de la sangre de un paciente y alterarse genéticamente para unirse específicamente a las proteínas expresadas en la superficie de las células cancerosas. Cuando se vuelven a colocar en el paciente, las células modificadas se dirigen de manera más eficiente a las células cancerosas. CD19 es una proteína expresada en células B cancerosas. Brentjens et al., informan que las células T alteradas para unirse a CD19 pueden inducir remisiones de cáncer en adultos con leucemia linfoblástica aguda refractaria a la quimioterapia. Sci Transl Med, 2013, 5 (177): 177ra38.
Los agentes de quimioterapia típicamente actúan matando las células cancerosas, pero también afectan a otras células circulantes tales como las células T. Dasgupta et al., informan la modificación de las células inmunes para hacerlas resistentes a los medicamentos contra el cáncer para prevenir la muerte de las células T y mejorar la muerte de las células tumorales durante la quimioterapia. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391 (1): 170-5.
Los seres humanos generan receptores antigénicos de células T y B principalmente mediante el ensamblaje de segmentos de genes V-(D)-J de Ig e hipermutación somática. Las lampreas y el pez bruja tienen un sistema alternativo que se basa en receptores de linfocitos variables (VLR), cuya diversidad se genera a partir de casetes de repetición ricos en leucina (LRR). Yu et al., informan la purificación e identificación de antígenos de la superficie celular usando anticuerpos monoclonales de lamprea. Immunol Methods, 2012, 386 (0): 43-49. Véase también Yu et al., A lamprey monoclonal VLR antibody recognizes a novel plasma cell antigen, The J of Immunol, 2013, 190, Abstract 114.11; Han et al., Antigen recognition by variable lymphocyte receptors, Science, 2008321:1834-183; Hirano et al., The evolution of adaptive immunity in vertebrates, Adv Immunol, 2011, 109: 125-57; WO 2013/078425; US 2011/0230374; WO 2010/065407; y WO 2008/016854.
Las referencias citadas en el presente documento no son una admisión de la técnica anterior.
Resumen
La protección buscada para esta invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a la expresión celular recombinante de proteínas quiméricas con secuencias peptídicas derivadas de receptores de linfocitos y usos para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica con un segmento con una fracción de direccionamiento basada en un receptor de linfocitos variable (VLR) capaz de unir un antígeno asociado a un tumor y un segmento con una subunidad de transducción de señal de célula T. En ciertas realizaciones, los vectores recombinantes se usan en tratamientos contra el cáncer basados en inmunidad.
Los vectores recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento del dominio del receptor de linfocitos variable, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señales de un dominio del receptor de antígeno de célula T tal como CD3zeta (CD3Z).
En ciertas realizaciones, el dominio del receptor de linfocitos variable contiene una secuencia de polipéptidos de menos de 250 aminoácidos y 4 o 5 o más segmentos que tienen la secuencia XXLXLXX (SEQ ID NO: 1) en la que X puede ser cualquier aminoácido y L puede ser, individual e independientemente en cada caso, leucina o isoleucina u opcionalmente una L (leucina o isoleucina) puede ser sustituida con cualquier aminoácido.
En ciertas realizaciones, el receptor de linfocitos variable tiene una secuencia VXCXXXXLXSVPAXIPTTTXXLXXXX NXITKXXPGVFDXLXXLXXXXLXXNXLXXXPXGXFD (SEQ ID NO: 2) en la que X puede ser cualquier aminoácido.
En ciertas realizaciones, el receptor de linfocitos variable tiene una secuencia de aminoácidos divulgada en el presente documento tal como la SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 o una variante o una secuencia con más del 80, 85, 90, 95% de identidad con la mismas
En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento tal como la SEQ ID NO: 3, 5, 7 o 9 o una variante o una secuencia con una identidad superior al 80, 85, 90, 95% con la mismas.
En ciertas realizaciones, la molécula coestimuladora se selecciona de CD28, CD80, CD86 o un fragmento o variante.
En ciertas realizaciones, el componente de transducción de señal del receptor de antígeno de células T comprende un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora con la secuencia de consenso YXXLXXXXXXXXYXXL (SEQ ID NO: 15) en la que X es cualquier aminoácido, L es leucina o isoleucina y opcionalmente una o dos X se eliminan opcionalmente.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende además una secuencia de interleucina tal como IL-2 o un fragmento o variante.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende además CD8 o un fragmento o variante.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica una enzima que confiere resistencia al daño celular en presencia de un agente de quimioterapia.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica metilguanina metiltransferasa (MGMT), dihidrofolato reductasa (DHFR), citidina desaminasa (CD) y una proteína resistente a múltiples fármacos (MDR-1) o variantes de los mismos.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica la secuencia del receptor de linfocitos variable que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor tal como CD5, CD19, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD152(CTLA-4), CD274(PD-L1), CD340(ErbB-2), GD2, TPBG, CA-125, CEA, MAGEA1, MAGEA3, MARTI, GP100, MUC1, WT1, TAG-72, HPVE6, HPVE7, BING-4, SAP-1, receptor de laminina inmaduro, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) o receptor del factor de crecimiento epidérmico (ErbB-1).
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a células aisladas que comprenden el vector recombinante según se reivindica.
En ciertas realizaciones, las células aisladas se seleccionan de células T auxiliares, células T citotóxicas, células T asesinas naturales o células T y§.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere al vector recombinante según se reivindica para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende aislar células inmunes, por ejemplo, células T, células T gamma delta o células NK, y mezclando o transfiriendo un vector recombinante como se reivindica en las células en condiciones tales que el vector recombinante exprese en las células aisladas un polipéptido quimérico que comprende un dominio receptor de linfocitos variable, un dominio de molécula transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal del dominio del receptor de antígeno de células T que proporciona células inmunes modificadas, células T, células T gamma delta o células NK; e implantar las células inmunes modificadas, células T, células T gamma delta o células NK en un sujeto que las necesite.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante codifica una enzima que confiere resistencia al daño celular en presencia de un agente de quimioterapia, y una cantidad efectiva del agente de quimioterapia se administra al sujeto antes, durante o después de implantar las células en el sujeto.
En ciertas realizaciones, las células inmunes aisladas, células T, células T gamma delta o células NK se aíslan del sujeto para recibir las células modificadas implantadas.
En ciertas realizaciones, el cáncer se selecciona de neuroblastoma, glioblastoma, glioma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, leucemia, linfoma o melanoma.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a polipéptidos recombinantes, vectores recombinantes que comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptidos reportados en el presente documento y sistemas de expresión para producir esos polipéptidos. En particular, la invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 4, 6, 8 o 10, en el que el extremo terminal amino o el extremo terminal carboxilo de la secuencia de aminoácidos están unidos opcionalmente a una secuencia de aminoácidos heteróloga, marcador o molécula reportera. La invención también se refiere a un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido según se reivindica y una célula inmune que comprende el vector recombinante según se reivindica.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A ilustra un ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) que codifica el receptor de linfocitos variable que se une a las células de neuroblastoma (clon 4 del VLR).
La Figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) del receptor de linfocitos variable traducido por el ácido nucleico en la Figura 1A.
La Figura 1C ilustra un ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) que codifica un receptor de linfocitos variable que se une a las células de neuroblastoma (clon 18 del VLR).
La Figura 1D muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) del receptor de linfocitos variable traducido por el ácido nucleico en la Figura 1C.
La Figura 1E ilustra un ácido nucleico (SEQ ID NO: 7) que codifica el receptor de linfocitos variable que se une a las células de neuroblastoma (clon 19 del VLR).
La Figura 1F muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) del receptor de linfocitos variable traducido por el ácido nucleico en la Figura 1E.
La Figura 2A muestra una secuencia del VLR de codón optimizado (SEQ ID NO: 9) que codifica una proteína que se muestra que se une a CD5, el CAR que expresa esta proteína se puede usar para tratar tumores malignos de células T.
La Figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) del receptor de linfocitos variable traducido por el ácido nucleico en la Figura 2A.
La Figura 3 ilustra un método para generar secuencias de VLR-CAR. Se aíslan muestras de tumor o líneas celulares tumorales (por ejemplo, neuroblastoma, células B, células T) de un paciente, por ejemplo, diagnosticado con leucemia y se inyectan en una lamprea. Los VLR específicos de tumor se identifican y se clonan en un casete del receptor de antígeno quimérico dentro de un vector lentiviral. SP se refiere al péptido señal y LTR se refiere a la repetición terminal larga. El vector se transduce en células inmunes (células T, células asesinas naturales) y se reintroduce en el mismo paciente o en otro diferente.
La Figura 4A muestra datos del proceso de cribado usando ensayos de presentación en levadura para el aislamiento de un VLR antitumoral específicamente para neuroblastoma. Los neuroblastomas clasificados por MACS se proporcionan en el cuadrante superior derecho (clasificación FACS). Las colonias se colocan en placas con agar, se secuencian y se clonan en un casete del CAR.
La Figura 4B muestra datos que evidencian la activación de células T después de la transducción usando el vector lentiviral que contiene el casete clonado de la Figura 4A.
La Figura 5 muestra un esquema del vector lentiviral utilizado para transducir células T y medir la expresión de VLR-CAR. Los anticuerpos contra el marcador Myc se usan para mostrar la expresión de la superficie celular de VLR-CAR. La Figura 6A muestra un recuento celular frente a la expresión de el marcador Myc (es decir, la expresión de VLR-CAR en la superficie celular) de células Jurkat sin modificar por FACS.
La Figura 6B muestra datos en los que las células Jurkat se transdujeron a una MOI 2 con el vector lentiviral mostrado en la Figura 5 y en el que las células genéticamente modificadas se identificaron para la expresión del receptor de antígeno quimérico utilizando el marcador Myc.
La Figura 6c muestra datos en los que las células Jurkat se transdujeron a una MOI 10 con el vector lentiviral mostrado en la Figura 5 y en el que las células genéticamente modificadas se identificaron para la expresión del receptor de antígeno quimérico utilizando el marcador Myc.
La Figura 7a muestra células Jurkat sin modificar cocultivadas con células BCL, y la activación de células T se controla por expresión de CD69.
La Figura 7B muestra células Jurkat transducidas con BCL-VLR-CAR cocultivadas con células BCL, transducidas a MOI 2. Las células Jurkat transducidas se incubaron con la línea celular BCL que expresa el receptor de células B objetivo y se monitorizaron mediante expresión de CD69 como una medida de activación de células T.
La Figura 7C muestra células Jurkat transducidas con BCL-VLR-CAR cocultivadas con células BCL, transducidas a MOI 10 y monitorizadas por expresión de CD69 como una medida de activación de células T.
La Figura 8A muestra células Jurkat transducidas con CD5-VLR-CAR activadas por células que expresan CD5 (tal como se mide por la expresión de CD69).
La Figura 8B muestra que las células que expresan GFP (control) en lugar del CD5-VLR-CAR, transducidas de manera similar a la de la Figura 8A, no se activan como se controla por la expresión de CD69.
La Figura 9A ilustra una realización de esta divulgación.
La Figura 9B ilustra una realización de esta divulgación.
Descripción detallada
Antes de que la presente divulgación se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas, y como tal, por supuesto, puede variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia al que pertenece esta divulgación. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento también se puede usar en la práctica o prueba de la presente divulgación, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la divulgación previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas podrían ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Como será evidente para los expertos en la materia al leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en este documento tiene componentes y características discretas que pueden separarse fácilmente o combinarse con las características de cualquiera de las otras diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Cualquier método mencionado se puede llevar a cabo en el orden de los eventos mencionados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Las realizaciones de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas de inmunología, medicina, química orgánica, bioquímica, biología molecular, farmacología, fisiología y similares, que están dentro de las posibilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura.
Debe observarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán para tener los siguientes significados, a menos que sea evidente una intención contraria.
Antes de describir las diversas realizaciones, se proporcionan las siguientes definiciones y deben usarse a menos que se indique lo contrario.
Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y se usan indistintamente. Un polipéptido o polinucleótido heterólogo se refiere a un polipéptido o polinucleótido derivado de una fuente o especie diferente. Por ejemplo, un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento se refiere a una proteína de fusión en la cual la secuencia de direccionamiento está unida a un polipéptido diferente no asociado con la proteína natural de la que se deriva la secuencia de direccionamiento. Un polipéptido quimérico se refiere al enlace covalente de dos polipéptidos distintos heterólogos entre sí. El enlace puede ser, por ejemplo, por medios químicos o recombinantes. En algunos casos, el enlace es químico, en el que una reacción entre la fracción del anticuerpo y el compañero de fusión ha producido un enlace covalente formado entre las dos moléculas para formar una molécula. Se puede incluir opcionalmente un conector peptídico (secuencia peptídica corta), por ejemplo, entre la secuencia de direccionamiento y el polipéptido heterólogo.
Los términos "variante" y "mutante" cuando se usan en referencia a un polipéptido se refieren a una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más aminoácidos de otro, generalmente un polipéptido relacionado. Las variantes pueden estar en forma de fragmentos funcionales que pueden tener más de 25, 50 o 100 aminoácidos y, en algunos casos, menos de 100, 150 o 200 aminoácidos. La variante puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares. Un tipo de sustituciones conservadoras de aminoácidos se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas con hidroxilo son serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas son lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos conservadores preferidos de sustitución de aminoácidos son: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Más raramente, una variante puede tener cambios "no conservadores" (por ejemplo, reemplazo de una glicina con un triptófano). Variaciones menores similares también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos (en otras palabras, adiciones), o ambas. Se puede encontrar orientación para determinar qué y cuántos residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o eliminar sin abolir la actividad biológica utilizando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNAStar. Las variantes se pueden probar en ensayos funcionales. Las variantes preferidas tienen menos del 10%, y preferiblemente menos del 5%, y aún más preferiblemente menos del 2% de cambios (ya sean sustituciones, eliminaciones, etc.).
El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de nucleótidos, o un polinucleótido, como se describió anteriormente. El término se usa para designar una sola molécula, o una colección de moléculas. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, y pueden incluir regiones de codificación y regiones de diversos elementos de control, como se describe a continuación.
El término "una secuencia de ácido nucleico que codifica" un polipéptido especificado se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de un gen o, en otras palabras, la secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico. La región de codificación puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, el oligonucleótido, el polinucleótido o el ácido nucleico pueden ser monocatenarios (es decir, la cadena sentido) o bicatenarios. Los elementos de control adecuados, tales como potenciadores/promotores, uniones de empalme, señales de poliadenilación, etc., se pueden colocar cerca de la región de codificación del gen si es necesario para permitir el inicio adecuado de la transcripción y/o el procesamiento correcto del transcrito de ARN primario. Alternativamente, la región de codificación utilizada en los vectores de expresión de la presente descripción puede contener potenciadores/promotores endógenos, uniones de empalme, secuencias intermedias, señales de poliadenilación, etc., o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos.
El término "recombinante" cuando se usa en referencia a una molécula de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que está compuesta de segmentos de ácido nucleico unidos entre sí mediante técnicas de biología molecular. El término "recombinante" cuando se usa en referencia a una proteína o un polipéptido se refiere a una molécula de proteína que se expresa usando una molécula de ácido nucleico recombinante. El término ácido nucleico recombinante se distingue de los recombinantes naturales que resultan del cruce entre cromosomas homólogos. Los ácidos nucleicos recombinantes como se usan en el presente documento son una unión no natural de ácidos nucleicos de fuentes no homólogas, generalmente de diferentes organismos.
Los términos "vector" o "vector de expresión" se refieren a un ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y las secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación operativamente unida en un organismo huésped particular o sistema de expresión, por ejemplo, celular o sin células. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas generalmente incluyen un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosomas, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación.
Los "sistemas de expresión" de proteínas se refieren a sistemas in vivo e in vitro (sin células). Los sistemas para la expresión de proteínas recombinantes utilizan típicamente células que transfectan con un vector de expresión de ADN que contiene la plantilla. Las células se cultivan en condiciones tales que traducen la proteína deseada. Las proteínas expresadas se extraen para su posterior purificación. Los sistemas de expresión de proteínas in vivo que usan células procariotas y eucariotas son bien conocidos. Además, algunas proteínas se recuperan usando desnaturalizantes y procedimientos de replegamiento de proteínas. Los sistemas de expresión de proteínas in vitro (sin células) generalmente usan extractos compatibles de traducción de células enteras o composiciones que contienen componentes suficientes para la transcripción, traducción y opcionalmente modificaciones postraduccionales tales como ARN polimerasa, factores proteicos reguladores, factores de transcripción, ribosomas, cofactores de ARNt, aminoácidos y nucleótidos. En presencia de vectores de expresión, estos extractos y componentes pueden sintetizar proteínas de interés. Los sistemas libres de células generalmente no contienen proteasas y permiten la marcación de la proteína con aminoácidos modificados. Algunos sistemas libres de células incorporaron componentes codificados para la traducción en el vector de expresión. Véase, por ejemplo, Shimizu et al., Cell-free translation reconstituted with purified components, 2001, Nat. Biotechnol., 19, 751-755 y Asahara & Chong, Nucleic Acids Research, 2010, 38 (13): e141.
Un "marcador seleccionable" es un ácido nucleico introducido en un vector recombinante que codifica un polipéptido que confiere un rasgo adecuado para la selección o identificación artificial (gen informador), por ejemplo, la betalactamasa confiere resistencia a los antibióticos, lo que permite que un organismo exprese beta-lactamasa para sobrevivir en presencia de antibióticos en un medio de crecimiento. Otro ejemplo es la timidina quinasa, que hace que el huésped sea sensible a la selección de ganciclovir. Puede ser un marcador cribable que permite distinguir entre las células deseadas y no deseadas en función de la presencia o ausencia de un color esperado. Por ejemplo, el gen lacz produce una enzima beta-galactosidasa que confiere un color azul en presencia de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolilp-D-galactósido). Si la inserción recombinante inactiva el gen lac-z, entonces las colonias resultantes son incoloras. Puede haber uno o más marcadores seleccionables, por ejemplo, una enzima que puede complementar la incapacidad de un organismo de expresión para sintetizar un compuesto particular requerido para su crecimiento (auxotrófico) y uno capaz de convertir un compuesto en otro que sea tóxico para el crecimiento. URA3, una orotidina-5' fosfato descarboxilasa, es necesaria para la biosíntesis de uracilo y puede complementar a los mutantes de ura3 que son auxotróficos para uracilo. URA3 también convierte el ácido 5-fluoroorótico en el compuesto tóxico 5-fluorouracilo. Los marcadores seleccionables adicionales contemplados incluyen cualquier gen que imparta resistencia antibacteriana o exprese una proteína fluorescente. Los ejemplos incluyen, entre otros, los siguientes genes: el gen ampr, camr, tetr, blasticidinr, neor, hygr, abxr, neomicina fosfotransferasa tipo II (nptlI), p-glucuronidasa (gus), proteína fluorescente verde (gfp), egfp, yfp, mCherry, p-galactosidasa (lacZ), lacZa, lacZAM15, cloranfenicol acetiltransferasa (cat), fosfatasa alcalina (phoA), luciferasa bacteriana (luxAB), gen de resistencia a bialafos (bar), fosfomanosa isomerasa (pmi), xilosa isomerasa (xylA), arabitol deshidrogenasa (atlD), UDP-glucosa:galactosa-1-fosfato uridiltransferasa I (galT), subunidad a insensible a la retroalimentación de antranilato sintasa (OASA1D), 2-desoxiglucosa (2-DOGR), benciladenina-N-3-glucurónido, treonina desaminasa de E. coli, glutamato 1-semialdehído aminotransferasa (GSA-AT), D-amino acidoxidasa (DAAO), gen de tolerancia a la sal (rstB), proteína similar a ferredoxina (pflp), gen de trehalosa-6-P sintasa (AtTPS1), lisina racemasa (lyr), dihidrodipicolinato sintasa (dapA), triptófano sintasa beta 1 (AtTSB1 ), deshalogenasa (dhlA), gen de la manosa-6-fosfato reductasa (M6PR), higromicina fosfotransferasa (HPT) y D-serina amoníacoliasa (dsdA).
En ciertas realizaciones, la "identidad" de secuencia se refiere al número de aminoácidos que coinciden exactamente (expresada como un porcentaje) en un alineamiento de secuencia entre dos secuencias del alineamiento calculadas usando el número de posiciones idénticas dividido por el mayor de la secuencia más corta o el número de posiciones equivalentes excluyendo salientes en las que los espacios internos se cuentan como una posición equivalente. Por ejemplo, los polipéptidos GGGGGG y GGGGT tienen una identidad de secuencia de 4 de 5 u 80%. Por ejemplo, los polipéptidos GGGPPP y GGGAPPP tienen una identidad de secuencia de 6 de 7 u 85%. En ciertas realizaciones, cualquier mención de identidad de secuencia expresada en el presente documento puede ser sustituida por la similitud de secuencia. El porcentaje de "similitud" se utiliza para cuantificar la similitud entre dos secuencias de la alineación. Este método es idéntico a determinar la identidad, excepto que ciertos aminoácidos no tienen que ser idénticos para tener una coincidencia. Los aminoácidos se clasifican como coincidencias si se encuentran entre un grupo con propiedades similares de acuerdo con los siguientes grupos de aminoácidos: Aromático: F Y W; hidrófobo: A V I L; Cargado positivamente: R K H; Cargado negativamente: D E; Polar: S T N Q.
"Se une específicamente" se refiere a la capacidad de un agente de unión específico (tal como un VLR o fragmento del mismo) de la presente divulgación para reconocer y unir polipéptidos objetivo maduros, de longitud completa o de longitud parcial (en el presente documento antígeno asociado a tumor), o un ortólogo del mismo, de modo que su afinidad (según lo determinado, por ejemplo, por ELISA de afinidad o los ensayos descritos en el presente documento) es al menos 10 veces mayor, pero opcionalmente 50 veces mayor, 100, 250 o 500 veces mayor, o incluso al menos 1000 veces mayor que la afinidad del mismo por un polipéptido aleatorio de hidrofobicidad general similar.
Un "marcador" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente a otra molécula, tal como un anticuerpo o una proteína, para facilitar la detección de esa molécula. Ejemplos específicos y no limitantes de marcadores incluyen marcadores fluorescentes, enlaces enzimáticos e isótopos radiactivos. En un ejemplo, un "receptor marcador" se refiere a la incorporación de un polipéptido heterólogo en el receptor. Un marcador incluye la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión covalente de fracciones de biotinilo a un polipéptido que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas son conocidos en la técnica y pueden usarse. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes: radioisótopos o radionucleótidos (tales como 35S o 1311) marcadores fluorescentes (tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un informador secundario (tal como secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos) o agentes magnéticos, tales como los quelatos de gadolinio. En algunas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el posible impedimento estérico.
Receptor de linfocitos variable
Los vertebrados sin mandíbula, la lamprea y el pez bruja tienen un sistema inmunitario adaptativo compuesto por linfocitos clonalmente diversos que expresan receptores de linfocitos variables (VLR). El gen VLRB de la línea germinal está incompleto, y consiste en regiones constantes invariantes 5' y 3' separadas por una secuencia intermedia no codificante. La región constante 5' codifica un péptido señal y parte del LRR del extremo terminal N (LRR-NT). La región constante 3' codifica para una porción de la LRR-CT y una región de tallo invariante. El gen incompleto de la línea germinal está flanqueado por cientos de segmentos parciales del gen LRR. En los linfocitos en desarrollo, los segmentos que flanquean al gen LRR se copian aleatoria y secuencialmente en el gen VLRB incompleto. A medida que cada segmento del gen LRR se copia en el locus, reemplaza una parte de la secuencia interviniente. El mecanismo de ensamblaje continúa hasta que toda la secuencia interviniente se reemplaza con módulos LRR y se expresa un VLRB funcional. El ensamblaje del gen VLRB ocurre en un solo alelo, de modo que cada linfocito expresa un gen VLRB.
El gen VLRB maduro codifica para una proteína en forma de media luna, con diversidad de secuencia de aminoácidos concentrada en la superficie cóncava. La superficie cóncava está compuesta de cadenas p paralelas y un bucle variable del extremo terminal C. Cada subunidad LRR contribuye con una cadena p y cada cadena p tiene cinco posiciones de aminoácidos variables. Los anticuerpos VLRB también tienen números variables de subunidades LRR. Los anticuerpos VLRB más pequeños tienen 4 subunidades LRR y los más grandes tienen 11 subunidades LRR. Cada subunidad LRR aumenta la curvatura de la superficie cóncava y aumenta el área de la superficie cóncava. El LRR del extremo terminal C, LRR-CT, codifica un bucle de longitud variable y composición de secuencia que se proyecta por encima de la superficie cóncava. La inmunización con antígenos particulados, tales como el exosporio de Bacillus anthracis o eritrocitos humanos (RBC), induce a las células VLRB+ que se unen a los antígenos para proliferar y diferenciarse en plasmacitos. Los plasmacitos secretan anticuerpos VLRB multivalentes que circulan en la sangre. Cada anticuerpo VLRB secretado se compone de cadenas de polipéptidos VLRB idénticas dispuestas en un pentámero o tetrámero de dímeros que se mantienen unidos mediante enlaces disulfuro en el extremo terminal C de la región del tallo flexible e invariante. Debido a esta multivalencia, los anticuerpos VLRB se unen a sus antígenos con gran avidez.
Los ADNc de VLRB expresados en líneas de células de mamífero (células HEK-293T y CHO) se secretan en el sobrenadante del cultivo de tejidos como anticuerpos multivalentes unidos por disulfuro, tales como VLRB in vivo. Para aislar clones de VLRB específicos de antígeno, se prepara una biblioteca de ADNc de VLRB a partir de los linfocitos de lampreas inmunizadas. Los ADNc de VLRB se transfectan en HEK-293T, y los sobrenadantes de cultivo de tejidos que contienen VLRB se criban para la unión al antígeno.
Yu et al., informan la generación de paneles de anticuerpos monoclonales del VLR a partir de larvas de lamprea inmunizadas con células T humanas y el uso de un anticuerpo del VLR recombinante monoclonal para la purificación de antígenos y la identificación por espectrometría de masas. Véase J Immunol Methods, 2012, 386 (1-2): 43-9 titulado "Purification and identification of cell surface antigens using lamprey monoclonal antibodies".
En ciertas realizaciones, los vectores recombinantes contemplados comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento de dominio del receptor de linfocitos variable, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal de un dominio del receptor de antígeno de células T.
Los receptores de linfocitos variables típicamente contienen una secuencia LRR del extremo terminal N, una secuencia LRR del extremo terminal C y múltiples módulos LRR interiores de aproximadamente 12-25 aminoácidos. La secuencia LRR del extremo terminal C típicamente contiene un bucle variable (inserción altamente variable). Dentro de los módulos LRR interiores, siete aminoácidos contienen típicamente una o dos leucinas o isoleucinas, si son dos, separadas por un solo aminoácido, por ejemplo, (SEQ ID NO: 1) XXLXLXX, que generalmente se encuentran en la superficie cóncava, en la que X puede ser cualquier aminoácido y L puede ser leucina o isoleucina. En algunos casos, una L (leucina o isoleucina) puede ser sustituida con cualquier aminoácido.
En ciertas realizaciones, el dominio del receptor de linfocitos variable contiene una secuencia de polipéptidos de menos de 250 aminoácidos y 4 o 5 o más segmentos que tienen la secuencia XXLXLXX (SEQ ID NO: 1) en la que X puede ser cualquier aminoácido y L puede ser, individualmente e independientemente en cada caso, leucina o isoleucina o una L (leucina o isoleucina) puede ser sustituida con cualquier aminoácido.
En ciertas realizaciones, el receptor de linfocitos variable tiene una secuencia VXCXXXXLXSVPAXIPTTTXXLXXXX NXITKXXPGVFDXLXXLXXXXLXXNXLXXXPXGXFD (SEQ ID NO: 2) en la que X puede ser cualquier aminoácido.
Se considera que cualquiera de las variantes de receptores de linfocitos variables divulgadas en el presente documento es aquella que tienen una secuencia de aminoácidos alterada, por ejemplo, sustituciones, eliminaciones, inserciones de aminoácidos o combinaciones de los mismos en las que la secuencia alterada mantiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno de interés. Las sustituciones, eliminaciones, inserciones pueden o no estar dentro de los 4 o 5 segmentos que tienen la SEQ ID NO: 1 o un segmento que tiene la SEQ ID NO: 2.
Las variantes pueden contener 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos. Las variantes de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8 o 10 pueden contener 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones pueden o no estar dentro de los 4 o 5 segmentos que tienen la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones variantes pueden ser sustituciones conservadas. Los aminoácidos pueden ser sustituciones conservadas si están entre un grupo con propiedades similares de acuerdo con los siguientes grupos de aminoácidos: Aromático: F Y W; hidrófobo: A V I L; Cargados positivamente: R K H; Cargados negativamente: D E; Polares: S T N Q.
Las variantes pueden contener 1, 2 o 3 eliminaciones de aminoácidos. Las variantes de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8 o 10 pueden contener 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones de aminoácidos. Las eliminaciones pueden ser eliminaciones terminales, por ejemplo, comenzando desde el primer aminoácido del extremo terminal N hacia adentro o el último aminoácido del extremo terminal C. Las eliminaciones pueden ser eliminaciones interiores, por ejemplo, entre el primer aminoácido del extremo terminal N identificado en la SEQ ID NO y el último aminoácido del extremo terminal C. Las eliminaciones pueden no estar dentro de los 4 o 5 segmentos que tienen la SEQ ID NO: 1.
Las variantes pueden contener 1, 2 o 3 adiciones de aminoácidos. Las variantes de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8 o 10 pueden contener 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 adiciones de aminoácidos. Las adiciones pueden ser adiciones terminales, por ejemplo, comenzando desde el primer aminoácido del extremo terminal N hacia afuera o el último aminoácido del extremo terminal C. Las adiciones pueden ser eliminaciones interiores, por ejemplo, entre el primer aminoácido del extremo terminal N identificado en la SEQ ID NO y el último aminoácido del extremo terminal C. Las eliminaciones pueden no estar dentro de los 4 o 5 segmentos que tienen la SEQ ID NO: 1.
Un experto en la materia podrá determinar variantes adecuadas del polipéptido como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. Un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se consideran importantes para la actividad. Se pueden identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Incluso las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden estar sujetas a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar negativamente la estructura del polipéptido.
Además, un experto en la materia puede revisar estudios de estructura-función que identifiquen residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparación, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes pronosticados.
Un experto en la materia también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. En vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la materia puede optar por no hacer cambios radicales en los residuos de aminoácidos que se predice que están en la superficie de la proteína, ya que dichos residuos pueden estar involucrados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la materia puede generar variantes de prueba que contienen una única sustitución de aminoácidos en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden cribarse luego usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácido particular da como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, se pueden evitar variantes con dicho cambio. En otras palabras, con base en la información recopilada de tales experimentos de rutina, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que se deben evitar sustituciones adicionales, ya sea solas o en combinación con otras mutaciones.
Las variantes del receptor de linfocitos variable individuales pueden aislarse de bibliotecas combinatorias usando tecnologías de presentación en proteínas, por ejemplo, presentación en fagos, presentación en superficie de levadura, presentación en bacterias o sistemas libres de células. Véase Finlay et al., Methods Mol. Biol., 2011, 681: 87-101; Daugherty, Curr. Opin. Struct. Biol., 2007,17: 474-480; Gai y Wittrup, Curr. Opin. Struct. Biol., 2007, 17: 467-473; Zhou et al., MAbs., 2010, 2: 508-518; Shen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos, 2005, 102: 5969-5974. Típicamente, una colección de variantes únicas se vincula a través de la plataforma de presentación mediante la expresión de los ácidos nucleicos mutados correspondientes. Después de exponer/mezclar las variantes expresadas en la plataforma de presentación con la molécula objetivo, las variantes unidas a la molécula se identifican y/o se separan para el análisis. Típicamente, la secuencia de proteínas se determina secuenciando un ácido nucleico asociado en la plataforma de presentación. Por ejemplo, en la presentación en la superficie de levadura, las células de levadura recombinantes expresan proteínas variantes en las que la célula de levadura expresa la proteína variante conjugada con una proteína de la pared celular. La célula de levadura puede contener un ADN plasmídico que codifica la proteína variante que se expresa en la superficie de la célula de levadura, y la secuenciación del ADN plasmídico proporciona la secuencia proteica de la proteína variante. Véase Gera et al., Protein selection using yeast surface display, Methods, 2013, 60 (1): 15-26. En la presentación en fagos, las proteínas variantes se conjugan típicamente con una proteína de recubrimiento del bacteriófago. Los sistemas basados en células también suelen depender de la expresión de proteínas variantes conjugadas con proteínas de la superficie celular, por ejemplo, en células bacterianas, de levadura y de mamífero, y la célula huésped porta un vector plasmídico que codifica las proteínas variantes. También se han desarrollado sistemas libres de células en los que la proteína variante se conjuga directamente a su ARNm codificador, denominado presentación en ribosomas o presentación en ARNm.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a polipéptidos aislados que comprenden la SEQ ID NO: 4, 6, 8 o 10, o fusiones de las mismos en las que el extremo terminal amino o el extremo terminal carboxilo de la secuencia de aminoácidos están opcionalmente unidos a una secuencia de aminoácidos heteróloga, marcador o molécula indicadora.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a los vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido divulgado en el presente documento o una proteína quimérica del mismo.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende opcionalmente un origen de replicación asociado a mamífero, humano, insecto, viral, bacteriano, plásmido bacteriano, levadura o gen tal como un gen o gen retroviral o LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS lentiviral, y segmento de nucleótidos INS o gen seleccionado de tat, rev, nef, vif, vpr, vpu y vpx o genes estructurales seleccionados de gag, pol y env.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende opcionalmente un elemento del vector génico (ácido nucleico) tal como una región marcadora seleccionable, operón lac, un promotor de CMV, un promotor híbrido potenciador de B-actina de pollo/CMV (CAG), promotor tac, un promotor de la ARN polimerasa T7,un promotor de la ARN polimerasa SP6, un promotor SV40, una secuencia interna del sitio de entrada al ribosoma (IRES), un elemento regulador postregulatorio de marmota de acción cis (WPRE), una región de unión al andamio (SAR), repeticiones terminales invertidas (ITR), una región de codificación de etiqueta FLAG, una región de codificación de etiqueta c-myc, una región de codificación de etiqueta de afinidad con metal, una región de codificación de etiqueta de péptido de unión a estreptavidina, una región de codificación de etiqueta poliHis, una región de codificación de etiqueta HA, una región de codificación de etiqueta MBP, una región de codificación de etiqueta GST, una región de codificación de poliadenilación, una señal de poliadenilación de SV40, origen de replicación de SV40, origen de replicación ColE1, origen f1, origen pBR322 u origen pUC, sitio de reconocimiento de proteasa TEV, sitio loxP, región codificante de recombinasa Cre, o un sitio de clonación múltiple tal como tener 5, 6, o 7 o más sitios de restricción dentro de un segmento continuo de menos de 50 o 60 nucleótidos o que tienen 3 o 4 o más sitios de restricción con un segmento continuo de menos de 20 o 30 nucleótidos.
Inmunoterapia y receptores de antígenos quiméricos
Para mejorar la capacidad de las células inmunes para matar células cancerosas, las células T pueden aislarse de la sangre de un paciente y modificarse genéticamente para atacar específicamente a las proteínas expresadas en la superficie de las células cancerosas. Cuando se vuelven a colocar en el paciente, las células pueden ser aglutinantes más eficientes de las células cancerosas. CD19 es una proteína expresada en células B cancerosas. Brentjens et al., informan que las células T alteradas para unirse a CD19 pueden inducir remisiones de cáncer en adultos con leucemia linfoblástica aguda refractaria a la quimioterapia. Sci Transl Med, 2013, 5 (177): 177ra38.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento del dominio receptor de linfocitos variables, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal de un dominio del receptor de antígeno de células T.
En ciertas realizaciones, la secuencia de direccionamiento es un dominio del receptor de linfocitos variable o cualquier variedad de secuencias de polipéptidos capaces de unirse selectivamente a una proteína de superficie en células objetivo, por ejemplo, células cancerosas. Otras secuencias de direccionamiento pueden ser regiones de unión variable de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla y mimético de anticuerpos.
En ciertas realizaciones, la molécula coestimuladora se selecciona a partir de CD28 MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDS AVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPP YLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFNFWVRSKR SRLLHSDYMNMT-PRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 11) o variantes o fragmento del mismo tal como el dominio de inmunoglobulina (Ig) del antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico ILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSERFRA SLHKGLDSAVEVCVV YGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKS NGTIIHVK (SEQ ID NO: 12) o variantes o fragmentos de los mismos. CD28 es el receptor para CD80 (B7.1) y la invención contempla CD80 como la secuencia GHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVA TLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKM VLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEK DAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELY AVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVI CCLTYCFAPRCRERRR NERLRRESVRPV (SEQ ID NO: 13) o variantes o fragmento de la misma o una secuencia con más del 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad con la misma. CD28 es también el receptor para CD86 (B7.2) y la invención contempla CD86 como la secuencia MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQ ENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIR IHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYlNLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIM
QKSQD NVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITA VLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQR VFKSSKTSSCDKSDT CFP (SEQ ID NO: 14) o variantes o fragmento de la misma o una secuencia con más del 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad con la misma.
En ciertas realizaciones, la invención contempla el uso de una molécula coestimuladora que sea un fragmento de 20 a 100 o de 50 a 150 aminoácidos de la SEQ ID NO: 11-14 o variantes de la misma o aquellas con 80, 90, 95% o mayor identidad con la misma.
En ciertas realizaciones, el componente de transducción de señal del receptor de antígeno de células T es un péptido con un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora con la secuencia de consenso YXXLXXXXXXXXYXXL (SEQ ID NO: 15) en la que X es cualquier aminoácido, L es leucina o isoleucina, en la que la SEQ ID NO: 15 tiene opcionalmente una o dos eliminaciones de aminoácidos X dentro del segmento medio XXXXXXXX (SEQ ID NO: 16). El motivo de activación basada en el inmunorreceptor tirosina (subrayado) está en la secuencia CD3-zeta parcial AQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR (SEQ ID NO: 17) que tiene o fragmentos variantes que tienen 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones o sustituciones de variantes de sustitución de aminoácidos, o una secuencia con más de 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad de secuencia con la misma.
En ciertas realizaciones, el componente de transducción de señal del receptor de antígeno de células T es un péptido con un motivo de activación basado en el inmunorreceptor tirosina (subrayado) con la secuencia del precursor de la subunidad gamma del receptor épsilon de inmunoglobulina IPAVv Ll LlLlVEQAAALEPQLCYiLdAILFLYGIVL TLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQ ID NO: 18), fragmentos o variantes, variantes de la misma o una secuencia con más de 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad con la misma.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico como se proporciona en el presente documento que además comprende una secuencia de interleucina tal como una secuencia señal de IL-2 humana (aminoácidos 1-60 de IL-2). MYRMQLLSC IALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 19), fragmentos, variantes o una secuencia con más de 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad de secuencia con la misma.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico como se proporciona en el presente documento que comprende además una secuencia de CD8 humano MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQ PRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRR ENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKP TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCK CPRPVVKSGDKPSLSARYV (SEQ ID NO: 20) o una variante o fragmento con una secuencia con 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad con la misma.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico como se proporciona en el presente documento que comprende además un CD137 humano MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC DICRQCKGV FRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCF GTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGH SPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCEL (SEQ ID NO: 21) o una variante o fragmento con una secuencia con 50, 60, 70, 80, 90, 95% o más de identidad con la misma.
Inmunoterapia
En ciertas realizaciones, la invención se relaciona con el vector recombinante según se reivindica para su uso en un método de tratamiento de cáncer que comprende aislar células T, células T gamma delta o células NK y transferir un vector recombinante según se reivindica en las células en condiciones tales que el vector recombinante expresa en las células aisladas un polipéptido quimérico que comprende un dominio del receptor de linfocitos variable, un dominio de molécula transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal del dominio del receptor de antígeno de células T que proporciona células T modificadas, células T gamma delta o células NK; e implantar las células T modificadas, las células T gamma delta o las células NK en un sujeto que las necesite.
En ciertos aspectos, la divulgación se refiere a un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T, un componente de transducción de señal de un dominio del receptor de antígeno de células T y una enzima que confiere resistencia al daño celular en presencia de un agente de quimioterapia.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante codifica una enzima que confiere resistencia al daño celular en presencia de un agente de quimioterapia, y una cantidad efectiva del agente de quimioterapia se administra al sujeto antes, durante o después de implantar las células en el sujeto.
Las células inmunocompetentes exhiben citotoxicidad hacia las células cancerosas y los modelos animales tumorigénicos han demostrado que estas células pueden infiltrarse en tumores dando como resultado una regresión tumoral. La infiltración tumoral por células inmunocompetentes indica un pronóstico favorable en varios tipos de cáncer, tales como melanoma, colon, cáncer de ovario, carcinoma de células basales y cáncer de pulmón.
Los regímenes de quimioterapia frecuentemente conducen a toxicidad celular inespecífica a células inmunocompetentes transferidas adoptivamente y a células madre hematopoyéticas. Una estrategia para combatir la toxicidad inducida por fármacos es modificar genéticamente las células inmunes para hacerlas resistentes a los fármacos, por ejemplo, utilizando médula ósea resistente a fármacos o células inmunocompetentes con capacidades citotóxicas intrínsecas. Varios genes, como los de la metilguanina metiltransferasa (MGMT), la dihidrofolato reductasa (DHFR), la citidina desaminasa (CD) y la proteína resistente a múltiples fármacos (MDR-1) pueden conferir resistencia farmacológica a las células inmunes anticancerígenas. Los vectores retrovirales recombinantes, como los vectores lentivirales, son sistemas eficientes de transferencia de genes para la modificación ex vivo de las células, por ejemplo, células hematopoyéticas. La transferencia génica retroviral da como resultado la integración de la secuencia de ácido nucleico transferida en el genoma de la célula objetivo.
En ciertas realizaciones, la invención contempla vectores recombinantes que codifican el polipéptido P140KMGMT MDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHEIKLLGKGTSAA DAVEVPAPAAVLGGPEPLMQCTAWLNAYF-HQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWK LLKVVKFGEVISYQQLAALAGNPKAARAVGGAMRGNPVKILIP-CHRVVCSSGAVGNYSGG LAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGGSSGLAGAWLKGAGATSGSPPAGRN (SEQ ID NO: 22) y/o el polipéptido L22YDHFR VGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDYPWPPLRNEFRYFQRMTTTS SVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQP ELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPG VLSDVQEEKGIKYKFE-VYEKND (SEQ ID NO: 23) o una secuencia con más del 80, 90 o 95% de identidad con la misma.
Zielske et al., informan que la transducción lentiviral de MGMT P140K en progenitores hematopoyéticos CD34(+) humanos confiere una resistencia significativa a BG/BCNU y permite la selección in vitro. Mol Ther. 2002, 5 (4): 381­ 7. Sawai et al., informan la protección y la selección in vivo de células madre hematopoyéticas utilizando temozolomida, O6-bencilguanina y un vector retroviral que expresa alquiltransferasa. Mol Ther. 2001, 3 (1): 78-87. Maier et al., informan que la secuencia F2A que une MGMT (P140K) y MDR1 en un vector lentiviral bicistrónico permite una quimioprotección eficiente de las células madre hematopoyéticas. Cancer Gene Ther. 2012, 19 (11): 802-10.
En ciertas realizaciones, las células inmunocompetentes, por ejemplo, células T aisladas, células T gamma delta o células NK se aíslan del sujeto para recibir las células modificadas implantadas.
En ciertas realizaciones, el cáncer se selecciona de neuroblastoma, glioblastoma, glioma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, leucemia, linfoma o melanoma.
En ciertas realizaciones, la secuencia de direccionamiento se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor tal como CD5, CD19, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD152 (CTLA-4), CD274 (PD-L1), CD340 (ErbB -2), GD2, TPBG, CA-125, CEA, MAGEA1, MAGEA3, MARTI, GP100, MUC1, WT1, TAG-72, HPVE6, HPVE7, BING-4, SAP-1, receptor de laminina inmaduro, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) o receptor del factor de crecimiento epidérmico (ErbB-1).
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a una célula aislada que comprende los vectores recombinantes divulgados en el presente documento. En ciertas realizaciones, las células aisladas se seleccionan de células T auxiliares, células T citotóxicas, células T asesinas naturales o células T gamma delta. Estas células pueden obtenerse por aislamiento de sangre periférica y opcionalmente purificarse mediante clasificación de células activadas fluorescentes, por ejemplo, mezclando células con anticuerpos fluorescentes u otros agentes fluorescentes y separando las células mediante clasificación fluorescente basada en citometría de flujo. Otra opción para la clasificación de células es proporcionar partículas magnéticas que se conjugan con anticuerpos contra un antígeno particular en la superficie celular. Después de mezclar con una muestra, las células unidas al anticuerpo se colocan a través de una columna de purificación que contiene una matriz compuesta de esferas ferromagnéticas. Cuando se colocan en un separador magnético, las esferas amplifican el campo magnético. Las células no marcadas pasan a través suyo mientras que las células marcadas magnéticamente se retienen dentro de la columna. El flujo continuo se puede recoger como la fracción de células no marcadas. Después de una breve etapa de lavado, la columna se retira del separador y las células marcadas magnéticamente se eluyen de la columna.
El CD3 se expresa en todas las células T ya que está asociado con el receptor de células T (TCR). La mayoría de los TCR están formados por cadenas alfa beta (células alfa beta T). Se cree que las células T alfa beta y las células T gamma delta se derivan de timocitos precursores doble negativos CD4'CD8‘ comunes. Las células T gamma delta maduras son doble negativas CD4'CD8‘. Por el contrario, las células T alfa beta generalmente se convierten en intermedios doblemente positivos (CD4+CD8+) que maduran en células T auxiliares positivas sencillas (CD4+CD8') o células T citotóxicas (c D4'CD8+). Las celdas de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Las células T de memoria típicamente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO. Las células T pueden aislarse y separarse de una muestra humana (sangre o PBMC) basándose en la expresión del receptor de células T alfa beta (TCR), el receptor de células T gamma delta, CD2, CD3, CD4, CD8, CD4 y CD8, NK1.1, Cd 4 y CD25 y otras combinaciones basadas en selección positiva o negativa. Las células T TCRy/6+ son TCRa/p', CD2+, CD3+, y CD5+. Véase también Salot et al., Large scale expansion of Vgamma9Vdelta2 T lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells after a positive selection using MACS "TCR gamma/delta+ T cell isolation kit," J Immunol Methods, 2009, 347(1-2):12-8.
En ciertos aspectos, la divulgación contempla métodos de tratamiento de células inmunes modificadas descritos en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos que comparan un VLR con un antígeno/molécula asociado para direccionamiento al tumor.
En ciertas realizaciones, la molécula es una molécula asociada a tumor seleccionada de CD20, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, molécula de adhesión de células epiteliales, gpA33, glicoproteína A33, mucinas, TAG-72, glicoproteína 72 asociada a tumor, proteína de unión al folato, VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular, integrina aVp3, integrina a5p1, FAP, proteína de activación de fibroblastos, CEA, antígeno carcinoembrionario, tenascina, Ley, antígeno Y de Lewis, CAIX, anhidrasa carbónica IX, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; también conocido como ERBB1), ERBB2 (también conocido como HER2), ERBB3, MET (también conocido como HGFR), receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF1R), receptor de efrina A3 (EPHA3), receptor 1 del ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAILR1; también conocido como TNFRSF10A), TRAILR2 (también conocido como TNFRSF10B) y el activador del receptor del ligando kB del factor nuclear (RANKL; también conocido como TNFSF11) y sus fragmentos.
En ciertas realizaciones, el sujeto está en riesgo de presentar síntomas o ser diagnosticado con cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas y cáncer de tiroides.
En ciertas realizaciones, los métodos contemplados incluyen la administración adicional de un segundo agente anticancerígeno tal como bevacizumab, gefitinib, erlotinib, temozolomida, docetaxel, cisplatino, 5-fluorouracilo, gemcitabina, tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, hidroxiurea, adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina, mitramicina, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, taxol, taxotere, etopósido, tenipósido, amsacrina, topotecano, camptotecina, bortezomib, anagrelida, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno fulvestrant, bicalutamida, flutamida, nilutamida, ciproterona, goserelina, leuprorelina, buserelina, megestrol, anastrozol, letrozol, vorazol, exemestano, finasteride, marimastat, trastuzumab, cetuximab, dasatinib, imatinib, combretastatina, talidomida y/o combinaciones de los mismos.
La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T son modificadas para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de otros agentes anticancerígenos adicionales. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T son modificadas para expresar enzimas resistentes a los fármacos, en combinación con la administración de trastuzumab y/o lapatinib. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T son modificadas para expresar enzimas resistentes a los fármacos, en combinación con la administración de docetaxel y ciclofosfamida. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T son modificadas para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de docetaxel, carboplatino y trastuzumab. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de ciclofosfamida, doxorrubicina y 5-fluorouracilo (5-FU). La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de docetaxel, doxorrubicina y ciclofosfamida. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de doxorrubicina y ciclofosfamida seguido de paclitaxel o docetaxel. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de mama usando métodos de tratamiento de células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de 5-FU, epirubicina y ciclofosfamida seguido de docetaxel o paclitaxel.
La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de próstata usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de otro agente anticancerígeno adicional. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de próstata usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de leuprolida, goserelina o buserelina. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de próstata usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de flutamida, bicalutamida, enzalutamida o nilutamida. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de próstata usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de ketoconazol o aminoglutetimida. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de próstata utilizando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de abiraterona, bicalutamida, cabazitaxel, bicalutamida, degarelix, denosumab, docetaxel, enzalutamida, cabazitaxel, leuprolida, prednisona, denosumab, sipuleucel-T o dicloruro de radio 223 y combinaciones de los mismos.
La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de colon usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de otro agente anticancerígeno adicional. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de colon usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de 5-FU, leucovorina o capecitabina o combinaciones de las mismas. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de colon usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de capecitabina y oxaliplatino. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de colon usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de 5-FU, leucovorina y oxaliplatino. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de colon usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de leucovorina, 5-FU e irinotecano. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de colon usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de leucovorina, 5-FU, oxaliplatino e irinotecano.
La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de pulmón usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de vinorelbina, etopósido, mitomicina C, gemcitabina, irinotecano, pemetrexed, gefitinib, erlotinib, lapatinib, crizotinib y un alcaloide de la vinca o combinaciones de los mismos. El alcaloide de la vinca es vinblastina, vincristina, vindesina o vinorelbina. En ciertas realizaciones, la divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de pulmón usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a los medicamentos, en combinación con la administración de bevacizumab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab o cetuximab. La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de pulmón usando métodos de tratamiento con células inmunes modificadas divulgados en este documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con la administración de un agente basado en platino y/o un taxano, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel o combinaciones de los mismos.
La divulgación contempla tratar o prevenir el cáncer de cerebro, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, tumores neuroectodérmicos primitivos, ependimomas o glioma. En ciertas realizaciones, la proteína quimérica se administra opcionalmente en combinación con temozolomida, procarbazina, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), vincristina y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, se combinan procarbazina, lomustina (CCNU) y vincristina. En ciertas realizaciones, la proteína quimérica se administra opcionalmente en combinación con irinotecano, cisplatino, carboplatino, metotrexato, etopósido, bleomicina, vinblastina, actinomicina (dactinomicina), ciclofosfamida o ifosfamida.
La divulgación contempla métodos que combinan tratamientos con células inmunes modificadas divulgados en el presente documento, tales como aquellos en los que las células T se modifican para expresar enzimas resistentes a fármacos, en combinación con tratamientos con temozolomida. El tratamiento del glioblastoma incluye quimioterapia durante y después de la radioterapia. En promedio, la quimioterapia después de la cirugía y la radioterapia pueden reducir inicialmente el tamaño del tumor.
Parte experimental
Creación de secuencias VLR-CAR que se unen a las células tumorales/neuroblastoma
Las lampreas sin modificar se inmunizaron en serie con células intactas (por ejemplo, células T humanas, leucemia de células B murinas, línea celular de neuroblastoma humano) durante 6 semanas. Posteriormente, sus linfocitos se recolectaron y se obtuvo ARN y se convirtió en ADNc. La amplificación por PCR de las secuencias del VLR de la biblioteca de ADNc facilitó la clonación de los VLR en una biblioteca de expresión de superficie de levadura que se usó para cribar los VLR que se unen a los antígenos en las células objetivo mediante citometría de flujo (véanse las Figuras 3 y 4 que ilustran el proceso utilizado para generar secuencias del VLR que se pueden usar para atacar a las células tumorales). Se puede usar un proceso similar de alto rendimiento que incorpora células o tejidos normales para seleccionar negativamente los VLR que probablemente generarán efectos del CAR fuera del objetivo. Los VLR que cumplen los criterios establecidos se secuencian y clonan en un casete transgénico del CAR. El VLR-CAR se clonó posteriormente en un vector lentiviral, que se usó para producir lentivirus recombinantes de alto título. El virus recombinante se usó para transducir células T (células Jurkat). Como se muestra en la Figura 4, VLR-CAR antineuroblastoma (generado contra la línea de células tumorales de neuroblastoma, SK-N-Be(2)) activó efectivamente las células T en presencia de células estimuladoras.
Secuencias de VLR que se unen a la leucemia de células B
Se desarrolló un CAR que contiene un VLR específico para el receptor de células B de una línea celular de leucemia de células B murinas (BCL). El diseño del CAR incorpora el anti-BCL-VLR, una etiqueta Myc, el dominio transmembrana CD28 y el dominio de señalización intracelular CD3Z (Figura 5). El vector lentiviral SIN VLR-CAR se produjo con alto título (~1 x 108) y se usó para transducir células HEK 293T y Jurkat. Las células Jurkat transducidas demostraron un CAR de superficie persistente (Figuras 6A-C) sin toxicidad manifiesta. Para determinar si el VLR era capaz de señalizar a través del CAR, las células Jurkat transducidas se incubaron con la línea celular BCL que expresaba el receptor de células B objetivo. Usando este ensayo, se demostró una potente activación de células T a través del VLR-c Ar (Figuras 7A-C).
Secuencias del VLR que se unen a la leucemia de células T

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de direccionamiento de un dominio de receptor de linfocitos variable, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal de un dominio receptor de antígeno de células T, en el que el receptor de linfocitos variable tiene la SEQ ID NO: 4, 6, 8 o 10, o una secuencia con más del 95% de identidad con la misma.
2. El vector recombinante de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico tiene la SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, o una secuencia con más del 95% de identidad con la misma.
3. El vector recombinante de la reivindicación 1 o 2, en el que la molécula coestimuladora se selecciona de CD28, CD80, CD86 o fragmento de la misma.
4. El vector recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente de transducción de señal del antígeno de células T comprende la secuencia YXXLXXXXXXXXYXXL (SEQ iD NO: 15) en la que X es cualquier aminoácido, L es leucina o isoleucina y uno o dos X se eliminan opcionalmente.
5. Una célula aislada que comprende el vector recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. La célula de la reivindicación 5, seleccionada de células T auxiliares, células T citotóxicas, células T asesinas naturales o células T y§.
7. El vector recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende
aislar células T, células T gamma delta o células NK y transferir el vector recombinante a las células en condiciones tales que el vector recombinante exprese en las células aisladas un polipéptido quimérico que comprende un dominio del receptor de linfocitos variable, un dominio de molécula transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señal del dominio del receptor de antígeno de células T que proporciona células T modificadas, células T gamma delta o células NK; y
implantar las células T modificadas, las células T gamma delta o las células NK en un sujeto que las necesite.
8. El vector recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector recombinante codifica una enzima que confiere resistencia al daño celular en presencia de un agente de quimioterapia, y se administra una cantidad efectiva del agente de quimioterapia al sujeto antes, durante o después de implantar las células en el sujeto.
9. El vector recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que las células T aisladas, las células T gamma delta o las células NK se aíslan del sujeto para recibir las células modificadas implantadas.
10. Un polipéptido aislado que comprende las SEQ ID NO: 4, 6, 8 o 10 en el que el extremo terminal amino o el extremo terminal carboxilo de la secuencia de aminoácidos están opcionalmente unidos a una secuencia de aminoácidos heteróloga, marcador o molécula indicadora.
11. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 10.
12. Una célula inmune que comprende el vector recombinante de la reivindicación 11.
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